CN110777205A - 一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110777205A CN110777205A CN201911174462.4A CN201911174462A CN110777205A CN 110777205 A CN110777205 A CN 110777205A CN 201911174462 A CN201911174462 A CN 201911174462A CN 110777205 A CN110777205 A CN 110777205A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- sequence
- named
- probe
- primers
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法,试剂盒包括:6管反应体系,每管检测3‑4种基因,标记3‑4种荧光基团;引物探针如SEQ ID NO.01‑63,本发明优化了多重逆转录检测体系,使得21个基因可以在6管反应中得到准确检测,大大提高了检测通量、灵敏度、特异性;本发明降低了实验操作的难度,使得操作简便、检测时间短、成本低;本发明再配合一步法逆转录体系,直接使用RNA作为检测模板,进一步简便操作,减短检测时间,避免了潜在的污染。
Description
技术领域
本发明涉及分子诊断技术领域,特别是一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌,50万妇女因乳腺癌死亡。北美和欧洲等发达国家是乳腺癌的高发区,虽然亚洲是乳腺癌的低发区,但乳腺癌的发病率逐年升高,且有年轻化趋向。同时,中国的乳腺癌发病的增长率却是全球第一。然而,癌症的诊断和治疗仍主要依靠经典的组织病理学和免疫组织化学技术,需要一种更量化的诊断方法和合理的个体化治疗。由于仅使用他莫西芬治疗的患者术后10年远期复发的可能性约为15%,如果将其提供给所有人,至少85%的患者会过度使用化疗。因此需要一种更为准确的方法能够快速的检测并评估患者的复发风险,及时辅助临床治疗、提高用药的有效率,降低患者经济负担。
21基因检测不仅能提供1-5年及5年后复发风险,还能预测ER阳性浸润性乳腺癌患者的对化疗和内分泌治疗的获益程度。乳腺癌21基因检测于2005年获美国FDA批准,是唯一获得美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国国立综合癌症网络(NCCN)联合推荐的多基因检测项目。
乳腺癌21基因检测通过检测21个基因,观察它们之间的相互作用来判断肿瘤特性,从而可预测乳腺癌复发指数以及接受化疗的效益比。由16个癌症相关基因和5个内参基因组成。16个癌症相关基因分成五组,细胞增殖相关的基因:Ki67、STK15、Survivin、CCNB1、MYBL2;细胞侵袭相关基因:MMP11、CTSL2;雌激素相关基因:ER、PGR、BCL2、SCUBE2;HER2相关基因:GRB7和ERBB2;三个独立的基因:GSTM1、CD68、BAG1。5个内参基因:ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS、TFRC。上述基因的选择是根据癌症相关文献、微阵列数据资料、基因组学数据库和分子生物学资料选定250个基因作为候选基因。根据3个独立的临床试验共447例患者的研究结果,选取与远处复发显著相关的基因,对250个候选基因进一步筛选,最终确定了上述16个癌症相关基因,并确定了5个管家基因作为参考基因。乳腺癌复发风险现行的评分标准为复发评分RS<18,为低复发风险,化疗获益小,可考虑只进行内分泌治疗;RS位于18<RS<31之间,为复发风险不明确,可考虑根据临床其他指标确定是否需要辅助化疗;RS>31,为高复发风险,辅助化疗获益较大。
现有乳腺癌21基因检测方法均使用两步法逆转录PCR,步骤繁琐,且容易造成cDNA污染,另外,检测管数常使用21个,大大增加了成本和操作复杂度;市场需要一种操作简便,检测通量高的乳腺癌21基因检测方法,本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法,本发明优化了多重逆转录检测体系,使得21个基因可以在6管反应中得到准确检测,大大提高了检测通量,节省了成本,降低了实验操作的难度;再配合一步法逆转录体系,直接使用RNA作为检测模板,操作简便,检测时间短,避免了潜在的污染。
为了实现上述目标,本发明采用如下的技术方案:
一种乳腺癌21基因检测试剂盒,包括:6管反应体系,每管检测3-4种基因,标记3-4种荧光基团;
乳腺癌21基因包括:STK15(AURKA)、Survivin(BIRC5)、CCNB1、Ki67(MKI67)、MYBL2、HER2(ERBB2)、GRB7、BCL2、ER、PGR、SCUBE2、MMP11、CTSL2、GSTM1、CD68、BAG1、ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC;
针对AURKA基因的引物包括:名称为F1,序列为SEQ ID NO.01,名称为R1,序列为SEQ ID NO.02;探针包括:名称为P1,序列为SEQ ID NO.43;
针对BIRC5基因的引物包括:名称为F2,序列为SEQ ID NO.03,名称为R2,序列为SEQ ID NO.04,探针包括:名称为P2,序列为SEQ ID NO.44;
针对CCNB1基因的引物包括:名称为F3,序列为SEQ ID NO.05,名称为R3,序列为SEQ ID NO.06,探针包括:名称为P3,序列为SEQ ID NO.45;
针对Ki67基因的引物包括:名称为F4,序列为SEQ ID NO.07,名称为R4,序列为SEQID NO.08,探针包括:名称为P4,序列为SEQ ID NO.46;
针对MYBL2基因的引物包括:名称为F5,序列为SEQ ID NO.09,名称为R5,序列为SEQ ID NO.10,探针包括:名称为P5,序列为SEQ ID NO.47;
针对ERBB2基因的引物包括:名称为F6,序列为SEQ ID NO.11,名称为R6,序列为SEQ ID NO.12,探针包括:名称为P6,序列为SEQ ID NO.48;
针对GRB7基因的引物包括:名称为F7,序列为SEQ ID NO.13,名称为R7,序列为SEQID NO.14,探针包括:名称为P7,序列为SEQ ID NO.49;
针对BCL2基因的引物包括:名称为F8,序列为SEQ ID NO.15,名称为R8,序列为SEQID NO.16,探针包括:名称为P8,序列为SEQ ID NO.50;
针对ER基因的引物包括:名称为F9,序列为SEQ ID NO.17,名称为R9,序列为SEQID NO.18,探针包括:名称为P9,序列为SEQ ID NO.51;
针对PGR基因的引物包括:名称为F10,序列为SEQ ID NO.19,名称为R10,序列为SEQ ID NO.20,探针包括:名称为P10,序列为SEQ ID NO.52;
针对SCUBE2基因的引物包括:名称为F11,序列为SEQ ID NO.21,名称为R11,序列为SEQ ID NO.22,探针包括:名称为P11,序列为SEQ ID NO.53;
针对CTSL2基因的引物包括:名称为F12,序列为SEQ ID NO.23,名称为R12,序列为SEQ ID NO.24,探针包括:名称为P12,序列为SEQ ID NO.54;
针对MMP11基因的引物包括:名称为F13,序列为SEQ ID NO.25,名称为R13,序列为SEQ ID NO.26,探针包括:名称为P13,序列为SEQ ID NO.55;
针对BAG1基因的引物包括:名称为F14,序列为SEQ ID NO.27,名称为R14,序列为SEQ ID NO.28,探针包括:名称为P14,序列为SEQ ID NO.56;
针对CD68基因的引物包括:名称为F15,序列为SEQ ID NO.29,名称为R15,序列为SEQ ID NO.30,探针包括:名称为P15,序列为SEQ ID NO.57;
针对GSTM1基因的引物包括:名称为F16,序列为SEQ ID NO.31,名称为R16,序列为SEQ ID NO.32,探针包括:名称为P16,序列为SEQ ID NO.58;
针对ACTB基因的引物包括:名称为F17,序列为SEQ ID NO.33,名称为R17,序列为SEQ ID NO.34,探针包括:名称为P17,序列为SEQ ID NO.59;
针对GAPDH基因的引物包括:名称为F18,序列为SEQ ID NO.35,名称为R18,序列为SEQ ID NO.36,探针包括:名称为P18,序列为SEQ ID NO.60;
针对GUS基因的引物包括:名称为F19,序列为SEQ ID NO.37,名称为R19,序列为SEQ ID NO.38,探针包括:名称为P19,序列为SEQ ID NO.61;
针对RPLP0基因的引物包括:名称为F20,序列为SEQ ID NO.39,名称为R20,序列为SEQ ID NO.40,探针包括:名称为P20,序列为SEQ ID NO.62;
针对TFRC基因的引物包括:名称为F21,序列为SEQ ID NO.41,名称为R21,序列为SEQ ID NO.42,探针包括:名称为P21,序列为SEQ ID NO.63。
前述的一种乳腺癌21基因检测试剂盒,荧光基团包括:FAM,HEX,ROX,Cy5;淬灭基团为MGB。
前述的一种乳腺癌21基因检测试剂盒,6管反应体系包括:反应液I、反应液II、反应液III、反应液IV、反应液V和反应液VI;
反应液I包括:F1,R1,P1,F2,R2,P2,F3,R3,P3,F4,R4,P4;
反应液II包括:F5,R5,P5,F6,R6,P6,F7,R7,P7,F8,R8,P8;
反应液III包括:F9,R9,P9,F10,R10,P10,F11,R11,P11;
反应液IV包括:F12,R12,P12,F13,R13,P13,F14,R14,P14;
反应液V包括:F15,R15,P15,F16,R16,P16,F17,R17,P17,F18,R18,P18;
反应液VI包括:F19,R19,P19,F20,R20,P20,F21,R21,P21。
一种乳腺癌21基因检测试剂盒的检测方法,包括如下步骤:
一,设计引物探针:
根据乳腺癌21基因设计特异引物和TaqMan-MGB探针;
乳腺癌21基因包括:STK15(AURKA)、Survivin(BIRC5)、CCNB1、Ki67(MKI67)、MYBL2、HER2(ERBB2)、GRB7、BCL2、ER、PGR、SCUBE2、MMP11、CTSL2、GSTM1、CD68、BAG1、ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC;
针对AURKA基因的引物包括:名称为F1,序列为SEQ ID NO.01,名称为R1,序列为SEQ ID NO.02;探针包括:名称为P1,序列为SEQ ID NO.43;
针对BIRC5基因的引物包括:名称为F2,序列为SEQ ID NO.03,名称为R2,序列为SEQ ID NO.04,探针包括:名称为P2,序列为SEQ ID NO.44;
针对CCNB1基因的引物包括:名称为F3,序列为SEQ ID NO.05,名称为R3,序列为SEQ ID NO.06,探针包括:名称为P3,序列为SEQ ID NO.45;
针对Ki67基因的引物包括:名称为F4,序列为SEQ ID NO.07,名称为R4,序列为SEQID NO.08,探针包括:名称为P4,序列为SEQ ID NO.46;
针对MYBL2基因的引物包括:名称为F5,序列为SEQ ID NO.09,名称为R5,序列为SEQ ID NO.10,探针包括:名称为P5,序列为SEQ ID NO.47;
针对ERBB2基因的引物包括:名称为F6,序列为SEQ ID NO.11,名称为R6,序列为SEQ ID NO.12,探针包括:名称为P6,序列为SEQ ID NO.48;
针对GRB7基因的引物包括:名称为F7,序列为SEQ ID NO.13,名称为R7,序列为SEQID NO.14,探针包括:名称为P7,序列为SEQ ID NO.49;
针对BCL2基因的引物包括:名称为F8,序列为SEQ ID NO.15,名称为R8,序列为SEQID NO.16,探针包括:名称为P8,序列为SEQ ID NO.50;
针对ER基因的引物包括:名称为F9,序列为SEQ ID NO.17,名称为R9,序列为SEQID NO.18,探针包括:名称为P9,序列为SEQ ID NO.51;
针对PGR基因的引物包括:名称为F10,序列为SEQ ID NO.19,名称为R10,序列为SEQ ID NO.20,探针包括:名称为P10,序列为SEQ ID NO.52;
针对SCUBE2基因的引物包括:名称为F11,序列为SEQ ID NO.21,名称为R11,序列为SEQ ID NO.22,探针包括:名称为P11,序列为SEQ ID NO.53;
针对CTSL2基因的引物包括:名称为F12,序列为SEQ ID NO.23,名称为R12,序列为SEQ ID NO.24,探针包括:名称为P12,序列为SEQ ID NO.54;
针对MMP11基因的引物包括:名称为F13,序列为SEQ ID NO.25,名称为R13,序列为SEQ ID NO.26,探针包括:名称为P13,序列为SEQ ID NO.55;
针对BAG1基因的引物包括:名称为F14,序列为SEQ ID NO.27,名称为R14,序列为SEQ ID NO.28,探针包括:名称为P14,序列为SEQ ID NO.56;
针对CD68基因的引物包括:名称为F15,序列为SEQ ID NO.29,名称为R15,序列为SEQ ID NO.30,探针包括:名称为P15,序列为SEQ ID NO.57;
针对GSTM1基因的引物包括:名称为F16,序列为SEQ ID NO.31,名称为R16,序列为SEQ ID NO.32,探针包括:名称为P16,序列为SEQ ID NO.58;
针对ACTB基因的引物包括:名称为F17,序列为SEQ ID NO.33,名称为R17,序列为SEQ ID NO.34,探针包括:名称为P17,序列为SEQ ID NO.59;
针对GAPDH基因的引物包括:名称为F18,序列为SEQ ID NO.35,名称为R18,序列为SEQ ID NO.36,探针包括:名称为P18,序列为SEQ ID NO.60;
针对GUS基因的引物包括:名称为F19,序列为SEQ ID NO.37,名称为R19,序列为SEQ ID NO.38,探针包括:名称为P19,序列为SEQ ID NO.61;
针对RPLP0基因的引物包括:名称为F20,序列为SEQ ID NO.39,名称为R20,序列为SEQ ID NO.40,探针包括:名称为P20,序列为SEQ ID NO.62;
针对TFRC基因的引物包括:名称为F21,序列为SEQ ID NO.41,名称为R21,序列为SEQ ID NO.42,探针包括:名称为P21,序列为SEQ ID NO.63;
步骤二,提取样品RNA;
步骤三,将对应于21个基因的引物探针分到6管反应体系,每管检测3-4种基因,标记3-4种荧光基团,使用一步法逆转录PCR进行检测;
步骤四,RS计算;
第一步:对16个基因的表达值进行标准化处理,通过各基因与5个参考基因的CT值差得到,标准化后的值在0-15;
第二步:计算组得分,
HER2分组值(HS)=0.9*GRB7+0.1*HER2,如果小于8,则取8;
雌激素相关基因分值(ES)=(0.8*ER+1.2*PGR+BCL2+SCUBE2)/4;
增殖相关基因组分值(PS)=(BIRC5+MKI67+MYBL2+CCNB1+AURKA)/5,如果小于6.5,则取6.5;
侵袭相关基因组分值(IS)=(CTSL2+MMP11)/2;
未矫正的复发风险值为RSU:
RSU=+0.47*HS-0.34*ES+1.04*PS+0.10*IS+0.05*CD68-0.08GSTM1-0.07*BAG1;
复发风险值RS:
如果RSU在0和100范围内,RS=20*(RSU-6.7);
如果RSU小于0,RS=0;
如果RSU大于100,RS=100;
如果RS<18,属于低风险;
如果18<RS<31,属于中风险;
如果RS>31,属于高风险。
前述的一种乳腺癌21基因检测试剂盒的检测方法,
步骤二,提取样品RNA;
用RNA提取试剂盒对新鲜病理组织进行提取,经紫外分光光度计检测提取质量,所提RNA的A260/A280应在1.8-2.0之间。
前述的一种乳腺癌21基因检测试剂盒的检测方法,合成好的引物和探针使用pH为8.3的Tris-HCl进行溶解。
前述的一种乳腺癌21基因检测试剂盒的检测方法,6管反应体系包括:反应液I、反应液II、反应液III、反应液IV、反应液V和反应液VI;
反应液I包括:一步法RT-PCR Mix,F1,R1,P1,F2,R2,P2,F3,R3,P3,F4,R4,P4,模板;
反应液II包括:一步法RT-PCR Mix,F5,R5,P5,F6,R6,P6,F7,R7,P7,F8,R8,P8,模板;
反应液III包括:一步法RT-PCR Mix,F9,R9,P9,F10,R10,P10,F11,R11,P11,模板;
反应液IV包括:一步法RT-PCR Mix,F12,R12,P12,F13,R13,P13,F14,R14,P14,模板;
反应液V包括:一步法RT-PCR Mix,F15,R15,P15,F16,R16,P16,F17,R17,P17,F18,R18,P18,模板;
反应液VI包括:一步法RT-PCR Mix,F19,R19,P19,F20,R20,P20,F21,R21,P21,模板。
前述的一种乳腺癌21基因检测试剂盒的检测方法,6管反应体系包括:反应液I、反应液II、反应液III、反应液IV、反应液V和反应液VI;
反应液I包括:一步法RT-PCR Mix,F1,R1,P1,F3,R3,P3,F9,R9,P9,模板;
反应液II包括:一步法RT-PCR Mix,F6,R6,P6,F7,R7,P7,F12,R12,P12,F18,R18,P18,模板;
反应液III包括:一步法RT-PCR Mix,F2,R2,P2,F10,R10,P10,F11,R11,P11,模板;
反应液IV包括:一步法RT-PCR Mix,F13,R13,P13,F14,R14,P14,F20,R20,P20,模板;
反应液V包括:一步法RT-PCR Mix,F8,R8,P8,F15,R15,P15,F16,R16,P16,F17,R17,P17,模板;
反应液VI包括:一步法RT-PCR Mix,F4,R4,P4,F5,R5,P5,F19,R19,P19,F21,R21,P21,模板。
前述的一种乳腺癌21基因检测试剂盒的检测方法,6管反应体系包括:反应液I、反应液II、反应液III、反应液IV、反应液V和反应液VI;
反应液I包括:一步法RT-PCR Mix,F2,R2,P2,F3,R3,P3,F11,R11,P11,F15,R15,P15,模板;
反应液II包括:一步法RT-PCR Mix,F5,R5,P5,F6,R6,P6,F7,R7,P7,F8,R8,P8,模板;
反应液III包括:一步法RT-PCR Mix,F4,R4,P4,F9,R9,P9,F10,R10,P10,模板;
反应液IV包括:一步法RT-PCR Mix,F12,R12,P12,F13,R13,P13,F14,R14,P14,F19,R19,P19,模板;
反应液V包括:一步法RT-PCR Mix,F16,R16,P16,F17,R17,P17,F18,R18,P18,模板;
反应液VI包括:一步法RT-PCR Mix,F1,R1,P1,F20,R20,P20,F21,R21,P21,模板。
本发明的有益之处在于:
本发明优化了多重逆转录检测体系,使得21个基因可以在6管反应中得到准确检测,大大提高了检测通量,节省了成本,降低了检测时间,降低了实验操作的难度;
体系通过优化和筛选,达到了较高灵敏度,且特异性强;
本发明使用一步法多重RT-PCR,不需要先进行逆转录,简化了样本制备过程,同时避免cDNA污染。
附图说明
图1是本发明检测方法的一种实施例的流程图;
图2是本发明检测1例高风险样本的结果图;
图3是本发明检测1例低风险样本的结果图;
图4是本发明高风险样本检测灵敏度的结果图;
图5是本发明低风险样本检测灵敏度的结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
如图1所示,一种乳腺癌21基因检测试剂盒的检测方法,包括如下步骤:
(1)引物探针设计
从UCSC数据库中下载21基因序列,具体为16个癌症相关基因和5个参考基因,癌症相关基因分为5组:增殖相关基因组,包括Ki67(MKI67)、STK15(AURKA)、Survivin(BIRC5)、CCNB1和MYBL2;表皮生长因子受体相关基因组,包括GRB7和HER2;激素相关基因组,包括ER、PgR、BCL2和SCUBE2;浸润相关基因组,包括MMP11和CTSL2以及3个未分类基因GSTM1、CD68和BAG1。5个参考基因分别为ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC。依据设计特异引物和TaqMan-MGB探针,序列如表4中的SEQ ID NO.01-SEQ ID NO.63,引物探针顺序是按照表1的各基因顺序排列。
表1:21基因检测分管情况
表2:21基因检测分管情况
表3:21基因检测分管情况
将21个基因分到6管反应体系,每管检测3-4种基因,标记3-4种荧光基团,使用一步法逆转录PCR进行检测,根据软件给出的CT值,用复发风险评分算法计算复发风险值RS。引物和探针均由专业公司合成并纯化,合成好的引物和探针使用Tris-HCl(pH 8.3)进行溶解,并用NanoReady紫外分光光度计进行浓度和纯度的测定,最后稀释至50μM,分装并保存在-20℃冰箱。
表4:21基因的引物探针序列信息
(2)RNA提取
新鲜病理组织使用TIANGEN的RNA提取试剂盒进行提取;石蜡包埋组织或切片,建议采用Qiagen公司的FFPE组织RNA提取试剂盒(RNeasy FFPE Kit)进行提取。经紫外分光光度计检测提取质量,所提RNA的A260/A280应在1.8-2.0之间,提取后的RNA应立即进行检测,或溶于0.1%DEPC水中,若暂时不用请于-70℃以下保存。
(3)PCR反应体系
作为一种实施例,6管反应体系包括:反应液I、反应液II、反应液III、反应液IV、反应液V和反应液VI;
反应液I包括:F1,R1,P1,F2,R2,P2,F3,R3,P3,F4,R4,P4;
反应液II包括:F5,R5,P5,F6,R6,P6,F7,R7,P7,F8,R8,P8;
反应液III包括:F9,R9,P9,F10,R10,P10,F11,R11,P11;
反应液IV包括:F12,R12,P12,F13,R13,P13,F14,R14,P14;
反应液V包括:F15,R15,P15,F16,R16,P16,F17,R17,P17,F18,R18,P18;
反应液VI包括:F19,R19,P19,F20,R20,P20,F21,R21,P21。
具体的反应体系按表5-1、表6-1、表7-1、表8-1、表9-1和表10-1的用量分别配制PCR反应液I、反应液II、反应液III、反应液IV、反应液V和反应液VI,每个反应管检测的基因如表1。
需要说明的是:反应体系的引物探针的组合并非只有这一种,也可以是以下组合:
作为一种实施例,反应体系的引物探针的组合可以是:
反应液I包括:F1,R1,P1,F3,R3,P3,F9,R9,P9,分别标记FAM、ROX、HEX;
反应液II包括:F6,R6,P6,F7,R7,P7,F12,R12,P12,F18,R18,P18,分别标记HEX、ROX、FAM、Cy5;
反应液III包括:F2,R2,P2,F10,R10,P10,F11,R11,P11,分别标记HEX、FAM、ROX;
反应液IV包括:F13,R13,P13,F14,R14,P14,F20,R20,P20,分别标记HEX、ROX、FAM;
反应液V包括:F8,R8,P8,F15,R15,P15,F16,R16,P16,F17,R17,P17,分别标记Cy5、FAM、HEX、ROX;
反应液VI包括:F4,R4,P4,F5,R5,P5,F19,R19,P19,F21,R21,P21,分别标记Cy5、FAM、HEX、ROX。
具体的反应体系按表5-2、表6-2、表7-2、表8-2、表9-2和表10-2的用量分别配制PCR反应液I、反应液II、反应液III、反应液IV、反应液V和反应液VI,每个反应管检测的基因如表2。
作为一种实施例,反应体系的引物探针的组合还可以是:
反应液I包括:F2,R2,P2,F3,R3,P3,F11,R11,P11,F15,R15,P15,分别标记HEX、ROX、FAM、Cy5;
反应液II包括:F5,R5,P5,F6,R6,P6,F7,R7,P7,F8,R8,P8,分别标记FAM、HEX、ROX、Cy5;
反应液III包括:F4,R4,P4,F9,R9,P9,F10,R10,P10,分别标记Cy5、FAM、HEX;
反应液IV包括:F12,R12,P12,F13,R13,P13,F14,R14,P14,F19,R19,P19,分别标记FAM、HEX、ROX、Cy5;
反应液V包括:F16,R16,P16,F17,R17,P17,F18,R18,P18,分别标记HEX、ROX、FAM;
反应液VI包括:F1,R1,P1,F20,R20,P20,F21,R21,P21,分别标记FAM、HEX、ROX。
需要说明的是:这些举例并非全部可能性,在此无法穷举,只要是本发明提出的引物探针的组合都在本发明的保护范围内。
具体的反应体系按表5-3、表6-3、表7-3、表8-3、表9-3和表10-3的用量分别配制PCR反应液I、反应液II、反应液III、反应液IV、反应液V和反应液VI,每个反应管检测的基因如表3。
表5-1 PCR体系各成分组成(反应液I)
各组分名称 | 终浓度或终体积 |
一步法RT-PCR Mix | 1μl |
F1 | 0.6μM |
R1 | 0.6μM |
P1 | 0.3μM |
F2 | 0.5μM |
R2 | 0.5μM |
P2 | 0.3μM |
F3 | 0.6μM |
R3 | 0.6μM |
P3 | 0.3μM |
F4 | 0.7μM |
R4 | 0.7μM |
P4 | 0.5μM |
模板 | 2μl |
总体积 | 20μl |
表6-1PCR体系各成分组成(反应液II)
各组分名称 | 终浓度或终体积 |
一步法RT-PCR Mix | 1μl |
F5 | 0.5μM |
R5 | 0.5μM |
P5 | 0.2μM |
F6 | 0.6μM |
R6 | 0.6μM |
P6 | 0.3μM |
F7 | 0.6μM |
R7 | 0.6μM |
P7 | 0.4μM |
F8 | 0.5μM |
R8 | 0.5μM |
P8 | 0.2μM |
模板 | 2μl |
总体积 | 20μl |
表7-1 PCR体系各成分组成(反应液III)
各组分名称 | 终浓度或终体积 |
一步法RT-PCR Mix | 1μl |
F9 | 0.4μM |
R9 | 0.4μM |
P9 | 0.2μM |
F10 | 0.5μM |
R10 | 0.5μM |
P10 | 0.4μM |
F11 | 0.6μM |
R11 | 0.6μM |
P11 | 0.6μM |
模板 | 2μl |
总体积 | 20μl |
表8-1 PCR体系各成分组成(反应液IV)
表9-1 PCR体系各成分组成(反应液V)
各组分名称 | 终浓度或终体积 |
一步法RT-PCR Mix | 1μl |
F15 | 0.7μM |
R15 | 0.7μM |
P15 | 0.5μM |
F16 | 0.6μM |
R16 | 0.6μM |
P16 | 0.5μM |
F17 | 0.6μM |
R17 | 0.6μM |
P17 | 0.5μM |
F18 | 0.6μM |
R18 | 0.6μM |
P18 | 0.5μM |
模板 | 2μl |
总体积 | 20μl |
表10-1 PCR体系各成分组成(反应液VI)
各组分名称 | 终浓度或终体积 |
一步法RT-PCR Mix | 1μl |
F19 | 0.4μM |
R19 | 0.4μM |
P19 | 0.3μM |
F20 | 0.5μM |
R20 | 0.5μM |
P20 | 0.5μM |
F21 | 0.6μM |
R21 | 0.6μM |
P21 | 0.6μM |
模板 | 2μl |
总体积 | 20μl |
表5-2 PCR体系各成分组成(反应液I)
表6-2 PCR体系各成分组成(反应液II)
各组分名称 | 终浓度或终体积 |
一步法RT-PCR Mix | 1μl |
F6 | 0.5μM |
R6 | 0.5μM |
P6 | 0.2μM |
F7 | 0.7μM |
R7 | 0.7μM |
P7 | 0.4μM |
F12 | 0.5μM |
R12 | 0.5μM |
P12 | 0.5μM |
F18 | 0.6μM |
R18 | 0.6μM |
P18 | 0.3μM |
模板 | 2μl |
总体积 | 20μl |
表7-2 PCR体系各成分组成(反应液III)
各组分名称 | 终浓度或终体积 |
一步法RT-PCR Mix | 1μl |
F2 | 0.4μM |
R2 | 0.4μM |
P2 | 0.2μM |
F10 | 0.5μM |
R10 | 0.5μM |
P10 | 0.5μM |
F11 | 0.5μM |
R11 | 0.5μM |
P11 | 0.25μM |
模板 | 2μl |
总体积 | 20μl |
表8-2 PCR体系各成分组成(反应液IV)
各组分名称 | 终浓度或终体积 |
一步法RT-PCR Mix | 1μl |
F13 | 0.8μM |
R13 | 0.8μM |
P13 | 0.4μM |
F14 | 0.6μM |
R14 | 0.6μM |
P14 | 0.3μM |
F20 | 0.5μM |
R20 | 0.5μM |
P20 | 0.2μM |
模板 | 2μl |
总体积 | 20μl |
表9-2 PCR体系各成分组成(反应液V)
各组分名称 | 终浓度或终体积 |
一步法RT-PCR Mix | 1μl |
F8 | 0.7μM |
R8 | 0.7μM |
P8 | 0.5μM |
F15 | 0.6μM |
R15 | 0.6μM |
P15 | 0.5μM |
F16 | 0.4μM |
R16 | 0.4μM |
P16 | 0.2μM |
F17 | 0.6μM |
R17 | 0.6μM |
P17 | 0.5μM |
模板 | 2μl |
总体积 | 20μl |
表10-2 PCR体系各成分组成(反应液VI)
各组分名称 | 终浓度或终体积 |
一步法RT-PCR Mix | 1μl |
F4 | 0.6μM |
R4 | 0.6μM |
P4 | 0.3μM |
F5 | 0.4μM |
R5 | 0.4μM |
P5 | 0.4μM |
F19 | 0.6μM |
R19 | 0.6μM |
P19 | 0.2μM |
F21 | 0.8μM |
R21 | 0.8μM |
P21 | 0.4μM |
模板 | 2μl |
总体积 | 20μl |
表5-3 PCR体系各成分组成(反应液I)
各组分名称 | 终浓度或终体积 |
一步法RT-PCR Mix | 1μl |
F2 | 0.5μM |
R2 | 0.5μM |
P2 | 0.3μM |
F3 | 0.6μM |
R3 | 0.6μM |
P3 | 0.3μM |
F11 | 0.5μM |
R11 | 0.5μM |
P11 | 0.5μM |
F15 | 0.6μM |
R15 | 0.6μM |
P15 | 0.3μM |
模板 | 2μl |
总体积 | 20μl |
表6-3 PCR体系各成分组成(反应液II)
各组分名称 | 终浓度或终体积 |
一步法RT-PCR Mix | 1μl |
F5 | 0.5μM |
R5 | 0.5μM |
P5 | 0.2μM |
F6 | 0.6μM |
R6 | 0.6μM |
P6 | 0.3μM |
F7 | 0.6μM |
R7 | 0.6μM |
P7 | 0.4μM |
F8 | 0.8μM |
R8 | 0.8μM |
P8 | 0.2μM |
模板 | 2μl |
总体积 | 20μl |
表7-3 PCR体系各成分组成(反应液III)
各组分名称 | 终浓度或终体积 |
一步法RT-PCR Mix | 1μl |
F4 | 0.5μM |
R4 | 0.5μM |
P4 | 0.5μM |
F9 | 0.6μM |
R9 | 0.6μM |
P9 | 0.3μM |
F10 | 0.5μM |
R10 | 0.5μM |
P10 | 0.4μM |
模板 | 2μl |
总体积 | 20μl |
表8-3 PCR体系各成分组成(反应液IV)
各组分名称 | 终浓度或终体积 |
一步法RT-PCR Mix | 1μl |
F12 | 0.7μM |
R12 | 0.7μM |
P12 | 0.4μM |
F13 | 0.5μM |
R13 | 0.5μM |
P13 | 0.2μM |
F14 | 0.5μM |
R14 | 0.5μM |
P14 | 0.3μM |
F19 | 0.8μM |
R19 | 0.8μM |
P19 | 0.4μM |
模板 | 2μl |
总体积 | 20μl |
表9-3 PCR体系各成分组成(反应液V)
表10-3 PCR体系各成分组成(反应液VI)
各组分名称 | 终浓度或终体积 |
一步法RT-PCR Mix | 1μl |
F1 | 0.5μM |
R1 | 0.5μM |
P1 | 0.3μM |
F20 | 0.5μM |
R20 | 0.5μM |
P20 | 0.5μM |
F21 | 0.6μM |
R21 | 0.6μM |
P21 | 0.3μM |
模板 | 2μl |
总体积 | 20μl |
(4)反应程序设定
表11 PCR程序
注:58℃时采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道的荧光。
(5)加样上机
a).检测灵敏度验证实验:
将一份高风险和一份低风险RNA样本用RNase free水稀释到1ng/μL,备用。按每反应孔18μL将PCR反应液分装到PCR八连排中,加2μL模板RNA,每个标本重复2次。同时设置空白对照,将模板替换成0.1%DEPC水。选择SLAN96P荧光PCR仪,按设定程序运行。
b).临床样本检测:
按每反应孔18μL分装到PCR八连排中,加2μL模板RNA,每个标本重复2次。同时设置空白对照,将模板替换成0.1%DEPC水。选择SLAN96P荧光PCR仪,按设定程序运行。
(6)RS计算第一步:对16个基因的表达值进行标准化处理,通过各基因与5个参考基因的CT值差得到,标准化后的值在0-15;第二步:计算组得分,
HER2分组值(HS)=0.9*GRB7+0.1*HER2,如果小于8,则取8;
雌激素相关基因分值(ES)=(0.8*ER+1.2*PGR+BCL2+SCUBE2)/4;
增殖相关基因组分值(PS)=(BIRC5+MKI67+MYBL2+CCNB1+AURKA)/5,如果小于6.5,则取6.5;
侵袭相关基因组分值(IS)=(CTSL2+MMP11)/2;
未矫正的复发风险值为RSU:
RSU=+0.47*HS-0.34*ES+1.04*PS+0.10*IS+0.05*CD68-0.08GSTM1-0.07*BAG1;
复发风险值RS:
如果RSU在0和100范围内,RS=20*(RSU-6.7);
如果RSU小于0,RS=0;
如果RSU大于100,RS=100;
如果RS<18,属于低风险;
如果18<RS<31,属于中风险;
如果RS>31,属于高风险。
根据以上算法,将16个癌相关基因的CT值进行标准化,最后换算成RS值,得到结果如下:附图2为本发明检测1例高风险样本的PCR结果图,表12为相对应的RS值计算结果,RS为78.05,属于高复发风险;附图3为本发明检测1例低风险样本的PCR结果图,表13为对应的RS值计算结果,RS为16.8,属于低复发风险;附图4为本发明对高风险样本检测灵敏度PCR结果图,表14为对应的RS值计算结果,RS为70.0,属于高复发风险;附图5为本发明对低风险样本检测灵敏度PCR结果图,表15为对应的RS值计算结果,RS为14.9,属于低复发风险。
表12
表13
表14
表15
本发明试剂盒特异性良好,主要是通过严格把控检测引物的特异性实现,例如现有专利CN107058523A中ACTB和GSTM1基因的引物除了特异性扩增ACTB和GSTM1基因之外,在人类RNA数据库中存在其他高度相似序列,如ACTB基因的引物会延伸出ACTG1、KANTR和ACTG1P4基因的片段。另外,GSTM1基因的引物同样可以延伸出GSTM2、GSTM4、GSTM5和GSTM2P1基因的片段,这些非特异片段的产生会对相应基因的表达量产生干扰,造成mRNA表达量定量不准确,从而进一步影响RS值计算结果。本试剂盒21基因引物特异性均经过NCBI-BLAST验证,ACTB和GSTM1两个基因的引物对在人类RNA数据库中不存在高度相似的非特异区域,只特异性扩增ACTB和GSTM1两个基因,而且其余19个基因的引物也同样具有良好的特异性,使得试剂盒具有更优的特异性。
本发明使用一步法多重RT-PCR,不需要先进行逆转录,简化了样本制备过程,同时避免cDNA污染。采用特异引物、TaqMan-MGB探针结合一步法多重RT-PCR技术,仅在6管反应中即可对21个基因同时检测,检测通量高,一块96孔板可同时检测超过10份的临床样本,本试剂盒灵敏度高、特异性强、操作简便、检测时间短、成本低。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解,上述实施例不以任何形式限制本发明,凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案,均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 合肥仁创基因生物科技有限公司
<120> 一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法
<141> 2019-11-26
<160> 63
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gtcccacctt cggcatc 17
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tgaagttctc tataaactgt tcca 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
acccttggtg aatttttga 19
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tttctccgca gtttcctc 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
actttcgcct gagcctatt 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
acatccagat gtttccattg 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cctgtcctga agaaaatcat c 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
cacatggatt tctgaacctg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
agctgatgat gtccacactg 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gtgaggctgg aagagtttg 19
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tgctggctgc aagaagat 18
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gggcagtgtt ggaggct 17
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
gacctcatcc agaacttcct 20
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
aaagcttccg tcctgaac 18
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
tacctgaacc ggcacct 17
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
tacagttcca caaaggcatc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
cctaacttgc tcttggacag 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
atgtagccag cagcatgtc 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
tgtcgcctta gaaagtgct 19
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
ctcacaactc tgactttatt gaac 24
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
atggggagct atgagtgc 18
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
actacagccg tgatccttat t 21
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
tacggctttg aaggagca 18
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
cgagccccat tctggac 17
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
tgagatcgac gctgcct 17
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
agggtcaaac ttccagtaga g 21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
gaaccagttg tccaagacct 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
catttccttc agagattttc c 21
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
ggtccaggga agctgtg 17
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
ctggaggtcc tgcatgaa 18
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
gctgggcatg atctgct 17
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
ttccccagaa actctgagta g 21
<210> 33
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
ccacggctgc ttccag 16
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
ctccatgccc aggaagg 17
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
ggagtcaacg gatttggtc 19
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
caacaatatc cactttacca gag 23
<210> 37
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
cgcagaaaat acgtggttg 19
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
tggttgtctc tgccgagt 18
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 39
gagaaactgc tgcctcatat c 21
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 40
cagcaacatg tccctgatct 20
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 41
tggactatga gaggtacaac ag 22
<210> 42
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 42
aactcaggcc catttcc 17
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
ccatgatgct accagagtct 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
cagagaaaga gccaagaaca 20
<210> 45
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 45
tgatactgcc tctccaagc 19
<210> 46
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 46
cagcctcaac catcagga 18
<210> 47
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 47
agtctctatc cttgccgac 19
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 48
agagctttga tggggacc 18
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 49
tggcagcttt cctgagatcc 20
<210> 50
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 50
ccaggataac ggaggctg 18
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 51
ccagggaaaa tgtgtagagg 20
<210> 52
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 52
caggctggca tggtcc 16
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 53
acacctgcat tcaccgc 17
<210> 54
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 54
cagcaagtat tggctcgtc 19
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 55
caggatgctg atggctatg 19
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 56
cataggggtt ccacagtctt 20
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 57
tcccctatgg acacctcag 19
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 58
ccagaatttg agaaactgaa gc 22
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 59
ctgacggcca ggtcatcac 19
<210> 60
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 60
tcaccagggc tgcttt 16
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 61
ctgaacagtc accgacgaga gtg 23
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 62
tgtgttcacc aaggaggacc 20
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 63
tgtgagggat ctgaaccaa 19
Claims (9)
1.一种乳腺癌21基因检测试剂盒,其特征在于,包括:6管反应体系,每管检测3-4种基因,标记3-4种荧光基团;
所述乳腺癌21基因包括:STK15(AURKA)、Survivin(BIRC5)、CCNB1、Ki67(MKI67)、MYBL2、HER2(ERBB2)、GRB7、BCL2、ER、PGR、SCUBE2、MMP11、CTSL2、GSTM1、CD68、BAG1、ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC;
针对AURKA基因的引物包括:名称为F1,序列为SEQ ID NO.01,名称为R1,序列为SEQ IDNO.02;探针包括:名称为P1,序列为SEQ ID NO.43;
针对BIRC5基因的引物包括:名称为F2,序列为SEQ ID NO.03,名称为R2,序列为SEQ IDNO.04,探针包括:名称为P2,序列为SEQ ID NO.44;
针对CCNB1基因的引物包括:名称为F3,序列为SEQ ID NO.05,名称为R3,序列为SEQ IDNO.06,探针包括:名称为P3,序列为SEQ ID NO.45;
针对Ki67基因的引物包括:名称为F4,序列为SEQ ID NO.07,名称为R4,序列为SEQ IDNO.08,探针包括:名称为P4,序列为SEQ ID NO.46;
针对MYBL2基因的引物包括:名称为F5,序列为SEQ ID NO.09,名称为R5,序列为SEQ IDNO.10,探针包括:名称为P5,序列为SEQ ID NO.47;
针对ERBB2基因的引物包括:名称为F6,序列为SEQ ID NO.11,名称为R6,序列为SEQ IDNO.12,探针包括:名称为P6,序列为SEQ ID NO.48;
针对GRB7基因的引物包括:名称为F7,序列为SEQ ID NO.13,名称为R7,序列为SEQ IDNO.14,探针包括:名称为P7,序列为SEQ ID NO.49;
针对BCL2基因的引物包括:名称为F8,序列为SEQ ID NO.15,名称为R8,序列为SEQ IDNO.16,探针包括:名称为P8,序列为SEQ ID NO.50;
针对ER基因的引物包括:名称为F9,序列为SEQ ID NO.17,名称为R9,序列为SEQ IDNO.18,探针包括:名称为P9,序列为SEQ ID NO.51;
针对PGR基因的引物包括:名称为F10,序列为SEQ ID NO.19,名称为R10,序列为SEQ IDNO.20,探针包括:名称为P10,序列为SEQ ID NO.52;
针对SCUBE2基因的引物包括:名称为F11,序列为SEQ ID NO.21,名称为R11,序列为SEQID NO.22,探针包括:名称为P11,序列为SEQ ID NO.53;
针对CTSL2基因的引物包括:名称为F12,序列为SEQ ID NO.23,名称为R12,序列为SEQID NO.24,探针包括:名称为P12,序列为SEQ ID NO.54;
针对MMP11基因的引物包括:名称为F13,序列为SEQ ID NO.25,名称为R13,序列为SEQID NO.26,探针包括:名称为P13,序列为SEQ ID NO.55;
针对BAG1基因的引物包括:名称为F14,序列为SEQ ID NO.27,名称为R14,序列为SEQID NO.28,探针包括:名称为P14,序列为SEQ ID NO.56;
针对CD68基因的引物包括:名称为F15,序列为SEQ ID NO.29,名称为R15,序列为SEQID NO.30,探针包括:名称为P15,序列为SEQ ID NO.57;
针对GSTM1基因的引物包括:名称为F16,序列为SEQ ID NO.31,名称为R16,序列为SEQID NO.32,探针包括:名称为P16,序列为SEQ ID NO.58;
针对ACTB基因的引物包括:名称为F17,序列为SEQ ID NO.33,名称为R17,序列为SEQID NO.34,探针包括:名称为P17,序列为SEQ ID NO.59;
针对GAPDH基因的引物包括:名称为F18,序列为SEQ ID NO.35,名称为R18,序列为SEQID NO.36,探针包括:名称为P18,序列为SEQ ID NO.60;
针对GUS基因的引物包括:名称为F19,序列为SEQ ID NO.37,名称为R19,序列为SEQ IDNO.38,探针包括:名称为P19,序列为SEQ ID NO.61;
针对RPLP0基因的引物包括:名称为F20,序列为SEQ ID NO.39,名称为R20,序列为SEQID NO.40,探针包括:名称为P20,序列为SEQ ID NO.62;
针对TFRC基因的引物包括:名称为F21,序列为SEQ ID NO.41,名称为R21,序列为SEQID NO.42,探针包括:名称为P21,序列为SEQ ID NO.63。
2.根据权利要求1所述的一种乳腺癌21基因检测试剂盒,其特征在于,荧光基团包括:FAM,HEX,ROX,Cy5;淬灭基团为MGB。
3.根据权利要求1所述的一种乳腺癌21基因检测试剂盒,其特征在于,所述6管反应体系包括:反应液I、反应液II、反应液III、反应液IV、反应液V和反应液VI;
反应液I包括:F1,R1,P1,F2,R2,P2,F3,R3,P3,F4,R4,P4;
反应液II包括:F5,R5,P5,F6,R6,P6,F7,R7,P7,F8,R8,P8;
反应液III包括:F9,R9,P9,F10,R10,P10,F11,R11,P11;
反应液IV包括:F12,R12,P12,F13,R13,P13,F14,R14,P14;
反应液V包括:F15,R15,P15,F16,R16,P16,F17,R17,P17,F18,R18,P18;
反应液VI包括:F19,R19,P19,F20,R20,P20,F21,R21,P21。
4.一种乳腺癌21基因检测试剂盒的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
一,设计引物探针:
根据乳腺癌21基因设计特异引物和TaqMan-MGB探针;
所述乳腺癌21基因包括:STK15(AURKA)、Survivin(BIRC5)、CCNB1、Ki67(MKI67)、MYBL2、HER2(ERBB2)、GRB7、BCL2、ER、PGR、SCUBE2、MMP11、CTSL2、GSTM1、CD68、BAG1、ACTB、GAPDH、RPLPO、GUS和TFRC;
针对AURKA基因的引物包括:名称为F1,序列为SEQ ID NO.01,名称为R1,序列为SEQ IDNO.02;探针包括:名称为P1,序列为SEQ ID NO.43;
针对BIRC5基因的引物包括:名称为F2,序列为SEQ ID NO.03,名称为R2,序列为SEQ IDNO.04,探针包括:名称为P2,序列为SEQ ID NO.44;
针对CCNB1基因的引物包括:名称为F3,序列为SEQ ID NO.05,名称为R3,序列为SEQ IDNO.06,探针包括:名称为P3,序列为SEQ ID NO.45;
针对Ki67基因的引物包括:名称为F4,序列为SEQ ID NO.07,名称为R4,序列为SEQ IDNO.08,探针包括:名称为P4,序列为SEQ ID NO.46;
针对MYBL2基因的引物包括:名称为F5,序列为SEQ ID NO.09,名称为R5,序列为SEQ IDNO.10,探针包括:名称为P5,序列为SEQ ID NO.47;
针对ERBB2基因的引物包括:名称为F6,序列为SEQ ID NO.11,名称为R6,序列为SEQ IDNO.12,探针包括:名称为P6,序列为SEQ ID NO.48;
针对GRB7基因的引物包括:名称为F7,序列为SEQ ID NO.13,名称为R7,序列为SEQ IDNO.14,探针包括:名称为P7,序列为SEQ ID NO.49;
针对BCL2基因的引物包括:名称为F8,序列为SEQ ID NO.15,名称为R8,序列为SEQ IDNO.16,探针包括:名称为P8,序列为SEQ ID NO.50;
针对ER基因的引物包括:名称为F9,序列为SEQ ID NO.17,名称为R9,序列为SEQ IDNO.18,探针包括:名称为P9,序列为SEQ ID NO.51;
针对PGR基因的引物包括:名称为F10,序列为SEQ ID NO.19,名称为R10,序列为SEQ IDNO.20,探针包括:名称为P10,序列为SEQ ID NO.52;
针对SCUBE2基因的引物包括:名称为F11,序列为SEQ ID NO.21,名称为R11,序列为SEQID NO.22,探针包括:名称为P11,序列为SEQ ID NO.53;
针对CTSL2基因的引物包括:名称为F12,序列为SEQ ID NO.23,名称为R12,序列为SEQID NO.24,探针包括:名称为P12,序列为SEQ ID NO.54;
针对MMP11基因的引物包括:名称为F13,序列为SEQ ID NO.25,名称为R13,序列为SEQID NO.26,探针包括:名称为P13,序列为SEQ ID NO.55;
针对BAG1基因的引物包括:名称为F14,序列为SEQ ID NO.27,名称为R14,序列为SEQID NO.28,探针包括:名称为P14,序列为SEQ ID NO.56;
针对CD68基因的引物包括:名称为F15,序列为SEQ ID NO.29,名称为R15,序列为SEQID NO.30,探针包括:名称为P15,序列为SEQ ID NO.57;
针对GSTM1基因的引物包括:名称为F16,序列为SEQ ID NO.31,名称为R16,序列为SEQID NO.32,探针包括:名称为P16,序列为SEQ ID NO.58;
针对ACTB基因的引物包括:名称为F17,序列为SEQ ID NO.33,名称为R17,序列为SEQID NO.34,探针包括:名称为P17,序列为SEQ ID NO.59;
针对GAPDH基因的引物包括:名称为F18,序列为SEQ ID NO.35,名称为R18,序列为SEQID NO.36,探针包括:名称为P18,序列为SEQ ID NO.60;
针对GUS基因的引物包括:名称为F19,序列为SEQ ID NO.37,名称为R19,序列为SEQ IDNO.38,探针包括:名称为P19,序列为SEQ ID NO.61;
针对RPLP0基因的引物包括:名称为F20,序列为SEQ ID NO.39,名称为R20,序列为SEQID NO.40,探针包括:名称为P20,序列为SEQ ID NO.62;
针对TFRC基因的引物包括:名称为F21,序列为SEQ ID NO.41,名称为R21,序列为SEQID NO.42,探针包括:名称为P21,序列为SEQ ID NO.63;
步骤二,提取样品RNA;
步骤三,将对应于21个基因的引物探针分到6管反应体系,每管检测3-4种基因,标记3-4种荧光基团,使用一步法逆转录PCR进行检测;
步骤四,RS计算;
第一步:对16个基因的表达值进行标准化处理,通过各基因与5个参考基因的CT值差得到,标准化后的值在0-15;
第二步:计算组得分,
HER2分组值(HS)=0.9*GRB7+0.1*HER2,如果小于8,则取8;
雌激素相关基因分值(ES)=(0.8*ER+1.2*PGR+BCL2+SCUBE2)/4;
增殖相关基因组分值(PS)=(BIRC5+MKI67+MYBL2+CCNB1+AURKA)/5,如果小于6.5,则取6.5;
侵袭相关基因组分值(IS)=(CTSL2+MMP11)/2;
未矫正的复发风险值为RSU:
RSU=+0.47*HS-0.34*ES+1.04*PS+0.10*IS+0.05*CD68-0.08GSTM1-0.07*BAG1;
复发风险值RS:
如果RSU在0和100范围内,RS=20*(RSU-6.7);
如果RSU小于0,RS=0;
如果RSU大于100,RS=100;
如果RS<18,属于低风险;
如果18<RS<31,属于中风险;
如果RS>31,属于高风险。
5.根据权利要求4所述的一种乳腺癌21基因检测试剂盒的检测方法,其特征在于,
步骤二,提取样品RNA;
用RNA提取试剂盒对新鲜病理组织进行提取,经紫外分光光度计检测提取质量,所提RNA的A260/A280应在1.8-2.0之间。
6.根据权利要求4所述的一种乳腺癌21基因检测试剂盒的检测方法,其特征在于,合成好的引物和探针使用pH为8.3的Tris-HCl进行溶解。
7.根据权利要求4所述的一种乳腺癌21基因检测试剂盒的检测方法,其特征在于,所述6管反应体系包括:反应液I、反应液II、反应液III、反应液IV、反应液V和反应液VI;
反应液I包括:一步法RT-PCR Mix,F1,R1,P1,F2,R2,P2,F3,R3,P3,F4,R4,P4,模板;
反应液II包括:一步法RT-PCR Mix,F5,R5,P5,F6,R6,P6,F7,R7,P7,F8,R8,P8,模板;
反应液III包括:一步法RT-PCR Mix,F9,R9,P9,F10,R10,P10,F11,R11,P11,模板;
反应液IV包括:一步法RT-PCR Mix,F12,R12,P12,F13,R13,P13,F14,R14,P14,模板;
反应液V包括:一步法RT-PCR Mix,F15,R15,P15,F16,R16,P16,F17,R17,P17,F18,R18,P18,模板;
反应液VI包括:一步法RT-PCR Mix,F19,R19,P19,F20,R20,P20,F21,R21,P21,模板。
8.根据权利要求4所述的一种乳腺癌21基因检测试剂盒的检测方法,其特征在于,所述6管反应体系包括:反应液I、反应液II、反应液III、反应液IV、反应液V和反应液VI;
反应液I包括:一步法RT-PCR Mix,F1,R1,P1,F3,R3,P3,F9,R9,P9,模板;
反应液II包括:一步法RT-PCR Mix,F6,R6,P6,F7,R7,P7,F12,R12,P12,F18,R18,P18,模板;
反应液III包括:一步法RT-PCR Mix,F2,R2,P2,F10,R10,P10,F11,R11,P11,模板;
反应液IV包括:一步法RT-PCR Mix,F13,R13,P13,F14,R14,P14,F20,R20,P20,模板;
反应液V包括:一步法RT-PCR Mix,F8,R8,P8,F15,R15,P15,F16,R16,P16,F17,R17,P17,模板;
反应液VI包括:一步法RT-PCR Mix,F4,R4,P4,F5,R5,P5,F19,R19,P19,F21,R21,P21,模板。
9.根据权利要求4所述的一种乳腺癌21基因检测试剂盒的检测方法,其特征在于,所述6管反应体系包括:反应液I、反应液II、反应液III、反应液IV、反应液V和反应液VI;
反应液I包括:一步法RT-PCR Mix,F2,R2,P2,F3,R3,P3,F11,R11,P11,F15,R15,P15,模板;
反应液II包括:一步法RT-PCR Mix,F5,R5,P5,F6,R6,P6,F7,R7,P7,F8,R8,P8,模板;
反应液III包括:一步法RT-PCR Mix,F4,R4,P4,F9,R9,P9,F10,R10,P10,模板;
反应液IV包括:一步法RT-PCR Mix,F12,R12,P12,F13,R13,P13,F14,R14,P14,F19,R19,P19,模板;
反应液V包括:一步法RT-PCR Mix,F16,R16,P16,F17,R17,P17,F18,R18,P18,模板;
反应液VI包括:一步法RT-PCR Mix,F1,R1,P1,F20,R20,P20,F21,R21,P21,模板。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911174462.4A CN110777205A (zh) | 2019-11-26 | 2019-11-26 | 一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911174462.4A CN110777205A (zh) | 2019-11-26 | 2019-11-26 | 一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110777205A true CN110777205A (zh) | 2020-02-11 |
Family
ID=69392679
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201911174462.4A Pending CN110777205A (zh) | 2019-11-26 | 2019-11-26 | 一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110777205A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111218512A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-06-02 | 宁波美丽人生医药生物科技发展有限公司 | 乳腺癌21基因检测试剂盒及其应用方法 |
CN111500687A (zh) * | 2020-05-12 | 2020-08-07 | 深圳市草履虫生物科技有限公司 | 一种乳腺癌21基因检测试剂盒 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3070178A1 (en) * | 2015-03-20 | 2016-09-21 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Method for diagnosing breast cancer |
CN106978492A (zh) * | 2017-04-13 | 2017-07-25 | 厦门飞朔生物技术有限公司 | 一种用于检测乳腺癌21基因表达水平的多重荧光pcr检测试剂盒 |
CN107058523A (zh) * | 2017-03-21 | 2017-08-18 | 温州迪安医学检验所有限公司 | 一种乳腺癌复发风险评估21基因检测引物及其应用 |
CN108624697A (zh) * | 2018-08-20 | 2018-10-09 | 默禾医疗科技(上海)有限公司 | 一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法 |
-
2019
- 2019-11-26 CN CN201911174462.4A patent/CN110777205A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3070178A1 (en) * | 2015-03-20 | 2016-09-21 | Albert-Ludwigs-Universität Freiburg | Method for diagnosing breast cancer |
CN107058523A (zh) * | 2017-03-21 | 2017-08-18 | 温州迪安医学检验所有限公司 | 一种乳腺癌复发风险评估21基因检测引物及其应用 |
CN106978492A (zh) * | 2017-04-13 | 2017-07-25 | 厦门飞朔生物技术有限公司 | 一种用于检测乳腺癌21基因表达水平的多重荧光pcr检测试剂盒 |
CN108624697A (zh) * | 2018-08-20 | 2018-10-09 | 默禾医疗科技(上海)有限公司 | 一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
M G BUTTI ET AL.: ""A sequence analysis of the genomic regions involved in the rearrangements between TPM3 and NTRK1 genes producing TRK oncogenes in papillary thyroid carcinomas"", 《GENOMICS》 * |
李文静等: "《乳腺癌21基因预后分析技术研究》", 《检验医学与临床》 * |
肖静等: "《现代医学检验技术》", 31 January 2018, 天津科学技术出版社 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111218512A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-06-02 | 宁波美丽人生医药生物科技发展有限公司 | 乳腺癌21基因检测试剂盒及其应用方法 |
CN111500687A (zh) * | 2020-05-12 | 2020-08-07 | 深圳市草履虫生物科技有限公司 | 一种乳腺癌21基因检测试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109022579B (zh) | 染色体1p/19q杂合性缺失的检测方法、试剂盒及引物组 | |
CN114277135B (zh) | 胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒 | |
US20090203015A1 (en) | Multiplex assays for hormonal and growth factor receptors, and uses thereof | |
CN111676292B (zh) | 一种用于检测肝癌的组合物,试剂盒及其用途 | |
CN113265456B (zh) | 一种检测宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化的引物和探针组合 | |
CN111235272A (zh) | 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用 | |
CN110777205A (zh) | 一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法 | |
CN108624697A (zh) | 一种乳腺癌21基因检测试剂盒及其检测方法 | |
CN109666746B (zh) | 用于检测人类ros1基因融合突变的引物、探针及试剂盒及其检测方法 | |
CN116751865A (zh) | 一种用于检测kmt2a-ptd融合基因的试剂盒、其方法和应用 | |
CN111826446A (zh) | 用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物、探针和试剂盒 | |
CN108359713B (zh) | 一种基因多态性检测探针的筛选方法 | |
CN116640862A (zh) | 引物及试剂盒 | |
CN113215325B (zh) | 二维pcr单管闭管检测多种hpv亚型的反应体系、方法及试剂盒 | |
CN111172248B (zh) | 一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒 | |
CN111471768B (zh) | 用于检测jak2 v617f及calr第九外显子基因突变的pcr引物组及试剂盒 | |
CN113930501A (zh) | 人egfr基因突变的数字pcr检测方法及应用 | |
CN111549137A (zh) | 胃癌辅助诊断相关的遗传分子标志物及其应用 | |
CN109790580A (zh) | 用于检测Htert基因的启动子中的突变的方法,序列,组合物和试剂盒 | |
CN117701720B (zh) | 宫颈癌clip3基因甲基化的检测试剂及试剂盒 | |
CN111566229A (zh) | 乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群及诊断产品和应用 | |
CN113528657B (zh) | 用于检测食管癌的组合物及其试剂盒和应用 | |
RU2804110C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для определения аллей полиморфизма rs55986091 и способ его применения | |
CN110863039B (zh) | 基于共享性引物探针检测slco1b1和apoe基因多态性的引物组、方法及其试剂盒 | |
CN111793715B (zh) | 一种与陆地棉纤维长度关联的单体型分子标记及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200211 |