KR20060027893A

KR20060027893A - 대장암 특이적 발현감소 유전자의 메틸화된 프로모터 및그 용도

Info

Publication number: KR20060027893A
Application number: KR1020040076765A
Authority: KR
Inventors: 안성환; 윤치왕; 오태정; 윤대경; 이선우; 김명순; 우숙경
Original assignee: (주)지노믹트리
Priority date: 2004-09-24
Filing date: 2004-09-24
Publication date: 2006-03-29
Also published as: KR100617649B1; US20060068402A1

Abstract

본 발명은 대장암 특이적 유전자의 메틸화된 프로모터 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 대장암 특이적 발현감소 유전자의 메틸화된 프로모터, 상기 메틸화된 프로모터가 고정되어 있는 암 진단용 마이크로어레이 및 상기 메틸화된 프로모터를 함유하는 대장암 진단키트에 관한 것이다.

본 발명에 의해 기능이 확인된 대장암 특이적 발현 감소 유전자의 메틸화된 프로모터는 암의 조기진단 뿐 아니라, 그 유전자의 발현조절을 통하여 조기에 치료가 가능한 신약을 스크리닝하는 타겟으로도 유용하다.

메틸화, 대장암, 발현감소 유전자, 프로모터, 마이크로어레이, 암 진단

Description

대장암 특이적 발현감소 유전자의 메틸화된 프로모터 및 그 용도 {Methylated Promoters of Colon Cancer Specific Expression-decreased Genes and Use Thereof}

도 1은 10종의 대장암 임상샘플과 10종의 정상 대장 샘플에서의 유전자 발현 변화를 human 17K cDNA 마이크로어레이를 이용하여 직접 비교 실험과 간접 비교 실험을 수행한 결과 및 8개 유전자 후보군의 발현패턴을 도시한 것이다.

도 2는 본 발명에서 선별된 8종의 유전자 발현이 프로모터 메틸화에 의해 조절되는지 여부를 확인하기 위하여, 대장암 세포주인 HCT116를 DAC 또는 DAC+TSA로 처리한 다음, 유전자 발현변화를 측정한 cDNA 마이크로어레이 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명에서 클로닝된 8종 유전자의 프로모터를 대상으로, 프로모터 메틸화 여부를 측정할 수 있는 방법인 HpaII/MspI 효소절단분석(enzyme digestion assay)을 수행한 결과를 도시한 것이다.

도 4는 본 발명에서 선별된 8개 유전자의 메틸화 프로모터가 고정된 마이크로어레이를 이용하여, 2개의 대장암 세포주(HCT116, Caco2)를 대상으로 프로모터 메틸화 프로파일을 작성한 것이다.

도 5는 3개 유전자(SEPP1, NR4A2 및 A2M)의 프로모터 메틸화를 확인하기 위하여 대장암 세포주 HCT116, Caco2를 대상으로 바이설파이트 시퀀싱을 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 본 발명에서 선별된 8개 유전자의 메틸화 프로모터가 고정된 마이크로어레이를 이용하여, 17명의 대장암 환자로부터 얻어진 암 조직과 3명의 정상인으로부터 얻어진 림프구(lymphocyte)를 대상으로 메틸화 프로파일을 작성한 것이다.

발명의 분야

배경기술

의학이 발달한 오늘날에도 인체 암, 특히 대다수를 차지하는 고형암(solid tumor: 혈액암을 제외한 나머지 암)의 경우 5년 생존율은 50%미만이다. 전체 암환 자의 약 3분의 2는 진행된 단계에서 발견되며, 이들 대부분은 진단 후 2년 이내에 사망한다. 이와 같이 저조한 암의 치료효과는 치료법의 문제 뿐만은 아니며, 실제 암을 조기에 진단할 수 있는 방법과 진행된 암을 정확히 진단하고 치료 후 추적 조사하는 것이 용이하지 않기 때문이다.

현재 임상에서 암의 진단은 문진(history taking)과 신체검사, 임상병리검사를 거쳐 일단 의심이 되면 방사선검사 및 내시경검사로 진행되며, 최종적으로는 조직검사로 확인된다. 그러나 현존 임상검사법으로는 암의 세포수가 10억개, 암의 직경이 1cm 이상이 되어야 진단이 가능하다. 이런 경우 이미 암세포는 전이능력을 갖고 있으며, 실제 절반이상에서 암이 이미 전이되어 있다. 한편, 암이 직간접으로 생산하는 물질을 혈액내에서 찾는 종양마커(tumor markers)가 암 선별검사(cancer screening)에 이용되는데, 이는 정확도에 한계가 있어서 암이 있을 때도 약 절반까지 정상으로 나타나며, 암이 없을 때도 종종 양성으로 나타나서 혼란을 야기한다. 또한, 암의 치료에 주로 사용되는 항암제의 경우, 암의 용적이 적은 경우에만 그 효과를 나타내는 문제점이 있다.

상기한 바와 같이, 암의 진단과 치료가 모두 어려운 것은 정상세포와 다른 점이 많고, 매우 복잡하고 다양하기 때문이다. 암은 제 멋대로 과잉으로 계속 자라며, 사망에서 해방되어 계속 생존하고, 주위조직을 침범하고 원위 장기로 확산(전이)되어서 인간을 사망하게 한다. 면역기전의 공격이나 항암 치료에도 생존하고, 끊임없이 진화하며 생존에 가장 유리한 세포군(클론)이 선택적으로 증식한다. 암세포는 다수의 유전자의 변이에 의해 발생하는 고도의 생존능력을 가진 생존체이다. 하나의 세포가 암세포로 바뀌고, 임상에서 보는 악성의 암 덩어리로 발전해 나가기 위해서는 다수의 유전자에 변이가 일어나야 한다. 따라서 암을 근원적으로 진단하고 치료하기 위해서는 유전자 수준에서 접근할 필요가 있다.

최근, 암의 진단에 유전자검사가 적극적으로 시도되고 있다. 가장 단순한 대표적 방법은 혈액에서 백혈병의 유전자 지표인 ABL:BCR 융합 유전자의 유무를 PCR로 찾는 것이다. 이는 정확도가 95%이상이며, 단순 용이한 검사로 만성골수성 백혈병의 진단과 치료 후 결과 평가, 추적조사 등에 유용하게 사용되고 있다. 그러나, 이 방법은 소수 혈액암의 경우에만 적용이 가능하다.

또한, 암세포가 발현하는 유전자의 존재를 RT-PCR 및 블라팅으로 파악함으로써 혈구세포 중에 함께 존재하는 암세포를 진단하는 방법도 시도되고 있다. 그러나 이 방법은 전립선암과 흑색종 등 일부 암에서만 적용이 가능하며, 가양성(false positive rate)이 많고, 검사 및 판독 방법의 표준화가 어렵고, 그 유용성에도 한계가 있다 (Kopreski, M.S. et al., Clin. Cancer Res., 5:1961, 1999; Miyashiro, I. et al., Clin. Chem., 47:505, 2001).

혈청(serum)이나 혈장(plasma)내 DNA를 사용하는 유전자검사가 최근 활발히 시도되고 있다. 이는 암세포에서 분리되어 혈액으로 나와서 혈청 내에 유리형(free DNA)으로 존재하는 암 관련 유전자를 찾는 방법이다. 실제 암환자에서는 혈청 내 DNA 농도가 정상인의 5-10배로 증가되며, 이렇게 증가된 DNA는 대부분이 암세포에서 유리되는 것으로 밝혀지고 있다. 이들 암에서 유리된 DNA를 가지고 암 유전자(oncogene)와 종양억제 유전자의 돌연변이나 소실, 기능상실 등, 암에 특이한 유전자 이상을 분석하면 암을 진단할 수 있다. 실제 혈청에서 돌연변이형의 K-Ras 암유전자나 p53 종양억제 유전자, p16 유전자의 프로모터 메틸화, 그리고 마이크로세틀라이트(microsatellite)의 표지와 불안정성(instability) 등을 검사하여 폐암과 두경부암, 유방암, 대장암, 간암 등을 진단하는 것이 활발하게 시도되고 있다 (Chen, X.Q. et al., Clin. Cancer Res., 5:2297, 1999; Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedes, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Sozzi, G. et al., Clin. Cancer Res., 5:2689, 1999).

한편, 혈액외의 검체에서도 암의 DNA를 검사할 수 있다. 폐암환자에서 객담이나 기관지폐포 세척액(bronchoalveolar lavage) 내에 존재하는 암세포 및 암 유전자의 존재를 유전자검사나 항체검사로 찾는 방법이 시도되고 있으며(Palmisano, W.A. et al., Cancer Res., 60:5954, 2000; Sueoka, E. et al., Cancer Res., 59:1404, 1999), 대장 및 직장암에서 대변 내에 존재하는 암 유전자를 찾는 방법 (Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119:1219-27, 2000)과 소변 및 전립선액 내에 존재하는 프로모터 메틸화 이상을 검사하는 방법 (Goessl, C. et al., Cancer Res., 60:5941, 2000)도 시도되고 있다. 하지만, 다수 유전자 이상을 동반하며 개개 암별로 제각기 다양한 변이를 보이는 암을 정확하게 진단하기 위해서는 다수의 유전자를 동시에, 그리고 정확하게 자동분석할 수 있는 방법이 요구되나, 아직 이러한 방법은 정립되어 있지 않다.

이에 최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있다. 특정 유전자의 프로모터 CpG 섬이 과메틸화되어 있을 때, 그 유전자의 발 현은 차단(gene silencing)되게 된다. 이는 생체 내에서 유전자의 단백질 지정 코딩서열(coding sequence)에 돌연변이(mutation)가 없이도 그 유전자의 기능이 소실되는 주요 기전이며, 인체 암에서 다수의 종양억제 유전자(tumor suppressor genes)의 기능이 소실되는 원인으로 해석되고 있다. 따라서 종양억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화를 검색하는 것은 암의 연구에 큰 도움이 되며, 이를 메틸화 특이 PCR(이하 MSP라고 함)이나 자동염기분석 등의 방법으로 검사하여 암의 진단과 스크리닝 등에 이용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다.

상당수의 질환은 유전자의 이상에 의해 발생하고, 유전자 이상 중 가장 많은 형태는 유전자의 코딩서열에 변화가 오는 것으로 이러한 유전자 자체의 변화(genetic change)를 돌연변이라고 한다. 어떤 유전자에 돌연변이가 있을 때, 그 유전자가 코딩하는 단백질은 구조와 기능이 바뀌고 장애와 결손을 가져오게 되며, 이러한 돌연변이 단백질은 질병을 유발한다. 그러나 특정 유전자에 돌연변이가 없이도 그 유전자의 발현에 이상이 있으면 질병이 유발될 수 있다. 대표적인 예가 유전자 전사의 조절부위, 즉 프로모터 CpG 섬의 시토신 염기부위에 메틸기가 붙는 메틸화로, 이 경우 그 유전자는 발현이 차단된다. 이와 같은 것을 유전자외 변화(epigenetic change)라고 하며, 이것도 돌연변이와 마찬가지로 자손세포에 전달되며, 동일한 효과, 즉 해당 단백질의 발현 상실을 야기한다. 가장 대표적인 것이 암세포에서 프로모터 CpG 섬의 메틸화에 의해 종양억제 유전자의 발현이 차단되는 것으로, 이는 발암의 중요한 기전이 된다 (Robertson, K.D. et al., Carcinogensis, 21:461, 2000).

암을 정확히 진단하려면 변이유전자를 파악하는 것뿐만 아니라, 그 유전자의 변이가 나타나는 기전을 파악하는 것이 중요하다. 이전에는 유전자의 코딩서열의 돌연변이, 즉 점 돌연변이나 결실, 삽입 등의 미세변화나 거시적인 염색체 이상에 초점을 맞추어 연구해 왔다. 그러나 최근에는 이들 만큼 유전자외 변화가 중요한 것으로 보고되고 있고, 대표적인 것이 프로모터 CpG 섬의 메틸화이다.

포유류 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G, T 외에 5번째 염기가 존재하며, 이는 시토신 환의 5번째 탄소에 메틸기가 붙은 5-메틸시토신(5-mC)이다. 5-mC는 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며(5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. CpG의 C는 대부분이 메틸기가 붙어서 메틸화되어 있다. 이러한 CpG의 메틸화는 알루(alu)나 전이인자(transposon)와 같이 게놈내에 반복되는 염기서열(repetitive sequence)이 발현되지 못하도록 억제하며, 포유류 세포에서 유전자외 변화가 가장 흔히 나타나는 부위이다. 이러한 CpG의 5-mC는 자연히 탈아미노화(deamination)되어 T로 바뀌며, 이에 따라 포유류 게놈내 CpG는 정상적으로 나타나야 할 빈도(1/4 x 1/4 = 6.25%)보다 훨씬 낮은 1%의 빈도만을 나타낸다.

CpG 중에 예외적으로 밀집되어 나타나는 것들이 있으며, 이를 CpG 섬이라고 한다. CpG 섬은 길이가 0.2~3kb이고, C 및 G염기의 분포백분율이 50%를 넘으며, CpG의 분포백분율이 3.75%이상으로 높게 집중되어 나타나는 부위를 가리킨다. CpG 섬은 전체 인체 유전체에 약 45,000개가 나타나며, 특히 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에 집중되어 나타난다. 실제로 인체 유전자중 약 절반을 차지하는 중요 유전자(housekeeping genes)의 프로모터에는 CpG 섬이 나타난다 (Cross, S. et al., Curr. Opin. Gene Develop., 5:309, 1995).

한편, 정상인의 체세포(somatic cell)에서는 이들 중요 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬이 메틸화되어 있지 않으나, 발생 중에 발현되지 않도록 각인된(imprinted) 유전자와 비활성화(inactivation)된 X 염색체 상의 유전자들은 메틸화되어 있다.

발암과정 중에는 프로모터 CpG 섬에 메틸화가 나타나며, 그 해당 유전자의 발현에 장애가 나타나게 된다. 특히, 세포주기나 고사를 조절하고, DNA를 복구하며 세포의 부착과 세포간 상호협조 작용에 관여하고, 침윤과 전이를 억제하는 종양억제 유전자들의 프로모터 CpG 섬에 메틸화가 발생하는 경우, 이는 코딩서열의 돌연변이와 동일하게 이들 유전자의 발현과 기능을 차단하며, 그 결과 암의 발생과 진행이 촉진된다. 그 외에도 노화에 따라 CpG 섬에 부분적으로 메틸화가 나타나기도 한다.

흥미로운 사실은 선천성 암에서는 돌연변이가 발암의 원인이 되나, 후천성암에서는 돌연변이가 나타나지 않는 유전자들의 경우, 돌연변이 대신에 프로모터 CpG 섬의 메틸화가 나타난다는 것이다. 대표적인 예로, 후천성 신장암의 VHL(von Hippel Lindau), 유방암의 BRCA1, 대장암의 MLH1, 위암의 E-CAD와 같은 유전자의 프로모터 메틸화가 있다. 아울러 전체 암 중 약 절반에서 p16의 프로모터 메틸화나 Rb의 돌연변이가 나타나며, 나머지 절반은 p53의 돌연변이나 그 계열로 p73, p14 등의 프로모터 메틸화를 보인다.

중요한 사실은 이러한 프로모터 메틸화에 의한 유전자외 변화가 곧 유전자 의 변화, 즉 코딩서열의 돌연변이를 유발하며, 이들 유전자 및 유전자외의 변화가 결합하여 발암이 진행된다는 것이다. MLH1 유전자를 예로 들면, 대장암세포에서 흔히 MLH1 유전자의 한 대립유전자(allele)는 돌연변이나 결실로 인해 기능이 상실되어 있고, 나머지 한 대립유전자는 프로모터 메틸화 때문에 고장이 나있는 경우가 있다. 아울러 프로모터 메틸화 때문에 DNA 복구 유전자인 MLH1의 기능이 상실되면, 이는 곧 다른 중요 유전자에 돌연변이가 일어나는 것을 용이하게 함으로써 발암을 촉진한다.

대부분의 암은 CpG에 관해 3가지 공통된 특징을 보이는데, 이는 종양억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 과메틸화, 나머지 CpG 염기부위의 과소메틸화, 및 메틸화 효소, 즉 DNA 시토신 메틸트랜스퍼라제(DNMT)의 활성증가가 그것이다 (Singal, R. & Ginder, G.D., Blood, 93:4059, 1999; Robertson, K. et al., Carcinogensis, 21:461, 2000; Malik, K. & Brown, K.W., Brit. J. Cancer, 83:1583, 2000).

프로모터 CpG 섬이 메틸화되어 있을 때, 그 해당 유전자의 발현이 차단되는 이유는 명확히 밝혀져 있지 않으나, 메틸화된 시토신에 메틸 CpG 부착 단백질(MECP)이나 CpG 부착 도메인 단백질(domain protein, MBD), 및 히스톤 디아세틸라제(histone deacetylase)가 부착되면서 염색체의 크로마틴 구조를 바꾸고 히스톤을 변화시키기 때문인 것으로 추측되고 있다.

프로모터 CpG 섬의 메틸화가 발암을 직접 유발하는지, 또는 이것이 발암에 2차적인 변화인지에 대해 논란이 있으나, 분명한 사실은 종양관련 유전자의 프로모 터 메틸화가 암의 중요한 지표이며, 따라서 이는 암의 진단과 조기진단, 발암위험의 예측, 암의 예후 예측, 치료 후 추적조사, 항암요법에 대한 반응 예측 등 다방면으로 이용될 수 있다는 것이다. 실제 혈액이나 객담, 침, 대변, 소변 등에서 종양관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다 (Esteller, M. et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedez, M. et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Ahlquist, D.A. et al., Gastroenterol., 119:1219, 2000).

프로모터 메틸화를 이용한 암 진단의 정확도를 극대화하고 발암을 단계별로 분석하며, 암과 고령화에 따른 변화를 감별하기 위해서는 프로모터 CpG 섬의 전체 시토신 염기의 메틸화를 모두 정확하게 분석할 수 있는 검사가 필요하다. 현재 이를 위한 표준적 방법은 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법이다. 이는 검체 DNA를 소듐 바이설파이트로 처리한 다음, 표적 유전자의 검사하고자 하는 CpG 섬 전체 부위를 PCR로 증폭한 후, 그 염기서열을 분석하는 것이다. 그러나 이 검사는 한번에 검사할 수 있는 유전자의 수나 검체의 수에 한계가 있으며, 자동화가 어렵고 시간과 비용이 많이 소요되는 단점이 있다.

존스 홉킨스 의대와 MD 엔더슨 암센터, 베를린의대 등에서 암과 관련된 유전자의 프로모터 메틸화에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이렇게 얻어진 기초자료는 DNA Methylation Society(DMS)에서 교류가 이루어지고 있으며, MethDB (http://www.methdb.de)에 자료가 저장되고 있다. 한편, EpiGenX Pharmaceuticals사는 CpG 섬의 메틸화와 관련된 치료제를 개발하고 있고, Epigenomics사는 DNA칩과 MALDI-TOF 등의 기법으로 프로모터 메틸화를 검사하여 암 진단에 응용하려는 연구를 진행 중이다.

프로모터 CpG 섬의 메틸화는 인체의 발생과 분화 등의 생리적 현상이나 노화, 각종 암과 양성질환의 발생과 깊은 연관이 있고, 특히 종양관련 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화는 암의 발생과 진행에 중요한 역할을 하여 암의 지표가 될 수 있다. 그러나, 기존의 방식으로는 수많은 유전자의 CpG 섬 모두를 MSP로 증폭하고, 각각 염기서열 분석법(바이설파이트 게놈 시퀀싱)으로 분석해야 한다는 어려움이 있다. 또한 다수 유전자의 다양한 형태의 프로모터 메틸화 변화를 한꺼번에 정확하고 신속하게 자동분석할 수 있고, 임상에서 각종 암의 진단이나 조기검진, 병기평가 등에 바로 응용될 수 있는 방법은 전무한 상태이다.

새로운 메틸화 관련 암억제 유전자의 스크리닝에 있어서도 많은 연구가 이루어져 왔다. 기존의 방법은, 암 조직과 정상 조직의 지노믹 DNA를 메틸화관련 제한효소로 제한한 후, 만들어진 수많은 DNA 단편을 모두 클로닝하여 암 조직과 정상 조직에서 차이나는 DNA 단편을 선정하고, 시퀀싱하여 스크리닝하는 방법, 또는 CpG 섬을 인식하는 binding column을 사용하는 방법 등이 있다 (Huang, T.H. et al., Hum. Mol. Genet., 8:459, 1999; Cross, S.H. et al., Nat. Genet., 6:236, 1994). 그러나, 이들 방법은 많은 시간을 필요로 할 뿐만 아니라, 유전자 후보군의 스크리닝 또한 효율적이지 못하며, 실제 임상에 적용하기에 어려움이 있다.

이에, 본 발명자들은 대장암의 조직과 세포주로부터 특이적으로 발현이 억제되는 유전자(대장암 특이적 발현감소 유전자)의 프로모터를 찾아내고, 이들이 암의 진단에 유용하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 대장암 특이적 발현감소 유전자의 메틸화된 프로모터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 메틸화된 프로모터가 고정되어 있는 암의 조기진단에 유용한 마이크로어레이를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 메틸화된 프로모터를 함유하는 암 진단키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 대장암의 조기진단을 위하여 임상샘플 유래의 샘플 DNA를 증폭하는데 유용한 프라이머 혼합물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 혼합물 및/또는 상기 마이크로어레이를 이용하는 것을 특징으로 하는 암의 조기 진단방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 8종의 대장암 특이적 발현감소 유전자 및 그 프로모터를 찾아내고, 상기 메틸화된 프로모터가 임상적으로 응용이 가능한지를 확인하였다.

결국, 본 발명은 LAMA2, FABP4, GSTA2, STMN2, NR4A2, DSCR1L1, A2M 및 SEPP1로 구성된 군에서 선택되는 대장암 특이적 발현감소 유전자의 메틸화된 프로 모터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 LAMA2, FABP4, GSTA2, STMN2, NR4A2, DSCR1L1, A2M 및 SEPP1는 각각 서열번호 1 내지 8의 DNA 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 메틸화된 프로모터는, 적어도 하나의 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 다음으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:

(a) SEQ ID NO: 9의 766 내지 805 영역;

(b) SEQ ID NO: 9의 896 내지 935 영역;

(c) SEQ ID NO: 10의 201 내지 240 영역;

(d) SEQ ID NO: 11의 206 내지 245 영역;

(e) SEQ ID NO: 11의 556 내지 595 영역;

(f) SEQ ID NO: 11의 661 내지 700 영역;

(g) SEQ ID NO: 12의 1176 내지 1215 영역;

(h) SEQ ID NO: 13의 81 내지 120 영역;

(i) SEQ ID NO: 13의 121 내지 160 영역;

(j) SEQ ID NO: 14의 226 내지 265 영역;

(k) SEQ ID NO: 14의 646 내지 685 영역;

(l) SEQ ID NO: 15의 226 내지 265 영역;

(m) SEQ ID NO: 15의 776 내지 815 영역;

(n) SEQ ID NO: 16의 266 내지 305 영역; 및

(o) SEQ ID NO: 16의 476 내지 515 영역.

보다 바람직하게, 상기 메틸화된 프로모터는 서열번호 9 내지 16으로 표시되는 DNA 서열 중 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 메틸화된 프로모터가 고체 기질상에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 암 진단용 마이크로어레이 및 상기 메틸화된 프로모터를 함유하는 암 진단키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 17/18, 서열번호 19/20, 서열번호 21/22, 서열번호 23/24, 서열번호 25/26, 서열번호 27/28, 서열번호 29/30, 및 서열번호 31/32로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 함유하는 프라이머 혼합물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 임상샘플에서 샘플 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 샘플 DNA를 (i) 메틸화되지 않은 시토신 잔기를 변형시키는 시약, 또는 (ii) MspI, HpaII, BssHII, BstUI 및 NotI로 구성된 군에서 선택되는 메틸레이션 민감성(methylation sensitive) 제한효소로 처리하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 처리된 DNA를 LAMA2, FABP4, GSTA2, STMN2, NR4A2, DSCR1L1, A2M 및 SEPP1로 구성된 군에서 선택되는 유전자의 프로모터에서 유래된 CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 증폭된 결과물의 존재 유무를 근거로 프로모터의 메틸화 여부를 결정하는 단계를 포함하는 종양 임상샘플 유래 유전자의 프로모터 메틸화 여부를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 임상샘플은 암 의심환자 또는 진단대상 유래의 조 직, 세포, 가래, 대변, 소변, 세포막, 뇌수, 양수, 안구, 장기 또는 혈액인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 메틸화되지 않은 시토신 잔기를 변형시키는 시약은 바이설파이트(bisulfite)인 것을 특징으로 할 수 있다. 바이설파이트(bisulfite)를 이용하여 메틸화되지 않은 시토신 잔기(residue)를 변형시켜 프로모터의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 종래기술에 상세히 기술되어 있다 (WO 01/26536; US 2003/0148326A1).

또한, 상기 증폭은 전형적으로 PCR에 의한 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 증폭물의 메틸화 여부는 시퀀싱(sequencing)에 의해 확인할 수 있으며, 본 발명의 방법에 의해 증폭된 서열은 PCR, 올리고머 제한, ASO(allele-specific oliginucleotide) 프로브 분석(Conner, B.J. et al., PNAS, 80:278, 1983 Saiki, R.K. et al., Nature, 324:163, 1986), OLA(oligonucleotide ligation assays) (Landegren, U. et al., Science, 241:1077, 1988 Landegren, U., Bioessays, 15:761, 1993)과 같은 특정 DNA 서열의 검출방법에 의해 용액에서 또는 고체 지지체에 결합한 후에 평가, 검출, 클로닝 또는 시퀀싱할 수 있다.

선택적으로, 핵산의 메틸레이션 패턴은 제한효소 절단(restriction enzyme digestion) 및 써던블롯(Southern blot) 분석에 의해 확인할 수 있다. 5'CpG 메틸화를 검출할 수 있는 메틸레이션 민감성 제한효소의 예로는 SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있다. 그 인식부위의 일부로 CG 함유하는 제한효소는 C가 메틸화되는 것을 저해한다. 전형적으로, 메틸레이션 민감성 제한효 소는 HpaII, MspI, 또는 BssHII 단독이거나 그 조합이다. 다른 메틸레이션 민감성 제한효소는 당업계에 잘 알려져 있다.

상기 CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 17/18, 서열번호 19/20, 서열번호 21/22, 서열번호 23/24, 서열번호 25/26, 서열번호 27/28, 서열번호 29/30, 및 서열번호 31/32로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 함유하는 프라이머 혼합물인 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 프라이머 혼합물은 서열번호 17 내지 32의 프라이머를 모두 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 프로모터 메틸화 여부를 검출하는 방법에 있어서, 상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계의 증폭 결과물을 전기영동하여, mock DNA에서 PCR 결과물이 나타난 상태에서, HpaII로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 있는 경우는 프로모터가 메틸화된 것으로 결정하고, HpaII로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 없는 경우는 프로모터가 메틸화되지 않은 것으로 결정하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계의 증폭 결과물을 상기 암 진단용 마이크로어레이와 하이브리다이제이션하여, mock DNA와 HpaII로 처리된 DNA에서 모두 하이브리다이제이션된 경우를 프로모터가 메틸화된 것으로 결정하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 '임상샘플'은 암 여부를 진단할 대상 유래의 조직, 세포뿐만 아니라 가래, 대변, 소변, 세포막, 뇌수, 양수, 안구, 장기, 혈액 등을 의미한다. 또 다른 용어 '대장암 특이적 발현감소 유전자'는 대장암에서 특이적으로 발현이 억제되는 유전자를 의미한다. 또 다른 용어 'mock DNA'는 임상샘플로부터 분리된, 아무런 처리를 하지 않은 상태의 샘플 DNA를 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1: 대장암 특이적 발현감소 유전자의 선별

10개의 대장암 조직샘플과, 10개의 정상 대장샘플을 사용하여, 대장암 특이적 발현감소 유전자군을 선별하기 위해, 직접비교방법과 간접비교방법으로 human 17K cDNA 마이크로어레이 실험을 수행하였다.

직접비교방법(direct comparison method)으로써, 대장암 조직샘플에서 추출한 total RNA 100㎍과, 암 조직에 상응하는 정상 대장조직샘플에서 추출한 total RNA 100㎍을 사용하여, 각각 형광염료인 Cy5-dUTP와 Cy3-dUTP로 labeling한 후, human 17K cDNA 마이크로어레이(GenomicTree, Inc., Korea)에 하이브리다이제이션하고, 그 발현변화를 분석하였다.

간접비교방법(indirect comparison method)으로써, 10종의 대장암 조직샘플과, 10종의 정상 대장 샘플에서 추출한 total RNA 100㎍을 Cy5-dUTP 형광염료로 labeling하고, 13종의 세포주에서 추출한 total RNA를 혼합한 common reference RNA(한국특허출원번호 10-2003-0058033) 100㎍을 Cy3-dUTP 형광염료로 labeling한 후, human 17K cDNA 마이크로어레이(GenomicTree, Inc., Korea)에 하이브리다이제이션한 후, 그 발현변화를 분석하였다.

상기 직접비교방법과 간접비교방법에 의해 대장암 조직샘플과 정상 대장샘플에서의 유전자 발현변화를 분석한 결과, 두 가지 방법에서 모두 발현이 감소된 유전자를 188개를 얻을 수 있었다. 상기 방법으로 얻어진 188개의 유전자로부터 프로모터 메틸화에 의해 발현이 억제되는 유전자(대장암 특이적 발현감소 유전자) 8종(도 1 및 표 1)을 선별하였다.

Name	서열번호	Full name
LAMA2	1	laminin alpha2(merosin, congenital)
FABP4	2	fatty acid binding protein 4, adipocyte
GSTA2	3	glutathione S transferase A2
STMN2	4	stathmin-like 2
NR4A2	5	nuclear receptor subfamily 4 group A, member 2
DSCR1L1	6	down syndrome candidate region 1-like
A2M	7	alpha-2-macroglobulin
SEPP1	8	selenoprotein P, plasma, 1

실시예 2: 프로모터 메틸화에 의한 8종 유전자의 발현조절

실시예 1에서 선별된 8종 유전자가 그 프로모터 부분의 메틸화에 의한 발현이 조절되는지를 검증하기 위하여, 프로모터 부분의 메틸화 현상을 억제시키는 탈메틸화제(demethylating agent)인 DAC(5'-aza-deoxycytidine)와, 또 다른 경로로 유전자 발현을 억제하는 HDAC(histone deacetylase) 단백질에 대한 특이적 저해제 인 TSA(trichostatin A)로 세포주를 처리하였다.

대장암 세포주인 HCT116(ATCC CCL 247)을 배양하여, DAC 및/또는 TSA로 처리하고, 대조군(약물 비처리 그룹)과 함께, total RNA를 추출하여, 17K cDNA 마이크로어레이 실험을 하였다. 우선, 세포주를 DMEM(10% FBS, 1% penicillin, 1% streptomycin) 배지에 현탁하고, 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 상기 세포주의 배양시 4 그룹으로 나누어, 배양액 1ml에 대하여 표 2와 같은 조건으로, 약물 1㎕을 첨가하여 처리한 후, 세포주를 회수하여 total RNA를 분리하였다.

	DAC 처리군	대조군	DAC+TSA 처리군	대조군
1일차	DAC 200nM	50% 아세트산	DAC 200nM	50%아세트산
2일차	DAC 200nM	50% 아세트산	DAC 200nM	50%아세트산
3일차	DAC 200nM	50% 아세트산	TSA 300nM	100% 에탄올

DAC 단독 처리군과, DAC+TSA 처리군의 total RNA를 Cy5 형광 dye로 labeling하고, 그에 상응하는 대조군을 Cy3 형광 dye로 labeling하여, 17K cDNA 칩(GenomicTree, Inc., Korea)으로 실험을 하였다. 65℃에서 16시간동안hybridization하고, washing한 다음, Axon Scanner 4000B와 GenePixPro 4.0 program으로 스캐닝하였다 (도 2).

이 실험에서는 메틸화에 의해 발현 억제되는 유전자는 위와 같은 실험에 의해 프로모터 메틸화 현상이 없어져 다시 발현될 것으로 예상하였다. 상기 실험결과, 8종 유전자의 발현은, 대조군에 비해, 메틸화 저해제를 처리한 세포주에서 유 의성 있게 증가하였다 (표 3). 이 결과로부터, 본 발명에 따른 8종 유전자의 발현은 프로모터의 메틸화에 의해 조절되는 것을 확인할 수 있었다.

메틸화 저해제 처리에 의한 대장암 세포주에서 8종 유전자의 발현변화

Name	ratio of median	Cy5 signal	Cy3 signal
LAMA2	21.163	14708	695
FABP4	10.105	1152	114
GSTA2	2.854	839	294
STMN2	2.827	2092	740
NR4A2	2.275	1151	506
DSCR1L1	1.642	1441	878
A2M	1.805	213	118
SEPP1	1.175	2120	1804

실시예 3: 8종 유전자 프로모터의 클로닝 및 digestion assay

실시예 1에서 선별되고, 실시예 2에서 검증된 8종 유전자의 프로모터를 실제로 클로닝하기 위하여, 건강한 정상인의 혈액내의 림프구에서 얻은 genomic DNA를 주형으로 하고, 하기 표 4의 프라이머를 사용하여 PCR[(94℃ 1min → 66℃ 1min → 72℃ 1min) 30 cycle]을 수행하였다.

8종 유전자 프로모터의 클로닝에 사용된 프라이머

LAMA2	서열번호 17	5'-cca gtg gcc cat tca gaa gtc-3'
LAMA2	서열번호 18	5'-cca ctt ctc ggg agc cag ag-3'
FABP4	서열번호 19	5'-gga tac aca gtg tag cga tgc a-3'
FABP4	서열번호 20	5'-gct gca gtt ttc agg agg gtg-3'
GSTA2	서열번호 21	5'-gca gtg acc ctg gat ccc ag-3'
GSTA2	서열번호 22	5'-ggt agc agt ctc ctg gag gtt-3'
STMN2	서열번호 23	5'-cct tcc tct gtg cca agg gaa-3'
STMN2	서열번호 24	5'-gga tgt gca gac gct gag ca-3'
NR4A2	서열번호 25	5'-cct aag atg gaa atg acc tct c-3'
NR4A2	서열번호 26	5'-ggg tga taa cac act cag cct-3'
DSCR1L1	서열번호 27	5'-gct ctt agc gtt act ggt ctg-3'
DSCR1L1	서열번호 28	5'-ggc aac ctc aga gtt ggg agt-3'
A2M	서열번호 29	5'-cct agc gca ttg cag gtg ct-3'
A2M	서열번호 30	5'-cct ctg cct tgg tat atc cca-3'
SEPP1	서열번호 31	5'-cgt tgc tca gag gaa gca tct-3'
SEPP1	서열번호 32	5'-cct agc cca tga att ctg tct c-3'

상기 PCR 결과물을 Topo pCR2.1 vector(Invitrogen)에 클로닝하고, DNA 시퀀싱을 통하여 정확한 DNA 부위가 클로닝된 것을 확인하였다. 이렇게 클로닝된 8종 유전자의 프로모터를 대상으로, 프로모터 메틸화 여부를 측정할 수 있는 분석방법인 HpaII 효소절단분석(enzyme digestion assay)을 수행하였다.

대장암 조직 유래 Caco2 세포주(ATCC HTB 37), 대장암 조직 유래 세포주 HCT116(ATCC CCL 247)을 배양한 후, genomic DNA을 추출하여, 각각 200ng의 DNA를 각각 40U의 HpaII 및 80U의 MspI으로 처리하였다. 상기 제한효소로 처리된 DNA를 정제한 다음, 제한효소로 처리되지 않은 샘플 DNA(mock DNA)와 함께, 상기 클로닝에 사용한 표 4의 프라이머를 사용하여 PCR[(94℃ 1min → 66℃ 1min → 72℃ 1min) 30 cycle]을 수행하였다.

상기 PCR 결과물을 전기영동하여 프로모터의 메틸화 여부를 검증하였다. 프로모터가 메틸화되어 있는 유전자는 HpaII로 절단되지 않으므로, PCR 결과가 나오게 되며, 프로모터가 메틸화되지 않은 유전자는 HpaII로 절단되기 때문에 PCR이 되지 않는다. HpaII 제한효소의 활성이 메틸화된 프로모터에 의해 억제되는지 여부를 검증하기 위해, MspI 제한효소를 사용하였다. MspI은 메틸화에 관계없이 HpaII 제한효소가 인식하는 염기서열과 동일한 염기서열을 인식하여 절단하므로, HpaII 제한효소의 메틸화 특이적 절단반응을 검증할 수 있다.

상기 증폭된 PCR 결과물을 전기영동하여, HpaII로 처리된 샘플에서는 PCR 결과물이 있는 것을 메틸화된 것으로 결정하여 흑색 block으로 표시하고, 메틸화되지 않아 HpaII로 처리된 샘플에서 PCR 결과물이 보이지 않은 경우를 백색 block으로 나타냈다 (도 4). 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 선별된 8종 유전자의 프로모터는 대장암 세포주에서 모두 메틸화되어 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 바이설파이트 시퀀싱

실시예 3에서 입증된, 8종 유전자의 프로모터 메틸화 여부를 다른 방법으로 확인하기 위하여, 이중 3개 유전자(NR4A2, A2M 및 SEPP1)의 프로모터를 대상으로 바이설파이트 시퀀싱을 수행하였다 (NR4A2: 역방향으로 시퀀싱; A2M 및 SEPP1: 정방향으로 시퀀싱). DNA에 바이설파이트를 처리하면 메틸화되지 않은 씨토신은 우라실로 변하고, 메틸화된 씨토신은 변하지 않는다. 대장암 세포주 HCT116의 게놈 DNA 1㎍을 MSP 바이설파이트 변형키트(In2Gen, Inc., 한국)를 사용하여 바이설파이트 변형(Sato, N. et al., Cancer Research, 63:3735, 2003)을 실시하였다. 바이설파 이트 처리된 HCT116 게놈 DNA를 서열번호 25/26, 29/30 및 31/32의 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭한 다음, PCR 산물의 염기서열을 분석하였다 (도 5). 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 3개 유전자(NR4A2, A2M 및 SEPP1) 프로모터의 염기서열 중 CpG 섬을 포함하는 부분에서 모두 씨토신이 검출되어, 상기 3개 유전자의 프로모터가 모두 메틸화되어 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 8종 유전자의 프로모터를 이용한 임상실험

본 발명에서 선별된 8종 유전자에 대한 메틸화 프로모터의 임상 적용가능성을 확인하기 위해, 대장암과 림프구(lymphocyte) 임상샘플을 대상으로 메틸레이션 assay를 수행하였다. 메틸레이션 마이크로어레이를 제작하기 위하여, 서열번호 9 내지 16의 프로모터 부분을 PCR로 증폭하여 얻은 후, 시퀀싱으로 확인하고, 50% DMSO에 녹인 다음, GeneMachine OmniGrid spotter를 사용하여 spotting하고, 24시간 air-dry한 후, 3600mJ의 UV를 사용한 crosslinking에 의해 암 진단용 마이크로어레이를 제작하였다.

상기 제작된 마이크로어레이를 이용하여, 17명의 대장암 환자로부터 얻어진 암 조직과 3명의 정상인의 림프구 샘플을 대상으로 메틸화 프로모터 프로파일을 작성하였다. 우선, 17명의 대장암 환자로부터 얻어진 암 조직과 3명의 정상인 림프구로부터 지노믹 DNA를 분리한 다음, 이를 각각 HpaII 제한효소로 처리한 후, 서열번호 17 내지 32의 프라이머 혼합물을 사용하여 PCR[(94℃ 1min → 66℃ 1min → 72℃ 1min) 30 cycle]로 증폭하여 샘플 DNA를 수득하였다.

상기 증폭된 샘플 DNA를 상기 제작된 암 진단용 마이크로어레이와 하이브리다이제이션 시켰다. 상기 하이브리다이제이션 결과, HpaII로 처리된 샘플에서 하이브리다이제이션이 유의성 있게 증가한 것을 메틸화된 것으로 결정하여 붉은 색 block으로 표시하였다. 이는 메틸화가 되어서, HpaII 처리 샘플에서 유의성 있게 PCR 증폭이 일어난 경우를 나타낸 것이다. 메틸화가 되지 않은 경우에는 검은 색으로 표시하였다 (도 6).

도 6에 나타난 바와 같이, 대부분의 대장암 조직에서는 8개 유전자의 프로모터 메틸화 현상을 볼 수 있었으나, 정상의 대조군으로 알려진 림프구(lymphocyte) 샘플에서는 메틸화 현상을 거의 볼 수 없었다. 따라서, 본 발명에 따른 8종 유전자의 프로모터는 계층적 클러스터링 분석을 통해, 정상과 암 조직을 유의성 있게 구별하는데 유용하다는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에서는 8종의 대장암 특이적 발현 감소 유전자 및 그 프로모터를 찾아내고, 이들이 여러 임상샘플에 광범위하게 적용되는 암 진단 마커(molecular marker)로서의 기능을 가진다는 것을 밝혀냈다. 본 발명에 따른 대장암 특이적 발현감소 유전자의 메틸화된 프로모터는 암 환자의 조기진단 뿐 아니라, 그 유전자의 발현의 조절을 통하여 조기에 치료가 가능한 신약을 스크리닝하는 타겟으로도 유용하고, 결국 암의 완치율 향상에 기여할 것으로 기대된다.

<110> GenomicTree, Inc <120> Methylated Promoters of Colon Cancer Specific Expression-decreased Genes and Use Thereof <130> P04-303 <160> 32 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9420 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cagcgactcc tctggctccc gagaagtgga tccggtcgcg gccactacga tgccgggagc 60 cgccggggtc ctcctccttc tgctgctctc cggaggcctc gggggcgtac aggcgcagcg 120 gccgcagcag cagcggcagt cacaggcaca tcagcaaaga ggtttattcc ctgctgtcct 180 gaatcttgct tctaatgctc ttatcacgac caatgcaaca tgtggagaaa aaggacctga 240 aatgtactgc aaattggtag aacatgtccc tgggcagcct gtgaggaacc cgcagtgtcg 300 aatctgcaat caaaacagca gcaatccaaa ccagagacac ccgattacaa atgctattga 360 tggaaagaac acttggtggc agagtcccag tattaagaat ggaatcgaat accattatgt 420 gacaattaca ctggatttac agcaggtgtt ccagatcgcg tatgtgattg tgaaggcagc 480 taactccccc cggcctggaa actggatttt ggaacgctct cttgatgatg ttgaatacaa 540 gccctggcag tatcatgctg tgacagacac ggagtgccta acgctttaca atatttatcc 600 ccgcactggg ccaccgtcat atgccaaaga tgatgaggtc atctgcactt cattttactc 660 caagatacac 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ttgctgctga gcgcctgcct ggcggtgagc gctggccctg tgccaacgcc 300 gcccgacaac atccaagtgc aggaaaactt caatatctct cggatctatg ggaagtggta 360 caacctggcc atcggttcca cctgcccctg gctgaagaag atcatggaca ggatgacagt 420 gagcacgctg gtgctgggag agggcgctac agaggcggag atcagcatga ccagcactcg 480 ttggcggaaa ggtgtctgtg aggagacgtc tggagcttat gagaaaacag atactgatgg 540 gaagtttctc tatcacaaat ccaaatggaa cataaccatg gagtcctatg tggtccacac 600 caactatgat gagtatgcca ttttcctgac caagaaattc agccgccatc atggacccac 660 cattactgcc aagctctacg ggcgggcgcc gcagctgagg gaaactctcc tgcaggactt 720 cagagtggtt gcccagggtg tgggcatccc tgaggactcc atcttcacca tggctgaccg 780 aggtgaatgt gtccctgggg agcaggaacc agagcccatc ttaatcccga gagtccggag 840 ggctgtgcta ccccaagaag aggaaggatc agggggtggg caactggtaa ctgaagtcac 900 caagaaagaa gattcctgcc agctgggcta ctcggccggt ccctgcatgg gaatgaccag 960 caggtatttc tataatggta catccatggc ctgtgagact ttccagtacg gcggctgcat 1020 gggcaacggt aacaacttcg tcacagaaaa ggagtgtctg cagacctgcc gaactgtggc 1080 ggcctgcaat ctccccatag 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ccttcctaac tttcccatat gtagaagaag ccattaagat tgcttactgt 540 gaaaagaaat gtggaaactg ctctctcacg actctcaaag atgaagactt ttgtaaacgt 600 gtatctttgg ctactgtgga taaaacagtt gaaactccat cgcctcatta ccatcatgag 660 catcatcaca atcatggaca tcagcacctt ggcagcagtg agctttcaga gaatcagcaa 720 ccaggagcac caaatgctcc tactcatcct gctcctccag gccttcatca ccaccataag 780 cacaagggtc agcataggca gggtcaccca gagaaccgag atatgccagc aagtgaagat 840 ttacaagatt tacaaaagaa gctctgtcga aagagatgta taaatcaatt actctgtaaa 900 ttgcccacag attcagagtt ggctcctagg agctgatgct gccattgtcg acatctgata 960 tttgaaaaaa cagggtctgc aatcacctga cagtgtaaag aaaacctccc atctttatgt 1020 agctgacagg gacttcgggc agaggagaac ataactgaat cttgtcagtg acgtttgcct 1080 ccagctgcct gacaaataag tcagcagctt atacccacag aagccagtgc cagttgacgc 1140 tgaaagaatc aggcaaaaaa gtgagaatga ccttcaaact aaatatttaa aataggacat 1200 actccccaat ttagtctaga cacaatttca tttccagcat ttttataaac taccaaatta 1260 gtgaaccaaa aatagaaatt agatttgtgc aaacatggag aaatctactg aattggcttc 1320 cagattttaa attttatgtc atagaaatat tgactcaaac catatttttt atgatggagc 1380 aactgaaagg tgattgcagc ttttggttaa tatgtctttt tttttctttt tccagtgttc 1440 tatttgcttt aatgagaata gaaacgtaaa ctatgaccta ggggttttct gttggataat 1500 tagcagttta gaatggagga agaacaacaa agacatgctt tccatttttt cctttactta 1560 tctctcaaaa caatattact ttgtcttttc aatcttctac ttttaactaa taaaataagt 1620 ggattttgta ttttaagatc cagaaatact taacacgtga atattttgct aaaaaagcat 1680 atataactat tttaaatatc catttatctt ttgtatatct aagactcatc ctgattttta 1740 ctatcacaca tgaataaagg cctttgtatc tttctttctc taatgttgta tcatactctt 1800 ctaaaacttg agtggctgtc ttaaaagata taaggggaaa gataatattg tctgtctcta 1860 tattgcttag taagtatttc catagtcaat gatggtttaa taggtaaacc aaaccctata 1920 aacctgacct cctttatggt taatactatt aagcaagaat gcagtacaga attggataca 1980 gtacggattt gtccaaataa attcaataaa aaccttaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2038 <210> 9 <211> 1050 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gtttgtttac tcactacata aatgaccagt ggcccattca gaagtctaag gacaaaatat 60 gttgtaggac tgtcctgacc actgagggac agctcacacc ctgacccaac agtacactaa 120 tgcctgcagt acccaccgtt cccggagtaa accaaaagac atcctgcgac tcacaaaatc 180 cattatggag ttgttttaaa ccttatgaga accactgacc taggccataa aaaacaaatg 240 aaaaaacaac aaaaactagg aatggcagta gttctgttga gttaaagagg agaaagagga 300 gaaaccagga ctggaagaga tgaaattgtg agtctggaag gaaactattg caaaggcctt 360 tattaccttt aagtaaatgt ctcctaactg aactgaaagc cttcattcta accattagtt 420 tggtcaggaa catttcaggg acgccagggt ggctgtttta ttttgcactt cctttactgc 480 cctcccagca gcctacctag cagtaagttc cccagcctgc agtgtcccca gagggcacct 540 tccctcggct agtaacttct cagacactct ggccttgggg atgtcttgga tcttctaggt 600 acacagtggc tgcacacagt tttgccaggc ctttctcaag aggtaaaagt tcctagctgt 660 ttgcatttcc cagaaataat gttttccatg tgtagggatt ttacagattt caaagtgctt 720 tcatgtcaat tactttcttt aatttaaaag aagttcagat accaggtcaa gctaggaatg 780 atccggtctc agagggaagg agcgctctag gaaaggagga tcctttaata gagggccgtc 840 ctggggccgc gtgcccatgg aaggcgagag tggaggagtg tcctctttct cccccaccct 900 caggcggcgg cccggccaaa gccagagggg gctgtctcct cctcttcccc agcagctgct 960 gctcgctcag ctcacaagcc aaggccaggg gacagggcgg cagcgactcc tctggctccc 1020 gagaagtgga tccggtcgcg gccactacga 1050 <210> 10 <211> 1122 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 caaagttttc actggagaca agtttccagg tacctacaaa agcatcacac attttgtgag 60 ttttctagga ttattcttca aggtgagaag gaagctgcag ttttcaggag ggtgctgtga 120 ccctcttgag tccagataac ttccttttaa agatgctcag aacatgtgat cttaggaatg 180 accaattggg aatgagatcc aatcatttcc ttcattaccg gcctctgcat ttttttctct 240 gagtcatgtt tttaatagaa atttctcaac tttggttctc cctggcaaat agtcactgga 300 cttagagtac aaattatttt taaaccacta acaggatatt ttaaacattc ctgttttgac 360 agcttaatgc tcagtgcact gaatttcccc ctattattcc tatacatatt tatcccagtg 420 tagagagggg aaattatttt gagataaact tcgaccttat tttgtgtgtg tgtgtggggt 480 gttatttaaa ttgcagttat gtggttcttt tgaattgagg aacataagaa ctgcctcgga 540 gattcttaca taattgcaaa ggctcttcgg gacactcctg tctcaggaat tacctggcga 600 ttaaaacaaa ataaataatg ggatttaaaa gtactccaga tttctgattt caaatgtttt 660 atatgaataa aaaagtacat tcaattcatc caccagtaat ctggactgta gatttaatcg 720 aaatgataat ttaacctcac tctttccatc tcctaaatga gagcatagca ttgatttcca 780 cagatccttt gaaaaatagg ccttattcta aaatactttc ctcatattga gaaactgcat 840 tcaatttctg aactgtatta taagttctga atttattcag atcagaaatg gtgtgtggtc 900 acaagctacc aaaaccaata tccttctttt atacagtgac caatctgtga aactagtttt 960 ctaaagtaat cgtggttttc aattcccttt gcctcatgca agaatgacag aagttgttca 1020 catgtgctgc aaattcccac gaacataccc agatttaggg gaaaaaaaga aactaaaata 1080 tttcagagtg atgcatcgct acactgtgta tcccactgaa ca 1122 <210> 11 <211> 1260 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cggatggact ccattctgcc ccgtatattg gagtagtgga gcttgggctt ctctgccatg 60 gtagcagtct cctggaggtt tctctaagcc tgagtgaatg aatgaatgaa tgaatgaata 120 attgaaacga tagaatcaaa aatgtacttt aggatgtatg gttgaaaacc acaaacaatg 180 ctgaagaaga acctgccttc ttcatgacgg tgttggagga gttcccggaa tgttttcttg 240 gctcaaatta ttacccagca gtggccaccc tcagattcca gcaaaccagt ctcaagtttt 300 cactgtttaa ctctgaattt tcttggcagc ctaagaggtg agagtatgtg gtaataatac 360 atgtatagga gttaatggga agaggaagaa ttcaagaact aatatttact gaaaacttcc 420 tagtgatcct tcctcaatgc tagtcccttt caatatttta tatctttaac cctccttata 480 gtcccatgaa atgattatct ccattttttc gttaatgaaa tggaacatca gagaaataca 540 atgttcacag tcacactccg gttggtgatg gacatgaata tctacaccaa ggactaaaat 600 gaaatcatgc ctggaagcca gctgggtgaa ggccctggga acccatgaac tggccatgaa 660 accagaggat gtcactgaca gggaggaccg gctgggagct aaatcactct tcagctcttt 720 ggctgtgaga ctgcatttga tcaaaaccag aaattaggcc tcagacttgt ttaactgtag 780 ctagaagatc caaattcttt caagagacag agattgttta tcccttgctt cttttggaat 840 tctgtattct aactctatgg ggtgcatttt gttttataag ctggaagaag agatgttgct 900 gcattaattt tgcaatatgg aaggagctag catttgttca acatcagtca cacactgatc 960 attcttctaa acttctcttt gttttatcct acaaaaatta cctaaggtta atgtggttgt 1020 tattctcatt ttacatttga ggatactgag gtttttaaag taacttgctc agagtaaatg 1080 atagatctgg gatccagggt cactgctatt aaaaaccaaa tactgagtct tattttctat 1140 gttagtgttt ctcaaatatg catggtaatc tctcagcaga ttgtgaaatc ccattacttt 1200 aaaaaataaa tagaaaagaa aagaatagaa aatatcagtg agcatgacat gttgaaaggt 1260 1260 <210> 12 <211> 1320 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 catatttaag tcaagtgaaa gagaacaaat gaatgactgg catccattaa gtgagaagga 60 ggaactaata aatgccttgt ttgtaatgaa agtcattttt tgcaactagt ctcaaagatc 120 ctcacatacg acattgctca atccgaaact tgaacacagc cttcctgggc ctacataaac 180 gtagtctctc tggatctcag aaaaataatg acccagacca cacctttcat ctcttctaag 240 ttttccatgt aaagcattct ccttagagcc ctggaaaggt tactaaaatt ttgacccact 300 taatcctaca ccttcagggc aacatggcat tcacctgtgg tttccttaat gcccaaacca 360 gccagccaac ctgttttctg ccgtgttaac aaatggacag gacacaggca ccagaggtta 420 aactttcttc ctcttccccc atgtccccag gtggaccatt attaccatcc ctattcccaa 480 gcaaccaggt agccccttcc tctgtgccaa gggaagaaaa caccatgctt ccctctcctg 540 agagaccttc aagagtttag agacgcctaa gtccagctgt gctaaaagat aaaggacaat 600 aatgcaagtc tgctctgagc tgccaccata gccagacata gggtagccct gaaagactag 660 aaccaaggac agagccaaag gtgaaagaaa atatgaaaaa gtgaaaacac agtatttaaa 720 cagaattttc caacagcctg catatagtga ggacttctca agcttctgaa tccttttcca 780 ttgaattgtg caatggcaca tgtatgagca aagtcaagcc tcctggctcc caggtaggca 840 cagcccagtt cttagctcct aggaagcttc agggcttaaa gctccactct acttggactg 900 tactatcagg cccccaaaat ggggggagcc gacagggaag gactgatttc catttcaaac 960 tgcattctgg tactttgtac tccagcacca ttggccgatc aatatttaat gcttggagat 1020 tctgactctg cgggagtcat gtcaggggac cttgggagcc aatctgcttg agcttctgag 1080 tgataattat tcatgggctc ctgcctcttg ctctttctct agcacggtcc cactctgcag 1140 actcagtgcc ttattcagtc ttctctctcg ctctctccgc tgctgtagcc ggaccctttg 1200 ccttcgccac tgctcagcgt ctgcacatcc ctacaatggc taaaacagca atgggtaagg 1260 cactgcgcct cgttctccgt cggctctacc tggagcccac ctctcacctc ctctcttgag 1320 1320 <210> 13 <211> 1140 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gctggctcct tgaggcgagg acccatactg cgcctgaaca caaggcatgg ctggaaatga 60 aacagggtga taacacactc agcctggtca actgaacact ttctcccggg ctcgggtaca 120 cctggagcta caccggcagc ccgcggcagt cagagagcat gtaggggcgc gagaggaaag 180 gcaggagaga gagaatgctg cagaacaaca gtttagggcg tggaaagact aaccaaataa 240 agacccagag ctaaaaagct actgagggtc tacactcctg ggtatttcca aacatctccc 300 tcataccccc ccactcatcc cactcagatg agcctcttct ctgaagctca gattcagcag 360 tctctttcta gaaatgacca tctagaaatg aagttgaatt tcacaatgag aaagttgttc 420 ccgaaggcga tgggtcgggc aaaccttaag ttacagggtt tgccttgtcc tgtttcttga 480 tgtttgggga gctctggaga gtaaaggaaa gaaatgaagt tgcactaacc ttcagccgag 540 ttacaggcgt tttcgaggaa attaaaggtg gacagtgtcg taattcaatg aaggacaaag 600 tttccaagat ttttagaaaa gcaatgggga gtccagcctg tccaatctcc tccctgaaat 660 acagacacag gaagcttcag ggtttcttcc cgacagagat tcagctgggc atatgtagac 720 tcaccaggca ggcccttcca tgccttccct gtttgtctca ttggaaatga gtgggaagcc 780 tttaccaaac atagcactta aaatgaatgt ataaaagaaa tgacttgaaa caacagaaaa 840 taccacccat tgcactgtgt aaatccttgc agagagaaga tcctgcaaga ggaaagctag 900 tccatgaact catttaacat ttatgatgta atgaactggc ccctttgcta cagtgtaggt 960 ggagaggtca tttccatctt aggttaattc aggacctgag tatgaagact agagtatgaa 1020 aatacagcat tggaaccttc tcttgcattt ttttttcttg tggtgaaatt gccttttctt 1080 ttggtagagg ggaagaaagt agaagtcaag aatataaaat gagaaaacaa tcttccccct 1140 1140 <210> 14 <211> 1140 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 aaccagagtg gaaacatcac agtccatgct aggggctggc attccccctt ctgaattttt 60 aataaagagt taggcaacct cagagttggg agtgaaggga agagcttcca gatggatatt 120 gctgtggcca ggcctcggtg ctgccttgct ctggggacgg ctggaggctc gggctcctgg 180 agcccgctcc cactgcacgc agccctccgc gtctgaggca gcacagcaga gtaacgaacg 240 gcccggctcg ctcatggcaa tgacatcacc acaaagactg acacaagctg aagctatttt 300 tttttctcca agccttttat ctctaggcag tgcagtggag caaattgaac atgattatgt 360 gctaaatctg aactcagact aaatcaattc aagcagcgtt agctaggaac tgagtcatag 420 ctgttgttgc agccgagtgc ttatgtttgc aaaaagcagg agggggtgaa tctgacacca 480 gagtttcttc tttgaggtgg gggaggtgta attctgcaga tgagcctcct gaggttaagg 540 tttgacaatt ttctgccttc gagatgagca ggaagttgag gcattttgca aattgcttgg 600 cttctgttaa ttgctctgtg ccactcagag cagccacaca tgttctgggc atcctaatgc 660 atcccgggca tgggctgaat agaaatccgt tcttggagtg actaaagagc tggtcgtctg 720 tcatttaggg agcatggtaa gaggagataa ttagaggttt gtggaaattc tatttgaagg 780 ctataagtgc agaccagtaa cgctaagagc acccttccaa gctcaggatt tcaggctgtc 840 tccaaggtca ttcaaaccaa aagcagttca tggaaaggag ttacagcaaa tatttcacac 900 ggggacagat ggcagggtct aacgggcaaa ctcactgatg tgtctcagag cttgtcagat 960 cctcggggct tgacttcacc tgagactttg aacacatcct tttgctttct caggcttttt 1020 tcctgattat aaatccctga ggggcaaggc cacagatgat ttacctttat atcttcagtc 1080 tttcacagat tgcctggcac aagaagatga tacttgttta ataaataaat caatcaaaca 1140 1140 <210> 15 <211> 1114 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 agggccccga ggctcctcat ggctatgggc tcctctgcct tggtatatcc cacaggctcg 60 gtctagcaac agaagggcca ccgcctccct gcaacagggc agctgtgaac tgaggctggg 120 gaaggggcct gtggcttgta gttgacctca gtgtttgccc tgctcagctg gggccaatta 180 cagccccaag gacagctcca atcgatccct gtagcctggc tggggtcagc agtaccaaga 240 ggccgggatg gctgcttcag aagaggcatt ggccaagcac aatagggccc tggagcacca 300 ggattgggct ccgcccccca aaagtccccc acagagggca tgcgaggatg gggagcgacc 360 tggcctttct gctgagtcat gccatctgga cctcacagct ctgtgagcca gcaggtcaag 420 cctgattggg cccatttctc acaggaaaaa actgaggccc aaggagagga agtgacttgc 480 cagagacctc agggaagtct atgggcagag ccaagaccag aacccaggta tcctgtctcc 540 agagttcctt ctccagcccc caggcttgcc ctagcctttg caaataatag agacattaac 600 aatgatgact gttacgagct tccgttcact gagcacctgc tatgtgctgg ctgtgtacca 660 ggcactttac acgtgccaca ggtgtccagt aaatccccac aacaagctta cgaagtaggt 720 gctatttgtc ccctttacag gcagaggagt tgagtctcca agaagtgaag tgacttgccc 780 agaatccctc agccgggagt ggagtagctg ggaaaggcgt ggtagagacc atggacgtgg 840 gagccaggca gcctacagtg gcactcactg ctgtgtgacc ttgggcaagt cactttacct 900 ttcagtgcct tggtttcctc atctgtaaat ggggataata atagttccta gctcctagca 960 ttgttgagtg agcacctgca atgcgctagg acagtaccca gcatagagta agagctgagt 1020 gtttgtggtg ggttgaacag tgccccctcc agaatccatg tgcaccccga accgcagaat 1080 gaacctgatt tgcagatgtg attagttaga tgag 1114 <210> 16 <211> 1080 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 acattgctgg ggttgtcctg taaaagagaa aacctgtcac tcttcttcat agttaacttc 60 acagtcctaa ctatgaattt ctataaatcc tgcagacata attccacttc ctaaaaatac 120 ctagcccatg aattctgtct ccagaaagtt atgttcagac tgtggcttat aaaaataagt 180 ctgtgactta tgtaacattc tgcaaacaca acctaacttt tgtttgagac acaccaagtt 240 ctgactgttc tttctatcct ccaagaagaa agggataggc cgggtgtggt ggctcacgcc 300 tgtaatccca gcactttggg aggccgaggc tggcagatca cgatgtcagg agatcgagac 360 catcctggct aacacggtga aaccccttct ctactaaaat tatacaaaaa aaaaaaaaaa 420 attagccagg cttggtggca gacacctgta gtcccagcta ctcaggaggc tgaggcagga 480 gaatggtgtg aacccgggcg gtggagcttg cagtgagctg agatcgcgcc cctgcactcc 540 agcctgggcg acagaacgag actctgtctc aaaaaaaaaa aaacaaaaga agaagaagaa 600 agggataaat agagcattct gcacagaaat gaaaagagcc agcaaaaaaa gagaaccaag 660 gaaaaaagat gatggcagaa aagacagtat accaacatga atgtggctca tgtcgggccc 720 ttagctcttc aagttcaaac attctatatt tatctcttgg gtatggctcc cttttgtttc 780 tcttattcct tgaagtctgg ctgtatgtat ctaaccaagt agaaatatca cacatctgcc 840 ccctctacca tttaagactc tttgaaatcc acactcaatt agcctattta ttggaaagtt 900 cctatgacta gaaaattcct atgactagac agcactttct ttggtaaaaa gatgcttcct 960 ctgagcaacg aaattaaaat gcttttaaat acctgactag aaatatcctc aaaactaggg 1020 ctagctctct aaacagaaat gttcaaaaac aggtgaactg tagacaggtg ataaagaaaa 1080 1080 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 ccagtggccc attcagaagt c 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 ccacttctcg ggagccagag 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 ggatacacag tgtagcgatg ca 22 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 gctgcagttt tcaggagggt g 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 gcagtgaccc tggatcccag 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 ggtagcagtc tcctggaggt t 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 ccttcctctg tgccaaggga a 21 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 ggatgtgcag acgctgagca 20 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 cctaagatgg aaatgacctc tc 22 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 gggtgataac acactcagcc t 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 gctcttagcg ttactggtct g 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 ggcaacctca gagttgggag t 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 cctagcgcat tgcaggtgct 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 cctctgcctt ggtatatccc a 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 cgttgctcag aggaagcatc t 21 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 cctagcccat gaattctgtc tc 22

Claims

LAMA2, FABP4, GSTA2, STMN2, NR4A2, DSCR1L1, A2M 및 SEPP1로 구성된 군에서 선택되는 대장암 특이적 발현감소 유전자의 메틸화된 프로모터.
제1항에 있어서, 상기 LAMA2, FABP4, GSTA2, STMN2, NR4A2, DSCR1L1, A2M 및 SEPP1는 각각 서열번호 1 내지 8의 DNA 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 프로모터.
제1항에 있어서, 상기 프로모터는 적어도 하나의 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 프로모터.
제1항에 있어서, 상기 프로모터는 다음으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 메틸화된 프로모터.

(a) SEQ ID NO: 9의 766 내지 805 영역;

(b) SEQ ID NO: 9의 896 내지 935 영역;

(c) SEQ ID NO: 10의 201 내지 240 영역;

(d) SEQ ID NO: 11의 206 내지 245 영역;

(e) SEQ ID NO: 11의 556 내지 595 영역;

(f) SEQ ID NO: 11의 661 내지 700 영역;

(g) SEQ ID NO: 12의 1176 내지 1215 영역;

(h) SEQ ID NO: 13의 81 내지 120 영역;

(i) SEQ ID NO: 13의 121 내지 160 영역;

(j) SEQ ID NO: 14의 226 내지 265 영역;

(k) SEQ ID NO: 14의 646 내지 685 영역;

(l) SEQ ID NO: 15의 226 내지 265 영역;

(m) SEQ ID NO: 15의 776 내지 815 영역;

(n) SEQ ID NO: 16의 266 내지 305 영역; 및

(o) SEQ ID NO: 16의 476 내지 515 영역.
제4항에 있어서, 상기 프로모터는 서열번호 9 내지 16으로 표시되는 DNA 서열 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 메틸화된 프로모터.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 메틸화된 프로모터가 기질상에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 암 진단용 마이크로어레이.
제6항에 있어서, 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 메틸화된 프로모터를 함유하는 것을 특징으로 하는 암 진단키트.
제8항에 있어서, 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 진단키트.
서열번호 17/18, 서열번호 19/20, 서열번호 21/22, 서열번호 23/24, 서열번호 25/26, 서열번호 27/28, 서열번호 29/30, 및 서열번호 31/32로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 함유하는 프라이머 혼합물.
다음의 단계를 포함하는 임상샘플 유래 유전자의 프로모터 메틸화 여부를 검출하는 방법:

(a) 임상샘플에서 샘플 DNA를 분리하는 단계;

(b) 상기 분리된 샘플 DNA를 (i) 메틸화되지 않은 시토신 잔기를 변형시키는 시약, 또는 (ii) MspI, HpaII, BssHII, BstUI 및 NotI로 구성된 군에서 선택되는 메틸레이션 민감성 제한효소로 처리하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 처리된 DNA를 LAMA2, FABP4, GSTA2, STMN2, NR4A2, DSCR1L1, A2M 및 SEPP1로 구성된 군에서 선택되는 유전자의 프로모터에서 유래된 CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계; 및

(d) 상기 (c) 단계에서 증폭된 결과물의 존재 유무를 근거로 프로모터의 메틸화 여부를 결정하는 단계.
제11항에 있어서, 상기 임상샘플은 암 의심환자 또는 진단대상 유래의 조직, 세포, 가래, 대변, 소변, 세포막, 뇌수, 양수, 안구, 장기 또는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 메틸화되지 않은 시토신 잔기를 변형시키는 시약은 바이설파이트(bisulfite)인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 증폭하는 단계는 PCR인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머는 제10항의 프라이머 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 프라이머 혼합물은 서열번호 17 내지 32의 프라이머를 모두 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계의 증폭 결과물을 전기영동하여, mock DNA에서 PCR 결과물이 나타난 상태에서, HpaII로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 있는 경우는 프로모터가 메틸화된 것으로 결정하고, HpaII로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 없는 경우는 프로모터가 메틸화되지 않은 것으로 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계의 증폭 결과물을 제6항의 암 진단용 마이크로어레이와 하이브리다이제이션하여, mock DNA와 HpaII로 처리된 DNA에서 모두 하이브리다이제이션된 경우를 프로모터가 메틸화된 것으로 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.