CN111235272A - 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用，其中包括用于检测肺癌EGFR、KRAS、BRAF、HER2、ALK、ROS1、RET、NTRK1、NTRK2、NTRK3、MET基因突变的引物、探针及其分配方式。本发明采用PCR 8联管设计，每两个PCR 8联管检测一个样品的11种基因突变/融合状态，其中一个PCR 8联管内装有相应的融合检测试剂和内控试剂；另一个PCR 8联管管内装有相应的突变检测试剂。本发明应用荧光PCR方法实现一次性检测肺癌的119种基因融合和112种基因突变类型，大大缩短了检测时间，操作简便，结果准确，满足了肿瘤患者得到及时诊治的迫切临床需求，助力精准检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体的，涉及一种一次性检测肺癌多重基因突变的引物、 探针、检测体系和试剂盒。
背景技术
肺癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，其中80～85％的肺癌为非小细胞肺癌 (NSCLC)。NSCLC患者中存在多种基因突变类型，其中EGFR、HER2、KRAS、BRAF基 因突变频率分别约为10～50％、1～4％、5～25％、1～2％，ALK、ROS1、RET、NTRK1、 NTRK2、NTRK3基因融合发生频率分别约为3～7％、1％、1％、0.12％、0.02％、0.08％，MET 外显子14跳跃基因突变发生频率约为1％。大量临床研究表明，驱动基因突变状态是靶向药 物治疗的重要疗效预测因子，EGFR、HER2、KRAS、BRAF基因突变患者可以从相应的酪氨 酸激酶抑制剂治疗中获益；ALK、ROS1、RET、NTRK1、NTRK2、NTRK3基因融合患者可 以从酪氨酸激酶抑制剂治疗中获益；MET外显子14跳跃基因突变患者可以从MET抑制剂治 疗中获益。《非小细胞肺癌NCCN指南》明确指出，在进行靶向治疗前需要对基因突变状态 进行检测，并强烈建议进行更广泛的有效基因的状态检测，因此，对NSCLC患者的多基因 突变联合检测可为患者提供更精准的治疗。本试剂盒检测结果仅供临床参考，不应作为患者 个体化治疗的唯一依据，临床医生应结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其它实验室检 测指标等因素对检测结果进行综合判断。
这些基因突变或融合状态与靶向药物的疗效相关，多基因的联合检测可进一步提高预测 预后的准确性。然而，目前大多数试剂盒每次只能检测一种或几种基因突变，检测通量低， 耗时长，对样本需求量大。虽然目前市面上用于科研用途的NGS Panel也有可能一次性检测 上述11种基因，但NGS价格昂贵、操作繁琐、数据分析复杂、样本用量多等因素也制约了 NGS方法的推广应用。目前临床上尚无能够同时、一次性完成对此11个热点基因进行检测 的PCR试剂盒。本发明提供一种高灵敏度和高特异性的用于一次性检测11种肺癌基因的引 物、探针、试剂盒及引物分配方式。该检测试剂盒利用DNA和RNA样本，分别进行基因突 变和基因融合的检测，检测特异性和灵敏度高，检测结果重复性好，操作简便快捷，为临床 EGFR、BRAF、HER2、KRAS、ALK、ROS1、RET、NTRK1、NTRK2、NTRK3和MET 11 种基因突变/融合的检测提供了一种快速可靠的检测方法。该方法可以实现PCR平台一次性 检测肺癌的11种基因，涵盖了肺癌已上市及未来3-5年潜在上市靶向药物所有的核心基因靶 点，将助力临床实现在最短的时间、用最少的样本让患者从精准医疗中获益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于一次性检测多重肺癌基因突变的组合物，包括EGFR、 KRAS、BRAF、HER2、ALK、ROS1、RET、NTRK1、NTRK2、NTRK3、MET等突变基因 的引物、探针，上述引物和探针用两支PCR 8联管分组分装如表1：
表1肺癌突变特异性引物、新型探针及分配方式
进一步，本发明还提供了上述引物和探针的反应体系，包括：
(1)逆转录反应体系：纯化水5～25μL、5×逆转录缓冲液5～15μL、各引物20～150μmol、 逆转录酶100～200U，总体积为20～30μL；
(2)PCR反应体系：纯化水15～45μL、10×PCR缓冲液5～15μL、MgCl21～10mmol、 各对引物1～20pmol、各对探针1～20pmol、dNTPs10～100pmol、Taq酶1～10U，总体积为 30～50μL。
本发明的另一目的在于提供一种试剂盒，该试剂盒包括SEQ ID NO：1～281序列。具体 地，该试剂盒包括两种PCR 8联管，两种PCR 8联管分别检测肺癌RNA基因融合和肺癌DNA 基因突变。该试剂盒包含EGFR、KRAS、BRAF、HER2、ALK、ROS1、RET、NTRK1、NTRK2、 NTRK3、MET等基因的特异性引物和特异探针，还包括PCR缓冲液、UNG酶等。
进一步，该PCR 8联管中检测肺癌RNA基因融合的检测试剂包括：ALK、NTRK1、NTRK2和NTRK3融合基因检测试剂各1管，ROS1融合基因检测试剂2管，MET 14号外显子跳跃 基因突变检测试剂1管，RET融合基因检测试剂1管。该八联管中1～4号管分别由ALK、NTRK1、NTRK2和NTRK3融合基因检测试剂组成，5和6号管由ROS1融合基因检测试剂 组成，7号管由MET 14号外显子跳跃突变检测试剂组成，8号管由RET融合基因检测试剂 和内控检测试剂组成。1～8号管融合基因检测试剂由FAM信号指示，1～8号管的内控检测 试剂用于监控样本RNA质量及加入情况，由VIC信号指示。
该PCR 8联管中检测肺癌DNA基因突变的检测试剂包括：EGFR突变基因检测试剂3管、EGFR/BRAF突变基因检测试剂1管、EGFR/KRAS突变基因检测试剂1管、HER2/KRAS 突变基因检测试剂2管，外控检测试剂1管。该八联管中1～5号管的FAM信号和1～3号管 的ROX信号分别指示EGFR基因的不同突变位点，4号管的ROX信号指示BRAF基因的 V600E突变，6～7号管的FAM信号指示HER2基因的不同突变位点，5～7号管的ROX信 号分别指示KRAS基因的不同突变位点，1～7号管的内控检测试剂用于检测样本加入情况， 由VIC信号指示，8号管由扩增人类基因组保守区段的检测试剂组成，用于监控样本DNA质 量，由FAM和ROX信号指示。
检测一个样本需要2个PCR 8联管。试剂盒组成详见表2、表3和表4。
表2试剂盒组成
| 试剂盒组分 | 主要组成成分 | 数量 | 体积 |
| LET PCR 8联管-基因融合 | 引物、探针、镁离子、dNTPs | PCR 8联管，12条 | 35μL/管 |
| LET PCR 8联管-基因突变 | 引物、探针、镁离子、dNTPs | PCR 8联管，12条 | 35μL/管 |
| LET RT反应液I | 引物、镁离子、dNTPs | 1管 | 220μL |
| LET RT反应液II | 引物、镁离子、dNTPs | 1管 | 220μL |
| LET逆转录酶 | 逆转录酶 | 1管 | 16μL |
| LET混合酶A | 热启动酶、UNG酶 | 1管 | 45μL |
| LET混合酶B | 热启动酶、UNG酶 | 1管 | 45μL |
| LET阳性对照 | 质粒DNA | 1管 | 500μL |
表3 LET PCR 8联管-基因融合组成成分
| 管号 | 检测试剂 | 检测类型 | 体积 | 荧光信号 |
| 1 | LET反应液A1 | ALK融合 | 35μL | FAM/VIC |
| 2 | LET反应液A2 | NTRK1融合 | 35μL | FAM/VIC |
| 3 | LET反应液A3 | NTRK2融合 | 35μL | FAM/VIC |
| 4 | LET反应液A4 | NTRK3融合 | 35μL | FAM/VIC |
| 5 | LET反应液A5 | ROS1融合 | 35μL | FAM/VIC |
| 6 | LET反应液A6 | ROS1融合 | 35μL | FAM/VIC |
| 7 | LET反应液A7 | MET 14号外显子跳跃 | 35μL | FAM/VIC |
| 8 | LET反应液A8 | RET融合 | 35μL | FAM/VIC |
表4 LET PCR 8联管-基因突变组成成分
| 管号 | 检测试剂 | 检测类型 | 体积 | 荧光信号 |
| 1 | LET反应液B1 | EGFR突变 | 35μL | FAM/VIC/ROX |
| 2 | LET反应液B2 | EGFR突变 | 35μL | FAM/VIC/ROX |
| 3 | LET反应液B3 | EGFR突变 | 35μL | FAM/VIC/ROX |
| 4 | LET反应液B4 | EGFR/BRAF突变 | 35μL | FAM/VIC/ROX |
| 5 | LET反应液B5 | EGFR/KRAS突变 | 35μL | FAM/VIC/ROX |
| 6 | LET反应液B6 | HER2/KRAS突变 | 35μL | FAM/VIC/ROX |
| 7 | LET反应液B7 | HER2/KRAS突变 | 35μL | FAM/VIC/ROX |
| 8 | LET反应液B8 | 外控 | 35μL | FAM/ROX |
表5 LET PCR 8联管-基因融合检测的位点
表6 LET PCR 8联管-基因突变检测的位点
本发明的再一目的在于提供该试剂盒的使用方法，其步骤包括：
(1)提取检测样本中的DNA和RNA，该检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织或石蜡切片组织；
(2)将上述RNA与逆转录酶混合，分别加入逆转录反应液，得到cDNA；
(3)将上述DNA和该cDNA分别与混合酶混合，并加入到PCR 8联管；
(4)经荧光PCR扩增仪扩增后，根据显示的Ct值判断检测结果。
本发明的有益效果是：
1.本发明采用特异性引物和探针技术，三色荧光通道检测模式，建立了实时PCR体系， 可以同时检测ALK、ROS1、RET、NTRK1、NTRK2、NTRK3、MET七种融合基因和EGFR、 KRAS、BRAF、HER2四种突变基因，共有119种基因融合和112种基因突变，具体包括， EGFR基因83种突变、KRAS基因7种突变、BRAF基因1种突变、HER2基因21种突变以 及ALK基因46种融合、ROS1基因23种融合、RET基因18种融合、NTRK1基因18种融 合、NTRK2基因5种融合、NTRK3基因8种融合和MET基因1种跳跃突变(详见表5、表 6)。
2.本发明根据所检测的多个突变/融合位点的检测难易程度、引物之间的相互影响、竞争 等多方面综合因素，将281条序列(包括引物和探针)分组，分装于两个PCR 8联管中，其 优点在于：(1)采用两重或三重PCR，将多种突变类型并管，并用不同荧光标记的探针加以 区分，可以实现在一管内检测多种突变类型，便于客户操作，同时节约了检测成本及检测样 本；(2)在突变类型并管时，除了考虑技术上并管的难度，还兼顾不同药物的需求。对于同 一种药物，尽量将药物相应靶点放置于同一个反应管中，或放置于不同反应管的同一荧光通 道，便于结果分析；(3)试剂盒可一次性检测231种突变/融合位点，且各反应管的操作方法 /扩增程序基本一致，操作简便，节约时间，便于临床应用；(4)每个反应体系中还含有内控 检测体系，融合反应管的内控用于质控RNA样本的质量及操作、仪器是否异常；突变反应管 的内控用于质控DNA样本的质量及操作、仪器是否异常，外控用于判断样本DNA质量，并 参与结果判读。(5)灵敏度高，对1％的基因突变DNA和125拷贝的融合基因质粒DNA均可以检出；(6)检测时间短，检测过程只需要3个小时即可完成；(7)预分装设计，并进行 密封处理，提高了运输过程的安全性，操作更方便。
3.本发明提供的试剂盒涵盖的检测位点均占到每种基因所有突变类型的95％以上，在非 小细胞肺癌患者中总突变率高达70％，是目前检测突变基因最多、突变类型最完整的荧光PCR 产品，为临床医生对肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供全面的参考。
4.与NGS方法相比，本发明提供的试剂盒操作简便快捷、灵敏度高、特异性好、结果判 读客观等，成为临床普及性最高的一线检测方法。
附图说明
图1为实施例1中ALK融合基因-EML4 exon 13、ALK exon 20的灵敏度图。
图2为实施例1中ROS1融合基因-CD74 exon 6、ROS1 exon 32的灵敏度图。
图3为实施例1中RET融合基因-KIF5B exon 16、ROS1 exon 12的灵敏度图。
图4为实施例1中NTRK1融合基因-CD74 exon8、NTRK1 exon10的灵敏度图。
图5为实施例1中NTRK2融合基因-TRIM24 exon12、NTRK2 exon15的灵敏度图。
图6为实施例1中NTRK3融合基因-ETV6 exon5、NTRK3 exon15的灵敏度图。
图7为实施例1中MET跳跃突变-MET exon14 skipping的灵敏度图。
图8为实施例1中EGFR基因突变-19del的灵敏度图。
图9为实施例1中EGFR基因突变-L858R的灵敏度图。
图10为实施例1中EGFR基因突变-T790M的灵敏度图。
图11为实施例1中KRAS基因突变-G12D的灵敏度图。
图12为实施例1中KRAS基因突变-G12C的灵敏度图。
图13为实施例1中BRAF基因突变-V600E的灵敏度图。
图14为实施例1中HER2基因突变-V769_D770insASV的灵敏度图。
图15为实施例1中HER2基因突变-A775_G776insYVMA的灵敏度图。
图16为实施例2中临床阳性样本ALK融合基因检测结果的PCR图。
图17为实施例2中临床阳性样本ROS1融合基因检测结果的PCR图。
图18为实施例2中临床阳性样本RET融合基因检测结果的PCR图。
图19为实施例2中临床阳性样本NTRK3融合基因检测结果的PCR图。
图20为实施例2中临床阳性样本MET跳跃突变检测结果的PCR图。
图21为实施例2中临床阳性样本EGFR19del基因突变检测结果的PCR图。
图22为实施例2中临床阳性样本EGFR L858R基因突变检测结果的PCR图。
图23为实施例2中临床阳性样本EGFRT790M基因突变检测结果的PCR图。
图24为实施例2中临床阳性样本KRAS基因突变检测结果的PCR图。
图25为实施例2中临床阳性样本KRAS G12C基因突变检测结果的PCR图。
图26为实施例2中临床阳性样本BRAF基因突变检测结果的PCR图。
图27为实施例2中临床阳性样本HER2基因突变检测结果的PCR图。
以上附图中各图的横坐标均为循环数(cycles)，纵坐标均为荧光值Fluorescence(dR)。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明进一步阐述，这些实施例仅用于解释本发明而不能理解为 对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或 条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得 的常规产品。
实施例1
根据Cosmic数据公布的人类EGFR、BRAF、HER2、KRAS、ALK、ROS1、RET、NTRK1、NTRK2、NTRK3和MET野生型基因序列，以EGFR、BRAF、HER2、KRAS、ALK、ROS1、 RET、NTRK1、NTRK2、NTRK3和MET的驱动性突变位点及融合位点为基础，来设计特异 性引物和探针(详见表1、表7及表8)。
表7 LETA反应液检测位点分布
表8 LET反应液B检测位点分布
本实施例分别以ALK融合基因EMLA exon 13、ALK exon 20，ROS1融合基因CD74exon 6、ROS1 exon 32，RET融合基因KIF5B exon 16、ROS1 exon 12，NTRK1融合基因CD74exon8、NTRK1 exon10，NTRK2融合基因TRIM24 exon12、NTRK2 exon15，NTRK3融合 基因ETV6exon5、NTRK3 exon15，MET跳跃突变基因MET exon14 skipping，EGFR基因 突变基因19del、L858R、T790M，KRAS突变基因G12D、G12C，BRAF基因突变基因V600E， HER2基因突变基因V769_D770insASV、A775_G776insYVMA为例来阐述本发明的荧光 PCR检测上述肺癌基因。
实验分别用含上述融合基因的T7 RNA及各突变的质粒模板，其荧光PCR检测包括以 下步骤：
(一)质粒、T7 RNA处理与提取：
质粒采用天根生化的质粒小提试剂盒(货号：DP103)进行DNA提取，将质粒采用TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit(货号：K0441)转录获得T7 RNA，具体操作 步骤按试剂盒说明书操作。DNA和RNA提取结束后，立即使用紫外分光光度计检测DNA和RNA的浓度及纯度。DNA和RNA的OD260/OD280应介于1.7～2.1；RNA浓度应介于10～ 100ng/μL。
(二)建立PCR扩增反应体系：
将上述所得模板，用作实时荧光PCR扩增的模板，按照如下扩增体系进行PCR扩增：
逆转录反应体系：纯化水5～25μL、5×逆转录缓冲液5～15μL、各引物20～150μmol、 逆转录酶100～200U，总体积为20～30μL；
PCR反应体系：纯化水15～45μL、10×PCR缓冲液5～15μL、MgCl21～10mmol、各对引物1～20pmol、各对探针1～20pmol、dNTPs10～100pmol、Taq酶1～10U，总体积为30～ 50μL。
逆转录反应条件：42℃ 60min，95℃ 5min，1个循环；
得到S-cDNA 1和S-cDNA2，与酶混合后，分别加入到检测管LET PCR 8联管-基因融合 -1～4和检测管LET PCR 8联管-基因融合-5～8；DNA样本则加入检测管LET PCR 8联管-基 因突变-1～8中，进行PCR扩增。
实时PCR反应条件为：
第一阶段：42℃ 5min，95℃ 5min，1个循环；
第二阶段：95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，10个循环；
第三阶段：93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s，36个循环；
信号收集：第三阶段60℃时收集FAM/VIC/ROX信号，执行实时PCR，保存文件。
(三)检测结果的判断：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果(详见表9、表10)。
1.确认未选择校正荧光参照，按管号顺序依次选择单一检测反应管进行分析，同时选择 阳性对照反应管、样本反应管和阴性对照管，然后用户可根据实际情况确定扩增曲线升起 的拐点处，得到各反应管的Ct值。
2.阴性对照FAM、VIC和ROX信号扩增曲线：
阴性对照LET PCR 8联管-基因融合-1～8FAM信号和LET PCR 8联管-基因突变-1～7 FAM和ROX信号应无扩增曲线升起，若任意一管上述信号有扩增曲线升起，则此次实验结果无效，建议重新检测。
3.阳性对照FAM、VIC和ROX信号扩增曲线：
①阳性对照LET PCR 8联管-基因融合-1～8和LET PCR 8联管-基因突变-1～8的FAM 信号应全部都有扩增曲线升起，且Ct值一般小于25，但可能会由于不同阈值设置而发生波 动。
②阳性对照LET PCR 8联管-基因突变-1～8的ROX信号应全部都有扩增曲线升起，且 Ct值小于25。
③阳性对照的LET PCR 8联管-基因融合-1～8和LET PCR 8联管-基因突变-1～7的VIC 信号应全部都有扩增曲线升起，且Ct值小于25。
4.样本RNA基因融合阴阳性判定：
①样本LET PCR 8联管-基因融合-1～8的VIC信号扩增曲线：
a.若8个管Ct值均＜36且任意一管Ct值＜26，则继续分析；
b.若8个管Ct值均≥26或任意一管Ct值≥36，说明RNA可能存在片段化或RNA降解或 样本存在抑制剂或漏加，建议重新检测或重新提取RNA后再进行检测。
②样本LET PCR 8联管-基因融合-1～8的FAM信号扩增曲线：
a.若任意一管FAM信号Ct值落在阳性区域(详见表9)，则该样本判定为该反应管阳性；
b.若所有管FAM信号Ct值均落在阴性区域(详见表9)，则该样本判定为阴性或低于本 试剂盒的检测下限。
表9 LET PCR 8联管-基因融合FAM信号结果判定
注意：5号管阳性样本可能会在6号管出现交叉反应扩增，因此，当5和6号管都存在阳性扩增曲线时，判定5号管为真阳性扩增信号，6号管为交叉反应扩增信号。
5.样本DNA基因突变阴阳性判定：LET PCR 8联管-基因突变中，首先确定样本1～7号管FAM和ROX信号各自的Ct值，然后确定该样本8号管FAM和ROX信号的Ct值。 由于样本中突变百分含量各不相同，所得到的突变Ct值也各不相同。根据不同的突变Ct值， 把样本检测结果分为阴性、阳性A区及阳性B区。具体判定详见表10。
①样本LET PCR 8联管-基因突变1～7号管VIC信号扩增曲线：
a.若1～7号管Ct值均＜36，则继续分析；
b.若1～7号管任意一管Ct值≥36，说明DNA可能存在片段化或DNA降解或样本存在抑制剂或漏加，建议重新检测或重新提取DNA后再进行检测。
②样本LETPCR 8联管-基因突变1～8号管FAM和ROX信号扩增曲线：
a.若19≤8号管FAM和ROX信号的Ct值≤25，则继续分析；
b.若8号管FAM和ROX信号的Ct值＜19，说明加入的DNA过量，应减少DNA加 入量再进行实验。但突变信号无升起或者落在阴性区，该实验结果仍然可信；
表10 LET PCR 8联管-基因突变FAM/ROX信号结果判定
c.若8号管FAM和ROX信号的Ct值＞25，说明加入的DNA可能存在片段化或降解 或存在抑制剂或漏加，若突变信号有升起且落在阳性A区，实验结果仍然可信，否则建议 增加DNA上样量或重新提取DNA后再进行检测；
d.当样本1～7号管FAM和ROX信号各管的Ct值都大于或等于阴性临界值时(即落于阴性区)，则该样本为阴性或低于本试剂盒的检测下限；
e.当样本1～7号管FAM和ROX信号的某个反应管Ct值小于阴性临界值时，进行下列判断：
i.当某个反应管的Ct值小于阳性临界值时(即落于阳性A区)，则该样本为该反应管对 应的突变阳性；
ii.当某个反应管的Ct值大于阳性临界值时，且小于阴性临界Ct值时(即落于阳性B 区)，则计算该反应管的ΔCt值。若反应管的ΔCt值小于相对应的ΔCt Cut-off值，则该样 品也为该反应管对应的突变阳性，即阳性B区；反之则为阴性或低于本试剂盒的检测下限。
③ΔCt值的计算：ΔCt值＝突变FAM(ROX)Ct值-外控FAM(ROX)Ct值。突变 FAM(ROX)Ct值是指样本突变信号1～7号管(FAM或ROX信号)对应的Ct值；外控Ct 值是指样本对应的外控信号8号管(FAM或ROX信号)的Ct值。
6.某些EGFR、HER2、KRAS阳性样品可能会导致个别突变反应管之间出现交叉信号。当样品在2个或2个以上反应管出现阳性结果(按照表10判读)时，先确定突变反应管中 Ct值最小的为真阳性，再计算各反应管的ACt值(突变Ct值-外控Ct值)，并按照表11～ 13所列交叉信号阈值来判定其它反应管是否为交叉信号。
①若ΔCt值小于交叉信号阈值，则认为是真阳性信号，可判为该突变反应管阳性；
②若ΔCt值大于或等于交叉阈值，则认为是交叉信号，可判为该突变反应管阴性。
表11 EGFR交叉反应阈值表
表12 HER2交叉反应阈值表
表13 KRAS交叉反应阈值表
7.一个样本可能同时含有2个或多个融合或突变类型。
(四)灵敏度分析：分别取DNA和RNA的质粒进行梯度稀释，每种基因最终均有至少2种浓度进行检测限考察。结果表明本发明的荧光PCR方法的灵敏度高，1％的基因突变DNA和25拷贝/μL的融合基因质粒均可检出，部分结果如图1～图15。
检测结果表明，本发明的检测体系可以一次性准确检测肺癌11种基因，检测的灵敏度可 达到1％的基因突变DNA和25拷贝/μL的融合基因RNA。
实施例2
运用本发明检测临床样本，2019年11月对172例临床NSCLC FFPE样本进行肺癌11种 基因突变/融合的检测(包括部分已知结果的临床样本)，并与NGS方法进行对比。
一、检测样本DNA和RNA的提取：DNA和RNA的提取使用厦门艾德生物医药科技股 份有限公司的核酸提取试剂(型号：FFPE DNA/RNA，医疗器械备案号：闽厦械备20150082 号，货号：8.0223601X036G)。DNA和RNA提取结束后，使用微量紫外分光光度计检测DNA 和RNA的浓度与纯度。RNA浓度应大于10ng/μL，DNA浓度应大于2ng/μL，DNA和RNA 的OD260/OD280应介于1.7～2.1之间。将上述提取的DNA和RNA用作肺癌11种基因检测的 扩增模板。
二、将上述所提的DNA和RNA，分别按照如下扩增体系进行PCR扩增：
逆转录反应体系：纯化水5～25μL、5×逆转录缓冲液5～15μL、各引物20～150μmol、逆 转录酶100～200U，总体积为20～30μL；
PCR反应体系：纯化水15～45μL、10×PCR缓冲液5～15μL、MgCl21～10mmol、各对引物1～20pmol、各对探针1～20pmol、dNTPs10～100pmol、Taq酶1～10U，总体积为30～50μL。逆转录反应条件：42℃ 60min，95℃ 5min，1个循环；
得到S-cDNA1和S-cDNA2，与酶混合后，分别加入到检测管LET PCR 8联管-基因融合 -1～4和5～8；DNA样本则加入检测管LET PCR 8联管-基因突变-1～8中，进行PCR扩增。
实时PCR反应条件为：
第一阶段：42℃ 5min，95℃ 5min，1个循环；
第二阶段：95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，10个循环；
第三阶段：93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s，36个循环；
信号收集：第三阶段60℃时收集FAM/VIC/ROX信号，执行实时PCR，保存文件。
三、检测结果的判断：根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果(判断方法参照 实施例1)。
四、NGS检测。提取合格的DNA样本，片段化后进行末端修复及接头连接，采用艾德人泛肿瘤116基因panel捕获探针，进行目标区域的捕获，质控合格的捕获后文库采用illumina Novaseq 6000测序平台进行测序，并用艾德人泛癌种116基因突变联合检测数据分析 系统(ADXPAN116-tMut_v0.2.0)对测序数据进行分析，得到116种基因(包括EGFR、KRAS、 BRAF、HER2、ALK、ROS1、RET、NTRK1、NTRK2、NTRK3、MET等)的基因变异结果。 172例临床样本，本发明试剂盒共检测出125例阳性样本，样本突变情况分布详见表14、 表15和图16～27。
表14临床样本的突变情况分布
| 突变名称 | 本发明(例数) | NGS(例数) |
| EGFR突变阳性 | 73 | 72 |
| KRAS突变阳性 | 13 | 13 |
| BRAF突变阳性 | 3 | 3 |
| HER2突变阳性 | 1 | 1 |
| ALK融合阳性 | 11 | 11 |
| ROS1融合阳性 | 8 | 8 |
| NTRK3融合阳性 | 4 | 4 |
| RET融合阳性 | 7 | 7 |
| MET Skipping阳性 | 7 | 7 |
表15本发明与NGS检测结果四格表分析
1例不一致样本采用已上市的人类EGFR基因突变检测试剂盒(荧光PCR法)(国械注准20143402001)进行验证，结果为EGFR 19del阳性，与本发明检测结果一致。
两种方法检测的数据分析如下：
阳性符合率＝124/124＝100.00％(95％CI：97.64％，100.76％)；
阴性符合率＝47/48＝97.92％(95％CI：93.88％，101.96％)；
总符合率＝171/172＝99.42％(95％CI：98.28％，100.55％)。
Kappa值＝0.985，标准误SK＝0.0145，Z值＝67.965，根据Z值，以v＝∞查t界值表，t 临界值是1.96(双侧0.05)或者1.64(单侧0.05)，Z＝67.965＞1.96，P＜0.05，可认为Kappa 值具统计学意义，两种试剂盒的检测结果存在一致性。
该荧光PCR方法和NGS结果的总符合率高达99.42％，荧光PCR灵敏度和选择性检测能力与NGS相当。与NGS相比，PCR方法检测11种基因方便快捷，耗时短，节约样本， 更有利于临床推广使用。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本 发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门艾德生物医药科技股份有限公司
<120> 一次性检测肺癌多重基因突变的组合物及其应用
<160> 281
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagaagccca ttattcagag c 21
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<212> DNA
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actgctctag cagacttttc tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttcaccagga tccacctc 18
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<212> DNA
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tactgtagag cccacacctg g 21
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<212> DNA
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tcaaccaagc aaaaatgtca actcg 25
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gttaccaaaa ctgcagacaa gcata 25
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<212> DNA
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ccagacaaca agtatataat gtctaactcg 30
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acacagacgg gaatgaacag c 21
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ctgaagatca tgtggcctca gt 22
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taggaacgca ctcaggcag 19
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aggacactgt gcagattttc atcc 24
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cataggaacg cactcaggca 20
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aggtcaaaga atatggccag aagag 25
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cgatgccctc agtgaagaac ta 22
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acctggagaa ccaggacctt 20
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<212> DNA
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agaattgaat cagggagata tgaagcc 27
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atggtgccac cacctgc 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tggcctcaac catttccgg 19
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<212> DNA
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agcactacga gcttgctgg 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tttcggtctc ctttatcgca gg 22
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gagtttgttg aagtgggaag attgg 25
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ggggaaaata tcagtgcttc accat 25
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cagccaccat atacaggagc tc 22
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cgaggcgccc tagacatc 18
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cgggttggta tcccttcagg 20
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tgatttactg ttctggcaca gaca 24
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<212> DNA
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cttcaactca aagaaaacaa gaggcag 27
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taaaaattca aaaacagaaa caagaaaccc taca 34
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atgggatatt cctgggatct tcgta 25
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catgagacct ccaaacccct tt 22
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gcctcccaaa cccactacc 19
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<212> DNA
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cgtattttat tgtcacaaac aacaggagt 29
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ggggagaagt cccctgaca 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ttctgggctg ggtgtgac 18
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<400> 53
ttgttgggtt tcgaggccaa 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcgagagcaa gtttaagaag gagc 24
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<212> DNA
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<400> 55
tatgtcagcg tttggcttaa caga 24
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gctatgggga ggtcaaggtc 20
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gaagtcccct gacagtgcc 19
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ccaccaggaa cacccatcat 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acacacgagc tgacctctct 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgccagcgtg agaaccag 18
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cccaaaaggt gtttcgtcct tc 22
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caatgtcatg aaatgcaggg acat 24
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cagcacatct ggagacc 17
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tggtactgct ctagcagact t 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 71
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
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<210> 72
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
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gggccaacac cttgtcttga 20
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cattggagat gtgatggagt ggg 23
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tccttcgcct agctcccttt 20
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cgttatcagc aatgat 16
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agcgacataa cattgttc 18
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ccattattca gagcgagtat gga 23
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atggtactgc tctagcagac 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctccccgcct gaagagc 17
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gcccaacact gtacctcagt t 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccagaaacaa gtttcatact t 21
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<211> 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cctggtgcta gttgcaaaga ca 22
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acggctgaag aagcaactga g 21
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 221
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 221
gccagcgtgg acaaccccca ccac 24
<210> 222
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 23
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgtgatggcc agcgtggagc gtg 23
<210> 233
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 233
cgtgatggcc agcgtggctg gt 22
<210> 234
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 234
gacaaccccc acgtgcacgt 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 235
cagcgtggac aaccccgtt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 236
gacatagtcc aggaggcagc cg 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcctgctgg gcatctgc 18
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gatagtgtat taaccttatg tgtgacatgt tc 32
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caaggcactc ttgcctacgc gaca 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgctgaaaa tgactgaat 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 241
cactcttgcc tacgccacca gctccaacta cca 33
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcggcctcc caaggtgtt 19
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ccacacagca gcaagtgata gtt 23
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taggtgccta gcccatggtg ccta 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gatagtgtat taaccttatg tgtgacatgt tc 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 246
cgtcaaggca ctcttgccta cgctacg 27
<210> 247
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 247
tcgtcaaggc actcttgcct acgcgaa 27
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 248
cgtcaaggca ctcttgccta cgtcag 26
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 249
tatcgtcaag gcactcttgc ctaagca 27
<210> 250
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 250
ctccaactac cacaagtt 18
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 251
atggctgtgg tttgtgatgg tt 22
<210> 252
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 252
accagccatc acgtaagcca tcac 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acatatgggg agcccacaca ca 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 254
gagacatatg gggagcccac acg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 255
ggagacatat ggggagccca caa 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 256
gagacatatg gggagcccac acag 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggagacatat ggggagcccc tc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 258
cgtatgcttc ctggggacaa gggtacg 27
<210> 259
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 259
ctctcagcgt acccttg 17
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 260
ctcggcctcc caaggtgtt 19
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 261
ccacacagca gcaagtgata gtt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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taggtgccta gcccatggtg ccta 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 263
tgaatataaa cttgtggtag ttggagccga 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 264
gaatataaac ttgtggtagt tggagcga 28
<210> 265
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 265
caagatttac ctctattgtt ggatcatatt c 31
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 266
cagctaattc agaatcat 18
<210> 267
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 267
gactgaatat aaacttgtgg tagttggagc tgg 33
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ctcggcctcc caaggtgtt 19
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ccacacagca gcaagtgata gtt 23
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taggtgccta gcccatggtg ccta 24
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tggtgtgggc tcccctggct c 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctaagaggc agccataggg cata 24
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 273
cccatatgtc tcccgccttc tgggc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 274
caaccctgcc ctgtgcaa 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtggttctg gaagtccat 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcatccagt ggcgggacat agtc 24
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agcatccagt ggcgggacat agtc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agctctcttg aggatcttga aggaa 25
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cctgtgccag ggaccttacc t 21
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ctccggtgcg ttcggcacg 19
<210> 281
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 281
ctccggtgcg ttcggcacg 19
Claims (7)
1.一种用于检测肺癌多重基因突变的组合物，其特征在于，该组合物包括下表所示的281条序列的引物和探针，且该281条序列用两支PCR 8联管分组分装如下：
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的引物和探针的反应体系，包括：
(1)逆转录反应体系：纯化水5～25μL、5×逆转录缓冲液5～15μL、各引物20～150μmol、逆转录酶100～200U，总体积为20～30μL；
(2)PCR反应体系：纯化水15～45μL、10×PCR缓冲液5～15μL、MgCl2 1～10mmol、各对引物1～20pmol、各对探针1～20pmol、dNTPs10～100pmol、Taq酶1～10U，总体积为30～50μL。
3.一种试剂盒，包括权利要求1中所述的281条序列的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括两种PCR 8联管，该两种PCR 8联管分别检测肺癌RNA基因融合和肺癌DNA基因突变。
5.根据权利要求3或4所述的一种试剂盒，其特征在于，所述PCR 8联管中检测肺癌RNA基因融合的检测试剂包括：ALK、NTRK1、NTRK2和NTRK3融合基因检测试剂各1管，ROS1融合基因检测试剂2管，MET 14号外显子跳跃基因突变检测试剂1管，RET融合基因检测试剂1管。
6.根据权利要求3或4所述的一种试剂盒，其特征在于，所述PCR 8联管中检测肺癌DNA基因突变的检测试剂包括：EGFR、EGFR、EGFR、EGFR/BRAF、EGFR/KRAS、HER2/KRAS、HER2/KRAS突变基因检测试剂各1管，外控检测试剂1管。
7.权利要求3至6中任一权利要求所述的一种试剂盒的使用方法，其特征在于，包括：
(1)提取检测样本中的DNA和RNA，所述检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织或石蜡切片组织；
(2)将所述RNA与逆转录酶混合，分别加入逆转录反应液，得到eDNA；
(3)将所述DNA和所述cDNA分别与混合酶混合，并加入到PCR 8联管；
(4)经荧光PCR扩增仪扩增后，根据显示的Ct值判断检测结果。
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