CN112322722A - 检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用 - Google Patents

检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112322722A
CN112322722A CN202011268239.9A CN202011268239A CN112322722A CN 112322722 A CN112322722 A CN 112322722A CN 202011268239 A CN202011268239 A CN 202011268239A CN 112322722 A CN112322722 A CN 112322722A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
probe
seq
detecting
deletion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011268239.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112322722B (zh
Inventor
魏利然
蒋丽莎
林灵
王永攀
孔芬
丁飞飞
殷月鹏
王新军
楼敬伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Biotecan Biology Medicine Technology Co ltd
Shanghai Biotecan Medical Diagnostics Co ltd
Original Assignee
Shanghai Biotecan Medical Diagnostics Co ltd
Shanghai Zhangjiang Medical Innovation Research Institute
Shanghai Biotecan Biology Medicine Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Biotecan Medical Diagnostics Co ltd, Shanghai Zhangjiang Medical Innovation Research Institute, Shanghai Biotecan Biology Medicine Technology Co ltd filed Critical Shanghai Biotecan Medical Diagnostics Co ltd
Priority to CN202011268239.9A priority Critical patent/CN112322722B/zh
Publication of CN112322722A publication Critical patent/CN112322722A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112322722B publication Critical patent/CN112322722B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用，所述引物探针组合物检测染色体16p11.2上32.5～33.8M缺失突变；所述引物探针组合物包括SEQ ID NO:1～3、SEQ ID NO:4～6、SEQ ID NO:7～9、SEQ ID NO:10～12和SEQ ID NO:13～15。本发明针对染色体16p11.2上32.5～33.8M区域内近1.25Mb缺失突变，选择5个特定的缺失位点设计特异性引物和Taqman探针，实现了利用基于Taqman的特异、灵敏的多重qPCR直接检测16p11.2微缺失状态的效果。

Description

检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，涉及检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用。
背景技术
16p11.2微缺失综合征是一类先天性基因缺陷病，常用的分子诊断方法包括微阵列比较基因组杂交(Array comparative genomic hybridization，array CGH)、多重连接探针扩增分析(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)、荧光原位杂交分析(FISH)和定量聚合酶链连锁反应(qPCR)等。
目前临床上常用的array CGH，微阵列芯片属于寡核苷酸平台，检测结果准确性弱，还需要进一步检测才能确定DNA缺失的长度，且芯片检测法存在检测时间长的问题，检测周期大于5天，检测成本高。MLPA是一种定量聚合酶反应分析方法，能够检测出DNA重复序列的数目，然而该方法的检测周期也大于 5天，检测不同的缺失区间需要定制探针，检测成本高。FISH技术作为检测 16p11.2微缺失综合征的金标准，可以检测到DNA缺失，但是无法确定缺失片段的大小，检测成本高，不适合作为疾病筛查方法。qPCR是功能强大的基因检测方法，仅需针对特定目标区域设计探针引物即可检测出DNA重复序列的数目，检测周期短，成本低，适合于临床筛查16p11.2微缺失表征的患者。
CN109182493A公开了人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法，主要采用基于SYBR Green I染料法的qPCR反应体系，与质控对照组ΔCt进行比较，判断是否发生杂合缺失，该方法只能间接推断是否患有16p11.2 微缺失综合征，检测结果存在一定误差。
CN105624308A公开了一种检测染色体16p11.2微缺失的产品，通过检测染色体16p11.2上29.5～30.1Mb区域内的SNP位点的基因型，判断是否存在染色体微缺失，亦是属于间接检测法，不能直接检测染色体微缺失。
因此，有必要建立一种直接检测方法，用于16p11.2微缺失综合征的筛查和检测。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用，所述引物探针组合物为针对染色体16p11.2上特定缺失的1.25Mb区间设计的，基于Taqman探针法的qPCR反应体系实现了对目标区域的直接、准确、快速检测。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了检测16p11.2微缺失的引物探针组合物，所述引物探针组合物检测染色体16p11.2上32.5～33.8M区间的缺失突变；
所述引物探针组合物包括(a)～(e)：
(a)检测第一缺失区段F1R1的引物探针：
上游引物SEQ ID NO:1：GGGTCAGAGCATGTGCATAA；
下游引物SEQ ID NO:2：CACAGAGAATCAGGGAGAAAGG；
探针SEQ ID NO:3：CTGCATCAGGTTCTGGGCTCCA；
(b)检测第二缺失区段F2R2的引物探针：
上游引物SEQ ID NO:4：CTAATGTTGACCAGGGAGCTATG；
下游引物SEQ ID NO:5：AGATGAGGGCCTAGCAGATTA；
探针SEQ ID NO:6：TCTTGTGGCCAGCTTCAGAGAACC；
(c)检测第三缺失区段F3R3的引物探针：
上游引物SEQ ID NO:7：TGGGAGGAGAGTGTGGTAAA；
下游引物SEQ ID NO:8：GTGGATACACGCAGACAAAGA；
探针SEQ ID NO:9：AGCAGAGGTCTAAACTGGGTGTCTCT；
(d)检测第四缺失区段F4R4的引物探针：
上游引物SEQ ID NO:10：GTGGAGTCAGGAGCTTTGTT；
下游引物SEQ ID NO:11：GTCTTAGGCTTTGGCCTCTC；
探针SEQ ID NO:12：AGTGCTGGGCATAGTGAGAAGTCA；
(e)检测第五缺失区段F5R5的引物探针：
上游引物SEQ ID NO:13：GGGAGCAAGGCATCTTACA；
下游引物SEQ ID NO:14：CTTGTGCTGTCTTGCGATAAC；
探针SEQID NO:15：AGAACAGGAGCAACACAGAGAGCG。
本发明中，针对染色体16p11.2上32.5～33.8M缺失突变，对突变序列进行分析，平衡各序列之间的稳定性、反应条件、扩增效率，选择5个特定的缺失位点设计特异性引物和Taqman探针，五组引物探针与一对内参引物在两个反应体系中进行扩增，其中，针对F1R1、F2R2、F3R3区段和内参基因的引物探针组合物处于第一反应体系中，针对F4R4、F5R5区段和内参基因的引物探针组合物处于第二反应体系中，相同反应体系中的引物探针组合物扩增效率一致，且可以避免引物间的交叉影响，实现了利用基于Taqman的特异、灵敏的多重qPCR直接检测16p11.2微缺失状态的效果。
优选地，所述检测染色体16p11.2上32.5～33.8M缺失突变的探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有荧光淬灭基团。
为确保相同反应体系的扩增产物标记有不同的荧光基团，本发明的处于相同反应体系中的不同Taqman探针的5’荧光基团不同，例如可以是，在第一反应体系中，检测F1R1、F2R2、F3R3、内参基因的探针的5’端分别修饰有FAM、 VIC、TAMRA和ROX，在第二反应体系中，检测F4R4、F5R5、内参基因的探针的5’端分别修饰有FAM、VIC和ROX。
第二方面，本发明提供了一种检测16p11.2微缺失的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物探针组合物。
优选地，所述试剂盒还包括检测内参基因的引物探针。
优选地，所述内参基因包括EFTUD2。
优选地，所述EFTUD2的引物探针包括：
上游引物SEQ ID NO:16：GGTCTTGCCAGACACCAAAG；
下游引物SEQ ID NO:17：TGAGAGGACACACGCAAAAC；
探针SEQ ID NO:18：GGACATCCTTTGGCTTTTGA；
优选地，所述检测EFTUD2的探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有荧光淬灭基团。
优选地，所述检测染色体16p11.2上32.5～33.8M区域的缺失突变的探针的 5’荧光基团和所述检测EFTUD2的探针的5’荧光基团不同，例如，检测染色体 16p11.2上32.5～33.8M缺失突变的探针的5’修饰有FAM/VIC/TAMRA，检测 EFTUD2的探针的5’修饰有ROX。
本发明中，各引物探针分别加TE缓冲液稀释至100μM，每组探针与引物按照1:2:2(探针:上游引物:下游引物)的比例混合，加水稀释至50μL，使引物终浓度为10μM。
优选地，所述试剂盒还包括PCR缓冲液和/或去离子水。
优选地，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为染色体16p11.2上 32.5～33.8M未发生缺失突变的野生型核酸样本。
第三方面，本发明提供了一种16p11.2微缺失的检测方法，所述检测方法包括：
采用第一方面所述的引物探针组合物，或第二方面所述的试剂盒，对样本 DNA进行多重qPCR，根据染色体16p11.2上32.5～33.8M缺失突变的拷贝数进行结果判断。
优选地，所述样本包括外周血。
优选地，所述多重qPCR的反应条件为：93～96℃预变性8～10min；93～96℃变性5～20s，55～60℃退火40～60s，共进行40～50个循环；0～25℃保持。
优选地，所述缺失突变的拷贝数的计算公式为：
ΔCt值＝CT目标-CT内参
ΔΔCt＝ΔCt实验组-ΔCt阴性对照
缺失突变的拷贝数＝2×2-ΔΔCt。
第四方面，本发明提供了一种16p11.2微缺失的检测装置，所述检测装置包括：
多重PCR反应体系配制单元：用于将样本DNA或阴性对照、第一方面所述的引物探针组合物和PCR缓冲液混合，得到多重PCR反应体系；
PCR反应单元：用于进行多重qPCR反应，得到扩增产物；
结果判断单元：用于计算缺失突变的拷贝数，判断16p11.2微缺失状态。
优选地，所述样本包括外周血。
优选地，所述多重qPCR反应的条件为：93～96℃预变性8～10min；93～96℃变性5～20s，55～60℃退火40～60s，共进行40～50个循环；0～25℃保持。
优选地，所述缺失突变的拷贝数的计算公式为：
ΔCt值＝CT目标-CT内参
ΔΔCt＝ΔCt实验组-ΔCt阴性对照
缺失区域的拷贝数＝2×2-ΔΔCt。
第五方面，本发明提供了第一方面所述的引物探针组合物、第二方面所述的试剂盒或第四方面所述的检测装置在制备16p11.2微缺失检测试剂和/或构建 16p11.2微缺失检测设备中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明针对染色体16p11.2上32.5～33.8M缺失突变，对突变序列进行分析，平衡各序列之间的稳定性、反应条件、扩增效率，选择5个特定的缺失位点设计特异性引物和Taqman探针，五组引物探针与一对内参引物分别在两个反应体系中进行扩增，相同反应体系中的引物探针组合物扩增效率一致，且可以避免引物间的交叉影响，实现了利用基于Taqman的特异、灵敏的多重qPCR 直接检测16p11.2微缺失状态的效果；
(2)本发明通过计算ΔCt值＝CT目标-CT内参、ΔΔCt＝ΔCt实验组-ΔCt阴性对照、缺失突变的拷贝数＝2×2-ΔΔCt，实现了根据拷贝数直接检测是否存在16p11.2微缺失的效果，特异性强、灵敏度高、准确性好、结果判断方法简单，在16p11.2微缺失检测技术领域具有重要意义。
附图说明
图1A为chr16:32564736-33815554缺失示意图，图1B为全外显子测序chr16:32564736-33815554缺失结果；
图2为针对16p11.2上32.5～33.8M区域的缺失突变的引物探针设计示意图；
图3A为疾病样本中F1R1、F2R2、F3R3三段缺失区段检测结果及内参对照检测结果扩增曲线，图3B为健康对照组F1R1、F2R2、F3R3三段缺失区段检测结果及内参对照检测结果扩增曲线，图3C为F4R4、F5R5两段缺失区段检测结果及内参对照检测结果扩增曲线，图3D为健康对照组F4R4、F5R5两段缺失区段检测结果及内参对照检测结果扩增曲线；
图4为检测样本和健康对照组的缺失突变拷贝数水平；
图5A为chr16:32564736-33815554缺失的染色体示意图，图5B为基因芯片检测结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1临床样本的全外显子组测序
本实施例对1例临床表现为生长发育迟缓的幼儿进行了全外显子组测序 (wholeexome sequencing，WES)，结果如图1A和图1B所示，该幼儿存在 chr16:32564736～33815554畸变，该区段位于致病基因TP53TG3的下游功能域。
实施例2引物探针组合物的设计与制备
本实施例采用基于Taqman的多重qPCR对上述WES检测 chr16:32564736～33815554区段的缺失结果进行验证。
对chr16:32564736～33815554缺失区段进行分析，平衡各检测位点序列之间的稳定性、反应条件、扩增效率，根据图2选择5个特定的缺失区段设计以下特异性引物和探针：
(a)检测第一缺失区段F1R1的引物探针：
上游引物SEQ ID NO:1：GGGTCAGAGCATGTGCATAA；
下游引物SEQ ID NO:2：CACAGAGAATCAGGGAGAAAGG；
探针SEQ ID NO:3：5’FAM-CTGCATCAGGTTCTGGGCTCCA-3’BHQ1；
(b)检测第二缺失区段F2R2的引物探针：
上游引物SEQ ID NO:4：CTAATGTTGACCAGGGAGCTATG；
下游引物SEQ ID NO:5：AGATGAGGGCCTAGCAGATTA；
探针SEQ ID NO:6：5’VIC-TCTTGTGGCCAGCTTCAGAGAACC-3’BHQ1；
(c)检测第三缺失区段F3R3的引物探针：
上游引物SEQ ID NO:7：TGGGAGGAGAGTGTGGTAAA；
下游引物SEQ ID NO:8：GTGGATACACGCAGACAAAGA；
探针SEQ ID NO:9：
5’TAMRA-AGCAGAGGTCTAAACTGGGTGTCTCT-3’BHQ1；
(d)检测第四缺失区段F4R4的引物探针：
上游引物SEQ ID NO:10：GTGGAGTCAGGAGCTTTGTT；
下游引物SEQ ID NO:11：GTCTTAGGCTTTGGCCTCTC；
探针SEQ ID NO:12：
5’FAM-AGTGCTGGGCATAGTGAGAAGTCA-3’BHQ1；
(e)检测第五缺失区段F5R5的引物探针：
上游引物SEQ ID NO:13：GGGAGCAAGGCATCTTACA；
下游引物SEQ ID NO:14：CTTGTGCTGTCTTGCGATAAC；
探针SEQID NO:15：
5’VIC-AGAACAGGAGCAACACAGAGAGCG-3’BHQ1；
本实施例进一步选取具有稳定拷贝数的EFTUD2作为内参，设计对应的上下游引物及探针SEQ ID NO:16～18：
上游引物SEQ ID NO:16：GGTCTTGCCAGACACCAAAG；
下游引物SEQ ID NO:17：TGAGAGGACACACGCAAAAC；
探针SEQ ID NO:18：5’ROX-GGACATCCTTTGGCTTTTGA-3’BHQ1。
以上各引物探针由合成公司合成后，分别加TE缓冲液稀释至100μM，每组探针与引物按照1:2:2(探针:上游引物:下游引物)的比例混合，加水稀释至 50μL，使引物终浓度为10μM，将不同组引物探针等体积混合配制引物探针组合物。
实施例3基于Taqman的多重qPCR检测
(1)样本DNA制备
对待测样本进行EDTA抗凝血处理，随后采用天根血液抽提试剂盒提取血液样本基因组DNA，同时从5例健康人血液样本中抽提核酸，作为对照；
用Nanodrop 2000对提取的DNA进行浓度和纯度测定，纯度OD260/280 在1.7～2.1之间，将提取的DNA用TE缓冲液稀释至5ng/μL备用；
(2)qPCR反应
从-20℃冰箱拿出PCR预混液置于室温，完全溶解后颠倒混匀，瞬时离心，参照表1配制qPCR反应体系：
表1
组份 体积
2×GoldStar Master Mix 10μL
DEPC H<sub>2</sub>O 6μL
引物探针组合物pool1/pool2 1μL
模板gDNA(5ng/μL) 3μL
总计 20μL
对实施例1的chr16:32564736～33815554区段缺失的样本和5例健康对照样本采用引物探针组合物(SEQ ID NO:1～15)和内参EFTUD2的引物探针(SEQ ID NO:16～18)进行多重qPCR检测，每个扩增设置3个重复；
扩增反应程序如表2所示。
表2
Figure BDA0002776777370000101
对第一缺失区段F1R1、第二缺失区段F2R2、第三缺失区段F3R3和内参 EFTUD2的扩增曲线如图3A和图3B所示，对第四缺失区段F4R4、第五缺失区段F5R5和内参EFTUD2的扩增曲线如图3C和图3D所示。
根据公式ΔCt值＝CT目标-CT内参、ΔΔCt＝ΔCt实验组-ΔCt健康组、缺失突变的拷贝数＝2×2-ΔΔCt计算得到检测样本的均值拷贝数为1.4，低于健康组均值拷贝数水平，如图4所示，提示chr16:32564736～33815554区间范围存在片段缺失。
检测结果经FDA/CFDA认证的CytoScan 750K基因芯片平台进一步验证，结果如图5A和图5B所示。
综上所述，本发明针对染色体16p11.2上特定缺失的1.25Mb区间设计特异性引物探针，基于Taqman探针法的qPCR反应体系实现了对目标区域的直接、准确、快速检测，在16p11.2微缺失检测技术领域具有重要的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海宝藤生物医药科技股份有限公司；上海宝藤医学检验所有限公司；上海张江医学创新研究院
<120> 检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用
<130> 20201112
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggtcagagc atgtgcataa 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cacagagaat cagggagaaa gg 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctgcatcagg ttctgggctc ca 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctaatgttga ccagggagct atg 23
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agatgagggc ctagcagatt a 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tcttgtggcc agcttcagag aacc 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgggaggaga gtgtggtaaa 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gtggatacac gcagacaaag a 21
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
agcagaggtc taaactgggt gtctct 26
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtggagtcag gagctttgtt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gtcttaggct ttggcctctc 20
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agtgctgggc atagtgagaa gtca 24
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gggagcaagg catcttaca 19
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cttgtgctgt cttgcgataa c 21
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
agaacaggag caacacagag agcg 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggtcttgcca gacaccaaag 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tgagaggaca cacgcaaaac 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ggacatcctt tggcttttga 20

Claims (10)

1.检测16p11.2微缺失的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物检测染色体16p11.2上32.5～33.8M区域的缺失突变；
所述引物探针组合物包括(a)～(e)：
(a)检测第一缺失区段F1R1的引物探针：
上游引物SEQ ID NO:1：GGGTCAGAGCATGTGCATAA；
下游引物SEQ ID NO:2：CACAGAGAATCAGGGAGAAAGG；
探针SEQ ID NO:3：CTGCATCAGGTTCTGGGCTCCA；
(b)检测第二缺失区段F2R2的引物探针：
上游引物SEQ ID NO:4：CTAATGTTGACCAGGGAGCTATG；
下游引物SEQ ID NO:5：AGATGAGGGCCTAGCAGATTA；
探针SEQ ID NO:6：TCTTGTGGCCAGCTTCAGAGAACC；
(c)检测第三缺失区段F3R3的引物探针：
上游引物SEQ ID NO:7：TGGGAGGAGAGTGTGGTAAA；
下游引物SEQ ID NO:8：GTGGATACACGCAGACAAAGA；
探针SEQ ID NO:9：AGCAGAGGTCTAAACTGGGTGTCTCT；
(d)检测第四缺失区段F4R4的引物探针：
上游引物SEQ ID NO:10：GTGGAGTCAGGAGCTTTGTT；
下游引物SEQ ID NO:11：GTCTTAGGCTTTGGCCTCTC；
探针SEQ ID NO:12：AGTGCTGGGCATAGTGAGAAGTCA；
(e)检测第五缺失区段F5R5的引物探针：
上游引物SEQ ID NO:13：GGGAGCAAGGCATCTTACA；
下游引物SEQ ID NO:14：CTTGTGCTGTCTTGCGATAAC；
探针SEQ ID NO:15：AGAACAGGAGCAACACAGAGAGCG。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述检测染色体16p11.2上32.5～33.8M区域的缺失突变的探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有荧光淬灭基团。
3.一种检测16p11.2微缺失的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组合物；
优选地，所述试剂盒还包括检测内参基因的引物探针，优选为检测EFTUD2的引物探针；
优选地，所述EFTUD2的引物探针包括：
上游引物SEQ ID NO:16：GGTCTTGCCAGACACCAAAG；
下游引物SEQ ID NO:17：TGAGAGGACACACGCAAAAC；
探针SEQ ID NO:18：GGACATCCTTTGGCTTTTGA；
优选地，所述检测EFTUD2的探针的5’端修饰有荧光基团，3’端修饰有荧光淬灭基团；
优选地，所述检测染色体16p11.2上32.5～33.8M区域的缺失突变的探针的5’荧光基团和所述检测EFTUD2的探针的5’荧光基团不同。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液和/或去离子水；
优选地，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为染色体16p11.2上32.5～33.8M未发生缺失突变的野生型基因。
5.一种16p11.2微缺失的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
采用权利要求1或2所述的引物探针组合物，或权利要求3或4所述的试剂盒，对样本DNA进行多重qPCR，根据染色体16p11.2上32.5～33.8M缺失突变的拷贝数进行结果判断。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述样本包括石蜡包埋病理切片组织、外泌体或外周血中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述多重qPCR的反应条件为：93～96℃预变性8～10min；93～96℃变性5～20s，55～60℃退火40～60s，共进行40～50个循环；0～25℃保持。
7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，所述缺失突变的拷贝数的计算公式为：
ΔCt值＝CT目标-CT内参
ΔΔCt＝ΔCt实验组-ΔCt阴性对照
缺失突变的拷贝数＝2×2-ΔΔCt。
8.一种16p11.2微缺失的检测装置，其特征在于，所述检测装置包括：
多重PCR反应体系配制单元：用于将样本DNA或阴性对照、权利要求1或2所述的引物探针组合物和PCR缓冲液混合，得到多重PCR反应体系；
PCR反应单元：用于进行多重qPCR反应，得到扩增产物；
结果判断单元：用于计算缺失突变的拷贝数，判断16p11.2微缺失状态。
9.根据权利要求8所述的检测装置，其特征在于，所述样本包括外周血；
优选地，所述多重qPCR反应的条件为：93～96℃预变性8～10min；93～96℃变性5～20s，55～60℃退火40～60s，共进行40～50个循环；0～25℃保持；
优选地，所述缺失突变的拷贝数的计算公式为：
ΔCt值＝CT目标-CT内参
ΔΔCt＝ΔCt实验组-ΔCt阴性对照
缺失区域的拷贝数＝2×2-ΔΔCt。
10.权利要求1或2所述的引物探针组合物、权利要求3或4所述的试剂盒或权利要求8或9所述的检测装置在制备16p11.2微缺失检测试剂和/或构建16p11.2微缺失检测设备中的应用。
CN202011268239.9A 2020-11-13 2020-11-13 检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用 Active CN112322722B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011268239.9A CN112322722B (zh) 2020-11-13 2020-11-13 检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011268239.9A CN112322722B (zh) 2020-11-13 2020-11-13 检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112322722A true CN112322722A (zh) 2021-02-05
CN112322722B CN112322722B (zh) 2021-11-12

Family

ID=74318075

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011268239.9A Active CN112322722B (zh) 2020-11-13 2020-11-13 检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112322722B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116732158A (zh) * 2022-04-15 2023-09-12 常州市妇幼保健院 22q11微缺失和/或微重复检测引物组、引物探针组合物、试剂盒及其应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101124484A (zh) * 2002-10-02 2008-02-13 催化剂生物科学有限公司 制备与筛选改变特异性蛋白酶的方法
CN105624308A (zh) * 2016-02-23 2016-06-01 吴南 一种检测染色体16p11.2微缺失的产品
CN106282349A (zh) * 2016-08-18 2017-01-04 陈晓丽 一种x染色体高密度探针定制的全基因组拷贝数检测芯片
US20170037475A1 (en) * 2014-04-09 2017-02-09 Lineagen, Inc. Genetic markers associated with asd and other childhood developmental delay disorders
CN108485940A (zh) * 2012-04-12 2018-09-04 维里纳塔健康公司 拷贝数变异的检测和分类
CN109182493A (zh) * 2018-09-12 2019-01-11 湖北省妇幼保健院（湖北省妇女儿童医院） 人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法
CN109642212A (zh) * 2016-06-16 2019-04-16 西达-赛奈医疗中心 将血液重编程成诱导多能干细胞的新型且有效的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101124484A (zh) * 2002-10-02 2008-02-13 催化剂生物科学有限公司 制备与筛选改变特异性蛋白酶的方法
CN108485940A (zh) * 2012-04-12 2018-09-04 维里纳塔健康公司 拷贝数变异的检测和分类
US20170037475A1 (en) * 2014-04-09 2017-02-09 Lineagen, Inc. Genetic markers associated with asd and other childhood developmental delay disorders
CN105624308A (zh) * 2016-02-23 2016-06-01 吴南 一种检测染色体16p11.2微缺失的产品
CN109642212A (zh) * 2016-06-16 2019-04-16 西达-赛奈医疗中心 将血液重编程成诱导多能干细胞的新型且有效的方法
CN106282349A (zh) * 2016-08-18 2017-01-04 陈晓丽 一种x染色体高密度探针定制的全基因组拷贝数检测芯片
CN109182493A (zh) * 2018-09-12 2019-01-11 湖北省妇幼保健院（湖北省妇女儿童医院） 人16p11.2微缺失综合征检测的引物和试剂盒及其检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LAUREN A. WEISS ET AL.: "Association between Microdeletion and Microduplication at 16p11.2 and Autism", 《THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE》 *
MARY KUSENDA ET AL.: "The Influence of Microdeletions and Microduplications of 16p11.2 on Global Transcription Profiles", 《J CHILD NEUROL》 *
SHANE MCCARTHY ET AL.: "Microduplications of 16p11.2 are Associated with Schizophrenia", 《NAT GENET》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116732158A (zh) * 2022-04-15 2023-09-12 常州市妇幼保健院 22q11微缺失和/或微重复检测引物组、引物探针组合物、试剂盒及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112322722B (zh) 2021-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190136330A1 (en) Method for screening cancer
WO2021073029A1 (zh) 一种膀胱癌驱动基因点突变和甲基化联合辅助诊断方法、试剂盒、系统及应用
JP2013090622A (ja) 多型検出用プローブ、多型検出方法、薬効判定方法及び多型検出用キット
WO2017112738A1 (en) Methods for measuring microsatellite instability
WO2021180105A1 (zh) 一种检测常见两性癌症的探针组合物
KR101784714B1 (ko) 재발 난소암 진단 또는 난소암 재발 예측용 mirna 마커 및 그 용도
CN113621704B (zh) 肝癌的检测和诊断的试剂及试剂盒
EP2821503B1 (en) Method for detecting hla-a*31:01 allele
CN110564861A (zh) 人类Y染色体STR基因座和InDel位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CN112322722B (zh) 检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用
JP5258760B2 (ja) メチル化核酸又は非メチル化核酸を増幅する方法
CN110295218B (zh) 量化靶基因的突变型等位基因负担的方法
CN116970722A (zh) 同时鉴定幽门螺杆菌感染和检测耐药基因突变位点的方法、引物探针组合物、应用和试剂盒
KR101646189B1 (ko) 내인성 아토피 피부염 진단용 마커 및 그의 용도
CN110819709A (zh) 用于荧光定量pcr检测cyp2c9和vkorc1基因多态性的方法
CN114277110B (zh) 检测fgf19基因拷贝数和/或扩增的试剂盒及检测方法、用途
CN116004775A (zh) 一种人运动神经元拷贝数定量的引物探针组合物、试剂盒及方法
CN111172248B (zh) 一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒
CN106868130B (zh) 用于结肠直肠癌中使用的生物标志物
KR20170049768A (ko) 피부 색상 및 흑화 민감도 진단용 단일염기다형성 마커 및 이의 용도
CN116356027B (zh) 一种用于食管鳞癌或癌前病变检测的试剂、试剂盒及应用
CN107400722A (zh) 一种检测人基因组的竞争性实时荧光pcr snp探针
CN115927607B (zh) 生物标志物在胃癌诊断中的应用
CN112831558B (zh) 克罗恩病易感基因的早筛方法及试剂盒
JP5860667B2 (ja) Ｅｇｆｒエクソン２１ｌ８５８ｒ遺伝子多型検出用プライマーセット及びその用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230406

Address after: 201203 5th Floor, No. 3 Building, 180 Lane, Zhangheng Road, China (Shanghai) Free Trade Pilot Area, Pudong New Area, Shanghai

Patentee after: SHANGHAI BIOTECAN BIOLOGY MEDICINE TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Patentee after: SHANGHAI BIOTECAN MEDICAL DIAGNOSTICS Co.,Ltd.

Address before: 201203 5th Floor, No. 3 Building, 180 Lane, Zhangheng Road, China (Shanghai) Free Trade Pilot Area, Pudong New Area, Shanghai

Patentee before: SHANGHAI BIOTECAN BIOLOGY MEDICINE TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Patentee before: SHANGHAI BIOTECAN MEDICAL DIAGNOSTICS Co.,Ltd.

Patentee before: Shanghai Zhangjiang Medical Innovation Research Institute