CN113215243A - 一种用于检测slc22a5基因高频致病变异的荧光定量pcr探针引物组和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR探针引物组和试剂盒，所述探针引物组包括用于扩增SLC22A5基因NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点的上下游引物以及针对所述变异位点的MGB探针，所述试剂盒包括针对检测位点的探针引物组、适用于高CG序列的高效DNA聚合酶、dNTPs、适用于高GC序列的缓冲液体系及用于校准反应液体积的ROX参比荧光染料。本发明的探针引物组和试剂盒可用于快速、准确地体外检测人全血样本中SLC22A5基因NM_003060转录本上的c.1400C>G变异，检测结果用于原发性肉碱缺乏症的辅助诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体来说，涉及一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR探针引物组和试剂盒。
背景技术
原发性肉碱缺乏症(Primary Carnitine Deficiency，以下简称PCD)是一种常染色体隐性遗传病，其临床特点为肉碱代谢出现异常。该病的致病基因为编码有机阳离子转运2型(OCTN2)的SLC22A5基因。PCD的发病年龄跨度较大，但大多数患儿于1个月至7岁发病，平均发病年龄在2岁左右。不同患者的临床表现差异较大，主要有：(1)急性能量代谢障碍，表现为低酮型低血糖、高血氨及代谢性酸中毒等；(2)心肌病，表现为心室肥厚、心功能不全、心律失常及肌酸激酶升高等；(3)肌病，表现为肌无力、肌张力减退、肌痛、运动耐力差、肌肉型肌酸激酶升高、肌纤维内脂质沉积等；(4)肝脏损害，表现为肝肿大、脂肪肝、肝功能异常等，一些出现肝损伤的患儿会急性起病，表现为抽搐、进行性意识障碍等，常被误诊为Reye综合征。此外，反复腹痛、呕吐、胃食管反流等消化道症状，反复感染、喘息等呼吸道表现以及贫血等也有报道。
PCD患病率为(0.8～2.5)/10万。不同地区的患病率存在差异，德国约为0.3/10万，美国约为0.5/10万，葡萄牙约为1/10万，澳大利亚约0.8/10万，沙特阿拉伯约为1.2/10万，日本约2.5/10万；我国上海地区为2.4/10万，浙江省为3.1/10万，中国香港患病率约为1.1/10万，中国台湾患病率约为0.8/10万。本实验室在郑州采集了388例健康备孕人群的DNA，发现致病变异位点NM_003060.3:exon8:c.1400C>G:p.S467C的携带率为1.55％(6/388)，以此推算发病率约为5.98/10万，高于目前文献报道的发病率，目前为止，关于该位点的文献大多数为案例报道，缺乏该致病变异在中国人群中的流行病学报道。综合其他致病位点，PCD在中国的真实发病率必然远高于目前的文献报道。
目前国内外对于原发性肉碱缺乏症筛查方法有全基因组Sanger测序、串联质谱、临床检查。其中全基因的测序费用过高，很难满足目前临床实际需求。
建立快速、准确的检测原发性肉碱缺乏症的方法具有重要意义。结合国内情况，在早期筛查出原发性肉碱缺乏症，对于新生儿患者应用肉碱替代治疗，维持血浆游离肉碱水平正常或接近正常，可以避免其发育不良问题。相比较而言，荧光PCR是针对遗传物质DNA/RNA进行检测的手段，准确度较高，假阳性率较低，有助于进行普遍筛查，降低原发性肉碱缺乏症新生儿出生率，同时可以帮助更多的患病儿童维持正常生活。目前，还没有专门针对该变异位点的荧光定量PCR引物、探针和试剂盒。本发明采用实时荧光定量PCR的方法，能够在较短的时间内实现原发性肉碱缺乏症携带者与患者的筛查。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR探针引物组和试剂盒，能够克服现有技术的上述不足。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR探针引物组，所述探针引物组包括用于扩增SLC22A5基因NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点的上下游引物以及针对所述变异位点的MGB探针，所述探针引物组的序列为：
SLC22A5-F1的序列如SEQ ID NO.1所示；
SLC22A5-R1的序列如SEQ ID NO.2所示；
SLC22A5-F2的序列如SEQ ID NO.3所示；
SLC22A5-R2的序列如SEQ ID NO.4所示；
SLC22A5-F3的序列如SEQ ID NO.5所示；
SLC22A5-F4的序列如SEQ ID NO.6所示；
SLC22A5-R4的序列如SEQ ID NO.7所示；
SLC22A5-F5的序列如SEQ ID NO.8所示；
SLC22A5-R5的序列如SEQ ID NO.9所示；
SLC22A5-Probe1的序列如SEQ ID NO.10所示；
SLC22A5-Probe2的序列如SEQ ID NO.11所示；
SLC22A5-Probe4的序列如SEQ ID NO.12所示；
SLC22A5-Probe6的序列如SEQ ID NO.13所示。
进一步地，SLC22A5-Probe1的5'端标记FAM，3'端标记MGB。
进一步地，SLC22A5-Probe2、SLC22A5-Probe4、SLC22A5-Probe6的5'端均标记VIC，3'端均标记MGB。
根据本发明的另一方面，提供了一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR试剂盒，包括针对检测位点设计的探针引物组，所述探针引物组包括用于扩增SLC22A5基因NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点的上下游引物以及针对所述变异位点的MGB探针，所述探针引物组的序列为：
SLC22A5-F1的序列如SEQ ID NO.1所示；
SLC22A5-R1的序列如SEQ ID NO.2所示；
SLC22A5-F2的序列如SEQ ID NO.3所示；
SLC22A5-R2的序列如SEQ ID NO.4所示；
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SLC22A5-F5的序列如SEQ ID NO.8所示；
SLC22A5-R5的序列如SEQ ID NO.9所示；
SLC22A5-Probe1的序列如SEQ ID NO.10所示；
SLC22A5-Probe2的序列如SEQ ID NO.11所示；
SLC22A5-Probe4的序列如SEQ ID NO.12所示；
SLC22A5-Probe6的序列如SEQ ID NO.13所示。
进一步地，所述荧光定量PCR试剂盒还包括适用于高CG序列的高效DNA聚合酶、dNTPs、适用于高GC序列的缓冲液体系及用于校准反应液体积的ROX参比荧光染料。
进一步地，当FAM和VIC双通道都出现明显的扩增曲线，且FAM通道和VIC通道的Ct值差距不大于1.0时，待测样本为SLC22A5基因NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点携带者DNA；当VIC通道出现明显的扩增曲线，且FAM通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0时，待测样本为SLC22A5基因NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点的野生型DNA；当FAM通道出现明显的扩增曲线，且VIC通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0，待测样本为纯合突变的患者DNA。
本发明的有益效果：本发明的探针引物组和试剂盒可用于快速、准确地体外检测人全血样本中SLC22A5基因NM_003060转录本上的c.1400C>G变异，检测结果用于原发性肉碱缺乏症(primary carnitine deficiency，PCD)的辅助诊断，该变异的致病性明确，且在正常人群中携带率较高(1.55％，6/388)；该反应体系可以使用人基因组DNA溶液作为模板，也可以使用未溶血的全血作为模板直接检测，省去了DNA提取的过程；该反应体系的探针/引物群经过优化，等位基因之间的扩增效率差异达到最大化，使实验人员可以方便准确的解读结果，不需要进行内参基因的比对或使用delta-delta-Ct法进行计算分析；该反应体系既适用于Ct值的判读，也可以使用终点法进行判读；相较于NGS和其他检测手段，荧光定量PCR的成本低廉，准确性得到公认，适合在临床推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明实施例2所述的log对数曲线实验结果；
图2是根据本发明实施例2所述的Linear线性扩增曲线实验结果；
图3是根据本发明实施例3所述的log对数曲线实验结果；
图4是根据本发明实施例3所述的Linear线性扩增曲线实验结果；
图5是根据本发明实施例4所述的log对数曲线实验结果；
图6是根据本发明实施例4所述的Linear线性扩增曲线实验结果；
图7是根据本发明实施例5所述的log对数曲线实验结果；
图8是根据本发明实施例5所述的Linear线性扩增曲线实验结果；
图9是根据本发明实施例6所述的log对数曲线实验结果；
图10是根据本发明实施例6所述的Linear线性扩增曲线实验结果；
图11是根据本发明实施例7所述的终点法进行SNP分型的结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR试剂盒，包括针对检测位点设计的探针引物组，所述探针引物组包括用于扩增SLC22A5基因NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点的上下游引物以及针对所述变异位点的MGB探针，所述探针引物组的序列如表1-2所示：
表1引物序列
表2MGB探针序列
采用上述试剂盒对待测样本进行检测的方法为：
(1)按照表3进行试剂配制；
表3试剂配制
| 组分 | 体积ul | 终浓度 |
| primer F(10μM) | 1.8 | 0.9μM |
| primer R(10μM) | 1.8 | 0.9μM |
| TaqMan Probe 1(10μM) | 0.4 | 0.2μM |
| TaqMan Probe 2(10μM) | 0.4 | 0.2μM |
| qPCR反应缓冲液 | 10 | |
| 模板(DNA溶液) | 2 | |
| RNase-free ddH2O | 3.6 | |
| 总体积 | 20 |
(2)扩增程序如表4所示。
表4扩增程序
实施例2
采用实施例1所述的试剂盒检测SLC22A5基因高频致病变异，当使用野生型DNA作为模板时，检测结果如表5所示：
表5野生型DNA检测结果
| 反应孔位置 | 样本名 | 等位基因 | 报告基团 | Ct值 |
| A2 | 235-3/2 | G | FAM | 31.54 |
| A2 | 235-3/2 | C | VIC | 24.31 |
| B2 | 237-3/2 | G | FAM | 29.56 |
| B2 | 237-3/2 | C | VIC | 23.72 |
| C2 | 611-3/2 | G | FAM | 29.93 |
| C2 | 611-3/2 | C | VIC | 24.18 |
| D2 | 3/2-BLANK | G | FAM | Undetermined |
| D2 | 3/2-BLANK | C | VIC | Undetermined |
其中，样本235、237和611为野生型人基因组DNA，3/2-BLANK为使用纯化水的空白对照。阈值线设置为0.1。由表5可知，VIC信号的平均Ct值为24.07，标准差为0.3106；而FAM信号的平均Ct值为30.34，标准差为1.0510；log对数曲线实验结果如图1所示，Linear线性扩增曲线实验结果如图2所示，linear曲线中几乎观测不到FAM通道的扩增曲线。
实施例3
采用实施例1所述的试剂盒检测SLC22A5基因高频致病变异，当使用杂合型DNA作为模板时，检测结果如表6所示：
表6杂合型DNA检测结果
| 反应孔位置 | 样本名 | 等位基因 | 报告基团 | Ct值 |
| A1 | SLC22A5-1-1 | G | FAM | 24.65 |
| A1 | SLC22A5-1-1 | C | VIC | 25.12 |
| B1 | SLC22A5-2-2 | G | FAM | 24.60 |
| B1 | SLC22A5-2-2 | C | VIC | 25.20 |
| C1 | SLC22A5-3-2 | G | FAM | 24.69 |
| C1 | SLC22A5-3-2 | C | VIC | 25.25 |
| D1 | SLC22A5-BLANK | FAM | FAM | Undetermined |
| D1 | SLC22A5-BLANK | VIC | VIC | Undetermined |
其中，样本SLC22A5-1-1、SLC22A5-2-2和SLC22A5-3-2均为变异位点NM_003060.3:exon8:c.1400C>G的杂合型人基因组DNA，SLC22A5-BLANK为使用纯化水的空白对照。阈值线设置为0.1。由表6可知，VIC信号的平均Ct值为25.19，标准差为0.0656；而FAM信号的平均Ct值为24.65，标准差为0.0451；log对数曲线实验结果如图3所示，Linear线性扩增曲线实验结果如图4所示。
实施例4
采用实施例1所述的试剂盒检测SLC22A5基因高频致病变异，当PCD患者的纯合突变DNA作为模板时，检测结果如表7所示：
表7纯合突变DNA检测结果
其中，样本Homozygous-DNA-1至Homozygous-DNA-6为人工合成的SLC22A5基因片段，并且带有纯合突变的NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点；BLANK-1、BLANK-2和BLANK-3为使用纯化水为模板的空白对照。阈值线设置为0.1。由表7可知，VIC信号的平均Ct值为30.51，标准差为0.2828；而FAM信号的平均Ct值为26.26，标准差为01700。log对数曲线实验结果如图5所示，Linear线性扩增曲线实验结果如图6所示。
实施例5
采用实施例1所述的试剂盒检测SLC22A5基因高频致病变异，当使用正常人的野生型全血(EDTA抗凝)时，检测结果如表8所示：
表8野生型全血检测结果
| 反应孔位置 | 样本名称 | 等位基因 | 报告基团 | Ct值 |
| A6 | whole blood-1 | G | FAM | 37.30 |
| A6 | whole blood-1 | C | VIC | 33.76 |
| A7 | whole blood-2 | G | FAM | 37.18 |
| A7 | whole blood-2 | C | VIC | 33.48 |
| A8 | whole blood-3 | G | FAM | 36.29 |
| A8 | whole blood-3 | C | VIC | 33.49 |
| B6 | whole blood-4 | G | FAM | 36.64 |
| B6 | whole blood-4 | C | VIC | 33.78 |
| B7 | whole blood-5 | G | FAM | 36.91 |
| B7 | whole blood-5 | C | VIC | 33.33 |
| B8 | whole blood-6 | G | FAM | 36.55 |
| B8 | whole blood-6 | C | VIC | 33.43 |
| C6 | tap water-1 | G | FAM | Undetermined |
| C6 | tap water-1 | C | VIC | Undetermined |
| C7 | tap water-2 | G | FAM | Undetermined |
| C7 | tap water-2 | C | VIC | Undetermined |
| C8 | tap water-3 | G | FAM | Undetermined |
| C8 | tap water-3 | C | VIC | Undetermined |
其中，样本whole blood-1至whole blood-6为正常人的全血样本，tap water-1至tap water-6为使用纯化水的空白对照。阈值线设置为0.1。由表8可知，VIC信号的平均Ct值为33.54，标准差为0.1854；而FAM信号的平均Ct值为36.81，标准差为0.3863；空白对照均无Ct值。log对数曲线实验结果如图7所示，Linear线性扩增曲线实验结果如图8所示。
实施例6
采用实施例1所述的试剂盒检测SLC22A5基因高频致病变异，当使用携带者的杂合型全血(EDTA抗凝)时，检测结果如表9所示：
表9杂合型全血检测结果
| 反应孔位置 | 样本名称 | 等位基因 | 报告基团 | Ct值 |
| A9 | SLC22A5-1-1 | G | FAM | 28.51 |
| A9 | SLC22A5-1-1 | C | VIC | 28.81 |
| B9 | SLC22A5-2-2 | G | FAM | 28.45 |
| B9 | SLC22A5-2-2 | C | VIC | 28.74 |
| C9 | SLC22A5-3-2 | G | FAM | 28.49 |
| C9 | SLC22A5-3-2 | C | VIC | 28.80 |
其中，样本SLC22A5-1-1、SLC22A5-2-2和SLC22A5-3-2为携带者的全血样本。阈值线设置为0.1。由表9可知，VIC信号的平均Ct值为28.78，标准差为0.0393；而FAM信号的平均Ct值为28.48，标准差为0.0351。log对数曲线实验结果如图9所示，Linear线性扩增曲线实验结果如图10所示。
实施例7
采用实施例1所述的试剂盒检测SLC22A5基因高频致病变异，当使用终点法进行SNP分型时，结果如表10和图11所示。
表10SNP分型结果
其中，样本Homozygous-DNA-1至Homozygous-DNA-5为人工合成的SLC22A5基因片段，并且带有纯合突变的NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点；235-3/2、237-3/2和611-3/2为野生型的人基因组DNA；SLC22A5-1-1、SLC22A5-2-2和SLC22A5-3-2为携带者的杂合型人基因组DNA；BLANK-1、BLANK-2、BLANK-3和BLANK-4为使用纯化水为模板的空白对照。阈值线设置为自动。由表10可知，根据终点法判定的SNP和样本基因型完全一致，符合率为100％。
综上所述，使用本发明所述的试剂盒检测SLC22A5基因高频致病变异，当使用SLC22A5基因NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点携带者DNA作为模板时，可以观察到FAM和VIC双通道都出现了明显的扩增曲线，且FAM通道和VIC通道的Ct值差距不大于1.0；当使用SLC22A5基因NM_003060.3:exon8:c.1400C>G变异位点的野生型DNA作为模板时，可以观察到VIC通道出现明显的扩增曲线，且FAM通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0；纯合突变的患者DNA作为模板时，可以观察到FAM通道出现明显的扩增曲线，且VIC通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0；该反应体系既适用于Ct值的判读，也可以使用终点法进行判读；相较于NGS和其他检测手段，荧光定量PCR的成本低廉，准确性得到公认，适合在临床推广。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京华诺奥美医学检验实验室有限公司
<120> 一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR探针引物组和试剂盒
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggtgggca agtttggagt 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtaaacgaag tagggagaca ggat 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggagtcacgg ctgcctttt 19
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtaaacgaa gtagggagac agg 23
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agtcacggct gccttttcc 19
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cacggctgcc ttttcca 17
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccaaggtaaa cgaagtaggg aga 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcccacagtg gtgagaaaca tg 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgaagtaggg agacaggatg ct 22
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agtcagctgc acagc 15
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agtcagctcc acagca 16
<210> 12
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggagtcagct ccac 14
<210> 13
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gctccacagc atc 13
Claims (6)
1. 一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR探针引物组，其特征在于，所述探针引物组包括用于扩增SLC22A5基因NM_003060.3: exon8: c.1400C>G变异位点的上下游引物以及针对所述变异位点的MGB探针，所述探针引物组的序列为：
SLC22A5-F1的序列如SEQ ID NO.1所示；
SLC22A5-R1的序列如SEQ ID NO.2所示；
SLC22A5-F2的序列如SEQ ID NO.3所示；
SLC22A5-R2的序列如SEQ ID NO.4所示；
SLC22A5-F3的序列如SEQ ID NO.5所示；
SLC22A5-F4的序列如SEQ ID NO.6所示；
SLC22A5-R4的序列如SEQ ID NO.7所示；
SLC22A5-F5的序列如SEQ ID NO.8所示；
SLC22A5-R5的序列如SEQ ID NO.9所示；
SLC22A5-Probe1的序列如SEQ ID NO.10所示；
SLC22A5-Probe2的序列如SEQ ID NO.11所示；
SLC22A5-Probe4的序列如SEQ ID NO.12所示；
SLC22A5-Probe6的序列如SEQ ID NO.13所示。
2.根据权利要求1所述的用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR探针引物组，其特征在于，SLC22A5-Probe1的5'端标记FAM，3'端标记MGB。
3.根据权利要求1所述的用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR探针引物组，其特征在于，SLC22A5-Probe2、SLC22A5-Probe4、SLC22A5-Probe6的5'端均标记VIC，3'端均标记MGB。
4. 一种用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括针对检测位点的探针引物组，所述探针引物组包括用于扩增SLC22A5基因NM_003060.3:exon8: c.1400C>G变异位点的上下游引物以及针对所述变异位点的MGB探针，所述探针引物组的序列为：
SLC22A5-F1的序列如SEQ ID NO.1所示；
SLC22A5-R1的序列如SEQ ID NO.2所示；
SLC22A5-F2的序列如SEQ ID NO.3所示；
SLC22A5-R2的序列如SEQ ID NO.4所示；
SLC22A5-F3的序列如SEQ ID NO.5所示；
SLC22A5-F4的序列如SEQ ID NO.6所示；
SLC22A5-R4的序列如SEQ ID NO.7所示；
SLC22A5-F5的序列如SEQ ID NO.8所示；
SLC22A5-R5的序列如SEQ ID NO.9所示；
SLC22A5-Probe1的序列如SEQ ID NO.10所示；
SLC22A5-Probe2的序列如SEQ ID NO.11所示；
SLC22A5-Probe4的序列如SEQ ID NO.12所示；
SLC22A5-Probe6的序列如SEQ ID NO.13所示。
5.根据权利要求4所述的用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，还包括DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液体系及ROX参比荧光染料。
6. 根据权利要求4所述的用于检测SLC22A5基因高频致病变异的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，当FAM和VIC双通道都出现明显的扩增曲线，且FAM通道和VIC通道的Ct值差距不大于1.0时，待测样本为SLC22A5基因NM_003060.3: exon8: c.1400C>G变异位点携带者DNA；当VIC通道出现明显的扩增曲线，且FAM通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0时，待测样本为SLC22A5基因NM_003060.3: exon8: c.1400C>G变异位点的野生型DNA；当FAM通道出现明显的扩增曲线，且VIC通道无明显扩增曲线，或有微弱扩增曲线且双通道间Ct值相差大于2.0，待测样本为纯合突变的患者DNA。
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