CN111218512A - 乳腺癌21基因检测试剂盒及其应用方法 - Google Patents

乳腺癌21基因检测试剂盒及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术及医学领域，具体涉及乳腺癌21基因检测试剂盒，包括分别检测Ki67、STK15、Survivin、CCNB1、MYBL2、MMP11、CTSL2、GRB7、HER2、ER、PGR、BCL2、SCUBE2、GSTM1、BAG1、CD68、β‑actin、GAPDH、RPLP0、GUS和TFRC基因的特异性引物和探针、阳性质控品和用于荧光定量PCR检测常见测组件等。本发明还提供了上述试剂盒的使用方法。本发明的试剂盒通过检测与人类乳腺癌相关的21种基因，来评估乳腺癌患者的复发风险与化疗获益程度，具有灵敏度高，特异性强，检测操作简单等特点。

Description

乳腺癌21基因检测试剂盒及其应用方法
技术领域
本发明属于生物技术及医学领域，具体涉及乳腺癌21基因检测试剂盒及其应用方法。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来以手术为主，放射治疗、化疗、内分泌治疗为辅助的多学科综合治疗模式使乳腺癌的复发和病死率显著降低。随着基因组学的发展，学者们发现检测一些多基因标志物，可能比临床病例指标更能准确的预测肿瘤的复发。从而判断患者是否从化疗中获益，避免过度治疗。
最早由Paik等提出的21基因检测是已被临床证实的用于评估ER阳性、腋窝淋巴结阴性早期乳腺癌患者复发风险的检测方法。这21个基因包括16个肿瘤相关基因及5个参考基因，其中肿瘤增值相关基因(Ki67、STK15、Survivin、CCNB1和MYBL2)、表皮生长因子受体HER2相关基因(GRB7和HER2)、激素(Estrogen)相关基因(ER、PGR、BCL2和SCUBE2)、浸润(Invasion)相关基因(MMP11和CTSL2)和3个未分类基因(GSTM1、CD68和BAG1)。5个参考基因分别为(β-actin、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC)。激素相关基因、GSTM1、BAG1的高表达将导致一个较低的复发分数(recurrence score,RS)，而增值相关基因、HER-2相关基因、侵袭相关基因和CD68的高表达将导致一个较高的RS值。NSABP B-14和B-20的实验结果表明，RS﹤18时为低复发风险；18≤RS＜31时为中复发风险；RS≥31时为高复发风险。近年来，大规模临床研究证实，复发分数与局部复发及病死率密切相关。
目前21基因的检测主要是通过从病人的石蜡标本中提取mRNA，然后进行RT-QPCR的方法来检测各个基因的表达再量化为复发风险评分(RS)。在基因检测实验的过程中，一个real time PCR反应体系中引物的用量极少不到1μl。而PCR反应本身就是灵敏度极高的实验，如此多的基因配成反应孔在检测实验操作时极易产生误差，且操作过程繁琐耗时多。如何能得到相应基因的精确CT值及能减少实验时间和减小实验误差成了亟待解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了乳腺癌21基因检测试剂盒及其使用方法，目的是为了解决现有技术中基因配成反应孔在检测实验操作时极易产生误差，且操作过程繁琐耗时多的技术问题。
本发明提供的乳腺癌21基因检测试剂盒，具体技术方案如下：
乳腺癌21基因检测试剂盒，包括21个检测基因，所述21个检测基因如下：Ki67、STK15、Survivin、CCNB1、MYBL2、MMP11、CTSL2、GRB7、HER2、ER、PGR、BCL2、SCUBE2、GSTM1、BAG1、CD68、β-actin、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC；
所述21个检测基因各设计了1对引物和1条特异性探针，21个检测基因所对应的引物序列和Taqman探针序列分别如下：
(1)检测Ki67基因的引物序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，检测Ki67基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：3；具体如下：
Ki67：
F)P1-KI67 5’-CTCCATGTGCCTGAGAT-3’ (SEQ ID NO：1)
R)P1-KI67 5’-TTCTGCACACCTCTTGACAC-3’ (SEQ ID NO：2)
Probe P1-KI67 5’FAM-AAAGACAAAAAGCCAGCCTGCAGC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：3)
(2)检测STK15基因的引物序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，检测STK15基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：6；具体如下：
STK15：
F)P2-STK15 5’-ATCTCTGGAGCCTTGGAGTT-3’ (SEQ ID NO：4)
R)P2-STK15 5’-CTGGCTGGGATTATGCTTCA-3’ (SEQ ID NO：5)
Probe P2-STK15 5’FAM-TTGTAACAGAGGGAGCCAGGGACC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：6)
(3)检测Survivin基因的引物序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，检测Survivin基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：9；具体如下：
Survivin：
F)P3-Survivin 5’-CCACCGCATCTCTACATTCA-3’ (SEQ ID NO：7)
R)P3-Survivin 5’-AGAAGAAACACTGGGCCAAG-3’ (SEQ ID NO：8)
Probe P3-Survivin 5’FAM-TTCATCCACTGCCCCACTGAGAA-3’BHQ1 (SEQ ID NO：9)
(4)检测CCNB1基因的引物序列为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，检测CCNB1基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：12；具体如下：
CCNB1：
F)P4-CCNB1 5’-TAAACTTTGGTCTGGGTCGG-3’ (SEQ ID NO：10)
R)P4-CCNB1 5’-GAGAAGGAGGAAAGTGCACC-3’ (SEQ ID NO：11)
Probe P4-CCNB1 5’FAM-ACCTTTGCACTTCCTTCGGAGAGC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：12)
(5)检测MYBL2基因的引物序列为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，检测MYBL2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：15；具体如下：
MYBL2：
F)P5-MYBL2 5’-AAGAACGCCCTGGAGAAGTA-3’ (SEQ ID NO：13)
R)P5-MYBL2 5’-GACTTTCTTGATGGGGCTCC-3’ (SEQ ID NO：14)
Probe P5-MYBL2 5’FAM-CCCGAGAAGCAGAAGAGGAAGCCT-3’BHQ1 (SEQ ID NO：15)
(6)检测MMP11基因的引物序列为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，检测MMP11基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：18；具体如下：
MMP11：
F)P6-MMP11 5’-GGGTGTACGACGGTGAAAAG-3’ (SEQ ID NO：16)
R)P6-MMP11 5’-TCTTGTTCTTCTCGGGACCC-3’ (SEQ ID NO：17)
Probe P6-MMP11 5’FAM-CCTGGTGAGGTTCCCGGTCCATG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：18)
(7)检测CTSL2基因的引物序列为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，检测CTSL2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：21；具体如下：
CTSL2：
F)P7-CTSL 5’-GGAGAGCAGTGTGGGAAAAG-3’ (SEQ ID NO：19)
R)P7-CTSL 5’-TGTGAAGCCATGTTTCCCTT-3’ (SEQ ID NO：20)
Probe P7-CTSL 5’FAM-TGAACTGCACAATGGGGAATACAGCC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：21)
(8)检测GRB7基因的引物序列为SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23，检测GRB7基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：24；具体如下：
GRB7：
F)P8-GRB7 5’-CTTCGGTTTCTGTGTCAAGC-3’ (SEQ ID NO：22)
R)P8-GRB7 5’-GGCTCTGCTCATCTTCACTG-3’ (SEQ ID NO：23)
Probe P8-GRB7 5’FAM-AAGCTTCGAAATGGCCACAAGGGG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：24)
(9)检测HER2基因的引物序列为SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，检测HER2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：27；具体如下：
HER2：
F)P9-HER2 5’-AGAACCCCGAGTACTTGACA-3’ (SEQ ID NO：25)
R)P9-HER2 5’-ATAGAGGTTGTCGAAGGCTG-3’ (SEQ ID NO：26)
Probe P9-HER2 5’FAM-CCCACCCTCCTCCTGCCTTCAG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：27)
(10)检测ER基因的引物序列为SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，检测ER基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：30；具体如下：
ER：
F)P10-ER 5’-TCATCCTCTCCCACATCAGG-3’ (SEQ ID NO：28)
R)P10-ER 5’-ATCTCCAGCAGCAGGTCATA-3’ (SEQ ID NO：29)
Probe P10-ER 5’FAM-ATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：30)
(11)检测PGR基因的引物序列为SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，检测PGR基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：33；具体如下：
PGR：
F)P11-PGR 5’-GCTCACAGCGTTTCTATCAAC-3’ (SEQ ID NO：31)
R)P11-PGR 5’-TCACCATCCCTGCCAATATC-3’ (SEQ ID NO：32)
Probe P11-PGR 5’FAM-TTATCCAGTCCCGGGCACTGAGTG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：33)
(12)检测BCL2基因的引物序列为SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，检测BCL2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：36；具体如下：
BCL2：
F)P12-BCL2 5’-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3’ (SEQ ID NO：34)
R)P12-BCL2 5’-TACTCAGTCATCCACAGGGC-3’ (SEQ ID NO：35)
Probe P12-BCL2 5’FAM-CATGTGTGTGGAGAGCGTCAACCG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：36)
(13)检测SCUBE2基因的引物序列为SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，检测SCUBE2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：39；具体如下：
SCUBE2：
F)P13-SCUBE2 5’-CATAGTTCGAGATGGCAGGC-3’ (SEQ ID NO：37)
R)P13-SCUBE2 5’-AAACATCTCTCGGGACTCCT-3’ (SEQ ID NO：38)
Probe P13-SCUBE2 5’FAM-CTGTTTGATGTCCTGGCCCATCCC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：39)
(14)检测GSTM1基因的引物序列为SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41，检测GSTM1基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：42；具体如下：
GSTM1：
F)P14-GSTM1 5’-GGGACGCTCCTGATTATGAC-3’ (SEQ ID NO：40)
R)P14-GSTM1 5’-GTGAGCCCCATCAATCAAGT-3’ (SEQ ID NO：41)
Probe P14-GSTM 5’FAM-TGAAAAATTCAAGCTGGGCCTGGA-3’BHQ1 (SEQ ID NO：42)
(15)检测BAG1基因的引物序列为SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44，检测BAG1基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：45；具体如下：
BAG1：
F)P15-BAG1 5’-CCCAGGTTGTTGAAGAGGTC-3’ (SEQ ID NO：43)
R)P15-BAG1 5’-CCCGGCAACCATCTTGTATT-3’ (SEQ ID NO：44)
Probe P15-BAG1 5’FAM-TGGAAACACCGTTGTCAGCACTTGG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：45)
(16)检测CD68基因的引物序列为SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，检测CD68基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：48；具体如下：
CD68：
F)P16-CD68 5’-CGGTGGAGTACAATGTGTCC-3’ (SEQ ID NO：46)
R)P16-CD68 5’-GTGGACAGCTGGTGAAAGAA-3’ (SEQ ID NO：47)
Probe P16-CD68 5’FAM-TTCGAGATCTCCAAGCACCCCTGG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：48)
(17)检测β-actin基因的引物序列为SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50，检测β-actin基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：51；具体如下：
β-actin：
F)P17-β-actin 5’-CCTCCCTGGAGAAGAGCTAC-3’ (SEQ ID NO：49)
R)P17-β-actin 5’-GATGTCCACGTCACACTTCA-3’ (SEQ ID NO：50)
Probe P17-β-actin 5’FAM-TGGCATCCACGAAACTACCTTCAA-3’BHQ1 (SEQ ID NO：51)
(18)检测GAPDH基因的引物序列为SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53，检测GAPDH基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：54；具体如下：
GAPDH：
F)P18-GAPDH 5’-CTCCAGAACATCATCCCTGC-3’ (SEQ ID NO：52)
R)P18-GAPDH 5’-GCTTCACCACCTTCTTGATGT-3’ (SEQ ID NO：53)
Probe P18-GAPDH 5’FAM-CTGAACGGGAAGCTCACTGGCATG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：54)
(19)检测RPLP0基因的引物序列为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56，检测RPLP0基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：57；具体如下：
RPLP0：
F)P19-RPLP0 5’-GCAGCATCTACAACCCTGAA-3’ (SEQ ID NO：55)
R)P19-RPLP0 5’-GACTCGTTTGTACCCGTTGA-3’ (SEQ ID NO：56)
Probe P19-RPLP0 5’FAM-TCTGCATTCTCGCTTCCTGGAGGG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：57)
(20)检测GUSB基因的引物序列为SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59，检测GUSB基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：60；具体如下：
GUSB：
F)P20-GUSB 5’-AGAGCGAGTATGGAGCAGAA-3’ (SEQ ID NO：58)
R)P20-GUSB 5’-AAATGAGCTCTCCAACCACG-3’ (SEQ ID NO：59)
Probe P20-GUSB 5’FAM-TGCAGGGTTTCACCAGGATCCACC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：60)
(21)检测TFRC基因的引物序列为SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62，检测TFRC基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：63；具体如下：
TFRC：
F)P21-TFRC 5’-TGAGAGGTACAACAGCCAAC-3’ (SEQ ID NO：61)
R)P21-TFRC 5’-GAAGAAGTCTCCACGAGCAG-3’ (SEQ ID NO：62)
Probe P21-TFRC 5’FAM-ATGGGCCTGAGTTTACAGTGGCTG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：63)
其中，Taqman探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3，端标记有淬灭基团。
在某些实施方式中，对应检测同一种基因的引物组和探针比例混合形成引物探针预混液，所述试剂盒包括分别对应乳腺癌21基因基因的21种引物探针预混液。
在某些实施方式中，对应检测一种基因的引物组的浓度稀释到0.5μM，探针浓度稀释到0.2-0.3μM后混合形成引物探针预混液。
在某些实施方式中，所述试剂盒中包括2×Microdiag Quantitive Reaction Mix溶液；所述2×Microdiag Quantitive Reaction Mix溶液包括高保真Taq酶，1.0-5.0mM的MgCl2，1.0-5.0mM的dNTPs(dATP，dUTP，dGTP，dCTP各1.0-5.0mM)和余量的ddH2O等组分。
本发明还提供了乳腺癌21基因检测试剂盒的应用方法，上述的乳腺癌21基因检测试剂盒，包括如下步骤：
S1：将2×Microdiag Quantitive Reaction Mix、待测样本的cDNA和ddH2O混匀后，取出分别加入到21种引物探针预混液中进行荧光定量PCR反应；
S2：通过荧光定量PCR扩增后获得的Ct值来计算乳腺癌的复发评分RS值；RS复发风险评分范围为0-100分；在淋巴结阴性、激素受体阳性、HER2阴性的乳腺癌全身辅助治疗中，21基因复发评分分为三种梯度，RS＜26为低复发风险组，RS为26-30位中复发风险组，RS≥31为高复发风险组；在淋巴结阳性、激素受体阳性、HER2阴性的乳腺癌全身辅助治疗中，RS＜18为低复发风险组，RS为18-30为中复发风险组，RS＞31为高复发风险组。
在某些实施方式中，在步骤S1中，所述待测样本的cDNA的制备方法如下：提取手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋的病理组织，石蜡切片标本的RNA，将提取得到的RNA反转录程cDNA。
在某些实施方式中，在步骤S1中，所述荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，60℃退火30秒，40个循环。
本发明具有以下有益效果：本发明可用于乳腺癌21基因检测，由基因表达量计算获得乳腺癌的复发评分(RS)，通过RS值评估个体化的治疗效果和预测10年乳腺癌复发的风险以及接受化疗的效益比。本发明提供乳腺癌21基因检测试剂盒灵敏度高，特异性强，方法简单，结果准确。
附图说明
图1为本发明21基因检测的扩增曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图1，对本发明进一步详细说明。
乳腺癌21基因检测试剂盒，包括21个检测基因，21个检测基因如下：Ki67、STK15、Survivin、CCNB1、MYBL2、MMP11、CTSL2、GRB7、HER2、ER、PGR、BCL2、SCUBE2、GSTM1、BAG1、CD68、β-actin、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC；
21个检测基因各设计了1对引物和1条特异性探针，21个检测基因所对应的引物序列和Taqman探针序列分别如下：
(1)检测Ki67基因的引物序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，检测Ki67基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：3；具体如下：
Ki67：
F)P1-KI67 5’-CTCCATGTGCCTGAGAT-3’ (SEQ ID NO：1)
R)P1-KI67 5’-TTCTGCACACCTCTTGACAC-3’ (SEQ ID NO：2)
Probe P1-KI67 5’FAM-AAAGACAAAAAGCCAGCCTGCAGC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：3)
(2)检测STK15基因的引物序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，检测STK15基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：6；具体如下：
STK15：
F)P2-STK15 5’-ATCTCTGGAGCCTTGGAGTT-3’ (SEQ ID NO：4)
R)P2-STK15 5’-CTGGCTGGGATTATGCTTCA-3’ (SEQ ID NO：5)
Probe P2-STK15 5’FAM-TTGTAACAGAGGGAGCCAGGGACC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：6)
(3)检测Survivin基因的引物序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，检测Survivin基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：9；具体如下：
Survivin：
F)P3-Survivin 5’-CCACCGCATCTCTACATTCA-3’ (SEQ ID NO：7)
R)P3-Survivin 5’-AGAAGAAACACTGGGCCAAG-3’ (SEQ ID NO：8)
Probe P3-Survivin 5’FAM-TTCATCCACTGCCCCACTGAGAA-3’BHQ1 (SEQ ID NO：9)
(4)检测CCNB1基因的引物序列为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，检测CCNB1基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：12；具体如下：
CCNB1：
F)P4-CCNB1 5’-TAAACTTTGGTCTGGGTCGG-3’ (SEQ ID NO：10)
R)P4-CCNB1 5’-GAGAAGGAGGAAAGTGCACC-3’ (SEQ ID NO：11)
Probe P4-CCNB1 5’FAM-ACCTTTGCACTTCCTTCGGAGAGC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：12)
(5)检测MYBL2基因的引物序列为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，检测MYBL2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：15；具体如下：
MYBL2：
F)P5-MYBL2 5’-AAGAACGCCCTGGAGAAGTA-3’ (SEQ ID NO：13)
R)P5-MYBL2 5’-GACTTTCTTGATGGGGCTCC-3’ (SEQ ID NO：14)
Probe P5-MYBL2 5’FAM-CCCGAGAAGCAGAAGAGGAAGCCT-3’BHQ1 (SEQ ID NO：15)
(6)检测MMP11基因的引物序列为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，检测MMP11基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：18；具体如下：
MMP11：
F)P6-MMP11 5’-GGGTGTACGACGGTGAAAAG-3’ (SEQ ID NO：16)
R)P6-MMP11 5’-TCTTGTTCTTCTCGGGACCC-3’ (SEQ ID NO：17)
Probe P6-MMP11 5’FAM-CCTGGTGAGGTTCCCGGTCCATG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：18)
(7)检测CTSL2基因的引物序列为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，检测CTSL2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：21；具体如下：
CTSL2：
F)P7-CTSL 5’-GGAGAGCAGTGTGGGAAAAG-3’ (SEQ ID NO：19)
R)P7-CTSL 5’-TGTGAAGCCATGTTTCCCTT-3’ (SEQ ID NO：20)
Probe P7-CTSL 5’FAM-TGAACTGCACAATGGGGAATACAGCC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：21)
(8)检测GRB7基因的引物序列为SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23，检测GRB7基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：24；具体如下：
GRB7：
F)P8-GRB7 5’-CTTCGGTTTCTGTGTCAAGC-3’ (SEQ ID NO：22)
R)P8-GRB7 5’-GGCTCTGCTCATCTTCACTG-3’ (SEQ ID NO：23)
Probe P8-GRB7 5’FAM-AAGCTTCGAAATGGCCACAAGGGG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：24)
(9)检测HER2基因的引物序列为SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，检测HER2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：27；具体如下：
HER2：
F)P9-HER2 5’-AGAACCCCGAGTACTTGACA-3’ (SEQ ID NO：25)
R)P9-HER2 5’-ATAGAGGTTGTCGAAGGCTG-3’ (SEQ ID NO：26)
Probe P9-HER2 5’FAM-CCCACCCTCCTCCTGCCTTCAG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：27)
(10)检测ER基因的引物序列为SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，检测ER基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：30；具体如下：
ER：
F)P10-ER 5’-TCATCCTCTCCCACATCAGG-3’ (SEQ ID NO：28)
R)P10-ER 5’-ATCTCCAGCAGCAGGTCATA-3’ (SEQ ID NO：29)
Probe P10-ER 5’FAM-ATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：30)
(11)检测PGR基因的引物序列为SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，检测PGR基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：33；具体如下：
PGR：
F)P11-PGR 5’-GCTCACAGCGTTTCTATCAAC-3’ (SEQ ID NO：31)
R)P11-PGR 5’-TCACCATCCCTGCCAATATC-3’ (SEQ ID NO：32)
Probe P11-PGR 5’FAM-TTATCCAGTCCCGGGCACTGAGTG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：33)
(12)检测BCL2基因的引物序列为SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，检测BCL2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：36；具体如下：
BCL2：
F)P12-BCL2 5’-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3’ (SEQ ID NO：34)
R)P12-BCL2 5’-TACTCAGTCATCCACAGGGC-3’ (SEQ ID NO：35)
Probe P12-BCL2 5’FAM-CATGTGTGTGGAGAGCGTCAACCG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：36)
(13)检测SCUBE2基因的引物序列为SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，检测SCUBE2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：39；具体如下：
SCUBE2：
F)P13-SCUBE2 5’-CATAGTTCGAGATGGCAGGC-3’ (SEQ ID NO：37)
R)P13-SCUBE2 5’-AAACATCTCTCGGGACTCCT-3’ (SEQ ID NO：38)
Probe P13-SCUBE2 5’FAM-CTGTTTGATGTCCTGGCCCATCCC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：39)
(14)检测GSTM1基因的引物序列为SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41，检测GSTM1基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：42；具体如下：
GSTM1：
F)P14-GSTM1 5’-GGGACGCTCCTGATTATGAC-3’ (SEQ ID NO：40)
R)P14-GSTM1 5’-GTGAGCCCCATCAATCAAGT-3’ (SEQ ID NO：41)
Probe P14-GSTM 5’FAM-TGAAAAATTCAAGCTGGGCCTGGA-3’BHQ1 (SEQ ID NO：42)
(15)检测BAG1基因的引物序列为SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44，检测BAG1基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：45；具体如下：
BAG1：
F)P15-BAG1 5’-CCCAGGTTGTTGAAGAGGTC-3’ (SEQ ID NO：43)
R)P15-BAG1 5’-CCCGGCAACCATCTTGTATT-3’ (SEQ ID NO：44)
Probe P15-BAG1 5’FAM-TGGAAACACCGTTGTCAGCACTTGG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：45)
(16)检测CD68基因的引物序列为SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，检测CD68基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：48；具体如下：
CD68：
F)P16-CD68 5’-CGGTGGAGTACAATGTGTCC-3’ (SEQ ID NO：46)
R)P16-CD68 5’-GTGGACAGCTGGTGAAAGAA-3’ (SEQ ID NO：47)
Probe P16-CD68 5’FAM-TTCGAGATCTCCAAGCACCCCTGG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：48)
(17)检测β-actin基因的引物序列为SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50，检测β-actin基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：51；具体如下：
β-actin：
F)P17-β-actin 5’-CCTCCCTGGAGAAGAGCTAC-3’ (SEQ ID NO：49)
R)P17-β-actin 5’-GATGTCCACGTCACACTTCA-3’ (SEQ ID NO：50)
Probe P17-β-actin 5’FAM-TGGCATCCACGAAACTACCTTCAA-3’BHQ1 (SEQ ID NO：51)
(18)检测GAPDH基因的引物序列为SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53，检测GAPDH基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：54；具体如下：
GAPDH：
F)P18-GAPDH 5’-CTCCAGAACATCATCCCTGC-3’ (SEQ ID NO：52)
R)P18-GAPDH 5’-GCTTCACCACCTTCTTGATGT-3’ (SEQ ID NO：53)
Probe P18-GAPDH 5’FAM-CTGAACGGGAAGCTCACTGGCATG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：54)
(19)检测RPLP0基因的引物序列为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56，检测RPLP0基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：57；具体如下：
RPLP0：
F)P19-RPLP0 5’-GCAGCATCTACAACCCTGAA-3’ (SEQ ID NO：55)
R)P19-RPLP0 5’-GACTCGTTTGTACCCGTTGA-3’ (SEQ ID NO：56)
Probe P19-RPLP0 5’FAM-TCTGCATTCTCGCTTCCTGGAGGG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：57)
(20)检测GUSB基因的引物序列为SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59，检测GUSB基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：60；具体如下：
GUSB：
F)P20-GUSB 5’-AGAGCGAGTATGGAGCAGAA-3’ (SEQ ID NO：58)
R)P20-GUSB 5’-AAATGAGCTCTCCAACCACG-3’ (SEQ ID NO：59)
Probe P20-GUSB 5’FAM-TGCAGGGTTTCACCAGGATCCACC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：60)
(21)检测TFRC基因的引物序列为SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62，检测TFRC基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：63；具体如下：
TFRC：
F)P21-TFRC 5’-TGAGAGGTACAACAGCCAAC-3’ (SEQ ID NO：61)
R)P21-TFRC 5’-GAAGAAGTCTCCACGAGCAG-3’ (SEQ ID NO：62)
Probe P21-TFRC 5’FAM-ATGGGCCTGAGTTTACAGTGGCTG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：63)
其中，Taqman探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3，端标记有淬灭基团。
进一步地，对应检测同一种基因的引物组和探针比例混合形成引物探针预混液，试剂盒包括分别对应乳腺癌21基因基因的21种引物探针预混液。
进一步地，对应检测一种基因的引物组的浓度稀释到0.5μM，探针浓度稀释到0.2-0.3μM后混合形成引物探针预混液。
进一步地，试剂盒中包括2×Microdiag Quantitive Reaction Mix溶液；2×Microdiag Quantitive Reaction Mix溶液包括高保真Taq酶，1.0-5.0mM的MgCl2，1.0-5.0mM的dNTPs(dATP，dUTP，dGTP，dCTP各1.0-5.0mM)和余量的ddH2O等组分。
本发明提供的乳腺癌21基因检测试剂盒的应用方法如下：
1.样本处理和核酸提取
利用商品化的RNA提取试剂盒处理样本，具体操作参考试剂盒说明书，建议使用QIAamp RNA FFPE Tissue Kit(Cat No.73504)试剂盒，所提RNA需要用紫外分光光度计检测浓度和纯度，其RNA OD260/OD280的值应在1.8～2.0，浓度>50ng/ul，样本RNA质量不合格者不得用于RNA反转录实验。提取完的RNA建议立即进行反转录试验，否则请与-80℃保存，保存时间不宜超过6个月。
利用商品化的RNA反转录试剂盒处理提取好的样本，具体操作参考试剂盒说明书，建议使用Takara PrimeSciptTMRT reagent Kit(Cat No.RR047A)试剂盒。进行反转录的RNA总量应不超过1μg，但也不宜过低，建议低于100ng/μL样品重新切片进行核算提取，高于500ng/μL样品予以适当稀释。
2.2根据21个基因的mRNA序列设计及其引物和探针序列，目的片段都小于100bp，具体序列为：SEQ ID NO：1～EQ ID NO：60。
2.3反应体系的配制
表1：PCR反应液体系配置
Figure BDA0002431373690000121
1)将2×Microdiag Quantitive Reaction Mix、酶(Polymerase)和引物探针预混液直接从试剂盒中取出，并离心；
2)取出反转录后的待测样本cDNA；
3)计算需要的反应数，按反应体系取出相应的2×Microdiag QuantitiveReaction Mix、酶(Polymerase)和待测样本cDNA/质控品/纯化水，然后将其分别加入到对应反应管中并充分混匀，盖好反应管盖子，离心，每个反应管的终体积为20μL。
4)打开荧光定量PCR仪，将加号的反应管放置在荧光定量PCR仪上。
3.PCR扩增程序设置
表2：PCR反应程序的设定
Figure BDA0002431373690000122
5.检测结果解读
从乳腺癌石蜡组织中提取RNA，进行实时荧光定量PCR反应，分别得到待测样本的21个基因的Ct值，Ct值范围设置为15－35个循环。将5个参考基因的Ct值取平均值，分别求出此均值与其余16个基因的差值，带入公式得出RSU值，再将RSU转换为RS(0－100)。具体的计算公式如下：
a.Proliferation组基因分数＝(Ki67+STK15+Survivin+CCNB1+MYBL2)/5；
b.HER2组基因分数＝0.9×GRB7+0.1×HER2；
c.Estrogen组基因分数＝(0.8×ER+1.2×PGR+BCL2+SCUBE2)/4；
d.Invasion组基因分数＝(MMP11+CTSL2)/2；
e.RSU＝1.04×Proliferation组基因分数+0.47×HER2组基因分数－0.34×Estrogen组基因分数+0.10×Invasion组基因分数+0.05×CD68基因分数－0.08×GSTM1基因分数－0.07×BAG1基因分数；
f.RS＝20×(RSU－6.7)。
复发评分(RS)分为高、中、低三组，具体来说：
在淋巴结阴性、激素受体阳性、HER2阴性的乳腺癌全身辅助治疗中，21基因复发评分分为三种梯度，RS＜26为低复发风险组，RS为26-30位中复发风险组，RS≥31为高复发风险组；在淋巴结阳性、激素受体阳性、HER2阴性的乳腺癌全身辅助治疗中，RS＜18为低复发风险组，RS为18-30为中复发风险组，RS＞31为高复发风险组。
上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁波美丽人生医药生物科技发展有限公司
<120> 乳腺癌21基因检测试剂盒及其应用方法
<160> 63
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agactccatg tgcctgagat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agactccatg tgcctgagat 20
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaagacaaaa agccagcctg cagc 24
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atctctggag ccttggagtt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctggctggga ttatgcttca 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgtaacaga gggagccagg gacc 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccaccgcatc tctacattca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agaagaaaca ctgggccaag 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcatccact gccccactga gaa 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
taaactttgg tctgggtcgg 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagaaggagg aaagtgcacc 20
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acctttgcac ttccttcgga gagc 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aagaacgccc tggagaagta 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gactttcttg atggggctcc 20
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cccgagaagc agaagaggaa gcct 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gggtgtacga cggtgaaaag 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcttgttctt ctcgggaccc 20
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cctggtgagg ttcccggtcc atg 23
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggagagcagt gtgggaaaag 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgtgaagcca tgtttccctt 20
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgaactgcac aatggggaat acagcc 26
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cttcggtttc tgtgtcaagc 20
<210> 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggctctgctc atcttcactg 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aagcttcgaa atggccacaa gggg 24
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 25
agaaccccga gtacttgaca 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atagaggttg tcgaaggctg 20
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cccaccctcc tcctgccttc ag 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tcatcctctc ccacatcagg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atctccagca gcaggtcata 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
atgaagtgca agaacgtggt gccc 24
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<212> DNA
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<400> 31
gctcacagcg tttctatcaa c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tcaccatccc tgccaatatc 20
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<212> DNA
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ttatccagtc ccgggcactg agtg 24
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<212> DNA
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tgtggccttc tttgagttcg 20
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tactcagtca tccacagggc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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catgtgtgtg gagagcgtca accg 24
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catagttcga gatggcaggc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aaacatctct cgggactcct 20
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ctgtttgatg tcctggccca tccc 24
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gtgagcccca tcaatcaagt 20
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<212> DNA
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ttcgagatct ccaagcaccc ctgg 24
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<212> DNA
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggcatccac gaaactacct tcaa 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<400> 54
ctgaacggga agctcactgg catg 24
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<400> 63
atgggcctga gtttacagtg gctg 24

Claims (7)

1.乳腺癌21基因检测试剂盒，其特征在于，包括21个检测基因，所述21个检测基因如下：Ki67、STK15、Survivin、CCNB1、MYBL2、MMP11、CTSL2、GRB7、HER2、ER、PGR、BCL2、SCUBE2、GSTM1、BAG1、CD68、β-actin、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC；
所述21个检测基因各设计了1对引物和1条特异性探针，21个检测基因所对应的引物序列和Taqman探针序列分别如下：
(1)检测Ki67基因的引物序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，检测Ki67基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：3；具体如下：
Ki67：
F)P1-KI67 5’-CTCCATGTGCCTGAGAT-3’(SEQ ID NO：1)
R)P1-KI67 5’-TTCTGCACACCTCTTGACAC-3’ (SEQ ID NO：2)
Probe P1-KI67 5’FAM-AAAGACAAAAAGCCAGCCTGCAGC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：3)
(2)检测STK15基因的引物序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，检测STK15基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：6；具体如下：
STK15：
F)P2-STK15 5’-ATCTCTGGAGCCTTGGAGTT-3’ (SEQ ID NO：4)
R)P2-STK15 5’-CTGGCTGGGATTATGCTTCA-3’ (SEQ ID NO：5)
Probe P2-STK15 5’FAM-TTGTAACAGAGGGAGCCAGGGACC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：6)
(3)检测Survivin基因的引物序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，检测Survivin基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：9；具体如下：
Survivin：
F)P3-Survivin 5’-CCACCGCATCTCTACATTCA-3’ (SEQ ID NO：7)
R)P3-Survivin 5’-AGAAGAAACACTGGGCCAAG-3’ (SEQ ID NO：8)
Probe P3-Survivin 5’FAM-TTCATCCACTGCCCCACTGAGAA-3’BHQ1 (SEQ ID NO：9)
(4)检测CCNB1基因的引物序列为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，检测CCNB1基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：12；具体如下：
CCNB1：
F)P4-CCNB1 5’-TAAACTTTGGTCTGGGTCGG-3’ (SEQ ID NO：10)
R)P4-CCNB1 5’-GAGAAGGAGGAAAGTGCACC-3’ (SEQ ID NO：11)
Probe P4-CCNB1 5’FAM-ACCTTTGCACTTCCTTCGGAGAGC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：12)
(5)检测MYBL2基因的引物序列为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14，检测MYBL2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：15；具体如下：
MYBL2：
F)P5-MYBL2 5’-AAGAACGCCCTGGAGAAGTA-3’ (SEQ ID NO：13)
R)P5-MYBL2 5’-GACTTTCTTGATGGGGCTCC-3’ (SEQ ID NO：14)
Probe P5-MYBL2 5’FAM-CCCGAGAAGCAGAAGAGGAAGCCT-3’BHQ1 (SEQ ID NO：15)
(6)检测MMP11基因的引物序列为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，检测MMP11基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：18；具体如下：
MMP11：
F)P6-MMP11 5’-GGGTGTACGACGGTGAAAAG-3’ (SEQ ID NO：16)
R)P6-MMP11 5’-TCTTGTTCTTCTCGGGACCC-3’ (SEQ ID NO：17)
Probe P6-MMP11 5’FAM-CCTGGTGAGGTTCCCGGTCCATG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：18)
(7)检测CTSL2基因的引物序列为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20，检测CTSL2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：21；具体如下：
CTSL2：
F)P7-CTSL 5’-GGAGAGCAGTGTGGGAAAAG-3’ (SEQ ID NO：19)
R)P7-CTSL 5’-TGTGAAGCCATGTTTCCCTT-3’ (SEQ ID NO：20)
Probe P7-CTSL 5’FAM-TGAACTGCACAATGGGGAATACAGCC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：21)
(8)检测GRB7基因的引物序列为SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23，检测GRB7基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：24；具体如下：
GRB7：
F)P8-GRB7 5’-CTTCGGTTTCTGTGTCAAGC-3’ (SEQ ID NO：22)
R)P8-GRB7 5’-GGCTCTGCTCATCTTCACTG-3’ (SEQ ID NO：23)
Probe P8-GRB7 5’FAM-AAGCTTCGAAATGGCCACAAGGGG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：24)
(9)检测HER2基因的引物序列为SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26，检测HER2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：27；具体如下：
HER2：
F)P9-HER2 5’-AGAACCCCGAGTACTTGACA-3’ (SEQ ID NO：25)
R)P9-HER2 5’-ATAGAGGTTGTCGAAGGCTG-3’ (SEQ ID NO：26)
Probe P9-HER2 5’FAM-CCCACCCTCCTCCTGCCTTCAG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：27)
(10)检测ER基因的引物序列为SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，检测ER基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：30；具体如下：
ER：
F)P10-ER 5’-TCATCCTCTCCCACATCAGG-3’ (SEQ ID NO：28)
R)P10-ER 5’-ATCTCCAGCAGCAGGTCATA-3’ (SEQ ID NO：29)
Probe P10-ER 5’FAM-ATGAAGTGCAAGAACGTGGTGCCC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：30)
(11)检测PGR基因的引物序列为SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，检测PGR基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：33；具体如下：
PGR：
F)P11-PGR 5’-GCTCACAGCGTTTCTATCAAC-3’ (SEQ ID NO：31)
R)P11-PGR 5’-TCACCATCCCTGCCAATATC-3’ (SEQ ID NO：32)
Probe P11-PGR 5’FAM-TTATCCAGTCCCGGGCACTGAGTG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：33)
(12)检测BCL2基因的引物序列为SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35，检测BCL2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：36；具体如下：
BCL2：
F)P12-BCL2 5’-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3’ (SEQ ID NO：34)
R)P12-BCL2 5’-TACTCAGTCATCCACAGGGC-3’ (SEQ ID NO：35)
Probe P12-BCL2 5’FAM-CATGTGTGTGGAGAGCGTCAACCG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：36)
(13)检测SCUBE2基因的引物序列为SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38，检测SCUBE2基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：39；具体如下：
SCUBE2：
F)P13-SCUBE2 5’-CATAGTTCGAGATGGCAGGC-3’ (SEQ ID NO：37)
R)P13-SCUBE2 5’-AAACATCTCTCGGGACTCCT-3’ (SEQ ID NO：38)
Probe P13-SCUBE2 5’FAM-CTGTTTGATGTCCTGGCCCATCCC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：39)
(14)检测GSTM1基因的引物序列为SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41，检测GSTM1基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：42；具体如下：
GSTM1：
F)P14-GSTM1 5’-GGGACGCTCCTGATTATGAC-3’ (SEQ ID NO：40)
R)P14-GSTM1 5’-GTGAGCCCCATCAATCAAGT-3’ (SEQ ID NO：41)
Probe P14-GSTM 5’FAM-TGAAAAATTCAAGCTGGGCCTGGA-3’BHQ1 (SEQ ID NO：42)
(15)检测BAG1基因的引物序列为SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44，检测BAG1基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：45；具体如下：
BAG1：
F)P15-BAG1 5’-CCCAGGTTGTTGAAGAGGTC-3’ (SEQ ID NO：43)
R)P15-BAG1 5’-CCCGGCAACCATCTTGTATT-3’ (SEQ ID NO：44)
Probe P15-BAG1 5’FAM-TGGAAACACCGTTGTCAGCACTTGG-3’BHQ1(SEQ ID NO：45)
(16)检测CD68基因的引物序列为SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，检测CD68基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：48；具体如下：
CD68：
F)P16-CD68 5’-CGGTGGAGTACAATGTGTCC-3’ (SEQ ID NO：46)
R)P16-CD68 5’-GTGGACAGCTGGTGAAAGAA-3’ (SEQ ID NO：47)
Probe P16-CD68 5’FAM-TTCGAGATCTCCAAGCACCCCTGG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：48)
(17)检测β-actin基因的引物序列为SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50，检测β-actin基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：51；具体如下：
β-actin：
F)P17-β-actin 5’-CCTCCCTGGAGAAGAGCTAC-3’ (SEQ ID NO：49)
R)P17-β-actin 5’-GATGTCCACGTCACACTTCA-3’ (SEQ ID NO：50)
Probe P17-β-actin 5’FAM-TGGCATCCACGAAACTACCTTCAA-3’BHQ1 (SEQ ID NO：51)
(18)检测GAPDH基因的引物序列为SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53，检测GAPDH基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：54；具体如下：
GAPDH：
F)P18-GAPDH 5’-CTCCAGAACATCATCCCTGC-3’ (SEQ ID NO：52)
R)P18-GAPDH 5’-GCTTCACCACCTTCTTGATGT-3’ (SEQ ID NO：53)
Probe P18-GAPDH 5’FAM-CTGAACGGGAAGCTCACTGGCATG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：54)
(19)检测RPLP0基因的引物序列为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56，检测RPLP0基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：57；具体如下：
RPLP0：
F)P19-RPLP0 5’-GCAGCATCTACAACCCTGAA-3’ (SEQ ID NO：55)
R)P19-RPLP0 5’-GACTCGTTTGTACCCGTTGA-3’ (SEQ ID NO：56)
Probe P19-RPLP0 5’FAM-TCTGCATTCTCGCTTCCTGGAGGG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：57)
(20)检测GUSB基因的引物序列为SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：59，检测GUSB基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：60；具体如下：
GUSB：
F)P20-GUSB 5’-AGAGCGAGTATGGAGCAGAA-3’ (SEQ ID NO：58)
R)P20-GUSB 5’-AAATGAGCTCTCCAACCACG-3’ (SEQ ID NO：59)
Probe P20-GUSB 5’FAM-TGCAGGGTTTCACCAGGATCCACC-3’BHQ1 (SEQ ID NO：60)
(21)检测TFRC基因的引物序列为SEQ ID NO：61和SEQ ID NO：62，检测TFRC基因的Taqman探针序列为：SEQ ID NO：63；具体如下：
TFRC：
F)P21-TFRC 5’-TGAGAGGTACAACAGCCAAC-3’ (SEQ ID NO：61)
R)P21-TFRC 5’-GAAGAAGTCTCCACGAGCAG-3’ (SEQ ID NO：62)
Probe P21-TFRC 5’FAM-ATGGGCCTGAGTTTACAGTGGCTG-3’BHQ1 (SEQ ID NO：63)
其中，Taqman探针序列的5’端标记有荧光报告基团，3，端标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的乳腺癌21基因检测试剂盒，其特征在于，对应检测同一种基因的引物组和探针比例混合形成引物探针预混液，所述试剂盒包括分别对应乳腺癌21基因基因的21种引物探针预混液。
3.根据权利要求2所述的乳腺癌21基因检测试剂盒，其特征在于，对应检测一种基因的引物组的浓度稀释到0.5μM，探针浓度稀释到0.2-0.3μM后混合形成引物探针预混液。
4.根据权利要求1所述的乳腺癌21基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括2×Microdiag Quantitive Reaction Mix溶液；所述2×Microdiag Quantitive ReactionMix溶液包括高保真Taq酶，1.0-5.0mM的MgCl2，1.0-5.0mM的dNTPs(dATP，dUTP，dGTP，dCTP各1.0-5.0mM)和余量的ddH2O等组分。
5.乳腺癌21基因检测试剂盒的应用方法，基于权利要求1-5任一项所述的乳腺癌21基因检测试剂盒，其特征在于，包括如下步骤：
S1：将2×Microdiag Quantitive Reaction Mix、待测样本的cDNA和ddH2O混匀后，取出分别加入到21种引物探针预混液中进行荧光定量PCR反应；
S2：通过荧光定量PCR扩增后获得的Ct值来计算乳腺癌的复发评分RS值；RS复发风险评分范围为0-100分；在淋巴结阴性、激素受体阳性、HER2阴性的乳腺癌全身辅助治疗中，21基因复发评分分为三种梯度，RS＜26为低复发风险组，RS为26-30位中复发风险组，RS≥31为高复发风险组；在淋巴结阳性、激素受体阳性、HER2阴性的乳腺癌全身辅助治疗中，RS＜18为低复发风险组，RS为18-30为中复发风险组，RS＞31为高复发风险组。
6.根据权利要求5所述的乳腺癌21基因检测试剂盒的应用方法，其特征在于，在步骤S1中，所述待测样本的cDNA的制备方法如下：提取手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋的病理组织，石蜡切片标本的RNA，将提取得到的RNA反转录程cDNA。
7.根据权利要求5所述的乳腺癌21基因检测试剂盒的应用方法，其特征在于，在步骤S1中，所述荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，60℃退火30秒，40个循环。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112646890A (zh) * 2020-12-29 2021-04-13 郑鸿钧 用于预测早期乳腺癌远处复发风险的多基因检测引物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108624697A (zh) * 2018-08-20 2018-10-09 默禾医疗科技（上海）有限公司 一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法
CN110777205A (zh) * 2019-11-26 2020-02-11 合肥仁创基因生物科技有限公司 一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108624697A (zh) * 2018-08-20 2018-10-09 默禾医疗科技（上海）有限公司 一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法
CN110777205A (zh) * 2019-11-26 2020-02-11 合肥仁创基因生物科技有限公司 一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PETRA RIETSCHEL 等: "《Handbook of Biomarkers IN CANCER》", 31 May 2013, CRC PRESS TAYLOR & FRANCIS GROUP *
SOONMYUNG PAIK 等: "A Multigene Assay to Predict Recurrence of Tamoxifen-Treated, Node-Negative Breast Cancer", 《N ENGL J MED》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112646890A (zh) * 2020-12-29 2021-04-13 郑鸿钧 用于预测早期乳腺癌远处复发风险的多基因检测引物

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