CN106755425A - 一种慢性淋巴细胞白血病患者notch1基因突变检测组合物 - Google Patents

一种慢性淋巴细胞白血病患者notch1基因突变检测组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN106755425A
CN106755425A CN201611221612.9A CN201611221612A CN106755425A CN 106755425 A CN106755425 A CN 106755425A CN 201611221612 A CN201611221612 A CN 201611221612A CN 106755425 A CN106755425 A CN 106755425A
Authority
CN
China
Prior art keywords
notch1
detection
hrm
chronic lymphocytic
compositions
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201611221612.9A
Other languages
English (en)
Inventor
国风
徐晶晶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201611221612.9A priority Critical patent/CN106755425A/zh
Publication of CN106755425A publication Critical patent/CN106755425A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)患者NOTCH1基因突变检测组合物，包括针对NOTCH1基因34号外显子PEST区域的直接测序法检测引物和高分辨率熔解曲线(high‑resolution melting，HRM)反应引物。本发明检测组合物具有高灵敏度、高通量、高特异性，重复性良好，适用范围广，操作简单灵活、准确、成本低，能够对NOTCH1基因突变进行快速检测，为CLL疾病判断、复发、治疗方案的确定以及预后的判断提供重要的参考依据。

Description

一种慢性淋巴细胞白血病患者NOTCH1基因突变检测组合物
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种慢性淋巴细胞白血病患者NOTCH1基因突变检测组合物。
背景技术
慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)是一类在生物学行为和临床进程上存在很大异质性的恶性B淋巴细胞性白血病。多种分子指标，如免疫球蛋白重链可变区域突变状态、细胞遗传学异常、ZAP-70和CD38的表达与其预后直接相关，研究表明，NOTCH1基因突变，主要是PEST区域的突变提示患者预后不良和化疗耐药。因此，检测CLL患者NOTCH1突变对指导临床判断预后和指导用药尤为重要。
随着技术的发展，基因突变检测的方法也日新月异，但是都存在一定的缺陷和不足。
对检测片段进行直接扩增、直接测序是一直以来都是基因突变检测的金标准，它能准确判断每个核酸的类型，能够发现未知突变类型，但是往往耗时耗力、价格昂贵，而且敏感性也比较低。对一些较大的，外显子较多的基因不宜用测序法直接检测突变，同时也不适用于临床对大量的标本进行检测。
HRM是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现了真正的闭管操作。在突变扫描、单核苷酸多态性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面HRM分析技术发挥着重要作用。
HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。同许多荧光PCR技术一样，HRM是利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。同时，借助于专业性的分析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。HRM的优势在于操作简单，分析时间短，灵敏度和特异性高，PCR产物无需后处理(如酶切、电泳等)，可实现真正的闭管操作从而降低污染风险。另外HRM具有高通量的特点，非常适合大量样品的分析。因此HRM检测方法备受关注，并已发展成为SNP基因分型、点突变筛查等的重要手段。
基于这种检测原理，HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR基础上增加一个饱和染料。所以，相比传统的SNP或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。
现有的对慢性淋巴细胞白血病患者NOTCH1基因突变的检测主要还是以PCR联合直接测序法为主，检测的灵敏度不高，单个样本耗时长，且不利于大通量检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种慢性淋巴细胞白血病患者NOTCH1基因突变检测组合物，高灵敏度、高通量、高特异性，用时短，重复性良好，适用范围广，成本低。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：一种慢性淋巴细胞白血病患者NOTCH1基因突变检测组合物，包括以下内容：
(1)针对NOTCH1基因34号外显子PEST区域的直接测序法检测引物
NOTCH1 Ex34_F：5′-CTGGCGGTGCACACTATTCTG-3′，
NOTCH1 Ex34_R：5′-GCGCGCCGTTTACTTGAAG-3′；
(2)HRM反应引物-1
NOTCH1 Ex34a_F：5′-ACAGCTACTCCTCGCCTGTG-3′，
NOTCH1 Ex34a_R：5′-GTCGGAGACGTTGGAATGCG-3′；
(3)HRM反应引物-2
NOTCH1 Ex34b_F：5′-GTGCACACTATTCTGCCCCAG-3′，
NOTCH1 Ex34b_R：5′-GAGTAGCTGTGCTGCGAGG-3′。
其中，所述直接测序法的聚合酶链式反应(PCR)扩增体系是：每20μl体系包含10×platinum缓冲液2μl，10mM dNTP mix 0.5μl，20pmol/μl NOTCH1 Ex34_F 0.5μl，20pmol/μlNOTCH1 Ex34_R 0.5μl，Platinum DNA聚合酶0.1μl，50mM MgSO40.6μl，100ng基因组DNA和超纯水。
其中，所述直接测序法的PCR扩增条件是：第一阶段：94℃，5分钟；第二阶段：94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，45秒；循环40次；第三阶段：72℃，10分钟延伸；扩增酶为PlatinumDNA聚合酶。
其中，所述HRM反应体系1为：每20μl体系包含2×Fast qPCR MasterMix 10μl，5pmol/μl NOTCH1 Ex34a_F 0.8μl，5pmol/μl NOTCH1 Ex34a_R 0.8μl，100ng基因组DNA和超纯水；
HRM反应体系2为：每20μl体系包含2×FastqPCR Master Mix 10μl，5pmol/μl NOTCH1 Ex34b_F 0.8μl，5pmol/μl NOTCH1 Ex34b_R 0.8μl，100ng基因组DNA和超纯水。
其中，所述HRM反应的扩增和溶解条件为：第一阶段：95℃，2分钟；第二阶段：95℃，5秒，60℃，35秒，72℃，25秒，50个循环；HRM条件为：95℃，1分钟，40℃，1分钟，65℃，1秒，从65℃起以0.02℃/秒速率升温至95℃，每度采集25个单信号，降温：40℃，30秒。
其中，所述引物对(1)的产物长度在325～328bp。
其中，所述引物对(2)的产物长度在129～132bp。
其中，所述引物对(3)的产物长度在116bp。
所述HRM检测所用的饱和荧光染料是qPCR Master Mix。
本发明检测组合物的检测条件和检测路径如下。
PCR联合直接测序法的反应体系是：每20μl体系包含10×platinum缓冲液2μl，10mM dNTP mix 0.5μl，20pmol/μl NOTCH1 Ex34_F 0.5μl，20pmol/μl NOTCH1 Ex34_R 0.5μl，Platinum DNA聚合酶0.1μl，50mM硫酸镁O.6μl，100ng基因组DNA和超纯水。PCR扩增条件是：第一阶段：94℃，5分钟；第二阶段：94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，45秒；循环40次；第三阶段：72℃，10分钟延伸；扩增酶为Platinum DNA聚合酶。2％琼脂糖电泳明确产物，并经ABI3730 DNA分析仪正反向测序。
HRM检测的扩增仪器为罗氏Light Cycler 480荧光定量PCR仪。
HRM反应体系1为：每20μl体系包含2×FastqPCRMaster Mix 10μl，5pmol/μl NOTCH1 Ex34a_F 0.8μl，5pmol/μl NOTCH1 Ex34a_R 0.8μl，100ng基因组DNA和超纯水；HRM反应体系2为：每20μl体系包含2×FastqPCR Master Mix 10μl，5pmol/μl NOTCH1 Ex34b_F 0.8μl，5pmol/μl NOTCH1 Ex34b_R 0.8μl，100ng基因组DNA和超纯水。HRM扩增和溶解条件为：第一阶段：95℃，2分钟；第二阶段：95℃，5秒，60℃，35秒，72℃，25秒，50个循环；HRM条件为：95℃，1分钟，40℃，1分钟，65℃，1秒，从65℃起以0.02℃/秒速率升温至95℃，每度采集25个单信号，降温：40℃，30秒。通过Light Cycler 480 Gene-Scanning分析软件分析PCR基因类型。
HRM法和直接测序法敏感性分析：通过已知NOTCH1突变型7541_7542delCT Molt4和野生型Jurkat细胞株的DNA进行不同比例混合，制备50％、20％、10％、5％、1％以及O％NOTCH1突变程度的DNA样本，分别进行HRM法和直接测序法分析。
本发明的检测组合物具有以下特点：
高灵敏度：HRM检测灵敏度达1％，传统直接测序法最多只能达到10％的敏感度；
高通量：1次可同时检测多个样本，最多96个样本；
特异性好：PCR产物无需后续处理，特异性达100％；
用时短：采用HRM方法检测，能将检测周期(turn-around-time，TAT)缩短至0.5天；
重复性好：用HRM方法进行分析时，样品经PCR扩增后直接进行HRM，PCR产物无需再转入其它分析装置，而直接在同一个PCR管内进行分析，实现闭管操作，避免交叉污染；
操作简便：用本发明的PCR引物，进行PCR反应，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限，在Roche Light Cycler 480荧光定量PCR仪器上直接获得高分辨率熔解曲线分析，即可完成对样品基因型的判断；
成本低：相比传统的SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且拓展了其应用面；
适用范围广：可用于新鲜或酒精固定、石蜡包埋的手术标本，也可用于微量的穿刺或活检标本、血液标本、粪便标本等非手术标本的检测。而传统“PCR+测序”方法难以检测大部分不能手术的患者。
其它：只检测PCR样品中荧光强度的变化，不消耗任何PCR样品，无污染，PCR产物可以进行下游分析。
本发明首次建立在CLL中快速检测NOTCH1基因PEST区域突变的HRM检测体系。HRM是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，相比传统的直接测序法，具有极高的敏感性，实现了高效、快速、高通量地对CLL患者NOTCH1突变状态进行筛查，为临床上了解CLL患者疾病状态、指导预后判断提供一定的理论基础。
本发明检测组合物是针对NOTCH1 PEST区域HRM扩增引物的设计，通过对NOTCH1Ex34a和Ex34b正反向引物的设计，将扩增产物控制在200bp以内，更有利于HRM灵敏度的提高，使检测的敏感性大大提高。
本发明选取qPCR为饱和荧光染料，克服了现有很多荧光染料不能得到满意结果的缺陷。
本发明的扩增条件和溶解条件是经过多次实验摸索，得到最优化配置，使其能够在扩增时重点突显DNA区段和HRM产物的产量，有利于后续检测中突变情况的判断识别。
本发明的检测组合物具有高灵敏度、高通量性、特异性好、检测快速、操作简单灵活、准确、成本低等优点，能够对NOTCH1基因突变进行快速检测，为CLL疾病判断、复发、治疗方案的确定以及预后的判断提供重要的参考依据。
附图说明
图1是HRM检测溶解曲线和测序图；
图2是直接测序法和HRM法敏感性比较图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1，CLL骨髓B细胞基因组DNA突变检测
样品来源：133例样本细胞。采取临床明确诊断133例CLL患者抗凝骨髓液1mL，常规经淋巴细胞分离液密度梯度离心分离出单个核细胞，并用CD19+磁珠分选CD19+细胞，并经流式细胞仪检测，留取CD5+CD19+细胞≥95％的细胞。提取样本细胞，利用核酸提取试剂盒提取基因组DNA，并培养已知NOTCH1突变型7541_7542delCT Molt4和野生型Jurkat细胞株的DNA，分别作为突变检测的阴性和阳性对照。
步骤一，针对NOTCH1基因34号外显子PEST区域进行直接测序法PCR扩增反应。
PCR反应体系为：每20μl体系包含10×platinum缓冲液2μl，10mM dNTP mix 0.5μl，20pmol/μl NOTCH1 Ex34_F 0.5μl，20pmol/μl NOTCH1 Ex34_R 0.5μl，Platinum DNA聚合酶0.1μl，50mM硫酸镁0.6μl，100ng基因组DNA和超纯水。
扩增引物序列为：
NOTCH1 Ex34_F：5′-CTGGCGGTGCACACTATTCTG-3′，
NOTCH1 Ex34_R：5′-GCGCGCCGTTTACTTGAAG-3′。
PCR扩增条件是：第一阶段：94℃，5分钟；第二阶段：94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，45秒；循环40次；第三阶段：72℃，10分钟延伸。
步骤二，HRM检测
HRM检测的扩增仪器为罗氏Light Cycler 480荧光定量PCR仪。
HRM反应体系1为：每20μl体系包含2×FastqPCR Master Mix 10μl，5pmol/μl NOTCH1 Ex34a_F 0.8μl，5pmol/μl NOTCH1 Ex34a_R 0.8μl，100ng基因组DNA和超纯水；
HRM反应体系2为：每20μl体系包含2×FastqPCR Master Mix 10μl，5pmol/μl NOTCH1 Ex34b_F 0.8μl，5pmol/μl NOTCH1 Ex34b_R 0.8μl，100ng基因组DNA和超纯水。
HRM引物为：
NOTCH1 Ex34a_F：5′-ACAGCTACTCCTCGCCTGTG-3′，
NOTCH1 Ex34a_R：5′-GTCGGAGACGTTGGAATGCG-3′；
NOTCH1 Ex34b_F：5′-GTGCACACTATTCTGCCCCAG-3′，
NOTCH1 Ex34b_R：5′-GAGTAGCTGTGCTGCGAGG-3′。
HRM中的扩增和溶解条件为：第一阶段：95℃，2分钟；第二阶段：95℃，5秒，60℃，35秒，72℃，25秒，50个循环；HRM条件为：95℃，1分钟，40℃，1分钟，65℃，1秒，从65℃起以0.02℃/秒速率升温至95℃，每度采集25个单信号，降温：40℃，30秒。
扩增仪器为罗氏Light Cycler 480荧光定量PCR仪，Light Cycler 480是瑞士Roche公司生产的具有HRM分析功能的板式全自动荧光定量PCR仪。
步骤三，HRM法和直接测序法敏感性分析：通过已知NOTCH1突变型7541_7542delCTMolt4和野生型Jurkat细胞株的DNA进行不同比例混合，制备50％、20％、10％、5％、1％以及0％NOTCH1突变程度的DNA样本，分别进行HRM法和直接测序法分析。
步骤四，检测结果
采用本发明检测组合物和HRM法检测发现，133例CLL样本中共有8例(6.02％)患者存在与野生型样本完全不同的溶解曲线模式，即存在NOTCH1突变，其中经测序法验证，以c.7541_7542delCT突变为代表的共有7例，以c.7535_7536insC突变为代表的共有1例。
直接测序法检测发现，NOTCH1突变率为6.02％(8/133)，且阳性标本与HRM法检测结果完全一致。
通过稀释Jurkat(NOTCH1野生型)和Molt4(NOTCH1突变型，c.7541_7542delCT)细胞株的基因组DNA，分别制备携带50％、20％、10％、5％和1％以及0％NOTCH1突变量的样本，用于分析HRM法和直接测序法的敏感性。
HRM检测溶解曲线和测序检测结果如图1所示，CLL-108、CLL-232的HRM的溶解曲线均存在与野生型(WT)样本完全不同的溶解曲线模式，即存在NOTCH1突变，经测序法验证，CLL-108存在c.7541_7542delCT突变，CLL-232存在c.7535_7536insC突变。
直接测序法和HRM法敏感性差异比较见图2，直接测序法结果显示，5％NOTCH1突变的测序图出现隐约可见的突变峰，当突变率到10％时，基本可以判断有突变存在，即直接测序法对NOTCH1突变的检出敏感性为10％。用HRM法检测发现，当突变率低至1％时，仍可以出现很明显的溶解曲线，即HRM法对NOTCH1突变的检出敏感性为1％。
两种方法的敏感性分析结果显示，直接测序对NOTCH1突变的检出敏感性为10％，TAT为3天，而本发明检测组合物采用HRM方法检测能够达到1％的敏感性，并将TAT缩短至0.5天。
本发明检测组合物具有高灵敏度、高通量、高特异性，用时短，重复性良好，适用范围广，操作简单灵活、准确、成本低，能够对NOTCH1基因突变进行快速检测，为CLL疾病判断、复发、治疗方案的确定以及预后的判断提供重要的参考依据。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 国风
<120> 一种慢性淋巴细胞白血病患者NOTCH1基因突变检测组合物
<130> 0
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 1
ctggcggtgc acactattct g 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<400> 2
gcgcgccgtt tacttgaag 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 3
acagctactc ctcgcctgtg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<400> 4
gtcggagacg ttggaatgcg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<400> 5
gtgcacacta ttctgcccca g 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<400> 6
gagtagctgt gctgcgagg 19

Claims (8)

1.一种慢性淋巴细胞白血病患者NOTCH1基因突变检测组合物，其特征在于，所述慢性淋巴细胞白血病患者NOTCH1基因突变检测组合物，包括以下内容：
(1)针对NOTCH1基因34号外显子PEST区域的直接测序法检测引物
NOTCH1 Ex34_F：5′-CTGGCGGTGCACACTATTCTG-3′，
NOTCH1 Ex34_R：5′-GCGCGCCGTTTACTTGAAG-3′；
(2)HRM反应引物-1
NOTCH1 Ex34a_F：5′-ACAGCTACTCCTCGCCTGTG-3′，
NOTCH1 Ex34a_R：5′-GTCGGAGACGTTGGAATGCG-3′；
(3)HRM反应引物-2
NOTCH1 Ex34b_F：5′-GTGCACACTATTCTGCCCCAG-3′，
NOTCH1 Ex34b_R：5′-GAGTAGCTGTGCTGCGAGG-3′。
2.如权利要求1所述的慢性淋巴细胞白血病患者NOTCH1基因突变检测组合物，其特征在于，所述直接测序法的聚合酶链式反应扩增体系是：每20μl体系包含10×platinum缓冲液2μl，10mM dNTP mix 0.5μl，20pmol/μl NOTCH1 Ex34_F 0.5μl，20pmol/μl NOTCH1Ex34_R0.5μl，Platinum DNA聚合酶0.1μl，50mM硫酸镁0.6μl，100ng基因组DNA和超纯水。
3.如权利要求2所述的慢性淋巴细胞白血病患者NOTCH1基因突变检测组合物，其特征在于，所述直接测序法的PCR扩增条件是：第一阶段：94℃，5分钟；第二阶段：94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，45秒；循环40次；第三阶段：72℃，10分钟延伸。
4.如权利要求1所述的慢性淋巴细胞白血病患者NOTCH1基因突变检测组合物，其特征在于，所述HRM反应体系1为：每20μl体系包含2×Fast qPCR Master Mix 10μl，5pmol/μl NOTCH1Ex34a_F 0.8μl，5pmol/μl NOTCH1 Ex34a_R 0.8μl，100ng基因组DNA和超纯水；
HRM反应体系2为：每20μl体系包含2×Fast qPCR Master Mix 10μl，5pmol/μl NOTCH1 Ex34b_F 0.8μl，5pmol/μl NOTCH1Ex34b_R 0.8μl，100ng基因组DNA和超纯水。
5.如权利要求4所述的慢性淋巴细胞白血病患者NOTCH1基因突变检测组合物，其特征在于，所述HRM反应的扩增和溶解条件为：第一阶段：95℃，2分钟；第二阶段：95℃，5秒，60℃，35秒，72℃，25秒，50个循环；HRM条件为：95℃，1分钟，40℃，1分钟，65℃，1秒，从65℃起以0.02℃/秒速率升温至95℃，每度采集25个单信号，降温：40℃，30秒。
6.如权利要求1所述的慢性淋巴细胞白血病患者NOTCH1基因突变检测组合物，其特征在于，所述引物对(1)的产物长度在325～328bp。
7.如权利要求1所述的慢性淋巴细胞白血病患者NOTCH1基因突变检测组合物，其特征在于，所述引物对(2)的产物长度在129～132bp。
8.如权利要求1所述的慢性淋巴细胞白血病患者NOTCH1基因突变检测组合物，其特征在于，所述引物对(3)的产物长度为116bp。
CN201611221612.9A 2016-12-26 2016-12-26 一种慢性淋巴细胞白血病患者notch1基因突变检测组合物 Pending CN106755425A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611221612.9A CN106755425A (zh) 2016-12-26 2016-12-26 一种慢性淋巴细胞白血病患者notch1基因突变检测组合物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611221612.9A CN106755425A (zh) 2016-12-26 2016-12-26 一种慢性淋巴细胞白血病患者notch1基因突变检测组合物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106755425A true CN106755425A (zh) 2017-05-31

Family

ID=58925947

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611221612.9A Pending CN106755425A (zh) 2016-12-26 2016-12-26 一种慢性淋巴细胞白血病患者notch1基因突变检测组合物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106755425A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109554478A (zh) * 2019-01-17 2019-04-02 苏州市立医院 检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102925580A (zh) * 2012-11-16 2013-02-13 上海赛安生物医药科技有限公司 Notch1基因突变的快速检测方法
CN103509865A (zh) * 2013-09-22 2014-01-15 上海中优医药高科技有限公司 利用高分辨熔解曲线分析技术检测pah基因突变的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102925580A (zh) * 2012-11-16 2013-02-13 上海赛安生物医药科技有限公司 Notch1基因突变的快速检测方法
CN103509865A (zh) * 2013-09-22 2014-01-15 上海中优医药高科技有限公司 利用高分辨熔解曲线分析技术检测pah基因突变的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PAULO VIDAL CAMPREGHER 等: "A Novel Assay for the Identification of NOTCH1 PEST Domain Mutations in Chronic Lymphocytic Leukemia", 《BIOMED RESEARCH INTERNATIONAL》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109554478A (zh) * 2019-01-17 2019-04-02 苏州市立医院 检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物
CN109554478B (zh) * 2019-01-17 2021-11-23 苏州市立医院 检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Diehl et al. Digital quantification of mutant DNA in cancer patients
CN107058538B (zh) 一种引物组合物及其组成的试剂盒和应用
Cao et al. Rapid detection of CALR type 1 and type 2 mutations using PNA-LNA clamping loop-mediated isothermal amplification on a CD-like microfluidic chip
CN102732633B (zh) 人idh基因突变的检测引物和试剂盒
CN113718021A (zh) 一种定量检测bcr-abl1融合基因的引物、探针及其试剂盒
CN106636441A (zh) 一种检测aldh2基因突变的探针及其应用和试剂盒
Scholl et al. Rapid screening and sensitive detection of NPM1 (nucleophosmin) exon 12 mutations in acute myeloid leukaemia
Zhang et al. Determination of ABO blood group genotypes using the real‑time loop‑mediated isothermal amplification method
CN104087672A (zh) 一种多重实时荧光定量pcr技术快速检测人21号染色体数目的试剂盒
CN106755425A (zh) 一种慢性淋巴细胞白血病患者notch1基因突变检测组合物
CN111909990B (zh) 单管同时检测基因的缺失突变和点突变的荧光pcr检测方法
CN115717167A (zh) 一种新型多靶点肝癌早期检测的标志物组合和试剂盒
WO2019084998A1 (zh) 一种kras、nras、braf基因突变检测试剂盒
CN103725787B (zh) 一种白血病融合基因荧光pcr检测试剂盒
CN104004823A (zh) 一种单核苷酸多态性熔解曲线分析方法
CN104073548A (zh) 基于溶解曲线的单核苷酸多态性检测方法及其试剂盒
CN103923981B (zh) Hla-b*27等位基因检测方法及其试剂盒
Lukowsky Clonality analysis by T-cell receptor γ PCR and high-resolution electrophoresis in the diagnosis of cutaneous T-cell lymphoma (CTCL)
CN109554478B (zh) 检测慢性淋巴细胞白血病基因突变的组合物
CN111690736A (zh) 一种华法林用药基因检测试剂盒及使用方法
CN110551817A (zh) 检测人wt1融合基因的试剂盒及其使用方法
CN103740835B (zh) 一种白血病融合基因荧光pcr检测试剂盒
CN103725775A (zh) 一种采用等位基因rna等温扩增法来快速检测braf基因突变的方法
CN102251059B (zh) 乙型肝炎病毒拉米夫定耐药核酸定量检测引物及其探针
CN117265138B (zh) 用于猫血型检测的引物和探针组合物、检测方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170531

RJ01 Rejection of invention patent application after publication