CN101124484A - 制备与筛选改变特异性蛋白酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了制备改变对应其剪切目标分子特异性蛋白酶的方法。本发明还公开了使用上述蛋白酶治疗涉及靶蛋白的疾病。使用蛋白酶在特定的底物序列剪切特定靶蛋白是一种治疗上述病症的方法。

Description

制备与筛选改变特异性蛋白酶的方法
发明背景
酶可以应用于广泛的领域。一组重要的酶族是断裂蛋白的蛋白酶。许多蛋白酶在特定的底物序列上特异性地断裂靶蛋白。由蛋白酶特异性断裂的趋势被称为底物特异性，或者底物序列特异性。与多族溶解蛋白酶不同成员有关的底物特异性部分归因于结合区域内不同组的氨基酸，每个酶族都利用这种结合区域内的氨基酸识别底物，并起到催化作用。针对一些蛋白酶，已经成功地研究出设计变异酶的合理方案。从结合裂隙保留的结晶数据获知，枯草杆菌蛋白酶的保守氨基酸残基(甘氨酸166)可以改变成多种不同氨基酸残基中的一种氨基酸残基。所得的酶衍生物表现出底物特异性的明显变化，并伴随着疏水性与氨基酸大小的增长(Wells等人，Cold Spring Harb，《症状定量生物学》第1987年第52期第647-652页)。人们还合理地改变了另一种细菌编码的丝氨酸肽链内切酶、α-溶解蛋白酶，将其192甲硫氨酸改变为丙氨酸。在其活性位点内获得的变异表现出增加了酶活性位点的结构柔性。对于更大型、疏水性更强的靶，所得的α-溶解蛋白酶衍生物具有了更广泛的底物特异性(Bone等人，《生物化学》1991年第43期第10388-10398页)。
丝氨酸蛋白酶是广泛研究的与以其所谓催化三合体：天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸为特征的肽链内切酶相关的族。在相似蛋白的族中，保留第一、第二和第三结构的区域趋向于含有涉及活性位点的残基，以及对活性很重要的其它残基。例如，尽管催化三合体的成员远离丝氨酸蛋白酶的第一结构(氨基酸结构)，但是，这些残基对准了这些蛋白第三结构(或者折叠)形成的结合区域。
丝氨酸蛋白酶在底物序列识别特性方面差别很大：一些丝氨酸蛋白酶具有强特异性(即，涉及血液凝固和免疫补体系统的蛋白酶)；一些丝氨酸蛋白酶只具有部分的特异性(即，哺乳动物消化蛋白酶，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)；并且其它类型的丝氨酸蛋白酶，象枯草杆菌蛋白酶，一种细菌蛋白酶，完全不具备特异性。尽管存在特异性差异，丝氨酸蛋白酶的催化机理还是非常保守的，由底物序列结合位点构成，此结合位点准确定位于活性位点中带有五个氢键的易切断肽。一旦与这种易切断肽结合，催化三合体的三个恒定残基之间的氢键网络就催化产生了此肽键的水解。尽管催化机理高度保守，但是这种大族蛋白酶在序列特异性方面可以具有广泛的差异。
发明概述
本发明涉及制备并筛选断裂公知涉及疾病蛋白的蛋白酶。所得的蛋白可以作为生命体内的治疗剂。
本发明广泛涉及改变底物序列特异性的蛋白酶修饰，以致修饰蛋白酶断裂了涉及或者造成病症的靶蛋白。在本发明一具体实施方式中，修饰的蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在本发明另一具体实施方式中，修饰的蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶。
本发明一具体实施涉及制备蛋白酶序列库，用于筛选在所需底物序列处断裂所需靶蛋白的蛋白酶。在此具体实施方式的一个方面，序列库的每个成员是带有针对其自身产生多种变异的蛋白酶支架。蛋白酶支架具有与公知蛋白酶相同或者相似的序列。在一具体实施方式中，这样的支架是丝氨酸蛋白酶。在另一具体实施方式中，这样的支架是半胱氨酸蛋白酶。使用所需靶蛋白的所需底物序列，测定序列库每个成员的断裂活性。结果是，可以测定出相对于所需的底物序列具有最高断裂活性的蛋白酶。
在此具体实施方式的另一方面，对于蛋白酶支架产生的变异数量可以是1、2-5(例如2、3、4或者5)，5-10(例如5、6、7、8、9或者10)，或者10-20(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或者20)。
在此具体实施方式的另一方面，公知的蛋白酶支架可以含有下述任一种微粒的氨基酸序列：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、凝血因子、纤维蛋白溶酶、凝血因子Xa、尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂(uPA)、组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)、膜型丝氨酸蛋白酶-1(MTSP-1)、粒酶B、粒酶M、弹性蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性白细胞弹性蛋白酶、血浆激肽释放酶、尿激素型纤溶酶原激活剂、补体因子丝氨酸蛋白酶、ADAMTS13、神经肽链内切酶/neprilysin、弗林蛋白酶、或者克鲁蛋白酶。
在此具体实施方式的另一方面，靶蛋白是与病症有关的，例如，靶蛋白导致了病症。病症可以是，例如类风湿性关节炎、败血症、癌症、艾滋病、呼吸道感染、流行性感冒、心血管疾病、或哮喘。
在此具体实施方式的另一方面，与序列库平均活性相比，测定的蛋白酶活性增长了至少10倍、100倍、或者1000倍。
本发明另一具体实施方式涉及生成了用于筛选修饰蛋白酶的底物序列库，从而测定出哪种底物序列(组)是修饰蛋白酶最有效断裂的底物序列(组)。序列库成员是由随机氨基酸序列构成的，并且测定蛋白酶对于序列库每个成员的断裂活性。测定出蛋白酶最有效断裂的底物序列。
此具体实施方式的另一个方面，底物序列是靶蛋白的一部分。此靶蛋白可以涉及病症。例如，靶蛋白是造成病症的一种蛋白。此具体实施方式的另一个方面，病症可以是类风湿性关节炎、败血症、癌症、艾滋病、呼吸道感染、流行性感冒、心血管疾病、或哮喘。
此具体实施方式的另一个方面，与序列库平均活性相比、测定底物序列的断裂效率增长了至少10倍、至少100倍、或者至少1000倍。
在另一具体实施方式中，本发明包括治疗带有病症的患者。这种方法涉及将断裂与病症有关靶蛋白的蛋白酶给药患者，以致断裂靶蛋白治疗病症。
此具体实施方式的一个方面，病症可以是类风湿性关节炎、败血症、癌症、艾滋病、呼吸道感染、流行性感冒、心血管疾病、或哮喘。此具体实施方式的另一个方面，这样的蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶。在本发明的另一具体实施方式，这样的修饰蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶。在此具体实施方式的另一方面，靶蛋白造成了病症。
带有病症的患者，例如由本发明方法治疗的患者，可以是哺乳动物，或者更具体的是一个人类。
在此具体实施方式的另一方面，靶蛋白可以是肿瘤坏死因子受体、白介素-1、白介素-1受体、白介素-2、白介素-2受体、白介素-4、白介素-4受体、白介素-5、白介素-5受体、白介素-12、白介素-12受体、白介素-13、白介素-13受体、血小板选择蛋白、血小板选择蛋白糖蛋白配基、P物质、缓激肽、PSGL、凝血因子IX、免疫球蛋白E、免疫球蛋白E受体、CCR5、CXCR4、糖蛋白120、糖蛋白41、CD4、血凝素、呼吸合胞体病毒融合蛋白、B7、CD28、CD2、CD3、CD4、CD40、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子受体、内皮生长因子、内皮生长因子受体、转化生长因子、转化生长因子受体、Her2、CCR1、CXCR3、CCR2、Src、Akt、B细胞受体-Ab1、胰高血糖素合酶激酶-3、细胞周期蛋白依赖性激酶-2(cdk-2)或者细胞周期蛋白依赖性激酶-4(cdk-4)。
除非另做规定，本文中所用的全部技术与科学名词具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与文中所述相似或者等效的方法与材料能够用于实施或者测试本发明，但是适合的方法与材料将在下文中描述。文中所提及的全部出版物、专利申请、专利，以及其它参考文献通过在此引述其全部内容合并于本文。如果出现冲突，以包括定义的本发明为准。此外，材料、方法、与实施例仅仅是说明性的，不用于限定本发明的保护范围。
通过下文的详细描述与权利要求，本发明的其它特征与优点将会显而易见。
附图的详细描述
图1是半胱天冬酶-3的氨基酸序列示意图，以及包括半胱天冬酶3氨基酸序列(序列编号NO：1)的表。
图2是X光晶体照相图，集中展示了由I99A/N218A粒酶B断裂半胱天冬酶3惰性序列的结构；以及展示了半胱天冬酶3惰性序列位点氨基酸序列(序列编号NO：2)的图形。
图3A展示了一组条形图，展示了野生型粒酶B的底物特异性对应于I99A/N219A粒酶B在P2、P3和P4的底物特异性。图3B展示了包括从图3A图形获得动力学数据的表。
图4展示了一组MALDI质谱分析一种肽的图形，在野生型和I99A/N219A粒酶B存在下此肽对应于半胱天冬酶3的惰性序列。
图5描绘了由野生型和I99A/N219A粒酶B断裂半胱天冬酶3小亚基所得产物的SDS PAGE凝胶显示带。
图6A展示了，在野生型粒酶B和I99A/N219A粒酶B存在下随时间标绘的图形。图6B展示了，在野生型粒酶B和I99A/N219A粒酶B存在下半胱天冬酶3活性的Vmax。
图7A展示了，如同在I99A/N218A粒酶B存在下测定半胱天冬酶3活性，标绘了在细胞溶胞产物中编程性细胞死亡的条形图。图7B展示了，如同在野生型粒酶B和I99A/N218A粒酶B浓度增加条件下测定半胱天冬酶3活性，标绘了在细胞溶胞产物中编程性细胞死亡的条形图。
发明详述
在详细阐述本发明以前，先定义文中所用的某些名词。
名词“等位基因变异体”指的是占据相同染色体基因座的任何两种或者多种基因替换形式。等位基因变异体通过变异自然产生，从而在种群中产生表型多态性。基因变异可以是沉默的(在编码的多肽中没有改变)，或者可以编码带有改变氨基酸序列的多肽。本文中名词“等位基因变异体”也可以用于表示由基因的等位基因变异体编码的蛋白。
名词“多核苷酸分子的补体”表示，与参考序列相比具有补充碱基序列并反方向排列的多核苷酸分子。例如，序列5’ATGCACGGG3’与序列5’CCCGTGCAT3’是互补的。
名词“简并核苷酸序列”表示了包括一个或者多个简并密码子的核苷酸序列(与编码多肽的参考多核苷酸分子相比)。简并密码子含有核苷酸的不同三联体，但是都编码相同的氨基酸残基(即，GAU和GAC三联体都编码了Asp)。
“DNA结构”是单链或者双链、直线型或者环型的DNA分子，其中含有以本质不可知方式结合并且并列的DNA片段。DNA结构是以人类操作的结果存在的，并且包括操作分子的克隆和其它拷贝。
“DNA片段”是具有特定属性的大型DNA分子的一部分。例如，编码特定多肽的DNA片段是更长DNA分子的一部分，例如质粒或者质粒片段，当5’向3’方向读取时，此DNA片段编码了特定多肽的氨基酸序列。
名词“表达载体”表示一种DNA结构，其中包括编码了与附加片段可操作连接的重要多肽的片段，此附加片段可以使重要多肽在宿主细胞内实现转录。这种附加片段可以包括启动子和终止子序列，还可以任意包括一个或者多个复制起点、一个或者多个可选择的标记、加A信号等。通常，表达标记来源于质粒或者病毒DNA，或者可以包括来自两种来源的元件。
名词“离析”，当应用于多核苷酸分子时，表示已经从天然的遗传环境取出的多核苷酸，因此不含有其它外部的不需要的编码序列，并且以遗传工程蛋白生成系统内适合应用的形式存在。这样的离析分子是从天然环境中分离出来的分子，包括cDNA和基因克隆，以及合成的多核苷酸。本发明的离析DNA分子可以包括天然的5’和3’未翻译的区域，例如启动子和终止子。相关区域的识别对于本领域普通技术人员显而易见(参加例如，Dynan和Tijan，《自然》1985年第316期第774-778页)。当施用于蛋白时，名词“离析”表明了除了天然环境以外条件下出现的蛋白，例如从血液和动物组织中分离的蛋白。在优选形式下，离析蛋白基本不含有其它蛋白，特别是动物源的其它蛋白。优选的是，提供高纯度形式的蛋白，即至少90％纯度，优选的是大于95％纯度，更优选的是大于99％纯度。
当涉及DNA片段时，名词“可操作地连接”表示，片段经过排列共同起到了预定用途的作用，例如转录由启动子引发通过编码部分进行到终止子。
名词“同源”表示从一个物种获得的多肽或者蛋白，这样的多肽或者蛋白是来自不同物种多肽或者蛋白的功能相似物。同源之间的序列差异是物种形成的结果。
名词“多核苷酸”表示从5’到3’末端读取的脱氧核糖核酸或者核糖核苷酸的单链或者双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以从天然来源离析获得，从生命体外合成获得，或者由天然和合成的分子组合制备而成。本文中根据核苷酸(缩写“nt”)或者碱基对(缩写“bp”)的数量给出了多核苷酸分子的长度。当上下文一致时，名词“核苷酸”可作为单链或者双链分子。当此名词施用于双链分子时，可以用于表明整个长度；可以理解与名词“碱基对”等价。本领域技术人员可以认定，双链多核苷酸的两条链在长度上略有差别，作为酶断裂的结果两条链末段交错排列；因此，双链多核苷酸分子内的所有核苷酸并非全部成对。通常，这种不成对的末端长度不超过20nt。
名词“启动子”表明了含有DNA序列、结合RNA聚合酶并启动转录的基因部分。启动子序列通常但不总出现在5’基因的非编码区域。
名词“蛋白酶”是一种断裂蛋白肽键的酶。“蛋白酶前体”是这种酶的相对惰性形式，通常基于另一种蛋白酶的断裂获得活化。
名词“分泌信号序列”表示作为更大型多肽的一部分、编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，并且引导更大型多肽通过其合成细胞的分泌通道。通常，在通过分泌通道的输送过程中更大型多肽发生断裂脱掉了分泌肽。
名词“底物序列”表示由蛋白酶特异性靶向断裂的序列。
名词“靶蛋白”表示由蛋白酶特异性断裂其底物序列的蛋白。
名词“S1-S4”指的是构成底物序列结合袋的蛋白酶残基。它们从识别位点N末端到蛋白酶解位点的裂开键顺序编号。
名词“P1-P4”和“P1’-P4’”指的是与上述S1-S4残基特异性相互作用的断裂肽。P1-P4通常含有底物序列。P1-P4位于断裂位点N-末端侧的位置，而P1’-P4’位于断裂位点N-末端侧的位置(参见图2)。
名词“支架”指的是产生各种变异的现有蛋白酶。通常，这些变异改变了支架的特异性与活性。
“离析的”或者“提纯的”多肽或者蛋白或者其生物活性部分基本不含有来自获得蛋白酶蛋白的细胞或者组织源的细胞材料或者污染蛋白，当化学合成时基本不含有化学前体或者其它化学品。术语“基本不含有细胞材料”包括蛋白酶蛋白的制品，其中蛋白从其离析或者重组生成的细胞的细胞成分分离获得。在一具体实施方式中，术语“基本不含有细胞材料”包括含有小于30％(干重)非蛋白酶蛋白(文中也称为“污染蛋白”)的蛋白酶蛋白制品，优选的是含有小于大约20％的非蛋白酶蛋白，更优选的是含有小于大约10％非蛋白酶蛋白，最优选的是含有小于大约5％的非蛋白酶蛋白。当蛋白酶蛋白或者其生物活性成分是重组产生的时，优选的是基本不含有培养介质，即在蛋白酶蛋白制品体积中培养介质占到小于大约20％，更优选的是小于大约10％，最优选的是小于大约5％。
术语“基本不含有化学前体或者其它化学品”包括蛋白酶蛋白制品，其中蛋白是从涉及此蛋白合成的化学前体或者其它化学品中分离获得。在一具体实施方式中，术语“基本不含有化学前体或者其它化学品”包括含有小于大约30％(干重)化学前体或者非蛋白酶化学品的蛋白酶蛋白制品，优选的是含有小于大约20％的化学前体或者非蛋白酶化学品，更优选的是含有小于大约10％的化学前体或者非蛋白酶化学品，最优选的是含有小于大约5％化学前体或者非蛋白酶化学品。
本发明涉及制备并筛选在特定底物序列断裂靶蛋白的蛋白酶的方法。蛋白酶是识别靶蛋白内氨基酸或者氨基酸底物序列的蛋白降解酶。基于识别底物序列，蛋白酶催化了靶蛋白内肽键的水解或者断裂。基于肽键在靶蛋白全长序列范围内的位置，这种靶蛋白的水解可以使其钝化。通过蛋白质工程可以改变蛋白酶的特异性。如果蛋白酶设计成识别靶蛋白内底物序列或者(1)改变功能的蛋白，即通过基于催化肽键水解使靶蛋白钝化，并且(2)认定或者并未认定，靶蛋白是特殊疾病或者多种疾病的分子介入点，那么工程蛋白酶具有通过蛋白水解-介导的治疗效果。特别是，蛋白酶可以设计成断裂跨膜与细胞因子结合区域之间的受体。因此，起到将蛋白受体栓在细胞表面或者环区域的茎状区域从多肽链的球状结构功能区分开。
在一具体实施方式中，需要断裂的靶蛋白涉及病症，并且在特定底物序列断裂靶蛋白可以用于治疗上述病症。
在一具体实施方式中，蛋白酶断裂了涉及类风湿性关节炎的蛋白。例如，蛋白酶断裂了在跨膜功能区域与细胞因子结合功能区域之间的肿瘤坏死因子受体。这种断裂可以钝化上述受体。因此，通过抑制肿瘤坏死因子(TNF)的作用可以治疗类风湿性关节炎。
蛋白酶断裂了与活化蛋白C相同的靶蛋白。这种断裂可以减弱凝血级联。因此，通过补充蛋白C的作用可以治疗败血症。
蛋白酶断裂了造成致肿瘤性的细胞表面分子，防止了癌症的扩散。例如，断裂细胞表面分子可以钝化其传递胞外信号的能力，特别是细胞增生信号。没有这些信号，癌症细胞通常不能增殖。因此，本发明蛋白酶可以用于治疗癌症。在此具体实施方式的另一方面，蛋白酶可以断裂造成癌症扩散的任何目标蛋白。断裂涉及细胞循环进程的靶细胞，可以钝化靶细胞允许细胞循环进行的能力。在没有细胞循环进程的情况下，癌细胞就不能增殖。因此，本发明蛋白酶可以用于治疗癌症。
在本发明的另一具体实施方式中，蛋白酶断裂了由人类免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞体病毒(RSV)、或者流行性感冒发现的膜融合蛋白，抑制了这些病毒感染细胞的能力。在没有上述膜蛋白的情况下，这些病毒不能够感染细胞。因此，蛋白酶可以用于治疗或者预防HIV、RSV或者流行性感冒的感染。
在本发明的另一具体实施方式中，蛋白酶断裂了涉及炎症的细胞因子或者受体，用于治疗哮喘或者与炎症有关的其它病症。通过断裂细胞因子或者受体，蛋白酶可以钝化涉及许多炎症过程的信号级联。因此，本发明蛋白酶可以用于治疗炎症和相关病症。
在本发明的另一具体实施方式中，蛋白酶断裂了涉及多种信号级联的信号分子，包括负责调节编程性细胞死亡的信号级联。例如，蛋白酶断裂了半胱天冻酶。例如，半胱天冬酶可以是半胱天冬酶-3。通过断裂涉及信号级联的蛋白，蛋白酶可以用于钝化或者调节信号级联。
在一些实施例中，工程蛋白酶可以设计成断裂表1中的任何靶蛋白，由此钝化此蛋白的活性。通过断裂一种靶蛋白，蛋白酶可以用于治疗与此蛋白有关的病症。
表1
靶 说明 分子类型
白介素-5/白介素-5受体 哮喘 细包因子
白介素-1/白介素-1受体 哮喘、炎症、类风湿性关节炎 细包因子
白介素-13/白介素-13受体 哮喘 细胞因子
白介素-12/白介素-12受体 免疫性紊乱 细胞因子
白介素-4/白介素-4受体 哮喘 细胞因子
肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因 哮喘、节段性回肠炎、 细胞因子
子受体 HIV感染、炎症、牛皮癣、类风湿性关节炎
CCR5/CXCR4 HIV感染 G-蛋白偶联受体
gp120/gp41 HIV感染 融合蛋白
CD4 HIV感染 受体
血球凝集素 流行性感冒感染 融合蛋白
呼吸道合胞体病毒融合蛋白 呼吸道合胞体病毒感染 融合蛋白
B7/CD28 移植-v、-宿主紊乱、类风湿性关节炎、移植排斥、糖尿病 受体
免疫球蛋白E/免疫球蛋白E受体 移植-v、-宿主紊乱、移植排斥 受体
CD2、CD3、CD4、CD40 移植-v、-宿主紊乱、移植排斥、牛皮癣 受体
白介素-2/白介素-2受体 自免疫性疾病、移植-v、-宿主紊乱、类风湿性关节炎 细包因子
VEGF、FGF、EGF、TGF 癌症 细胞因子
Her2/neu 癌症 受体
CCR1 多发性硬化 G-蛋白偶联受体
CXCR3 多发性硬化、类风湿性关节炎 G-蛋白偶联受体
CCR2 动脉粥样硬化、类风湿性 G-蛋白偶
关节炎 联受体
Src 癌症、骨质疏松症 激酶
Akt 癌症 激酶
Bcl-2 癌症 蛋白-蛋白
b细胞受体-Abl 癌症 激酶
GSK-3 糖尿病 激酶
细胞周期蛋白依赖性激酶-2/细胞周期蛋白依赖性激酶-4 癌症 激酶
蛋白酶支架也是表2所列任何一种蛋白。
表2
 编码 名称  基因  连接  基因座
 S01.010 人类型粒酶B  GZMB  3002  14q11.2
 S01.011 Testisin  PRSS21  10942  16p13.3
 S01.015 类胰蛋白酶β1(人类III)  TPSB1  7177  16p13.3
 S01.017 激肽释放酶hK5  KLK5  25818  19q13.3-q13.4
 S01.019 Corin  10699  4p13-p12
 S01.020 激肽释放酶12  KLK12  43849  19q13.3-q13.4
 S01.021 DESC1蛋白酶  28983  4q13.3
 S01.028 类胰蛋白酶γ1  TPSG1  25823  16p13.3
 S01.029 激肽释放酶hK14  KLK14  43847  19q13.3-q13.4
 S01.033 透明质烷-结合丝氨酸蛋白酶(HGF  HABP2  3026  10q25.3
激活因子类蛋白)
 S01.034 跨膜蛋白酶，丝氨酸4  TMPRSS4 56649  11q23.3
 S01.054 类胰蛋白酶δ1(人类)  TPSD1 23430  16p13.3
 S01.074 Marapsin 83886  16p13.3
 S01.075 类胰蛋白酶同系物2(人类) 260429
 S01.076 类胰蛋白酶同系物3(人类)
 S01.077 类胰蛋白酶染色体21(人类)  21q
 S01.079 跨膜蛋白酶，丝氨酸3  TMPRSS3 64699  21q22.3
 S01.081 激肽释放酶hK15(人类) 55554  19q13.41
 S01.085 Mername-AA031肽  酶  (  由MEROPS从已表达序列标记推导出的)
 S01.087 膜类型嵌合体丝氨酸蛋白酶 84000  11q23
 S01.088 Mername-AA038
肽酶
 S01.098 Mername-AA128肽  酶  (  由MEROPS从已表达序列标记推导出的)
 S01.127 阳离子型胰蛋白酶(人类型1(阳离子型))  PRSS1  5644  7q35
 S01.131 中性白细胞弹性蛋白酶  ELA2  1991  19p13.3
 S01.132 甘露聚糖-结合凝集素-相关丝氨酸蛋白酶-3
 S01.133 组织蛋白酶G  CTSG  1511  14q11.2
 S01.134 成髓细胞蛋白酶(蛋白酶3)  PRTN3  5657  19p13.3
 S01.135 粒酶A  GZMA  3001  5q11-q12
 S01.139 粒酶M  GZMM  3004  19p13.3
 S01.140 胰凝乳蛋白酶(人类)  CMA1  1215  14q11.2
 S01.143 类胰蛋白酶α(1)  TPS1  7176  16p13.3
 S01.146 粒酶K  GZMK  3003  5q11-q12
 S01.147 粒酶H  GZMK  2999  14q11.2
 S01.152 胰凝乳蛋白酶B  CTRB1  1504  16q23.2-q23.3
 S01.153 胰弹性蛋白酶  ELA1  1990  12q13
 S01.154 胰肽链内切酶E(A)  10136  1p36.12
 S01.155 胰弹性蛋白酶II(IIA)  63036  12
 S01.156 肠肽酶  PRSS7  5651  21q21
 S01.157 胰凝乳蛋白酶C  11330  1
 S01.159 前列腺蛋白酶  PRSS8  5652  16p11.2
 S01.160 激肽释放酶1  KLK1  3816  19q13.2-q13.4
 S01.161 激肽释放酶hK2(人类)  KLK2  3817  19q13.2-q13.4
 S01.162 激肽释放酶3  KLK3  354  19q13.3-q13.4
 S01.174 内消旋胰蛋白酶  PRSS3  5646  9p13
 S01.191 补体因子D  DF  1675  19
 S01.192 补体成分激活的c1r  C1R  715  12p13
 S01.193 补体成分激活的c1s  C1S  716  12p13
 S01.194 补体成分2  C2  717  6p21.3
 S01.196 补体因子B  BF  629  6p21.3
 S01.198 甘露聚糖-结合凝集素-相关丝氨酸蛋白酶-1  MASP1  5648  3q27-q28
 S01.199 补体因子I  IF  3426  4q24-q25
 S01.205 胰肽链内切酶E型(B)  ELA3B  23436  1p36.12
 S01.206 胰弹性蛋白酶II(B)(人类B)(IIB)  51032  12q13
 S01.211 凝结因子XIIa  F12  2161  5q33-qter
 S01.212 血浆激肽释放酶  KLKB1  3818  4q35
 S01.213 凝结因子XIa  F11  2160  4q35
 S01.214 凝结因子IXa  F9  2158  Xq27.1-q27.2
 S01.215 凝结因子VIIa  F7  2155  13q34
 S01.216 凝结因子Xa  F10  2159  13q34
 S01.217 凝血因子  F2  2147  11p11-q12
 S01.218 蛋白C(活化)  PROC  5624  2q13-q14
 S01.223 顶体蛋白  ACR  49  22q13-qter
 S01.224  Hepsin  HPN  3249  19q11-q13.2
 S01.228 肝细胞生长因子激活剂  HGFAC  3083  4p16
 S01.229 甘露聚糖-结合凝集素-相关丝氨酸蛋白酶-2  MASP2  10747  1p36.3-p36.2
 S01.231 尿激酶型-纤维蛋白溶酶原激活剂  PLAU  5328  10q24
 S01.232 组织-纤维蛋白溶酶原激活剂  PLAT  5327  8p12
 S01.233 纤维蛋白溶酶  PLG  5340  6q26
 S01.236 neurosin  KLK6  5653  19q13.3-q13.4
 S01.237 Neurotrypsin  PRSS12  8492  4q25-q26
 S01.242 类胰蛋白酶β2(人类)(I)  TPSB1  7177  16p13.3
 S01.242 类胰蛋白酶β2(人类)(2)  TPSB2  64499  16p13.3
 S01.244 neuropsin  KLK8  11202  19q13.3-q13.4
 S01.246 激肽释放酶hK10(人类)  KLK10  5655  19q13.33
 S01.247 Epitheliasin  TMPRSS2  7113  21q22.3
 S01.251 前列腺酶  KLK4  9622  19q13.3-q13.4
 S01.252 脑丝氨酸蛋白酶-2  64063  16p13.3
 S01.256 Chymopasin  CTRL  1506  16q22.1
 S01.257 激肽释放酶11  KLK11  11012  19q13.3-q13.4
 S01.258 阴离子型胰蛋白酶(人类型)(II)  PRSS2  5645  7q35
 S01.291 LOC144757肽酶(人类型)  12q13.13
 S01.292 Mername-AA169肽酶  4q13.1
 S01.294 Mername-AA171肽酶
 S01.298 Mername-AA174  154754  7q34
肽酶
 S01.299 Mername-AA175肽酶  8p23.1
 S01.300 角化层胰蛋白酶致酶  KLK7 5650  19q13.3-q13.4
 S01.301 呼吸性胰蛋白酶类酶(人类) 9407  4q13.2
 S01.302 Matriptase  ST14 6768  11q24-q25
 S01.306 激肽释放酶hK13  KLK13 26085  19q19.3-q19.4
 S01.307 激肽释放酶hK9(人类)  KLK9 23579  19q19.3-q19.4
 S01.308 Mername-AA035肽酶 164656  22q13.1
 S01.309 伞状静脉蛋白酶 11098  11q14.1
 S01.311 LCLP蛋白酶(LCLP(N-末端))
 S01.313 spinesin  TMPRSS5 80975  11q23.3
 S01.318 Mername-AA178肽酶  1
 S01.320 Mername-AA180肽酶  11p15.3
 S01.322 Mername-AA182肽酶  12p12.1
 S01.414 Mername-AA122肽酶(由MEROPS从已表
达序列标记推导出的)
工程蛋白酶
事实上蛋白酶的每个方面都可以重新设计，包括酶底物序列特异性、热稳定性、pH轮廓、催化效率、氧化稳定性、和催化功能。
现有的蛋白酶可以用做支架，其中含有改变其底物特异性的各种变异。支架主要含有下述任一种微粒的氨基酸序列：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、凝血因子、纤维蛋白溶酶、凝血因子Xa、尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、粒酶B、弹性蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、膜型丝氨酸蛋白酶-1(MTSP-1)、糜蛋白酶、中性白细胞弹性蛋白酶、血浆激肽释放酶、粒酶M、补体因子丝氨酸蛋白酶、ADAMTS13、神经肽链内切酶/neprilysin、弗林蛋白酶或者其组合。优选的支架包括粒酶B、MTSP-1、糜蛋白酶、中性白细胞弹性蛋白酶、粒酶A、血浆激肽释放酶、尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂、粒酶M、胰凝乳蛋白酶、凝血因子、补体因子丝氨酸蛋白酶、ADAMTS13、神经肽链内切酶/neprilysin、弗林蛋白酶和纤维蛋白溶酶。丝氨酸蛋白酶底物序列特异性的决定因子来自活性位点的S1-S4位置，在此位置蛋白酶与肽底物序列的P1-P4残基相接触。在一些情况下，活性位点S1-S4袋之间很少相互作用(若有的话)，由此每个袋看来似乎独立于其它袋以外识别并结合肽底物序列的对应残基。因此，在未影响其它袋特异性的情况下，通常可以改变一个袋的特异性决定因子。
例如，通过在底物序列结合袋产生点变异，可以改变在特定结合位点对于残基或者特殊序列具有低特异性蛋白酶的特异性。在一些情况下，与野生型相比对于特殊序列所得的变异体位点的特异性增长了大于10倍。在另一具体实施方式中，与野生型相比对于特殊序列所得的变异体位点的特异性增长了大于100倍。在另一具体实施方式中，与野生型相比对于特殊序列所得的变异体位点的特异性增长了大于1000倍。
本发明还设计，使用本领域公知方法并参照下文详细描述，制备并筛选了带有各种变异的支架库。筛选支架库，从而确定成员底物序列的特异性。通过将成员暴露于底物肽序列，可以测定支架库的特异性。鉴别出断裂底物序列、带有变异的成员。可以构建带有足够多样变异的支架库，以致库成员能够断裂任何底物肽序列。因此，可以制备特异于任何靶蛋白的蛋白酶。
过程
1.选择支架
在本发明的另一具体实施方式中，按照下述要求选择支架蛋白酶：(1)蛋白酶是人类或者哺乳动物蛋白酶公知的序列；(2)蛋白酶可以通过当前分子生物技术操作；(3)蛋白酶可以在适当宿主内以相对高浓度异种表达；(4)蛋白酶在足以筛选的浓度下可以被提纯成化学稳定型。在本发明的另一具体实施方式，变异的支架蛋白酶断裂了细胞外出现的蛋白。例如，这样的胞外蛋白是受体、信号蛋白、或者细胞因子。基于变异，残基影响了上述两种支架蛋白酶族的活性和特异性。优选的是，可以获得蛋白酶的三维结构信息。而且，优选的是，具有蛋白酶初始底物特异性的知识。优选的是，蛋白酶在生命体外具有活性与稳定性，并且可以获得蛋白酶大分子调节剂的知识。而且，优选的蛋白酶是断裂与造成病症相关靶的蛋白酶，例如钝化病症蛋白效应物。
丝氨酸蛋白酶
在本发明的另一具体实施方式中，根据基于结构的设计方案制备出改变特异性的丝氨酸蛋白酶。每种蛋白酶具有排列在活性位点袋的一系列氨基酸，并且与底物直接接触。在整个胰凝乳蛋白酶族中，底物与酶的主链相互作用是完全保守的，但是侧链的相互作用相对多样化。对于构成活性位点S1-S4袋氨基酸的识别决定了此特殊袋的底物特异性。将丝氨酸蛋白酶的氨基酸与相同折叠中另一个氨基酸结合，就改变了相互之间的特异性。例如，对应小型氨基酸的S2袋中位置99的变异就给予了P2底物位置大型疏水残基的优先权。采用此选择性变异的方法，然后再通过底物库的筛选，可以设计出对于涉及各种疾病的蛋白具有新型底物特异性的蛋白酶。
丝氨酸蛋白酶是与胰凝乳蛋白酶相同族的成员，因此丝氨酸蛋白酶具有与其相同的序列与结构。活性位点残基是天冬氨酸102，组氨酸57，丝氨酸195。线型氨基酸序列可以与胰凝乳蛋白酶共同排列，并且根据胰凝乳蛋白酶的β折叠编码。插入与删除出现在β折叠之间的环上，但是在整个结构系中核心片层是保守的。丝氨酸蛋白酶以保守的β折叠方式与底物相互作用。在底物与酶之间出现了数目达到6个的保守氢键。
半胱氨酸蛋白酶
木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶是与木瓜蛋白酶结构相似、基于硫醇的肽键内切酶族。它们形成了带有R和L标记(对于左右区域)的双区域结构蛋白，两区域结构组成的环构成了底物识别裂隙。木瓜蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶具有由氨基酸Cys25、His 159和Asn175构成的催化三合体。与丝氨酸蛋白酶(基于底物β折叠构象识别并蛋白分解靶蛋白)不同，此族蛋白酶不具有用于底物识别、定义明确的袋。主要的底物识别发生在P2氨基酸(与丝氨酸蛋白酶P1残基相比)。
S2袋是最具选择性的，并以蛋白酶底物识别位点为最佳特征。根据下述空间位置(木瓜蛋白酶编号)定义S2袋：66、67、68、133、157、160和205。位置205起到了与丝氨酸蛋白酶位置189相同的作用，是在确定特异性的袋底部隐藏的残基。
使用完全多样化位置扫描合成组合库(PS-SCL)，描绘许多半胱氨酸蛋白酶(人类组织蛋白酶L、V、K、S、F、B，木瓜蛋白酶和克鲁蛋白酶)的底物特异性。完全组合库由P1、P2、P3和P4四肽底物构成，其中一个位置氨基酸种类固定后，另外三个位置从20种可能的氨基酸等摩尔混合物中随机选取，总共给出了大约160,000个四肽序列的多样性。
总的来说，在组织蛋白酶之间P1特异性几乎是相同的，当耐受小型脂肪族氨基酸时，优选的是精氨酸和赖氨酸。许多选择性出现在P2位置，但是人类组织蛋白酶严格选择疏水性氨基酸。有趣的是，对应疏水性残基的P2特异性被分为了芳香氨基酸类，例如Phe、Tyr和Trp(组织蛋白酶L、V)，以及大体积的脂肪族氨基酸，例如Val或者Leu(组织蛋白酶K、S、F)。与P2位置相比，P3位置的选择性明显缺少严格性。然而，一些蛋白酶对于脯氨酸(组织蛋白酶V、S和木瓜蛋白酶)、亮氨酸(组织蛋白酶B)、或者精氨酸(组织蛋白酶S、克鲁蛋白酶)表现出了明显的优先选择。此蛋白酶在P4位置上表现出广泛的选择性，而且没有一个氨基酸可以基于其它氨基酸被选中。
底物识别评价
为了生成带有改变底物识别评价的变异体蛋白酶，对底物选择性(特异性决定因子)起作用的三维结构中的氨基酸作为诱发突变的靶。对于丝氨酸蛋白酶，族成员的许多结构已经定义了对扩展底物特异性起作用的表面残基(Wang等人，《生物化学》2001年8月28日；第40(34)期第10038-10046页；Hopfner等人，《结构折叠描述》1999年8月15日；第7(8)期第989-996页；Friedrich等人，期刊《生物化学》2002年1月18日，第277(3)期第2160-2168页；Waugh等人，《天然结构生物学》2000年9月，第7(9)期第762-765页)。各种蛋白酶的结构决定因子汇集在表3中，还罗列了已确定公知扩展特异性族成员的氨基酸子集。对于丝氨酸蛋白酶，第一序列中的下列氨基酸是特异性的决定因子：195、102、57(催化三合体)；189、190、191、192和226(P1)；57、58和64之间的环、和99(P2)；192、217、218(P3)、半光氨酸168和半光氨酸180之间的环、215和97-100(P4)。
表3.各种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的结构决定因子及其对应的底物特异性
  决定特异性的残基
  S4   S3   S2   S1
  171   174   180   215   Cys168Cys182   192   218   99   57   60环   189   190   226   CCys1 81CCys2 20
  粒酶B   Leu   Tyr   Glu   Tyr   14   arg   Asn   Ile   His   6   Gly   ser   arg   No
  粒酶A   Asn   Val   Met   Phe   17   Asn   Leu   Arg   His   7   Asp   Ser   Gly   Yes
  粒酶M   Arg   Ser   Met   Phe   15   Lys   Arg   Leu   His   8   Ala   Pro   Pro   Yes
  组织蛋白酶G   Phe   Ser   Gln   Tyr   13   Lys   Ser   Ile   His   6   Ala   Ala   Glu   No
  MTSP-4   Leu   Gln   Met   Trp   13   Gln   Asp   Phe   His   16   Asp   Ser   Gly   Yes
  中性白细胞弹性酶   -   -   -   Tyr   5   Phe   Gly   Leu   His   10   Gly   Val   Asp   Yes
  糜蛋白酶   Phe   Arg   Gln   Tyr   12   Lys   Ser   Phe   His   6   Ser   Ala   Ala   No
  α类胰蛋白酶   Tyr   Ile   Met   Trp   22   Lys   Glu   Ile   His   9   Asp   Ser   Gly   Yes
  β类胰蛋白酶I   Tyr   Ile   Met   Trp   22   Gln   Glu   Val   His   9   Asp   Ser   Gly   Yes
  β类胰蛋白酶(II)   Tyr   Ile   Met   Trp   22   Lys   Glu   Thr   His   9   Asp   Ser   Gly   Yes
  胰凝乳蛋白酶   Trp   Arg   Met   Trp   13   Met   Ser   Val   His   7   Ser   Ser   Gly   Yes
  Easter   Tyr   Ser   Gln   Phe   16   Arg   Thr   Gln   His   14   Asp   Ser   Gly   Yes
  胶原酶   Tyr   Ile   -   Phe   12   Asn   Ala   Ile   His   8   Gly   Thr   Asp   Yes
凝血因子Xa Ser  Phe  Met  Trp  13  Gln  Glu  Tyr  His  8  Asp  Ala  Gly  Yes
蛋白C Met  Asn  Met  Trp  13  Glu  Glu  Thr  His  8  Asp  Ala  Gly  Yes
血浆激肽释放酶 Tyr  Gln  Met  Tyr  13  Arg  Pro  Phe  His  11  Asp  Ala  Ala  Yes
纤维蛋白溶酶 Glu  Arg  Glu  Trp  15  Gln  Leu  Thr  His  11  Asp  Ser  Gly  Yes
胰蛋白酶 Tyr  Lys  Met  Trp  13  Gln  Tyr  Leu  His  6  Asp  Ser  Gly  Yes
凝血酶 Thr  Ile  Met  Trp  13  Glu  Glu  leu  His  16  Asp  Ala  Gly  Yes
TPA  Leu  Thr  Met  Trp  15  Gln  Leu  Tyr  His  11  Asp  Ala  Gly  Yes
UPA  His  Ser  met  Trp  15  gln  arg  His  His  11  Asp  ser  gly  Yes
底物特异性
 P4  P3  P2  P1
粒酶B  Ileleu  Glu  X  Asp
粒酶A  IleVal  AlaGly  AsnAsp  Arg
粒酶M  LeuMet
组织蛋白酶G  X  X  ValLeu  PheLys
MTSP-4  ArgHφ  HφArg  SerThr  ArgLys
中性白细胞弹性酶  ArgMet  GlnGlu  ProAla  ValAla
糜蛋白酶 X  GluAla  X  PheTyr
胰凝乳蛋白酶 X  X  ValLeu  PheTyr
Easter IleVal  GluAla  ValLeu  Arg
胶原酶  Arg
凝血因子Xa X  X  Gly  Arg
血浆激肽释放酶 Hφ  X  PheTyr  Arg
纤维蛋白溶酶 Lys  X  TrpPhe  Lys
凝血酶 PheLeu  X  Pro  Arg
TPA X  PheTyr  GlySer  Arg
UPA X  ThrSer  SerAla  Arg
粒酶B是胰凝乳蛋白酶折叠丝氨酸蛋白酶族成员，具有与粒酶族其它成员大于50％的同一性；粒酶族包括粒酶C-G、组织蛋白酶G、鼠肥大细胞蛋白酶II。粒酶B是由短α-螺旋连接两个六链反向平行β桶状结构区域的多层结构。其催化三合体是由Asp102、His57和Ser195构成。根据与α胰凝乳蛋白酶比较的增加或者删除，编号表面环；表面环代表了此结构族最易变的区域。通过鼠粒酶B与ecotin[IEPD]、底物类结合环的大分子抑制因子复合的三维结构确定特异性的决定因子(Waugh等人，《天然结构生物学》)。这些特异性结构决定因子包括Ile99、Arg192、Asn218、Tyr215、Tyr174、Leu172、Arg226和Tyr151，按照胰凝乳蛋白酶编号。有趣的是，丝氨酸酶粒族的其它成员仅仅共享粒酶B这些氨基酸中的两个氨基酸。它们是Tyr215和Leu172，在整个结构族中变化非常小的两个残基。这说明，当粒酶序列同一性很高时，其底物特异性的差别就很大。
为了测定氨基酸对扩展特异性的作用，将Ile99、Arg192、Asn218和Tyr174变异成氨基酸丙氨酸。经确定，Ile99对P2特异性起作用，Asn218和Arg192对P3特异性起作用，Tyr174对P4特异性起作用。采用组合底物库评价每个修饰的蛋白酶，从而确定变异对扩展特异性的作用。由于蛋白酶P1特异性代表了其主要特异性，因此修饰并没有破坏粒酶B对P1天门冬氨酸的唯一特异性，但是调节了扩展P2到P4位点的特异性。
对于P3和P4亚位点，在Tyr174、Arg192和Asn218上的变异并没有显著影响其特异性(参见下文表4)。Y174A增加了在P4位置趋向Leu的活性，但是剩余的氨基酸具有很差的可选择性。R192A和N218A都扩展了P3的特异性。除了对谷氨酸的强优先选择外，变异中相似优选的是Ala、Ser、Glu和Gln。对于理想的野生型底物N-乙酰基-Ile-Glu-Pro-Asp-AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)(Ac-IEPD-AMC)，变异体的总活性(kcat/Km)比野生型活性低小于10％。
在P2亚位点观察到极显著的效果(参见下文中表4)。在野生型粒酶B中，优先选择很广泛，脯氨酸具有稍强的优先选择权。I99A将P2特异性限制在Phe和Tyr残基。在P2位置上Phe具有比其它氨基酸平均活性强将近5倍的优先选择权。在丝氨酸蛋白酶的胰凝乳蛋白酶族中，超过12种蛋白酶在此结构位点上具有小型残基，天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或者甘氨酸。对于这种蛋白酶族，采用组合底物库已经评价出两种蛋白酶(血浆激肽释放酶和纤维蛋白溶酶)，这两种蛋白酶对Phe和Tyr都表现出强烈的优先选择。上述的两个结论说明，在位置99变异成Asn、Ser、Thr、Gly或者Ala的任何丝氨酸蛋白酶都表现出与血浆激肽释放酶、纤维蛋白溶酶和I99A粒酶B变异体相同的疏水特异性。
对于P2特异性决定因子的理解可以扩展到变异与底物优先权的对照。将近24种胰凝乳蛋白酶折叠丝氨酸蛋白酶在位置99上具有芳香族氨基酸。采用组合底物库已经评价出四种这样的蛋白酶：人类粒酶B、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂、尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂和膜型丝氨酸蛋白酶1。除了粒酶B以外的上述蛋白酶在底物P2位置上具有对丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸的优先选择权。
表4.粒酶B的变异体
 S4  S3  S2  S1
 变异体  171  174  180 215  Cys168-182  192  218  99  57  60环  189  190  226  Cys191-220
 野生型  Leu  Tyr  Glu Tyr  14  Arg  Asn  Ile  His  6  Gly  Ser  Arg  No
 I99F  Leu  Tyr  Glu Tyr  14  Arg  Asn  Phe  His  6  Gly  Ser  Arg  No
 I99A  Leu  Tyr  Glu Tyr  14  Arg  Asn  Ala  His  6  Gly  Ser  Arg  No
 I99K  Leu  Tyr  Glu Tyr  14  Arg  Asn  Lys  His  6  Gly  Ser  Arg  No
 N218A  Leu  Tyr  Glu Tyr  14  Arg  Ala  Ile  His  6  Gly  Ser  Arg  No
 N218T  Leu  Tyr  Glu Tyr  14  Arg  Thr  Ile  His  6  Gly  Ser  Arg  No
 N218V  Leu  Tyr  Glu Tyr  14  Arg  Val  Ile  His  6  Gly  Ser  Arg  No
 R192A  Leu  Tyr  Glu Tyr  14  Ala  Asn  Ile  His  6  Gly  Ser  Arg  No
 R192E  Leu  Tyr  Glu Tyr  14  Glu  Asn  Ile  His  6  Gly  Ser  Arg  No
 Y174A  Leu  Ala  Glu Tyr  14  Arg  Asn  Ile  His  6  Gly  Ser  Arg  No
 Y174V  Leu  Val  Glu Tyr  14  Arg  Asn  Ile  His  6  Gly  Ser  Arg  No
 I9  Leu  Tyr  Glu Tyr  14  Ar  Ala  Al  His  6  Gl  Se  Arg  No
 9A/N218A  g  a  y  r
 R192A/N218A  Leu  Tyr  Glu Tyr  14  Ala  Ala  Ile  His  6  Gly  Ser  Arg  No
 R192E/N218A  Leu  Tyr  Glu Tyr  14  Glu  Ala  Ile  His  6  Gly  Ser  Arg  No
表5.对特异性的效果
 特异性评价
 变异体  P4  P3  P2  P1
 野生型  Ile/Val  Glu  X  Asp
 I99F  Ile/Val  Glu  X  Asp
 I99A  Ile/Val  Glu  Phe  Asp
 I99K  Ile/Val  Glu  X  Asp
 N218A  Ile/Val  X  X  Asp
 N218T  Ile/Val  Ala/Ser  X  Asp
 N218V  Ile/Val  X  X  Asp
 R192A  Ile/Val  Glu  X  Asp
 R192E  Ile/Val  Lys/Gln/Ser  X  Asp
 Y174A  Ile/Val/Leu  Glu  X  Asp
 Y174V  Ile/Val  Glu  X  Asp
 I99A/N218A  Phe/Leu  Ala/Ser  Phe  Asp
 R192A/N218A  Ile/Val  Ala/Gln/Ser  X  Asp
 R192E/N218A  Ile/Val  Arg/Lys/Ala  X  Asp
从表4和表5得知，鼠粒酶B选择改变特异性的决定因子包括如下：Ser195、Asp102、His57、Ala189、Ser190、Phe191、Arg192、Arg226、Ser58、Gly59、Ser60、Lys61、Ile62、Asn63、Ile99、Gln217、Asn218、Glu169、Ser170、Tyr171、Leu171A(注意与胰凝乳蛋白酶相比插入了一个氨基酸)、Lys172、Asn173、Tyr174、Phe175、Asp176、Lys177、Ala178、Glu180、Ile181、Tyr215、Lys97、Thr98、Ile99和Ser100。
对于半胱氨酸蛋白酶，选择修饰的氨基酸缺少详细的描述。S2袋是最具选择性的并且以蛋白酶底物识别位点为最佳特征。S2袋由下述三维位置的氨基酸限定(木瓜蛋白酶编号)：66、67、68、133、157、160和205。位置205起到了与丝氨酸蛋白酶位置189、一个隐藏在袋底部决定特异性残基相似的作用。其它特异性决定因子包括下列氨基酸(根据木瓜蛋白酶编号)：61和66(P3)；19、20和158(P1)。
表6.各种半胱氨酸蛋白酶的结构决定因子和其对应底物特异性
  决定特异性的底物
  活性位点残基   S3   S2   S1
  25   159   175   61   66   66   133   1 57   160   205   19   20   158
  组织蛋白酶L   cys   His   Asn   Glu   Gly   Gly   Ala   Met   Gly   Ala   Gln   Gly   Asp
  组织蛋白酶V   Cys   His   Asn   Gln   Gly   Gly   Ala   Leu   Gly   Ala   Gln   Lys   Asp
  组织蛋白   Cys   His   Asn   Asp   Gly   Gly   Ala   Leu   Ala   Leu   Gln   Gly   Asn
酶K
组织蛋白酶S  Cys  His  Asn  Lys  Gly  Gly  Gly  Val  Gly  Phe  Gln  Gly  Asn
组织蛋白酶F  Cys  His  Asn  Lys  Gly  Gly  Ala  Ile  Ala  Met  Gln  Gly  Asp
组织蛋白酶B  Cys  His  Asn  Asp  Gly  Gly  Ala  Gly  Ala  Glu  Gln  Gly  Gly
木瓜蛋白酶  Cys  His  Asn  Tyr  Gly  Gly  Val  Val  Ala  Ser  Gln  Gly  Asp
克鲁蛋白酶  cys  His  Asn  Ser  Gly  Gly  Ala  Leu  Gly  Glu  Gln  Gly  Asp
 底物特异性
 P4  P3  P2  P1
组织蛋白酶L  X  X  Phe/Trp  Arg/Lys
组织蛋白酶V  X  Pro/X  Trp/Tyr/Phe  X
组织蛋白酶K  X  X  Leu/Pro  Arg/Lys
组织蛋白酶S  X  Arg/X  Val/Leu/Met  Lys/Arg
组织蛋白酶F  X  X  Leu  Lys/Arg
组织蛋白酶B  X  Leu/X  Val  Arg/Lys
木瓜蛋白酶 X  Pro/X  Val/Phe/Lyr  Arg/Lys
克鲁蛋白酶 X  Arg/X  Leu/Phe/tyr  Arg/Lys
2.支架蛋白酶的诱发变异
为了改变特定亚位点(S1-S4)对于特定氨基酸的底物优先选择，可以单独或者组合变异排列成结合袋的特异性决定因子。在本发明一具体实施方式中，使用饱和的诱发变异技术，将排列成结合袋的残基变异成20种可能氨基酸中的每一种氨基酸。采用Kunkle方法(分子生物学的当前方案，John Wiley和Sons，Inc，Media Pa)，可以完成此过程。简单地讲，合成诱变的寡核苷酸引子，其中在所需的密码子上随机含有NNS或者NNK。将引子退火成单链的DNA模板，然后加入DNA聚合酶合成模板的互补链。连接后，将双链DNA模板转入大肠杆菌扩增。此外，可以使用标准的商业可得的位点靶向诱发变异盒，例如QuikChange(Stratagene)，产生单氨基酸改变。在另一具体实施方式中，对于位点特定氨基酸变异可以使用本领域公知的任何方法。
3.表达并提纯变异体蛋白酶
可以采用活性或者惰性酶原形式表达蛋白酶。蛋白酶可以在异源表达系统中表达，例如大肠杆菌、Pichia pastoris、S.cerevisae或者杆状病毒的表达系统。蛋白可以在胞内环境表达，也可以分泌到介质中。为了提纯变异体蛋白酶，可以使用柱层析法。蛋白酶含有在镍柱上提纯的C末端6-组氨酸尾端。基于蛋白酶的等电点，阳离子或者阴离子交换柱都是适合的。蛋白酶可以储存在使其催化活性最小化的低PH值缓冲液中，以避免其自身降解。通过采用免疫吸附法、凝胶过滤法、或者本领域所用的任何其它提纯方法，也可以实现提纯。
4.合成ACC位置扫描库
本领域技术人员认定，可以采用多种方法制备本发明的肽和库。在一实施例具体实施方式中，通过将荧光标记底物肽附着在固体载体上筛选库。通过将氮-Fmoc香豆素衍生物缩合到酸易变Rink连接基团上以提供ACC树脂(Baches等人，<天然生物技术>2000年2月，第18(2)期第187-193页)，可以从底物肽合成荧光离去基团。Fmoc的去除产生了游离胺。天然、非天然或者修饰的氨基酸可以与通过结合附加氨基酸精心制备的游离胺结合。在完成上述肽合成后，肽-荧光部分的结合物可以从固体载体断裂，或者结合物可以仍旧附着在固体载体上。
因此，在更优选的具体实施方式中，本发明提供了制备荧光肽或者含有荧光肽材料的方法。这样的方法包括：(1)提供了含有共价结合固体载体荧光部分的第一结合物；(2)将第一结合物与第一保护氨基酸部分和活化剂相接触，由此在羧基基团与第一结合物胺氮原子之间生成了肽键；(3)去保护，由此生成了含有反应性胺部分的第二结合物；(4)将第二结合物与第二保护氨基酸和活化剂相接触，由此在羧基基团与反应性胺部分之间生成了肽键；(5)去保护，由此生成了含有反应性胺部分的第三结合物。
在优选的具体实施方式中，此方法还包括：(6)将第三结合物与第三保护氨基酸和活化剂相接触，由此在羧基基团与反应性胺部分之间生成了肽键；(7)去保护，由此生成了含有反应性胺部分的第四结合物。
对于结合困难的氨基酸(Ile、Val等)，游离的未经反应的胺可以保留在载体上，并使后续合成与分析操作复杂化。在二甲基酰胺中使用乙酸硝基三唑活性酯的特殊加帽步骤有效地酰化了剩余的苯胺。通常，出现在未经提纯底物序列溶液中的所得乙酸加帽香豆素不是蛋白酶的底物序列。可以使用这些方法获得的P1-取代树脂，制备任何ACC-荧光底物。
在更优选的具体实施方式中，通过使用至少2种、优选至少6种、更优选至少12种、更优选至少20种氨基酸的混合物增长肽链，可以在任何特殊位置或者位置组合获得多样性。氨基酸混合物可以包括任何有效用量的特殊氨基酸，以及任何有效用量的一种或者多种不同氨基酸。在一优选具体实施方式中，混合物是氨基酸等动力混合物(适当比率的混合物使所有成分具有等摩尔的反应性)。等动力混合物是氨基酸摩尔比率基于其报道的反应比率已经进行调节的混合物(Ostresh JM，Winkle JH，HamashinVT & Houghten，RA(1994)<生物聚合物>第34期第1681-1689页)。
固体相肽合成法是制备本发明化合物肽主链的优选方法，其中包括将序列的碳末端氨基酸附着在不溶的载体上，然后顺序加入序列上剩余的氨基酸。固相合成技术记录在下述文献中：Barrany和Merrifield，固相肽合成，<肽：分析、合成>生物学第2卷第3-284页；<肽合成的特殊方法>第A部分，Gross和Meienhofer，eds.Academic Press，纽约，1980年；Stewart等人，<固体相肽合成>第二版，Pierce Chem.Co，Rockford，III(1984年)；上述文献全部内容通过在以引述合并于本文。通过使用商业获得的肽合成器，利用Fmoc(9-芴甲氧羰基)或者叔丁氧羰基化学性质，可以极容易地实现固体相合成。
在特别优选的具体实施方式中，利用Fmoc合成的化学性质实施肽合成。使用叔丁基优选保护Asp、Ser、Thr和Tyr侧链；使用硫-三苯甲基和硫-叔丁基硫代基优选保护Cys残基侧链；使用叔丁氧羰基、Fmoc和4-甲基三苯甲基优选保护Lys残基侧链。适当保护的氨基酸试剂可以商业获得，或者可以采用本领域公知的方法制备。使用多种保护性基团，可以选择性解锁并且将荧光基团与任何特别需要的侧链结合。因此，例如，使用二氯甲烷中的TFA，实现叔丁氧羰基去保护。例如，使用20％(体积/体积)二甲基酰胺中的哌啶或者N-甲基吡咯烷酮，完成Fmoc去保护；例如，使用1-5％(体积/体积)水中的TFA、或者1％TFA和5％DCM中的三异丙基硅烷，完成4-甲基三苯甲基去保护。例如，使用水性的巯基乙醇(10％)完成了硫-叔丁基硫代基去保护。例如，使用TFA∶苯酚∶水∶硫代茴香醚∶乙烷二硫醇(85∶5∶5∶2.5∶2.5)，或者TFA∶苯酚∶水(95∶5∶5)，完成叔丁基、叔丁氧羰基、和硫-三苯甲基基团的去除。
5.筛选特异性改变的蛋白酶
根据本领域公知方法识别利用本发明方法制备、蛋白酶的重要氨基酸，例如位点-靶向诱导变异或者活性位点残基的饱和诱导变异。在后面的技术中，以单独或者组合的方式将证实是特异性重要决定因子、构成S1-S4袋的残基变异成每种可能的氨基酸。参见例如，Legendre等人，《JMB》2000年第296期第87-102页。采用ACC位置扫描库，通过单底物动力学分析(Harris等人，《PNAS》第2000年第97期第7754-7759页)，确定所得变异体的底物特异性。
采用诱发突变和筛选的公知方法，制备并且测定多种氨基酸取代，例如Reidhaar-Olson和Sauer(《科学》1998年第241期第53-57页)或者Bowie和Sauer(《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》1989年第86期第2152-2156页)公开的内容。简单的讲，这些作者公开了多种方法，将多肽的两个或者多个位置同时随机选取，选择功能性多肽，然后将诱发变异的多肽排序，确定在每个位置上允许取代的范围。可以使用其它方法，其中包括噬菌体展示法(例如，Legendre等人，《JMB》2000年第296期第87-102页；Lowman等人，《生物化学》1991年第30期第10832-10837页；Ladner等人，美国专利No.5223409；Huse，PCT专利申请WO92/06204)和区域导向诱发变异法(Derbyshire等人，《基因》1986年第46期第145页；Ner等人，《DNA》1988年第7期第127页)。
上述诱导变异的方法可以与测定宿主细胞中克隆变异多肽活性的高处理量自动筛选方法结合使用。从宿主细胞收集编码了具有蛋白分解活性蛋白或者其前体的变异DNA分子，再采用现代设备迅速排序。这些方法可以迅速确定重要多肽中单一氨基酸残基的重要性，并且可以施用于未知结构的多肽。
通过蛋白酶噬菌体展示筛选
在一具体实施方式中，采用蛋白酶噬菌体展示法，利用对应特定底物序列的各种亲和力，筛选变异蛋白酶库，如Legendre等人所述，《JMB》2000年第296期第87-102页，和Corey等人所述，《基因》1993年6月15日，第218(1)期第129-134页。噬菌体技术给人们提供了蛋白与编码此蛋白基因信息的物理连接。通过将其基因融合到细菌病毒表面层蛋白，构建重要的蛋白。当在细菌宿主中产生病毒颗粒时，重要蛋白作为融合蛋白产生，并且在病毒表面上展示，其基因包裹在病毒的壳体颗粒中。通过结合固定靶，筛选噬菌体展示的随机蛋白库。挑选噬菌体库(每种噬菌体代表单一的变异体)，寻找对靶具有增强亲和力的噬菌体。在噬菌体表面已经展示了丝氨酸蛋白酶，这种技术结合适当的诱发变异技术可以用于产生多样化的蛋白酶变异体库。
选择的靶可以是与蛋白酶治疗应用有关的靶。例如，靶序列可以存在于内毒素、或者病毒蛋白、或者细菌壁蛋白、或者与自免疫条件有关的天然血液肽。文中所选蛋白酶可以用于治疗方法，通过将此肽给药于病体，例如通过静脉给药。
利用荧光性筛选
在本发明另一具体实施方式中，使用了一种分析酶活性蛋白酶存在的方法。这样的方法包括：(1)将样品与蛋白酶相接触，基于蛋白酶的作用荧光部分从肽底物序列释放出来，由此生成了发荧光的部分；(2)观察样品是否经过可测的荧光变化，可测的荧光变化说明样品中存在酶活性蛋白酶。
本发明方法可以用于分析任何充分公开的或者后来发现的蛋白酶。含有蛋白酶的样品可以从任何来源或者有机体获得。在一具体实施方式中，样品是来自病体的临床样品。在另一具体实施方式中，蛋白酶选自天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。特别优选的是，本发明方法用于分析由微生物获得的蛋白酶，其中不限于此地包括细菌、真菌、酵母菌、病毒和原生动物。
溶液中蛋白酶活性的分析只需要，将一定量储存溶液加入荧光蛋白酶指示剂中，再测定后续荧光的增加或者吸收光谱中激发带的降低。还可以将溶液与荧光指示剂混合在使蛋白酶活性最佳化的“消化缓冲液”中，再进行分析。适合分析蛋白酶活性的缓冲液对于本领域技术人员众所周知。例如，特别适合分析弹性蛋白酶活性的缓冲液由50mM磷酸钠和1mM EDTA的PH8.9溶液构成。使用荧光计最容易进行测定，这种仪器为荧光基团提供了“激发”光源，然后在特定波长下测定随后发射的光。
具体实施方式：缺少蛋白酶的对照指示剂溶液比较提供了对蛋白酶活性的测定。通过绘制蛋白酶/指示剂组合的标准曲线，其中测定由公知活性蛋白酶溶液产生的荧光变化率，可以精确量化活性水平。
当使用荧光计优选完成荧光化合物的测定时，可以使用本领域技术人员公知的多种其它方法完成测定。因此，例如，当发光基团发射可见光时，测定只需要目测观察响应光源激发的荧光。测定还可以通过图象分析系统完成，使用接合数字转换器或者其它图象获取系统的摄象机。测定还可以通过过滤器采用造影法完成，例如在荧光显微镜下。这样的显微镜可以提供由操作者简单显影的信号。此外，信号还可以记录在照相软片上，或者使用图象分析系统。利用图象分析系统或者光度计，信号还可以随实时简单量化。
因此，例如，样品蛋白酶活性的基本分析涉及将样品悬浮或者溶解在缓冲液中(在待测特定蛋白酶的最佳PH值条件下)，然后向缓冲液中加入荧光蛋白酶指示剂，如Harris等人所述，再使用分光荧光计监视所得的荧光变化，参见期刊《生物化学》1998年10月16日，第273卷第42期第27364-27373页。将分光荧光计设置在荧光基团激发波长下激发荧光基团，然后，在荧光基团发射波长下测定所得的荧光。荧光蛋白酶指示剂是由蛋白酶断裂自身使荧光发生变化的蛋白酶底物序列。
在一说明性具体实施方式中，本发明提供了用于评价各种丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶的库。这种库能够区别对于不同氨基酸具有特异性的蛋白酶。
在另一说明性具体实施方式中，库提供了探测涉及血液凝固的一些丝氨酸蛋白酶的扩展底物序列特异性，其中基于蛋白酶的优选P1特异性，在P1位置保持赖氨酸或者精氨酸不变。
PS-SCL策略可以快速简便地测定出蛋白溶解底物序列的特异性。本领域技术人员可以认定，这些方法提供了广泛多样的替换库形式。例如，在P2位置固定大型疏水氨基酸，可以防止木瓜蛋白酶类蛋白酶内部的优选断裂，并且可以完全地记录下底物序列。考虑并确定对于测定底物序列特异性的任何特定酶或者方法的特殊限制，属于本领域技术人员的能力范围。
除了分析所选择的酶是否存在以外，本发明方法还可以用于探测、鉴别和量化样品中的一种酶(例如，蛋白酶)。因此，在另一优选的具体实施方式中，筛选方法还包括(3)量化荧光部分，由此量化样品中存在的酶(例如，蛋白酶)。样品可以是，例如生物流体，例如血液、血清、尿液、眼泪、牛奶或者精液。
利用蛋白酶序列特异性分析筛选
在另一优选的具体实施方式中，这些方法用于选择特异性断裂靶序列的酶，优选的是酶促活性蛋白酶。这类方法包括：(1)含有内部抑制荧光基团的随机肽库，其中荧光基团是例如O-氨基苯甲酰，并且猝光剂是例如3-硝基酷氨酸；(2)对应靶向断裂序列的肽底物序列，其中还含有内部抑制的荧光基团，荧光基团是例如Cy3B，并且猝光剂是例如Cy5Q；(3)按1∶1比率将随机肽库与肽底物序列混合；(4)将混合物暴露于变异蛋白酶，然后量化Cy3B荧光与O-氨基苯甲酰荧光的比率。如果蛋白酶对靶蛋白具有选择性，那么蛋白酶只会断裂靶肽，而不会断裂随机库，因此Cy3B荧光与O-氨基苯甲酰荧光的比率就会很高(Meldal和Breddam，《生物化学》(1991年)第195期第141-147页；Gron等人，《生物化学》(1992年)第31期第6011-6018页)。
在另一优选具体实施方式中，这些方法用于测定酶的序列特异性，优选的是测定酶促活性蛋白酶的序列特异性。这类方法包括：(1)将蛋白酶与本发明的肽库接触，由此荧光部分从肽序列中释放出来，因此生成了荧发光部分；(2)测定荧发光部分；(3)确定肽序列的序列，由此确定蛋白酶肽序列特异性评价。
在上述方法的一优选具体实施方式中，上述方法还包括：(4)量化荧光部分，由此量化蛋白酶。
此外，在上文给出的本发明每个方面与具体实施方式中，蛋白酶基本上可以是任何重要的蛋白酶，但是优选的是天门冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、或者丝氨酸蛋白酶。使用本发明方法分析的蛋白酶基本上可以来源于任何生物，不限于此地包括哺乳动物(例如人类)、鸟、爬行动物、昆虫、植物、真菌等。在优选的具体实施方式中，蛋白酶来源于微生物，不限于此地包括细菌、真菌、酵母菌、病毒和原生动物。
6.步骤1-5的重复
本发明方法反复涉及制备在扩展结合亚位点P2、P3和P4的每个亚位点上具有所需特异性和选择性的变异体蛋白酶。在一些情况下，丝氨酸蛋白酶变异已经说明，构成活性位点(S1-S4)的每个亚位点彼此之间独立地发挥作用，因此修饰单一亚位点的变异对相邻亚位点特异性几乎不产生影响。因此，采用逐步方式，可以实现整个扩展结合位点的工程底物特异性与选择性。
然后，由底物库确定，利用对应所需断裂序列的单个肽底物，分析匹配所需特异性评价的变异蛋白酶。还可以分析变异体蛋白酶，从而确定其断裂了全长蛋白范围内存在的所需序列。还可以分析靶蛋白的活性，从而证实其功能已经被断裂结果破坏。在用变异体蛋白酶培养提纯的全长蛋白后，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定断裂结果。
在另一具体实施方式中，组合变异体蛋白酶，从而获得多种蛋白酶的特异性。在一个位点产生特异性的支架单一残基变异可以与相同蛋白酶支架另一个位点的另一个变异组合，生成组合特异性蛋白酶。相同支架分散位点上任何数量的变异可以用于产生组合特异性蛋白酶。在一具体实施方式中，粒酶B支架位置99从异亮氨酸到丙氨酸的变异与位置218从天门冬酰胺到丙氨酸的变异组合，生成了组合特异性蛋白酶I99A/N218A粒酶B，其特性在本文中已详细描述。
采用下述标准鉴别靶向断裂与钝化的蛋白：(1)蛋白涉及病症；(2)强烈的证据表明，蛋白是治疗病症的重要插入点；(3)蛋白溶解断裂此蛋白极大可能地破坏了其功能。采用下列标准鉴别靶蛋白内部的断裂位点：(1)断裂位点位于蛋白的裸露表面；(2)按照原子结构或者结构预测算法(这些区域趋于在蛋白表面呈环型或者在细胞表面受体上呈茎状)，断裂位点位于缺少第二结构的区域内(即，不含有β折叠或者α螺旋)；(3)基于其公知的功能断裂位点位于有可能钝化蛋白的位点上。断裂序列可以是，例如匹配许多丝氨酸蛋白酶扩展底物特异性的四个残基长度，但是也可以更长些或者更短些。
在本发明另一具体实施方式中，靶蛋白辅助催化可以用于制备特异于靶蛋白的蛋白酶。在靶蛋白辅助催化中，作为丝氨酸蛋白酶催化三合体部分的不变组氨酸变异成丙氨酸，造成了蛋白酶钝化。靶蛋白适当位置的组氨酸可以起到氢受体的作用，实际上发挥了与蛋白酶中变异组氨酸相同的作用，由此保留了催化活性。然而，严格需要在底物序列(P2或者P1’)的适当位置放置组氨酸。蛋白酶底物序列结合位点的单一变异可以改变其特异性，造成其底物序列特异性的变化。利用少量变异，可以改变底物序列特异性。
使用上述方法，本领域技术人员可以鉴别和/或制备基本同源于蛋白酶支架的多种多肽或者其等位变异体，并且保留了野生型蛋白的蛋白溶解特性。在一具体实施方式中，这些支架含有下述任一种微粒的氨基酸序列：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、凝血因子、纤维蛋白溶酶、凝血因子Xa、尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、粒酶B、粒酶A、糜蛋白酶、膜型丝氨酸蛋白酶-1、组织蛋白酶G、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶、或者克鲁蛋白酶。这类多肽可以含有由其它氨基酸残基构成的靶向部分，这些氨基酸残基构成了独立折叠的结合区域。这些区域包括，例如细胞因子受体的胞外配基结合区域(例如，一种或者多种纤维结合蛋白型III区域)；免疫球蛋白区域；DNA结合区域(参见，例如He等人，《自然》1995年第378期第92-96页)；亲和标记物等。这类多肽还可以包括上文所述的其它多肽片段。
蛋白酶多肽
本发明多肽包括含有蛋白酶氨基酸序列的多肽，此蛋白酶序列出现在文中所述的任一支架中。本发明还包括变异体或者变异体蛋白酶，所述变异体或者变异体蛋白酶的任何残基是从文中所述任一支架中显示的对应残基变化而成的，同时编码蛋白的变异体或者变异体蛋白酶依旧保持着蛋白酶的活性和生理功能，或者其功能片段。在优选具体实施方式中，如文中所述，变异出现在蛋白酶S1-S4区域内。
通常，保留蛋白酶类功能的蛋白酶变异包括序列中特定位置的残基已经被其它氨基酸取代的任何变异体，还包括在母蛋白质两个残基之间插入一个或者多个额外残基的可能性，以及从母序列删除一个或者多个残基的可能性。本发明涵盖任何氨基酸的取代、插入或者删除。在优选的环境中，取代可以是上述的保守取代。
本发明一方面涉及离析蛋白酶及其生物活性部分，或者其衍生物、片段、类似物或者同系物。本发明还提供了适合用做培养抗蛋白酶抗体免疫原的多肽片段。在另一具体实施方式中，采用重组DNA技术制备蛋白酶。作为重组表达的替换方法，采用标准肽合成技术化学合成蛋白酶蛋白或者多肽。
蛋白酶蛋白的生物活性部分包括含有氨基酸序列的肽，此氨基酸序列同源于蛋白酶蛋白氨基酸序列或者从蛋白酶蛋白氨基酸序列获得，并且表现出至少一种此蛋白酶蛋白的活性，此蛋白酶蛋白含有少于全长蛋白酶蛋白的氨基酸。通常，生物活性部分含有具有至少一种此蛋白酶蛋白活性的区域或者基序。蛋白酶蛋白的生物活性部分是，例如长度为10个、25个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个或者更多氨基酸残基的多肽。
此外，采用重组技术可以制备蛋白的其它生物活性部分，蛋白的其它区域被删除，并且可以评价评价天然蛋白的一种或者多种功能活性。
在一具体实施方式中，蛋白酶含有文中所述一种支架或者此支架一种变异体的氨基酸序列。蛋白酶蛋白基本同源于文中所述一种支架或者此支架的一种变异体，并且保留了此蛋白的功能活性，然而由于天然等位基因变异或者诱发变异氨基酸序列存在差异。相应地，在另一具体实施方式中，蛋白酶含有至少大约45％同源于文中所述一种支架或者此支架一种变异体的氨基酸序列，并且保留了文中所述一种支架或者此支架一种变异体的功能活性。在一优选具体实施方式中，蛋白酶含有至少大约90％同源于文中所述一种支架的氨基酸序列。在另一优选具体实施方式中，蛋白酶含有至少大约95％同源于文中所述一种支架的氨基酸序列。在一优选具体实施方式中，蛋白酶含有至少大约99％同源于文中所述一种支架的氨基酸序列。
测定两种或者多种序列的同源性
为了确定两个氨基酸序列或者两个核酸的同源百分率，排列两个序列以获得最佳比较效果(例如，为了获得最佳排列将第二氨基酸或者核酸序列导入第一氨基酸或者核酸序列的间隙中)。然后，比较对应氨基酸位置或者核苷酸位置的氨基酸残基或者核苷酸。当第一序列一个位置被第二序列对应位置相同的氨基酸残基或者核苷酸占据，那么两分子在此位置同源(即，文中所用的氨基酸或者核酸“同源”等同于氨基酸或者核酸“相同”)。
以两序列之间的相同程度确定核酸序列的同源性。使用本领域公知的计算机程序确定同源性，例如GCG程序包提供的GAP软件。参见，Needleman和Wunsch，1970年期刊《分子生物学》第48期第443-453页。使用GCG GAP软件，带有针对核酸序列比较的下列设置：GAP生成损失5.0和GAP扩展损失3.0，涉及上述表现相同程度优选至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、或者99％的类似核酸序列编码区域。
名词“序列相同”指的是，在对比的特定区域中以残基对残基为基础两个多核苷酸或者多肽序列相同的程度。名词“序列相同百分比”是由下述步骤计算获得：先将最佳排列的两个序列基于对比区域进行比较；再确定两个序列中出现相同核酸碱基的位置数量(例如，对于核酸，可以是A、T、C、G、U或者I)，获得匹配位置的数量；将匹配位置的数量除以对比区域的总位置数量(即窗口大小)；最后，以100乘以所得结果，获得序列相同的百分比。文中所用的名词“基本相同”表示多核苷酸序列的特征，其中与参照序列基于对比区域相比，多核苷酸含有至少80％相同的序列，优选的是含有至少85％相同的序列，并且经常含有90-95％相同的序列，更经常含有至少99％相同的序列。
嵌合体蛋白与融合蛋白
本发明还提供了蛋白酶的嵌合体蛋白或者融合蛋白。如文中所用，蛋白酶“嵌合体蛋白”或者“融合蛋白”含有可操作地连接非蛋白酶多肽的蛋白酶多肽。“蛋白酶多肽”指的是含有对应文中所述一种支架或者此支架一种变异体氨基酸序列的多肽，而“非蛋白酶多肽”指的是含有对应与文中所述任一种支架非同源蛋白的氨基酸序列的多肽，即蛋白与支架相区别并且蛋白可以从相同或者不同的有机体获得。在蛋白酶融合蛋白中，蛋白酶多肽可以对应于所有或者部分的蛋白酶蛋白。在一具体实施方式中，蛋白酶融合蛋白含有蛋白酶蛋白的至少一个生物活性部分。在另一具体实施方式中，蛋白酶融合蛋白含有蛋白酶蛋白的至少两个生物活性部分。在另一具体实施方式中，蛋白酶融合蛋白含有蛋白酶蛋白的至少三个生物活性部分。在融合蛋白内部，名词“可操作地连接”用于表示，蛋白酶多肽和非蛋白酶多肽相互之间框架融合。非蛋白酶多肽可以融合到蛋白酶多肽的N-末端或者C-末端。
在一具体实施方式中，融合蛋白是GST-蛋白酶融合蛋白，其中蛋白酶序列融合到GST(谷胱甘肽硫转移酶)序列的氮末端。这种融合蛋白可以有助于重组蛋白酶多肽的提纯。
在另一具体实施方式中，融合蛋白是Fc融合，其中蛋白酶序列融合到来自免疫球蛋白G的Fc区域氮末端。这种融合蛋白可以增加生命体内药效学性质。
在另一具体实施方式中，融合蛋白是在氮末端上含有异种信号序列的蛋白酶蛋白。在特定宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)中，通过使用异种信号序列可以增加蛋白酶的表达和/或分泌。
采用标准重组DNA技术，可以制备本发明的嵌合体蛋白酶或者融合蛋白。例如，采用常规技术框架连接编码不同多肽序列的DNA片段，例如通过使用平端或者交错端界标用于连接，先使用限制性内切酶消化以提供适当的界标，再适当地填入粘性末端，接着使用碱性磷酸酶处理以避免不需要的连接，最后进行酶连接。在另一具体实施方式中，采用常规技术可以合成融合基因，其中包括自动DNA合成。此外，采用锚定引物实施基因片段的PCR扩增，随后经退火和再放大生成了嵌合体基因序列(参见，例如Ausubel等人(编辑)《分子生物学的现有方案》，JohnWiley& Sons，1992年)。此外，许多表达载体是已经编码了融合部分的商品(例如，谷胱甘肽硫转移酶多肽)。编码了蛋白酶的核酸可以克隆到这样的表达载体中，以致融合部分可以与蛋白酶蛋白框架连接。
蛋白酶激动剂和对抗剂
本发明还涉及起到蛋白酶激动剂(即拟态剂)或者蛋白酶对抗剂作用的蛋白酶蛋白变异体。通过诱导变异可以制备蛋白酶蛋白变异体(蛋白酶蛋白的分散点变异或者截断)。蛋白酶蛋白激动剂可以保留与天然型蛋白酶蛋白相同的生物活性或者其子集。蛋白酶蛋白的对抗剂可以抑制天然型蛋白酶蛋白的一种或者多种活性，例如作为蛋白酶蛋白断裂相同的靶蛋白。因此，使用限定功能的变异体治疗，可以激发特殊的生物作用。在一具体实施方式中，使用具有天然型蛋白生物活性子集的变异体治疗病体，对于与使用天然型蛋白酶蛋白有关的病体具有较少的副作用。
编程性细胞死亡
抑制编程性细胞死亡的方法
本发明还包括抑制编程性细胞死亡的方法。编程性细胞死亡，也被称为程序性细胞死亡，在细胞发育、老化和多种病症中发挥作用。在发育的生命体中，包括脊椎动物和无脊椎动物，作为正常形态发生过程的一部分，在特定时间特定位置细胞死亡。编程性细胞死亡过程是以不限于此的多种作用结果为特征的。细胞失去了其细胞连接与微绒毛，细胞质浓缩，并且核染色质边缘化为许多分散物质。作为核碎片，细胞质浓缩物和线粒体、核糖体紧密压缩。在内质网膨胀并与细胞膜融合后，细胞破碎成多个膜约束泡囊，编程性细胞死亡体，通常被相临体吞噬。由于染色质断裂成低核苷酸，片段成为编程性细胞死亡最后阶段的特征，可以使用DNA断裂模型作为生命体外分析，从而确定编程性细胞程序死亡的发生(Cory，《自然》1994年第367期第317-318页)。
一方面，本发明提供了治疗或者预防编程性相关病症的方法，其中将有效治疗用量的蛋白酶抑制剂给药于病体，从而抑制编程性细胞程序死亡。病体可以是，例如任何哺乳动物，例如人类、灵长类动物(例如，人类)、小鼠、大鼠、狗、猫、奶牛、马、或者猪。名词“有效治疗”指的是足以改善编程性细胞死亡相关病症的蛋白酶抑制剂用量。
编程性相关病症包括，例如，包括AIDS和HIV的免疫缺陷疾病、衰老症、神经退化症、退化症、缺血性和再灌注细胞死亡、急性局部缺血损伤、不育症、创伤愈合等。
测定编程性细胞死亡的许多方法，包括文中所述的方法，对于本领域技术人员众所周知，且不限于此地包括采用凝胶电泳形成DNA梯型的典型方法、通过电子显微镜形态学检测的典型方法。测定编程性细胞死亡更现代更容易操作的方法是流式细胞法。流式细胞法可以迅速定量地测定编程性细胞死亡。已经公开了测定细胞内编程性细胞死亡的多种不同流式细胞法(Darzynkiewicz等人，《流式细胞法》1992年第13期，第795-808页)。大部分的这些方法通过使用各种DNA染剂(即，亚丙基(PI)、4′，6二脒基-2-苯吲哚盐酸(DAPI)、烟酸己可碱)染色，测定细胞内编程性细胞死亡的变化；然而，还开发了一些使用末端脱氧核苷酸转化酶(TUNNEL)或者切口平移分析技术(Gorczyca等人，《癌症研究》1993年第53期第1945-1951页)。最近，快速流动细胞染色法已经商业可得，此方法使用了膜联蛋白V，测定暴露在细胞表面作为编程性细胞死亡标记的磷脂酰丝氨酸。最先进的流式细胞分析法测定作为细胞经历编程性细胞死亡早期标记的半胱天冬酶-3的活性，并且实施此分析的试剂盒已经商业可得(Nicholson等人，《自然》1995年第376期第37-43页)。
可以将本发明蛋白酶给药断裂半胱天冬酶-3，由此抑制其活性。在优选的具体实施方式中，将本发明蛋白酶给药断裂半胱天冬酶-3。本发明蛋白酶还可以断裂涉及编程性细胞死亡的其它蛋白，例如人类细胞色素c、人类抗恶性贫血因子-1、人类半胱天冬酶-7、人类半胱天冬酶-6、人类半胱天冬酶-2、人类BAD、人类BID、人类BAX、人类PARP、或者人类p53。通过断裂这些蛋白酶，本发明蛋白酶由此使其钝化。通过上述方式本发明蛋白酶可以用于抑制编程性细胞死亡。
在另一方面，通过将细胞与用量足以抑制编程性细胞死亡的本发明蛋白酶相接触，抑制细胞的编程性细胞死亡。暴露于本发明蛋白酶、即与本发明蛋白酶接触的细胞群体可以是任何数量的细胞，即一个或者多个细胞，并且可以从生命体外、生命体内获得或者取自活体材料。细胞可以与蛋白酶蛋白相接触，或者由编码蛋白酶的多核苷酸转染。
诱导编程性细胞死亡的方法
本发明还可以包括诱导编程性细胞死亡的方法。在一方面，通过将用量足以诱导编程性细胞死亡的本发明蛋白酶给药，可以诱导编程性细胞死亡。病体可以是，例如任何哺乳动物，例如人类、灵长类动物(例如，人类)、小鼠、大鼠、狗、猫、奶牛、马、或者猪。在各个方面病体易感染癌症或者自免疫疾病。
本发明蛋白酶可以与抗血管原化合物共同给药。抗血管原化合物的实例不限于此地包括酪氨酸激酶抑制剂、表皮派生生长因子抑制剂、成纤维细胞生长因子抑制剂、血小板派生生长因子抑制剂、基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂、整联蛋白阻断剂、干扰素α、可诱导干扰素蛋白10、白介素-12、聚硫酸戊聚糖、环氧合酶抑制剂、非类固醇抗炎药(NSAID)、环氧合酶-2抑制剂、羧氨基三唑、四氢皮质醇、考布他汀A-4、角鲨胺、O-(氯乙酰甲酰)夫马菌素醇、沙立度胺、血管他丁、内皮他丁、肌原蛋白-1、血管内皮生长因子抗体、血小板因子4或者血小板反应素。
在一些具体实施方式中，本发明蛋白酶还可以与化学治疗化合物共同给药。化学治疗化合物的实例不限于此地包括紫杉醇、红豆杉醇、洛伐它丁、minosine、三苯氧胺、吉西他滨、5-氟尿嘧啶(5FU)、氨甲喋呤(MTX)、多西他奇、长春新碱、长春灭瘟碱、诺考达唑、替尼泊苷、依托泊苷、阿霉素、epothilone、新霉酰胺、喜树碱、道诺霉素、放线菌素D、米托蒽醌、安吖啶、表柔比星、或者伊达比星。
在另一方面，通过将细胞与用量足以诱导编程性细胞死亡的本发明蛋白酶相接触，诱导细胞的编程性细胞死亡。暴露于本发明蛋白酶、即与本发明蛋白酶接触的细胞群体可以是任何数量的细胞，即一个或者多个细胞，并且可以从生命体外、生命体内获得或者取自活体材料。细胞可以与蛋白酶蛋白相接触，或者由编码蛋白酶的多核苷酸转染。
一些疾病症状涉及受累细胞中缺陷型减量调节编程性细胞死亡的发展。例如，瘤形成至少部分归因于抗编程性细胞死亡的状态，在此状态下细胞增生信号不适当地超过了细胞死亡信号。此外，一些DNA病毒，例如爱波斯坦-巴尔病毒、非洲猪热病毒和腺病毒，寄生在宿主细胞结构中促使其自身复制。同时，调节编程性细胞死亡抑制细胞死亡，并且促使靶细胞复制病毒。此外，某些疾病症状，例如淋巴增生症状、包括抗药物癌症的癌症、关节炎、炎症、自免疫疾病等都是由细胞死亡调节的减量调节造成的。针对这类病症，需要促进编程性细胞死亡机理。
实施例
实施例1.I99A粒酶B的制备和存储
如上文所述制备野生型鼠粒酶B结构(Harris等人，期刊《生物化学》1998年第273期第27364-27373页)。向pPICZαA质粒导入下列点变异：N218A、N218T、N218V、I99A、I99F、I99R、Y174A、Y174V。通过使用引子排序5’AOX和3’AOX区域证实每个变异，然后转入X33细胞，再使用Zeocin(Invitrogen，La JollaCA)选择。对每个变异体的表达与提纯与用于野生型鼠粒酶B的前述方法相同(Harris等人，期刊《生物化学》1998年第273期第27364-27373页)。
采用位点靶向诱导变异的QuikChange(Stratagene)法，变异蛋白酶鼠粒酶B，将位置99上的异亮氨酸改变成丙氨酸。导入I99A变异的DNA引子是：CCA GCG TAT AAT TCT AAG ACA GCCTCC AAT GAC ATC ATG CTG(序列编号3)反向引子：CAG CATGAT GTC ATT GGA GGC TGT CTT AGA ATT ATA CGC TGG(序列编号5)。进行聚合酶链反应，其中包括野生型双链DNA、重叠变异的两个引子、反应缓冲液、三磷酸脱氧核糖核苷聚合酶和DNA聚合酶。在退火与扩增的30次循环后，停止反应。加入酶DpnI以消化含有修饰碱基对的野生型DNA，然后将所得的切口DNA链转入细菌。使用Zeocin选择确保只有正向克隆生长。通过排列粒酶B的基因证实变异。采用相同的方案，选择适当变化的诱变引子，制备剩余的粒酶B变异体。
采用公开的方案(Invitrogen)将含有变异体粒酶B蛋白酶的DNA转入毕赤酵母属pastoria的X33细胞，然后使用Zeocin选择正向转化细胞。接着，将克隆转移到1升培养液中，培养到细胞密度大于OD600＝1.0。然后，加入0.5％甲醇诱导蛋白表达，静置超过72小时。为了提纯变异体蛋白酶，离心培养物后收集上清液。基于重力负载使上清液流过SP-琼脂糖快速流式阳离子交换柱。柱体是由50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸、PH6.0、100mM氯化钠的溶液清洗，更严格地使用50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸、pH6.0和250mM氯化钠的溶液清洗。此蛋白是由50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸、PH6.0、1M氯化钠的溶液洗提，并且由50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸、pH6.0、2M氯化钠和0.5氢氧化钠的溶液柱清洗。所得蛋白酶的纯度小于90％。将最后所得的蛋白酶交换并浓缩到50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸、PH6.0、100mM氯化钠的溶液中，在4℃下储存。
此外，提纯后，在280nm下定量测定每个变异体的吸光率，然后如前所述使用野生型ecotin或者M84D ecotin滴定，接着，交换到50mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸、PH6.0和100mM氯化钠的缓冲液中，在4℃下储存。
实施例2.ACC位置扫描库的合成与筛选
ACC-树脂的合成
使用9-芴甲氧羰基氯(Fmoc-Cl)处理7-氨基香豆素-4-乙酸，制备7-Fmoc-氨基香豆素-4-乙酸。将7-氨基香豆素-4-乙酸(10.0克，45.6毫摩尔)和水(228毫升)混合。然后，加入小部分的碳酸氢钠(3.92克，45.6毫摩尔)，接着，加入丙酮(228毫升)。使用冰浴冷却溶液，在一小时搅拌过程中加入9-芴甲氧羰基氯(10.7克，41.5毫摩尔)。移开冰浴，过夜搅拌溶液。通过旋转蒸发去除丙酮后，过滤收集所得的粘性固体，再多次使用部分己烷清洗。使用7-Fmoc-氨基香豆素-4-乙酸缩合Rink酰胺AM树脂，制备ACC-树脂。将Rink酰胺AM树脂(21克，17毫摩尔)溶解在200毫升二甲基酰胺(DMF)中。搅拌混合物30分钟，使用过滤器套管过滤，然后，加入含有20％哌啶的二甲基酰胺(200毫升)。搅拌25分钟后，过滤树脂并用二甲基酰胺清洗三次(每次200毫升)。接着，加入7-Fmoc-氨基香豆素-4-乙酸(15克，34毫摩尔)、1-羟基苯并三唑(4.6克，34毫摩尔)、二甲基酰胺(150毫升)，随后加入二异丙基碳化二亚胺(DICI)(5.3毫升，34毫摩尔)。过夜混合所得混合物，过滤，清洗(二甲基酰胺，清洗三次每次200毫升；四氢呋喃，清洗三次每次200毫升；甲醇，清洗三次每次200毫升)，再经五氧化二磷干燥。通过9-芴甲氧羰基(Fmoc)分析测定出，所得树脂的取代水平是0.58毫摩尔/克(大于95％)。
P1-多样库合成
将单个P1-取代的Fmoc-氨基酸ACC-树脂(大约25毫克，0.013毫摩尔)加入MultiChem96孔反应装置的孔中。向含有树脂的孔中加入二甲基酰胺(0.5毫升)作为溶剂。经过过滤，加入含有20％哌啶的二甲基酰胺溶液(0.5毫升)，接着再搅拌30分钟。过滤反应单元的孔，再用二甲基酰胺清洗(清洗三次，每次0.5毫升)。为了引入随机的P2位置，使用二异丙基碳化二亚胺(390微升，2.5毫摩尔)和含有1-羟基苯并三唑(340毫克，2.5毫摩尔)的二甲基酰胺(10毫升)预活化Fmoc-氨基酸的等动力混合物[4.8毫摩尔，每孔10等份；Fmoc-氨基酸，摩尔％：Fmoc-Ala-OH，3.4；Fmoc-Arg(Pbf)-OH 6.5；Fmoc-Asn(Trt)-OH，5.3；Fmoc-Asp(O-t-Bu)OH，3.5；Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH，3.6；Fmoc-Gln(Trt)-OH，5.3；Fmoc-Gly-OH，2.9；FmocHis(Trt)-OH，3.5；Fmoc-Ile-OH，17.4；Fmoc-Leu-OH，4.9；Fmoc-Lys(Boc)-OH，6.2；Fmoc-Nle-OH，3.8；Fmoc-Phe-OH，2.5；Fmoc-Pro-OH，4.3；Fmoc-Ser(O-t-Bu)-OH，2.8；Fmoc-Thr(O-t-Bu)-OH，4.8；Fmoc-Trp(Boc)-OH，3.8；Fmoc-Tyr(O-t-Bu)-OH，4.1；Fmoc-Val-OH，11.3]。向每个孔加入上述溶液(0.5毫升)。摇摆反应单元3小时，过滤，然后用二甲基酰胺清洗(三次，每次0.5毫升)。以相同的方式插入随机的P3和P4位置。去除P4氨基酸的Fmoc，然后用二甲基酰胺清洗树脂(三次，每次0.5毫升)，再使用乙醇加帽溶液(150微升，2.5毫摩尔)、1-羟基苯并三唑(340毫克，2.5毫摩尔)、含有二异丙基碳化二亚胺(390微升，2.5毫摩尔)的二甲基酰胺(10毫升)处理。经过4小时摇摆后，使用二甲基酰胺(三次清洗，每次0.5毫升)和二氯甲烷(三次清洗，每次0.5毫升)清洗树脂，然后使用95∶2.5∶2.5的TFA/TIS/H2O溶液处理。经过一个小时培养，打开反应单元，将其放入96深孔滴定平板中，然后用额外的断裂溶液清洗孔(二次，每次0.5毫升)。浓缩收集板，使用乙醇(0.5毫升)稀释含有底物孔中的材料，然后再浓缩，并重复两遍。使用CH3CN/H2O混合物冷冻脱水每个孔的内涵物。基于单一底物产量每个孔的底物总量保守估计是0.0063毫摩尔(50％)。
P1-固定库的合成
采用所述方法，可以合成多克用量的P1-取代ACC-树脂。将Fmoc-氨基酸-取代的ACC树脂放入96孔反应单元的57个孔中：由选择19个氨基酸(删除半胱氨酸并且用蛋氨酸取代正白氨酸)的第二固定位置(P4、P3、P2)表示子文库。除了对于P2、P3、P4子文库，将单个氨基酸(5等量Fmoc-氨基酸单体，5等量二异丙基碳化二亚胺，5等量含有1-羟基苯并三唑的二甲基酰胺)、而不是等动力混合物插入空间设定的P2、P3、或P4位置外，底物的合成、加帽与断裂与文中上一部分所述的内容相同。
如上所述制备完全多样性的组合库和P1-固定组合库。将库的等份试样加入96孔平板直至250微摩尔浓度。在粒酶活性缓冲液(50毫摩尔羟乙基哌嗪乙磺酸钠、PH8.0、100毫摩尔氯化钠、0.01％吐温-20)中稀释变异体蛋白酶直至50纳摩尔到1微摩尔之间的浓度。利用对应Ac-IEPD-AMC的初始活性调节变异体蛋白酶浓度至大约等同于50纳摩尔野生型鼠粒酶B的浓度。在30℃下使用最大光谱德耳塔荧光仪(Spectra-Max Deltaflourimeter公司名词)，测定P1-Asp库的酶活性，并持续一小时。分别在3 80纳米和460纳米处测定激发与发射。
实施例3.单独动力学测定I99A粒酶B
使用最大光谱德耳塔荧光仪，实施单个动力学测定。在分析缓冲液中将每种蛋白酶稀释到50纳摩尔-1微摩尔的浓度。使用MeSO将所有ACC底物稀释到5-500微摩尔，同时将AMC底物稀释到20-2000微摩尔。每次分析物含有小于50％的MeSO。分别在380纳米和460纳米的激发与发射波长，每隔15秒测定酶活性，总共持续10分钟。在1％二甲亚砜中实施所有的分析。
这种方法可以用于筛选I99A粒酶B。在位置扫描的组合底物库中评价I99A粒酶，从而确定变异效果。如上所述制备这样的组合底物库，然后，将底物库的等份试样加入96孔平板中直至250微摩尔的最终浓度。使用粒酶活性缓冲液(50毫摩尔羟乙基哌嗪乙磺酸钠、PH8.0、100毫摩尔氯化钠、0.01％吐温-20)稀释变异体蛋白酶直至50纳摩尔-1微摩尔。利用对应Ac-IEPD-AMC的初始活性调节变异体蛋白酶浓度至大约等于50纳摩尔野生型鼠粒酶B的浓度。在30℃下使用最大光谱德耳塔荧光仪，测定P1-Asp库的酶活性，并持续一小时。分别在380纳米和460纳米处测定激发与发射。将粒酶B变异体的评价与野生型评价进行比较，从而确定之间的差别。例如，对于I99A变异体，在P2氨基酸的特异性明显差别于野生型的特异性。野生型具有广泛的选择性并且对于脯氨酸具有稍强的优先选择性，而变异体对于疏水残基、例如苯丙氨酸和酪氨酸具有强烈的优先选择性。变异体蛋白酶的选择性也发生了改变。野生型毫无目的地选择P2亚位点，水解在此位点含有任何氨基酸的底物。而I99A蛋白酶具有极强的选择性。在P2位置上，苯丙氨酸的优选选择程度比任何其它氨基酸高得多(参见上文所列的表5)。
实施例4.肿瘤坏死因子与肿瘤坏死因子受体的蛋白水解与断裂
受体断裂
将新鲜离析的中性白细胞(PMN)再次悬浮在1×107细胞/毫升含有0.2％胎儿牛血清(FCS)的RPMI1640溶液中，接着使用特异于肿瘤坏死因子受体1或者肿瘤坏死因子受体2茎部区域的各种浓度蛋白酶培养。在37℃下培养40分钟后，加入蛋白酶抑制剂停止反应，然后，使用酶联免疫吸附测定法(Roche)，定量分析释放到介质中肿瘤坏死因子受体的含量。
肿瘤坏死因子的断裂
使用各种浓度蛋白酶培养125I—肿瘤坏死因子(40,000cpm)，然后将样品放入十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)样品缓冲液中煮沸，再在12％聚丙烯酰胺凝胶上测定。在-70℃下干燥凝胶并暴露于X光照片(Kodak)。
肿瘤坏死因子结合分析
使用上述各种浓度的蛋白酶培养125I—肿瘤坏死因子或者中性白细胞。利用闪烁现象定量测定暴露于对应正常中性白细胞蛋白酶的125I—肿瘤坏死因子结合，或者暴露于蛋白酶对应中性白细胞的正常125I—肿瘤坏死因子结合。然后，通过真空抽吸清洗细胞三次，接着将30微升闪烁液(Wallac)加入每个孔中。最后，使用Wallac Microbeta闪烁计数器记录闪烁次数(由下列文献改编：van Kessel等人，期刊《免疫学》1991年第147期第3862-3868页和Porteau等人，期刊《生物化学》1991年第266期第18846-18853页)。
实施例5利用蛋白酶噬菌体展示选择能够断裂肽序列特异靶的酶
构建噬菌粒，以致其(1)运载M13噬菌体形态形成的所有基因；(2)运载与复制噬菌体源相互作用引发生成单链DNA的包装信号；(3)运载断裂的复制噬菌体源；(4)运载抗氨必西林基因。
无效的噬菌体源复制与完整的质粒源复制的组合有利于在作为质粒(作为RF，复制型，DNA)而不是噬菌体的宿主细菌中载体的增殖。因此，可以在不杀死宿主的情况下持续复制。此外，拥有质粒源意味着，可以独立地复制有效噬菌体类增殖的噬菌粒。由于抗氨必西林基因，载体可以扩增，从而增加噬菌粒DNA进入噬菌体颗粒的包装。
使用标准的克隆方法(Sidhu，《酶学方法》2000年，第328卷第333页)，可以构建蛋白酶基因与M13外壳蛋白基因3或者基因8的融合。然后，将编码蛋白酶基因变异体的组合库展示在M13表面，作为与M13外壳蛋白p3或者p8的融合，并且针对重要靶断裂对应的固定含醛肽进行面位显示。醛部分可以抑制蛋白酶断裂易断开键的能力，然而，醛部分并不干扰肽对蛋白酶的识别。具有对应固定靶肽特异性、展示变异体蛋白酶的噬菌体可以与涂布靶肽的平板结合，而非特异性噬菌体会被清洗掉。通过连续淘洗循环，可以离析对应靶序列具有增强特异性的蛋白酶。然后，可以在不含醛条件下合成靶序列，并且可以测定离析噬菌体对肽的特异性水解。
实施例6.库的合成与荧光筛选
A.P1-多样库
A(1)合成
将单个P1-取代的Fmoc-氨基酸ACC-树脂(大约25毫克，0.013毫摩尔)加入MultiChem96孔反应装置的孔中。向含有树脂的孔加入二甲基酰胺(0.5毫升)作为溶剂。然后，加入含有20％哌啶的二甲基酰胺溶液(0.5毫升)，接着再搅拌30分钟。过滤反应单元的孔，再用二甲基酰胺清洗(清洗三次，每次0.5毫升)。为了引入随机的P2位置，使用二异丙基碳化二亚胺(390微升，2.5毫摩尔)和含有1-羟基苯并三唑(340毫克，2.5毫摩尔)的二甲基酰胺(10毫升)预活化Fmoc-氨基酸的等动力混合物[4.8毫摩尔，每孔10等份；Fmoc-氨基酸，摩尔％：Fmoc-Ala-OH，3.4；Fmoc-Arg(Pbf)-OH 6.5；Fmoc-Asn(Trt)-OH，5.3；Fmoc-Asp(O-t-Bu)OH，3.5；Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH，3.6；Fmoc-Gln(Trt)-OH，5.3；Fmoc-Gly-OH，2.9；FmocHis(Trt)-OH，3.5；Fmoc-Ile-OH，17.4；Fmoc-Leu-OH，4.9；Fmoc-Lys(Boc)-OH，6.2；Fmoc-Nle-OH，3.8；Fmoc-Phe-OH，2.5；Fmoc-Pro-OH，4.3；Fmoc-Ser(O-t-Bu)-OH，2.8；Fmoc-Thr(O-t-Bu)-OH，4.8；Fmoc-Trp(Boc)-OH，3.8；Fmoc-Tyr(O-t-Bu)-OH，4.1；Fmoc-Val-OH，11.3]。向每个孔加入上述溶液(0.5毫升)。摇摆反应单元3小时，过滤，然后用二甲基酰胺清洗(三次，每次0.5毫升)。以相同的方式插入随机的P3和P4位置。去除P4氨基酸的Fmoc，然后用二甲基酰胺清洗树脂(三次，每次0.5毫升)，再使用乙醇加帽溶液(150微升，2.5毫摩尔)、1-羟基苯并三唑(340毫克，2.5毫摩尔)、含有二异丙基碳化二亚胺(390微升，2.5毫摩尔)的二甲基酰胺(10毫升)处理。经过4小时摇摆后，使用二甲基酰胺(三次清洗，每次0.5毫升)和二氯甲烷(三次清洗，每次0.5毫升)清洗树脂，然后使用95∶2.5∶2.5的TFA/TIS/H2O溶液处理。经过一个小时培养，打开反应单元，将其放入96深孔滴定平板中，然后用额外的断裂溶液清洗孔(二次，每次0.5毫升)。浓缩收集板，使用乙醇(0.5毫升)稀释含有底物的孔，然后再浓缩，并重复两遍。使用CH3CN与H2O混合物冷冻脱水每个孔的内涵物。基于单一底物产量每个孔的底物总量保守估计是0.0063毫摩尔(50％)。
A(2)库的酶公析
通过在280纳米测定吸光率确定蛋白水解酶的浓度(Gill，S.C等人，《分析生物化学》第182期第319-326页)。使用MUGB和MUTMAC，通过活性位点的滴定定量测定出催化活性的凝血因子、胰蛋白酶、uPA、tPA和胰凝乳蛋白酶的比率(Jameson，GW等人，期刊《生物化学》1973年第131期第107-117页)。
将来自PS-SCL的底物溶解在二甲亚砜中。将大约1.0×10-9摩尔的每种P1-Lys、P1-Arg、或者P1-Leu子库(361种化合物)加入96孔显微荧光板(Dynex Technologies，Chantilly，Va)的57个孔中，直至0.1微摩尔的最终浓度。将大约1.0×10-10摩尔的每种P1-多样子库(6859种化合物)加入96孔平板的20个孔中，直至每种化合物0.01微摩尔的最终浓度。加入酶(0.02-100纳摩尔)引发水解反应，然后，使用Perkin Elmer LS50B发光分光计进行荧光监测，在380纳米下监测激发光，在450或者460纳米下监测发射光。在25℃含有50毫摩尔三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔氯化钠、0.5毫摩尔氯化钙、0.01％吐温-20和1％二甲亚砜(来自底物)的PH8.0缓冲液中，实施丝氨酸蛋白酶分析。在25℃含有100毫摩尔乙酸钠、100毫摩尔氯化钠、5毫摩尔二硫苏糖醇、1毫摩尔EDTA、0.01％布里杰-35和1％二甲亚砜(来自底物)的PH5.5缓冲液中，实施半胱氨酸蛋白酶分析。
B.使用137.180底物序列的P1-多样库评价蛋白酶
为了测定所有氨基酸附着底物序列P1位点的可能性，构建P1-多样四肽库。P1-多样库由20个孔组成，其中只有P1位置选取所有的氨基酸并系统保持不变，排除半胱氨酸并且包括正白氨酸。P2、P3、P4位置是由所有氨基酸的等摩尔混合物构成，每个孔中共计6859种底物序列。评价一些丝氨酸与半胱氨酸蛋白酶，从而测定此库对识别最佳P1氨基酸的实用性。胰凝乳蛋白酶对大型疏水氨基酸表现出预期的特异性。胰蛋白酶与凝血因子对P1-碱性氨基酸表现出优先选择性(Lys＞Arg)。粒酶B，具有P1-Asp特异性唯一公知的哺乳动物丝氨酸蛋白酶，与所有其它氨基酸相比对天门冬胺酸表现出显著的优先选择性，其中也包括其它酸性氨基酸，Glu。人类中性白细胞弹性酶的P1评价对于丙氨酸和缬氨酸具有标准的优先选择性。尽管对于精氨酸具有适中的优选选择性，半胱氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶、克鲁蛋白酶表现出广泛的P1底物序列特异性，并且众所周知。
实施例7.筛选单个底物的断裂
由底物库测定出，使用对应所需断裂序列的单个肽底物，分析匹配所需特异性评价的变异体蛋白酶。使用最大光谱德耳塔荧光仪(分子设备)，进行单个动力学测试。将每个蛋白酶在测定缓冲液中稀释到5-500微摩尔浓度。使用MeSO稀释所有ACC底物到5-500微摩尔浓度，同时将AMC底物稀释到20-2000微摩尔浓度。每个分析物含有小于5％的MeSO。分别在380纳米和460纳米的激发与发射波长，每隔15秒测定酶活性，总共持续10分钟。在1％二甲亚砜中实施所有的分析。
实施例8.筛选全长蛋白的断裂
分析变异体蛋白酶，确定其断裂了全长蛋白范围内所需的序列，并且分析靶蛋白的活性，证实其功能已经被断裂结果所破坏。使用变异体蛋白酶培养提纯的全长蛋白后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法监测断裂结果。使用标准的库马西蓝染色，或者使用放射性标记蛋白通过放射自显影，或者使用适当的抗体通过蛋白质印迹，显影此蛋白。此外，如果靶蛋白是细胞表面受体，表达靶蛋白的细胞可以暴露于变异体蛋白酶。通过溶解细胞，然后利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离此蛋白，接着使用蛋白质印迹显影，测定断裂结果。此外，采用酶联免疫吸附测定法，可以定量分析由蛋白溶解释放的可溶受体。
使用上述这些技术测定肿瘤坏死因子受体1和2(TNF-R1和TNF-R2)。将新鲜离析的中性白细胞(PMN)再次悬浮在1×107细胞/毫升含有0.2％胎儿牛血清(FCS)的RPMI1640溶液中，接着使用特异于肿瘤坏死因子受体1或者肿瘤坏死因子受体2茎部区域的各种浓度蛋白酶培养。在37℃下培养40分钟后，加入蛋白酶抑制剂停止反应，然后，使用酶联免疫吸附测定法(Roche)，定量分析释放到介质中肿瘤坏死因子受体的含量。
尽管本发明已经公开了制备并使用能够断裂靶多肽序列酶的方法，很显然，在不超出本发明保护范围的情况下可以做出各种改进与修饰。
肿瘤坏死因子的断裂
使用各种浓度蛋白酶培养125I-肿瘤坏死因子(40,000cpm)，然后将样品放入十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)样品缓冲液中煮沸，再在12％聚丙烯酰胺凝胶上测定。在-70℃下干燥凝胶并暴露于X光照片(Kodak)。
肿瘤坏死因子结合分析
使用上述各种浓度的蛋白酶培养125I-肿瘤坏死因子或者中性白细胞。利用闪烁现象定量测定暴露于对应正常中性白细胞蛋白酶的125I-肿瘤坏死因子结合，或者暴露于蛋白酶对应中性白细胞的正常125I-肿瘤坏死因子结合。然后，通过真空抽吸清洗细胞三次，接着将30微升闪烁液(Wallac)加入每个孔中。最后，使用Wallac Microbeta闪烁计数器记录闪烁次数(由下列文献改编：van Kessel等人，期刊《免疫学》1991年第147期第3862-3868页和Porteau等人，期刊《生物化学》1991年第266期第18846-18853页)。
实施例9.鉴别靶蛋白并断裂其中的位点
采用下述标准鉴别靶向断裂与钝化的蛋白：(1)蛋白涉及病症；(2)强烈的证据表明，蛋白是治疗病症的重要插入点；(3)蛋白溶解断裂此蛋白极大可能地破坏了其功能。采用下列标准鉴别靶蛋白内部的断裂位点：(1)断裂位点位于蛋白的裸露表面；(2)按照原子结构或者结构预测算法(这些区域趋于在蛋白表面呈环型或者在细胞表面受体上呈茎状)，断裂位点位于缺少第二结构的区域内(即，不含有β折叠或者α螺旋)；(3)基于其公知的功能断裂位点位于有可能钝化蛋白的位点上。断裂序列可以是，例如匹配许多丝氨酸蛋白酶扩展底物特异性的四个残基长度，但是也可以更长些或者更短些。
肿瘤坏死因子和肿瘤坏死因子受体
肿瘤坏死因子(TNF)是主要由单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞产生的前炎性细胞因子。通过与两个表面结合受体的相互作用-肿瘤坏死因子受体p55(TNF-R1)和肿瘤坏死因子受体p57(TNF-R2)，肿瘤坏死因子引发了信号传导。肿瘤坏死因子在类风湿性关节炎(RA)病理生理学中发挥核心作用，并在患有类风湿性关节炎病人的滑膜与滑液中发现高浓度的肿瘤坏死因子。肿瘤坏死因子信号作用导致了其它前炎性细胞因子(Il-1、Il-6，GM-CSF)的生成，诱导产生了金属蛋白酶，例如胶原蛋白酶和基质降解酶，增加了破骨细胞活性并促进了破骨细胞的增生；所有这些效果导致了滑膜炎、组织与骨骼的破坏。两种类型的肿瘤坏死因子受体以可溶形式从细胞表面脱离，保留了其糖基结合能力。在生命体内或者生命体外这些可溶的肿瘤坏死因子受体可以使肿瘤坏死因子的活性失效，因此可以认定为是减弱细胞坏死因子信号的天然抑制剂。
血管内皮生长因子
血管内皮生长因子(VEGF)是在胚胎形成与成人生活过程中正常生成的内皮细胞特异性促分裂素。血管内皮生长因子是各种正常与病理过程中血管生成的重要介质，其中包括肿瘤发生。肿瘤血管生成是肿瘤发展成可以转移阶段的重要过程。已经鉴别出三种对于血管内皮生长因子具有高亲和力的同类受体：VEGFR-1/Flt-1、VEGF-2/KDR和VEGFR-3/Flt-4。血管内皮生长因子受体是在血管发育过程中起到信号分子作用的细胞表面受体酪氨酸激酶。
表皮生长因子受体和HER-2
受体酪胺酸激酶的ErbB族包括四个成员：表皮生长因子(Her-1)、ErbB2(Her-2)、ErbB3(Her-3)和ErbB4(Her-4)。所有成员对正常细胞生长至关重要，并且都参与了正常的细胞功能。ErbB受体、特别是表皮细胞因子受体和ErbB2，通常在人类癌症某些普通形式下解除管制。由于多种机理出现ErbB信号的失调，其中包括基因扩增，增加受体转录的变异，或者增加受体活性的变异。通过与内皮生长因子(EGF)的结合激活了ErbB受体，通过促分裂素-激活的蛋白激酶(MAPK)与活性/磷酸肌醇3-激酶(PI3-激酶)通路向下游发出信号，最终导致细胞增生、分化与血管生成。
潜在的蛋白水解断裂位点
上述蛋白的蛋白水解断裂位点汇集在表7中。
表7.所选疾病相关蛋白的断裂序列
靶  断裂序列 区域
肿瘤坏死因子α  AEAK 环 类风湿性关节炎，节段性回肠炎，炎性肠疾病，牛皮癣
肿瘤坏死因子受体1  ENVKGTED 茎部茎部
肿瘤坏死因子受体2  SPTRVSTRSTSF 茎部茎部茎部
HER-2  KFPDAEQR 茎部茎部 乳腺癌
表皮生长因子受体  KYADNGPK 茎部茎部 肺癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、头&颈癌
实施例11.粒酶BI99A/N218A变异体的断裂评价
图1显示了半胱天冬酶-3的序列，半胱天冬酶-3是涉及一些细胞类型编程性细胞死亡通路的蛋白。野生型粒酶B分别在残基175和176的天冬氨酸与丝氨酸之间断裂了半胱天冬酶-3。粒酶B在位置99和218的变异将其特异性改变成分别在残基263和264的天冬氨酸与丙氨酸之间断裂。
图2展示了聚焦在由I99A/N218A粒酶B在半胱天冬酶-3残基260-265(序列编号2)断裂的惰性序列结晶模型。在PS-SCL库中P2、P3、P4位置上带有各种残基的情况下，变异粒酶B的特异性汇集在表3A中。通过野生型和N218A/I99A粒酶B分析形式为P4-P3-P2-Asp-AMC的PS-SCL库；使用氨基酸绘制每个位置的底物特异性。与野生型的脯氨酸相比，变异体对于P2位置的苯丙氨酸表现出强出5倍的优先选择性。而且，变异体在P4位置接纳了大型疏水氨基酸，包括苯丙氨酸和亮氨酸；而野生型通常只接纳异亮氨酸和缬氨酸。
图4展示了NH2-FSFDAT-COOH(序列编号2)断裂的MALDI质谱图；NH2-FSFDAT-COOH(序列编号2)是半胱天冬酶钝化序列，由半胱天冬酶残基260-265组成。使用100纳摩尔野生型粒酶B或者1微摩尔I99A/N218A培养钝化序列18个小时。第一张照片展示了单独肽的分子量。所显示的是代表未断裂肽准确分子量的峰值。第二张照片展示了此肽与野生型粒酶B的混合结果。峰值再次表示未断裂肽的准确分子量，说明野生型粒酶B未能断裂此肽。第三张照片展示了此肽与N218A/I99A变异体粒酶B的混合结果。在此照片中，峰值已经转而代表538.04的断裂产物，代表了对于断裂肽适当尺寸(538Da)的断裂产物。变异体粒酶B有效地断裂了此肽。
图5展示了在SDS-PAGE凝胶上的三个单独反应结果。在下列条件下培养含有大约50微摩尔半胱天冬酶-3的三个单独试管：泳道1：只含有缓冲液；泳道2：野生型粒酶B；泳道3：粒酶BI99A/N218A。通过加入2倍SDS样品缓冲液终止每个反应，然后加热到95℃，接着在两性离子缓冲剂凝胶上电泳。第一泳道显示了单独的半胱天冬酶。第二泳道显示了带有野生型粒酶B的半胱天冬酶。第三泳道显示了带有变异体粒酶B的半胱天冬酶。变异体可以断裂半胱天冬酶的小亚单元。
I99/N218A粒酶B断裂并钝化了全长的半胱天冬酶-3。在未含有蛋白酶、100纳摩尔野生型粒酶B、或者1微摩尔I99/N218A粒酶B的粒酶B活性缓冲液中培养提纯的半胱天冬酶-3(2微摩尔)18小时。将10微升每个反应稀释到90微升半胱天冬酶-3的活性缓冲液中；通过Ac-DEVD-AMC断裂测定半胱天冬酶-3的活性。图6A展示了随时间绘制的半胱天冬酶-3活性的图形。I99A/N218A粒酶B将半胱天冬酶-3钝化到很低的活性水平。野生型粒酶B钝化半胱天冬酶-3，使其活性低于对照的活性；但是，不影响变异体对半胱天冬酶-3的活性。这也表现在图6B中，其中半胱天冬酶-3活性的Vmax显示了来源于图6A的数据。在变异体粒酶B存在下Vmax几乎是零，其中野生型只是对照Vmax的一半。
在含有半胱天冬酶-3的细胞溶胞产物中，变异体粒酶B还有效地抑制了半胱天冬酶-3的活性与编程性细胞死亡。在图7A中，向细胞溶胞产物加入了I99A/N218A粒酶B的显示用量后，再培养18小时。通过加入荧光底物(Ac-DEVD-AMC)至最终浓度200微摩尔，然后分析半胱天冬酶-3的活性。通过断裂活化序列(序列编号4)，在低浓度下变异体激活了半胱天冬酶-3；但是，通过断裂其钝化序列，在高浓度下变异体抑制半胱天冬酶-3。因此，I99A/N218A粒酶B在低浓度下诱导了编程性细胞死亡，但是，在高浓度下抑制编程性细胞死亡。图7A绘制了随着I99A/N218A变异体粒酶B浓度增长下半胱天冬酶-3的活性。随着在细胞溶解产物中变异体粒酶B浓度的增长，半胱天冬酶-3活性降低。
在细胞溶胞产物中加入100纳摩尔野生型粒酶B，诱导编程性细胞死亡，在含有或者不含有所示用量的I99A/N218A粒酶B条件下，通过断裂活化序列激活半胱天冬酶-3，然后，再培养18小时。通过Ac-DEVD-AMC断裂分析半胱天冬酶的活性。通过对应由I99A/N218A粒酶B诱导背景半胱天冬酶-3的活性，规范数据。如图7B所示，在增加或者不增加I99A/N218A粒酶B的浓度下，向所有样品细胞提取物加入100纳摩尔野生型粒酶B。如图7B所示，变异体粒酶B对抗野生型粒酶B通过钝化半胱天冬酶-3诱导编程性细胞死亡的效果。图7B展示了，在100纳摩尔野生型粒酶B存在下，随着变异体粒酶B浓度变化半胱天冬酶-3片段活性的图形。随着变异体粒酶B浓度的增高，半胱天冬酶-3活性降低到低于只有野生型粒酶B存在的水平。
等效方案
尽管本发明已经详细公开了特殊具体实施方式，但是通过实施例方式所做的公开仅起到说明的目的，并不对本发明所附权利要求的保护范围加以限制。本发明人认为，在不超出本发明权利要求限定保护范围的条件下，可以对本发明进行各种的替换、修改与修饰。本领域普通技术人员可以认定，参照文中所述具体实施方式的内容，筛选方法、蛋白酶支架、或者库类型的选择属于常规问题。可以认为，本发明的其它方面、优点与修饰属于所附权利要求的保护范围。

Claims (44)

1.一种鉴别断裂底物序列蛋白酶的方法，其中包括，生成蛋白酶序列库，其中相对于野生型支架序列、序列库的每个成员具有N种变异的蛋白酶支架；测定序列库每个成员断裂底物序列的活性；然后，将每个成员的活性与序列库平均活性相比较；由此a，鉴别出具有最高断裂活性的蛋白酶；其中N是正整数。
2.权利要求1的方法，其中蛋白酶是丝氨酸或者半胱氨酸蛋白酶。
3.权利要求1的方法，其中N是1。
4.权利要求1的方法，其中N是1-5的正整数。
5.权利要求1的方法，其中N是5-10的正整数。
6.权利要求1的方法，其中N是10-20的正整数。
7.权利要求1的方法，其中蛋白酶支架含有下述任一种微粒的氨基酸序列：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、凝血因子、纤维蛋白溶酶、凝血因子Xa、尿激酶型纤维蛋白酶原激活剂、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、膜型丝氨酸蛋白酶-1、粒酶B、粒酶M、弹性蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性白细胞弹性蛋白酶、血浆激肽释放酶、尿激素型纤溶酶原激活剂、补体因子丝氨酸蛋白酶、ADAMTS13、神经肽链内切酶/neprilysin、弗林蛋白酶、克鲁蛋白酶。
8.权利要求1的方法，其中靶蛋白涉及病症。
9.权利要求8的方法，其中病症是下述的一种病症：类风湿性关节炎、败血症、癌症、艾滋病、呼吸道感染、流行性感冒、心血管疾病、和哮喘。
10.权利要求8的方法，其中靶蛋白涉及产生病症的途径。
11.权利要求1的方法，其中靶蛋白涉及编程性细胞死亡。
12.权利要求11的方法，其中靶蛋白是半胱天冬酶-3。
13.权利要求1的方法，其中与序列库平均活性相比测定的蛋白酶活性增长了至少10倍。
14.权利要求1的方法，其中与序列库平均活性相比测定的蛋白酶活性增长了至少100倍。
15.权利要求1的方法，其中与序列库平均活性相比测定的蛋白酶活性增长了至少1000倍。
16.权利要求1的方法，还包括下列步骤：
提供了用断裂活性增长鉴别出的两种或者更多种蛋白酶库成员；将第一种支架的变异与第二种支架的变异相结合，生成第三种支架；鉴别上述结合是否产生了相对于底物序列增加断裂活性的组合特异性蛋白酶。
17.一种鉴别蛋白酶特异断裂的底物序列的方法，其中包括，生成底物序列库，序列库每个成员具有随机的氨基酸序列；测定蛋白酶断裂序列库每个成员的程度；因此，与序列库其它成员的平均断裂相比，检测出被最有效断裂的底物序列。
18.权利要求17的方法，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
19.权利要求17的方法，其中底物序列库的每个成员具有4个氨基酸长度。
20.权利要求17的方法，其中底物序列库的每个成员具有5-10个氨基酸长度。
21.权利要求17的方法，其中底物序列库的每个成员具有15个氨基酸长度。
22.权利要求17的方法，其中底物序列库的每个成员具有20个氨基酸长度。
23.权利要求17的方法，其中靶蛋白含有底物序列。
24.权利要求23的方法，其中靶蛋白涉及病症。
25.权利要求24的方法，其中病症是下述的一种病症：类风湿性关节炎、败血症、癌症、艾滋病、呼吸道感染、流行性感冒、心血管疾病、炎症、和哮喘。
26.权利要求24的方法，其中靶蛋白涉及产生病症的途径。
27.权利要求17的方法，其中与序列库平均活性相比、测定底物序列的断裂效率增长了至少10倍。
28.权利要求17的方法，其中与序列库平均活性相比、测定底物序列的断裂效率增长了至少100倍。
29.权利要求17的方法，其中与序列库平均活性相比、测定底物序列的断裂效率增长了至少1000倍。
30.一种治疗带有病症患者的方法，其中包括将带有N种变异的野生型蛋白酶给药患者，其中蛋白酶是以足以断裂涉及上述病症靶蛋白的用量给药，其中蛋白的断裂治疗了上述病症，并且N是正整数。
31.权利要求30的方法，其中N是1。
32.权利要求30的方法，其中N是1-5的正整数。
33.权利要求30的方法，其中N是5-10的正整数。
34.权利要求30的方法，其中N是10-20的正整数。
35.权利要求30的方法，其中病症是下述的一种病症：类风湿性关节炎、败血症、癌症、艾滋病、呼吸道感染、流行性感冒、心血管疾病、炎症、和哮喘。
36.权利要求30的方法，其中蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。
37.权利要求30的方法，其中靶蛋白造成了病症。
38.权利要求30的方法，其中患者是哺乳动物。
39.权利要求30的方法，其中患者是人类。
40.权利要求30的方法，其中靶蛋白是下述的任一种蛋白：肿瘤坏死因子受体、白介素-1、白介素-1受体、白介素-2、白介素-2受体、白介素-4、白介素-4受体、白介素-5、白介素-5受体、白介素-12、白介素-12受体、白介素-13、白介素-13受体、血小板选择蛋白、血小板选择蛋白糖蛋白配基、P物质、缓激肽、凝血因子IX、免疫球蛋白E、免疫球蛋白E受体、CCR5、CXCR4、糖蛋白120、糖蛋白41、CD4、血凝素、呼吸合胞体病毒融合蛋白、B7、CD28、CD2、CD3、CD4、CD40、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子受体、内皮生长因子、内皮生长因子受体、转化生长因子、转化生长因子受体、CCR1、CXCR3、CCR2、Src、Akt、B细胞受体-Ab1、胰高血糖素合酶激酶-3、细胞周期蛋白依赖性激酶-2和细胞周期蛋白依赖性激酶-4。
41.一种含有与粒酶B氨基酸序列95％相同多肽的组合物，其中多肽在下述位置具有至少一种变异：171、174、180、215、192、218、99、57、189、190、或者226。
42.权利要求41的组合物，其中所述变异是在99位置上由丙氨酸替换异亮氨酸。
43.权利要求41的组合物，其中所述变异是在218位置上由丙氨酸替换天冬氨酸。
44.权利要求41的组合物，其中所述变异是在99位置上由丙氨酸替换异亮氨酸，并且在218位置上由丙氨酸替换天冬氨酸。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112322722A (zh) * 2020-11-13 2021-02-05 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101132555B1 (ko) * 2002-10-02 2012-04-02 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 변경된 특이성을 갖는 프로테아제의 제조 및 선별 방법
US20060024289A1 (en) * 2002-10-02 2006-02-02 Ruggles Sandra W Cleavage of VEGF and VEGF receptor by wild-type and mutant proteases
US7939304B2 (en) * 2002-10-02 2011-05-10 Catalyst Biosciences, Inc. Mutant MT-SP1 proteases with altered substrate specificity or activity
CA2534629C (en) * 2003-08-06 2016-01-19 University Of Maryland Biotechnology Institute Engineered proteases for affinity purification and processing of fusion proteins
AU2005244271B2 (en) * 2004-04-12 2010-04-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Cleavage of VEGF and VEGF receptor by wildtype and mutant MT-SP1
WO2005100556A2 (en) * 2004-04-12 2005-10-27 Catalyst Biosciences Cleavage of vegf and vegf receptor by wild-type and mutant proteases
JP2006117594A (ja) * 2004-10-22 2006-05-11 Shiseido Co Ltd 活性型カスパーゼ−１４特異的抗体及びその作成方法
KR101314899B1 (ko) 2005-03-22 2013-10-04 로도세이야구가부시기가이샤 콜라겐 또는 히알루론산 생성을 증가시키는 펩티드
US20070093443A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Madison Edwin L Modified proteases that inhibit complement activation
EP2423307A1 (en) * 2006-06-19 2012-02-29 Catalyst Biosciences, Inc. Modified coagulation factor IV polypeptides and use thereof for treatment
KR20170014023A (ko) * 2006-07-05 2017-02-07 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 프로테아제 스크리닝 방법 및 이에 의해 확인된 프로테아제
KR20100016462A (ko) 2007-04-13 2010-02-12 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 변형 제ｖｉｉ 인자 폴리펩타이드 및 이의 용도
TWI538916B (zh) 2008-04-11 2016-06-21 介控生化科技公司 經修飾的因子vii多肽和其用途
PL4032979T3 (pl) 2008-09-15 2024-09-30 Uniqure Biopharma B.V. Mutant polipeptydu czynnika ix, jego zastosowania i sposób jego otrzymywania
US10577639B2 (en) 2009-06-26 2020-03-03 University Of Florida Research Foundation, Inc. Rapid bed-side measurement of neutrophil elastase activity in biological fluids
US20120270241A1 (en) * 2009-09-23 2012-10-25 Bryan Philip N Systems and methods for evolving enzymes with desired activities
WO2012038049A2 (en) * 2010-09-22 2012-03-29 Roche Diagnostics Gmbh Amplification of distant nucleic acid targets using engineered primers
TWI557135B (zh) 2010-11-03 2016-11-11 介控生化科技公司 經修飾之第九因子多胜肽及其用途
JP5851092B2 (ja) * 2010-12-24 2016-02-03 株式会社明治 ペプチド組成物、およびその製造方法
EP2658971A1 (en) 2010-12-28 2013-11-06 XOMA Technology Ltd. Cell surface display using pdz domains
WO2013041659A2 (en) * 2011-09-23 2013-03-28 Pharmedartis Gmbh Novel serine protease variants
CA3100606C (en) * 2012-05-25 2023-08-01 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved milk-clotting properties
CN104755492A (zh) 2012-07-25 2015-07-01 催化剂生物科学公司 修饰的因子x多肽及其应用
WO2014055836A2 (en) * 2012-10-04 2014-04-10 Research Development Foundation Serine protease molecules and therapies
UA121380C2 (uk) 2014-02-26 2020-05-25 Кр. Гансен А/С Поліпептид хімозину з удосконаленими властивостями щодо згортання молока
CA2947198C (en) * 2014-04-29 2023-01-17 Novartis Ag Novel vertebrate cells and methods for recombinantly expressing a polypeptide of interest
AU2015371265B2 (en) 2014-12-24 2021-06-03 Neximmune, Inc Nanoparticle compositions and methods for immunotherapy
EP4079849A1 (en) 2015-06-22 2022-10-26 Chr. Hansen A/S Variants of chymosin with improved properties
BR112018003493A2 (pt) 2015-08-31 2018-09-18 Chr Hansen As variantes de quimosina com propriedades aperfeiçoadas
US11702477B2 (en) 2015-11-06 2023-07-18 Orionis Biosciences BV Bi-functional chimeric proteins and uses thereof
EP3377080B1 (en) 2015-11-19 2024-02-14 Asclepix Therapeutics, LLC Peptides with anti-angiogenic, anti-lymphangiogenic, and anti-edemic properties and nanoparticle formulations
CN109071627B (zh) 2016-02-05 2023-04-04 奥里尼斯生物科学私人有限公司 Cd8结合剂
WO2017153402A1 (en) 2016-03-07 2017-09-14 Vib Vzw Cd20 binding single domain antibodies
CA3023881A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Therapeutic targeting of non-cellular structures
CA3023883A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Targeted mutant interferon-beta and uses thereof
US12019066B2 (en) * 2016-05-16 2024-06-25 Biomadison, Inc. Assay with synaptobrevin based moiety
CN109640677A (zh) 2016-05-19 2019-04-16 科·汉森有限公司 具有改善的凝乳特性的凝乳酶的变体
AR108527A1 (es) 2016-05-19 2018-08-29 Chr Hansen As Variantes de quimosina con propiedades mejoradas de coagulación de leche
SG10202103032QA (en) 2016-10-04 2021-05-28 Asclepix Therapeutics Inc Compounds and methods for activating tie2 signaling
BR102017010169A2 (pt) * 2017-05-15 2019-02-26 Remer Consultores Assessoria Empresarial Ltda. composto, intermediário de síntese, uso na preparação de anticonvulsivante, composição farmacêutica anticonvulsivante
CN110114368B (zh) 2016-10-24 2024-08-02 奥睿尼斯生物科学私人有限公司 靶向突变干扰素-γ及其用途
GB201622422D0 (en) * 2016-12-30 2017-02-15 Dublin Inst Of Tech Peptide prediction
CN110573172A (zh) 2017-02-06 2019-12-13 奥里尼斯生物科学有限公司 靶向的工程化干扰素及其用途
IL268346B2 (en) 2017-02-06 2024-08-01 Orionis Biosciences BV Targeted chimeric proteins and their uses
US11246911B2 (en) 2017-02-07 2022-02-15 Vib Vzw Immune-cell targeted bispecific chimeric proteins and uses thereof
EP3641801A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 Catalyst Biosciences, Inc. Modified membrane type serine protease 1 (mtsp-1) polypeptides and methods of use
US11674959B2 (en) 2017-08-03 2023-06-13 The Johns Hopkins University Methods for identifying and preparing pharmaceutical agents for activating Tie1 and/or Tie2 receptors
US12059476B2 (en) 2017-10-10 2024-08-13 The Johns Hopkins University Biodegradable biomimetic particles
CN108241054B (zh) * 2017-12-26 2021-03-12 天津市中西医结合医院（天津市南开医院） 检测g蛋白偶联受体18的试剂在制备败血症诊断及病程监测和预后判断试剂中表达的应用
GB201800620D0 (en) 2018-01-15 2018-02-28 Univ Manchester C3b Binding Polypeptide
US11896643B2 (en) 2018-02-05 2024-02-13 Orionis Biosciences, Inc. Fibroblast binding agents and use thereof
US11613744B2 (en) 2018-12-28 2023-03-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified urokinase-type plasminogen activator polypeptides and methods of use
JP2022516725A (ja) 2018-12-28 2022-03-02 カタリスト・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド 改変ウロキナーゼ型プラスミノゲンアクティベータポリペプチドおよび使用方法
JP2022520632A (ja) 2019-02-15 2022-03-31 インテグラル・モレキュラー・インコーポレイテッド 共通軽鎖を含む抗体及びその使用
BR112021016056A2 (pt) 2019-02-15 2021-12-14 Integral Molecular Inc Anticorpos de claudina 6 e usos dos mesmos
WO2020210455A1 (en) * 2019-04-09 2020-10-15 University Of Houston System Engineered chymotrypsins and uses thereof
CN110079514A (zh) * 2019-04-12 2019-08-02 江苏大学 一种制备蛋白酶3重组蛋白的方法
EP3833381B1 (en) 2019-08-15 2022-08-03 Catalyst Biosciences, Inc. Modified factor vii polypeptides for subcutaneous administration
GB202004514D0 (en) 2020-03-27 2020-05-13 Inst De Medicina Molecular Joaeo Lobo Antunes Treatment of Immunosuppressive Cancer
WO2024008755A1 (en) 2022-07-04 2024-01-11 Vib Vzw Blood-cerebrospinal fluid barrier crossing antibodies
WO2024118771A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Integral Molecular, Inc. Antibodies directed to claudin 6, including bispecific formats thereof
WO2024208816A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 Vib Vzw Blood-brain barrier crossing antibodies

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5801038A (en) * 1984-05-29 1998-09-01 Genencor International Inc. Modified subtilisins having amino acid alterations
US5185258A (en) * 1984-05-29 1993-02-09 Genencor International, Inc. Subtilisin mutants
DK6488D0 (da) * 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5304482A (en) * 1989-03-06 1994-04-19 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Serine protease mutants of the chymotrypsin superfamily resistant to inhibition by their cognate inhibitors
US5843693A (en) * 1989-08-16 1998-12-01 Chiron Corporation Assay method for screening for inhibitors of proTNF conversion
US6271012B1 (en) * 1989-10-11 2001-08-07 Genencor International, Inc. Protease muteins and their use in detergents
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
US6335160B1 (en) * 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5766842A (en) * 1994-09-16 1998-06-16 Sepracor, Inc. In vitro method for predicting the evolutionary response of a protein to a drug targeted thereagainst
US6165794A (en) * 1994-11-10 2000-12-26 The Regents Of The University Of California Suppression of proteolytic activity by dysfunctional protease formation
GB9618960D0 (en) * 1996-09-11 1996-10-23 Medical Science Sys Inc Proteases
US7083786B2 (en) * 1997-04-03 2006-08-01 Jensenius Jens Chr MASP-2, a complement-fixing enzyme, and uses for it
DE19743683A1 (de) * 1997-10-02 1999-04-08 Basf Ag Verfahren zur Änderung der Substratspezifität von Enzymen
US20030186329A1 (en) * 1999-03-22 2003-10-02 The Scripps Research Institute Use of substrate subtraction libraries to distinguish enzyme specificities
US20020068320A1 (en) * 2000-03-14 2002-06-06 Yanggu Shi Serine protease polynucleotides, polypeptides, and antibodies
DE19943177C2 (de) * 1999-09-09 2002-10-24 Dieter Jenne Verfahren zur Herstellung von aktiven Serienproteasen und inaktiven Varianten
US7030231B1 (en) * 1999-09-30 2006-04-18 Catalyst Biosciences, Inc. Membrane type serine protease 1 (MT-SP1) and uses thereof
US20030171252A9 (en) * 2000-01-31 2003-09-11 Rosen Craig A. Nucleic acids, proteins, and antibodies
CA2400187A1 (en) * 2000-02-11 2001-08-16 Eli Lilly And Company Protein c derivatives
US20020031801A1 (en) * 2000-03-24 2002-03-14 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 18806, a novel trypsin serine protease-like molecule and uses thereof
WO2001094332A1 (en) * 2000-06-02 2001-12-13 Regents Of The University Of California Profiling of protease specificity using combinatorial fluorogenic substrate libraries
US7157596B2 (en) * 2000-09-08 2007-01-02 Dendreon Corporation Inhibitors of serine protease activity of matriptase or MTSP1
US6797461B2 (en) * 2000-10-27 2004-09-28 Promega Corporation Tryptase substrates and assay for tryptase activity using same
US20030104591A1 (en) * 2000-12-14 2003-06-05 Murray Christopher J. Methods and compositions for grafting functional loops into a protein
US20030049689A1 (en) * 2000-12-14 2003-03-13 Cynthia Edwards Multifunctional polypeptides
US20030068792A1 (en) * 2000-12-14 2003-04-10 Yiyou Chen Targeted enzymes
WO2003089648A1 (en) * 2002-04-22 2003-10-30 Novozymes Biotech, Inc. Methods for preparing variants of a dna sequence in filamentous fungi
US20040072276A1 (en) * 2002-05-10 2004-04-15 Direvo BioTech AG. Process for generating sequence-specific proteases by directed evolution and use thereof
AU2003262937B2 (en) * 2002-08-27 2009-05-07 Bristol-Myers Squibb Company Adzymes and uses thereof
ES2343518T3 (es) * 2002-09-09 2010-08-03 Hanall Biopharma Co., Ltd. Polipeptidos interferon alfa modificados resistentes a proteasas.
US7939304B2 (en) * 2002-10-02 2011-05-10 Catalyst Biosciences, Inc. Mutant MT-SP1 proteases with altered substrate specificity or activity
US20060024289A1 (en) * 2002-10-02 2006-02-02 Ruggles Sandra W Cleavage of VEGF and VEGF receptor by wild-type and mutant proteases
KR101132555B1 (ko) * 2002-10-02 2012-04-02 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 변경된 특이성을 갖는 프로테아제의 제조 및 선별 방법
US20040115727A1 (en) * 2002-12-11 2004-06-17 Allergan, Inc., A Corporation Evolved clostridial toxins with altered protease specificity
US7335504B2 (en) * 2003-06-18 2008-02-26 Direvo Biotechnology Ag Engineered enzymes and uses thereof
CA2529589A1 (en) * 2003-06-18 2004-12-29 Direvo Biotech Ag New biological entities and the pharmaceutical or diagnostic use thereof
US7439226B2 (en) * 2003-09-30 2008-10-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Serine protease inhibitors
AU2005244271B2 (en) * 2004-04-12 2010-04-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Cleavage of VEGF and VEGF receptor by wildtype and mutant MT-SP1
EP1726643A1 (en) * 2005-05-27 2006-11-29 Direvo Biotech AG Method for the provision, identification and selection of proteases with altered sensitivity to activity-modulating substances
US7974395B2 (en) * 2005-09-28 2011-07-05 Avaya Inc. Detection of telephone number spoofing
US20070093443A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Madison Edwin L Modified proteases that inhibit complement activation
EP1976861A2 (en) * 2005-11-29 2008-10-08 The Scripps Research Institute Inhibiting tumour cell invasion, metastasis and angiogenesis through targetting legumain
KR20170014023A (ko) * 2006-07-05 2017-02-07 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 프로테아제 스크리닝 방법 및 이에 의해 확인된 프로테아제
KR20100016462A (ko) * 2007-04-13 2010-02-12 카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 변형 제ｖｉｉ 인자 폴리펩타이드 및 이의 용도
TWI557135B (zh) * 2010-11-03 2016-11-11 介控生化科技公司 經修飾之第九因子多胜肽及其用途

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112322722A (zh) * 2020-11-13 2021-02-05 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用
CN112322722B (zh) * 2020-11-13 2021-11-12 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 检测16p11.2微缺失的引物探针组合物、试剂盒及其应用

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