TW201934758A

TW201934758A - 用以預斷吉特曼症候群的方法及套組

Info

Publication number: TW201934758A
Application number: TW107105320A
Authority: TW
Inventors: 楊松昇; 林石化; 鄭智仁; 黃哲群
Original assignee: 國防醫學院
Priority date: 2018-02-13
Filing date: 2018-02-13
Publication date: 2019-09-01
Also published as: TWI674320B

Abstract

本揭示內容關於一種用以預斷個體是否罹患吉特曼症候群(Gitelman's syndrome)或有罹患吉特曼症侯群之風險的方法。該方法包含：擴增一SLC12A3 基因片段；決定該SLC12A3 基因片段中是否存在一突變；以及基於該突變存在與否進行一預斷。本揭示內容亦提供一種用於透過前述方法預斷吉特曼症候群的套組。

Description

用以預斷吉特曼症候群的方法及套組

本揭示內容是關於預斷疾病的領域。更具體來說，本揭示內容是關於一種用以預斷一個體是否患有吉特曼症候群(Gitelman's syndrome，GS)或有罹患吉特曼症候群之風險的方法及套組。

吉特曼症候群是一種體染色體隱性腎小管遺傳性疾病，目前全球發病率約為1：40,000。罹患該疾病的生理表現包含低血鉀(hypokalemia)、代謝性鹼中毒(metabolic alkalosis)、低血鎂(hypomagnesemia)及低血鈣(hypocalciuria)。臨床上常見症狀包含嗜鹽(salt craving)、夜尿(nocturia)、強直發作(tetanic episodes)、感覺異常(paresthesias)及因麻痺導致的肌肉萎縮。

吉特曼症候群主要是由SLC12A3 基因的多種突變類型所導致，且該些突變基因型在不同人種族群中具有高度遺傳異質性(heterogeneity)，目前在華人族群中已被報導的突變位點已超過50種。然而，由於該些突變類型可能包含部分單對偶基因(uniallelic)突變或無法偵測的變異，再者，單一病患可能同時具有多個突變位點的組合，使得吉特曼症候群疾病的檢測具有一定難度，不僅增加誤診機率，亦導致確診的時間及金錢成本大幅增加。

因此，本發明所屬領域亟需發展一種檢測方法及套組，用以全面性快速地預斷罹患吉特曼症候群或是有罹患吉特曼症候群之風險的患者。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本發明之一態樣是關於一種吉特曼症候群的檢測方法。該方法係透過至少一引子對擴增SLC12A3 基因片段，加以篩出包含至少一突變的SLC12A3 基因片段，藉以快速準確地獲得吉特曼症候群的預斷及檢測結果。

具體來說，該種利用一個體之離體樣本來預斷該個體是否罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險的方法包含以下步驟： (a) 萃取該離體樣本之DNA； (b) 以步驟(a)之DNA作為模版，利用一第一引子對來擴增一第一SLC12A3 基因片段，其中該第一引子對包含一第一正向引子及一第一反向引子； (c) 決定該經擴增之第一SLC12A3 基因片段中是否包含一c.2881-2delAG的第一突變；以及 (d) 根據步驟(c)之結果來評估該個體是否罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險，其中若該經擴增之第一SLC12A3 基因片段包含該第一突變，則該個體罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險。

依據本揭示內容一特定實施方式，該第一正向引子及該第一反向引子分別具有序列編號：1及2之核苷酸序列。

依據本揭示內容一較佳實施方式，步驟(c)是利用一第一野生型探針及一第一突變型探針來決定該經擴增之第一SLC12A3 基因片段中是否包含該第一突變，其中該第一野生型探針及該第一突變型探針分別具有序列編號：35及36的核苷酸序列。

依據本揭示內容某些實施方式，在步驟(b)中，可更包含利用一第二引子對來擴增一第二SLC12A3 基因片段，藉以在步驟(c)中決定該經擴增之第二SLC12A3 基因片段中是否包含一選自由T60M、c.1670-191 C→T、S710X、T163M、c.2548+253 C→T、R871H、IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT、W844X、R83Q、H90Y、R642H、R642C、T649M、N442K、N640S及D486N所組成之群組的第二突變。其中該第二引子對包含一第二正向引子及一第二反向引子。

依據本揭示內容特定實施方式，當該第二突變是T60M時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：3及4之核苷酸序列；當該第二突變是c.1670-191 C→T時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：5及6之核苷酸序列；當該第二突變是S710X時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：7及8之核苷酸序列；當該第二突變是T163M時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：9及10之核苷酸序列；當該第二突變是c.2548+253 C→T時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：11及12之核苷酸序列；當該第二突變是R871H時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：13及14之核苷酸序列；當該第二突變是IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：15及16之核苷酸序列；當該第二突變是W844X時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：17及18之核苷酸序列；當該第二突變是R83Q時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：19及20之核苷酸序列；當該第二突變是H90Y時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：21及22之核苷酸序列；當該第二突變是R642H時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：23及24之核苷酸序列；當該第二突變是R642C時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：25及26之核苷酸序列；當該第二突變是T649M時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：27及28之核苷酸序列；當該第二突變是N442K時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：29及30之核苷酸序列；當該第二突變是N640S時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：31及32之核苷酸序列；或是當該第二突變是D486N時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：33及34之核苷酸序列。

依據本揭示內容較佳實施方式，步驟(c)是利用一第二野生型探針及一第二突變型探針來決定該經擴增之第二SLC12A3 基因片段中是否包含該第二突變。

在該些較佳實施方式中，當該第二突變是T60M時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：37及38之核苷酸序列；當該第二突變是c.1670-191 C→T時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：39及40之核苷酸序列；當該第二突變是S710X時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：41及42之核苷酸序列；當該第二突變是T163M時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：43及44之核苷酸序列；當該第二突變是c.2548+253 C→T時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：45及46之核苷酸序列；當該第二突變是R871H時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：47及48之核苷酸序列；當該第二突變是IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：49及50之核苷酸序列；當該第二突變是W844X時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：51及52之核苷酸序列；當該第二突變是R83Q時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：53及54之核苷酸序列；當該第二突變是H90Y時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：55及56之核苷酸序列；當該第二突變是R642H時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：57及58之核苷酸序列；當該第二突變是R642C時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：59及60之核苷酸序列；當該第二突變是T649M時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：61及62之核苷酸序列；當該第二突變是N442K時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：63及64之核苷酸序列；當該第二突變是N640S時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：65及66之核苷酸序列；當該第二突變是D486N時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：67及68之核苷酸序列。

依據本揭示內容的實施方式，本發明的離體樣本可選自由血液、血漿、組織液、唾液、淚液、眼球內液、尿液、淋巴液、脊髓液、宮頸液、陰道液及細胞組織所組成的群組。

本發明之另一態樣是關於一種吉特曼症候群的檢測套組。該套組包含至少一對可用以擴增SLC12A3 基因片段的引子對，以取得包含至少一突變的SLC12A3 基因片段，藉此可提高吉特曼症候群的檢測準確度及檢測效率。

依據本揭示內容實施方式，所述套組包含一用以擴增一第一SLC12A3 基因片段的第一引子對，其包含一具有序列編號：1之核苷酸序列的第一正向引子，以及一具有序列編號：2之核苷酸序列的第一反向引子。

依據本揭示內容的一實施方式，該套組更包含一具有序列編號：35之核苷酸序列的第一野生型探針，以及一具有序列編號：36之核苷酸序列的第一突變型探針。

依據本揭示內容的某些實施方式，該套組更包含一用以擴增一第二SLC12A3 基因片段的第二引子對，其包含：一具有序列編號：3之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：4之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：5之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：6之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：7之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：8之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：9之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：10之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：11之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：12之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：13之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：14之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：15之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：16之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：17之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：18之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：19之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：20之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：21之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：22之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：23之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：24之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：25之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：26之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：27之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：28之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：29之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：30之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：31之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：32之核苷酸序列的第二反向引子；或是一具有序列編號：33之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：34之核苷酸序列的第二反向引子。

在本揭示內容較佳實施方式中，該套組更可包含一第二野生型探針及一第二突變型探針，其中，當該第二引子對包含該具有序列編號：3之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：4之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：37及38之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：5之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：6之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：39及40之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：7之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：8之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：41及42之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：9之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：10之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：43及44之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：11之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：12之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：45及46之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：13之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：14之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：47及48之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：15之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：16之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：49及50之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：17之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：18之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：51及52之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：19之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：20之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：53及54之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：21之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：22之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：55及56之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：23之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：24之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：57及58之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：25之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：26之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：59及60之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：27之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：28之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：61及62之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：29之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：30之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：63及64之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：31之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：32之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：65及66之核苷酸序列；或是當該第二引子對包含該具有序列編號：33之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：34之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：67及68之核苷酸序列。

非必要性地，該第一野生型探針、該第一突變型探針、該第二野生型探針及該第二突變型探針可分別與一第一、一第二、一第三及一第四偵測標記連接，且該第一、該第二、該第三及該第四偵測標記可發出彼此相異的光波長。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

1. 定義

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」與「一或更多」等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本說明書與申請專利範圍中，「A、B及C其中至少一者」、「A、B或C其中至少一者」以及「A、B和/或C其中至少一者」係指涵蓋了僅有A、僅有B、僅有C、A與B兩者、B與C兩者、與C兩者、以及A、B與C三者。

雖然在此處利用「第一」、「第二、「第三」等詞彙來描述多種元件、部件、區域和/或區段，這些元件(以及部件、區域和/或區段)不受上述修飾詞的限制。此外，除非上下文有明示的說明，使用這些序數並未隱含序列或順序。反之，這些詞彙僅是用來區分各元件。因此，亦可將下文所述的第一元件命名為第二元件，而不會悖離例示性實施方式所揭示的內容。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

於一些實施方式中，本案的範圍亦涵蓋和任何所述序列具有至少90%序列相似度的任何序列，上述序列相似度較佳為至少93%或95%、更佳為至少98%。

本文使用的「基因」(gene)一詞表示一段具有功能性、含特定遺傳訊息的核苷酸序列(包含去氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)及核醣核酸(Ribonucleic acid，RNA))，其不僅包含可編碼出基因產物(RNA及蛋白質)的DNA區域，也包含用以調控的區域。舉例來說，調控的區域包含啟動子(promoter)、終止子(terminator)、轉譯調控序列(例如：核醣體結合位(ribosome binding site)以及內部核醣體進入位(internal ribosome entry site，IRES))、強化子(enhancer)、緘默子(silencer)、絕緣子(insulator)、邊界元素(boundary element)、複製起點(origins of replication)、基質結合位(matrix binding sites)及基因座控制區(locus control region，LCR)等。「基因」一詞更可以包含從mRNA轉錄本剪接出，以及來自選擇式剪接位(alternative splicing site)的所有內含子(intron)及其他DNA序列，以及其各種變異型。本文使用的「基因」或「基因片段」(gene fragment)一詞可包含一基因的任何部分或全部，特別可以是前述各DNA區域的任何部分。

「突變」(mutations)一詞是指在基因序列和該基因序列編碼出的胺基酸序列上的任何分子層次及組織層次的變化。從分子層次上看，突變可以是基因在結構上發生鹼基對組成或排列順序的改變，該些改變包含點突變(point mutation)、沉默突變(silent mutation)、誤義突變(missense mutation)、無意義突變(nonsense mutation)、缺失突變(deletion mutation)、框移突變(frameshift mutation)、插入突變(insertion mutation)、剪接位突變(splicing-site mutation)等。在本說明書中，「突變」包含同型突變(homozygous mutation)、異型突變(heterozygous mutation)、單對偶基因突變( uniallelic或 monoallelic mutation)及雙對偶基因突變(biallelic mutation)。本文使用的「突變型」(mutant type)一詞係包含前述所有突變種類的基因及/或蛋白質，以及具有該些突變基因及/或蛋白質的有機體或生物檢體。

本文使用的「野生型」(wild type)一詞係為一相對性的詞彙，意指相較於前述突變型而言，沒有前述突變的基因及/或蛋白質的有機體或生物檢體。同時，「野生型」一詞也可表示具有如野生自然所見之形式的基因組組成(genome make-up)之有機體或生物檢體，更可應用於形容細胞株及特定個別基因。因此，「野生型」一詞可排除經人為使用重組方法(recombinant method)對基因序列作至少部分變更的基因、或含有前述變更的有機體及生物檢體。

在本揭示內容中，「多核苷酸」(polynucleotide)「核苷酸序列」或「核酸序列」(nucleic acid sequence)是指RNA、DNA或其組合之單股或雙股聚合物，解讀方向是由5'到3'端。在本揭示內容中，「多核苷酸」可包含一或多經修飾的核苷酸殘基，且可作為引子或探針。

本文所使用的「引子」(primer) 一詞是指能夠與目標核酸序列(舉例來說，待擴增的DNA模板)雜合(hybridize)的寡核苷酸(oligonucleotide)，並可作為聚合酶開始進行擴增的反應起點。「引子」可包括經修飾後的寡核苷酸，像是經生物素化(biotinylation)、磷酸化(phosphorylation)或添加鎖核酸(locked nucleic acids，LNA))修飾的寡核苷酸。「引子」可以是單股或雙股。本文使用的「引子對」(primer pair)是指一組或一對引子，其包含與待擴增序列之5’端上游序列(upstream sequence)互補且雜合的「正向引子」(forward primer)以及與待擴增序列之3’端下游序列(downstream sequence)互補並雜合的「反向引子」(reverse primer)。本發明所屬領域具有通常知識者應理解，本文使用「正向引子」及「反向引子」並非用以限制該引子，而僅是提供示例性的方向。

本說明書中，「專一性引子」(specific primer)一詞是指能夠與待擴增序列特異性或專一性地結合或雜合的引子。在本揭示內容某些實施方式中，該些專一性引子的長度為約10-35個核苷酸的多核苷酸序列，較佳地為17-27個核苷酸的多核苷酸序列。

本文使用的「探針」(probe)一詞，是指一單股多核苷酸，其可與一互補的單股標的序列進行雜合，以形成一雙股分子(雜合體)。在本揭示內容的某些實施方式中，「探針」可與互補的單股經擴增之基因片段進行雜合。本說明書中，「專一性探針」(Specific probe)是指可以與單股標的序列特異性或專一性地互補結合或雜合的探針。在本揭示內容某些實施方式中，該些專一性探針的長度為約10-25個核苷酸的寡核苷酸片段，較佳地為12-20個核苷酸的多核苷酸序列。

本揭示內容中，「雜合」(hybridize或hybridization)一詞是指任何涉及核酸之一股藉由鹼基配對結合至一互補股的反應。一般來說，雜合及雜合強度(即核酸之間的結合強度)會受到以下因素影響：核酸之間的互補程度、反應條件、形成雜合體的Tm值及核酸內的G:C比例。「專一性地雜合」或「特異性地雜合」(hybridizing specifically)是指兩核酸分子之間，其核苷酸序列彼此具有高度準確的互補性(complementarity)的結合反應。高度準確的互補性可以為約90%以上的互補性，較佳為約95%以上的互補性，更佳為約99%以上的互補性。

本文使用的「模版」(template)一詞是指待擴增的任何類型之核酸分子，較佳為待擴增的DNA序列，亦可稱為DNA模版。本揭示內容的「核酸模版」或「DNA模版」至少包含部分或完整的單股核酸序列或單股DNA序列。在對核酸模版進行的雜合反應中，所得到的複合物可包括單股分子和雙股分子。

本文所使用的「偵測標記」(label) 一詞可包含能夠發出訊號的任何合適實體。在該情況下，該訊號可以是任何物理訊號、化學訊號或生物訊號。在本揭示內容中，較佳的訊號是電磁波。當被電磁波(特別是光)的激態激發時，可發射冷光(photoluminescence)的光致發光(photoluminescent)標記是較佳的偵測標記。具體而言，螢光標記及光致發光標記可包含螢光染劑、金屬及半導體奈米顆粒。依據本揭示內容的某些實施方式，較佳的螢光標記可包含螢光染劑。

此外，被標記的雜合體數量並不受任何特定的限制，且可根據預期目的而適當的決定。被標記的數量至少為一個，且可以是兩個、三個或以上。同樣地，標記的位置也不受任何特定限制，可能的標記位置包括其末端。當雜合體為多核苷酸或寡核苷酸時，偵測標記的位置可以在例如5’端及/或3’端，但不排除其他位置的可能。在本揭示內容的某些實施方式中，偵測標記可以以共價結合或非共價結合的方式與雜合體連接。在本揭示內容的一實施方式中，偵測標記可透過聚合酶與寡核苷酸連接。

本文使用的「預斷」(prognosis)一詞是表示，致力於獲得有助於評估，與平均值或比較個體(健康個體或有相似症狀的個體)相較，一病患不論於過去、診斷的當下或未來是否有可能或極有可能患有特定疾病或病症之資訊，藉此以找出疾病的發展情況或未來可能的發展情況，或用以評估病患對特定療程的反饋，舉例來說，投予合適的藥物(例如可在病症發生前，對有罹患吉特曼症候群之風險的個體投予延緩或預防疾病發生之藥物；或可於吉特曼症候群之病症緩和之後仍持續投予以延緩或預防吉特曼症候群復發之藥物)。因此，在本揭示內容的實施方式中，「預斷」不僅僅包含一般所知的診斷，還包含監測疾病或病症的過程及/或預測患病風險。

「病徵」(condition)、「疾病」(disease)及「病症」(disorder)在本揭示內容為可互換的詞彙。

本文中「個體」(subject)與「病患」(patient)可交替使用。「個體」(subject)一詞泛指一人類個體(即任何年齡的男性或女性，例如嬰兒、幼兒或青少年之小兒科個體，或是青年、中年或老年的成人個體)。「病患」(patient)泛指有需要治療一疾病的人類個體。依據本揭示內容，「個體」或「病患」是指罹患吉特曼症候群、疑似罹患吉特曼症候群以及具有罹患吉特曼症候群之風險的人類個體。依據本發明較佳實施方式，個體可以是具有與臨床上吉特曼症候群之病徵表現相同的病患、該病患的親屬或是沒有任何病徵症狀的健康個體。

本文使用的「離體樣本」(sample)一詞是從前述「個體」或「病患」分離出且經離體處理或培養的受測檢體。「離體樣本」可包含分離的體液、淋巴結樣本或組織樣本，特別是可能包含個體基因片段的生物樣本。依據本揭示內容的實施方式，離體樣本可包含血液、血漿、血球、組織液、唾液、淚液、眼球內液、尿液、淋巴液、脊髓液、宮頸液、陰道液、脊髓液樣本及細胞組織(例如：肌肉組織切片或腎臟組織切片)等檢體。

本文使用的「套組」(kit)可包含本發明的至少一引子對以及一容器(例如微量離心管、小瓶、安瓶、瓶罐、注射器及/或分配器包裝，或是其他適當的容器)。在本揭示內容的某些實施方式中，本發明的套組是指實施方式中所必須的材料、試劑及操作說明的各種組合。

2. 預斷吉特曼症候群之方法

吉特曼症候群的致病原因是SLC12A3 基因上的突變所導致。目前在全球已知超過400種SLC12A3 基因的突變，而該些突變基因型在不同人類組群中具有高度遺傳異質性。發明人針對華人族群的吉特曼症候群患者進行研究，發現在華人族群中，具有較高基因型頻率(genotype frequency)的突變基因型就超過50種，其中亦包含具族群特異性之突變型(即，該突變型僅存在於華人族群中)。

另一方面，發明人亦發現，大多數吉特曼症候群患者同時攜帶兩個不同等位基因的兩個不同突變，並呈現異型合子基因型。此外，有為數不少的(大約10%-15%)的病患甚至攜帶三種SLC12A3 基因突變的遺傳訊息；僅不到10%的病患是僅攜帶一個異型突變。由此可知，SLC12A3 基因在族群中複雜的突變表現模式提高臨床上對於吉特曼症候群的檢測難度，導致增加確診的時間及金錢成本。因此，勢必需要發展出更具檢測效率及準確率的檢測技術，以解決前述問題。本發明提供可擴增SLC12A3 基因片段的至少一專一性引子對，以取得包含至少一突變的SLC12A3 基因片段，藉此可提高吉特曼症候群的檢測準確度及檢測效率。本發明提出的檢測方法亦提供了一種可靠的檢測方法，可以專一性地擴增SLC12A3 基因片段，加以篩出包含至少一突變的SLC12A3 基因片段，藉以快速準確地獲得吉特曼症候群的預斷及檢測結果。

有鑑於上述目的，本發明第一態樣提供一種吉特曼症候群的檢測方法。該方法主要是利用一個體之離體樣本，來預斷該個體是否罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險。本發明方法包含以下步驟： (a) 萃取該離體樣本之DNA； (b) 以步驟(a)之DNA作為模版，利用一第一引子對來擴增一第一SLC12A3 基因片段，其中該第一引子對包含一第一正向引子及一第一反向引子； (c) 決定該經擴增之第一SLC12A3 基因片段中是否包含一c.2881-2delAG的第一突變；以及 (d) 根據步驟(c)之結果來評估該個體是否罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險，其中若該經擴增之第一SLC12A3 基因片段包含該第一突變，則該個體罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險。其中，當該第一突變是c.2881-2delAG時，則第一正向引子及第一反向引子分別具有序列編號：1及2之核苷酸序列。

在實施本發明方法時，首先須從一個體取得其離體樣本之DNA(步驟(a))。依據某些特定實施方式，是從一罹患或疑似罹患吉特曼症候群的病患身上取得離體樣本，如周邊血液之全血液樣本或血球樣本，較佳為白血球。依據其他特定實施方式，則是從健康的人類個體身上取得離體樣本。接著，可利用任何本領域具有通常知識者熟知的方法從所取得的離體樣本中(例如白血球)萃取該個體的基因體DNA(genomic DNA)。萃取DNA的方法可包含首先利用物理作用、化學作用或溫差方式使細胞膜裂解；接著加入有機溶劑以純化細胞內的核酸。前述物理作用實例包含但不限於，超聲波震盪或研磨。化學作用包含利用細胞裂解緩衝液來裂解細胞膜。一般而言，細胞裂解緩衝液可含有酸(如，HCl、乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA))、界面活性劑(如，十二基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS))、鹽類(如，NaCl)及蛋白酶等成分，用以使細胞膜裂解。前述溫差方式包括將細胞於20℃之溫度差的環境下反覆冰凍及解凍，藉以使細胞膜破裂。接著，可添加乙醇或異丙醇來純化從細胞中釋放出的核酸。另一方面，也可以藉由商業化套組來達到相同的DNA萃取目的。適用於本發明的商業化基因體DNA萃取套組包含但不限於：DNeasy 血液及組織套組(供應商：Qiagen)、Puregene血液套組(供應商：Qiagen)、DNAzol™ 試劑(供應商：Thermo Fisher)、PureLink™ 基因體DNA迷你套組(供應商：Thermo Fisher)、PureLink™ 前96 基因體DNA純化套組(供應商：Thermo Fisher)及InstaGene™ Matrix (供應商：Bio-Rad)。依據本揭示內容一實施方式，是利用Puregene血液套組(供應商：Qiagen)萃取白血球基因體DNA。

接著，在步驟(b)中，以步驟(a)中萃取出的DNA作為擴增模版，並以至少一引子對來擴增至少一基因片段。在本揭示內容的某些實施方式中，步驟(b)是利用第一引子對來擴增第一SLC12A3 基因片段，其中第一引子對包含第一正向引子及第一反向引子。在此步驟中，擴增係指選擇性地增加特異蛋白質編碼基因的複製數量，而其他基因則未按比例增加的過程。本揭示內容的擴增是針對SLC12A3 基因或SLC12A3 基因片段進行複製放大。藉由第一引子對與作為模版的DNA互補雜合，以作為DNA聚合酶的核苷酸延伸起點。依據本揭示內容的實施方式，可根據任何本領域具有通常知識者熟知的方法執行擴增反應，例如：聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)。依據本實施例的一實施方式，是以PCR對第一SLC12A3 基因片段進行擴增反應。

在步驟(c)中，判定步驟(b)中經擴增之至少一SLC12A3 基因片段是否包含至少一突變，例如 c.2881-2delAG之突變判定是否包含突變的方法包含以諸如凝膠電泳法、基因定序以或DNA雜合反應等方法分析步驟(b)中經擴增後的核苷酸產物，以確認該經擴增的SLC12A3 基因片段中是否包含特定突變型的資訊。舉例來說，可將經PCR擴增後的基因片段產物分離出來，並透過定序、核苷酸長度判定等序列分析，來確認從離體樣本取得之DNA模版是否帶有突變型基因片段。

接著，在步驟(d)中，根據步驟(c)的結果來評估該個體是否罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險。具體而言，若經擴增的第一SLC12A3 基因片段包含至少一突變，則該個體可能罹患吉特曼症候群、或是具有罹患吉特曼症候群之風險。

依據本揭示內容的某些任選實施的實施方式，在步驟(c)中，亦可利用探針進行DNA雜合反應來決定經擴增之第一SLC12A3 基因片段中是否包含第一突變。在本揭示內容的一實施方式中，所述探針包含第一野生型探針以及第一突變型探針。所述探針可與目標第一SLC12A3 基因片段互補雜合形成雜合體。在本實施方式中，第一野生型探針是可以與不具有第一突變(即野生型)的第一SLC12A3 基因片段彼此互補結合的探針；第一突變型探針則是能夠與可能包含第一突變之第一SLC12A3 基因片段彼此互補結合的探針。透過野生型探針及突變型探針的設計，可以獲得經擴增的SLC12A3 基因片段中是否包含特定突變型的資訊。換句話說，當突變型探針與經擴增之一SLC12A3 基因片段專一性雜合時，即表示該SLC12A3 基因片段應包含對應的一突變。因此，當第一突變型探針與第一SLC12A3 基因片段形成雜合體時，即表示該第一SLC12A3 基因片段應包含對應的第一突變。如此一來，可根據雜合結果在後續步驟(d)中評估該個體是否罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險。

依據本揭示內容另一任選實施的實施方式，在步驟(b)中，更包含利用第二引子對來擴增第二SLC12A3 基因片段，藉以在步驟(c)中決定經擴增之第二SLC12A3 基因片段中是否包含第二突變，其中第二引子對包含第二正向引子及第二反向引子。相似地，藉由第二引子對與作為模版的DNA互補雜合，以作為DNA聚合酶的核苷酸延伸起點，以針對SLC12A3 基因或其基因片段進行DNA複製擴增。

依據本揭示內容另一任選實施的實施方式，步驟(c)可更包含利用一第二野生型探針及一第二突變型探針來決定經擴增的第二SLC12A3 基因片段中是否包含第二突變。同樣地，第二野生型探針是可以與不具有第二突變(即野生型)的第二SLC12A3 基因片段互補結合的探針；第二突變型探針則是能夠與包含第二突變之第二SLC12A3 基因片段互補結合的探針。透過第二野生型探針及第二突變型探針與第二SLC12A3 基因片段的專一性設計，可以獲得經擴增的SLC12A3 基因片段中是否包含特定突變型的資訊。總結來說，當第二突變型探針與經擴增之第二SLC12A3 基因片段呈現專一性雜合時，即表示該第二SLC12A3 基因片段應包含對應的一第二突變。如此一來可根據雜合結果在後續步驟(d)中評估該個體是否罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險。

承前所述，適用於本發明的探針種類可包含但不限於：TaqMan®探針、分子信標探針(Molecular Beacon probe)、LNA ®探針及Scorpion® 探針等。本技術領域中具通常知識者可依據實際需求選擇適合的探針類型。在一較佳實施方中，探針是TaqMan®探針。

依據本揭示內容之一實施方式，在步驟(c)中，為了便於決定探針與經擴增之SLC12A3 基因片段之間的雜合情形，所述探針更可與至少一偵測標記連接，透過該偵測標記所提供的訊號而得知探針與經擴增SLC12A3 基因片段之間是否成功形成雜合體。具體而言，在一實施方式中，第一野生型探針、第一突變型探針、第二野生型探針及第二突變型探針可分別與第一偵測標記、第二偵測標記、第三偵測標記及第四偵測標記連接。同時，第一偵測標記、第二偵測標記、第三偵測標記及第四偵測標記發出訊號可彼此相異，以便於區別不同雜合體。在一實施方式中，偵測標記可以是螢光標記，訊號可以是光訊號。在又一實施方式中，第一、第二、第三及第四偵測標記可分別發出不同波長的光。較佳地，該些光的波長可分別為介於550 nm至560 nm之間、575 nm至585 nm之間、610 nm 至620 nm之間，以及650 nm至660 nm之間。在一實施方式中，該些偵測標記可發出分別為517 nm、551 nm、580 nm及617 nm之光波長。同時，這裡所列舉之光波長僅為例示性非限制性者，光訊號之顏色不以此為限。適用於本發明方法的偵測標記包含，但不限於：VIC^TM 、FAM^TM 、JUN^TM 、ABY^TM 、HEX^TM 、NED^TM 、TAMRA^TM 、SYBR® Green、Texas Red®等。較佳地，該偵測標記為VIC^TM 、FAM^TM 、JUN^TM 及ABY^TM 。

根據偵測標記提供的訊號，可確知第一突變型探針與經擴增之第一SLC12A3 基因片段，及第二突變型探針與經擴增之第二SLC12A3 基因片段是否各自呈現專一性雜合。當第一突變型探針及/或第二突變型探針分別與經擴增之第一SLC12A3 基因片段及/或第二SLC12A3 基因片段呈現專一性雜合時，即表示該第一SLC12A3 基因片段及/或第二SLC12A3 基因片段應包含對應的第一突變及/或第二突變。反之，若第一野生型探針與經擴增之第一SLC12A3 基因片段，以及/或是第二野生型探針與經擴增之第二SLC12A3 基因片段呈現專一性雜合反應，則表示該第一SLC12A3 基因片段及/或第二SLC12A3 基因片段不包含對應的第一突變及/或第二突變。藉此，在後續的步驟(d)中，即可利用偵測標記提供的訊號來評估該個體是否罹患吉特曼症候群或具有罹患吉特曼症候群之風險。

3.SLC12A3 基因之突變的專一性引子對及探針

依據本揭示內容的某些實施方式，SLC12A3 基因片段所包含的突變可包含，但不限於：A13P、D26G、T60M、R83Q、H90Y、R145C、T163M、P213S、L215P、H234Q、L245P、IVS6-1G＞A、c.835-836ins15bp、S283Y、T304M、IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT、R334W、G403E、N426K、N442K、N426Y、c.1421delT、D486N、A514V、S614L、N640S、IVS15+2 T＞G、R642H、R642C、T649M、IVS16-1 G＞A、L671R、S710X、c.2069delA、W844X、L858H、R871H、G876S、IVS22+1 G＞A、L892P、R896X、c.2881-2delAG、P947S、R974W、R977X、R1011K、c.1670-191C→T及c.2548+253C→T。

本發明SLC12A3 基因為一種蛋白質編碼基因，其位於人類第16條染色體上，基因體序列為NC_000016.10(56865207..56915850)，其Gene ID為6559 (詳細內容請參閱GeneBank，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6559，更新日期：2018年1月27日)。本發明SLC12A3 基因片段所包含的前述突變可以是點突變、誤義突變、無意義突變、缺失突變、框移突變、插入突變及剪接位突變等。具體而言，誤義突變係指由於某一鹼基對的改變，使編碼特定胺基酸的密碼子變成編碼另外一種胺基酸的密碼子，進而使整體蛋白質構型發生變化。舉例來說，本領域技術所述具有通常知識者可理解本發明之SLC12A3 基因片段所包含的突變A13P、D26G及T60M均為誤義突變，其中A13P即表示胺基酸序列第13個殘基之處的丙胺酸(Alanine，縮寫為A)突變成脯胺酸(Proline，縮寫為P)；相似地，突變D26G即表示胺基酸序列第26個殘基之處的天冬胺酸(Aspartic acid，縮寫D)突變成甘胺酸(Glycine，縮寫G)；而突變T60M表示胺基酸序列第60個殘基之處的酪胺酸(Tyrosine，縮寫T)突變成甲硫胺酸(Methionine，縮寫M)。所屬技術領域中具有通常知識者均可以此類推，以理解本發明的SLC12A3 基因片段的誤義突變位點，故不一一贅述。另一方面，本領域技術所述具有通常知識者可理解插入突變係指在原有正常核苷酸序列中插入一段長短不等的核苷酸序列，舉例來說，本發明SLC12A3 基因片段可能包含的突變c.835-836ins15bp，係表示從第835個密碼子至第836個密碼子之間有15個鹼基對(序列為：TTGGCGTGGTCTCGG)的插入突變。另外，本發明SLC12A3 基因片段包含的IVS6-1G＞A、IVS15+2 T＞G、IVS16-1 G＞A、IVS22+1 G＞A、c.1670-191C→T及c.2548+253C→T等點突變，在此例示性說明，突變IVS6-1G＞A是在第6個內含子前1個鹼基對(-1)位置的核苷酸，從原本的鳥嘌呤突變為腺嘌呤；突變IVS15+2 T＞G是在第15個內含子內，後2個鹼基對(+2)位置的核苷酸，由原本的胸腺嘧啶(Thymine，縮寫為T)的突變成鳥嘌呤。是以，本領域技術所述具有通常知識者可類比推理該些突變均係發生於內含子的特定鹼基對位置的點突變，故不一一贅述。另一方面，突變c.1670-191C→T，是指在第1670個密碼子之前第191個鹼基對(-191)的位置，發生胞嘧啶(Cytosine，縮寫C)變成胸腺嘧啶的突變。至於缺失突變，係指DNA上丟失一段鹼基對序列。以突變c.1421delT、c.2069delA及c.2881-2delAG為例，本領域技術所述具有通常知識者可藉由該記載方式理解，突變c.1421delT是指在第1421個密碼子丟失一個胸腺嘧啶；突變c.2069delA係指在第2069個密碼子丟失一個腺嘌呤；而是c.2881-2delAG係指第2881個密碼子之處，缺失腺嘌呤及鳥嘌呤兩個鹼基對。另外，以IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT而言，係表示該突變是在第7個內含子前1個位置(-1)的核苷酸，原本為鳥嘌呤(Guanine，縮寫為G)變成腺嘌呤(Adenine，簡稱A)之點突變，加上第971個核苷酸之處缺失一段CGGACATTTTT之核苷酸序列，並有一段ACCGAAAATTTT的插入序列。是以，前述突變的命名及記載方式均可被本領域具有通常知識者以邏輯類比推理得知，故不一一詳細贅述。

本發明SLC12A3 基因片段包含之突變與其對應之引子對及探針之序列請參閱表1。表1：本發明之SLC12A3 基因片段包含之突變及其對應之引子對與探針之核苷酸序列

依據本揭示內容的某些實施方式，第一突變以及第二突變分別選自由c.2881-2delAG、T60M、c.1670-191C→T、S710X、T163M、c.2548+253 C→T、R871H、IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT、W844X、R83Q、H90Y、R642H、R642C、T649M、N442K、N640S及D486N所組成之群組。

本揭示內容的某些實施方式中，第一突變係選自由c.2881-2delAG、c.1670-191C→T以及 IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT所組成之群組；第二突變係選自由T60M、S710X、T163M、c.2548+253C→T、R871H、W844X、R83Q、H90Y、R642H、R642C、T649M、N442K、N640S及D486N所組成之群組。

在本揭示內容的某些實施方式中，第一突變為c.2881-2delAG；第二突變係選自由T60M、c.1670-191C→T、S710X、T163M、c.2548+253 C→T、R871H、IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT、W844X、R83Q、H90Y、R642H、R642C、T649M、N442K、N640S及D486N所組成之群組。

依據本揭示內容的一實施方式，當第一突變為c.2881-2delAG時，前述步驟(b)中使用的第一正向引子具有序列編號：1之核苷酸序列；第一反向引子具有序列編號：2之核苷酸序列。在另一實施方式中，步驟(c)使用的第一野生型探針具有序列編號：35之核苷酸序列；而第一突變型探針具有序列編號：36之核苷酸序列。

詳言之，具有序列編號：1之核苷酸序列的第一正向引子及具有序列編號：2之核苷酸序列的第一反向引子所組成的第一引子對，可專一性結合至DNA模版上的一SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋第24個外顯子中第2881密碼子之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用具有序列編號：35之核苷酸序列的第一野生型探針以及具有序列編號：36之核苷酸序列的第一突變型探針對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第一突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第一突變c.2881-2delAG。藉此，可根據該雜合結果來評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

依據本揭示內容的某些實施方式，在相同個體之DNA模版的第二SLC12A3 基因片段可額外地或選擇性地更包含第二突變。第二突變可包含T60M、c.1670-191C→T、S710X、T163M、c.2548+253 C→T、R871H、IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT、W844X、R83Q、H90Y、R642H、R642C、T649M、N442K、N640S及D486N其中至少一者。可利用第二引子對針對第二SLC12A3 基因片段進行擴增，以在步驟(c)中以第二野生型探針及第二突變型探針決定經擴增之第二SLC12A3 基因片段是否包含具有前述的第二突變。

依據本揭示內容之實施方式，當第二突變是T60M時，第二正向引子具有序列編號：3之核苷酸序列，第二反向引子具有序列編號：4之核苷酸序列；同時，第二野生型探針具有序列編號：37之核苷酸序列，且第二突變型探針具有序列編號：38之核苷酸序列。具體而言，第二正向引子(序列編號：3)及第二反向引子(序列編號：4)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第1個外顯子的T60M之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用第二野生型探針(序列編號：37)以及第二突變型探針(序列編號：38)對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變T60M。當可想見，可根據該雜合結果來評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

在本揭示內容之一實施方式，當第二突變是c.1670-191 C→T時，第二正向引子具有序列編號：5之核苷酸序列，第二反向引子具有序列編號：6之核苷酸序列；同時，第二野生型探針具有序列編號：39之核苷酸序列，且第二突變型探針具有序列編號：40之核苷酸序列。具體而言，第二正向引子(序列編號：5)及第二反向引子(序列編號：6)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第13個內含子的c.1670-191 C→T之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用第二野生型探針(序列編號：39)以及第二突變型探針(序列編號：40)對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變c.1670-191 C→T。藉此，可根據該雜合結果來評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

在本揭示內容之一實施方式，當第二突變是S710X時，第二正向引子具有序列編號：7之核苷酸序列，第二反向引子具有序列編號：8之核苷酸序列；同時，第二野生型探針具有序列編號：41之核苷酸序列，而第二突變型探針則具有序列編號：42之核苷酸序列。具體而言，第二正向引子(序列編號：7)及第二反向引子(序列編號：8)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第17個外顯子的S710X之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用第二野生型探針(序列編號：41)以及第二突變型探針對(序列編號：42)經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變S710X。藉此，可根據該雜合結果來評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

在本揭示內容之一實施方式，當第二突變是T163M時，第二正向引子具有序列編號：9之核苷酸序列，第二反向引子具有序列編號：10之核苷酸序列；同時，第二野生型探針具有序列編號：43之核苷酸序列，而第二突變型探針具有序列編號：44之核苷酸序列。具體而言，第二正向引子(序列編號：9)及第二反向引子(序列編號：10)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第3個外顯子的T163M之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用第二野生型探針(序列編號：43)以及第二突變型探針(序列編號：44)對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變T163M。當可想見，可根據前述雜合結果以評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

在本揭示內容之一實施方式，當第二突變是c.2548+253 C→T時，則第二正向引子具有序列編號：11之核苷酸序列，且第二反向引子具有序列編號：12之核苷酸序列；同時，第二野生型探針具有序列編號：45之核苷酸序列，而第二突變型探針則具有序列編號：46之核苷酸序列。具體而言，由第二正向引子(序列編號：11)及第二反向引子(序列編號：12)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第21個內含子的c.2548+253 C→T之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，第二野生型探針(序列編號：45)以及第二突變型探針(序列編號：46)對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變c.2548+253 C→T。當可想見，可根據前述雜合結果以評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

在本揭示內容之一實施方式，當第二突變是R871H時，則第二正向引子具有序列編號：13之核苷酸序列，且及第二反向引子具有序列編號：14之核苷酸序列；同時，第二野生型探針具有序列編號：47之核苷酸序列，且第二突變型探針具有序列編號：48之核苷酸序列。具體而言，第二正向引子(序列編號：13)及第二反向引子(序列編號：14)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第22個外顯子的R871H之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用第二野生型探針(序列編號：47)以及第二突變型探針(序列編號：48)對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變R871H。當可想見，可根據前述雜合結果以評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

在本揭示內容之一實施方式，當第二突變是IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT時，則第二正向引子具有序列編號：15之核苷酸序列，第二反向引子具有序列編號：16之核苷酸序列；同時，第二野生型探針具有序列編號：49之核苷酸序列，且第二突變型探針具有序列編號：50之核苷酸序列。具體而言，第二正向引子(序列編號：15)及第二反向引子(序列編號：16)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第8個外顯子的IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用第二野生型探針(序列編號：49)以及第二突變型探針(序列編號：50)對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT。當可想見，可根據前述雜合結果以評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

在本揭示內容之一實施方式，當第二突變是W844X時，則該第二正向引子具有序列編號：17之核苷酸序列，第二反向引子具有序列編號：18之核苷酸序列；同時，第二野生型探針有序列編號：51之核苷酸序列，且第二突變型探針具有序列編號：52之核苷酸序列。具體而言，第二正向引子(序列編號：17)及第二反向引子(序列編號：18)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第21個外顯子的W844X之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用第二野生型探針(序列編號：51)以及第二突變型探針(序列編號：52)對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變W844X。當可想見，可根據前述雜合結果以評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

在本揭示內容之一實施方式，當第二突變是R83Q時，則第二正向引子具有序列編號：19之核苷酸序列，第二反向引子具有序列編號：20之核苷酸序列；同時，第二野生型探針具有序列編號：53之核苷酸序列，而第二突變型探針具有序列編號：54之核苷酸序列。具體而言，第二正向引子(序列編號：19)及第二反向引子(序列編號：20)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第1個外顯子的R83Q之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用第二野生型探針(序列編號：53)以及第二突變型探針(序列編號：54)對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變R83Q。當可想見，可根據前述雜合結果以評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

在本揭示內容之一實施方式，當第二突變是H90Y時，則第二正向引子具有序列編號：21之核苷酸序列，第二反向引子具有序列編號：22之核苷酸序列；同時，第二野生型探針具有序列編號：55之核苷酸序列，而第二突變型探針具有序列編號：56之核苷酸序列。具體而言，第二正向引子(序列編號：21)及第二反向引子(序列編號：22)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第1個外顯子的H90Y之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用第二野生型探針(序列編號：55)以及第二突變型探針(序列編號：56)對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變H90Y。當可想見，可根據前述雜合結果以評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

在本揭示內容之一實施方式，當第二突變是R642H時，則第二正向引子具有序列編號：23之核苷酸序列，而第二反向引子具有序列編號：24之核苷酸序列；同時，第二野生型探針具有序列編號：57之核苷酸序列，而第二突變型探針具有序列編號：58之核苷酸序列。具體而言，第二正向引子(序列編號：23)及第二反向引子(序列編號：24)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第15個外顯子的R642H之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用第二野生型探針(序列編號：57)以及第二突變型探針(序列編號：58)對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變R642H。當可想見，可根據前述雜合結果以評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

在本揭示內容之一實施方式，當第二突變是R642C時，則第二正向引子具有序列編號：25之核苷酸序列，而第二反向引子具有序列編號：26之核苷酸序列；同時，第二野生型探針具有序列編號：59之核苷酸序列，第二突變型探針具有序列編號：60之核苷酸序列。具體而言，第二正向引子(序列編號：25)及第二反向引子(序列編號：26)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第15個外顯子的R642C之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用第二野生型探針(序列編號：59)以及第二突變型探針(序列編號：60)對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變R642C。藉此，可根據前述雜合結果以評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

在本揭示內容之一實施方式，當該第二突變是T649M時，則第二正向引子具有序列編號：27之核苷酸序列，而第二反向引子具有序列編號：28之核苷酸序列；同時，第二野生型探針具有序列編號：61之核苷酸序列，第二突變型探針具有序列編號：62之核苷酸序列。具體而言，第二正向引子(序列編號：27)及第二反向引子(序列編號：28)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第16個外顯子的T649M之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用第二野生型探針(序列編號：61)以及第二突變型探針(序列編號：62)對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變T649M。藉此，可根據前述雜合結果以評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

在本揭示內容之一實施方式，當該第二突變是N442K時，則該第二正向引子具有序列編號：29之核苷酸序列，而第二反向引子具有序列編號：30之核苷酸序列；同時，第二野生型探針具有序列編號：63之核苷酸序列，第二突變型探針具有序列編號：64之核苷酸序列。具體而言，第二正向引子(序列編號：29)及第二反向引子(序列編號：30)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第10個外顯子的N442K之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用第二野生型探針(序列編號：63)以及第二突變型探針(序列編號：64)對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變N442K。藉此，可根據前述雜合結果以評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

在本揭示內容之一實施方式，當該第二突變是N640S時，則該第二正向引子具有序列編號：31之核苷酸序列，而第二反向引子具有序列編號：32之核苷酸序列；同時，第二野生型探針具有序列編號：65之核苷酸序列，且第二突變型探針具有序列編號：66之核苷酸序列。具體而言，第二正向引子(序列編號：31)及第二反向引子(序列編號：32)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第15個外顯子的N640S之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用第二野生型探針(序列編號：65)以及第二突變型探針(序列編號：66)對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變N640S。藉此，可根據前述雜合結果以評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

在本揭示內容之一實施方式，當該第二突變是D486N時，則該第二正向引子具有序列編號：33之核苷酸序列，第二反向引子具有序列編號：34之核苷酸序列；同時，第二野生型探針具有序列編號：67之核苷酸序列，而第二突變型探針則具有序列編號：68之核苷酸序列。具體而言，第二正向引子(序列編號：33)及第二反向引子(序列編號：34)所組成的第二引子對，可專一性結合至DNA模版上的第二SLC12A3 基因片段，且該SLC12A3 基因片段涵蓋位於第12個外顯子的D486N之區域。經擴增後，該SLC12A3 基因片段被選擇性地複製放大。可於擴增同時或之後，利用第二野生型探針(序列編號：67)以及第二突變型探針(序列編號：68)對經擴增之該SLC12A3 基因片段進行雜合。若第二突變型探針可與該SLC12A3 基因片段進行專一性雜合，則表示該SLC12A3 基因片段包含第二突變D486N。當可想見，可根據前述探針與基因片段之間的雜合結果以評估個體已罹患吉特曼症候群或極可能未來有罹患吉特曼症候群之風險。

總體而言，本發明提供利用一個體之離體樣本來預斷該個體是否罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險的方法，可透過專一性引子對擴增至少一特定SLC12A3 基因片段，再利用突變型探針與該擴增之特定SLC12A3 基因片段專一性雜合以獲得特定SLC12A3 基因片段是否包含任何突變的資訊，透過雜合結果以評估該個體是否罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險。據此，本發明之方法可大幅增加預斷準確率及檢測效率。

另，為解決習知問題並達成本發明之目的，本發明第二態樣提供一種檢測套組。在本揭示內容的某些實施方式中，是關於一種用於檢測一個體是否罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險的套組。該套組包含第一引子對，用以擴增第一SLC12A3 基因片段。其中該第一引子對包含一具有序列編號：1之核苷酸序列的第一正向引子，以及一具有序列編號：2之核苷酸序列的第一反向引子。

依據本揭示內容的某些實施方式，該套組更包含一具有序列編號：35之核苷酸序列的第一野生型探針，以及一具有序列編號：36之核苷酸序列的第一突變型探針。

具體而言，第一引子對包含第一正向引子(序列編號：1)及第一反向引子(序列編號：2)，其用以擴增含有對應特定突變位點的第一SLC12A3 基因片段。同時，可額外包含第一野生型探針(序列編號：35)及第一突變型探針(序列編號：36)，用以決定經擴增後的第一SLC12A3 基因片段是否含有該特定突變。

依據本揭示內容的某些實施方式，該套組更包含一第二引子對，其用以擴增第二SLC12A3 基因片段。其中，該第二引子對包含：一具有序列編號：3之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：4之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：5之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：6之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：7之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：8之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：9之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：10之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：11之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：12之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：13之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：14之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：15之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：16之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：17之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：18之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：19之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：20之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：21之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：22之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：23之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：24之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：25之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：26之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：27之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：28之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：29之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：30之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：31之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：32之核苷酸序列的第二反向引子；或是一具有序列編號：33之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：34之核苷酸序列的第二反向引子。

在本揭示內容的某些實施方式中，本發明之套組更包含一第二野生型探針及一第二突變型探針。

承前所述，在一實施方式中，當該第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：3之核苷酸序列)及第二反向引子(具有序列編號：4之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：37及38之核苷酸序列。

在另一實施方式中，當該第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：5之核苷酸序列)以及第二反向引子(具有序列編號：6之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：39及40之核苷酸序列。

在另一實施方式中，當該第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：7之核苷酸序列)以及第二反向引子(具有序列編號：8之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：41及42之核苷酸序列。

在另一實施方式中，當該第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：9之核苷酸序列)及第二反向引子(具有序列編號：10之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：43及44之核苷酸序列。

在另一實施方式中，當該第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：11之核苷酸序列)及第二反向引子(具有序列編號：12之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：45及46之核苷酸序列。

在另一實施方式中，當第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：13之核苷酸序列)以及第二反向引子(具有序列編號：14之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：47及48之核苷酸序列。

在另一實施方式中，當第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：15之核苷酸序列)以及第二反向引子(具有序列編號：16之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：49及50之核苷酸序列。

在另一實施方式中，當第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：17之核苷酸序列)以及第二反向引子 (具有序列編號：18之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：51及52之核苷酸序列。

在另一實施方式中，當第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：19之核苷酸序列)以及第二反向引子(具有序列編號：20之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：53及54之核苷酸序列。

在另一實施方式中，當第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：21之核苷酸序列)以及第二反向引子(具有序列編號：22之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：55及56之核苷酸序列。

在另一實施方式中，當第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：23之核苷酸序列)以及第二反向引子(具有序列編號：24之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：57及58之核苷酸序列。

在另一實施方式中，當第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：25之核苷酸序列)以及第二反向引子(具有序列編號：26之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：59及60之核苷酸序列。

在另一實施方式中，當第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：27之核苷酸序列)以及第二反向引子(具有序列編號：28之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：61及62之核苷酸序列。

在另一實施方式中，當第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：29之核苷酸序列)以及第二反向引子(具有序列編號：30之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：63及64之核苷酸序列。

在另一實施方式中，當第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：31之核苷酸序列)以及第二反向引子(具有序列編號：32之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：65及66之核苷酸序列。

在又一實施方式中，當第二引子對包含第二正向引子(具有序列編號：33之核苷酸序列)以及第二反向引子(具有序列編號：34之核苷酸序列)時，則第二野生型探針及第二突變型探針分別具有序列編號：67及68之核苷酸序列。

須說明的是，依據本揭示內容的實施方式，本發明之套組並不以兩對引子對為限，可依據實際需求包含第三引子對、第四引子對或更多引子對。其中該些對可包含本發明表1表列的任一引子核苷酸序列，也可以包含其餘不同的核苷酸序列。同時，當本發明套組具有第三引子對或更多引子對時，可更包含具有本發明表1表列的探針核苷酸序列之第三野生型探針及/或第三突變型探針，也可以包含不同的核苷酸序列。

依據本揭示內容的某些實施方式，前述第一野生型探針、第一突變型探針、第二野生型探針及該第二突變型探針可分別與第一偵測標記、第二偵測標記、第三偵測標記及第四偵測標記連接，用以呈現探針與目標DNA雜合資訊。具體而言，第一偵測標記、第二偵測標記、第三偵測標記及第四偵測標記發出訊號可彼此相異，以便於區別不同雜合體。在一實施方式中，偵測標記可以是螢光標記，訊號可以是光訊號。在又一實施方式中，第一、第二、第三及第四偵測標記分別發出不同波長的光。較佳地，該些光之波長可分別為介於510 nm與520 nm之間、550 nm至560 nm之間、575 nm至585 nm之間，以及610 nm 至620 nm之間。在一實施方式中，該些偵測標記可發出分別為517 nm、551 nm、580 nm及617 nm波長之光。同時，這裡所列舉之光波長僅為例示性非限制性者，光訊號之顏色不以此為限。可適用於本發明的偵測標記包含但不限於：VIC^TM 、FAM^TM 、JUN^TM 、ABY^TM 、HEX^TM 、NED^TM 、TAMRA^TM 、SYBR® Green、Texas Red®等。較佳地為VIC^TM 、FAM^TM 、JUN^TM 及ABY^TM 。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信本發明所屬技術領域的通常知識者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實驗例

材料與方法

1. 收集個體離體樣本

於醫療單位(國防醫學中心，臺灣)對176名疑似患有吉特曼症侯群的病患進行採血。該些病患均表現出低血鉀、代謝性鹼中毒以及高尿鹽的臨床症狀。後續實驗均取得該些病患同意。經採血後，以Puregene血液套組(供應商：Qiagen)取得病患之基因體DNA，並於適當環境下保存。

2. 突變檢測

將基因體DNA溶液(體積為1 μl或重量50 ng)加入已含有專一性引子對(體積：2.5 μl)、TaqMan^TM 專一性探針(包含專一性野生型探針及專一性突變型探針(體積各2.5 μl))的96孔反應盤(96-well plate)中。加入反應試劑(master mix)使每孔總反應體積為10 μl之後，利用即時PCR反應機器(型號：QuantStudio 5 Real-Time PCR System，供應商：AppliedBiosytems)於適當條件下進行即時聚合酶連鎖反應。

前述專一性引子對包含如序列編號：1至序列編號：34所示的核苷酸序列的至少一者，前述專一性野生型探針包含以及如序列編號：35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65及67所示的核苷酸序列的至少一者，而前述專一性突變型探針則包含如序列編號：36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66及68所示的核苷酸序列的至少一者(請參閱表1)。專一性野生型探針的5’端與綠色螢光標記VIC^TM 或紅色JUN^TM 連接；專一性突變型探針的5’端與藍色螢光標記FAM^TM 或黃色螢光標記ABY^TM 連接。

識別特定突變的專一性引子對與專一性探針可組合成一個測試組合，放置在相同的反應孔(well)中，其專一性探針分別與不同顏色之螢光標記連接，便於區分(表2)。總共有五個測試組。其餘的專一性引子對及專一性探針個別放置於獨立的反應孔中。96孔反應盤的縱向12列分別對應不同的突變基因型，橫向8行分別對應不同個體樣本。表2：可形成測試組合的突變種類

即時PCR的反應條件設定如下：階段1：初始階段60℃維持30秒；階段2：升溫至95℃，5分鐘；階段3：於95℃下分開DNA兩股，30秒；階段4：以60℃，1分鐘進行DNA延展；返回階段3，重複40個循環；階段5：至60℃冷卻30秒，完成反應。

3. 結果分析

對該些病患檢測其血液樣本之結果如第1圖至第4圖所示。圖上每個點可表示每一樣本的基因型，該些個體的基因型分佈可以將圖面以象限區域來表示。位於第一象限的點(淺灰色圓點)表示異型合子突變；第二象限(黑色圓點)：同型合子突變型；第三象限：無訊號區；第四象限(灰色圓點)：同型合子野生型。第1圖呈現疑似患有吉特曼症侯群的病患針對c.2881-2delAG突變的檢測結果，且根據專一性引子對及專一性探針，可區分出同型突變(第二象限)及異型突變(第一象限)，是以可判定該病患具有c.2881-2delAG突變。第2圖則呈現該些個體具有IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT的突變，且根據專一性引子對及專一性探針，可區分出同型突變(第二象限)及異型突變(第一象限)。第3圖則呈現針對c.1670-191 C→T突變的檢測結果，其顯現在該測試族群中，大多數個體攜帶同型合子的c.1670-191 C→T突變型(第二象限)。第4圖亦呈現該些病患的檢測結果，其顯示在該些測試個體中，均攜帶異型合子的突變N442K(第一象限)。

4. 比較例

以突變T163M以及R871H為例，以該些突變的專一性引子對及專一性探針與比較引子對及比較探針兩者之間進行功效測試。請參閱表3，其列出突變T163M以及R871H之專一性引子對及專一性探針的序列，以及比較引子對及比較探針之序列。表3：突變T163M以及R871H之專一性引子對、專一性探針、比較引子對及比較探針之序列

第5圖繪示針對突變T163M，以專一性引子對及專一性探針與比較引子對及比較探針兩者之間的檢測結果。挑選具有突變T163M且經確診為吉特曼症候群的病患，取其離體樣本，分別以比較引子對及比較探針與專一性引子對及專一性探針對突變T163M進行雜合效率檢測。A小圖呈現以突變T163M的專一性引子對(序列編號：9及10)及專一性探針(序列編號：43及44)的檢測結果。其中，經過一定擴增循環，可得到目標基因片段的複製數明顯增加的結果(螢光訊號增加)，同時可藉由野生型探針及突變型探針得到該等位基因的突變狀態(野生型探針與突變型探針的訊號均隨著循環數上升，表示該個體攜帶異型合子之突變基因型)。B小圖呈現比較引子對及探針之結果。其中，可明顯看出該些引子對未能有效地對目標基因片段進行擴增，同時，野生型探針及突變型探針兩者亦無法彼此區分。

第6圖繪示針對以突變R871H，以專一性引子對及專一性探針與比較引子對及比較探針兩者之間的檢測結果。挑選具有突變R871H且經確診為吉特曼症候群之病患，取其離體樣本，分別以專一性引子對及專一性探針與比較引子對及比較探針對該突變R871H進行雜合效率檢測。A小圖呈現以突變R871H的專一性引子對(序列編號：13及14)及專一性探針(序列編號：47及48)的檢測結果。其中，經過一定擴增循環，可得到目標基因片段的複製數明顯增加的結果(螢光訊號增加)，同時可藉由野生型探針及突變型探針得到該等位基因的突變狀態(野生型探針與突變型探針的訊號均隨著循環數上升，表示該個體攜帶異型合子之突變基因型)。B小圖呈現比較引子對及探針之結果。其中，可明顯看出該些引子對未能有效地對含有突變R871H之目標基因片段進行擴增，同時，野生型探針及突變型探針兩者亦無法彼此區分。

總結來說，本發明提供一種利用一個體之離體樣本來預斷該個體是否罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險的方法及套組，藉由至少一專一性引子對，以擴增至少一特定SLC12A3 基因片段，同時以對應該經擴增SLC12A3 基因片段的專一性探針，以獲得該經擴增的SLC12A3 基因片段是否包含至少一突變。藉此，可提高與吉特曼症候群相關之突變基因的檢測準確度及檢測效率，以快速準確地獲得吉特曼症候群的預斷及檢測結果。

同時，相較於非專一性引子對及探針(比較例)，本發明提供的專一性引子對及專一性探針與目標SLC12A3 基因片段之間具有較佳的雜合程度，提升基因檢測的準確性，具有顯著功效。

無

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：

第1圖繪示以本發明方法及套組對疑似患有吉特曼症候群之個體離體樣本的檢測結果，其顯示該樣本是否包含c.2881-2delAG的突變。每一點表示一個樣本單位值，第一象限：攜帶異型合子突變基因型之個體；第二象限：攜帶同型合子突變基因型之個體；第四象限：攜帶野生型(正常)基因型之個體。

第2圖繪示以本發明方法及套組對疑似患有吉特曼症候群之個體離體樣本的檢測結果，其顯示該樣本是否包含IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT (簡稱為IVS 7-1)的突變。每一點表示一個樣本單位值，第一象限：攜帶異型合子突變基因型之個體；第二象限：攜帶同型合子突變基因型之個體；第四象限：攜帶野生型(正常)基因型之個體。

第3圖繪示以本發明之方法及套組對疑似患有吉特曼症候群之個體離體樣本的檢測結果，其顯示該樣本是否包含c.1670-191C→T的突變。每一點表示一個樣本單位值，第一象限：攜帶異型合子突變基因型之個體；第二象限：攜帶同型合子突變基因型之個體；第四象限：攜帶野生型(正常)基因型之個體。

第4圖繪示以本發明之方法及套組對疑似患有吉特曼症候群之個體離體樣本的檢測結果，其顯示該樣本是否包含N442K的突變。每一點表示一個樣本單位值，第一象限：攜帶異型合子突變基因型之個體；第二象限：攜帶同型合子突變基因型之個體；第四象限：攜帶野生型(正常)基因型之個體。

第5圖繪示針對突變T163M，以專一性引子對及專一性探針與比較引子對及比較探針兩者之間的檢測結果。A小圖：以專一性引子對(序列編號：9及10)及專一性探針(序列編號：43及44)的檢測結果。B小圖：以比較引子對及比較探針的檢測結果。

第6圖繪示針對以突變R871H，以專一性引子對及專一性探針與比較引子對及比較探針兩者之間的檢測結果。A小圖：以專一性引子對(序列編號：13及14)及專一性探針(序列編號：47及48)的檢測結果。B小圖：以比較引子對及比較探針的檢測結果。

序列表<110> 國防醫學院 <120> 用以預斷吉特曼症候群的方法及套組<130> P3083-TW<160> 68 <170> PatentIn version 3.5<210> 1<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<400> 1gactgcccct ggaagatctc a 21<210> 2<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<400> 2tgtccctgac ccagtgatgt 20<210> 3<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<400> 3catgcgcacc tttggcta 18<210> 4<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<400> 4ttgctgttgg catagtgct 19<210> 5<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<400> 5tggatgctcc tggtgaaatg 20<210> 6<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<400> 6tcctgggctg ggtctacag 19<210> 7<211> 23<212> DNA<213> 人工序列<400> 7tggctgaaca agaggaagat caa 23<210> 8<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<400> 8tggcacctgc atgaggatct 20<210> 9<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<400> 9tccagattcg ttgcatgctc 20<210> 10<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<400> 10caagccctcc ctcctcttc 19<210> 11<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<400> 11gtcgccatga gatggaaact 20<210> 12<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<400> 12tctttctatc tgtgactcta tcaaagg 27<210> 13<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<400> 13agaggaggtg gagcaaatgc 20<210> 14<211> 23<212> DNA<213> 人工序列<400> 14tctcctggtc catcctgtta ctc 23<210> 15<211> 22<212> DNA<213> 人工序列<400> 15ccttactcat caggccttgc tt 22<210> 16<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<400> 16tccagtcagg caccaagttc t 21<210> 17<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<400> 17tgggatcgcc cttcagg 17<210> 18<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<400> 18gatcgccctt gcaggag 17<210> 19<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<400> 19tcgcaccttt ggctacaaca c 21<210> 20<211> 25<212> DNA<213> 人工序列<400> 20cttctgagac agcacttacc ttgag 25<210> 21<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<400> 21gtgagccccg gaaggtga 18<210> 22<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<400> 22cagggaagtg gccagtctt 19<210> 23<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<400> 23ggatcgccct tggtacaggc 20<210> 24<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<400> 24tgggatcgcc cttcagg 17<210> 25<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<400> 25ggatcgccct tggtacaggc 20<210> 26<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<400> 26tgggatcgcc cttcagg 17<210> 27<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<400> 27tggctcctgc ccttttcc 18<210> 28<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<400> 28tgccgggcgg aagttg 16<210> 29<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<400> 29cagcacagct gccactacg 19<210> 30<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<400> 30ttgcaggcct ggaagtttgt 20<210> 31<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<400> 31tctggccctc agctactcg 19<210> 32<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<400> 32agggtggagc catcactgg 19<210> 33<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<400> 33ttcccagcct aagggtgagt g 21<210> 34<211> 21<212> DNA<213> 人工序列<400> 34gaagccgatc agtgggtaca g 21<210> 35<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<400> 35aagaacagag tcaaggtg 18<210> 36<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<400> 36acagtcaagg tgcagaga 18<210> 37<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<400> 37ttggctacaa cacgat 16<210> 38<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<400> 38ctacaacatg atcgatgtg 19<210> 39<211> 15<212> DNA<213> 人工序列<400> 39ccaaagcagg cgtgt 15<210> 40<211> 15<212> DNA<213> 人工序列<400> 40caggtgtgtg atttg 15<210> 41<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<400> 41ccttctactc ggatgtcat 19<210> 42<211> 19<212> DNA<213> 人工序列<400> 42ctactaggat gtcattgcc 19<210> 43<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<400> 43ctgccctgga ttacgg 16<210> 44<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<400> 44ctggattatg gcccagg 17<210> 45<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<400> 45cacaggcagg tgatat 16<210> 46<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<400> 46cacaggtagg tgatataa 18<210> 47<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<400> 47aaatgcaaga tccgtg 16<210> 48<211> 20<212> DNA<213> 人工序列<400> 48aagatccatg tgttcgtagg 20<210> 49<211> 12<212> DNA<213> 人工序列<400> 49gcggacattt tt 12<210> 50<211> 15<212> DNA<213> 人工序列<400> 50aaccgaaaat ttttc 15<210> 51<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<400> 51atctactggc tctttg 16<210> 52<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<400> 52ctactgactc tttgacg 17<210> 53<211> 14<212> DNA<213> 人工序列<400> 53tggtgagccc cgga 14<210> 54<211> 12<212> DNA<213> 人工序列<400> 54ccccagaagg tc 12<210> 55<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<400> 55aaggtgacct gcactc 16<210> 56<211> 16<212> DNA<213> 人工序列<400> 56acctgtactc cttcct 16<210> 57<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<400> 57tcaagaacta ccggtgag 18<210> 58<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<400> 58actactggtg agcagag 17<210> 59<211> 18<212> DNA<213> 人工序列<400> 59tcaagaacta ccggtgag 18<210> 60<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<400> 60actactggtg agcagag 17<210> 61<211> 14<212> DNA<213> 人工序列<400> 61cctggtgctc acgc 14<210> 62<211> 14<212> DNA<213> 人工序列<400> 62ctggtgctca tgcg 14<210> 63<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<400> 63cctcatcaac tattacc 17<210> 64<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<400> 64cctcatcaag tattacc 17<210> 65<211> 15<212> DNA<213> 人工序列<400> 65cacatcaaga actac 15<210> 66<211> 17<212> DNA<213> 人工序列<400> 66acatcaagag ctaccgg 17<210> 67<211> 15<212> DNA<213> 人工序列<400> 67cgaggaccag ctgta 15<210> 68<211> 14<212> DNA<213> 人工序列<400> 68cctttgcgag aacc 14

Claims

一種利用一個體之離體樣本來預斷該個體是否罹患吉特曼症候群(Gitelman's syndrome)或有罹患吉特曼症候群之風險的方法，包含： (a) 萃取該離體樣本之DNA； (b) 以步驟(a)之DNA作為模版，利用一第一引子對來擴增一第一SLC12A3 基因片段，其中該第一引子對包含一第一正向引子及一第一反向引子； (c) 決定該經擴增之第一SLC12A3 基因片段中是否包含一c.2881-2delAG的第一突變；以及 (d) 根據步驟(c)之結果來評估該個體是否罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險，其中若該經擴增之第一SLC12A3 基因片段包含該第一突變，則該個體罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險；其中，當該第一突變是c.2881-2delAG時，則該第一正向引子及該第一反向引子分別具有序列編號：1及2之核苷酸序列。
如請求項1所述之方法，其中步驟(c)是利用一第一野生型探針及一第一突變型探針來決定該經擴增之第一SLC12A3 基因片段中是否包含該第一突變，其中該第一野生型探針及該第一突變型探針分別具有序列編號：35及36的核苷酸序列。
如請求項1所述之方法，其中在步驟(b)中更包含利用一第二引子對來擴增一第二SLC12A3 基因片段，藉以在步驟(c)中決定該經擴增之第二SLC12A3 基因片段中是否包含一選自由T60M、c.1670-191C→T、S710X、T163M、c.2548+253C→T、R871H、IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT、W844X、R83Q、H90Y、R642H、R642C、T649M、N442K、N640S及D486N所組成之群組的第二突變，其中該第二引子對包含一第二正向引子及一第二反向引子，其中當該第二突變是T60M時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：3及4之核苷酸序列；當該第二突變是c.1670-191 C→T時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：5及6之核苷酸序列；當該第二突變是S710X時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：7及8之核苷酸序列；當該第二突變是T163M時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：9及10之核苷酸序列；當該第二突變是c.2548+253 C→T時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：11及12之核苷酸序列；當該第二突變是R871H時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：13及14之核苷酸序列；當該第二突變是IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：15及16之核苷酸序列；當該第二突變是W844X時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：17及18之核苷酸序列；當該第二突變是R83Q時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：19及20之核苷酸序列；當該第二突變是H90Y時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：21及22之核苷酸序列；當該第二突變是R642H時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：23及24之核苷酸序列；當該第二突變是R642C時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：25及26之核苷酸序列；當該第二突變是T649M時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：27及28之核苷酸序列；當該第二突變是N442K時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：29及30之核苷酸序列；當該第二突變是N640S時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：31及32之核苷酸序列；或是當該第二突變是D486N時，則該第二正向引子及該第二反向引子分別具有序列編號：33及34之核苷酸序列。
如請求項3所述之方法，其中步驟(c)是利用一第二野生型探針及一第二突變型探針來決定該經擴增之第二SLC12A3 基因片段中是否包含該第二突變，其中當該第二突變是T60M時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：37及38之核苷酸序列；當該第二突變是c.1670-191 C→T時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：39及40之核苷酸序列；當該第二突變是S710X時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：41及42之核苷酸序列；當該第二突變是T163M時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：43及44之核苷酸序列；當該第二突變是c.2548+253 C→T時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：45及46之核苷酸序列；當該第二突變是R871H時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：47及48之核苷酸序列；當該第二突變是IVS7-1G→A+971delCGGACATTTTTInsACCGAAAATTTT時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：49及50之核苷酸序列；當該第二突變是W844X時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：51及52之核苷酸序列；當該第二突變是R83Q時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：53及54之核苷酸序列；當該第二突變是H90Y時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：55及56之核苷酸序列；當該第二突變是R642H時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：57及58之核苷酸序列；當該第二突變是R642C時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：59及60之核苷酸序列；當該第二突變是T649M時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：61及62之核苷酸序列；當該第二突變是N442K時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：63及64之核苷酸序列；當該第二突變是N640S時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：65及66之核苷酸序列；或是當該第二突變是D486N時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：67及68之核苷酸序列。
如請求項1所述之方法，其中該離體樣本係選自由血液、血漿、組織液、唾液、淚液、眼球內液、尿液、淋巴液、脊髓液、宮頸液及陰道液所組成的群組。
一種用於檢測一個體是否罹患吉特曼症候群或有罹患吉特曼症候群之風險的套組，包含：一用以擴增一第一SLC12A3 基因片段的第一引子對，其包含一具有序列編號：1之核苷酸序列的第一正向引子，以及一具有序列編號：2之核苷酸序列的第一反向引子。
如請求項6所述之套組，更包含一具有序列編號：35之核苷酸序列的第一野生型探針，以及一具有序列編號：36之核苷酸序列的第一突變型探針。
如請求項6所述之套組，更包含一用以擴增一第二SLC12A3 基因片段的第二引子對，其包含一具有序列編號：3之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：4之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：5之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：6之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：7之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：8之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：9之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：10之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：11之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：12之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：13之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：14之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：15之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：16之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：17之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：18之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：19之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：20之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：21之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：22之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：23之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：24之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：25之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：26之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：27之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：28之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：29之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：30之核苷酸序列的第二反向引子；一具有序列編號：31之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：32之核苷酸序列的第二反向引子；或是一具有序列編號：33之核苷酸序列的第二正向引子，以及一具有序列編號：34之核苷酸序列的第二反向引子。
如請求項8所述之套組，更包含一第二野生型探針及一第二突變型探針，其中當該第二引子對包含該具有序列編號：3之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：4之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：37及38之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：5之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：6之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：39及40之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：7之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：8之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：41及42之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：9之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：10之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：43及44之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：11之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：12之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：45及46之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：13之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：14之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：47及48之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：15之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：16之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：49及50之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：17之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：18之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：51及52之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：19之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：20之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：53及54之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：21之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：22之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：55及56之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：23之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：24之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：57及58之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：25之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：26之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：59及60之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：27之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：28之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：61及62之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：29之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：30之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：63及64之核苷酸序列；當該第二引子對包含該具有序列編號：31之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：32之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：65及66之核苷酸序列；或是當該第二引子對包含該具有序列編號：33之核苷酸序列的第二正向引子及該具有序列編號：34之核苷酸序列的第二反向引子時，則該第二野生型探針及該第二突變型探針分別具有序列編號：67及68之核苷酸序列。
如請求項9所述之套組，其中該第一野生型探針、該第一突變型探針、該第二野生型探針及該第二突變型探針分別與一第一、一第二、一第三及一第四偵測標記連接，且該第一、該第二、該第三及該第四偵測標記可發出彼此相異的光波長。