CN109554478B - 检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，本发明要求保护一种检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物，包括建立含MYD88 p.L265P基因突变的突变子的引物和HRM反应引物。本发明检测组合物采用HRM方法检测能够达到1％的敏感性，并将TAT缩短至0.5天。

Description

检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物

技术领域

本发明生物医药技术领域，具体涉及检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物。

背景技术

慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是一类在生物学行为和临床进程上存在很大异质性的恶性B淋巴细胞性白血病。多种分子指标，如免疫球蛋白重链可变区域突变状态、细胞遗传学异常、ZAP-70和CD38 的表达与其预后直接相关。MYD88在固有免疫中起到关键作用并影响B细胞的新陈代谢。MYD88基因的突变，以位于TIR域的L265P突变最为常见。含有这种MYD88突变的慢性淋巴细胞白血病患者有比较明显的NF-KB信号通路基因的表达，他们的临床表现也出现得更早。另外，MYD88基因的突变往往与药物的抵抗和慢淋患者的预后有一定的相关性。因此，检测CLL患者MYD88p.L265P 基因突变对指导临床判断预后和指导用药尤为重要。

随着技术的发展，基因突变检测的方法也日新月异，但是都存在一定的缺陷和不足。

对检测片段进行直接扩增、直接测序是一直以来都是基因突变检测的金标准，它能准确判断每个核酸的类型，能够发现未知突变类型，但是往往耗时耗力、价格昂贵，而且敏感性也比较低。对一些较大的，外显子较多的基因不宜用测序法直接检测突变，同时也不适用于临床对大量的标本进行检测。

HRM是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作。在突变扫描、单核苷酸多态性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面 HRM分析技术发挥着重要作用。

HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。同许多荧光PCR技术一样，HRM是利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链 DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。同时，借助于专业性的分析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。HRM的优势在于操作简单，分析时间短，灵敏度和特异性高，PCR产物无需后处理(如酶切、电泳等)，可实现真正的闭管操作从而降低污染风险。另外HRM具有高通量的特点，非常适合大量样品的分析。因此HRM检测方法备受关注，并已发展成为SNP基因分型、点突变筛查等的重要手段。

基于这种检测原理，HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR基础上增加一个饱和染料。所以，相比传统的SNP或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。

现有的对慢性淋巴细胞白血病患者MYD88p.L265P基因突变的检测以PCR 联合直接测序法为主，检测的灵敏度不高，单个样本耗时长，且不利于大通量检测。

发明内容

本发明所要解决问题是在克服现有技术的缺陷，提供一种慢性淋巴细胞白血病MYD88p.L265P基因突变检测组合物，具有高灵敏度、高通量、高特异性的特点，使用该组合物检测时间短，重复性好，且具有广泛适用性。

本发明提供一种检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物，所述组合物包括：

(1)建立含MYD88p.L265P基因突变的突变子的引物：

L265P FP：如Seq No.3所示：5’-CCATCAGAAGCGACCGATCCCCATCAAGTA-3’，

L265P RP:如Seq No.4所示：5’-TACTTGATGGGGATCGGTCGCTTCTGATGG-3’；

(2)HRM反应引物：

如Seq No.7所示：FP:5’-GACTGGGCTTGTCCCACC-3’,

如Seq No.8所示：RP:5’-CGCAGACAGTGATGAACCTC-3’。

本发明优选的技术方案中，HRM反应体系为：每20μl体系包含2×Fast

qPCR Master Mix 5μl，40nM正向引物和40nM反向引物各1μl，75ng 基因组DNA和超纯水。

本发明优选的技术方案中，HRM反应的扩增和熔解条件为：第一阶段： 95℃，2分钟；第二阶段：95℃，5秒，60℃，35秒，72℃，25秒，50个循环； HRM条件为：95℃，1分钟，40℃，1分钟，65℃，1秒，从65℃起以0.02℃/秒速率升温至95℃，每℃采集25个单信号，降温：40℃，30秒。

本发明优选的技术方案中，HRM检测所用的饱和荧光染料是

qPCRMaster Mix。

本发明优选的技术方案中，建立含MYD88p.L265P基因突变的突变子的聚合酶链式反应PCR扩增条件是：第一阶段：94℃30秒；第二阶段：94℃30秒， 55℃60秒，72℃45秒；循环40次；第三阶段：72℃10分钟延伸；扩增酶为 Platinum DNA聚合酶。PCR产物加入MutazymeTM，37℃放置1小时，随后 competent cell DH5α转移了处理过的PCR产物。最终得到的质粒命名为 pCMV-MYD88-L265P-Mu，经测序确认后，-20℃保存。

本发明优选的技术方案中，检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物还包括建立含MYD88exon5的野生型TA克隆的引物：

MYD88Exon5-F:如Seq No.1所示：5’-GTGAATGTGTGCCAGGGGTA-3’,

MYD88Exon5-R:如Seq No.2所示：5’-GGTTGGTGTAGTCGCAGACA-3’；

和针对MYD88p.L265P基因exon5区域的直接测序法检测引物：

L265P exon5-F:如Seq No.5所示：5’-GACTGGGCTTGTCCCACC-3’,

L265P exon5-R:如Seq No.6所示：5’-CGCAGACAGTGATGAACCTC-3’。

本发明优选的技术方案中，建立含MYD88基因exon5的野生型TA克隆的聚合酶链式反应PCR扩增条件是：第一阶段：94℃30秒；第二阶段：95℃30秒， 55℃60秒，72℃45秒；循环40次；第三阶段：72℃10分钟延伸；扩增酶为 Platinum DNA聚合酶。2％琼脂糖电泳明确产物，并经ABI 3730DNA分析仪正反向测序。

本发明第二方面，所述组合物用于检测慢性淋巴细胞白血病患者MYD88 p.L265P基因突变。

本发明检测组合物具有高灵敏度、高通量、高特异性，用时短，重复性良好，适用范围广，操作简单灵活、准确、成本低，能够对MYD88p.L265P基因突变进行快速检测，为CLL疾病判断、复发、治疗方案的确定以及预后的判断提供重要的参考依据。

直接测序法和HRM法敏感性差异比较见图3，直接测序法对MYD88p.L265P 突变的检出敏感性为10％。HRM法对MYD88p.L265P突变的检出敏感性为1％。两种方法的敏感性分析结果显示，直接测序对NOTCH1突变的检出敏感性为 10％，TAT为3天，而本发明检测组合物采用HRM方法检测能够达到1％的敏感性，并将TAT缩短至0.5天。

附图说明

图1A为MYD88野生型质粒的直接测序结果，显示在794位置上无突变；图1B为pCMV-MYD88-L265P-Mu突变型质粒直接测序结果，显示在794位置上发生T>C突变。

图2为含有MYD88p.L265P突变及野生型MYD88截然不同的熔解曲线和直接测序结果：

图2A根据熔解曲线的不同，可以清楚地分辨794位置的突变型(红色)和野生型(蓝色)。

图2B为HRM曲线可以清楚地分辨794位置的突变型(红色)和野生型(蓝色)。

图2C为直接测序法证实了这些标本存在794T>C突变。

图3A和图3B为HRM法检测突变敏感性测试，用HRM法检测发现，当突变率低至1％时，仍可以出现很明显的溶解曲线，即HRM法对MYD88p.L265P突变的检出感性为1％。

图4为直接测序法检测突变敏感性敏测试，显示直接测序法对MYD88 p.L265P突变的检出敏感性为10％。

具体实施方式

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

以下将以举例形式进行说明，如有未详尽之处，可以参见常用的实验手册，如《分子克隆实验手册》以及所用试剂和仪器的厂商说明书。其中，所有化学试剂均采用分析级，实验用水经Milli-XQ过滤，各试剂均和材料可以商用渠道获得。

HRM检测的扩增仪器为罗氏Light Cycler 480荧光定量PCR仪。Fast

qPCR Master mix(Biotium,Califonia,America)试剂盒。The Original TA Cloning Kit(Invitrogen,China)。

所有引物由Invitrogen(China)公司合成。

实施例1CLL骨髓B细胞基因组DNA突变检测

样品来源：采取临床明确诊断129例CLL患者抗凝骨髓液1mL，常规经淋巴细胞分离液密度梯度离心分离出单个核细胞，并用CD19+磁珠分选CD19+细胞，并经流式细胞仪检测，留取CD5+CD19+细胞≥95％的细胞。提取样本细胞，利用核酸提取试剂盒提取基因组DNA构建MYD88基因5号外显子野生型的质粒、定点突变794T>C合成pCMV-MYD88-L265P-Mu突变子质粒，分别作为突变检测的阴性和阳性对照。

步骤一.构建包含MYD88基因野生型的质粒

使用TA克隆试剂盒，构建MYD88基因5号外显子野生型的质粒。前向引物 5’-GTGAATGTGTGCCAGGGGTA-3’，反向引物5’-GGTTGGTGTAGTCGCAGACA-3’。整个PCR反应在50μl体系中进行，包含10×platinum缓冲液5μl，10mM dNTP mix 1.25μl，20pmol/μl TA正向引物1.25μl，20pmol/μl TA反向引物1.25μl，Platinum DNA聚合酶0.25μl，50mM MgSO₄ 3μl，2.5μl基因组DNA和33.5μl超纯水。操作步骤如下。PCR的条件如下：94℃,30s；(95℃，30s，55℃，60s，72℃，45s)×40个循环， 10℃终止。随后，使用试剂盒(gel DNA recovery kit)按照程序进行纯化。然后根据操作步骤将克隆装载入载体pCR2.1(Invitrogen,China)。将产物转移至E.coli(Invitrogen,China)。将最后得到质粒命名为pCMV-MYD88-TA，其中包含MYD88的野生型exon5。质粒通过测序验证结果，-20℃保存。见图1测序结果。

步骤二.定点突变，构建含有794T>C突变的质粒

采用试剂盒Muta-direct TM Site Directed Mutation Kit(SDM-125,SBSGenetech China)，操作步骤如下。引物设计按照操作规程要求。前向引物’-CCATCAGAAGCGACCGATCCCCATCAAGTA-3’，反向引物5’-TACTTGATGGGGATCGGTCGCTTCTGATGG-3’。PCR混合液根据操作规程配置，具体如下，50μl体系，包含10×platinum缓冲液5μl，10mMdNTP mix 1.25μl，20pmol/μl 定点突变正向引物1.25μl，20pmol/μl定点突变反向引物1.25μl，Platinum DNA 聚合酶0.25μl，50mM MgSO₄ 3μl，2.5μl基因组DNA和33.5μl超纯水。PCR循环如下：94℃，30s；(94℃,30s，55℃，60s，72℃，45s)×40；10℃停止。PCR 产物加入MutazymeTM，37℃放置1小时，随后competent cell DH5α转移了处理过的PCR产物。最终得到的质粒命名为pCMV-MYD88-L265P-Mu，经测序确认后，-20℃保存。见图1测序结果。

步骤三.HRM检测

HRM反应体系为2×Fast

qPCR Master mix(Biotium,Califonia,America)5μL,40nM前向引物，40nM反向引物1μL,75ngDNA及PCR water, 一共20μL。

HRM引物为：前向引物5’-GACTGGGCTTGTCCCACC-3’，反向引物 5’-CGCAGACAGTGATGAACCTC-3’。

HRM中的扩增和溶解条件为：第一阶段：95℃，2分钟；第二阶段：95℃， 5秒，60℃，35秒，72℃，25秒，50个循环；HRM条件为：95℃，1分钟，40℃， 1分钟，65℃，1秒，从65℃起以0.02℃/秒速率升温至95℃，每度采集25个单信号，降温：40℃，30秒。

步骤四.HRM法和直接测序法敏感性分析：

使用已经制备的pCMV-MYD88-L265P-Mu质粒作为评估HRM法及直接测序法的敏感度和准确性的阳性对照品，制备的TA克隆质粒作为阴性对照。质粒浓度均调整为5ng/μL。将两者以不同比例稀释，使最终样品中野生型质粒含量分别为100％,50％,20％,10％,5％,1％and 0％。使用这一系列稀释液分别采用HRM 法和直接测序法进行检测，比较其敏感度。

分别进行HRM法和直接测序法分析。

用针对MYD88p.L265P基因exon5区域的直接测序法检测引物：L265P exon5-F:如Seq No.5所示：5’-GACTGGGCTTGTCCCACC-3’,L265P exon5-R:如Seq No.6所示： 5’-CGCAGACAGTGATGAACCTC-3’。

直接测序法的聚合酶链式反应(PCR)扩增条件是：第一阶段：94℃，5分钟；第二阶段：94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，45秒；循环40次；第三阶段： 72℃，10分钟延伸；扩增酶为Platinum DNA聚合酶。PCR产物加入MutazymeTM， 37℃放置1小时，随后competent cellDH5α转移了处理过的PCR产物。最终得到的质粒命名为pCMV-MYD88-L265P-Mu，经测序确认后，-20℃保存。

本发明优选的技术方案中，直接测序法的聚合酶链式反应(PCR)扩增体系是：每20μl体系包含10×platinum缓冲液2μl，10mM dNTP mix 0.5μl， 20pmol/μl MYD88p.L265P正向引物0.5μl，20pmol/μl MYD88p.L265P反向引物 0.5μl，Platinum DNA聚合酶0.1μl，50mMMgSO4 0.6μl，100ng基因组DNA和超纯水。

步骤五.检测结果

采用本发明检测组合物和HRM法检测发现，129例CLL样本中共有6个有显突变，占4.7％。直接测序法检测发现阳性标本与HRM法检测结果完全一致。 HRM结果见图2A，图2B。直接测序验证结果见图2C。

直接测序法和HRM法敏感性差异，直接测序法对MYD88p.L265P突变的检出敏感性为10％，见图4。HRM法对MYD88p.L265P突变的检出敏感性为1％，见图3A，图3B。

两种方法的敏感性分析结果显示，直接测序对NOTCH1突变的检出敏感性为10％，TAT为3天，而本发明检测组合物采用HRM方法检测能够达到1％的敏感性，并将TAT缩短至0.5天。

本发明检测组合物具有高灵敏度、高通量、高特异性，用时短，重复性良好，适用范围广，操作简单灵活、准确、成本低，能够对MYD88p.L265P基因突变进行快速检测，为 CLL疾病判断、复发、治疗方案的确定以及预后的判断提供重要的参考依据。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

<110> 苏州市立医院

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<212> DNA

<213> 人工合成

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Claims (1)

1.检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物，其特征在于，所述组合物包括：

(1)建立含MYD88p.L265P基因突变的突变子的引物：

L265P FP：如Seq No.3所示：

5’-CCATCAGAAGCGACCGATCCCCATCAAGTA-3’，

L265P RP:如Seq No.4所示：

5’-TACTTGATGGGGATCGGTCGCTTCTGATGG-3’和

(2)HRM反应引物：

如Seq No.7所示：FP:5’-GACTGGGCTTGTCCCACC-3’,

如Seq No.8所示：RP:5’-CGCAGACAGTGATGAACCTC-3’。

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