CN109811043A - 基于Taqman-MGB探针的基因多态性检测方法及检测试剂盒 - Google Patents
基于Taqman-MGB探针的基因多态性检测方法及检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基于Taqman‑MGB探针法的基因多态性检测方法及检测试剂盒，该方法包括：(1)人工合成含有待测位点的野生型和突变型序列的质粒DNA，并制备待测位点各基因型参考品；(2)配制待测位点的PCR反应液，体系内包含一对扩增引物及野生型探针、突变型探针；(3)采用待测位点PCR反应液检测各基因型参考品，设置基线、阈值后分析得到Ct野生型和Ct突变型，其中基线设为6～18或手动调整，阈值取各荧光通道荧光增量的5％～50％；(4)计算ΔCt值＝Ct突变型‑Ct野生型；(5)采用所述ΔCt值判断被测多态性位点基因型。该方法能快速灵敏地检测基因多态性，且采用ΔCt值作分型分析可避免分型错误。
Description
技术领域
本发明涉及遗传基因检测技术领域，尤其涉及一种基于Taqman-MGB探针的基因多态性检测方法及检测试剂盒。
背景技术
单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism，SNP)是主要指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，即指基因组内特定核苷酸位置上,存在两种不同的核苷酸。SNP是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多，是继微卫星之后的第三代遗传标记。一般情况下，SNP位点只有两种碱基组成，是一种二态标记，即二等位基因(biallelic)。具有单核苷酸多态性的基因有很多，例如：(1)人CYP2C19基因具有遗传多样性，CYP2C19*2(G681A)与CYP2C19*3(G636A)是中国人群中最常见的遗传变异类型，可造成酶活性丧失，导致人群出现快代谢(EM)、中间代谢(IM)及慢代谢(PM)三种表型。研究表明，CYP2C19参与氯吡格雷活性代谢产物和中间代谢产物的形成。氯吡格雷活性代谢物的药代动力学和抗血小板作用随着CYP2C19基因型的不同而有差异。CYP2C19慢代谢型(PM)患者应用常规剂量的氯吡格雷后体内活性代谢物生产减少，对血小板的抑制作用下降。人CYP2C19基因多态性检测可为临床提供氯吡格雷用药参考。(2)人MTHFR基因具有遗传多样性，C677T与A1298C是最常见的多态性位点，引起酶分子热稳定性和活性下降。MTHFR基因编码的亚甲基四氢叶酸还原酶是同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)代谢过程中的关键酶，催化5,10-亚甲基四氢叶酸为5-甲基四氢叶酸，后者提供甲基给Hcy合成甲硫氨酸和四氢叶酸。研究表明，MTHFR酶活性降低是血Hcy水平升高的原因之一，而血Hcy水平升高则是心脑血管事件的独立危险因素，与心脑血管事件风险呈正相关。(3)人ALDH2基因具有遗传多样性。中国人群中，ALDH2基因最常见的多态性位点为G1510A，又称ALDH2*2；携带ALDH2*2突变等位基因的个体酶活性大幅下降，杂合子个体酶活性仅为野生型个体的10％，突变纯合子个体酶活性缺失。ALDH2基因编码的线粒体乙醛脱氢酶是抗心绞痛急性发作药物硝酸甘油的重要代谢酶，可将硝酸甘油代谢为具有药理活性的一氧化氮。研究表明，携带ALDH2*2等位基因的个体代谢硝酸甘油的能力下降，硝酸甘油抗心肌缺血的效应减弱。国家卫生计生委医政医管局印发的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》中指出：携带ALDH2*2等位基因的心绞痛患者应尽可能改用其他急救药物，避免硝酸甘油含服无效。
SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤，它为生物学的基础研究提供了一个强有力的工具。目前，SNP已应用于遗传图谱绘制的标记、疾病诊断和疾病易感基因的鉴别、药物基因组学研究和新药筛选、药物代谢和药物遗传学、法医鉴定和个体识别、群体遗传学研究和遗传多态性分析、物种鉴定、菌种鉴定等。另外，通过对Y染色体SNP的分析，使得在人类进化、人类种群的演化和迁徙领域取得了一系列重要成果。
目前，常用的SNP检测技术包括基因测序、Taqman-MGB探针法、等位基因特异性PCR(AS-PCR)、SNPshot、引物延伸法、基因芯片法、高分辨率熔解曲线法(HRM)等。商业化SNP检测试剂盒主要基于实时荧光定量PCR平台，采用Taqman-MGB探针法、等位基因特异性PCR(AS-PCR)、高分辨率熔解曲线法(HRM)等荧光PCR技术。
Taqman-MGB探针法核心是在Taqman探针3’端偶联有MGB(minor groovebinder)基团，这样的设计大大提高了探针检测单碱基差异的分辨率，显著提高了SNP检测的特异性。Taqman-MGB探针法是商业化试剂盒最主流的检测方法，是采用两种荧光基团(常用FAM、VIC)分别标记野生型与突变型：1)检测野生型样本时，仅有野生型探针与野生型模板DNA形成稳定退火结构，PCR时退火的野生型探针的荧光基团被切割，从而发出单色光；2)检测突变型样本时，仅有突变型探针与突变型模板DNA形成稳定退火结构，PCR时退火的突变型探针的荧光基团被切割，从而发出单色光；3)检测杂合型样本时，野生型探针与野生型模板DNA形成稳定退火结构，同时，突变型探针与突变型模板DNA形成稳定退火结构，PCR时退火的两条探针各自的荧光基团均被切割，从而发出双色光。
等位基因特异性PCR(Allele-specificPCR，AS-PCR)又称作ARMS-PCR(Amplification refractory mutation system PCR)，其基本原理：根据SNP位点设计两条特异性引物，其中野生型扩增引物的3′末端与野生碱基互补(或相同)，突变型扩增引物的3′末端与突变碱基互补(或相同)。目前，不少商业化SNP检测试剂盒采用AS-PCR方法，是在两个反应孔内检测一个SNP位点，其中含有野生型扩增引物的反应孔检测野生型DNA，含有突变型扩增引物的反应孔检测突变型DNA。
高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分型技术，其基本原理是：双链DNA(dsDNA)的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中dsDNA解链行为的改变。因为所用的荧光染料只能嵌入并结合到dsDNA上，因此利用实时PCR技术，通过实时监测dsDNA熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将PCR产物中存在的差异直观地展示出来，借助于专业软件分析从而实现基因分型。目前，也有个别商业化SNP检测试剂盒采用了HRM技术。
Taqman-MGB探针法、AS-PCR法、HRM法检测SNP时均具有快速、便捷、高灵敏等特征，其中Taqman-MGB探针法由于具有更高特异性(特异性荧光探针)、更高检测通量(一个SNP位点可在一个反应孔内完成检测)以及更好的通用性(受序列影响较小)，已成为最受商业化SNP检测试剂盒青睐的SNP检测技术。
绝大多少SNP位点只有两种碱基组成，可形成三种基因型个体：野生型(100％为野生型DNA)、杂合型(50％为野生型DNA、50％为突变型DNA)、突变型(100％为突变型DNA)，因此，三种基因型个体中，野生型DNA与突变型DNA的浓度差异是恒定不变的，这一属性与肿瘤组织中基因突变含量的随机性、连续性截然不同。
Taqman-MGB探针法是在一个反应孔内检测一个SNP位点，其中FAM标记野生型(或突变型)，VIC标记突变型(或野生型)。根据荧光PCR技术理论，两个荧光通道的阈值循环数(Ct值)代表野生型、突变型DNA的浓度，而ΔCt值代表野生型、突变型DNA的浓度差异；ΔCt值的绝对值越大，表示野生型DNA与突变型DNA的浓度差异也越大。对于只有两种碱基组成的SNP位点，三种基因型个体中的野生型DNA与突变型DNA的浓度差异是恒定的，不同基因型对应的ΔCt值应当稳定在一个范围内，且各基因型对应的ΔCt值范围具有显著差异。
PCR是一种体外扩增技术，于1-2小时内将目的基因片段放大几万甚至几百万倍，灵敏度非常高。按照相关管理制度，临床检验的PCR实验必须在临床基因扩增实验室内，由取得PCR上岗证的专业技术人员操作完成。然而，现实中，不同PCR实验室的设计装修水平及PCR技术人员的专业熟练度、实验室管理水平等均有明显差异，PCR实验室发生污染是比较常见的，特别是人源性基因组检测(如人类SNP检测)时容易发生环境污染。
目前，一些商业化SNP检测试剂盒或行业研究人员采用Taqman-MGB探针法检测SNP时，仅对两个荧光通道的阈值循环数(Ct值)作具体要求(如呈典型指数扩增且Ct值满足一定条件时为阳性)，忽略了两个荧光通道Ct值间的ΔCt值，即忽略了不同基因型个体中的野生型DNA与突变型DNA的浓度差异是恒定不变的根本事实。对于PCR实验室内长期使用忽略ΔCt值的检测设计，如若实验室发生人源性基因组污染，则可能显著增加检测错误率。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了一种基于Taqman-MGB探针的基因多态性检测方法及检测试剂盒，该检测方法采用ΔCt值做分型分析，能快速灵敏地检测基因多态性，由于ΔCt值是恒定不变的，因而该检测方法准确率高，即使发生人源性基因组污染，也能避免分型错误。
本发明是这样实现的：
本发明的目的之一在于提供了一种基于Taqman-MGB探针的基因多态性检测方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1、人工合成含有目标基因被测多态性位点的野生型和突变型目标序列的质粒DNA，并制备被测多态性位点各基因型参考品；或使用不同基因型人基因组DNA制备各基因型参考品；
步骤2、配制待测基因多态性位点的PCR反应液，所述PCR反应液包括检测目标基因待测多态性位点的上、下游引物，及目标基因的待测多态性位点的突变型探针和野生型探针，突变型采用FAM或VIC/HEX标记，野生型采用VIC/HEX或FAM标记；
步骤3、应用被测位点PCR反应液检测各基因型参考品，设置基线、阈值后分析得到Ct野生型和Ct突变型，其中基线设为6～18或手动调整，阈值取各荧光通道荧光增量的5％～50％；
步骤4、计算ΔCt值＝Ct突变型-Ct野生型；
步骤5、根据所述ΔCt值判断基因型，判断标准为：
a、当ΔCt值＞4时，该待测基因的被测多态性位点为野生型；
b、-3＜ΔCt值＜3时，该待测基因的被测多态性位点为杂合型；
c、ΔCt值＜-4时，该待测基因的被测多态性位点为突变型。
需要说明的是，上述方法也可以计算ΔCt值的绝对值(|Ct野生型-Ct突变型|或|Ct突变型-Ct野生型|)，当ΔCt值的绝对值＜3时，该待测基因的被测多态性位点为杂合型；当ΔCt值的绝对值＞4时，该待测基因的被测多态性位点为野生型或者突变型；进一步看若Ct突变型＞Ct野生型，该待测基因的被测多态性位点为野生型；进一步看若Ct突变型＜Ct野生型，该待测基因的被测多态性位点为突变型。
优选地，所述PCR反应液还包括5×TaqMan-MGB Genotyping MasterMix。
优选地，所述待测基因的被测多态性位点包括人CYP2C19基因的G681A和G636A两个SNP位点；人MTHFR基因的C677T和A1298C两个SNP位点；人ALDH2基因的G1510A位点。
优选地，所述步骤3中荧光PCR扩增检测的反应条件为：37℃5min；95℃2min；95℃10S，60℃40秒，循环45次。
本发明的目的之二在于提供了一种采用所述的基因多态性检测方法的基因多态性检测试剂盒。
优选地，所述试剂盒包括人CYP2C19基因的多态性检测试剂盒，包括如下两对引物及其对应的探针：
(1)用于人CYP2C19基因G681A SNP位点检测的引物和探针：
上游引物CYP2C19681F：5’-GATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTG-3’
下游引物CYP2C19681R：5’-CTCCAAAATATCACTTTCCATAAAAGC-3’
突变探针CYP2C19681A：5’FAM-TATTTCCCAGGAACC-3’MGB；
野生探针CYP2C19681G：5’VIC-TATTTCCCGGGAACC-3’MGB；
(2)用于人CYP2C19基因G636A SNP位点检测的引物和探针：
上游引物CYP2C19636F：5’-GATGGAAAAATTGAATGAAAACATCA-3’
下游引物CYP2C19636R：5’-GTGGTTTCTCAGGAAGCAAAAAAC-3’
突变探针CYP2C19636A：5’FAM-CACCCCCTGGATC-3’MGB；
野生探针CYP2C19636G：5’VIC-CACCCCCTGAATC-3’MGB。
优选地，所述试剂盒包括人MTHFR基因的多态性检测试剂盒，包括如下两对引物及其对应的探针：
(1)用于人MTHFR基因C677T SNP位点检测的引物和探针：
上游引物MTHFR 677F：5’-CCGAAGCAGGGAGCTTTG-3’
下游引物MTHFR 677R：5’-CGGTGCATGCCTTCACAA-3’
突变探针MTHFR 677T：5’FAM-TCTGCGGGAGTCG-3’MGB；
野生探针MTHFR 677C：5’VIC-CTGCGGGAGCCGA-3’MGB；
(2)用于人MTHFR基因A1298C SNP位点检测的引物和探针：
上游引物MTHFR 1298F：5’-GAGCTGCTGAAGATGTGGGG-3’
下游引物MTHFR 1298R：5’-GTTCTCCCGAGAGGTAAAGAACG-3’
突变探针MTHFR 1298C：5’FAM-AGTGAAGCAAGTGTC-3’MGB；
野生探针MTHFR 1298A：5’VIC-CAGTGAAGAAAGTGTC-3’MGB。
优选地，所述试剂盒包括人ALDH2基因G1510A位点的多态性检测试剂盒，包括如下一对引物及其对应的探针：
上游引物ALDH21510F：5’-GAGTTGGGCGAGTACGGG-3’
下游引物ALDH21510R：5’-CCAGCAGGTCCCACACTCA-3’
突变探针ALDH21510A：5’FAM-CATACACTAAAGTGAAAAC-3’MGB；
野生探针ALDH21510G：5’VIC-CATACACTGAAGTGAAAA-3’MGB。
优选地，所述试剂盒包括5×TaqMan-MGB Genotyping MasterMix。
本发明具有的有益效果是：
该检测方法及检测试剂盒采用Taqman-MGB探针法检测人类基因SNP，在一个反应孔内检测一个SNP位点，突变型采用FAM标记，野生型采用VIC标记，固定取各荧光通道ΔRn(荧光增量)的5％～30％作为阈值，软件分析即得到FAM、VIC通道的Ct值，分别代表突变型DNA浓度及野生型DNA浓度，FAM、VIC通道的Ct值差值(ΔCt值，即CtFAM-CtVIC)代表突变型DNA与野生型DNA浓度的差异，根据差值ΔCt值即可判断基因型：
(1)该检测方法速度快、操作简便、步骤简洁：能够快速灵敏地检测待测位点基因类型，从而准确对基因多态性进行基因分型。
(2)重复性好，效果稳定：采用Taqman-MGB探针法检测人类基因SNP，并使用两个等位基因荧光通道Ct值差异作结果分析时，即使非常低浓度的样本的重复性较差，但依然可以得出具有非常大差异的可以判断基因型的ΔCt值区间。
(3)基因检测错误率为0：不同基因型个体中的野生型DNA与突变型DNA的浓度差异ΔCt值是恒定不变的，因而即使实验室发生人源性基因组污染，也不会出现错误的基因检测，从而避免了分型错误。
附图说明
图1为人CYP2C19基因681位点ΔCt值统计图；
图2为人CYP2C19基因636位点ΔCt值统计图；
图3为人MTHFR基因677位点ΔCt值统计图；
图4为人MTHFR基因1298位点ΔCt值统计图；
图5为人ALDH2基因1510位点ΔCt值统计图。
具体实施方式
实施例1人CYP2C19基因多态性检测
一、设计引物/探针：
在NCBI数据库中检索人类CYP2C19编码基因的参考序列NG_008384.3，分别截取681、636两个位点及两侧序列作为目标序列。使用Primer Express3.0软件，新建选择“MGB Allelic Discrimination”，将681目标序列粘贴至序列框内，设置681位点为G/A多态进行设计，结果见表1。相同方法得到636位点的引物/探针(见表1)。
表1-引物/探针序列
二、准备样本
标准样本：人工合成含有CYP2C19基因681、636两个位点野生型或突变型目标序列的质粒DNA共4个：681G-Temp、681A-Temp、636G-Temp、636A-Temp。质粒DNA呈干粉状，用1×TE溶解后离心，使用超微量分光光度计Nanodrop 2000C进行浓度测定，并将测定的质量浓度换算为拷贝数浓度；按照人基因组DNA为300拷贝/ng计算，将质粒DNA的拷贝数浓度换算为相当于人基因组DNA的浓度。使用1×TE缓冲液、681G-Temp和681A-Temp配制6个不同浓度的681GG型参考品、681GA型参考品、681AA型参考品；使用1×TE缓冲液、636G-Temp和636A-Temp配制6个不同浓度的636GG型参考品、636GA型参考品、636AA型参考品。两个位点三种基因型均有6个浓度参考品：1ng/μl、5ng/μl、25ng/μl、125ng/μl、250ng/μl和500ng/μl。
三、Taqman-MGB探针法体系
1、使用位点特异性引物(Invitrogen)、Taqman-MGB探针(AppliedBiosystems)、无核酸酶超纯水(Life technologies)、5×TaqMan-MGB GenotypingMasterMix(武汉明德生物)等配制681位点检测体系和636位点检测体系(见表2)，PCR循环参数见表3。
表2-Taqman-MGB探针法681、636两个位点检测体系
表3-CYP2C19基因检测Taqman-MGB探针法PCR循环参数
2、PCR结果分析：全选681位点反应孔，依次分析野生型681G(VIC)与突变型681A(FAM)两个检测通道：基线设为6～18或根据实际情况手动调整，取野生型681G、突变型681A各自的荧光增量ΔRn的10％(5％～50％均可)作为阈值，软件分析后得到Ct681G和Ct681A，计算ΔCt681(Ct681A-Ct681G)。相同方法分析后得到Ct636G和Ct636A，计算ΔCt636(Ct636A-Ct636G)。
四、阳性判断值研究
1、使用质粒DNA配制的参考品模拟不同浓度的各基因型样本DNA。应用681位点Taqman-MGB探针法体系检测681GG、681GA、681AA分别对应的6个浓度参考品(共18个参考品)，各设4复孔。设定基线、阈值后分析得到各反应孔Ct值，计算各孔ΔCt值(Ct突变型-Ct野生型)，详见表4。SPSS20.0统计分析ΔCt值，结果见表5和图1。同时，综合考虑实验室环境、仪器性能及样本均存在差异性，将各基因型ΔCt值范围略微调整并取整，初步得出681位点阳性判断值为：ΔCt值＞8为681GG型；ΔCt值＜-9为681AA型；-2＜ΔCt＜2为681GA型；其他区间为检测灰区。
2、应用636位点Taqman-MGB探针法体系检测636GG、636GA、636AA分别对应的6个浓度参考品(共18个参考品)，各设4复孔。设定基线、阈值后分析得到各反应孔Ct值，计算各孔ΔCt值(Ct突变型-Ct野生型)，详见表6。SPSS20.0统计分析ΔCt值，结果见表7和图2。同时，综合考虑实验室环境、仪器性能及样本均存在差异性，将各基因型ΔCt值范围略微调整并取整，初步得出636位点阳性判断值为：ΔCt值＞5为636GG型；ΔCt值＜-11为636AA型；-3＜ΔCt＜1为636GA型；其他区间为检测灰区。
表4-CYP2C19基因681位点阳性判断值研究实验数据
表5-CYP2C19基因681位点ΔCt值统计
DeltaCt
表6-CYP2C19基因636位点阳性判断值研究实验数据
表7-CYP2C19基因636位点ΔCt值统计
DeltaCt
五、临床样本检测
1、临床样本：随机收集临床实验室完成检验后剩余的EDTA外周血样本211例，使用血液基因组提取试剂盒(北京天根生化)进行核酸提取，提取的核酸于-20℃保存备用。
2、Sanger测序是公认的基因序列分析的“金标准”方法，本实例采用Sanger测序对临床样本CYP2C19基因型进行确认。Sanger测序引物设计：使用PrimerPremier 5软件设计681和636两个位点的Sanger测序引物，扩增子大小设置为200-700bp，Tm值设置为52-58℃，结果见表8。以上引物均由Invitrogen合成，Taqman-MGB探针由Applied Biosystems(ABI)合成。
表8-Sanger测序引物序列
Sanger测序体系：使用位点特异性测序引物(Invitrogen)、无核酸酶超纯水(Lifetechnologies)、10×PCR Buffer(TAKARA)、TakaraTaq Hot Start version(TAKARA)、dNTP(TAKARA)等配制681位点一扩体系和636位点一扩体系(见表9)。一扩PCR完成后使用胶回收试剂盒(上海生工生物)回收扩增产物。按照Sanger测序操作规程，配制测序PCR体系，纯化测序PCR产物后上机测序。
表9-CYP2C19基因681、636两个位点一扩PCR体系(Sanger测序)
| 组成 | 终浓度 |
| 无核酸酶超纯水(Lifetechnologies) | 补至25μl |
| 10×PCRBuffer(TAKARA) | 1× |
| SGS-681FP(Invitrogen)或SGS-636FP(Invitrogen) | 0.4μM |
| SGS-681RP(Invitrogen)或SGS-636RP(Invitrogen) | 0.4μM |
| dNTP(TAKARA) | 0.2mM |
| TakaraTaqHotStartversion(TAKARA) | 0.08U/μl |
| 样本DNA | 5μl |
Sanger测序完成后，将测序所得结果与NCBI数据库中人CYP2C19基因参考序列进行比对，并结合测序图谱分析681、636两个位点基因型。
3、分别采用本发明的方法与Sanger测序法对211例外周血样本进行检测
方法1：应用Taqman-MGB探针法体系检测211例临床样本，按照上述681、636两个位点各自的阳性判断值进行基因型判读，ΔCt值见表10中Taqman-MGB探针法检测结果。
方法2：应用Sanger测序体系检测211例样本，测序结果与NCBI数据库中人CYP2C19基因参考序列比对，结合测序图谱分析211例681、636两个位点基因型，结果见表10中Sanger测序结果。
表10-211例样本的Taqman-MGB探针法与Sanger测序法检测结果
六、数据统计与分析
采用“四格表”汇总211例样本的检测结果(见表11和表12)。以Sanger测序结果为准，计算本发明Taqman-MGB探针法检测681、636两个位点结果的符合率。
表11-两种方法检测211例样本CYP2C19基因681位点的结果统计
表12-两种方法检测211例样本CYP2C19基因636位点的结果统计
由表11可知，
由表12可知，
上述结果表明，临床样本采用本发明的检测方法的结果与Sanger测序结果一致，总符合率为100％，证明本发明方法检测的结果准确可靠。
实施例2人MTHFR基因多态性检测
一、设计引物/探针：
在NCBI数据库中检索人类MTHFR编码基因的参考序列NG_013351.1，分别截取677、1298两个位点及两侧序列作为目标序列。使用Primer Express3.0软件，新建选择“MGB Allelic Discrimination”，将677目标序列粘贴至序列框内，设置677位点为C/T多态进行设计，结果见表13。相同方法得到1298位点的引物/探针(见表13)。
表13-MTHFR引物/探针序列
二、准备样本
标准样本：人工合成含有MTHFR基因677、1298两个位点野生型或突变型目标序列的质粒DNA共4个：677C-Temp、677T-Temp、1298A-Temp、1298C-Temp。质粒DNA呈干粉状，用1×TE溶解后离心，使用超微量分光光度计Nanodrop 2000C进行浓度测定，并将测定的质量浓度换算为拷贝数浓度；按照人基因组DNA为300拷贝/ng计算，将质粒DNA的拷贝数浓度换算为相当于人基因组DNA的浓度。使用1×TE缓冲液、677C-Temp和677T-Temp配制6个不同浓度的677CC型参考品、677CT型参考品、677TT型参考品；使用1×TE缓冲液、1298A-Temp和1298C-Temp配制6个不同浓度的1298AA型参考品、1298AC型参考品、1298CC型参考品。两个位点三种基因型均有6个浓度参考品：1ng/μl、5ng/μl、25ng/μl、125ng/μl、250ng/μl和500ng/μl。
三、准备Taqman-MGB探针法体系
1、使用位点特异性引物(Invitrogen)、Taqman-MGB探针(Applied Biosystems)、无核酸酶超纯水(Life technologies)、5×TaqMan-MGB Genotyping Master Mix(武汉明德生物)等配制677位点检测体系和1298位点检测体系(见表14)，PCR循环参数见表15。
表14-Taqman-MGB探针法677、1298两个位点检测体系
表15-MTHFR基因检测Taqman-MGB探针法PCR循环参数
2、PCR结果分析：全选677位点反应孔，依次分析野生型677C(VIC)与突变型677T(FAM)两个检测通道：基线设为6～18或根据实际情况手动调整，取野生型677C、突变型677T各自的荧光增量ΔRn的10％(5％～50％均可)作为阈值，软件分析后得到Ct677C和Ct677T，计算ΔCt677(Ct677T-Ct677C)。相同方法分析后得到Ct1298A和Ct1298C，计算ΔCt1298(Ct1298C-Ct1298A)。
四、阳性判断值研究
1、使用质粒DNA配制的参考品模拟不同浓度的各基因型样本DNA。应用677位点Taqman-MGB探针法体系检测677CC、677CT、677TT分别对应的6个浓度参考品(共18个参考品)，各设4复孔。设定基线、阈值后分析得到各反应孔Ct值，计算各孔ΔCt值(Ct突变型-Ct野生型)，详见表16。SPSS20.0统计分析ΔCt值，结果见表17和图3。同时，综合考虑实验室环境、仪器性能及样本均存在差异性，将各基因型ΔCt值范围略微调整并取整，初步得出677位点阳性判断值为：ΔCt值＞4为677CC型；ΔCt值＜-10为677TT型；-2＜ΔCt＜3为677CT型；其他区间为检测灰区。
2、应用1298位点Taqman-MGB探针法体系检测1298AA、1298AC、1298CC分别对应的6个浓度参考品(共18个参考品)，各设4复孔。设定基线、阈值后分析得到各反应孔Ct值，计算各孔ΔCt值(Ct突变型-Ct野生型)，详见表18。SPSS20.0统计分析ΔCt值，结果见表19和图4。同时，综合考虑实验室环境、仪器性能及样本均存在差异性，将各基因型ΔCt值范围略微调整并取整，初步得出1298位点阳性判断值为：ΔCt值＞11为1298AA型；ΔCt值＜-14为1298CC型；-2＜ΔCt＜1为1298AC型；其他区间为检测灰区。
表16-MTHFR基因677位点阳性判断值研究实验数据
表17-MTHFR基因677位点ΔCt值统计
DeltaCt
表18-MTHFR基因1298位点阳性判断值研究实验数据
表19 MTHFR基因1298位点ΔCt值统计
DeltaCt
五、临床样本检测
1、临床样本：随机收集临床实验室完成检验后剩余的EDTA外周血样本205例，使用血液基因组提取试剂盒(北京天根生化)进行核酸提取，提取的核酸于-20℃保存备用。
2、Sanger测序是公认的基因序列分析的“金标准”方法，本实例采用Sanger测序对样本检测结果进行验证。Sanger测序引物设计：使用PrimerPremier 5软件设计677和1298两个位点的Sanger测序引物，扩增子大小设置为200-700bp，Tm值设置为52-58℃，结果见表20。以上引物均由Invitrogen合成，Taqman-MGB探针由Applied Biosystems(ABI)合成。
表20-Sanger测序用MTHFR引物序列
| 引物 | 序列 | 纯化方法 |
| SGS-677FP | 5’-ATCCCTCGCCTTGAACAGG-3’(SEQ ID NO：21所示) | PAGE |
| SGS-677RP | 5’-ACAGACACTGTTGCTGGGTTTT-3’(SEQ ID NO：22所示) | PAGE |
| SGS-1298FP | 5’-TCCTGGGCATGTGGTGG-3’(SEQ ID NO：23所示) | PAGE |
| SGS-1298RP | 5’-TCCCAACTTACCCTTCTCCCTT-3’(SEQ ID NO：24所示) | PAGE |
Sanger测序体系：使用位点特异性测序引物(Invitrogen)、无核酸酶超纯水(Lifetechnologies)、10×PCR Buffer(TAKARA)、TakaraTaq Hot Start version(TAKARA)、dNTP(TAKARA)等配制677位点一扩体系和1298位点一扩体系(见表21)。一扩PCR完成后使用胶回收试剂盒(上海生工生物)回收扩增产物。按照Sanger测序操作规程，配制测序PCR体系，纯化测序PCR产物后上机测序。
表21-MTHFR基因677、1298两个位点一扩PCR体系
| 组成 | 终浓度 |
| 无核酸酶超纯水(Lifetechnologies) | 补至25μl |
| 10×PCRBuffer(TAKARA) | 1× |
| SGS-677FP(Invitrogen)或SGS-1298FP(Invitrogen) | 0.4μM |
| SGS-677RP(Invitrogen)或SGS-1298RP(Invitrogen) | 0.4μM |
| dNTP(TAKARA) | 0.2mM |
| TakaraTaqHotStartversion(TAKARA) | 0.08U/μl |
| 样本DNA | 5μl |
Sanger测序完成后，将测序所得结果与NCBI数据库中人MTHFR基因参考序列进行比对，并结合测序图谱分析677、1298两个位点基因型。
3、分别采用本发明的方法与Sanger测序法对205例外周血样本进行检测
方法1：应用Taqman-MGB探针法体系检测205例临床样本，按照677、1298两个位点各自的阳性判断值进行基因型判读，ΔCt值数据见表22。
方法2：应用Sanger测序体系检测205例样本，测序结果与NCBI数据库中人MTHFR基因参考序列比对，结合测序图谱分析205例677、1298两个位点基因型，结果见表22。
表22-205例样本的Taqman-MGB探针法与Sanger测序法检测结果
六、数据统计与分析
采用“四格表”汇总205例样本的检测结果(见表23和表24)。以Sanger测序结果为准，计算本发明Taqman-MGB探针法检测677、1298两个位点结果的符合率。
表23-两种方法检测205例样本MTHFR基因677位点的结果统计
表24-两种方法检测205例样本MTHFR基因1298位点的结果统计
由表23可知
由表24可知
上述结果表明临床样本采用本发明的检测方法的结果与Sanger测序结果一致，总符合率为100％，证明本发明方法检测的结果准确可靠。
实施例3人ALDH2基因多态性检测
一、设计引物/探针：
在NCBI数据库中检索人类ALDH2编码基因的参考序列NG_012250.2，截取1510位点及两侧序列作为目标序列。使用Primer Express3.0软件，新建选择“MGBAllelic Discrimination”，将1510目标序列粘贴至序列框内，设置1510位点为G/A多态进行设计，结果见表25。以上引物均由Invitrogen合成，Taqman-MGB探针由AppliedBiosystems(ABI)合成。
表25-引物/探针序列
二、准备样本
2个质粒：1510G-Temp、1510A-Temp。质粒DNA呈干粉状，用1×TE溶解后离心，使用超微量分光光度计Nanodrop 2000C进行浓度测定，并将测定的质量浓度换算为拷贝数浓度；按照人基因组DNA为300拷贝/ng计算，将质粒DNA的拷贝数浓度换算为相当于人基因组DNA的浓度。使用1×TE缓冲液、1510G-Temp和1510A-Temp配制6个不同浓度的1510GG型参考品、1510GA型参考品、1510AA型参考品。三种基因型有6个浓度参考品：1ng/μl、5ng/μl、25ng/μl、125ng/μl、250ng/μl和500ng/μl。
三、Taqman-MGB探针法体系
1、使用位点特异性引物(Invitrogen)、Taqman-MGB探针(Applied Biosystems)、无核酸酶超纯水(Life technologies)、5×TaqMan-MGB Genotyping MasterMix(武汉明德生物)等配制1510位点检测体系(见表26)，PCR循环参数见表27。
表26-Taqman-MGB探针法1510位点检测体系
| 组成 | 终浓度 |
| 无核酸酶超纯水(Lifetechnologies) | 补至25μl |
| 5×TaqMan-MGBGenotypingMasterMix(武汉明德生物) | 1× |
| 1510FP(Invitrogen) | 0.8μM |
| 1510RP(Invitrogen) | 0.8μM |
| 1510A-FAM(ABI) | 0.15μM |
| 1510G-VIC(ABI) | 0.15μM |
| 样本DNA | 5μl |
表27-ALDH2基因检测Taqman-MGB探针法PCR循环参数
2、PCR结果分析：全选1510位点反应孔，依次分析野生型1510G(VIC)与突变型1510A(FAM)两个检测通道：基线设为6～18或根据实际情况手动调整，取野生型1510G、突变型1510A各自的荧光增量ΔRn的10％(5％～50％均可)作为阈值，软件分析后得到Ct1510G和Ct1510A，计算ΔCt1510(Ct1510A-Ct1510G)。
四、阳性判断值研究
使用质粒DNA配制的参考品模拟不同浓度的各基因型样本DNA。应用1510位点Taqman-MGB探针法体系检测1510GG、1510GA、1510AA分别对应的6个浓度参考品(共18个参考品)，各设4复孔。设定基线、阈值后分析得到各反应孔Ct值，计算各孔ΔCt值(Ct突变型-Ct野生型)，详见表28。SPSS20.0统计分析ΔCt值，结果见表29和图5。同时，综合考虑实验室环境、仪器性能及样本均存在差异性，将各基因型ΔCt值范围略微调整并取整，初步得出1510位点阳性判断值为：ΔCt值＞5为1510GG型；ΔCt值＜-15为1510AA型；-3＜ΔCt＜2为1510GA型；其他区间为检测灰区。
表28-ALDH2基因1510位点阳性判断值研究实验数据
表29-ALDH2基因1510位点ΔCt值统计
DeltaCt
五、临床样本检测
1、临床样本：随机收集临床实验室完成检验后剩余的EDTA外周血样本217例，使用血液基因组提取试剂盒(北京天根生化)进行核酸提取，提取的核酸于-20℃保存备用。
2、Sanger测序是公认的基因序列分析的“金标准”方法，本实例采用Sanger测序对样本检测结果进行验证。Sanger测序引物设计：使用PrimerPremier 5软件设计1510位点的Sanger测序引物，扩增子大小设置为200-700bp，Tm值设置为52-58℃，结果见表30。以上引物均由Invitrogen合成，Taqman-MGB探针由AppliedBiosystems(ABI)合成。
表30-引物/探针序列
Sanger测序体系：使用位点特异性测序引物(Invitrogen)、无核酸酶超纯水(Lifetechnologies)、10×PCR Buffer(TAKARA)、TakaraTaq Hot Start version(TAKARA)、dNTP(TAKARA)等配制1510位点一扩体系(见表31)。一扩PCR完成后使用胶回收试剂盒(上海生工生物)回收扩增产物。按照Sanger测序操作规程，配制测序PCR体系，纯化测序PCR产物后上机测序。
表31-1510位点一扩PCR体系(Sanger测序)
Sanger测序完成后，将测序所得结果与NCBI数据库中人ALDH2基因参考序列进行比对，并结合测序图谱分析1510位点基因型。
3、分别采用本发明的方法与Sanger测序法对217例外周血样本进行检测
方法1：应用Taqman-MGB探针法体系检测217例临床样本，按照1510位点各自的阳性判断值进行基因型判读，ΔCt值见表32。
方法2：应用上述Sanger测序体系检测217例样本，测序结果与NCBI数据库中人ALDH2基因参考序列比对，结合测序图谱分析217例1510位点基因型，结果见表32。
表32-217例样本的Taqman-MGB探针法与Sanger测序法检测结果
六、数据统计与分析
采用“四格表”汇总217例样本的检测结果(见表33)。以Sanger测序结果为准，计算本发明Taqman-MGB探针法检测1510位点结果的符合率。
表33-两种方法检测217例样本ALDH2基因1510位点的结果统计
由表33可知，
上述结果表明临床样本采用本发明的检测方法的结果与Sanger测序结果一致，总符合率为100％，证明本发明方法检测的结果准确可靠。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉明德生物科技股份有限公司
<120> 基于Taqman-MGB探针的基因多态性检测方法及检测试剂盒
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatatgcaat aattttccca ctatcattg 29
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctccaaaata tcactttcca taaaagc 27
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tatttcccag gaacc 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tatttcccgg gaacc 15
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatggaaaaa ttgaatgaaa acatca 26
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtggtttctc aggaagcaaa aaac 24
<210> 7
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caccccctgg atc 13
<210> 8
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
caccccctga atc 13
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tacaaccaga gcttggcata tt 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tacgcaagca gtcacataac taag 24
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctttcatcct gggctgtg 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggcagcttc tgtggttc 18
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ccgaagcagg gagctttg 18
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cggtgcatgc cttcacaa 18
<210> 15
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tctgcgggag tcg 13
<210> 16
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctgcgggagc cga 13
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gagctgctga agatgtgggg 20
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttctcccga gaggtaaaga acg 23
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agtgaagcaa gtgtc 15
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cagtgaagaa agtgtc 16
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atccctcgcc ttgaacagg 19
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
acagacactg ttgctgggtt tt 22
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tcctgggcat gtggtgg 17
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tcccaactta cccttctccc tt 22
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gagttgggcg agtacggg 18
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ccagcaggtc ccacactca 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
catacactaa agtgaaaac 19
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
catacactga agtgaaaa 18
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tttggagccc agtcaccc 18
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cctcagtatt tctcatggga caga 24
Claims (9)
1.一种基于Taqman-MGB探针的基因多态性检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1、人工合成含有目标基因被测多态性位点的野生型和突变型目标序列的质粒DNA，并制备被测多态性位点各基因型参考品；或使用不同基因型人基因组DNA制备各基因型参考品；
步骤2、配制待测基因多态性位点的PCR反应液，所述PCR反应液包括检测目标基因待测多态性位点的上、下游引物，及目标基因的待测多态性位点的突变型探针和野生型探针，突变型采用FAM或VIC/HEX标记，野生型采用VIC/HEX或FAM标记；
步骤3、应用被测位点PCR反应液检测各基因型参考品，设置基线、阈值后分析得到Ct野生型和Ct突变型，其中基线设为6～18或手动调整，阈值取各荧光通道荧光增量的5％～50％；
步骤4、计算ΔCt值＝Ct突变型-Ct野生型；
步骤5、根据所述ΔCt值判断基因型，判断标准为：
a、当ΔCt值＞4时，该待测基因的被测多态性位点为野生型；
b、-3＜ΔCt值＜3时，该待测基因的被测多态性位点为杂合型；
c、ΔCt值＜-4时，该待测基因的被测多态性位点为突变型。
2.如权利要求1所述的基因多态性检测方法，其特征在于，所述PCR反应液还包括5×TaqMan-MGB Genotyping Master Mix。
3.如权利要求1所述的基因多态性检测方法，其特征在于，所述待测基因的被测多态性位点包括人CYP2C19基因的G681A和G636A两个SNP位点；人MTHFR基因的C677T和A1298C两个SNP位点；人ALDH2基因的G1510A位点。
4.如权利要求1所述的基因多态性检测方法，其特征在于，所述步骤3中荧光PCR扩增检测的反应条件为：37℃ 5min；95℃ 2min；95℃ 10S，60℃ 40秒，循环45次。
5.一种采用权利要求1-4任一所述的基因多态性检测方法的基因多态性检测试剂盒。
6.如权利要求5所述的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括人CYP2C19基因的多态性检测试剂盒，包括如下两对引物及其对应的探针：
(1)用于人CYP2C19基因G681A SNP位点检测的引物和探针：
上游引物CYP2C19 681F：5’-GATATGCAATAATTTTCCCACTATCATTG-3’
下游引物CYP2C19 681R：5’-CTCCAAAATATCACTTTCCATAAAAGC-3’
突变探针CYP2C19 681A：5’FAM-TATTTCCCAGGAACC-3’MGB；
野生探针CYP2C19 681G：5’VIC-TATTTCCCGGGAACC-3’MGB；
(2)用于人CYP2C19基因G636A SNP位点检测的引物和探针：
上游引物CYP2C19 636F：5’-GATGGAAAAATTGAATGAAAACATCA-3’
下游引物CYP2C19 636R：5’-GTGGTTTCTCAGGAAGCAAAAAAC-3’
突变探针CYP2C19 636A：5’FAM-CACCCCCTGGATC-3’MGB；
野生探针CYP2C19 636G：5’VIC-CACCCCCTGAATC-3’MGB。
7.如权利要求5所述的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括人MTHFR基因的多态性检测试剂盒，包括如下两对引物及其对应的探针：
(1)用于人MTHFR基因C677T SNP位点检测的引物和探针：
上游引物MTHFR 677F：5’-CCGAAGCAGGGAGCTTTG-3’
下游引物MTHFR 677R：5’-CGGTGCATGCCTTCACAA-3’
突变探针MTHFR 677T：5’FAM-TCTGCGGGAGTCG-3’MGB；
野生探针MTHFR 677C：5’VIC-CTGCGGGAGCCGA-3’MGB；
(2)用于人MTHFR基因A1298C SNP位点检测的引物和探针：
上游引物MTHFR 1298F：5’-GAGCTGCTGAAGATGTGGGG-3’
下游引物MTHFR 1298R：5’-GTTCTCCCGAGAGGTAAAGAACG-3’
突变探针MTHFR 1298C：5’FAM-AGTGAAGCAAGTGTC-3’MGB；
野生探针MTHFR 1298A：5’VIC-CAGTGAAGAAAGTGTC-3’MGB。
8.如权利要求5所述的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括人ALDH2基因G1510A位点的多态性检测试剂盒，包括如下一对引物及其对应的探针：
上游引物ALDH2 1510F：5’-GAGTTGGGCGAGTACGGG-3’
下游引物ALDH2 1510R：5’-CCAGCAGGTCCCACACTCA-3’
突变探针ALDH2 1510A：5’FAM-CATACACTAAAGTGAAAAC-3’MGB；
野生探针ALDH2 1510G：5’VIC-CATACACTGAAGTGAAAA-3’MGB。
9.如权利要求5所述的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括5×TaqMan-MGB Genotyping MasterMix。
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