CN117363718A - 用于检测hla-b*15:02等位基因的引物组及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测HLA‑B*15:02等位基因的引物组及方法，所述引物组包括分别针对HLA‑B*15:02等位基因外显子2的AAC位点突变、GAT位点突变、以及外显子3的GGT位点突变、TCA位点突变的引物组；其中针对外显子2的AAC位点突变的引物组核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5；针对外显子2的GAT位点突变的引物组核苷酸序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.10；针对外显子3的GGT位点突变的引物组核苷酸序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.15；以及针对外显子3的TCA位点突变的引物组核苷酸序列如SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.21。本发明的引物组保证了LAMP反应的高度扩增性和特异性，特异性可达100％，同时将LAMP扩增时间大幅度降低，控制在30分钟左右，且通过四位点突变的相互印证可以提高HLA‑B*15:02等位基因检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测HLA-B*15:02等位基因的引物组及方法。
背景技术
癫痫是神经系统第二大疾病，患病率为4‰～7‰,目前全球约有7000万癫痫患者,我国癫痫患者人数约为1000万。以治疗癫痫的“黄金标准”抗癫痫药之一—卡马西平为例，价格低、疗效好，近年来在治疗癫痫和外周神经痛等方面应用广泛。但是研究发现，部分抗癫痫药物会引起超敏反应，服用马卡西平引起的不良反应包括严重的皮肤病——Steven-Johnson综合征(SJS)和中毒性表皮坏死松解症(TEN)。SJS/TEN的发病率从药物暴露的千分之一到万分之一不等，死亡率高达35％。药物遗传学研究已经发现了抗癫痫药物诱导的不良反应与HLA-B*15:02等位基因之间存在很强的关联性，且HLA-B*15:02等位基因主要见于亚洲人群。作为预防措施，美国食品和药物管理局(FDA)强制要求对高危人群用药前进行等位基因的筛查。然而由于传统的基因检测模式费用高且需要等到5-7天，很多患者不愿意进行这项检查，在没有HLA-B*15:02检测结果的条件下，医生也没法随便开药。这样就导致了卡马西平药物的使用量急剧下降。筛查政策出台后，中国香港使用卡马西平下降超过80％，其他亚洲国家和地区的情况类似。反过来又导致很多病人实际上得不到有效治疗，而这种情况实际上已经严重危害了病人本身的安全。在中国三甲医院和全球的大医院尚且如此，在很多社区医院甚至边远乡村医院更难以开展有效的基因检测工作。这些地区的很多病患根本就享受不到基因检测这项技术给他们带来的价值和服务。
HLA-B*15:02等位基因的常规检测方法主要包括PCR扩增荧光检测法以及二代测序发，具有准确度高的特点，但是需要专业的检测设备，对实验室条件要求较高，且操作较为复杂，需要经过培训的专业人员进行，检测时间较长，检测费用较高，使得HLA-B*15:02等位基因检测难以在普通医疗机构大面积推广普及。因此，亟需一种准确、快速、操作便捷的检测手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测HLA-B*15:02等位基因的引物组。
本发明的再一目的是提供上述引物组的应用。
本发明的再一目的是提供用于检测HLA-B*15:02等位基因的方法。
根据本发明具体实施方式的用于检测HLA-B*15:02等位基因的引物组，包括分别针对HLA-B*15:02等位基因外显子2的AAC位点突变、GAT位点突变、以及外显子3的GGT位点突变、TCA位点突变的引物组；
针对HLA-B*15:02等位基因外显子2的AAC突变和GAT突变、外显子3的GGT突变和TCA突变设计的引物组中分别有4条特异性引物，包括正向和后外引物(F3和B3)，正向和后内引物(FIP和BIP)，对靶基因上6个区域进行识别，保证了LAMP反应的高度扩增性和特异性，以及针对外显子2的AAC突变和GAT突变，以及针对外显子3的GGT突变的引物组中还设计有1条环引物(LB)，针对外显子3的TCA突变的引物组中还设计有两条环引物(LB和LF)，可以减少核酸扩增反应时间，
其中，针对外显子2的AAC位点突变的引物组核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.5；
针对外显子2的GAT位点突变的引物组核苷酸序列如SEQ ID NO.6～SEQ IDNO.10；
针对外显子3的GGT位点突变的引物组核苷酸序列如SEQ ID NO.11～SEQ IDNO.15；以及
针对外显子3的TCA位点突变的引物组核苷酸序列如SEQ ID NO.16～SEQ IDNO.21。
又一方面，本发明提供用于检测检测HLA-B*15:02等位基因的引物组的应用，具体的，在检测HLA-B*15:02等位基因的试剂盒中的应用，或者，在检测HLA-B*15:02等位基因的方法中的应用，在检测HLA-B*15:02等位基因的微流控芯片中的应用，尤其是利用环介导等温扩增-光谱传感器-人工智能技术平台检测HLA-B*15:02等位基因。
又一方面，本发明还提供了一种用于检测HLA-B*15:02等位基因的方法，包括：利用LAMP检测技术结合上述的引物组中针对HLA-B*15:02等位基因外显子2的AAC位点突变、GAT位点突变、以及外显子3的GGT位点突变、TCA位点突变的引物组分别对待测样本进行环介导等温扩增；分析扩增产物的结果。
进一步的，所述环介导等温扩增的反应温度为65～70℃，反应时间为25～30分钟。
进一步的，所述环介导等温扩增的程序在包含至少四个反应腔的微流控芯片中进行。
具体的，先将四份2×LAMP预混液分别和针对HLA-B*15:02等位基因外显子2的AAC位点突变、外显子2的GAT位点突变、外显子3的GGT位点突变、以及外显子3的TCA位点突变的引物组的混合液分别注入微流控芯片的其中四个不同反应腔内，将待测样本用灭菌无酶水稀释后分别注入两个反应腔中形成LAMP反应体系，在65～70℃条件下进行LAMP扩增，25～30分钟后扩增结束。
进一步的，所述分析扩增产物的结果的方法包括对LAMP反应结果进行光谱分析和/或显色分析。
本发明的有益效果是，本发明分别针对HLA-B*15:02等位基因外显子2的AAC位点突变、外显子2的GAT位点突变、外显子3的GGT位点突变、以及外显子3的TCA位点突变，均设计了4条特异性引物，对靶基因上6个区域进行识别，保证了LAMP反应的高度扩增性和特异性，特异性可达100％，同时各引物组分别设计一条或两条环引物，将LAMP扩增时间大幅度降低，控制在30分钟左右，且通过四位点突变的相互印证可以提高HLA-B*15:02等位基因检测的准确性。
本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明特异性实验中确定为HLA-B*15:02等位基因的阳性样本的LAMP检测结果；
图2是本发明特异性实验中确定不是HLA-B*15:02等位基因的阴性样本的LAMP检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的实施例中涉及的2×LAMP预混液可以是购买得到的NEB，M1800(美国)，也可以是自己配置的，其可以包含有MgSO4，MgSO4的浓度为6mM～12mM，缓冲液、dNTPs、KCl、(NH4)2SO4、Bst DNA polymerase、酚红、灭菌无酶水等。
本发明的实施例中涉及的引物序列和EGFR基因的野生型以及突变型合成质粒DNA可以从生工生物工程(上海)股份有限公司订购。
本发明使用的样本DNA均为用HLA-B*15:02等位基因阳性和阴性患者血样利用血液DNA提取试剂盒(天根)提取得到。
1、引物的设计与筛选
通过LAMP引物设计网站(http://primerexplorer.jp/)针对HLA-B*15:02等位基因外显子2的AAC、GAT位点突变，外显子3的GGT、TCA位点突变分别设计引物。用HLA-B*15:02等位基因阳性和阴性患者血样提取的gDNA通过LAMP反应分别对引物进行筛选，最终选定的各突变类型的LAMP引物组核苷酸序列序列如下表1。
表1
2、反应条件
经过几轮不同反应条件测试后，最终选定以下条件为最终的试剂配比与反应条件：
(1)10×引物混合液配制：
表2
(3)LAMP反应体系中的引物、2×LAMP预混液和样本稀释液配比：
表3
| 1个反应(μL) | |
| 2×LAMP预混液 | 6.25 |
| 10×引物混合液 | 1.25 |
| 样本稀释液 | 5.0 |
所述样本稀释液为用血液DNA提取试剂盒(天根)提取所得的待检测的血样DNA稀释得到，也可以是其他体液样本及组织样本提取的DNA稀释得到。
(4)反应条件
在65～70℃温度条件下，恒温扩增25～30分钟，有较好的检测结果。
加热可以采用恒温加热装置(水浴锅、金属浴、恒温烘箱、或PCR仪等)进行加热。
3、HLA-B*15:02等位基因的LAMP检测方法
第一步、样本稀释液制备
将待检测的血样DNA用去离子水稀释至10ng/μL，制成样本稀释液。
第二步、引物混合液制备
将分别针对HLA-B*15:02等位基因外显子2的AAC、GAT位点突变，外显子3的GGT、TCA位点突变设计的四组引物组，按表2中的配比分别配制成相应的引物混合液。
第三步、LAMP反应体系制备
按表3中的配比，分别将配制的四组引物混合液与2×LAMP预混液混合，配制成针对外显子2的AAC位点突变的LAMP反应体系、针对外显子2的GAT位点突变的LAMP反应体系、针对外显子3的GGT位点突变的LAMP反应体系、以及针对外显子3的TCA位点突变的LAMP反应体系。
第四步、取四组5μL样本稀释液，分别加入四组LAMP反应体系中，并在65～70℃下恒温扩增25～30分钟，得到扩增产物。
第五步、利用光谱传感器对四组反应体系的检测结果进行判读，或者直接根据四组反应体系的显色结果进行判读，确定待测EGFR基因样本的基因型，原反应体系的颜色为紫色，若经LAMP反应后颜色发生变化则为阳性反应，若经LAMP反应后颜色不变化则为阴性反应，判读标准为：当同一样本的四组引物的LAMP检测结果均为阳性反应，则此样本为HLA-B*15:02等位基因的阳性样本，即该样本的分型为HLA-B*15:02；当同一样本的四组引物组的LAMP检测结果中至少有一个为阴性反应时，则此样本为HLA-B*15:02等位基因的阴性样本，即该样本的分型不是HLA-B*15:02。
本发明采用了LAMP技术对HLA-B*15:02等位基因的突变位点进行检测，相比于传统的PCR法以及二代测序法，本发明仅需要恒温水浴锅或金属浴即可在30分钟内完成检测，无需昂贵的仪器设备，无需专业实验场地与专业技术人员。
本发明通过将针对HLA-B*15:02等位基因的四个突变位点的四组引物组的LAMP反应结果相互印证，可以更加快速精准地对HLA-B*15:02等位基因进行筛查，提高HLA-B*15:02等位基因的检测效率。
4、检测HLA-B*15:02等位基因的特异性试验
获取已通过第三方进行二代测序确定HLA-B*15:02等位基因样本分型的血液样本，并利用HLA-B*15:02等位基因的LAMP检测方法对确定样本分型的血液样本进行检测，并将检测结果与第三方检测结果进行比对，也可以通过环介导等温扩增-光谱传感器-人工智能技术平台确定血液样本的体外基因快筛的结果，计算灵敏度和特异性。
本实施例中采用确定样本分型的血样DNA样本，其中确定样本分型为HLA-B*15:02的阳性样本11个，确定样本分型不是HLA-B*15:02的阴性样本7个，分别对上述18个样本采用HLA-B*15:02等位基因的LAMP检测方法进行检测，并进行结果比对；如图1所示，确定样本分型为HLA-B*15:02的11个样本的四组引物组的LAMP检测结果均为阳性反应；如图2所示，确定样本分型不是HLA-B*15:02的7个样本的四组引物组的LAMP检测结果中均至少有一组为阴性反应。
由上述检测结果可知，采用本发明的方法对HLA-B*15:02等位基因的检测结果与传统二代测序法结果一致性为100％，无假阳性或假阴性结果，灵敏度和特异性均为100％。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (8)
1.一种用于检测HLA-B*15:02等位基因的引物组，其特征在于，所述引物组包括分别针对HLA-B*15:02等位基因外显子2的AAC位点突变、GAT位点突变、以及外显子3的GGT位点突变、TCA位点突变的引物组；其中
针对外显子2的AAC位点突变的引物组核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5；
针对外显子2的GAT位点突变的引物组核苷酸序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.10；
针对外显子3的GGT位点突变的引物组核苷酸序列如SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.15；以及
针对外显子3的TCA位点突变的引物组核苷酸序列如SEQ ID NO.16～SEQ ID NO.21。
2.根据权利要求1所述的引物组在制备检测HLA-B*15:02等位基因的试剂盒中的应用。
3.根据权利要求1所述的引物组在检测个体HLA-B*15:02等位基因的方法中的应用。
4.根据权利要求1所述的引物组在用于检测HLA-B*15:02等位基因的微流控芯片中的应用。
5.一种用于检测HLA-B*15:02等位基因的方法，其特征在于，
利用LAMP检测技术结合权利要求1所述引物组中针对HLA-B*15:02等位基因外显子2的AAC位点突变、GAT位点突变、以及外显子3的GGT位点突变、TCA位点突变的引物组分别对待测样本进行环介导等温扩增；
分析扩增产物的结果。
6.根据权利要求5所述的用于检测HLA-B*15:02等位基因的方法，其特征在于，
所述环介导等温扩增的反应温度为65～70℃，反应时间为25～30分钟。
7.根据权利要求6所述的用于检测HLA-B*15:02等位基因的方法，其特征在于，
所述环介导等温扩增的程序在包含至少四个反应腔的微流控芯片中进行。
8.根据权利要求5所述的用于检测HLA-B*15:02等位基因的方法，其特征在于，
所述分析扩增产物的结果的方法包括对LAMP反应结果进行光谱分析和/或显色分析。
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