CN114317714B - 用于检测slc22a5基因九种高频致病变异的荧光定量pcr引物、探针及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增SLC22A5基因八个高频致病变异位点（含九种变异）的引物、针对所述变异位点的MGB探针、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液体系及ROX参比荧光染料；所述引物的序列如SEQ ID NO.1‑16所示，所述MGB探针的序列如SEQ ID NO.17‑33所示。本发明的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒，既可以使用人基因组DNA溶液作为模板，也可以使用未溶血的全血作为模板直接检测，适合在临床推广；采用本发明的试剂盒，能够在较短的时间内实现原发性肉碱缺乏症携带者与患者的筛查。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体来说，涉及一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒。
背景技术
原发性肉碱缺乏症(Primary Carnitine Deficiency，简称PCD)是一种常染色体隐性遗传病，其临床特点为肉碱代谢出现异常。该病的致病基因为编码有机阳离子转运2型(OCTN2)的SLC22A5基因。
目前国内外对于原发性肉碱缺乏症筛查方法有全基因组Sanger测序、串联质谱、临床检查。其中全基因的测序费用过高，很难满足目前临床实际需求。
相比较而言，荧光PCR是针对遗传物质DNA/RNA进行检测的手段，准确度较高，但目前还没有专门针对SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物、探针和试剂盒。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物和探针，包括用于扩增SLC22A5基因八个高频致病变异位点(含九种变异)的引物以及针对所述变异位点的MGB探针，所述引物的序列如SEQ ID NO.1-16所示，所述MGB探针的序列如SEQ ID NO.17-33所示。
进一步地，所述探针的5'端均标记荧光基团，所述探针的3'端均标记MGB。
进一步地，所述荧光基团包括FAM、VIC、NED、CY5。
进一步地，所述SLC22A5基因九种高频致病变异为NM_003060.3(SLC22A5):c.760C>T、NM_003060.3(SLC22A5):c.428C>T、NM_003060.3(SLC22A5):c.338G>A、NM_003060.3(SLC22A5):c.1195C>T、NM_003060.3(SLC22A5):c.51C>G、NM_003060.3(SLC22A5):c.51A>G、NM_003060.3(SLC22A5):c.844C>T、NM_003060.3(SLC22A5):c.797C>T及NM_003060.3(SLC22A5):c.1400C>G。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR试剂盒，包括用于扩增SLC22A5基因八个高频致病变异位点的引物、针对所述变异位点的MGB探针、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液体系及ROX参比荧光染料；所述引物的序列如SEQ ID NO.1-16所示，所述MGB探针的序列如SEQ ID NO.17-33所示。
进一步地，所述试剂盒的检测反应包含8个PCR反应，所述8个PCR反应分别在独立的PCR管中进行。
进一步地，当DNA模板中含有所述九种高频致病变异的任何一种时，对应的反应孔中FAM和VIC双通道都出现明显的扩增曲线，且FAM通道和VIC通道的Ct值差距不大于1.0。
进一步地，对于野生型的位点，对应的反应孔中仅能观察到VIC通道出现明显的扩增曲线，且FAM通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0。
进一步地，当所述八个高频变异位点中某一个位点为纯合突变时，对应的反应孔中FAM通道出现明显的扩增曲线，且VIC通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0。
本发明的有益效果：本发明的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒，既可以使用人基因组DNA溶液作为模板，也可以使用未溶血的全血作为模板直接检测，省去了DNA提取的过程；该反应体系的探针/引物群经过优化，同一反应管内可以容纳最多两个等位基因，且等位基因之间的扩增效率差异达到最大化，使实验人员可以方便准确的解读结果，不需要进行内参基因的比对或使用delta-delta-Ct法进行计算分析；该反应体系既适用于Ct值的判读，也可以使用终点法进行判读；该反应体系可以覆盖95％以上的患者，并且覆盖80％以上的已知致病变异位点。相较于NGS和其他检测手段，荧光定量PCR的成本低廉，准确性得到公认，适合在临床推广；采用本发明的试剂盒，能够在较短的时间内实现原发性肉碱缺乏症携带者与患者的筛查。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明实施例所述的使用野生型人DNA作为模板得到的实验结果；
图2是根据本发明实施例所述的使用纯合突变的质粒DNA作为模板得到的实验结果；
图3是根据本发明实施例所述的使用杂合型DNA作为模板得到的实验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物和探针，包括用于扩增SLC22A5基因八个高频致病变异位点(含九种变异)的引物以及针对所述变异位点的MGB探针，所述引物的序列如表1所示，所述MGB探针的序列如表2所示。
表1：针对高频致病变异位点的引物(51位点涵盖两类变异)
表2：针对高频致病变异位点的探针(51位点涵盖两类变异)
所述SLC22A5基因八个高频致病变异位点如表3所示。
表3：高频致病变异位点
以上八个变异位点的致病性明确，且在携带者和患者中的出现频次较高，根据文献调研，在明确基因型的111名PCD患者中，以上八个位点的等位基因覆盖率可以达到80.18％，(178/222)，患者检出率可以达到95.50％(106/111)，如表4-5所示。
表4：等位基因覆盖率计算(患者111人，等位基因222个)
| 变异位点 | 变异出现频次 | 单个位点覆盖率 |
| NM_003060.3(SLC22A5):c.760C>T | 25 | 11.26％ |
| NM_003060.3(SLC22A5):c.428C>T | 10 | 4.50％ |
| NM_003060.3(SLC22A5):c.338G>A | 8 | 3.60％ |
| NM_003060.3(SLC22A5):c.1195C>T | 9 | 4.05％ |
| NM_003060.3(SLC22A5):c.51C>G | 18 | 8.11％ |
| NM_003060.3(SLC22A5):c.844C＞T | 1 | 0.45％ |
| NM_003060.3(SLC22A5):c.51A>G | 15 | 6.76％ |
| NM_003060.3(SLC22A5):c.797C>T | 5 | 2.25％ |
| NM_003060(SLC22A5):c.1400C>G | 87 | 39.19％ |
| 合计 | 178 | 80.18％ |
表5：患者检出率计算(患者111人)
本发明还提供了一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR试剂盒，包括用于扩增SLC22A5基因八个高频致病变异位点的引物、针对所述变异位点的MGB探针、高效DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液体系(适用于高GC)及用于校准反应液体积的ROX参比荧光染料；所述引物的序列如表1所示，所述MGB探针的序列如表2所示。
该试剂盒的检测反应包含8个PCR反应，分别在独立的PCR管中进行。当DNA模板中含有表1九种变异的任何一种时，可以在对应的反应孔中观察到FAM和VIC双通道都出现了明显的扩增曲线，且FAM通道和VIC通道的Ct值差距不大于1.0；对于其他为野生型的位点，其反应孔中仅能观察到VIC通道出现明显的扩增曲线，且FAM通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0；当以上八个位点中某一个位点为纯合突变时，可以观察到对应反应孔中FAM通道出现明显的扩增曲线，且VIC通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0。
采用本发明的试剂盒对待测样本进行检测时，单个PCR管的试剂配置如表6-8所示。
表6：单个PCR管的试剂配置(单SNP位点)
| 组分 | 体积ul | 终浓度 |
| primer F(10μM) | 1.8 | 0.9μM |
| primer R(10μM) | 1.8 | 0.9μM |
| TaqMan Probe WT(10μM) | 0.4 | 0.2μM |
| TaqMan Probe MT(10μM) | 0.4 | 0.2μM |
| Qpcr反应缓冲液 | 10 | |
| 模板(DNA溶液) | 2 | |
| Rnase-free ddH2O | 3.6 | |
| total volume | 20 |
表7：单个PCR管的试剂配置(双SNP位点)
表8：单个PCR管的试剂配置(单SNP位点三个探针)
| 组分 | 体积ul | 终浓度 |
| primer F1(10μM) | 1.8 | 0.9μM |
| primer R1(10μM) | 1.8 | 0.9μM |
| TaqMan Probe WT1(10μM) | 0.4 | 0.2μM |
| TaqMan Probe MT1(10μM) | 0.4 | 0.2μM |
| TaqMan Probe WT2(10μM) | 0.4 | 0.2μM |
| Qpcr反应缓冲液 | 10 | |
| 模板(DNA溶液) | 2 | |
| Rnase-free ddH2O | 3.2 | |
| total volume | 20 |
扩增程序如表9所示。
表9：扩增程序
实施例1
采用本发明所述的试剂盒检测SLC22A5基因八个高频致病变异位点，当使用野生型人DNA作为模板时，检测结果如表10及图1所示。
表10：野生型人DNA检测结果
A1-A6孔为野生型人DNA，A7为纯化水的空白对照。在A1-A3的反应体系中含有两对探针/引物，可以同时检测两个SNP位点。由于797位点存在两种野生型的碱基，因此需要三个探针进行区别。FAM和NED代表两种野生型探针，VIC代表突变型探针。在以上反应程序中，阈值线设为0.3。
由检测结果可见，代表野生型位点的FAM和NED通道均有明显的S型扩增曲线，Ct平均值为35.02，变异系数CV＝1.68％。代表突变位点的VIC和CY5通道未检测到扩增曲线和Ct值。
实施例2
采用本发明所述的试剂盒检测SLC22A5基因八个高频致病变异位点，当使用纯合突变的质粒DNA作为模板(10^5稀释)时，检测结果如表11及图2所示。
表11：纯合突变的质粒DNA检测结果
B1-B6孔为合成的带有突变位点的质粒DNA，B6为纯化水的空白对照。在B1-B3的反应体系中含有两对探针/引物，可以同时检测两个SNP位点。由于797位点存在两种野生型的碱基，因此需要三个探针进行区别。质粒稀释10^5倍使用。在以上反应程序中，阈值线设为0.3。
由检测结果可见，代表突变型位点的VIC和CY5通道均有明显的S型扩增曲线，Ct平均值为25.42，变异系数CV＝1.10％。代表野生型位点的FAM和NED通道未检测到扩增曲线和Ct值。
实施例3
采用本发明所述的试剂盒检测SLC22A5基因八个高频致病变异位点，将带有野生型基因位点的质粒和带有突变基因位点的质粒1:1等比例混合后，作为杂合型DNA作为模板使用(10^5稀释)时，检测结果如表12及图3所示。
表12：杂合型DNA检测结果
C1-C6孔为含有1：1等比例混合的两种基因型质粒DNA，C7为纯化水的空白对照。在C1-C3的反应体系中含有两对探针/引物，可以同时检测两个SNP位点。由于797位点存在两种野生型的碱基，因此需要三个探针进行区别。质粒稀释10^5倍使用。在以上反应程序中，阈值线设为0.3。
由检测结果可见，除空白对照以外，代表突变位点的VIC和CY5通道以及代表野生型位点的FAM和NED通道均有明显的S型扩增曲线。突变型荧光通道的Ct值和野生型荧光通道的Ct值差距均小于1.0。
综上所述，借助于本发明的上述技术方案，本发明的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒，既可以使用人基因组DNA溶液作为模板，也可以使用未溶血的全血作为模板直接检测，省去了DNA提取的过程；该反应体系的探针/引物群经过优化，同一反应管内可以容纳最多两个等位基因(5个管内检测9个位点)，且等位基因之间的扩增效率差异达到最大化，使实验人员可以方便准确的解读结果，不需要进行内参基因的比对或使用delta-delta-Ct法进行计算分析；该反应体系既适用于Ct值的判读，也可以使用终点法进行判读；该反应体系可以覆盖95％以上的患者，并且覆盖80％以上的已知致病变异位点。相较于NGS和其他检测手段，荧光定量PCR的成本低廉，准确性得到公认，适合在临床推广；采用本发明的试剂盒，能够在较短的时间内实现原发性肉碱缺乏症携带者与患者的筛查。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京华诺奥美基因医学检验实验室有限公司
<120> 用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物、探针及试剂盒
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<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cggatgctgc tggtggc 17
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agtcagctgc acagc 15
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agtcagctcc acagca 16
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgagtccccc tgatg 15
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgagtccccc cgatg 15
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cccttccagc gcctcatctt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cccttgcagc gcctcatctt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tggagcagga gagctgtctg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tggagcagga gagctctctg 20
<210> 25
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ctggaaggcc ctact 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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actggaaggc cccac 15
<210> 27
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgccagtctc agat 14
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tccgccagtc tcgga 15
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<212> DNA
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aatatttgcc ctggcgc 17
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<211> 16
<212> DNA
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<400> 30
aatatttgcc ccggcg 16
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<212> DNA
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tgacgatgcc gggggt 16
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tgacgatgct gggggt 16
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tgacgatgcg gggggt 16
Claims (5)
1.一组用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR引物和探针，其特征在于，包括用于扩增SLC22A5基因八个高频致病变异位点的引物以及针对所述变异位点的MGB探针，所述引物的序列如SEQ ID NO.1-16所示，所述MGB探针的序列如SEQ ID NO.17-33所示，所述SLC22A5基因九种高频致病变异为NM_003060.3:c.760C>T、NM_003060.3:c.428C>T、NM_003060.3:c.338G>A、NM_003060.3:c.1195C>T、NM_003060.3:c.51C>G、NM_003060.3:c.51A>G、NM_003060.3:c.844C>T、NM_003060.3:c.797C>T及NM_003060.3:c.1400C>G。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述探针的5'端均标记荧光基团，所述探针的3'端均标记MGB。
3.根据权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、VIC、NED、CY5。
4. 一种用于检测SLC22A5基因九种高频致病变异的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括用于扩增SLC22A5基因八个高频致病变异位点的引物、针对所述变异位点的MGB探针、DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液体系及ROX参比荧光染料；所述引物的序列如SEQ ID NO.1-16所示，所述MGB探针的序列如SEQ ID NO.17-33所示，所述SLC22A5基因九种高频致病变异为NM_003060.3:c.760C>T、NM_003060.3:c.428C>T、NM_003060.3:c.338G>A、NM_003060.3:c.1195C>T、NM_003060.3:c.51C>G、NM_003060.3:c.51A>G、NM_003060.3:c.844C>T、NM_003060.3:c.797C>T及NM_003060.3:c.1400C>G。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测反应包含8个PCR反应，所述8个PCR反应分别在独立的PCR管中进行。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| CN202111663224.7A CN114317714B (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 用于检测slc22a5基因九种高频致病变异的荧光定量pcr引物、探针及试剂盒 |
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN110157790A (zh) * | 2019-04-17 | 2019-08-23 | 中山大学 | 一种不明原因心脏性猝死的快速基因筛查试剂盒 |
| CN113215243A (zh) * | 2021-05-19 | 2021-08-06 | 北京华诺奥美医学检验实验室有限公司 | 一种用于检测slc22a5基因高频致病变异的荧光定量pcr探针引物组和试剂盒 |
-
2021
- 2021-12-31 CN CN202111663224.7A patent/CN114317714B/zh active Active
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Molecular investigation in Chinese patients with primary carnitine deficiency;Yanghui Zhang等;Mol Genet Genomic Med;第7卷(第9期);第e901页 * |
| Molecular spectrum of SLC22A5 (OCTN2) gene mutations detected in 143 subjects evaluated for systemic carnitine deficiency;Fang-Yuan Li等;HUMAN MUTATION;第31卷(第8期);第E1632-E1651页 * |
Also Published As
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