CN110042165B

CN110042165B - 猕猴abo血型基因分型方法

Info

Publication number: CN110042165B
Application number: CN201910216519.6A
Authority: CN
Inventors: 时长军; 杨玲焰; 王立鹏
Original assignee: Suzhou Xishan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Xishan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-03-21
Filing date: 2019-03-21
Publication date: 2022-08-12
Anticipated expiration: 2039-03-21
Also published as: CN110042165A

Abstract

本发明公开了一种猕猴ABO血型基因分型方法的引物组，包括引物1，引物2，引物3，引物4，引物5，引物6，引物7，引物8。所述引物1的核苷酸序列为序列1，所述引物2的核苷酸序列为序列2，所述引物3的核苷酸序列为序列3，所述引物4的核苷酸序列为序列4，所述引物5的核苷酸序列为序列5，所述引物6的核苷酸序列为序列6，所述引物7的核苷酸序列为序列7，所述引物8的核苷酸序列为序列8。本发明还公开了猕猴ABO血型的基因分型方法，本发明的ABO分型技术，是在分子基因水平上的一种快速，可靠，敏感、低成本的检测方法。

Description

猕猴ABO血型基因分型方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及猕猴ABO血型基因分型方法。

背景技术

由于猕猴(Macaca mulatta，Macaques)与人类拥有共同祖先，他们的基因相似率大于93％，且在神经学、生理学、代谢类疾病及对微生物的敏感性方面表现的都非常相似，所以猕猴作为非人灵长类实验动物模型，被广泛用于生物医药研究中。近几年，生物医药研究领域的投入不断加大，干细胞和移植研究也得到飞速发展，而对用于这方面研究的供体和受体动物的血型要准确的掌握，ABO血型是最重要的血型系统，所以当猕猴被用于研究时就需要明确知道它的ABO血型，才能防止在移植中出现严重的排斥反应，导致实验的失败及资源的浪费。

目前应用于人ABO血型鉴定的常规技术仍是基于抗原抗体反应的血凝实验和微柱凝胶实验，但用于人血型检测的商业试剂并不适用于猕猴的血型鉴定。随着测序技术的发展， ABO血型相关的糖基转移酶基因序列都已确定，使血型研究进入分子生物学时代。事实上血型差异主要是与基因突变有关，ABO血型基因上存在丰富的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)位点，通过分子生物学方法检测ABO血型基因的SNP 位点，可以确定A，B或AB表型。目前检测SNP的方法很多，主要有Taqman PCR、普通PCR结合Sanger测序的方法、下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术等。国际上已有多篇报道，用多重普通PCR方法或实时定量PCR进行实验猴的ABO血型分析。竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR，KASP)是在等位基因特异性PCR(AlleleSpecific PCR，AS-PCR)基础上，在PCR试剂中加入通用的荧光探针，通过引物3’末端碱基与SNP位点上的碱基特异互补，然后通过直接识别荧光信号来对SNP分型以及检测序列的插入和缺失，目前该技术在植物育种方面应用较多，本文首次将KASP方法应用于实验猴ABO血型检测，所选的2个SNP位点，是猕猴表达A和 B转移酶所必需的，第一个SNP位点是检测A或B表型基因区域内负责编码第266位氨基酸的突变；第二个SNP位点是检测第268位氨基酸的突变。目前尚无文献报道用KASP 方法进行实验猕猴ABO血型检测。本文建立的KASP方法相较于普通PCR方法，节省了大量的时间；相较于Taqman探针法，节约了合成探针的费用；本文同时还建立了普通PCR 结合Sanger测序法用于血型检测，适合没有实时定量PCR仪的实验室开展ABO血型分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定猕猴ABO血型方法的引物组及方法。

本发明的第一方面提供一种鉴定猕猴ABO血型的引物组，包括引物1，引物2，引物4，引物5，所述引物1的核苷酸序列为序列1，所述引物2的核苷酸序列为序列2，所述引物4的核苷酸序列为序列4，所述引物5的核苷酸序列为序列5。

本发明的一优选技术方案中，所述组合物还包括引物3和引物6，所述引物3的核苷酸序列为序列3，所述引物6的核苷酸序列为序列6。

本发明的一优选技术方案中，引物1∶引物2∶引物3的摩尔比为4∶4∶5；引物4∶引物5∶引物6的摩尔比为4∶4∶5。

本发明的一优选技术方案中，所述引物1和引物2的5’端为可识别通用荧光探针的片段；具体而言，引物1的识别片段为“GAAGGTGACCAAGTTCATGCT”；引物2的识别片段为“GAAGGTCGGAGTCAACGGATT”；所述引物4和引物5的5’端为可识别通用荧光探针的序列；具体而言，引物4的识别片段为“GAAGGTGACCAAGTTCATGCT”；引物5的识别片段为“GAAGGTCGGAGTCAACGGATT”。

本发明的一优选技术方案中，所述荧光基团选自FAM荧光基团和HEX荧光基团。

本发明第二方面提供鉴定猕猴ABO血型的PCR试剂，包括上述的引物1，引物2，引物4，引物5，所述引物1的核苷酸序列为序列1，所述引物2的核苷酸序列为序列2，所述引物4的核苷酸序列为序列4，所述引物5的核苷酸序列为序列5。

优选地，还包括引物3和引物6，所述引物3的核苷酸序列为序列3，所述引物6的核苷酸序列为序列6。

本发明第三方面提供鉴定猕猴ABO血型的方法，包括如下步骤：(1)提取待测猕猴的 DNA，(2)利用前述的引物进行PCR扩增，(3)分析扩增结果，判断待测猕猴的血型。

本发明的一优选技术方案中，还包括利用引物7，引物8进行PCR测序检测的步骤。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为实施例2的KASP法鉴定ABO血型分区结果图；

图2为A型、B型、AB型样本普通PCR后测序比对图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。以下结合附图描述本发明具体实施方式。

一.材料和方法

1.样本

15份已确定ABO血型的实验猕猴核酸样本由美国VRL实验室提供，干冰运输至本公司，-20℃存放；实验猴外周血样本(EDTAK2抗凝)，分别来自于广州、广西、四川、海南4个实验猴饲养场，共计51份样本，其中食蟹猴全血38份，恒河猴全血13份，样本冷藏快递运输至本公司，4度存放。

2试剂与仪器

血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，DP318)，KASP试剂(LGC，KBS-1016-001)，rTaq DNA聚合酶(5U/μL)(Takara,R001WZ)，dNTP Mix(2.5mM) (Takara,4030)，琼脂糖(天根生化，RT101)，GelRed(博美达，41003-0.5ml)，特异引物用Primer 3软件设计，由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。产物测序由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成。荧光定量PCR仪(Bio-Rad，CFX96)，普通PCR仪(杭州博日科技有限公司，TC-96/G/H(b)A)，紫外分光光度计(GE,Nanovue plu)，紫外凝胶成像系统(上海勤翔，Genosens1560)。

二.实施例

实施例1ABO血型鉴定引物的设计

SNP位点的选取及引物设计

15号染色体的7号外显子的氨基酸序列中，由于碱基的突变，A抗原第266位氨基酸为亮氨酸和第268位为甘氨酸，而B抗原第266位为甲硫氨酸和第268位为丙氨酸。用Primer3软件设计2组引物组，特异性识别这2个位点上的碱基。另在这2个SNP位点的外围设计1对引物，用于用于Sanger测序验证。引物序列见表1。

表1 ABO血型鉴定引物

实施例2

1.DNA提取

每个动物取500μl抗凝全血，参照血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取核酸，用紫外分光光度计测定核酸浓度，稀释样本使其核酸浓度调整为10ng/μL左右。

2.KASP法

A组和B组引物组分别在2个体系中扩增。反应体系：2×PCR试剂预混液5μL；具体为反应体系1为：引物1/引物2/引物3，浓度为12/12/15μM，0.14μL；反应体系2为：引物4/引物5/引物6浓度为12/12/15μM；0.14μL；

每个反应体系均设立A型，B型，AB型阳性对照，以及不加核酸的空白对照。

反应条件：94℃预变性15min，94℃20s，退火温度61℃开始每个循环降0.6℃，1min，10个循环；94℃20s，退火温度55℃1min，26个循环；94℃20s，退火温度 57℃1min，12个循环；30℃30s，读取FAM和HEX荧光信号。

3.普通PCR及测序

反应体系：10×PCR buffer(Mg2+)2.5μL，dNTP Mix(2.5mM)2.0μL，C组引物等量混合液引物7/引物8(10μM)1μL，水14.3μL，DNA模板5μL，rTaq DNA聚合酶(5U/μL)0.2 μL。每个体系均设立阳性对照，以及不加核酸的空白对照。

反应条件：95℃预变性10min，95℃45s，退火温度58℃30s，72℃30s，45 个循环，72℃延伸5min。

电泳确认：取5μL PCR产物在2％琼脂糖凝胶电泳后，成像系统拍照后分析结果。

测序及序列分析：将PCR产物测序后用DNASTAR 7.1软件分析序列中对应SNP位点的碱基序列。

三.结果

已知样本的方法确认

2.1.1KASP法结果

用KASP分型方法共检测15份已知血型样本，通过qPCR仪对产物中荧光信号的识别，可以很好地区分ABO血型。图1是A引物组的KASP分型结果，蓝色正方形聚集点为HEX荧光信号，识别的是A型第266位氨基酸对应的SNP突变位点的T碱基；橙色圆形聚集点为FAM荧光信号，识别的是SNP突变位点的A碱基；绿色三角形聚集点为同时有FAM和HEX荧光信号，同时识别到A和T碱基，这些样本在该位点是杂合型的；黑色正方形点是空白对照，无荧光信号未识别到T或A碱基。15份已知样本中KASP分型得到 A型、B型和AB型各5份，与美国VRL公司用Taqman PCR方法分型结果完全一致。

2.1.2普通PCR结合Sanger测序方法验证结果

对这15个已知样本进行PCR扩增，产物测序后片段分析，最终得到A型、B型、AB 型各5份，与KASP分型结果及美国VRL公司用Taqman PCR方法的分型结果完全一致。在2个SNP位点上的碱基与KASP分型结果一致。其中A型、B型、AB型3份样本的测序结果见图2，红框中为对应的2个位点的测序结果。

2.2临床样本检测

2.2.1KASP法结果

共检测实验猕猴全血样本51份，包括食蟹猴样本38份，恒河猴样本13份，通过对2个不同SNP位点进行分析，血型结果一致，其中A型血9份(17.6％)，B型血19份(37.3％)， AB型血23份(45.1％)，4个实验猴养殖场均存在A型、B型、AB型动物，但未检出O 型血动物。

表2不同猴场样本ABO血型鉴定结果

Table 2ABO genotyping results of the monkeys from different breedingfarm

2.2.2普通PCR结合Sanger测序法结果

选择KASP方法鉴定出的A型、B型、AB型临床样本各5份，用普通PCR扩增并测序后分析，所得的2个SNP位点上的碱基与KASP分型结果完全一致。

灵长类动物的ABO血型存在跨物种多态性。ABO血型系统为三复等位基因，有IA、IB和i三个基因，IA负责编码N-乙酰氨基半乳糖胺转移酶，IB编码D-型半乳糖糖基转移酶，对抗原前体H进行不同的修饰后，进而得到了A抗原或B抗原，而i基因则不能编码任何糖基转移酶，故抗原前体H保持不变。ABO血型的决定基因位于15号染色体上的 9q34.1-9q34.2，包含7个外显子和6个内含子，而第6和7外显子上占了其多数的编码序列，这些序列负责编码ABO糖基转移酶的催化结构域，其中外显子7共编码344个氨基酸，占总ABO蛋白的催化域65％，血型差异主要是与基因突变有关，A抗原第266位氨基酸为亮氨酸和第268位为甘氨酸，而B抗原第266位为甲硫氨酸和第268位为丙氨酸。因此可通过第266和268位密码子碱基的改变来区分A和B糖基转移酶。

基于抗原抗体反应的人ABO血型检测常规方法一般都不适用于猕猴，主要原因有以下三点：一是猕猴红细胞表面的类人ABO抗原分子与人类的抗原分子结构不一定完全相同；二是猕猴的ABO抗原分子抗原性极其微弱，在猕猴的红细胞表面ABH抗原未找到；三是人源性的ABO抗血清用于猕猴检测，存在种属抗体的干扰。之前有研究者用反定型和唾液抑制实验检测猕猴血型，也有用流式方法检测猴体内血型抗体水平，但是对样本要求比较高，需要获取动物的新鲜血液或足够量的唾液样本，而且由于方法的局限性，得到结果的可靠性不高。市面上可获得的用于人血型检测的商业免疫试剂，用于实验猴血型检测一般均得不到可靠结果，且血清学结果有时也比较难判定。也有学者研究制备出猕猴专用ABO 抗血清和改良吸收放散技术，但该方法耗时长，也会有不确定的结果出现。

随着分子生物学方法在人类ABO血型中的应用，研究人员通过对实验猴基因序列进行分析，通过识别SNP位点碱基差异，对猕猴进行ABO血型分型。AS-PCR方法有快速、经济、准确等优点，在医学领域中被广泛应用，如疾病SNP监测，血型分析等。Muro等用AS-PCR结合定量PCR方法成功进行人ABO血型的检测。本文所用的KASP方法是基于AS-PCR原理，在PCR试剂中增加了通用的荧光探针，可通过直接识别荧光信号实现 SNP快速分型。

本研究建立了KASP血型鉴定方法并与美国VRL实验室用的Taqman PCR方法进行了比较，15份已知样本的分型结果完全一致。同时新建立的的KASP方法也与新建的普通 PCR方法进行了比较，结果完全一致。本文用建立的KASP方法检测了国内4家猴场的血液样本51份，检测到A型血占18％；B型血占37％；AB型血占45％；Premasuthan A[4] 等用多重PCR筛查78头恒河猴，其中B型血的动物占了51％，其次为AB型占28％，A 型21％，未见O型血，与本实验恒河猴中血型分布相似，B型血占比为46％；Premasuthan A于2012年又发表一篇文章，通过实时定量PCR方法，增加了89头食蟹猴的筛选，其A、 B、AB型分布为20％，48％，32％，同样未见O型血，而本实验食蟹猴中AB型血占比最高为50％，其次为B型34％，A型16％。Kanthaswamy S等扩大了样本量用荧光定量PCR 方法筛查了1256只恒河猴，1113只食蟹猴，恒河猴中B型血占比达90％，A型占2％， AB型占8％；食蟹猴中A、B、AB型血分别为39％、33％、28％；同样未检出O型血。不同血型占比与样本量和动物的来源都密切相关，本实验的数据还需进一步扩大样本量进行统计后给出血型分布的结论。从我们的检测数据来看，未发现O型血的存在。人类的15 号染色体的第6外显子上存在O型血表型相关的突变位点，有文献报道在猕猴中找到同样的位点与O型血表型相关，但是有多篇文献报道，对猕猴的第6和第7外显子基因序列测序分析，均未发现有突变与O型血表型有关。当然也有文献报道通过血清学方法检出有猕猴是O型血，但是考虑到血清学方法的弊端，对此结果仍然存在争议；也有学者提出假设在编码区外有可以识别O型等位基因的存在；近期Choi YJ等报道O型血的存在，作者通过针对第7外显子区域设计引物，用PCR方法筛查了66只恒河猴，有8％的动物为O型血，我们正在对这些与O型血表型相关的位点进行验证中。猕猴是否存在O型血表型目前还是比较争议的，我们下一步计划就是找到这个或多个位点。

本文所建立的ABO基因分型技术，是首次将KASP方法应用于实验猕猴ABO血型检测，是在分子基因水平上的一种快速，可靠，敏感、低成本的检测方法。本文新建的普通 PCR方法结合Sanger测序同样可对实验猕猴进行ABO血型分型，对于没有定量PCR仪的实验室同样适用。该方法对样本的类型及新鲜程度都要求不高，血液样品也可用滤纸片承载运输，可用于恒河猴、食蟹猴的ABO血型分型，为器官移植、肿瘤免疫治疗或干细胞研究等实验提供有效的保证。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

序列表

<110> 苏州西山生物技术有限公司

<120> 猕猴ABO血型基因分型方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tgacgagggt gatttctact act 43

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tgacgagggt gatttctact aca 43

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acctcctgca ccgacc 16

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc tgaccccccg aagaacc 37

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat tgaccccccg aagaacg 37

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caaggacgag ggtgatttct 20

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcggtgctt ggggtg 16

<210> 8

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcctggtggt tcttgg 16

Claims

1.一种猕猴ABO血型基因分型的引物组，其特征在于，引物组为引物1，引物2，引物3，引物4，引物5，引物6，所述引物1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述引物2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述引物3的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述引物4的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，所述引物5的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，所述引物6的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，引物1∶引物2∶引物3的摩尔比为4∶4∶5；引物4∶引物5∶引物6的摩尔比为4∶4∶5。

2.根据权利要求1所述的猕猴ABO血型基因分型的引物组，其特征在于，所述引物1和引物2的5’端为可识别通用荧光探针的片段；所述引物4和引物5的5’端为可识别通用荧光探针的片段。

3.根据权利要求2所述的猕猴ABO血型基因分型的引物组，其特征在于，所述荧光基团选自FAM荧光基团和HEX荧光基团。

4.一种鉴定猕猴ABO血型的PCR试剂盒，其特征在于，包括引物1，引物2，引物3，引物4，引物5，引物6，所述引物1的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述引物2的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述引物3的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，所述引物4的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，所述引物5的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示，所述引物6的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示。

5.猕猴ABO血型基因分型方法，包括如下步骤：(1)提取待测猕猴的DNA，(2)利用权利要求1所述的引物组进行PCR扩增，(3)分析扩增结果，判断待测猕猴的血型。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括利用引物7，引物8进行PCR测序检测的步骤，所述引物7的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示，所述引物8的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:8所示。