CN102994629A - 检测IL28B(rs8099917)和ITPA(rs1127354)的突变的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测IL28B(rs8099917)和ITPA(rs1127354)的突变的方法，还涉及用于该目的的核酸探针和试剂盒。具体地，本发明提供一种多态性检测用探针，其是用于检测IL28B基因的多态性的探针，其特征在于包含下述P1或P1’的荧光标记寡核苷酸，(P1)寡核苷酸，其具有包含序列编号1所示的碱基序列中的第301～307位的碱基的碱基长为7～28的碱基序列或与之同源的序列，且与第307位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并经荧光染料标记；(P1’)寡核苷酸，其具有在严格条件下与包含序列编号1所示的碱基序列中的第301～307位的碱基的碱基长为7～28的碱基序列的互补链杂交的序列，且与第307位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并经荧光染料标记。

Description

检测IL28B(rs8099917)和ITPA(rs1127354)的突变的方法

技术领域

本发明涉及检测IL28B(rs8099917)和ITPA(rs1127354)的突变方法以及用于该目的的核酸探针和试剂盒。

背景技术

丙型肝炎是通过感染丙型肝炎病毒(HCV)而导致发病的一种病毒性肝炎。日本国HCV患者数达到约200万人，HCV患者中6～8成转变为慢性肝炎。不对其进行治疗的话，慢性肝炎的状态经过10～30年，3～4成转变为肝硬化/肝癌。干扰素疗法作为排除HCV的抗病毒疗法，通过与利巴韦林(リバビリン)的联用/干扰素的PEG化，改善了治疗成绩。

报道称，针对PEG干扰素+利巴韦林的联用疗法有效的日本人患者和无效患者314人，分析了人基因中有个体差异的大约90万处，结果，作为干扰素(IFN)的一种的IL28B基因及其基因周围存在的SNP与治疗效果有关联(Nature Genetics 41，1105-1109(2009))。此外，报道称，预测与PEG干扰素+利巴韦林联用疗法的效果相关的6个SNP内，rs8099917是对治疗效果最有影响的(PLoS One.2010Oct 29；5(10)：e13771.)。

利巴韦林诱发性贫血是抗丙型肝炎病毒(HCV)疗法治疗中断及减量的主要原因之一(Hepatol Res.2010Nov；40(11)：1063-1071.)。报道称，以接受PEG干扰素(PEG-IFN)/利巴韦林联用疗法的日本人丙型肝炎患者为对象，评价了ITPA基因突变带来的临床意义，结果发现，rs1127354(其是ITPA外显子内功能性SNP)是利巴韦林诱发性贫血的有用的预测因子(Gastroenterology.2010Oct；139(4)：1190-7.Epub 2010Jul 14.)。

PLoS One.2010Oct 29；5(10)：e13771.中报道：IL28B(rs8099917)的突变与对丙型肝炎患者的PEG干扰素+利巴韦林疗法强烈相关，是否有IL28B(rs8099917)的突变使用测序分析来检测。HePATOLOGY，Vol.53，Issue 2，P.415-421，2011中报道，ITPA(rs1127354)的突变与使用PEG干扰素/利巴韦林疗法时的贫血强烈相关，ITPA(rs1127354)的突变使用测序分析来检测。

但是，如PLoS One.2010Oct 29；5(10)：e13771.和HePATOLOGY，Vol.53，Issue 2，P.415-421，2011所述，为调查丙型肝炎患者的SNP突变而进行的从全血提取基因组，在实际的临床现场非常需要人力和成本。因此预计很需要从全血直接自动测定是否有突变的技术。此外，因为使用PEG干扰素+利巴韦林疗法时，IL28B(rs8099917)和ITPA(rs1127354)与效果相关，临床领域非常可能很需要同时测定IL28B(rs8099917)和ITPA(rs1127354)是否有突变的技术。但PLoS One.2010Oct 29；5(10)：e13771.和HePATOLOGY，Vol.53，Issue 2，P.415-421，2011由于是进行测序分析，来发现IL28B(rs8099917)和ITPA(rs1127354)有无突变，因此无法同时检测两种突变的有无。

特开2002-119291号公报中记载了使用经荧光染料标记的核酸探针、使其与靶标核酸杂交、测定荧光染料发光的减少量的方法。但是，使用经荧光染料标记的核酸探针、使其与靶标核酸杂交、测定荧光染料发光的减少量的过程实施时，并不能对任何任意序列均可实施，必须针对每种突变找到适当的序列。

发明内容

发明要解决的问题

本发明以提供下述方法及用于其的试剂盒作为要解决的问题，所述方法用于指定能有效检测IL28B基因多态性的rs8099917和ITPA基因多态性的rs1127354的探针、检测IL28B基因多态性的rs8099917和ITPA基因多态性的rs1127354。

用于解决问题的手段

本发明的发明人发现，通过基于包含IL28B基因多态性的rs8099917的特定区域以及包含ITPA基因多态性的rs1127354的特定区域来设计探针，使用该探针，来通过检测基于与靶标核酸形成杂交体和/或杂交体解离的信号，可检测所述的突变，从而实现本发明。

即，本发明如下所述。

(1)一种多态性检测用探针，其是用于检测IL28B基因的多态性的探针，其特征在于包含下述P1或P1’的荧光标记寡核苷酸，

(P1)寡核苷酸，其具有包含序列编号1所示的碱基序列中的第301～307位的碱基的碱基长为7～28的碱基序列或与之同源的序列，且与第307位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；

(P1’)寡核苷酸，其具有在严格条件下与包含序列编号1所示的碱基序列中的第301～307位的碱基的碱基长为7～28的碱基序列的互补链杂交的序列，且与第307位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。

(2)一种多态性检测用探针，其是用于检测TIPA基因的多态性的探针，其特征在于包含选自下述P2～P3’中的至少一种的荧光标记寡核苷酸，

(P2)寡核苷酸，其具有与包含序列编号2所示的碱基序列中的第239～251位的碱基的碱基长为13～28的碱基序列互补的序列或与之同源的序列，且与第239位的碱基对应(即，互补)的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；

(P2’)寡核苷酸，其具有在严格条件下与包含序列编号2所示的碱基序列中的第239～251位的碱基的碱基长为13～28的碱基序列杂交的序列，且与第239位的碱基对应(即，互补)的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；

(P3)寡核苷酸，其具有包含序列编号2所示的碱基序列中的第251～256位的碱基的碱基长为6～42的碱基序列或与之同源的序列，且第256位的碱基对应的碱基为胞嘧啶，

(P3’)经荧光染料标记的寡核苷酸，其具有在严格条件下与包含序列编号2所示的碱基序列中的第251～256位的碱基的碱基长为6～42的碱基序列的互补链杂交的序列，且第256位的碱基对应的碱基为胞嘧啶。

(3)(1)或(2)记载的探针，其中，

P1和P1’的寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位具有经荧光染料标记的第307位碱基对应(即，互补)的碱基，

P2和P2’的寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位中的任何的位置具有经荧光染料标记的第239位碱基对应的碱基，

P3和P3’的寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位中的任何的位置具有经荧光染料标记的第256位碱基对应的碱基。

(4)(1)或(2)记载的探针，其中，

P1和P1’的寡核苷酸在3’末端具有经荧光染料标记的第307位碱基对应的碱基，

P2和P2’的寡核苷酸在3’末端具有经荧光染料标记的第239位碱基对应(即，互补)的碱基，

P3和P3’的寡核苷酸在3’末端具有经荧光染料标记的第256位碱基对应的碱基，

(5)(1)～(4)中任意一项记载的探针，所述荧光标记寡核苷酸在不与靶标序列杂交的时候发出荧光，并且与靶标序列杂交的时候荧光强度减少或增加。

(6)(5)记载的探针，所述荧光标记寡核苷酸在不与靶标序列杂交的时候发出荧光，并且在与靶标序列杂交的时候荧光强度减少。

(7)(1)～(6)中任意一项记载的探针，其中，

P1和P1’的寡核苷酸的碱基长为7～23，

P2和P2’的寡核苷酸的碱基长为13～23，

P3和P3’的寡核苷酸的碱基长为6～27。

(8)(1)～(6)中任意一项记载的探针，其中，

P1和P1’的寡核苷酸的碱基长为7～18，

P2和P2’的寡核苷酸的碱基长为13～18，

P3和P3’的寡核苷酸的碱基长为6～22。

(9)(1)～(8)中任意一项记载的探针，所述探针是熔解曲线分析用的探针。

(10)一种方法，其是检测IL28B基因或ITPA基因中的多态性的方法，其特征在于使用(1)～(9)中任意一项记载的探针。所述方法针对可能含有所述多态性的核酸的试样来进行，包括：通过使所述探针和所述试样接触，以及检测所述多态性的有无。本发明还包括用于检测所述多态性的探针的使用。

(11)一种方法，其是分别或在一个反应体系中同时检测IL28B基因或ITPA基因中的多态性的方法，其特征在于，包含下述步骤(I)～(IV)，

(I)向含有DNA的试样中，添加(1)～(9)中任意一项记载的探针，使所述探针与所述DNA杂交的步骤，

(II)使温度变化，使所述DNA与所述探针的杂交体形成体解离，测定基于杂交体形成体的解离的信号变动的步骤，

(III)解析所述信号变动以确定Tm值；以及

(IV)步骤，基于所述Tm值来确定目标多态性的有无或者具有多态性的碱基序列的丰度比。

(12)根据(11)所述的方法，还包含在(I)步骤之前或与(I)步骤同时扩增DNA。

(13)一种丙型肝炎病毒治疗药物的药效判定(或预测)方法，其包括：根据(10)～(12)中任意一项所述的方法，分别或在一个反应体系中同时检测IL28B基因和ITPA基因中的多态性的步骤；以及基于多态性的有无来判定(或预测)对药剂的耐药性或药剂的药效。所述方法，可在源自要进行所述判定/预测的被验者(例如人)的试样中实施。在本说明书中使用的情况下，“试样”是指包括可能含有所述多态性的核酸(例如DNA)。

(14)一种包含(1)～(9)中任意一项记载的探针的试剂盒，其是用于分别或在一个反应体系中同时检测IL28B基因和ITPA基因中的多态性的试剂盒。

(15)根据(14)记载的试剂盒，其包含P1或P1’的寡核苷酸、和P2或P2’的寡核苷酸或者P3或P3’的寡核苷酸。

(16)根据(14)或(15)记载的试剂盒，还包含：用于扩增包含IL28B基因的序列编号1所示的碱基序列中与P1或P1’的寡核苷酸杂交的序列的区域的引物，和/或

用于扩增包含ITPA基因的序列编号2所示的碱基序列中与P2或P2’、或者P3或P3’的寡核苷酸杂交的序列的区域的引物。本发明还包括用于检测所述多态性的试剂盒的使用。

发明效果

向PCR等基因扩增体系中添加本发明的探针，基因扩增反应完成后，仅进行Tm分析，即可对IL28B基因多态性的rs8099917和ITPA基因多态性的rs1127354进行分型。并且，因为可以直接检查全血/口腔黏膜悬浊液等，可以减少人力和成本。

本发明的探针具有高特异性。

通过使用本发明的方法，即使进行PCR的情况下，也不必移出扩增产物，因此基本上没有污染的危险。此外，本发明的方法因为步骤简单，故而容易自动化。

通过本发明的方法，可以同时检测IL28B基因多态性的rs8099917和ITPA基因多态性的rs1127354。使用PEG干扰素+利巴韦林疗法，由于IL28B(rs8099917)和ITPA(rs1127354)与治疗的效果有很大关系，因此能够同时检测两种突变在临床上具有重大意义。

附图说明

图1示出了(A)核酸混合物的熔解曲线、和(B)微分熔解曲线的一个例子的图。

图2为使用本发明的实施例1中所涉及的多态性检测用探针得到的熔解曲线。纵轴是相对于单位时间而言的荧光强度的变化量(d荧光强度增加量/t)，横轴是温度(℃)。方形示出了野生型，菱形示出了突变型，三角形示出了杂合型(下文中相同)。

图3是使用比较例1中所涉及的多态性检测用探针得到的熔解曲线。

图4是使用本发明的实施例2中所涉及的多态性检测用探针得到的熔解曲线。

图5是使用比较例2中所涉及的多态性检测用探针得到的熔解曲线。

图6是使用本发明的实施例3的精制人基因组所涉及的多态性检测用探针得到的熔解曲线。左图是IL28B基因多态性检测的熔解曲线，右图是ITPA基因多态性检测的熔解曲线(下文中相同)。

图7是使用本发明的实施例3的全血所涉及的多态性检测用探针得到的熔解曲线。

具体实施方式

<1>本发明的探针和本发明的检测方法

本发明的(P1)探针是用于检测IL28B基因多态性的rs8099917的探针，其特征在于，包括下述寡核苷酸，所述寡核苷酸具有包含序列编号1所示的碱基序列中的第301～307位的碱基的碱基长为7～28的碱基序列或与之同源的序列，且与第307位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。在参照该上下文时，“同源的序列”是指与序列编号1或序列编号1的所述记载部分同源的序列。碱基长7～28的碱基序列的全部连续包含在序列编号1或“同源的序列”中。

本发明的(P1’)探针是用于检测IL28B基因多态性的rs8099917的探针，其特征在于，包括下述寡核苷酸，所述寡核苷酸具有在严格条件下与包含序列编号1所示的碱基序列中的第301～307位的碱基的碱基长为7～28的碱基序列的互补链杂交的序列，且与第307位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。在参照该上下文时，“杂交的序列”是与序列编号1或序列编号1的所述记载部分的互补链杂交。碱基长7～28的碱基序列的全部连续包含在序列编号1或“杂交的序列”中。

本文中，IL28B基因多态性的rs8099917是序列编号1的第301位的碱基。该rs编号表示National Center for Biotechnology Information的dbSNP数据库(//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)的登录编号。此外，虽然序列编号1的第301位示为k，但野生型的碱基为T，突变型的碱基为G。本发明的(P1)或(P1’)探针中，优选地，序列编号1的第301位的碱基为突变型的碱基G。

本发明的(P1)或(P1’)探针，除了具有序列编号1中所示的碱基序列中上述指定的序列之外，还可与特开2002-119291号公报中记载的探针相同地来制造。(P1)或(P1’)探针的长度例如为7～48个碱基长、7～28个碱基长、7～23个碱基长、7～18个碱基长。

作为本发明中使用的(P1)或(P1’)探针的碱基序列的例子，可举出5’-ctgtgagcaatGtcaccc-3’(序列编号3)，大写字母的碱基G对应第301位的碱基。

本发明的(P2)探针是用于检测ITPA基因多态性的rs1127354的探针，其特征在于，包括下述寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与包含序列编号2所示的碱基序列中的第239～251位的碱基的碱基长为13～28的碱基序列互补的序列或与之同源的序列，且第239位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。在参照该上下文时，“同源的序列”是指与序列编号2或者序列编号2的所述记载部分同源的序列。即，所述寡核苷酸包含所述“同源的序列”的互补链。碱基长13～28的碱基序列的全部连续包含在序列编号2或者“同源的序列”中。

本发明的(P2’)探针是用于检测ITPA基因多态性的rs1127354的探针，其特征在于，包括下述寡核苷酸，其具有在严格条件下与包含序列编号2所示的碱基序列中第239～251位的碱基的碱基长为13～28的碱基序列杂交的序列，且与第239位的碱基对应(即，互补)的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。碱基长13～28的碱基序列的全部连续包含在序列编号2中。

本文中，ITPA基因多态性的rs1127354是序列编号2的第251位的碱基。此外，虽然序列编号2的第251位示为v，但野生型的碱基是C，突变型的碱基是A。此外，虽然NCBI的SNP站点中，ITPA基因多态性的rs1127354登录了C/A/G三种，但记载称日本人的C的等位频率为87.5％，A的等位频率为12.5％(没有G型的日本人)。此外，仅测定了1名报道G的人(组织)(关于P3的探针也相同)。优选地，本发明的(P2)或(P2’)的探针与第251位的碱基为突变型的碱基A的序列编号2的碱基序列互补。

本发明的(P2)或(P2’)探针，除了具有序列编号2中所示的碱基序列中上述指定的序列之外，还可与特开2002-119291号公报中记载的淬灭探针相同地来制造。本发明的探针的长度例如为13～48个碱基长、13～28个碱基长、13～23个碱基长、13～18个碱基长。

作为本发明中使用的(P2)或(P2’)探针的碱基序列的例子，可举出5’-gcatgTaaacttatctcc-3’(序列编号4)，大写字母的碱基T相当于第251位的碱基(即，互补)。

本发明的(P3)探针是用于检测ITPA基因多态性的rs1127354的探针，其特征在于，包括寡核苷酸，所述寡核苷酸具有包含序列编号2所示的碱基序列中的第251～256位的碱基的碱基长为6～42的碱基序列或与之同源的序列，且与第256位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。在参照该上下文时，“同源的序列”是指与序列编号2或序列编号2的所述记载部分同源的序列。碱基长6～42的碱基序列的全部连续包含在序列编号2或“同源的序列”中。

本发明的(P3’)探针是用于检测ITPA基因多态性的rs1127354的探针，其特征在于，包括下述寡核苷酸，所述寡核苷酸具有在严格条件下与包含序列编号2所示的碱基序列中的第251～256位的碱基的碱基长为6～42的碱基序列的互补链杂交的序列，且与第256位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。在参照该上下文时，“杂交的序列”是指与序列编号2或者序列编号2的所述记载部分的互补链杂交的序列。碱基长6～42的碱基序列的全部连续包含在序列编号2或者“杂交的序列”中。

本文中，ITPA基因多态性的rs127354是序列编号2的第251位的碱基。本发明的(P3)或(P3’)探针中，优选地，序列编号2的第251位的碱基是野生型的碱基C。

本发明的(P3)或(P3’)探针，除了具有序列编号2中所示的碱基序列中上述指定的序列之外，还可与特开2002-119291号公报中记载的淬灭探针相同地来制造。本发明的探针的长度例如为6～72个碱基长、6～42个碱基长、6～27个碱基长、6～22个碱基长。

作为本发明中使用的(P3)或(P3’)探针的碱基序列的例子，可举出5’-tctaggagataagtttCcatgc-3’(序列编号5)，大写字母的碱基C相当于第251位的碱基。

所述荧光染料无特别限制，例如可举出荧光素、磷光体、罗丹明、聚甲炔染料衍生物等。作为荧光染料，例如可举出BODIPY FL(商标名，Molecular Probe公司制)、FluorePrime(商品名，Amersham Pharmacia公司制)、Fluoredite(商品名，Millipore公司制)、FAM(ABI公司制)、Cy3和Cy5(Amersham Pharmacia公司制)、TAMRA(Molecular Probe公司制)等。探针的检测条件无特别限制，可以根据使用的荧光染料适当确定。例如Pacific Blue能够在检测波长445～280nm下检测，TAMRA能够在检测波长585～700nm下检测，BODIPY FL能够在检测波长520～555nm下检测。如果使用这种探针，则能够根据信号的变动来容易地确认杂交和解离。荧光染料结合至寡核苷酸的结合方法可以按照通常的方法、例如日本专利文献特开2002-119291号公报中记载的方法来进行。

本申请中“同源的序列”指具有下述序列的碱基序列：在指定的碱基序列中，与碱基序列(例如，序列编号1或者2或者所述记载部分)或碱基序列的互补链(或者所述记载部分)具有例如80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上的同一性的序列。本申请中，也可以有100％的同一性。

本申请中的杂交可以根据公知的方法或者基于公知方法的方法，例如Molecular Cloning 3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)中记载的方法等来进行。该文献通过引用被并入本说明书中。所述杂交例如在严格条件下进行。

严格条件是指形成特异性杂交体但不形成非特异性杂交体的条件。典型的严格条件例如可以举出在钾浓度约25mM～约50mM以及镁浓度约1.0mM～约5.0mM中进行杂交的条件。作为本发明的条件的一个例子，可以举出在Tris-HCl(pH8.6)、25mM的KCl以及1.5mM的MgCl₂下进行杂交的条件，但是不限于此。此外，严格条件被记载在Molecular Cloning3rd(J.Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Lab.Press，2001)中。该文献通过引用被并入本说明书中。本领域技术人员能够通过改变杂交反应、杂交反应液的盐浓度等来容易地选择这样的条件。

所述荧光标记寡核苷酸中，作为寡核苷酸，除了包含寡核苷酸之外，还包含经修饰的寡核苷酸。

作为所述寡核苷酸的构成单位，可举出核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、人工核酸等。作为所述人工核酸，可举出DNA、RNA、作为RNA类似物的LNA(锁核酸，Locked Nucleic Acid)；作为肽核酸的PNA(Peptide Nucleic Acid)；作为桥联化核酸的BNA(Bridged NucleicAcid)等。

所述寡核苷酸可以是所述构成单位中的一种构成的，也可以是多种构成的。

本发明的(P1)及(P1’)的探针是与包含序列编号1的第301～307位的碱基的碱基长为7～28的碱基序列同源的序列，其显示具有与序列编号1的同源性的序列。即，本发明的(P1)及(P1’)的探针与包含序列编号1的第301～307位的碱基的碱基长为7～28的碱基序列同源，但也可以不完全同一。此外，对应第307位的碱基是胞嘧啶，其被荧光标记。

本发明的(P2)及(P2’)的探针是包含序列编号2的第239～251位的碱基的碱基长为13～28的碱基序列，其显示与和序列编号2互补的序列有同源性的序列。即，本发明的(P2)及(P2’)的探针与包含序列编号2的第239～251位的碱基的碱基长为13～28的碱基序列互补，但也可以不完全互补。此外，对应第239位的碱基是胞嘧啶，其被荧光标记。

本发明的(P3)及(P3’)的探针是包含序列编号2的第251～256位的碱基的碱基长为6～42的碱基序列，其显示与和序列编号2有同源性的序列。即，本发明的(P3)及(P3’)的探针与包含序列编号2的第251～256位的碱基的碱基长为6～42的碱基序列同源，但也可以不完全相同。此外，对应第256位的碱基是胞嘧啶，其被荧光标记。

所述荧光标记寡核苷酸例如是其与互补序列杂交时的荧光强度比未与互补序列杂交时的荧光强度减少(淬灭)或增加的荧光标记寡核苷酸。例如，与互补序列杂交时的荧光强度比未与互补序列杂交时的荧光强度减少的荧光标记寡核苷酸。利用了这种荧光淬灭现象(Quenchingphenomenon)的探针一般称为鸟嘌呤淬灭探针，已知为所谓Q Probe(注册商标)。例如是下述经荧光染料标记的寡核苷酸：寡核苷酸被设计为3’末端或5’末端为C，并用荧光染料标记该末端的C使其靠近G时发光变弱。

此外，本发明的探针例如3’被用荧光染料标记。

此外，本说明书中，“3’末端起数第1～3位”的情况下，以3’末端作为第1位来数。

本发明的检测方法为如下方法：针对具有IL28B基因多态性的rs8099917和/或ITPA基因多态性的rs1127354的核酸，使用经荧光染料标记的核酸探针，通过测定荧光染料的荧光进行熔解曲线分析，基于熔解曲线分析的结果来检测多态性，其特征在于，核酸探针是本发明的探针。

本发明的检测方法，例如使用本发明的探针，其特征在于包括下述步骤。

(I)步骤，向含有DNA的试样中添加本发明的探针，使所述探针与所述DNA杂交；

(II)步骤，使温度变化，使所述DNA与所述探针的杂交体形成体解离，测定基于杂交体形成体的解离的信号变动；

(III)步骤，分析所述信号变动、确定Tm值；以及

(IV)步骤，基于所述Tm值确定目标多态性的有无或者具有多态性的碱基序列的丰度比。

此外，(III)中对Tm值的评价中，不仅包括评价杂交体形成体的解离温度，还包括评价杂交体形成体熔解时随着温度而变动的荧光信号的微分值的大小。根据微分值的大小，能评价具有多态性的碱基序列(DNA)的丰度比。

作为核酸扩增的方法，例如是使用聚合酶的方法，作为其例子，可举出PCR、ICAN、LAMP等。在通过使用聚合酶的方法进行扩增的情况下，例如，可在存在本发明探针的情况下，进行扩增。本领域技术人员易于根据使用的探针来调整扩增的反应条件等。由此，在核酸扩增后仅分析探针的Tm值，因此在反应结束之后不需要处理扩增产物。由此，不用担心扩增产物带来的污染。另外，由于能够用与扩增所需的仪器相同的仪器进行检测，因此不需要移动容器。因此，容易自动化。

另外，作为PCR法中使用的DNA聚合酶，可以使用通常所用的DNA聚合酶，无特别限制。例如可以为GeneTaq(Nippon Gene公司制)、PrimeSTAR Max DNA聚合酶(Takara Bio公司制)、Taq聚合酶等。

作为聚合酶的使用量，只要是采用通常使用的浓度即可，无特别限制。例如在使用Taq聚合酶的情况下，相对于反应溶液量50μl，可以为0.01U～100U的浓度。由此，具有能获得充足的扩增产物量等的优点。

本发明中，试样中的DNA可以是单链DNA也可以是双链DNA。在所述DNA为双链DNA的情况下，例如可以包括在与所述杂交步骤之前，通过加热使所述试样中的双链DNA解离的步骤。通过将双链DNA解离成单链DNA，可与所述荧光标记寡核苷酸进行杂交。

本发明中，本发明的探针相对于所述试样中的DNA的添加比例(摩尔比)没有限制，从充分确保检测信号来说，例如相对于试样中的DNA而言为1倍以下或0.3倍以下。此时，试样中的DNA例如可以是发生了检测目标多态性的检测对象DNA和未发生所述多态性的非检测对象DNA的合计，也可以是含有发生了检测目标多态性的检测对象序列的扩增产物和含有未发生所述多态性的非检测对象序列的扩增产物的合计。此外，试样中的DNA中的所述检测对象DNA的比例通常是不清楚的，但是结果上相对于检测对象DNA(含有检测对象序列的扩增产物)而言，所述探针的添加比例(摩尔比)为100倍以下、50倍以下或者30倍以下。另外，其下限无特别限制，例如为0.001倍以上、0.01倍以上或0.2倍以上。本发明的探针相对于所述DNA的添加比例例如可以是相对于双链DNA的摩尔比，也可以是相对于单链DNA的摩尔比。

对Tm值进行说明。当加热含有双链DNA的溶液时，260nm处的吸光度上升。这是因为双链DNA中的两条双链之间的氢键由于加热而断裂，解离成单链DNA(DNA的熔解)。并且，当所有的双链DNA解离成为单链DNA时，其吸光度显示为加热开始时的吸光度(仅双链DNA的吸光度)的约1.5倍左右，由此可以判断熔解完成。基于该现象，Tm值一般被设定为吸光度达到吸光度总上升量的50％时的温度。

在本发明中，用于确定Tm值的、随温度变化的信号变动的测定可以由前述那样的原理，通过260nm的吸光度测定来进行，例如可以测定如下信号：所述信号是基于本发明的探针上添加的标记的信号的信号，并且该信号根据DNA和探针的杂交体形成的状态而变动。因此，能够使用例如前述的经标记探针来作为本发明的探针。作为所述经标记探针，例如可以举出未与靶标序列杂交时发出荧光且与靶标序列杂交时荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸探针，或者未与靶标序列杂交时发出荧光且与靶标序列杂交时荧光强度增加的荧光标记寡核苷酸探针。如果是前者那样的探针，与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)的时候不显示信号或者信号弱，而通过加热、探针游离时则显示出信号或者信号增加。另外，如果是后者的探针，通过与检测对象序列形成杂交体(双链DNA)而显示出信号，而通过加热、探针游离时信号减少(消失)。因此，通过在信号特有的条件(吸光度等)下检测基于该标记的信号的变化，能够与所述260nm的吸光度测定同样地进行熔解以及Tm值的确定。标记化探针中的标记化物质例如如前文所述，可使用荧光染料标记化探针。

下面，关于本发明的多态性检测方法，关于检测基于荧光染料的信号变化的方法，通过举出具体例子来说明。此外，本发明的多态性检测方法特征在于使用所述多态性检测用探针自身，对于其它步骤/条件没有限制。

对荧光强度的变动进行测定时的温度范围无特别限制，例如起始温度可以为室温～85℃，或25～70℃，结束温度例如可以为40～105℃。另外，温度的上升速度无特别限制，例如可以为0.1℃/秒～20℃/秒，或0.3℃/秒～5℃/秒。

下面，分析所述信号的变动并确定Tm值。具体而言，基于所得的荧光强度来计算各温度下的微分值(-d荧光强度/dt)，将显示最低值的温度确定为Tm值。另外，可以将每单位时间的荧光强度增加量(荧光强度增加量/t)最高的点确定为Tm值。此外，在标记化探针采用由于杂交体形成而信号强度增加的探针而不采用淬灭探针的情况下，相反地测定荧光强度的减少量即可。

另外，在本发明中，如前所述，对杂交体进行加热，并测定伴随温度上升的荧光信号变动(例如荧光强度的增加)，但替代该方法，例如也可以测定杂交体形成时的信号变动。即，也可以对降低添加了所述探针的试样的温度来形成杂交体形成体时随所述温度下降的荧光信号变动进行测定。

作为具体例，在使用较之未和互补序列杂交时的荧光强度而言与互补序列杂交时荧光强度减少(淬灭)的荧光标记寡核苷酸探针(例如QProbe)的情况下，当在试样中添加了所述探针时，所述探针处于解离状态因此荧光强度大，当由于温度下降而形成杂交体形成体时，所述荧光减少(或淬灭)。因此，例如可以慢慢降低所述加热的试样的温度，并测定伴随温度下降的荧光强度的减少。

另一方面，在使用由于杂交体形成而信号增加的经标记探针的情况下，当在试样中添加了所述探针时，所述探针处于解离状态因此荧光强度小(或淬灭)，但是在由于温度下降而形成杂交体时，荧光强度增加。因此，例如可以慢慢降低所述试样的温度，并测定随温度下降的荧光强度的增加。

作为进行核酸扩增时的模板的核酸，只要是含有核酸即可，无特别限制，例如血液、口腔粘膜悬浮液、指甲或毛发等体细胞、生殖细胞、乳汁、腹水液、石蜡包埋组织、胃液、胃洗涤液、腹膜液、羊水、细胞培养等任意的源自或者可以源自生物学起源的物质。作为模板的核酸可以从该起源得到后直接使用，或者为了改变所述样品的特性而经预处理之后使用。例如，在将全血作为试样的情况下，可以通过现有的公知方法来从全血中分离基因组DNA。例如，可以使用市售的基因组DNA分离盒(商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit；GE Healthcare Bioscience公司制造)等。

应用于PCR法的引物只要是能够扩增本发明的多态性检测用探针能够杂交的区域，则无特别限制，本领域技术人员能够基于序列编号1或2所示的碱基序列来适当设计。引物的长度和Tm值可以设为12mer～40mer和40℃～70℃，或16mer～30mer和55℃～60℃。

另外，引物对的各引物的长度也可以不相同，但是优选两引物的Tm值基本相同(或者，两引物之间Tm值之差在5℃以内)。Tm分析除了用于测定本发明探针的荧光染料的荧光之外，可根据通常的方法来进行。荧光的测定可以使用对应于荧光染料的波长的激发光，来测定发光波长的光。Tm分析中的升温速度通常为0.1～1℃/秒。进行Tm分析时的反应溶液的组成只要探针与具有和其碱基序列互补的序列的核酸杂交能杂交即可，并无特殊限制，但通常一价阳离子浓度为1.5～5mM，pH为7～9。PCR等应用DNA聚合酶的扩增方法的反应溶液通常满足该条件，因此扩增后的反应液可原样用于Tm分析。

基于Tm分析的结果，检测IL28B基因多态性的rs8099917和/或ITPA基因多态性的rs1127354可按照通常的方法来进行。本发明中的检测包含检测突变的有无。

此外，因为通过本发明的探针和方法，能够检测突变的有无，因此本发明也包括基于突变的有无，来判断或预测丙型肝炎病毒治疗药物的药效和对丙型肝炎病毒治疗药物的耐药性。具体而言，IL28B基因多态性的rs8099917的碱基是野生型的T的情况下(T/T)，提示PEG干扰素+利巴韦林联用疗法是有效的，而包含突变型的G的情况下(G/T或T/G)，提示为无效。另外，ITPA基因多态性的rs1127354的碱基包含突变型的A的情况下(A/A或C/A)，作为利巴韦林的副作用的重度贫血难于发病，提示利巴韦林的高用量施用是可能的。

此外，根据本发明的方法，可同时检测IL28B基因多态性的rs8099917和ITPA基因多态性的rs1127354。

<2>本发明的试剂盒

本发明的试剂盒是用于本发明的检测方法的试剂盒。该试剂盒特征在于，包含包括所述寡核苷酸的核酸探针，所述核酸探针是经荧光染料标记、杂交时荧光染料的荧光变化的核酸探针(例如淬灭探针)。另外，本发明的试剂盒也能用于判断或预测丙型肝炎病毒治疗药物的药效和对丙型肝炎病毒治疗药物的耐药性。

本发明的检测试剂盒除了探针之外还可包含进行本发明的检测方法中的核酸扩增所必要的试剂类，特别是用于进行使用DNA聚合酶的扩增的引物。

具体而言，本发明的引物是用于扩增包含IL28B基因的序列编号1所示的碱基序列中与P1或P1’的寡核苷酸杂交的序列的区域的引物，和/或是用于扩增包含ITPA基因的序列编号2所示的碱基序列中与P2或P2’、或者P3或P3’的寡核苷酸杂交的序列的区域的引物。

本发明的检测试剂盒中，探针、引物和其它试剂类可单独收纳，这些中的一部分作为混合物也是可以的。

下面，根据实施例来具体说明本发明。但是，这些实施例仅作示例用，并不被限于这些。

本发明中，如无特别指明，关于作为检测对象的试样中的试样核酸、多态性检测用探针或引物的各条序列，基于它们之间的相互关系记述的事项，只要不特别指出，也适用于各个序列和相对各序列而互补的序列。本发明的事项适用于相对各序列而互补的所述序列时，由该互补的序列识别的序列，在本领域技术人员的技术常识的范围内，视为将说明书全体替换为与对应的本说明书中记载的序列互补的序列。

实施例

实施例1(以IL28B的模板寡核苷酸作为检测对象，使用单一探针的情况)

基于包含IL28B基因多态性的rs8099917的位点的碱基序列(序列编号1)，设计了表1所示的在3’末端具有C的探针。表1中，探针的位置表示序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号。通过BODIPY FL的标记按照常规方法来进行。

另外，作为检测对象使用的模板寡核苷酸(突变型(序列编号1)和野生型(序列编号11))的序列在表1中示出。表1中，寡核苷酸的位置表示序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号。此外，杂合型的时候，序列编号10、11的模板寡核苷酸以1∶1混合用于试样。

表1

*大写的碱基示出了突变的位置。

模板寡核苷酸	序列(5′→3′)	位置	序列编号	mer
					突变型	tggttccaatttgggtgaCattgctcacagaaaggaa	319-283	10	37
野生型	tggttccaatttgggtgaAattgctcacagaaaggaa	319-283	11	37

*大写的碱基示出了突变的位置。

使用下述试剂，通过全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)、爱科来公司制)进行Tm分析，确认了荧光标记寡核苷酸(序列编号3)的性能。

Tm分析的条件为95℃处理1秒、40℃处理60秒，温度的上升速度为1℃/3秒，使温度从40℃上升到85℃，测定其间随时间的荧光强度变化。Tm分析中激发波长和检测波长分别为420～485nm和520～555nm(BODIPY FL)。

表2

应用表1的探针进行Tm分析的结果是，关于野生型寡核苷酸(方形)，在55℃附近看到BODIPY FL的峰，而关于突变型寡核苷酸(菱形)，则是在64℃附近看到BODIPY FL的峰(图2)。另外，关于野生型和突变型混合的杂合型寡核苷酸(三角形)，在55℃和64℃附近看到了BODIPY FL的峰(图2)。

如上文所述，因为针对野生型(T/T)、杂合型(T/G)、突变型(G/G)中的任何均看到了明确的、固有的峰，可知将其互相区分开了。

比较例1(以IL28B的模板寡核苷酸作为检测对象，使用单一探针的情况)

基于包含IL28B基因多态性的rs8099917的位点的碱基序列(序列编号1)，设计了表3所示的在3’末端具有C的探针。表3中，探针的位置示出了序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号。通过BODIPY FL的标记按照常规方法来进行。

另外，作为检测对象使用的模板寡核苷酸(突变型(序列编号3)和野生型(序列编号14))的序列在表3中示出。表3中，寡核苷酸的位置示出了序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号。此外，杂合型的时候，序列编号13、14的模板寡核苷酸以1∶1混合用于试样。

表3

*大写的碱基示出了突变的位置。

模板寡核苷酸	序列(5′→3′)	位置	序列编号	mer
					突变型	ttcctttctgtgagcaatGtcacccaaattggaacca	283-319	13	37
野生型	ttcctttctgtgagcaatTtcacccaaattggaacca	283-319	14	37

*大写的碱基示出了突变的位置。

使用下述试剂，通过全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)、爱科来公司制)进行Tm分析，确认了荧光标记寡核苷酸(序列编号12)的性能。

Tm分析的条件为95℃处理1秒、40℃处理60秒，温度的上升速度为1℃/3秒，使温度从40℃上升到85℃，测定其间随时间的荧光强度变化。Tm分析中激发波长和检测波长分别为420～485nm和520～555nm(BODIPY FL)。

表4

应用表3的探针进行Tm分析的结果是，关于野生型寡核苷酸(方形)，在56℃附近看到BODIPY FL的峰，而关于突变型寡核苷酸(菱形)，则是在55℃附近看到BODIPY FL的峰(图3)。故而可知，由于Tm值的Δ(即，Tm值之差)小，所以无法区分开。

另外，关于野生型和突变型混合的杂合型寡核苷酸(三角形)，仅在56℃附近看到了BODIPY FL的峰(图3)。故而可知，杂合型仅能得到一个检测峰，无法和野生型与突变型区分开。

因此，与实施例1的结果合并考虑，理解了：像序列编号3的探针那样、序列编号1所示的碱基序列中第307位的C被荧光标记是重要的，并非只要探针的3’末端的C被荧光标记就可以使用随便什么样的探针序列。

实施例2(以ITPA的模板寡核苷酸作为检测对象，使用单一探针的情况)

基于包含ITPA基因多态性的rs1127354的位点的碱基序列(序列编号2)，设计了表5所示的在3’末端具有C的探针。表5中，探针的位置表示序列编号2所示的碱基序列中的碱基编号。通过TAMRA的标记按照常规方法来进行。

另外，作为检测对象使用的模板寡核苷酸(突变型(序列编号15)和野生型(序列编号16))的序列在表5中示出。表5中，寡核苷酸的位置表示序列编号2所示的碱基序列中的碱基编号。此外，杂合型的时候，序列编号15、16的模板寡核苷酸以1∶1混合用于试样。

表5

*大写的碱基示出了突变的位置。

模板寡核苷酸	序列(5’→3’)	位置	序列编号	mer
					突变型	ggtcaattttctgtgccaccaaagtgcatgTaaacttatctcctagaatctgaacgacct	281-222	15	60
野生型	ggtcaattttctgtgccaccaaagtgcatgGaaacttatctcctagaatctgaacgacct	281-222	16	60

*大写的碱基示出了突变的位置。

使用下述试剂，通过全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)、爱科来公司制)进行Tm分析，确认了荧光标记寡核苷酸(序列编号5)的性能。

Tm分析的条件为95℃处理1秒、40℃处理60秒，温度的上升速度为1℃/3秒，使温度从40℃上升到85℃，测定其间随时间的荧光强度变化。Tm分析中激发波长和检测波长分别为520～555nm和585～700nm(TAMRA)。

表6

应用表5的探针进行Tm分析的结果是，关于野生型寡核苷酸(方形)，在64℃附近看到TAMRA的峰，而关于突变型寡核苷酸(菱形)，则是在56℃附近看到TAMRA的峰(图4)。由此可见区分了野生型和突变型。

另外，关于野生型和突变型混合的杂合型寡核苷酸(三角形)，在56℃和64℃附近看到了TAMRA的峰(图4)。由此，可见能够将杂合型与野生型和突变型区分开。

比较例2(以ITPA的模板寡核苷酸作为检测对象，使用单一探针的情况)

基于包含ITPA基因多态性的rs1127354的位点的碱基序列(序列编号2)，设计了表7所示的在3’末端具有C的探针。表7中，探针的位置表示序列编号2所示的碱基序列中的碱基编号。通过TAMRA的标记按照常规方法来进行。

另外，作为检测对象使用的模板寡核苷酸(野生型(序列编号18)和突变型(序列编号19))的序列在表7中示出。表7中，寡核苷酸的位置表示序列编号2所示的碱基序列中的碱基编号。此外，杂合型的时候，序列编号18、19的模板寡核苷酸以1∶1混合用于试样。

表7

名称

序列(5’→3’)位置

序列编号

mer

Gc含量(％)

Tm(mt)

Tm(WT)

ΔTm

3T-ITPA-94A-F1-TK

cagattctaggagataagtttCc-(TAMRA)230-252

17

23

39.1

40.4

49.6

9.2

*大写的碱基示出了突变的位置。

模板寡核苷酸	序列(5’→3’)	位置	序列编号	ner
					野生型(ITPA-RG)	tgGaaacttatctcctagaatctga	253-229	18	25
突变型(ITPA-RT)	tgTaaacttatctcctagaatctga	253-229	19	25

*大写的碱基示出了突变的位置。

使用下述试剂，通过全自动SNPs检查装置(商品名i-densy(商标)，爱科来公司制)进行Tm分析，确认了荧光标记寡核苷酸(序列编号17)的性能。

Tm分析的条件为95℃处理1秒、40℃处理60秒，温度的上升速度为1℃/3秒，使温度从40℃上升到75℃，测定其间荧光强度随时间的变化。Tm分析中激发波长和检测波长分别为520～555nm和585～700nm(TAMRA)。

表8

应用表7的探针进行Tm分析的结果是，关于野生型寡核苷酸(三角形)，在63℃附近看到TAMRA的峰，而关于突变型寡核苷酸(方形)，则是在59℃附近看到TAMRA的峰(图5)。

另外，关于野生型和突变型混合的杂合型寡核苷酸(菱形)，仅在64℃附近看到了TAMRA的峰(图5)。故而可知，杂合型仅能得到一个检测峰，无法和野生型与突变型区分开。

因此，与实施例2的结果合并考虑，理解了：像序列编号5的探针那样，序列编号2所示的碱基序列中第256位的C被荧光标记是重要的，并非只要探针的3’末端的C被荧光标记就可以使用随便什么样的探针序列。

实施例3(以精制人基因组或全血作为检测对象，使用多种探针的情况)

如下文所述，应用下述引物，通过PCR扩增精制人基因组或全血的多态性区域，应用序列编号3、4所示的探针进行Tm分析。

首先，基于包含IL28B基因多态性的rs8099917的位点的碱基序列(序列编号1)，设计表9所示的引物，以便能够扩增多态性的位点。表9中，引物的位置表示序列编号1所示的碱基序列中的碱基编号。

另外，基于包含ITPA基因多态性的rs1127354的位点的碱基序列(序列编号2)，设计表10所示的引物，以便能够扩增多态性的位点。表10中，引物的位置表示序列编号2所示的碱基序列中的碱基编号。

接下来，应用全自动SNPs检查装置(商品名i-densy IS-5310、爱科来公司制)，进行PCR和Tm分析。PCR反应溶液的组成如下所示。试样使用下述全血或精制人基因组。PCR和Tm分析的条件是95℃、60秒→(95℃、1秒→58℃、30秒)×50个循环→95℃、1秒→40℃、60秒→(40℃→85℃、1℃/3秒)。

Tm分析中激发波长和检测波长分别为420～485nm和520～555nm(BODIPY FL)，或者分别为520～555nm和585～700nm(TAMRA)。

表9

*大写的碱基示出了突变的位置。

表10

*大写的碱基示出了突变的位置。

表11

《使用精制人基因组为模板的情况》

※使用由全血精制的人基因组

表12

《使用全血作为模板的情况》

※使用经预处理的血

<精制DNA>

关于精制DNA，向PCR反应液中添加达到每1个测试100个拷贝，作为模板使用。

<全血的制备>

向70μl稀释液(1)中添加10μl全血，充分混合之后，将10μl该混合液添加至70μl稀释液(2)中。95℃对17μl该混合液进行10分钟的加热，得到4μl预处理完毕的全血。将此添加至PCR反应溶液中，将从所述预处理完毕的全血获得的DNA作为模板使用。

表13

稀释液(1)
		Tris-HCl(pH8.0)	10mM
EDTA(pH8.0)	0.1mM
		SDS	0.30％

通过BODIPY FL的荧光进行对IL28B基因的评价的结果是，关于精制人基因组(图6左图)和血液(图7左图)，野生型和突变型两者的峰均被看到，由此知道是杂合型(T/G)的多态性。

另外，通过TAMRA的荧光进行对ITPA基因的评价的结果是，关于精制人基因组(图6右图)和血液(图7右图)，仅看到野生型的峰，由此知道是野生型(C/C)。

根据图6、7的结果，使用序列编号3、4所示的探针时，关于IL28B基因多态性和ITPA基因多态性，确认到通过Tm分析而可能分析的荧光强度的变化。

即，关于IL28B基因多态性，作为杂合型的T/G的精制人基因组和全血具有两个峰(53℃和62℃)，存在固有的荧光强度的变化量的模式的变化。

另外，关于ITPA基因多态性，精制人基因组和全血仅具有一个峰(48℃)，也存在固有的荧光强度的变化量的模式的变化。

由此，通过同时使用序列编号3和4的探针，可同时检测IL28B基因多态性和ITPA基因多态性。

另外，序列编号5的探针和序列编号4的探针同样地，3’末端℃被荧光标记，实施例2中显示了其效果，因此，通过同时使用序列编号5的探针和序列编号3的探针，也能同时检测IL28B基因多态性和ITPA基因多态性。

产业可利用性

本发明的多态性的检测方法既可以用于医疗或诊断目的，又可以用于非医疗或非诊断目的。本发明可优选适用于医疗、诊断、研究等领域。

Claims (16)

1.一种多态性检测用探针，其是用于检测IL28B基因的多态性的探针，其特征在于包含下述P1或P1’的荧光标记寡核苷酸，

(P1)寡核苷酸，其具有包含序列编号1所示的碱基序列中的第301～307位的碱基的碱基长为7～28的碱基序列或与之同源的序列，且与第307位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；

(P1’)寡核苷酸，其具有在严格条件下与包含序列编号1所示的碱基序列中的第301～307位的碱基的碱基长为7～28的碱基序列的互补链杂交的序列，且与第307位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。

2.一种多态性检测用探针，其是用于检测TIPA基因的多态性的探针，其特征在于包含选自下述P2～P3’中的至少一种的荧光标记寡核苷酸，

(P2)寡核苷酸，其具有与包含序列编号2所示的碱基序列中的第239～251位的碱基的碱基长为13～28的碱基序列互补的序列或与之同源的序列，且与第239位的碱基互补的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；

(P2’)寡核苷酸，其具有在严格条件下与包含序列编号2所示的碱基序列中的第239～251位的碱基的碱基长为13～28的碱基序列杂交的序列，且与第239位的碱基互补的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；

(P3)寡核苷酸，其具有包含序列编号2所示的碱基序列中的第251～256位的碱基的碱基长为6～42的碱基序列或与之同源的序列，且与第256位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记；

(P3’)寡核苷酸，其具有在严格条件下与包含序列编号2所示的碱基序列中的第251～256位的碱基的碱基长为6～42的碱基序列的互补链杂交的序列，且与第256位的碱基对应的碱基为胞嘧啶并用荧光染料标记。

3.根据权利要求1或2所述的探针，其中，

P1和P1’的寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位的位置具有经荧光染料标记的与第307位碱基对应的碱基，

P2和P2’的寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位中的任何的位置具有经荧光染料标记的与第239位碱基互补的碱基，

P3和P3’的寡核苷酸在从3’末端起数第1位～第3位中的任何的位置具有经荧光染料标记的与第256位碱基对应的碱基。

4.根据权利要求1或2所述的探针，其中，

P1和P1’的寡核苷酸在3’末端具有经荧光染料标记的与第307位碱基对应的碱基，

P2和P2’的寡核苷酸在3’末端具有经荧光染料标记的与第239位碱基互补的碱基，

P3和P3’的寡核苷酸在3’末端具有经荧光染料标记的与第256位碱基对应的碱基。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述的探针，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交的时候发出荧光，并且与靶标序列杂交的时候荧光强度减少或增加。

6.根据权利要求5所述的探针，所述荧光标记寡核苷酸在未与靶标序列杂交的时候发出荧光，并且在与靶标序列杂交的时候荧光强度减少。

7.根据权利要求1～6中任意一项所述的探针，其中，

P1和P1’的寡核苷酸的碱基长为7～23，

P2和P2’的寡核苷酸的碱基长为13～23，

P3和P3’的寡核苷酸的碱基长为6～27。

8.根据权利要求1～6中任意一项所述的探针，其中，

P1和P1’的寡核苷酸的碱基长为7～18，

P2和P2’的寡核苷酸的碱基长为13～18，

P3和P3’的寡核苷酸的碱基长为6～22。

9.根据权利要求1～8中任意一项所述的探针，所述探针是用于熔解曲线分析的探针。

10.一种IL28B基因或ITPA基因中的多态性的检测方法，其特征在于使用权利要求1～9中任意一项所述的探针。

11.一种分别或在一个反应体系中同时检测IL28B基因和ITPA基因中的多态性的方法，其特征在于，包含下述步骤(I)～(IV)，

(I)步骤，向含有DNA的试样中，添加权利要求1～9中任意一项所述的探针，使所述探针与所述DNA杂交；

(II)步骤，使温度变化，使所述DNA与所述探针的杂交体形成体解离，测定基于杂交体形成体的解离的信号变动；

(III)步骤，分析所述信号变动以确定Tm值；以及

(IV)步骤，基于所述Tm值来确定目标多态性的有无或者具有多态性的碱基序列的丰度比。

12.根据权利要求11所述的方法，还包含在(I)步骤之前或与(I)步骤同时扩增DNA。

13.一种丙型肝炎病毒治疗药物的药效判定方法，其包括：根据权利要求10～12中任意一项所述的方法，分别或在一个反应体系中同时检测IL28B基因和ITPA基因中的多态性的步骤；以及基于多态性的有无来判定对药剂的耐药性或药剂的药效。

14.一种包含权利要求1～9中任意一项所述的探针的试剂盒，其是用于分别或在一个反应体系中同时检测IL28B基因和ITPA基因中的多态性的试剂盒。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其包含P1或P1’的寡核苷酸、以及P2或P2’的寡核苷酸或者P3或P3’的寡核苷酸。

16.根据权利要求14或15所述的试剂盒，还包含：用于扩增包含IL28B基因的序列编号1所示的碱基序列中与P1或P1’的寡核苷酸杂交的序列的区域的引物，和/或

用于扩增包含ITPA基因的序列编号2所示的碱基序列中与P2或P2’、或者P3或P3’的寡核苷酸杂交的序列的区域的引物。

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