CN116574801A - Pai-1基因启动子4g/5g多态性检测试剂盒、组合物及其应用 - Google Patents
Pai-1基因启动子4g/5g多态性检测试剂盒、组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了PAI‑1基因启动子4G/5G多态性检测试剂盒、组合物及其应用。具体地公开了用于检测PAI‑1基因4G/5G多态性的组合物，所述组合物包括引物F1、引物F2和引物R，所述引物F1为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子，所述引物F2为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子，所述引物R为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子。本发明建立了检测PAI‑1基因4G/5G多态性的PCR‑荧光探针法，进行简便、快速、准确的基因分型，为与PAI‑1基因4G/5G多态性相关疾病的易感性检测、诊断或辅助诊断、筛查及风险评估提供了一个新的快速、准确、灵敏的方法，具有广泛的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及PAI-1基因启动子4G/5G多态性检测试剂盒、组合物及其应用。
背景技术
纤溶酶原激活物抑制剂(Plasminogen activator inhibitor，PAI)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)家族，具有抑制纤维蛋白降解、促进纤维蛋白沉积于血管壁和刺激平滑肌细胞增生等作用，在维持血浆凝血-纤溶系统的动态平衡中起到关键作用。PAI至少可以分为三类：内皮细胞型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)、胎盘型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-2)和蛋白酶Nexin I，其中PAI-1的活性最强。PAI-1的作用原理是通过组织型纤溶酶原激活剂(tPA)或尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)结合形成稳定的复合物，从而抑制纤溶酶原激活，抑制纤维蛋白溶解。生理情况下，PAI-1密切调节凝血和纤溶系统的平衡。纤溶系统是机体抑制血栓形成的重要保护机制，PAI-1是重要的纤溶调节剂。
PAI-1基因位于7号染色体(q21.2-q22)，约含12200个碱基对，包括9个外显子和8个内含子。PAI-1启动子存在一个P53的特异位点，P53通过启动子激活，诱导PAI-1表达，从而调控细胞纤维蛋白溶解活动。研究发现血浆PAI-1浓度与基因表达水平明显相关。基因多态性能够影响基因表达水平，其中PAI-1基因4G/5G多态性(rs1799762)是一种单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)，是PAI-1基因启动子区-675bp处有一个单核苷酸G(鸟嘌呤，Guanine)插入，可形成4个或5个鸟嘌呤碱基序列，因此出现三种多态性，分别为4G/4G、4G/5G以及5G/5G，影响基因表达，研究证明转录起始因子位点4G、5G等位基因均存在于不同人群中，5G等位基因与抑制蛋白结合后，覆盖了阻遏蛋白与其相结合的位点，空间结构改变后干扰了PAI-1转录水平，而4G等位基因没有转录抑制位点，导致4G等位基因转录水平是5G等位基因的6倍，进而导致PAI-1活性水平也明显升高。PAI-1水平升高可引起血小板聚集趋势增加，增加形成静脉血栓的风险。有文献表明4G/4G基因型者发生静脉血栓的风险是5G/5G型(正常纤溶型)的6.35倍，4G/5G基因型者发生静脉血栓的风险是5G/5G型的4.85倍。大量研究表明PAI-1基因5G等位基因能够通过下调PAI-1基因表达从而引起血浆PAI-1浓度降低，对纤溶系统活性抑制作用减弱，表现为出血倾向。更有研究发现，临床上肥胖、高脂血症、糖尿病、心绞痛、动脉粥样硬化等患者血浆PAI-1水平明显升高，而尿激酶、低分子肝素等增加纤溶活性的细胞因子水平上升时，PAI-1水平往往呈下降状态。PAI-1活性不仅反映了纤溶系统的状态，也反映了血管内皮细胞功能及机体清除血栓的水平，4G/5G多态性(rs1799762)对于血栓预防诊断具有重要意义。研究表明，4G/5G多态性与脑血管病具有相关性，4G纯合子个体具有较高的脑梗死发病倾向(张晨，李江，李玲，等.PAI-1启动子区插入/缺失(5G/4G)多态性与脑血管病的相关性研究[J].中华医学遗传学杂志，2001，18(5)：383-387.)。PAI-1基因多态性还与与妊娠相关疾病(如：复发性自然流产(Recurrentspontaneous abortion，RSA)、妊娠期高血压疾病(Hypertensive disorders ofpregnancy，HDP)、妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellims，GDM))等的发生、发展具有一定相关性。刘美玉等人报道了4G/4G基因型和4G等位基因患不明原因复发性流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)的相对风险增加(刘玉美，胡春青，唐晓勇，等.不明原因复发性流产患者血浆中PAI-1水平表达及其基因启动区4G/5G位点多态性分析[J].中外医学研究，2022，20(10)：4.)。叶鸣等人报道了4G/5G多态性与不良妊娠的相关性(叶鸣，方佳，赵磊，等.皖南地区MTHFR和PAI-1基因多态性分布及与不良妊娠相关性研究[J].中国药业，2022，31(9)：65-68.)。此外，PAI-1基因4G/5G基因多态性还与冠心病相关(姜大钧，纪琳琳，孙鹏，等.PAI-1基因多态性与冠心病的相关性研究[J].世界最新医学信息文摘(连续型电子期刊)，2018，18(92)：159.DOI：10.19613/j.cnki.1671-3141.2018.92.076.)。
鉴于此，开发一种操作方便、成本低廉、灵敏度高的PAI-1基因启动子4G/5G多态性检测方法具有重要的意义和广泛的临床应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何快速、准确和/或灵敏地检测PAI-1基因4G/5G多态性。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测PAI-1基因4G/5G多态性的组合物，所述组合物可包括引物F1、引物F2和引物R，所述引物F1为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子，所述引物F2为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子，所述引物R为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子。
所述引物F1和F2为正向引物，所述引物R为反向引物。
所述引物F1、引物F2和引物R用于特异性扩增含有PAI-1基因4G/5G多态性位点(rs1799762)的PAI-1基因片段。
所述PAI-1基因片段的核苷酸序列可为SEQ ID No.6(SNP位点处为GGGG)或SEQ IDNo.7(SNP位点处为GGGGG，即PAI-1基因启动子区-675bp处有一个单核苷酸G的插入)。
所述引物F1和引物R可用于特异性扩增SEQ ID No.6所示的DNA分子，所述引物F2和引物R可用于特异性扩增SEQ ID No.7所示的DNA分子。
所述引物F1、引物F2和引物R可用于检测PAI-1基因4G/5G多态性。
所述引物F1、引物F2和引物R检测(针对)的PAI-1基因靶序列可为SEQ IDNo.5。
PAI-1基因4G/5G多态性(rs1799762)是一种单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphisms，SNP)，是PAI-1基因启动子区-675bp处有一个单核苷酸G(鸟嘌呤，Guanine)插入，可形成4个或5个鸟嘌呤碱基序列，包括三种多态性，分别为4G/4G、4G/5G以及5G/5G。
进一步地，所述组合物还可包括探针，所述探针的核苷酸序列可为SEQ IDNo.4。
所述探针可为TaqMan探针。
进一步地，所述探针的5’端可标记荧光基团，3’端可标记淬灭基团。
所述荧光基团选自FAM、VIC、HEX、TRT、CY3、CY5、ROX、JOE、FITC、TET、NED、TAMRA、LCRED640、LC RED705、Quasar705或Texas Red中的至少一种。
所述淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、Dabcy1中的至少一种。
进一步地，所述探针的5’端可标记FAM，3’端可标记TAMRA。
进一步地，所述组合物可包括组合物1和组合物2，所述组合物1可包括：引物F1(SEQ ID No.1)、引物R(SEQ ID No.3)和探针(SEQ ID No.4)；所述组合物2可包括引物F2(SEQ ID No.2)、引物R(SEQ ID No.3)和探针(SEQ ID No.4)。
本发明还提供了用于检测PAI-1基因4G/5G多态性的试剂盒，所述试剂盒可包含本文中任一所述的组合物。
进一步地，所述试剂盒还可包含阳性对照品，所述阳性对照品可为下述任一种：
C1)PAI-1 4G/4G基因和PAI-1 5G/5G基因；
C2)PAI-1 4G/4G基因片段和PAI-1 5G/5G基因片段；
C3)含有PAI-1 4G/4G基因的重组载体和含有PAI-1 5G/5G基因的重组载体；
C4)含有PAI-1 4G/4G基因片段的重组载体和含有PAI-1 5G/5G基因片段的重组载体；
所述PAI-1 4G/4G基因和PAI-1 4G/4G基因片段均含有PAI-1基因4G/5G多态性位点(rs1799762)中4G/4G多态性位点，所述PAI-1 5G/5G基因和PAI-1 5G/5G基因片段均含有PAI-1基因4G/5G多态性位点(rs1799762)中5G/5G多态性位点。
所述PAI-1 4G/4G基因的核苷酸序列为GenBank Accession No.NM_000602.5的第-775～591位(Update Date 03-APR-2023)。
所述PAI-1 5G/5G基因的核苷酸序列为GenBank Accession No.NM_000602.5的第-776～591位(Update Date 03-APR-2023)。
所述PAI-1 4G/4G基因片段可为含有PAI-1基因4G/5G多态性位点(rs1799762)中4G/4G多态性位点的PAI-1基因的任一片段。
所述PAI-1 5G/5G基因片段可为含有PAI-1基因4G/5G多态性位点(rs1799762)中5G/5G多态性位点的PAI-1基因的任一片段。
进一步地，所述PAI-1 4G/4G基因片段可为SEQ ID No.6所示的DNA分子或SEQ IDNo.5所示的DNA分子(PAI-1基因靶序列)；所述PAI-1 5G/5G基因片段可为SEQ ID No.7所示的DNA分子或DNA分子1，所述DNA分子1是在SEQ IDNo.5的第101和102位中间插入一个核苷酸“G”得到的DNA分子。
所述阳性对照品可以是扩增得到或直接合成得到的含有PAI-1基因4G/5G多态性位点(rs1799762)的PAI-1基因片段，也可以是PAI-1基因的基因组DNA。
所述阳性对照品还可以是含有所述PAI-1基因片段的质粒载体(重组载体)，或含所述PAI-1基因的基因组DNA的质粒载体(重组载体)。
在本发明的一个或多个实施方案中，所述阳性对照品为基因组DNA。
进一步地，所述试剂盒还可包括PCR扩增所需要的Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液、Mg2+中的一种或多种。
进一步地，所述试剂盒还可包括核酸提取试剂，所述核酸提取试剂用于提取来自受试者的生物样品(待测样本)中的核酸。
所述试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者可以全部或部分预组合成试剂混合物。
进一步地，所述试剂盒还可包括记载有本文中所述检测PAI-1基因4G/5G多态性的方法的可读性载体。所述可读性载体可为关于实践本发明方法的试剂盒说明书(例如印刷形式的说明书)或在其上已记录了信息的计算机可读的介质(例如软盘、CD等)。
所述试剂盒的检测样本可为血液样本(如全血、血浆、血清或血斑)、组织样本、唾液样本、痰液样本、体液样本或产前诊断样本(如羊水样本、绒毛膜样本或母体外周血样本)等但不限于此。
所述试剂盒的检测样本也可为口腔拭子、鼻拭子、喉拭子、咽拭子或鼻腔洗液等样本但不限于此。
本发明还提供了本文中任一所述的组合物，和/或，所述PAI-1 4G/4G基因片段、PAI-1 5G/5G基因片段、含有PAI-1 4G/4G基因片段的重组载体或含有PAI-15G/5G基因片段的重组载体的下述任一种应用：
A1)在检测PAI-1基因4G/5G多态性或制备用于检测PAI-1基因4G/5G多态性的产品中的应用；
A2)在检测与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的易感性或制备用于检测与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的易感性的产品中的应用；
A3)在与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的筛查或制备用于与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的筛查的产品中的应用；
A4)在与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的诊断或辅助诊断或制备用于与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的诊断或辅助诊断的产品中的应用；
A5)在评估与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病风险或制备用于评估与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病风险的产品中的应用。
上述应用中，所述与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病可为心血管疾病、脑血管疾病、静脉血栓、糖尿病、肥胖、高脂血症、妊娠相关疾病、肿瘤或脓毒败血症但不限于此。
所述心血管疾病可包括高血压、心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)、血栓形成、心绞痛等但不限于此。
所述脑血管疾病可包括脑梗塞(脑梗死)、缺血性脑卒中、颅内大血管粥样硬化、脑血栓、脑栓塞等但不限于此。
所述静脉血栓可为深静脉血栓(deep venous thrombosis，DVT)。
所述妊娠相关疾病可包括复发性自然流产(Recurrent spontaneous abortion，RSA)、不明原因复发性流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)、妊娠期高血压疾病(Hypertensive disorders of pregnancy，HDP)、妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellims，GDM)、不良妊娠、先兆子痫、子痫等但不限于此。
所述肿瘤可包括神经母细胞瘤、结直肠癌、头颈鳞癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌等但不限于此。
本发明还提供了一种检测PAI-1基因4G/5G多态性的方法，所述方法可包括如下步骤：
B1)提取待测样本基因组DNA；
B2)以所述基因组DNA为模板，用本文中任一所述的组合物进行实时荧光PCR反应，采集荧光信号；
B3)根据所述荧光信号确定待测样本的基因型。
上述方法中，所述实时荧光PCR反应条件为：预变性阶段：95℃3min；循环阶段：95℃15s，60℃30s，40个循环。在60℃设置荧光信号采集。
上述方法中，所述实时荧光PCR反应体系为：A管(5G反应)：PAI-1检测试剂A(5G反应)8.8ul，纯化水9.2ul，模板DNA 2ul；
B管(4G反应)：PAI-1检测试剂B(4G反应)8.8ul，纯化水9.2ul，模板DNA 2ul。
其中，PAI-1检测试剂A可包含组分：引物F2(SEQ ID No.2),探针(SEQ IDNo.4)、内控ACTB引物及探针、Buffer、dNTP/dUTP、Mg2+、Taq酶等；PAI-1检测试剂B可包含组分：引物F1(SEQ ID No.1)及探针(SEQ ID No.4)、内控ACTB引物及探针、Buffer、dNTP/dUTP、Mg2+、Taq酶等。
内控ACTB引物ACTB-F：5’-GACCTGACTGACTACCTCATG-3’(SEQ IDNo.8)，
内控ACTB引物ACTB-R：5’-TCTCCTTAATGTCACGCAC-3’(SEQ IDNo.9)，
内控ACTB探针ACTB-probe：5’-VIC-CTACAGCTTCACCACCACGGC-BHQ1-3’(SEQ IDNo.10)。
在本发明的一个实施方案中，检测5G基因型的PCR反应体系为20ul体系，各组分终浓度为：ACTB-F引物750nM，ACTB-R引物750nM，ACTB-probe为200nM；引物F2(SEQ ID No.2)200nM，引物R(SEQ ID No.3)200nM，探针(SEQ ID No.4)100nM。氯化镁终浓度为3.5mM、dNTP终浓度为300μM，高特异性DNA聚合酶的终浓度为2U/反应。
在本发明的一个实施方案中，检测4G基因型的PCR反应体系为：20ul体系，各组分终浓度为：ACTB-F引物750nM，ACTB-R引物750nM，ACTB-probe为200nM；引物F1(SEQ IDNo.1)200nM，引物R(SEQ ID No.3)200nM，探针(SEQ ID No.4)100nM。氯化镁终浓度为3.5mM、dNTP终浓度为300μM，高特异性DNA聚合酶的终浓度为2U/反应。
上述方法中，所述B3)可包括如下步骤：
查看FAM通道扩增曲线进行结果判定：
(1)若样本A管有扩增曲线升起，B管无扩增曲线升起，则样本为5G/5G纯合子。
(2)若样本A管，B管都有扩增曲线升起，则样本为4G/5G杂合子。
(3)若样本B管有扩增曲线升起，A管无扩增曲线升起，则样本为4G/4G纯合子。
本文所述待测样本可为血液样本(如全血、血浆、血清或血斑)、组织样本、唾液样本、痰液样本、体液样本或产前诊断样本(如羊水样本、绒毛膜样本或母体外周血样本)等但不限于此。
所述待测样本也可为口腔拭子、鼻拭子、喉拭子、咽拭子或鼻腔洗液等样本但不限于此。
所述待测样本具体可为全血样本。
本文所述产品可为试剂、试剂盒、芯片或试纸。
本文所述产品可包含本文中任一所述的用于检测PAI-1基因4G/5G多态性的组合物。
上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
本发明所提供的检测PAI-1基因4G/5G多态性的方法既可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。其中，所述非疾病诊断治疗方法可如在人群中进行与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的筛查时检测PAI-1基因4G/5G多态性，或进行与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的易感性检测。
另外，本发明所提供的检测PAI-1基因4G/5G多态性的方法还可以有许多其他用途，例如进行基因多态性分析和家族进化史研究。本发明的方法还可以用于非特定对象的样品研究，例如对混合血液制品进行检测。
本发明的目的之一是检测PAI-1基因启动子区域4G/5G多态性，目前国内市面上无任何针对该启动子区域多态性的诊断试剂盒，该位点插入与缺失与单位点多态性有区别，需要大量样本的测试，才能获得比较稳定的检测效果、溶解以及扩增曲线。
PAI-1全称纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)，是组织型纤溶酶原激活物(t-PA)的快速抑制物。t-PA与PAI-1间的动态平衡对维持血浆纤溶系统的稳态起决定性作用，PAI-1活性或水平过高是血栓形成的主要原因之一。大量研究表明：PAI-14G/4G基因型携带者纤溶酶原激活物抑制物-1表达增高。PAI-1(4G/5G)多态性是静脉血栓发病的重要独立预测因子。
目前PAI-1基因4G/5G多态性已被证明与多种疾病密切相关，可用于与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的易感性检测、诊断或辅助诊断、筛查及风险评估等领域。本发明首先根据PAI-1基因启动子4G/5G多态性位点(SNP位点)及其上下游序列确定出检测PAI-1基因4G/5G多态性的靶序列(SEQ ID No.5)，然后针对该靶序列设计和筛选出引物探针序列，基于ARMS-PCR技术，进一步建立了可检测PAI-1基因4G/5G多态性的PCR-荧光探针法，能够对PAI-1基因4G/5G多态性位点(rs1799762)进行简便、快速的基因分型，分型结果准确。本发明的检测方法和基于本发明检测方法的试剂盒灵敏度高、准确性和稳定性好，为与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的易感性检测、诊断或辅助诊断、筛查及风险评估提供了一个新的快速、准确、灵敏的方法，具有广泛的临床应用前景。
附图说明
图1为含有PAI-1基因片段的质粒载体(已知拷贝数)经10-1梯度稀释后使用本发明试剂盒进行5G反应检测结果，图中标注ZL1-ZL10表示质粒稀释梯度。
图2为含有PAI-1基因片段的质粒载体(已知拷贝数)经10-1梯度稀释后使用本发明试剂盒进行4G反应检测结果，图中标注ZL1-ZL10表示质粒稀释梯度。
图3为已知基因型为4G/5G型的标准genomic DNA，经梯度稀释后使用本发明试剂盒进行5G反应检测结果，图中数字表示DNA浓度，单位ng/ul。
图4为已知基因型为4G/5G型的标准genomic DNA，经梯度稀释后使用本发明试剂盒进行4G反应检测结果，图中数字表示DNA浓度，单位ng/ul。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所述PAI-1基因4G/5G多态性(rs1799762)是一种单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)，是PAI-1基因启动子区-675bp处有一个单核苷酸G(鸟嘌呤，Guanine)插入，可形成4个或5个鸟嘌呤碱基序列，包括三种多态性，分别为4G/4G、4G/5G以及5G/5G。
PAI-1基因4G/5G多态性(rs1799762)也称为PAI-1基因4G/5G插入/缺失单核苷酸多态性，采用TaqMan探针等位基因识别的方法进行检测。
下述实施例中PAI-1 4G/4G基因的核苷酸序列为GenBank Accession No.NM_000602.5的第-775～591位(Update Date 03-APR-2023)。
下述实施例中PAI-1 5G/5G基因的核苷酸序列为GenBank Accession No.NM_000602.5的第-776～591位(Update Date 03-APR-2023)。
实施例1、用于检测PAI-1基因4G/5G多态性的引物和探针的设计
本发明采用ARMS特异性引物结合荧光探针技术，检测DNA中是否存在基因突变，特异性引物能够选择性扩增突变基因，而荧光探针在Taq酶的作用下水解释放荧光，从而进行基因突变检测。发明人进行了大量的研究、分析比对首先确定了检测PAI-1基因4G/5G多态性的靶序列：5’-AGCCACCACCACCCCACCCAGCACACC TCCAACCTCAGCCAGACAAGGTTGTTGACACAAGAGAGCCCTCAGGGGCACAGAGAG AGTCTGGACACGTGGGGAGTCAGCCGTGTATCATCGGAGGCGGCCGGGCACATGGCAG GGATGAGGGAAAGACCAAGAGTCCTCTGTTGGGCCCAAGTCCT-3’(SEQ ID No.5)。
然后针对该靶序列设计引物和TaqMan探针，进一步筛选出灵敏度高的引物及探针。引物和探针序列如下所示：
引物F1(正向引物)：5’-GAGTCTGGACACGTGGGGA-3’(SEQ ID No.1)，
引物F2(正向引物)：5’-GAGTCTGGACACGTGGGGG-3’(SEQ ID No.2)，
引物R(反向引物)：5’-TCTTTCCCTCATCCCTGCCATGT-3’(SEQ ID No.3)，
TaqMan探针：5’-FAM-AGCCGTGTATCATCGGAGGCGGCC-TAMRA-3’(SEQ ID No.4)。
设计的引物用于特异性扩增含有PAI-1基因4G/5G多态性位点(rs1799762)的PAI-1基因片段。
模板中含有4G等位基因时，以引物F1和引物R扩增得到的PAI-1基因片段的核苷酸序列为：5’-GAGTCTGGACACGTGGGGAGTCAGCCGTGTATCATCGGA GGCGGCCGGGCACATGGCAGGGATGAGGGAAAGA-3’(SEQ ID No.6，SNP位点处为GGGG)。
模板中含有5G等位基因时，以引物F2和引物R扩增得到的PAI-1基因片段的核苷酸序列为：5’-GAGTCTGGACACGTGGGGGAGTCAGCCGTGTATCATCGG AGGCGGCCGGGCACATGGCAGGGATGAGGGAAAGA-3’(SEQ ID No.7，SNP位点处为GGGGG，即PAI-1基因启动子区-675bp处有一个单核苷酸G的插入)。
实施例2、检测PAI-1基因4G/5G多态性的方法的建立
本发明基于ARMS-PCR技术，建立了检测PAI-1基因启动子4G/5G多态性的PCR-荧光探针法。本发明建立的检测PAI-1基因4G/5G多态性的方法如下所示：
1、提取待测样本基因组DNA
DNA从各种待测样本中提取分离出来(例如全血，血斑，口腔拭子或唾液)。提取的DNA确保在浓度、纯度和完整性方面适合扩增。为了准确的检测基因型，每个样本所有DNA每次反应的量在10到100ng之间。
2、PCR检测
以提取的基因组DNA为模板，用实施例1中设计的引物F1(SEQ ID No.1)、引物F2(SEQ ID No.2)、引物R(SEQ ID No.3)、TaqMan探针(SEQ ID No.4)进行实时荧光PCR反应，采集荧光信号。其中：
实时荧光PCR反应体系如表1和表2所示：
表1、实时荧光PCR反应体系(5G反应)
| 组分 | 加入量(μl) |
| PAI-1检测试剂A(5G反应) | 8.8μl |
| 纯化水 | 9.2 |
| 模板DNA | 2μl |
| 总体积 | 20μl |
表2、实时荧光PCR反应体系(4G反应)
| 组分 | 加入量(μl) |
| PAI-1检测试剂B(4G反应) | 8.8μl |
| 纯化水 | 9.2 |
| 模板DNA | 2μl |
| 总体积 | 20μl |
其中，PAI-1检测试剂A包含组分：引物F2(SEQ ID No.2),探针(SEQ ID No.4)、内控ACTB引物及探针、Buffer、dNTP/dUTP、Mg2+、Taq酶等；PAI-1检测试剂B包含组分：引物F1(SEQ ID No.1)及探针(SEQ ID No.4)、内控ACTB引物及探针、Buffer、dNTP/dUTP、Mg2+、Taq酶等。
具体地，检测5G基因型的PCR反应体系为20ul体系，各组分终浓度为：ACTB-F引物750nM，ACTB-R引物750nM，ACTB-probe为200nM；引物F2(SEQ ID No.2)200nM，引物R(SEQ IDNo.3)200nM，探针(SEQ ID No.4)100nM。氯化镁终浓度为3.5mM、dNTP终浓度为300μM，高特异性DNA聚合酶的终浓度为2U/反应。
检测4G基因型的PCR反应体系为：20ul体系，各组分终浓度为：ACTB-F引物750nM，ACTB-R引物750nM，ACTB-probe为200nM；引物F1(SEQ ID No.1)200nM，引物R(SEQ ID No.3)200nM，探针(SEQ ID No.4)100nM。氯化镁终浓度为3.5mM、dNTP终浓度为300μM，高特异性DNA聚合酶的终浓度为2U/反应。
内控ACTB引物ACTB-F：5’-GACCTGACTGACTACCTCATG-3’(SEQ IDNo.8)，
内控ACTB引物ACTB-R：5’-TCTCCTTAATGTCACGCAC-3’(SEQ IDNo.9)，
内控ACTB探针ACTB-probe：5’-VIC-CTACAGCTTCACCACCACGGC-BHQ1-3’(SEQ IDNo.10)。
每次实验中都要加入无模板对照(NTC)，以确认没有潜在污染，无模板对照(NTC)是不含模板DNA的反应体系。始终将阳性对照品：PAI-1 4G/5G对照作为未知样本的阳性参考信号。
阳性对照品可为下述任一种：
(1)PAI-1 4G/4G基因和PAI-1 5G/5G基因；
(2)PAI-1 4G/4G基因片段和PAI-1 5G/5G基因片段；
(3)含有PAI-1 4G/4G基因的重组载体和含有PAI-1 5G/5G基因的重组载体；
(4)含有PAI-1 4G/4G基因片段的重组载体和含有PAI-1 5G/5G基因片段的重组载体；
其中，PAI-1 4G/4G基因和PAI-1 4G/4G基因片段均含有PAI-1基因4G/5G多态性位点(rs1799762)中4G/4G多态性位点，PAI-1 5G/5G基因和PAI-1 5G/5G基因片段均含有PAI-1基因4G/5G多态性位点(rs1799762)中5G/5G多态性位点。
PAI-1 4G/4G基因片段可为含有PAI-1基因4G/5G多态性位点(rs1799762)中4G/4G多态性位点的PAI-1基因的任一片段。
PAI-1 5G/5G基因片段可为含有PAI-1基因4G/5G多态性位点(rs1799762)中5G/5G多态性位点的PAI-1基因的任一片段。
PAI-1 4G/4G基因片段可为SEQ ID No.6所示的DNA分子，也可为SEQ ID No.5所示的DNA分子(PAI-1基因靶序列)。PAI-1 5G/5G基因片段可为SEQ ID No.7所示的DNA分子，也可为DNA分子1，该DNA分子1是在SEQ ID No.5的第101和102位中间插入一个核苷酸“G”得到的DNA分子。
所述阳性对照品可以是扩增得到或直接合成得到的含有PAI-1基因4G/5G多态性位点(rs1799762)的PAI-1基因片段，也可以是PAI-1基因的基因组DNA。
所述阳性对照品还可以是含有所述PAI-1基因片段的质粒载体(重组载体)，或含所述PAI-1基因的基因组DNA的质粒载体(重组载体)。
本发明中，采用PAI-1基因基因型为4G/5G的基因组DNA作为阳性对照品。
实时荧光PCR反应条件如表3所示：
表3、实时荧光PCR反应条件
3、结果判定(数据分析)
查看FAM通道扩增曲线进行结果判定(表4)：
(1)若样本A管有扩增曲线升起，B管无扩增曲线升起，则样本为5G/5G纯合子。
(2)若样本A管，B管都有扩增曲线升起，则样本为4G/5G杂合子。
(3)若样本B管有扩增曲线升起，A管无扩增曲线升起，则样本为4G/4G纯合子。
表4、结果判定标准
实施例3、PAI-1基因4G/5G多态性检测方法的灵敏度实验
本实施例以含有PAI-1基因片段的质粒载体、标准genomic DNA(来源于Thermofisher试剂，货号905996)为样本，利用实施例2中的检测方法验证本发明检测方法的灵敏度，具体步骤如下：
1、含有PAI-1基因片段的质粒载体的获得
质粒在生工生物工程(上海)股份有限公司购买，具体构建方法为：将pUC57载体的ATCTAGAT和ATCGGATC间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.5的DNA片段，保持pUC57载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体，作为4G基因型样本。
将pUC57载体的ATCTAGAT和ATCGGATC间的片段(小片段)替换为DNA分子1(在SEQID No.5的第101和102位中间插入一个核苷酸“G”得到的DNA分子。)，保持pUC57载体的其他核苷酸序列不变，得到的重组表达载体，作为5G基因型样本。
2、以质粒载体为样本的灵敏度检测
已知拷贝数的质粒，按表5进行10-1梯度稀释：
表5、梯度稀释的质粒拷贝数
稀释后取2ul按实施例2中的反应体系和条件检测，检测结果如图1(5G反应)和图2(4G反应)所示，结果表明本发明检测方法最低检测限为25copies，表明本发明检测方法具有较高的灵敏度。
3、以genomic DNA为样本的灵敏度检测
用已知基因型为4G/5G型的标准genomic DNA，按表6稀释，稀释后取2ul为模板，按实施例2中的反应体系和条件进行检测，检测结果如图3(5G反应)和图4(4G反应)所示。
表6、梯度稀释的genomic DNA浓度
| 稀释DNA倍数 | 1 | 5 | 10 | 20 | 50 | 100 | 200 |
| 终浓度ng/ul | 20 | 4 | 2 | 1 | 0.4 | 0.2 | 0.1 |
| 2ul总量ng | 40 | 8 | 4 | 2 | 0.8 | 0.4 | 0.2 |
结果表明，以genomic DNA为样本时，本发明检测方法的灵敏度为0.1ng/ul，表明本发明检测方法具有较高的灵敏度。
实施例4、PAI-1基因4G/5G多态性检测方法的准确性及稳定性实验
本实施例通过Sanger测序验证本发明检测方法的准确性和稳定性，待测样本为血液，来源于志愿者的静脉血，具体步骤如下：
共收集212例志愿者的静脉血，使用天根DP304试剂盒提取待测样本基因组DNA，将DNA分为三份，其中一份按照实施例2中的方法鉴定PAI-1rs1799762位点基因型；第二份DNA送至测序公司，使用Sanger测序技术，分析测序结果；第三份DNA送至质谱公司，使用Sequenom Massarray平台进行质谱检测。结果显示，212例样本PAI-1rs1799762基因分型全部正确。
取2ul按实施例2中的反应体系和条件进行实时荧光PCR检测。
检测结果如表7所示，本发明的检测方法与Sanger测序结果完全一致，准确性达到了100％，表明本发明检测方法具有很高的准确性和稳定性。
表7、212例样本的检测结果对比
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以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.用于检测PAI-1基因4G/5G多态性的组合物，其特征在于，所述组合物包括引物F1、引物F2和引物R，所述引物F1为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子，所述引物F2为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子，所述引物R为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括探针，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.4。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述探针的5’端标记FAM，3’端标记TAMRA。
5.用于检测PAI-1基因4G/5G多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-4中任一所述的组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含阳性对照品，所述阳性对照品为下述任一种：
C1)PAI-1 4G/4G基因和PAI-1 5G/5G基因；
C2)PAI-1 4G/4G基因片段和PAI-1 5G/5G基因片段；
C3)含有PAI-1 4G/4G基因的重组载体和含有PAI-1 5G/5G基因的重组载体；
C4)含有PAI-1 4G/4G基因片段的重组载体和含有PAI-1 5G/5G基因片段的重组载体；
所述PAI-1 4G/4G基因和PAI-1 4G/4G基因片段均含有PAI-1基因4G/5G多态性位点中4G/4G多态性位点，所述PAI-1 5G/5G基因和PAI-1 5G/5G基因片段均含有PAI-1基因4G/5G多态性位点中5G/5G多态性位点。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PAI-1 4G/4G基因片段为SEQ IDNo.6所示的DNA分子或SEQ ID No.5所示的DNA分子；所述PAI-1 5G/5G基因片段可为SEQ IDNo.7所示的DNA分子或DNA分子1，所述DNA分子1是在SEQ ID No.5的第101和102位中间插入一个核苷酸“G”得到的DNA分子。
8.权利要求1-4中任一所述的组合物、权利要求6或7中所述PAI-1 4G/4G基因片段、PAI-1 5G/5G基因片段、含有PAI-1 4G/4G基因片段的重组载体或含有PAI-15G/5G基因片段的重组载体的下述任一种应用：
A1)在检测PAI-1基因4G/5G多态性或制备用于检测PAI-1基因4G/5G多态性的产品中的应用；
A2)在检测与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的易感性或制备用于检测与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的易感性的产品中的应用；
A3)在与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的筛查或制备用于与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的筛查的产品中的应用；
A4)在与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的诊断或辅助诊断或制备用于与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病的诊断或辅助诊断的产品中的应用；
A5)在评估与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病风险或制备用于评估与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病风险的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述与PAI-1基因4G/5G多态性相关疾病为心血管疾病、脑血管疾病、静脉血栓、糖尿病、肥胖、高脂血症、妊娠相关疾病、肿瘤或脓毒败血症。
10.一种检测PAI-1基因4G/5G多态性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
B1)提取待测样本基因组DNA；
B2)以所述基因组DNA为模板，用权利要求1-4中任一所述的组合物进行实时荧光PCR反应，采集荧光信号；
B3)根据所述荧光信号确定待测样本的基因型。
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