CN107267505B - 微卫星标记及其在结直肠癌的预后判定和/或化疗敏感性预测中的应用 - Google Patents

微卫星标记及其在结直肠癌的预后判定和/或化疗敏感性预测中的应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及微卫星标记及其在结直肠癌的预后判定和/或化疗敏感性预测中的应用。所述微卫星标记选自如SEQ ID Nos.1‑20所示的核苷酸序列中的至少一种。另外，本申请还公开了微卫星标记组合，包括如SEQ ID Nos.1‑5和SEQ ID Nos.61‑63所示的核苷酸序列；和/或所述组合包括SEQ ID No.4和/或SEQ ID No.6所示的核苷酸序列。这些微卫星位点组合将为中国人群的结直肠癌患者的预后判定和/或中国人群的结直肠癌患者的化疗应答提供更为有力的工具。

Description

微卫星标记及其在结直肠癌的预后判定和/或化疗敏感性预 测中的应用
技术领域
本申请涉及一种微卫星标记，特别是相关的微卫星标记及组合在结直肠癌的预后判定和/或化疗敏感性预测中的应用。
背景技术
微卫星(Microsatellite,MS)(又称之为短串联重复(short tandem repeat,STR)序列)，是以1-6个碱基为单位的DNA重复序列，其在动植物中具有高度的多态性。微卫星位点随机地分布在整个真核生物基因组中。由于微卫星在哺乳动物基因组中随机的高频多态性而被视为重要的DNA标记物。微卫星在DNA复制过程中极易发生滑动，导致其长度的变化，这种现象称为微卫星不稳定性(Microsatellite instability，MSI)。多种癌症都存在微卫星不稳定性现象，例如结直肠癌，子宫内膜癌，胃癌，胶质瘤，肺癌，乳腺癌，淋巴瘤和卵巢癌等。事实上，MSI已被视为结直肠癌预后以及生存期的一个有价值的标志物。
结直肠癌是西方发达国家，中国和其他国家都最为常见的肿瘤之一，根据中国国家癌症中心的数据，胃癌和结直肠癌是中国男性和女性最常见的癌症，无论是男性还是女性患者，结直肠癌都是癌症致死的前5位因素之一。研究表明西方国家有80％的结直肠癌表现出染色体不稳定性(chromosome instability,CIN)，15％表现为微卫星不稳定性。在我国，14.3％的结直肠癌患者表现出微卫星不稳定。这表明MSI表型与结直肠癌密切相关。美国国家癌症中心就推荐Bethesda位点组合(包括单核苷酸重复BAT25和BAT26以及二核苷酸重复D2S123，D5S346和D17S250)以及修订后的Bethesda位点组合(包括5个单核苷酸重复)在临床上用于MSI的检测。近期国外的研究表明，Bethesda位点组合似乎是预后较好以及更长无病生存期的一个好的生物标记物。然而，这一结论主要是基于西方人群得出的结论。
临床研究进一步证实同一种癌症存在着不同的临床病理学特征和基因突变谱以及化疗应答的差异性，而且，较为重要的是，不同人种和不同地区的同一种肿瘤的发生发展、基因突变谱和机制也不尽相同。我国结直肠癌患者与西方国家的患者就存在一些差异，如西方国家所有结直肠癌患者和MSI-H(高频微卫星不稳定性)结直肠癌患者中BRAFV600E突变率分别为3.7％-20.6％和18.4％-70.8％，而在东亚国家患者中该比例较低，分别为0.7％-11.4％和6.2％-45.7％。
因此，在我国迫切需要开展结直肠癌临床预后判定、化疗敏感性预测分子生物学标记物，特别是针对中国人群的结直肠癌临床预后判定、化疗敏感性预测分子生物学标记物。
发明内容
基于现有技术中存在的问题，本申请以中国人群为研究对象，对中国人群中患有结直肠癌的样本检测MSI发生情况，筛选并提出更适合预后判定和/或化疗敏感性预测(例如化疗药物应答评估)的微卫星标记位点及其组合。
本申请之一提供了一种微卫星标记，所述微卫星标记选自如SEQ ID Nos.1-20所示的核苷酸序列中的至少一种。
本申请之二提供了一种微卫星标记组合，所述组合包括如SEQ ID Nos.1-5和SEQID Nos.61-63所示的核苷酸序列；优选所述组合包括如SEQ ID Nos.1-5和SEQ ID No.61所示的核苷酸序列中的至少两种。例如，在一个最优选的实施方式中，所述组合包括如SEQ IDNos.1-5和SEQ ID No.61所示的核苷酸序。和/或
本申请之二的微卫星标记组合包括所述组合包括如SEQ ID Nos.1-5、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.61和SEQ ID No.70所示的核苷酸序列中的至少两种，同时，在所述组合仅由两种微卫星标记组成时，所述组合不能为由SEQ ID No.61和SEQ ID No.70的组合构成的组合。例如，在一个优选的实施方式中，所述组合包括如SEQ ID Nos.1-5、SEQ ID No.9、SEQID No.61和SEQ ID No.70所示的核苷酸序。
本申请之三提供了一种微卫星标记组合，所述组合包括SEQ ID No.4和/或SEQ IDNo.6所示的核苷酸序列。
在用于扩增包含微卫星标记的PCR片段过程中，主要考虑到Taq酶的保真性，因此选取的长度一般不超过300bp，但是扩增的片段也不宜过短，一般可设置下限为100bp。此外，在使用高保真酶的情况下，可选取更长的片段来扩展，例如500bp，甚至更长，不过，一般来讲，扩增的目的仅在于检测微卫星位点序列，因此只要能够满足可以方便地检测到微卫星位点，就没有必要扩增更长的长度。因此，本申请之四提供了至少一种核苷酸序列，所述核苷酸序列具有100-500bps的长度；优选所述核苷酸序列具有150-400bps的长度；更优选所述核苷酸序列具有150-350bps的长度；最优选所述核苷酸序列具有180-250bps的长度；且所述核苷酸序列包含如下微卫星标记中的至少一种：I)如本申请之一所述的微卫星标记，II)如本申请之二所述的组合中的微卫星标记，以及III)如本申请之三所述的组合中的微卫星标记。实际上如上所述，一般来讲，不论长短，只要所述核苷酸序列中包含所述微卫星标记，通过引物条件探索可实现对所述微卫星标记的检测。然而，为了更有利于方便地检测，所述核苷酸序列可以具有100-500bps的长度。例如，160bps的长度、170bps的长度、180bps的长度、190bps的长度、200bps的长度、210bps的长度、220bps的长度、230bps的长度、240bps的长度、250bps的长度、260bps的长度、270bps的长度、280bps的长度、290bps的长度、300bps的长度、310bps的长度、320bps的长度、330bps的长度、340bps的长度、350bps的长度。另外，需要指出的是，如上的核苷酸序列中一般一个片段只含有一个如上所述的微卫星标记，但是在核苷酸序列为两条以上时，每条核苷酸序列上包含如上的微卫星标记一般为不同的微卫星标记，这是本领域技术人员容易理解的。
优选地，所述核苷酸序列具有150-400bps的长度；更优选所述核苷酸序列具有150-350bps的长度；最优选所述核苷酸序列具有180-250bps的长度。
在一个具体实施方式中，所述核苷酸序列选自如下核苷酸序列中的至少一种：
以人基因组为模板，以SEQ ID No.21和SEQ ID No.22进行PCR扩增得到含有SEQID No.1的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.23和SEQ ID No.24进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.2的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.25和SEQ ID No.26进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.3的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.27和SEQ ID No.28进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.4的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQID No.29和SEQ ID No.30进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.5的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.31和SEQ ID No.32进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.6的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.33和SEQ ID No.34进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.7的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.35和SEQ ID No.36进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.8的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.37和SEQ ID No.38进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.9的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.39和SEQ IDNo.40进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.10的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ IDNo.41和SEQ ID No.42进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.11的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.43和SEQ ID No.44进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.12的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.45和SEQ ID No.46进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.13的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.47和SEQ ID No.48进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.14的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.49和SEQ ID No.50进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.15的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.51和SEQ IDNo.52进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.16的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ IDNo.53和SEQ ID No.54进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.17的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.55和SEQ ID No.56进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.18的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.57和SEQ ID No.58进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.19的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.59和SEQ ID No.60进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.20的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.64和SEQ ID No.65进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.61的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ ID No.66和SEQ IDNo.67进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.62的产物的序列；以人基因组为模板，以SEQ IDNo.68和SEQ ID No.69进行PCR扩增得到含有SEQ ID No.63的产物的序列。
本申请之五提供了一种引物对，所述引物对选自能够扩增如本申请之四的所述的核苷酸序列的至少一种引物对。
在一个具体实施方式中，所述引物对选自如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22的引物对、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24的引物对、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26的引物对、SEQID No.27和SEQ ID No.28的引物对、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30的引物对、SEQ IDNo.31和SEQ ID No.32的引物对、SEQ ID No.33和SEQ ID No.34的引物对、SEQ ID No.35和SEQ ID No.36的引物对、SEQ ID No.37和SEQ ID No.38的引物对、SEQ ID No.39和SEQ IDNo.40的引物对、SEQ ID No.41和SEQ ID No.42的引物对、SEQ ID No.43和SEQ ID No.44的引物对、SEQ ID No.45和SEQ ID No.46的引物对、SEQ ID No.47和SEQ ID No.48的引物对、SEQ ID No.49和SEQ ID No.50的引物对、SEQ ID No.51和SEQ ID No.52的引物对、SEQ IDNo.53和SEQ ID No.54的引物对、SEQ ID No.55和SEQ ID No.56的引物对、SEQ ID No.57和SEQ ID No.58的引物对、SEQ ID No.59和SEQ ID No.60的引物对、SEQ ID No.64和SEQ IDNo.65的引物对、SEQ ID No.66和SEQ ID No.67的引物对，和SEQ ID No.68和SEQ ID No.69的引物对中的至少一种。
在一个具体实施方式中，每对引物的上游引物的5’末端分别用荧光标记物标记；例如每对引物的上游引物的5’末端分别用FAM，HEX或TAMRA标记；亦可其他荧光标记物，例如ROX、CY3、CY5、AMCA、TET和JOE等等。
本申请之六提供了一种引物对组合，所述组合包括如SEQ ID No.21和SEQ IDNo.22的引物对、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24的引物对、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26的引物对、SEQ ID No.27和SEQ ID No.28的引物对、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30的引物对、SEQ ID No.64和SEQ ID No.65的引物对、SEQ ID No.66和SEQ ID No.67的引物对、和SEQID No.68和SEQ ID No.69的引物对；优选所述组合包括如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22的引物对、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24的引物对、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26的引物对、SEQ ID No.27和SEQ ID No.28的引物对、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30的引物对、和SEQID No.64和SEQ ID No.65的引物对中的至少两对。例如所述组合包括如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22的引物对、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24的引物对、SEQ ID No.25和SEQ IDNo.26的引物对、SEQ ID No.27和SEQ ID No.28的引物对、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30的引物对、和SEQ ID No.64和SEQ ID No.65的引物对。或者，所述组合包括如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22的引物对、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24的引物对、SEQ ID No.25和SEQ IDNo.26的引物对、SEQ ID No.27和SEQ ID No.28的引物对、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30的引物对、SEQ ID No.64和SEQ ID No.65的引物对、和SEQ ID No.66和SEQ ID No.67的引物对。或者，所述组合包括如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22的引物对、SEQ ID No.23和SEQ IDNo.24的引物对、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26的引物对、SEQ ID No.27和SEQ ID No.28的引物对、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30的引物对、SEQ ID No.64和SEQ ID No.65的引物对、和SEQ ID No.68和SEQ ID No.69的引物对。
和/或所述组合包括如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22的引物对、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24的引物对、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26的引物对、SEQ ID No.27和SEQ IDNo.28的引物对、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30的引物对、SEQ ID No.37和SEQ ID No.38、SEQ ID No.64和SEQ ID No.65的引物对、和SEQ ID No.71和SEQ ID No.72的引物对中的至少两对，同时，在所述组合仅由两种引物对组成时，所述组合不能为由SEQ ID No.64和SEQID No.65的引物对、和SEQ ID No.71和SEQ ID No.72的引物对构成的组合。例如，所述组合中包括如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22的引物对、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24的引物对、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26的引物对、SEQ ID No.27和SEQ ID No.28的引物对、SEQID No.29和SEQ ID No.30的引物对、SEQ ID No.37和SEQ ID No.38、SEQ ID No.64和SEQID No.65的引物对、和SEQ ID No.71和SEQ ID No.72的引物对。
在一个具体实施方式中，每对引物的上游引物的5’末端分别用荧光标记物标记；例如每对引物的上游引物的5’末端分别用FAM，HEX或TAMRA标记；亦可其他荧光标记物，例如ROX、CY3、CY5、AMCA、TET和JOE等等。
本申请之七提供了一种引物对组合，所述组合包括如SEQ ID No.27和SEQ IDNo.28的引物对，和/或SEQ ID No.31和SEQ ID No.32的引物对。例如包括如SEQ ID No.27和SEQ ID No.28的引物对，和SEQ ID No.31和SEQ ID No.32的引物对。
在一个具体实施方式中，每对引物的上游引物的5’末端分别用荧光标记物标记；例如每对引物的上游引物的5’末端分别用FAM，HEX或TAMRA标记；亦可其他荧光标记物，例如ROX、CY3、CY5、AMCA、TET和JOE等等。
本申请之八提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括如本申请之五中的至少一种的所述的引物对，或包括本申请之六和/或本申请之七中的所述的引物对组合。
在一个具体实施方式中，所述试剂盒中还包括DNA聚合酶和/或PCR扩增缓冲液。具体地，DNA聚合酶可以为Taq酶和/或高保真DNA聚合酶。高保真DNA聚合酶可以为pfu酶。
此外，检测微卫星标记的方法还可以为如PCR后的扩增产物进行聚丙烯酸胺凝胶电泳检测：经PCR扩增的产物，可利用高分辨率的并行聚丙烯酰胺电泳区分，然后银染后显色。也可以为利用位点的特异性探针进行限制性片段长度多态性的检测，或用该等位基因的寡核苷酸探针进行印记杂交，然后放射自显影的方法。因此，通过这些方法来检测本申请的微卫星标记，或微卫星标记的组合也在本申请的保护范围之内。
本申请之九提供了一种根据本申请之一中所述的微卫星标记、根据本申请之二中所述的组合、根据本申请之四所述的核苷酸序列、根据本申请之五的引物对、根据本申请之六的组合、和根据本申请之八中所述的试剂盒中的至少一种在结直肠癌的预后判定中的应用；特别是在中国人群的结直肠癌的预后判定中的应用。
特别是，如SEQ ID Nos.1-5和SEQ ID Nos.61-63的微卫星标记组合；SEQ IDNos.1-5和SEQ ID No 61的微卫星标记组合；SEQ ID Nos.1-5、SEQ ID No.9、SEQ ID No.61和SEQ ID No.70的微卫星标记组合；含有以上这些微卫星标记组合的核苷酸序列；能够扩增含有以上这些微卫星标记组合的核苷酸序列的引物对；能检测以上这些微卫星标记的试剂盒中的至少一种在中国人群的结直肠癌的预后判定中的应用。其中，SEQ ID Nos.1-5和SEQ ID Nos.61-63的微卫星标记组合，或者SEQ ID Nos.1-5和SEQ ID No 61的微卫星标记组合发生MSI适于II、III期的中国人群的结直肠癌的预后判定；而SEQ ID Nos.1-5、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.61和SEQ ID No.70的微卫星标记组合发生MSI更适于II期的中国人群的结直肠癌的预后判定。
本申请之十提供了一种根据本申请之一中所述的微卫星标记、根据本申请之三中所述的组合、根据本申请之四所述的核苷酸序列、根据本申请之五的引物对、根据本申请之七的组合、和根据本申请之八中所述的试剂盒中的至少一种在结直肠癌的化疗敏感性预测中的应用；特别是在中国人群的结直肠癌的化疗敏感性预测中的应用。或者说，包括如SEQID No.4和/或SEQ ID No.6所示的核苷酸序列的微卫星标记，和/或含有这两个微卫星标记中的至少一种的核苷酸序列(包含在如上所述的序列中)，和/或能够扩增含有这两个微卫星标记中的至少一种的核苷酸序列的引物对(包含在如上所述的引物对中)，和/或能检测这两个微卫星标记中的至少一种的试剂盒在中国人群的结直肠癌的化疗敏感性预测中的应用。
特别是，如SEQ ID No.4和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列的微卫星标记组合；含有SEQ ID No.4和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列的核苷酸序列；能够扩增含有SEQ IDNo.4和SEQ ID No.6的微卫星标记的核苷酸序列的引物对；能检测SEQ ID No.4和SEQ IDNo.6的微卫星标记的试剂盒中的至少一种在中国人群的结直肠癌的化疗敏感性预测的应用。
本申请的有益效果：
本申请发现了多个与结直肠癌相关的微卫星位点发生MSI，并且组合后的位点能够更好地评估结直肠癌患者的预后和/或结直肠癌患者的化疗应答情况，为中国结直肠癌患者个性化精准医疗提供新的依据和适宜的方法。因此，本申请检测了相关微卫星不稳定性的发生并首次筛选出了适于中国人群的与结直肠癌预后相关的位点组合，这些微卫星位点组合将为中国人群的结直肠癌患者的预后判定和/或中国人群的结直肠癌患者的化疗应答提供更为有力的工具。
附图说明
图1显示了位点LIMS1-5扩增得到的纯合基因型STR扫描图。
图2显示了位点LIMS1-5扩增得到的杂合基因型STR扫描图。
图3显示了Bethesda组合位点MSI与结直肠癌预后、化疗之间的相关性分析。
图4显示了本申请的微卫星标记位点的MSI与结直肠癌预后之间的相关性分析。
图5显示了本申请的微卫星标记位点的MSI与结直肠癌预后、化疗之间的相关性分析。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特别说明，本申请的实施例中的原料均通过商业途径购买。
临床病例：2006年12月至2014年8月于北京友谊医院普外科匿名收集263例结直肠癌及其配对的癌旁正常组织。收集整理所有患者的临床病理学特征及随访信息，定期随访记录信息。
1.酚-氯仿法提取结直肠癌组织和正常组织基因组DNA
(1)取相应的组织约0.1g置于1.5mL离心管中，加入0.1mL组织消化缓冲液，用手动匀浆器将组织打碎，将匀浆好的组织转移至10mL离心管中，加入1.9mL组织消化缓冲液(共2mL)，然后加入20mg/mL蛋白酶K10μL，充分混匀后，置于37℃水浴过夜。
(2)加入与组织消化缓冲液等体积(2mL)的Tris-饱和酚，充分混匀后以12000rpm/min4℃离心10min，离心后含DNA的水相位于上层，含杂质的有机相位于下层。吸取上清液于另一个10mL离心管中。
(3)向上清液中加入1mL Tris-饱和酚和1mL氯仿，充分混匀，12000rpm/min 4℃离心10min。吸取上清液于另一个10mL离心管中。
(4)向上清液中加入2mL氯仿，充分混匀，12000rpm/min离心10min。吸取上清液于另一个10mL离心管中。
(5)向上清液中加入饱和NaCl 200μL，混匀，然后加入3-5mL冷的无水乙醇，混匀，可见絮状沉淀物出现。用枪头将絮状沉淀物挑至一个1.5mL离心管中，加入1mL 75％乙醇洗涤两次，尽可能的将乙醇吸干净，空气中干燥DNA样品约20-30min。
(6)根据沉淀块大小加入50μL-100μLTE缓冲液，将DNA旋起以便充分溶解。
(7)吸取溶解好的DNA原液1μL，用超微量分光光度计测样品浓度和OD值(OD260/OD280)。
(8)用TE溶液将已知浓度的DNA原液稀释为50ng/μL，-20℃保存备用，DNA原液保存于-80℃。
2.微卫星位点的分析
选用经软件分析得到的20个微卫星位点进行PCR扩增。每对引物的上游5’末端分别用FAM，HEX或TAMRA标记，亦可其他荧光标记物，例如ROX、CY3、CY5、AMCA、TET和JOE等等。并按照目的片段的大小进行分组。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Mg2+浓度和退火温度均由本实验室筛选获得。
(1)PCR扩增产物：按照上述PCR反应体系以及优化后的到的反应条件进行PCR扩增。为防止荧光淬灭，PCR加样过程中注意避光，PCR产物应用锡箔纸包好4℃保存。
(2)琼脂糖凝胶初步检测PCR扩增产物，同上。
(3)扩增产物的STR扫描
扩增产物经过琼脂糖电泳检测确保扩增出目的片断后将3种不同荧光标记的产物混合，即FAM、HEX、TAMRA标记位点的扩增产物以适当的混合(例如1：1.5：1.5)，每个样品取1μL进行STR扫描。扫描检测委托相关技术公司完成。
(4)STR扫描结果的判读
利用GeneMarker V2.2.0软件进行结果分析。根据软件读出波峰处的扩增产物的bp数。扫描结果出现两种波形：一种为纯合基因型，只有一个主波(见图1)；另一种为杂和基因型，有两个主波(见图2)。每个肿瘤样本的扫描结果都与自身癌旁正常组织扫描结果相比较判断是否有微卫星不稳定性发生。
实验结果：
1.肿瘤相关基因内微卫星位点的选择
在本申请中共选取了有效扩增的20个微卫星位点。其中，微卫星位点APC-6位于APC基因第10个内含子中；MCC-29位于MCC基因中第8个内含子中；MCC-32位于MCC基因中第15个内含子中；TP53-1位于TP53基因中第1个内含子中；BRAF-9位于BRAF基因中第13个内含子中；MCC-26位于MCC基因中第4个内含子中；MCC-3位于MCC基因中第1个内含子中；MCC-10位于MCC基因中第1个内含子中；MCC-14位于MCC基因中第2个内含子中；MCC-16位于MCC基因中第3个内含子中；MCC-17位于MCC基因中第3个内含子中；MCC-25位于MCC基因中第4个内含子中；MSH2-7位于MSH2基因中第7个内含子中；MGMT-5位于MGMT基因中第2个内含子中；MGMT-10位于MGMT基因中第2内含子中；LIMS1-5位于LIMS1基因5'非编码区中；LIMS1-13位于LIMS1基因中第1个内含子中；BRAF-7位于BRAF基因中第3个内含子中；CDKN1A-1位于CDKN1A基因中第1个内含子中；PMS2-1位于PMS2基因中第1内含子中。
20个微卫星位点的名称、引物序列、退火温度、Mg2+浓度、MSI等信息见表1：从微卫星位点分布的位置来看，95.0％(19/20)的位点位于内含子区域，5.0％(1/20)的位点位于非编码区。
表1 20个微卫星位点的信息
Figure BDA0001356691040000081
注：表1中的标题行依次为微卫星位点的名称、引物序列、退火温度、Mg2+浓度、扩增片段大小(bp)、微卫星序列和MSI发生几率。
2人结直肠癌中肿瘤相关基因内MSI发生情况
鉴于Bethesda组合位点在临床上应用广泛，通过STR扫描分析了263个结直肠癌肿瘤样本中Bethesda组合位点MSI的发生情况。结果表明，Bethesda组合中的5个位点BAT25(SEQ ID No.62；扩增其的引物序列见SEQ ID No.64和SEQ ID No.65)、BAT26(SEQ IDNo.63；扩增其的引物序列见SEQ ID No.66和SEQ ID No.67)、D2S123(SEQ ID No.70，扩增其的引物序列的见SEQ ID No.71和SEQ ID No.72)、D17S250(SEQ ID No.73，扩增其的引物序列的见SEQ ID No.74和SEQ ID No.75)和D5S346(SEQ ID No.61；扩增其的引物序列见SEQ ID No.68和SEQ ID No.69)的MSI发生率分别为11.0％(发生MSI的人数/总人数)、10.3％、11.8％、15.2％和16.3％。应用本申请的20个微卫星位点对263对结直肠肠癌样本进行检测，发现有101例(38.4％)肿瘤发生一个以上MSI，162例(61.7％)肿瘤未发生MSI(定义为微卫星稳定，microsatellite stability,MSS)。在发生MSI的113例肿瘤样本中共发现348个MSI，平均每个肿瘤的MSI达3.44(348/101)。用于检测的表1中的20个微卫星位点中，共有20个(82.0％)微卫星位点发生了MSI，而且统计表明这20个位点MSI的发生频率不尽相同。其中，位于TP53基因中的TP53-1位点其MSI发生率最高达15.6％(41/263)，其MSI发生率显著高于其他位点(表1)。其次是分别位于APC、MCC、BRAF和CDKN1A基因内的APC-6、MCC-29、BRAF-9和CDKN1A-1位点，比例分别为10.3％(27/263)、10.3％(27/263)、8.37％(22/263)和7.98％(21/263)。MSI发生率最高的3个位点的MSI发生率为10.3％-15.6％。
3.Bethesda组合位点MSI与结直肠癌预后、化疗之间的相关性
微卫星不稳定性的检测能够为结直肠癌患者预后和化疗应答提供十分重要的提示，根据Bethesda组合位点MSI的发生情况，在5个位点中，一个以上(包含一个)，即MSI，或者两个以上(包含两个)，即MSI-H的患者具有更好的预后和更长的生存期，且能够从化疗中受益。然而在本研究中根据Bethesda组合位点MSI的发生情况，通过统计分析发现MSI患者与MSS患者的5年疾病特异生存率(p＝0.576)和总生存率(p＝0.904)都没有显著性差异(图3A-B)。同样，MSI-H患者与MSI-L/MSS患者的5年疾病特异生存率(p＝0.720)和总生存率(p＝0.691)亦没有显著性差异(图3C-D)。在II期患者中得到相似结果，MSI患者与MSS患者的5年疾病特异生存率(p＝0.087)和总生存率(p＝0.296)都没有显著性差异(图3E-F)。除此之外，分析表明经化疗治疗的MSI患者与MSS患者的5年疾病特异生存率(p＝0.755)也没有显著性差异(图3G)。以上这些结果说明Bethesda组合位点不能够预测结直肠癌患者的预后以及化疗应答，提示Bethesda组合位点可能不适于预测本研究中结直肠癌人群的预后和化疗应答，需要在此基础上建立更好更为有效的位点组合用于预后和化疗应答的判定。
4.肿瘤相关基因内位点MSI与结直肠癌预后、化疗之间的相关性
结直肠癌患者接受适当的化疗能够提高其生存率，为结直肠癌患者提供个性化的治疗策略十分重要。而我们关于Bethesda的分析结果说明该组合位点并不能够提示结直肠癌患者的预后和化疗应答情况。在本申请中，通过肿瘤相关基因内微卫星位点的筛选和深入分析我们欣喜地发现，包含TP53-1、APC-6、MCC-29、MCC-32、BRAF-9、BAT25、BAT26和D5S346这8个位点组合中一个以上(包括一个)发生MSI的患者具有更好的预后。MSI患者的5年疾病特异生存率(p＝0.022)和总生存率(p＝0.05)都显著高于MSS(上述8个位点均未发生MSI)患者(图4A-B)。
通过进一步分析我们发现TP53-1、APC-6、MCC-29、MCC-32、BRAF-9和D5S346这6个位点组合中一个以上位点(包括一个)发生MSI的患者具有比以上8个位点更好的预后。MSI患者的5年疾病特异生存率(p＝0.017)和总生存率(p＝0.043)都显著高于MSS(上述6个位点均未发生MSI)患者(图5A-B)。另外，包含TP53-1、APC-6、MCC-29、MCC-14、MCC-32、BRAF-9、D5S346和D2S123这8个位点的组合中一个以上位点(包括一个)发生MSI的II期患者具有更好的预后，MSI患者的5年疾病特异生存率(p＝0.011)和总生存率(p＝0.032)都显著高于MSS(上述8个位点均未发生MSI)患者(图5C-D)。在经过化疗的患者中，TP53-1或者MCC-26位点之一或者两者发生MSI的患者5年疾病特异生存率显著高于MSS患者具有更好的预后(p＝0.044)(图5E)，提示TP53-1与MCC-26位点组合提示患者能够在化疗后受益。
为了进一步评估组合位点的预后价值，我们进行了单因素以及多因素Cox比例风险回归模型分析。通过Cox单因素模型分析发现，年龄显著与5年疾病特异生存率(DSS)(风险比：2.232；95％置信区间：1.197-4.161，p＝0.012)以及5年总体生存率(OS)(风险比：2.216；95％置信区间：1.240-3.959，p＝0.007)显著相关，在Cox多因素模型分析中，年龄仍显著地与5年疾病特异生存率(DSS)(风险比：2.567；95％置信区间：1.367-4.819，p＝0.003)以及5年总体生存率(OS)(风险比：2.534；95％置信区间：1.409-2.465，p＝0.002)相关。值得注意的是，本研究中筛选的到的6个位点(TP53-1、APC-6、MCC-29、MCC-32、BRAF-9和D5S346)的组合在Cox单因素和多因素模型分析中均表现出预后价值：单因素分析中，5年疾病特异生存率(DSS)(风险比：0.476；95％置信区间：0.255-0.888，p＝0.020)以及5年总体生存率(OS)(风险比：0.567，95％置信区间：0.325-0.990，p＝0.046)；以及多因素分析中，5年疾病特异生存率(DSS)(风险比：0.370；95％置信区间：0.179-0.764，p＝0.007)以及5年总体生存率(OS)(风险比：0.430；95％置信区间：0.224-0.824，p＝0.011)。但其他因素，包括Bethesda组合5个位点、性别、分期等，无论是Cox单因素或者多因素模型分析，均与结直肠癌患者的预后没有相关性(表3)。
研究结论：
本申请中，通过对广泛应用的Bethesda组合位点MSI情况的检测和分析，发现MSI患者和MSS患者的5年疾病特异生存率和总生存率与MSS患者没有显著性差异，这些结果表明Bethesda组合位点不能有效预测中国结直肠癌患者的预后。尽管有研究表明MSI-H CRC的预后特征包括患者预后良好以及从辅助化疗中受益，但是由于MSI-H CRC患者的分子学异质性、种族差异或环境差异也使其存在预后差异。因此，迫切需要筛选更好更有效的标志物，尤其是更适于中国人的用于结直肠癌临床预后的判定标志物。在本申请中，分析了20个微卫星位点MSI的发生情况及其与结直肠癌预后之间的相关性。
非常幸运地是，发现一个包含8个位点的组合(TP53-1、APC-6、MCC-29、MCC-32、BRAF-9、BAT25、BAT26和D5S346，其中BAT25、BAT26和D5S346属于Bethesda组合)在II、III期结直肠癌患者中可提示预后。进一步地分析又发现一个包含6个位点的组合(TP53-1、APC-6、MCC29、MCC-32、BRAF-9和D5S346；其中，D5S346属于Bethesda组合)在II、III期结直肠癌患者中可提示预后该位点为判定II、III期结直肠癌患者预后的最优组合。而另外一个包含8个位点的组合(TP53-1、APC-6、MCC-29、MCC-14、MCC-32、BRAF-9、D5S346和D2S123；其中，D5S346和D2S123属于Bethesda组合)在II期结直肠癌患者中提示预后。也就是说，在258个随访信息完整的患者中，92例(35.7％)患者在上述最优组合位点(6个位点)至少发生一个MSI，其预后情况显著优于该组合位点没有发生MSI的病人，说明本申请筛选得到的位点组合能够提示结直肠癌患者的预后情况。然而，Bethesda组合位点仅能够提示大约15％的结直肠癌患者的预后情况。本申请探索了肿瘤相关基因内微卫星不稳定性的发生并首次筛选出了与结直肠癌预后相关的位点组合，这些微卫星位点组合将为中国结直肠癌患者预后判定提供更为有力的工具。
另外，在本申请中，还筛选得到一个能够提示结直肠癌患者化疗应答情况的位点组合(TP53-1和MCC-26)，这2个位点若能应用于预测结直肠癌化疗应答方面将是非常简便快捷的。
以上所述，仅是本申请的部分实施例。虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。
Figure BDA0001356691040000121
LHA1760438 核 苷 酸 序 列 表
<110> 首都医科大学
<120> 微卫星标记及其在结直肠癌的预后判定和/或化疗敏感性预测中的应用
<130> LHA1760438
<160> 75
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 智人（homo sapiens）
<223> APC-6
<400> 1
ACACACACACACACACACACACACACACACACAC)；
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> MCC-29
<400> 2
GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA；
<210>3
<211> 20
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> MCC-32
<400> 3
TTGTTTGTTTGTTTGTTTGT；
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> TP53-1
<400> 4
AAAATAAAATAAAATAAAATAAAATAAAATAAAATAAAAT；
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> BRAF-9
<400> 5
TTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTTG；
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 智人（homo sapiens）
<223> MCC-26
<400> 6
TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG；
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> MCC-3
<400> 7
TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG；
<210>8
<211> 20
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> MCC-10
<400> 8
ATATATATATATATATATAT；
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> MCC-14
<400> 9
TTGTTGTTGTTGTTGTTGTTG；
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> MCC-16
<400> 10
CACACACACACACACACACACACACACACA；
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人（homo sapiens）
<223> MCC-17
<400> 11
CACACACACACACACACACACACACACACA；
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> MCC-25
<400> 12
TGTGTGTGTGTGTGTGTGTG；
<210>13
<211> 32
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> MSH2-7
<400> 13
AAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAAT；
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> MGMT-5
<400> 14
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT；
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> MGMT-10
<400> 15
ACACACACACACACACACACACAC；
<210> 16
<211> 50
<212> DNA
<213> 智人（homo sapiens）
<223> LIMS1-5
<400> 16
TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG；
<210> 17
<211> 46
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> LIMS1-13
<400> 17
TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG；
<210>18
<211> 26
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> BRAF-7
<400> 18
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT；
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> CDKN1A-1
<400> 19
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT；
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> PMS2-1
<400> 20
AATAATAATAATAATAATAATAATAAT；
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<223> APC-6F
<400> 21
AACTTATTTCATTCCTGT；
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<223> APC-6R
<400> 22
TTGTATCATCTCCTCTTC；
<210>23
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-29F
<400> 23
AAATCCCCCCAACATCTC；
<210>24
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-29R
<400> 24
CCTGTCAATAGCCACTGC；
<210> 25
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-32F
<400> 25
ATCCATTATCCAGCA；
<210> 26
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-32R
<400> 26
AACACAGTGAGACCC；
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<223> TP53-1F
<400> 27
GGCAATAAGAGCTGAGACTCC；
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<223> TP53-1R
<400> 28
GACAAAACATCCCCTACCAAA；
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213>人工序列
<223> BRAF-9F
<400> 29
TAGAGACAGAGTTTCG；
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213>人工序列
<223> BRAF-9R
<400> 30
CAGTTAGGATTTGAAG；
<210> 31
<211> 16
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-26F
<400> 31
GCTCTCCCTCTCCATC；
<210> 32
<211> 16
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-26R
<400> 32
CCTTCAGCATCCCTAC；
<210> 33
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-3F
<400> 33
CTTGATTCCTTGCCC；
<210> 34
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-3R
<400> 34
ACCTCTGTCGCTGCT；
<210> 35
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-10F
<400> 35
GCCATACCCACTTCC；
<210> 36
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-10R
<400> 36
GCTCATCACCCTGCT；
<210> 37
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-14F
<400> 37
CTGCTTGGTGTTCTA；
<210> 38
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-14R
<400> 38
ATCATGCCATTGTAC；
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-16F
<400> 39
CCTAAGAAAATACGACAAC；
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-16R
<400> 40
CAAAGACAGGAGAGAGAGT；
<210> 41
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-17F
<400> 41
AATGAACTTGCAGAC；
<210> 42
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-17R
<400> 42
AAAGATGGTGAATAA；
<210> 43
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-25F
<400> 43
TGTTGCCTCTTGTTC；
<210> 44
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MCC-25R
<400> 44
GCTGCTCTGCCTATG；
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MSH2-7F
<400> 45
TTGCTCTCTTGCTATCTTG；
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MSH2-7R
<400> 46
GCCCTCTACTGTCTCTCTG；
<210>47
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MGMT-5F
<400> 47
AAACGGGAACTTTCAGAC；
<210>48
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MGMT-5R
<400> 48
AAATCACTAGGCACCAAC；
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MGMT-10F
<400> 49
AAGACTTCAAGGGAGAC；
<210> 50
<211> 17
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MGMT-10R
<400> 50
TTTGCCACCTTCTTTCA；
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213>人工序列
<223> LIMS1-5F
<400> 51
AGCACTAAACCCTTCCC；
<210>52
<211> 17
<212> DNA
<213>人工序列
<223> LIMS1-5R
<400> 52
ACCACCACAACAAACCA；
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213>人工序列
<223> LIMS1-13F
<400> 53
AATCCCTTGCCTTTCTG；
<210> 54
<211> 17
<212> DNA
<213>人工序列
<223> LIMS1-13R
<400> 54
ATCTTTCACTGCCCGTT；
<210> 55
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<223> BRAF-7F
<400> 55
GCCTTAAAGTAGGAGACA；
<210> 56
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<223> BRAF-7R
<400> 56
TATGAAGAGTGGGGAAAT；
<210>57
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<223> CDKN1A-1F
<400> 57
TTCGTTGCTCCCGTCTAT；
<210>58
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<223> CDKN1A-1R
<400> 58
GCTCTTGTGCCGTCTCTG；
<210> 59
<211> 16
<212> DNA
<213>人工序列
<223> PMS2-1F
<400> 59
ATGCCATTGCCCTCTA；
<210> 60
<211> 16
<212> DNA
<213>人工序列
<223> PMS2-1R
<400> 60
TGCCCCACTTCCTACT；
<210> 61
<211> 26
<212> DNA
<213> 智人（homo sapiens）
<223> D5S346
<400> 61
CACACACACACACACACACACACACA；
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> BAT25
<400> 62
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA；
<210>63
<211> 26
<212> DNA
<213>人工序列
<223> BAT26
<400> 63
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA；
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列
<223> D5S346-F
<400> 64
ACTCACTCTAGTGATAAATCGGG；
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<223> D5S346-R
<400> 65
AGCAGATAAGACAGTATTACTAGTT；
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<223> BAT25-F
<400> 66
TCGCCTCCAAGAATGTAAGT；
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<223> BAT25-R
<400> 67
TCTGGATTTTAACTATGGCTC；
<210>68
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<223> BAT26-F
<400> 68
TGACTACTTTTGACTTCAGCC；
<210> 69
<211> 28
<212> DNA
<213>人工序列
<223> BAT26-R
<400> 69
GTTTCTAACCATTCAACATTTTTATCCC；
<210> 70
<211> 42
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> D2S123
<400> 69
CACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACA；
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<223> D2S123-F
<400> 71
AAACAGGATGCCTGCCTTTA；
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<223> D2S123-R
<400> 72
GGACTTTCCACCTATGGGAC；
<210> 73
<211> 38
<212> DNA
<213>智人（homo sapiens）
<223> D17S250
<400> 73
CACACACACACACACACACACACACACACACACACACA；
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<223> D17S250-F
<400> 74
GGAAGAATCAAATAGACAAT；
<210> 75
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<223> D17S250-R
<400> 75
GCTGGCCATATATATATTTAAACC。

Claims (11)

1.一种微卫星标记组合，所述微卫星标记组合包括如SEQ ID Nos.1-5和SEQ IDNos.61-63所示序列的核苷酸；和/或
所述微卫星标记组合包括如SEQ ID Nos.1-5、SEQ ID No.9、SEQ ID No.61和SEQ IDNo.70所示序列的核苷酸中的至少两种，同时，在所述微卫星标记组合仅由两种微卫星标记组成时，所述微卫星标记组合不能为由SEQ ID No.61和SEQ ID No.70的组合构成的组合。
2.根据权利要求1所述的微卫星标记组合，其特征在于，所述微卫星标记组合包括如SEQ ID Nos.1-5和SEQ ID No.61所示序列的核苷酸中的至少两种。
3.一种核酸组合，所述核酸的序列具有100-500bps的长度；且所述核酸包含如权利要求1或2所述的微卫星标记组合中的微卫星标记。
4.根据权利要求3所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸的序列具有150-400bps的长度。
5.根据权利要求4所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸的序列具有150-350bps的长度。
6.根据权利要求5所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸的序列具有180-250bps的长度。
7.根据权利要求3所述的核酸组合，其特征在于，所述核酸的序列选自如下核酸序列：
以人基因组为模板，以SEQ ID No.21和SEQ ID No.22进行PCR扩增得到含有SEQ IDNo.1的产物的序列；
以人基因组为模板，以SEQ ID No.23和SEQ ID No.24进行PCR扩增得到含有SEQ IDNo.2的产物的序列；
以人基因组为模板，以SEQ ID No.25和SEQ ID No.26进行PCR扩增得到含有SEQ IDNo.3的产物的序列；
以人基因组为模板，以SEQ ID No.27和SEQ ID No.28进行PCR扩增得到含有SEQ IDNo.4的产物的序列；
以人基因组为模板，以SEQ ID No.29和SEQ ID No.30进行PCR扩增得到含有SEQ IDNo.5的产物的序列；
以人基因组为模板，以SEQ ID No.64和SEQ ID No.65进行PCR扩增得到含有SEQ IDNo.61的产物的序列；
以人基因组为模板，以SEQ ID No.66和SEQ ID No.67进行PCR扩增得到含有SEQ IDNo.62的产物的序列；
以人基因组为模板，以SEQ ID No.68和SEQ ID No.69进行PCR扩增得到含有SEQ IDNo.63的产物的序列；
以人基因组为模板，以SEQ ID No.71和SEQ ID No.72进行PCR扩增得到含有SEQ IDNo.70的产物的序列。
8.一种引物对组合，所述引物对组合包括如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22的引物对、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24的引物对、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26的引物对、SEQ IDNo.27和SEQ ID No.28的引物对、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30的引物对、SEQ ID No.64和SEQ ID No.65的引物对、SEQ ID No.66和SEQ ID No.67的引物对、和SEQ ID No.68和SEQID No.69的引物对；和/或
所述引物对组合包括如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22的引物对、SEQ ID No.23和SEQID No.24的引物对、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26的引物对、SEQ ID No.27和SEQ IDNo.28的引物对、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30的引物对、SEQ ID No.37和SEQ ID No.38、SEQ ID No.64和SEQ ID No.65的引物对、和SEQ ID No.71和SEQ ID No.72的引物对中的至少两对，同时，在所述引物对组合仅由两种引物对组成时，所述引物对组合不能为由SEQ IDNo.64和SEQ ID No.65的引物对、和SEQ ID No.71和SEQ ID No.72的引物对构成的组合。
9.根据权利要求8所述的引物对组合，其特征在于，所述引物对组合包括如SEQ IDNo.21和SEQ ID No.22的引物对、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24的引物对、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26的引物对、SEQ ID No.27和SEQ ID No.28的引物对、SEQ ID No.29和SEQ IDNo.30的引物对、和SEQ ID No.64和SEQ ID No.65的引物对中的至少两对。
10.一种试剂盒，所述试剂盒中包括如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22的引物对、SEQ IDNo.23和SEQ ID No.24的引物对、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26的引物对、SEQ ID No.27和SEQ ID No.28的引物对、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30的引物对、SEQ ID No.64和SEQ IDNo.65的引物对、SEQ ID No.66和SEQ ID No.67的引物对、和SEQ ID No.68和SEQ ID No.69的引物对；和/或
所述试剂盒中包括如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22的引物对、SEQ ID No.23和SEQ IDNo.24的引物对、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26的引物对、SEQ ID No.27和SEQ ID No.28的引物对、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30的引物对、SEQ ID No.37和SEQ ID No.38、SEQ IDNo.64和SEQ ID No.65的引物对、和SEQ ID No.71和SEQ ID No.72的引物对中的至少两对，同时，所述试剂盒中的引物对仅由两种引物对组成时，所述引物对不能为由SEQ ID No.64和SEQ ID No.65的引物对、和SEQ ID No.71和SEQ ID No.72的引物对构成的组合。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22的引物对、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24的引物对、SEQ ID No.25和SEQ IDNo.26的引物对、SEQ ID No.27和SEQ ID No.28的引物对、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30的引物对、和SEQ ID No.64和SEQ ID No.65的引物对中的至少两对。
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