CN114350781A

CN114350781A - 检测coqr2基因多态性位点snp分型的引物探针组合、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN114350781A
Application number: CN202111604397.1A
Authority: CN
Inventors: 乔晓颖; 李彦鹏; 王文轩; 陈江坡; 李佳瑛; 李都悦; 胖铁良
Original assignee: Langfang Norway Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Langfang Norway Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2022-04-15

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种检测COQR2基因多态性位点SNP分型的引物探针组合、试剂盒及其应用，所述引物探针组合包括1对引物、探针PC和探针PG；所述试剂盒中包含上述引物探针组合，用于检测在检测COQR2基因rs4693075多态性位点。本发明的试剂盒检测人COQ2基因多态性，每次可以检测96个样品，且不需要进行PCR产物的后续分析，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测效率。

Description

检测COQR2基因多态性位点SNP分型的引物探针组合、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及一种引物探针组合及其应用，尤其涉及一种检测COQR2基因多态性位点SNP分型的引物探针组合、试剂盒及其应用。

背景技术

随着社会的进步和发展，人们的生活水平日益提高，饮食习惯也随之发生了改变，长期、过多的脂肪摄入导致体内血脂水平异常增高。血脂水平异常会引起和加重心脑血管疾病，已成为威胁人类健康的重要因素。据文献报道，我国现有心脑血管疾病患者2.9亿例，其中脑卒中患者1 300万例、冠心病患者1100万例、肺原性心脏病患者500万例、心力衰竭患者450万例、风湿性心脏病患者250万例、先天性心脏病患者200万例、高血压患者2.7 亿例，心脑血管疾病患病率正在呈持续升高的趋势。他汀类药物作为临床上首选的降脂药物，在血脂异常管理中发挥着极其重要的作用。

他汀类药物为3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG－CoA)还原酶抑制剂，作为调脂药物，并用于心血管疾病和中风的一级和二级预防。然而，由于个体间的差异，在临床治疗过程中存在一些问题。随着精准医疗理念的提出，他汀类药物基因组学在血脂异常管理中的应用越来越受到关注。近年来，研究药物基因组学来预测药物不良反应这方面也开始受到众多学者的重视。药物基因组学是从已知基因对药物效应的影响，确定药物作用的靶点，研究从表型到基因型的药物反应个体多样性，其核心是药物反应的遗传多态性，即单核苷酸多态性(SNP)。通过研究分析遗传对药物代谢酶、对药物受体以及对药物转运蛋白的影响，指导临床合理用药，提高用药的有效性和安全性。

研究表明，COQ2基因多态性与使用阿托伐他汀后发生横纹肌溶解的不良反应风险相关。COQ2基因用于编码羟基聚戊烯基转移酶，而羟基聚戊烯基转移酶是合成辅酶Q10过程中一种重要的酶，其中，最常见的SNP位点是rs4693075，人群中的该基因型主要分为CC基因型、CG基因型和GG基因型这3种。与GG基因型或CG基因型患者相比，CC基因型患者发生他汀类药物相关肌肉症状的风险明显较低。因此，在临床用药前，进行COQ2 基因多态性检测，对于携带基因型为CG或GG的患者，可考虑换药或减少阿托伐他汀的剂量，同时密切监测肌病的发生。这对于知道阿托伐他汀的用量具有很大的指导意义。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种检测COQR2基因多态性位点SNP分型的引物探针组合、试剂盒及其应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种检测COQR2基因多态性位点SNP分型的引物探针组合，检测 COQR2基因rs4693075多态性位点SNP分型的引物探针组合的正向引物如SEQ ID NO：1所示，反向引物如SEQ ID NO：2所示，探针PC如SEQ ID NO：3所示，探针PG如SEQ ID NO：4所示。

一种包含上述检测COQR2基因多态性位点SNP分型的引物探针组合的试剂盒。

进一步的，所述试剂盒中含有引物探针组合液；

引物探针组合液中正向引物、反向引物、探针PC、探针PG的浓度比为 1：1：1：0.2。

进一步的，所述试剂盒中的试剂还包括反应液。

进一步的，反应液是由0.2体积份Taq DNA聚合酶、10体积份buffer Mix for SNP3#、3体积份Mega buffer Mix for SNP和3.8体积份ddH2O配制而得。

一种上述试剂盒在检测COQR2基因rs4693075多态性位点中的应用。

进一步的，所述应用的具体步骤是取待测样本核酸分别与试剂盒中的试剂，振荡混匀，离心，制成待测反应体系，再进行PCR扩增反应，每个反应获得2个扩增曲线图和CT值，再根据所得扩增曲线图和CT值判断待测样本核酸的基因型。

进一步的，所述待测反应体系为17μL反应液、1μL引物探针组合液和2μL待测样本核酸；

引物探针组合液中正向引物、反向引物、探针PC、探针PG的浓度比为 1：1：1：0.2；

反应液是由0.2体积份Taq DNA聚合酶、10体积份buffer Mix for SNP 3#、3体积份Mega buffer Mix for SNP和3.8体积份ddH₂O配制而得。

进一步的，当FAM的CT值≤38且HEX的CT值＞38/无CT值时，则基因型判定为GG型；

当HEX的CT值≤38且FAM的CT值＞38/无CT值时，则基因型判定为CC型；

当FAM的CT值≤38且HEX的CT值≤38时，则基因型判定为CG型；

当FAM的CT值＞38/无CT值且HEX的CT值＞38/无CT值时，则需复测。

进一步的，PCR扩增反应的条件为95℃预变性2min，再经95℃变性5s、 58℃退火15s，共40个循环。

本发明的检测COQR2基因多态性位点SNP分型的引物探针组合、试剂盒及其应用的有益效果为：

本发明的检测COQR2基因多态性位点SNP分型的引物探针组合及其试剂盒能够采用荧光定量PCR检测人COQR2(rs4693075)基因，其准确率高，与一代测序相比，准确率为100％；检出限低于现有市面产品，为0.5ng/μL；精密度CV值≤2.59％；抗干扰性强，其中，血红素、甘油三酯、胆红素等对检测结果均没有影响，且与大肠埃希氏菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸、阴沟肠杆菌核酸等也没有交叉反应；

利用本发明的试剂盒检测人COQ2基因多态性，每次可以检测96个样品，且不需要进行PCR产物的后续分析，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测效率，且本发明的试剂盒异性强，不会受到其他基因的干扰，降低了PCR产物污染引起假阳性的风险，并且结果判读更容易；

通过优化试剂盒，使整个试剂盒的应用过程简单、快速，且PCR程序只需50min，成本较低，检测速度明显快于一代测序检测；

本发明的试剂盒对每个样本的需求量低，只需要10～50ng DNA即可进行检测；

本发明的试剂盒可以辅助对他汀类药物用药进行判断，以准确判断用药情况，为疾病诊断提供充足的依据，也为治疗方案提供坚实的基础，具有很好的临床应用价值。

附图说明

图1是本发明实施例1中第一组引物探针组合筛选实验结果图；

图2是本发明实施例1中第二组引物探针组合筛选实验结果图；

图3是本发明实施例1中第三组引物探针组合筛选实验结果图；

图4是本发明实施例1中第四组引物探针组合筛选实验结果图；

图5是本发明实施例1中第三组引物探针组合对真实核酸样本检测的实验结果图；

图6是本发明实施例1中引物探针组合液A的浓度筛选实验结果图；

图7是本发明实施例1中引物探针组合液B的浓度筛选实验结果图；

图8是本发明实施例1中引物探针组合液C的浓度筛选实验结果图；

图9是本发明实施例1中引物探针组合液D的浓度筛选实验结果图；

图10是本发明实施例3中试剂盒检出限筛选实验结果图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

试剂：AK Taq DNA聚合酶、AK buffer Mix for SNP 3#、Mega buffer Mix forSNP均购自从菲鹏生物股份有限公司。

实施例1引物探针组合的设计和筛选

一)引物探针组合的设计

1)引物探针组合设计

在NCBI网上查询COQR2基因rs4693075的多态性位点信息，具体基因序列如下：

CTGATAACTC TCCTAAGCTC CAGACTGCAT ACTGAACAGT CTGCTGGACT TCTCTGCCTG

CAAGTTGCTC ATGTACCTTAAACTCAATGT GTCCCAGATA TCTTTTCTCA GAAACCCCTT

TTCTCCTCCT GTATTACCTA TTTCCACTCA TGTCCCCTCC TTAACTGATG AAGTGCCTCT

CCTTTGTGGT CCCATAGCAC TCCTGCCTGACACGTTGTAC TGCAATGACC TGTTTATCTG

TCATCTCCAT CTCCAACTCC TTAAAGATGG TCAGGGTGTT TTAGTCATTT TTATTTTCCC

AGTACCTGCT GCAATTCCTA GCACGAAGTAAATGTAGGGG TTCAGTAAAT GTTTGGAGTA

AATATACCAG CTTCTTAATA TTATCTTATA GATAGGAAAT GCTTATATTG AGAATATAAT

TTCAAATTTA ATAAAGAGAA CATTCAATGA GAGGATCTTA GAAAAAGATA AATATTCTAC

CACAACTTTC CCACAAATCA

N

GCTCACATCA ATTTCTTGAG TTGCTTTTAG TTCTTTCATT TACTGAAAAA AATGATTCAA

AGAACTAGAA TCATTCTAGG AATAGAATAG AAAAGTCTGG GAATAGATAT TTTTGCAGCA

GATTCTGATA CCTGCTTACC TAACTATGTT TCTTTCTTTT CACCAACAAG TATGTATTCA

ATACCTACAC CGCACCAAGT GCTATGCTAA ATGCTGGGCC ACAATTTATT AACTGGAGAC

CATAGGAGGC TCTCAACGTA TTCTTGGTTG AATTAATGCT GCTGAAATAA GTAAGTGCCG

GATTAGAATC CTATGGTAGC CCAGAAGAGA CTGTCTAACT TCTTCCTGAG AGGCTTCACA

GAATACGAGC TGTCTAAGCT ATCACATACA CTTTAACCCT TGTTTTCCTG CCACAGAGTG

CTTCCTACCC CATCCCCCAA ATTCTTCAGG GCATCTAGAT CAAACATTTT TTCATGACAT

ACCTAGATTT TTAAAAAAGC；

其中，突变方向：C>G，

基因频率：CC-0.777，CG-0.214，GG-0.010。

依据查询所得的COQ2基因rs4693075的多态性位点信息导入Beacon Designer、oligo、Primer Primer 5等生物软件，结合引物探针设计原则和个人探针设计经验，设计引物对；再依据突变方向和设计的引物对，设计引物对对应的两条探针(PC和PG)。在涉及探针过程中，为了使应用过程中能够利用探针对基因型进行区分，设计探针时，给探针PG的5'修饰FAM荧光，探针PC的5'修饰HEX荧光。设计完成后，将设计出的引物探针组合的序列导入NCBI进行特异性比对，特异性为100％，且不与其它基因序列一致，筛选设计结果见表1。这里需要说明的是，在该引物探针组合设计过程中，由于引物探针组合应用效果的偶然性，我们进行了多次设计，这里只列举了其中四组。

表1设计的检测COQ2基因rs4693075多态性位点SNP分型的引物探针组合

分别对设计的引物探针组合，委托通用生物公司进行合成。

针对表1中设计的引物探针组合分别进行PCR扩增实验，具体过程如下：

分别取表1中的引物探针组合配制引物探针组合液，配制方法为：取1 μL浓度为100μM的正向引物、1μL浓度为100μM的反向引物、1μL 浓度为100μM的探针PG和1μL浓度为100μM的探针PC混合，再加 DEPC水补至10μL，即得相应的引物探针组合液(即1μL浓度为100μM 的F1、1μL的R1、1μL浓度为100μM的PG1、1μL浓度为100μM的 PC1和6μL的DEPC水制备的是引物探针组合液1，以此类推)。

取0.2μL AK Taq DNA 聚合酶、10μL AK buffer Mix for SNP 3#、3 μL Megabuffer Mix for SNP和3.8μL ddH₂O混匀，离心，得反应液(该反应液的量为1个反应孔所需量，在实验量扩大时，仅需扩大相应倍数即可)。

委托通用生物公司合成表2中的两种基因型质粒；

表2 COQ2基因rs4693075多态性位点基因型质粒

取表2中的两种基因型质粒分别采用0.1TE缓冲液稀释至浓度为 0.0005ng/μL，得CC型质粒稀释液(稀释COQ2-C质粒所得)和GG型质粒稀释液(稀释COQ2-G质粒所得)。

将CC型质粒稀释液和GG型质粒稀释液等体积混合，得CG型质粒稀释液。

CC型质粒稀释液、GG型质粒稀释液和CG型质粒稀释液统称质粒稀释液。

在八联排的每个反应孔中分别依次加入17μL反应液、1μL引物探针组合液(4组引物探针组合液分别制备反应体系进行检测)和2μL质粒稀释液，混匀后，离心，得相应的反应体系。

其中，每种引物探针组合液加至6个反应孔中，这6个反应孔中的两个反应孔中加入的是CC型质粒稀释液，另外两个反应孔中加入的是CG型质粒稀释液，最后的两个反应孔中加入的是GG型质粒稀释液(也就是说，加入引物探针组合液1和CC型质粒稀释液的反应孔有2个，加入引物探针组合液1和CG型质粒稀释液的反应孔也有2个，加入引物探针组合液1和 GG型质粒稀释液的反应孔还是有2个，以此类推)。

分别取上述反应体系和对照反应体系，移至荧光定量PCR仪中，进行 PCR扩增反应，反应条件为先经95℃预变性2min，再经95℃变性5s、58℃ 退火15s，共40个循环，获得检测结果见表3和图1～4(手动阈值调至100)。

表3引物探针组合筛选实验结果一览表

根据CT值和荧光强度进行探针优劣的筛选，理想状况下，仅加入CC 型质粒稀释液的反应孔应该只有HEX荧光(绿色)起线，仅加入GG型质粒稀释液的反应孔应该只有FAM荧光(蓝色)起线，而加入CG型质粒稀释液的反应孔应该两种荧光都起线。由图1可以看出，第一组三种质粒稀释液对应的反应体系中FAM荧光(蓝色)起线都很高，说明该引物探针组合无法区分三种质粒稀释液；图2可以看出，三种质粒稀释液对应的反应体系中FAM荧光(蓝色)和HEX荧光(绿色)都无起线，说明该引物探针组合无法区分三种质粒稀释液，故舍弃该组；图3中可以看出，GG型质粒稀释液对应的反应体系中只有FAM荧光(蓝色)有起线，CG型质粒稀释液对应的反应体系中HEX荧光(绿色)和FAM荧光(蓝色)均有起线，CC型质粒稀释液对应的反应体系中HEX荧光(绿色)有明显起线，而FAM荧光(蓝色)有起线虽有起线，但相对较低，说明该组引物探针组合基本可以区分三种基因型，可尝试通过调整引物和探针用量比例(减少探针PG用量)对CC 基因型进行检测实验，如调整比例仍无法改善，则需舍弃该组；图4可以看出，三种质粒稀释液对应的反应体系中FAM荧光(蓝色)和HEX荧光(绿色)都无起线，说明该引物探针组合无法区分三种质粒稀释液，故舍弃该组。

进一步，以真实的CC型核酸样本代替CC型质粒稀释液，真实的GG 型核酸样本代替GG型质粒稀释液，CG型核酸样本代替CG型质粒稀释液 (由于只采集到一个CG型核酸样本，因此只做了一组CG型核酸样本检测实验)，采用第三组引物探针组合液进行PCR扩增实验，扩增结果见表4和图5

表4真实的核酸样本PCR扩增实验结果一览表

由表4和图5可以看出，采用第三组引物探针组合对三种基因型的真实核酸样本检测结果与对三种质粒稀释液的检测结果差异不大，依然是GG型核酸样本对应的反应体系中只有FAM荧光(蓝色)有起线，CG型核酸样本对应的反应体系中HEX荧光(绿色)和FAM荧光(蓝色)均有起线，CC 型核酸样本对应的反应体系中HEX荧光(绿色)有明显起线，而FAM荧光(蓝色)有起线虽有起线，但相对较低，基本可以区分三种基因型，因此可以调整引物和探针用量比例进行改良。

3)引物探针组合用量的比例调整

按照步骤2)引物探针组合筛选中的配制方法配制不同比例的引物探针组合液，与步骤2)中的不同之处仅在于：

引物探针组合液A中仅加入0.5μL探针PG；

引物探针组合液B中仅加入0.4μL探针PG；

引物探针组合液C中仅加入0.2μL探针PG，同时对于检测结果手动阈值调至200；

引物探针组合液D中仅加入0.3μL探针PG，同时对于检测结果手动阈值调至200；

再按照步骤2)引物探针组合筛选中的PCR扩增实验，对引物探针组合液A～D进行测定，测定结果见表5和图6～9。

表5用量比例筛选实验结果一览表

由表4和图6～9可以看出，使用引物探针组合液A时，CC型质粒稀释液对应的反应体系中FAM荧光(蓝色)有所降低，CG型质粒稀释液对应的反应体系中两种荧光比之前要接近，但是FAM(蓝色)还是高于HEX(绿色)，还需继续调整PG探针用量；使用引物探针组合液B时，CG型质粒稀释液对应的反应体系中两种荧光比之前要接近，但是FAM(蓝色)还是高于HEX(绿色)，还需继续调整PG探针用量；使用引物探针组合液C和引物探针组合液D时，CC型质粒稀释液对应的反应体系中FAM荧光(蓝色) 仍做不到完全不起，将手动阈值调至200，高过CC型FAM(蓝色)荧光值，此时再观察另外两种基因型对应的附图，发现使用引物探针组合液C时， CG型质粒稀释液对应的反应体系中两种荧光较好，CC型样本的FAM荧光 (蓝色)低手动阈值基准线，CG型样本两个荧光相差不大且CT值也很接近，最终确定选用引物探针组合液C的配制比例。因此最终确定的引物探针组合用量比例为正向引物1μL、反向引物1μL、探针PC 1μL、探针PG 0.2μL和DEPC水6.8μL(此为10人份的配方，用量大时等比例扩大即可)。

4)试剂盒的制备和应用

本发明确定的检测COQ2基因rs4693075多态性位点SNP分型的引物探针组合的正向引物如SEQ ID NO：1所示，反向引物如SEQ ID NO：2所示，探针PC如SEQ ID NO：3所示，探针PG如SEQ ID NO：4所示。

利用步骤2)引物探针组合筛选中确定的引物探针组合及步骤3)引物探针组合用量的比例调整中确定的用量制备试剂盒，其中，引物探针组合液是由体积比为1：1：1：0.2：6.8的浓度为100μM的正向引物、浓度为100 μM的反向引物、浓度为100μM的探针PC、浓度为100μM的探针PG和 DEPC水混合而得(正向引物、反向引物、探针PC、探针PG的浓度比为1： 1：1：0.2)；反应液是由0.2μL AK Taq DNA聚合酶、10μL AK buffer Mix for SNP 3#、3μLMega buffer Mix for SNP和3.8μL ddH₂O混匀，离心制得(该反应液的量为1个反应孔所需量，在实验量扩大时，仅需扩大相应倍数即可)。

检测时，在八联排的每个反应孔中分别依次加入17μL反应液、1μL 引物探针组合液和2μL待测样本核酸，混匀后，离心，得待测反应体系。

将八连排移至荧光定量PCR仪中，进行PCR扩增反应，反应条件为先经95℃预变性2min，再经95℃变性5s、58℃退火15s，共40个循环，每个反应孔获得FAM和HEX这两个荧光的扩增曲线图和CT值，根据每个反应孔所得的两个扩增曲线图和CT值对检测结果分别进行分析，判断待测样本核酸的基因型。将扩增曲线算法设置为绝对荧光值法，手动阈值调至200进行分析，判断待测样本核酸的基因型的标准为：

当FAM的CT值≤38且HEX的CT值＞38/无CT值时，则基因型判定为GG型；

当FAM的CT值≤38且HEX的CT值≤38时，则基因型判定为CG型；

当FAM的CT值＞38/无CT值且HEX的CT值＞38/无CT值时，则需复测。

实施例2试剂盒的正确性验证试验

提取50个人的全血核酸样本，测定浓度，并委托擎科生物公司对COQR2 基因rs4693075多态性位点进行一代测序，以一代测序结果作为金标准；

利用实施例1中的试剂盒的制备和应用分别对上述的50个全血核酸样本进行检测，检测的基因结果与一代测序结果进行对比，来验证试剂盒及试剂盒应用的准确性，具体结果见下表：

表6正确性验证试验结果一览表

由上表可以看出，本发明的试剂盒及其应用具有良好的正确性。

实施例3试剂盒的检出限实验

取三种基因型的全血核酸样本，分别配制浓度为0.01、0.1、0.5、1、10、 100ng/μL的不同浓度的GG型核酸样本稀释液、不同浓度的CG型核酸样本稀释液和不同浓度的CC型核酸样本稀释液；

利用实施例1中的试剂盒的制备和应用分别对不同浓度的GG型核酸样本稀释液、不同浓度的CG型核酸样本稀释液和不同浓度的CC型核酸样本稀释液进行测定，具体结果见表7和图10。

表7不同浓度的全血核酸样本检测结果一览表

由表7和图10可以看出，本发明的试剂盒检测出浓度为0.1ng/μL及以上浓度的CC型核酸样本、浓度为0.5ng/μL及以上浓度的GG型核酸样本和CG型核酸样本。

再次浓度为0.1ng/μL的CC型核酸样本、浓度为0.5ng/μL的GG型核酸样本和CG型核酸样本检出限进行稳定性测定，具体结果见表8。

表8浓度为0.1ng/μL的全血核酸样本稀释液检测结果一览表

由表8可以看出，本发明的试剂盒检测出的浓度为0.1ng/μL的CC型核酸样本一次阳性检出率为100％、浓度为0.5ng/μL的GG型核酸样本和 CG型核酸样本一次阳性检出率均为100％，符合行业要求(一般检出限20 次一次阳性检出率大于等于90％)，取较大浓度作为最低检出限，因此，本发明的试剂盒的三种基因型的最低检出限(LOD)为0.5ng/μL。

实施例4试剂盒的精密度试验

利用实施例1中的试剂盒的制备和应用对3种基因型的全血核酸样本分别进行10次重复性试验(同时间、地点、人和仪器，且在短时间内)，并计算CV值，具体结果见表9。

表9精密度试验检测结果一览表

再次对3种基因型的全血核酸样本分别进行5次重复性试验(仅不同工作日进行检测，分别在连续的5个工作日内进行检测，一天检测一次)，并计算CV值，具体结果见表10。

表10精密度试验检测结果一览表(不同工作日)

再次对3种基因型的全血核酸样本分别进行3次重复性试验(仅采用不同批次的试剂盒)，并计算CV值，具体结果见表11。

表11精密度试验检测结果一览表(不同批次的试剂盒)

再次对3种基因型的全血核酸样本分别进行2次重复性试验(仅为不同操作人员进行检测)，并计算CV值，具体结果见表12。

表12精密度试验检测结果一览表(不同操作人员)

由表9～12可以看出，本发明的引物探针组合的CV值均≤2.59％，低于行业标准(CV值≤5％)，具有良好的精密度。

实施例5试剂盒的干扰试验

利用实施例1中的试剂盒的制备和应用分别对添加了血红素浓度≤200 g/L、甘油三酯浓度≤1000mg/dL或胆红素浓度≤2mg/dL的三种基因型的全血进行核酸提取，对提取的三种核酸样本进行检测，具体结果见表13。

表13干扰试验检测结果一览表

由表13可以看出，本发明的试剂盒的检测性能不受血红素、甘油三酯及胆红素影响，抗干扰能力强。

再次利用实施例1中的试剂盒的制备和应用分别对添加了浓度为 0.01ng/μL的大肠埃希氏菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸或阴沟肠杆菌核酸的核酸样本进行检测，具体结果见表14。

表14干扰试验检测结果一览表

由表14可以看出，本发明的试剂盒与大肠埃希氏菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸、阴沟肠杆菌核酸等(这些均为潜在非人类基因组核酸干扰物质) 均无交叉反应。

实施例6试剂盒的实际临床样本检测

本实施例所采用临床样本来自廊坊市地区医院于采集的全血样本(采集者自愿的原则)，对全血样本提取待测样本核酸，利用本发明的试剂盒和检测方法进行检测，通过与内对照品和阳性对照品进行比较，检测判断核酸样本基因型，用时50min。

对全血样本提取的待测样本核酸，委托擎科生物公司对COQR2基因 rs4693075多态性位点进行一代测序，测序时间为1.5d。

本发明的试剂盒实际临床样本检测速率比现有试剂盒检测速率快。

实际临床样本的具体检测结果见下表：

表15实际临床样本的检测结果一览表

待测样本核酸	本发明试剂盒检测的样本数	现有试剂盒检测的样本数
			CC	396	396
CG	101	101
			GG	3	3

显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 廊坊诺道中科医学检验实验室有限公司

<120> 检测COQ2基因多态性位点SNP分型的引物探针组合、试剂盒及其应用

<130> 2021-08

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

ataaatattc taccacaact ttcccaca 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

cagtaaatga aagaactaaa agcaactc 28

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

atcacgctca catca 15

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

atcaggctca catca 15

Claims

1.一种检测COQR2基因多态性位点SNP分型的引物探针组合，其特征在于，检测COQR2基因多态性位点SNP分型的引物探针组合的正向引物如SEQ ID NO：1所示，反向引物如SEQ IDNO：2所示，探针PC如SEQ ID NO：3所示，探针PG如SEQ ID NO：4所示。

2.包含权利要求1所述的检测COQR2基因多态性位点SNP分型的引物探针组合的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有引物探针组合液；

引物探针组合液中正向引物、反向引物、探针PC、探针PG的浓度比为1：1：1：0.2。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的试剂还包括反应液。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，反应液是由0.2体积份Taq DNA聚合酶、10体积份buffer Mix for SNP 3#、3体积份Mega buffer Mix for SNP和3.8体积份ddH₂O配制而得。

6.权利要求2-5中任一项所述的试剂盒在检测COQR2基因rs4693075多态性位点中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的具体步骤是取待测样本核酸分别与试剂盒中的试剂，振荡混匀，离心，制成待测反应体系，再进行PCR扩增反应，每个反应获得2个扩增曲线图和CT值，再根据所得扩增曲线图和CT值判断待测样本核酸的基因型。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述待测反应体系为17μL反应液、1μL引物探针组合液和2μL待测样本核酸；

引物探针组合液中正向引物、反向引物、探针PC、探针PG的浓度比为1：1：1：0.2；

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，当FAM的CT值≤38且HEX的CT值＞38/无CT值时，则基因型判定为GG型；

当FAM的CT值≤38且HEX的CT值≤38时，则基因型判定为CG型；

当FAM的CT值＞38/无CT值且HEX的CT值＞38/无CT值时，则需复测。

10.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，PCR扩增反应的条件为95℃预变性2min，再经95℃变性5s、58℃退火15s，共40个循环。