CN114350786A

CN114350786A - 用于检测hla-b*15：02等位基因的引物组及其应用

Info

Publication number: CN114350786A
Application number: CN202210022817.3A
Authority: CN
Inventors: 关国良; 陈建雄; 陈薛名; 陈巧玲; 吴婧
Original assignee: Changzhou Xianxu Medical Technology Co ltd
Current assignee: Changzhou Xianxu Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2022-04-15

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测HLA‑B*15：02等位基因的引物组及其应用。本发明的用于检测HLA‑B*15：02等位基因的引物组，包括引物组A和引物组B，引物A的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示，引物组B的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8～SEQ ID NO.13所示。本发明针对HLA‑B*15:02基因的两个外显子设计了LAMP反应引物，LAMP反应中有4条特异性引物，对靶基因上6个区域进行识别，保证了LAMP反应的高度扩增性和特异性，特异性达100％。同时，设计两条环引物，将LAMP扩增时间大幅度降低，控制在20分钟左右。

Description

用于检测HLA-B*15：02等位基因的引物组及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于检测HLA-B*15：02等位基因的引物组及其应用。

背景技术

癫痫是大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病，是一种主要的全球性疾病，尤其在资源匮乏和收入低的亚洲国家，癫痫患病率较高。

近年来在治疗癫痫和外周神经痛等方面广泛应用卡马西平，其具有价格低、疗效好的特点。但是研究发现，部分抗癫痫药物会引起超敏反应，例如，服用马卡西平引起的不良反应包括严重的皮肤病-Steven-Johnson综合征(SJS)和中毒性表皮坏死松解症(TEN)。SJS/TEN的发病率从药物暴露的千分之一到万分之一不等，死亡率高达35％。药物遗传学研究已经发现了抗癫痫药物诱导的不良反应与HLA-B*15:02等位基因之间存在很强的关联性，且HLA-B*15:02等位基因主要见于亚洲人群。作为预防措施，美国食品和药物管理局(FDA)强制要求对高危人群用药前进行等位基因的筛查。

HLA-B*15:02等位基因的常规检测方法主要为PCR扩增荧光检测法，其具有准确度高的特点，但需要昂贵的实验室设备、熟练的实验室人员，且必须在实验室中完成。此外，PCR扩增前，提取DNA是必需的步骤。在临床检测中，HLA检测从样本收集、运输到检测和向临床医生报告结果，有很长的周转时间(几天至一周)，影响了有效的治疗策略，尤其对癫痫发作期间或癫痫发作后的快速给药构成了障碍，以上原因极大限制了卡马西平在普通医疗机构的大面积推广。

虽然目前LAMP等温扩增技术在生物安全行业也使用广泛，尤其用于快速筛查方面，但因为假阳性高，在灵敏度和特异性方面无法做到和PCR一样高的精度，所以目前在医学检测行业没有广泛使用。

为了克服这些障碍，需要一种快速、准确、便携式、操作简便的针对HLA-B*15:02基因的体外快速检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测HLA-B*15：02等位基因的引物组。

本发明的再一目的在于提供上述引物组的应用。

本发明的再一目的在于提供含有上述引物探针组的试剂盒。

本发明的再一目的在于提供检测个体中HLA-B*15：02分型的方法。

根据本发明具体实施方式的检测个体中HLA-B*15：02等位基因的引物组，包括引物组A和引物组B，

针对HLA-B*15:02基因的两个外显子，外显子2和外显子3，分别设计了LAMP反应引物探针组A和引物探针组B，LAMP反应中有4条特异性引物(包括正向和后外引物(F3和B3)，正向和后内引物(FIP和BIP)，以及环状引物(FL和BL))，对靶基因上6个区域进行识别，保证了LAMP反应的高度扩增性和特异性，

其中，引物组A的引物的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.1:5’-TGAGGTTCGACAGCGACG-3’,

SEQ ID NO.2:5’-TCACCGGCCTCGCTCT-3’,

SEQ ID NO.3:5’-TCCGGTCCCAATACTCCGGCTTTTCCGCGAGTCCGAGGAT-3’,

SEQ ID NO.4:5’-CACACAGATCTCCAAGACCTTTTAGTAGCCGCGCAGGTT-3’,

SEQ ID NO.5:5’-TCCTGCTCTATCCATGGCG-3’,

SEQ ID NO.6:5’-AACACACAGACTTACCGAGAGA-3’,

引物组B的引物的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.8:5’-GATTACATCGCCCTGAACGA-3’,

SEQ ID NO.9:5’-CCCACTGCCCCTGGTA-3’,

SEQ ID NO.10:5’-TCACGGGCCGCCTCCCACTTTTGACCTGAGCTCCTGGACC-3’,

SEQ ID NO.11:5’-TGAGAGCCTACCTGGAGGTTTTCGCTGCAGCGTCTCCTT-3’,

SEQ ID NO.12:5’-TGATCTGAGCCGCCGTGTC-3’,

SEQ ID NO.13:5’-GTGGCTCCGCAGATACCTGG-3’。

本发明提供用于检测个体中HLA-B*15：02等位基因的引物探针组的应用，具体的，在检测个体中HLA-B*15：02基因型试剂盒中的应用，或者，在检测个体中HLA-B*15：02基因型方法中的应用。

根据本发明具体实施方式的检测个体中HLA-B*15：02基因型方法，所述方法包括使用上述引物探针组，并通过环介导等温扩增-生物传感芯片-人工智能技术平台对待测样品进行检测的步骤。

其中，生物传感芯片是利用生物传感器为生物学组件，作为主要功能性元件，能够感受规定的被测量物质并按照一定规律将其转换成可识别信号的器件或装置。根据生物传感器的输出信号可分为比色生物传感器、荧光生物传感器、电化学生物传感器以及其他种类的生物传感器。

LAMP电化学生物传感器按照电化学活性物质与靶DNA结合特点的不同可为结合探针和嵌合剂两种类型。优选的，本发明使用结合探针，生物探针的序列与等位基因序列互补，能与LAMP扩增产物互补结合后让生物传感芯片的阻抗发生特定变化，将LAMP等温扩增的化学信号转化为电信号。

优选的，本发明中生物传感芯片可以采用IDE生物传感器芯片，IDE生物传感芯片上预先结合生物探针，在生物探针与扩增片段结合后，会影响IDE生物传感芯片的阻抗特性，IDE生物传感芯片的阻抗会发生剧烈变化。例如，IDE生物传感芯片与扩增也进行融合，在融合后，如果扩增液中包含与生物探针匹配的片段，生物探针会与该片段进行绑定，此时IDE生物传感芯片的阻抗发生剧烈变化；如果扩增液中不包含与生物探针匹配的片段，探针不会与DNA或RNA链绑定，此时IDE生物传感芯片的阻抗不发生剧烈变化。

也就是说，如果输入的待测样品为阳性，包含有要测试的HLA-B*15：02等位基因，扩增后后的片段和IDE生物传感芯片上的生物探针结合，IDE生物传感芯片的阻抗特性会发生强烈变化，在向IED生物传感芯片输入端输入电信号后，IDE生物传感芯片输出端信号的幅值和相位都会发生强烈变化；如果输入待测样品为阴性，则扩增后的片段无法与生物探针结合，IDE生物传感芯片的阻抗特性变化不大，那么IDE生物传感芯片的输出端信号的幅值和相位发生的变化没有强烈变化。

优选的，引物组A中的探针A的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.7:5’-TGTGTGTTCCG-3’。

引物组B中的探针B的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.14:5’-CTGCTCCGCC-3’。

本发明选择环介导等温扩增-生物传感芯片-人工智能技术平台(LAMP-IDE-AI)，粗血样经过裂解、扩增、与生物探针的特异性结合，基因扩增后的化学信号转化为电信号，通过建立AI算法模型对电信号进行处理，分析判决生物探针两端的阻抗特性频谱以及阳性样本阻抗特性频谱的共性特征，并通过机器学习模型对该共性特征值进行深度学习和提取，生成一组配置仪器的最佳参数,以对样本进行精准判决。同时,综合HLA外显子2和外显子3的LAMP-IDE-AI检测结果，降低假阳性的测试概率，最终快速准确判断样本的HLA-B*15:02阳性或阴性结果。

根据本发明具体实施方式的检测个体中HLA-B*15：02基因型方法，所述环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)的程序包括进行含有引物组A的LAMP扩增反应，以及进行含有引物组B的LAMP扩增反应。

其中，含有引物组A的LAMP扩增反应，以及进行含有引物组B的LAMP扩增反应可以按照先后次序进行，也可以选择同时进行。

根据本发明具体实施方式的检测个体中HLA-B*15：02基因型方法，含有引物探针组A的LAMP扩增反应：将待测样品用超纯水稀释后，在90～96℃条件下裂解，得到裂解液；裂解液与变色LAMP混合液、引物组A在65～75℃条件下进行LAMP扩增，15～25min后扩增结束。

具体的，将待检测的样本用超纯水稀释10倍后，注入微流控芯片的裂解腔体，在95℃裂解5min后，流入至LAMP扩增反应腔体中，与变色LAMP混合液(LAMP显色预混液)、引物B混合液在70℃条件下扩增，20min后扩增结束。

根据本发明具体实施方式的检测个体中HLA-B*15：02基因型方法，含有引物探针组B的LAMP扩增反应：将待测样品用超纯水稀释后，在90～96℃条件下裂解，得到裂解液；裂解液与变色LAMP混合液(LAMP显色预混液)、引物组B在65～75℃条件下进行LAMP扩增，15～25min后扩增结束。

具体的，将待测样品用超纯水稀释10倍后，注入微流控芯片的裂解腔体，在95℃裂解5min后，流入至LAMP扩增反应腔体中，与变色LAMP混合液、引物B混合液在70℃条件下扩增，20min后扩增结束。

本发明的有益效果：

1.核酸扩增特异性好

本发明针对HLA-B*15:02基因的外显子2和外显子3，分别设计了LAMP反应引物，LAMP反应中有4条特异性引物，对靶基因上6个区域进行识别，保证了LAMP反应的高度扩增性和特异性，特异性达100％。

2.扩增时间短

设计两条环引物，将LAMP扩增时间大幅度降低，控制在20分钟左右；

3.灵敏性高

为了解决LAMP反应假阳性高的缺点，设计了特异性的生物探针，与IDE生物传感芯片结合。将LAMP扩增产物与生物传感芯片上的探针互补结合后，改变芯片电极的阻抗，将把LAMP扩增产生的化学信号转化为电信号，通过算法模型针对HLA-B*15：02等位基因阴性、阳性产生电信号进行学习判断，能明确区分阴性、阳性结果，有效代替传统的荧光检测法和浊度检测法。

4.操作简单

本发明与其它检测方法相比，不需要复杂、昂贵、占地广的仪器设备，对操作人员技术要求低，不需提取样本DNA，仅需μL级别的样本加入微流控芯片中，自动进行裂解、扩增、与探针孵化结合、算法判决。因此，样本和试剂在LAMP扩增腔中的反应时间，加上进入IDE生物传感器室中与探针孵化结合、算法判决的时间，总体流程约45分钟，即可获得判别结果。

将样品限制在设备的微流控环境中，降低了样品污染的风险，并将检测所需的样品体积和试剂降到最低，从而进一步降低了筛选和检测的总体成本。

5.结果直观性

本发明采用LAMP-IDE-AI技术，最后直接显示HLA-B*15：02基因检测结果为阴性或阳性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1显示外显子2和外显子3的LAMP显色法检测结果；

图2显示外显子2和外显子3的LAMP-IDE-AI检测结果；

其中，‘+’表示存在LAMP扩增产物，‘-’表示不存在LAMP扩增产物；*阳性和阴性实验结果分别表示HLA-B*15:02阳性和HLA-B*15:02阴性；表中阴影区域包括HLA-B*15:02阳性样本(n＝9)，非阴影区域包括HLA-B*15:02阴性样本(n＝12)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例1设计引物和探针

外显子2和外显子3的多态性对于HLA-I类分子的肽结合特异性非常重要，编码结合肽的α1和α2结构域。本发明选择HLA-B*15：02等位基因的外显子2和外显子3以及部分内含子的序列，如下：

1 gaggtatttc tacaccgcca tgtcccggcc cggccgcggg gagccccgct tcatcgcagt

61 gggctacgtg gacgacaccc agttcgtgag gttcgacagc gacgccgcga gtccgaggat

121 ggcgccccgg gcgccatgga tagagcagga ggggccggag tattgggacc ggaacacaca

181 gatctccaag accaacacac agacttaccg agagagcctg cggaacctgc gcggctacta

241 caaccagagc gaggccggtg agtgaccccg gcccggggcg caggtcacga ctccccatcc

301 cccacgtacg gcccgggtcg gcccgagtct ccgggtccga gatccgcccc cctgaggccg

361 cgggacccgc ccaaaccctc gaccggcgag agccccaggg gcgtttaccc ggtttcattt

421 tcagttgagg ccaaaatccc cgcgggttgg tcggggcggg gcggggctcg ggggacgggg

481 ctgaccgcgg ggcctgggcc agggtctcac accctccaga ggatgtacgg ctgcgacgtg

541 gggccggacg ggcgcctcct ccgcgggtat gaccagtccg cctacgacgg caaggattac

601 atcgccctga acgaggacct gagctcctgg accgcggcgg acacggcggc tcagatcacc

661 cagcgcaagt gggaggcggc ccgtgtggcg gagcagctga gagcctacct ggagggcctg

721 tgcgtggagt ggctccgcag atacctggag aacgggaagg agacgctgca gcgc

1.1针对上述序列设计引物、探针如下：

Exon2引物探针序列表

引物/探针名称	末端修饰	序列(5’to 3’)
			F3	/	CGACACCCAGTTCGTGA
FIP(F1c/TTTT/F2)	5’Biotin	GGCCCCTCCTGCTCTATCTTTTTTCGACAGCGACGCCG
			BIP(B1c/TTTT/B2)	/	CCAAGACCAACACACAGACTTTTTTCACTCACCGGCCTCG
B3	/	GGGAGTCGTGACCTGC
			生物探针3	5’Amine	TGTGTGTTCCG

Exon3引物探针序列表

引物/探针名称	末端修饰	序列(5’to 3’)
			F3	/	GGCCAGGGTCTCACATCAT
FIP(F1c/TTTT/F2)	/	TCATACCCGCGGAGGATTTTAGGATGTATGGCTGCGACGT
			BIP(B1c/TTTT/B2)	/	GTGAGGCGGAGCAGCTGATTTTCAGGTATCTGCGGAGCCACT
B3	/	AGCGTCTCCTTCCCGTTCT
			生物探针4	5’Amine	CGTAGGCGGAC

生物探针是一段将LAMP扩增阳性产物与IDE生物传感芯片上化学分子连接的小片段DNA序列，本发明的设计原则包括：(1)DNA序列与目标基因互补，(2)对探针5’进行氨基改性，以便与传感器芯片上的化学分子连接。根据探针的设计原则，本发明在目标序列中引物B1与F1之间的序列上，选择与其它HLA等位基因突变的点位，并通过大量的LAMP-IDE实验确定反应效果最佳的一段序列，选择上述序列作为生物探针。

取4μL待检测的样本用超纯水稀释10倍后注入微流控芯片的裂解腔体，同时按照以下配比混合后加入到LAMP扩增腔体中：

Exon2 LAMP反应混合液

待检样本在裂解腔体中95℃裂解5min后，流出4μL进入LAMP扩增反应腔体中，65℃、60min后扩增结束，LAMP扩增结果与微流控芯片及生物传感芯片结合，将生物化学信号转化成电信号，检测结果(阳性/阴性)可直接显示在便携式仪器的LED屏上。

为进一步确定HLA-B*15：02基因检测结果的准确性，利用Exon3引物再次进行实验。将设计的Exon3的探针提前结合在生物传感芯片上。取4uL待检测的样本用超纯水稀释10倍后注入微流控芯片的裂解腔体，同时按照以下配比混合后加入到LAMP扩增腔体中。

Exon3 LAMP反应混合液

成分	体积
		变色LAMP混合液	6.25μL
LAMP引物混合液(Exon3)	1.25μL
		甜菜碱，1M	2.5μL
硫酸镁，2mM	0.25μL
		无酶纯水	1.25μL

待检样本在裂解腔体中95℃裂解5min后，流出1μL进入LAMP扩增反应腔体中，66℃、80min后扩增结束，LAMP扩增技术与微流控芯片及生物传感芯片结合，将生物化学信号转化成电信号，检测结果(阳性/阴性)可直接显示在便携式仪器的LED屏上。

同时，对相应的全血样本进行DNA抽提，采用PCR扩增荧光检测技术确定血样的HLA-B*15：02是否阴性或阳性，或对血样进行HLA-B基因分型。将检测结果进行比对，确定LAMP-IDE-AI技术平台下的对HLA-B*15：02的体外基因快筛结果，计算灵敏度和特异性。

本发明共采用27个全血样本，分别以LAMP-IDE-AI和PCR技术扩增，检测HLA-B*15：02基因分型，并进行结果比对。其中，LAMP-IDE-AI实验中，阳性结果15个，阴性结果12个；PCR技术中，血样中有14个为HLA-B*15:02阳性，13个为阴性血样。

以PCR荧光检测或血样HLA分型结果为“金标准”，对两种检测方法进行比对，计算LAMP-IDE-AI技术平台下的HLA-B*15：02检测结果的灵敏度和特异性。

灵敏度％＝真阳性个数/(真阳性个数+假阴性个数)*100％；

特异性％＝真阴性个数/(真阴性个数+假阳性个数)*100％。

经过比对，使用本发明的引物探针检测结果中真阳性个数为13，假阳性个数为2；真阴性个数为11，假阴性个数为1。通过计算，利用本发明最初设计的引物探针进行检测，其灵敏度是92.86％，特异性是84.62％，仍需进一步优化。

1.2引物的优化

1.2.1在上述引物基础上，本发明进一步优化设计，引物设计按照如下原则：

引物序列不能比对到其他HLA等位基因(如HLA-B*40:10等)序列，以保证特异性；引物序列与GENBANK数据库中的HLA-B*15：02基因进行比对，需匹配程度高，保证引物通用型好；从引物F2到B2的LAMP扩增产物序列需要进行blast，确保特异性。

按照上述原则设计出合适的LAMP引物，包括正向和后外引物(F3和B3)，正向和后内引物(FIP和BIP)，以及环状引物(FL和BL)。同时，根据HLA-B*15：02等位基因与其它HLA等位基因突变的点位，设计生物探针，与基因序列互补。

Exon2引物探针序列表

引物/探针名称	序列(5’to 3’)
		F3	TGAGGTTCGACAGCGACG
FIP(F1c/TTTT/F2)	TCCGGTCCCAATACTCCGGCTTTTCCGCGAGTCCGAGGAT
		BIP(B1c/TTTT/B2)	CACACAGATCTCCAAGACCTTTTAGTAGCCGCGCAGGTT
B3	TCACCGGCCTCGCTCT
		FL	TCCTGCTCTATCCATGGCG
BL	AACACACAGACTTACCGAGAGA
		生物探针1	TGTGTGTTCCG

Exon3引物探针序列表

引物/探针名称	序列(5’to 3’)
		F3	GATTACATCGCCCTGAACGA
FIP(F1c/TTTT/F2)	TCACGGGCCGCCTCCCACTTTTGACCTGAGCTCCTGGACC
		BIP(B1c/TTTT/B2)	TGAGAGCCTACCTGGAGGTTTTCGCTGCAGCGTCTCCTT
B3	CCCACTGCCCCTGGTA
		FL	TGATCTGAGCCGCCGTGTC
BL	GTGGCTCCGCAGATACCTGG
		生物探针2	CTGCTCCGCC

1.2.2引物的制备

将引物干粉12000r/min条件下离心1分钟，加入分子生物学级别的纯水，(不加TE或其他缓冲液，以免将多余的缓冲液带入LAMP反应中)。采用无酶水来制备引物反应液。按照下表所示，制备引物混合液，-20℃下储存备用。

引物混合液

引物	浓度	体积
			FIP	100μM	20μL
BIP	100μM	20μL
			F3	10μM	25μL
B3	10μM	25μL
			FL	100μM	10μL
BL	100μM	10μL
			ddH<sub>2</sub>O	/	15μL

实施例2HLA-B*15：02基因LAMP检测方法

将实施例1获得的Exon2的探针提前结合在生物传感芯片上。

取4μL待检测的样本用超纯水稀释10倍后，注入微流控芯片的裂解腔体，同时按照下表配比将Exon2 LAMP反应混合液加入到LAMP扩增腔体中,其中，变色LAMP混合液是NEB公司的市售试剂。

Exon2 LAMP反应混合液

成分	体积
		变色LAMP混合液	6.25μL
LAMP引物混合液(Exon2)	1.25μL

待测样品依次经过裂解、LAMP扩增反应、与IDE上生物探针结合后，获得测试结果，并与传统HLA-B*15:02的检测方法相比对，具体过程如下：

待检样本在裂解腔体中95℃裂解5min后，流出5μL进入LAMP扩增反应腔体中，70℃、20min后扩增结束，LAMP扩增产物与生物传感芯片结合，将生物化学信号转化成电信号，检测结果(阳性/阴性)可直接显示在便携式仪器的LED屏上。

为进一步确定HLA-B*15：02基因检测结果的准确性，利用Exon3引物再次进行实验。将设计的Exon3的探针提前结合在生物传感芯片上。取4uL待检测的样本用超纯水稀释10倍后注入微流控芯片的裂解腔体，同时按照以下配比混合后加入到LAMP扩增腔体中：

Exon3 LAMP反应混合液

成分	体积
		变色LAMP混合液	6.25μL
LAMP引物混合液(Exon3)	1.25μL

优化后的Exon3的LAMP反应混合液的成分更加简洁，通过实验优化不再使用甜菜碱、硫酸镁溶液，并且通过增加环引物FL、BL来达到减少LAMP反应时间。同时将LAMP反应温度从65℃提高至70℃，将反应时间从80分钟减少至20分钟。

从IHWG获得HLA-B分型的人类基因组DNA，包括7个阳性样本，10个阴性样本。核酸样本经过LAMP-IDE-AI技术平台的HLA-B*15：02基因体外快速检测，结果显示7个阳性结果，10个阴性结果。同时，采用PCR技术进行扩增，检测HLA-B*15:02基因分型，确定这17个样本的HLA-B*15：02基因阳性或阴性。检测结果显示7个HLA-B*15:02阳性，10个阴性结果。

通过两种检测方法的比对，本发明对HLA-B*15：02检测结果的灵敏度是100％，特异性是100％。

实施例3检测结果比对

将12个样本分别在微流控芯片中进行LAMP扩增反应，先于裂解腔内95℃裂解5分钟，再将裂解液泵入LAMP扩增腔内，70℃扩增，反应20分钟。

观察LAMP扩增溶液显色变化后，将扩增液泵入IDE生物传感器室内，与传感器上的生物探针孵化30分钟，通过检测设备和autolab各自采集电极阻抗频谱数据后，将12组数据进行算法模型的测试集，之前的17组数据作为算法模型的训练集。同时对外显子2和外显子3进行实验。

首先通过17组数据训练得到阳性和阴性样本的特征值，再对新采集的12组数据进行测试。将测试结果分别与LAMP扩增产物显色反应和PCR荧光检测法的结果进行对比，计算灵敏度和特异性。

由上表可知，本发明能有效避免出现假阳性情况，其特异性和灵敏度可达到100％，与PCR扩增荧光检测法的结果相当。

再取21个病人样本进行LAMP反应，并将LAMP扩增产物分别通过IDE生物传感芯片和显色反应(或者凝胶电泳法)进行检测对比，都同时对外显子2和外显子3进行实验，其中，病人样本已经进行PCR扩增和HLA-B*15:02基因分型确定了样本HLA-B*15:02基因阳性阴性结果。检测结果见图1、2。

图1显示了外显子2和外显子3的LAMP显色法检测结果，将每个样本检测结果与已知HLA-B基因型进行比较。其中，外显子3有一个假阴性结果。LAMP显色法法检测HLA-B*15:02的灵敏度和特异性分别为88.89％和100％。

图2分别显示了外显子2和外显子3的LAMP-IDE-AI检测结果，包括通过IDE生物传感器和机器学习算法获得的外显子2和外显子3的测试结果。其中，通过生物传感器使用预先训练的算法确定之前外显子3的LAMP结果为假阴性的样本为阳性。使用IDE传感器和机器学习算法检测HLA-B*15:02的灵敏度和特异性分别为100％和100％。

本发明通过对HLA-B基因外显子2和外显子3的组合反应结果来判断HLA-B*15:02基因是否为阳性或者阴性。只有当外显子2和外显子3的实验结果都为阳性的时候，才会判断HLA-B*15:02的检测结果为阳性，外显子2和外显子3都为阴性或者一个为阳性一个为阴性的情况都判断为检测结果为阴性。通过这种组合判决方法，降低了LAMP反应假阳性或假阴性带来的不良反应。

同时，LAMP反应扩增物中含有的目标DNA链会和绑定在生物传感芯片上面的特定的和DNA链具有互补性的生物探针进行键合，从而引起生物探针两端的阻抗特性频谱会发生显著变化，阳性样本的阻抗特性频谱具有共性特征，通过机器学习模型对该共性特征值进行学习提取，利用这些共性特征值对新的阳性样本上进行精准判决。通过区别假阳性和真阳性的频谱特征值，可以进一步有效区分假阳性和真阳性，从而降低假阳性的概率，从而进一步提高灵敏度和特异性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 常州先趋医疗科技有限公司

<120> 用于检测HLA-B*15:02等位基因的引物组及其应用

<141> 2021-12-23

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tgaggttcga cagcgacg 18

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tcaccggcct cgctct 16

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

tccggtccca atactccggc ttttccgcga gtccgaggat 40

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cacacagatc tccaagacct tttagtagcc gcgcaggtt 39

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tcctgctcta tccatggcg 19

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aacacacaga cttaccgaga ga 22

<210> 7

<211> 11

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

tgtgtgttcc g 11

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gattacatcg ccctgaacga 20

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

cccactgccc ctggta 16

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

tcacgggccg cctcccactt ttgacctgag ctcctggacc 40

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

tgagagccta cctggaggtt ttcgctgcag cgtctcctt 39

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tgatctgagc cgccgtgtc 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

gtggctccgc agatacctgg 20

<210> 14

<211> 10

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

ctgctccgcc 10

Claims

1.用于检测HLA-B*15：02等位基因的引物组，其特征在于，所述引物组包括引物组A和引物组B，其中，引物组A中的引物的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.1:5’-TGAGGTTCGACAGCGACG-3’,

SEQ ID NO.2:5’-TCACCGGCCTCGCTCT-3’,

SEQ ID NO.3:5’-TCCGGTCCCAATACTCCGGCTTTTCCGCGAGTCCGAGGAT-3’,

SEQ ID NO.4:5’-CACACAGATCTCCAAGACCTTTTAGTAGCCGCGCAGGTT-3’,

SEQ ID NO.5:5’-TCCTGCTCTATCCATGGCG-3’,

SEQ ID NO.6:5’-AACACACAGACTTACCGAGAGA-3’,

引物组B中的引物的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.8:5’-GATTACATCGCCCTGAACGA-3’,

SEQ ID NO.9:5’-CCCACTGCCCCTGGTA-3’,

SEQ ID NO.10:5’-TCACGGGCCGCCTCCCACTTTTGACCTGAGCTCCTGGACC-3’,

SEQ ID NO.11:5’-TGAGAGCCTACCTGGAGGTTTTCGCTGCAGCGTCTCCTT-3’,

SEQ ID NO.12:5’-TGATCTGAGCCGCCGTGTC-3’,

SEQ ID NO.13:5’-GTGGCTCCGCAGATACCTGG-3’。

2.根据权利要求1所述的用于检测HLA-B*15：02等位基因的引物组，其特征在于，引物组A还包含探针A，探针A的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.7:5’-TGTGTGTTCCG-3’；并且

引物组B还包含探针B，探针B的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO.14:5’-CTGCTCCGCC-3’。

3.权利要求1或2所述的用于检测HLA-B*15：02等位基因的引物组的应用。

4.权利要求1或2所述的引物组在制备检测HLA-B*15：02基因型的试剂盒中的应用。

5.权利要求1或2所述的引物组在检测个体中HLA-B*15：02基因型方法中的应用。

6.检测HLA-B*15：02基因型的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1或2所述的引物组，并通过环介导等温扩增-生物传感芯片-人工智能技术平台对待测样品进行检测的步骤。

7.根据权利要求6所述的检测HLA-B*15：02基因型的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的程序包括进行含有引物组A的LAMP扩增反应，以及进行含有引物组B的LAMP扩增反应。

8.根据权利要求6所述的检测HLA-B*15：02基因型方法，其特征在于，含有引物组A的LAMP扩增反应：将待测样品用超纯水稀释后，在90～96℃条件下裂解，得到裂解液；裂解液与变色LAMP混合液、引物组A在65～75℃条件下进行LAMP扩增，15～25min后扩增结束。

9.根据权利要求6所述的检测HLA-B*15：02基因型方法，其特征在于，含有引物组B的LAMP扩增反应：将待测样品用超纯水稀释后，在90～96℃条件下裂解，得到裂解液；裂解液与变色LAMP混合液、引物组B在65～75℃条件下进行LAMP扩增，15～25min后扩增结束。

10.根据权利要求6～9任一项所述的检测HLA-B*15：02基因型方法，其特征在于，环介导等温扩增的扩增产物与生物传感芯片上的探针结合，生物化学信号转化成电信号，并由人工智能技术平台输出检测结果。