CN114196757B

CN114196757B - Kras基因突变多重检测引物探针及其试剂盒

Info

Publication number: CN114196757B
Application number: CN202111617386.7A
Authority: CN
Inventors: 洪专; 潘文健
Original assignee: Prius New Shanghai Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Prius New Shanghai Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2024-02-23
Anticipated expiration: 2041-12-28
Also published as: CN114196757A

Abstract

本发明涉及一种KRAS基因突变多重检测引物探针及其试剂盒包括上游引物，下游引物，G12位点野生型探针WP‑G12，G13位点野生型探针WP‑G13，检测KRAS基因2号外显子G12位点突变的突变型探针MP‑G12D、突变型探针MP‑G12C、突变型探针MP‑G12V、突变型探针MP‑G12S、突变型探针MP‑G12A、突变型探针MP‑G12R，检测KRAS基因2号外显子G13位点突变的突变型探针MP‑G13D。本发明的KRAS基因突变多重检测引物探针及其试剂盒快速高效，标准品的配制简单，检测体系的特异性与灵敏度高，游离DNA的利用率高，准确度高。

Description

KRAS基因突变多重检测引物探针及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种KRAS基因突变检测产品，属于生物技术领域。

背景技术

在所有NSCLC的治疗预后生物标志物中，KRAS突变的特征是其高频率事件(接近腺癌的30％)，KRAS阴性预示着具有较好的预后，阳性突变患者缺乏有效的靶向治疗。KRAS基因突变存在于40％的结直肠腺癌中，是对抗表皮生长因子受体(抗anti-EGFR)9抗体无反应的预测标志物。美国国立综合癌症网络(NCCN)明确指出：所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态，并且不建议KRAS基因突变的非小细胞肺癌患者使用特罗凯进行分子靶向治疗。最近的临床前发现和早期试验表明，使用KRAS信号传导的下游靶向药物或直接靶向KRAS突变蛋白对治疗该类突变患者具有潜在的有效策略。循环肿瘤DNA(ctDNA)存在于晚期癌症患者的血浆中，ctDNA是结肠直肠癌(CRC)患者的预后标志物，也可用于预测对靶向治疗的反应，KRAS的突变表明那些患者将对特定治疗(西妥昔单抗、帕尼妥马抗)无效。

在细胞死亡后，肿瘤释放的DNA可以在血液和其他体液中检测到，如淋巴结、粪便和尿液中检测到。虽然ctDNA来自于存在体细胞突变，ctDNA与野生型DNA的比例可能低至1/10000，目前传统的突变检测方法无法对其准确的检测，通常超出了qPCR或dPCR方法的能力。对患者的血液样本(即液体活检)进行基因突变的评估有巨大优势。ctDNA的鉴定和定量可用于评估对治疗和监测疾病复发。此外，它可以提供突变状态的实时评估，而不必依赖于原发肿瘤的样本或需要转移部位的侵入性活检。使用ctDNA的能力也提高了在癌症成为临床可检测到之前进行筛查和早期诊断的可能性。目前在临床实践中使用的突变检测方法的中等灵敏度限制了ctDNA的检测。传统方法的敏感性阈值约为1％，但ctDNA可能只代表总循环DNA的一小部分。在早期癌症中，这个比例可能为0.01％。使用数字PCR(dPCR)来检测和定量KRAS致癌基因中7个最常见的突变，可是我们能更早期、更灵敏和准确的检测KRAS基因的突变情况，能很好的解决早期检测困难，并能无创实时检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速高效，检测体系的特异性与灵敏度高，游离DNA的利用率高，准确度高的KRAS基因突变多重检测引物探针，以及采用该引物探针的试剂盒。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种KRAS基因突变多重检测引物探针，包括上游引物，下游引物，G12位点野生型探针WP-G12，G13位点野生型探针WP-G13，检测KRAS基因2号外显子G12位点突变的突变型探针MP-G12D、突变型探针MP-G12C、突变型探针MP-G12V、突变型探针MP-G12S、突变型探针MP-G12A、突变型探针MP-G12R，检测KRAS基因2号外显子G13位点突变的突变型探针MP-G13D；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述野生型探针WP-G12的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述野生型探针WP-G13的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述突变型探针MP-G12D的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述突变型探针MP-G12C的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述突变型探针MP-G12V的核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示，所述突变型探针MP-G12S的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；所述突变型探针MP-G12A的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；所述突变型探针MP-G12R的核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示，所述突变型探针MP-G13D的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。

上述突变型探针MP-G12D的使用浓度为10nM，所述突变型探针MP-G12C的使用浓度为40nM，所述突变型探针MP-G12V的使用浓度为40nM，所述突变型探针MP-G12S的使用浓度为50nM，所述突变型探针MP-G12A的使用浓度为60nM，所述突变型探针MP-G12R的使用浓度为30nM，所述突变型探针MP-G13D的使用浓度为20nM。

上游引物和下游引物的使用浓度为50nM。野生型探针WP-G12和野生型探针WP-G13的使用浓度为20nM。

所有野生型探针和突变型探针为经过修饰的MGB探针，所有野生型探针的5’端为VIC荧光基团修饰，所有突变型探针的5’端为FAM荧光基团修饰，所有突变型探针的3’端为NFQ基团修饰。

本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述引物探针的KRAS基因突变多重检测试剂盒。

上述KRAS基因突变多重检测试剂盒还包括带有KRAS基因G12D、G12C、G12V、G12S、G12A、G12R和G13D突变的质粒。

本发明具有积极的效果：

(1)本发明的KRAS基因突变多重检测产品采用的标准品是用酶切后的正常cfDNA和酶切后的插入KRAS基因G12D、G12C、G12V、G12S、G12A、G12R和G13D突变片段的突变质粒按拷贝数比例配制而成，不同突变频率标准品起到不同的作用。标准品采用cfDNA和质粒可以最大程度的还原检测样本的特征，给体系的优化提供了很多的基础，在体系优化中起到决定性的作用。

(2)本发明的KRAS基因突变多重检测产品通过中突变频率标准品的数字PCR检测结果确定各突变探针在不同浓度下产生的终点荧光信号值，使得数据统计的结果更加准确。本发明的KRAS基因G12D、G12C、G12V、G12S、G12A、G12R和G13D突变检测体系通过野生型模板的数字PCR检测结果确定检测体系各突变位点的背景阈值，检测样本的突变拷贝数时，突变拷贝数等于检测结果减去背景阈值，可以使得结果更加准确。

(3)本发明的KRAS基因突变多重检测产品通过低突变频率标准品的数字PCR检测结果，可以确定检测体系的灵敏度。

(4)本发明的KRAS基因突变多重检测产品检测突变的优化通过高突变频率标准品的传统实时荧光PCR检测结果进行各探针浓度优化，根据各突变不同浓度探针反应后荧光强度的差异，选择合适的探针浓度，该方法结果准确，成本较低。

(5)本发明的KRAS基因G12D、G12C、G12V、G12S、G12A、G12R和G13D突变检测体系的引物探针为自行设计，探针为MGB探针，探针序列更短，特异性好。引物探针经过多重组合优化选定，扩增效率高，灵敏度高。

(6)本发明的KRAS基因突变多重检测产品快速，高效，成本较低，准确度高可根据样本中微量的KRAS基因G12D、G12C、G12V、G12S、G12A、G12R和G13D突变ctDNA快速准确的监测出肿瘤患者EGFR基因发生的各种突变，因此可将数字PCR平台用于ctDNA的检测，能及时监测患者新的基因突变的发生，为临床治疗方案的制定和调整提供依据。

附图说明

图1为实施例的试剂盒检测全野生型模板的反应数据结果图；

图2为实施例的试剂盒检测突变野生比为0.5的模板的反应数据结果图；

图3为实施例的试剂盒检测突变野生比为0.0001的模板的反应数据结果图；

图4为不同浓度突变型探针的突变信号FAM荧光的强度分布图。

具体实施方式

下面介绍的内容是通过具体实施例对本发明内容进行描述，其中需要指出的有：接下来的实施例只用于对本发明进行说明，并不表示对该发明所保护范围的限制，任何第三方可以根据本发明所阐述的方法及内容作出一些非本质的改进和调整。在接下来的实施例中，除存在特别申明，所用的试剂均默认为分析纯，所用试剂均可通过商业购买获得。该发明未做出明确表示的实验方法，基本可按照常规实验方法如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》书籍中所公布的基础生化分子实验方法进行完成，或者按照试剂供应商明确表明的实验方法进行得到。除了少数文中明确指出的定义，文中所涉及的全部专业和科学用语与本领域技术人员所共识的意义一致。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

主要试剂：

本专利内容涉及所有实验所用试剂耗材均从正规试剂耗材生产厂商购买，用到主要试剂有(少数通用常规试剂不再列举)：25×Droplet stabilizer(RainDance)、TaqManGenotypingMaster Mix(2×)(Applied Biosystems)、EcoR I内切酶(TAKARA，1040A)、10×T Buffer(TAKARA，1116A)、0.1％BSA(TAKARA，1116A)、质粒小量提取试剂盒(D1100，北京索莱宝科技有限公司)、QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(50)(55114，Qiagen公司)、Qubit^TMdsDNA HS Assay Kit(Q32854)等。

主要仪器：

磁力架、漩涡震荡仪、3.0荧光定量仪、高速离心机、MiniAmp PCR仪(厂家：Applied Biosystems)、生物安全柜、水浴锅、RainDropSource(RainDance Technologies)、移液枪、RainDropSense(RainDance Technologies)等。

实施例

本实施例的KRAS基因突变多重检测试剂盒包括上游引物F-E2，下游引物R-E2，G12位点野生型探针WP-G12，G13位点野生型探针WP-G13，检测KRAS基因2号外显子G12位点突变的突变型探针MP-G12D、突变型探针MP-G12C、突变型探针MP-G12V、突变型探针MP-G12S、突变型探针MP-G12A、突变型探针MP-G12R，检测KRAS基因2号外显子G13位点突变的突变型探针MP-G13D，，带有KRAS基因G12D、G12C、G12V、G12S、G12A、G12R和G13D突变的质粒。

本实施例中涉及的引物、探针和质粒的设计均有普瑞斯新(上海)生物医疗科技有限公司实验室技术人员自行设计，合成单位是南京金斯瑞生物科技有限公司完成，引物和探针的核苷酸序列如表1所示。

表1引物探针特征表

引物为常规引物，探针为经过修饰的MGB探针，所有野生型探针的5’端荧光修饰基团为VIC荧光，3’端为NFQ基团修饰；所有突变型探针的5’端荧光修饰基团为FAM荧光，3’端为NFQ基团修饰。

本实施例中用到的野生型扩增模板采用的是非肿瘤患者健康人游离DNA(cfDNA)，突变型扩增模板采用的是实验室人工构建的质粒，该质粒经过内切酶酶切处理成线性结构。

将野生型模板和突变型模板按不同的拷贝数比例配制成理论突变频率的模板，制备方法如下：

1.样本抽提。

血浆抽提使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(50)(55114，Qiagen公司)试剂盒进行，具体操作步骤可以参考该试剂盒的产品说明。

质粒的提取采用的是质粒小量提取试剂盒(D1100，北京索莱宝科技有限公司)，按照产品说明书进行，具体操作步骤可以参考该试剂盒的官方说明书。

2.cfDNA和突变质粒的浓度测定。

提取得到的cfDNA和质粒用为3.0荧光定量仪，使用Qubit^TMdsDNA HSAssay Kit(Q32854)进行定量，具体的实验操作步骤参照试剂盒中自带的说明书。

3.标准品的制备。

1)质粒模板酶切线化及回收。

血浆游离DNA为高度片段化的核酸双链，无需进行片段化。

将定量后的突变质粒进行酶切，如下表2所示。

表2各种突变质粒的酶切反应体系

成分	用量
		10×SEBuffer	10μl
BSA	10μl
		EcoRⅠ	1.0μl
质粒DNA	79.0μl

酶切后的突变采用磁珠法回收方法如下：

a.将酶切后的产物全部转移至一个1.5ml的EP管中，向EP管中加入AmPure XPReagent磁珠，反复吹打混匀，室温静置，计时5min。

b.将EP转移至磁力架上，静置10min，磁珠和溶液分离，待磁珠完全吸附于管壁，用移液器吸取液体，弃溶液。

c.加入用200μl新鲜配置的80％的乙醇水溶液，没过磁珠。

d.弃清洗过的乙醇溶液，重复上一步，弃乙醇溶液，并用10μl移液器吸去残留的少量溶液，晾干。

e.待磁珠干燥，用80μl的去离子水加入EP管子，溶解磁珠，吹打混匀，至于磁力架上，静置约10min，至磁珠和液体完全分离。

f.小心吸取转移79μl的澄清的DNA溶液于新的EP管中。

g.将纯化得酶切产物，取1μl使用3.0进行定量。

2)配置实验所需标准品

①理论上，人类DNA每1ng的单个基因拷贝数约300ng计算，将血浆游离DNA(cfDNA)逐级稀释到约2.0×10⁵copies/μl。

②酶切后得到的质粒拷贝数计算，9.1×10⁸×质粒浓度(ng/μl)÷质粒长度(2800bp)；将得到的质粒逐级稀释到2.0×10⁶copies/μl、2.0×10⁵copies/μl、2.0×10²copies/μl、20copies/μl。

③配置实验所需标准品：取10ul的2.0×10⁵copies/μlcfDNA和同等体积的2.0×10⁵copies/μl的突变质粒溶液混匀，再加入同等体积去离子水，得到1.0×10⁵copies/μl模板，突变频率0.5，取10ul的2.0×10⁵copies/μlcfDNA和1ul体积的2.0×10³copies/μl的突变质粒溶液混匀，再加入9ul的去离子水，得到1.0×10⁵copies/μl模板，突变频率为0.001模板；取10ul的2.0×10⁵copies/μlcfDNA和1ul体积的2.0×10²copies/μl的突变质粒溶液混匀，再加入9ul的去离子水，得到1.0×10⁵copies/μl模板，突变频率为0.0001模板。

本实施例使用MiniAmp PCR仪(厂家：Applied Biosystems)测定各突变位突变型探针的最适工作浓度，以达到在实验反应的终点区分开各突变位点的目的。

本实施例采用实时荧光定量(qPCR)反应进行探针浓度的优化。

根据开发的目的，确定三组引物(50nM)和三种野生型探针(20nM)的工作浓度恒定不变，将三组引物和三位点的野生型探针提前混合均匀成MIX1，分别调节各突变型探针的工作浓度，以最大限度使各突变型探针的区分相互独立：

确定将各突变位点的突变型探针实验终浓度分别是10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、和60nM。使用突变型模板和野生型模板按照拷贝数比例1∶1配制成扩增模板，根据表3所示的qPCR反应体系组分表，配制qPCR反应体系。

表3 qPCR反应体系组分表

其中的x表示突变型探针的体积。

根据表4所示的qPCR反应程序进行qPCR反应。在MiniAmp PCR仪(厂家：AppliedBiosystems)反应28各循环。

表4 qPCR的反应程序

qPCR反应结束，在突变模板和野生型模板在1∶1情况下，记录在各突变探针浓度下，突变的荧光信号值，根据各荧光信号值汇总统计，综合统筹选出多重体系中各探针最适合的浓度，避免数字PCR(ddPCR)反应各反应微滴的相互干扰。

表5 qPCR反应结果

根据各探针的终点荧光信号值做出如图4所示的突变信号FAM荧光的强度分布图，由图中各突变信号的荧光值的位置就可以合理挑选出多重ddPCR体系中各突变探针的浓度值。

由图4可知，确定三组引物(50nM)和三种野生型探针(20nM)的工作浓度恒定不变时，随着突变型探针的工作浓度不断上升时，荧光值在不断上升，继而到达平台期，此时随着浓度的上升荧光值并没有随之上升，根据各探针在不同浓度下的荧光信号的差异，选择各突变位点终点信号差异最大的荧光浓度作为ddPCR进行后续的检测实验和试剂盒开发。由以上原则，选择各突变型探针最适合的探针浓度为：MP-G12D：10nM，MP-G12C:40nM，MP-G12V:40nM，MP-G12S:50nM，MP-G12A:60nM，MP-G12R:30nM，MP-G13D:20nM。这七种探针浓度组合时，突变信号值相互影响最小，可大大降低假阳性和提高检测的灵敏度。

本实施例的KRAS基因突变多重检测试剂盒根据以上的实验结论，进行下一步ddPCR反应，验证该体系的有效性，先根据上述结论将所有引物探针配制成MIX2，然后加入公共试剂成分和反应模板进行后续实验，ddPCR反应体系如表6所示。

表6 ddPCR反应体系组分表

使用突变型模板和野生型模板按照表7所示的突变频率配制成相应的突变模板。

表7 ddPCR反应突变模板

进行dPCR反应，ddPCR反应程序如表8所示。

表8 ddPCR反应程序表

反应结束后，采用RainDance公司仪器自带的桌面化软件RainDropAnalystⅡ(V1.0.0)进行后续的分析，步骤如下：

1.双击打开RainDropAnalystⅡ软件，左键点击“Add sample”机器自动读取fcs数据文件导入该软件，准备进行后续的分析。

2.第一步选定突变频率为0.5样本数据进行分析，此时，可粗略选定阴性点集合、野生型探针VIC荧光点集合和带有FAM荧光的突变型点集，使用“Apply spectralcompensation”功能按钮，纵坐标设置成FAM荧光信号值，横坐标设置成了Vic设置成信号值。

3.软件界面“Elliptical Gate”功能框可选取并调整聚集点的区域范围，选取的聚集点尽可能集中，并使其阳性突变频率尽可能接近理论值50％的突变频率，将该标准品的选择区域范围作为标准选取范围标准，并将应用于其他样本的分析。

使用本实施例的反应体系在进行数据分析时，需将已知各位点突变为0.5的标准品使用同一实验体系和实验条件伴随进行。首先分析突变频率为0.5的标准品实验所得的数据，以此确定野生型聚集点区域和各突变位点聚集区的最适区域，为样本分析提供最适选择区域。与此同时，由突变频率为0.5的标准品计算出每一突变位点野生突变位点的比例常数k，k＝Tt/Na，常数k将用于该批次反应拥有不同突变频率样本的野生型位点数的计算，如图2所示，G12D:k＝1555203/4576751＝0.339；G12C:k＝1502484/4576751＝0.328；G12V：k＝1344328/4576751＝0.293；G12A:k＝1520057/4576751＝0.332；G12R:k＝1397047/4576751＝0.305；G13D：k＝1511271/4576751＝0.330。

使用本实施例的KRAS基因突变多重检测试剂盒的过程中，需设置全野生型的标准品采用同样的体系和方法进行伴随实验，全野生型标准品分析得到突变区域内的阳性位点个数为同一批样本的假阳性背景数值(Tf)，如图1所示，G12D:9，G12C:9，G12V:7，G12A:6，G12S:8，G12R:7，G13D:8。真阳性位点值(Tt)＝总位点数(Tn)-假阳性背景数值(Tf)如图3所示，G12D:162-9＝153，G12C:181-9＝172，G12V:152-7＝145，G12S:163-8＝155，G12A:172-6＝166，G12R:156-7＝149，G13D:173-8＝165。

使用本实施例的反应体系和反应程序，在各位点突变频率计算时，突变频率(V)＝Tt/(Tt+Nt)*100％，其中Nt代表该位点的野生型突变位点数，Nt＝k*Na，N a是总的野生型位点数，k由突变频率为0.5的标准品实验体系计算得到。如图3所示，G12D:0.0094％，G12C:0.011％，G12V:0.010％，G12A:0.010％，G12S:0.010％，G12v:0.010％，G13D:0.010％，所以该试剂盒的灵敏度可达到万分之一，特异性较好、信噪比高。

本发明的KRAS基因突变多重检测试剂盒将用于解决血浆游离cfDNA检测突变灵敏都不够、灵敏度低、准确度低和血浆游离cfDNA不足等问题，该检测方法体系还可用于，全血、脑脊液、胸腹水和组织样品。

本发明是提供一种基于数字PCR系统的KRAS基因多点突变的多重反应体系，提高血浆游离DNA(cfDNA)中微量肿瘤DNA(ctDNA)KRAS基因2号外显子G12D、G12C、G12V、G12S、G12A、G12R和G13D突变的检测灵敏度和准确度，独立的一个ddPCR反应体系同时检测7个KRAS基因多重热点突变，提高了血浆游离DNA的利用效率，降低检测成本，并在后期通过优化体系进行试剂盒的开发。

本发明野生型模板是酶切后的正常人体cfDNA，突变型模板是酶切后的插入KRAS基因各突变片段的突变质粒。将突变型模板和野生型模板按1∶1的拷贝数比例配制成中突变频率标准品，首先使用普通的荧光定量qPCR仪器上进行充分的PCR反应，反应模板为突变频率为0.5的模板和纯野生型模板，探针浓度设置了10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM各级浓度，PCR反应后采集突变探针产生的终点荧光值，根据各终点荧光探针对应的荧光值的差异。在坐标系中标出各浓度下，突变探针对应的荧光值，选择接下来多重dPCR各探针的浓度的合理配置。由于在统一反应管中反应，野生型探针产生荧光终点值是一致的，使突变型探针对应的荧光信号值彼此差异最大化，即是选择的合理探针搭配。采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域，突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同。

采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应，突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。

将突变型模板和野生型模板按1∶1，1∶10000的拷贝数比例配制成低突变频率标准品，采用数字PCR以低突变频率标准品为模板进行反应，若突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数大于所述背景阈值的2.5倍，则该检测体系的灵敏度达到低突变频率标准品的拷贝数比例相同的值。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 普瑞斯新（上海）生物医疗科技有限公司

<120> KRAS基因突变多重检测引物探针及其试剂盒

<130> 无

<141> 2021-12-27

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 1

ctgaaaatga ctgaatataa acttgtgg 28

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 2

tagctgtatc gtcaaggcac tc 22

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 3

ttggagctgg tggcgta 17

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 11

ctggtggcgt aggc 14

<210> 4

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 4

tcatcatgca gctc 14

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 5

ttggagcttg tggcgta 17

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 6

ttggagctgt tggcgta 17

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 7

ttggagctag tggcgta 17

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 8

ttggagctgc tggcgta 17

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 9

ttggagctcg tggcgta 17

<210> 10

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 10

ctggtgacgt aggc 14

Claims

1.一种KRAS基因突变多重检测引物探针，其特征在于：包括上游引物，下游引物，G12位点野生型探针WP-G12，G13位点野生型探针WP-G13，检测KRAS基因2号外显子G12位点突变的突变型探针MP-G12D、突变型探针MP-G12C、突变型探针MP-G12V、突变型探针MP-G12S、突变型探针MP-G12A、突变型探针MP-G12R，检测KRAS基因2号外显子G13位点突变的突变型探针MP-G13D；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示，所述野生型探针WP-G12的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述野生型探针WP-G13的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述突变型探针MP-G12D的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述突变型探针MP-G12C的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述突变型探针MP-G12V的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述突变型探针MP-G12S的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；所述突变型探针MP-G12A的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；所述突变型探针MP-G12R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，所述突变型探针MP-G13D的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；

所述突变型探针MP-G12D的使用浓度为10nM，所述突变型探针MP-G12C的使用浓度为40nM，所述突变型探针MP-G12V的使用浓度为40nM，所述突变型探针MP-G12S的使用浓度为50nM，所述突变型探针MP-G12A的使用浓度为60nM，所述突变型探针MP-G12R的使用浓度为30nM，所述突变型探针MP-G13D的使用浓度为20nM；上游引物和下游引物的使用浓度为50nM；野生型探针WP-G12和野生型探针WP-G13的使用浓度为20nM。

2.根据权利要求1所述的KRAS基因突变多重检测引物探针，其特征在于：所有野生型探针和突变型探针为经过修饰的MGB探针，所有野生型探针的5’端为VIC荧光基团修饰，所有突变型探针的5’端为FAM荧光基团修饰，所有突变型探针的3’端为NFQ基团修饰。

3.一种采用如权利要求1所述的引物探针的KRAS基因突变多重检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述的KRAS基因突变多重检测试剂盒，其特征在于：还包括带有KRAS基因G12D、G12C、G12V、G12S、G12A、G12R和G13D突变的质粒。