CN116445618A - 用于检测braf基因t1799a点突变的引物组及方法 - Google Patents

用于检测braf基因t1799a点突变的引物组及方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测BRAF基因T1799A点突变的引物组及方法，本发明的用于检测BRAF基因T1799A点突变的引物组包括：野生型引物组和突变型引物组，其中，野生型引物组的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.7所示，突变型引物组的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.7所示，本发明针对BRAF基因T1799A点突变与野生型，分别设计了LAMP反应的野生型和突变型引物组，各引物组中包含有4条特异性引物，对靶基因上6个区域进行识别，保证了LAMP反应的高度扩增性和特异性，特异性可达100％，同时设计一条环引物，将LAMP扩增时间大幅度降低，控制在30分钟左右。

Description

用于检测BRAF基因T1799A点突变的引物组及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测BRAF基因T1799A点突变的引物组及方法。
背景技术
甲状腺结节是一种常见的内分泌器官疾病，在不同人群中的发病率高达19-68％，其中5％-15％的结节为恶性。甲状腺癌是最常见的头颈部恶性肿瘤，在过去10年中，已成为发病增长速度最快的恶性肿瘤之一。与甲状腺癌关系最为密切的基因突变就是BRAF基因突变(大约占36％-69％)。BRAF基因位于染色体7q34。目前，已被研究人员发现的BRAF突变类型高达30多种，其中BRAF基因T1799A点突变可能与甲状腺癌的发生发展关系密切。在乳头状甲状腺癌中，BRAF基因T1799A点突变的检出率可高达87％。BRAF基因T1799A点突变作为乳头状甲状腺癌最常见的可遗传变异已经成为世界各地研究者的共识，是甲状腺癌基因检测的理想标记物，术前通过甲状腺细针穿刺细胞学基因突变检测也成为临床上广泛应用鉴别甲状腺结节良恶性的技术手段。
目前，关于癌症相关基因BRAF基因T1799A点突变的核酸检测方法主要为PCR。这种方法不仅需要从样本中进行核酸提取而且PCR反应时间很长，PCR扩增后还需要进行琼脂糖凝胶电泳来对PCR产物进行检测。这种检测方法不仅耗时长，而且需要配备专业的检验技术人员与专业的检测实验室，因此只有大型医院才能进行此类检测，基层社区医院则无法开展。而且即使在大型医院也无法做到患者随到随检，快速出结果。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测BRAF基因T1799A点突变的引物组。
本发明的再一目的是提供上述引物组的应用。
本发明的再一目的是提供用于检测BRAF基因T1799A点突变的方法。
根据本发明具体实施方式的用于检测BRAF基因T1799A点突变的引物组，包括野生型引物组和突变型引物组，
针对BRAF基因T1799A点突变与野生型，分别设计了LAMP反应的野生型引物探针组和突变型引物探针组，LAMP反应中有4条特异性引物，包括正向和后外引物(F3和B3)，正向和后内引物(FIP和BIP)，对靶基因上6个区域进行识别，保证了LAMP反应的高度扩增性和特异性，LAMP反应中还设计有1条环引物，可以减少核酸扩增反应时间，
其中，野生型引物组的引物的核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.1：5’-TGCTCTGATAGGAAAATGAGA-3’；
SEQ ID NO.2：5’-TCAGTGGAAAAATAGCCTCA-3’；
SEQ ID NO.3：
5’-ACTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTGTTTTCCTTTACTTACTACACC-3’；
SEQ ID NO.4：
5’-TGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATTTTATTCTTACCATCCACAAAATGG-3’；
SEQ ID NO.7：5’-TCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATC-3’；
突变型引物组的引物的核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.1：5’-TGCTCTGATAGGAAAATGAGA-3’；
SEQ ID NO.2：5’-TCAGTGGAAAAATAGCCTCA-3’；
SEQ ID NO.5：
5’-TCTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTGTTTTCCTTTACTTACTACACC-3’；
SEQ ID NO.6：
5’-AGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATTTTATTCTTACCATCCACAAAATGG-3’；
SEQ ID NO.7：5’-TCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATC-3’。
优选的，野生型引物组和突变型引物组均包含探针，其核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.8：5’-AACTTGTCAACA-3’。
又一方面，本发明提供用于检测BRAF基因T1799A点突变的引物组的应用，具体的，在检测BRAF基因T1799A点突变的试剂盒中的应用，或者，在检测BRAF基因T1799A点突变的方法中的应用，在检测BRAF基因T1799A点突变的微流控芯片中的应用，尤其是利用环介导等温扩增-生物传感芯片-人工智能技术平台检测BRAF基因T1799A点突变。
又一方面，本发明还提供了一种用于检测BRAF基因T1799A点突变的方法，包括：利用LAMP检测技术结合权利要求1或2所述的引物组中的野生型引物组和突变型引物组分别对待测样本进行检测；获取探针分别与相应扩增产物特异性结合的电信号；分析所述电信号，输出检测结果。
根据本发明具体实施方式的用于检测BRAF基因T1799A点突变的方法，所述利用LAMP检测技术结合野生型引物组和突变型引物组分别对待测样本进行检测，包括：将待测样本与2×LAMP预混液、野生型引物组混合后在70℃条件下进行LAMP扩增，30min后扩增结束；以及将待测样本稀释液与2×LAMP预混液、突变型引物组混合后在70℃条件下进行LAMP扩增，30min后扩增结束。
进一步的，所述环介导等温扩增的程序在包含至少两个反应腔的微流控芯片中进行。
具体的，先将2×LAMP预混液和野生型引物组的混合液，以及2×LAMP预混液和突变型引物组的混合液分别注入微流控芯片的两个不同反应腔内，将待测样本用灭菌无酶水稀释后分别注入两个反应腔中形成LAMP反应体系，在70℃条件下进行LAMP扩增，30min后扩增结束。
本发明的用于检测BRAF基因T1799A点突变的方法可以利用环介导等温扩增-生物传感芯片-人工智能技术平台实现。通过甲状腺穿刺废弃样本经过裂解、扩增、与生物探针的特异性结合，基因扩增后的化学信号转化为电信号，通过建立AI算法模型对电信号进行处理，分析判决生物探针两端的阻抗特性频谱以及阳性样本阻抗特性频谱的共性特征，并通过机器学习模型对该共性特征值进行深度学习和提取，生成一组配置仪器的最佳参数,以对样本进行精准判决。同时，综合野生型引物组和突变型引物组的检测结果，降低假阳性的测试概率，最终快速准确判断样本基因型。
其中，生物传感芯片是利用生物传感器为生物学组件，作为主要功能性元件，能够感受规定的被测量物质并按照一定规律将其转换成可识别信号的器件或装置。根据生物传感器的输出信号可分为比色生物传感器、荧光生物传感器、电化学生物传感器以及其他种类的生物传感器。
LAMP电化学生物传感器按照电化学活性物质与靶DNA结合特点的不同可为结合探针和嵌合剂两种类型。优选的，本发明使用结合探针，生物探针的序列与等位基因序列互补，能与LAMP扩增产物互补结合后让生物传感芯片的阻抗发生特定变化，将LAMP等温扩增的化学信号转化为电信号。
本发明的有益效果是，本发明针对BRAF基因T1799A点突变与野生型，分别设计了LAMP反应的野生型和突变型引物组，各引物组中包含有4条特异性引物，对靶基因上6个区域进行识别，保证了LAMP反应的高度扩增性和特异性，特异性可达100％，同时设计一条环引物，将LAMP扩增时间大幅度降低，控制在30分钟左右。本发明还可以根据野生型和突变型反应体系的检测结果相互印证，快速准确判断样本基因型。有利于基因检测产品的小型化、集成化、低成本设计和快速检测，操作要求简易，便于临床医学应用。
本发明的其他特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点在说明书、权利要求书以及实施例中所特别指出的结构来实现和获得。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的实施例中涉及的2×LAMP预混液可以是购买得到的NEB(美国)2×LAMP预混液，也可以是自己配置的，其可以包含有MgSO4，MgSO4的浓度为6mM～12mM，缓冲液、dNTPs、KCl、(NH4)2SO4、Bst DNA polymerase、酚红、灭菌无酶水等。
本发明的实施例中涉及的引物序列可以从生工生物工程(上海)股份有限公司订购。
1、设计引物和探针
BRAF基因的1799A点突变是乳头状甲状腺癌最常见的可遗传变异，是甲状腺癌基因检测的理想标记物，其LAMP引物的设计方法如下：
在引物设计网站(http://primerexplorer.jp/e/)，输入BRAF基因的第15外显子序列(SEQ ID NO.9：taggtgattttggtctagctacagAgaaatctcgatggagtgggtcccatcagttt)并标出1799A点突变位点，运行后选择合适引物并对其扩增的片段进行特异性比对，并最终选定特异性最高的引物组如表1所示。
生物探针是一段将LAMP扩增阳性产物与IDE生物传感芯片上化学分子连接的小片段DNA序列。探针的设计原则包括：(1)DNA序列与目标基因互补，(2)对探针5'进行氨基改性，以便与传感器芯片上的化学分子连接。根据以上原则，本发明将生物探针设计在B1与F1引物序列之间并通过大量的LAMP-IDE实验筛选，最终确定反应效果最佳的一段序列作为生物探针，序列如表1所示。
表1
2、引物的制备
订制LAMP扩增反应实验所需的引物。将引物干粉12000r/min条件下离心1分钟，加入分子生物学级别的纯水。通常采用灭菌无酶水来制备引物混合液。按照下表所示，分别制备野生型引物混合液和突变型引物混合液，-20℃下储存备用。
表2
引物浓度(μM) 引物名称 体积(μL)
100 FIP 20
100 BIP 20
10 F3 25
10 B3 25
100 LB 10
灭菌无酶水 25
总体积(μL) 125
3、基于环介导等温扩增-生物传感芯片-人工智能技术平台的BRAF基因T1799A点突变的LAMP检测方法
本发明中无需对检测样本进行核酸提取及纯化，大大减小了操作难度及提取时间。将生物探针提前结合在生物传感芯片上。将样本注入微流控芯片中并将微流控芯片插入反应设备运行，经过裂解、LAMP扩增反应、与生物传感芯片上的生物探针结合后，获得检测结果。
第一步、如下表3所示，将引物混合液、2×LAMP预混液混合，分别配制野生型与突变型两个LAMP反应体系。
表3
成分 1个反应(μL)
2×LAMP预混液 6.25
野生型引物混合液/突变型引物混合液 1.25
第二步、将配制好的野生型LAMP反应体系与突变型LAMP反应体系分别注入到微流控芯片上的两个不同的反应腔中。
第三步、将1μL待检测的甲状腺穿刺废弃样本用灭菌无酶水稀释10倍，取两组5μL的10倍稀释样本分别注入微流控芯片的两个反应腔内，将微流控芯片插入仪器内，使微流控芯片的不同反应腔内的两个LAMP反应体系在70℃下恒温扩增30分钟，得到扩增产物。
第四步、将扩增产物推入到装载有生物传感芯片的生物传感器室内，与生物传感芯片上的生物探针在45℃下杂交20分钟。
第五步、直接将野生型反应体系和突变型反应体系的检测结果(阴性/阳性)显示在仪器的LED屏上，并根据两个反应体系的检测结果判断样本的基因型。
若野生型反应体系的检测结果为“阳性”且突变型反应体系的检测结果为“阴性”，则说明样本为野生型；若突变型反应体系的检测结果为“阳性”且野生型反应体系的检测结果为“阴性”，则说明样本为突变型杂合子；若突变型反应体系与野生型反应体系的检测结果均为“阳性”，则说明样本为突变型纯合子。
优选的，本实施例中的生物传感芯片可以采用IDE生物传感器芯片，IDE生物传感芯片上预先结合生物探针，在生物探针与扩增片段结合后，会影响IDE生物传感芯片的阻抗特性，IDE生物传感芯片的阻抗会发生剧烈变化。例如，IDE生物传感芯片与扩增产物进行融合，在融合后，如果扩增产物中包含与生物探针匹配的片段，生物探针会与该片段进行绑定，此时IDE生物传感芯片的阻抗发生剧烈变化；如果扩增产物中不包含与生物探针匹配的片段，探针不会与DNA或RNA链绑定，此时IDE生物传感芯片的阻抗不发生剧烈变化。
也就是说，如果输入的待测样品为阳性，其扩增后的片段和IDE生物传感芯片上的生物探针结合，IDE生物传感芯片的阻抗特性会发生强烈变化，在向IED生物传感芯片输入端输入电信号后，IDE生物传感芯片输出端信号的幅值和相位都会发生强烈变化；如果输入待测样品为阴性，则扩增后的片段无法与生物探针结合，IDE生物传感芯片的阻抗特性变化不大，那么IDE生物传感芯片的输出端信号的幅值和相位发生的变化没有强烈变化。
本实施例选择环介导等温扩增-生物传感芯片-人工智能技术平台，甲状腺穿刺废弃样本经过裂解、扩增、与生物探针的特异性结合，基因扩增后的化学信号转化为电信号，通过建立AI算法模型对电信号进行处理，分析判决生物探针两端的阻抗特性频谱以及阳性样本阻抗特性频谱的共性特征，并通过机器学习模型对该共性特征值进行深度学习和提取，生成一组配置仪器的最佳参数，以对样本进行精准判决。同时，无需常规LAMP反应中采用的水浴锅或金属浴等仪器，全程反应在微流控芯片中进行，降低了结果假阳性的可能；并且野生型反应体系和突变型反应体系的检测结果相互印证，降低假阳性的测试概率，最终快速准确判断样本基因型。
与其它检测方法相比，本实施例中的检测方法操作简便、不要求检测场地、检测速度快、检测精度不低于常规检测、成本低集成化高等优点，让BRAF基因T1799A点突变的分子检测技术走出实验室，走进基层，实现随到随检，结果立等可取。
此外，样本和试剂在LAMP扩增反应腔中的反应时间，加上进入生物传感器室中与生物探针结合、算法判决的时间，总体流程约1小时，即可获得判别结果。另外，将样品限制在设备的微流控环境中，降低了样品污染的风险，并将检测所需的样品体积和试剂降到最低，从而进一步降低了筛选和检测的总体成本。
4、检测BRAF基因T1799A点突变的特异性试验
获取已通过第三方检测(采用PCR技术)确定BRAF基因基因型的甲状腺穿刺废弃样本，并利用BRAF基因T1799A点突变的LAMP检测方法对确定BRAF基因基因型的甲状腺穿刺废弃样本进行检测，并将检测结果与采用PCR技术的第三方检测结果进行比对，可以通过环介导等温扩增-生物传感芯片-人工智能技术平台确定对BRAF基因的体外基因快筛的结果，计算灵敏度和特异性。
本实施例中共采用20个确定BRAF基因基因型的甲状腺穿刺废弃样本，其中确定基因型为野生型的样本10个，确定基因型为突变型的样本10个，分别对上述20个样本采用BRAF基因T1799A点突变的LAMP检测方法进行检测，并进行结果比对，其检测结果如下表4所示：
表4
由检测结果可知，采用基于环介导等温扩增-生物传感芯片-人工智能技术平台对BRAF基因T1799A点突变的检测结果与传统PCR检测技术结果一致性为100％，无假阳性或假阴性结果，灵敏度和特异性均为100％。
本发明通过对BRAF基因T1799A点突变的野生型和突变型的反应结果相互印证，可以在区分野生型与突变型的同时还能分辨出突变型是纯合子还是杂合子，可以实现对BRAF基因T1799A点突变进行分子生物学定性检测。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (9)

1.一种用于检测BRAF基因T1799A点突变的引物组，其特征在于，所述引物组包括野生型引物组和突变型引物组，其中，野生型引物组的引物的核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.1：5’-TGCTCTGATAGGAAAATGAGA-3’；
SEQ ID NO.2：5’-TCAGTGGAAAAATAGCCTCA-3’；
SEQ ID NO.3：
5’-ACTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTGTTTTCCTTTACTTACTACACC-3’；
SEQ ID NO.4：
5’-TGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATTTTATTCTTACCATCCACAAAATGG-3’；
SEQ ID NO.7：5’-TCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATC-3’；
突变型引物组的引物的核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.1：5’-TGCTCTGATAGGAAAATGAGA-3’；
SEQ ID NO.2：5’-TCAGTGGAAAAATAGCCTCA-3’；
SEQ ID NO.5：
5’-TCTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTGTTTTCCTTTACTTACTACACC-3’；
SEQ ID NO.6：
5’-AGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATTTTATTCTTACCATCCACAAAATGG-3’；
SEQ ID NO.7：5’-TCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATC-3’。
2.根据权利要求1所述的用于检测BRAF基因T1799A点突变的引物组，其特征在于，
所述野生型引物组和突变型引物组均包含探针，其核苷酸序列如下：
SEQ ID NO.8：5’-AACTTGTCAACA-3’。
3.根据权利要求1或2所述的引物组在制备检测BRAF基因T1799A点突变的试剂盒中的应用。
4.根据权利要求1或2所述的引物组在检测个体BRAF基因T1799A点突变的方法中的应用。
5.根据权利要求1所述的引物组在检测BRAF基因T1799A点突变的微流控芯片中的应用。
6.一种用于检测BRAF基因T1799A点突变的方法，其特征在于，包括：
利用LAMP检测技术结合权利要求1或2所述的引物组中的野生型引物组和突变型引物组分别对待测样本进行检测；
获取探针分别与相应扩增产物特异性结合的电信号；
分析所述电信号，输出检测结果。
7.根据权利要求6所述的用于检测BRAF基因T1799A点突变的方法，其特征在于，
所述利用LAMP检测技术结合野生型引物组和突变型引物组分别对待测样本进行检测，包括：
将待测样本与2×LAMP预混液、野生型引物组混合后在70℃条件下进行LAMP扩增，30min后扩增结束；以及
将待测样本稀释液与2×LAMP预混液、突变型引物组混合后在70℃条件下进行LAMP扩增，30min后扩增结束。
8.根据权利要求7所述的用于检测BRAF基因T1799A点突变的方法，其特征在于，
所述环介导等温扩增的程序在包含至少两个反应腔的微流控芯片中进行。
9.根据权利要求8所述的用于检测BRAF基因T1799A点突变的方法，其特征在于，
所述环介导等温扩增的扩增产物与生物传感芯片上的探针结合，生物化学信号转化成电信号，并由人工智能技术平台输出检测结果。
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