CN103114133A - 一种用于检测c-kit基因突变的探针、引物及检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测C-KIT的引物、探针及试剂盒。本发明主要包括以下序列：SEQ ID NO1-SEQ ID NO3。本发明采用特异引物和探针技术，建立了用于检测C-KIT基因突变的实时荧光PCR体系。该方法（1）灵敏度高，可检出5-10拷贝的突变DNA；（2）特异性强，10ng的野生型基因组DNA不会产生非特异性信号；（3）检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。

Description

一种用于检测C-KIT基因突变的探针、引物及检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种C-KIT基因突变的检测探针、引物及试剂盒。

背景技术

C-KIT是一种原癌基因，位于染色体4q11-12基因全长约80kb。C-KIT编码的C-KIT蛋白属于III型受体酪氨酸激酶家族成员，其分子量约为145KD的跨膜蛋白，包含了胞内的酪氨酸激酶区，跨膜区和配体结合位点胞外区。当配体与其结合后能激活自身酪氨酸蛋白激酶活性，通过一系列反应激活下游信号转导通路，从而调节细胞的生长与增殖。

格列卫（Gleevec）是针对C-KIT开发的一种靶向药物，通过结合Kit蛋白胞浆内酪氨酸激酶功能区的ATP位点，阻断磷酸基团由ATP向底物酪氨酸残基的转移，从而抑制肿瘤细胞的增殖和分化。胃肠道间质瘤（GIST）是消化道最常见的间叶源性肿瘤。绝大部分的GIST均存在CKIT基因突变，从而使Kit蛋白的活化不需要通过配体激活就能刺激肿瘤细胞的持续增殖和抗凋亡信号的失控。

研究表明，在GIST患者中C-KIT基因突变率约为90%，C-KIT的突变位点主要位点位于17外显子Asp816Val的突变，其中第9外显子Ala502-Tyr503的突变约占5-10%。临床研究表明GIST中C-KIT基因的突变情况与靶向药物格列卫的疗效密切相关：存在外显子17的D816V的突变患者的疗效较差，表明C-KIT的突变会导致肿瘤患者对D816V的靶向药物治疗产生耐药性。因此，在实施化疗之前，通过快速的方法对C-KIT基因突变的检测可延长患者生存期，指导患者的合理用药，避免过度化疗，指导临床科学用药具有重要的参考价值。

目前DNA直接测序法检测为C-KIT基因突变的检测主要方法。然而，直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20-30%，低灵敏度的检测会导致漏检及假阴性的发生。此外，直接测序法实验操作复杂，检测效率低、样品易污染、检测时间长，无法满足临床检测的实际需求，临床迫切需要开发一种高灵敏度，快速的C-KIT基因突变检测技术，以实现采用高灵敏度检测方法对C-KIT基因突变进行检测，从而为临床肿瘤的个体化治疗方案提供科学参考。

本发明开发一种快速，高灵敏、操作简便的C-KIT基因突变检测试剂盒及检测方法。该检测方法灵敏度高，检测时间只需90分钟即可完成，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于C-KIT基因突变检测的引物和探针，通过对其突变的检测可以用于GIST化疗预后，其特异引物与探针包括如下序列：

KF:CATCGCCATACTCATGCTCG                SEQNO1

KR:TAATTAGAATGACCTTGATGA               SEQNO2

KP:FAM-CGGCTAGACGATATCACATATC-BHQ1     SEQNO3

本发明另一方面提供一种用于检测C-KIT基因突变检测试剂盒，其PCR反应扩增体系如下：

1×PCR缓冲液

本发明另一方面提供一种用于检测C-KIT基因突变方法，其方法包括以下步骤：

(1)根据COSMIC数据公布的人类C-KIT为野生型基因序列，针对C-KIT的突变点，设计特异性引物和探针。

(2)提取检测样本中基因组DNA，检测样本包括新鲜病理组织、全血和血浆等组织中的DNA。

(3)配制实时荧光PCR扩增反应体系。

(4)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：检测反应体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31：阴性；Ct值小于31：阳性。

本发明的有益效果是：本发明采用了特异性引物和探针技术，可以特异性检测C-KIT基因突变。此方法：（1）建立了实时PCR体系实现对C-KIT基因D816V快速检测；（2）灵敏度高，5-10拷贝的突变可以检出；（3）特异性强，10ng的野生型基因组DNA不会产生非特异性信号；（4）检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。（5）稳定率高。对于PCR来说，通常肿瘤细胞C-KIT的突变的模板序列的绝对数并不高；而当拷贝数低于1000，引物和探针杂交效率陡然下降，稳定检出并不容易。因此，需要引物有较高的单次杂交效率，以便能够有效启动延伸反应，在本发明的实施例中，多次检测结果表明，设计的引物和探针和传统测序的结果符合率为100%，可以稳定检出。

附图说明

图1为实施例检测阴性样本PCR图。

图2为实施例检测突变阳性样本PCR图。

具体实施方式

本发明以野生型细胞系基因组为DNA模板，建立C-KIT实时荧光PCR检测反应体系，针对突变位点设计特异引物和探针，检测C-KIT基因突变的方法包括以下步骤：

（1）针对突变位点设计合成特异性引物和探针

根据COSMIC数据库公布的C-KIT基因序列为野生型序列，针对C-KIT基因突变位点设计特异引物和探针。通过特异性引物和探针优化，实现高灵敏和快速检测。设计的引物和探针序列如表1所示。

（2）检测样本处理与DNA的提取

检测样本包括新鲜病理组织，石蜡包埋组织、全血、血浆和胸腔积液。对于鲜病理组织和石蜡组织样品，样品切成5-10μm，加入1mL二甲苯脱蜡，离心收集沉淀，加入1mL无水乙醇到沉淀中，室温或37℃晾干，加入蛋白酶K和BufferATL，56℃消化裂解1小时，90℃孵化1h，加入200mL Buffer AL混匀再加入200μL无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA2mL离心柱中，6000×g（8000rpm）离心1min，加入500μLBuffer AW1，6000×g（8000rpm）离心1min，小心打开盖子加入500μLBuffer AW2,6000×g（8000rpm）离心1min，空管离心20000×g（14000rpm）离心3min，加入100μLBuffer ATE于膜中央，温育5分钟，20000×g（14000rpm）离心1min。对于全血、血浆和胸腔积液，其体积不少于800μL,使用TIANGEN的DNA提取试剂盒提取基因组DNA。提取具体操作步骤按试剂盒操作说明进行操作。

所提DNA溶于Tris-HCl中（10mmol/L,PH8.0），经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl溶液调整DNA浓度到2ng/μL作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。

（2）建立PCR扩增反应体系

应用上述设计的探针和引物，取5μL提取的DNA作为反应模板，采用如下PCR反应体系进行扩增，PCR扩增反应体系为：

1×PCR缓冲液

实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环。后31个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。

(4)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：

检测反应体系的FAM荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31：阴性；Ct值小于31：阳性。

以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。

实施例1

本实施例以基因工程构建的质粒为阳性质粒，利用本发明实时荧光PCR检测C-KIT基因D842V突变的方法包括如下步骤：

(1)检测样本DNA提取

将样本加入1mL二甲苯脱蜡，离心收集沉淀，加入1mL无水乙醇到沉淀中，室温或37℃晾干，加入蛋白酶K和Buffer ATL，56℃消化裂解1小时，90℃孵化1h，加入200mL Buffer AL混匀再加入200μL无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA2mL离心柱中，6000×g（8000rpm）离心1min，加入500μLBufferAW1，6000×g（8000rpm）离心1min，小心打开盖子加入500μLBuffer AW2,6000×g（8000rpm）离心1min，空管离心20000×g（14000rpm）离心3min，加入100μLBuffer ATE于膜中央，温育5分钟，20000×g（14000rpm）离心1min。

所提DNA溶于Tris-HCl中（10mmol/L,PH8.0），经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl溶液调整DNA浓度到2ng/μL作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。

（2）建立PCR反应体系

应用上述设计的探针和特异引物，取5μL提取的DNA作为反应模板，采用如下PCR反应体系进行扩增，PCR扩增反应体系为：

1×PCR缓冲液

实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环。后31个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。

(3)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果

根据Ct值作为结果判断的标准：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31：阴性；Ct值小于31：阳性。

灵敏度分析：取定量后浓度为1000个拷贝的样品DNA，进行10倍梯度稀释，共做3个稀释梯度，每次反应加入5μL，8个平行进行扩增反应。结果表明，本发明灵敏度可以检测到5-10拷贝/μL。

检测结果表明，本发明的检测体系可以准确检测突变质粒基因，检测的灵敏度可达到5-10拷贝/μL。

实施例2

运用本发明检测临床样本，取我公司临床胃肠道间质瘤样本共90例，男性40例，女性50例，年龄为30-72岁，平均年龄为50岁。利用本发明实时荧光PCR体系检测90例临床样本C-KIT基因突变步骤如下。

(1)检测样本DNA提取

检测样本包括新鲜病理组织，石蜡包埋组织、全血、血浆和胸腔积液。对于鲜病理组织和石蜡组织样品，样品切成5-10μm，加入1mL二甲苯脱蜡，离心收集沉淀，加入1mL无水乙醇到沉淀中，室温或37℃晾干，加入蛋白酶K和BufferATL，56℃消化裂解1小时，90℃孵化1h，加入200mL Buffer AL混匀再加入200μL无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA2mL离心柱中，6000×g（8000rpm）离心1min，加入500μLBuffer AW1，6000×g（8000rpm）离心1min，小心打开盖子加入500μLBuffer AW2,6000×g（8000rpm）离心1min，空管离心20000×g（14000rpm）离心3min，加入100μLBuffer ATE于膜中央，温育5分钟，20000×g（14000rpm）离心1min。对于全血、血浆和胸腔积液，其体积不少于800μL,使用TIANGEN的DNA提取试剂盒提取基因组DNA。提取具体操作步骤按试剂盒操作说明进行操作。

所提DNA溶于Tris-HCl中（10mmol/L,PH8.0），经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl溶液调整DNA浓度到2ng/μL作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。

（2）建立PCR反应体系

应用上述设计的探针和特异引物，取5μL提取的DNA作为反应模板，采用如下PCR反应体系进行扩增，PCR扩增反应体系为：

1×PCR缓冲液

实时PCR反应条件是95℃预变性5分钟，1个循环；95℃变性25秒,64℃退火20秒,72℃延伸20秒，15个循环；93℃变性25秒,60℃退火35秒,72℃延伸20秒,31个循环。后31个循环在退火时检测FAM和HEX荧光信号。

(3)根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果

根据Ct值作为结果判断的标准：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果：以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或31：阴性；Ct值小于31：阳性。

在所检测的90例GIST的临床样本中，C-KIT的突变率为83%。同时采用直接测序法进行对比检测，结果表明本发明体系与直接测序法的符合率达到100%，进一步证明了本发明体系检测的准确性，结果见表2。本发明荧光PCR反应体系可检测C-KIT D816V突变，检测方便快捷，准确性高，可满足C-KIT基因突变快速检测。该荧光PCR方法和传统测序方法结果的符合率为100%，荧光PCR灵敏度和选择性检测能力高于传统测序方法。

表1引物和探针序列表

KF:CATCGCCATACTCATGCTCG               SEQNO1

KR:TAATTAGAATGACCTTGATGA              SEQNO2

KP:FAM-CGGCTAGACGATATCACATATC-BHQ1    SEQNO3

表2荧光PCR方法与传统测序方法比较

Claims (4)

1.用于检测C-KIT基因突变的引物和探针，其特征在于，包括以下序列：SEQ IDNO1-SEQ ID NO3。

2.用于检测C-KIT基因突变的试剂盒，其特征在于，包括以下序列：SEQ ID NO1-SEQ ID NO3。

3.如权利要求2所述的检测C-KIT基因突变的检测试剂盒，其特征在于：包括如下荧光PCR的反应体系：

1×PCR缓冲液

4.如权利要求2所述的C-KIT基因突变检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

(1)提供权利要求1所述的引物和探针序列；

(2)待测样品的处理和模板DNA的提取；

(3)配制荧光PCR扩增反应体系；

(4)用步骤（1）的引物和探针扩增待测基因突变靶序列；

检测反应体系的FAM和HEX荧光强度，以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值大于或等于31为阴性；Ct值小于31为阳性。

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