CN108359713B - 一种基因多态性检测探针的筛选方法 - Google Patents

一种基因多态性检测探针的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因多态性检测探针的筛选方法，包括以下步骤：(1)根据细菌16S rDNA保守区设计出通用探针，且设计出包含突变位点的模板序列；(2)根据GeneBank数据库的待测基因突变位点碱基序列，设计涵盖多态位点的多对筛选引物P1和多对筛选引物P2；(3)逐一取步骤(2)设计获得的多对筛选引物P1和多对筛选引物P2中的一对，分别与步骤(1)设计获得的通用探针、模板序列进行退火反应，筛选获得优选的模板序列；(4)根据优选的模板序列，合成与之匹配的荧光探针，即为最终的优选探针。本发明的基因多态性检测探针的筛选方法可避免因大量的探针筛选而引起的成本高和研发效率低的问题。

Description

一种基因多态性检测探针的筛选方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术，特别涉及一种基因多态性检测探针的筛选方法。
背景技术
现有的基因检测技术包括：(1)Sanger测序：是检测基因突变的金标准，但是由于其耗时长，操作繁琐，成本高，临床应用受限；(2)PCR-荧光熔解曲线法：利用不同双链DNA熔解Tm值不同检测基因突变的方法。通常包含染料法和探针法，该方法进行多重不对称扩增和多位点检测时，扩增难度增加，Tm值差异较难区分，往往需要多管扩增，降低了检测通量，开发成本较高；(3)荧光PCR法：利用荧光标记的探针与不同基因型靶序列特异性结合，从而产生特异性荧光信号进行检测，受PCR仪荧光通道限制，多位点检测成本较高；(4)PCR-RFLP：将PCR与限制性酶切相结合的传统方法，由于酶切操作繁琐及污染风险已很少在临床使用；(5)PCR-反向点杂交法：将PCR产物与固定在膜条上的特异性探针进行杂交，通过化学显色进行判读。但该方法存在耗时长、污染风险高以及特异性较差的缺陷；(6)突变扩增阻滞PCR(AMRS)：又称等位基因特异性扩增法，利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性扩增引物，只有引物3’碱基与模板配对时才能出现扩增带，从而检测突变。该方法需要严格控制反应条件，多重PCR扩增时难度更高，从而限制了临床应用。
在建立基因检测体系时，例如建立荧光熔解曲线检测体系，需要进行大量的探针筛选。目前，探针价格为1000-6000元/条，同时，探针合成周期一般为2-3周，因此，大量的探针筛选，不可避免存在研发成本高且合成速度慢的问题，极大的影响了研发的效率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：基于上述检测方案的不足，提供一种基因多态性检测探针的筛选方法，可避免因大量的探针筛选而引起的成本高和研发效率低的问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种基因多态性检测探针的筛选方法，包括以下步骤：
(1)根据细菌16S rDNA保守区设计出通用探针，且设计出包含突变位点的模板序列；将通用探针顺序分为第一通用探针序列部分和第二通用探针序列部分；将模板序列顺序分成第一模板序列部分和第二模板序列部分；
(2)根据GeneBank数据库的待测基因突变位点碱基序列，设计涵盖多态位点的多对筛选引物P1和多对筛选引物P2；将筛选引物P1顺序分成第一引物序列部分和第二引物序列部分；筛选引物P2顺序分成第三引物序列部分和第四引物序列部分；
其中，多对筛选引物P1和多对筛选引物P2的设计满足以下设计原则：设计第一引物序列部分与第一模板序列部分互补；设计第三引物序列部分与第二模板序列部分互补；设计第二引物序列部分与第一通用探针序列部分互补，设计第四引物序列部分与第二通用探针序列部分互补；
(3)逐一取步骤(2)设计获得的多对筛选引物P1和多对筛选引物P2中的一对筛选引物P1和一对筛选引物P2，分别与步骤(1)设计获得的通用探针、模板序列进行退火反应，筛选获得优选的筛选引物P1和筛选引物P2，进而筛选获得优选的模板序列；
(4)根据优选的模板序列，合成与之匹配的荧光探针，即为最终的优选探针。
本发明的有益效果在于：
本发明的基因多态性检测探针的筛选方法中，建立了一种四叶草结构通用探针筛选法，探针筛选阶段利用四叶草结构，仅需要一条通用荧光探针，以引物筛选代替探针筛选，获得合适的序列后再合成相应探针，极大的节约了研发时间和研发成本。
附图说明
图1为本发明实施例的基因多态性检测探针的筛选方法中的四叶草结构通用探针模型图；
图2为本发明实施例的基因多态性检测探针的筛选方法中野生型对应的四叶草结构通用探针模型图；
图3为图2对应的荧光熔解曲线图；
图4为本发明实施例的基因多态性检测探针的筛选方法中突变型对应的四叶草结构通用探针模型图；
图5为图4对应的荧光熔解曲线图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。
本发明最关键的构思在于：建立一种四叶草结构通用探针筛选法，以引物筛选代替探针筛选，从而避免因大量的探针筛选而引起的成本高和研发效率低的问题。
请参阅图1-2，以说明本发明的四叶草结构通用探针筛选法的机理。
图1和图2中，T为通用探针，探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团；P1和P2依次对应为筛选引物P1和筛选引物P2；M为模板序列。
如图1所示，M为模板序列，包含突变位点。将模板序列M顺序分为两段序列，分别设计部分序列与其互补的引物序列P1和引物序列P2，P1和P2的一段序列分别与模板M互补，另一段序列分别与探针T互补。
当进行退火时，根据碱基互补配对原理，形成如图1所示的四叶草结构，探针T的荧光基团与淬灭基团分离，探针发出荧光。随着体系温度升高，四叶草双链DNA解链，探针T恢复柔性结构，荧光基团和猝灭基团靠近，荧光被猝灭，系统中荧光信号降低。如图2-5所示，图2-3对应野生型，图4-5对应突变型；图2和图4均为退火时形成的四叶草结构，图3和图5均为对应的熔解曲线图。根据图2-5可知，野生型的匹配度最好，Tm值最高；突变型则于发生错配后，Tm值下降；即，野生型和突变型碱基匹配度不同，解链时Tm存在差异，通过实时检测dsDNA熔解过程中荧光信号值的变化，就可以生成不同Tm值的熔解曲线峰，从而检测出突变位点。
采用上述四叶草结构通用探针筛选法，在探针筛选阶段，仅需要一次性合成通用探针T，设计不同的与模板序列结合的P1/P2引物来筛选、优化体系。确定最终体系后，以优选的M序列做模板，合成与之匹配的荧光探针作为最终的优选探针。如此，研发全过程中，仅仅需要合成两条荧光探针，1条为通用探针，1条为最终优选探针，P1/P2引物仅作为筛选时使用，获得优选探针后，体系内不用再加入优选的P1/P2引物。
基于上述机理，本发明提供了一种基因多态性检测探针的筛选方法，包括以下步骤：
(1)根据细菌16S rDNA保守区设计出通用探针，且设计出包含突变位点的模板序列；将通用探针顺序分为第一通用探针序列部分和第二通用探针序列部分；将模板序列顺序分成第一模板序列部分和第二模板序列部分；
(2)根据GeneBank数据库的待测基因突变位点碱基序列，设计涵盖多态位点的多对筛选引物P1和多对筛选引物P2；将筛选引物P1顺序分成第一引物序列部分和第二引物序列部分；筛选引物P2顺序分成第三引物序列部分和第四引物序列部分；
其中，多对筛选引物P1和多对筛选引物P2的设计满足以下设计原则：设计第一引物序列部分与第一模板序列部分互补；设计第三引物序列部分与第二模板序列部分互补；设计第二引物序列部分与第一通用探针序列部分互补，设计第四引物序列部分与第二通用探针序列部分互补；
(3)逐一取步骤(2)设计获得的多对筛选引物P1和多对筛选引物P2中的一对筛选引物P1和一对筛选引物P2，分别与步骤(1)设计获得的通用探针、模板序列进行退火反应，筛选获得优选的筛选引物P1和筛选引物P2，进而筛选获得优选的模板序列；
(4)根据优选的模板序列，合成与之匹配的荧光探针，即为最终的优选探针。
本发明的有益效果在于：
本发明的基因多态性检测探针的筛选方法中，建立了一种四叶草结构通用探针筛选法，探针筛选阶段利用四叶草结构，仅需要一条通用荧光探针，以引物筛选代替探针筛选，获得合适的序列后再合成相应探针，极大的节约了研发时间和研发成本。
实施例1
以叶酸代谢基因MTHFR的基因多态性检测探针的筛选为例，即将本发明的基因多态性检测探针的筛选方法用于筛选MTHFR基因多态性检测探针，其完整技术方案包括：
(1)样本基因组DNA的制备及浓度测定
样本来源：人血液样本、口腔细胞及羊水；基因组DNA的制备采用微量样本基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，提取得到的DNA采用Nanodrop2000测定提取DNA的浓度与纯度值，将其稀释至一定的浓度范围进行后续的扩增验证工作。
(2)探针、引物设计
MTHFR基因多肽位点为C677T和A1298C，根据GeneBank数据库的MTHFR各突变位点碱基序列，分别设计涵盖多态位点特异性PCR扩增引物，以及不同的筛选引物，通用探针则选择细菌16s保守区进行设计，内参选择ACTB基因保守区。
针对2个突变及内参基因分别设计3对特异性引物，退火温度为50-55℃，根据熔解曲线分析需要，采用不对称PCR富集单一目标链，分别针对dsDNA的正义链和反义链设计了10对扩增引物，每对扩增引物量按照1：10～10:1比例进行筛选。
针对2个突变及内参基因，分别选择了10组模板序列，根据模板及通用探针组合，设计筛选引物，筛选引物包含部分模板序列和部分通用探针序列，退火温度为55-65℃。
根据细菌16S rDNA保守区，设计了10条通用探针序列，退火温度为55-65℃，通用探针序列与筛选引物同时配合设计，5’端FAM标记。为保证探针特异性，采用Taqman-MGB探针，MGB分子结合到DNA螺旋小沟，通过稳定MGB探针/模板提高杂交稳定性，使短至13个碱基的探针获得高错配区分辩别能力。
最终的优选探针有3条，荧光标记如表1。
表1
位点 5’端荧光基团 3’端
C677T FAM MGB
A1298C VIC MGB
IC CY5 MGB
(3)探针、引物筛选
利用正交试验方法，在同一管中同时扩增目标序列及内参序列，通过大量实验对比筛选引物和探针，实验结果证明引物和探针序列左右平移或长度改变，实验结果均有很大不同。不对称PCR，模板浓度、比例均对扩增效果有重要影响。引物、探针太长会有非特异扩增信号，太短则扩增效率比较低，检测灵敏度下降。
四叶草结构进行熔解曲线分析时，各个互补序列的退火效率与序列的GC含量有关，高GC含量不利于退火，影响熔解曲线分析。
通过大量的实验优化，最终确立的探针和内参探针组合见表2所示。
表2
Figure GDA0002383432600000061
(4)PCR反应液的确定、PCR扩增中反应条件、以及熔解曲线分析程序的确定
确定探针、引物以及反应体系其他组分浓度，并试验获得适宜的PCR反应条件以及熔解曲线分析的具体程序参数条件。
(5)结果判断
根据熔解峰对应的Tm值进行结果判断。
实施例2：
以叶酸代谢基因MTRR的基因多态性检测探针的筛选为例，即将本发明的基因多态性检测探针的筛选方法用于筛选MTRR基因多态性检测探针，其完整技术方案包括：
(1)样本基因组DNA的制备及浓度测定
样本来源：人血液样本、口腔细胞及羊水；基因组DNA的制备采用微量样本基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，提取得到的DNA采用Nanodrop2000测定提取DNA的浓度与纯度值，将其稀释至一定的浓度范围进行后续的扩增验证工作。
(2)探针、引物设计
MTRR基因多肽位点为A66G，根据GeneBank数据库突变位点碱基序列，分别设计涵盖多态位点特异性PCR扩增引物，以及不同的筛选引物，通用探针则选择细菌16s保守区进行设计，内参选择ACTB基因保守区。
针对1个突变及内参基因分别设计2对特异性引物，退火温度为50-55℃，根据熔解曲线分析需要，采用不对称PCR富集单一目标链，分别针对dsDNA的正义链和反义链设计多对扩增引物，每对扩增引物量按照1：10～10:1比例进行筛选。
针对2个突变及内参基因，分别选择了10组模板序列，根据模板及通用探针组合，设计筛选引物，筛选引物包含部分模板序列和部分通用探针序列，退火温度为55-65℃。
根据细菌16S rDNA保守区，设计了10条通用探针序列，退火温度为55-65℃，通用探针序列与筛选引物同时配合设计，5’端FAM标记。为保证探针特异性，采用Taqman-MGB探针，MGB分子结合到DNA螺旋小沟，通过稳定MGB探针/模板提高杂交稳定性，使短至13个碱基的探针获得高错配区分辩别能力。
最终的优选探针有2条，其荧光标记如表3中所示。
表3
位点 5’端荧光基团 3’端
A66G FAM MGB
IC CY5 MGB
(3)探针、引物筛选
利用正交试验方法，在同一管中同时扩增目标序列及内参序列，通过大量实验对比筛选引物和探针，实验结果证明引物和探针序列左右平移或长度改变，实验结果均有很大不同。不对称PCR，模板浓度、比例均对扩增效果有重要影响。引物、探针太长会有非特异扩增信号，太短则扩增效率比较低，检测灵敏度下降。
四叶草结构进行熔解曲线分析时，各个互补序列的退火效率与序列的GC含量有关，高GC含量不利于退火，影响熔解曲线分析。
通过大量的实验优化，最终确立的探针和内参探针组合见表4所示。
表4
Figure GDA0002383432600000081
(4)PCR反应液的确定、PCR扩增中反应条件、以及熔解曲线分析程序的确定
确定探针、引物以及反应体系其他组分浓度，并试验获得适宜的PCR反应条件以及熔解曲线分析的具体程序参数条件。
(5)结果判断
根据熔解峰对应的Tm值进行结果判断。
实施例3
本实施例基本与实施例1相同，不同在于，本实施例进一步披露了对具体的筛选过程中涉及的基因模板及通用探针序列。本实施例的筛选过程中，所用到的MTHFR基因模板及通用探针序列(各10条)，具体参见下述表5。
表5
Figure GDA0002383432600000091
Figure GDA0002383432600000101
表6为筛选后获得的优选的MTHFR模板、引物及通用探针序列表。
表6
Figure GDA0002383432600000102
Figure GDA0002383432600000111
表6中的“/”指示出顺序分隔形成的第一通用探针序列部分和第二通用探针序列部分之间的具体分隔位置、第一模板序列部分和第二模板序列部分之间的具体分隔位置、第一引物序列部分和第二引物序列部分之间的具体分隔位置、或者第三引物序列部分和第四引物序列部分之间的具体分隔位置。
根据表6可知，表6中最终获得的探针序列(SEQ ID No.1-4)即为表2中最终获得的探针序列。
实施例4
本实施例基本与实施例2相同，不同在于，本实施例进一步披露了对具体的筛选过程中涉及的基因模板及通用探针序列。本实施例的筛选过程中，所用到的MTRR基因模板及通用探针序列(各10条)，具体参见下述表7。
表7
Figure GDA0002383432600000112
Figure GDA0002383432600000121
Figure GDA0002383432600000131
表8为筛选后获得的优选的MTRR模板、引物及通用探针序列表。
表8
Figure GDA0002383432600000132
表8中的“/”指示出顺序分隔形成的第一通用探针序列部分和第二通用探针序列部分之间的具体分隔位置、第一模板序列部分和第二模板序列部分之间的具体分隔位置、第一引物序列部分和第二引物序列部分之间的具体分隔位置、以及第三引物序列部分和第四引物序列部分之间的具体分隔位置。
根据表8可知，表8中最终获得的探针序列(SEQ ID No.5-7)即为表4中最终获得的探针序列。
综上所述，本发明提供的基因多态性检测探针的筛选方法，以引物筛选代替探针筛选，获得合适的序列后再合成相应探针，极大的节约了研发时间和研发成本。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳会众生物技术有限公司
<120> 一种基因多态性检测探针的筛选方法
<130> 2018
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tacggctacc ttgttacgac tt 22
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaaatcggct cccgcagaca ccttct 26
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
accagtgaag aaagtgtctt tgaagtctt 29
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccaccttcca gcagatgtgg atcagc 26
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tacggctacc ttgttacgac tt 22
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaagaaatat gtgagcaagc tgtggtacat 30
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
accttccagc agatgtggat cagc 24

Claims (7)

1.一种基因多态性检测探针的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据细菌16S rDNA保守区设计出通用探针，且设计出包含突变位点的模板序列；将通用探针顺序分为第一通用探针序列部分和第二通用探针序列部分；将模板序列顺序分成第一模板序列部分和第二模板序列部分；
(2)根据GeneBank数据库的待测基因突变位点碱基序列，设计涵盖多态位点的多对筛选引物P1和多对筛选引物P2；将筛选引物P1顺序分成第一引物序列部分和第二引物序列部分；筛选引物P2顺序分成第三引物序列部分和第四引物序列部分；
其中，多对筛选引物P1和多对筛选引物P2的设计满足以下设计原则：设计第一引物序列部分与第一模板序列部分互补；设计第三引物序列部分与第二模板序列部分互补；设计第二引物序列部分与第一通用探针序列部分互补，设计第四引物序列部分与第二通用探针序列部分互补；
(3)逐一取步骤(2)设计获得的多对筛选引物P1和多对筛选引物P2中的一对筛选引物P1和一对筛选引物P2，分别与步骤(1)设计获得的通用探针、模板序列进行退火反应，筛选获得优选的筛选引物P1和筛选引物P2，进而筛选获得优选的模板序列；
(4)根据优选的模板序列，合成与之匹配的荧光探针，即为最终的优选探针。
2.根据权利要求1所述的基因多态性检测探针的筛选方法，其特征在于，所述通用探针为Taqman探针、Taqman-MGB探针、Molecular beacon探针或Molecular beacon-MGB探针。
3.根据权利要求1所述的基因多态性检测探针的筛选方法，其特征在于，所述通用探针的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的基因多态性检测探针的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法用于筛选叶酸代谢基因MTHFR的基因多态性检测探针，所述通用探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，筛选获得的最终的优选探针包括用于检测MTHFR基因C677T位点和A1298C位点的探针，其核苷酸序列如SEQ ID No.2-3所示。
5.根据权利要求4所述的基因多态性检测探针的筛选方法，其特征在于，所述叶酸代谢基因MTHFR的基因多态性检测探针还包括内参探针，内参探针根据ACTB基因保守区设计，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
6.根据权利要求1-3任意一项所述的基因多态性检测探针的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法用于筛选叶酸代谢基因MTRR的基因多态性检测探针，所述通用探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，筛选获得的最终的优选探针包括用于检测MTRR基因A66G位点的探针，其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。
7.根据权利要求6所述的基因多态性检测探针的筛选方法，其特征在于，所述叶酸代谢基因MTRR的基因多态性检测探针还包括内参探针，内参探针根据ACTB基因保守区设计，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
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JP2007330135A (ja) * 2006-06-14 2007-12-27 Toyobo Co Ltd 塩基多型の同定方法
EP3012326A1 (en) * 2013-03-26 2016-04-27 Nippon Gene Co., Ltd Primer and probe set used in identifying gene polymorphism, and use thereof

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