CN105861691A - 一种braf基因突变检测的引物组合物、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种BRAF基因突变检测的引物组合物、试剂盒及方法，采用PNA Clamp LAMP技术，将PNA与LAMP法结合，利用PNA将相应的等位基因“封闭”，从而使得LAMP反应无法继续；而当检测样本中存在另外一个或者几个等位基因时，PNA由于不能有效对其进行“封闭”，使得LAMP反应得以顺利进行，以此达到检测目的基因是否发生突变的目的。该发明具有的优点在于该方法步骤简单，特异性高，鉴定简便，成本低廉。

Description

一种BRAF基因突变检测的引物组合物、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其是涉及一种BRAF基因突变检测的引物组合物、试剂盒及方法。

背景技术

BRAF全称为鼠肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B1，是RAF家族的成员之一，定位于人染色体7q34，是一种原癌基因，其编码产物是一个94KDa的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(B-raf)。B-raf主要存在于睾丸组织和神经组织，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK通路中重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和调往等重要的细胞事件。B-raf由783个氨基酸残基组成，其功能的活化依赖于特点位点的氨基酸残基的磷酸化，其中位于CR3区的T598和S601的磷酸化对于B-raf蛋白的激活至关重要，只有当这两个位点均磷酸化后，B-raf才能被完全激活。在多种人类的恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌及肝癌中，均存在不同比例的BRAF突变，其中尤以V600E(c.1799T>A)突变最为常见，约占所有突变比例的86％。V600E突变能够模拟T598和S601两个位点的磷酸化作用，使B-raf处于持续活化的状态。由于B-raf是位于K-ras下游级联信号通路上的一个重要蛋白，因此当B-raf发生突变后，其编码产物无需接受K-ras的活化信号便处于激活状态，使得EGFR抑制剂西妥昔单抗和帕尼单抗的治疗效果减弱甚至无效。同时，一种威罗菲尼已被FDA批准用于治疗V600E突变阳性的不可手术的转移性黑色素瘤患者。由于肿瘤存在异质性，而且取样标本中往往混入大量的正常组织，再加上石蜡标本提取的基因组DNA质量有限，因此可能会导致检测结果出现假阴性。目前用于检测BRAF基因突变的方法主要有Sanger测序法、焦磷酸测序法和荧光定量PCR法，它们的灵敏度依次升高。测序法耗时长，操作繁琐，灵敏度低，且依赖非常昂贵的进口设备，不易于大规模推广；荧光定量PCR法灵敏度较好，但同样依赖昂贵的检测设备和探针，因此检测费用一直居高不下，然而患者的检测又势在必行，因此亟需我们开发一种既快速灵敏又成本低廉的检测方法。

环介导的等温扩增(LAMP)技术是日本科学家于2000年提出的一种等温扩增技术，其主要特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)的作用下进行恒温扩增，仅需15-90分钟即可产生10⁹-10¹⁰数量级的产物。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)步骤简单：扩增DNA只需反应体系配置完毕后放置在恒温水浴锅中进行反应扩增即可，不需要预先进行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、退火、延伸等变温过程；

(2)高特异性：扩增的特异性很高，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否，可应用于检测BRAF突变型等位基因，会给西妥昔单抗和帕尼单抗以及威罗菲尼的正确使用带来更可靠的保障；

(3)扩增反应快速、高效：整个扩增2h内即可完成，且产率高；

(4)高敏感性：扩增模板可最低至6个拷贝，比传统PCR高出10-1000倍，具有与real-time Taqman PCR同样的敏感性；

(5)鉴定简便：反应完成后通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，结果的观察可以脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制，加上扩增是等温进行，不用依赖PCR仪复杂的循环温度变化来完成，在水浴锅中就能进行，使该技术有着更广阔的应用前景。

(6)成本低廉：整个检测反应仅需要水浴锅就可开展，无需任何其他检测设备。

LAMP法具有操作简单，特异性强和成本低廉的优点。目前LAMP法较多用于病原体和其他一些微生物的检测中，虽然对于使用LAMP法进行基因突变的检测也偶见报道，但这些等位基因特异性引物的LAMP法在实际的应用中很不稳定，因此在市场上还没有以LAMP法为基础的基因突变检测试剂盒出售。肽核酸(PNA)是具有类多肽骨架的DNA类似物，骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸与核酸碱基通过亚甲基羰基连接而成的。PNA可以特异性地与DNA或RNA杂交，形成稳定的复合体。当PNA与靶序列完全互补时，这种复合体的稳定性要远远高于普通的DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA的双链结构。然而，当PNA与靶序列不完全配对甚至只有一个碱基错配的时候，这种PNA-DNA复合物就变得非常不稳定，很容易打开双链。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有的BRAF基因突变检测方法不理想，检测费用高，不易于大规模推广。

为解决上述问题，本发明采用PNA Clamp LAMP技术，将PNA与LAMP法结合，利用PNA将相应的等位基因“封闭”，从而使得LAMP反应无法继续；而当检测样本中存在另外一个或者几个等位基因时，PNA由于不能有效对其进行“封闭”，使得LAMP反应得以顺利进行，以此达到检测目的基因是否发生突变的目的，该方法既快速灵敏又成本低廉。

本发明的第一个目的在于提供一种BRAF基因突变检测的引物组合物，包括：

正向外侧引物F3：

5’-TCAGATATATTTCTTCATGAAGACC-3’(SEQ ID No.1)；

反向外侧引物B3：

5’-AGTTGAGACCTTCAATGACTT-3’(SEQ ID No.2)；

正向内侧引物FIP：

5’-ATGGGACCCACTCCATCGAGCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGT-3’(SEQID No.3)；

反向内侧引物BIP：

5’-CTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGCTAGTAACTCAGCAGCATCT-3’(SEQID No.4)；以及

用于封闭野生型BRAF的肽核酸序列PNA：

5’-GCTACAGTGAAATCTC-3’(SEQ ID No.5)。

本发明的第二个目的在于提供一种BRAF基因突变检测的试剂盒，所述检测的试剂盒包括上述的引物和肽核酸序列。

进一步地，所述检测的试剂盒中还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。

进一步地，所述检测的试剂盒中还包括用于显示体系颜色的指示剂。

优选地，所述指示剂为羟基萘酚蓝，羟基萘酚蓝的浓度为120μM。

进一步地，所述检测的试剂盒中还包括添加剂。

优选地，所述添加剂为甜菜碱，甜菜碱的浓度为0.8M。

优选地，所述缓冲液包括Tris-HCl 20mM，KCl 50mM，(NH₄)₂SO₄ 10mM，MgSO₄8mM，Tween-20 0.1％(体积分数)。

优选地，所述检测的试剂盒中F3和B3的浓度相同，均为0.2μM，FIP和BIP的浓度相同，均为1.6μM，PNA的浓度为0.4μM。

优选地，所述检测的试剂盒中dNTP的浓度为1.4mM，Bst聚合酶的浓度为8U。

本发明的第三个目的在于提供一种BRAF基因突变检测的方法，其使用上述检测的试剂盒，包括如下步骤：

一、取石蜡包埋样本，用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒提取DNA作为检测的模板；

二、采用PNA Clamp LAMP技术，对模板进行LAMP反应，将模板加入到反应体系中，于60℃下反应，之后升温至80℃保持20min进行灭活处理，之后降温，观察体系颜色变化即可。

进一步地，所述反应时间为60～80min。

在本发明的反应体系中，当体系中存在指示剂时，当选用羟基萘酚蓝作为指示剂时，反应前体系中的镁离子与dNTP螯合，体系呈现紫罗兰色；当有阳性反应时，镁离子与副产物焦磷酸形成沉淀，溶液pH发生改变，颜色逐渐由紫罗兰色变为天蓝色。因此，观察反应体系颜色的变化就可以直接判定是否发生扩增反应。

本发明具有的优点和积极效果是：

本发明采用PNA Clamp LAMP技术，将PNA与LAMP法结合，利用PNA将相应的等位基因“封闭”，从而使得LAMP反应无法继续；而当检测样本中存在另外一个或者几个等位基因时，PNA由于不能有效对其进行“封闭”，使得LAMP反应得以顺利进行，以此达到检测目的基因是否发生突变的目的。

与现有技术相比，PNA Clamp LAMP法具有如下有益效果：

(1)步骤简单：LAMP法本身对模板的要求并不严格，只需反应体系配置完毕后放置在恒温水浴锅中进行反应扩增即可，不需要预先进行双链DNA的变性及类似于PCR循环反应中的反复变性、退火、延伸等变温过程；

(2)高特异性：扩增的特异性很高，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否；

(3)扩增反应快速、高效：整个扩增2h内即可完成，且产率高；

(4)鉴定简便：反应完成后通过肉眼观察颜色变化即可判定结果，结果的观察可以脱离凝胶成像的操作要求和仪器限制；

(5)成本低廉：整个检测反应仅需要水浴锅就可开展，无需任何其他检测设备。

附图说明

图1-图2分别是检测样本M1和M3用PCR测序分型得到的测序图谱。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

一种BRAF基因突变检测的引物组合物，包括：

正向外侧引物F3：

5’-TCAGATATATTTCTTCATGAAGACC-3’(SEQ ID No.1)；

反向外侧引物B3：

5’-AGTTGAGACCTTCAATGACTT-3’(SEQ ID No.2)；

正向内侧引物FIP：

5’-ATGGGACCCACTCCATCGAGCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGT-3’(SEQID No.3)；

反向内侧引物BIP：

5’-CTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGCTAGTAACTCAGCAGCATCT-3’(SEQID No.4)；以及用于封闭野生型BRAF的肽核酸序列PNA：

5’-GCTACAGTGAAATCTC-3’(SEQ ID No.5)。

一种BRAF基因突变检测的试剂盒，所述检测的试剂盒包括上述的引物和肽核酸序列，还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶、超纯水、羟基萘酚蓝和甜菜碱，检测的试剂盒中F3和B3的浓度相同，均为0.2μM，FIP和BIP的浓度相同，均为1.6μM，PNA的浓度为0.4μM，dNTP的浓度为1.4mM，缓冲液包括Tris-HCl 20mM，KCl 50mM，(NH₄)₂SO₄ 10mM，MgSO₄ 8mM，Tween-20 0.1％(体积分数)，Bst聚合酶的浓度为8U，羟基萘酚蓝的浓度为120μM，甜菜碱的浓度为0.8M。

一种BRAF基因突变检测的方法，其使用上述检测的试剂盒，具体为：取石蜡包埋样本，用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒提取DNA作为检测的模板；采用PNA ClampLAMP技术，对模板进行LAMP反应，将模板加入到反应体系中，于60℃下反应，之后升温至80℃保持20min进行灭活处理，灭活处理使得体系中的酶失活，防止体系放置时间长时发生非特异性扩增，之后降至室温，观察体系颜色变化。作为优选地，所述反应时间为60～80min。

具体实施时，取1份直肠癌的石蜡包埋样本，经HE染色排除掉癌旁组织后，用天根或其他公司的石蜡包埋组织DNA提取试剂盒提取出DNA，编号为M1(其反应终浓度为1.1ng/μL)，以水代替模板的阴性对照记为M2，另有一个已知BRAF的1799T>A突变的质粒作为阳性对照，记为M3，实际操作中，将M3稀释两万倍后做模板，在反应体系中其终浓度为4pg/μL。

利用检测的试剂盒对模板Mn(n为组别编号，1-3)进行检测，作为一种实施方式，试剂盒的反应体系选为25μL，其内的组分和含量如下表1所示：

表1反应体系的组分和含量

对模板Mn进行LAMP反应，将模板Mn分别加入到反应体系中，于60℃下反应60min，之后升温至80℃保持20min进行酶灭活处理，之后降温，观察体系颜色变化。

反应按照上述的检测方法进行，反应前，体系颜色均为紫罗兰色，反应后，各组别反应体系的颜色及基因型判断如下表2所示：

表2各组别反应体系的颜色及基因型判断

编号	反应体系颜色	是否携带BRAF突变
			M1	紫罗兰色	否
M2	紫罗兰色	否
			M3	天蓝色	是

为进一步验证反应的准确性，将上述2个实验组别的模板M1和M3分别用PCR测序法进行分型，得到的测序图谱参见图1和图2。

对比基因测序图谱和本发明提供的检测的试剂盒的检测结果可知，二者的检测吻合率100％，验证了本发明的结果精确。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (12)

1.一种BRAF基因突变检测的引物组合物，其特征在于：包括：

正向外侧引物F3：

5’-TCAGATATATTTCTTCATGAAGACC-3’(SEQ ID No.1)；

反向外侧引物B3：

5’-AGTTGAGACCTTCAATGACTT-3’(SEQ ID No.2)；

正向内侧引物FIP：

5’-ATGGGACCCACTCCATCGAGCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGT-3’(SEQID No.3)；

反向内侧引物BIP：

5’-CTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGCTAGTAACTCAGCAGCATCT-3’(SEQID No.4)；以及

用于封闭野生型BRAF的肽核酸序列PNA：

5’-GCTACAGTGAAATCTC-3’(SEQ ID No.5)。

2.一种BRAF基因突变检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物和肽核酸序列。

3.根据权利要求2所述的BRAF基因突变检测的试剂盒，其特征在于：还包括dNTP、缓冲液、Bst聚合酶和超纯水。

4.根据权利要求3所述的BRAF基因突变检测的试剂盒，其特征在于：还包括用于显示体系颜色的指示剂。

5.根据权利要求4所述的BRAF基因突变检测的试剂盒，其特征在于：所述指示剂为羟基萘酚蓝，羟基萘酚蓝的浓度为120μM。

6.根据权利要求3所述的BRAF基因突变检测的试剂盒，其特征在于：还包括添加剂。

7.根据权利要求6所述的BRAF基因突变检测的试剂盒，其特征在于：所述添加剂为甜菜碱，甜菜碱的浓度为0.8M。

8.根据权利要求3-7中任一项所述的BRAF基因突变检测的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液包括Tris-HCl 20mM，KCl 50mM，(NH₄)₂SO₄ 10mM，MgSO₄ 8mM，Tween-20 0.1％(体积分数)。

9.根据权利要求3-7中任一项所述的BRAF基因突变检测的试剂盒，其特征在于：F3和B3的浓度相同，均为0.2μM，FIP和BIP的浓度相同，均为1.6μM，PNA的浓度为0.4μM。

10.根据权利要求3-7中任一项所述的BRAF基因突变检测的试剂盒，其特征在于：dNTP的浓度为1.4mM，Bst聚合酶的浓度为8U。

11.一种BRAF基因突变检测的方法，使用权利要求3-10任一所述检测的试剂盒，其特征在于：包括如下步骤：

一、取石蜡包埋样本，用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒提取DNA作为检测的模板；

二、采用PNA Clamp LAMP技术，对模板进行LAMP反应，将模板加入到反应体系中，于60℃下反应，之后升温至80℃保持20min进行灭活处理，之后降温，观察体系颜色变化即可。

12.根据权利要求11所述的BRAF基因突变检测的方法，其特征在于：所述反应时间为60～80min。