CN116640862A - 引物及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测目的基因的引物、探针序列，及用于检测结直肠癌的核酸检测试剂盒，可用于ddPCR技术或其他PCR技术进行结直肠癌的检测。

Description

引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，特别是涉及一种用于结直肠癌诊断的引物及试剂盒。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)又称大肠癌(Large bowel cancer)，主要包括结肠癌和直肠癌，是世界上第三大常见癌症，仅位于肺癌和乳腺癌之下；同时，它也是排名第四的杀手癌症，仅位于肺癌、肝癌和胃癌之下。我国结直肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升的趋势，肠镜作为结直肠癌筛查的金标准，但具有一定侵入性和危险性，容易给筛查参与者带来不适感。粪便隐血试验(fecal occult blood test，FOBT)是结直肠癌无创筛查的最重要手段，包括化学法和免疫化学法。化学法粪便隐血试验：愈创木脂粪便隐血试验(guaiac fecal occult blood testing，gFOBT)检出结直肠癌及其癌前病变的敏感性较低，故无法显著降低结直肠癌的发病率。此外，其检查结果易受食物、药物等多种因素干扰，假阳性率相对较高。免疫化学法粪便隐血试验(fecal immunochemical test，FIT)的主要不足是检出进展期腺瘤的敏感性偏低，一般仅20％～30％，在高危人群中亦不足50％。
人肠道菌群包括了生活在人体肠道的所有微生物的集合，是人体的“另一器官”。近年来，与结直肠癌相关的肠道菌群是研究数目最多的方向之一，随着二代测序技术的深入，越来越多的研究显示肠道菌群对人体的代谢、神经、免疫和内分泌系统的正常功能发挥着重要作用。最近两年，数篇文献利用对肠道菌群的宏基因组或16S微生物组测序来区分健康人和结直肠癌患者，并且鉴定出了一系列结直肠癌marker菌，这些marker菌的含量在结直肠癌患者中比在正常人群众有显著升高。对这些marker菌的准确定量检测，有望实现结直肠癌的早期筛查。2019年，Thomas等人鉴定出在不同人群间共通的CRC相关肠道菌群组成和功能特征，构建了含16个物种的CRC疾病预测模型，并在两个额外的队列数据中得到验证。该研究证实了不同人群中的CRC菌群特征存在异质性，但综合分析多个队列获得的菌群标志物，能提高诊断准确性。这些发现对于用菌群标志物进行疾病诊断，以及研究菌群成员在CRC中的潜在作用，均有重要的参考价值和临床应用前景。
然而，现有技术大部分是利用宏基因组测序和16S测序的方法，对肠道微生物进行检测，价格昂贵并且耗时较长，另外一些用肠道微生物基因组中特定区段作为检测靶标的现有技术，检测的特异性和灵敏度不高，均不大适合用于临床检测。因此，迫切需要改善现有的或开发新的筛查方法，并提供更加准确高效的检测引物探针及检测试剂盒，以期提高结直肠癌筛查的效能及人群依从性，降低结直肠癌的发病率与病死率。
发明内容
鉴于现有技术中检测结直肠癌肠道marker菌的不足，本发明设计了用于检测目的基因的引物、探针序列，通过序列多重分析找到来自6种marker菌的特异性检测区段，并据此设计了多组特异性引物、探针，开发出用于检测结直肠癌的核酸检测试剂盒，可用于ddPCR技术或其他PCR技术进行CRC检测。由于检测区段的特异性高，且组合检测的效能相较单个Marker的检测提升明显，本发明的引物探针以及检测试剂盒具有较优的检测效能。
在一个具体的实施方式中，以体检样本为对照，本发明采用的技术方案对CRC样本有大于0.85的AUC，能较好地满足CRC临床检测的需求。
本发明提供检测引物组，所述检测引物组包括引物，所述引物包括正向引物和反向引物，其中：
所述正向引物的核苷酸序列具有相对于Fusobacterium nucleatum基因组的第504814-504843位碱基区域的18-22个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Fusobacterium nucleatum基因组的第504819-504838位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；所述反向引物的核苷酸序列具有相对于Fusobacterium nucleatum基因组的第504881-504911位碱基区域的18-24个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Fusobacterium nucleatum基因组的第504886-504906位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列具有相对于Fusobacterium nucleatum基因组的第504843-504870位碱基区域的16-20个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Fusobacterium nucleatum基因组的第504848-504865位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列。
优选的，该正向引物序列如SEQ ID NO：1所示，反向引物序列如SEQ ID NO：7所示；可选的，还包括探针，探针序列如SEQ ID NO：13所示。
本发明提供的另一检测引物组，所述检测引物组包括引物，所述引物包括正向引物和反向引物，其中：
所述正向引物的核苷酸序列具有相对于Gemella morbillorum基因组的第78979-79010位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Gemella morbillorum基因组的第78984-79005位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；所述反向引物的核苷酸序列具有相对于Gemella morbillorum基因组的第79043-79074位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Gemella morbillorum基因组的第79048-79069位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列具有相对于Gemellamorbillorum基因组的第79016-79045位碱基区域的18-22个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Gemella morbillorum基因组的第79021-79040位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列。
优选的，该正向引物序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物序列如SEQ ID NO：8所示；可选的，还包括探针，所述探针序列如SEQ ID NO：14所示。
本发明提供的又一检测引物组，所述检测引物组包括引物，所述引物包括正向引物和反向引物，其中：
所述正向引物的核苷酸序列具有相对于Solobacterium moorei基因组的第16795-16826位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Solobacterium moorei基因组的第16800-16821位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；所述反向引物的核苷酸序列具有相对于Solobacterium moorei基因组的第16966-16896位碱基区域的18-23个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Solobacterium moorei基因组的第16871-16891位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列具有相对于Solobacterium moorei基因组的第16825-16855位碱基区域的18-23个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Solobacterium moorei基因组的第16830-16850位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列。
优选的，该正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：9所示；可选的，还包括探针，所述探针序列如SEQ ID NO：15所示。
本发明提供的又一检测引物组，所述检测引物组包括引物，所述引物包括正向引物和反向引物，其中：
所述正向引物的核苷酸序列具有相对于Peptostreptococcus stomatis基因组的第22347-22379位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Peptostreptococcus stomatis基因组的第22352-22374位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；所述反向引物的核苷酸序列具有相对于Peptostreptococcusstomatis基因组的第22396-22427位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Peptostreptococcus stomatis基因组的第22401-22422位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列具有相对于Peptostreptococcus stomatis基因组的第22379-22403位碱基区域的21-26个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Peptostreptococcus stomatis基因组的第22375-22398位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列。
优选的，该正向引物序列如SEQ ID NO：4所示，反向引物序列如SEQ ID NO：10所示；可选的，还包括探针，所述探针序列如SEQ ID NO：16所示。
本发明提供的又一检测引物组，所述检测引物组包括引物，所述引物包括正向引物和反向引物，其中：
所述正向引物的核苷酸序列具有相对于Parvimonas micra基因组的第1274701-1274733位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Parvimonas micra基因组的第1274706-1274728位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；所述反向引物的核苷酸序列具有相对于Parvimonas micra基因组的第1274769-1274800位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Parvimonas micra基因组的第1274774-1274795位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列具有相对于Parvimonas micra基因组的第1274734-1274767位碱基区域的21-26个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Parvimonas micra基因组的第1274739-1274762位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列。
优选的，该正向引物序列如SEQ ID NO：5所示，反向引物序列如SEQ ID NO：11所示；可选的，还包括探针，所述探针序列如SEQ ID NO：17所示。
本发明提供的又一检测引物组，所述检测引物组包括引物，所述引物包括正向引物和反向引物，其中：
所述正向引物的核苷酸序列具有相对于Clostridium symbiosum基因组的第240872-240902位碱基区域的18-24个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Clostridium symbiosum基因组的第240877-240897位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；所述反向引物的核苷酸序列具有相对于Clostridium symbiosum基因组的第240932-240963位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Clostridium symbiosum基因组的第240937-240958位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列具有相对于Clostridium symbiosum基因组的第240905-240940位碱基区域的23-29个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Clostridium symbiosum基因组的第240910-240935位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列。
优选的，该正向引物序列如SEQ ID NO：6所示，反向引物序列如SEQ ID NO：12所示；可选的，还包括探针，所述探针序列如SEQ ID NO：18所示。
本发明提供检又一检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4,1所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：10,7所示；可选的，还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：16,13所示。
本发明提供检又一检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4,5所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：10,11所示；可选的，还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：16,17所示。
本发明提供检又一检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2,5所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8,11所示；可选的，还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：14,17所示。
本发明提供检又一检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2,3,4所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8,9,10所示；可选的，还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：14,15,16所示。
本发明提供检又一检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2,4,5所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8,10,11所示；可选的，还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：14,16,17所示。
本发明提供检又一检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1,2,4,5所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7,8,10,11所示；可选的，还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：13,14,16,17所示。
本发明提供检又一检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2,4,5,6所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8,10,11,12所示；可选的，还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：14,16,17,18所示。
本发明提供检又一检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1,2,3,5所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7,8,9,11所示；可选的，还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：13,14,15,17所示。
本发明提供检又一检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2,3,5,6所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8,9,11,12所示；可选的，还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：14,15,17,18所示。
本发明提供检又一检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1,2,3,4,5所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7,8,9,10,11所示；可选的，还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：13,14,15,16,17所示。
本发明提供一种试剂盒，该试剂盒包含上述的引物和/或探针。
该试剂盒用于结直肠癌诊断。
本发明的探针，探针的5′端标记荧光基团，3′端标记淬灭基团和/或MGB。
本发明的探针，其5′端标记的荧光基团选自由FAM、HEX、VIC、JOE、NED、TAMRA、Cy3、ROX、TexasRed和Cy5组成的组中的至少一种，所述3′端标记的淬灭基团选自由BHQ1、TAMRA和ECLIPSE组成的组中的至少一种
附图说明
图1：实施例2的试剂盒中质粒参考品4重(上)和3重(下)靶标检测结果2D图。
图2：实施例2的临床样本中2重(上)和3重(下)靶标检测结果2D图。
图3-1、图3-2、图3-3：联合两个微生物标志物的检测结果。
图4-1、图4-2：联合三个微生物标志物的检测结果。
图5-1、图5-2、图5-3、图5-4：联合四个微生物标志物的检测结果。
图6：联合五个微生物标志物的检测结果。
其中，图3-1中，P值如下：
pep_sto&FN vs.pep_sto:0.048134197569719456
pep_sto&FN vs.FN:0.005520650911669688
图3-2中，P值如下：
pep_sto&par_micra vs.pep_sto:0.028910728300070083
pep_sto&par_micra vs.par_micra:0.018171134250517182
图3-3中，P值如下：
par_micra&GM vs.par_micra:0.017122133873211376
par_micra&GM vs.GM:0.08285582516422617
图4-1中，P值如下：
pep_sto&par_micra&GM vs.pep_sto:0.032505705440769854
pep_sto&par_micra&GM vs.par_micra:0.052760203353106584
pep_sto&par_micra&GM vs.GM:0.05578964550091032
图4-2中，P值如下：
pep_sto&SM&GM vs.pep_sto:0.023771699512497888
pep_sto&SM&GM vs.SM:1.3688721808358324e-06
pep_sto&SM&GM vs.GM:0.045756448236077385
图5-1中，P值如下：
FN&GM&SM&par_micra vs.FN:0.0018967015092690954
FN&GM&SM&par_micra vs.GM:0.03222059406121381
FN&GM&SM&par_micra vs.SM:1.2667326585077084e-08
FN&GM&SM&par_micra vs.par_micra:0.00640145030555388
图5-2中，P值如下：
FN&GM&pep_sto&par_micra vs.FN:0.001977057865807568
FN&GM&pep_sto&par_micra vs.GM:0.05173470606661765
FN&GM&pep_sto&par_micra vs.pep_sto:0.030553895420915984
FN&GM&pep_sto&par_micra vs.par_micra:0.01329034089616062
图5-3中，P值如下：
GM&SM&pep_sto&par_micra vs.GM:0.0364200169837039
GM&SM&pep_sto&par_micra vs.SM:2.6256680201989563e-07
GM&SM&pep_sto&par_micra vs.pep_sto:0.020087124401732638
GM&SM&pep_sto&par_micra vs.par_micra:0.034428795787960084
图5-4中，P值如下：
GM&pep_sto&par_micra&clo_sym vs.GM:0.03519968450181337
GM&pep_sto&par_micra&clo_sym vs.pep_sto:0.011479703162353057
GM&pep_sto&par_micra&clo_sym vs.par_micra:0.00884353020488127
GM&pep_sto&par_micra&clo_sym vs.clo_sym:1.0259048475184967e-10
具体实施方式：
表1引物探针
表2检测靶点序列及参考位点
实施例1检测引物和探针是根据表2中的检测靶点及参考位点进行设计的，引物的长度为18-25bp，探针长度为15-30bp.实际设计时，引物和探针的起始位点均可在表2中记录的位点左右移动1bp-5bp.
本实施例的一个优选实施方式中，经设计及筛选获得的引物及探针序列如上表1所示：
第1组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：1所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：7所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：13所示。
第2组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：2所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：8所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：14所示。
第3组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：9所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：15所示。
第4组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：4所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：10所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：16所示。
第5组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：5所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：11所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：17所示。
第6组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：6所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：12所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：18所示。
第7组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：4,1所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：10,7所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：16,13所示。
第8组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：4,5所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：10,11所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：16,17所示。
第9组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：2,5所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：8,11所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：14,17所示。
第10组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：2,3,4所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：8,9,10所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：14,15,16所示。
第11组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：2,4,5所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：8,10,11所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：14,16,17所示。
第12组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：1,2,4,5所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：7,8,10,11所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：13,14,16,17所示。
第13组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：2,4,5,6所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：8,10,11,12所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：14,16,17,18所示。
第14组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：1,2,3,5所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：7,8,9,11所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：13,14,15,17所示。
第15组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：2,3,5,6所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：8,9,11,12所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：14,15,17,18所示。
第16组引物及探针：
正向引物序列如SEQ ID NO：1,2,3,4,5所示，
反向引物序列如SEQ ID NO：7,8,9,10,11所示，
荧光探针序列为如SEQ ID NO：13,14,15,16,17所示。
实施例2试剂盒
本发明的检测引物和/或探针可用于组成检测试剂盒，作为优选实施方式之一，由检测引物和/或探针组成的试剂盒及本实施例的用于检测CRC(结直肠癌)的试剂盒包括以下组分：
一、质粒参考品
本实施方式中，质粒参考品混合物为1-6种marker菌的任意一种质粒或多种质粒的混合，每种marker选取特异性片段合成amplicon，之后分别与载体pmd18-t或pUC57连接，通过体外扩增得到106数量级的拷贝数。之后对所有环状质粒进行酶切线性化，以减少复杂的二级结构影响后续的液滴生成。质粒在推荐的限制性内切酶条件(Hind III；BamH I)下，以每微克10个酶单位酶切。反应时间：Hind III 37℃，1小时；BamH I 30℃，1小时。
表3质粒参考品混合物组分
反应混合物 每次反应体积，μL
Hind III/BamH I 1
10X M Buffer 2
底物DNA ≤1
无菌水 补足至20
二、样本情况及样本核酸提取
所有样本(见下表)均称取0.2g使用QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit进行DNA提取，
通过Qubit定量完成质检后，取100ng进行ddPCR检测。
表4实验病例样本统计
1.胃息肉、胃腺瘤或胃炎等非结直肠息肉性病变标记为对照组(CON)
2.临床信息不明、腹泻、急性胰腺炎、溃疡性结肠炎或肿瘤等病例，可能影响肠道群者，不适合纳入研究的病例标记为NAN
3.体检对照标记为PE
4.后续分析把Polyp、Adenoma、CON合并为Control组
三、引物探针
本实施例中使用的探针5’端采用FAM或HEX荧光基团进行标记，3’端采用BHQ1或MGB进行标记。使用的特异性引物和探针如表1所示：
本实施例的试剂盒可使用表中的任意一组或多组引物探针的组合。其中物种名称一栏描述了相应引物检测的目标微生物名称，及其在本申请中使用的缩写形式。
本实施例中描述的引物探针组的序号1-6均与表1的序号一致。分别对应检测的微生物如下：
1.Fusobacterium nucleatum(FN) 2.Gemella morbillorum(GM)
3.Solobacterium moorei(SM) 4.Peptostreptococcus stomatis(pep_sto)
5.Parvimonas micra(par_micra) 6.Clostridium symbiosum(clo_sym)
作为优选实施方式，可选表1中4,1的组合，也即实施例1中第7组引物及探针；作为另一优选实施方式，可选表1中4,5的组合，也即实施例1中第8组引物及探针；作为另一优选实施方式，可选表1中2,5的组合，也即实施例1中第9组引物及探针；作为另一优选实施方式，可选表1中2,3,4的组合，也即实施例1中第10组引物及探针；作为另一优选实施方式，可选表1中2,4,5的组合，也即实施例1中第11组引物及探针；作为另一优选实施方式，可选表1中1,2,4,5的组合，也即实施例1中第12组引物及探针；作为又一优选实施方式，可选表1中2,4,5,6的组合，也即实施例1中第13组引物及探针；作为另一优选实施方式，可选表1中1,2,3,5的组合，也即实施例1中第14组引物及探针；作为另一优选实施方式，可选表1中2,3,5,6的组合，也即实施例1中第15组引物及探针；作为另一优选实施方式，可选表1中1,2,3,4,5的组合，也即实施例1中第16组引物及探针。
本实施例对用于ddPCR检测的试剂盒的反应体系及检测过程进行描述，以举例说明本发明试剂盒应用于ddPCR方法检测的过程，当然，本发明试剂盒还可用其他PCR方法进行检测，例如QPCR。以下是用于ddPCR检测的试剂盒的反应体系及检测过程：
一、反应混合液的制备
1.将所有试剂解冻至室温。通过≥2个循环的涡旋和离心来混合。
2.在设置反应混合物之前将样品稀释至所需浓度，混合均匀。
3.参考下表制备预混液反应：
表5多重引物混合物的组分
探针混合物的组分
总反应体系
注：上表中五重体系、四重体系、三重体系分别对应实施例中第5组、4组、3组、2组引物探针的组合
4.通过≥2个涡旋和离心的循环彻底混合后平衡反应管；
5.在装入DG8 cartridge(微滴发生卡)之前，在室温下放置约3分钟。
二、QX200液滴生成器生成反应油包水微滴
1.在装入DG8生成卡之前，将ddPCR反应混合物平衡至室温(约3分钟)。
2.将20μL每个样品沿底部转移到安装好的生成卡样品孔(中间行)中，使用两侧的孔将垫片牢固地钩在支架上。
3.打开生成仪，按下绿盖上的按钮，打开QX200液滴发生器，将卡槽放入仪器中，电源(左)和支架(中)指示灯变为绿色。按下按钮关闭门并开始产生液滴。当机器运行时，将样本和油结合成油包水液滴到新的孔内。
4.待到三个指示灯全部变成绿色常亮，按下按钮打开绿盖，从液滴生成器上取下带有DG8生成卡的卡槽。顶部“液滴”行的孔中的乳状液体表示已完成液滴生成。
三、PCR反应板制备
1.将40μL油滴从孔的侧面缓慢移至倾斜位置。(预留约5μL空气)*液滴倾向于漂浮在表面上，缓慢移液以防剪切或凝聚液滴。
2.沿着孔的侧面缓慢地将液滴分配到96孔PCR板的单列中，每轮后用一张热封膜盖住板子，以免蒸发。
3.按下DG8卡槽上的闩锁以打开，取出空的DG8生成卡并丢弃。
4.对所有样品重复生成油包水过程并加入PCR板中，关闭液滴发生器并在使用后放置回原位卡槽。
5.立即用PX1 PCR Plate Sealer用铝膜密封板(与PX1 PCR封板器匹配)以避免蒸发。
四、PCR热循环扩增
按照以下扩增步骤进行PCR反应：
表6 PCR扩增步骤
五、液滴读取与结果分析
表7多重体系靶标探针标记及浓度
如图1、2所示，其中图1为质粒参考品4重(上)和3重(下)靶标检测结果2D图；图2为临床样本中2重(上)和3重(下)靶标检测结果2D图。
在质粒和临床样本中的cluster分布可见，在质粒中，cluster分布与预测基本一致，有个别cluster有角度的偏差，但区分仍然清晰，证明多重引物探针间互不干扰，无“rain”的产生可实现较好的区分，且引物探针的配比合适，多重体系可用于样本的检测。在临床样本中的检测可见，在多重反应体系中都可以清晰的低区分各个cluster，由于样本量本身的差异，在样本中模板量较少时，存在的多重cluster较少。
综合质粒和临床样本中的情况，该多重引物探针可较好地对本发明实施例临床样本中的marker菌进行区分检测，并给出准确的拷贝数。可实现高效快捷的CRC肠道菌群特异性marker检测，从而对病人的结直肠癌情况进行诊断。
如图3-1、3-2、3-3所示，为联合两个微生物，即本实施例中两组引物探针的组合的标志物的检测结果。
以体检样本为对照，对CRC样本有接近或大于0.85的AUC。
且对由检测两个微生物的引物探针组成的检测试剂盒的检测性能与检测单个微生物的检测试剂盒的性能进行了对比，以图3-3为例进行说明，P值结果如下：
par_micra&GM vs.par_micra:0.017122133873211376
par_micra&GM vs.GM:0.08285582516422617
对比结果由P值进行表征，P值越小说明差异越显著，其中P值小于或接近0.05则说明三个微生物的组合相对于单个微生物的检测性能有显著提高，对比结果的三个P值均小于或接近0.05，表明组合有协同效应，该三组靶标的组合检测的效能明显高于单独检测的效能。图3-1、3-2的情况与图3-3类似，AUC值均接近或大于0.85，且P值均小于或接近0.05，表明这两组两个微生物组合的检测效果优秀，P值均小于0.05，表明组合均有协同效应，这这两组两个微生物的组合检测的效能均明显高于单独检测的效能。
如图4-1、4-2所示，为联合三个微生物，即本实施例中三组引物探针的组合的标志物的检测结果。
以体检样本为对照，对CRC样本有大于0.85的AUC。
且对由检测三个微生物的引物探针组成的检测试剂盒的检测性能与检测单个微生物的检测试剂盒的性能进行了对比，以图4-1为例进行说明，P值结果如下：
pep_sto&par_micra&GM vs.pep_sto:0.032505705440769854
pep_sto&par_micra&GM vs.par_micra:0.052760203353106584
pep_sto&par_micra&GM vs.GM:0.05578964550091032
对比结果由P值进行表征，P值越小说明差异越显著，其中P值小于或接近0.05则说明三个微生物的组合相对于单个微生物的检测性能有显著提高，对比结果的三个P值均小于或接近0.05，表明组合有协同效应，该三组靶标的组合检测的效能明显高于单独检测的效能。
图4-2的情况与图4-1类似，AUC值大于0.85，且P值均小于或接近0.05，表明组合有协同效应，该三组靶标的组合检测的效能明显高于单独检测的效能。
如图5-1、5-2、5-3、5-4所示，为联合四个微生物，即本实施例中四组引物探针的组合之一的标志物的检测结果。
以体检样本为对照，对CRC样本有大于0.85的AUC。
且对由检测四个微生物的引物探针组成的检测试剂盒的检测性能与检测单个微生物的检测试剂盒的性能进行了对比，以图5-1为例进行说明，P值结果如下：
FN&GM&SM&par_micra vs.FN:0.0018967015092690954
FN&GM&SM&par_micra vs.GM:0.03222059406121381
FN&GM&SM&par_micra vs.SM:1.2667326585077084e-08
FN&GM&SM&par_micra vs.par_micra:0.00640145030555388
对比结果由P值进行表征，P值越小说明差异越显著，其中P值小于0.05则说明四个微生物的组合相对于单个微生物的检测性能有显著提高，对比结果的四个P值均小于0.05，表明组合有协同效应，该四组靶标的组合检测的效能明显高于单独检测的效能。
图5-2、5-3、5-4的情况与图5-1类似，AUC值均大于0.85，且P值均小于或接近0.05，其中P值小于0.05则说明四个微生物的组合相对于单个微生物的检测性能有显著提高，对比结果的四个P值均小于0.05，表明组合有协同效应，该三个四组靶标的组合检测的效能均明显高于单独检测的效能。
如图6所示，为联合五个微生物:FN&GM&SM&pep_sto&par_micra，即本实施例中五组引物探针的组合标志物的检测结果。
以体检样本为对照，综合五次统计的结果，对CRC样本有>0.85的AUC(左：训练集，右：验证集)。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (26)

1.检测引物组，所述检测引物组包括引物，所述引物包括正向引物和反向引物，其中：
所述正向引物的核苷酸序列具有相对于Fusobacterium nucleatum基因组的第504814-504843位碱基区域的18-22个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Fusobacterium nucleatum基因组的第504819-504838位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；
所述反向引物的核苷酸序列具有相对于Fusobacterium nucleatum基因组的第504881-504911位碱基区域的18-24个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Fusobacterium nucleatum基因组的第504886-504906位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；
可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列具有相对于Fusobacterium nucleatum基因组的第504843-504870位碱基区域的16-20个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Fusobacterium nucleatum基因组的第504848-504865位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列。
2.检测引物组，所述检测引物组包括引物，所述引物包括正向引物和反向引物，其中：
所述正向引物的核苷酸序列具有相对于Gemella morbillorum基因组的第78979-79010位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Gemella morbillorum基因组的第78984-79005位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；
所述反向引物的核苷酸序列具有相对于Gemella morbillorum基因组的第79043-79074位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Gemella morbillorum基因组的第79048-79069位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；
可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列具有相对于Gemellamorbillorum基因组的第79016-79045位碱基区域的18-22个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Gemella morbillorum基因组的第79021-79040位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列。
3.检测引物组，所述检测引物组包括引物，所述引物包括正向引物和反向引物，其中：
所述正向引物的核苷酸序列具有相对于Solobacterium moorei基因组的第16795-16826位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Solobacterium moorei基因组的第16800-16821位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；
所述反向引物的核苷酸序列具有相对于Solobacterium moorei基因组的第16966-16896位碱基区域的18-23个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Solobacterium moorei基因组的第16871-16891位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；
可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列具有相对于Solobacterium moorei基因组的第16825-16855位碱基区域的18-23个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Solobacterium moorei基因组的第16830-16850位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列。
4.检测引物组，所述检测引物组包括引物，所述引物包括正向引物和反向引物，其中：
所述正向引物的核苷酸序列具有相对于Peptostreptococcus stomatis基因组的第22347-22379位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Peptostreptococcus stomatis基因组的第22352-22374位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；
所述反向引物的核苷酸序列具有相对于Peptostreptococcus stomatis基因组的第22396-22427位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Peptostreptococcus stomatis基因组的第22401-22422位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；
可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列具有相对于Peptostreptococcus stomatis基因组的第22379-22403位碱基区域的21-26个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Peptostreptococcus stomatis基因组的第22375-22398位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列。
5.检测引物组，所述检测引物组包括引物，所述引物包括正向引物和反向引物，其中：
所述正向引物的核苷酸序列具有相对于Parvimonas micra基因组的第1274701-1274733位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Parvimonas micra基因组的第1274706-1274728位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；
所述反向引物的核苷酸序列具有相对于Parvimonas micra基因组的第1274769-1274800位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Parvimonas micra基因组的第1274774-1274795位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；
可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列具有相对于Parvimonasmicra基因组的第1274734-1274767位碱基区域的21-26个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Parvimonas micra基因组的第1274739-1274762位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列。
6.检测引物组，所述检测引物组包括引物，所述引物包括正向引物和反向引物，其中：
所述正向引物的核苷酸序列具有相对于Clostridium symbiosum基因组的第240872-240902位碱基区域的18-24个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Clostridium symbiosum基因组的第240877-240897位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；
所述反向引物的核苷酸序列具有相对于Clostridium symbiosum基因组的第240932-240963位碱基区域的20-25个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Clostridium symbiosum基因组的第240937-240958位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；
可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列具有相对于Clostridiumsymbiosum基因组的第240905-240940位碱基区域的23-29个连续核苷酸的互补或相同的核苷酸序列；或者具有相对于Clostridium symbiosum基因组的第240910-240935位碱基区域的核苷酸的互补或相同的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的检测引物组，其中，所述检测引物组中的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
8.根据权利要求2所述的检测引物组，其中，所述检测引物组中的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示。
9.根据权利要求3所述的检测引物组，其中，所述检测引物组中的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示。
10.根据权利要求4所述的检测引物组，其中，所述检测引物组中的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。
11.根据权利要求5所述的检测引物组，其中，所述检测引物组中的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。
12.根据权利要求6所述的检测引物组，其中，所述检测引物组中的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。
13.检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4,1所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：10,7所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQID NO：16,13所示。
14.检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4,5所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：10,11所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQID NO：16,17所示。
15.检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2,5所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8,11所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQID NO：14,17所示。
16.检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2,3,4所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8,9,10所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQID SEQ ID NO：14,15,16所示。
17.检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2,4,5所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8,10,11所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQID NO：14,16,17所示。
18.检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1,2,4,5所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7,8,10,11所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQID NO：13,14,16,17所示。
19.检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2,4,5,6所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8,10,11,12所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQID NO：14,16,17,18所示。
20.检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1,2,3,5所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7,8,9,11所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQID NO：13,14,15,17所示。
21.检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：2,3,5,6所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：8,9,11,12所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQID NO：14,15,17,18所示。
22.检测引物组，所述检测引物组包括正向引物组和反向引物组，其中：
所述正向引物组的正向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1,2,3,4,5所示，所述反向引物组中的反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7,8,9,10,11所示；
可选的，所述检测引物组还包括探针组，所述探针组中的探针的核苷酸序列分别如SEQID NO：13,14,15,16,17所示。
23.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含权利要求1-22中任一项所述的检测引物组。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于结直肠癌诊断。
25.根据权利要求1-22中任一项所述的检测引物组或权利要求23-24任一项所述的检测试剂盒，其中，所述检测引物组或检测试剂盒中的探针的5′端标记荧光基团，3′端标记淬灭基团和/或MGB。
26.根据权利要求25所述的检测引物组或检测试剂盒，其中，所述检测引物组或检测试剂盒中的探针的5′端标记的荧光基团选自由FAM、HEX、VIC、JOE、NED、TAMRA、Cy3、ROX、TexasRed和Cy5组成的组中的至少一种，所述3′端标记的淬灭基团选自由BHQ1、TAMRA和ECLIPSE组成的组中的至少一种。
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