CN114686611A - 用于检测单增李斯特菌的引物组及其应用 - Google Patents

用于检测单增李斯特菌的引物组及其应用 Download PDF

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CN114686611A CN202210433329.1A CN202210433329A CN114686611A CN 114686611 A CN114686611 A CN 114686611A CN 202210433329 A CN202210433329 A CN 202210433329A CN 114686611 A CN114686611 A CN 114686611A
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陈巧玲
吴婧
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Abstract

本发明属于食品安全检测领域，具体涉及用于检测单增李斯特菌的引物组及其应用。本发明的用于检测单增李斯特菌的引物组，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1‑SEQ ID NO.4所示。与现有的PCR扩增荧光检测技术比较，本发明设计针对单增李斯特菌hlyA基因的环介导等温扩增(LAMP)引物，实现样本核酸的快速扩增，灵敏度和特异性均得到显著提高；本发明的方法操作简便，实验仪器要求较低，在基层或家庭中具有广阔的推广应用前景。

Description

用于检测单增李斯特菌的引物组及其应用
技术领域
本发明属于食品安全检测领域，具体涉及用于检测单增李斯特菌的引物组及其应用。
背景技术
单核细胞增生李斯特菌又称单增李斯特菌，是一种引起人畜共患病和食源性疾病的病原菌。人食用了被单增李斯特菌污染的食物后，会引起恶心、头痛、发烧、腹痛等一般性细菌感染引起的症状，除此之外，可能还会引起脑膜炎、脊髓炎、败血症等；孕妇食用了李斯特菌后会造成流产等较为严重的情况，小孩和老人因免疫力低下，易受到单增李斯特菌感染，其死亡率高达30％。单增李斯特菌可通过粪-口途径污染，也可通过眼睛、皮肤黏膜等途径感染。该菌在4℃环境下仍可生长，是冰箱中冷藏食物的“杀手”，威胁了人类的健康。因此，建立快速检测食物中是否存在单增李斯特菌的检测方法对人类健康有着十分重要的意义。
目前，用于检测单增李斯特菌的方法主要有细菌的分离鉴定、PCR扩增检测法，其具有准确度高的特点，但需要很长的时间及专业的技术性人员，并且其需要的实验设备体积大、成本高，需要在实验室中完成检测。此外，PCR扩增前，DNA提取是必需的步骤，从而难以在基层或家庭中普及应用。
LAMP等温扩增技术在食品安全行业有一定的应用，尤其是在快速筛查方面，但该方法假阳性高，在灵敏度和特异性方面无法做到和PCR一样高的精度，所以LAMP等温扩增技术在食品安全检测行业还没有广泛使用。
发明内容
本发明的目的在于提供一组检测单增李斯特菌的引物组、生物探针组。
本发明的再一目的在于提供上述引物探针组的应用。
本发明的再一目的在于提供检测单增李斯特菌的方法。
本发明针对单增李斯特菌hlyA基因设计4条特异性引物，能够针对靶基因6个区域进行识别。
根据本发明具体实施方式的用于检测单增李斯特菌的引物组，所述引物组包括以下引物：
SEQ ID NO.1:5’-TTCGGCGCAATCAGTGAA-3’,
SEQ ID NO.2:5’-GGAAGGTCTTGTAGGTTCATTAACAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTC-3’,SEQID NO.3:5’-TCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGTGAGATATATGCAGGAGGAT-3’,SEQ ID NO.4:5’-TAAACTTGACGGCCATACGC-3’。
根据本发明具体实施方式的用于检测单增李斯特菌的引物组，所述引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.5:5’-GAAAAATCTGG-3’。
本发明提供上述引物、引物探针组的应用，上述引物探针组可以应用于检测单增李斯特菌的试剂盒中，或者，利用上述引物探针组检测单增李斯特菌的方法中，尤其是利用环介导等温扩增-生物传感芯片-人工智能技术平台检测单增李斯特菌。
具体的，根据本发明具体实施方式的检测单增李斯特菌的方法，所述方法包括使用上述引物组或生物探针组，并通过环介导等温扩增-生物传感芯片-人工智能技术平台对待测样品进行检测的步骤。
本发明针对单增李斯特菌hlyA基因设计特定的引物，绑定叉指电极(IDE)生物传感芯片的针对单增李斯特菌hlyA基因的生物探针，以及机器学习产生的针对hlyA基因的特定特征值，一起组合成了能够精准判决单增李斯特菌hlyA基因检测结果的方案。
其中，生物传感芯片是利用生物传感器为生物学组件，作为主要功能性元件，能够感受规定的被测量物质并按照一定规律将其转换成可识别信号的器件或装置。根据生物传感器的输出信号可分为比色生物传感器、荧光生物传感器、电化学生物传感器以及其他种类的生物传感器。
将样品限制在设备的微流控环境中，降低了样品污染的风险，并将检测所需的样品体积和试剂降到最低，从而进一步降低了筛选和检测的总体成本。
LAMP电化学生物传感器按照电化学活性物质与靶DNA结合特点的不同可分为结合探针和嵌合剂两种类型。优选的，本发明使用结合探针，生物探针的序列与基因序列互补，能与LAMP扩增产物互补结合后让生物传感芯片的阻抗发生特定变化，将LAMP等温扩增的化学信号转化为电信号。
优选的，本发明中生物传感芯片可以采用IDE生物传感器芯片，IDE生物传感芯片上预先结合生物探针，在生物探针与扩增片段结合后，会影响IDE生物传感芯片的阻抗特性，IDE生物传感芯片的阻抗会发生剧烈变化。例如，IDE生物传感芯片与扩增液进行融合，在融合后，如果扩增液中包含与生物探针匹配的片段，生物探针会与该片段进行绑定，此时IDE生物传感芯片的阻抗发生剧烈变化；如果扩增液中不包含与生物探针匹配的片段，探针不会与DNA或RNA链绑定，此时IDE生物传感芯片的阻抗不发生剧烈变化。
也就是说，如果输入的待测样品为阳性，包含有单增李斯特菌的hlyA基因，扩增后的片段和IDE生物传感芯片上的生物探针结合，IDE生物传感芯片的阻抗特性会发生强烈变化，在向IED生物传感芯片输入端输入电信号后，IDE生物传感芯片输出端信号的幅值和相位都会发生强烈变化；如果输入待测样品为阴性，则扩增后的片段无法与生物探针结合，IDE生物传感芯片的阻抗特性变化不大，那么IDE生物传感芯片的输出端信号的幅值和相位发生的变化没有强烈变化。
根据本发明具体实施方式的检测单增李斯特菌的方法，所述环介导等温扩增(LAMP)的程序为：将待测样品稀释后，注入微流控芯片的LAMP扩增腔体，在60-70℃条件下，扩增20-40min。
具体的，5μL待测样品进入LAMP扩增反应腔体中，70℃、20min后扩增结束，LAMP扩增产物与生物传感芯片结合，将生物化学信号转化成阻抗频谱信号，用机器学习模型对结果进行判决，检测结果(阳性/阴性)可直接显示在便携式仪器的LED屏上。
根据本发明具体实施方式的检测单增李斯特菌的方法，环介导等温扩增的扩增产物与生物传感芯片上的探针结合，生物化学信号转化成电信号，并由人工智能技术平台输出检测结果。
本发明选择环介导等温扩增-生物传感芯片-人工智能技术平台(LAMP-IDE-AI)，待测样品经过裂解、扩增、与生物探针的特异性结合，基因扩增后的化学信号转化为电信号，通过建立AI算法模型对电信号进行处理，分析判决生物探针两端的阻抗特性频谱以及阳性样本阻抗特性频谱的共性特征，并通过机器学习模型对该共性特征值进行深度学习和提取，生成一组配置仪器的最佳参数，以对待测样品进行精准判决。
本发明的有益效果：
1.本发明LAMP扩增反应针对单增李斯特菌hlyA基因设计了4条特异性引物，以提高灵敏度和特异性；
2.本发明设计了专门针对单增李斯特菌hlyA基因的独特的生物探针，与IDE生物传感芯片结合后，再与LAMP扩增产物互补结合，改变生物传感芯片中的点击阻抗，将LAMP扩增产生的化学信号转化为电信号，并配合AI算法分析判断生物探针两端阳性样本的阻抗特性频谱的特征，通过机器学习模型对共性特征值进行深度学习和提取，生成一组配置仪器的最佳参数，对样本进行精准判决；
3.通过单增李斯特菌hlyA基因的LAMP技术和AI算法组合来综合判断阴性和阳性，降低假阳性和假阴性的概率，极大提高了灵敏度和特异性。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
实施例1引物的设计和优化
单增李斯特菌溶血素O编码基因中的hlyA基因是单增李斯特菌具有毒害能力的主导地位基因，因此，选择hlyA基因进行LAMP引物的设计。
本发明选择的hlyA基因上的靶序列：
AATAGTTGTAAAAAATGCCACTAAATCAAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCGAAATTTGGTACAGCATTTAAAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTTAAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGTATGGCCGTCAAGTTTATTT
为了避免LAMP检测中的假阳性问题，本发明引物设计原则如下：(1)引物序列不能比对到其他基因序列，以保证特异性；(2)引物序列与GENBANK数据库中的hlyA基因进行比对，需匹配程度高，保证引物通用性好；(3)从引物F2到B2的LAMP扩增产物序列需要进行blast，确保特异性。
按照上述原则设计出合适的LAMP引物，包括正向和后外引物(F3和B3)，正向和后内引物(FIP和BIP)，以及环状引物(FL和BL)。
生物探针是一段将LAMP扩增阳性产物与IDE生物传感芯片上化学分子连接的小片段DNA序列，本发明的设计原则包括：(1)DNA序列与目标基因互补，(2)对探针5’进行氨基改性，以便与传感器芯片上的化学分子连接。根据探针的设计原则，本发明在目标序列中引物B1与F1之间的序列上，选择特异性强的DNA片段，并通过大量的LAMP-IDE-AI实验确定反应效果最佳的一段序列，选择上述序列作为生物探针。
1.1初步筛选引物
根据上述原则，本发明初步设计9套hlyA基因的LAMP引物供选择，引物序列如下：
Figure BDA0003611868040000051
Figure BDA0003611868040000061
将引物干粉12000r/min条件下离心1分钟，加入分子生物学级别的纯水，(不加TE或其他缓冲液，以免将多余的缓冲液带入LAMP反应中)。采用无酶水来制备引物反应液。按照下表所示，制备引物混合液，-20℃下储存备用。
引物 浓度 体积
FIP 100μM 20μL
BIP 100μM 20μL
F3 10μM 25μL
B3 10μM 25μL
无酶水 / 35μL
用以上9套LAMP引物，将质粒DNA稀释成50ng/ul作为模板。同时以无酶水做为阴性对照，按照以下配比混合后加入到PCR管中：
LAMP反应混合液
成分 体积
变色LAMP混合液 6.25μL
LAMP引物混合液 1.25μL
模板DNA/无酶水 2uL
无酶纯水 3μL
将PCR管置水浴锅中65℃加热30min后观察结果。PCR管中黄色说明为阳性，保持粉色说明为阴性结果。
结果显示，引物组5、引物组6、引物组8在加热30min后LAMP混合液颜色变黄，说明此三组引物较其它引物更灵敏。
1.2进一步筛选引物
选择引物组5、6、8进行LAMP扩增实验，将质粒DNA稀释成50ng/μL作为模板，同时以无酶水做为阴性对照，按照以下配比混合后加入到PCR管中：
LAMP反应混合液
组1 组2 组3 组4 组5
成分 体积 体积 体积 体积 体积
LAMP变色混合液 6.25μL 6.25μL 6.25μL 6.25μL 6.25μL
引物混合液 1.25μL 1.25μL 1.25μL 1.25μL 1.25μL
模板量 0.5μL 1μL 1.5μL 2μL /
无酶水 4.5μL 4μL 3.5μL 3μL 5μL
总体积 12.5μL 12.5μL 12.5μL 12.5μL 12.5μL
表1引物组5扩增结果
扩增时间 5-1 5-1 5-2 5-2 5-3 5-3 5-4 5-4 5-5 5-5 5-5
30min 粉 粉 粉 粉 粉 粉 黄 粉 粉 粉 粉
40min 粉 粉 粉 黄 粉 黄 黄 黄 粉 粉 粉
45min 黄 黄 黄 黄 黄 黄 黄 黄 粉 粉 粉
50min / / / / / / / / 粉 粉 粉
55min / / / / / / / / 粉 粉 粉
60min / / / / / / / / 粉 粉 粉
注：5-1代表引物5的第一组实验，以此类推；“/”表示不再进行加热扩增
表2引物组6扩增结果
扩增时间 6-1 6-1 6-2 6-2 6-3 6-3 6-4 6-4 6-5 6-5 6-5
30min 粉 粉 粉 粉 粉 粉 黄 粉 粉 粉 粉
40min 粉 粉 粉 粉 粉 粉 黄 粉 粉 粉 粉
45min 粉 粉 粉 粉 粉 黄 黄 黄 粉 粉 粉
50min 粉 黄 粉 黄 粉 黄 黄 黄 粉 粉 粉
55min 微黄 黄 微黄 黄 微黄 黄 黄 黄 粉 粉 粉
60min 黄 黄 黄 黄 黄 黄 黄 黄 粉 粉 粉
注：6-1代表引物6的第一组实验，以此类推；“/”表示不再进行加热扩增
表3引物组8扩增结果
Figure BDA0003611868040000071
Figure BDA0003611868040000081
注：8-1代表引物8的第一组实验，以此类推；“/”表示不再进行加热扩增
以上结果表明，引物组8对低浓度DNA模板具有较好的敏感性。因此确定引物组8为本发明的最终引物。
确定效果最佳引物序列后，在LAMP扩增的hlyA序列中选择多组10-12bp的核酸片段，将该片段与最佳引物组各引物序列进行比对，选择重合率最低的片段，其互补片段即为探针序列。
1.3本发明的引物探针序列和检测方法
hlyA引物探针序列表
引物/探针名称 序列(5’to 3’)
F3 TTCGGCGCAATCAGTGAA
FIP(F1c/TTTT/F2) GGAAGGTCTTGTAGGTTCATTAACAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTC
BIP(B1c/TTTT/B2) TCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGTGAGATATATGCAGGAGGAT
B3 TAAACTTGACGGCCATACGC
生物探针 GAAAAATCTGG
单增李斯特菌的LAMP检测方法：
取检测样本在微流控芯片中运行，经过LAMP扩增反应、与IDE上生物探针结合后，获得测试结果。
取单增李斯特菌基因组DNA约0.01ng，接入5μL无酶纯水中稀释后作为模板，注入微流控芯片的LAMP扩增腔体，同时按照以下配比混合后将LAMP反应液加入到LAMP扩增腔体中：
LAMP反应混合液
成分 体积
变色LAMP混合液 6.25μL
LAMP引物混合液 1.25μL
待检样本和LAMP反应混合液在LAMP扩增腔体中，70℃、20min后扩增结束，LAMP扩增产物与生物传感芯片结合，将生物化学信号转化成阻抗频谱信号，用机器学习模型对结果进行判决，检测结果(阳性/阴性)可直接显示在便携式仪器的LED屏上。
将20个样本分别泵入微流控芯片中的LAMP扩增腔体内，70℃扩增，反应20分钟。观察LAMP扩增溶液显色变化后，将扩增液泵入IDE生物传感器室内，与传感器上的生物探针孵化30分钟，通过检测设备和autolab各自采集电极阻抗频谱数据后，将20组数据作为算法模型的训练集得到阳性和阴性样本的特征值。
再次选择14个样本，分别泵入微流控芯片中进行LAMP扩增，70℃反应20分钟后，观察溶液颜色变化并将扩增液泵入IDE生物传感器室内，与生物探针孵育30分钟后，采集新的数据信号。将测试结果与LAMP扩增产物显色反应结果进行对比，计算灵敏度和特异性。
Figure BDA0003611868040000091
由上表可知，本发明通过单增李斯特菌hlyA基因的LAMP技术和AI算法组合来综合判断阴性和阳性，能有效避免出现假阳性情况，极大提高了灵敏度和特异性。
实施例2本发明方法与PCR法的比较
单增李斯特菌扩培后，挑取10个菌落(CFU)，接入50μL无酶纯水中，以1：10的比例依次稀释5次后，每次各取5μL单增李斯特菌样本，分别进行LAMP反应和PCR反应，比较其方法检测的灵敏度。
LAMP反应体系参照实施例1，反应温度设定为70℃，反应时间设定为20分钟，PCR反应使用的引物为F3和B3，PCR反应体系如下表：
成分 体积
10×PCR Buffer(含Mg2+) 2.75μL
F(20uM) 1μL
R(20uM) 1μL
dNTP 2.5μL
Taq DNA聚合酶 0.25μL
DNA模板 1μL
ddH<sub>2</sub>O 补足至25μL
PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸5min。
将LAMP和PCR的扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶上电泳，GelRed染色，凝胶成像系统中观察PCR结果，以能观察到条带的最低DNA浓度为检测限。
实验结果显示，当样本中单增李斯特菌的浓度为2.0*10-3CFU/mL，LAMP和PCR均能检测出阳性结果。这表明，本发明的LAMP试剂盒及LAMP方法比PCR方法的灵敏度相当，检出限为2.0*10-3CFU/mL。
实施例3本发明检测方法的特异性
分别取单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠埃希氏菌的DNA模板，按照以下配比混合，加入到LAMP扩增腔体中：
LAMP反应混合液
成分 体积
变色LAMP混合液 6.25μL
LAMP引物混合液 1.25μL
无酶纯水 2.5μL
70℃、20min后扩增结束，LAMP扩增产物与生物传感芯片结合，将生物化学信号转化成阻抗频谱信号，用机器学习模型对结果进行判决，检测结果(阳性/阴性)可直接显示在便携式仪器的LED屏上。
检测结果表明，只有在加入单增李斯特菌的样本时，才会显示出阳性的结果，其它样本均为阴性，说明本发明的引物探针具有良好的特异性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 常州先趋医疗科技有限公司
<120> 用于检测单增李斯特菌的引物组及其应用
<141> 2022-04-22
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ttcggcgcaa tcagtgaa 18
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggaaggtctt gtaggttcat taacagggaa aatgcaagaa gaagtc 46
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tcggcaaagc tgttactaaa gagtgagata tatgcaggag gat 43
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
taaacttgac ggccatacgc 20
<210> 5
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gaaaaatctg g 11
<210> 6
<211> 411
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
aatagttgta aaaaatgcca ctaaatcaaa cgttaacaac gcagtaaata cattagtgga 60
aagatggaat gaaaaatatg ctcaagctta tccaaatgta agtgcaaaaa ttgattatga 120
tgacgaaatg gcttacagtg aatcacaatt aattgcgaaa tttggtacag catttaaagc 180
tgtaaataat agcttgaatg taaacttcgg cgcaatcagt gaagggaaaa tgcaagaaga 240
agtcattagt tttaaacaaa tttactataa cgtgaatgtt aatgaaccta caagaccttc 300
cagatttttc ggcaaagctg ttactaaaga gcagttgcaa gcgcttggag tgaatgcaga 360
aaatcctcct gcatatatct caagtgtggc gtatggccgt caagtttatt t 411

Claims (8)

1.用于检测单增李斯特菌的引物组，其特征在于，所述引物组包括以下引物：
SEQ ID NO.1:5’-TTCGGCGCAATCAGTGAA-3’,
SEQ ID NO.2:5’-GGAAGGTCTTGTAGGTTCATTAACAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTC-3’,
SEQ ID NO.3:5’-TCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGTGAGATATATGCAGGAGGAT-3’,
SEQ ID NO.4:5’-TAAACTTGACGGCCATACGC-3’。
2.根据权利要求1所述的用于检测单增李斯特菌的引物组，其特征在于，所述引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.5:5’-GAAAAATCTGG-3’。
3.权利要求1或2所述的引物组的应用。
4.根据权利要求1或2所述的的引物组在制备检测单增李斯特菌试剂盒中的应用。
5.根据权利要求1或2所述的引物组在检测单增李斯特菌中的应用。
6.检测单增李斯特菌的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1或2所述的引物组，并通过环介导等温扩增-生物传感芯片-人工智能技术平台对待测样品进行检测的步骤。
7.根据权利要求6所述的检测单增李斯特菌的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的程序为：将待测样品注入微流控芯片的LAMP扩增腔体后，在60-70℃条件下，扩增20-40min。
8.根据权利要求6-7任一项所述的检测单增李斯特菌的方法，其特征在于，环介导等温扩增的扩增产物与生物传感芯片上的探针结合，生物化学信号转化成电信号，并由人工智能技术平台输出检测结果。
CN202210433329.1A 2022-04-24 2022-04-24 用于检测单增李斯特菌的引物组及其应用 Pending CN114686611A (zh)

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