CN106676165A - Kit基因突变检测试剂盒 - Google Patents

Kit基因突变检测试剂盒 Download PDF

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CN106676165A CN201610866568.0A CN201610866568A CN106676165A CN 106676165 A CN106676165 A CN 106676165A CN 201610866568 A CN201610866568 A CN 201610866568A CN 106676165 A CN106676165 A CN 106676165A
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郑焱
陈佩璇
徐锋
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

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Abstract

本发明提供一种KIT基因突变检测试剂盒，包括：（1）用于扩增样本中KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1‑10；（2）用于测序PCR的测序引物，用于对KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子进行测序分析，引物序列是SEQ ID Nos：11‑15；（3）5个装有KIT野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管。本试剂盒中不同外显子的PCR扩增条件一致，能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。

Description

KIT基因突变检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，具体涉及一种肿瘤相关基因KIT基因突变检测试剂盒。
背景技术
胃肠道间质瘤（GIST）是消化道最常见的间叶源性肿瘤。绝大部分的GIST均表达c-kit基因编码的Kit蛋白（CD117），c-kit基因位于人染色体4q12-13，属于原癌基因，其产物是Ⅲ型酪氨酸激酶。在分子层面上，大部分的GIST均存在c-kit基因突变，从而导致kit蛋白的活化不需要配体SCF参与就能刺激肿瘤细胞的持续增殖和抗凋亡信号的失控。
格列卫（Glivec）是一种酪氨酸激酶抑制剂，经FDA批准可用于治疗c-kit阳性、不能手术切除和/或转移性的恶性GIST，其临床疗效令人振奋。其作用机理在于药物结合于Kit蛋白胞浆内酪氨酸激酶功能区的ATP结合位点，阻断磷酸基团由ATP向底物酪氨酸残基的转移，从而抑制细胞增殖并恢复细胞凋亡程序。
GIST中c-kit基因突变率约为90%，且突变形式多样。其中位于11号外显子Lys550-Val560区段的变异最为常见（约占70-80%），位于9号外显子Ala502-Tyr503区段的6碱基重复突变约占5-10%。临床研究表明GIST中c-kit基因的突变情况与格列卫分子靶向治疗的疗效相关：存在11号外显子突变患者的疗效最好，存在9号外显子突变的患者疗效次之，而野生型GIST的疗效最差。另外，对于9号外显子突变的患者，提高用药剂量可显著提高疗效。检测c-kit基因突变对于指导GIST患者的合理用药，具有重要的参考价值。
另外，c-kit的配体为干细胞生长因子。c-kit受体正常表达于造血干/祖细胞，在急性淋巴细胞白血病中极少或不表达，而在急性髓性白血病(AML)中则表达较高，但在AML的各亚型表达不尽一致，因而c-kit受体检测有助于急性白血病(AL)的分类诊断和分型诊断。c-kit在原发性AML患者的表达高于MDS转变的AML，因此，c-kit检测有助于两种不同AML的鉴别诊断。SCF/c-kit诱导的细胞凋亡耐受与AML患者化疗疗效差有关，抗c-kit单抗可逆转AL细胞对化疗的凋亡耐受，这为难治性AML的治疗提供了新的思路。
KIT基因突变的检测主要有Sanger测序法、ARMS、RT-PCR等。其中RT-PCR技术采用等位基因特异性扩增法对样本的基因突变进行区分，该方法成本较低，但检测率较高，容易出现假阴性结果；ARMS技术是目前国内应用最为广泛的技术，但只能检测已知的位点，且要将样本分成多个管进行实验才能实现分型，对样本量要求高；而Sanger测序法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准，其主要优点是测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。所以探索一种可以采用Sanger测序法检测KIT基因的技术具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种KIT基因突变检测试剂盒，可直接利用含人体某组织部位的石蜡包埋样本通过Sanger测序法检测出样本中KIT基因主要突变位点型别，检测位点包括KIT基因9、11、13、14和17五个外显子的主要突变位点，包括但不限于9号外显子上c.1509 1510insGCCTAT突变位点；11号外显子上c.1648 1680del缺失突变位点；13号外显子上c. 1961T>C突变位点；14号外显子上c. 2009C>T突变位点，17号外显子上c. 2247A>T突变位点。
本发明的KIT基因突变检测试剂盒具体包括：
（1）用于扩增样本中KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子的特异性引物，具体序列如下:
（2）用于测序PCR的测序引物，分别用于对KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子进行测序分析，具体序列如下：
外显子 名称 序列号 Reverse 5’-3’
9 SEQ-K9 SEQ ID No.11 AGCCAGGGCTTTTGTTTTCT
11 SEQ-K11 SEQ ID No.12 AAACAAAGGAAGCCACTGGA
13 SEQ-K13 SEQ ID No.13 GTTCCTGTATGGTACTGCATGCG
14 SEQ-K14 SEQ ID No.14 TCTCACCTTCTTTCTAACCTTTTCTT
17 SEQ-K17 SEQ ID No.15 TTTGACTGCTAAAATGTGTGA
3）5个装有KIT野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒包括9号外显子上c.1509 1510insGCCTAT突变位点；11号外显子上c.1648 1680del缺失突变位点；13号外显子上c. 1961T>C突变位点；14号外显子上上c. 2009C>T突变位点；17号外显子上c. 2247A>T突变位点；PCR反应预混液由以下组份组成：
组份 体积（μl）
10 PCR buffer 2.5
5 Q solution 5
25mM MgCl2 2.5
25mM dNTPs 0.4
H2O 9.35
其中10× PCR buffer中含有500 mM KCl，100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM (NH4)2SO4，和15 mM MgCl2；5× Q solution 中含有1M Tricine [pH8.7(with KOH)]，8% (v/v)Glycerol和5% (v/v) DMSO；25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和25mM dGTPs。
本试剂盒主是根据KIT基因的Exon9、11、13、14和17五个外显子的保守序列分别设计KIT基因四个外显子的特异性引物，分别将Exon9、11、13、14和17号外显子使用PCR的方法进行扩增，纯化回收扩增产物。本发明的各种引物长度在20-25个碱基之间，无特殊修饰。反应液预混液采用独特的配方及比例。不同外显子的PCR扩增条件一致，且能在样本浓度较低时检测到目的基因，结果无非特异性扩增。具体操作流程包括：
（1）引物设计：利用引物设计软件，如Primer Premier 5，从KIT基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQ ID NOs：1-15。长度在20-25个碱基左右
（2）PCR扩增：利用试剂盒中含特定序列的引物PCR扩增临床样本中的DNA。
（3）琼脂糖凝胶电泳及胶回收：将扩增得到的目的基因KIT的Exon9、11、13、14和17五个外显子片段回收用于测序。
附图说明
以下是附图的说明，以便于理解上述发明的目的和具体特征。
图1为 KIT基因的Exon9、11、13、14和17五个外显子的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
图1中各标号的具体表示如下：
1：1号样本；2：2号样本；3：3号样本；9：KIT基因第9号外显子；11：KIT基因第11号外显子；13：KIT基因第13号外显子；14：KIT基因第14号外显子；17：KIT基因第17号外显子；M：DNAmaker，从上到下大小依次为2000、1000、750、500、250和100。
图2-1为KIT基因的Exon9外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。
图2-2为KIT基因的Exon9外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。
图2-3为KIT基因的Exon11外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。
图2-4为KIT基因的Exon11外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。
图2-5为KIT基因的Exon13外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。
图2-6为KIT基因的Exon13外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。
图2-7为KIT基因的Exon14外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。
图2-8为KIT基因的Exon14外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。
图2-9为KIT基因的Exon17外显子的测序结果截图，测序结果为野生型。
图2-10为KIT基因的Exon17外显子的测序结果截图，测序结果为突变体。
具体实施方式
1、引物设计
根据KIT基因在肺癌等疾病中的突变情况及个体化治疗后产生的耐药机制，利用引物设计软件，如Primer Premier 5，从KIT基因DNA序列中挑选特定的序列，然后根据碱基互补特点，设计KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子的特异性引物，用于扩增样本中DNA。引物序列分别是SEQ ID Nos：1-10。
测序引物的设计与用于扩增样本中DNA的特异性引物的设计类似，不过测序引物只需要一段即可，引物序列分别是SEQ ID Nos：11-15。长度在20-25个碱基。
2、PCR扩增
2.1、质控品准备
阳性质控品为KIT野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的混合物，阴性质控品为无菌水。使用前室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。
2.2、试剂配制
提前将试剂取出，室温融化，旋涡振荡10秒，瞬时离心10秒。
确定反应数N，N=待检样本数（n）×5+质控品数+1。计算加到反映混合物中的各个试剂的量，计算如下：
组分 PCR mix 3（即PCR反应预混液） Taq酶
体积（μl） 19.75×N 0.25×N
取一个灭菌离心管配制上述反应体系，试剂全部加入后旋涡振荡10秒，瞬时离心。然后将上述混合液按20μl/管分装至PCR反应管中。
2.3、加样
将KIT阳性质控品、阴性质控品和样本DNA分别取2.5 μl加入到PCR反应管中，其中样本要稀释至20ng/μl；然后再将相应的引物加入到对应的PCR反应管中，每个样本需要引物各加1.25μl（引物用之前先稀释1/10至10µM），同时作好标记，盖紧管盖后，瞬时离心15秒，将管壁上的液体全部甩至管底，消除气泡，可重复离心至气泡完全消除。然后立即进行PCR扩增反应。
2.4、PCR扩增
配置完成后，将PCR管放入PCR仪进行反应，PCR反应程序如下：
3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳及回收
由于PCR产物长度较短，配制2%（w/w）的琼脂糖凝胶；电泳条件为120V，20min。电泳完成后，取出凝胶，使用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，并记录扩增条带情况。如果PCR产物电泳结果良好，即可回收目的片段用于测序。回收得到的产物即可用于测序。
序列表
<110> 广州凯普医药科技有限公司
<120> KIT基因突变检测试剂盒
<160> 15
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KITEx9-F
<400> 1
agccagggct tttgttttct 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KITEx9-R
<400> 2
cagagcctaa acatcccctt a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KITEx11-F
<400> 3
cctttgctga ttggtttcgt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KITEx11-R
<400> 4
aaacaaagga agccactgga 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KITEx13-F
<400> 5
gttcctgtat ggtactgcat gcg 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KITEx13-R
<400> 6
cagtttataa tctagcattg cc 22
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KITEx14-F
<400> 7
tctcaccttc tttctaacct tttctt 26
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KITEx14-R
<400> 8
aacccttatg accccatgaa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KITEx17-F
<400> 9
tttcttttct cctccaacct 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KITEx17-R
<400> 10
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<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ-K9
<400> 11
agccagggct tttgttttct 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ-K11
<400> 12
aaacaaagga agccactgga 20
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ-K13
<400> 13
gttcctgtat ggtactgcat gcg 23
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ-K14
<400> 14
tctcaccttc tttctaacct tttctt 26
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ-K17
<400> 15
tttgactgct aaaatgtgtg a 21

Claims (3)

1.用于KIT基因突变检测的Exon9、11、13、14和17五个外显子的引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1-15。
2.KIT基因突变检测试剂盒，包括：
（1）用于扩增样本中KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子的特异性引物，引物序列分别是SEQ ID Nos：1-10；
（2）用于测序PCR的测序引物，用于对KIT基因Exon9、11、13、14和17五个外显子进行测序分析，引物序列是SEQ ID Nos：11-15；
（3）5个装有KIT野生型质粒和突变型质粒按1:1质量比例混合的阳性质控品管和1个装有PCR反应预混液的试管；其中突变型质粒包括9号外显子上c.1509 1510insGCCTAT突变位点；11号外显子上c.1648 1680del缺失突变位点；13号外显子上c. 1961T>C突变位点；14号外显子上上c. 2009C>T突变位点；17号外显子上c. 2247A>T突变位点。
3.权利要求2所述试剂盒，其特征在于，PCR反应预混液由以下组份组成：
组份 体积（μl） 10 PCR buffer 2.5 5 Q solution 5 25mM MgCl2 2.5 25mM dNTPs 0.4 H2O 9.35
其中10× PCR buffer中含有500 mM KCl，100 mM Tris-HCl (pH 8.3)，100 mM (NH4)2SO4，和15 mM MgCl2；5× Q solution 中含有1M Tricine [pH8.7(with KOH)]，8% (v/v)Glycerol和5% (v/v) DMSO；25mM dNTPs中含有25mM dATPs、25mM dTTPs、25mM dCTPs和25mM dGTPs。
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