CN111041031A - 一种喉鳞癌分子标志物及鉴定和应用 - Google Patents

一种喉鳞癌分子标志物及鉴定和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种喉鳞癌分子标志物及鉴定和应用。在喉鳞癌组织中发现一对检测hsa_circ_0000437特异性良好的引物，q‑circ‑0000437‑F和q‑circ‑0000437‑R。本发明公开了hsa_circ_0000437在73对喉鳞癌组织和癌旁组织中的表达情况，经提取RNA，反转录，qPCR检测hsa_circ_0000437。本发明优势在于在喉鳞癌组中高表达的hsa_circ_0000437可用于喉鳞癌的辅助诊断。

Description

一种喉鳞癌分子标志物及鉴定和应用
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种喉鳞癌分子标志物及鉴定和应用。
背景技术
喉鳞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)起源于喉黏膜上皮，居头颈部鳞癌第2位，约占全身恶性肿瘤的6％。喉鳞癌具有局部侵袭及早期颈淋巴结转移的恶性生物学行为，成为患者复发及预后不良的主要风险因素，患者一旦发生颈淋巴结转移，其生存率降低一半。对于喉鳞癌侵袭转移的信号通路机制研究迫在眉睫，这将有助于深入了解转移过程，鉴定新的治疗靶标，为临床诊断和治疗奠定基础。
环状RNA(circRNA)是一种非编码的内源性RNA(Non-coding RNA；ncRNA)，由线性RNA通过反向剪接形成；除此之外，circRNA为环状闭合结构，没有5’端帽子和3’端多聚腺苷酸尾巴。circRNA因其自身结构特点，在细胞中、尤其是哺乳动物细胞中时具有内生、丰富、保守、稳定、组织特异性、时空特异性等特点。越来越多的研究发现circRNA的表达与多种疾病相关，并且具有作为疾病新型诊断或预后预测的生物标志物的重要潜能。
发明内容
针对上述问题本发明提供了一种喉鳞癌分子标志物及鉴定和应用。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种喉鳞癌分子标志物，所述喉鳞癌分子标志物hsa_circ_0000437的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的hsa_circ_0000437的结构为由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列首尾连接成的环状结构；环状hsa_circ_0000437由人12号染色体108,645,109和108,731,596区域的CORO1C基因剪切而成。
一种喉鳞癌分子标志物的鉴定方法，包括以下步骤：
步骤1，设计标志物引物；从circbank中找到hsa_circ_0000437的线性序列，将3’端146个碱基移动到5’端序列前，GCCAGAAA即为反向连接点，在连接点上下游设计引物，引物特异性很好，预计扩增产物大小为221base pair；分析hsa_circ_0000437序列，发现hsa_circ_0000437序列母本基因为CORO1C，hsa_circ_0000437序列由母本基因中的第7和8外显子反向连接形成，选取73对喉鳞癌患者的癌组织和癌旁组织，通过实时荧光定量分析hsa_circ_0000437的表达量；
步骤2，RNA抽提：将组织研磨机模块-80℃预冷后，从液氮中快速取出组织样本，在EP管中加入Trizol以及钢珠，将组织样本转移至EP管中，组织研磨机75Hz研磨85s；然后在室温下静置5min，12,000g，4℃离心15min；转移上清至新1.5mL EP管中，加200μL氯仿，用力震荡15s；然后待乳化混匀后静置5min，4℃，转速12,000g，离心15min，转移上清至新1.5mLEP管；加入与上清等体积的异丙醇后轻摇混匀，室温静置10min；4℃，转速12,000g，离心10min，离心管底部有白色沉淀产生，弃上清；继续向EP管中加入1mL用RNase free水配制的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤沉淀；4℃，转速12,000g，离心5min，弃上清，用移液枪吸尽水和乙醇；最后将有沉淀的EP管置于超净台中，干燥5min；沉淀溶解，提取Total RNA于-80℃保存；
步骤3，RT-PCR：在4℃下配制反转录反应液，然后加入Total RNA样品进行反转录；
步骤4，qPCR：配制PCR反应液，设置3个复孔，然后进行PCR反应，增加熔解曲线。
进一步，所述步骤1设计标志物引物中标志物hsa_circ_0000437的引物由正向引物和反向引物组成；
正向引物q-circ-0000437-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
5’-AAGGGTGACAGCAGTATTC-3’；
反向引物q-circ-0000437-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
5’-GTCATAGAAAGGCAGCAAC-3’。
进一步，所述步骤3反转录中所述反转录反应液为HiScript 1st Strand cDNASynthesis Kit；
反转录体系由20μL RNase free ddH2O、10μL 2×RT Mix、2μL HiScript IIEnzyme Mix、1μL Oligo dT23VN(50μM)、1μL Random hexamers(50ng/μL)、1000ng TotalRNA组成；
反转录反应条件为:在25℃下反转录5min；然后在50℃下反转录15min；最后在85℃下反转录5min。
进一步，所述步骤4qPCR中所述PCR反应液由10μL AceQ qPCR SYBR Green MasterMix、0.4μL Primer1(10μM)、0.4μL Primer2(10μM)、2μL Template cDNA、7.2μL ddH2O组成，总体积为20μL；
所述PCR反应的条件为：在95℃下反应5min，然后在95℃下反应10sec；再在60℃下反应30sec；对在95℃下反应10sec，在60℃下反应30sec，持续40个循环；
增加熔解曲线的条件为：在95℃下熔解15s，在60℃下熔解60s，然后以每个循环升高0.3℃并收集一次荧光信号，直到95℃，在95℃下熔解15s。
一种喉鳞癌分子标志物的应用，在喉鳞癌组织中高表达，应用于喉鳞癌的辅助诊断。
本发明公开了hsa_circ_0000437的检测引物，及喉鳞癌组织提取RNA，反转录，qPCR的方法，此外还公开了hsa_circ_0000437在73对喉鳞癌组织和癌旁组织中的表达情况，及其表达量与喉鳞癌患者临床参数的关系，发现hsa_circ_0000437在喉鳞癌组织中高表达，且与喉鳞癌患者的T分期和临床分析有关，P值分别为0.0065和0.0189。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
(1)本方法利用一对引物经qPCR鉴定出喉鳞癌组织中高表达的标志物hsa_circ_0000437，为喉鳞癌的早期发现与诊断提供参考价值。
(2)本方法中标志物的引物特异性强、qPCR方法简单，具有广泛的临床应用前景。
附图说明
图1为标志物hsa_circ_0000437的引物的溶解曲线图；
图2为PCR产物的核酸凝胶电泳图；
图3为标志物成环示意图；
图4为标志物在喉鳞癌组织中的表达量示意图。
具体实施方式
实施例1
本发明喉鳞癌分子标志物hsa_circ_0000437的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，hsa_circ_0000437的结构由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列首尾连接成的环状结构；
环状hsa_circ_0000437由人12号染色体108,645,109和-108,731,596区域的CORO1C基因剪切而成。
本发明喉鳞癌分子标志物hsa_circ_0000437的鉴定方法：
从circbank中找到hsa_circ_0000437的线性序列，将3’端146个碱基(蓝色部分)移动5’端序列前面，GCCAGAAA即为反向连接点，在连接点上下游设计引物，引物特异性很好，见图1标志物hsa_circ_0000437的引物的溶解曲线图，其中引物的Tm值为85℃；扩增产物大小为221bp(base pair)，如图2PCR产物的核酸凝胶电泳图所示，将该引物的qPCR扩增产物回收，经2％的琼脂糖凝胶电泳分离，与DNAmarker相比，在200bp-300bp之间，与预期大小221bp相符。
分析hsa_circ_0000437序列，如图3标志物成环示意图所示，标志物由其母本基因CORO1C的第7和8外显子反向连接形成，GA为连接点碱基。
选取73对喉鳞癌患者的癌组织和癌旁组织，通过实时荧光定量分析hsa_circ_0000437的表达量，见图4标志物在喉鳞癌组织中的表达量，qPCR验证标志物在73对喉鳞癌组织和癌旁组织中的表达量，喉鳞癌组相对癌旁组归一化后，标志物在喉鳞癌组中高表达，且p值小于0.001。
RNA抽提：
1、将组织研磨机模块-80℃预冷后，从液氮中快速取出组织样本，EP管中加入Trizol以及钢珠，将组织转移至EP管中，组织研磨机75Hz研磨85s。
2、室温静置5min，12,000g，4℃离心15min。
3、用移液枪将上清转移至新的1.5mL EP管中，后加入200uL的氯仿，用力震荡15s，待乳化混匀后静置5min；
4、4℃，转速12,000g，离心15min，将上清转移到新的1.5mL EP管；加入与上清等体积的异丙醇后轻摇混匀，室温静置10min；
5、4℃，转速12,000g离心10min，离心管底部有白色沉淀产生，弃上清；
6、向EP管中加入用RNase free水配制的75％乙醇1mL，轻轻上下颠倒洗涤沉淀；
7、4℃，转速12,000g离心5min，弃上清，用移液枪吸尽水和乙醇；
8、将有沉淀的EP管置于超净台中打开风机，干燥约5min；
9、沉淀溶于适量的RNase-free ddH2O中，溶解沉淀；
10、提取的Total RNA直接进行下一步反转录实验或于-80℃保存。
RT-PCR：
按下列组份在4℃下配制RT反应液然后加入Total RNA样品；为了保证反应液配制的准确性，减少分装时造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。
试剂：HiScript 1st Strand cDNASynthesis Kit
反转录体系：
Figure BDA0002376402360000061
反转录反应条件如下:
25℃ 5min
50℃ 15min
85℃ 5min
实时荧光定量PCR
1、配制PCR反应液，设置3个复孔：
Figure BDA0002376402360000062
Figure BDA0002376402360000071
2、进行PCR反应，程序如下：
Figure BDA0002376402360000072
增加熔解曲线
95℃，15s，
60℃，60s，
95℃，15s；
在60℃升到95℃过程中，每升0.3℃收集一次荧光信号；
将hsa_circ_0000437在73对组织中的表达量取中位数，高于中位数定义为高表达患者，低于中位数定义为低表达患者，统计circ_0000437表达量与73位喉鳞癌患者的病理信息的关系，并进行p-Value分析，见表1。
表1，73例喉鳞癌患者中hsa_circ_0000437表达量与临床参数的关系
Figure BDA0002376402360000073
Figure BDA0002376402360000081
上述内容对实施例做了详细的说明，但本发明不受上述实施方式和实施例的限制，在不脱离本发明宗旨的前提下，在本领域技术人员所具备的知识范围内还可以对其进行各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明要保护的范围之内。
序列表
<110> 山西医科大学第一医院
<120> 一种喉鳞癌分子标志物及鉴定和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 251
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 1
aaaaatatgc aggaaccaat tgctcttcat gagatggaca ctagcaatgg ggtgttgctg 60
cctttctatg accctgacac cagcatcatt tacttatgtg gaaagggtga cagcagtatt 120
cgctattttg agatcacgga tgaatccccg tacgtccact acctcaacac attcagcagc 180
aaggagcctc agagagggat gggttacatg cccaagaggg gacttgatgt taacaaatgt 240
gagattgcca g 251
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 2
aagggtgaca gcagtattc 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 3
gtcatagaaa ggcagcaac 19

Claims (6)

1.一种喉鳞癌分子标志物，其特征在于：所述喉鳞癌分子标志物为hsa_circ_0000437的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的hsa_circ_0000437的结构由如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列首尾连接成的环状结构；环状hsa_circ_0000437由人12号染色体108,645,109和108,731,596区域的CORO1C基因剪切而成。
2.一种喉鳞癌分子标志物的鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，设计标志物引物：从circbank中找到hsa_circ_0000437的线性序列，将3’端146个碱基移动到5’端序列前，GCCAGAAA即为反向连接点，在连接点上下游设计引物，预计扩增产物大小为221 base pair；分析hsa_circ_0000437序列，发现hsa_circ_0000437序列母本基因为CORO1C，hsa_circ_0000437序列由母本基因中的第7和8外显子反向连接形成，选取73对喉鳞癌患者的癌组织和癌旁组织，通过实时荧光定量PCR(qPCR)分析hsa_circ_0000437的表达量；
步骤2，RNA抽提：将组织研磨机模块-80℃预冷后，从液氮中快速取出组织样本，在EP管中加入Trizol以及钢珠，将组织样本转移至EP管中，组织研磨机75Hz研磨85s；然后在室温下静置5min，12,000g，4℃离心15min；转移上清至新1.5mL EP管中，加200μL氯仿，用力震荡15s；然后待乳化混匀后静置5min，4℃，转速12,000g，离心15min，转移上清至新1.5mL EP管；加入与上清等体积的异丙醇后轻摇混匀，室温静置10min；4℃，转速12,000g，离心10min，离心管底部有白色沉淀产生，弃上清；继续向EP管中加入1mL用RNase free水配制的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤沉淀；4℃，转速12,000g，离心5min，弃上清，用移液枪吸尽水和乙醇；最后将有沉淀的EP管置于超净台中，干燥5min；沉淀溶解，提取Total RNA于-80℃保存；
步骤3，反转录：在4℃下配制反转录反应液，然后加入Total RNA样品进行反转录；
步骤4，qPCR：配制PCR反应液，设置3个复孔，然后进行PCR反应，增加熔解曲线。
3.根据权利要求2所述的一种喉鳞癌分子标志物的鉴定方法，其特征在于：所述步骤1设计标志物引物中标志物hsa_circ_0000437的引物由正向引物和反向引物组成；
正向引物q-circ-0000437-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’-AAGGGTGACAGCAGTATTC-3’；
反向引物q-circ-0000437-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’-GTCATAGAAAGGCAGCAAC-3’。
4.根据权利要求2所述的一种喉鳞癌分子标志物的鉴定方法，其特征在于：所述步骤3反转录中所述反转录反应液为HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit；
反转录体系由20μL RNase free ddH2O、10μL 2×RT Mix、2μL HiScript II EnzymeMix、1μL Oligo dT23VN(50μM)、1μL Random hexamers(50ng/μL)、1000ng Total RNA组成；
反转录反应条件为:在25℃下反转录5min；然后在50℃下反转录15min；最后在85℃下反转录5min。
5.根据权利要求2所述的一种喉鳞癌分子标志物的鉴定方法，其特征在于：所述步骤4qPCR中所述PCR反应液由10μL AceQ qPCR SYBR Green Master Mix、0.4μL Primer1(10μM)、0.4μL Primer2(10μM)、2μL Template cDNA、7.2μL ddH2O组成，总体积为20μL；
所述PCR反应的条件为：在95℃下反应5min，然后在95℃下反应10sec；再在60℃下反应30sec；对在95℃下反应10sec，在60℃下反应30sec，持续40个循环；
增加熔解曲线的条件为：在95℃下熔解15s，在60℃下熔解60s，然后以每个循环升高0.3℃并收集一次荧光信号，直到95℃，在95℃下熔解15s。
6.一种喉鳞癌分子标志物的应用，其特征在于：在喉鳞癌组织中高表达，应用于喉鳞癌的辅助诊断。
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