CN112063701A - 检测kras基因突变的核酸组合物及其试剂盒和检测方法 - Google Patents

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CN112063701A CN202011088890.8A CN202011088890A CN112063701A CN 112063701 A CN112063701 A CN 112063701A CN 202011088890 A CN202011088890 A CN 202011088890A CN 112063701 A CN112063701 A CN 112063701A
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Abstract

本发明涉及一种检测KRAS基因突变的核酸组合物及其试剂盒和检测方法。该核酸组合物包括：用于检测KRAS基因的G12S突变的第一正向引物，第一正向引物的序列如SEQ ID No.1所示，序列如SEQ ID No.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针。上述核酸组合物对KRAS基因突变的检测灵敏度较高。

Description

检测KRAS基因突变的核酸组合物及其试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种检测KRAS基因突变的核酸组合物及其试剂盒和检测方法。
背景技术
KRAS基因定位于12号染色体上，约35kb，是RAS基因家族的成员之一。研究发现导致KRAS基因处于激活状态的突变主要发生在第12和第13密码子上，最常见的热点突变为：G12C、G12S、G12R、G12V、G12D、G12A和G13D，这7种突变占KRAS所有突变的98.5％以上。
目前，KRAS基因突变检测的主要方法有以下几种：1)Sanger测序法；直接测序法一直以来是基因突变检测的金标准，但是测序法存在很多缺点，比如耗时长，后续要对PCR产物进行处理，程序复杂，容易出现污染导致结果不准确。另外，测序法的灵敏度低，特别是在混合模板时检出率低，一般需要突变丰度达到20％以上才能准确检测。2)高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)是通过饱和燃料结合于PCR扩增产物监控其形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术，其敏感性在5％左右。3)扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)是根据引物3’端末位碱基必须与其模板DNA链互补才能进行有效的扩增。基于此，设计针对基因突变位点的引物序列，可以检测突变基因，该检测方法的灵敏度在1％左右。这些方法的检测灵敏度较低，不能满足实际需求。
发明内容
基于此，有必要提供一种灵敏度较高的检测KRAS基因突变的核酸组合物。
此外，还有必要提供一种检测KRAS基因突变的试剂盒和KRAS基因突变的检测方法。
一种检测KRAS基因突变的核酸组合物，包括：
用于检测KRAS基因的G12S突变的第一正向引物，所述第一正向引物的序列如SEQID No.1所示，序列如SEQ ID No.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针；
及/或，用于检测KRAS基因的G12R突变的第二正向引物，所述第二正向引物的序列如SEQ ID No.2所示，序列如SEQ ID No.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针；
及/或，用于检测KRAS基因的G12C突变的第三正向引物，所述第三正向引物的序列如SEQ ID No.3所示，序列如SEQ ID No.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针；
及/或，用于检测KRAS基因的G12D突变的第四正向引物，所述第四正向引物的序列如SEQ ID No.4所示，序列如SEQ ID No.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.10所示的第二通用探针；
及/或，用于检测KRAS基因的G12A突变的第五正向引物，所述第五正向引物的序列如SEQ ID No.5所示，序列如SEQ ID No.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针；
及/或，用于检测KRAS基因的G12V突变的第六正向引物，所述第六正向引物的序列如SEQ ID No.6所示，序列如SEQ ID No.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针；
及/或，用于检测KRAS基因的G13D突变的第七正向引物，所述第七正向引物的序列如SEQ ID No.7所示，序列如SEQ ID No.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.10所示的第二通用探针。
上述核酸组合物对KRAS基因的G12C、G12S、G12R、G12V、G12D、G12A和G13D突变中的至少一种具有较高的特异性，能够分别检测KRAS基因的上述七种突变中的至少一种，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的KRAS基因的G12C、G12S、G12R、G12V、G12D、G12A和G13D突变中的至少一种，灵敏度较高。
其中一个实施例中，还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。
其中一个实施例中，所述内控基因为CFTR基因，所述内控引物对的序列如SEQ IDNo.11及SEQ ID No.12所示，所述内控探针的序列如SEQ ID No.13所示。
其中一个实施例中，所述内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基因和内控荧光淬灭基团；
所述检测KRAS基因突变的核酸组合物中含有所述第一通用探针时，所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基因与所述内控荧光报告基因不同；
所述检测KRAS基因突变的核酸组合物中含有所述第二通用探针时，所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第二荧光报告基因与所述内控荧光报告基因不同。
一种检测KRAS基因突变的试剂盒，包括上述检测KRAS基因突变的核酸组合物。
其中一个实施例中，所述检测KRAS基因突变的核酸组合物还包括质控引物对和质控探针。
其中一个实施例中，所述质控引物对的序列如SEQ ID No.14及SEQ ID No.15所示，所述质控探针的序列如SEQ ID No.16所示。
其中一个实施例中，还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
一种KRAS基因突变的检测方法，包括如下步骤：
向待测样品中加入上述检测KRAS基因突变的核酸组合物进行PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析。
其中一个实施例中，检测所述G12S突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的所述第一正向引物，1μM的所述通用反向引物，0.25μM的所述第一通用探针。
其中一个实施例中，检测所述G12R突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.1μM的所述第二正向引物，0.5μM的所述通用反向引物，0.5μM的所述第一通用探针。
其中一个实施例中，检测所述G12C突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.1μM的所述第三正向引物，0.5μM的所述通用反向引物，0.5μM的所述第一通用探针。
其中一个实施例中，检测所述G12D突变的反应体系包括：1.75mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.25μM的所述第四正向引物，0.75μM的所述通用反向引物，0.25μM的所述第二通用探针。
其中一个实施例中，检测所述G12A突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.1μM的所述第五正向引物，0.5μM的所述通用反向引物，0.5μM的所述第一通用探针。
其中一个实施例中，检测所述G12V突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的所述第六正向引物，0.5μM的所述通用反向引物，0.5μM的所述第一通用探针。
其中一个实施例中，检测所述G13D突变的反应体系包括：1.75mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.25μM的所述第七正向引物，1μM的所述通用反向引物，0.25μM的所述第二通用探针。
其中一个实施例中，所述检测KRAS基因突变的核酸组合物还包括质控引物对和质控探针，所述质控反应体系为：4mM的MgCl2，10mM的Tris，50mM的KCl，200mg/L的BSA，0.1mM的dNTPs，1.125U的rtaq酶，0.3μM的所述质控引物对中的正向引物，0.3μM的所述质控引物对中的反向引物，0.225μM的所述质控探针。
附图说明
图1为阴性检测结果示例图；
图2为阳性检测结果示例图；
图3为G12A突变位点检测能力测试图；
图4为G12C突变位点检测能力测试图；
图5为G12R突变位点检测能力测试图；
图6为G12V突变位点检测能力测试图；
图7为G12S突变位点检测能力测试图；
图8为G13D突变位点检测能力测试图；
图9为G12D突变位点检测能力测试图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本研究第一实施方式提供一种检测KRAS基因突变的核酸组合物，能够检测KRAS基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测KRAS基因突变的核酸组合物包括用于检测KRAS基因的G12S突变的第一正向引物，第一正向引物的序列如SEQ ID No.1所示，序列如SEQ IDNo.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针。
上述核酸组合物对KRAS基因的G12S突变具有较高的特异性，能够检测KRAS基因的G12S突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的KRAS基因的G12S突变，灵敏度较高。
具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为：TTGTGGTAGTTGGAGC。如SEQ ID No.8所示的序列为：TTGGATCATATTCGTCCAC。如SEQ ID No.9所示的序列为：CGCTGGAGCTGGTGGCGTAGGGCG。
第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团。进一步地，第一荧光报告基因选自TXR、HEX、CY5及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，第一荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第一荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，首先，利用ARMS引物特异性扩增目的序列。其次，分子信标探针设计与野生型匹配，探针TM值比引物高，这样探针优先于引物竞争性结合到野生型模版上，这样就抑制了野生型的扩增，分子信标探针起到了Block的作用。由于分子信标探针设计时与突变型模板存在错配，TM值对于突变型来说TM较低，引物就优先与突变型模板链结合。扩增结束后，对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。若样品中有突变基因存在，则会出现熔解峰；若没有突变基因存在，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对KRAS基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为CFTR基因。内控引物对的序列如SEQ ID No.11及SEQ IDNo.12所示。内控探针的序列如SEQ ID No.13所示。
具体地，如SEQ ID No.11所示的序列为：TCAAAGATCTCACAGCAAAATAC。如SEQ IDNo.12所示的序列为：CTAACAAAGCAAGCAGTGTTCA。如SEQ ID No.13所示的序列为：CGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACACCG。其中，如SEQ ID No.11所示的序列为正向引物，如SEQID No.12所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第一荧光报告基团不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX、CY5及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为CY5。内控荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测KRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测KRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第二实施方式提供一种检测KRAS基因突变的核酸组合物，能够检测KRAS基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测KRAS基因突变的核酸组合物包括用于检测KRAS基因的G12R突变的第二正向引物，第二正向引物的序列如SEQ ID No.2所述，序列如SEQ IDNo.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针。
上述核酸组合物对KRAS基因的G12R突变具有较高的特异性，能够检测KRAS基因的G12R突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的KRAS基因的G12R突变，灵敏度较高。
具体地，如SEQ ID No.2所示的序列为：TTGTGGTAGTTGGAGC。如SEQ ID No.8所示的序列为：TTGGATCATATTCGTCCAC。如SEQ ID No.9所示的序列为：CGCTGGAGCTGGTGGCGTAGGGCG。
第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团。进一步地，第一荧光报告基因选自TXR、HEX、CY5及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，第一荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第一荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，首先，利用ARMS引物特异性扩增目的序列。其次，分子信标探针设计与野生型匹配，探针TM值比引物高，这样探针优先于引物竞争性结合到野生型模版上，这样就抑制了野生型的扩增，分子信标探针起到了Block的作用。由于分子信标探针设计时与突变型模板存在错配，TM值对于突变型来说TM较低，引物就优先与突变型模板链结合。扩增结束后，对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。若样品中有突变基因存在，则会出现熔解峰；若没有突变基因存在，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对KRAS基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为CFTR基因。内控引物对的序列如SEQ ID No.11及SEQ IDNo.12所示。内控探针的序列如SEQ ID No.13所示。
具体地，如SEQ ID No.11所示的序列为：TCAAAGATCTCACAGCAAAATAC。如SEQ IDNo.12所示的序列为：CTAACAAAGCAAGCAGTGTTCA。如SEQ ID No.13所示的序列为：CGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACACCG。其中，如SEQ ID No.11所示的序列为正向引物，如SEQID No.12所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第一荧光报告基团不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX、CY5及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为CY5。内控荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测KRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测KRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第三实施方式提供一种检测KRAS基因突变的核酸组合物，能够检测KRAS基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测KRAS基因突变的核酸组合物包括用于检测KRAS基因的G12C突变的第三正向引物，第三正向引物的序列如SEQ ID No.3所述，序列如SEQ IDNo.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针。
上述核酸组合物对KRAS基因的G12C突变具有较高的特异性，能够检测KRAS基因的G12S突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的KRAS基因的G12C突变，灵敏度较高。
具体地，如SEQ ID No.3所示的序列为：TTGTGGTAGTTGGAGC。如SEQ ID No.8所示的序列为：TTGGATCATATTCGTCCAC。如SEQ ID No.9所示的序列为：CGCTGGAGCTGGTGGCGTAGGGCG。
第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团。进一步地，第一荧光报告基因选自TXR、HEX、CY5及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，第一荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第一荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，首先，利用ARMS引物特异性扩增目的序列。其次，分子信标探针设计与野生型匹配，探针TM值比引物高，这样探针优先于引物竞争性结合到野生型模版上，这样就抑制了野生型的扩增，分子信标探针起到了Block的作用。由于分子信标探针设计时与突变型模板存在错配，TM值对于突变型来说TM较低，引物就优先与突变型模板链结合。扩增结束后，对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。若样品中有突变基因存在，则会出现熔解峰；若没有突变基因存在，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对KRAS基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为CFTR基因。内控引物对的序列如SEQ ID No.11及SEQ IDNo.12所示。内控探针的序列如SEQ ID No.13所示。
具体地，如SEQ ID No.11所示的序列为：TCAAAGATCTCACAGCAAAATAC。如SEQ IDNo.12所示的序列为：CTAACAAAGCAAGCAGTGTTCA。如SEQ ID No.13所示的序列为：CGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACACCG。其中，如SEQ ID No.11所示的序列为正向引物，如SEQID No.12所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第一荧光报告基团不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX、CY5及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为CY5。内控荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测KRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测KRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第四实施方式提供一种检测KRAS基因突变的核酸组合物，能够检测KRAS基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测KRAS基因突变的核酸组合物包括用于检测KRAS基因的G12D突变的第四正向引物，第四正向引物的序列如SEQ ID No.4所述，序列如SEQ IDNo.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.10所示的第二通用探针。
上述核酸组合物对KRAS基因的G12D突变具有较高的特异性，能够检测KRAS基因的G12D突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的KRAS基因的G12D突变，灵敏度较高。
具体地，如SEQ ID No.4所示的序列为：TGTGGTAGTTGGAGCAG。如SEQ ID No.8所示的序列为：TTGGATCATATTCGTCCAC。如SEQ ID No.10所示的序列为：CGCTGGAGCTGGTGGCGTAGGGCG。
第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团。进一步地，第二荧光报告基因选自TXR、HEX、CY5及FAM中的一种。第二荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第二荧光报告基因为FAM。第二荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，第二荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第二荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，首先，利用ARMS引物特异性扩增目的序列。其次，分子信标探针设计与野生型匹配，探针TM值比引物高，这样探针优先于引物竞争性结合到野生型模版上，这样就抑制了野生型的扩增，分子信标探针起到了Block的作用。由于分子信标探针设计时与突变型模板存在错配，TM值对于突变型来说TM较低，引物就优先与突变型模板链结合。扩增结束后，对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。若样品中有突变基因存在，则会出现熔解峰；若没有突变基因存在，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对KRAS基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为CFTR基因。内控引物对的序列如SEQ ID No.11及SEQ IDNo.12所示。内控探针的序列如SEQ ID No.13所示。
具体地，如SEQ ID No.11所示的序列为：TCAAAGATCTCACAGCAAAATAC。如SEQ IDNo.12所示的序列为：CTAACAAAGCAAGCAGTGTTCA。如SEQ ID No.13所示的序列为：CGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACACCG。其中，如SEQ ID No.11所示的序列为正向引物，如SEQID No.12所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第一荧光报告基团不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX、CY5及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为CY5。内控荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测KRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测KRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第五实施方式提供一种检测KRAS基因突变的核酸组合物，能够检测KRAS基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测KRAS基因突变的核酸组合物包括用于检测KRAS基因的G12A突变的第五正向引物，第五正向引物的序列如SEQ ID No.5所示，序列如SEQ IDNo.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针。
上述核酸组合物对KRAS基因的G12A突变具有较高的特异性，能够检测KRAS基因的G12A突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的KRAS基因的G12A突变，灵敏度较高。
具体地，如SEQ ID No.5所示的序列为：GTGGTAGTTGGAGCT。如SEQ ID No.8所示的序列为：TTGGATCATATTCGTCCAC。如SEQ ID No.9所示的序列为：CGCTGGAGCTGGTGGCGTAGGGCG。
第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团。进一步地，第一荧光报告基因选自TXR、HEX、CY5及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，第一荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第一荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，首先，利用ARMS引物特异性扩增目的序列。其次，分子信标探针设计与野生型匹配，探针TM值比引物高，这样探针优先于引物竞争性结合到野生型模版上，这样就抑制了野生型的扩增，分子信标探针起到了Block的作用。由于分子信标探针设计时与突变型模板存在错配，TM值对于突变型来说TM较低，引物就优先与突变型模板链结合。扩增结束后，对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。若样品中有突变基因存在，则会出现熔解峰；若没有突变基因存在，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对KRAS基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为CFTR基因。内控引物对的序列如SEQ ID No.11及SEQ IDNo.12所示。内控探针的序列如SEQ ID No.13所示。
具体地，如SEQ ID No.11所示的序列为：TCAAAGATCTCACAGCAAAATAC。如SEQ IDNo.12所示的序列为：CTAACAAAGCAAGCAGTGTTCA。如SEQ ID No.13所示的序列为：CGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACACCG。其中，如SEQ ID No.11所示的序列为正向引物，如SEQID No.12所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第一荧光报告基团不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX、CY5及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为CY5。内控荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测KRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测KRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第六实施方式提供一种检测KRAS基因突变的核酸组合物，能够检测KRAS基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测KRAS基因突变的核酸组合物包括用于检测KRAS基因的G12V突变的第六正向引物，第六正向引物的序列如SEQ ID No.6所示，序列如SEQ IDNo.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针。
上述核酸组合物对KRAS基因的G12V突变具有较高的特异性，能够检测KRAS基因的G12V突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的KRAS基因的G12V突变，灵敏度较高。
具体地，如SEQ ID No.6所示的序列为：TGTGGTAGTTGGAGCT。如SEQ ID No.8所示的序列为：TTGGATCATATTCGTCCAC。如SEQ ID No.9所示的序列为：CGCTGGAGCTGGTGGCGTAGGGCG。
第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团。进一步地，第一荧光报告基因选自TXR、HEX、CY5及FAM中的一种。第一荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第一荧光报告基因为FAM。第一荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，第一荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第一荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，首先，利用ARMS引物特异性扩增目的序列。其次，分子信标探针设计与野生型匹配，探针TM值比引物高，这样探针优先于引物竞争性结合到野生型模版上，这样就抑制了野生型的扩增，分子信标探针起到了Block的作用。由于分子信标探针设计时与突变型模板存在错配，TM值对于突变型来说TM较低，引物就优先与突变型模板链结合。扩增结束后，对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。若样品中有突变基因存在，则会出现熔解峰；若没有突变基因存在，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对KRAS基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为CFTR基因。内控引物对的序列如SEQ ID No.11及SEQ IDNo.12所示。内控探针的序列如SEQ ID No.13所示。
具体地，如SEQ ID No.11所示的序列为：TCAAAGATCTCACAGCAAAATAC。如SEQ IDNo.12所示的序列为：CTAACAAAGCAAGCAGTGTTCA。如SEQ ID No.13所示的序列为：CGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACACCG。其中，如SEQ ID No.11所示的序列为正向引物，如SEQID No.12所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第一荧光报告基团不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX、CY5及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为CY5。内控荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测KRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测KRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究第七实施方式提供一种检测KRAS基因突变的核酸组合物，能够检测KRAS基因突变，检测灵敏度较高。具体地，该检测KRAS基因突变的核酸组合物包括用于检测KRAS基因的G13D突变的第一正向引物，第一正向引物的序列如SEQ ID No.7所示，序列如SEQ IDNo.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.10所示的第二通用探针。
上述核酸组合物对KRAS基因的G13D突变具有较高的特异性，能够检测KRAS基因的G13D突变，检测灵敏度较高。经试验验证，上述核酸组合物能够检测0.1％的KRAS基因的G13D突变，灵敏度较高。
具体地，如SEQ ID No.7所示的序列为：GTAGTTGGAGCTGGAG。如SEQ ID No.8所示的序列为：TTGGATCATATTCGTCCAC。如SEQ ID No.10所示的序列为：CGCTGGAGCTGGTGGCGTAGGGCG。
第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团。进一步地，第二荧光报告基因选自TXR、HEX、CY5及FAM中的一种。第二荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，第二荧光报告基因为FAM。第二荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，第二荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，第二荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
上述核酸组合物中，首先，利用ARMS引物特异性扩增目的序列。其次，分子信标探针设计与野生型匹配，探针TM值比引物高，这样探针优先于引物竞争性结合到野生型模版上，这样就抑制了野生型的扩增，分子信标探针起到了Block的作用。由于分子信标探针设计时与突变型模板存在错配，TM值对于突变型来说TM较低，引物就优先与突变型模板链结合。扩增结束后，对扩增产物进行熔解分析，荧光探针在未杂交时，荧光基团和淬灭基团相接近而被淬灭，不产生荧光；而处于杂交状态时，荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。若样品中有突变基因存在，则会出现熔解峰；若没有突变基因存在，则不会出现熔解峰。
在其中一个实施例中，上述核酸组合物还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。通过设置用于检测内控基因的引物对和探针，以便于对KRAS基因突变检测进行内控，有利于提高检测的准确性。
进一步地，内控基因为CFTR基因。内控引物对的序列如SEQ ID No.11及SEQ IDNo.12所示。内控探针的序列如SEQ ID No.13所示。
具体地，如SEQ ID No.11所示的序列为：TCAAAGATCTCACAGCAAAATAC。如SEQ IDNo.12所示的序列为：CTAACAAAGCAAGCAGTGTTCA。如SEQ ID No.13所示的序列为：CGGTGGAAATGCCATATTAGAGAACACCG。其中，如SEQ ID No.11所示的序列为正向引物，如SEQID No.12所示的序列为反向引物。
内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基团和内控荧光淬灭基团，内控与第一荧光报告基团不同。
进一步地，内控荧光报告基团选自TXR、HEX、CY5及FAM中的一种。内控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，内控荧光报告基因为CY5。内控荧光淬灭基团为BHQ2。需要说明的是，内控荧光报告基因不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，内控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测KRAS基因突变的核酸组合物能够用于检测KRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
本研究一实施方式还提供一种检测KRAS基因突变的试剂盒，包括上述各实施方式的检测KRAS基因突变的核酸组合物中的至少一种。该检测KRAS基因突变的试剂盒能够较为准确检测KRAS基因突变，检测灵敏度较高。
进一步地，检测KRAS基因突变的试剂盒还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
其中，酶混合液例如可以包括酶Ⅰ混合液和酶Ⅱ混合液。酶Ⅰ混合液为不具有5’端到3’端外切酶活性的Taq酶和抗体等混合物。酶Ⅱ混合液为5’端到3’端外切酶活性和抗体等混合物。
检测KRAS基因突变的核酸组合物还包括：还包括质控引物对和质控探针。此种设置能够提高检测准确性。
进一步地，质控引物对的序列如SEQ ID No.11及SEQ ID No.12所示，质控探针的序列如SEQ ID No.13所示。
具体地，SEQ ID No.11所示的序列为：ACCTCTATTGTTGGATCATATTC。SEQ ID No.12所示的序列为：TTATTTTTATTATAAGGCCTGCTG。SEQ ID No.13所示的序列为：ATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGCC。其中，SEQ ID No.11所示的引物为正向引物。SEQ IDNo.12所示的引物为反向引物。
质控探针的两端分别连接有质控荧光报告基团和质控荧光淬灭基团。进一步地，质控荧光报告基因选自CY5及FAM中的一种。质控荧光淬灭基团选自BHQ1及BHQ2中的一种。在一个具体示例中，质控荧光报告基因为FAM。质控荧光淬灭基团为BHQ1。需要说明的是，质控荧光报告基团不限于上述指出的荧光报告基团，也可以为其他荧光报告基团。需要说明的是，质控荧光淬灭基团不限于上述指出的荧光淬灭基团，也可以为其他荧光淬灭基团。
本研究的检测KRAS基因突变的试剂盒结合了ARMS引物、分子信标探针和探针熔解曲线等技术，能够用于检测KRAS基因上第12号密码子和第13号密码子上的7种热点突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；用质控管对样品DNA质量进行监控，能够适用于血浆或者FFPE样本的检测，尤其适用于检测靶序列含量低的样本。
本研究一实施方式还提供一种KRAS基因突变的检测方法，检测灵敏度较低，能够用于KRAS基因突变的非疾病的治疗和诊断的检测，例如用于KRAS基因突变的实验性研究。
具体地，向待测样品中加入上述各实施方式的检测KRAS基因突变的核酸组合物中的至少一种进行PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析。
其中一个实施例中，检测G12S突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的第一正向引物，1μM的通用反向引物，0.25μM的第一通用探针。进一步地，检测G12S突变的反应体系还包括：0.05μM的内控引物对中的正向引物，0.5μM的内控引物对中的反向引物，0.1μM的内控探针。
其中一个实施例中，检测G12R突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.1μM的第二正向引物，0.5μM的通用反向引物，0.5μM的第一通用探针。进一步地，检测G12R突变的反应体系还包括：0.05μM的内控引物对中的正向引物，0.5μM的内控引物对中的反向引物，0.1μM的内控探针。
其中一个实施例中，检测G12C突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.1μM的第三正向引物，0.5μM的通用反向引物，0.5μM的第一通用探针。进一步地，检测G12C突变的反应体系还包括：0.05μM的内控引物对中的正向引物，0.5μM的内控引物对中的反向引物，0.1μM的内控探针。
其中一个实施例中，检测G12D突变的反应体系包括：1.75mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.25μM的第四正向引物，0.75μM的通用反向引物，0.25μM的第二通用探针。进一步地，检测G12D突变的反应体系还包括：0.05μM的内控引物对中的正向引物，0.5μM的内控引物对中的反向引物，0.1μM的内控探针。
其中一个实施例中，检测G12A突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.1μM的所述第五正向引物，0.5μM的所述通用反向引物，0.5μM的所述第一通用探针。进一步地，检测G12A突变的反应体系还包括：0.05μM的内控引物对中的正向引物，0.5μM的内控引物对中的反向引物，0.1μM的内控探针。
其中一个实施例中，检测G12V突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的第六正向引物，0.5μM的通用反向引物，0.5μM的第一通用探针。进一步地，检测G12V突变的反应体系还包括：0.05μM的内控引物对中的正向引物，0.5μM的内控引物对中的反向引物，0.1μM的内控探针。
其中一个实施例中，检测G13D突变的反应体系包括：1.75mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.25μM的第七正向引物，1μM的通用反向引物，0.25μM的第二通用探针。进一步地，检测G13D突变的反应体系还包括：0.05μM的内控引物对中的正向引物，0.5μM的内控引物对中的反向引物，0.1μM的内控探针。
其中一个实施例中，KRAS基因突变的核酸组合物还包括质控引物对和质控探针。质控反应体系为：4mM的MgCl2，10mM的Tris，50mM的KCl，200mg/L的BSA，0.1mM的dNTPs，1.125U的rtaq酶，0.3μM的质控引物对中的正向引物，0.3μM的质控引物对中的反向引物，0.225μM的质控探针。
本研究的KRAS基因突变的检测方法能够非疾病的治疗和诊断的检测KRAS基因突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；能够适用于血浆或者FFPE样本的检测。
以下为具体实施例部分。
实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
提供一种检测KRAS基因突变的试剂盒。
该试剂盒包括：
检测KRAS基因突变的核酸组合物(如表1所示)、dNTPs、PCR反应液、酶混合液、阳性对照品和空白对照品。
其中，酶混合液包括酶Ⅰ混合液和酶Ⅱ混合液。酶Ⅰ混合液为不具有5’端到3’端外切酶活性的Taq酶和抗体等混合物。酶Ⅱ混合液为5’端到3’端外切酶活性和抗体等混合物。其中，Taq酶购于TAKARA生物公司和广州百旺生物技术有限公司，抗体购于TOYOBO公司。
阳性对照品为人类KRAS基因G12S阳性质粒、G12R阳性质粒、G12C阳性质粒、G12D阳性质粒、G12A阳性质粒、G12V阳性质粒、G13D阳性质粒和野生型人类基因组DNA的混合物。
空白对照品为超纯水。
检测G12S突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的K-12-1aF，1μM的K-X2-R1，0.25μM的K-P，0.05μM的CFTR-F，0.5μM的CFTR-R4，0.1μM的CFTR-P。
检测G12R突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.1μM的K-12-1cF，0.5μM的K-X2-R1，0.5μM的K-P，0.05μM的CFTR-F，0.5μM的CFTR-R4，0.1μM的CFTR-P。
检测G12C突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.1μM的K-12-1tF，0.5μM的K-X2-R1，0.5μM的K-P，0.05μM的CFTR-F，0.5μM的CFTR-R4，0.1μM的CFTR-P。
检测G12D突变的反应体系包括：1.75mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.25μM的K-12-2aF8，0.75μM的K-X2-R1，0.25μM的K-P-1，0.05μM的CFTR-F，0.5μM的CFTR-R4，0.1μM的CFTR-P。
检测G12A突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.1μM的K-12-2cF，0.5μM的K-X2-R1，0.5μM的K-P，0.05μM的CFTR-F，0.5μM的CFTR-R4，0.1μM的CFTR-P。
检测G12V突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的K-12-2tF，0.5μM的K-X2-R1，0.5μM的K-P，0.05μM的CFTR-F，0.5μM的CFTR-R4，0.1μM的CFTR-P。
检测G13D突变的反应体系包括：1.75mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.25μM的K-13-2aF8，1μM的K-X2-R1，0.25μM的K-P-1，0.05μM的CFTR-F，0.5μM的CFTR-R4，0.1μM的CFTR-P。
质控反应体系为：4mM的MgCl2，10mM的Tris，50mM的KCl，200mg/L的BSA，0.1mM的dNTPs，1.125U的rtaq酶，0.3μM的K-Q-F，0.3μM的K-Q-R，0.225μM的K-Q-P。
表1检测KRAS基因突变的核酸组合物
Figure BDA0002721301670000271
Figure BDA0002721301670000281
实施例2
采用实施例1检测样本的KRAS基因突变，具体实施步骤如下：
1、待测样本的提取
组织样本使用QIAGEN的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit进行提取，血浆样本使用QIAGEN公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid进行提取。提取过程应严格按照说明书要求进行。组织样本提取后的核酸稀释浓度2～100ng/μL，血浆提取后的核酸浓度应不少于2ng/μL，纯度都应满足A260/A280比值范围在1.6～2.3之间。模版可直接用于后续实验或置于-20℃冰箱备用，避免反复冻融。
2、试剂配置
(1)根据检测样品数量及实验设计，取对应检测需要的8联管、PIK3CA质控PCR反应液、酶Ⅰ混合液、酶Ⅱ混合液、PIK3CA阳性对照、超纯水一起放置冰上或4℃冰箱里。
(2)将8联管、PIK3CA阳性对照及样本混匀后微离心，放置冰上；DNA聚合酶和纯化水微离心后置冰上；按照下表2和表3的反应体系进行配置，每个样品、阳性对照及NTC各配制一个混合液mix A和一个混合液mix B。
表2 mix A的配液组份表
Figure BDA0002721301670000282
Figure BDA0002721301670000291
表3 mix B配液组份表
Figure BDA0002721301670000292
(3)轻取8联管，固定在加样板上，不得剧烈晃动，并轻轻揭开8联管管盖，将混合液mix B加入8联管中第6孔中，每孔加入16μl，将混合液mix A分别加入对应的8联管中1-7号，每孔加入5μL；在联管中6号中加入4μL的样本，然后小心盖上8联管管盖；加样完成的8联管轻轻混匀后微离心。
(4)将8联管放入PCR仪器中，按照加样布局排列，推荐排列布局详见表4。
表4 PCR仪96孔板建议布局
名称 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
G12S 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10 阳性对照 空白对照
G12R 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10 阳性对照 空白对照
G12C 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10 阳性对照 空白对照
G12D 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10 阳性对照 空白对照
G12A 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10 阳性对照 空白对照
G12V 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10 阳性对照 空白对照
G13D 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10 阳性对照 空白对照
质控 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10 阳性对照 空白对照
(5)PCR扩增荧光检测(PCR扩增区)
将各反应管按照一定顺序放入荧光定量PCR仪上，按照表5设置反应程序，进行反应。
表5 PCR扩增反应程序
Figure BDA0002721301670000301
备注：荧光通道选择FAM，CY5检测通道。
3、检测结果的解释
(1)试剂盒有效性情况判断：
(a)空白对照在熔解分析后，FAM通道和CY5通道无明显熔解峰；若分析后出现明显熔解峰，可能为试剂受到污染或操作过程中污染，请排除污染源后重新检测。
(b)阳性对照管在熔解曲线分析后，FAM通道和CY5通道出现单独熔解峰，FAM通道的熔解曲线Tm值在59～64℃(TL988仪器为57～63℃)范围内，CY5通道的熔解曲线Tm值在63±2℃范围内。
(2)样本有效性的判断：
(a)Threshold的设置：根据仪器自动设置的情况，确认Threshold是否位于扩增曲线log图斜率的1/2处，如果发现Threshold位置太高或太低，请手动调整Threshold至扩增曲线log图斜率的1/2处再分析。
(b)质控PCR反应液：若为石蜡样本，则FAM通道27≤Ct值<31；若为非石蜡样本，则FAM通道25≤Ct值<29，满足上述1)要求，说明所加入的样本基因组DNA量适中，继续分析。
(c)质控PCR反应液：若为石蜡样本，FAM通道Ct值>31；若为非石蜡样本，FAM通道Ct值>29，则说明所加入的样本基因组DNA含量过低，只有突变DNA含量较高的样本可能可以检测出突变类型，也可能为DNA样本中存在着PCR抑制剂，建议重新制备样本或者增加使用量进行检测。
(d)质控PCR反应液：若为石蜡样本，FAM通道Ct值<27；若为非石蜡样本，FAM通道Ct值<25，说明所加入样本基因组DNA过量，建议稀释后重新检测。
(e)质控PCR反应液仅用于判断样本的有效性，通过FAM通道的扩增曲线判定样本情况。
(3)检测结果的判定：若满足1和2要求，表明此时检测成功，对样本管进行分析。
(a)样品反应管中CY5通道出现单独熔解峰，且熔解曲线的Tm值在63±2℃范围内，FAM通道无熔解峰，则该样本判定为阴性，见图1。图1为临床确诊为阴性样本的检测结果示例图。图1中，横坐标为温度，单位为℃，纵坐标的“-dF/dT”表示荧光强度的变化对温度变化的求导。
(b)样品反应管中CY5通道出现单独熔解峰，且熔解曲线的Tm值在63±2℃范围内，FAM通道出现单独熔解峰，且熔解曲线的Tm值在59～64℃(TL988仪器为57～63℃)范围内则该样本判定为阳性，见图2。图2为临床确诊为阳性样本的检测结果示例图。图2中，横坐标为温度，单位为℃，纵坐标的“-dF/dT”表示荧光强度的变化对温度变化的求导。
(c)样品反应管中CY5通道未出现单独熔解峰，但FAM通道出现单独熔解峰，且熔解曲线的Tm值在59～64℃(TL988仪器为57～63℃)范围内，则该样本也判定为阳性。
(d)样品反应管中CY5通道出现单独熔解峰，且熔解曲线的Tm值在63±2℃范围内，若样本中多个反应孔出现FAM通道的熔解峰，且熔解曲线的Tm值在59～64℃(TL988仪器为57～63℃)范围内，则该样本也判定为阳性。
实施例3
采用实施例1的检测KRAS基因突变的试剂盒的检测限
取人类KRAS基因野生型基因组，人KRAS基因各突变型质粒及TE buffer缓冲液，制备同时含有5ng/μL的人KRAS野生型DNA及含量分别为野生型的10％、1％和0.1％的人KRAS各突变型基因质粒，记录阳性检出率。具体实施步骤参见实施例2，此处不再赘述。
检测结果详见图3～图9。图3为G12A突变位点检测能力测试图，实线为目的基因，虚线为内参基因。图4为G12C突变位点检测能力测试图，实线为目的基因，虚线为内参基因。图5为G12R突变位点检测能力测试图，实线为目的基因，虚线为内参基因。图6为G12V突变位点检测能力测试图，实线为目的基因，虚线为内参基因。图7为G12S突变位点检测能力测试图，实线为目的基因，虚线为内参基因。图8为G13D突变位点检测能力测试图，实线为目的基因，虚线为内参基因。图9为G12D突变位点检测能力测试图，实线为目的基因，虚线为内参基因。图3～图9中，横坐标为温度，单位为℃，纵坐标的“-dF/dT”表示荧光强度的变化对温度变化的求导。
从图3～图9可以看出，上述检测KRAS基因突变的试剂盒，能够检测出5ng野生型背景下突变比例为0.1％的上述7种KRAS基因突变，检测灵敏度和特异性较高。
本研究的检测KRAS基因突变的试剂盒本研究的检测KRAS基因突变的试剂盒结合了ARMS引物、分子信标探针和探针熔解曲线等技术，能够用于检测KRAS基因上第12号密码子和第13号密码子上的7种热点突变，检测用时短，完成一次检测用时只需1.5h；无须产物后处理分析含有内外质控排除假阴性和假阳性；结果判读简单，准确。只需看熔解曲线的峰和TM值，即可判读阴阳性；灵敏度和特异性高，一般可以检测到0.1％的突变DNA；用质控管对样品DNA质量进行监控，能够适用于血浆或者FFPE样本的检测，尤其适用于检测靶序列含量低的样本；7管同时检测，检测效率高，整个过程闭管操作、简便快捷、同时大大降低污染机率。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 苏州中科先进技术研究院有限公司
<120> 检测KRAS基因突变的核酸组合物及其试剂盒和检测方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgtggtagt tggagc 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgtggtagt tggagc 16
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgtggtagt tggagc 16
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgtggtagtt ggagcag 17
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtggtagttg gagct 15
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgtggtagtt ggagct 16
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtagttggag ctggag 16
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttggatcata ttcgtccac 19
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgctggagct ggtggcgtag ggcg 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgctggagct ggtggcgtag ggcg 24
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcaaagatct cacagcaaaa tac 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ctaacaaagc aagcagtgtt ca 22
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cggtggaaat gccatattag agaacaccg 29
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acctctattg ttggatcata ttc 23
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttatttttat tataaggcct gctg 24
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
attagctgta tcgtcaaggc actcttgcc 29

Claims (11)

1.一种检测KRAS基因突变的核酸组合物，其特征在于，包括：
用于检测KRAS基因的G12S突变的第一正向引物，所述第一正向引物的序列如SEQ IDNo.1所示，序列如SEQ ID No.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针；
及/或，用于检测KRAS基因的G12R突变的第二正向引物，所述第二正向引物的序列如SEQ ID No.2所示，序列如SEQ ID No.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针；
及/或，用于检测KRAS基因的G12C突变的第三正向引物，所述第三正向引物的序列如SEQ ID No.3所示，序列如SEQ ID No.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针；
及/或，用于检测KRAS基因的G12D突变的第四正向引物，所述第四正向引物的序列如SEQ ID No.4所示，序列如SEQ ID No.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.10所示的第二通用探针；
及/或，用于检测KRAS基因的G12A突变的第五正向引物，所述第五正向引物的序列如SEQ ID No.5所示，序列如SEQ ID No.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针；
及/或，用于检测KRAS基因的G12V突变的第六正向引物，所述第六正向引物的序列如SEQ ID No.6所示，序列如SEQ ID No.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.9所示的第一通用探针；
及/或，用于检测KRAS基因的G13D突变的第七正向引物，所述第七正向引物的序列如SEQ ID No.7所示，序列如SEQ ID No.8所示的通用反向引物，序列如SEQ ID No.10所示的第二通用探针。
2.根据权利要求1所述的检测KRAS基因突变的核酸组合物，其特征在于，还包括：用于检测内控基因的内控引物对和内控探针。
3.根据权利要求2所述的检测KRAS基因突变的核酸组合物，其特征在于，所述内控基因为CFTR基因，所述内控引物对的序列如SEQ ID No.11及SEQ ID No.12所示，所述内控探针的序列如SEQ ID No.13所示。
4.根据权利要求2～3任一项所述的检测KRAS基因突变的核酸组合物，其特征在于，所述内控探针的两端分别连接有内控荧光报告基因和内控荧光淬灭基团；
所述检测KRAS基因突变的核酸组合物中含有所述第一通用探针时，所述第一通用探针的两端分别连接有第一荧光报告基团和第一荧光淬灭基团，所述第一荧光报告基因与所述内控荧光报告基因不同；
所述检测KRAS基因突变的核酸组合物中含有所述第二通用探针时，所述第二通用探针的两端分别连接有第二荧光报告基团和第二荧光淬灭基团，所述第二荧光报告基因与所述内控荧光报告基因不同。
5.一种检测KRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的检测KRAS基因突变的核酸组合物。
6.根据权利要求5所述的检测KRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，所述检测KRAS基因突变的核酸组合物还包括质控引物对和质控探针。
7.根据权利要求5所述的检测KRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，所述质控引物对的序列如SEQ ID No.14及SEQ ID No.15所示，所述质控探针的序列如SEQ ID No.16所示。
8.根据权利要求5～7任一项所述的检测KRAS基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取试剂、dNTPs、PCR反应液、酶混合液中的至少一种。
9.一种KRAS基因突变的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
向待测样品中加入权利要求1～4任一项所述的检测KRAS基因突变的核酸组合物进行PCR扩增反应，根据反应结果进行检测分析。
10.根据权利要求9所述的KRAS基因突变的检测方法，其特征在于，检测所述G12S突变的反应体系包括：4mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的所述第一正向引物，1μM的所述通用反向引物，0.25μM的所述第一通用探针；
检测所述G12R突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.1μM的所述第二正向引物，0.5μM的所述通用反向引物，0.5μM的所述第一通用探针；
检测所述G12C突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.1μM的所述第三正向引物，0.5μM的所述通用反向引物，0.5μM的所述第一通用探针；
检测所述G12D突变的反应体系包括：1.75mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.25μM的所述第四正向引物，0.75μM的所述通用反向引物，0.25μM的所述第二通用探针；
检测所述G12A突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.1μM的所述第五正向引物，0.5μM的所述通用反向引物，0.5μM的所述第一通用探针；
检测所述G12V突变的反应体系包括：2mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.05μM的所述第六正向引物，0.5μM的所述通用反向引物，0.5μM的所述第一通用探针；
检测所述G13D突变的反应体系包括：1.75mM的MgCl2，50mM、pH8.3的Tris，500mg/L的BSA，100μM的dNTPs，0.4U的Taq酶，0.25μM的所述第七正向引物，1μM的所述通用反向引物，0.25μM的所述第二通用探针。
11.根据权利要求9～10任一项所述的KRAS基因突变的检测方法，其特征在于，所述检测KRAS基因突变的核酸组合物还包括质控引物对和质控探针，所述质控反应体系为：4mM的MgCl2，10mM的Tris，50mM的KCl，200mg/L的BSA，0.1mM的dNTPs，1.125U的rtaq酶，0.3μM的所述质控引物对中的正向引物，0.3μM的所述质控引物对中的反向引物，0.225μM的所述质控探针。
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