CN103725775A - 一种采用等位基因rna等温扩增法来快速检测braf基因突变的方法 - Google Patents

Abstract

一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，步骤为：细胞裂解处理；RNA的逆转录处理；生成cDNA，并成为RNA扩增模板；通过定期监测荧光信号，来对RNA扩增子进行定量；本发明采用等温反应法，对BRAF的V600E突变位点进行定点特异检测，其中温度等温41℃进行，试验条件温和，反应化合物普通，操作简单，特异性高，仅需要能检测荧光探针的仪器即可。它有一个更高的放大系数，能够在1.5小时之内用2条针对靶向RNA的特异性引物和三个酶，制造出十亿个与目标RNA互补的RNA，通过荧光探针的检测，读出低至0.1％含量的BRAF突变信息，用于肿瘤患者靶向药物的用药指导。

Description

一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法

技术领域

本发明涉及一种基因突变的检测方法，具体是一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法。

背景技术

BRAF基因是1988年由Ikawa等首先在人类尤文氏肉瘤中发现并克隆确认的，是一个能转染NIH3T3细胞且有活性的DNA序列，因其与CRAF和ARAF具有相当高的同源性，故称其为BRAF。BRAF癌基因编码的BRAF蛋白是有丝分裂原活化的蛋白激酶／细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)途径蛋白，是MAPK激酶家族里最高效的磷酸化剂，在凋亡和增殖过程中起着重要作用，位于MAPK通路入口处，它将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，调节细胞的生长、发育。近来研究发现，人类的许多恶性肿瘤中都有BRAF基因突变，BRAF作为分子标记在多种肿瘤的发生发展中充当着重要角色。英国肿瘤基因组计划的科学家Davies等对来自于530个不同肿瘤细胞株的基因组DNA进行筛查，结果证实有43株细胞发生了BRAF基因突变。调查显示，大约有65％的结直肠癌、卵巢癌等恶性肿瘤与该家族中的BRAF突变体有关。BRAF突变后持续性激活MAPK通路，使有丝分裂能力增强，导致细胞异常增殖和分化。

RAF蛋白家族含有三个成员：aRAF，bRAF，cRAF，它们是在细胞外基质表达的一类保守的特异性丝／苏氨酸蛋白激酶，参与了细胞外信号调节激酶(Extracellular RegulatedKinase，ERK)和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)的信号级联传导途径。RAF激酶作用与RAS的下游，它的功能是磷酸化并激活MAPK／ERK激酶活性(MEK)。通过激活或者抑制Ras-Raf-MAPK／ERK信号通路，可以调控由于生长因子、细胞因子和激素介导的细胞增殖以及细胞存活。因此，对此通路不适当的激活和／或持续的激活会导致异常的细胞分化、增殖和凋亡，并且还会导致肿瘤的发生。

人们通过在大量不同的恶性肿瘤组织中对BRAF进行测序，鉴定出30个以上单点缺失意义的突变，而大部分都发生在激酶区域。恶性黑色素瘤和甲状腺乳头状癌中有50％含有bRAF突变，低度恶性卵巢癌中有30％，结肠癌中有15％，BRAF突变还存在于更多的癌症中(http：／／www.sanger.ac.uk／genetics／CGP／cosmic／)。而其中90％的BRAF突变都在600位存在缬氨酸被谷氨酸替代的现象(V600E)，这样的突变激活了BRAF激酶，并引起了失控的细胞增殖以及癌症发生。

当人们发现了这一点后，便开始研发生产出一些能够抑制BRAF突变的药物，并且在临床上应用上取得了重要的成果，比如威罗菲尼片(vemurafenib)，能对那些肿瘤表达原癌基因BRAF的病人起到非常好的效果。另一方面，在临床使用抗BRAF药物之前，进行肿瘤组织中BRAF基因型的鉴定是一件非常重要的事情。对病人BRAF基因的突变的金标准检测包括肿瘤组织样本的搜集，Sanger法测序或特异引物PCR法。

基因突变的研究已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。但是这种方法有一定的局限性，更多时候会涉及到更加复杂、费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性(single-strand comformational polymorphism，SSCP)和异源双链分析法(heteroduplex analysis，HA)。以下是几种PCR衍生技术及经典突变检测方法。

1、PCR-SSCP法：

PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其灵敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大组织样本基因突变研究的筛选工作。

2、异源双链分析法(HA)：

HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。

3、突变体富集PCR法(mutant-enriched PCR)：

本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstN I位点，第13密码子有Bgl II位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。

4、变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradient electrophoresis，DGGE)：

DGGE法分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适范围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。在DGGE的基础上，又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法(温度梯度凝胶电泳temperature gradient gel electrophoresis，TGGE)。DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置，该法一经建立，操作也较简便，适合于大组织样本的检测筛选。

5、化学切割错配法(chemical cleavage ofmismatch，CCM)：

CCM为在Maxam-Gilbert测序法的基础上发展的一项检测突变的技术，其检测突变的准确性可与DNA测序相仿。其基本原理为将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混杂变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺或哌啶切割，错配的T能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变。该法检出率很高，也是检片段最长的方法，已有报功检测了1.7kb片段，如果同时对正、反义链进行分析，检出率可达100％。应用荧光检测系统可增强敏感度，可检测到10个细胞中的1个突变细胞。该法中的化学试剂有毒，又发展了碳二亚胺检测法(catodiimide，CDI)，CDI为无毒物质，也可检测大片段DNA的点突变。

6、等位基因特异性寡核苷酸分析法(allele-specific oligonucleotide，ASO)：

ASO为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR扩增的样品DNA杂交。可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表示在样品中存在与该ASO探针相应的点突变，ASO需严格控制杂交条件和设置标准对照避免假阳性和假阴性。目前已有商品化的检测盒检测部分癌基因ASO突变。

7、DNA芯片技术(DNA chip)：

DNA芯片技术是90年代后发展的一项DNA分析新技术，它集合了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术。可用于基因定位、DNA测序、物理图谱和遗传图谱的构建等。在基因突变检测方面DNA芯片也有广阔的前景，其基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上，彼此之间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA分别与2块DNA芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、自动化程度高，具有很大的发展潜力，将在基因突变检测中心发挥非常重要的作用。

8、连接酶链反应(ligase chain reaction，LCR)：

与其他核酸扩增技术比较，其最大特点为可准确区分基因序列中单个基因突变，由Landegree于1988年首次应用于镰刀状细胞贫血的分子诊断。LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5`-磷酸与另一相邻链3`-羟基连接为基础，应用两对互补的引物，双链DNA经加热变性后，两对引物分别与模板复性，若完全互补，则在连接酶的作用下，使相邻两引物的5`-磷酸与3`-羟基形成磷酸二酯键而连接，前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板，如果配对的碱基存在突变则不能连接和扩增。LCR产物检测最初是通过这32p标记上游引物3`未端，经变性凝胶电泳分离后放射自显影加以鉴定，其检测敏感性达到200个靶分子。也可设计1个横跨两引物的检测探针，用它与LCR产物进行杂交检测。近年有应用荧光素、地高辛等非核素标记方法。Batt在1994年发展了一种更为简洁的方法，微孔板夹心杂交法。由于LCR的快速、特异和敏感的特性，以及能检测单个碱基突变的能力，因此被应用于肿瘤基因突变的分子诊断，并与PCR结合用以提高其敏感性。

9、等位基因特异性扩增法(Allele-specific amplification，ASA)：

ASA于1989年建立，是PCR技术应用的发展，也称扩增阻碍突变系统(amplificationrefractory mutation system，ARMS)、等位基因特性PCR(allele-specific PCR，ASPCR)等，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5`端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3`端引物进行两个平行PCR，只有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩增产物。如果错配位于引物的3`端则导致PCR不能延伸，则称为ARMS。ARMS和ASPCR借鉴多重PCR原理，可在同一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点。ASA法的检出率依赖于反应条件的优化和可能发生的引物与靶DNA有错配时错配延伸，特别是当错配碱基为G：T时，这时可通过调整实验条件如引物靶DNA，Taq DNA聚合酶的浓度等来得到更高的特异性。在反应体系中加入甲酰胺也可减少非特异性扩增。还可通过在引物3`端的第二个碱基引入一个错配碱基，使之与模板之间形成双重错配以阻止错误延伸。

10、RNA酶A切割法(RNase A cleavage)：

在一定条件下，氨基源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的错配碱基可被RNaseA切割，切割产物可通过变性凝胶电泳分离。当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，RNaseA在错配处的切割效率很低，甚至不切割，而当错配碱基为嘧啶时，则其切割效率较高。故如果仅分析被检DNA的一个条链，突变检出率只有30％，如同时分析正义和反义二条链，检出率可达70％。该法需要制备RNA探针，增加了操作的复杂性，但可用于1-2kb的大片段进行检测，并能确定突变位点。介于这些优越性的存在，它仍被作为一种经典方法用于对未知突变进行分析。

11、染色体原位杂交(In situ hybridization of chronosome)：

染色体发现距今已有150多年的历史，染色体检测被广泛用于动、植物及人类的细胞遗传学研究，随着染色体分技术和分子生物学技术的发展。染色体研究范围也不断扩大，特别是用于肿瘤分子诊断。肿瘤细胞的染色体变化是非常普遍的现象，可分为原发和继发两类。在肿瘤形成的生物学基础方面，原发性的染色体变化与引起肿瘤的直接原因有关，肿瘤细胞中可以发现各种形式的染色体畸变，如缺失、重复、易位、重排、单体断裂及核内复制等；继发性变化主要是肿瘤细胞核型的改变。染色体的检测对于肿瘤的诊断、鉴别诊断、生物学行为判别等方面都重要意义。染色体的检测方法进展很快，检测的精确率也不断提高，这里主要介绍荧光原位杂交和PRINS法。

12、荧光原位杂交技术(fluorescent in situ hybridization，FISH)：

创建于1986年。1969年Gall和Pardue首先应用核素标记核苷酸制备探针，通过放射自显影检测杂交信号。应用核素标记的探针其敏感性可以检测到中期染色体上几百碱基的单拷贝靶核苷酸序列，敏感性虽高，但定位不够精确。FISH具有探针稳定、操作安全，可快速、多色显示多个不同探针的杂交信号等优点。FISH的灵敏感与探针标记方法和检测仪器性能有关，探针标记时掺入的修饰核苷酸比例直接影响杂交信号强度。FISH探针一般采用随机引物法或切口翻译法，如将PCR技术引入FISH探针标记，可使其灵敏度提高到0.25kb。应用慢扫描CCD配合影像处理软件，增强信噪比，有利于检测微弱信号，如应用TSA系统((Tyramide Signal Amplification,TSA)能将杂交信号再放大1000倍，可用于单拷贝基因的定位。FISH分辨率大约为1-3Mb，如果应用强变性剂处理染色体，让DNA分子从蛋白质中分离出来，使双DNA完全伸展并粘附在玻片上，经过处理后，分辨率可达1-2kb。还可采用对分裂中期染色体进行显微解剖(microdissect)法以提高分辨率。FISH的另一个特点是可以联合庆用地高辛、生物素等多种标记系统，在一次杂交中可检测多种探针在染色体上的位置及探针间的相互关系，即多色FISH或多靶FISH。FISH技术已被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、易位重排及缺失等的检测，在肿瘤诊断和鉴别诊断、预后和治疗监控等方面都有重要意义。

13、Klch等于1989年发明了染色体上寡核苷酸引物原位DNA合成技术(oligonucleotideprimed in situ DNA synthesis，PRINS)，并成功地用于染色体特异卫星DNA标记。其基本原理是用非标记的寡核苷酸引物同染色体上靶序列特异性地杂交，在DNA聚合酶作用下，当引物延伸时，掺入标记的核革酸可直接或间接地检测标记位点。PRINS技术的优点是不需克隆基因作探针，且由于杂交反应在前，标记在后，故非特异性背景低。缺点是信号弱，灵敏度低，为克服这一制眯，Terkelsen等建立了重复引物原位标记技术(repeatedPRINS)，重复进行PRINS反应，使信号强度明显提高。基于FISH的原理，发展了多色原位引物标记(multicolor PRINS)，可测定二个以上靶序列在DNA分子上的相互的位置，且特异性比FISH还高。

14、DNA序列分析(DNA sequencing)应用各种突变检测技术检测到的基因突变，最后都需用序列分析才能确定突变类型及突变位置，其效率可以达到100％。现在的测序方法已与经典的方法有了很大的不同，其基本原理虽仍是双脱氧终止法，但自动化程度大为提高，操作更简便，测序时间也大大缩短。随着PCR技术与测序联合使用，不需经过M13亚克隆步骤，故称为直接测序法(direct sequencing，DS)。DS法测序的模板主要来源于PCR，应用不对称PCR(asymmetric PCR)和基因组扩增转录同步测序法(genomicamplification with transcript sequencing，GAWTS)等，使单链产物大大增加。近年来，PCR循环测序法的建立，使模板扩增与同步进行，引物用四种不同的颜色的荧光标记，使每个样品的四个测序反应可在一个反应管和一个泳道内进行，大大提高了测得的自动化程度。目前PE公司推同出的DNA自动测序仪已发展到96泳道，并仍在不断改进。这些高度自动化的测序方法是比较理想的基因突变分析技术，但其昂贵的费用其使用范围，所以对一些小组织样本或为了某些特定目的的组织样本分析，仍进行经典的手工测序。

15、突变基因的检测方法多种多样，特别是PCR技术诞生后，许多检测技术都是在PCR基础上衍生的。由于PCR扩增南非要的模板量少，使对肿瘤的突变分析可以精确到单细胞，如霍奇金病的R-S细胞的单细胞基因突变分析。另外，应用显微解剖法(microdissection)可在组织切片上较精确地挑选需检测的靶点，其优点是可克服肿瘤组织中间质或癌周组织的混杂，提高准确性。除上述介绍的方法外，还有多种方法也用于基因突变的分子检测，如对未知突变基因进行分析的酶促切割错配法(enzyme mismatecleavage，EMC)、切割片段长度多态性(cleavage fragment length polymor phism，CEFLP)、双脱氧指纹图谱法(dideoxy finger printing，ddF)、错配接合蛋白质截短测试法(proteintruncation test，PTT)等。对已知突变基因进行分析的有引物延伸法(primer extension，PEX)、寡核苷酸链接检测法(oligonucleotiide ligation assay，OLA)、毛细管电泳法(capillaryelectrophoresis，CE)等方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，该方法设备要求简单，方法易行，能快速大量扩增出突变的单链RNA，特异性高，灵敏度可以达到0.1％，解决了BRAF基因突变的检测难度大，速度慢等问题。

现有BRAF检测技术主要采用QPCR的方法，其中检测需要在复杂的仪器中进行，需要复杂的温度变化，对设备要求高，本发明主要采用等温反应法，能够快速有效且平稳的进行试验，对BRAF的V600E突变位点进行定点特异检测，其中温度等温41℃进行，试验条件温和，反应化合物普通，操作简单，特异性高，不需要昂贵的qPCR仪，仅需要能检测荧光探针的仪器即可。它有一个更高的放大系数，能够在1.5小时之内用2条针对靶向RNA的特异性引物和三个酶，逆转录酶(Reverse transcriptase，RT)、RNA酶H(RNaseH)和T7DNA依赖的RNA聚合酶(T7DNA-dependent RNA polymerase)，制造出十亿个与目标RNA互补的RNA，通过荧光探针的检测，读出低至0.1％含量的BRAF突变信息，用于肿瘤患者靶向药物(EGFR-TKI等)的用药指导。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，包括以下步骤：

(1)检测准备：

①组织样本：采集新鲜手术肿瘤组织样本；如果立即检测，则用细针抽吸组织样本，将血液中的循环肿瘤细胞，或者体液中的肿瘤细胞用于检测；如果不立即检测，将组织样本放置到-70℃的温度中保存；

②细胞系和细胞培养：HT29细胞系带有突变型BRAF V600E，293细胞系带有野生型BRAF，将这两种细胞系进行培养；从两种细胞系中分别提取总RNA，并用进行定量；然后将突变型BRAF V600E与野生型BRAF稀释后混合；所述V600E是指第600位点上，氨基酸由正常的V突变为E；

③DNA引物和探针：

所用的对应突变型BRAF V600E的正向引物序列为：

5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGA-3；

所用的对应野生型BRAF的正向引物序列为：

5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGT-3；

所用的BRAF的反向引物序列为：

5-biotin-TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT；

所用的BRAF的反向引物序列中含有RNA聚合酶的结合区域为：

AATTCTAATACGACTCACTATAGGG；

所用的分子信标的序列为：

5-FLUOROPHORE-GCGAGAAGTCATCAGAATGCACTCGC-QUENCHER-3；

(3)检测程序：

①将组织样本置于1.5ml离心管中，加入100μl裂解液，振荡30s，然后在4℃下离心处理5min，得到组织样本上清液；

②准备以下检测反应混合物，体系20μl包含：

所述的5×引物混合液中含有75％二甲基亚砜和正向引物和反向引物各1mM；

③将反应混合液加入到微测试孔中(未加入样本)，每孔19μl；

④取待检测的组织样本的1μl上清液或者分离得到的浓度为10-100ng／μl的总RNA1μl加入微测试孔中；反应混合物在65℃下孵育5min，然后冷却到41℃孵育5min，加入5μl酶混合物，然后在41℃孵育90min；

所述的酶混合物中含有：山梨醇、牛血清白蛋白、核糖核酸酶H、T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶；

⑤通过监测荧光信号来对RNA扩增子进行定量；分析每个反应的斜率，通过对比组织样本与标准RNA的斜率比较来确定突变型BRAF V600E或者野生型BRAF的含量。

作为本发明进一步的方案：步骤(1)的①中如果组织样本未立即检测，将组织样本放置到-70℃的温度中保存。

作为本发明进一步的方案：步骤(1)的②中从两种细胞系中分别提取总RNA，并用分光光度计进行定量；然后将突变型BRAF V600E与野生型BRAF按照以下稀释比进行混合(突变型RNA：野生型RNA)：100％，10％，1％，0.1％。

作为本发明进一步的方案：步骤(2)的①中将组织样本置于1.5ml离心管中，加入100pl裂解液，振荡30s，然后在4℃下离心处理5min，得组织样本上清液。

作为本发明进一步的方案：步骤(2)的①中所述裂解液中含有pH=8.5的10mMTris-HCl缓冲液、50mM乙二胺四乙酸、0.2％十二烷基磺酸钠、200mM NaCl、0.1mg／mL蛋白酶K和水。

作为本发明再进一步的方案：步骤(2)的②中准备以下检测反应混合物：

每个96孔板的一个孔包含20μl体系的反应混合液，如下：

其中，所述的5×反应缓冲液中含有：

200mM Tris-HCl缓冲液，pH=8.5

60mM MgCl₂

350mM KCl

2.5mM二硫苏糖醇

5mM of each dNTP

10mM each of ATP，UTP and CTP

7.5mM GTP

2.5mM ITP。

作为本发明进一步的方案：步骤(2)的④中取待检测的组织样本的1μl上清液或者分离得到的浓度为10-100ng／μl的总RNA1μl加入微测试孔中；反应混合物在65℃下孵育5min，然后冷却到41℃孵育5min，加入5μl酶混合物，然后在41℃孵育90min；

所述的酶混合物中含有：

作为本发明进一步的方案：步骤(2)中所述微测试孔为带有密封膜的96孔PCR板中的微测试孔；⑤通过5到10min监测间隔定期监测荧光信号，所用仪器为各种检测荧光信号的仪器，包括qPCR仪。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)不需要复杂的热循环控制步骤，仪器设备要求低，可以简单实现。

(2)速度快，成本低。本技术具有更高的放大系数，能够在1.5小时之内用2条针对靶向RNA的特异性引物和三个酶，逆转录酶(Reverse transcriptase，RT)、RNA酶H(RNaseH)和T7DNA依赖的RNA聚合酶(T7DNA-dependent RNA polymerase)，制造出十亿个与目标RNA互补的RNA；

(3)敏感度高，正向引物是针对突变的等位基因特异性引物，携带BRAF基因突变的患者，也同时带有BRAF野生型，本方法针对性的扩增突变基因部分，大大提高了灵敏度，可以达到0.1％。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中，一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，包括以下步骤：

(1)检测准备：

①组织样本：采集新鲜手术肿瘤组织样本；如果立即检测，则用细针抽吸组织样本，将血液中的循环肿瘤细胞，或者体液中的肿瘤细胞用于检测；如果未立即检测，将组织样本迅速放置到-70℃的温度中保存；

②细胞系和细胞培养：HT29细胞系带有突变型BRAF V600E，293细胞系带有野生型BRAF，将这两种细胞系按照标准条件进行培养；从两种细胞系中分别提取总RNA，并用分光光度计进行定量；然后将突变型BRAF V600E与野生型BRAF按照以下稀释比进行混合(突变型RNA：野生型RNA)：100％，10％，1％，0.1％；所述V600E是指第600位点上，氨基酸由正常的V突变为E；

③DNA引物和探针：

所用的对应突变型BRAF V600E的正向引物序列为：

5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGA-3；

所用的对应野生型BRAF的正向引物序列为：

5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGT-3；

所用的BRAF的反向引物序列为：

5-biotin-TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT；biotin能够与特殊处理的96孔板进行偶联；

所用的BRAF的反向引物序列中含有RNA聚合酶的结合区域为：

AATTCTAATACGACTCACTATAGGG；通过与生物素偶联，能够增加BRAF基因捕捉几率，并提高将BRAF基因锁定到96孔板内的特异性；

所用的分子信标(荧光探针)的序列为：

5-FLUOROPHORE-GCGAGAAGTCATCAGAATGCACTCGC-QUENCHER-3；

(4)检测程序：

①将组织样本置于1.5ml离心管中，加入100μl裂解液，振荡30s，然后在4℃下离心处理5min，得反应混合物(premix)；所述裂解液中含有pH=8.5的10mM Tris-HCl缓冲液、50mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.2％十二烷基磺酸钠(SDS)、200mM NaCl、0.1mg／mL蛋白酶K，以及用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的水；

②准备检测反应混合物(premix)：

准备以下物质：

一个反应混合液(premix)(对应于每个96孔板的一个孔，20μl体系)

其中：

所述的5×反应缓冲液(reaction buffer)中含有：

200mM Tris-HCl缓冲液，pH＝8.5

60mMMgCl₂

350mM KCl

2.5mM二硫苏糖醇(DTT)

5mM of each dNTP

10mM each of ATP，UTP and CTP

7.5mM GTP

2.5mM ITP

所述的5×引物混合液(primer mix)含有75％二甲基亚砜(DMSO)和正向引物和反向引物各1mM；

③将反应混合液(Premix)加入到微测试孔(带有密封膜的96孔PCR板)中，每孔19μl；

④取待检测的组织样本的1μl上清液或者分离得到的总RNA1μl(10-100ng/μl)加入微测试孔中；反应混合物在65℃下孵育5min，然后冷却到41℃孵育5min，加入5μl酶混合物，然后在41℃孵育90min；

所述的酶混合物(Each reaction)中含有：

⑤通过定期监测荧光信号(5到10min监测间隔)来对RNA扩增子进行定量；分析每个反应的斜率，通过对比组织样本与标准RNA的斜率比较来确定突变型BRAF V600E或者野生型BRAF的含量。

所述定期监测荧光信号所用仪器包括qPCR仪，但不限于qPCR仪，可以是各种检测荧光信号的仪器。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (8)

1.一种采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)检测准备：

①组织样本：采集新鲜手术肿瘤组织样本；如果立即检测，则用细针抽吸组织样本，将血液中的循环肿瘤细胞，或者体液中的肿瘤细胞用于检测；如果不立即检测，将组织样本放置到-70℃的温度中保存；

②细胞系和细胞培养：HT29细胞系带有突变型BRAF V600E，293细胞系带有野生型BRAF，将这两种细胞系进行培养；从两种细胞系中分别提取总RNA，并进行定量；然后将突变型BRAF V600E与野生型BRAF稀释后混合；所述V600E是指第600位点上，氨基酸由正常的V突变为E；

③DNA引物和探针：

所用的对应突变型BRAF V600E的正向引物序列为：

5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGA-3；

所用的对应野生型BRAF的正向引物序列为：

5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGT-3；

所用的BRAF的反向引物序列为：

5-biotin-TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT；

所用的BRAF的反向引物序列中含有RNA聚合酶的结合区域为：

AATTCTAATACGACTCACTATAGGG；

所用的分子信标的序列为：

5-FLUOROPHORE-GCGAGAAGTCATCAGAATGCACTCGC-QUENCHER-3；

(2)检测程序：

①将组织样本置于1.5ml离心管中，加入100μl裂解液，振荡30s，然后在4℃下离心处理5min，得到组织样本上清液；

②准备以下检测反应混合物，体系20μl包含：

所述的5×引物混合液中含有75％二甲基亚砜，突变型BRAF V600E的正向引物(序列为5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGA-3和BRAF的反向引物(序列为5-biotin-TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT)各1mM，检测到的结果是突变型BRAF的含量；

如果加入的引物是野生型BRAF正向引物(序列为5-GTGATTTTGGTCTAGCTACAGT-3)和BRAF的反向引物(序列为5-biotin-TTAATTCTAATACGACTCACTATAGGGCTGGTCCCTGTTGTTGAT)，那么检测到的结果就是野生型BRAF的含量；

③将反应混合液(未加入样本)加入到微测试孔中，每孔19μl；

④取待检测的组织样本的1μl上清液或者分离得到的浓度为10-100ng／μl的总RNA1μl加入微测试孔中；反应混合物在65℃下孵育5min，然后冷却到41℃孵育5min，加入5μl酶混合物，然后在41℃孵育90min；

所述的酶混合物中含有：山梨醇、牛血清白蛋白、核糖核酸酶H、T7RNA聚合酶、AMV逆转录酶；

⑤通过监测荧光信号来对RNA扩增子进行定量；分析每个反应的斜率，通过对比组织样本与标准RNA的斜率比较来确定突变型BRAF V600E或者野生型BRAF的含量。

2.根据权利要求1所述的采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，步骤(1)的①中如果组织样本未立即检测，将组织样本放置到-70℃的温度中保存。

3.根据权利要求1所述的采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，步骤(1)的②中从两种细胞系中分别提取总RNA，并用分光光度计进行定量；然后将突变型BRAF V600E与野生型BRAF按照以下稀释比进行混合(突变型RNA：野生型RNA)：100％、10％、1％、0.1％。

4.根据权利要求1所述的采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，步骤(2)的①中将组织样本置于1.5ml离心管中，加入100μl裂解液，振荡30s，然后在4℃下离心处理5min，得到组织样本上清液。

5.根据权利要求1或4所述的采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，步骤(2)的①中所述裂解液中含有pH=8.5的10mM Tris-HCl缓冲液、50mM乙二胺四乙酸、0.2％十二烷基磺酸钠、200mM NaCl、0.1mg／mL蛋白酶K和水。

6.根据权利要求1所述的采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，步骤(2)的②中准备以下检测反应混合物：

每个96孔板的一个孔包含20μl体系的反应混合液，如下：

其中，所述的5×反应缓冲液中含有：

200mM Tris-HCl缓冲液，pH=8.5

60mM MgCl₂

350mM KCl

2.5mM二硫苏糖醇

5mM of each dNTP

10mM each of ATP，UTP and CTP

7.5mM GTP

2.5mM ITP。

7.根据权利要求1所述的采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，步骤(2)的④中取待检测的组织样本的1μl上清液或者分离得到的浓度为10-100ng/μl的总RNA1μl加入微测试孔中；反应混合物在65℃下孵育5min，然后冷却到41℃孵育5min，加入5μl酶混合物，然后在41℃孵育90min；

所述的酶混合物中含有：

8.根据权利要求1所述的采用等位基因RNA等温扩增法来快速检测BRAF基因突变的方法，其特征在于，步骤(2)中所述微测试孔为带有密封膜的96孔PCR板中的微测试孔；⑤通过5到10min监测间隔定期监测荧光信号，所用仪器为各种检测荧光信号的仪器，包括qPCR仪。