CN104480206A - 脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针及试剂盒 - Google Patents

脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针及试剂盒。所述试剂盒包括脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针，所述引物包括9对引物，所述探针包括15条探针；本发明的脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针及试剂盒利用荧光定量PCR技术，增加现有专利技术中所没有的常见突变位点的检测，实现一次性特异的检测16种由于SMN基因缺失、转换与点突变导致的SMA患者并实现对SMA患者的分型。

Description

脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针及试剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针及试剂盒。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是一种较常见的遗传性疾病，儿童起病的SMA呈常染色体隐性遗传。携带者发生率为1/35-1/80，最近报道中国人群SMA致病基因的携带者频率为1/42，群体发病率为1/5000-1/10000活产婴儿，居儿童致死性常染色体遗传病的第二位，仅次于囊性纤维变性。脊髓性肌萎缩症国际协会根据SMA患者的发病年龄和临床表现分为4型：I型(严重型)、Ⅱ型(中间型)、Ⅲ型(轻型)和IV型(成人型)。
目前，临床上常用于辅助脊髓性肌萎缩症检测的方法主要有肌电图、肌肉活检组织化学染色及血清肌酸磷酸激酶(CPK)检测。但SMA的临床变异性大，肌电图在儿童患者不易配合检查，肌肉活检为有创性检查，令家长难以接受，且需冰冻切片组化染色的条件，更难以在临床上广泛开展，即使可以推行，肌电图和肌肉活检亦均缺乏特异性，因此本病极易误诊。为了能够更准确地对患者进行确诊，以防止重症患者的出生，就需要对患者的基因型进行检测。发展至今，在国内外用于SMA基因诊断的主要方法有：①连锁分析；②聚合酶链反应单链构象多态性(PCR-SSCP)技术；③错配聚合酶链反应一限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析；④变性高效液相分析技术(DHPLC)；⑤多重连接探针依赖性扩增技术(MLPA)⑥实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术；⑦高分辨率溶解曲线(Hight Resolution Melting Analysis，HRMA)；⑧数字PCR技术(Digital PCR)。现有产品及专利见表1。
表1
专利《脊髓性肌萎缩症相关基因突变检方法、相关检测探针组合物及检测试剂盒、以及相关应用》只对SMN1的外显子7、外显子8进行检测，没有对SMN2的外显子7进行检测，也就意味着只能鉴别是否为SMA的患者，而没有对SMA患者的轻重程度进行鉴定，对患者的生活质量没有指导意义，并且对外显子7、外显子8分管检测，间接增加了工作量及检测的成本；专利《一种诊断人类脊髓性肌萎缩症的荧光定量PCR试剂盒》对SMN1及SMN2进行了检测，还外加了NAIP基因进行检测，虽增加了SMA疾病检测的基因分型，但该方法采用Taqman对SMN1、SMN2仅几个位点单碱基的差异容易造成非特异性，在临床检测中具有极高的风险；综上所述的方法均只能实现对缺失型SMA患者的检测；仍有非缺失型SMA患者不在该方案的检测范围。
现有技术中对脊髓性肌萎缩症致病基因的检测位点少，且不能实现患者SMAI型(严重型)、Ⅱ型(中间型)、Ⅲ型(轻型)的分型，大部分荧光定量采用单内参标准化，定量检测结果判断存在一定的主观因素，导致结果不能准确反应样本真实情况，增加临床检测特别是产前诊断的风险；而采用MLPA技术操作时间比较长，且需要多步开盖操作，增加了污染的风险，检测成本偏高，也不能实现对突变点的检测，因此不能满足SMA临床诊断快速、检测范围广的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种实现一次性特异的检测16种由于SMN基因缺失、转换与点突变导致的SMA患者并实现对SMA患者的分型的脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针及试剂盒。
本发明的技术方案为：提供一种脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针，所述引物包括9对引物，所述探针包括15条探针；
所述9对引物(包括内参扩增引物)为：
引物SMN-EX1-F，其序列为：ACATAACCTCTAACCAGGTAAGTTTCCT；
引物SMN-EX1-R，其序列为：TCAGTGCTGTATCATCCCAAATG；
引物SMN-EX2a-F，其序列为：AGTTGTTTTTATTTCTTACCCTTTCCA；
引物SMN-EX2a-R，其序列为：CATTTCATACCTTAAATGAAGCCAC；
引物SMN-EX3-F，其序列为：CCCTCTTCAAAAGAAATGTGTGC；
引物SMN-EX3-R，其序列为：GTATCCTTACCTCTTGAGCATTTTGTT；
引物SMN-EX4-F，其序列为：GAGAATGAAAATGAAAGCCAAGTTTC；
引物SMN-EX4-R，其序列为：GCTTGATGTTATCTGATTTATTTCCAG；
引物SMN-EX5-F，其序列为：CTAAAATTCAATGGCCCACCA；
引物SMN-EX5-R，其序列为：CGATTAATAGTTTAACATACACTTTCGT；
引物SMN-EX6-F，其序列为：ACCTCCCATATGTCCAGATTCTCT；
引物SMN-EX6-R，其序列为：GAAAAGATGCTGAGTGATTACTTACCA；
引物SMN-EX7-F，其序列为：GTAAAATGTCTTGTGAAACAAAATGCT；
引物SMN-EX7-R，其序列为：GTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTG；
引物SMN-EX8-F，其序列为：AAAAGGAAGTGGAATGGGTAACTCT；
引物SMN-EX8-R，其序列为：AAAAGGAAGTGGAATGGGTAACTCT；
内参引物ACTB-F，其序列为：GCTCCATCCTGGCCTCGC；
内参引物ACTB-R，其序列为：AGAAGCATTTGCGGTGGACG；
所述15条探针为： 
探针SMN-EX1-P1，其序列为：TTGCCGCCGCTGCTCATCG；
探针SMN-EX1-P2，其序列为：CTTTCCAGGAGCGATGA；
探针SMN-EX2a-P，其序列为：AATGTCAGAAATCATCGC；
探针SMN-EX3-P1，其序列为：CTTCTGACTAAATGGC；
探针SMN-EX3-P2，其序列为：AAATAGGAGCAAAATC；
探针SMN-EX3-P3，其序列为：CAATCTGTAGCTAATAAT；
探针SMN-EX4-P，其序列为：GATGAAAGAGAAACTC；
探针SMN-EX5-P，其序列为：CACCCCACATACTATC；
探针SMN-EX6-P1，其序列为：TTGATGATGGGAATTAT；
探针SMN-EX6-P2，其序列为：CAATATGACAGCCAC；
探针SMN1-7P，其序列为：ATTTTGTCTGAAACCCTG；
探针SMN2-7P，其序列为：TGATTTTGTCTAAAACCCTG；
探针SMN-EX7-P，其序列为：CTTAATTTAAGGAATGTGAGCAC；
探针SMN-EX8-P，其序列为：CACCCCAGTCTTTTACAGAT；
内参探针ACTB-P，其序列为：CCACCTTCCAGCAGAT。
优选的，上述的脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针中，所述15条探针的5’端和3’端分别设有荧光基团和荧光淬灭基团，具体如下：
探针SMN-EX1-P1为：NED-TTGCCGCCGCTGCTCATCG-MGB；
探针SMN-EX1-P2为：NED-CTTTCCAGGAGCGATGA-MGB；
探针SMN-EX2a-P为：NED-AATGTCAGAAATCATCGC-MGB；
探针SMN-EX3-P1为：NED-CTTCTGACTAAATGGC-MGB；
探针SMN-EX3-P2为：NED-AAATAGGAGCAAAATC-MGB；
探针SMN-EX3-P3为：NED-CAATCTGTAGCTAATAAT-MGB；
探针SMN-EX4-P为：NED-GATGAAAGAGAAACTC-MGB；
探针SMN-EX5-P为：NED-CACCCCACATACTATC-MGB；
探针SMN-EX6-P1为：NED-TTGATGATGGGAATTAT-MGB；
探针SMN-EX6-P2为：NED-CAATATGACAGCCAC-MGB；
探针SMN1-7P为：FAM-ATTTTGTCTGAAACCCTG-MGB；
探针SMN2-7P为：VIC-TGATTTTGTCTAAAACCCTG-MGB；
探针SMN-EX7-P为：NED-CTTAATTTAAGGAATGTGAGCAC-MGB；
探针SMN-EX8-P为：NED-CACCCCAGTCTTTTACAGAT-MGB；
内参探针ACTB-P为：ROX-CCACCTTCCAGCAGAT-BHQ2。
本发明提供的另一技术方案为提供一种脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的试剂盒，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含上述的脊髓性 肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针。
优选的，上述的脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的试剂盒，所述PCR反应液包括如下含量的各组分：
本发明有益效果在于：本发明的脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针及试剂盒利用荧光定量PCR技术，增加现有专利技术中所没有的常见突变位点的检测，实现一次性特异的检测16种由于SMN基因缺失、转换与点突变导致的SMA患者并实现对SMA患者的分型。本发明试剂盒利用多重荧光定量PCR方法，四重荧光标记探针，分别采用FAM、VIC结合MGB技术标记SMN1、SMN2外显子7，选用ROX标记内参ACTB基因，进行相对定量根据外显子7基因拷贝数的变化实现对SMA患者的检测及分型，采用NED标记SMN1外显子8及其余13个位点上突变基因的检测并指导进行分型；扩增体系实现内参与目标基因的双标，防止假阴性的存在。
与目前现有方法相比，本发明不仅可以检测由于SMN基因缺失、转换导致的脊髓性肌萎缩症，而且还可以检测点突变导致的脊髓性肌萎缩症，能快速实现SMA疾病的临床诊断，有效的减少乃至避免重型脊髓性肌萎缩症重症患儿的 出生，为婚前、产前检测和孕期胎儿的诊断提供科学的依据。与现有临床使用的试剂盒相比，检测的点更全，对临床检测更具有指导意义；成本更低，是MLPA检测试剂盒价格的1/10左右，并且操作时间更短，满足临床低成本高通量的检测需求。
附图说明
图1为本发明试剂盒对样本浓度梯度的扩增结果；
图2为本发明试剂盒对同一样本进行5个浓度梯度分析目标基因与内参基因扩增效率的一致性的结果；
图3为本发明试剂盒PCR反应条件；
图4为本发明试剂盒PCR反应条件。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。
本发明最关键的构思在于：本发明利用多重荧光定量PCR方法，四重荧光标记探针，分别采用FAM、VIC结合MGB技术标记SMN1、SMN2外显子7，选用ROX标记内参ACTB基因，进行相对定量根据外显子7基因拷贝数的变化实现对SMA患者的检测及分型，采用NED标记SMN1外显子8及其余13个位点上突变基因的检测并指导进行分型，根据荧光信号实现对突变位点的检测；扩增体系实现内参与目标基因的双标，防止假阴性的存在。
实施例1
1、技术基础 
本发明采用Taq Man-MGB探针技术结合相对定量方法来进行分析。Taq Man探针的5′端标记有报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC、NED等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如TAMRA等，当探针完整时，两者可发生荧光共振能量传递(FRET)，检测不到荧光信号。当PCR扩增时，由于Taq酶的5′外切酶活性将探针水解，使荧光分子与淬灭分子间距增大，从而破坏其FRET，则荧光监测系统能检测到荧光信号。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信 号的强度。同时探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，且特异性高于普通的Taq Man探针，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。
现有荧光定量PCR法检测SMA均为单荧光或者多荧光标记探针对SMA进行检测，本发明采用四种标记探针，分别采用FAM、VIC结合MGB探针技术标记SMN1与SMN2外显子7实现SMA基因的缺失、转换及分型；采用NED探针标记检测SMN1外显子8缺失突变及其它与SMN蛋白功能区域有关的外显子突变点检测，包含Exon1(5C-G，22insA，81dupG)、Exon2a(91_92insT)、Exon3(305G-A，399_402delAGAG，439_433delGAAGT)、Exon4(509_510delGT)、Exon5(683T-A)、Exon6(768_780dudupTGCTGATGCTT，785G-T，815 A-G，821C-T)、Exon7(835 G-T)；采用ROX标记人类看家基因beta-actin为内参，实现了SMA患者的检测及分型需求，同时也实现了对稀有点突变的检测。实现了操作方便、成本低、检测时间短的目的。
一般PCR仅采用一对引物，而本发明采用多重PCR法(multiplex PCR)即多重核酸扩增法，同一PCR反应体系中含有两对以上引物对多个靶序列进行PCR检测。多重PCR有优势也有劣势，优势为：多重PCR具有高效性、经济简便性等特点，可以在同一反应管内同时检出多种基因型，可大大节省时间和成本，更能满足临床的要求；劣势为：多重PCR往往因为引物过多，引物之间发生相互反应，影响彼此的扩增效率。因此，在设计引物和探针的时候要格外注意应该避免引物与引物之间、引物与探针之间和探针与探针之间的交叉反应，尽量做到引物和探针越短越好、越少越好，相互之间无交叉反应，此劣势也为设计上的一大难点。本发明采用Taq Man MGB探针，在退火温度不变的情况下可减少探针长度，从而降低和引物及其他探针交叉反应的几率，提高扩增效率，提高产品的灵敏度。
本发明对脊髓性肌萎缩症SMN1与SMN2基因外显子区域序列进行比对分析，寻找能检测多种基因型的保守序列作为本发明的引物和探针，尽量减少总的引物和探针的数量，一方面提高扩增效率，另一方面降低成本，且通过分析 尽量满足各个序列之间无交叉反应。在进行反应体系优化时，为满足各个基因型扩增效率一致，需对各引物和探针浓度、反应体系中各个组分浓度进行调整，以获得最佳的扩增效率。本发明利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的引物、探针组合，以及反应体系中各个组分最优的浓度。
2、引物和探针的设计
2.1待测位点基因特异性序列位置的选取
由于SMN1与SMN2的高同源性，仅5个单碱基差异，其中两个单碱基位点分别在外显子7(C→T)和外显子8(G→A)，其余3个位点的突变均在内含子上，因此在其单碱基及突变点外围设计通用扩增的引物序列，在其特异检测位点设计检测探针序列，每个位点设计三对引物及三条探针序列，选取β-action为内存基因，在其高保守区域设计扩增序列及其特异的检测探针。
2.2引物、探针的筛选及确定
利用正交试验方法，在同一管中同时扩增目标序列及内参序列，通过大量实验对比筛选引物和探针，实验结果证明引物和探针序列左右平移或长度改变，实验结果均有很大不同。引物、探针太长会有非特异扩增信号，太短则扩增效率比较低，检测灵敏度下降。通过大量的实验优化最终确立的引物、探针和内参的引物、探针组合见表2、表3所示。因此本发明试剂盒扩增PCR反应液中SMA引物和探针包含9对引物、15条探针，可高效特异检测SMN1、SMN2外显子7的缺失及转换、SMN1外显子8的缺失及其13种常见的点突变；1对内参引物、1条探针检测可实现拷贝数的定量分析，同时作为内参监控实验的成败。
最终同一管中共9对引物15条探针可一次实现对SMA患者缺失的检测及分型及常规点突变的检测。此9对引物和15条探针是通过大量实验对比筛选得到，此引物和探针长度或位置的改变均会降低本发明试剂盒的灵敏度、特异性和重复性。
表2 本发明试剂盒的扩增引物序列
表3 本发明试剂盒的检测探针序列
3、引物、探针以及反应体系其他组分浓度确定
靶序列扩增引物和内参引物、探针终浓度选择50nM-500nM，MgCl2终浓度选择1.5mM-9mM，dN(U)TP终浓度选择100nM-300nM，Taq酶终浓度选择1-7.5U/反应，UNG选择0.05-0.3IU/反应，Probe qPCR buffer利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应体系见表4。
表4 PCR反应液配方 
注：DNA加样量为2μL，总反应体积为25μL。其中PCR buffer可为 http://www.promega.com.cn/Product.asp？Pro_ID＝2172&PostType＝Detail，货号：K1005S，5Xprobe qPCR buffer为天根生物，HA-Hotstar Taq组分http://www.tiangen.com.cn/？productShow/t1/2/id/312.html货号：ET108-02
4、反应条件：本发明采用含U(尿嘧啶)体系，UNG可以消除产物带来的污染。反应条件分以下步骤优化：具体反应条件如图3；
经过大量实验对比优化，最终确定的最佳反应条件为图4所示。
退火温度和退火时间对PCR扩增效率和特异性扩增影响较大，上述条件优化结果显示退火温度偏低会其有非特异性扩增信号导致假阳性结果、温度偏高扩增效率偏低，灵敏度下降。本实验通过控制退火温度和退火时间可以做到对无非特异性扩增信号，特异性好，扩增效率高，灵敏度可达0.5ng。检测总反应时间约为80min，与MLPA试剂盒相比缩短近20个小时。
5、结果分析及拷贝数定量的实现
突变位点的分析，对于突变点的检测可以直接根据荧光曲线结果进行判断，扣除背景的影响，在内参有较好扩增曲线的基础上；当荧光增量大于5000可以检测到有较强的NED荧光信号，即说明有突变位点的产生；反之无NED荧光信号则无突变点的产生。
拷贝数的分析参照文献(Kenneth J，et al.METHODS.2001；25:402–408.)的基本模式，采用ΔΔCt值法相对定量方式，其依据是每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。因此，比较不同待检样本中DNA的Ct值与正常样本Ct值的变化，就可对未知标本目的基因 的原始拷贝数做出判断。正常人群中，SMN1、SMN2和ACTB都是2个拷贝，定量检测时目的基因与参比序列的拷贝数相等而ΔCt值恒定(ΔΔCt＝0)，2-ΔΔCt值为1.0；如果某个体目的基因缺失了其中1个，定量检测时此基因的Ct值增高幅度为1，与参比序列比较所得的ΔCt值增幅也为1(ΔΔCt＝1)，所计算的2-ΔΔCt值为0.5，也就说明目的基因拷贝数只有参比序列的一半；反之如果两个都缺失，则不会有目的序列扩增。所以，根据此数值变化规律，以ΔΔCt值法相对定量方式，直接分析SMN1、SMN2基因目的序列的相对拷贝数，实现缺失型SMA的快速分子诊断及分型。
表5为相对拷贝数定量数据分析结果判定(荧光定量SD为0.25，根据我们的重复实验结果分析，确定标准差SD为正负0.2)，表6为SMA分型与拷贝数的关系。
表5 拷贝数与结果分析判定
备注：若2-ΔΔCt值为0.10-0.3或0.70-0.80或1.20-1.30此为临界值，须重新检测。
表6 SMA分型与拷贝数的关系
6、使用本发明专利对临床样本检测结果，表7为本发明试剂盒临床样本检测结果。
表7
使用本发明试剂盒对临床107例样本进行检测，检测结果与MLPA完全一致，同时对有突变位点的样本进行测序分析，测序结果显示均存在不同位点的突变，准确率达100％。对上述阳性样本进行重复性检测实验。选取3个批号产品，不同人(2人)操作，每次试验每个样本重复3次检测，评价试剂盒重复性，检测结果一致，试剂盒检测重复性良好。
请参阅图1为本发明试剂盒对样本浓度梯度扩增结果的示意图，横坐标为扩增的循环数，纵坐标为相应的荧光信号强度；结果显示Ct值与样本浓度梯度呈现较好的线性关系。
请参阅图2为本发明试剂盒对同一样本进行5个浓度梯度分析目标基因与内参基因扩增效率的一致性的结果示意图，结果显示扩增体系目标基因与内参 基因具有较好的扩增一致性，扩增效率相当，满足比较Ct法进行相对定量的必要条件。
7、产品性能指标：
(1)灵敏度：本发明试剂盒能稳定检出人血液基因组DNA的浓度在0.5ng；
(2)准确性：本发明试剂盒检测SMA患者的血液样本准确率达99％以上(在进行的107例样本中，阳性样本全检出，阴性无检测结果)；
(3)特异性：本发明试剂盒检测SMA患者的特异性达99％以上(107例样本重复检测结果基因型一致)；
(4)重复性：本发明试剂盒的重复性为99％以上；
(5)稳定性：本发明试剂盒产品在有效期内使用完全可满足以上各指标。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
。

Claims (4)

1.脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针，其特征在于，所述引物包括9对引物，所述探针包括15条探针；
所述9对引物为：
引物SMN-EX1-F，其序列为：ACATAACCTCTAACCAGGTAAGTTTCCT；
引物SMN-EX1-R，其序列为：TCAGTGCTGTATCATCCCAAATG；
引物SMN-EX2a-F，其序列为：AGTTGTTTTTATTTCTTACCCTTTCCA；
引物SMN-EX2a-R，其序列为：CATTTCATACCTTAAATGAAGCCAC；
引物SMN-EX3-F，其序列为：CCCTCTTCAAAAGAAATGTGTGC；
引物SMN-EX3-R，其序列为：GTATCCTTACCTCTTGAGCATTTTGTT；
引物SMN-EX4-F，其序列为：GAGAATGAAAATGAAAGCCAAGTTTC；
引物SMN-EX4-R，其序列为：GCTTGATGTTATCTGATTTATTTCCAG；
引物SMN-EX5-F，其序列为：CTAAAATTCAATGGCCCACCA；
引物SMN-EX5-R，其序列为：CGATTAATAGTTTAACATACACTTTCGT；
引物SMN-EX6-F，其序列为：ACCTCCCATATGTCCAGATTCTCT；
引物SMN-EX6-R，其序列为：GAAAAGATGCTGAGTGATTACTTACCA；
引物SMN-EX7-F，其序列为：GTAAAATGTCTTGTGAAACAAAATGCT；
引物SMN-EX7-R，其序列为：GTAAGTCTGCCAGCATTATGAAAGTG；
引物SMN-EX8-F，其序列为：AAAAGGAAGTGGAATGGGTAACTCT；
引物SMN-EX8-R，其序列为：AAAAGGAAGTGGAATGGGTAACTCT；
内参引物ACTB-F，其序列为：GCTCCATCCTGGCCTCGC；
内参引物ACTB-R，其序列为：AGAAGCATTTGCGGTGGACG；
所述15条探针为：
探针SMN-EX1-P1，其序列为：TTGCCGCCGCTGCTCATCG；
探针SMN-EX1-P2，其序列为：CTTTCCAGGAGCGATGA；
探针SMN-EX2a-P，其序列为：AATGTCAGAAATCATCGC；
探针SMN-EX3-P1，其序列为：CTTCTGACTAAATGGC；
探针SMN-EX3-P2，其序列为：AAATAGGAGCAAAATC；
探针SMN-EX3-P3，其序列为：CAATCTGTAGCTAATAAT；
探针SMN-EX4-P，其序列为：GATGAAAGAGAAACTC；
探针SMN-EX5-P，其序列为：CACCCCACATACTATC；
探针SMN-EX6-P1，其序列为：TTGATGATGGGAATTAT；
探针SMN-EX6-P2，其序列为：CAATATGACAGCCAC；
探针SMN1-7P，其序列为：ATTTTGTCTGAAACCCTG；
探针SMN2-7P，其序列为：TGATTTTGTCTAAAACCCTG；
探针SMN-EX7-P，其序列为：CTTAATTTAAGGAATGTGAGCAC；
探针SMN-EX8-P，其序列为：CACCCCAGTCTTTTACAGAT；
内参探针ACTB-P，其序列为：CCACCTTCCAGCAGAT。
2.根据权利要求1所述的脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针，其特征在于，所述15条探针的5’端和3’端分别设有荧光基团和荧光淬灭基团，具体如下：
探针SMN-EX1-P1为：NED-TTGCCGCCGCTGCTCATCG-MGB；
探针SMN-EX1-P2为：NED-CTTTCCAGGAGCGATGA-MGB；
探针SMN-EX2a-P为：NED-AATGTCAGAAATCATCGC-MGB；
探针SMN-EX3-P1为：NED-CTTCTGACTAAATGGC-MGB；
探针SMN-EX3-P2为：NED-AAATAGGAGCAAAATC-MGB；
探针SMN-EX3-P3为：NED-CAATCTGTAGCTAATAAT-MGB；
探针SMN-EX4-P为：NED-GATGAAAGAGAAACTC-MGB；
探针SMN-EX5-P为：NED-CACCCCACATACTATC-MGB；
探针SMN-EX6-P1为：NED-TTGATGATGGGAATTAT-MGB；
探针SMN-EX6-P2为：NED-CAATATGACAGCCAC-MGB；
探针SMN1-7P为：FAM-ATTTTGTCTGAAACCCTG-MGB；
探针SMN2-7P为：VIC-TGATTTTGTCTAAAACCCTG-MGB；
探针SMN-EX7-P为：NED-CTTAATTTAAGGAATGTGAGCAC-MGB；
探针SMN-EX8-P为：NED-CACCCCAGTCTTTTACAGAT-MGB；
内参探针ACTB-P为：ROX-CCACCTTCCAGCAGAT-BHQ2。
3.脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液中包含权利要求1-2任一项所述的脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的脊髓性肌萎缩症基因荧光定量检测的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括如下含量的各组分：
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112541A (zh) * 2015-09-22 2015-12-02 山东山大附属生殖医院有限公司 人类胚胎脊髓性肌萎缩症突变基因检测试剂盒
CN108048548A (zh) * 2017-11-07 2018-05-18 北京华瑞康源生物科技发展有限公司 人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量pcr试剂盒
CN108456726A (zh) * 2018-04-19 2018-08-28 深圳会众生物技术有限公司 脊髓性肌萎缩症基因检测探针、引物和试剂盒
CN113151419A (zh) * 2021-04-07 2021-07-23 深圳会众生物技术有限公司 脊髓性肌萎缩症检测方法
CN114480617A (zh) * 2021-12-30 2022-05-13 广州达安基因股份有限公司 Smn1基因拷贝数变异检测试剂盒
CN116144750A (zh) * 2022-11-10 2023-05-23 合肥行知生物技术有限公司 一种引物探针组、数字pcr试剂盒及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103614477A (zh) * 2013-11-27 2014-03-05 南方医科大学 一种诊断人类脊髓性肌萎缩症的荧光定量pcr试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103614477A (zh) * 2013-11-27 2014-03-05 南方医科大学 一种诊断人类脊髓性肌萎缩症的荧光定量pcr试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
林晓贞等: "脊髓性肌姜缩症患者SMN基因微小突变分析", 《第十一届全国神经病学学术会议论文汇编》, 1 August 2008 (2008-08-01), pages 652 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105112541A (zh) * 2015-09-22 2015-12-02 山东山大附属生殖医院有限公司 人类胚胎脊髓性肌萎缩症突变基因检测试剂盒
CN105112541B (zh) * 2015-09-22 2017-12-15 山东山大附属生殖医院有限公司 人类胚胎脊髓性肌萎缩症突变基因检测试剂盒
CN108048548A (zh) * 2017-11-07 2018-05-18 北京华瑞康源生物科技发展有限公司 人脊髓性肌萎缩症致病基因拷贝数检测荧光定量pcr试剂盒
CN108456726A (zh) * 2018-04-19 2018-08-28 深圳会众生物技术有限公司 脊髓性肌萎缩症基因检测探针、引物和试剂盒
CN113151419A (zh) * 2021-04-07 2021-07-23 深圳会众生物技术有限公司 脊髓性肌萎缩症检测方法
CN113151419B (zh) * 2021-04-07 2022-07-19 深圳会众生物技术有限公司 脊髓性肌萎缩症检测方法
CN114480617A (zh) * 2021-12-30 2022-05-13 广州达安基因股份有限公司 Smn1基因拷贝数变异检测试剂盒
CN116144750A (zh) * 2022-11-10 2023-05-23 合肥行知生物技术有限公司 一种引物探针组、数字pcr试剂盒及应用

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