CN105803088A

CN105803088A - 一组检测Kras基因突变的引物和探针及其试剂盒

Info

Publication number: CN105803088A
Application number: CN201610284206.0A
Authority: CN
Inventors: 邹鸿志; 牛智通
Original assignee: Guangzhou Kangliming Biological Science & Technology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Kangliming Biotechnology Co ltd
Priority date: 2016-04-29
Filing date: 2016-04-29
Publication date: 2016-07-27
Anticipated expiration: 2036-04-29
Also published as: WO2017185767A1; CN105803088B

Abstract

本发明公开了一组检测Kras基因突变的引物和探针及其试剂盒。包括针对检测7种Kras基因突变型的前向引物、反向引物和探针；前向引物分别为34A‑Rev‑Fp10、35A‑Rev‑Fp4、38A‑Rev‑Fp13、34C‑Rev‑Fp、34T‑Rev‑Fp、35C‑Rev‑Fp、35T‑Rev‑Fp，反向引物均为Kras‑Rev‑Rp，探针分别为34A‑Rev‑Pb4、35A‑Rev‑Pb2、38A‑Rev‑Pb3、34C‑Rev‑Pb、34T‑Rev‑Pb、35C‑Rev‑Pb、35T‑Rev‑Pb。本发明对Kras基因突变的检测灵敏度和准确性高，特异性好，可分别或同时检测7种不同的突变类型。

Description

一组检测Kras基因突变的引物和探针及其试剂盒

技术领域

本发明属于基因检测技术领域。更具体地，涉及一组检测Kras基因突变的引物和探针及其试剂盒。

背景技术

RAS基因最早发现于上世纪八十年代初，首先从人膀胱癌细胞系中分离出的一种转化基因，可使NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞系)发生恶性转化，而从正常人组织中提取的DNA则无此种作用。RAS基因在进化中相当保守，广泛存在于各种真核生物如哺乳类，果蝇，真菌，线虫及酵母中，提示它有重要的生理功能。

RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——Hras、Kras和Nras，分别定位在11、12和1号染色体上。Kras因编码21kD的RAS蛋白又名p21基因。在RAS基因中，Kras对人类癌症影响最大。Kras基因就像体内一个“开关”：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。因此，Kras基因在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用，正常的Kras基因可抑制肿瘤细胞生长，而一旦Kras基因发生突变，它就会持续刺激细胞生长，使细胞内信号传导紊乱，打乱生长规律，细胞增殖失控而癌变，从而导致肿瘤的发生。在不同的癌症当中存在不同的Kras基因突变的比例：胰腺癌90％、结肠癌50％、肺癌30％、卵巢癌15％、甲状腺癌50％、膀胱癌6％左右；另外，红斑性狼疮(SLE)、乳腺癌、肝癌、皮肤癌、类风湿性关节炎(RA)、肾癌及某些的白血病(Leukemia)等都有较高的Kras基因突变水平。也有研究表明，Kras基因突变发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的Kras基因高度保持一致。一般认为，Kras基因状态不会因治疗而发生变化。因此，Kras基因突变的及时检测具有很大的意义，检测Kras基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后、放化疗疗效的重要指标。

另外，随着人类医学和药物研究水平的提高，药理遗传学(Pharmacogenetics)日渐兴起。研究表明，药物在体内的代谢、药物治疗的有效性以及副反应、甚至患者的预后都存在个体差异，受患者基因背景的影响。因此，应用药理遗传学，在基因水平上研究药物作用的个体差异，使得个性化治疗这一新一代医学概念成为可能。对药物作用相关基因的检测，可指导医生对患者准确施药，规避药物副作用，同时提高病人乃至社会的医疗费用效率。近年来推向市场的一些肿瘤靶向治疗的主流药物，都相继在其临床试验中建立和确认了相应的预测疗效的基因生物标记物。Kras基因是目前确认的肿瘤靶向治疗药物的重要基因标记物之一。Kras蛋白是EGFR(表皮生长因子受体)信号传导通路中的一个关键的下游调节因子，参与细胞生长的调节，在癌变发生过程中起着重要作用。肿瘤患者Kras基因突变与否显著影响EGFR靶向治疗药物的疗效。最新的临床研究表明，当患者本身不存在Kras基因突变，服用有关靶向治疗药物，能获得明显的治疗效果。例如非Kras基因突变的结直肠癌患者，可受益于Cetuximab和Panitumumab等EGFR抗体药物；另外对非Kras基因突变的晚期非小细胞肺癌患者使用Gefitinib和Erlotinib等EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)类药物，能明显提高靶向治疗的疗效。美国癌症综合网络(NCCN)提出肿瘤患者接受EGFR靶向药物治疗之前，必须进行Kras基因突变检测，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。Kras基因突变检测已被NCCN列为《结肠癌临床治疗指南》与《直肠癌临床治疗指南》临床用药必检项目。

综上所述，Kras基因突变的检测对深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后、放化疗疗效的评价、指导用药具有重要的意义。

目前，Kras基因突变的检测方法主要是ARMs-qPCR和HRM。(1)ARMs-qPCR：扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)也就是常说的等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,ASPCR)，用于对已知突变基因或者基因多态性进行检测。该方法的核心是三条引物的设计，此处的三条引物一般包含两条正向引物和一条公用的反向引物；而这两条正向引物的区别在于引物的3’末端的碱基不同，也就是等位基因或者已知突变的突变碱基和野生碱基，因为Taq DNA聚合酶没有校正活性，且一般只有引物3’端完全和模板互补时才能有效发生扩增反应。所以可以将两条正向引物分别和反向引物配置成反应体系(一个位点需要两个反应)，这样可以结合荧光定量PCR的高灵敏度特性有效的监测两个反应的是否存在扩增，也就可以判断是否突变或确定基因型。然而上述的都是理论上的假设，假如引物其他参数都符合要求(如GC含量、Tm值、无发夹结构等)，单单因为3’末端的碱基不同，使得Taq DNA聚合酶起始扩增的效率不同，换句话说当3’末端为T时，就算不匹配，可能发生扩增的概率大于3’末端为A时的引物，这样就产生了检测特异性不高的因素，很容易造成假阳性。(2)HRM(High Resolution Melt)：即“高分辨率熔解曲线”，是一种简单、快速、低成本的PCR扩增后检测技术，可用于高通量的突变扫描和基因分型。不同DNA的熔解温度T_m各不相同，通常片段越长、GC含量越高的片段其熔解温度就越高，因而每条DNA序列都有其特定的熔解曲线和熔解温度。如果在PCR扩增中出现非特异的扩增，那么就会出现多个熔解峰。可以通过熔解曲线判断PCR扩增的特异性，判断反应产物的条带数目。同理，也可以根据熔解温度(熔解曲线)区分不同的扩增片段。该技术在标准PCR试剂的基础上再加入双链DNA结合染料即可进行，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线，即可完成对样品基因型的分析。最近的研究表明，HRM方法对突变检测的灵敏度可以比拟甚至超过当前的一些SNP/突变分析技术，如DHPLC等，其灵敏度也大大高于测序。这种方法操作简便、快速、通量大、使用成本低、结果准确。但是，该方法也具有所依赖的仪器较昂贵等缺陷，普及利用率较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有Kras基因突变检测技术的缺陷和不足，采用独特的创新设计方法，设计优化出一组检测Kras基因突变的引物和探针，并通过对退火温度、使用体系、PCR程序等使用条件的研究优化，成功组建了一种检测Kras基因突变的试剂盒，对Kras基因突变的检测灵敏度高，而且特异性、准确性好，具体使用时既可以分别检测7种不同的突变类型，也可以同时检测7种突变类型，应用更灵活、更广泛。

本发明的目的是提供一组检测Kras基因突变的引物和探针。

本发明另一目的是提供一种检测Kras基因突变的试剂盒。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一组检测Kras基因突变的引物，包括针对检测7种Kras基因突变型的前向引物和反向引物，针对检测7种Kras基因突变型的前向引物分别为34A-Rev-Fp10、35A-Rev-Fp4、38A-Rev-Fp13、34C-Rev-Fp、34T-Rev-Fp、35C-Rev-Fp、35T-Rev-Fp，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～7所示；针对检测7种Kras基因突变型的反向引物均为Kras-Rev-Rp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

一种检测Kras突变的探针，包括针对检测7种Kras基因突变型的探针，分别为34A-Rev-Pb4、35A-Rev-Pb2、38A-Rev-Pb3、34C-Rev-Pb、34T-Rev-Pb、35C-Rev-Pb、35T-Rev-Pb，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9～15所示。

优选地，上述每个探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有对应的淬灭基团。

更优选地，所述5'端标记的荧光基团为FAM、HEX或VIC。优选地，3'端标记的淬灭基团为BHQ1或BHQ2。

更优选地，所述5'端标记的荧光基团为FAM。优选地，3'端标记的淬灭基团为BHQ1。

一套检测检测Kras基因突变的引物和探针，包括前向引物、反向引物和探针；即上述引物和探针的配套使用，都在本发明的保护范围之内。所述前向引物、反向引物和探针为上述的引物和探针，依次配套使用针对检测7种Kras基因突变型。

具体地，针对检测的7种突变型、以及引物探针的配套情况如下表所示：

另外，本发明基于上述检测引物和探针，通过大量的优化实验成功组建了一种检测Kras基因突变的试剂盒，该试剂盒也在本发明的保护范围之内，所述试剂盒包含有上述前向引物和反向引物。

进一步地，所述试剂盒还包含有上述探针。

更进一步地，所述试剂盒还包含有利用该试剂盒进行PCR扩增时，PCR扩增体系所需试剂，包括dNTP、镁离子、反应缓冲液、酶、无核酸酶的水。

优选地，所述体系试剂包括5～20mM的dNTP、10～40mM的镁离子、1×～10×反应缓冲液、酶、无核酸酶的水。

进一步优选地，所述体系试剂包括5～15mM的dNTP、15～35mM的镁离子、1×～10×反应缓冲液、酶、无核酸酶的水。

再进一步优选地，所述体系试剂包括10mM的dNTP、25mM的镁离子、5×反应缓冲液(5×buffer)、酶、无核酸酶的水。

更优选地，所述dNTPs为10mM的dNTPs。

更优选地，所述酶为热启动酶(DNA聚合酶)。

更优选地，酶的浓度优选为5U/μl。

更优选地，所述反应缓冲液优选为5×反应缓冲液。

更优选地，所述镁离子优选为25mM的Mg²⁺。

另外，优选地，利用上述试剂盒进行Kras突变检测时，PCR体系中各组分的反应终浓度如下：

更优选地，利用上述试剂盒进行Kras基因突变检测时，PCR体系按照如下比例进行：

优选地，利用上述试剂盒进行Kras突变检测时，PCR程序如下：

95℃300s；1个循环；

95℃20s，62℃30s，70℃30s；10个循环；

95℃20s，58℃60s，72℃30s；30～40个循环；

37℃30s；1个循环。

更优选地，利用上述试剂盒进行Kras突变检测时，PCR程序如下：

95℃300s；1个循环；

95℃20s，62℃30s，70℃30s；10个循环；

95℃20s，58℃60s，72℃30s；35～40个循环；

37℃30s；1个循环。

本发明上述引物和探针及其试剂盒在Kras基因突变检测方面具有很好的应用前景。

一种检测Kras基因突变的方法，也即上述试剂盒的使用方法，分为两种检测体系：

(1)检测体系一：可区分具体突变型

检测的PCR体系和反应程序分别如上所述。分别利用上述7种前向引物和探针，每个反应加入相同的反向引物，针对待测样本分别进行7次PCR反应，分别测定7种不同的突变。

(2)检测体系二：仅判断有无突变，不区分突变类型

检测的PCR体系和反应程序同检测体系一，唯一不同之处在于：针对待测样品进行一次PCR反应，正向引物是7种突变的正向引物的等体积混合物，探针是7种突变的探针的等体积混合物。测定待测样本中是否发生Kras基因突变。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一组检测Kras基因突变的引物和探针，并通过对退火温度、使用体系、PCR程序等使用条件的优化，成功组建了一种检测Kras基因突变的试剂盒，对Kras基因突变的检测灵敏度高，而且可以分别检测7种不同的突变类型，也可以同时检测7种突变类型，即可以将几种突变合在一个管内做，检测Kras基因突变；也可以将几种突变分别在7个管中做，分别测定7种不同的突变类型，应用更灵活、更广泛。

另外，本方法的检测灵敏度高，在1000个野生型拷贝中可以准确的检测出1个突变型，检测灵敏度可达0.1％。

本发明的方法快速，只需75～90min左右的时间即可完成检测，无需高昂的仪器和检测费用，操作简单，结果判读客观，适合于临床中大规模开展。

附图说明

图1为Kras基因突变型34A的引物和探针的检测灵敏度结果。

图2为Kras基因突变型34C的引物和探针的检测灵敏度结果。

图3为Kras基因突变型34T的引物和探针的检测灵敏度结果。

图4为Kras基因突变型35A的引物和探针的检测灵敏度结果。

图5为Kras基因突变型35C的引物和探针的检测灵敏度结果。

图6为Kras基因突变型35T的引物和探针的检测灵敏度结果。

图7为Kras基因突变型38A的引物和探针的检测灵敏度结果。

图8为Kras基因突变型34A的引物和探针的检测特异性结果。

图9为Kras基因突变型34C的引物和探针的检测特异性结果。

图10为Kras基因突变型34T的引物和探针的检测特异性结果。

图11为Kras基因突变型35A的引物和探针的检测特异性结果。

图12为Kras基因突变型35C的引物和探针的检测特异性结果。

图13为Kras基因突变型35T的引物和探针的检测特异性结果。

图14为Kras基因突变型38A的引物和探针的检测特异性结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1引物和探针的设计

1、引物设计：Kras基因常见的7种突变类型如表1所示。

表1Kras基因常见的7种突变类型

本发明中突变类型标记	突变名称	氨基酸变化	碱基变化
				34T	12CYS	G12C	c.34G>T
34A	12SER	G12S	c.34G>A
				34C	12ARG	G12R	c.34G>C
35T	12VAL	G12V	c.35G>T
				35A	12ASP	G12D	c.35G>A
35C	12ALA	G12A	c.35G>C
				38A	13ASP	G13D	c.38G>A

本发明针对检测上述7种突变的引物中，共用相同的反向引物，各自使用特异的前向引物。

(1)共同反向引物为：

Kras-Rev-Rp：GGCCTGCTGAAAATGACTG

(2)针对7种不同的突变类型，分别设计了多个前向引物，经过一定的优化实验后，得出表2所示的较好的引物：

表2各突变类型的前向引物

2、探针设计

针对7种不同的突变类型，分别设计了多个探针，经过一定的优化实验后，得出表3所示的较好的探针：

表3针对检测各突变类型的探针

3、PCR体系和反应程序的优化

(1)经过实验优化后得出，利用本发明设计的引物和探针检测Kras突变时，最佳的反应体系如下表4所示：

表4PCR反应体系

(2)经过实验优化后得出，利用本发明设计的引物和探针检测Kras突变时，最佳的反应程序如下表5所示：

表5 PCR反应程序

实施例2引物和探针的进一步优化

1、前向引物优化

(1)利用上述PCR反应条件对引物进行进一步地优化。

PCR模板分别是突变型和野生型的质粒模板，其具体的制备过程如下：参考COSMIC数据库中查询到的Kras基因的野生型和7种常见突变型的参考序列，根据参考序列依次合成野生型和含有突变位点的8种人工核酸序列，将该人工序列连接到质粒载体上，经过筛选后得到分别装载了野生型和7种突变序列的质粒。质粒模板的浓度为10000拷贝数量级。结果如表6所示。

表6引物优化结果

注：“-”表示无扩增。

(2)结论

由以上表6结果可以看出，引物34A-Rev-Fp10、35A-Rev-Fp4、38A-Rev-Fp13、34C-Rev-Fp、34T-Rev-Fp、35C-Rev-Fp、35T-Rev-Fp检测结果使得突变型模板扩增最早且与野生型差值最大，因此，选用上述引物作为最终检测引物。

2、探针优化

(1)同上，利用上述PCR反应条件对探针进行进一步地优化。结果如表7所示。

表7探针优化结果

注：“-”表示无扩增。

(2)结论

结论：由以上可看出，探针34A-Rev-Pb4、35A-Rev-Pb2、38A-Rev-Pb3、34C-Rev-Pb、34T-Rev-Pb、35C-Rev-Pb、35T-Rev-Pb检测结果使得突变型模板扩增达到的荧光值最高，因此选择他们做为最终检测探针。

实施例3 Kras基因突变检测试剂盒的组装

1、本发明根据上述研究结果成功组装出高灵敏性、高准确性检测Kras基因突变的试剂盒，包括如下组分：

(1)引物：前向引物如表8所示：

表8

反向引物(SEQ ID NO.8)：Kras-Rev-Rp：GGCCTGCTGAAAATGACTG。

(2)探针，如表9所示：

表9

(3)PCR反应所需要的dNTPs，优选为10mM的dNTPs。

(4)酶；优选为Taq热启动酶(DNA聚合酶)；其浓度优选为5U/μl。

(5)反应缓冲液，优选为5*酶缓冲液。

(6)Mg²⁺，优选为25mM的Mg²⁺。

(7)无核酸酶的水。

2、上述试剂盒使用时PCR反应体系和反应程序分别如实施例1中的表4和表5所示。

实施例4引物和探针的灵敏度检测

1、PCR模板同上为质粒模板，将合成的质粒进行酶切并得到10⁴拷贝数量级的酶切片段，然后对两者进行不同比例的混合，得到含有不同浓度突变型和野生型的样品：100％突变型，50％突变型，10％突变型，5％突变型，1％突变型，0.1％突变型和100％野生型样品模板。

使用上述反应体系和程序进行检测。

2、突变型34A、34C、34T、35A、35C、35T、38A的检测曲线图分别如附图1～7所示。数据如表10和表11所示。

表10灵敏度检测结果

表11灵敏度检测结果

注：“-”表示无扩增。

结论：由以上结果可以看出，每种突变型的检测体系均可达到0.1％(千分之一)的检测灵敏度。

实施例5引物和探针的准确性检测(Kras基因不同突变类型之间的特异性测试)

1、分别利用突变型34A、34C、34T、35A、35C、35T、38A的引物和探针组成的检测体系，分别检测7种不同突变型的模板以及野生型模板，模板浓度为10⁴拷贝数量级。

2、各体系检测各个模板的Ct值如表12所示，从测试的结果看，以这7种引物和探针为基础构建的检测体系，均能够明显地将目标检测突变型和其它突变型区分开来，并且检测其他突变型的Ct值与模板突变型Ct值的差值都在10以上，说明本申请中使用的引物和探针有很好的特异性。

表12

注：“-”表示无扩增。

3、另外，上述7种引物和探针的体系检测突变型34A、34C、34T、35A、35C、35T、38A的检测曲线图分别如附图8～14所示，也表明了以这7种引物和探针为基础构建的检测体系，均能够明显地将目标检测突变型和其它突变型区分开来，各组引物和探针都有很好的特异性。

实施例6临床样本(石蜡组织样本)检测

1、样本

测定20例结直肠癌患者临床样本(石蜡组织样本)，其中10例Kras基因突变，10例正常。

2、样本的处理方法：

利用DNA提取试剂盒提取石蜡组织样本的DNA，测定提取的DNA浓度，调整浓度至20ng/μl。以下是QIAgen_FFPE_DNA_kit石蜡组织提取DNA的试剂盒的方法：

石蜡组织样本，将样本切成5～10μm，加入1ml的二甲苯脱蜡，离心后收集沉淀，加入1ml的无水乙醇，室温或者37度晾干，加入蛋白酶K和BufferATL，56℃消化裂解1小时，90摄氏度孵化1小时，加入200μlBufferAL混匀再加入200μl的无水乙醇充分混匀，将上清小心转移到QIA 2ml离心柱中，8000rpm离心1min，加入500μl的BufferAW1，8000rpm离心1min，小心打开盖子加入500μl BufferAW2，8000rpm离心1min，空管离心14000rpm 3min，加入100μlBufferATE于膜中央，温育5min，14000rpm离心1min。取1μl测定OD值，将提取的样本DNA稀释到20ng/μl，取1μl进行PCR反应。

3、检测体系一：可区分具体突变型

(1)检测的PCR体系和反应程序分别如实施例1中的表4和表5所示。每个样本进行7管反应，分别测定7种不同的突变，每管反应加入相同的反向引物，缓冲液，聚合酶，脱氧核糖核酸，氯化镁，无核酸酶的水以及模板DNA，所不同的只有前向引物和所对应的探针。

(2)测定结果如表13所示

表13 20例临床样本的检测结果

注：“Mut”表示突变“Wt”表示野生型。

结果显示，在20例样本中检测出10例样本为Kras基因突变型，其中2例样本发生c.35G>T突变，1例发生c.34G>A突变，1例c.34G>C突变，3例发生c.35G>A突变，1例发生c.34G>A突变，1例发生c.35G>T突变，2例发生c.38G>A突变。其中4号样本，同时发生c.35G>T和c.34G>T突变。其余10例样本均为野生型。

上述样本均经过测序验证，结果显示，测序结果和使用本发明方法测定的结果完全一致，一致性(准确性)为100％。

综上所述结果表明，本发明的特异性的引物探针设计方法对检测肿瘤组织中的Kras基因突变有高准确性和灵敏度，可检测临床样本中的微量突变模板；其结果可靠，与突变检测“金标准”：直接测序发的结果符合率为100％。

4、检测体系二：仅判断有无突变，不区分突变类型

(1)检测的PCR体系和反应程序分别如实施例1中的表4和表5所示，唯一不同之处在于：PCR体系中，正向引物换成7种突变的正向引物的等体积混合物，探针换成7种突变的探针的等体积混合物。

每个样本进行1管反应，测定待测的样本中是否发生Kras基因突变，每管反应加入相同的正反向引物，探针，缓冲液，聚合酶，脱氧核糖核酸，氯化镁，无核酸酶的水以及模板DNA。

(2)测定结果如表14所示

表14 20例临床样本的检测结果

注：“Mut”表示突变“Wt”表示野生型。

结果显示，在20例样本中检测出9例样本为Kras基因突变型。上述样本均经过测序验证，结果显示，其中12号样本的测序结果显示其为突变型，而本发明方法显示其为野生型，其余样本的测序结果和使用本方法测定的结果完全一致，一致性(准确性)为95％。

综上所述结果表明，本发明的特异性的引物探针设计方法对检测肿瘤组织中的Kras基因突变有高灵敏度，可检测临床样本中的微量突变模板；其结果可靠，与突变检测“金标准”——直接测序的结果符合率为95％。

实施例7临床样本(粪便样本)检测

1、样本

48例粪便样本Kras基因片段的测定。

2、样本处理方法

磁珠捕获方法是采用磁珠作为固相吸附载体并使用特定设计的试剂体系及提取流程(Journal of China Medical University应用磁珠法检测并提取尿液游离甲基化DNA；2015,(10))。

将新鲜收取的粪便样本使用缓冲液进行混匀和稀释，然后在6000rpm下离心30min获得粪便的上清，将该上清转移到含有Kras捕获片段的羧基偶联的磁珠悬液中，经过一定时间的反应后磁珠上的捕获片段会将粪便中的Kras片段抓取，并依附在磁珠上。经过多次的洗涤后，充分的去掉捕获体系中的抑制物，然后将捕获片段从磁珠上洗脱下来，得到待测样品，取5μl进行PCR反应。

3、测定体系二(仅判断有无突变，不区分突变类型)

(1)经过优化后的反应体系为25μl，包括DNA聚合酶，突变型引物及探针，DNA模板等。所述的PCR检测体系如表15所示：

表15

(2)在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增。每个样本进行1管反应，测定待测的样本中是否发生Kras基因突变，每管反应加入共同的正反向引物，探针，缓冲液，聚合酶，脱氧核糖核酸，氯化镁，无核酸酶的水以及模板DNA。

反应条件如表16所示：

表16

4、测定结果如表17所示：

表17

结果显示，按照本发明所述方法，在48例样本中检测出9例样本为Kras基因突变型。其中结直肠癌样本中为8例，正常样本中为1例。

上述结果均与样本的组织来源测序结果进行验证，结果显示，样本中按照本方法的测试结果显示有1例野生型样本测定结果为突变型，2例突变型未检出，被判断为野生型，正常组中有一例突变型样本本方法未检测到，其余样本的测序结果和使用本方法测定的结果完全一致，一致性为91％。

另外，考虑到本实施例中测序所用的样本是组织提取的核酸样本，而本发明方法所用的核酸样本是来自粪便中的，其中能够提取到的人的核酸量很少，因此本发明所述方法具有高准确性和灵敏度的特点。

上述结果表明，根据本发明设计方法设计的特异性的引物探针对检测粪便样本中的Kras基因突变有高灵敏度，其结果可靠，与突变检测“金标准”：直接测序发的结果符合率为91％。而且，本发明所述的方法快速，操作简单，结果判读客观，适合于临床中大规模开展。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州市康立明生物科技有限责任公司

<120> 一组检测Kras基因突变的引物和探针及其试剂盒

<130>

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物34A-Rev-Fp10

<400> 1

cactcttgcc tacgctact 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物35A-Rev-Fp4

<400> 2

cactcttgcc tacgtcat 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物38A-Rev-Fp13

<400> 3

acggactctt gcctacgt 18

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物34C-Rev-Fp

<400> 4

cactcttgcc tacgccatg 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物34T-Rev-Fp

<400> 5

cactcttgcc tacgcgaca 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物35C-Rev-Fp

<400> 6

cactcttgcc tacgcctg 18

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物35T-Rev-Fp

<400> 7

gcactcttgc ctacgtcaa 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 反向引物Kras-Rev-Rp

<400> 8

ggcctgctga aaatgactg 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物34A-Rev-Pb4

<400> 9

ctagctccaa ctaccacaag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物35A-Rev-Pb2

<400> 10

atcagctcca actaccacaa 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物38A-Rev-Pb3

<400> 11

gtctccagct ccaactacca cgc 23

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物34C-Rev-Pb

<400> 12

tgagctccaa ctaccac 17

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物34T-Rev-Pb

<400> 13

caagctccaa ctaccac 17

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物35C-Rev-Pb

<400> 14

tgcagctcca actaccac 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物35T-Rev-Pb

<400> 15

aacagctcca actaccac 18

Claims

1.一组检测Kras基因突变的引物，其特征在于，包括针对检测7种Kras基因突变型的前向引物和反向引物，针对检测7种Kras基因突变型的前向引物分别为34A-Rev-Fp10、35A-Rev-Fp4、38A-Rev-Fp13、34C-Rev-Fp、34T-Rev-Fp、35C-Rev-Fp、35T-Rev-Fp，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～7所示；针对检测7种Kras基因突变型的反向引物均为Kras-Rev-Rp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.一种检测Kras基因突变的探针，其特征在于，包括针对检测7种Kras基因突变型的探针，分别为34A-Rev-Pb4、35A-Rev-Pb2、38A-Rev-Pb3、34C-Rev-Pb、34T-Rev-Pb、35C-Rev-Pb、35T-Rev-Pb，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9～15所示。

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，每个探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有对应的淬灭基团。

4.一套检测Kras基因突变的引物和探针，其特征在于，包括前向引物、反向引物和探针；所述前向引物、反向引物和探针为权利要求1和2所述的引物和探针，依次配套使用针对检测7种Kras基因突变型。

5.一种检测Kras基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有权利要求1所述引物。

6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含有权利要求2或3所述探针。

7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含有利用该试剂盒进行PCR扩增时，PCR扩增体系所需试剂，包括dNTP、镁离子、反应缓冲液、酶、无核酸酶的水。

8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，所述体系试剂包括5～20mM的dNTP、10～40mM的镁离子、1×～10×反应缓冲液、酶、无核酸酶的水。

9.根据权利要求8所述检测试剂盒，其特征在于，利用该试剂盒进行Kras基因突变检测时，PCR体系中各组分的反应终浓度如下：

前向引物 0.1～2μM

后向引物 0.1～2μM

探针 0.1～1μM

dNTP 0.1～2mM

镁离子 2～10mM

反应缓冲液 1×反应体系总体积

酶 0.1U～0.6U/μL

无核酸酶的水补足反应体系体积。

10.根据权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于，利用该试剂盒进行Kras基因突变检测时，PCR程序如下：

95℃ 300s；1个循环；

95℃ 20s，62℃ 30s，70℃ 30s；10个循环；

95℃ 20s，58℃ 60s，72℃ 30s；30～40个循环；

37℃ 30s；1个循环。