CN103898232B - 一种检测低丰度分子改变的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种检测低丰度分子改变的方法，是一种使用数字化高分辨率熔解曲线（以下简称digital？HRM）的方法，结合一对特异性引物<i>KRAS</i>-76-F/<i>KRAS-</i>76-R，检测<i>KRAS</i>基因4-14号密码子突变的方法。本发明所述方法可以廉价、快速、高灵敏性的实现对所有待测样本（包括各种疾病患者的质量较差、片段化严重或者放置时间较长的陈旧石蜡样本）的<i>KRAS</i>基因4-14号密码子突变的快速精确检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种检测低丰度分子改变的方法，是一种使用digitalHRM方法检测KRAS基因4-14号密码子突变的方法。
背景技术
ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种——HRAS、KRAS和NRAS，分别定位在11、12和1号染色体上。KRAS因编码21kD的ras蛋白又名p21基因。在ras基因中，KRAS对人类癌症影响最大，它是一种分子开关：当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当KRAS基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。检测KRAS基因突变是深入了解癌基因、了解各种癌症的发展预后、化疗疗效的重要指标。KRAS基因的点突变主要集中在特定的氨基酸密码子(第12、13、61密码子)上，占所有突变的90%以上。KRAS基因突变可以导致细胞逃逸凋亡，这种突变在胰腺癌、大肠癌、肺癌中的发生率较高。在胰腺癌中。KRAS基因点突变发生率高达90%以上。
2011年，美国国家癌症综合治疗联盟（NCCN）《结直肠癌临床实践指南》(V3.2011)明确指出：(1)所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态；(2)只有KRAS基因野生型患者才建议接受EGFR抑制剂（如西妥昔单抗和帕尼单抗）的治疗。2013年8月，国家卫生计生委员会发布了《医疗机构临床检验项目目录（2013年版）》，KRAS基因突变检测属于肿瘤分子生物学检验项目之一。
检测KRAS基因突变，对判断这些肿瘤的发生和发展、预后以及了解肿瘤的治疗效果具有一定意义。正常人血液或粪便中出现KRAS基因突变，提示属于肿瘤高危人群；良性肿瘤患者若是检测出组织细胞中KRAS基因突变，提示有恶变的可能；大量研究表明，KRAS基因如突变，即使病理组织学诊断淋巴结转移阴性，癌症复发的可能性也很高；无KRAS基因突变的肺癌、结直肠癌等肿瘤患者，经抗EGFR靶向药物（如西妥昔单抗、帕尼单抗）治疗疗效明显，因此，通过检测KRAS基因突变状态可以筛选用药人群，实现肿瘤患者的个体化治疗，延长患者生存期。
目前对KRAS基因突变检测的方法主要包括：测序、单链构象多态性(SSCP)、变性高效液相色谱(DHPLC)、荧光定量PCR法、基因芯片、液相芯片等方法。测序法因为可以读到DNA每个碱基的变化，目前被认为是检测基因突变的金标准方法，但因为灵敏度低，检测异质性较高的临床肿瘤组织样本时假阴性率高，同时，测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员的要求较高，不易于形成标准化操作的临床诊断产品。SSCP、DHPLC、基因芯片、液相芯片等方法也因操作复杂、对设备要求高，目前仅在科研单位实验室应用。荧光定量PCR法检测基因突变是通过序列特异性探针实现的，该方法灵敏度高、特异性好，目前已有基于该方法的检测KRAS基因突变的商品化试剂盒，但该方法需荧光标记的特异性探针，一种探针只能进行一种基因突变类型的检测，且检测试剂成本高，针对于KRAS基因12、13号密码子上发生的稀有突变类型检测不出来。经过发明人利用测序法对2800余例患者组织DNA进行的检测，发现KRAS基因的12，13号密码子存在约1/200的稀有突变类型，针对这部分患者，如使用商品化的荧光定量法KRAS基因突变检测试剂盒（仅带有针对7种常见突变的探针），即存在漏检风险。
另一个重要的方面是上述这些检测方法都是针对正常的待测样本进行检测，而对于质量较差、片段化严重或者放置时间较长的陈旧石蜡样本，这些方法都无法实现高灵敏性的检测。因此，有必要开发一种改进的方法以实现对所有待测样本（包括质量较差、片段化严重或者放置时间较长的陈旧石蜡样本）都能实现对KRAS基因突变的快速、有效且精确的检测。
发明内容
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种使用digitalHRM方法，结合一对特异性引物KRAS-76-F/KRAS-76-R，检测KRAS基因4-14号密码子突变的方法。该方法可快速、高灵敏性的实现对所有待测样本（包括各种疾病患者的质量较差、片段化严重或者放置时间较长的陈旧石蜡样本）的KRAS基因4-14号密码子突变的快速精确检测。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
一种使用digitalHRM方法检测KRAS基因突变的引物对KRAS-76-F/KRAS-76-R，KRAS-76-F引物序列为AGGCCTGCTGAAAATGACTG（SEQIDNO：1所示）；KRAS-76-R引物序列为GCAAGAGTGCCTTGACGATA（SEQIDNO：2所示）。本发明所述的引物对KRAS-76-F/KRAS-76-R是发明人经过大量探索性试验（已完成2800余例组织DNA检测）发现的针对KRAS基因4-14号密码子突变的特异性引物，该引物可以对所有待测样本，包括质量较差、片段化严重或者放置时间较长的陈旧石蜡样本，都能实现对KRAS基因4-14号密码子突变的快速精确检测。本发明同时也验证了现有技术中已公开的其他两对针对KRAS基因12-13号密码子突变的引物，发现现有技术中引物的检测灵敏性均不高，而且，现有技术中公开的这些引物不能实现对质量较差样本、片段化严重样本或者陈旧石蜡样本的高灵敏性的检测。
本发明所述检测方法适合所有质量较差样本的检测，优选地，所述质量较差样本为样品DNA初始浓度低于50ng/μl，或紫外吸收A260/A280的比值低于1.6或大于2.0的样本。
本发明所述检测方法适合所有陈旧石蜡样本的检测，优选地，所述陈旧石蜡样本为组织标本经石蜡包埋后3~8年的样本。
因为KRAS基因突变与癌症相关，经验证发现，本发明所述检测方法适合所有癌症的所有样本，包括正常样本、质量较差样本、片段化严重样本或者陈旧石蜡样本。优选地，胃癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、盆腔癌、胰腺癌、肛管癌、乳腺癌、肺癌的正常样本、质量较差样本、片段化严重样本或者陈旧石蜡样本均可检测。
本发明所述检测方法亦适用于患者的粪便标本和血液标本的KRAS基因4-14号密码子突变检测。
本发明以引物对KRAS-76-F/KRAS-76-R为检测引物，再结合digitalHRM检测方法的基本要求，创建了一种特异性地检测KRAS基因4-14号密码子突变的检测方法，优选地，所述检测方法具体为：在进行PCR扩增前，对样品DNA进行充分稀释，令样品DNA的浓度＜50ng/μl，以稀释后的样品DNA为模板，配制2个以上的独立扩增体系，全部进行PCR扩增，扩增结束后对每个反应体系中的PCR产物逐一分析熔解曲线，只要有一个反应体系检测出突变型模板的熔解峰，则判断该样品为突变型样品。
本发明实施范围包括一种使用HRM或digitalHRM方法检测KRAS基因4-14号密码子突变的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物对KRAS-76-F/KRAS-76-R，当然所述试剂盒还含有其他所需要的一系列检测试剂。
本发明的有益效果是：
本发明所述的引物对KRAS-76-F/KRAS-76-R是发明人经过大量探索性试验（2800余例组织DNA检测）发现的针对KRAS基因4-14号密码子突变的特异性引物，该引物可以对所有待测样本，包括质量较差、片段化严重或者放置时间较长的陈旧石蜡样本，都能实现对KRAS基因4-14号密码子突变的快速精确检测。
本发明将引物对KRAS-76-F/KRAS-76-R和digitalHRM方法相结合，具有以下优势：digitalHRM检测方法所需样本DNA量很少（<50ng），并且对标本的质量要求较为宽松，这对于临床检测来说有重要意义，尤其是当病理样本稀少（如穿刺活检样本）或针对陈旧石蜡样本、质量较差样本，digitalHRM均可检测KRAS基因4-14号密码子突变，以辅助临床工作的开展。
另外，经我们测试，使用QIAGEN公司RotorGeneQ型荧光定量PCR仪开展digitalHRM的方法进行KRAS基因4-14号密码子突变检测，检测所使用的耗材及试剂比较开放，成本低。经过调研发现，现有的商品化KRAS基因突变检测试剂盒成本很高；并且，商品化KRAS基因突变检测试剂盒由于其所含探针的特异性，只能针对特定的7种常见突变类型进行检测。对比而言，digitalHRM的方法成本更低，且检测突变类型的范围更宽，特别适用于与金标准测序法结合起来进行常规检测或单独使用。
附图说明
图1.本发明所述方法的检测灵敏度下限示意图；a：100%突变质粒检测结果；b：90%突变混合质粒检测结果；c：80%突变混合质粒检测结果；d：70%突变混合质粒检测结果；e：60%突变混合质粒检测结果；f：50%突变混合质粒检测结果；g：40%突变混合质粒检测结果；h：30%突变混合质粒检测结果；i：20%突变混合质粒检测结果；j：10%突变混合质粒检测结果；k：5%突变混合质粒检测结果；l：2.5%突变混合质粒检测结果；m：1%突变混合质粒检测结果；n：0.5%突变混合质粒检测结果；o：0.4%突变混合质粒检测结果；p：0.3%突变混合质粒检测结果；q：0.2%突变混合质粒检测结果；r：0.1%突变混合质粒检测结果；
注：0.5%突变混合质粒仍可被本发明所述方法检测出突变型熔解峰，因此本发明所述方法的检测灵敏度为0.5%。
图2.实施例胃癌标本使用本发明所述方法及测序法检测结果对比图；注：针对胃癌标本，测序法和本发明所述方法的检测结果一致。
图3.实施例结肠癌标本使用本发明所述方法及测序法检测结果对比图；注：针对结肠癌标本，测序法和本发明所述方法的检测结果一致。
图4.实施例直肠癌标本使用本发明所述方法及测序法检测结果对比图；注：针对直肠癌标本，测序法和本发明所述方法的检测结果一致。
图5.实施例食管癌标本使用本发明所述方法及测序法检测结果对比图；注：针对食管癌标本，测序法和本发明所述方法的检测结果一致。
图6.实施例盆腔癌标本使用本发明所述方法及测序法检测结果对比图；注：针对盆腔癌标本，测序法和本发明所述方法的检测结果一致。
图7.实施例胰腺癌标本使用本发明所述方法及测序法检测结果对比图；注：针对胰腺癌标本，测序法和本发明所述方法的检测结果一致。
图8.实施例肛管癌标本使用本发明所述方法及测序法检测结果对比图；注：针对肛管癌标本，测序法和本发明所述方法的检测结果一致。
图9.实施例乳腺癌标本使用本发明所述方法及测序法检测结果对比图；注：针对乳腺癌标本，测序法和本发明所述方法的检测结果一致。
图10.实施例肺癌标本使用本发明所述方法及测序法检测结果对比图；注：针对肺癌标本，测序法和本发明所述方法的检测结果一致。
图11.本发明针对表2中样品的普通PCR后的电泳结果图；表2中B1-B6号标本均无法获得单一、清晰扩增产物条带，无法用测序法进行检测。
图12.本发明所述方法检测表2中样品的检测结果；表2中B1-B6号标本均可被本发明所述技术检测出KRAS基因4-14号密码子突变情况。
图13.本发明针对表3中样品的普通PCR后的电泳结果图；表3中C2(2006年)和C3（2008年）样本不能获得单一、清晰的扩增条带，无法用测序法进行检测。
图14.本发明所述方法检测表3中样品的检测结果；表3中C1-C6号标本均可被本发明所述技术检测出KRAS基因4-14号密码子突变情况。
图15.不同引物使用本发明所述方法检测的扩增曲线；使用SEQ1引物对扩增效果良好；使用SEQ2引物对扩增效果较差；使用SEQ3引物对无法扩增。
图16.不同引物使用本发明所述方法检测的判读结果；注：使用SEQ1引物结合本发明所述方法可以根据熔解曲线分辨出一组经测序验证为突变型样本的KRAS基因4-14号密码子突变情况；使用SEQ2或SEQ3引物对结合本发明所述方法均不能获得清晰易辨识的突变峰，无法根据熔解曲线分辨出一组经测序验证为突变型样本的KRAS基因4-14号密码子突变情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备。
实施例1
1、引物：发明人经过大量探索性试验发现一对针对KRAS基因4-14号密码子突变的特异性引物对KRAS-76-F/KRAS-76-R；序列如下：
KRAS-76-F：AGGCCTGCTGAAAATGACTG（SEQIDNO：1所示）；
KRAS-76-R：GCAAGAGTGCCTTGACGATA（SEQIDNO：2所示）；
2、试验方法：首先发明人做不同比例浓度突变比例质粒混合物的验证，看是否可以如文献所说可检测至0.1%的突变率。确定本发明所述方法的检测灵敏度。
2.1、使用质粒标准品（100%突变型质粒和100%野生型质粒）配置不同突变比例的混合质粒，100%突变，90%突变，80%突变，70%突变，60%突变，50%突变，40%突变，30%突变，20%突变，10%突变，5%突变，2.5%突变，1%突变，0.5%突变，0.4%突变，0.3%突变，0.2%突变，0.1%突变。具体配置方法参考本技术领域的常规方法。
2.2、具体操作方法：取步骤2.1所配置的不同突变比例的混合质粒各2ul，并用超纯水稀释20倍，将全部稀释后的不同突变比例的混合质粒分别进行检测，观察所有待测样品的熔解曲线。若在主峰旁边出现有另一熔解峰，则判读该样品是突变型样品。使用仪器为QIAGEN公司RotorGeneQ荧光定量PCR仪。
PCR反应体系：
| 反应体系组分 | 加入的体积（ul） |
| 10×buffer | 2.5 |
| dNTPs | 2.5 |
| EvaGreen | 1.25 |
| 上下游引物KRAS-76- F / R | 1.25+1.25 |
| Taq酶 | 0.25 |
| 纯水 | 15 |
PCR和HRM反应条件：
实验结果如图所示，由图1结果可知：利用标准质粒模板，本发明所述方法可检测的灵敏度下限为0.5%。
本实施例中，0.5%突变混合质粒的制备方法为：将浓度相同、进行荧光定量PCR扩增时具有相同ct值的突变型质粒和野生型质粒按5：995的比例进行混合而成。以0.5%突变混合质粒为例，倘若只做单管的PCR扩增后进行高分辨率熔解曲线分析，1000单位中只有5单位的突变型模板，可能检测到的突变模板概率为5/1000×1=0.5%。
digitalHRM技术的原理为：模板DNA经过充分稀释后，再同时检测2个以上的独立扩增体系，则在每个独立的PCR扩增体系中，其模板DNA中有可能不含待检的核酸靶分子（本专利特指KRAS基因的突变型模板），或者含有一个至数个的待检核酸靶分子，突变型模板在某些特定的反应管中因比例升高而可被定量PCR仪检测到，检出率大大提高。在本发明所述方法中，如先将1ul的0.5%突变混合质粒稀释20倍，然后将稀释后的模板DNA均分至20个反应体系，20个反应体系全部进行扩增检测，则突变型模板会按泊松分布（）的规律分布在20个反应体系中，使得某些孔中的突变型模板的比例可以达到2-10%，这样突变型模板就可以在某些特定反应管中因比例升高而被定量PCR仪检测到。
实施例2
利用本发明特异性引物对KRAS-76-F/KRAS-76-R，验证不同来源（胃癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、盆腔癌、胰腺癌、肛管癌、乳腺癌、肺癌）癌症标本DNA模板的digitalHRM法检测结果和测序法检测结果的一致率。
具体操作如下：选取下表1所示不同病种石蜡标本DNA进行digitalHRM检测，并使用测序方法验证检测结果。实验方法、实验仪器及相关反应条件如实施例1所示。
表1
| 样本编号 | 病理诊断 | 测序结果 | digital HRM结果 | 备注 |
| A1 | 胃癌 | 野生型 | 野生型 | 见图2所示 |
| A2 | 结肠癌 | GGT-GAT | 突变型 | 见图3所示 |
| A3 | 直肠癌 | 野生型 | 野生型 | 见图4所示 |
| A4 | 食管癌 | 野生型 | 野生型 | 见图5所示 |
| A5 | 盆腔癌 | 野生型 | 野生型 | 见图6所示 |
| A6 | 胰腺癌 | 野生型 | 野生型 | 见图7所示 |
| A7 | 肛管癌 | GGT-GAT | 突变型 | 见图8所示 |
| A8 | 乳腺癌 | GGT-AGT | 突变型 | 见图9所示 |
| A9 | 肺癌 | GGT-GAT | 突变型 | 见图10所示 |
从图2~10的结果可知：利用本发明特异性引物对KRAS-76-F/KRAS-76-R，使用digitalHRM的方法检测不同来源（胃癌、结肠癌、直肠癌、食管癌、盆腔癌、胰腺癌、肛管癌、乳腺癌、肺癌）癌症标本DNA模板，其检测结果和目前公认的金标准测序法检测结果一致率达到100%。
实施例3
选取片段化严重、质量差的DNA标本，使用本发明的所述的方法进行检测。实验方法、实验仪器及相关反应条件如实施例1所示。质量差的DNA标本定义为：样品初始DNA浓度低于50ng/μl，或紫外吸收A260/A280的比值低于1.6或大于2.0的样本。根据以上要求选取表格2中所述样品。
表2
| 样品编号 | 浓度（ng/μl） | 纯度（A260/280） |
| B1 | 32.6 | 1.343 |
| B2 | 33 | 1.365 |
| B3 | 23.3 | 1.245 |
| B4 | 52.6 | 1.623 |
| B5 | 54.9 | 2.598 |
| B6 | 203.9 | 2.118 |
在使用本发明实施例1所述方法来检测表2中样品的突变状态的同时，本发明也使用普通PCR方法来检测表2中的样本，普通PCR反应体系和反应条件根据引物序列再参照普通分子克隆技术来设定。普通PCR反应的扩增产物经琼脂糖电泳检测，结果分别如图11所示：普通PCR反应的扩增产物的电泳条带显示样品扩增质量不佳，无法直接进行测序反应。而使用本发明所述digitalHRM检测方法仍可检测到样品KRAS基因4-14号密码子突变（见图12）。
实施例4
选取陈旧石蜡样本，提取DNA进行digitalHRM检测。实验方法、实验仪器及相关反应条件如实施例1所示。陈旧石蜡样本定义为：组织标本经石蜡包埋后3~8年。选取以下表格3所述样品。
表3
| 样品编号 | 标本年份 |
| C1 | 2006 |
| C2 | 2006 |
| C3 | 2008 |
| C4 | 2008 |
| C5 | 2010 |
| C6 | 2010 |
在使用本发明实施例1所述方法来检测表3中样品的突变状态的同时，本发明也使用普通PCR方法来检测表3中的样本，普通PCR反应体系和反应条件根据引物序列再参照普通分子克隆技术来设定。检测结果分别如图13所示：普通PCR反应的扩增产物的电泳条带显示C2、C3样品扩增质量不佳，无法用测序法进行检测。而使用本发明所述digitalHRM检测方法可检测到所有样品KRAS基因4-14号密码子突变，结果见图14。
实施例5
为了验证本发明所述引物对的检测灵敏性，本实施例使用现有技术中已经公开的针对KRAS基因突变的引物对结合本发明所述的digitalHRM检测方法来检测，选取以下表格4所述样品。KRAS基因的突变情况。实验方法、实验仪器及相关反应条件如实施例1所示。现有技术中已经公开的针对KRAS基因突变的引物是指下列两篇文献中的引物。
[1]ZouH,TaylorWR,HarringtonJJ,etal.HighdetectionratesofcolorectalneoplasiabystoolDNAtestingwithanoveldigitalmeltcurveassay.Gastroenterology.2009,136(2):459-70.
[2]曾庆，邹鸿志，吴岚晓，张颖芬.用于检测KRAS基因突变的试剂盒及其检测方法.专利申请号：201110256633.5。
表4
| 样品编号 | 浓度（ng/μl） | 纯度（A260/280） |
| D1 | 132.6 | 1.843 |
| D2 | 233 | 1.765 |
实验结果见图15和图16，由图15和16的结果可知：只有使用SEQ1所示引物（也即本发明所述的KRAS-76-F/KRAS-76-R引物对）方可得到有效扩增曲线（如图15所示）。而且，也只有SEQ1所示引物可以通过熔解曲线判读待测标本的KRAS基因4-14号密码子的突变状态（如图16所示）。
SEQUENCELISTING
<110>汪建平、邹鸿志、傅新晖
<120>一种检测低丰度分子改变的方法
<130>
<160>2
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>KRAS-76-F
<400>1
aggcctgctgaaaatgactg20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>KRAS-76-R
<400>2
gcaagagtgccttgacgata20
Claims (4)
1.一种使用digitalHRM方法检测KRAS基因突变的引物对KRAS-76-F/KRAS-76-R，其特征在于，所述KRAS-76-F引物序列如SEQIDNO：1所示，KRAS-76-R引物序列如SEQIDNO：2所示；所述引物能用于检测各类癌症样本中KRAS基因4-14号密码子的突变状态，各类癌症样本包括正常样本、质量较差样本、片段化严重样本或者陈旧样本；
所述质量较差样本为样品浓度低于50ng/μl，纯度低于1.6或大于2.0的样本；
所述陈旧样本为组织标本经石蜡包埋后3~8年的样本。
2.根据权利要求1所述引物对，其特征在于，所述正常样本、质量较差样本、片段化严重样本或者陈旧样本为肠癌、胃癌、肺癌、食管癌、盆腔粘液腺癌、胰腺恶性内分泌肿瘤或肛管腺癌的正常样本、质量较差样本、片段化严重样本或者陈旧样本。
3.根据权利要求1所述引物对，其特征在于，所述引物亦适用于患者的粪便标本和血液标本的KRAS基因4-14号密码子突变检测。
4.一种使用digitalHRM方法检测KRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对KRAS-76-F/KRAS-76-R。
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| 利用高分辨率熔解曲线分析法检测结直肠癌中KRAS基因突变;傅新晖等;《中华普通外科学文献(电子版)》;20091001;第03卷(第05期);第376-378页 * |
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