CN114214413A

CN114214413A - Esr1基因突变多重检测引物探针及其试剂盒

Info

Publication number: CN114214413A
Application number: CN202111617389.0A
Authority: CN
Inventors: 洪专; 潘文健
Original assignee: Prius New Shanghai Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Prius New Shanghai Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2022-03-22

Abstract

本发明涉及一种ESR1基因突变多重检测引物探针及其试剂盒包括上游引物、下游引物、野生型探针、检测ESR1基因10号外显子Y537C突变的突变型探针MP‑Y537C、检测ESR1基因10号外显子Y537N突变的突变型探针MP‑Y537N、检测ESR1基因10号外显子Y537S突变的突变型探针MP‑Y537S、检测ESR1基因10号外显子D538G突变的突变型探针MP‑D538G。本发明的ESR1基因突变多重检测引物探针及其试剂盒快速高效，标准品的配制简单，检测体系的特异性与灵敏度高，游离DNA的利用率高，准确度高。

Description

ESR1基因突变多重检测引物探针及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种ESR1基因突变检测产品，属于生物技术领域。

背景技术

ESR1(Estrogen Receptor1)基因编码的人类雌激素受体α蛋白(Estrogenreceptor alpha,ESRα)，其与雌激素结合后，激活细胞内一系列周期反应，促使细胞生长增值。ESR1基因的激活突变如乳腺癌的发生发展息息相关。其中，ESR1基因最为常见的突变类型为有Y537S，Y537C，Y537N以及D538G。这些突变使得ESRα的构象改变，使其可在不与雌激素结合的情况，表现为持续性激活状态。

乳腺癌是最常见的妇科妇科肿瘤之一。超过70％的原发性乳腺癌雌激素受体(ER)呈阳性，许多乳腺癌最初对内分泌治疗有反应。尽管治疗乳腺癌的新疗法的开发正在不断改善，但对这些药物的先天和获得性耐药性仍然是一个挑战。肿瘤微环境被认为是赋予癌症治疗先天耐药性的主要因素，而很大一部分患者在接受他莫昔芬等全身抗雌激素或雌激素剥夺治疗如芳香化酶抑制剂(AIs)时会产生耐药性。许多机制，包括激活细胞存活、细胞应激和细胞信号通路，已经被认为是获得性耐药性的驱动因素。最近研究指出了雌激素受体(ESR1)基因的激活突变在驱动耐药性中起重要作用。已确定的关键的激活突变热点有p.L536，p.Y537和p.D538，这些突变产生不依赖于雌激素配体的内质网转录活性，被认为是耐药突变。

由于肿瘤自身的异质性，存在继发性耐药。癌症生物标志物在疾病类型和疾病进展阶段而不同，这使早期阶段的癌症检测和识别复杂化。癌症生物标志物在疾病类型和疾病进展阶段而不同，这使早期阶段的癌症检测和识别复杂化。循环肿瘤DNA(ctDNA)作为一种“液体活检”手段越来越突出，用于检测和监测系统治疗的耐药性。对激素治疗的获得性耐药性可能是基于雌激素受体基因(ESR1)的激活突变。使用cfDNA进行肿瘤突变检测的优点包括i)无创收集，ii)病程中任何时间的可用性，iii)实时检测和动态监测与肿瘤组织检测相比，异质性问题可能更少。体外和临床前数据表明，ESR1突变导致AI完全耐药，并对ER激动剂和拮抗剂产生部分耐药。ESR1激活突变的检测可能与指导临床医生进行内分泌和非内分泌治疗。cfDNA片段相对较小，峰值大小约为180bp。肿瘤来源的DNA部分在总cfDNA中的百分比是单独可变的，往往太低，无法检测。因此，开发一种具有高灵敏度的基于cfDNA的EGFR突变检测方法具有重要意义。

聚合酶链反应(PCR)的发明改变了生命科学的研究和分子诊断。现在，数字PCR(dPCR)正在改变传统PCR的领域，并重新定义了对突变检测的检测下线。对于许多检测方法，dPCR的敏感度明显高于传统的PCR分析，并且通过单独计数更多的分子，提高了检测方法的准确性和精度。数字PCR的敏感性将会提高检测限制重新定义了我们对疾病发病、进展和复发的理解。数字PCR的一个特别有吸引力的应用是在大量野生型分子中定量检测少量的突变DNA分子，这与癌症研究有关，特别是与次要等位基因的检测有关。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速高效，检测体系的特异性与灵敏度高，游离DNA的利用率高，准确度高的ESR1基因突变多重检测引物探针，以及采用该引物探针的试剂盒。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种ESR1基因突变多重检测引物探针，包括上游引物、下游引物、野生型探针、检测ESR1基因10号外显子Y537C突变的突变型探针MP-Y537C、检测ESR1基因10号外显子Y537N突变的突变型探针MP-Y537N、检测ESR1基因10号外显子Y537S突变的突变型探针MP-Y537S、检测ESR1基因10号外显子D538G突变的突变型探针MP-D538G；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述突变型探针MP-Y537C的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述突变型探针MP-Y537N的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示；所述突变型探针MP-Y537S的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述突变型探针MP-D538G的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

上述突变型探针MP-Y537C的使用浓度为60nM，所述突变型探针MP-Y537N的使用浓度为10nM，所述突变型探针MP-Y537S的使用浓度为40nM，所述突变型探针MP-Y537S的使用浓度为60nM。

上游引物和下游引物的使用浓度为50nM。野生型探针的使用浓度为20nM。

野生型探针和突变型探针为经过修饰的MGB探针，野生型探针的5’端为VIC荧光基团修饰，所有突变型探针的5’端为FAM荧光基团修饰，所有突变型探针的3’端为NFQ基团修饰。

本发明为解决上述技术问题提出的另一种技术方案是：一种采用上述引物探针的ESR1基因突变多重检测试剂盒。

上述ESR1基因突变多重检测试剂盒还包括带有ESR1基因10号外显子Y537C、Y537N、Y537S和D538G突变的质粒。

本发明具有积极的效果：

(1)本发明ESR1基因突变多重检测产品，采用的标准品是用酶切后的正常cfDNA和酶切后的插入ESR1基因10号外显子Y537C、Y537N、Y537S和D538G突变片段的突变质粒按拷贝数比例配制而成，不同突变频率标准品起到不同的作用。标准品采用cfDNA和质粒可以最大程度的还原检测样本的特征，给体系的优化提供了很多的基础，在体系优化中起到决定性的作用。

(2)本发明ESR1基因突变多重检测产品通过中突变频率标准品的数字PCR检测结果确定各突变探针在不同浓度下产生的终点荧光信号值，使得数据统计的结果更加准确。本发明的ESR1基因突变检测体系通过野生型模板的数字PCR检测结果确定检测体系各突变位点的背景阈值，检测样本的突变拷贝数时，突变拷贝数等于检测结果减去背景阈值，可以使得结果更加准确。

(3)本发明的ESR1基因突变多重检测产品的突变检测体系通过低突变频率标准品的数字PCR检测结果，可以确定检测体系的灵敏度。

(4)本发明的ESR1基因突变多重检测产品的优化通过高突变频率标准品的传统实时荧光PCR检测结果进行各探针浓度优化，根据各突变不同浓度探针反应后荧光强度的差异，选择合适的探针浓度，该方法结果准确，成本较低。

(5)本发明的ESR1基因突变多重检测产品的引物探针为自行设计，探针为MGB探针，探针序列更短，特异性好。引物探针经过多重组合优化选定，扩增效率高，灵敏度高。

(6)本发明的ESR1基因突变多重检测产品快速，高效，成本较低，准确度高可根据样本中微量的ESR1基因10号外显子Y537C、Y537N、Y537S和D538G突变ctDNA快速准确的监测出肿瘤患者ESR1基因发生的各种突变，因此可将数字PCR平台用于ctDNA的检测，能及时监测患者新的基因突变的发生，为临床治疗方案的制定和调整提供依据。

附图说明

图1为实施例1的试剂盒检测全野生型模板的反应数据结果图；

图2为实施例1的试剂盒检测突变野生比为0.5的模板的反应数据结果图；

图3为实施例1的试剂盒检测突变野生比为0.0001的模板的反应数据结果图；

图4为不同浓度突变型探针的突变信号FAM荧光的强度分布图。

具体实施方式

下面介绍的内容是通过具体实施例对本发明内容进行描述，其中需要指出的有：接下来的实施例只用于对本发明进行说明，并不表示对该发明所保护范围的限制，任何第三方可以根据本发明所阐述的方法及内容作出一些非本质的改进和调整。在接下来的实施例中，除存在特别申明，所用的试剂均默认为分析纯，所用试剂均可通过商业购买获得。该发明未做出明确表示的实验方法，基本可按照常规实验方法如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》书籍中所公布的基础生化分子实验方法进行完成，或者按照试剂供应商明确表明的实验方法进行得到。除了少数文中明确指出的定义，文中所涉及的全部专业和科学用语与本领域技术人员所共识的意义一致。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。

主要试剂：

本专利内容涉及所有实验所用试剂耗材均从正规试剂耗材生产厂商购买，用到主要试剂有(少数通用常规试剂不再列举)：25×Droplet stabilizer(RainDance)、TaqManGenotypingMaster Mix(2×)(Applied Biosystems)、EcoR I内切酶(TAKARA，1040A)、10×T Buffer(TAKARA，1116A)、0.1％BSA(TAKARA，1116A)、质粒小量提取试剂盒(D1100，北京索莱宝科技有限公司)、QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(50)(55114，Qiagen公司)、Qubit^TM dsDNA HS Assay Kit(Q32854)等。

主要仪器：

磁力架、漩涡震荡仪、

3.0荧光定量仪、高速离心机、MiniAmp PCR、和和和仪(厂家：Applied Biosystems)、生物安全柜、水浴锅、RainDropSource(RainDanceTechnologies)、移液枪、RainDropSense(RainDance Technologies)等。

实施例

本实施例的ESR1基因突变多重检测试剂盒包括上游引物F-ESR1、下游引物R-ESR1、野生型探针WP-ESR1、检测ESR1基因10号外显子Y537C突变的突变型探针MP-Y537C、检测ESR1基因10号外显子Y537N突变的突变型探针MP-Y537N、检测ESR1基因10号外显子Y537S突变的突变型探针MP-Y537S、检测ESR1基因10号外显子D538G突变的突变型探针MP-D538G和带有ESR1基因10号外显子Y537C、Y537N、Y537S和D538G突变的质粒。

本实施例中涉及的引物、探针和质粒的设计均有普瑞斯新(上海)生物医疗科技有限公司实验室技术人员自行设计，合成单位是南京金斯瑞生物科技有限公司完成，引物和探针的核苷酸序列如表1所示。

表1引物探针特征表

引物为常规引物，探针为经过修饰的MGB探针，野生型探针的5’端荧光修饰基团为VIC荧光，3’端为NFQ基团修饰；所有突变型探针的5’端荧光修饰基团为FAM荧光，3’端为NFQ基团修饰。

本实施例中用到的野生型扩增模板采用的是非肿瘤患者健康人游离DNA(cfDNA)，突变型扩增模板采用的是实验室人工构建的质粒，该质粒经过内切酶酶切处理成线性结构。

将野生型模板和突变型模板按不同的拷贝数比例配制成理论突变频率的模板，制备方法如下：

1.样本抽提。

血浆抽提使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(50)(55114，Qiagen公司)试剂盒进行，具体操作步骤可以参考该试剂盒的产品说明。

质粒的提取采用的是质粒小量提取试剂盒(D1100，北京索莱宝科技有限公司)，按照产品说明书进行，具体操作步骤可以参考该试剂盒的官方说明书。

2.cfDNA和突变质粒的浓度测定。

提取得到的cfDNA和质粒用为

3.0荧光定量仪，使用Qubit^TM dsDNA HSAssay Kit(Q32854)进行定量，具体的实验操作步骤参照试剂盒中自带的说明书。

3.标准品的制备。

1)质粒模板酶切线化及回收。

血浆游离DNA为高度片段化的核酸双链，无需进行片段化。

将定量后的突变质粒进行酶切，如下表2所示。

表2各种突变质粒的酶切反应体系

成分	用量
		10×SEBuffer	10μl
BSA	10μl
		EcoRⅠ	1.0μl
质粒DNA	79.0μl

酶切后的突变采用磁珠法回收方法如下：

a.将酶切后的产物全部转移至一个1.5ml的EP管中，向EP管中加入AmPure XPReagent磁珠，反复吹打混匀，室温静置，计时5min。

b.将EP转移至磁力架上，静置10min，磁珠和溶液分离，待磁珠完全吸附于管壁，用移液器吸取液体，弃溶液。

c.加入用200μl新鲜配置的80％的乙醇水溶液，没过磁珠。

d.弃清洗过的乙醇溶液，重复上一步，弃乙醇溶液，并用10μl移液器吸去残留的少量溶液，晾干。

e.待磁珠干燥，用80μl的去离子水加入EP管子，溶解磁珠，吹打混匀，至于磁力架上，静置约10min，至磁珠和液体完全分离。

f.小心吸取转移79μl的澄清的DNA溶液于新的EP管中。

g.将纯化得酶切产物，取1μl使用

3.0进行定量。

2)配置实验所需标准品

①理论上，人类DNA每1ng的单个基因拷贝数约300ng计算，将血浆游离DNA(cfDNA)逐级稀释到约2.0×10⁵copies/μl。

②酶切后得到的质粒拷贝数计算，9.1×10⁸×质粒浓度(ng/μl)÷质粒长度(2800bp)；将得到的质粒逐级稀释到2.0×10⁶copies/μl、2.0×10⁵copies/μl、2.0×10²copies/μl、20copies/μl。

③配置实验所需标准品：取10ul的2.0×10⁵copies/μlcfDNA和同等体积的2.0×10⁵copies/μl的突变质粒溶液混匀，再加入同等体积去离子水，得到1.0×10⁵copies/μl模板，突变频率0.5，取10ul的2.0×10⁵copies/μlcfDNA和1ul体积的2.0×10³copies/μl的突变质粒溶液混匀，再加入9ul的去离子水，得到1.0×10⁵copies/μl模板，突变频率为0.001模板；取10ul的2.0×10⁵copies/μlcfDNA和1ul体积的2.0×10²copies/μl的突变质粒溶液混匀，再加入9ul的去离子水，得到1.0×10⁵copies/μl模板，突变频率为0.0001模板。

本实施例使用MiniAmp PCR仪(厂家：Applied Biosystems)测定各突变位突变型探针的最适工作浓度，以达到在实验反应的终点区分开各突变位点的目的。

本实施例采用实时荧光定量(qPCR)反应进行探针浓度的优化。

根据开发的目的，确定三组引物(50nM)和三种野生型探针(20nM)的工作浓度恒定不变，将三组引物和三位点的野生型探针提前混合均匀成MIX1，分别调节各突变型探针的工作浓度，以最大限度使各突变型探针的区分相互独立：

确定将各突变位点的突变型探针实验终浓度分别是10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、和60nM。使用突变型模板和野生型模板按照拷贝数比例1∶1配制成扩增模板，根据表3所示的qPCR反应体系组分表，配制qPCR反应体系。

表3 qPCR反应体系组分表

其中的x表示突变型探针的体积。

根据表4所示的qPCR反应程序进行qPCR反应。在MiniAmp PCR仪(厂家：AppliedBiosystems)反应28各循环。

表4 qPCR的反应程序

qPCR反应结束，在突变模板和野生型模板在1∶1情况下，记录在各突变探针浓度下，突变的荧光信号值，根据各荧光信号值汇总统计，综合统筹选出多重体系中各探针最适合的浓度，避免数字PCR(ddPCR)反应各反应微滴的相互干扰。

表5 qPCR反应结果

根据各探针的终点荧光信号值做出如图4所示的突变信号FAM荧光的强度分布图，由图中各突变信号的荧光值的位置就可以合理挑选出多重ddPCR体系中各突变探针的浓度值。

由图4可知，确定引物(50nM)和野生型探针(20nM)的工作浓度恒定不变时，随着突变型探针的工作浓度不断上升时，荧光值在不断上升，继而到达平台期，此时随着浓度的上升荧光值并没有随之上升，根据各探针在不同浓度下的荧光信号的差异，选择各突变位点终点信号差异最大的荧光浓度作为ddPCR进行后续的检测实验和试剂盒开发。由以上原则，选择各突变型探针最适合的探针浓度为：ESR1基因10号外显子Y537C检测探针MP-Y537C浓度为60nM、Y537N检测探针MP-Y537N、Y537S检测探针MP-Y537S浓度为40nM、D538G检测探针MP-D538G浓度为10nM；这四种探针浓度组合时，突变信号值相互影响最小，可大大降低假阳性和提高检测的灵敏度。

本实施例的ESR1基因突变多重检测试剂盒根据以上的实验结论，进行下一步ddPCR反应，验证该体系的有效性，先根据上述结论将所有引物探针配制成MIX2，然后加入公共试剂成分和反应模板进行后续实验，ddPCR反应体系如表6所示。

表6 ddPCR反应体系组分表

使用突变型模板和野生型模板按照表7所示的突变频率配制成相应的突变模板。

表7 ddPCR反应突变模板

进行dPCR反应，ddPCR反应程序如表8所示。

表8 ddPCR反应程序表

反应结束后，采用RainDance公司仪器自带的桌面化软件RainDropAnalystⅡ(V1.0.0)进行后续的分析，步骤如下：

1.双击打开RainDropAnalystⅡ软件，左键点击“Add sample”机器自动读取fcs数据文件导入该软件，准备进行后续的分析。

2.第一步选定突变频率为0.5样本数据进行分析，此时，可粗略选定阴性点集合、野生型探针VIC荧光点集合和带有FAM荧光的突变型点集，使用“Apply spectralcompensation”功能按钮，纵坐标设置成FAM荧光信号值，横坐标设置成了Vic设置成信号值。

3.软件界面“Elliptical Gate”功能框可选取并调整聚集点的区域范围，选取的聚集点尽可能集中，并使其阳性突变频率尽可能接近理论值50％的突变频率，将该标准品的选择区域范围作为标准选取范围标准，并将应用于其他样本的分析。

使用本实施例的反应体系在进行数据分析时，需将已知各位点突变为0.5的标准品使用同一实验体系和实验条件伴随进行。首先分析突变频率为0.5的标准品实验所得的数据，以此确定野生型聚集点区域和各突变位点聚集区的最适区域，为样本分析提供最适选择区域。与此同时，由突变频率为0.5的标准品计算出每一突变位点野生突变位点的比例常数k，k＝Tt/Na，常数k将用于该批次反应拥有不同突变频率样本的野生型位点数的计算，如图2所示，Y537C:k＝1493698/4469693＝0.334；Y537N:k＝1590349/4469693＝0.355；Y537S：k＝1142239/4469693＝0.255；D538G：k＝1405833/4469693＝0.314。

使用本实施例的ESR1基因突变多重检测试剂盒的过程中，需设置全野生型的标准品采用同样的体系和方法进行伴随实验，全野生型标准品分析得到突变区域内的阳性位点个数为同一批样本的假阳性背景数值(Tf)，如图1所示，Y537C:7，Y537N:3，Y537S:6，，D538G:9。真阳性位点值(Tt)＝总位点数(Tn)-假阳性背景数值(Tf)如图3所示，Y537C:157-7＝150，Y537N:174-3＝171，Y537S:129-6＝123，D538G:157-9＝148。

使用本实施例的反应体系和反应程序，在各位点突变频率计算时，突变频率(V)＝Tt/(Tt+Nt)*100％，其中Nt代表该位点的野生型突变位点数，Nt＝k*Na，N a是总的野生型位点数，k由突变频率为0.5的标准品实验体系计算得到。如图3所示，Y537C:0.012％，Y537N:＝0.010％＝0.00043％，Y537S:0.010％，D538G:0.0101％，所以该试剂盒的灵敏度可达到万分之一，特异性较好、信噪比高。

本发明的ESR1基因突变多重检测试剂盒将用于解决血浆游离cfDNA检测突变灵敏都不够、灵敏度低、准确度低和血浆游离cfDNA不足等问题，该检测方法体系还可用于，全血、脑脊液、胸腹水和组织样品。

本发明是提供一种基于数字PCR系统的ESR1基因多点突变的多重反应体系，提高血浆游离DNA(cfDNA)中微量肿瘤DNA(ctDNA)ESR1基因10号外显子Y537C、Y537N、Y537S和D538G突变的检测灵敏度和准确度，独立的一个ddPCR反应体系同时检测4个ESR1基因多重热点突变，提高了血浆游离DNA的利用效率，降低检测成本，并在后期通过优化体系进行试剂盒的开发。

本发明野生型模板是酶切后的正常人体cfDNA，突变型模板是酶切后的插入ESR1基因各突变片段的突变质粒。将突变型模板和野生型模板按1∶1的拷贝数比例配制成中突变频率标准品，首先使用普通的荧光定量qPCR仪器上进行充分的PCR反应，反应模板为突变频率为0.5的模板和纯野生型模板，探针浓度设置了10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM各级浓度，PCR反应后采集突变探针产生的终点荧光值，根据各终点荧光探针对应的荧光值的差异。在坐标系中标出各浓度下，突变探针对应的荧光值，选择接下来多重dPCR各探针的浓度的合理配置。由于在统一反应管中反应，野生型探针产生荧光终点值是一致的，使突变型探针对应的荧光信号值彼此差异最大化，即是选择的合理探针搭配。采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域，突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同。

采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应，突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数即为该检测体系的背景阈值。

将突变型模板和野生型模板按1∶1，1∶10000的拷贝数比例配制成低突变频率标准品，采用数字PCR以低突变频率标准品为模板进行反应，若突变型的荧光区域中出现的荧光信号拷贝数大于所述背景阈值的2.5倍，则该检测体系的灵敏度达到低突变频率标准品的拷贝数比例相同的值。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而这些属于本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 普瑞斯新（上海）生物医疗科技有限公司

<120> ESR1基因突变多重检测引物探针及其试剂盒

<130> 无

<141> 2021-12-27

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 1

aggcatggag catctgtaca 20

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 2

ttggtccgtc tcctcca 17

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 3

tggtgcccct ctatgacctg 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 4

tgcccctctg tgacctgct 19

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 5

agtttggccc gcccaa 16

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 6

tcgctatcaa aacatctccg a 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(无)

<400> 7

ccctctatgg cctgctgct 19

Claims

1.一种ESR1基因突变多重检测引物探针，其特征在于：包括上游引物、下游引物、野生型探针、检测ESR1基因10号外显子Y537C突变的突变型探针MP-Y537C、检测ESR1基因10号外显子Y537N突变的突变型探针MP-Y537N、检测ESR1基因10号外显子Y537S突变的突变型探针MP-Y537S、检测ESR1基因10号外显子D538G突变的突变型探针MP-D538G；

所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQID No.2所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述突变型探针MP-Y537C的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述突变型探针MP-Y537N的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示，所述突变型探针MP-Y537S的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述突变型探针MP-D538G的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

2.根据权利要求1所述的ESR1基因突变多重检测引物探针，其特征在于：所述突变型探针MP-Y537C的使用浓度为60nM，所述突变型探针MP-Y537N的使用浓度为10nM，所述突变型探针MP-Y537S的使用浓度为40nM，所述突变型探针MP-Y537S的使用浓度为60nM。

3.根据权利要求1所述的ESR1基因突变多重检测引物探针，其特征在于：上游引物和下游引物的使用浓度为50nM。

4.根据权利要求1所述的ESR1基因突变多重检测引物探针，其特征在于：野生型探针的使用浓度为20nM。

5.根据权利要求1所述的ESR1基因突变多重检测引物探针，其特征在于：野生型探针和突变型探针为经过修饰的MGB探针，野生型探针的5’端为VIC荧光基团修饰，所有突变型探针的5’端为FAM荧光基团修饰，所有突变型探针的3’端为NFQ基团修饰。

6.一种采用如权利要求1所述的引物探针的ESR1基因突变多重检测试剂盒。

7.根据权利要求6所述的ESR1基因突变多重检测试剂盒，其特征在于：还包括带有ESR1基因10号外显子Y537C、Y537N、Y537S和D538G突变的质粒。