JP4836710B2 - マイクロサテライト不安定性細胞の検出方法及びキット - Google Patents
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Description
[1] 生体試料において、配列番号1で示される塩基配列を5'末端に含むヒトMLH1遺伝子の転写産物、及び配列番号2で示される塩基配列を5'末端に含むヒトMLH1遺伝子の転写産物の発現量を測定し、配列番号1で示される塩基配列を5'末端に含むヒトMLH1遺伝子の転写産物の発現量よりも配列番号2で示される塩基配列を5'末端に含むヒトMLH1遺伝子の転写産物の発現量が高い場合にマイクロサテライト不安定性を示す大腸癌細胞の存在が示されたものと判定することで、マイクロサテライト不安定性を示す大腸癌細胞を検出することを特徴とする、遺伝子発現分析方法。
(a)配列番号1で示される塩基配列上の、1〜204番目のエクソン1部分の一部を少なくとも含む連続した15〜50塩基の塩基配列からなるプライマーと、配列番号5で示されるエクソン2部分の塩基配列上の連続した15〜50塩基の配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、プライマー対、及び
(b)配列番号2で示される塩基配列上の1〜132のエクソン1及び2部分の一部を少なくとも含む連続した15〜50塩基の塩基配列からなるプライマーと、配列番号5で示されるエクソン2部分の塩基配列上の連続した15〜50塩基の配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、プライマー対。
配列番号6で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号7で示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせであるプライマー対(a)、及び
配列番号8で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号7で示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせであるプライマー対(b)、
が挙げられる。これらのプライマー対を用いる測定において、TaqMan(登録商標)プローブ法によりリアルタイムPCR法を用いて転写産物の発現量を測定し、かつそのTaqMan(登録商標)プローブ法を利用する場合には、一方の端部に蛍光物質が、他方の端部に消光物質が付加された配列番号9で示される塩基配列からなるプローブを好適に用いることができる。
(a) 配列番号1で示される塩基配列上の、1〜204番目のエクソン1部分の一部を少なくとも含む連続した15〜50塩基の塩基配列からなるプライマーと、配列番号5で示されるエクソン2部分の塩基配列上の連続した15〜50塩基の配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、プライマー対、及び
(b) 配列番号2で示される塩基配列上の1〜132のエクソン1及び2部分の一部を少なくとも含む連続した15〜50塩基の塩基配列からなるプライマーと、配列番号5で示されるエクソン2部分の塩基配列上の連続した15〜50塩基の配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、プライマー対。
(a) 配列番号1で示される塩基配列上の、1〜204番目のエクソン1部分の一部を少なくとも含む連続した15〜50塩基の塩基配列からなるプライマーと、配列番号5で示されるエクソン2部分の塩基配列上の連続した15〜50塩基の配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、プライマー対、及び
(b) 配列番号2で示される塩基配列上の1〜132のエクソン1及び2部分の一部を少なくとも含む連続した15〜50塩基の塩基配列からなるプライマーと、配列番号5で示されるエクソン2部分の塩基配列上の連続した15〜50塩基の配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、プライマー対。
プライマー対(a)が、配列番号6で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号7で示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせであり、
プライマー対(b)が、配列番号8で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号7で示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである。
(b) 配列番号2で示される塩基配列上の、1〜91番目のエクソン1部分の一部(例えば、10〜30塩基長)を少なくとも含む連続した15〜50塩基の塩基配列からなるプライマーと、配列番号5で示されるエクソン2部分の塩基配列上の連続した15〜50塩基の配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、プライマー対。
プライマー対(a):配列番号6で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号7で示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、
プライマー対(b):配列番号8で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号7で示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ。
・配列番号6で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号7で示される塩基配列からなるプライマーとを用いて、生体試料由来のcDNAからバリアント1の増幅反応を行うステップ、
・配列番号8で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号7で示される塩基配列からなるプライマーとを用いて、生体試料由来のcDNAからバリアント3の増幅反応を行うステップ、
・それぞれの増幅反応においてPCR増幅産物量をモニタリングし、そこから生体試料中のバリアント1とバリアント3の初期含有量を算出するステップ、
によって、行うことができる。
(b) 配列番号2で示される塩基配列上の、1〜91番目のエクソン1部分の一部(例えば、10〜30塩基長)を少なくとも含む連続した15〜50塩基の塩基配列からなるプライマーと、配列番号5で示されるエクソン2部分の塩基配列上の連続した15〜50塩基の配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、プライマー対。
配列番号6で示される塩基配列からなるプライマーと、
配列番号7で示される塩基配列からなるプライマーと、
配列番号8で示される塩基配列からなるプライマーと、
を含むプライマーの組み合わせが挙げられる。
本発明者らは、hMLH1遺伝子が選択的スプライシングや選択的プロモーターの利用により複数の転写産物バリアント(変異体)として発現されている可能性を検討するため、以下の実験を行った。
実施例1での解析により、hMLH1遺伝子の転写産物として3種類のバリアントが存在することが判明した。hMLH1遺伝子はこれまでも細胞の癌化に関わる遺伝子として知られていたが、今回、転写産物バリアントの存在が初めて明らかになったことから、これらのバリアントと癌との間の関連が予想された。
配列番号9はプローブである。
Claims (13)
- 生体試料において、配列番号1で示される塩基配列を5'末端に含むヒトMLH1遺伝子の転写産物、及び配列番号2で示される塩基配列を5'末端に含むヒトMLH1遺伝子の転写産物の発現量を測定し、配列番号1で示される塩基配列を5'末端に含むヒトMLH1遺伝子の転写産物の発現量よりも配列番号2で示される塩基配列を5'末端に含むヒトMLH1遺伝子の転写産物の発現量が高い場合にマイクロサテライト不安定性を示す大腸癌細胞の存在が示されたものと判定することで、マイクロサテライト不安定性を示す大腸癌細胞を検出することを特徴とする、遺伝子発現分析方法。
- リアルタイムPCR法を用いて転写産物の発現量を測定する、請求項1に記載の方法。
- リアルタイムPCR法を用いた測定を、TaqMan(登録商標)プローブ法により行う、請求項2に記載の方法。
- 以下の(a)及び(b)のプライマー対を用いて測定を行う、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
(a) 配列番号1で示される塩基配列上の、1〜204番目のエクソン1部分の一部を少なくとも含む連続した15〜50塩基の塩基配列からなるプライマーと、配列番号5で示されるエクソン2部分の塩基配列上の連続した15〜50塩基の配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、プライマー対、及び
(b) 配列番号2で示される塩基配列上の1〜132のエクソン1及び2部分の一部を少なくとも含む連続した15〜50塩基の塩基配列からなるプライマーと、配列番号5で示されるエクソン2部分の塩基配列上の連続した15〜50塩基の配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、プライマー対。 - プライマー対(a)が、配列番号6で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号7で示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせであり、
プライマー対(b)が、配列番号8で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号7で示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、
請求項4に記載の方法。 - TaqMan(登録商標)プローブ法によりリアルタイムPCR法を用いて転写産物の発現量を測定し、かつそのTaqMan(登録商標)プローブ法において、一方の端部に蛍光物質が、他方の端部に消光物質が付加された配列番号9で示される塩基配列からなるプローブを用いる、請求項5に記載の方法。
- 大腸癌が、遺伝性非ポリポーシス大腸癌である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 以下の(a)及び(b)のプライマー対を含む、マイクロサテライト不安定性を示す大腸癌細胞を検出するための遺伝子発現量分析用プライマーセット。
(a) 配列番号1で示される塩基配列上の、1〜204番目のエクソン1部分の一部を少なくとも含む連続した15〜50塩基の塩基配列からなるプライマーと、配列番号5で示されるエクソン2部分の塩基配列上の連続した15〜50塩基の配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、プライマー対、及び
(b) 配列番号2で示される塩基配列上の1〜132のエクソン1及び2部分の一部を少なくとも含む連続した15〜50塩基の塩基配列からなるプライマーと、配列番号5で示されるエクソン2部分の塩基配列上の連続した15〜50塩基の配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、プライマー対。 - 以下の(a)及び(b)のプライマー対を含む、マイクロサテライト不安定性を示す大腸癌細胞を検出するための遺伝子発現量分析用キット。
(a) 配列番号1で示される塩基配列上の、1〜204番目のエクソン1部分の一部を少なくとも含む連続した15〜50塩基の塩基配列からなるプライマーと、配列番号5で示されるエクソン2部分の塩基配列上の連続した15〜50塩基の配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、プライマー対、及び
(b) 配列番号2で示される塩基配列上の1〜132のエクソン1及び2部分の一部を少なくとも含む連続した15〜50塩基の塩基配列からなるプライマーと、配列番号5で示されるエクソン2部分の塩基配列上の連続した15〜50塩基の配列に相補的な塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、プライマー対。 - プライマー対(a)が、配列番号6で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号7で示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせであり、
プライマー対(b)が、配列番号8で示される塩基配列からなるプライマーと、配列番号7で示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせである、
請求項9に記載のキット。 - 一方の端部に蛍光物質が、他方の端部に消光物質が付加された配列番号9で示される塩基配列からなるプローブをさらに含む、請求項10に記載のキット。
- 大腸癌診断用キットである、請求項9〜11のいずれか1項に記載のキット。
- 遺伝性非ポリポーシス大腸癌診断用キットである、請求項12に記載のキット。
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