CN101130819A - 微卫星不稳定性细胞的检测方法以及试剂盒 - Google Patents

微卫星不稳定性细胞的检测方法以及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于癌诊断的、基于基因表达分析的异常的细胞的检测方法。本发明的解决方法是提供一种基因表达分析方法，其特征在于，通过测定生物试样中的在5′末端含有序列号1所示的碱基序列的人MLH1基因的转录产物、以及在5′末端含有序列号2所示的碱基序列的人MLH1基因的测定转录产物的表达量，将其进行比较，检测显示微卫星不稳定性的细胞。

Description

微卫星不稳定性细胞的检测方法以及试剂盒
技术领域
本发明涉及用于癌诊断的、基于基因表达分析来检测具有微卫星不稳定性的细胞的方法。
背景技术
据报道通过人类基因组计划阐明的惊人发现之一是人基因组中含有的基因数比预测少的多，只有25000个左右。这个基因数和更低等生物相比几乎没有差异，不能充分解释人的复杂的脑系统和免疫系统统的功能。所以认为在高等动物的复杂的生物功能中，来自1个基因的多种的表达结构起着重要的作用。
来自1个基因的mRNA以及蛋白质的表达的多样性主要是通过mRNA转录、或者RNA加工阶段的选择性启动子的利用、或者选择性剪切进行控制的(参见非专利文献1)。选择性剪切是指在mRNA前体中多个内含子存在的情况下，通常通过在多种剪切部位间发生在相互邻接的剪切部位间进行的剪切反应，由1个mRNA前体产生多种成熟的mRNA(剪切变体)的机制。另一方面，选择性启动子是指存在控制1个基因的转录的选择性的多个启动子。在选择性启动子存在的情况下，由于在这个基因上存在多个转录启点，结果生成了具有不同的5′末端序列的多种转录产物。最近，报道说基于寡核苷酸帽法cDNA文库中含有的1780295种的完整长cDNA序列进行的检索，结果令人吃惊地发现在美国NCBI的RefSeq数据库(http://ncbi.nih.gov/RefSeq/；转录产物相关数据库)中登记的基因中有约52％的基因在选择性启动子的控制之下，平均每1个基因存在3.1个选择性启动子(参见非专利文献2)。已知通过这样的由1个基因进行多种表达，衍生出在进化的过程中的生物的多样性和复杂的生物功能，另外一方面，导致在个体中的异常蛋白质的产生和蛋白质自体缺陷，其结果有时诱发细胞癌变(参见非专利文献3)。
对于遗传性非息肉性大肠癌(Hereditary non-poliposiscolorectal cancer；HNPCC)，通过从1993年到1995年分离的错配修复相关的各种基因的发现，对其在遗传学上的理解取得理飞跃性的进步。错配修复机制是指识别DNA复制和基因重组时在DNA上产生的异常的碱基匹配(错配)，将其除去加以修复的机制。已知在家族性肿瘤中最具代表性的疾病之一的HNPCC中，90％以上的情况下，作为错配修复系统缺陷的反映的结果，其肿瘤组织的DNA中微卫星不稳定性(Microsatellite instability；MSI)呈阳性(参见非专利文献4)。微卫星是指2～5个碱基对的重复单位反复重复数次到数十次的重复序列，其不稳定性是指它们的重复数变得异常地少的现象。MSI通常能够通过采用PCR法的微卫星标记(BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250等)的分析实现检测。所以MSI的检测成为在HNPCC诊断时的一个辅助(参见非专利文献5)。此外，在1997年的MSI检测相关国际交流会议中，将检测出这些标记中的2个以上的不稳定性的肿瘤定义为MSI-H(检测出肿瘤中30％以上的MSI的状态)，判定具有临床病理性特征。
癌的基因诊断多数根据致病基因的突变解析的结果。不过作为家族性腺瘤性息肉病(Familial adenomatous polyposis；FAP)的致病基因的APC基因等是不同的，在HNPCC的情况下，已经确定了5个(hMSH2、hMLH1、hPMS1、hPMS2、以及hMSH6)致病基因，不过在这些致病基因有突变的情况下，发病的比例(浸透率；penetrance rate)也不是100％，所以在美国临床肿瘤学会(ASCO)的分类中，基于上述致病基因的突变进行的HNPCC的基因诊断现在尚且未达到临床水平，处于研究水平阶段。也有人提出了针对hMLH1等癌相关基因进行基因组上的基因突变和甲基化检测，以此作为指标的癌检测方法的方案(专利文献1以及2)。不过疾病覆盖率不太高，此外在简便性以及迅速性方面也有问题。所以亟需开发出用于包括HNPCC在内的癌诊断的、简便并且高可靠性的好的细胞检测方法。认为如果公开发能够判断癌发病的基因表达水平的细胞检测方法，因为能够确认检测时的细胞的基因表达状态，所以能够用于实时地检测细胞的突变。不过尚未开发出这样有用的检测方法。
专利文献1：特开2005-304497号公报
专利文献2：特表2002-533061号公报
非专利文献1：Landry J.R.et al.，Trends in Genetics，(2003)19(11)p.640-648
非专利文献2：Kimura K.et al.，Genome Research，(2006)16：p，55-65
非专利文献3：Brinkman B.M.，Clin.Biochem.，(2004)37(7)：p.584-594
非专利文献4：Liu B.et al.，Nature Med.，(1996)2：p.169-174
非专利文献5：Laiho P.et al.，Cancer Research，(2002)62：p.1166-1170
非专利文献6：Deng G.et al.，Cancer Research，(1999)59：p.2029-2033
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的是提供能够用于癌诊断的、基于基因表达分析的细胞的检测方法。
解决问题的方法
本发明人等为了解决上述问题，反复努力研究，结果发现由人MLH1基因(hMLH1基因)表达至少3种转录产物变体(变体1、变体2、变体3)，此外在显示微卫星不稳定性的癌细胞中，与其中主要的转录产物的变体1相比，变体3的表达量相对增加，由此完成了本发明。
即、本发明包含下述内容。
[1]基因表达分析方法，特征在于，测定生物试样中的在5′末端含有序列号1所示的碱基序列的人MLH1基因的转录产物、以及在5′末端含有序列号2所示的碱基序列的人MLH1基因的转录产物的表达量，通过将其进行比较，检测显示微卫星不稳定性的细胞。
在该方法中，能够使用实时PCR法测定转录产物的表达量。使用实时PCR法的测定可以使用TaqMan(注册商标)探针法进行。
在本发明的方法中优选使用下述的(a)以及(b)的引物对进行测定：
(a)引物对：其是由至少含有序列号1所示的碱基序列上的1～204位的外显子1部分的一部分的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合，以及
(b)引物对：其是由至少含有序列号2所示的碱基序列上的1～91位的外显子1部分的一部分的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合。
作为适合上述(a)以及(b)的引物对的例子可以列举：
作为由序列号6所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合的引物对(a)、以及
作为由序列号8所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合的引物对(b)。使用这些引物对进行测定时，在利用TaqMan(注册商标)探针法的情况下，可以使用在一端添加了荧光物质，另一端添加了消光物质的序列号9所示的碱基序列构成的探针。
用上述本发明的方法检测的显示微卫星不稳定性细胞多数情况下是癌细胞。该癌可以是大肠癌。此外，这种大肠癌可以是遗传性非息肉性大肠癌。
[2]含有下述的(a)以及(b)的引物对的、用于检测显示微卫星不稳定性的细胞的基因表达量的分析用引物组：
(a)引物对：其是由至少含有序列号1所示的碱基序列上的1～204位的外显子1部分的一部分的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合，以及
(b)引物对：其是由至少含有序列号2所示的碱基序列上的1～91位的外显子1部分的一部分的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合。
[3]含有下述的(a)以及(b)的引物对的、用于检测显示微卫星不稳定性的细胞的基因表达量分析用试剂盒。
(a)引物对：其是由至少含有序列号1所示的碱基序列上的1～204位的外显子1部分的一部分的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合，以及
(b)引物对：其是由至少含有序列号2所示的碱基序列上的1～91位的外显子1部分的一部分的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合。
该试剂盒中含有的引物对(a)以及(b)优选：
引物对(a)是由序列号6所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合，
引物对(b)是由序列号8所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合。
该试剂盒还可以含有在一端添加了荧光物质、另一端添加了消光物质的序列号9所示的碱基序列构成的探针。
作为该试剂盒的检测对象的上述细胞优选是癌细胞。特别是该试剂盒可以作为癌诊断用试剂盒使用，还可以作为大肠癌诊断用试剂盒使用，特别是作为遗传性非息肉性大肠癌诊断用试剂盒使用。
发明的效果
本发明的检测方法即使针对仅仅含有少量癌细胞的生物试样也能够简便并且清楚地检测hMLH1基因的表达状态，能够迅速并且简便地检测显示微卫星不稳定性细胞(特别是、癌细胞)。
附图说明
图1是表示hMLH1基因的3种转录产物变体的外显子结构的图。
图2是表示在6种癌细胞株中的hMLH1基因的转录产物变体1以及3的表达量的图。黑色条型表示变体1、白色条型表示变体3。图2的下半页表示的是上半页图所示的各癌细胞株中变体1和变体3的表达量的比较结果，将变体1的表达量比变体3的少表示为V1＜V3，将变体1未能检测到，仅仅检测到变体3，表示为V1(-)，V3(+)，将变体1的表达量比变体3多表示为V1＞V3。此外，图2的下半页中，微卫星不稳定性(MSI)的阳性为(+)，阴性为(-)，并且hMLH1基因的启动子区域中确认有甲基化为(+)，未确认有为(-)。
序列表
序列号6～8以及10～12是引物。
序列号9是探针。
具体实施方式
下面详细说明本发明。
人MLH1基因(hMLH1基因)是大肠杆菌(E.coli)的DNA错配修复基因mutL的人等同物(相同体)。hMLH1基因作为识别在遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)中高频性突然突变的基因座已经为人所知。hMLH1基因的mRNA的RefSeq序列公开在GenBank登记号NM000249中，在本说明书中为了参照该序列，表示为序列号13。该hMLH1基因的mRNA的RefSeq序列(序列号13)中含有hMLH1基因中所含有的19个外显子部分。
在本发明中，作为hMLH1基因的转录产物的变体(variant；突变体)，除了与作为主要转录产物的上述RefSeq序列几乎一致的变体1之外，发现还存在变体2以及变体3(图1)。该变体1在其5′末端含有序列号1的碱基序列(外显子1+2)，之后连接着hMLH1基因的外显子3～19部分(与序列号13的第268～2524位碱基相当)。变体2具有与变体1几乎相同的外显子结构，但在外显子2部分(序列号5)的5′末端缺失5个碱基。另一方面，因为变体3来自从变体1更后方的约300bp的转录启点开始转录而得到的mRNA前体，所以其5′末端含有和变体1不同的序列号2的碱基序列(外显子1+2)，其后面连接有和变体1以及2共同的外显子3～19部分。因为变体1的外显子1部分中含有翻译启始部位ATG，所以推测变体3编码的蛋白质与变体1编码的蛋白质至少在5′末端的氨基酸序列上不同，是作为不完整的蛋白质而产生的或者根本不产生。
本发明中还表现出了在大肠癌等的癌细胞、特别是显示微卫星不稳定性细胞中，与上述的变体1的表达量相比较，变体3的表达量相对增加。因为预测在生物内通常变体1的表达量最多，所以这样的hMLH1基因的转录产物之间的表达量的比率的变化显示生物试样中的细胞中hMLH1基因的表达状态的异常。所以由此认为这种异常与细胞中微卫星不稳定性以及癌变有关。
本发明的方法是基于以上发现的基因表达分析方法，其特征在于，测定在生物试样中的变体1(在5′末端含有序列号1所示的碱基序列的人MLH1基因的转录产物)、以及变体3(在5’末端含有序列号2所示的碱基序列的人MLH1基因的转录产物)的表达量，通过将其进行比较检测显示微卫星不稳定性的细胞。
在本发明中，生物试样可以是从人受试者回收到的任意的组织、细胞或者体液。这样的生物试样可以是例如：皮肤、粘膜组织、消化道组织等，也可以是血液、淋巴液、唾液、精液等。更优选的生物试样特别是肿瘤、癌组织、或者癌变疑似组织。生物试样也可以是建立品系的培养细胞。特别优选的生物试样是来自大肠癌的组织或者细胞、或者也可以大肠癌(并非是限定，例如、遗传性非息肉性大肠癌)的疑似大肠组织或者细胞等。
本发明中用语“转录产物”包含从某些基因转录得到的mRNA前体、该mRNA前体的修饰物(通过加帽结构添加或者多聚腺苷酸化进行量修饰的产物等)、成熟mRNA、以及从成熟RNA逆转录的cDNA。作为转录产物，当指的是RNA的情况下，为了指定该转录产物而将各序列号等所示的碱基序列中的“T(胸腺嘧啶)”换成“U(尿嘧啶)”。本发明中“转录产物(变体)的表达量”指的是生物试样中的由该基因表达得到的转录产物的存在量。
生物试样中转录产物变体1以及变体3的表达量的测定可以使用本技术领域内公知的方法。对这样的表达量的测定没有限定，可以使用例如实时PCR法、半定量的RT-PCR法、使用毛细管电泳装置的竞争的PCR法、使用DNA芯片或者微阵列的基因表达量测定法、Northern印记法等测定从生物试样中制备得到的核酸试样(例如RNA、cDNA)中的各转录产物的存在量。从生物试样制备核酸试样可以按照常规方法进行，也可以在分析前进行纯化。本发明中实施的基因组DNA或RNA的制备可以按照J.Sambrook et al.(Eds.)，Molecular Cloning，3nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，(2001)等的分子生物学领域的标准的试验书进行。
变体1以及变体3的表达量的测定只要能区分开不同的转录产物，进行定量，可以使用任何方法。本发明中分别检测例如、变体1和变体3间具有很大差别的外显子1部分，进行定量的方法很方便。
作为一个例子。对使用实时PCR法的表达量测定进行详细的说明。实时PCR法是实时地监测PCR扩增产物的增加，进行解析的技术。通常使用热循环仪和分光荧光光度计一体化的实时PCR仪进行。实时PCR和以往的PCR法相比，不需要进行电泳，所以能够迅速并且简便地解析，而且对DNA和RNA的定量性优良。通过实时PCR法进行定量的原理如下所示。首先，将梯度稀释的已知量的DNA作为标准试样，一边进行PCR，一边进行PCR产物量的监测，读取针对各稀释样在指数级扩增区域达到的一定的扩增产物量的循环数(thre shold cycle；Ct值)，将其作为横轴坐标，然后将标准试样的初期模板量作为纵轴坐标，制作标准曲线。对于含有未知浓度的转录产物的待测核酸试样，一边进行和标准试样相同的条件下的PCR反应，一边进行监测，求出达到与上述相同的扩增产物量的循环数(Ct值)。待测核酸试样得到的Ct值与上述制作的标准曲线拟合，能够算出待测核酸试样中含有的初期模板量。这个初期模板量相当于转录产物的表达量。
对实时PCR中的PCR产物量的监测(检测)没有限定，优选能够使用荧光物质来进行。作为这种荧光监测法没有限定，可以使用例如：intercalater、TaqMan(注册商标)探针法等公知的技术。intercalater法是通过将与双链DNA结合的发出荧光的物质(intercalater法)SYBR(注册商标)Green I添加到实时PCR反应系中的方法。在该方法中，intercalater结合到PCR反应合成的双链DNA上，经过激发光的照射发出荧光，通过测定其荧光强度，能够监测PCR扩增产物的生成量。这种intercalater法，不需要制备用于任意的双链DNA检测的针对每个基因的检测用探针，试验成本低廉，反应体系构建也很容易，不过检测特异性不那么高。而另外一方面，TaqMan(注册商标)探针法是通常用将荧光物质(FAM等)标记了5′末端，消光物质(TAMRA等)标记(添加)了3′末端的寡核苷酸探针(TaqMan(注册商标)探针)添加到实时PCR反应系的方法。这种方法中，TaqMan(注册商标)探针在退火步骤与模板DNA特异性地杂交，此时，因为在探针上共存有荧光物质和消光物质，所以，即使激发光照射荧光物质，也能抑制荧光的发生。不过在后续的延伸步骤中，通过Taq DNA聚合酶具有的5′→3′核酸外切酶活性将与模板杂交的TaqMan(注册商标)探针依次分解，将荧光物质从探针上释放，解除了消光物质的抑制，发出荧光。通过测定该荧光强度能够监测PCR扩增产物的生成量。这种TaqMan(注册商标)探针法试验成本高，不过，检测特异性高，定量性也特别优良。
在本发明的方法中，为了测定各变体的表达量，可以适当选用基于上述的实时PCR法的定量法。这种情况下，对PCR扩增产物的监测没有限定，可以适当使用TaqMan(注册商标)探针法。在TaqMan(注册商标)探针法中，使用在多聚核苷酸的一端添加(一般在5′末端)荧光物质，另一端(一般在3′末端)添加消光物质的TaqMan(注册商标)探针。这种探针是设计用于在实时PCR中生成的PCR扩增产物退火的。作为添加到这种探针上的荧光物质可以使用FAM、VIC，作为消光物质可以使用TAMRA等。对于实时PCR的反应条件，本领域的技术人员可以适当加以设定，也可以参照后述的实施例中记载的反应条件。
在本发明的方法中，为了各变体的表达量的测定，分别使用用于变体1的特异性PCR扩增的下述引物对(a)、和用于变体3特异性PCR扩增的下述引物对(b)，能够扩增各变体。
(a)引物对：由至少含有序列号1所示的碱基序列上的、1～204位的外显子1部分的一部分(优选10个碱基以上长度、例如、10～30个碱基长度)的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合，以及
(b)引物对：由至少含有序列号2所示的碱基序列上的、1～91位的外显子1部分的一部分(例如、10～30个碱基长度)的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合。
这些引物对(a)以及(b)之中，优选的具体例如下所述。
引物对(a)：由序列号6所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合、
引物对(b)：由序列号8所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合。
使用由这些序列号6～8的序列构成的引物的组合，基于TaqMan(注册商标)探针法，通过实时RNA测定上述变体1以及3的表达量的情况下，作为TaqMan(注册商标)探针，特别优选由一端添加(一般在5′末端)了荧光物质、另一端添加(一般在3′末端)了消光物质的序列号9所示的碱基序列构成的探针。
使用这些引物以及探针进行变体的表达量测定，例如、通过含有下述步骤进行：
·使用序列号6所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物，由来自生物试样的cDNA进行变体1的扩增反应的步骤、
·使用序列号8所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物，由来自生物试样的cDNA进行变体3的扩增反应的步骤、
·监测各个扩增反应中PCR扩增产物量，由此计算出生物试样中的变体1和变体3的初期含有量的步骤。
并且，在该监测步骤中通过向各个扩增反应系中添加TaqMan(注册商标)探针，能够从得到的荧光强度测定出PCR扩增产物量。
在本发明的方法中，进行如上所述的变体1以及变体3的表达量的测定后，通过将其进行比较，能够检测显示微卫星不稳定性的细胞。具体而言，比较变体1和变体3，当与变体1的表达量的测定值相比，变体3的表达量的测定值高的情况下，表示所研究的生物试样中含有显示微卫星不稳定性细胞的可能性高。并且如果检测不到变体1，仅仅检测到变体3的情况下，由于变体3的表达量为多，也能判断含有显示微卫星不稳定性的细胞。这样，在本发明的方法中，能够针对来自受试者回收的生物试样进行显示微卫星不稳定性细胞的存在的检测。
微卫星不稳定性是基因组上的2～5个碱基的重复单位(微卫星)的重复数异常少的现象。高度的微卫星不稳定性在全部大肠癌中有12～16％、在遗传性非息肉性大肠癌中有90％以上。微卫星不稳定性实际上在子宫癌、胃癌、食道癌、多重癌、淋巴系统肿瘤、扁平上皮癌等各种癌中被观测到，与癌的相关性强。微卫星不稳定性是由于DNA修复机制的缺陷造成的，所以推测显示微卫星不稳定性的情况具有癌多发倾向性和预后不良。所以通过本发明的方法检测到显示微卫星不稳定性细胞的情况下，可以判断该细胞是癌细胞的可能性高。这样检测的显示微卫星不稳定性细胞可以是癌细胞，具体的而言，例如大肠癌、遗传性非息肉性大肠癌、子宫癌、胃癌、食道癌、多重癌、淋巴系统肿瘤、扁平上皮癌、子宫内膜癌、胰癌，优选大肠癌，特别是遗传性非息肉性大肠癌。这样以来本发明涉及测定生物试样中hMLH1基因的变体1和变体3的表达量，通过将其进行比较，进行癌细胞的检测的方法。
此外，本发明涉及在上述方法中优选使用的含有引物对(a)、(b)的引物组。即，该引物组是用于检测显示微卫星不稳定性的细胞的基因表达量分析用的、下述(a)以及(b)所示的各引物的组合。
(a)引物对：由至少含有序列号1所示的碱基序列上的、1～204位的外显子1部分的一部分(例如、10～30个碱基长度)的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合、以及
(b)引物对：由至少含有序列号2所示的碱基序列上的、1～91位的外显子1部分的一部分的(例如、10～30个碱基长度)的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合。
作为这些引物组的具体例子，可以列举：含有序列号6所示的碱基序列构成的引物、序列号7所示的碱基序列构成的引物、和序列号8所示的碱基序列构成的引物的组合。
这些引物可以使用本技术领域公知的寡核苷酸合成技术或者以序列号1或者2等上述hMLH1基因变体1以及3内的序列作为模板通过PCR法等容易地进行制备。并且本发明中的“引物”只要能用于PCR等中，可以标记适合检测用的标记就行。例如，本发明涉及的引物可以是在5′末端或者3′末端添加了荧光色素、酶、蛋白质、放射性同位体、化学发光物质、生物素等的标记的多聚核苷酸。在本发明中，通过向多聚核苷酸添加而用于检测用等的寡核苷酸(例如、用于突变检测的invader法中的与模板无关的序列“flap”等)也包含在“标记”中。
此外，本发明涉及含有上述引物对(a)以及(b)的、用于检测显示微卫星不稳定性的细胞的基因表达量分析用试剂盒。该试剂盒中还可以含有一端添加了荧光物质、另一端添加了消光物质的序列号9所示的碱基序列构成的探针的TaqMan(注册商标)探针。该试剂盒的检测对象优选是癌细胞，特别是可以用于显示微卫星不稳定性的癌细胞的检测用。所以，本试剂盒可以用作癌诊断用试剂盒。此外，本试剂盒可以用作大肠癌诊断用试剂盒、特别是遗传性非息肉性大肠癌诊断用试剂盒。
实施例
下面使用实施例对本发明进一步具体地加以说明。不过，本发明的技术的范围不局限于这些实施例中。
[实施例1]hMLH1基因的转录产物变体的探索
本发明人等为了研究hMLH1基因通过利用选择性剪切或者选择性启动子而作为多个转录产物变体(突变体)进行表达的可能性，进行了下述试验。
如非专利文献2所记载的基于使用寡核苷酸帽法构建的cDNA文库(Suzuki and Sugano(2003)Methods Mol.Biol.221：p.73-91)得到人基因完全长cDNA，阐明含有5′末端的人完全长cDNA的碱基序列信息有大约1800000种。这些序列信息登记于GenBank中，一般都是公开的。本发明人等从GenBank收集这些序列信息，进行multi-FASTA-format化。针对这样得到的序列数据，将hMLH1 mRNA的RefSeq序列(NCBI Reference Sequence)(GenBank登记号NM_000249；序列号13)作为query序列，用blastn程序进行同源性检索，将选中的序列中的E-value在10-10以下的序列作为hMLH1相关cDNA序列。然后提取GenBank的人基因组序列数据的Build35的3号染色体中与hMLH1基因相当的区域的碱基序列，将该hMLH1基因的基因组序列和上述那样选择出的每个hMLH1相关cDNA序列用BLAST程序的b12seq进行处理，得到分别比对的结果。从这样得到的hMLH1基因组序列与各hMLH1相关cDNA序列的比对中，选择出被认为能与上述的hMLH1RefSeq序列上的2位的外显子部分(NM_000249的第177～267位碱基序列)更靠前面的区域内也能很好地比对(alignment)的部分，并且比对部分中一致率达到98％以上的基因。解析选择的比对序列时，发现hMLH1相关cDNA序列和hMLH1基因组序列的对应关系有3种模式。即，判断在hMLH1基因的转录产物中存在至少3种变体(变体1～3)。这3种转录产物的5′末端侧的结构如图1所示。在图1中仅仅表示了各转录产物中所含的19个外显子区域中的最初的3个。
如图1所示，转录产物的变体1从5′末端侧开始依次连接着外显子1部分、外显子2部分、外显子3部分，在外显子1部分中含有翻译启始部位(ATG)。通过该解析可知作为hMLH1基因的RefSeq序列的NM000249碱基序列，在该变体1的外显子1部分的5′末端存在少量的缺失。与此相对，变体2具有和变体1几乎相同的外显子结构，不过外显子2部分和变体1的外显子2部分相比，在5′侧短了5个碱基，是选择性剪切变体。此外，在变体3中，外显子2部分以及外显子3部分与变体1相同，不过，外显子1部分是与变体1以及2不完全相同的序列。由此可知：hMLH1基因通过选择性启动子受到控制，变体3的结果是在比变体1靠近后面约325bp的转录启点开始转录，经过剪切后生成的。
在上述解析中表现出，在所选择的hMLH1相关cDNA序列中，变体1是141个(75％)、变体2是14个(7.4％)、变体3是33个(17.6％)，变体1是最主要的转录产物。分类为各变体的hMLH1相关cDNA序列表示在表1中。表1中，各hMLH1相关cDNA序列如GenBank登记号所示。
【表1】
  变体1   变体2   变体3
  AU131219AU127758DA619769DA024420DA953555DA023897DA486475DA932049DA426942DA555173DA479521DA524635DA447945DA952842DA350100DA915432DA790495DA050020DA729732DA972163DA563477DA707133AU128432DA555707DB092229DA555444DA880449DA033654DA305360DA013759   DA031179DA716680DA472218DA983131DA702671DA701340DB200826DA304561DA658037DA624450DA489729DA476333AU280370DA374168DA201970DA577087DA926525DA814813DB011897DA582565DA287218DA173423DA501808DA881017DB000482DA548685DA349545DB008432DA970996DA308229   DA050403DA125431DA043349DA695612DB272759DB090691DA556556DB274178DA659112DB270772DB269584DA559708DA913772DA619525DA478068DA503277DA937827DA650335DA554567DA690019DA738557DA262636DA819642DA356018DA919830DA751926DA207023DA659014DA599881DA503294   DA110166DB040429DA880601DA475144DA762271DA503831DA494857DB252001DB120181DA666173DA631956DA518707DA698928DB246315DA106361DA712069DA493353DA911958DA765712DA656699DA592612DB266774DA877866DB055056DA887994DA997466DA874359DA478450DB089707DA004869  DB243737DA909925DA453337DA055019DA209147DA914770DA472331DA609156DA752464DB014982DA958303DA952805DA7B3187DA884873DA794400DA287058DB040297DA348650DA086654DA660079DA510241共计141个克隆   DA385243DA868597DA815001DA070867DB139980DB287548DB157098DB012065DB114802DB018927DAB66298DA352218DA506267DB252510共计14个克隆   AU127122DA935122DB253300DB204422DA930241DA566031DA814707DA166268DA748219DA927898DA921733DA963961DA430514DA303777DA664790DA922309DA476068DA580525DB012054DA296090DB259565DA955738DA821467DA275297DA172498DA582466DA750838DA749519DA073874DA653050   DA517219DA343206DA156778共计33个克隆
本实施例中发现的变体1以及3的外显子1～2部分的碱基序列如表2所示。
【表2】
  变体1，外显子1(序列号3)   AAGAACGTGAGCACGAGGCACTGAGGTGATTGGCTGAAGGCACTTCCGTTGAGCATCTAGACGTTTCCTTGGCTCTTCTGGCGCCAAAATGTCGTTCGTGGCAGGGGTTATTCGGCGGCTGGACGAGACAGTGGTGAACCGCATCGCGGCGGGGGAAGTTATCCAGCGGCCAGCTAATGCTATCAAAGAGATGATTGAGAACTG
变体3，外显子1(序列号4)   GCATGCCCACAACGGCGGAGGCCGCCGGGTTCCCTGACGTGCCAGTCAGGCCTTCTCCTTTTCCGCAGACCGTGTGTTTCTTTACCGCTCTCCCCCGAGACCTTTTAAGGGTTGTTTGGAGT
变体1和3，外显子2(序列号5)   TTTAGATGCAAAATCCACAAGTATTCAAGTGATTGTTAAAGAGGGAGGCCTGAAGTTGATTCAGATCCAAGACAATGGCACCGGGATCAGG
变体1，外显子1+2(序列号1)   AAGAACGTGAGCACGAGGCACTGAGGTGATTGGCTGAAGGCACTTCCGTTGAGCATCTAGACGTTTCCTTGGCTCTTCTGGCGCCAAAATGTCGTTCGTGGCAGGGGTTATTCGGCGGCTGGACGAGACAGTGGTGAACCGCATCGCGGCGGGGGAAGTTATCCAGCGGCCAGCTAATGCTATCAAAGAGATGATTGAGAACTGTTTAGATGCAAAATCCACAAGTATTCAAGTGATTGTTAAAGAGGGAGGCCTGAAGTTGATTCAGATCCAAGACAATGGCACCGGGATCAGG
变体3，外显子1+2(序列号2)   GCATGCCCACAACGGCGGAGGCCGCCGGGTTCCCTGACGTGCCAGTCAGGCCTTCTCCTTTTCCGCAGACCGTGTGTTTCTTTACCGCTCTCCCCCGAGACCTTTTAAGGGTTGTTTGGAGTTTTAGATGCAAAATCCACAAGTATTCAAGTGATTGTTAAAGAGGGAGGCCTGAAGTTGATTCAGATCCAAGACAATGGCACCGGGATCAGG
[实施例2]
通过实施例1的解析可知作为hMLH1基因的转录产物存在3种的变体。虽然到目前为止已知hMLH1基因是细胞癌变相关的基因，不过这次为首次阐明存在转录产物变体，推测这些变体和癌之间具有相关性。
所以然后着眼于变体1以及3，通过实时PCR测定其细胞内表达量，将癌细胞和正常细胞进行比较。
作为待测材料，从ATCC(American Type Culture Collection)以及财团法人人类科学振兴财团研究资源银行购买的培养细胞株LoVo、COLO 320、COLO201、SW48、RKO、HCT116(全部是来自人大肠癌细胞)。将各细胞在添加了10％FBS(Invitrogen公司)的Advanced DMEM培养基(Invitrogen公司)中培养。从培养后的细胞中使用QIAGEN公司的RNeasy Tissue Kit提取总RNA。将提取的总RNA在后述的逆转录反应以及实时PCR中作为待测试样使用。
此外，设计在实时PCR中使用的引物以及探针。引物以及探针的设计可以使用实时PCR仪ABI PRISM 7900HT(Applied Biosystems公司)附带的Primer Express软件进行。从输入各种条件得到的引物以及探针的检索结果中选择出分值高的最前面的10组，用这些进行实际的实时PCR来进行评价的时候，因为都得到很好的结果，所以使用最高分值的引物以及探针的组合进行下述的试验。
在逆转录反应(cDNA合成反应)中使用SuperScriptTM III ReverseTranscriptase(Invitrogen公司)。首先向管中加入2.0μl的寡聚(dT)20引物(50μM)、2.0μg的总RNA、4.0μl的dNTPs(5mM)，加入DEPC处理水，使总量达到26μl。然后将该混合物在65℃下温育5分钟后，迅速移到冰上，加入5×First Strand Buffer(8.0μl)、0.1MDTT(2.0μl)、SuperScriptTM III Reverse Transcriptase(2.0μl)、DEPC处理水(2.0μl)，使总量达到40μl。将其用涡旋器混合后，进行离心，将溶液收集到管子的底部，在50℃温育60分钟。然后，通过在70℃温育15分钟终止反应。
然后，用上述得到的逆转录产物作为模板，使用ABI PRISM7900HT(Applied Biosystems社)，通过实时PCR，尝试对来自各细胞的逆转录产物中含有的变体1、变体3分别进行定量。
为了进行变体1的PCR扩增，混合作为模板DNA的逆转录产物1.0μl、1×master-混合物10μl、5.0μm正义引物(5′-CAGCGGCCAGCTAATGCTAT-3′；序列号6)3.5μl、5.0μM反义引物(5′-CCATTGTCTTGATCTGAATCAACTTC-3′；序列号7)3.5μl、5.0μMTaqMan(注册商标)探针(5′-CAAGTATTCAAGTGATTGTTAAAGAGGGAGGCC-3′；序列号9)5.0μl、超纯水1.0μl，制备总量为20μl的反应液。为了变体3的PCR扩增用，同样地，混合作为模板DNA的逆转录产物1.0μl、1×master-混合物10μl、5.0μM正义引物(5′-GGGTTGTTTGGAGTTTTAGATGCA-3′；序列号8)3.5μl、5.0μM反义引物(5′-CCATTGTCTTGGATCTGAATCAACTTC-3′；序列号7)3.5μl、5.0μM TaqMan(注册商标)探针(5′-CAAGTATTCAAGTGATTGTTAAAGAGGGAGGCC-3′；序列号9)5.0μl、超纯水1.0μl，制备总量为20μl的反应液。此处使用的TaqMan(注册商标)探针是能够在变体1以及3共同检测中使用的探针，是由AppliedBiosystems Japan株式会社制备的在5′末端标记FAM(荧光物质)、在3′末端标记TAMRA(消光物质)的形态的探针。制备的反应液供给ABIPRISM 7900HT(Applied Biosystems公司)，在95℃反应10分钟后，在95℃下15秒，以及在60℃下1分钟，进行40个循环的反应，然后测定荧光强度。
还有，为了制作可以从实时PCR中测定得到的荧光强度计算出试样中的DNA量的标准曲线，在进行实时PCR前，由来自COLO 320细胞株的上述逆转录产物如下所述那样预先制备PCR产物。首先，为了变体1的PCR扩增用，混合作为模板DNA的逆转录产物2.0μl、10×PCR缓冲液5.0μl、dNTP混合物(各2.5mM)4.0μl、5.0μM正义引物(5′-CTGGACGAGACAGTGGTGAAC-3′；序列号10)3.5μl、5.0μM反义引物(5′-ATACTGGCTAAATCCTCAAAGGACTG-3′；序列号11)3.5μl、Ex Taq聚合酶0.25μl、超纯水37μl，制备得到总量为50μl的反应液。为了变体3的PCR扩增用，除了变更正义引物为序列号12(5′-TTTCTTTACCGCTCTCCCCCG-3′)所示的序列之外，按照与上述变体1的PCR扩增用相同的组成制备反应液。制备的各反应液在95℃下反应10分钟后，在95℃下30秒、在63℃下1分钟、在72℃下1分钟，进行35个循环的反应，最后在72℃反应10分钟。对于这样得到的来自COLO320细胞株的PCR产物测定DNA量后，进行梯度稀释，将其作为模板DNA与在上述的实时PCR中其他的逆转录产物一样地进行扩增。并且，进行与上述相同的荧光强度的测定，根据得到的值，按照常规方法制作标准曲线。
根据由上述测定的荧光强度得到的Ct(Threshold Cycle)值、和上述制成的标准曲线，计算出从各细胞提取到的总RNA中含有的初期转录产物中的变体1以及3的量。该各变体量的测定值即相当于各自的表达量。
以上那样定量的6种大肠癌培养细胞中的变体1以及3的表达量结果如图2所示。如图2所示，对于变体1，在LoVo、HCT116、COLO320、以及COLO201细胞中检测到了表达，在RKO以及SW48细胞中未检测到表达(检测限以下)。这些结果和目前的报道(非专利文献5)是一致的。另一方面，本发明人等首次阐明的变体3的表达模式和变体1的表达模式是明显不同的，在目前的报道未检测到hMLH1的变体1的表达的RKO细胞和SW48细胞中检测到了变体3的表达。此外，变体3在LoVo细胞以及HCT116细胞中，与变体1相比，表达量显著多。该结果与在实施例1的解析中变体1是hMLH1基因的主要转录产物，变体3的表达量少的预测相反。这样，变体3比变体1多表达的LoVo以及HCT116细胞、以及检测到变体3但是检测不到变体1的RKO细胞以及SW48细胞在使用文献信息进行分析时，发现微卫星不稳定性(MSI)呈现阳性(图2、非专利文献5)。此外，根据非专利文献5的记载研究左右hMLH1基因的表达量、同基因的启动子区域的甲基化程度的时候，只有检测到变体3但未检测到变体1的RKO细胞以及SW48细胞在hMLH1基因的启动子区域中检测到了甲基化。即可以认为hMLH1基因的启动子区域中的甲基化抑制变体1的表达，不抑制变体3的表达。
如果考虑到已知hMLH1基因与遗传性非息肉性大肠癌(HNPCC)相关，已知在包括HNPCC在内的各种癌中高频率地出现微卫星不稳定性阳性，可以认为相对于hMLH1基因的转录产物变体1，变体3的表达量的相对增加，和癌中MSI阳性以及启动子区域的甲基化有关。
对于变体3的表达条件和其表达所影响的癌症发病的具体作用并不清楚。认为与其说是转录产物变体3自体的MSI，进一步对癌发病带来恶劣影响，不如说变体1的表达量的低下或者丧失可能是造成诱发MSI的重要原因。不过，不论如何对这些机制进行推测，可以明确与转录产物变体1相比较，变体3的量的表现相对增加的情况表示存在伴随MSI的癌细胞。
产业上的可利用性
本发明的检测方法能够在很早期的癌检测样本等中，简便并且清楚地检测到大肠癌等的癌细胞的存在。本方法得到的检测结果在以HNPCC代表的伴随微卫星不稳定性的癌症的早期诊断中可以作为有用的判断材料。
序列表
<110>日立公司
<120>微卫星不稳定性细胞的检测方法以及试剂盒
<130>H600399
<160>14
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>295
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<223>发明人：高桥亮介；永井启-
<400>1
aagaacgtga gcacgaggca ctgaggtgat tggctgaagg cacttccgtt gagcatctag 60
acgtttcctt ggctcttctg gcgccaaaat gtcgttcgtg gcaggggtta ttcggcggct 120
ggacgagaca gtggtgaacc gcatcgcggc gggggaagtt atccagcggc cagctaatgc 180
tatcaaagag atgattgaga actgtttaga tgcaaaatcc acaagtattc aagtgattgt 240
taaagaggga ggcctgaagt tgattcagat ccaagacaat ggcaccggga tcagg      295
<210>2
<211>213
<212>DNA
<213>智人
<400>2
gcatgcccac aacggcggag gccgccgggt tccctgacgt gccagtcagg ccttctcctt 60
ttccgcagac cgtgtgtttc tttaccgctc tcccccgaga ccttttaagg gttgtttgga 120
gttttagatg caaaatccac aagtattcaa gtgattgtta aagagggagg cctgaagttg 180
attcagatcc aagacaatgg caccgggatc agg                              213
<210>3
<211>204
<212>DNA
<213>智人
<400>3
aagaacgtga gcacgaggca ctgaggtgat tggctgaagg cacttccgtt gagcatctag 60
acgtttcctt ggctcttctg gcgccaaaat gtcgttcgtg gcaggggtta ttcggcggct 120
ggacgagaca gtggtgaacc gcatcgcggc gggggaagtt atccagcggc cagctaatgc 180
tatcaaagag atgattgaga actg                                        204
<210>4
<211>122
<212>DNA
<213>智人
<400>4
gcatgcccac aacggcggag gccgccgggt tccctgacgt gccagtcagg ccttctcctt 60
ttccgcagac cgtgtgtttc tttaccgctc tcccccgaga ccttttaagg gttgtttgga 120
gt                                                                122
<210>5
<211>91
<212>DNA
<213>智人
<400>5
tttagatgca aaatccacaa gtattcaagt gattgttaaa gagggaggcc tgaagttgat 60
tcagatccaa gacaatggca ccgggatcag g                                91
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>6
cagcggccag ctaatgctat                                             20
<210>7
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>7
ccattgtctt gatctgaatc aacttc                                    26
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>8
gggttgtttg gagttttaga tgca                                      24
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：探针
<400>9
caagtat tca agtgattgtt aaagagggag gcc                           33
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>10
ctggacgaga cagtggtgaa c                                         21
<210>11
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>11
atactggcta aatcctcaaa ggactg                                26
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<400>12
tttct ttacc gctctccccc g                                    21
<210>13
<211>2524
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(61)..(2331)
<400>13
attggctgaa ggcacttccg ttgagcatct agacgtttcc ttggctcttc tggcgccaaa 60
atg tcg ttc gtg gca ggg gtt att cgg cgg ctg gac gag aca gtg gtg  108
Met Ser Phe Val Ala Gly Val Ile Arg Arg Leu Asp Glu Thr Val Val
  1               5                  10                  15
aac cgc atc gcg gcg ggg gaa gtt atc cag cgg cca gct aat gct atc  156
Asn Arg Ile Ala Ala Gly Glu Val Ile Gln Arg Pro Ala Asn Ala Ile
             20                   25                 30
aaa gag atg att gag aac tgt tta gat gca aaa tcc aca agt att caa    204
Lys Glu Met Ile Glu Asn Cys Leu Asp Ala Lys Ser Thr Ser Ile Gln
         35                  40                  45
gtg att gtt aaa gag gga ggc ctg aag ttg att cag atc caa gac aat    252
Val Ile Val Lys Glu Gly Gly Leu Lys Leu Ile Gln Ile Gln Asp Asn
     50                  55                  60
ggc acc ggg atc agg aaa gaa gat ctg gat att gta tgt gaa agg ttc    300
Gly Thr Gly Ile Arg Lys Glu Asp Leu Asp Ile Val Cys Glu Arg Phe
 65                  70                  75                  80
act act agt aaa ctg cag tcc ttt gag gat tta gcc agt att tct acc    348
Thr Thr Ser Lys Leu Gln Ser Phe Glu Asp Leu Ala Ser Ile Ser Thr
                 85                  90                  95
tat ggc ttt cga ggt gag gct ttg gcc agc ata agc cat gtg gct cat    396
Tyr Gly Phe Arg Gly Glu Ala Leu Ala Ser Ile Ser His Val Ala His
            100                 105                 110
gtt act att aca acg aaa aca gct gat gga aag tgt gca tac aga gca    444
Val Thr Ile Thr Thr Lys Thr Ala Asp Gly Lys Cys Ala Tyr Arg Ala
        115                 120                 125
agt tac tca gat gga aaa ctg aaa gcc cct cct aaa cca tgt gct ggc    492
Ser Tyr Ser Asp Gly Lys Leu Lys Ala Pro Pro Lys Pro Cys Ala Gly
    130                 135                 140
aat caa ggg acc cag atc acg gtg gag gac ctt ttt tac aac ata gcc    540
Asn Gln Gly Thr Gln Ile Thr Val Glu Asp Leu Phe Tyr Asn Ile Ala
145                 150                 155                 160
acg agg aga aaa gct tta aaa aat cca agt gaa gaa tat ggg aaa att    588
Thr Arg Arg Lys Ala Leu Lys Asn Pro Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Ile
                165                 170                 175
ttg gaa gtt gtt ggc agg tat tca gta cac aat gca ggc att agt ttc    636
Leu Glu Val Val Gly Arg Tyr Ser Val His Asn Ala Gly Ile Ser Phe
            180                 185                 190
tca gtt aaa aaa caa gga gag aca gta gct gat gtt agg aca cta ccc    684
Ser Val Lys Lys Gln Gly Glu Thr Val Ala Asp Val Arg Thr Leu Pro
        195                 200                 205
aat gcc tca acc gtg gac aat att cgc tcc atc ttt gga aat gct gtt    732
Asn Ala Ser Thr Val Asp Asn Ile Arg Ser Ile Phe Gly Asn Ala Val
    210                 215                 220
agt cga gaa ctg ata gaa att gga tgt gag gat aaa acc cta gcc ttc    780
Ser Arg Glu Leu Ile Glu Ile Gly Cys Glu Asp Lys Thr Leu Ala Phe
225                 230                 235                 240
aaa atg aat ggt tac ata tcc aat gca aac tac tca gtg aag aag tgc    828
Lys Met Asn Gly Tyr Ile Ser Asn Ala Asn Tyr Ser Val Lys Lys Cys
                245                 250                 255
atc ttc tta ctc ttc atc aac cat cgt ctg gta gaa tca act tcc ttg    876
Ile Phe Leu Leu Phe Ile Asn His Arg Leu Val Glu Ser Thr Ser Leu
            260                 265                 270
aga aaa gcc ata gaa aca gtg tat gca gcc tat ttg ccc aaa aac aca    924
Arg Lys Ala Ile Glu Thr Val Tyr Ala Ala Tyr Leu Pro Lys Asn Thr
        275                 280                 285
cac cca ttc ctg tac ctc agt tta gaa atc agt ccc cag aat gtg gat    972
His Pro Phe Leu Tyr Leu Ser Leu Glu Ile Ser Pro Gln Asn Val Asp
    290                 295                 300
gtt aat gtg cac ccc aca aag cat gaa gtt cac ttc ctg cac gag gag    1020
Val Asn Val His Pro Thr Lys His Glu Val His Phe Leu His Glu Glu
305                 310                 315                 320
agc atc ctg gag cgg gtg cag cag cac atc gag agc aag ctc ctg ggc    1068
Ser Ile Leu Glu Arg Val Gln Gln His Ile Glu Ser Lys Leu Leu Gly
                325                 330                 335
tcc aat tcc tcc agg atg tac ttc acc cag act ttg cta cca gga ctt    1116
Ser Asn Ser Ser Arg Met Tyr Phe Thr Gln Thr Leu Leu Pro Gly Leu
            340                 345                 350
gct ggc ccc tct ggg gag atg gtt aaa tcc aca aca agt ctg acc tcg    1164
Ala Gly Pro Ser Gly Glu Met Val Lys Ser Thr Thr Ser Leu Thr Ser
        355                 360                 365
tct tct act tct gga agt agt gat aag gtc tat gcc cac cag atg gtt    1212
Ser Ser Thr Ser Gly Ser Ser Asp Lys Val Tyr Ala His Gln Met Val
    370                 375                 380
cgt aca gat tcc cgg gaa cag aag ctt gat gca ttt ctg cag cct ctg    1260
Arg Thr Asp Ser Arg Glu Gln Lys Leu Asp Ala Phe Leu Gln Pro Leu
385                 390                 395                 400
agc aaa ccc ctg tcc agt cag ccc cag gcc att gtc aca gag gat aag    1308
Ser Lys Pro Leu Ser Ser Gln Pro Gln Ala Ile Val Thr Glu Asp Lys
                405                 410                 415
aca gat att tct agt ggc agg gct agg cag caa gat gag gag atg ctt    1356
Thr Asp Ile Ser Ser Gly Arg Ala Arg Gln Gln Asp Glu Glu Met Leu
            420                 425                 430
gaa ctc cca gcc cct gct gaa gtg gct gcc aaa aat cag agc ttg gag    1404
Glu Leu Pro Ala Pro Ala Glu Val Ala Ala Lys Asn Gln Ser Leu Glu
        435                 440                 445
ggg gat aca aca aag ggg act tca gaa atg tca gag aag aga gga cct    1452
Gly Asp Thr Thr Lys Gly Thr Ser Glu Met Ser Glu Lys Arg Gly Pro
    450                 455                 460
act tcc agc aac ccc aga aag aga cat cgg gaa gat tct gat gtg gaa    1500
Thr Ser Ser Asn Pro Arg Lys Arg His Arg Glu Asp Ser Asp Val Glu
465                 470                 475                 480
atg gtg gaa gat gat tcc cga aag gaa atg act gca gct tgt acc ccc    1548
Met Val Glu Asp Asp Ser Arg Lys Glu Met Thr Ala Ala Cys Thr Pro
                485                 490                 495
cgg aga agg atc att aac ctc act agt gtt ttg agt ctc cag gaa gaa    1596
Arg Arg Arg Ile Ile Asn Leu Thr Ser Val Leu Ser Leu Gln Glu Glu
            500                 505                 510
att aat gag cag gga cat gag gtt ctc cgg gag atg ttg cat aac cac    1644
Ile Asn Glu Gln Gly His Glu Val Leu Arg Glu Met Leu His Asn His
        515                 520                 525
tcc ttc gtg ggc tgt gtg aat cct cag tgg gcc ttg gca cag cat caa    1692
Ser Phe Val Gly Cys Val Asn Pro Gln Trp Ala Leu Ala Gln His Gln
    530                 535                 540
acc aag tta tac ctt ctc aac acc acc aag ctt agt gaa gaa ctg ttc    1740
Thr Lys Leu Tyr Leu Leu Asn Thr Thr Lys Leu Ser Glu Glu Leu Phe
545                 550                 555                 560
tac cag ata ctc att tat gat ttt gcc aat ttt ggt gtt ctc agg tta    1788
Tyr Gln Ile Leu Ile Tyr Asp Phe Ala Asn Phe Gly Val Leu Arg Leu
                565                 570                 575
tcg gag cca gca ccg ctc ttt gac ctt gcc atg ctt gcc tta gat agt    1836
Ser Glu Pro Ala Pro Leu Phe Asp Leu Ala Met Leu Ala Leu Asp Ser
            580                 585                 590
cca gag agt ggc tgg aca gag gaa gat ggt ccc aaa gaa gga ctt gct    1884
Pro Glu Ser Gly Trp Thr Glu Glu Asp Gly Pro Lys Glu Gly Leu Ala
        595                 600                 605
gaa tac att gtt gag ttt ctg aag aag aag gct gag atg ctt gca gac    1932
Glu Tyr Ile Val Glu Phe Leu Lys Lys Lys Ala Glu Met Leu Ala Asp
    610                 615                 620
tat ttc tct ttg gaa att gat gag gaa ggg aac ctg att gga tta ccc    1980
Tyr Phe Ser Leu Glu Ile Asp Glu Glu Gly Asn Leu Ile Gly Leu Pro
625                 630                 635                 640
ctt ctg att gac aac tat gtg ccc cct ttg gag gga ctg cct atc ttc    2028
Leu Leu Ile Asp Asn Tyr Val Pro Pro Leu Glu Gly Leu Pro Ile Phe
                645                 650                 655
att ctt cga cta gcc act gag gtg aat tgg gac gaa gaa aag gaa tgt    2076
Ile Leu Arg Leu Ala Thr Glu Val Asn Trp Asp Glu Glu Lys Glu Cys
            660                 665                 670
ttt gaa agc ctc agt aaa gaa tgc gct atg ttc tat tcc atc cgg aag    2124
Phe Glu Ser Leu Ser Lys Glu Cys Ala Met Phe Tyr Ser Ile Arg Lys
        675                 680                 685
cag tac ata tct gag gag tcg acc ctc tca ggc cag cag agt gaa gtg    2172
Gln Tyr Ile Ser Glu Glu Ser Thr Leu Ser Gly Gln Gln Ser Glu Val
    690                 695                 700
cct ggc tcc att cca aac tcc tgg aag tgg act gtg gaa cac att gtc    2220
Pro Gly Ser Ile Pro Asn Ser Trp Lys Trp Thr Val Glu His Ile Val
705                 710                  715                720
tat aaa gcc ttg cgc tca cac att ctg cct cct aaa cat ttc aca gaa    2268
Tyr Lys Ala Leu Arg Ser His Ile Leu Pro Pro Lys His Phe Thr Glu
                725                 730                 735
gat gga aat atc ctg cag ctt gct aac ctg cct gat cta tac aaa gtc   2316
Asp Gly Asn Ile Leu Gln Leu Ala Asn Leu Pro Asp Leu Tyr Lys Val
             740                745                 750
ttt gag agg tgt taa atatggttat ttatgcactg tgggatgtgt tcttctttct   2371
Phe Glu Arg Cys
        755
ctgtattccg atacaaagtg ttgtatcaaa gtgtgatata caaagtgtac caacataagt 2431
gttggtagca cttaagactt atacttgcct tctgatagta ttcctttata cacagtggat 2491
tgattataaa taaatagatg tgtcttaaca taa                              2524
<210>14
<211>756
<212>PRT
<213>智人
<400>14
Met Ser Phe Val Ala Gly Val Ile Arg Arg Leu Asp Glu Thr Val Val
  1               5                  10                  15
Asn Arg Ile Ala Ala Gly Glu Val Ile Gln Arg Pro Ala Asn Ala Ile
             20                  25                  30
Lys Glu Met Ile Glu Asn Cys Leu Asp Ala Lys Ser Thr Ser Ile Gln
         35                  40                  45
Val Ile Val Lys Glu Gly Gly Leu Lys Leu Ile Gln Ile Gln Asp Asn
     50                  55                  60
Gly Thr Gly Ile Arg Lys Glu Asp Leu Asp Ile Val Cys Glu Arg Phe
 65                  70                  75                  80
Thr Thr Ser Lys Leu Gln Ser Phe Glu Asp Leu Ala Ser Ile Ser Thr
                 85                  90                  95
Tyr Gly Phe Arg Gly Glu Ala Leu Ala Ser Ile Ser His Val Ala His
            100                 105                 110
Val Thr Ile Thr Thr Lys Thr Ala Asp Gly Lys Cys Ala Tyr Arg Ala
        115                 120                 125
Ser Tyr Ser Asp Gly Lys Leu Lys Ala Pro Pro Lys Pro Cys Ala Gly
    130                 135                 140
Asn Gln Gly Thr Gln Ile Thr Val Glu Asp Leu Phe Tyr Asn Ile Ala
145                 150                 155                 160
Thr Arg Arg Lys Ala Leu Lys Asn Pro Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Ile
                165                 170                 175
Leu Glu Val Val Gly Arg Tyr Ser Val His Asn Ala Gly Ile Ser Phe
            180                 185                 190
Ser Val Lys Lys Gln Gly Glu Thr Val Ala Asp Val Arg Thr Leu Pro
        195                 200                 205
Asn Ala Ser Thr Val Asp Asn Ile Arg Ser Ile Phe Gly Asn Ala Val
    210                 215                 220
Ser Arg Glu Leu Ile Glu Ile Gly Cys Glu Asp Lys Thr Leu Ala Phe
225                 230                 235                 240
Lys Met Asn Gly Tyr Ile Ser Asn Ala Asn Tyr Ser Val Lys Lys Cys
                245                 250                 255
Ile Phe Leu Leu Phe Ile Asn His Arg Leu Val Glu Ser Thr Ser Leu
            260                 265                 270
Arg Lys Ala Ile Glu Thr Val Tyr Ala Ala Tyr Leu Pro Lys Asn Thr
        275                 280                 285
His Pro Phe Leu Tyr Leu Ser Leu Glu Ile Ser Pro Gln Asn Val Asp
    290                 295                 300
Val Asn Val His Pro Thr Lys His Glu Val His Phe Leu His Glu Glu
305                 310                 315                 320
Ser Ile Leu Glu Arg Val Gln Gln His Ile Glu Ser Lys Leu Leu Gly
                325                 330                 335
Ser Asn Ser Ser Arg Met Tyr Phe Thr Gln Thr Leu Leu Pro Gly Leu
            340                 345                 350
Ala Gly Pro Ser Gly Glu Met Val Lys Ser Thr Thr Ser Leu Thr Ser
        355                 360                 365
Ser Ser Thr Ser Gly Ser Ser Asp Lys Val Tyr Ala His Gln Met Val
    370                 375                 380
Arg Thr Asp Ser Arg Glu Gln Lys Leu Asp Ala Phe Leu Gln Pro Leu
385                 390                 395                 400
Ser Lys Pro Leu Ser Ser Gln Pro Gln Ala Ile Val Thr Glu Asp Lys
                405                 410                 415
Thr Asp Ile Ser Ser Gly Arg Ala Arg Gln Gln Asp Glu Glu Met Leu
            420                 425                 430
Glu Leu Pro Ala Pro Ala Glu Val Ala Ala Lys Asn Gln Ser Leu Glu
        435                 440                 445
Gly Asp Thr Thr Lys Gly Thr Ser Glu Met Ser Glu Lys Arg Gly Pro
    450                 455                 460
Thr Ser Ser Asn Pro Arg Lys Arg His Arg Glu Asp Ser Asp Val Glu
465                 470                 475                 480
Met Val Glu Asp Asp Ser Arg Lys Glu Met Thr Ala Ala Cys Thr Pro
                485                 490                 495
Arg Arg Arg Ile Ile Asn Leu Thr Ser Val Leu Ser Leu Gln Glu Glu
            500                 505                 510
Ile Asn Glu Gln Gly His Glu Val Leu Arg Glu Met Leu His Asn His
        515                 520                 525
Ser Phe Val Gly Cys Val Asn Pro Gln Trp Ala Leu Ala Gln His Gln
    530                 535                 540
Thr Lys Leu Tyr Leu Leu Asn Thr Thr Lys Leu Ser Glu Glu Leu Phe
545                 550                 555                 560
Tyr Gln Ile Leu Ile Tyr Asp Phe Ala Asn Phe Gly Val Leu Arg Leu
                565                 570                 575
Ser Glu Pro Ala Pro Leu Phe Asp Leu Ala Met Leu Ala Leu Asp Ser
            580                 585                 590
Pro Glu Ser Gly Trp Thr Glu Glu Asp Gly Pro Lys Glu Gly Leu Ala
        595                 600                 605
Glu Tyr Ile Val Glu Phe Leu Lys Lys Lys Ala Glu Met Leu Ala Asp
    610                 615                 620
Tyr Phe Ser Leu Glu Ile Asp Glu Glu Gly Asn Leu Ile Gly Leu Pro
625                  630                635                 640
Leu Leu Ile Asp Asn Tyr Val Pro Pro Leu Glu Gly Leu Pro Ile Phe
                645                 650                 655
Ile Leu Arg Leu Ala Thr Glu Val Asn Trp Asp Glu Glu Lys Glu Cys
            660                 665                 670
Phe Glu Ser Leu Ser Lys Glu Cys Ala Met Phe Tyr Ser Ile Arg Lys
        675                 680                 685
Gln Tyr Ile Ser Glu Glu Ser Thr Leu Ser Gly Gln Gln Ser Glu Val
    690                 695                 700
Pro Gly Ser Ile Pro Asn Ser Trp Lys Trp Thr Val Glu His Ile Val
705                 710                 715                 720
Tyr Lys Ala Leu Arg Ser His Ile Leu Pro Pro Lys His Phe Thr Glu
                725                 730                 735
Asp Gly Asn Ile Leu Gln Leu Ala Asn Leu Pro Asp Leu Tyr Lys Val
            740                 745                 750
Phe Glu Arg Cys
        755

Claims (17)

1.基因表达分析方法，其特征在于，测定生物试样中的在5′末端含有序列号1所示的碱基序列的人MLH1基因的转录产物、以及在5′末端含有序列号2所示的碱基序列的人MLH1基因的转录产物的表达量，通过将其进行比较，检测显示微卫星不稳定性的细胞。
2.权利要求1记载的方法，其使用实时PCR法测定转录产物的表达量。
3.权利要求2记载的方法，其通过使用TaqMan(注册商标)探针法进行使用实时PCR法的测定.
4.权利要求1～3的任一项记载的方法，其中，使用下述的(a)以及(b)的引物对进行测定：
(a)引物对：其是由至少含有序列号1所示的碱基序列上的1～204位的外显子1部分的一部分的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合，以及
(b)引物对：其是由至少含有序列号2所示的碱基序列上的1～91位的外显子1部分的一部分的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合。
5.权利要求4记载的方法，其中，引物对(a)是由序列号6所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合，
引物对(b)是由序列号8所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合。
6.权利要求5记载的方法，其中，在TaqMan(注册商标)探针法中，使用一端添加了荧光物质、另一端添加了消光物质的序列号9所示的碱基序列构成的探针。
7.权利要求1～6的任一项记载的方法，其中，显示微卫星不稳定性的细胞是癌细胞。
8.权利要求7记载的方法，其中，癌是大肠癌。
9.权利要求8记载的方法，其中，大肠癌是遗传性非息肉性大肠癌。
10.基因表达量分析用引物组，其用于检测显示微卫星不稳定性的细胞，其中含有下述的(a)以及(b)的引物对：
(a)引物对：其是由至少含有序列号1所示的碱基序列上的1～204位的外显子1部分的一部分的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合，以及
(b)引物对：其是由至少含有序列号2所示的碱基序列上的1～91位的外显子1部分的一部分的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合。
11.基因表达量分析用试剂盒，其用于检测显示微卫星不稳定性的细胞，其中含有下述的(a)以及(b)的引物对：
(a)引物对：其是由至少含有序列号1所示的碱基序列上的1～204位的外显子1部分的一部分的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合，以及
(b)引物对：其是由至少含有序列号2所示的碱基序列上的1～91位的外显子1部分的一部分的连续15～50个碱基的碱基序列构成的引物、和与序列号5所示的外显子2部分的碱基序列上的连续15～50个碱基的序列互补的碱基序列构成的引物的组合。
12.权利要求11记载的试剂盒，其中，引物对(a)是由序列号6所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合；引物对(b)是由序列号8所示的碱基序列构成的引物、和序列号7所示的碱基序列构成的引物的组合。
13.权利要求12记载的试剂盒，其中，还含有一端添加了荧光物质，另一端添加了消光物质的序列号9所示的碱基序列构成的探针。
14.权利要求11～13的任一项记载的试剂盒，其中，上述细胞是癌细胞。
15.权利要求14记载的试剂盒，其是癌诊断用试剂盒。
16.权利要求15记载的试剂盒，其是大肠癌诊断用试剂盒。
17.权利要求16记载的试剂盒，其是遗传性非息肉性大肠癌诊断用试剂盒。
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