CN113151419B

CN113151419B - 脊髓性肌萎缩症检测方法

Info

Publication number: CN113151419B
Application number: CN202110375305.0A
Authority: CN
Inventors: 刘晶晶; 刘福平
Original assignee: Shenzhen Huizhong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Huizhong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-04-07
Filing date: 2021-04-07
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2041-04-07
Also published as: CN113151419A

Abstract

本发明公开一种脊髓性肌萎缩症检测方法，其中，脊髓性肌萎缩症检测方法包括样本基因组DNA的提取、扩增引物和检测探针的设计及合成、荧光定量PCR反应、基因相对拷贝数的计算及碱基突变水平的分析。本发明脊髓性肌萎缩症检测方法可以实现对SMN1相对拷贝数、SMN2相对拷贝数及SMN1点突变的同时检测，检测全面，步骤简单，易于临床应用和推广。

Description

脊髓性肌萎缩症检测方法

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种脊髓性肌萎缩症检测方法。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy，SMA)是一种较常见的隐性遗传性疾病。根据SMA患者的发病年龄和临床表现分为4型：I型(严重型)、Ⅱ型(中间型)、Ⅲ型(轻型)和IV型(成人型)。SMA的致病基因SMN位于染色体5qll.2-13.3，存在2个同源性高度一致的拷贝，分别为端粒侧SMN1和着丝粒侧SMN2。SMN基因的终止密码子位于第7号外显子上，SMN1和SMN2的编码序列仅存在一个碱基的差异，即第7外显子内C>T的差异。

SMN1缺失是引起SMA的主要原因，约95％患者由SMN1第7外显子的缺失导致，极少部分由SMN1第7外显子缺失的同时伴随碱基的突变或其他变异导致。SMN1缺失大部分为第7外显子合并第8外显子共同缺失，由于SMN的终止密码子位于第7外显子上，第8外显子位于非编码区，所以SMN1的缺失通常指第7外显子的缺失。5％的SMA患者由SMN1基因发生碱基突变导致，其突变位点位于SMN1基因的不同功能区域可引起不同的临床表型。因为SMN2基因可以产生10％～15％具有功能的、结构稳定的SMN全长蛋白，被普遍认为是SMA的修饰基因，SMN2基因的拷贝数与疾病的临床表型和患者的生存时间相关，临床症状较轻的患者的SMN2基因拷贝数通常比症状严重的患者的拷贝数多。

目前，已有多种检测技术对SMA进行检测和诊断，例如一代测序、双侧双重AS-PCR、荧光定量PCR、多重连接探针扩增技术(MLPA)、二代测序、PCR-DHPLC等，但是现有检测方法的检测结果不够全面和准确。

上述内容仅用于辅助理解发明的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种脊髓性肌萎缩症检测方法，旨在解决现有检测方法的检测结果不够全面和准确的技术问题。

为实现上述目的，本发明提出一种脊髓性肌萎缩症检测方法，包括如下步骤：

(1)将包含样本基因组DNA、第一扩增引物组和第一检测探针组的第一反应管放入荧光定量PCR仪中，将包含样本基因组DNA、第二扩增引物组和第二检测探针组的第二反应管放入荧光定量PCR仪中；所述第一反应管和所述第二反应管在荧光定量PCR仪中进行PCR反应；

(2)荧光定量PCR仪检测所述第一反应管和所述第二反应管产生的荧光强度，通过测得的荧光强度值计算所述第一反应管中相应序列的相对拷贝数，及通过得到的熔解曲线分析所述第二反应管中的序列是否发生碱基突变；

其中，所述第一扩增引物组用以分别特异性地扩增SMN1基因第7外显子、SMN2基因第7外显子及内参基因，所述第一检测探针组用以分别特异性地检测SMN1基因、SMN2基因及内参基因分别经由所述第一扩增引物组扩增后的序列；所述第二扩增引物组用以分别特异性地扩增SMN1基因的多个突变位点，所述第二检测探针组用以分别特异性地检测SMN1基因经由所述第二扩增引物组扩增后的序列。

可选地，所述第一扩增引物组包括P1-SMN-EX7-F、P2-SMN-EX7-R、P1及P2；其中，所述P1-SMN-EX7-F的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；所述P2-SMN-EX7-R的核苷酸序列如SEQID No：2所示；所述P1的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；所述P2的核苷酸序列如SEQ IDNo：4所示。

可选地，所述第一扩增引物组还包括P1-ACTB-F及P2-ACTB-R；其中，所述P1-ACTB-F的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示；所述P2-ACTB-R的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示。

可选地，所述第一检测探针组包括SMN1-7及SMN2-7；其中，所述SMN1-7包括如SEQID No：7所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述SMN2-7包括如SEQ ID No：8所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团。

可选地，所述核苷酸序列一的5’端连接VIC荧光基团，3’端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列二的5’端连接FAM荧光基团，3’端连接MGB淬灭基团。

可选地，所述第一检测探针组包括ACTB-P，所述ACTB-P包括如SEQ ID No：9所示的核苷酸序列三和分别连接所述核苷酸序列三的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团。

可选地，所述核苷酸序列三的5’端连接CY5荧光基团，3’端连接BHQ3淬灭基团。

可选地，所述第二扩增引物组包括EX1-F、EX1-R、EX2a-F、EX2a-R、EX3-F、EX3-R、EX5-F、EX5-R、EX6-F、EX6-R、EX7-F及EX7-R；其中，所述EX1-F的核苷酸序列如SEQ ID No：10所示；所述EX1-R核苷酸序列如SEQ ID No：11所示；所述EX2a-F核苷酸序列如SEQ ID No：12所示；所述EX2a-R核苷酸序列如SEQ ID No：13所示；所述EX3-F核苷酸序列如SEQ ID No：14所示；所述EX3-R核苷酸序列如SEQ ID No：15所示；所述EX5-F核苷酸序列如SEQ ID No：16所示；所述EX5-R核苷酸序列如SEQ ID No：17所示；所述EX6-F核苷酸序列如SEQ ID No：18所示；所述EX6-R核苷酸序列如SEQ ID No：19所示；所述EX7-F核苷酸序列如SEQ ID No：20所示；所述EX7-R核苷酸序列如SEQ ID No：21所示。

可选地，所述第二检测探针组包括-39P、-7A5P、22P、40A43P、56P、84P、326P、400P、683A689P、744P、811P、830P、835P及863P；其中，所述-39P包括如SEQ ID No：22所示的核苷酸序列四和分别连接所述核苷酸序列四的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述-7A5P包括如SEQ ID No：23所示的核苷酸序列五和分别连接所述核苷酸序列五的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述22P包括如SEQ ID No：24所示的核苷酸序列六和分别连接所述核苷酸序列六的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述40A43P包括如SEQ ID No：25所示的核苷酸序列七和分别连接所述核苷酸序列七的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述56P包括如SEQ ID No：26所示的核苷酸序列八和分别连接所述核苷酸序列八的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述84P包括如SEQ ID No：27所示的核苷酸序列九和分别连接所述核苷酸序列九的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述326P包括如SEQ ID No：28所示的核苷酸序列十和分别连接所述核苷酸序列十的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述400P包括如SEQ ID No：29所示的核苷酸序列十一和分别连接所述核苷酸序列十一的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述683A689P包括如SEQ ID No：30所示的核苷酸序列十二和分别连接所述核苷酸序列十二的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述744P包括如SEQ ID No：31所示的核苷酸序列十三和分别连接所述核苷酸序列十三的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述811P包括如SEQ ID No：32所示的核苷酸序列十四和分别连接所述核苷酸序列十四的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述830P包括如SEQ ID No：33所示的核苷酸序列十五和分别连接所述核苷酸序列十五的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述835P包括如SEQ ID No：34所示的核苷酸序列十六和分别连接所述核苷酸序列十六的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述863P包括如SEQ ID No：35所示的核苷酸序列十七和分别连接所述核苷酸序列十七的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团。

可选地，所述核苷酸序列四～七的5’端分别连接FAM荧光基团，3’端分别连接BHQ1淬灭基团；所述核苷酸序列八～十一的5’端分别连接VIC荧光基团，3’端分别连接BHQ1淬灭基团；所述核苷酸序列十二～十四的5’端分别连接ROX荧光基团，3’端分别连接BHQ2淬灭基团；所述核苷酸序列十五～十七的5’端分别连接CY5荧光基团，3’端分别连接BHQ3淬灭基团。

本发明脊髓性肌萎缩症检测方法包括以下步骤：(1)将包含样本基因组DNA、第一扩增引物组和第一检测探针组的第一反应管放入荧光定量PCR仪中，将包含样本基因组DNA、第二扩增引物组和第二检测探针组的第二反应管放入荧光定量PCR仪中；所述第一反应管和所述第二反应管在荧光定量PCR仪中进行PCR反应；(2)荧光定量PCR仪检测所述第一反应管和所述第二反应管产生的荧光强度，通过测得的荧光强度值计算所述第一反应管中相应序列的相对拷贝数，及通过得到的熔解曲线分析所述第二反应管中的序列是否发生碱基突变；其中，所述第一扩增引物组用以分别特异性地扩增SMN1基因第7外显子、SMN2基因第7外显子及内参基因，所述第一检测探针组用以分别特异性地检测SMN1基因、SMN2基因及内参基因分别经由所述第一扩增引物组扩增后的序列；所述第二扩增引物组用以分别特异性地扩增SMN1基因的多个突变位点，所述第二检测探针组用以分别特异性地检测SMN1基因经由所述第二扩增引物组扩增后的序列。

如此，通过本发明脊髓性肌萎缩症检测方法，一次PCR实验就可以同时得到SMN1基因的相对拷贝数、SMN2基因的相对拷贝数及SMN1基因碱基突变的结果，可以检测到：SMN1基因第7外显子未缺失同时未发生碱基突变，SMN1基因第7外显子缺失同时未发生碱基突变，SMN1基因第7外显子未缺失但发生碱基突变，SMN1基因第7外显子缺失同时发生碱基突变四种结果，也即检测范围涵盖了SAM中约95％的SMN1第7外显子缺失和约5％的SMN1点突变，可以明确患者SMN1基因的突变类型，对SMA患者的检出率达到100％；并且，本发明检测方法也可以同时得到SMN2的拷贝数，这对于初步判断患者的临床分型起到重要的参考意义；因此，本发明脊髓性肌萎缩症检测方法检测范围全面，检测结果准确，具有重要的临床应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为PCR蝎尾扩增示意图；

图2为实施例一样本SMN1基因、SMN2基因的拷贝数检测结果图；

图3为实施例一野生型样本在FAM通道的熔解曲线图；

图4为实施例一野生型样本在VIC通道的熔解曲线图；

图5为实施例一野生型样本在ROX通道的熔解曲线图；

图6为实施例一野生型样本在CY5通道的熔解曲线图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

需要说明，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，全文中出现的“和/或”的含义为，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案，或B方案，或A和B同时满足的方案。

本发明提出一种脊髓性肌萎缩症检测方法。

本发明提出的脊髓性肌萎缩症检测方法包括如下步骤：(1)将包含样本基因组DNA、第一扩增引物组和第一检测探针组的第一反应管放入荧光定量PCR仪中，将包含样本基因组DNA、第二扩增引物组和第二检测探针组的第二反应管放入荧光定量PCR仪中；所述第一反应管和所述第二反应管在荧光定量PCR仪中进行PCR反应；(2)荧光定量PCR仪检测所述第一反应管和所述第二反应管产生的荧光强度，通过测得的荧光强度值计算所述第一反应管中相应序列的相对拷贝数，及通过得到的熔解曲线分析所述第二反应管中的序列是否发生碱基突变；其中，所述第一扩增引物组用以分别特异性地扩增SMN1基因第7外显子、SMN2基因第7外显子及内参基因，所述第一检测探针组用以分别特异性地检测SMN1基因、SMN2基因及内参基因分别经由所述第一扩增引物组扩增后的序列；所述第二扩增引物组用以分别特异性地扩增SMN1基因的多个突变位点，所述第二检测探针组用以分别特异性地检测SMN1基因经由所述第二扩增引物组扩增后的序列。

在本发明检测方法中，所述内参基因可以为β-actin，β-actin属于管家基因，广泛分布于细胞浆内，且在细胞中的表达相对恒定，是荧光定量PCR反应常用的内参。所述SMN1基因和所述SMN2基因的相对拷贝数可以通过比较Ct法计算。具体地，比较Ct法可以按下述公式进行计算：待检样本(或对照样本)目的基因ΔCt＝Ct_目的基因-Ct_内参基因；待检样本目的基因ΔΔCt＝ΔCt_待检样本－ΔCt_对照样本；待检样本目的基因表达值＝2^-ΔΔCt。在正常人群中，SMN1基因、SMN2基因和β-actin基因都是2个拷贝，因此，SMN1基因、SMN2基因的2^-ΔΔCt值均为1.0。如果某个个体中的SMN1基因或者SMN2基因缺失了一个拷贝，定量检测时此基因的Ct值增高幅度为1，与β-actin基因比较所得的ΔCt值增幅也为1(ΔΔCt＝1)，所计算的2^-ΔΔCt值为0.5(拷贝数只有β-actin基因的一半)。如果两个拷贝都缺失，则不会有目的序列扩增(2^-ΔΔCt值为0)。SMN1基因的突变位点可以通过熔解曲线分析技术进行分析。熔解曲线分析技术基于单核苷酸熔解温度的不同而形成不同形态的熔解曲线，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异、结果准确、不受检测位点的局限。

本发明脊髓性肌萎缩症检测方法，通过一次PCR实验就可以同时得到SMN1基因的相对拷贝数、SMN2基因的相对拷贝数及SMN1基因碱基突变的结果，可以检测到：SMN1基因第7外显子未缺失同时未发生碱基突变，SMN1基因第7外显子缺失同时未发生碱基突变，SMN1基因第7外显子未缺失但发生碱基突变，SMN1基因第7外显子缺失同时发生碱基突变四种结果，也即检测范围涵盖了SAM中约95％的SMN1第7外显子缺失和约5％的SMN1点突变，可以明确患者SMN1基因的突变类型，对SMA患者的检出率达到100％；并且，本发明检测方法也可以同时得到SMN2的相对拷贝数，这对于初步判断患者的临床分型起到重要的参考意义；因此，本发明脊髓性肌萎缩症检测方法检测范围全面，检测结果准确，具有重要的临床应用价值。

下面对所述第一扩增引物组、所述第一检测探针组、所述第二扩增引物组及所述第二检测探针组进行具体介绍。

可选地，所述第一扩增引物组包括P1-SMN-EX7-F、P2-SMN-EX7-R、P1及P2；其中，所述P1-SMN-EX7-F的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；所述P2-SMN-EX7-R的核苷酸序列如SEQID No：2所示；所述P1的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；所述P2的核苷酸序列如SEQ IDNo：4所示。可选地，所述第一扩增引物组还包括P1-ACTB-F及P2-ACTB-R；其中，所述P1-ACTB-F的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示；所述P2-ACTB-R的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示。所述P1-SMN-EX7-F和所述P2-SMN-EX7-R用以扩增SMN1/2的Exon7。所述P1和所述P2用以扩增蝎尾序列。所述P1-ACTB-F和所述P2-ACTB-R用以扩增β-actin内参基因。

根据国内外对SMA基因的研究结果，从Genebank数据库中调取相关基因组的全序列进行比对分析，用Primer5.0和Oligo6.0设计特异性扩增SMN1基因和SMN2基因的引物。请参阅图1，本发明设计双重扩增系统，所述第一扩增引物组中的所述P1-SMN-EX7-F和所述P2-SMN-EX7-R为蝎尾引物，具体地，所述P1-SMN-EX7-F包括位于5'端的第一序列段和连接所述第一序列段的位于3'端的第二序列段，所述第一序列段与SMN1基因无法发生特异性互补配对，所述第二序列段可以与SMN1基因发生特异性互补配对。所述P2-SMN-EX7-R包括位于5'端的第三序列段和连接所述第三序列段的位于3'端的第四序列段，所述第三序列段与SMN2基因无法发生特异性互补配对，所述第四序列段可以与SMN2基因发生特异性互补配对。这样，经过一轮PCR反应后，扩增后的序列相比原模板序列，5'端延长增加了所述第一序列段(或与所述第一序列段互补的序列)，3'端延长增加了与所述第三序列段互补的序列(或所述第三序列段)。

所述P1、P2为通用引物，根据细菌16S保守区设计，与人类基因组匹配较低，可以避免非特异结合。所述P1的序列与所述第一序列段的序列一致，所述P2的序列与所述第三序列段的序列一致，从而所述P1、所述P2可以扩展出蝎尾序列。以扩增延长后的序列为模板，所述P1、所述P2为引物，进行第二轮PCR扩增。这样设置，二轮PCR的反应温度和反应时间比较统一，定量体系的扩增具有高度一致性。

可选地，所述第一检测探针组包括SMN1-7及SMN2-7；其中，所述SMN1-7包括如SEQID No：7所示的核苷酸序列一和分别连接所述核苷酸序列一的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述SMN2-7包括如SEQ ID No：8所示的核苷酸序列二和分别连接所述核苷酸序列二的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团。荧光基团和淬灭基团的种类具有多种，例如，可选地，所述核苷酸序列一的5’端连接VIC荧光基团，3’端连接MGB淬灭基团；所述核苷酸序列二的5’端连接FAM荧光基团，3’端连接MGB淬灭基团。可选地，所述第一检测探针组包括ACTB-P，所述ACTB-P包括如SEQ ID No：9所示的核苷酸序列三和分别连接所述核苷酸序列三的5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团。可选地，所述核苷酸序列三的5’端连接CY5荧光基团，3’端连接BHQ3淬灭基团。所述SMN1-7用以结合SMN1的Exon7。所述SMN2-7用以结合SMN2的Exon7，所述ACTB-P用以结合β-actin。

本发明检测方法采用Taqman-MGB探针，Taqman-MGB探针具有高错配区分辩别能力，且不产生荧光，本底信号的强度较低，相比普通探针具有序列更短、特异性更高的优势。

可选地，所述第二扩增引物组包括EX1-F、EX1-R、EX2a-F、EX2a-R、EX3-F、EX3-R、EX5-F、EX5-R、EX6-F、EX6-R、EX7-F及EX7-R；其中，所述EX1-F的核苷酸序列如SEQ ID No：10所示；所述EX1-R核苷酸序列如SEQ ID No：11所示；所述EX2a-F核苷酸序列如SEQ ID No：12所示；所述EX2a-R核苷酸序列如SEQ ID No：13所示；所述EX3-F核苷酸序列如SEQ ID No：14所示；所述EX3-R核苷酸序列如SEQ ID No：15所示；所述EX5-F核苷酸序列如SEQ ID No：16所示；所述EX5-R核苷酸序列如SEQ ID No：17所示；所述EX6-F核苷酸序列如SEQ ID No：18所示；所述EX6-R核苷酸序列如SEQ ID No：19所示；所述EX7-F核苷酸序列如SEQ ID No：20所示；所述EX7-R核苷酸序列如SEQ ID No：21所示。所述EX1-F和所述EX1-R检测c.-39A>G、c.-7_9del、c.5C>G、c.22dupA、c.40G>T、c.43C>T和c.56delT位点。所述EX2a-F和所述EX2a-R检测c.84C>T位点。所述EX3-F和所述EX3-R检测c.326A>G和c.400G>A位点。所述EX5-F和所述EX5-R检测c.683T>A和c.689C>T位点。所述EX6-F和所述EX6-R检测c.744delC，c.811_814dup和c.830A>G位点。所述EX7-F和所述EX7-R检测c.835-5T>G，c.835-1G>A和c.863G>T位点。

可选地，所述核苷酸序列四～七的5’端分别连接FAM荧光基团，3’端分别连接BHQ1淬灭基团；所述核苷酸序列八～十一的5’端分别连接VIC荧光基团，3’端分别连接BHQ1淬灭基团；所述核苷酸序列十二～十四的5’端分别连接ROX荧光基团，3’端分别连接BHQ2淬灭基团；所述核苷酸序列十五～十七的5’端分别连接CY5荧光基团，3’端分别连接BHQ3淬灭基团。所述-39P检测c.-39A>G位点。所述-7A5P检测c.-7_9del和c.5C>G位点。所述22P检测c.22dupA位点。所述40A43P检测c.40G>T和c.43C>T位点。所述56P检测c.56delT位点。所述84P检测c.84C>T。所述326P检测c.326A>G位点。所述400P检测c.400G>A位点。所述683A689P检测c.683T>A和c.689C>T位点。所述744P检测c.744delC位点。所述811P检测c.811_814dupGGCT位点。所述830P检测c.830A>G位点。所述835P检测c.835-1G>A和c.835-5T>G位点。所述863P检测c.863G>T位点。实施例一、荧光定量PCR反应

1)样本基因组DNA的准备

样本可以为人血液样本、口腔细胞样本及羊水样本。采用微量样本基因组DNA提取试剂盒提取上述样本中的基因组DNA，并采用Nanodrop2000测定提取的DNA的浓度与纯度值，将其稀释至合适的浓度后进行后续实验。基因组DNA的提取请参阅提取试剂盒说明书。

2)引物和探针的设计

所述第一扩增引物组、所述第一检测探针组、所述第二扩增引物组及所述第二检测探针组的具体信息请参阅前文。

3)PCR反应

本检测方法采用UNG酶防污染体系，可以有效降低荧光定量PCR产物的污染。

本发明采用正交试验方法，验证发现，所述第一扩增引物组、所述第一检测探针组、所述第二扩增引物组及所述第二检测探针组的终浓度可以为大于或等于50nM，且小于或等于500nM；dN(U)TP的终浓度可以为大于或等于100nM，且小于或等于300nM；Taq酶的终浓度可以为大于或等于1U/反应，且小于或等于7.5U/反应；UNG的终浓度可以为大于或等于0.05IU/反应，且小于或等于0.3IU/反应。PCR反应的最优体系请参阅表1和表2。本发明检测方法也对PCR反应条件进行了优化，PCR反应条件请参阅表3，PCR最优反应条件请参阅表4。

表1第一反应管的PCR最优反应体系

试剂	每管(μL)
		样本	2
10×PCR buffer(TIANGEN)	2
		5×Probe qPCR Buffer(TIANGEN)	5
2.5mM dN(U)TP	2
		10mM dUTP	0.5
100uM P1-SMN-EX7-F	0.06
		100μM P1-SMN-EX7-R	0.06
100uM P1	0.05
		100μM P2	0.05
100uM ACTB-F	0.05
		100μM ACTB-R	0.05
SMN1-7	0.04
		SMN2-7	0.04
ACTB-P	0.03
		5U/μL Taq酶(TIANGEN)	0.5
1U/μL UNG	0.1
		ddH<sub>2</sub>O	11.97
总量	25

表2第二反应管的PCR最优反应体系

表3 PCR反应条件

表4 PCR最优反应条件

优化后的PCR反应无非特异性扩增，扩增效率高，灵敏度可达0.5ng，总反应时长约为1.5小时，与现有技术相比，总反应时长缩短了近20个小时，大大节省了反应时间。

4)相对拷贝数定量结果分析

相对拷贝数定量结果的分析判定请参阅表5。本检测方法通过分析多次重复实验的结果，确定标准差SD为±0.25。

表5相对拷贝数定量结果的分析判定

在本实施例中，若表达值(2^-ΔΔCt)为临界值0.25、0.75、1.25、1.75或2.25，重新对样本进行检测。请参阅图2，图2为六个样本(样本一、样本二、样本三、样本四、样本五、样本六)及阳性对照的结果。结果表明，六个检测样本的SMN1基因、SMN2基因的表达值(2^-ΔΔCt)均在0.75～1.25范围内，即六个检测样本的SMN1基因、SMN2基因的相对拷贝数均为2。

5)SMN1碱基突变结果分析

图3至图6分别为野生型样本在FAM通道、VIC通道、ROX通道及CY5通道中的熔解曲线图。其中，野生型样本在FAM通道的Tm值范围：c.-39A>G为52.8℃±1℃；c.-7_9del和c.5C>G为45.5℃±1℃；c.22dupA为67.1℃±1℃；c.40G>T和c.43C>T为59.9℃±1℃。野生型样本在VIC通道的Tm值范围：c.56delT为48.3℃±1℃；c.84C>T为61.6℃±1℃；c.326A>G为67.4℃±1℃；c.400G>A为56.1℃±1℃。野生型样本在ROX通道的Tm值范围：c.683T>A和c.689C>T为58.2℃±1℃；c.744delC为51.7℃±1℃；c.811_814dupGGCT为47.8℃±1℃。野生型样本在CY5通道的Tm值范围：c.830A>G为53.8℃±1℃；c.835-1G>A和c.835-5T>G为68.7℃±1℃；c.863G>T为60.1℃±1℃。各位点突变型在对应通道中的△Tm值波动范围结果请参阅表6。

表6各位点突变型在对应通道中的△Tm值波动范围结果

实施例二

采用本发明检测方法，对150例临床样本进行检测，检测结果与MLPA和Sanger测序法进行对比。检测结果请参阅表7。

表7临床样本检测结果

表7中的数据显示，本发明检测方法的检测结果与现有技术(MLPA和Sanger测序法)的检测结果完全一致，说明本发明检测方法的准确性为100％，本发明检测方法可信度很高，可以用于临床检测。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳会众生物技术有限公司

<120> 脊髓性肌萎缩症检测方法

<130>

<160> 35

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

taatggccta ccaaggcgaa gctatctata tatagctatc 40

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ttagggttgt aaagctcttt gctggcagac ttactcc 37

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

taatggccta ccaaggcga 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ttagggttgt aaagctctt 19

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

taatggccta ccaaggcgac atccacgaaa ctaccttcaa 40

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ttagggttgt aaagctcttc ttctgcatcc tgtcggc 37

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cttacagggt ttcagacaaa a 21

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

cagggtttta gacaaaatc 19

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ggcatggagt cctgtggcat c 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

atgtgggagg gcgataacc 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

aggctgcgga aggagagtt 19

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

agtcacataa cctctaacca gg 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

cctttccaaa tgaataacga g 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

ctaccctcta tccttcacct cc 22

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

tctcatctag tctctgcttc cag 23

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

ttatcctttt ggttttgagt cc 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

gagcactgca tctgggtaac 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

tgggcaacat agcaagacct 20

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

caagagtaat ttaagcctca gacag 25

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

gtctcattat gttgcccagg 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

ccacaaacca taaagtttta c 21

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

actcttaaga agggacgg 18

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

atggcgatga gcagcggc 18

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

ccaccactgc cgccgct 17

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

gtcccggagc aggagga 17

<210> 26

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

gattccgtgc tgtt 14

<210> 27

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

ttccagagcg atgatt 16

<210> 28

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

gcatttaccc agcta 15

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

gaaatagaga ggagcaaaa 19

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

ccccacttac tatcatgctg 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

caccacctcc catatgtcca 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

agtggctatc atactggcta 20

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 33

catactggct attatatggt aag 23

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 34

ttttccttac agggtttcag 20

<210> 35

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 35

gaaggaaggt gctcac 16

Claims

1.一种用于检测SMN1基因的相对拷贝数、SMN2基因的相对拷贝数及SMN1基因碱基突变的引物组和探针组在制备检测脊髓性肌萎缩症试剂中的应用，其特征在于，所述脊髓性肌萎缩症试剂包括：

第一扩增引物组，用以分别特异性地扩增SMN1基因第7外显子、SMN2基因第7外显子及内参基因；

第一检测探针组，用以分别特异性地检测SMN1基因、SMN2基因及内参基因分别经由所述第一扩增引物组扩增后的序列；其中，所述内参基因为β-actin内参基因；

第二扩增引物组，用以分别特异性地扩增SMN1基因的多个突变位点；其中，多个突变位点为c.-39A＞G、c.-7_9del、c.5C＞G、c.22dupA、c.40G＞T、c.43C＞T、c.56delT、c.84C＞T、c.326A＞G、c.400G＞A、c.683T＞A、c.689C＞T、c.744delC、c.811_814dup、c.830A＞G、c.835-5T＞G、c.835-1G及c.863G＞T；

第二检测探针组，用以分别特异性地检测SMN1基因经由所述第二扩增引物组扩增后的序列；

还包括上述脊髓性肌萎缩症试剂的使用方法：

(2)荧光定量PCR仪检测所述第一反应管和所述第二反应管产生的荧光强度，通过测得的荧光强度值计算所述第一反应管中相应序列的相对拷贝数，及通过得到的熔解曲线分析所述第二反应管中的序列是否发生碱基突变。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一扩增引物组包括P1-SMN-EX7-F、P2-SMN-EX7-R、P1及P2；

其中，所述P1-SMN-EX7-F的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示；所述P2-SMN-EX7-R的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示；所述P1的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示；所述P2的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述第一扩增引物组还包括P1-ACTB-F及P2-ACTB-R；

其中，所述P1-ACTB-F的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示；所述P2-ACTB-R的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第一检测探针组包括SMN1-7及SMN2-7；

其中，所述SMN1-7包括如SEQ ID No：7所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述SMN2-7包括如SEQ ID No：8所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述SMN1-7的5’端连接VIC荧光基团，3’端连接MGB淬灭基团；所述SMN2-7的5’端连接FAM荧光基团，3’端连接MGB淬灭基团。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述第一检测探针组包括ACTB-P，所述ACTB-P包括如SEQ ID No：9所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述ACTB-P的5’端连接CY5荧光基团，3’端连接BHQ3淬灭基团。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二扩增引物组包括EX1-F、EX1-R、EX2a-F、EX2a-R、EX3-F、EX3-R、EX5-F、EX5-R、EX6-F、EX6-R、EX7-F及EX7-R；

其中，所述EX1-F的核苷酸序列如SEQ ID No：10所示；所述EX1-R核苷酸序列如SEQ IDNo：11所示；所述EX2a-F核苷酸序列如SEQ ID No：12所示；所述EX2a-R核苷酸序列如SEQ IDNo：13所示；所述EX3-F核苷酸序列如SEQ ID No：14所示；所述EX3-R核苷酸序列如SEQ IDNo：15所示；所述EX5-F核苷酸序列如SEQ ID No：16所示；所述EX5-R核苷酸序列如SEQ IDNo：17所示；所述EX6-F核苷酸序列如SEQ ID No：18所示；所述EX6-R核苷酸序列如SEQ IDNo：19所示；所述EX7-F核苷酸序列如SEQ ID No：20所示；所述EX7-R核苷酸序列如SEQ IDNo：21所示。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述第二检测探针组包括-39P、-7A5P、22P、40A43P、56P、84P、326P、400P、683A689P、744P、811P、830P、835P及863P；

其中，所述-39P包括如SEQ ID No：22所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述-7A5P包括如SEQ ID No：23所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述22P包括如SEQ IDNo：24所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述40A43P包括如SEQ ID No：25所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述56P包括如SEQ ID No：26所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述84P包括如SEQ ID No：27所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述326P包括如SEQ ID No：28所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述400P包括如SEQ ID No：29所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述683A689P包括如SEQ ID No：30所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述744P包括如SEQ ID No：31所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述811P包括如SEQ ID No：32所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述830P包括如SEQ ID No：33所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述835P包括如SEQ IDNo：34所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团；所述863P包括如SEQ ID No：35所示的核苷酸序列和分别连接在所述核苷酸序列5’端的荧光基团和3’端的淬灭基团。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述-39P、所述-7A5P、所述22P及所述40A43P的5’端分别连接FAM荧光基团，3’端分别连接BHQ1淬灭基团；所述56P、所述84P、所述326P及所述400P的5’端分别连接VIC荧光基团，3’端分别连接BHQ1淬灭基团；所述683A689P、所述744P及所述811P的5’端分别连接ROX荧光基团，3’端分别连接BHQ2淬灭基团；所述830P、所述835P及所述863P的5’端分别连接CY5荧光基团，3’端分别连接BHQ3淬灭基团。