CN112746102A - 一种检测脆性x综合征fmr1基因型的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测脆性X综合征FMR1基因型的试剂盒,含有一组检测脆性X综合征FMR1基因型的引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1~3,其核苷酸序列如SEQ ID NO:3引物的5’端有FAM荧光基团。本发明开发了一种快速、准确、通量大适用于临床检测脆性X综合征FMR1基因型的试剂盒,能够同时检测AGG插入信息和CGG重复数。该试剂盒的检测扩增范围可涵盖所有正常人、脆性X前突变携带者/患者、脆性X全突变携带者/患者;且具有检测时间短,通量大,操作简单,所需样本核酸量少的特点。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域,具体地,涉及一种检测脆性X综合征FMR1基因型的试剂盒。
背景技术
脆性X综合征是一种发病率仅次于唐氏综合征的遗传性智力低下综合征,发病率因性别不同有差异,男性为1/4000,女性为1/8000~1/6000。FXS患者的学习能力及社会适应能力都严重受损,但患者的预期寿命通常并不受到严重影响。早发现、早治疗、早干预能显著改善患儿预后,且可为家系遗传提供产前遗传咨询,避免家族中再次出现同样的患者,对家庭幸福美满、社会人口素质提高有重大意义,具有不可估量的社会效益和经济效益。
FMR1基因是脆性X综合征的致病基因,位于染色体Xq27.3,由17个外显子和16个内含子组成,全长38kb。在基因5’端非翻译区存在一段(CGG)n的重复序列,(CGG)n重复序列的长度具有高度多态性,并且可以遗传,在遗传过程中易发生突变。
影响CGG重复序列不稳定扩增的主要原因有两个:(1)CGG重复数,重复数越大扩展成全突变的风险越高;(2)AGG的数目及AGG的嵌入模式,AGG可增强CGG序列的稳定性。正常人中,CGG重复数增加,AGG插入数目也随之增多,而在脆性X综合征患者中AGG数目比例明显较低,提示AGG的减少可能与患病有关。当有AGG插入时可使(CGG)n序列的化学特性发生变化,插入1个AGG的CGG序列相对没有AGG插入时Tm值下降2℃,2个AGG插入Tm值下降5℃,说明AGG插入不但可影响(CGG)n序列的稳定性,同时显著降低了热力学稳定性。由此可见,AGG的插入有利于(CGG)n重复序列的稳定遗传;在临床上,该结构也有助于预测<100的前突变扩展的风险。
正常人群FMR1基因CGG重复数在6~44之间,最常见的是29~30个重复;中间型CGG重复数在45~54之间,重复数扩展至55~200称前突变,当重复数扩展达200以上常伴有CpG岛甲基化,称全突变。中间型等位基因可以认为是正常的,此类等位基因与脆性X综合征无关,并且尚未发现通过一代扩展为全突变的先例。前突变与后代脆性X综合征再发风险相关,且其本身也是一种致病突变,前突变的女性约20%易发生“脆性X原发性卵巢功能不全”,部分男性和女性易发生“脆性X相关震颤-共济失调综合征”;对于女性如果将突变基因遗传给下一代,子代的CGG重复数易发生进一步扩展。全突变临床即可导致脆性X综合征(Fragile X Syndrome,FXS)的发生,也是导致自闭症谱系障碍(Autism SpectrumDisorder,ASD)的主要原因。全突变男性全部表现为脆性X综合征特征,女性约50%表现为脆性X综合征特征,症状较男性轻。
现有的脆性X综合征检测方法采用PCR技术能够快速地检出结果,避免了荧光探针、MLPA、Southern Blot等技术操作难度高、检测耗时长、成本高等缺点。但由于GC含量很高,导致该技术对于女性脆性X综合征携带或嵌合体等的检测特异性和灵敏度较低,容易出现假阴性。中国专利(CN103981253A)公开了一种用于检测脆性X染色体综合征的CGG重数及AGG插入信息的PCR试剂盒,该专利针对AGG插入信息的引物为S+(CGG)4AGG,S+(GCG)4GAG,S+(GGC)4GGA或它们的反向互补序列S+(GCC)4TCC,S+(CGC)4CTC,S+(CCG)4CCT,这些引物全部是在AGG的序列上设计的引物,只能识别脆性X综合征野生型的样本,而脆性X综合征样本的DNA的CGG的重复数过高且无AGG插入时,该引物序列对无AGG插入信息的样本无法判断是否为脆性X综合征或实验失败,后续的计算公式亦不适合。因此该专利只能判断正常样本的CGG重复数,而不能判断是否为脆性X综合征携带者,具有较大的局限性。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足,提供一种检测脆性X综合征FMR1基因型的试剂盒,本发明公开的试剂盒能够对脆性X综合征FMR1基因AGG插入情况及CGG重复数进行检测。
本发明的第一个目的是提供一组检测脆性X综合征FMR1基因型的的引物。
本发明的第二个目的是提供任一所述的引物中的一条或几条在制备检测脆性X综合征FMR1基因型的试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种检测脆性X综合征FMR1基因型的试剂盒。
为了实现上述目的,本发明是通过以下方案予以实现的:
本发明要求保护一组检测脆性X综合征FMR1基因型的的引物,所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~3所示。
优选地,核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示引物的5’端有荧光基团。
最优选地,所述荧光基团为FAM。
进一步要求保护任一所述引物在制备检测脆性X综合征FMR1基因型的试剂盒中的应用。
用于检测AGG插入信息的AGG/CGG引物,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,
用于扩增FMR1基因CGG重复区的F/R引物,核苷酸序列如SEQ ID NO:2~3所示,核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的引物的5’端带FAM荧光基团。
SEQ ID NO:1:5’-AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGCCGGCGGCGGCGGAGG-3’;
SEQ ID NO:2:5’-GTTCAGCGCTTAGCTTCCGTTCGGTCTTA-3’
SEQ ID NO:3:5’-GAAGGTGCTGGCCTTCCAATGCGCATGC-3’。
核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的引物是公用的一条引物,可以与核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所示的引物分别组成引物对,进行扩增.
本发明还要求保护一种检测脆性X综合征FMR1基因型的试剂盒,含有所述引物中的一条或几条。
优选地,含有所述引物。
更优选地,还含有PCR反应液、PCR酶、稀释液、阳性质控品、阴性质控品。
进一步优选地,所述PCR反应液为高GC片段扩增PCR反应液,
进一步优选地,所述PCR酶为高GC片段扩增PCR酶。
进一步优选地,所述阳性质控品为CGG重复数为89~91,且没有AGG插入的DNA。
进一步优选地,所述阴性质控品为CGG重复数为29~31,且AGG插入数量为2的DNA。
最优选地,本发明要求保护一种检测脆性X综合征FMR1基因型的试剂盒,
一、组成
1、引物
用于检测AGG插入信息的AGG/CGG引物(60μL/管),其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,
于扩增FMR1基因CGG重复区的F/R引物(60μL/管),核苷酸序列如SEQ ID NO:2~3所示,核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的引物的5’端带FAM荧光基团。
SEQ ID NO:1:5’-AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGCCGGCGGCGGCGGAGG-3’;
SEQ ID NO:2:5’-GTTCAGCGCTTAGCTTCCGTTCGGTCTTA-3’;
SEQ ID NO:3:5’-GAAGGTGCTGGCCTTCCAATGCGCATGC-3’。
2、高GC片段扩增PCR反应液
3、高GC片段扩增PCR酶
4、稀释液:无核酸酶水
5、阳性质控品:为CGG重复数为89~91,且没有AGG插入的DNA
6、阴性质控品:为CGG重复数为29~31,且AGG插入数量为2的DNA
二、使用方法
1、DNA提取,DNA样本浓度为10~40ng/μL;
2、PCR反应
PCR反应体系(15μL体系)为:高GC片段扩增PCR反应液11.4μL,核苷酸序列如SEQID NO:1所示的引物0.5μL,核苷酸序列如SEQ ID NO:2~3所示的引物各0.5μL,高GC片段扩增PCR酶0.1μL,稀释液0.50μL,DNA样本2μL;
PCR反应程序如下:
3、PCR扩增产物检测
取1μL PCR产物和8.5μL ABI Hi-DiTM Formamide、0.5μL GeneScanTM 1200LIZTMdye Size standard混合;然后在95℃条件下加热变性混合物3分钟,立即放置冰上至少2分钟;之后使用3500Dx基因分析仪,进行毛细管电泳。
三、结果判读
将扩增出的全长序列片段长度,带入以下公式计算,计算出CGG重复数:
Y=0.3399X-78.554,其中X代表全长扩增产物峰片段大小,Y代表CGG重复数
当CGG重复数<44为FMR1基因野生型;CGG重复数45~54为FMR1基因中间型;CGG重复数55~200为FMR1基因前突变型;CGG重复数>200为FMR1基因全突变型。
毛细管电泳结果图显示,片段大小在150~220bp的范围内,出现荧光值高于CGG峰的产物峰,即为AGG峰,AGG峰的个数代表AGG的插入数量。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明开发了一种快速、准确、通量大适用于临床检测脆性X综合征FMR1基因型的试剂盒,能够同时检测AGG插入信息和CGG重复数。该试剂盒的检测扩增范围可涵盖所有正常人、脆性X前突变携带者/患者、脆性X全突变携带者/患者;且具有检测时间短,通量大,操作简单,所需样本核酸量少的特点。
附图说明
图1为不同引物组检测女性全突变携带的毛细管电泳图;图1A为优选出的引物组检测结果,图1B到1D为其它引物组合检测结果。
图2为FMR1基因野生型的毛细管电泳图;图2A显示正常男性(CGG重复数为30,AGG插入数量为2);图2B显示正常女性(AGG插入数量为29/36,AGG插入数量为3)。
图3为前突变型的毛细管电泳图;图3A显示男性前突变(CGG重复数为90,没有AGG插入);图3B显示女性前突变携带(CGG重复数为29/66,AGG插入数量为2)。
图4为全突变型的毛细管电泳图图4A显示男性全突变(CGG重复数>200,没有AGG插入);图4B显示女性全突变携带(CGG重复数为12/>200,AGG插入数量为2)。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1检测脆性X综合征FMR1基因的引物组
为实现可同时对AGG和CGG重复数进行检测,要克服由于AGG和CGG高度相似可能产生的非特异性扩增,以及目的区域序列C/G含量高造成的扩增困难的问题。为解决上述问题采用三引物的方法设计了特异性引物,其中2条引物用于目的序列的全长扩增,另一条引物设计在这对引物的内部,作为“嵌套”引物,用于检测AGG插入信息;这种引物设计可明显提高敏感度,同时可以保持高特异性。经过了大量的试验进行组合,筛选,优化,验证,实验结果如图1所示。最终优选出稳定性强,扩增效率高,特异性好的一个引物组(如表1所示)。表1脆性X综合征FMR1基因的特异性引物
序列编号 | 引物序列 |
SEQ ID NO:1 | 5’-AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGCCGGCGGCGGCGGAGG-3’ |
SEQ ID NO:2 | 5’-GTTCAGCGCTTAGCTTCCGTTCGGTCTTA-3’ |
SEQ ID NO:3 | 5’-GAAGGTGCTGGCCTTCCAATGCGCATGC-3’ |
实施例2一种检测脆性X综合征FMR1基因型的试剂盒
本实施例根据毛细管电泳检测平台,示例性地提供一种检测脆性X综合征FMR1基因型的检测试剂盒。值得注意的是,利用本发明的引物组,开发的基于其他检测平台脆性X综合征FMR1基因检测试剂盒也应当是本申请的保护范围,在此不一一示例。
一、组成
1、引物
用于检测AGG插入信息的AGG/CGG引物(60μL/管),其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,
于扩增FMR1基因CGG重复区的F/R引物(60μL/管),核苷酸序列如SEQ ID NO:2~3所示,核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的引物的5’端带FAM荧光基团。
SEQ ID NO:1:5’-AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGCCGGCGGCGGCGGAGG-3’;
SEQ ID NO:2:5’-GTTCAGCGCTTAGCTTCCGTTCGGTCTTA-3’
SEQ ID NO:3:5’-GAAGGTGCTGGCCTTCCAATGCGCATGC-3’。
2、高GC片段扩增PCR反应液(1.5mL/管);
3、高GC片段扩增PCR酶(5.5μL/管);
4、稀释液(150μL/管):无核酸酶水;
5、阳性质控品(10μL/管):为CGG重复数为89~91,且没有AGG插入的DNA;
6、阴性质控品(10μL/管):为CGG重复数为29~31,且AGG插入数量为2的DNA;二、使用方法
1、DNA提取
使用广州市达瑞生物技术股份有限公司的核酸提取或纯化试剂提取DNA,外周全血和干血片DNA提取,具体操作根据核酸提取试剂盒说明书进行,用于后续PCR扩增的核酸浓度需≥10ng/μL,若提取的DNA浓度>40ng/μL,需将该DNA样本稀释至10~40ng/μL;
2、PCR反应
PCR反应体系(15μL体系)如下:
在该体系中,引物SEQ ID NO:1~3对应的用量比为1:100:100(pmol)。
PCR反应程序如下:
3、PCR扩增产物检测
取1μL PCR产物和8.5μL ABI Hi-DiTM Formamide、0.5μL GeneScanTM 1200LIZTMdye Size standard混合;然后在95℃条件下加热变性混合物3分钟,立即放置冰上至少2分钟;之后使用使用3500Dx基因分析仪,进行毛细管电泳。
三、结果判读
将扩增出的全长序列片段长度,带入以下公式计算,计算出CGG重复数:
Y=0.3399X-78.554,其中X代表全长扩增产物峰片段大小,Y代表CGG重复数
当CGG重复数<44为FMR1基因野生型;CGG重复数45~54为FMR1基因中间型;CGG重复数55~200为FMR1基因前突变型;CGG重复数>200为FMR1基因全突变型。
毛细管电泳结果图显示,片段大小在150~220bp的范围内,位置,出现荧光值高于CGG峰的产物峰,即为AGG峰,AGG峰的个数代表AGG的插入数量。
实施例3对不同FMR1基因型的样本检测
一、实验方法
二、实验结果
结果如图2到图4,将全长扩增产物峰片段大小带入到计算公式Y=0.3399X-78.554中计算出样本的CGG重复数,具体结果见表2。样本AGG的插入情况:图2A男性样本有2个AGG插入,图2B女性样本有3个AGG插入;图3A和图4A男性阳性样本没有AGG插入,图3B和4B女性阳性样本正常的等位基因有2个AGG插入,使用实施例2的试剂盒和PCR/CEFMR1Kit试剂盒的具体检测结果见表1。
表2:
说明了该试剂盒的检测扩增范围涵盖广(包括所有正常人、脆性X前突变携带者/患者、脆性X全突变携带者/患者)准确性高;而且明确AGG插入情况有助于对前突变基因扩展成全突变基因的可能性进行预测。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,对于本领域的普通技术人员来说,在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动,这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 广州市达瑞生物技术股份有限公司
<120> 一种检测脆性X综合征FMR1基因型的试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcgtctact gtctcggcac ttgccggcgg cggcggagg 39
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttcagcgct tagcttccgt tcggtctta 29
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggtgctg gccttccaat gcgcatgc 28
Claims (9)
1.一组检测脆性X综合征FMR1基因型的引物,其特征在于,所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~3所示。
2.根据权利要求2所述的引物,其特征在于,核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示引物的5’端有荧光基团。
3.根据权利要求2所述的引物,其特征在于,所述荧光基团为FAM。
4.权利要求1到3任一所述的引物中的一条或几条在制备检测脆性X综合征FMR1基因型的试剂盒中的应用。
5.一种检测脆性X综合征FMR1基因型的试剂盒,其特征在于,含有权利要求1所述的引物中的一条或几条。
6.根据权利要求5所述的试剂盒,其特征在于,含有权利要求1所述的引物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,还含有PCR反应液、PCR酶、稀释液、阳性质控品、阴性质控品。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR反应液为高GC片段扩增PCR反应液。
9.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述PCR酶为高GC片段扩增PCR酶。
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- 2020-12-31 CN CN202011641166.3A patent/CN112746102A/zh active Pending
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