KR20100016462A - 변형 제ｖｉｉ 인자 폴리펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

변형 제ｖｉｉ 인자 폴리펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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KR20100016462A
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에드윈 엘. 매디슨
크리스토퍼 디. 타노스
산드라 와프 러글스
숀 코플린
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카탈리스트 바이오사이언시즈, 인코포레이티드
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Abstract

변형 제VII 인자 폴리펩타이드 및 이의 용도가 제공된다. 이러한 변형 FVII 폴리펩타이드는 제VIIa 인자 및 제VII 인자의 다른 형태를 포함한다. 변경된 활성을 보유하는, 일반적으로 증가된 응고촉진 활성을 비롯한 변경된 응고촉진 활성을 보유하는 변형 FVII 폴리펩타이드도 제공한다. 따라서, 이러한 변형 폴리펩타이드는 치료제이다.
Figure P1020097023568
제VII 인자, 응고촉진 활성, 변형 FVII 폴리펩타이드, 출혈 장애, 응고 인자

Description

변형 제ＶＩＩ 인자 폴리펩타이드 및 이의 용도{Modified factor VII polypeptides and uses thereof}
관련 출원
2007년 4월 13일에 출원된 "변형 제VII 인자 폴리펩타이드 및 이의 용도"라는 명칭 하에, 에드윈 매디슨, 크리스토퍼 타노스, 산드라 와프 러글스 및 숀 코플린의 미국 특허 임시출원 일련번호 60/923,512에 대해 우선권을 주장한다.
본 출원은 또한 미국 임시출원 일련번호 60/923,512에 대해 우선권을 주장하는, "변형 제VII 인자 폴리펩타이드 및 이의 용도"라는 명칭 하에, 에드윈 매디슨, 크리스토퍼 타노스, 산드라 와프 러글스 및 숀 코플린의, 상응하는 미국 특허 임시출원 일련번호 12/082,662에 관한 것이다.
허용된다면, 상기 각 출원들의 주제는 모두 참고 인용된다.
본 발명은 변형된 치료 단백질을 제공한다. 특히, 변형 제VII 인자 폴리펩타이드, 예컨대 제VIIa 인자 및 제VII 인자의 다른 형태, 및 이의 용도를 제공한다.
지혈은 출혈을 정지시키는 복잡한 생리 과정이다. 이 과정의 3가지 구성요소는 혈소판, 혈장 단백질, 혈관 및 내피 세포로서, 각각 조직 손상 직후의 사건들에서 중요한 역할을 하고, 정상 상황에서 응괴의 빠른 형성을 야기한다. 이에 대한 핵심은 특정 혈장 단백질(또는 응고인자)이 이전에 활성화된 다른 응고인자에 의해 "캐스캐이드(cascade)"로 후속해서 활성화되어 트롬빈을 신속하게 생성시키는 일련의 단백분해 사건인 응고 캐스캐이드이다. 이러한 캐스캐이드에 의해 생성된 다량의 트롬빈은 그 다음 피브리노겐을 응괴 형성에 필요한 피브린 펩타이드로 절단하는 기능을 한다.
응고인자는 불활성 단일쇄 자이모겐으로서 순환하고, 하나 이상의 위치에서 절단에 의해 활성화되어 이중쇄 활성화된 형태의 단백질을 생성한다. 비타민 K 의존적 혈장 단백질인 제VII 인자(FVII)는 처음에는 자이모겐으로서 혈액에서 순환한다. FVII 자이모겐은 단일 부위, Arg152-Ile153에서 단백분해 절단에 의해 활성화되어, 단일 이황화 결합에 의해 결합된 이중쇄 프로테아제(FVIIa)가 된다. FVIIa는 이의 보조인자인 조직인자(TF)와 결합하여, FVIIa가 제X 인자(FX)를 FXa로 효과적으로 활성화시킬 수 있는 복합체를 형성하여, 피브린 형성과 지혈을 초래하는 일련의 사건을 개시시킨다.
대부분의 경우에는 정상 지혈이 달성되지만, 이 과정의 결함은 응괴 형성에 장시간을 필요로 하는 출혈 장애를 야기할 수 있다. 이러한 장애는 선천적이거나 후천적일 수 있다. 예를 들어, 혈우병 A 및 B는 각각 제VIII 인자(FVIII) 및 제IX 인자(FIX)의 결핍을 특징으로 하는 유전병이다. 대체요법은 혈우병 A 및 B의 통상 적인 치료법으로서, 사람 혈장으로부터 제조되거나 또는 재조합 단백질로서 제조된 FVIII 또는 FIX의 정맥내 투여를 수반한다. 하지만, 많은 경우에, 환자들은 주입된 단백질에 대하여 항체(또한 저해제로 알려지기도 함)를 발생시켜, 치료 효능을 저감시키거나 무효화시킨다. 재조합 FVIIa(Novoseven®)는 FVIII 또는 FIX에 대한 저해제를 보유하는 혈우병 A 또는 B 환자의 치료용으로 승인을 받았고, 외상 및/또는 수술과 관련된 출혈을 방지하거나 또는 출혈 에피소드를 정지시키는데 사용되기도 한다. 또한, 재조합 FVIIa는 선천적 FVII 결핍 환자의 치료용으로 승인을 받았고, 비혈우병 환자의 다른 선천적 또는 후천적 출혈 장애, 외상 및 수술과 관련된 출혈의 치료 등과 같은 오프라벨(off-label)용으로 점점 더 많이 사용되고 있다.
응괴 형성을 촉진시키기 위한 재조합 FVIIa의 사용은 이의 치료제로서의 중요성 증가를 강조한다. FVIIa 요법은 충족되지 않은 상당한 의학적 요구를 남기고 있다. 예를 들어, 임상실험 데이터를 바탕으로, 혈우병 환자의 급성 출혈 에피소드를 치료하는 데에는 6시간 이상의 시간 기간 동안에 걸친 FVIIa의 평균 3회 용량이 필요하다. 이러한 필요를 줄이기 위해서는 더욱 효능적인 FVIIa 변이체가 필요하다. 따라서, 본 발명의 목적 중의 하나는 치료 성질을 개선시키기 위해 설계된 변형 FVII 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
개요
본 발명은 변형 제VII 인자(FVII) 폴리펩타이드를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 응고촉진(procoagulant) 활성을 나타내는 변형 FVII 폴리펩타이드를 제공한 다. FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드와 비교했을 때 1차 서열이 변형된 것으로, 아미노산 삽입, 결실 및 교체를 포함할 수 있다. 본원에서 제공되는 변형 FVII 폴리펩타이드는 조직인자 경로 저해제(TFPI)의 저해 영향에 대한 내성 증가, 안티트롬빈-III(AT-III)의 저해 영향에 대한 내성 증가, Zn2+ 결합 감소, 반감기 증가와 같은 약동학적 성질의 향상, TF의 존재 및/또는 부재 하에 촉매 활성의 증가 및/또는 활성화된 혈소판에 대한 결합 증가를 나타내는 FVII 폴리펩타이드를 포함한다. 변형 FVII 폴리펩타이드는 본 명세서에 제공된 변형들의 임의의 조합을 포함할 수 있고, 이에 따라 이 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성 또는 성질은 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 변경된다. 일반적으로, 변형 FVII 폴리펩타이드는 응고촉진 활성을 유지한다. 또한, 본 발명은 변형 FVII 폴리펩타이드를 암호화/발현하는 핵산 분자, 벡터 및 세포도 제공한다. 또한, 본 발명은 약제학적 조성물,제조품, 키트 및 치료방법도 제공한다. FVII 폴리펩타이드는 대립유전자 및 종 변이체 및 폴리펩타이드는 물론, 다른 활성 및/또는 성질에 영향을 미치는 변형을 보유하는 다른 변이체도 포함한다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 제공되는 변형을 포함하는 FVII 폴리펩타이드의 활성 단편도 포함한다. FVII 폴리펩타이드의 예에는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 이와 서열 동일성이 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상인 변이체도 포함된다.
제VII 인자(FVII) 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 1차 서열이 변형되어 있고, 아미노산 삽입, 결실 및 교체를 포함할 수 있다. 본 발명에서 제공하는 변형 FVII 폴리펩타이드는 TFPI의 저해 영향에 대한 내성 증가, AT-III의 저해 영향에 대한 내성 증가, Zn2+ 결합 감소, 반감기 증가와 같은 약동학적 성질의 향상, TF(조직인자)의 존재 및/또는 부재 하에 촉매 활성의 증가 및/또는 활성화된 혈소판에 대한 결합 증가를 나타내는 FVII 폴리펩타이드를 포함한다. 변형 FVII 폴리펩타이드는 본 명세서에 제공된 변형들의 임의의 조합을 포함할 수 있고, 이에 따라 이 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성 또는 성질은 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 변경된다. FVII 폴리펩타이드는 다른 성질 및/또는 활성을 변경시키는 다른 변형을 포함할 수 있다. 일반적으로, 변형 FVII 폴리펩타이드는 응고촉진 활성을 유지한다. 또한, 본 발명은 변형 FVII 폴리펩타이드를 암호화/발현하는 핵산 분자, 벡터 및 세포도 제공한다. 또한, 본 발명은 약제학적 조성물, 제조품, 키트 및 치료방법도 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 변형 제VII 인자(FVII) 폴리펩타이드 대립유전자 및 종 변이체 또는 이의 활성 단편이나 다른 변이체를 제공한다. 또한, 본 발명은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 보유하는 FVII 폴리펩타이드의 위치 D196, K197 또는 K199에 상응하는 위치에 있는, 또는 FVII 폴리펩타이드의 대립유전자 및 종 변이체, 활성 단편을 비롯한 FVII 폴리펩타이드 및 다른 활성 또는 성질에 대해 변형된 다른 FVII 폴리펩타이드 내의 상응하는 잔기에 있는 변형을 함유하는, FVII 폴리펩타이드의 대립유전자 및 종 변이체 또는 활성 단편을 포함하는 FVII 폴리펩타이드를 제공한다. FVII 폴리펩타이드는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 FVII 폴리펩타이드의 D196, K197 또는 K199 위치에 상응하는 위치에 또는 FVII 폴리펩타이드의 상응하는 잔기에 적어도 하나의 변형을 함유한다. 이러한 변형은 Val(V), Leu(L), Ile(I), Phe(F), Trp(W), Met(M), Tyr(Y), Cys(C), Asp(D) 및 Glu(E) 중에서 선택되는 소수성 또는 산성 아미노산에 의한 교체 및/또는 삽입이다. 활성 단편이 제공될 때, 활성 단편은 이러한 변형을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 D196F, D196W, D196L, D196I, D196Y, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199D, K199E 및 K197Y 중에서 선택되는 교체를 추가로 포함하는 변형 제VII 인자(FVII) 폴리펩타이드, 이의 대립유전자 및 종 변이체 또는 활성 단편 또는 다른 변이체도 제공한다.
또한, 제공되는 변형 FVII 폴리펩타이드는 FVII 폴리펩타이드의 다른 위치에 아미노산 교체, 삽입 또는 결실을 포함하는 추가의 변형을 함유할 수 있다. 일부 예에서, 추가의 변형은 D196, K197, K199, G237, T239, R290 및 K341 중에서 선택되는 위치에 상응하는 위치에서의 아미노산 교체이며, 이 때 제1 변형과 제2 변형은 다른 아미노산에서 이루어진다. 이러한 변형은 다음과 같은 변형을 포함할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다: D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D 및 K341Q. 아미노산 삽입인 변형의 다른 예는 다음과 같은 삽입 중 임의의 삽입을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다: G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA 및 K197I198insS. 다른 변형 FVII 폴리펩타이드의 예는 다음과 같은 변형을 포함한다: D196R/K197E/K199E, D196K/K197E/K199E, D196R/K197E/K199E/R290E, D196R/K197M/K199E, D196R/K197M/K199E/R290E, D196K/K197L, D196F/K197L, D196L/K197L, D196M/K197L, D196W/K197L, D196F/K197E, D196W/K197E, K196V/K197E, K197E/K341Q, K197L/K341Q, K197E/G237V/K341Q, K197E/K199E, K197E/G237V, K199E/K341Q 또는 K197E/K199E/K341Q.
또한, 본 발명은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 보유하는 FVII 폴리펩타이드에 또는 FVII 폴리펩타이드 내의 상응하는 잔기에 D196R, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197E, K197D, K197L, K197M, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199D, K199E, G237W, G237I, G237V, R290M, R290V, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA 또는 K197I198insS 중 어느 하나 이상에 상응하는 아미노산 변형을 함유할 수 있는, 대립유전자 및 종 변이체 또는 활성 단편 또는 다른 변이체를 비롯한 변형 FVII 폴리펩타이드를 제공한다. 또한, 이러한 변형 FVII 폴리펩타이드는 FVII 폴리펩타이드의 다른 위치에 아미노산 교체, 삽입 또는 결실을 비롯한 추가의 변형을 함유할 수도 있다. 일부 예에서, 추가의 변형은 위치 D196, Kl97, Kl99, G237, T239, R290 및 K341에 상응하는 위치에서의 아미노산 교체일 수 있고, 이러한 추가의 변형은 제1 변형과 다른 위치에서 일어난다. 예를 들어, 변형 FVII 폴리펩타이드는 추가로 D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196M, D196W, D196L, D196I, Kl97Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, Kl97I, Kl97V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D 및 K341Q 중에서 선택되는 아미노산 교체를 함유할 수 있다. 이러한 변형 FVII 폴리펩타이드의 예는 D196R/R290E, D196R/R290D, D196R/K197E/K199E, D196K/K197E/K199E, D196R/K197E/K199E/R290E, D196R/K197M/K199E, D196R/K197M/K199E/R290E, D196K/K197L, D196F/K197L, D196L/K197L, D196M/K197L, D196W/K197L, D196F/K197E, D196W/K197E, K197L/K341Q, G237V/K341Q, K197E/G237V/K341Q, K197E/K199E, K197E/G237V, K199E/K341Q, K197E/K199E/K341Q 및 K196V/K197E 중에서 선택되는 변형을 포함하는 것이다.
일부 경우에, 변형 제VII 인자(FVII) 폴리펩타이드의 대립유전자 및 종 변이체, 이의 활성 단편 또는 이의 다른 변이체를 비롯한 변형 FVII 폴리펩타이드는 FVII 폴리펩타이드에 2개 이상의 변형을 포함할 수 있고, 이러한 2개 이상의 아미노산 변형은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 보유하거나 포함하는 FVII 폴리펩타이드 중의 또는 FVII 폴리펩타이드 내의 상응하는 잔기 중의 D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196M, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D, K341Q, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA 또는 K197I198insS에 상응한다. 이러한 폴리펩타이드는 2개 이상의 변형, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개 변형을 포함할 수 있다.
이의 예는 D196R/R290E, D196K/R290E, D196R/R290D, D196R/K197E/K199E, D196K/K197E/K199E, D196R/K197E/K199E/R290E, D196R/K197M/K199E, D196R/K197M/K199E/R290E, D196K/K197L, D196F/K197L, D196L/K197L, D196M/K197L, D196W/K197L, D196F/K197E, D196W/K197E, D196V/K197E, K197E/K341Q, K197L/K341Q, G237V/K341Q, K197E/G237V/K341Q, K197E/K199E, K197E/G237V, K199E/K341Q, K197E/K199E/K341Q 및 K197E/G237V/M298Q 중에서 선택되는 변형을 포함하는 FVII 폴리펩타이드이다.
전술한 임의의 변형 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 조직인자 경로 저해제(TFPI)에 대한 내성 증가를 나타낼 수 있다. 일부 예에서, 변형 FVII 폴리펩타이드는 TFPI에 대한 내성이 적어도 약 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상이다. 또한, 이러한 변형 FVII 폴리펩타이드는 이종 Gla 도메인 또는 이의 인지질 결합 달성에 충분한 부분을 함유할 수도 있다.
또한, 본 발명은 이종 Gla 도메인 또는 이의 인지질 결합 달성에 충분한 부분, 예컨대 이종 Gla 도메인의 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 등을 함유하는 변형 FVII 폴리펩타이드도 제공한다. 위에서 언급한 임의의 모든 변형 FVII 폴리펩타이드는 Gla 교환(swap), 예컨대 본 명세서에 예시되고 기술된 Gla 교환을 포함할 수 있다.
이종 Gla 도메인은 제IX 인자(FIX), 제X 인자(FX), 프로트롬빈, 단백질 C, 단백질 S, 오스테오칼신, 기질 Gla 단백질, 성장-정지-특이적 단백질 6(Growth-arrest-specific protein 6; Gas6) 또는 단백질 Z의 Gla 도메인 중에서 선택될 수 있다. 일부 예에 따르면, 본 명세서에 제시된 변형 FVII 폴리펩타이드 중의 이종 Gla 도메인은 서열번호 110 내지 118, 120 및 121 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 또는 인지질 결합 달성에 충분한 상기 서열의 부분을 보유한다. FVII 폴리펩타이드에 대한 변형은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 보유하거나 포함하는 FVII 폴리펩타이드 또는 FVII 폴리펩타이드 내의 상응하는 잔기의 아미노산 1-45를 포함할 수 있는, 천연 FVII Gla 도메인 전부 또는 근접부를 제거하고, 이를 이종 Gla 도메인 또는 인지질 결합의 증가와 같이 인지질 결합에 영향을 미치기에 충분한 상기 도메인의 부분으로 교체하여 실시할 수 있다. 이러한 변형은 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 인지질 결합의 증가를 나타내는 변형 FVII 폴리펩타이드를 생성할 수 있다. 예를 들어, 변형 FVII 폴리펩타이드는 적어도 약 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상의 증가된 인지질 결합을 나타낼 수 있다.
변형 FVII 폴리펩타이드는 천연 FVII Gla 도메인의 전부 또는 근접부를 제거 하고, 이종 Gla 도메인 또는 인지질 결합을 실시하기에 충분한 상기 도메인의 부분으로 교체시킬 수 있다. 이러한 폴리펩타이드의 예는 천연 FVII Gla 도메인이 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 보유하거나 포함하는 FVII 폴리펩타이드 또는 FVII 폴리펩타이드 내의 상응하는 잔기에 아미노산 1-45를 포함하는 것이다. Gla 변형은 Gla 교환 FIX, Gla 교환 FX, Gla 교환 단백질 C, Gla 교환 단백질 S 및 Gla 교환 트롬빈 중에서 선택되는 변형을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
Gla 교환에 의하여, 변형 FVII 폴리펩타이드는 증가된 인지질 결합을 나타낼 수 있다. 이러한 증가는 적어도 약 또는 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상의 증가된 인지질 결합일 수 있다.
이종 Gla 도메인을 함유하는 변형 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 조직인자 경로 저해제(TFPI)에 대해 증가된 내성을 나타내거나 초래하는 위치에 추가의 변형을 함유할 수 있다. 이러한 변형의 예는 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 보유하거나 포함하는 FVII 폴리펩타이드에 또는 FVII 폴리펩타이드 내의 상응하는 잔기에 존재하는 D196, K197, K199, G237, T239, R290 및 K341 중에서 선택되는 위치의 하나 이상의 아미노산 변형(들)이다. 구체적으로, 이러한 변형은 D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196M, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D, K341Q, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA 및 K197I198insS 중에서 선택되는 하나 이상의 아미노산 변형(들)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이종 Gla 도메인을 함유하는 변형 FVII 폴리펩타이드는 D196R/R290E, D196K/R290E, D196R/R290D, D196R/ K197E/K199E, D196K/K197E/K199E, D196R/K197E/K199E/R290E, D196R/K197M/K199E 및 D196R/K197M/K199E/R290E와 같은 아미노산 교체 및/또는 삽입을 함유할 수도 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 일부 경우에, 이러한 추가의 변형은 이러한 변형을 함유하지 않는 FVII 폴리펩타이드, 즉 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 변형 폴리펩타이드의 TFPI에 대한 내성 증가를 초래한다.
전술한 임의의 변형 FVII 폴리펩타이드, 예컨대 TFPI에 대한 내성 증가 또는 인지질에 대한 결합 증가 또는 이의 임의의 조합을 나타내는 폴리펩타이드는 추가로 다른 변형, 예컨대 당업계에 기술된 임의의 변형을 함유할 수 있다. 이러한 추가의 아미노산 변형은 안티트롬빈-III(AT-III)에 대한 내성 증가, 인지질에 대한 결합 및/또는 친화성 증가, 조직인자(TF)에 대한 친화성 증가, 고유 활성 증가, 효소형성성(zymogenicity) 변경을 위한 폴리펩타이드의 입체형태 변경, 예컨대 더욱 자이모겐 유사형 또는 덜 자이모겐 유사형으로의 입체형태 변경, 프로테아제에 대한 내성 증가, 글리코실화 감소, 글리코실화 증가, 면역원성 감소, 안정성 증가 및/또는 화학 그룹 결합의 촉진일 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공되는 변형 FVII 폴리펩타이드는 서열번호 3에 제시되는 아미노산 서열을 보유하거나 포함하는 FVII 폴리펩타이드에 또는 FVII 폴리펩타이드 내의 상응하는 잔기에 존재하는 위치 Q176, M298 또는 E296에서의 변형(들)을 함유할 수 있다. 일부 예에 따르면, 변형 FVII 폴리펩타이드는 추가로 Q176A, M298Q, E296V 및/또는 E296A 중에서 선택되는 아미노산 변형을 함유할 수 있다. 다른 예에 따르면, 변형 FVII 폴리펩타이드는 추가로 Gla 교환 및/또는 다른 제시된 변형 외에, 다음과 같은 추가의 아미노산 변형(들) 중 하나 이상을 함유할 수 있다: S278C/V302C, L279C/N301C, V280C/V301C, S281C/V299C, 위치 4에 타이로신의 삽입, F4S, F4T, P10Q, P10E, P10D, P10N, Q21N, R28F, R28E, I30C, I30D, I30E, K32D, K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32C, K32A, K32S, D33C, D33F, D33E, D33K, A34C, A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, T37C, T37D, T37E, K38C, K38E, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, L39E, L39Q, L39H, W41N, W41C, W41E, W41D, I42R, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42K, S43Q, S43N, Y44K, Y44C, Y44D, Y44E, S45C, S45D, S45E, D46C, A51N, S53N, G58N, G59S, G59T, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, L65N, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, E82S, E82T T83K, N95S, N95T, G97S, G97T, YlOlN, D104N, T106N, K109N, El16D, Gl17N, G124N, S126N, T128N, L141C, L141D, L141E, E142D, E142C, K143C, K143D, K143E, R144E, R144C, R144D, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, Q250C, V253N, E265N, T267N, E270N, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, R277N, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, L280N, L288K, L288C, L288D, D289C, D289K, L288E, R290C, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R290D, R290E, G291E, G291D, G291C, G291N, G291K, A292C, A292K, A292D, A292E, T293K, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, P3O3S, P3O3ST, R304Y, R304F, R304L, R304M, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L3O5P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L3O5Q, M306D, M306N, D309S, D309T, Q312N, Q313K, Q313D, Q313E, S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C, V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A, K341S, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, V376N, R379N, L390C, L390K, L390D, L390E, M391D, M391C, M391K, M391N, M391E, R392C, R392D, R392E, S393D, S393C, S393K, S393E, E394K, P395K, E394C, P395D, P395C, P395E, R396K, R396C, R396D, R396E, P397D, P397K, P397C, P397E, G398K, G398C, G398D, G398E, V399C, V399D, V399K, V399E, L400K, L401K, L401C, L401D, L401E, R402D, R402C, R402K, R402E, A403K, A403C, A403D, A403E, P404E, P404D, P404C, P404K, F405K, P406C, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I3ON/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/ Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S, Y44N/D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S/, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/K316S, S314N/K316T, Q313N/R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/D343S, K341N/D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/R392S, L390N/R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S 및 P404N/P406T, Vl58D/G237V/E296V/M298Q, K197E/G237V/M298Q, K197E/G237V/M298Q/K341Q, K197E/K199E/G237V/M298Q/K341Q, G237V/M298Q, G237V/M298Q/K341Q, M298Q/Gla 교환 FIX, K197E/M298Q 및 M298Q/K341D.
본 명세서에 제공된 임의의 변형 FVII 폴리펩타이드는 안티트롬빈-III(AT-III)에 대한 내성 증가, 인지질에 대한 결합 및/또는 친화성 증가, 조직인자(TF)에 대한 친화성 증가, 고유 활성 증가, 효소형성성 변경을 위한 폴리펩타이드의 입체형태 변경, 프로테아제에 대한 내성 증가, 글리코실화 감소, 글리코실화 증가, 면역원성 감소, 안정성 증가 및/또는 화학 그룹 결합의 촉진을 야기하는 하나 이상의 추가의 아미노산 변형(들)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 효소형성성 변경은 더욱 자이모겐 유사형 또는 덜 자이모겐 유사형을 제공할 수 있다. 이러한 변형 FVII 폴리펩타이드는 예컨대 위치 300-322, 305-322, 300-312 또는 305-312의 트립신, 트롬빈 또는 FX 유래의 상응하는 아미노산으로의 치환, 또는 위치 310-329, 311-322 또는 233-329의 트립신 유래의 상응하는 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
본원에 제공된 변형 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드가 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 유일하게 이 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 변형 FVII 폴리펩타이드의 예는 서열번호 18-43, 125-150 및 206-250 중 임의의 서열번호에 제시된 아미노산 서열을 보유하거나 또는 포함하는 폴리펩타이드, 또는 이의 대립유전자 변이체 또는 종 변이체 또는 다른 변이체이다. 대립유전자 변이체 또는 종 변이체 또는 다른 변이체는 아미노산 변형(들)을 제외한, 서열번호 3에 제시된 폴리펩타이드에 대해 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 보유할 수 있다. FVII 폴리펩타이드의 급원은 사람 및 비-사람의 다른 종을 포함한다. 폴리펩타이드는 성숙 폴리펩타이드 또는 전구체 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 양태에 따르면, FVII 폴리펩타이드의 1차 서열만이 변형되어 있다. 또한, FVII 폴리펩타이드는 화학적 변형 또는 해독후 변형을 포함할 수 있고, 그 예로는 글리코실화, 카르복실화, 하이드록실화, 설폰화, 인산화, 알부민화 또는 다른 잔기, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 잔기에 대한 접합을 포함할 수 있다.
변형 FVII 폴리펩타이드는 단일쇄 폴리펩타이드로서, 또는 단일쇄와 이중쇄 또는 다중쇄 형태의 혼합물로서, 또는 이중쇄, 삼중쇄 또는 다른 다중쇄 형태로서 제공될 수 있다. 변형 FVII 폴리펩타이드는 불활성 폴리펩타이드로서 또는 활성화된 폴리펩타이드로서 제공될 수 있다. 활성화는 예컨대 자가활성화에 의한 단백분해 절단, 제IX 인자(FIXa)에 의한 절단, 제X 인자(FXa)에 의한 절단, 제XII 인자(FXIIa)에 의한 절단 또는 트롬빈에 의한 절단에 의해 달성될 수 있다.
변형 FVII 폴리펩타이드는 일반적으로 비변형 FVII 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성 또는 성질을 유지한다. 변형은 폴리펩타이드가 비변형 FVII 폴리펩타이드의 적어도 하나의 FVII 활성을 유지하는 한, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60개 아미노산 위치에서의 변형을 포함할 수 있다. 활성의 유지는 비변형 FVII 폴리펩타이드 활성의 적어도 약 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상일 수 있다. 활성은 예컨대 조직인자(TF) 결합, 제X 인자(FX) 활성화, 제IX 인자(FIX) 활성화, 인지질 결합 및 응고제 활성을 포함한다. 활성은 증가하거나 감소할 수 있다. 본원에 제공되는 변형 폴리펩타이드 중에는 응고 활성이 증가된 폴리펩타이드가 있다. 활성은 시험관내 및 생체내에서 평가될 수 있다.
또한, 본 발명은 임의의 변형 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자도 제공한다. 또한, 본 발명은 벡터, 예컨대 원핵생물 벡터 또는 진핵생물 벡터, 구체적으로 포유동물 벡터, 및 바이러스 벡터도 제공한다. 바이러스 벡터의 예로는 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스 및 사이토메갈로바이러스 벡터를 포함한다. 또한, 핵산 분자 또는 벡터를 함유하는 세포도 제공한다. 세포는 진핵생물, 예컨대 포유동물 또는 효모세포, 또는 원핵생물 세포일 수 있다. 포유동물 세포는 예컨대 어린 햄스터 신장 세포(BHK-21) 또는 293 세포 및 CHO 세포를 포함한다. 세포는 변형 FVII 폴리펩타이드가 발현되는 조건 하에서 성장될 수 있다. 분비될 수 있다. 본 발명은 이러한 세포에 의해 생성된 변형 FVII 폴리펩타이드도 제공한다.
또한, 본 발명은 본원에 제공된 변형 FVII 폴리펩타이드를 함유하는 조성물도 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 이러한 폴리펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 본원에 제공되는 변형 FVII 폴리펩타이드, 또는 핵산 분자 또는 벡터 또는 세포의 치료학적 유효 농도 또는 유효량을 약제학적으로 허용되는 비히클 내에 함유할 수 있다. 약제학적 조성물은 단일 투여량 투여 또는 다회 투여량 투여용으로 제형화할 수 있다. 약제학적 조성물은 액체, 젤 또는 고체와 같은 임의의 형태일 수 있고 캡슐, 용기 및 다른 적당한 비히클 내에 구비될 수 있다. 투여하기 전에 희석하는 형태 또는 임의의 적당한 형태로 제형화할 수 있다. 그 양은 치료받는 장애 및/또는 치료받는 개체에 따라 달라질 수 있고, 필요하다면 실험적으로 결정될 수 있다. 약제학적 조성물은 임의의 투여 경로, 예컨대 국소, 전신 또는 국부 투여를 비롯한 임의의 투여 경로용으로 제형화하거나, 또는 경구, 비강, 폐, 구강, 경피, 피하, 십이지장내, 장, 비경구, 정맥내 또는 근육내 투여용으로 제형화할 수 있다. 약제학적 조성물은 제어 방출형으로 제형화할 수 있다.
또한, 본 발명은 치료방법 및 치료에 사용되는 조성물의 용도도 제공한다. 약제학적 조성물은 활성 FVII(FVIIa)의 투여에 의한 치료를 비롯한, FVII 투여에 의해 치료되는 질환 또는 병태를 보유하는 피검체에 투여하거나 또는 투여용으로 제형화한다. 약제학적 조성물에 의한 치료는 상기 질환 또는 병태와 관련이 있는 증상을 호전시키거나 완화시킨다. 투여 후 또는 투여와 함께, FVII 매개 질환 또는 병태와 관련이 있는 증상의 변화에 대한 피검체의 모니터링을 실시할 수 있다. 치료되는 질환 또는 병태로는 혈액 응고 장애, 혈액학적 장애, 출혈성 장애(hemorrhagic disorder), 혈우병, 제VII 인자 결핍 및 출혈 장애(bleeding disorder)를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이의 예로는 혈우병 A 또는 혈우병 B 또는 혈우병 C가 있다. 혈우병은 선천적이거나 후천적일 수 있고, 그 원인은 외상이나 수술로 인한 출혈 합병증일 수 있다. 출혈은 급성 혈관절증, 혈우병 관절병증, 혈종, 혈뇨, 중추신경계 출혈, 위장 출혈 또는 뇌출혈로 나타날 수 있고, 예컨대 발치 또는 수술, 예컨대 혈관성형술, 폐수술, 복부수술, 척추수술, 뇌수술, 혈관수술, 치아수술 또는 기관 이식 수술, 예컨대 골수, 심장, 폐, 췌장 및 간장 이식 등으로부터 나타날 수 있다. 피검체는 제VIII 인자 또는 제IX 인자에 대한 자가항체를 보유할 수 있다. 치료는 1종 이상의 추가의 응고인자, 예컨대 혈장 정제형 또는 재조합 응고인자, 응고촉진제(procoagulant), 예컨대 비타민 K, 비타민 K 유도체 및 단백질 C 저해제, 혈장, 혈소판, 적혈구 및 코르티코스테로이드가 함께 동반되거나 또는 연속해서 또는 간헐적으로 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 이러한 다른 응고인자를 함유하는 조성물과 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 포장재와 이 포장재 내에 담긴 약제학적 조성물, 및 임의로 투여 지침서를 함유하는 제조품을 제공한다. 예를 들어, 약제학적 조성물 중의 변형 FVII 폴리펩타이드는 FVII 매개 질환 또는 장애의 치료용일 수 있고, 포장재는 변형 FVII 폴리펩타이드가 FVII 매개 질환 또는 장애의 치료용으로 사용됨을 나타내는 라벨을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 약제학적 조성물과 이 조성물의 투여용 장치 및 임의로 투여 지침서를 함유하는 키트도 제공한다.
도 1은 응고 캐스캐이드를 도시한 것이다. 이 도면은 FXa의 독립 생산하는 응고의 내인성 및 외인성 경로와 이 경로들이 공통 경로로 수렴되어 응괴 형성을 위한 트롬빈과 피브린을 생성함을 나타낸다. 이 경로들은 상호연관성이 있다. 이 도면은 자이모겐이 하나 이상의 펩타이드 결합의 절단에 의해 활성화된 프로테아제로 전환되는 활성화 캐스캐이드에 관여하는 분자의 순서를 나타낸다. 활성화된 프로테아제는 그 다음 캐스캐이드에서 다음 자이모겐 분자에 대한 활성화 프로테아제로서 작용하여, 종국에는 응괴를 형성시킨다.
도 2는 세포를 기반으로 한 응고 모델을 도시한 것이다(예컨대, Hoffman et al.(2001) Thromb Haemost 85: 958-965). 이 도면은 TF 보유 세포 상에 존재하는 TF/FVIIa 복합체에 의한 FX의 FXa로의 활성화에 의해 응고 개시가 실시되어 FXa/FVa에 의한 활성화 후 소량의 트롬빈이 생성되는, 3 단계로 분리된 응고 사건을 도시한 것이다. 트롬빈이 혈소판에 결합하여 혈소판을 활성화시킬 때 증폭이 일어나고, 이 증폭은 적당한 응고인자의 충분한 양의 활성화를 개시시켜 FVIIIa/FIXa 및 FVa/FXa 복합체를 형성시킨다. 상해 부위에 있는 다수의 활성화된 혈소판의 표면에서는 응고의 전파가 일어나서, 상해 부위에 응괴를 형성시키기에 충분한 피브린을 피브리노겐으로부터 생성시키기에 충분히 많은 폭발적인 트롬빈 생성을 야기한다.
도 3은 FVIIa가 트롬빈 형성을 개시시킬 수 있는 기전을 도시한 것이다. 이 도면은 TF 보유 세포의 표면에서 작용하고 FX의 FXa로의 활성화 전에 TF와 FVIIa의 복합체화를 수반하는 FVIIa 트롬빈 생성의 TF 의존적 경로를 예시한다. 또한, 이 도면은 FVIIa 트롬빈 생성의 TF 독립적 경로도 도시하고 있고, 이 경로 동안 FVIIa는 활성화된 혈소판 상의 인지질에 결합하고 FX를 FXa로 활성화시키며, 그 다음 FVa와 복합체를 형성하여 프로트롬빈을 트롬빈으로 절단한다.
도 4는 TFPI/FXa 복합체가 TF/FVIIa 복합체에 결합할 때 나타나는 4차 저해성 복합체를 도시한 것이다. TFPI는 3개의 쿠니츠(Kunitz) 도메인을 함유한다. 쿠니츠 도메인 2(K-2)는 FXa와 상호작용하여 FXa를 저해하는 반면, 쿠니츠 도메인(K-1)은 FVIIa와 상호작용하여 FVIIa를 저해한다.
도 5는 (a) BPTI5L15(서열번호 106의 아미노산 위치 1 내지 55) 및 TFPI-2(서열번호 105의 아미노산 위치 14-65), 및 (b) TFPI-1(서열번호 102의 아미노산 위치 26-76) 및 TFPI-2(서열번호 105의 아미노산 위치 14-65)의 제1 쿠니츠 도메인의 아미노산 서열을 정렬하고 보존적 아미노산을 나타낸 것이다.
도 6은 FVIIa와 TFPI 간의 상호작용의 계면에 있는 접촉 잔기를 결정하는데 사용된 상동성 모델을 도시한 것이다. TFPI-2의 쿠니츠 도메인 1(K1)의 구조는 트 립신/TFPI 복합체 결정 구조에서 취해서 TF/FVIIa/BPTI5L15 결정 구조 상의 BPTI5L15 위에 모형을 만들었다. 이 모형에 TFPI-1 K1의 상응하는 아미노산을 맞추기 위해 컴퓨터 모의실험으로(in silico) 돌연변이유발을 수행했다. 단백질-단백질 계면에서 TFPI와의 상호작용에 관련된 것으로 보이는 FVIIa의 접촉 잔기를 확인하여, TFPI 내성 FVII 폴리펩타이드의 개발에 있어서 돌연변이유발을 위한 후보로 확립시켰다.
도 7은 FVIIa와 TFPI 간에 모형화된 상호작용을 도시한 것이다. 구체적으로, 이 도면은 FVIIa와 TFPI 상호작용의 계면에 존재하는 FVII 접촉 잔기, 및 이에 대해 상보성 정전기적 접촉부를 형성하는 상응하는 TFPI 접촉 잔기를 도시한다.
개요
A. 정의
B. 지혈 개론
1. 혈소판 부착 및 응집
2. 응고 캐스캐이드
a. 개시
b. 증폭
c. 전파
3. 응고 조절
C. 제VII 인자(FVII)
1. FVII 구조 및 체제
2. 해독후 변형
3. FVII 프로세싱
4. FVII 활성화
5. FVII 기능
a. 조직인자 의존적 FVIIa 활성
b. 조직인자 독립적 FVIIa 활성
6. 생물약제로서의 FVII
D. 변형 FVII 폴리펩타이드
1. 저해제에 대한 내성
a. TFPI
TFPI에 대한 내성을 증가시키는 변형
b. 안티트롬빈 III(AT-III)
AT-III에 대한 내성을 증가시키는 변형
2. 활성화된 혈소판에 대한 결합
이종 Gla 도메인의 도입에 의한 변형
3. 조합 및 추가의 변형
a. 고유 활성을 증가시키는 변형
b. 프로테아제에 대한 내성을 증가시키는 변형
c. 인지질에 대한 결합을 증가시키는 변형
d. 글리코실화를 변경시키는 변형
e. 화학 그룹 결합을 용이하게 하는 변형
f. 예시적 FVII 조합 돌연이체
E. FVII를 변형시키는 설계 및 방법
1. 추론적
2. 실험적(즉, 선별)
a. 무작위 돌연변이유발
b. 초점식 돌연변이유발
c. 선별
3. FVII 변이체 선택
F. FVII 폴리펩타이드의 생산
1. 벡터 및 세포
2. 발현계
a. 원핵생물 발현
b. 효모
c. 곤충 및 곤충 세포
d. 포유동물 세포
e. 식물
2. 정제
3. 융합 단백질
4. 폴리펩타이드 변형
5. 뉴클레오타이드 서열
G. 변형 FVII 폴리펩타이드 활성 평가
1. 시험관내 분석
a. 해독후 변형
b. 단백분해 활성
c. 응고 활성
d. 다른 단백질에 결합 및/또는 다른 단백질에 의한 저해
e. 인지질 결합
2. 비-사람 동물 모델
3. 임상 분석
H. 제형 및 투여
1. 제형
a. 투여량
b. 투여 형태
2. 변형 FVII 폴리펩타이드의 투여
3. 변형 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여(유전자 요법)
I. 치료 용도
1. 선천적 출혈 장애
a. 혈우병
b. FVII 결합증
c. 기타
2. 후천적 출혈 장애
a. 화학요법 획득성 혈소판감소증
b. 기타 응고병증
c. 이식 획득성 출혈
d. 항응고제 요법 유도성 출혈
e. 후천적 혈우병
3. 외상 및 수술 출혈
J. 병용 요법
K. 제조품 및 키트
L. 실시예
A. 정의
다른 언급이 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적, 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 숙련된 자가 일반적으로 이해하고 있는 바와 같은 의미이다. 모든 특허, 특허출원, 공개공보 및 간행물, 진뱅크(Genbank) 서열, 데이터데이스, 웹사이트 및 본 명세서를 통해 언급된 기타 공개 자료는 다른 언급이 없는 한, 전문이 참고인용되었다. 본 명세서에서 용어들에 대한 정의가 여러 개인 경우에는, 본 섹션의 정의가 우세하다. URL 또는 이러한 다른 식별자 또는 주소를 참고로 하는 경우에, 이러한 식별자는 변경될 수 있고 인터넷에서의 특정 정보는 등록 및 삭제될 수 있지만, 인터넷을 조사하면 동등한 정보를 찾을 수 있다. 이에 대한 언급은 이러한 정보의 이용가능성 및 대중 보급성을 입증한다.
본 명세서에 사용된 응고 경로 또는 응고 캐스캐이드는 불용성 피브린 응괴의 형성을 야기하는 활성화 사건의 시리즈를 의미한다. 응고 캐스캐이드 또는 경로에서 세린 프로테아제의 불활성 단백질(자이모겐이라고도 불림)은 하나 이상의 펩타이드 결합의 절단에 의해 활성 프로테아제로 전환되고, 이어서 캐스캐이드 중의 다음 자이모겐 분자에 대한 활성화 프로테아제로 작용한다. 캐스캐이드의 최종 단백분해 단계에서 피브리노겐은 트롬빈에 의해 피브린으로 단백분해 절단되고, 이 피브린은 상해 부위에서 가교결합하여 응괴를 형성한다.
본 명세서에 사용된 "지혈"은 기관이나 신체 부위에서의 출혈 또는 혈류의 정지를 의미한다. 지혈이란 용어는 혈관 상해 후 혈액 상실을 방지하는 혈괴화부터 조직 수복 후 혈괴의 후속 용해까지의 전 과정을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "응고(clotting)" 또는 "응고(coagulation)"는 불용성 피브린 응괴의 형성 또는 혈액의 응고인자가 응고 캐스캐이드에서 상호작용하여, 결국 불용성 피브린 응괴를 형성시키는 과정을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "프로테아제"는 공유 펩타이드 결합의 가수분해를 촉진시키는 효소이다. 이 명칭은 자이모겐 형태 및 이의 활성화된 단일쇄, 이중쇄 및 다중쇄 형태를 포함한다. 분명히 말하면, 프로테아제에 대한 언급은 모든 형태를 의미한다. 프로테아제는 활성 부위의 촉매 활성 및 표적 기질의 펩타이드 결합을 절단하는 기전에 따라서, 예컨대 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 트레오닌 및 메탈로프로테아제를 포함한다.
본 명세서에 사용된 세린 프로테아제 또는 세린 엔도펩티다제는 이 효소의 활성 부위에 세린 잔기의 존재를 특징으로 하는 펩티다제 부류를 의미한다. 세린 프로테아제는 체내의 광범위한 기능, 예컨대 혈액 응고 및 염증에 관여할 뿐만 아니라, 원핵생물 및 진핵생물에서 소화 효소로서 기능하다. 세린 프로테아제에 의한 절단 기전은 세린에 의한 표적화된 펩타이드 결합의 친핵성 공격을 기본으로 한다. 아스파테이트 또는 금속과 결합된 시스테인, 트레오닌 또는 물 분자 역시 이 역할을 할 수 있다. 세린, 트레오닌 및 아스파테이트의 정렬된 측쇄는 대부분의 세린 프로테아제에 공통적인 촉매성 3인조를 형성한다. 세린 프로테아제의 활성 부위는 폴리펩타이드 기질이 결합하는 틈(cleft)으로 형성되어 있다.
본 명세서에 사용된 제VII 인자(FVII, F7; 제7 인자, 응고인자 VII, 혈청 인자 VII, 혈청 프로트롬빈 전환 촉진인자, SPCA, 프로컨버틴 및 엡타코그 알파(eptacog alpha)라고도 불림)는 응고 캐스캐이드의 부분인 세린 프로테아제를 의미한다. FVII는 Gla 도메인, 2개의 EGF 도메인(EGF-1 및 EGF-2), 및 키모트립신과 같은 세린 프로테아제의 펩티다제 S1 패밀리의 모든 구성원들 중에서 매우 보존적인 세린 프로테아제 도메인(또는 펩티다제 S1 도메인)을 포함한다. 시그널 펩타이드와 프로펩타이드를 보유하는 예시적 전구체 FVII의 서열은 서열번호 1에 제시되어 있다. 성숙 FVII 폴리펩타이드의 예는 서열번호 3에 제시되어 있다. FVII는 단이로새 자이모겐, 자이모겐 유사 이중쇄 폴리펩타이드 및 완전 활성화된 이중쇄 형태로 나타난다. 자이모겐 유사 형태로부터 입체형태 변화 시에 나타나는 완전 활성화는 보조인자 조직인자에 결합 후에 나타난다. 또한, 조직인자의 부재 시에 입체형태 변화를 초래하는 돌연변이가 도입될 수도 있다. 따라서, FVII에 대한 언급은 이의 단일쇄 및 이중쇄 형태, 예컨대 자이모겐 유사 및 완전 활성화된 이중쇄 형태를 포함한다.
또한, FVII 폴리펩타이드에 대한 언급은 단일쇄 또는 이중쇄 형태의 전구체 폴리펩타이드 및 성숙 FVII 폴리펩타이드, 활성을 보유하는 이의 절두형을 포함하고, 대립유전자 변이체 및 종 변이체, 스플라이싱 변이체에 의해 암호화된 변이체, 및 기타 변이체, 예컨대 서열번호 1에 제시된 전구체 폴리펩타이드 또는 이의 성숙 형태와 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 보유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한, 변형 FVII 폴리펩타이드, 예컨대 서열번호 18-43, 125-150 또는 206-150의 폴리펩타이드 및 이의 변이체도 포함한다. 또한, 적어도 하나의 FVII 활성, 예컨대 TF 결합, 제X 인자 결합, 인지질 결합 및/또는 FVII의 응고제 활성을 유지하는 폴리펩타이드도 포함한다. 활성 유지란, 유지되는 활성의 수준이 검출가능한 효과를 나타내기에 충분하기만 하다면 야생형 FVII에 비해 감소 또는 증가되는 것과 같이 변경될 수 있다. FVII 폴리펩타이드는 조직 특이적 이소폼 및 이의 대립유전자 변이체, 핵산의 해독에 의해 제조된 합성 분자, 화학적 합성, 예컨대 재조합 방법을 통해 짧은 폴리펩타이드의 연결을 포함하는 합성에 의해 생성된 단백질, 사람 및 비-사람의 조직 및 세포로부터 분리된 단백질, 키메릭 FVII 폴리펩타이드 및 이의 변형 형태를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, FVII 폴리펩타이드는 전체 길이의 성숙 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성(필요하다면 활성화 후에)을 유지하기에 적당한 영역을 포함하거나 충분한 길이인 FVII의 단편 또는 부분(portion)를 포함한다. 또한, FVII 폴리펩타이드는 화학적 변형 또는 해독후 변형을 함유하는 폴리펩타이드 및 화학적 또는 해독후 변형을 함유하지 않는 폴리펩타이드도 포함한다. 이러한 변형으로는, 페길화, 알부민화, 글리코실화, 파네실화, 카르복실화, 하이드록실화, 인산화 및 당업계에 공지된 다른 폴리펩타이드 변형을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
FVII 폴리펩타이드의 예에는 사람을 비롯한 포유동물 기원의 폴리펩타이드가 있다. 사람 기원의 FVII의 아미노산 서열의 예는 서열번호 1, 2 및 3에 제시되어 있다. 이러한 사람 FVII 폴리펩타이드의 변이체 예로는 서열번호 44-100에 제시된 임의의 전구체 폴리펩타이드를 포함한다. 또한, FVII 폴리펩타이드는 임의의 비-사람 기원의 폴리펩타이드, 예컨대 비제한적으로 쥐, 개, 고양이, 토끼, 조류, 소, 양, 돼지, 말, 물고기, 래닌(ranine) 및 다른 영장류 제VII 인자 폴리펩타이드도 포함한다. 비-사람 기원의 FVII 폴리펩타이드의 예로는 소(Bos taurus, 서열번호 4), 마우스(Mus musculus, 서열번호 5), 피그미 침팬지(Pan paniscus, 서열번호 6), 침팬지(Pan troglodytes, 서열번호 7), 토끼(Oryctolagus cuniculus, 서열번호 8), 래트(Rattus norvegicus, 서열번호 9), 리서스 마카크(Macaca mulatta, 서열번호 10), 돼지(Sus scrofa, 서열번호 11), 개(Canis familiaris, 서열번호 12), 제브라피쉬(Brachydanio rerio, 서열번호 13), 일본 복어(Fugu rubripes, 서열번호 14), 닭(Gallus gallus, 서열번호 15), 오랑우탄(Pongo pygmaeus, 서열번호 16) 및 고릴라(Gorilla gorilla, 서열번호 17)를 포함한다.
당업자는, 성숙 제VII 인자 폴리펩타이드(서열번호 3)의 언급된 위치가 시그널 펩타이드와 프로펩타이드 서열을 함유하는 이소폼 a 제VII 인자 폴리펩타이드인 서열번호 1에 제시된 이소폼 a 전구체 FVII 폴리펩타이드와 비교했을 때 60개 아미노산 잔기만큼 차이가 있음을 인정한다. 즉, 서열번호 3의 제1 아미노산 잔기는 서열번호 1의 61번째 아미노산 잔기에 "상응한다". 또한, 당업자는 성숙 제VII 인자 폴리펩타이드(서열번호 3)의 언급된 위치가 시그널 펩타이드와 프로펩타이드 서열을 함유하는 이소폼 b 제VII 인자 폴리펩타이드인 서열번호 2에 제시된 전구체 FVII 폴리펩타이드와 비교했을 때 38개 아미노산 잔기만큼 차이가 있음을 인정한다. 따라서, 서열번호 3의 제1 아미노산 잔기는 서열번호 2의 39번째(39th) 아미노산 잔기에 "상응한다".
본 명세서에 사용된, 상응하는 잔기는 정렬된 유전자좌에서 나타나는 잔기를 의미한다. 관련 또는 변이체 폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 정렬된다. 이러한 방법은 일반적으로 정합수(matches)를 최대화하고, 수동 정렬 이용 및 이용가능한 다수의 정렬 프로그램(예컨대, BLASTP) 이용 및 당업자에게 공지된 기타 방법의 이용과 같은 방법을 포함한다. 폴리펩타이드 서열의 정렬을 통해, 당업자는 가이드로서 보존적인 동일 아미노산 잔기를 사용하여 상응하는 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들어, 제VII 인자 폴리펩타이드의 서열을 정렬함으로써, 당업자는 가이드로서 보존적인 동일 아미노산 잔기를 사용하여 상응하는 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 3(성숙 제VII 인자)의 아미노산 위치 1(A1)의 알라닌은 서열번호 1의 아미노산 위치 61(A61)의 알라닌 및 서열번호 2의 아미노산 위치 39(A39)의 알라닌에 상응한다. 다른 경우에도 상응하는 영역이 확인될 수 있다. 예를 들어, Gla 도메인은 서열번호 3의 아미노산 위치 A1부터 F45, 서열번호 1의 아미노산 위치 A61부터 S105, 및 서열번호 2의 아미노산 위치 A39 내지 S83에 상응한다. 또한, 당업자는 사람 서열과 비-사람 서열 간에 상응하는 아미노산 잔기를 찾기 위한 가이드로서 보존적 아미노산 잔기를 이용할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 3(사람)의 아미노산 잔기 S43 및 E163은 서열번호 4(소)의 S83 및 E203에 상응한다. 또한, 상응하는 위치는 단백질 구조의 컴퓨터 모의 정렬 등을 통해 구조적 정렬을 기초로 할 수 있다. 다른 경우에는, 상응하는 영역이 확인될 수도 있다.
본 명세서에 사용된 "전구영역(proregion)", "프로펩타이드" 또는 "전구서열"은 절단되어 성숙 단백질을 생산하는 영역 또는 분절을 의미한다. 이것은 촉매 기구를 은폐하여 촉매 중간체의 형성을 방지하여(즉, 기질 결합 부위를 입체적으로 차단하여) 단백분해 활성을 억제하는 기능을 하는 분절을 포함할 수 있다. 전구영역은 성숙한 생물학적 활성 폴리펩타이드의 아미노 말단에 위치한 아미노산 서열이며 수개의 아미노산만큼 작을 수도 있고, 또는 다중도메인 구조일 수도 있다.
본 명세서에 사용된 "성숙 제VII 인자"는 시그널 서열과 프로펩타이드 서열이 없는 FVII 폴리펩타이드를 의미한다. 일반적으로, 시그널 서열은 소포체(ER)-골지 경로를 통해 분비되는 단백질을 표적으로 하고, 해독 동안 ER 내로 삽입된 후 절단된다. 따라서, 성숙 FVII 폴리펩타이드는 일반적으로 분비형 단백질이다. 일 예로서, 성숙 사람 FVII 폴리펩타이드는 서열번호 3에 제시된 것이다. 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열은 서열번호 1 및 2의 아미노산 잔기 1 내지 20에 상응하는 시그널 서열이 서열번호 3에 없다는 점에서 서열번호 1 및 2에 제시된 전구체 폴리펩타이드 서열과 상이하고; 또한 서열번호 1의 아미노산 잔기 21 내지 60에 상응하고 서열번호 2의 아미노산 잔기 21 내지 38에 상응하는 프로펩타이드 서열이 없다. 성숙 FVII 폴리펩타이드에 대한 언급은 단일쇄 자이모겐 형태와 이중쇄 형태를 포함한다.
본 명세서에 사용된, FVII에 관한 "야생형" 또는 "천연"은 사실상 사람 및 다른 동물을 비롯한 유기체 내에 존재하는 대립유전자 변이체를 포함한 천연 또는 자연 발생의 FVII 유전자에 의해 암호화된 FVII 폴리펩타이드를 의미한다. 종에 관련없이 야생형 제VII 인자에 대한 언급은 모든 종의 야생형 제VII 인자를 포함시키고자 했다. 야생형 FVII 폴리펩타이드 중에는 암호화된 전구체 폴리펩타이드, 이의 단편 및 이의 프로세싱된 형태, 예컨대 시그널 펩타이드가 없는 성숙 형태뿐만 아니라 이의 임의의 해독전 또는 해독후 프로세싱된 또는 변형된 형태가 포함된다. 또한, 천연 FVII 폴리펩타이드 중에는 글리코실화, 카르복실화 및 하이드록실화에 의한 변형을 포함한, 이에 국한되지 않는 변형에 의해 해독후 변형된 형태가 포함된다. 또한, 천연 FVII 폴리펩타이드는 단일쇄 및 이중쇄 형태도 포함한다. 예를 들어, 사람은 천연 FVII를 발현한다. 예시적 야생형 사람 FVII의 아미노산 서열은 서열번호 1, 2, 3에 제시되어 있고, 대립유전자 변이체는 서열번호 44-100에, 그리고 이의 성숙 형태가 제시되어 있다. 다른 동물들도 천연 FVII를 생산하며, 그 예로는 소(Bos taurus, 서열번호 4), 마우스(Mus musculus, 서열번호 5), 피그미 침팬지(Pan paniscus, 서열번호 6), 침팬지(Pan troglodytes, 서열번호 7), 토끼(Oryctolagus cuniculus, 서열번호 8), 래트(Rattus norvegicus, 서열번호 9), 리서스 마카크(Macaca mulatta, 서열번호 10), 돼지(Sus scrofa, 서열번호 11), 개(Canis familiaris, 서열번호 12), 제브라피쉬(Brachydanio rerio, 서열번호 13), 일본 복어(Fugu rubripes, 서열번호 14), 닭(Gallus gallus, 서열번호 15), 오랑우탄(Pongo pygmaeus, 서열번호 16) 및 고릴라(Gorilla gorilla, 서열번호 17)를 포함한다.
본 명세서에 사용된, 종 변이체는 마우스 및 사람과 같이 다른 포유동물 종을 포함하는 다른 종들 중의 폴리펩타이드 변이체를 의미한다.
본 명세서에 사용된, 대립유전자 변이체는 동일 종의 구성원들 간에 단백질 변형을 의미한다.
본 명세서에 사용된, 스플라이싱 변이체는 1종이 넘는 mRNA를 초래하는 게놈 DNA의 1차 전사체의 차등 프로세싱에 의해 생성된 변이체를 의미한다.
본 명세서에 사용된, 자이모겐은 활성화 절단과 같은 성숙화 절단을 비롯한 단백분해 절단 및/또는 다른 단백질(들) 및/또는 보조인자(들)과 복합체 형성에 의해 활성화되는 프로테아제를 의미한다. 자이모겐은 단백분해 효소의 불활성 전구체이다. 이러한 전구체는 일반적으로 활성형보다 더 크지만, 반드시 더 크지는 않다. 세린 프로테아제를 참고로 하면, 자이모겐은 특이적 절단, 예컨대 촉매적 및 자가촉매적 절단에 의해 또는 활성화 보조인자의 결합에 의해 활성 효소를 생성함으로써 활성 효소로 전환된다. 예를 들어, 자이모겐은 일반적으로 단일쇄 형태로 존재한다. 자이모겐은 일반적으로 불활성이고 하나 이상의 단백분해 부위에서 촉매적 또는 자가촉매적 절단에 의해 이중쇄와 같은 다중쇄 폴리펩타이드를 생성하여 성숙 활성 폴리펩타이드로 전환될 수 있다. 따라서, 자이모겐은 활성인자의 작용에 의해 단백분해 효소로 전환되는 효소적 불활성 단백질이다. 절단은 자가활성화에 의해 달성될 수 있다. 다수의 응고 단백질은 자이모겐이고; 이들은 불활성이지만, 혈관 손상 후 응고계의 개시 후 절단되어 활성화된다. FVII 폴리펩타이드에 관하여, 이는 혈장에 자이모겐으로 존재하고, 아프로테아제(aprotease), 예컨대 활성화된 제IX 인자(FIXa), 활성화된 제X 인자(FXa), 활성화된 제XII 인자(FXIIa), 트롬빈에 의해, 또는 자가활성화에 의해 절단되어 자이모겐 유사 이중쇄 형태를 형성하며, 이 형태는 완전한 활성을 위해 추가의 입체형태 변화를 필요로 한다.
본 명세서에 사용된 "자이모겐 유사" 단백질 또는 폴리펩타이드는 단백분해 절단에 의해 활성화된 단백질을 의미하지만, 자이모겐과 관련된 성질, 예컨대 낮은 활성 또는 비활성, 또는 이 단백질의 자이모겐 형태의 입체형태를 닮은 입체형태를 여전히 나타낸다. 예를 들어, 조직인자에 결합되어 있지 않을 때, FVII의 활성화된 이중쇄 형태는 자이모겐 유사 단백질이고; 절단되지 않은 FVII 자이모겐과 유사한 입체형태를 유지하여 매우 낮은 활성을 나타낸다. 조직인자에 결합 후, FVII의 활성화된 이중쇄 형태는 입체형태 변화를 겪어 응고인자로서 완전한 활성을 수득한다.
본 명세서에 사용된, 활성화 서열은 활성 프로테아제를 형성하기 위한 활성화 절단 또는 성숙 절단에 필요한 부위인, 자이모겐 내의 아미노산 서열을 의미한다. 활성화 서열의 절단은 자가촉매적으로 또는 활성화 파트너에 의해 촉진될 수 있다.
본 명세서에 사용된 활성화 절단은 성숙 절단의 한 종류로서, 완전한 효소 활성의 발달에 필요한 입체형태 변화를 유도한다. 이것은 절단으로 키모트립신의 Asp194와 같은 프로테아제의 보존적 영역과 상호작용하는 새로운 N-말단이 발생되어 활성에 필요한 입체형태 변화를 유도하는 세린 프로테아제 등의 고전적 활성화 경로이다. 활성화는 프로테아제의 다중쇄 형태를 생성시킬 수 있다. 일부 경우에, 프로테아제의 단일쇄 형태는 단백분해 활성을 나타낼 수 있다.
본 명세서에 사용된, "활성화된 제VII 인자" 또는 "FVIIa"는 FVII 폴리펩타이드의 임의의 이중쇄 형태를 의미한다. 이중쇄 형태는 일반적으로 단백분해 절단으로부터 수득되지만, 합성 생산할 수도 있다. 따라서, 활성화된 제VII 인자는 응고제 활성이 낮은 자이모겐 유사 이중쇄 형태, 조직인자에 결합한 후에 나타나는 완전 활성화된 형태(약 1000배 이상의 활성), 및 완전 활성화된 이중쇄 형태로 존재하거나 완전 활성화된 형태로 입체형태 변화를 일으키는 돌연변이 형태를 포함한다. 예를 들어, FVII 폴리펩타이드의 단일쇄 형태(예, 서열번호 3 참조)는 성숙 FVII 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 R152와 I153 사이에서 단백분해적으로 절단된다. 이황화 결합(서열번호 3의 FVII의 아미노산 잔기 135C와 162C 사이)에 의해 함께 유지된, 절단 산물인 FVII 중쇄 및 FVII 경쇄는 이중쇄 활성화된 FVII 효소를 형성한다. 단백분해 절단은 예컨대 활성화된 제IX 인자(FIXa), 활성화된 제X 인자(FXa), 활성화된 제XII 인자(FXIIa), 트롬빈에 의해 또는 자가활성화에 의해 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용된 FVII 폴리펩타이드의 "성질"은 3차원 구조, pI, 반감기, 입체형태 및 이러한 다른 물리적 특성과 같은 물리적 또는 구조적 성질을 의미한다.
본 명세서에 사용된, FVII 폴리펩타이드의 "활성"은 제VII 인자 폴리펩타이드에 의해 나타나는 임의의 활성을 의미한다. 이러한 활성은 시험관내 및/또는 생체내에서 검사될 수 있고, 응고 또는 응고제 활성, 응고촉진 활성, 단백분해 또는 촉매 활성, 예컨대 제X 인자(FX) 활성화 또는 제IX 인자(FIX) 활성화의 실시를 위한 활성; 항원성(항-FVII 항체에 결합하는 능력 또는 항-FVII 항체에 결합하기 위해 폴리펩타이드와 경쟁하는 능력); 조직인자, 제X 인자 또는 제IX 인자에 결합하는 능력; 및/또는 인지질에 결합하는 능력을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 활성은 공인된 분석법을 사용해서 시험관내 또는 생체내에서 평가할 수 있으며, 그 예로는 시험관내 또는 생체내에서의 응고 측정이 있다. 이러한 분석법의 결과는 폴리펩타이드가 생체내 폴리펩타이드의 활성과 상관성이 있을 수 있는 활성을 나타낸다는 것을 시사하며, 여기서 생체내 활성은 생물학적 활성으로 지칭될 수도 있다. FVII의 변형 형태의 기능성 또는 활성을 측정하는 분석법은 당업자에게 공지되어 있다. FVII 폴리펩타이드의 활성을 평가하는 분석법의 예로는 응고제 활성을 평가하는 프로트롬보플라스틴 시간(PT) 분석법 또는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 분석법, 또는 촉매 활성이나 단백분해 활성을 평가하는 실시예 4, 5 및 11에 기술된 바와 같은 합성 기질을 사용하는 발색법이 포함된다.
본 명세서에 사용된, "적어도 하나의 활성을 나타낸다" 또는 "적어도 하나의 활성을 유지한다"는 동일한 조건 하에 동일한 형태의 비변형 FVII 폴리펩타이드와 비교했을 때 변형 FVII 폴리펩타이드가 나타내는 활성을 의미한다. 예를 들어, 이중쇄 형태의 변형 FVII 폴리펩타이드는 이중쇄 형태의 비변형 FVII 폴리펩타이드와 동일한 조건 하에 비교되고, 여기서 두 폴리펩타이드 간에 유일한 차이는 연구 중인 변형이다. 다른 예에 따르면, 단일쇄 형태의 변형 FVII 폴리펩타이드는 동일한 실험 조건 하에 단일쇄 형태의 비변형 FVII 폴리펩타이드와 비교되며, 여기서 두 폴리펩타이드 간에 유일한 차이는 연구 중인 변형이다. 일반적으로, 동일한 형태의 비변형 FVII 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 유지하거나 나타내는 변형 FVII 폴리펩타이드는, 변형 FVII 폴리펩타이드가 생체내 투여되었을 때 응고촉진 치료제로서 치료학적으로 효과적일 정도로 충분한 양의 활성을 유지한다. 일반적으로, 응고촉진제로서 치료 효능을 유지하는 변형 FVII 폴리펩타이드에서, 유지되는 활성의 양은, 응고촉진제로서 치료 효능을 나타내는 동일한 형태의 비변형 FVII 폴리펩타이드의 활성의 약 또는 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상이다. 응고촉진제로서 치료 효능을 유지하는데 필요한 활성의 양은 필요하다면 실험적으로 측정될 수 있다. 일반적으로 활성의 0.5% 내지 20%, 0.5% 내지 10%, 0.5% 내지 5%의 유지는 생체내 응고촉진제로서 치료 효능을 유지하는데 충분하다.
변형 FVII 폴리펩타이드에 의해 나타나거나 유지되는 활성은 임의의 활성, 예컨대 응고 또는 응고제 활성, 응고촉진 활성, 단백분해 또는 촉매 활성, 예컨대 제X 인자(FX) 활성화 또는 제IX 인자(FIX) 활성화의 실시를 위한 활성; 항원성(항-FVII 항체에 결합하는 능력 또는 항-FVII 항체에 결합하기 위해 폴리펩타이드와 경쟁하는 능력); 조직인자, 제X 인자 또는 제IX 인자에 결합하는 능력; 및/또는 인지질에 결합하는 능력을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 일부 경우에, 변형 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 증가된 활성을 유지할 수 있다. 일부 경우에, 변형 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 감소된 활성을 유지할 수 있다. 변형 FVII 폴리펩타이드의 활성은 동일한 형태인 비변형 폴리펩타이드의 활성 백분율의 임의의 수준일 수 있으며, 예컨대 문제의 변형을 함유하지 않는 폴리펩타이드에 비해 1%의 활성, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상의 활성일 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어,변형 FVII 폴리펩타이드는 동일한 형태의 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 증가되거나 감소된 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 비변형 FVII 폴리펩타이드 활성의 적어도 약 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 적어도 99%의 활성을 유지할 수 있다. 다른 양태에 따르면, 활성의 변화는 비변형 FVII보다 적어도 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배 또는 그 이상 크다. 유지되어야 하는 특정 수준은 폴리펩타이드의 의도된 용도의 함수로서, 실험적으로 결정될 수 있다. 활성은 예컨대 이하 실시예에 기술되거나 본 명세서에 기술된 바와 같은 시험관내 또는 생체내 분석법을 사용하여 측정할 수 있다.
본 명세서에 사용된, "응고 활성" 또는 "응고제 활성" 또는 "응고촉진 활성"은 응고를 실시하는 폴리펩타이드의 능력을 의미한다. 응고제 활성을 평가하는 분석법은 당업자에게 공지되어 있고, 프로트롬보플라스틴 시간(PT) 분석법 또는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 분석법을 포함한다.
본 명세서에 사용된, FVII에 관한 "촉매 활성" 또는 "단백분해 활성"은 기질의 단백분해 절단을 촉진하는 FVII 단백질의 능력을 의미하며, 상호교환해서 사용된다. 이러한 활성을 평가하는 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, FVII의 단백분해 활성은 Spectrozyme FVIIa(CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA)와 같은 발색성 기질을 사용하여 측정할 수 있으며, 여기서 기질의 절단은 흡광도로 모니터하며 기질 가수분해 속도는 선형 회귀법으로 측정한다.
본 명세서에 사용된 FVII에 관한 "고유 활성"은 조직인자의 부재 시에 FVII 단백질의 촉매적, 단백분해적 및/또는 응고 활성을 의미한다.
본 명세서에 사용된, 도메인(보통 3개 이상, 일반적으로 5개 또는 7개 또는 그 이상의 아미노산의 서열)은 분자의 다른 부분과 구조적 및/또는 기능적으로 상이하고 식별할 수 있는, 단백질 또는 암호화 핵산과 같은 분자의 일부를 의미한다. 예를 들어, 도메인은 하나 이상의 구조 모티프로 구성된 단백질 내에서 독립적으로 주름진 구조를 형성할 수 있고/있거나 단백분해 활성과 같은 기능적 활성에 의거하여 인식되는 폴리펩타이드의 부분을 포함한다. 단백질은 하나 또는 하나보다 많은 독특한 도메인을 보유할 수 있다. 예를 들어, 도메인은 이 안의 서열과 관련 패밀리 구성원과의 상동성, 예컨대 프로테아제 도메인 또는 gla 도메인을 한정하는 모티프와의 상동성을 통해 확인하거나, 한정하거나 또는 구별할 수 있다. 다른 예에 따르면, 도메인은 기능에 따라, 예컨대 단백분해 활성, 또는 생체분자와의 상호작용 능력, 예컨대 DNA 결합, 리간드 결합 및 이량체화 등에 따라 구별될 수 있다. 도메인은 독립적으로 생물학적 기능이나 활성을 나타낼 수 있어, 이 도메인 단독으로 또는 다른 분자와 융합되어 단백분해 활성 또는 리간드 결합 등과 같은 활성을 수행할 수 있다. 도메인은 아미노산의 선형 서열 또는 아미노산의 비선형 서열일 수 있다. 많은 폴리펩타이드는 다수의 도메인을 함유한다. 이러한 도메인은 공지되어 있고 당업자에 의해 확인될 수 있다. 본 발명의 예증을 위해, 정의들이 제공되지만, 명칭으로 특정 도메인을 인식하는 것은 당해 기술분야에 공지된 것임을 잘 알고 있을 것이다. 필요하면, 도메인의 확인을 위해 적당한 소프트웨어를 이용할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 프로테아제 도메인은 프로테아제의 촉매 활성부이다. 프로테아제의 프로테아제 도메인에 대한 언급은 임의의 이 단백질들의 단일쇄, 이중쇄 및 다중쇄 형태를 포함한다. 단백질의 프로테아제 도메인은 단백분해 활성에 필요한 상기 단백질의 모든 필수 성질, 예컨대 촉매 중심을 함유한다. FVII와 관련하여, 프로테아제 도메인은 키모트립신/트립신 패밀리 프로테아제 도메인들과 상동성 및 구조적 특징, 예컨대 촉매 3인조를 공유한다. 예를 들어, 서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드에서, 프로테아제 도메인은 아미노산 위치 153 내지 392에 상응한다.
본 명세서에 사용된, 감마-카르복시글루타메이트(Gla) 도메인은 비타민 K 의존적 단백질과 같은 단백질의 부분을 의미하는 것으로서, 이 부분은 모든 글루타메이트 잔기가 그런 것은 아니지만, 일반적으로 대부분의 글루타메이트 잔기가 비타민 K 의존적 카르복실화에 의해 Gla를 형성하는 글루타메이트 잔기의 해독후 변형을 함유한다. Gla 도메인은 칼슘 이온의 고친화도 결합 및 음하전성 인지질에 대한 결합을 담당한다. 일반적으로, Gla 도메인은 비타민 K 의존적 단백질의 성숙 형태의 N-말단 끝에서 시작해서 보존적 방향족 잔기로 끝난다. 성숙 FVII 폴리펩타이드에서 Gla 도메인은 서열번호 3에 제시된 예시적 폴리펩타이드의 아미노산 위치 1 내지 45에 상응한다. Gla 도메인은 공지되어 있고, 이들의 유전자좌는 특정 폴리펩타이드에서 확인할 수 있다. 다양한 비타민 K 의존적 단백질의 Gla 도메인은 서열, 구조적 및 기능성 상동성을 공유하는데, 그 예로는 세포 표면 막에 존재하는 음하전성 인지질과 상호작용을 매개하는 소수성 패치 내에 N-말단 소수성 잔기의 클러스터링이 있다. 다른 Gla 함유 폴리펩타이드의 예로는 FIX, FX, 프로트롬빈, 단백질 C, 단백질 S, 오스테오칼신, 기질 Gla 단백질, 성장-정지-특이적 단백질 6(Gas6) 및 단백질 Z를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 예시적 단백질 및 기타 예시적 단백질의 Gla 도메인은 서열번호 110 내지 121 중 임의의 서열에 제시되어 있다.
본 명세서에 사용된 Gla 도메인에 관한 "천연" 또는 "내인성"은 Gla 도메인을 보유하는 폴리펩타이드 전체 또는 일부와 결합된 자연 발생의 Gla 도메인을 의미한다. 본 발명의 목적상, 천연 Gla 도메인은 FVII 폴리펩타이드에 관한 것이다. 예를 들어, 서열번호 119에 제시된 FVII의 천연 Gla 도메인은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 45에 상응한다.
본 명세서에 사용된, 이종 Gla 도메인은 FVII Gla 도메인이 아닌, 동일 종 또는 다른 종 유래의 폴리펩타이드의 Gla 도메인을 의미한다. 이종 Gla 도메인의 예는 Gla 함유 폴리펩타이드 유래의 Gla 도메인, 예컨대 FIX, FX, 프로트롬빈, 단백질 C, 단백질 S, 오스테오칼신, 기질 Gla 단백질, 성장-정지-특이적 단백질 6(Gas6) 및 단백질 Z의 Gla 도메인이지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 예시적 단백질 및 기타 예시적 단백질의 Gla 도메인은 서열번호 110-118, 120 및 121 중 임의의 서열에 제시되어 있다.
본 명세서에 사용된 Gla 도메인의 근접부는 적어도 2개 이상의 인접 아미노산, 일반적으로 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40 또는 그 이상 내지 Gla 도메인을 구성하는 모든 아미노산까지 의미한다.
본 명세서에 사용된 "인지질 결합을 실시하기에 충분한 Gla 도메인 부분"은 이 도메인의 적어도 하나의 아미노산, 일반적으로 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 또는 그 이상의 아미노산을 포함하지만, 이러한 부분을 함유하는 폴리펩타이드가 인지질 결합을 나타내는 한, 이 도메인을 구성하는 아미노산 전부보다는 적은 수의 아미노산을 포함한다.
본 명세서에 사용된, Gla 도메인에 관한 "교체" 또는 "Gla 도메인 교환"은 단백질의 내인성 Gla 도메인이 재조합, 합성 또는 다른 방법에 의해 다른 단백질의 Gla 도메인으로 교체되는 과정을 의미한다. "Gla 도메인 교환"의 상황에서, "Gla 도메인"은 인지질 결합 활성을 유지하기에 충분한, Gla 도메인 및 인접 영역 유래의 아미노산의 임의의 선택이다. 일반적으로, Gla 도메인 교환은 내인성 단백질의 40 내지 50개 아미노산과 다른 단백질의 40 내지 50개 아미노산과의 교체를 수반할 것이지만, 이보다 적거나 많은 아미노산을 수반할 수도 있다.
본 명세서에 사용된, 상피성장인자(EGF) 도메인(EGF-1 또는 EGF-2)은 상피성장인자(EGF) 서열의 특정 30 내지 40개 아미노산 부분과 서열 상동성을 공유하는 단백질의 부분을 의미한다. EGF 도메인은 이황화 결합에 관여하는 것으로 밝혀진(EGF에서) 6개의 시스테인 잔기를 포함한다. EGF 도메인의 주요 구조는 이본쇄 베타 시트와 그 다음 C-말단 짧은 이본쇄 시트까지의 루프이다. FVII는 2개의 EGF 도메인, EGF-1 및 EGF-2를 함유한다. 이 도메인들은 서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드의 아미노산 위치 46 내지 82와 87 내지 128에 각각 상응한다.
본 명세서에 사용된, "비변형 폴리펩타이드" 또는 "비변형 FVII" 및 이의 문법적 변형어들은 본 명세서에 제공된 변형을 위해 선택된 출발 폴리펩타이드를 의미한다. 출발 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 자연 발생의 야생형일 수 있다. 또한, 출발 폴리펩타이드는 천연 야생형 이소폼과 상이하게 변경 또는 변이될 수 있지만, 그럼에도 불구하고 본 발명에서 생산되는 후속 변형된 폴리펩타이드에 상대적으로 출발 비변형 폴리펩타이드라고 지칭된다. 따라서, 비변형 참조 단백질에 비해 특정 활성이나 성질의 목적한 증가 또는 감소를 보유하도록 변형된 당업계에 공지된 기존 단백질들은 출발 비변형 폴리펩타이드로 선택되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 단일 아미노산 변화에 의해 천연 형태로부터 변형되어, 글리코실화의 변경을 위한 아미노산 잔기 또는 잔기들의 변화와 같이 목적 성질의 증가 또는 감소를 갖고 있는 단백질은 동일한 성질 또는 다른 성질을 추가 변형시키기 위한, 본 명세서에서 비변형으로 불리기도 하는 표적 단백질일 수 있다. 당업계에 공지된 변형 FVII 폴리펩타이드의 예로는, 예컨대 미국 특허 5580560, 6017882, 6693075, 6762286 및 6806063, 미국 특허출원 공개번호 20030100506 및 20040220106, 및 국제특허공개번호 WOl988010295, WO200183725, WO2003093465, WO200338162, WO2004083361, WO2004108763, WO2004029090, WO2004029091, WO2004111242 및 WO2005123916에 기술된 임의의 FVII 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 사용된, "변형 제VII 인자 폴리펩타이드" 및 "변형 제VII 인자"는 비변형 제VII 인자 폴리펩타이드와 비교했을 때 하나 이상의 아미노산 차이를 보유하는 FVII 폴리펩타이드를 의미한다. 하나 이상의 아미노산 차이는 하나 이상의 아미노산 교체(치환), 삽입 또는 결실과 같은 아미노산 돌연변이이거나, 또는 전체 도메인의 삽입 또는 결실일 수 있고, 그리고 이의 임의의 조합일 수 있다. 일반적으로, 변형 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드와 비교했을 때 1차 서열에 하나 이상의 변형을 보유한다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 변형 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드와 비교했을 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50개 이상의 아미노산 차이를 보유할 수 있다. 임의의 변형은 최종 폴리펩타이드가 천연 FVII 폴리펩타이드와 관련된 적어도 하나의 FVII 활성, 예컨대 촉매 활성, 단백분해 활성, TF를 결합시키는 능력 또는 활성화된 혈소판을 결합시키는 능력을 나타내는 한, 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 사용된 "응고 저해제"는 응고 또는 응괴 형성을 저해하거나 방지하는 작용을 하는 단백질 또는 분자를 의미한다. 응고의 저해 또는 방지는 생체내 또는 시험관내에서 관찰될 수 있고, 프로트롬보플라스틴 시간(PT) 분석법 또는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 분석을 비롯한, 이에 국한되지 않는 당업계에 공지된 모든 방법에 의해 분석될 수 있다.
본 명세서에 사용된, 조직인자 경로 억제제(TFPI, 또한 TFPI-1 이라고도 지칭됨)는 FVIIa의 활성이 저해되는 4차 TF/FVIIa/TFPI/FXa 저해 복합체의 형성에 관여하는 쿠니츠형 저해제이다. TFPI는 선택적 스플라이싱 후에 2개의 다른 전구체 형태, TFPIα (서열번호 101) 및 TFPIβ(서열번호 103) 전구체로 발현되고, 이들은 분비 동안 절단되어 각각 276개 아미노산(서열번호 102) 및 223개 아미노산(서열번호 104)의 성숙 단백질이 된다. TFPI는 3개의 쿠니츠 도메인을 함유하며, 이 중 쿠니츠-1 도메인은 FVIIa의 결합 및 억제를 담당한다.
본 명세서에 사용된 TFPI-2(태반 단백질 5(PP5) 및 기질 결합된 세린 프로테아제 억제제(MSPI)라고도 알려져 있음)는 TFP1의 동족체를 의미한다. 213개 아미노산 성숙 TFPI-2 단백질(서열번호 105)은 TFPI-1 쿠니츠형 도메인 1, 2 및 3과 각각 43%, 35% 및 53% 1차 서열 동일성을 나타내는 3개의 쿠니츠형 도메인을 함유한다. TFPI-2는 세포외 기질 분해 및 재모형화의 조절에 역할을 하고, 응고 경로에는 중요하지 않은 인자인 것으로 생각된다.
본 명세서에 사용된, 안티트롬빈 III(AT-III)은 세린 프로테아제 저해제(서핀(serpin))이다. AT-III은 464개 아미노산 잔기를 함유하는 전구체 단백질(서열번호 122)로서 합성되고 분비되는 동안 절단되어 432개 아미노산 성숙 안티트롬빈(서열번호 123)을 방출한다.
본 명세서에 사용된, 보조인자는 다른 특정 단백질 또는 분자에 결합하여 활성 복합체를 형성하는 단백질 또는 분자를 의미한다. 일부 예에 따르면, 보조인자에 대한 결합은 최적의 단백분해 활성에 필요하다. 예를 들어, 조직인자(TF)는 FVIIa의 보조인자이다. TF에 대한 FVIIa의 결합은 FVIIa의 이의 기질인 FX 및 FIX에 대한 단백분해 활성을 증가시키는 입체형태 변화를 유도한다.
본 명세서에 사용된, 조직인자(TF)는 FVIIa의 보조인자로서 작용하는 263개 아미노산의 막관통 당단백질(서열번호 124)을 의미한다. 이는 평활근 세포 및 섬유아세포에 의해 구성적으로 발현되고, 이들 세포들이 조직 상해 후 혈류와 접촉하게 될 때 FVII 및 FVIIa를 결합시킴으로써 응고의 개시를 돕는다.
본 명세서에 사용된, 활성화된 혈소판은 교원섬유, 트롬복산 A2, ADP 및 트롬빈과 같은 분자의 결합에 의해, 궁극적으로 응고를 촉진하는 형태, 표현형 및 기능의 다양한 변화를 겪도록 자극된 혈소판을 의미한다. 예를 들어, 활성화된 혈소판은 돌출성 핑거를 보유한 더욱 무정형 형태로 모양이 변화한다. 또한, 활성화된 혈소판은 일반적으로 세포막의 내엽에 존재하는 포스파티딜세린과 다른 음하전성 인지질이 혈장 지향적 외측 표면으로 전위되도록 세포막의 "플립(flip)"을 겪는다.이러한 활성화된 혈소판의 막들은 응고 캐스캐이드의 많은 반응들이 실시되는 표면을 제공한다. 또한, 활성화된 혈소판은 vWF, FV, 트롬빈, ADP 및 트롬복산 A2와 같은 응고촉진제 인자를 함유하는 소포를 분비하고, 서로 부착하여, 피브린에 의해 안정화되어 응괴가 되는 혈소판전(platelet plug)을 형성한다.
본 명세서에 사용된 활성화된 혈소판에 대한 결합 및/또는 친화도의 증가 및 이의 임의의 문법적 변형어들은 참조 폴리펩타이드 또는 단백질과 비교했을 때 활성화된 혈소판의 표면에 결합하는 폴리펩타이드 또는 단백질, 예컨대 FVII 폴리펩타이드의 증강된 능력을 의미한다. 예를 들어, 활성화된 혈소판에 결합하는 변형 FVII 폴리펩타이드의 능력은 비변형 FVII 폴리펩타이드가 활성화된 혈소판에 결합하는 능력보다 훨씬 클 수 있다. 활성화된 혈소판에 대한 폴리펩타이드의 결합 및/또는 친화도는 비변형 폴리펩타이드의 결합 및/또는 친화도에 비해 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 증가할 수 있다. 활성화된 혈소판에 대한 폴리펩타이드의 결합 및/또는 친화도를 측정하는 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 활성화된 혈소판에 대한 FVII 폴리펩타이드의 결합은 활성화된 혈소판에서 포스파티딜세린과 같은 음하전성 인지질과 FVII 폴리펩타이드 내의 Gla 도메인의 아미노산과의 상호작용을 통해 매개된다. 이러한 바와 같이, 활성화된 혈소판에 대한 폴리펩타이드, 예컨대 FVII 폴리펩타이드의 결합을 측정하는 분석법은 포스파티딜세린과 같은 인지질을 함유하는 소포와 막을 이용한다. 예를 들어, 활성화된 혈소판에 결합하는 폴리펩타이드의 능력은 광산란 기술로 측정할 수 있는, 인지질 소포에 결합하는 폴리펩타이드의 능력을 통해 반영된다.
본 명세서에 사용된, 인지질에 대한 결합 및/또는 친화도 증가 및 이의 문법적 변형어는 참조 폴리펩타이드 또는 단백질에 비해 인지질에 결합하는 폴리펩타이드 또는 단백질의 증강된 능력을 의미한다. 인지질은 임의의 인지질을 포함할 수 있지만, 특히 포스파티딜세린을 포함한다. 폴리펩타이드의 인지질에 대한 결합 및/똔느 친화도는 비변형 폴리펩타이드의 결합 및/또는 친화도에 비해 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 증가할 수 있다. 인지질에 대한 폴리펩타이드의 결합 및/또는 친화도를 측정하는 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인지질 소포에 대한 FVII 폴리펩타이드 결합은 입사각에 대해 90°에서의 상대적 광산란에 의해 측정될 수 있다. 인지질 소포 단독 및 FVII와 인지질 소포에 의한 광산란의 강도는 해리상수를 측정하기 위해 계측한다. 또한, 표면 플라즈마 공명, 예컨대 BIAcore 바이오센서 기구를 사용해서 인지질 막에 대한 FVII 폴리펩타이드의 친화도를 계측할 수도 있다.
본 명세서에 사용된, 저해제에 대한 내성 증가 또는 "TFPI에 대한 내성 증가" 또는 "AT-III에 대한 내성 증가"는 비변형 FVII 폴리펩타이드와 같은 참조 폴리펩타이드에 비해 TFPI 또는 AT-III과 같은 저해제의 저해 효과에 대한 폴리펩타이드의 감소된 감수성의 임의의 양을 의미한다. 예를 들어, FXa와 복합체화된 TFPI는 TF/FVIIa 복합체에 결합한다. 이렇게 함으로써, FVIIa의 활성을 저해한다. 따라서, TF/FVIIa 복합체에 대한 TFPI의 결합을 감소 또는 차단하여 FVIIa 활성의 TFPI 매개의 저해를 감소 또는 차단하는 변형 FVII 폴리펩타이드는 TFPI에 대한 증가된 내성을 나타낸다. TFPI와 같은 저해제에 대한 내성 증가는 변형 FVII 폴리펩타이드의 저해제에 대한 결합을 평가하여 분석할 수 있다. 또한, TFPI와 같은 저해제에 대한 내성 증가는 TFPI의 존재 하에 FVII 폴리펩타이드의 고유 활성 또는 응고제 활성을 계측하여 분석할 수도 있다. TFPI 또는 AT-III과 같은 저해제에 대한 폴리펩타이드의 결합을 측정하는 분석법은 당업계에 공지되어 있다. TFPI와 같은 비공유 저해제에 대해서는 k i 를 계측할 수 있다. AT-III과 같은 공유 저해제에 대해서는 2차 저해 속도 상수를 계측할 수 있다. 또한, BIAcore 바이오센서 기구와 같은 표면 플라즈마 공명을 통해서 TFPI, AT-III 또는 다른 저해제에 대한 FVII 폴리펩타이드의 결합을 계측할 수 있다. 하지만, AT-III과 같은 공유 저해제에 대해서는 오로지 결합속도(on-rate)를 BIAcore를 사용해서 계측할 수 있다. FVII 응고 활성 또는 고유 활성에 미치는 TFPI 등의 저해 효과를 측정하는 분석법 역시 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, TFPI의 존재 또는 부재 하에 변형 FVII 폴리펩타이드의 이의 기질인 FX를 절단하는 능력을 계측할 수 있고, 이 반응을 TFPI가 저해하는 정도를 측정했다. 이를, 비변형 FVII 폴리펩타이드가 TFPI의 존재 또는 부재 하에 기질 FX를 절단하는 능력과 비교할 수 있다. 저해제에 대한 내성 증가를 나타내는 변형 폴리펩타이드는 예컨대 비변형 폴리펩타이드에 비해 저해제 효과의 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상의 내성 증가를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 "생물학적 활성"은 화합물, 조성물 또는 다른 혼합물의 생체내 투여 시에 초래되는 생리학적 반응 또는 화합물의 생체내 활성을 의미한다. 따라서, 생물학적 활성은 상기 화합물, 조성물 및 혼합물의 치료 효과 및 약제학적 활성을 포함한다. 생물학적 활성은 이러한 활성을 검사하거나 사용하도록 설계된 시험관내 시스템에서 관찰할 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적에서, FVII 폴리펩타이드의 생물학적 활성은 응고 활성을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "평가하는"이란 용어 및 이의 문법적 변형어는 폴리펩타이드의 활성의 절대값을 수득한다는 점에서, 또한 활성의 수준을 시사하는 지수, 비율, 백분율, 가시적 또는 다른 값을 수득한다는 점에서 정량적 및 정성적 측정을 포함하는 것으로 간주한다. 평가는 직접 또는 간접 평가일 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드에 의한 기질의 절단 검출은 산물을 직접 계측하여 수행할 수도 있고, 또는 절단된 기질의 최종 활성을 측정하여 간접적으로 계측할 수도 있다.
본 명세서에 사용된 "키모트립신 번호매김"은 서열번호 107의 성숙 키모트립신 폴리펩타이드의 아미노산 번호매김을 의미한다. 제VII 인자의 프로테아제 도메인과 같은 다른 프로테아제의 프로테아제 도메인과 키모트립신을 정렬시킬 수 있다. 이러한 경우에, 키모트립신의 아미노산에 상응하는 제VII 인자의 아미노산에는 키모트립신의 아미노산 번호매김이 주어진다. 상응하는 위치는 수동 정렬을 이용하는 당업자에 의한 이러한 정렬을 통해 또는 입수할 수 있는 다수의 정렬 프로그램(예, BLASTP)을 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 상응하는 위치는 단백질 구조의 컴퓨터 모의 정렬 등을 통한 구조적 정렬을 기반으로 할 수 있다. 폴리펩타이드의 아미노산이 개시된 서열의 아미노산에 상응한다는 언급은 GAP 알고리듬과 같은 표준 정렬 알고리듬을 이용하여 동일성 또는 상동성(보존적 아미노산이 정렬되는 경우)을 최대화하도록 개시된 서열과 폴리펩타이드의 정렬 시에 확인된 아미노산을 의미한다. 서열번호 3에 제시된 FVII 폴리펩타이드의 아미노산 위치 153 내지 406의 상응하는 키모트립신 번호는 표 1에 제시한다. 서열번호 3에 제시된 서열에 상대적인 아미노산 위치는 정상 폰트이고, 이 위치에 있는 아미노산 잔기는 진한 글씨이며, 상응하는 키모트립신 번호는 이탤릭체이다. 예를 들어, 성숙 키모트립신(서열번호 107)과 성숙 제VII 인자(서열번호 3)의 정렬 후, 제VII 인자의 아미노산 위치 153에 있는 이소류신(I)에는 키모트립신 번호매김 I16이 주어진다. 후속 아미노산들은 이에 따라서 번호가 매겨진다. 일 예에 따르면, 성숙 제VII 인자(서열번호 3)의 아미노산 위치 210에 있는 글루탐산(E)은 키모트립신 번호매김에 기초한 아미노산 위치 E70에 상응한다. 잔기가 프로테아제에 존재하지만 키모트립신에는 존재하지 않는 경우에는, 이 아미노산 잔기에는 문자 표시가 주어진다. 예를 들어, 키모트립신 번호매김에 기초한 아미노산 60과 루프의 일부이지만 키모트립신과 비교했을 때 제VII 인자 서열에는 삽입되어 있는 키모트립신 잔기들은 예컨대 K60a, I60b, K60c 또는 N60d라 지칭된다. 이 잔기들은 성숙 제VII 인자 서열(서열번호 3)에 관한 번호매김에 의해서는 각각 K197, I198, K199 및 N200에 상응한다.
Figure 112009069306018-PCT00001
Figure 112009069306018-PCT00002
본 명세서에 사용된 핵산은 DNA, RNA 및 이의 유사체, 예컨대 펩타이드 핵산(PNA) 및 이의 혼합물을 포함한다. 핵산은 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있다. 프로브 또는 프라이머에 관한 것일 때에는 일본쇄 분자로, 형광 또는 방사능표지와 같은 검출가능한 표지 등으로 경우에 따라 표지된다. 이러한 분자들의 길이는 일반적으로 이들의 표적이 라이브러리의 탐침 또는 프라이밍을 위한 통계적으로 고유한 수 또는 낮은 카피수(보통 5 미만, 일반적으로 3 미만)일 정도의 길이이다. 일반적으로, 프로브 또는 프라이머는 당해의 유전자와 동일하거나 상보성인 서열의 적어도 14개, 16개 또는 30개의 근접 뉴클레오타이드를 함유한다. 프로브 및 프라이머는 10, 20, 30, 50, 100 또는 그 이상의 핵산 길이일 수 있다.
본 명세서에 사용된, 펩타이드는 2 내지 40개 아미노산 길이인 폴리펩타이드를 의미한다.
본 명세서에 사용된, 여기에 제시된 다양한 아미노산 서열에서 나타나는 아미노산은 이들의 공지된 3문자 또는 1문자 약어(표 1)에 따라 확인된다. 다양한 핵산 단편에서 나타나는 뉴클레오타이드는 당업계에 통상적으로 사용되는 표준 1문자 명칭으로 나타낸다.
본 명세서에 사용된 "아미노산"은 아미노기와 카르복시산기를 함유하는 유기 화합물이다. 폴리펩타이드는 2개 이상의 아미노산을 함유한다. 본 발명의 목적을 위해, 아미노산은 20개의 자연발생의 아미노산, 비자연 아미노산 및 아미노산 유사체(즉, α-탄소가 측쇄를 보유하는 아미노산)를 포함한다.
문헌[J.Biol.Chem., 243: 3552-3559(1969)]에 기술되고 37 C.F.R§§1.821-1.822에 채택된 표준 폴리펩타이드 명명법을 준수하여, 아미노산 잔기의 약어는 표 1에 제시한 바와 같다:
Figure 112009069306018-PCT00003
본 명세서에 상투적인 문구로 나타낸 아미노산 잔기의 모든 서열은 왼쪽에서 오른쪽 배향으로 통상적인 아미노-말단에서 카르복시-말단 방향을 나타낸다. 또한, "아미노산 잔기"란 어구는 대응표(표 2)에 열거된 아미노산 및 본 발명에 참고인용된 37 C.F.R.§§1.821-1.822에 언급된 바와 같은 변형된 및 특이적 아미노산을 포함하는 것으로 광범위하게 정의된다. 더욱이, 아미노산 잔기 서열 중 시작이나 말단에 줄표는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 서열에 대한 펩타이드 결합 또는 NH2와 같은 아미노 말단 기 또는 COOH와 같은 카르복시 말단 기에 대한 펩타이드 결합을 나타낸다는 것을 유의해야 한다.
본 명세서에 사용된 "소수성 아미노산"은 아이젠버그 소수성 컨센서스 스케일을 사용하여 소수성인 것으로 측정된 아미노산 중 어느 하나를 포함한다. 그 예로는 자연 발생의 소수성 아미노산, 예컨대 이소류신, 페닐알라닌, 발린, 류신, 트립토판, 메티오닌, 알라닌, 글리신, 시스테인 및 티로신(Eisenberg et al.,(1982) Faraday Symp. Chem. Soc. 17: 109-120)이 있다. 비자연 발생의 소수성 아미노산도 포함된다.
본 명세서에 사용된 "산성 아미노산"은 자연 발생의 아미노산 중에서 아스파르트산 및 글루탐산 잔기를 포함한다. 비자연 발생의 산성 아미노산도 포함된다.
본 명세서에 사용된 "자연 발생의 아미노산"은 폴리펩타이드에서 나타나는 20개의 L-아미노산을 의미한다.
본 명세서에 사용된 "비자연 아미노산"이란 용어는 표 2에 열거된 자연 발생의 아미노산 중 하나가 아닌, 아미노 기와 카르복시산 기를 함유하는 유기 화합물을 의미한다. 따라서, 비자연 발생의 아미노산은 예를 들어 20개의 자연 발생의 아미노산 외에 다른 아미노산 또는 다른 아미노산의 유사체를 포함하며, 예컨대 아미노산의 D-이소스테레오머(isostereomer)를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 비자연 아미노산의 예는 당업자에게 공지되어 있고 변형 제VII 인자 폴리펩타이드에 포함될 수 있다.
본 명세서에 사용된 DNA 작제물은 일본쇄 또는 이본쇄인 선형 또는 원형의 DNA 분자로서, 자연에서 발견되지 않는 방식으로 조합 및 병치된 DNA 분절을 함유한다. DNA 작제물은 사람 조작의 결과로서 존재하고 조작된 분자의 클론 및 다른 카피를 포함한다.
본 명세서에 사용된 DNA 분절은 특정 속성을 보유하는 큰 DNA 분자의 부분이다. 예를 들어, 특정 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분절은 5'에서 3' 방향으로 판독할 때 특정 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 플라스미드 또는 플라스미드 단편과 같은 긴 DNA 분자의 부분이다.
본 명세서에 사용된 폴리뉴클레오타이드란 용어는 5'에서 3' 말단으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 염기의 일본쇄 또는 이본쇄 중합체를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 RNA 및 DNA를 포함하고 자연 근원에서 분리하거나, 시험관내에서 합성하거나 또는 자연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드분자의 길이는 뉴클레오타이드(약어 "nt") 또는 염기쌍(약어 "bp")으로 제시된다. 뉴클레오타이드란 용어는 상황에 따라 일본쇄 분자 및 이본쇄 분자에 사용된다. 이 용어가 이본쇄 분자에 적용될 때 총 길이를 나타내는데 사용되고 염기쌍이란 용어와 동등한 것으로 이해되어야 할 것이다. 당업자라면 잘 알고 있듯이, 이본쇄 폴리뉴클레오타이드의 2 가닥은 길이가 약간 다를 수 있어 그 말단들이 어긋날 수 있다; 따라서 이본쇄 폴리뉴클레오타이드 분자 내의 모든 뉴클레오타이드가 쌍을 이룰 수는 없다. 이러한 짝이 없는 말단은 일반적으로 길이가 20개 뉴클레오타이드를 초과하지 않을 것이다.
본 명세서에 사용된 "1차 서열"은 폴리펩타이드의 아미노산 잔기의 서열을 의미한다.
본 명세서에 사용된 두 단백질 또는 핵산 간의 "유사성"은 단백질의 아미노산 서열 또는 핵산의 뉴클레오타이드 서열 간의 관련도를 의미한다. 유사성은 잔기의 서열과 이 안에 함유된 잔기의 동일성 및/또는 상동성의 정도를 기초로 할 수 있다. 단백질 또는 핵산 간에 유사성 정도를 평가하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 서열 유사성을 평가하는 한 방법에서, 두 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열은 서열 간에 동일성의 최대 수준을 산출하는 방식으로 정렬된다. "동일성"은 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열이 변하지 않은 정도를 의미한다. 또한, 아미노산 서열의 정렬, 및 어느 정도까지는 뉴클레오타이드 서열의 정렬은 아미노산(또는 뉴클레오타이드)의 보존적 차이 및/또는 빈번한 치환을 감안할 수 있다. 보존적 차이는 관련된 잔기의 이화학적 성질을 보존하는 것이다. 정렬은 전체적(서열의 전 길이에 걸쳐 모든 잔기를 포함하는 비교된 서열의 정렬) 또는 국소적(가장 유사한 영역 또는 영역들만을 포함하는 서열 일부의 정렬)일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "상동성" 및 "동일성"이란 용어는 상호교환적으로 사용되지만, 단백질의 상동성은 보존적 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상응하는 위치를 확인하기 위해, 아미노산 서열은 최고 수준의 정합이 수득되도록 정렬된다(예컨대, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48 : 1073 참조).
본 명세서에 사용된, "서열 동일성"은 검사 및 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 간에 비교 시에 동일한 아미노산(또는 뉴클레오타이드 염기)의 수를 의미한다. 상동성 폴리펩타이드는 소정의 수의 동일한 또는 상동성인 아미노산 잔기를 의미한다. 상동성은 동일한 잔기뿐만 아니라 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 서열 동일성은 각 공급업체에서 확립된 디폴트 갭 패널티(default gap penalty)가 사용된 표준 정렬 알고리듬 프로그램으로 측정할 수 있다. 상동성 핵산 분자는 소정의 수의 동일한 또는 상동성인 뉴클레오타이드를 의미한다. 상동성은 동일한 잔기 외에 암호화된 아미노산을 변화시키지 않는 치환(즉, "침묵 치환")을 포함한다. 실질적으로 상동성인 핵산 분자는 일반적으로 중간 엄중도 또는 높은 엄중도에서 당해의 전체 길이의 핵산 분자의 적어도 약 70%, 80% 또는 90%를 따라 하이브리드화하거나 또는 핵산의 길이를 따라 전체가 하이브리드화한다. 또한, 하이브리드화하는 핵산 분자 중의 코돈 대신에 축퇴성 코돈을 함유하는 핵산 분자도 고려된다. (단백질의 상동성을 측정하기 위해, 동일한 아미노산 외에 보존적 아미노산이 정렬될 수 있다; 이러한 경우에 동일성 %와 상동성 %는 다르다). 임의의 두 핵산 분자가 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% "동일성"인 뉴클레오타이드 서열(또는 임의의 두 폴리펩타이드의 경우에는 아미노산 서열)을 보유하는지는 피어슨 등(Pearson et al. Proc . Natl . Acad . Sci. USA 85: 2444 (1988))에서와 같은 디폴트 파라미터를 사용하는 "FAST A" 프로그램과 같은 공지된 컴퓨터 알고리듬을 이용해서 측정할 수 있다(다른 프로그램은 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994), 및 Carillo et al. SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)를 포함한다). 예를 들어, 국립 생명공학정보센터(NCBI) 데이터베이스의 BLAST 기능은 동일성을 측정하는데 사용할 수 있다. 다른 상업적인 또는 대중이 이용가능한 프로그램으로는 DNAStar "MegAlign" 프로그램 (Madison, WI) 및 위스콘신 대학 유전자 컴퓨터 그룹(University of Wisconsin Genetics Computer Group) (UWG) "Gap" 프로그램 (Madison WI))을 포함한다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 상동성 또는 동일성 백분율은 예컨대 GAP 컴퓨터 프로그램(예, Needleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), 스미드와 워터만[Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]에 의해 개정됨)을 사용하여 서열 정보를 비교하여 측정할 수 있다. 간략히 설명하면, GAP 프로그램은 유사한 정렬 기호(즉, 뉴클레오타이드 또는 아미노산)의 수를 두 서열 중 더 짧은 서열의 기호의 총 수로 나누어 유사성을 정의한다. GAP 프로그램의 디폴트 파라미터는 1진법 비교 행렬(동일물에 대해서는 1의 값, 비동일물에 대해서는 0의 값을 포함함) 및 그리브스코브 등(Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986))의 가중 비교 행렬[Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 기술되어 있음]; (2) 각 갭에 대해 3.0의 벌점 및 각 갭의 각 기호에 대해 추가 0.10 벌점; 및 (3) 말단 갭에 대해서는 무벌점을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "동일성"이란 용어는 검사 및 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 간의 비교를 나타낸다. 1가지 비제한적 예에서, "~에 적어도 90% 동일한"은 참조 폴리펩타이드에 대해 90 내지 100%의 동일성 %를 의미한다. 90% 수준 또는 그 이상의 동일성은 예시적 목적으로 가정해보면 100개의 아미노산의 검사 및 참조 폴리뉴클레오타이드 길이를 비교할 때, 검사 폴리펩타이드의 아미노산 중 10%(즉, 100개 중 10개) 이하가 참조 폴리펩타이드의 아미노산과 상이하다는 사실을 나타낸다. 이와 유사하게 검사 및 참조 폴리뉴클레오타이드 간에도 비교할 수 있다. 이러한 차이는 아미노산 서열의 전 길이를 따라 무작위로 분포된 점 돌연변이로서 나타날 수도 있고, 또는 허용될 수 있는 최대 수까지, 예컨대 10/100 아미노산 차이(약 90% 동일성)까지 다양한 길이로 하나 이상의 위치에서 응집되어 있을 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로서 정의된다. 상동성 또는 동일성 수준이 약 85 내지 90% 이상일 때는, 이 결과는 프로그램 및 갭 파라미터 세트와 무관해야 하고; 이러한 높은 수준의 동일성은 종종 소프트웨어에 관계없이 쉽게 평가될 수 있다.
본 명세서에 사용된, "실질적으로 동일한" 또는 "유사한"이란 용어는 관련 기술분야의 숙련된 자가 이해하는 바와 같이 상황에 따라 달라지지만, 당업자라면 쉽게 평가할 수 있는 것임은 물론이다.
본 명세서에 사용된, 정렬된 서열은 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열의 상응하는 위치를 정렬시키기 위한 상동성(유사성 및/또는 동일성)의 사용을 의미한다. 보통, 50% 또는 그 이상의 동일성으로 관련이 있는 2 이상의 서열이 정렬된다. 정렬된 서열 세트는 상응하는 위치에 정렬된 2 이상의 서열을 의미하고 게놈 DNA 서열과 정렬된 EST 및 다른 cDNA와 같은 RNA 유래의 정렬 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된, "특이적으로 하이브리드화한다"는 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자(예, 올리고뉴클레오타이드)의 상보성 염기쌍 형성에 의한 어닐링을 의미한다. 당업자는 특이적 하이브리드화에 영향을 미치는 시험관내 및 생체내 파라미터, 예컨대 특정 분자의 길이 및 조성 등에 익숙하다. 시험관내 하이브리드화와 특히 관련이 있는 파라미터로는 또한 어닐링 및 세척 온도, 완충액 조성물 및 염 농도를 포함한다. 높은 엄중도에서 비특이적으로 결합된 핵산 분자를 제거하기 위한 세척 조건의 예는 0.1 x SSPE, 0.1% SDS, 65℃이고, 중간 엄중도에서는 0.2 x SSPE, 0.1% SDS, 50℃이다. 등가의 엄중도 조건은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 특정 용도에 적당한 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자의 특이적 하이브리드화를 달성하기 위해 상기 파라미터를 쉽게 조정할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 분리 또는 정제된 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 이의 생물학적 활성부는 실질적으로 세포성 물질 또는 단백질이 유래된 세포 또는 조직의 기타 불순 단백질이 실질적으로 없는, 또는 화학 합성되었을 때 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없는 것이다. 제조물은 이러한 순도를 평가하기 위해 당업자가 사용하는 표준 분석방법, 예컨대 박층크로마토그래피(TLC), 겔전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등으로 측정했을 때 쉽게 검출할 수 있는 불순물이 없는 것으로 보이면 실질적으로 제거된 것으로 결정될 수 있고, 또는 추가 정제에 의해 물질의 단백분해 및 생물학적 활성과 같은 이화학적 성질의 검출가능한 변화가 없을 정도로 충분히 순수한 것으로 결정될 수 있다. 거의 화학적으로 순수한 화합물을 생산하는 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 하지만, 거의 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 이러한 경우에, 추가 정제는 화합물의 비활성을 증가시킬 수도 있을 것이다.
세포성 물질이 실질적으로 없는 이란 용어는 세포성 성분이 분리된 세포의 세포성 성분으로부터 단백질이 분리되거나, 또는 단백질이 재조합 생산된, 단백질 제조물을 포함한다. 일 양태에 따르면, 세포성 물질이 실질적으로 없는 이란 용어는 프로테아제외 단백질(불순 단백질이라 불리기도 함)이 약 30%(건조중량 기준) 미만인, 일반적으로 프로테아제외 단백질이 약 20% 미만 또는 프로테아제외 단백질이 10% 또는 프로테아제외 단백질이 약 5% 미만인, 프로테아제 단백질 제조물을 포함한다. 프로테아제 단백질 또는 이의 활성부가 재조합 생산된 경우에는, 배양 배지가 실질적으로 없어야 하고, 즉 배양 배지가 프로테아제 단백질 제조물 용적의 약 20%, 10% 또는 5% 이하여야 한다.
본 명세서에 사용된, 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 이란 용어는 단백질의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 기타 화물질로부터 단백질이 분리된, 프로테아제 단백질의 제조물을 포함한다. 이 용어는 화학적 전구체 또는 프로테아제외 화학물질 또는 성분이 약 30%(건조중량 기준), 20%, 10%, 5% 또는 그 이하인 프로테아제 단백질의 제조물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 재조합 DNA 방법을 사용하는 재조합법에 의한 생산은 클로닝된 DNA에 의해 암호화된 단백질을 발현시키기 위한 분자생물학의 공지된 방법의 사용을 의미한다.
본 명세서에 사용된, 벡터(또는 플라스미드)는 이종 핵산을 이의 발현 또는 복제를 위해 세포 내로 도입시키는데 사용되는 독립된 구성요소를 의미한다. 벡터는 보통 에피솜성을 유지하지만, 게놈의 염색체 내로 유전자 또는 이의 일부를 통합시키도록 설계될 수 있다. 또한, 인공 염색체, 예컨대 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체 및 포유동물 인공 염색체인 벡터도 고려한다. 이러한 비히클의 선택 및 사용은 당업자에게 공지되어 있다.
본 명세서에 사용된, 발현은 핵산이 mRNA로 전사되어 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질로 해독되는 과정을 의미한다. 핵산이 게놈 DNA에서 유래된다면, 발현은 적당한 진핵생물 숙주 세포 또는 유기체가 선택된다면 프로세싱, 예컨대 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 발현 벡터는 DNA 단편을 발현시킬 수 있는 프로모터 영역과 같은 조절 서열과 작동가능하게 결합된 DNA를 발현시킬 수 있는 벡터를 포함한다. 상기 추가의 분절로는 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함할 수 있고, 경우에 따라 하나 이상의 복제 오리진, 하나 이상의 선택성 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 시그널 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA에서 유래되거나, 이 둘 모두의 구성요소를 함유할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 적당한 숙주 세포에 도입 시에 클로닝된 DNA를 발현시키는 재조합 DNA 또는 RNA 작제물, 예컨대 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 기타 벡터를 의미한다. 적당한 발현 벡터는 당업자에게 공지되어 있고, 진핵생물 세포 및/또는 원핵생물 세포에서 복제할 수 있고 에피솜성을 유지하거나 숙주 세포 게놈 내로 통합되는 것을 포함한다.
본 명세서에 사용된, 벡터는 또한 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스성 벡터"를 포함한다. 바이러스성 벡터는 외인성 유전자를 세포내로 전이시키기 위해 외인성 유전자에 작동가능하게 결합된 유전자조작된 바이러스(비히클 또는 셔틀로서)이다.
본 명세서에 사용된, 아데노바이러스는 사람에서 상기도 감염 및 결막염을 유발하는 DNA 함유 바이러스 그룹의 임의의 바이러스를 의미한다.
본 명세서에 사용된, 나출형 DNA는 백신 및 유전자요법에 사용될 수 있는 히스톤이 없는 DNA를 의미한다. 나출형 DNA는 형질전환 또는 형질감염이라는 처리가 된 유전자 전이 동안 세포에서 세포로 전달되는 유전자 물질이다. 형질전환 또는 형질감염에서, 수용체 세포에 의해 흡수되는 정제된 또는 나출형 DNA는 수용체 세포에게 새로운 특징 또는 표현형을 제공할 것이다.
본 명세서에 사용된, DNA 분절에 관한 것일 때, 실시가능하게 또는 작동가능하게 결합된 이란 분절들이 의도된 목적을 위해 협력하여 기능하도록 분절들이 배열되어 있음을 의미하며, 예컨대 전사는 프로모터에서 시작하여 암호화 분절을 통해 터미네이터로 진행된다.
본 명세서에 사용된, 단백질의 활성 또는 유전자 또는 핵산의 발현을 조절하는 제제는 단백질의 활성을 감소 또는 증가시키거나 또는 다른 방식으로 변경시키고, 또는 일부 방식에서는 세포 내에서 핵산의 발현을 상향조절 또는 하향조절하거나 또는 다른 방식으로 변경시킨다.
본 명세서에 사용된 "키메릭 단백질" 또는 "융합 단백질"은 다른 폴리펩타이드에 작동가능하게 결합된 폴리펩타이드를 의미한다. 본 명세서에 제공된 키메릭 또는 융합 단백질은 하나 이상의 FVII 폴리펩타이드 또는 이의 일부, 및 전사/해독 조절 시그널, 시그널 서열, 국재화를 위한 태그, 정제를 위한 태그, 면역글로불린 G 도메인의 일부 및/또는 표적화제 중 어느 하나 이상을 위한 하나 이상의 다른 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 또한, 키메릭 FVII 폴리펩타이드는 이 폴리펩타이드의 내인성 도메인 또는 영역이 다른 폴리펩타이드로 교환된 것을 포함한다. 이러한 키메릭 또는 융합 단백질은 재조합 수단에 의해 융합 단백질로 생산된 것, 화학적 수단, 예컨대 설프하이드릴 그룹에 대한 커플링 등의 화학적 커플링에 의해 생산된 것, 및 임의의 다른 방법으로 생산된 것을 포함하며, 이로써 적어도 하나의 폴리펩타이드(즉, FVII) 또는 이의 부분이 링커(들)를 통해 다른 폴리펩타이드에 직접 또는 간접적으로 결합된다.
본 명세서에 사용된, 융합 단백질에 대해 언급할 때의 작동가능하게 결합된 이란 서로 프레임내 융합된 프로테아제 폴리펩타이드와 프로테아제외 폴리펩타이드를 의미한다. 프로테아제외 폴리펩타이드는 프로테아제 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
본 명세서에 사용된, 표적화제는 세포 표면 수용체와 같은 세포 표면 분자에 특이적 결합을 제공하고, 몇몇 경우에는 결합된 접합체 또는 이의 부분을 내재화시킬 수 있는 단백질 또는 이의 유효부와 같은 임의의 잔기이다. 또한, 표적화제는 접합체의 친화도 분리 또는 정제; 표면에 대한 접합체의 부착; 또는 접합체 또는 접합체를 함유하는 복합체의 검출 등을 촉진하거나 용이하게 하는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된, 분자의 유도체 또는 유사체는 분자 유래의 부분 또는 이 분자의 변형 버전을 의미한다.
본 명세서에 사용된, "질환 또는 장애"는 감염, 후천적 병태, 유전자 상태를 포함한, 이에 국한되지 않는 원인이나 병태에서 야기되고 식별가능한 증상들을 특징으로 하는 유기체의 병리학적 상태를 의미한다. 본 명세서에서 당해의 질환 및 장애는 응고를 수반하는 것, 예컨대 응고 단백질에 의해 매개되는 것 및 응고 단백질이 병인 또는 병리에 역할을 하는 것이다. 또한, 질환 및 장애는 혈우병에서와 같이 단백질의 부재에 의해 유발되는 것을 포함하고, 특히 본 발명의 대상은 응고 단백질의 결함 결핍으로 인해 응고가 일어나지 않는 장애이다.
본 명세서에 사용된 "응고촉진제"는 혈액 응고를 촉진하는 모든 물질을 의미한다.
본 발명에 사용된, "항응고제"는 혈액 응고를 저해하는 모든 물질을 의미한다.
본 명세서에 사용된, "혈우병"은 혈액 응고인자의 결핍으로 인해 유발된 출혈 장애를 의미한다. 혈우병은 예컨대 응고 인자의 부재, 발현 감소 또는 기능 감소 등의 결과일 수 있다. 가장 일반적인 혈우병 종류는 혈우병 A로서, 제VIII 인자의 결핍으로 인해 나타난다. 두번째로 가장 일반적인 혈우병 종류는 혈우병 B이며, 이는 제IX 인자의 결핍으로 인해 나타난다. FXI 결핍증으로도 불리는 혈우병 C는 혈우병의 가볍고 덜 일반적인 형태이다.
본 명세서에 사용된, "선천적 혈우병"은 유전되는 혈우병 종류를 의미한다. 선천적 혈우병은 응고 인자의 생산이 없거나, 감소되거나, 비기능성인 응고 인자 유전자의 돌연변이, 결실, 삽입 또는 기타 변형으로부터 나타난다. 예를 들어, 제VIII 인자 및 제IX 인자와 같은 응고 인자 유전자의 유전성 돌연변이는 각각 선천적 혈우병, 혈우병 A 및 B를 초래한다.
본 명세서에 사용된 "후천적 혈우병"은 FVIII을 불활성화시키는 자가항체의 생산으로부터 성인기에 발생하는 혈우병의 종류를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "출혈 장애"는 출혈을 저지하는 능력이 감소된 피검체의 상태를 의미한다. 출혈 장애는 선천적 또는 후천적일 수 있고, 응고 경로의 결함이나 결핍, 혈소판 활성의 결함이나 결핍 또는 혈관 결함 등으로부터 초래될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "후천적 출혈 장애"는 간 질환, 비타민 K 결핍증 또는 쿠마딘(와파린) 또는 다른 항응고제 요법과 같은 병태에 의해 유발되는 응고 결핍으로부터 초래되는 출혈 장애를 의미한다.
본 명세서에 사용된, 질환 또는 병태를 보유한 피검체를 "치료하는"이란 폴리펩타이드, 조성물 또는 본 명세서에 제공된 기타 산물이 피검체에 투여되는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된, 치료제, 치료 요법, 방사선보호제, 또는 화학치료제는 당업자에게 공지된 백신을 비롯한 통상의 약물 및 약물 치료제를 의미한다. 방사능치료제는 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에 사용된 치료는 병태, 장애 또는 질환의 증상들이 호전되거나, 다른 방식으로 유리하게 변경되는 모든 방식을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 치료법 및/또는 치유를 포함한다. 또한, 치료는 본 명세서에 제공된 조성물의 모든 약제학적 사용을 포함한다. 또한, 치료는 본 명세서에 제공된 변형 FVII 및 조성물의 임의의 약제학적 사용을 포함한다.
본 발명에 사용된, 약제학적 조성물 또는 다른 치료제의 투여와 같은 치료에 의한 특정 질환 또는 장애의 증상들의 호전은, 영구적 또는 일시적, 지속적 또는 일과성 여부에 관계없이, 조성물 또는 치료제의 투여에 기인할 수 있는 또는 그 투여와 관련이 있을 수 있는 증상들의 임의의 완화를 의미한다.
본 명세서에 사용된, 방지 또는 예방은 질환이나 병태가 발생할 위험을 감소시키는 방법을 의미한다. 예방은 질환이나 병태의 발생 위험의 감소 및/또는 질환의 증상이나 진행의 악화 방지 또는 질환의 증상이나 진행의 악화 위험의 감소를 포함한다.
본 명세서에 사용된 특정 질환을 치료하기 위한 화합물 또는 조성물의 유효량은 그 질환과 관련이 있는 증상을 호전시키거나, 일부 방식에서는 저감시키기에 충분한 양이다. 이러한 양은 단일 투여량으로 투여될 수 있고, 또는 요법에 따라 투여될 수 있어, 효과적이다. 이 양은 질환을 치유할 수 있지만, 통상 질환의 증상을 호전시키기 위해 투여한다. 보통, 증상의 원하는 호전을 달성하기 위해서는 반복 투여가 필요하다.
본 명세서에 사용된, "치료학적 유효량" 또는 "치료학적 유효 용량"은 적어도 치료 효과를 나타내기에 충분한, 제제, 화합물, 물질 또는 화합물을 함유하는 조성물을 의미한다. 유효량은 질환이나 장애의 증상을 예방하거나, 치유하거나, 호전시키거나, 정지시키거나 또는 부분적으로 정지시키는데 필요한 치료제의 양이다.
본 명세서에 사용된, 치료되는 "환자" 또는 "피검체"는 사람 및/또는 비-사람 동물, 예컨대 포유동물을 포함한다. 포유동물은 영장류, 예컨대 사람, 침팬지, 고릴라 및 원숭이; 가축 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 돼지, 염소, 소; 및 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터 및 저빌을 포함한다.
본 명세서에 사용된, 조합은 두 항목 간에 또는 그 이상의 항목 간에 임의의 연합을 의미한다. 연합은 공간적일 수 있고, 또는 공통 목적을 위한 2 이상의 항목의 사용을 의미하기도 한다.
본 명세서에 사용된, 조성물은 2 이상의 산물 또는 화합물(예, 제제, 변조인자, 조절인자 등)의 임의의 혼합물을 의미한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성 또는 비수성 제형 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "제조품"은 제조되어 판매되는 제품이다. 본원을 통해 사용된 바와 같이, 이 용어는 포장 물품에 함유된 변형 프로테아제 폴리펩타이드 및 핵산을 내포하기 위한 것이다.
본 명세서에 사용된, 유체(fluid)는 흐를 수 있는 모든 조성물을 의미한다. 따라서, 유체는 반고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 젤, 로션, 크림의 형태인 조성물 및 이러한 다른 조성물을 내포한다.
본 명세서에 사용된, "키트"는 포장된 조합물을 의미하며, 경우에 따라 조합물의 구성요소를 사용하여 방법을 실행하는 시약 및 다른 산물 및/또는 성분을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 변형 프로테아제 폴리펩타이드 또는 핵산 분자와 생물학적 활성 또는 성질의 평가, 진단 및 투여(이에 국한되지 않는다) 등의 목적을 위한 다른 항목을 함유하는 키트가 제공된다. 키트는 경우에 따라 사용 지침서를 포함한다.
본 명세서에 사용된, 항체는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역으로 구성된 Fab 단편과 같은 항체 단편을 포함한다.
본 명세서에 사용된 수용체는 특정 리간드에 대한 친화도를 보유하는 분자를 의미한다. 수용체는 자연 발생의 분자 또는 합성 분자일 수 있다. 또한, 수용체는 당업계에서 항리간드로 불리기도 한다.
본 명세서에 사용된, 동물은 모든 동물, 예컨대 사람, 고릴라 및 원숭이를 포함하는 영장류; 마우스 및 래트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 염소, 소, 사슴, 양과 같은 반추동물; 돼지와 같은 양류, 및 기타 동물을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 비-사람 동물은 고찰되는 동물로서 사람을 제외한다. 본 발명에 제공된 프로테아제는 임의의 급원, 동물, 식물, 원핵생물 및 진균류 유래의 프로테아제이다.
본 명세서에 사용된 유전자요법은 이 요법이 추구하는 장애 또는 병태를 보유한 포유동물, 특히 사람의 특정 세포, 표적 세포 내로 DNA와 같은 이종 핵산의 전이를 수반한다. DNA와 같은 핵산은 선택된 표적 세포 내로 직접 또는 벡터나 다른 전달 비히클 등을 통해, DNA와 같은 이종 핵산이 발현되어, 이로 인해 암호화된 치료 산물이 생산되도록 하는 방식으로 도입된다. 대안적으로, DNA와 같은 이종 핵산은 일부 방식에서는 치료 산물을 암호화하는 DNA의 발현을 매개할 수 있거나, 또는 일부 방식에서는 치료 산물의 발현을 직접 또는 간접적으로 매개하는 펩타이드 또는 RNA와 같은 산물을 암호화할 수 있다. 또한, 유전자요법은 핵산이 도입되는 세포 또는 포유동물에 의해 생성되는 유전자 산물을 보충하거나 결함 유전자를 교체하는 유전자 산물을 암호화하는 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다. 도입된 핵산은 포유동물 숙주에서 정상적으로 생산되지 않거나, 치료학적 유효량으로 또는 치료학적으로 유용한 시간에 생산되지 않는 프로테아제 또는 변형 프로테아제와 같은 치료 화합물을 암호화할 수 있다. 치료 산물을 암호화하는 DNA와 같은 이종 핵산은 병에 걸린 숙주의 세포 내로 도입되기 전에 변형되어 그 산물 또는 이의 발현을 증강시키거나 또는 다른 방식으로 변경시킬 수 있다. 또한, 유전자요법은 유전자 발현의 저해제, 억제제 또는 다른 변조인자(modulator)의 전달을 수반할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 이종 핵산은 이 핵산이 발현되는 세포에 의해 정상적으로는 생체내에서 생산되지 않거나, 또는 이 세포에 의해 생산되지만 다른 유전자좌에 있거나 다르게 발현되거나, 또는 전사, 해독 또는 다른 조절성 생화학 과정에 영향을 미쳐 DNA와 같은 내인성 핵산의 발현을 변조시키는 매개인자를 매개하거나 암호화하는 핵산이다. 이종 핵산은 일반적으로 이 핵산이 도입되는 세포에 대해 내인성인 것이 아니라, 다른 세포에서 수득되거나 합성 제조된 것이다. 이종 핵산은 내인성일 수 있으나, 다른 유전자좌에서 발현되거나, 그 발현이 변경된 핵산이다. 이러한 핵산은 반드시 그렇지는 않지만, 일반적으로 세포에 의해 정상적으로 생산되지 않거나 또는 이 핵산이 발현되는 세포에서와 같은 방식으로 생산되지 않는 RNA 및 단백질을 암호화한다. 이종 핵산, 예컨대 DNA는 또한 이질(foreign) 핵산, 예컨대 DNA라 부를 수도 있다. 따라서, 이종 핵산 또는 이질 핵산은 게놈에서 발현되는 상응하는 핵산 분자, 예컨대 DNA와 정확한 배향 또는 위치에 존재하지 않는 핵산 분자를 포함한다. 또한, 다른 유기체 또는 종 유래의 핵산 분자라고 부를 수도 있다(즉, 외인성).
당업자가 핵산이 발현되는 세포에 대해 이종성이거나 이질성인 것으로 인식하거나 생각할 수 있는 DNA와 같은 모든 핵산은 본 명세서에서 이종 핵산에 포함되며, 이종 핵산은 내인적으로 발현되기도 하는 외인적으로 첨가된 핵산을 포함한다. 이종 핵산의 예로는 추적할 수 있는 마커 단백질, 예컨대 내약물성을 부여하는 단백질을 암호화하는 핵산, 항암제, 효소 및 호르몬과 같이 치료학적 유효 물질을 암호화하는 핵산, 및 항체와 같이 다른 종류의 단백질을 암호화하는 DNA와 같은 핵산을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이종 핵산에 의해 암호화된 항체는 이종 핵산이 도입된 세포 표면에서 분비되거나 발현될 수 있다.
본 명세서에 사용된, 유전자 요법의 치료학적 유효 산물은 이종 핵산, 보통 DNA에 의해 암호화된 산물로서, 숙주에 핵산 도입 시에 질환을 치유하거나, 선천적 또는 후천적 질환의 증상, 징후를 호전시키거나 제거하는 산물이 발현된다. 또한, RNAi 및 안티센스와 같은 생물학적 활성 핵산 분자도 포함된다.
본 명세서에 사용된, 폴리펩타이드가 언급된 아미노산 서열로 "본질적으로 이루어진"이란 언급은 전체 길이의 폴리펩타이드 중 언급된 부분, 또는 이의 단편만이 존재한다는 것을 의미한다. 이러한 폴리펩타이드는 경우에 따라, 일반적으로 다른 급원 유래의 추가의 아미노산을 포함하거나, 또는 다른 폴리펩타이드에 삽입될 수 있다.
본 명세서에 사용된, 하나를 뜻하는 어형은 다른 분명한 언급이 없는 한 복수의 관련물을 포함한다. 예를 들어, "세포외 도메인"을 포함하는 화합물에 대한 언급은 하나 또는 복수의 세포외 도메인을 보유하는 화합물을 포함한다.
본 명세서에 사용된, 범위 및 양은 "약" 특수값 또는 범위로서 표현될 수 있다. 또한, 정확한 양도 포함된다. 따라서, "약 5개 염기"는 "약 5개 염기"와 "5개 염기"를 의미한다.
본 명세서에 사용된, "임의의" 또는 "임의로"는 후술되는 사건 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않으며, 이 표현은 그러한 사건이나 상황이 일어나는 경우와 일어나지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 임의로 치환된 그룹은 그룹이 치환되거나 치환되지 않은 것임을 의미한다.
본 명세서에 사용된, 임의의 보호 그룹, 아미노산 및 다른 화합물에 대한 약어는 다른 표시가 없는 한 통용되는 용법, 공식 약어 또는 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature(Biochem. 11: 1726 (1972) 참조)에 따른다.
B. 지혈 개론
본 발명은 변형 제VII 인자(FVII) 폴리펩타이드를 제공한다. 이러한 FVII 폴리펩타이드는 증가된 응고 활성을 보유하도록 설계된다. 따라서, 이러한 폴리펩타이드는 다양한 용도와 이용가능성이 있으며, 그 예로는 지혈 변조 및 다른 관련 생물학적 과정을 위한 치료제가 있다. 본 명세서에 제시된 변형과 이와 같이 변형된 FVII 분자의 용도를 이해하기 위해서는 지혈계와 혈액 응고 캐스캐이드의 이해가 유리하다. 다음 논의는 이러한 배경을, 제VII 인자 및 이의 변형에 대한 논의의 서문으로서 제공한다.
지혈은 혈관계 상해로부터 초래되는 출혈을 기원으로 하는 생리학적 기전이다. 정상 지혈은 세포 성분과 가용성 혈장 단백질에 의존적이고, 최종적으로 혈전 형성으로 이어지는 일련의 시그널링 사건들을 수반한다. 응고는 혈관에 상해가 일어나고 내피 세포가 손상된 후 빠르게 개시된다. 응고의 1차 단계는 혈소판이 활성화되어 상해 부위에 지혈전(hemostatic plug)을 형성한다. 2차 지혈은 이어서 혈장 응고 인자를 수반하고, 이 인자는 단백분해 캐스캐이드에서 작용하여 혈소판전을 강화시키는 피브린 가닥을 형성시킨다.
혈관 상해 시에, 직접 상해 부위로의 혈액 흐름은 내피하의 결합 조직 상에 새로 노출된 섬유원성 교원섬유(fibrillar collagen)에 혈소판이 부착하도록 하는 혈관 수축에 의해 제한된다. 이러한 부착은 상해 3초 내에 내피에 결합하여, 혈소판 부착과 응집을 촉진하는 폰빌레브란트 인자(vWF)에 의존적이다. 응집된 혈소판의 활성화는 ADP, ATP, 트롬복산 및 세로토닌을 비롯한 다양한 인자들을 분비시킨다. 또한, 부착 분자, 피브리노겐, vWF, 트롬보스폰딘 및 피브로넥틴도 방출된다. 이러한 분비는 혈소판의 추가의 부착 및 응집, 증가된 혈소판 활성화 및 혈관 수축, 혈액 응고 효소 복합체의 어셈블리를 위한 플랫폼으로서 작용하는 혈소판 표면에 대한 음이온성 인지질의 노출을 촉진한다. 이 혈소판들은 형태를 변화시켜 위족(pseudopodia) 형성을 야기하고, 이는 추가로 다른 혈소판들에 대한 응집을 촉진하여 이완 혈소판전(loose platelet plug)을 초래한다.
펩티다제(응고 캐스캐이드)의 응고 캐스캐이드는 동시에 개시된다. 응고 캐스캐이드는 단백분해 절단을 포함하는 일련의 활성화 사건을 수반한다. 이러한 캐스캐이드에서, 세린 프로테아제의 불활성 단백질(자이모겐이라고도 함)은 하나 이상의 펩타이드 결합의 절단에 의해 활성 프로테아제로 전환되고, 그 다음 이 캐스캐이드의 다음 자이모겐 분자에 대한 활성화 프로테아제로서 작용하여, 최종적으로 피브린의 가교결합에 의해 응괴 형성을 초래한다. 예를 들어, 캐스캐이드는 트롬빈(프로트롬빈의 절단으로부터)과 같은 활성화된 분자를 생성하고, 이는 추가로 혈소판을 활성화시키고 피브리노겐의 절단으로부터 피브린을 생성시키기도 한다. 그 다음, 피브린은 혈소판전 주위에 가교결합 중합체를 형성시켜 응괴를 안정화시킨다. 상해의 수복 시에, 피브린은 주요 성분이 플라스미노겐과 조직형 플라스미노겐 활성인자(tPA)인 피브린용해계에 의해 분해된다. 상기 단백질들은 중합하는 피브린 내로 혼입되어 서로 상호작용하여 플라스민을 생성하고, 이것은 그 다음 피브린에 작용하여 사전형성된 응괴를 용해한다. 응괴 형성 동안, 응고인자 저해제가 혈액을 통해 순환하여 상해 부위 너머까지 응괴 형성을 방해한다.
상해부터 응괴 형성 및 이어 피브린용해까지 상기 계의 상호작용은 이하에 설명한다.
1. 혈소판 부착 및 응집
혈액의 응고는 정상 상태 하에서는 적극적으로 우회된다. 혈관 내피는 혈관확장을 지지하고 혈소판 부착과 활성화를 저해하며, 응고를 억제하고 피브린 절단을 증강시키고 항염증성 특성이 있다. 혈관 내피 세포는 혈소판 응집을 저해하고 혈관을 확장시키는 산화질소(NO) 및 프로스타사이클린(prostacylin)과 같은 분자를 분비한다. 이러한 분자들의 방출은 가용성 구아닐레이트 사이클라제(sGC) 및 cGMP 의존적 단백질 키나제 I(cGKI)을 활성화시키고 사이클릭 구아노신 모노포스페이트(cGMP) 수준을 증가시켜, 혈관벽 내의 평활근의 이완을 유발한다. 더욱이, 내피세포는 혈소판으로부터 방출된 ADP를 아데닌 뉴클레오타이드 혈소판 저해제로 전환시켜 혈소판 활성화 및 응집을 제어하는 CD39와 같은 세포 표면 ADPase를 발현한다. 또한, 내피는 피브린용해 캐스캐이드의 효소들을 조절하는데 있어서 중요한 역할을 한다. 내피세포는 모두 응괴 제거를 촉진하는, 조직형 및 우로키나제 플라스미노겐 활성인자의 분비뿐만 아니라 플라스미노겐(아넥신 II) 및 우로키나제의 수용체들의 발현을 통해 플라스민의 생성을 직접 촉진한다. 혈전유발성 조절의 마지막 층에서, 내피세포는, 트롬빈 및 다른 응고 인자의 안티트롬빈 III 저해의 반응속도론을 증가시키는 헤파란 설페이트를 생산하여 응고 캐스캐이드를 저해하는데 있어서 능동적인 역할을 한다.
하지만, 급성 혈관 외상 하에서는 혈관수축신경 기전이 우세하고, 내피는 사실상 혈전유발성, 응고촉진성 및 염증유발성이 된다. 이것은 혈관 평활근 세포의 수축을 유인하는 혈관 평활근 세포 상의 ADP, 세로토닌 및 트롬복산의 직접 작용; 및 내피 확장제, 즉 아데노신, NO 및 프로스타사이클린의 감소에 의해 달성된다(Becker, Heindle et al., 2000). 울혈 혈전의 형성을 야기하는 내피 기능 변화의 주요 동기는 혈액과 세포외 기질(ECM) 성분 사이에 내피 세포 장벽의 상실이다(Ruggeri(2002) Nat Med 8: 1227-1234). 혈행 혈소판은 내피 병변 영역을 식별하고 구별하여, 노출된 내피하층에 부착한다. 이들과 다양한 혈전형성성 기질 및 국소 발생 또는 방출된 작용제(agonist)와의 상호작용은 혈소판 활성화를 초래한다. 이러한 과정은 처리 2단계, 즉 1) 부착: 1차적으로 표면에 대한 구속(tethering), 및 2) 응집: 혈소판-혈소판 유착으로 표현된다(Savage et al.(2001) Curr Opin Hematol 8: 270-276).
혈소판 부착은 혈행 혈소판이 세포 표면 상의 교원섬유 결합 단백질과의 상호작용, 및 또한 내피에 존재하는 vWF와의 상호작용을 통해 노출된 교원섬유에 결합할 때 개시된다. vWF 단백질은 내피에 의해 2가지 방향, 즉 기저측쪽(basolateral)으로, 그리고 혈류 내로 분비되는, 다양한 크기의 다량체 구조이다. 또한, vWF는 제VIII 인자에 결합하며, 이는 제VIII 인자의 안정화 및 혈행 중에서의 생존에 중요하다.
혈소판 부착 및 후속 활성화는 vWF가 A1 도메인을 통해 GPIb(혈소판 당단백질 수용체 복합체 GPIb-IX-V의 일부)에 결합할 때 달성된다. vWF와 GPIb 간의 상호작용은 전단력에 의해 조절되어, 전단 응력의 증가는 이에 상응하는 vWF의 GPIb에 대한 친화도를 증가시킨다. VLA-2로서 백혈구 상에 알려져 있는 인테그린 α1β2는 혈소판 상의 주요 교원섬유 수용체이며, 이 수용체를 통한 체결은 혈소판 활성화에 기여하는 세포내 시그널을 생성한다. α1β2를 통한 결합은 저친화도(lower-affinity) 교원섬유 수용체, GP VI의 체결을 촉진한다. 이는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 일부이며, 혈소판 활성화의 가장 강력한 세포내 시그널을 생성하는 수용체이다. 혈소판 활성화는 트롬복산 A2로 전환되는 아데노신 디포스페이트(ADP)를 방출시킨다.
또한, 혈소판 활성화는 혈소판 당단백질 IIb-IIIa(GP IIb-IIIa) 수용체의 표면 발현을 야기하고, GP IIb-IIIa 수용체는 이 수용체를 통해 혈소판을 결합시키는 피브리노겐 분자로 인해 혈소판을 서로 부착시킨다(즉, 응집). 이것은 결과적으로 상해 부위에 혈소판전을 형성시켜 추가의 혈액 손실의 방지를 돕는 한편, 손상된 혈관 조직은 혈소판전 주위에 안정화 피브린 메쉬의 형성 및 응고 캐스캐이드를 개시시키는 인자들을 방출한다.
2. 응고 캐스캐이드
응고 경로는 각 효소가 자이모겐 또는 불활성 형태로 혈장에 존재하는 단백분해 경로이다. 자이모겐의 절단은 전구체 분자로부터 활성 형태를 방출시키기 위해 조절된다. 또한, 당단백질 FVIII 및 FV와 같은 활성화된 프로테아제의 보조인자도 역시 이 캐스캐이트 반응에서 활성화되고 응괴 형성에 한 역할을 한다. 이 경로는 활성화 과정을 통제하는 일련의 양성 및 음성 피드백 루프로서 작용하고, 여기서 궁극적 목표는 가용성 피브리노겐을 피브린으로 전환시켜 응괴를 형성시킬 수 있는 트롬빈을 생산하는 것이다. 응고에 관여하는 인자들은 전형적으로 로마 숫자로 표시되고, 활성화된 형태를 나타내기 위해 소문자 "a"가 부가된다. 이하 표 3은 이러한 인자들의 예시 목록과 이들의 일반명 및 응고 캐스캐이드에서의 역할을 설명한다. 일반적으로, 이 단백질들은 응고의 내인성, 외인성 또는 공통 경로 중 하나 이상을 통해 혈액 응고에 참여한다(도 1 참조). 이하에 논의되는 바와 같이, 이러한 경로들은 서로 연결되어 있고, 혈액 응고는 1차 응고 개시인자인 제VII 인자(FVII)에 의한 세포계 활성화 모델을 통해 일어나는 것으로 생각되고 있다.
응고 인자
인자 일반명 경로 특성
I 피브리노겐 양쪽성 -
II 프로트롬빈 양쪽성 N-말단 Gla 도메인 함유
III 조직인자 외인성 -
IV 칼슘 양쪽성 -
V 프로악셀레린, 불안정 인자, 촉진인자 글로불린 양쪽성 단백질 보조인자
VI (Va) 악셀레린 - (제V 인자와 중복됨)
VII 프로컨버틴, 혈청 프로트롬빈 전환 촉진인자(SPCA) 코트롬보플라스틴 외인성 Gla 도메인을 보유한 엔도펩티다제
VIII 항혈우병 인자 A, 항혈우병 글로불린(AHG) 내인성 단백질 보조인자
IX 크리스마스 인자, 항혈우병 인자 B, 혈장 트롬보플라스틴 성분(PTC) 내인성 Gla 도메인을 보유하는 엔도펩티다제
X 스튜어트-프라워 인자 양쪽성 Gla 도메인을 보유한 엔도펩티다제
XI 혈장 트롬보플라스틴 전구물질(PTA) 내인성 엔도펩티다제
XII 하게만 인자 내인성 엔도펩티다제
XIII 프로트랜스글루타미다제, 피브린 안정화 인자(FSF), 피브리노리가제 양쪽성 트랜스펩티다제
* 이 표는 M.W.King(2006) med.unibs.it/~marchesi/blood.html에서 발췌된 것임
역사적으로, 트롬빈의 생성은 3가지 경로, 즉 활성화된 제X 인자(FXa) 생성의 대체 경로를 제공하는 내인성(이 경로의 모든 성분들이 혈장에 내인성임을 암시한다) 및 외인성(이 경로의 하나 이상의 성분들이 혈장에 외인성임을 암시한다) 경로, 및 트롬빈을 형성시키는 마지막 공통 경로로 분류되었다(도 1). 이 경로들은 응고를 실시하는 상호연결되고 상호의존적인 과정에 함께 참가한다. 이 경로들을 설명하는 세포를 기반으로 한 응고 모델이 개발되었다(도 2)(Hoffman et al.(2001) Thromb Haemost 85: 958-965). 이 모델에서, "외인성" 및 "내인성" 경로들은 다른 세포 표면, 즉 각각 조직인자(TF) 보유 세포 및 혈소판에서 실시된다. 응고 과정은 독특한 단계들, 즉 개시, 증폭 및 전파로 분리되고, 이 과정 동안 외인성 및 내인성 경로는 다양한 단계에서 기능하여 응괴 형성에 충분한 양의 피브리노겐을 피브린으로 전환시키는데 필요한 트롬빈을 대량으로 생산한다.
a. 개시
FVII는 응고 캐스캐이드의 개시를 담당하는 응고 인자인 것으로 생각되고 있고, 상기 개시는 TF와의 상호작용에 의존적이다. TF는 평활근 세포, 섬유아세포, 단핵구, 림프구, 과립구, 혈소판 및 내피세포와 같은 다양한 세포에 의해 발현되는 막관통 당단백질이다. 골수성 세포 및 내피 세포는 이들이 염증유발성 사이토카인 등에 의해 자극될 때에만 TF를 발현한다. 하지만, 평활근 세포 및 섬유아세포는 구성적 방식으로 TF를 발현한다. 따라서, 이 세포들이 일단 조직 상해 후에 혈류와 접촉하게 되면, 응고 캐스캐이드는 혈장 내의 제VII 인자 또는 FVIIa와 TF의 결합에 의해 빠르게 개시된다.
이하에 논의되는 바와 같이, 혈액에 존재하는 FVII의 대부분은 자이모겐 형태이고, 소량, 약 1%는 FVIIa로서 존재한다. 하지만, TF 결합의 부재 하에서는 FVIIa도 자이모겐 유사 특성을 나타내어, TF와 복합체를 형성할 때까지 유의적인 활성을 나타내지 않는다. 따라서, 혈장 FVII는 단백분해 절단에 의한 활성화, 및 완전한 활성을 위한 TF와의 상호작용을 통한 추가의 입체형태 변화를 필요로 한다. 다양한 프로테아제, 예컨대 제IXa, Xa, XIIa 인자 및 트롬빈은 TF의 존재 하에 가속되는 과정인 FVII 절단을 시험관내에서 수행할 수 있는 것으로 밝혀져 있다. FVIIa 자체도 TF의 존재 하에 FVII를 활성화시킬 수 있으며, 이 과정은 자가활성화라 불린다. 혈액에 존재하는 소량의 FVIIa는 FXa 및/또는 FIXa에 의한 활성화로 인한 것으로 생각되고 있다(Wildgoose et al.(1992) Blood 80: 25-28, 및 Butenas et al.(1996) Biochemistry 35: 1904-1910). 따라서, TF/FVIIa 복합체는 TF에 FVIIa의 직접 결합을 통해, 또는 TF에 FVII의 결합 후, FXa, FIXa, FXIIa 또는 FVIIa 자체와 같은 혈장 프로테아제에 의한 FVII의 FVIIa로의 후속 활성화를 통해 형성될 수 있다. TF/FVIIa 복합체는 응고의 "외인성 경로"로 알려진 것에서 소량의 FX를 FXa로 활성화시키는 TF 보유 세포에 고착된 상태를 유지한다.
또한, TF/FVIIa 복합체는 소량의 FIX를 FIXa로 절단한다. FXa는 이의 보조인자 FVa와 결합하여 TF 보유 세포 상에서 복합체를 또한 형성하고, 그 후 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환시킬 수 있다. 하지만, 생산된 소량의 트롬빈은 완전한 응고에 필요한 피브린 형성을 지지하는 데에는 부족하다. 또한, 임의의 활성 FXa 및 FIXa는 안티트롬빈 III(AT-III) 및 다른 서핀류(serpin)에 의해 혈행 중에서 저해되고, 이에 대해서는 이하에 더 상세하게 논의된다. 이것은 보통 혈행 중의 응괴 형성을 방해할 수 있는 하지만, 상해의 존재 하에서 혈관구조에 손상은 이 트롬빈 형성 부위에서 혈소판 응집 및 활성화를 야기하여, 응고 시그널을 증폭시킨다.
b. 증폭
증폭은 트롬빈이 혈소판에 결합하여 혈소판을 활성화시킬 때 일어난다. 활성화된 혈소판은 이의 알파 과립으로부터 FV를 방출하고, 이는 트롬빈에 의해 FVa로 활성화된다. 또한, 트롬빈은 혈소판 막 상의 FVIII/vWF 복합체로부터 FVIII을 방출 및 활성화시키고, FXI을 FXIa로 절단한다. 이 반응들은 표면에 FVa, FVIIIa 및 FIXa를 보유하는 활성화된 혈소판을 생성시키고, 이는 전파 단계동안 트롬빈을 대량 생성시키는 단계가 된다.
c. 전파
응고의 전파는 상해 부위에서 다수의 혈소판 표면에서 일어난다. 전술한 바와 같이, 활성화된 혈소판은 표면에 FXIa, FVIIIa 및 FVa를 보유한다. 여기서 외인성 경로가 실행된다. FXIa는 FIX를 FIXa로 활성화시키고, 그 다음 FVIIIa와 결합할 수 있다. 이 과정은 TF 보유 세포 상의 TF/FVIIa 복합체에 의한 FIX의 절단을 통해 생성되는 소량의 FIXa 외에, 최종적으로 유의적인 양의 FX를 FXa로 활성화시킬 수 있는 다수의 FXIa/FVIIIa 복합체를 생성시킨다. FXa 분자는 FVa에 결합하여, 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시키는 프로트롬비나제 복합체를 생성시킨다. 트롬빈은 양성 피드백 루프에서 작용하여 훨씬 더 많은 혈소판을 활성화시키고, 다시 증폭 단계에서 설명한 과정들을 개시시킨다.
곧, 적당한 복합체를 갖는 충분한 수의 활성화된 혈소판이 존재하여, 피브리노겐으로부터 충분한 양의 피브린을 생성하기에 충분히 많은 트롬빈 폭발을 일으켜 지혈성 피브린 응괴를 형성한다. 피브리노겐은 혈장에 가용성인 이량체이고, 트롬빈에 의해 절단될 때 피브리노펩타이드 A와 피브리노펩타이드 B를 방출한다. 피브리노펩타이드 B는 그 다음 트롬빈에 의해 절단되고, 이러한 제2 단백분해 절단에 의해 형성된 피브린 단량체는 자발적으로 불용성 겔을 형성한다. 중합된 피브린은 비공유 및 정전기력에 의해 함께 유지되고, 트롬빈에 의한 FXIII의 절단에 의해 생성된 아미드교환 효소 제XIIIa 인자(FXIIIa)에 의해 안정화된다. 또한, 트롬빈은 TAFI를 활성화시켜, 응괴 표면에서의 플라스민 생성을 저감시켜 피브린용해를 저해한다. 또한, 트롬빈은 그 자체가 응괴 구조 내로 혼입되어 더욱 안정화된다. 이러한 불용성 피브린 응집물(응괴)은 응집된 혈소판(혈전)과 함께 손상된 혈관을 차단하고 추가의 출혈을 방지한다.
3. 응고 조절
응고 동안, 캐스캐이드는 응괴 형성을 더욱 저해하기 위해 구성적이며 자극된 과정에 의해 조절된다. 이러한 조절 기전에는 여러가지 이유가 있다. 첫째, 조절은 피브린 응괴 형성에 의해 조직의 허혈을 제한하는데 필요하다. 둘째, 조절은 조직 상해 부위에만 응괴 형성을 국재화시켜 광범위한 혈전증을 방지한다.
조절은 여러 저해 분자들의 양이온에 의해 달성된다. 예를 들어, 안티트롬빈 III(AT-III) 및 조직인자 경로 저해제(TFPI)는 구성적으로 작업하여 응고 캐스캐이드의 인자들을 저해한다. AT-III은 트롬빈, FIXa 및 FXa를 저해하는 반면, TFPI는 FXa 및 FVIIa/TF 복합체를 저해한다. 혈소판 활성화를 통해 자극되는 추가의 인자인 단백질 C(Protein C)는 단백분해 절단 및 FVa와 FVIIIa의 불활성화를 통해 응고를 조절한다. 단백질 S는 단백질 C의 활성을 증강시킨다. 또한, 응고 저해에 기여하는 다른 인자는 트롬빈 수용체로서 작용하고 혈관 내피 세포에 의해 생성되는 필수 막단백질 트롬보모둘린(thrombomodulin)이다. 트롬보모둘린에 대한 트롬빈의 결합은 트롬빈 응고촉진 활성을 저해하고, 또한 단백질 C 활성화에 기여한다.
또한, 피브린 응괴의 붕괴인 피브린용해는 응고를 조절하는 기전을 제공한다. 응괴 중의 가교결합된 피브린 다량체는 세린 프로테아제인 플라스민에 의해 가용성 폴리펩타이드로 붕괴된다. 플라스민은 이의 불활성 전구체 플라스미노겐으로부터 생성될 수 있고, 2가지 방식, 즉 피브린 응괴 표면에 있는 조직 플라스미노겐 활성인자(tPA)와의 상호작용 및 세포 표면에 있는 우로키나제 활성인자(uPA)와의 상호작용에 의해 피브린 응괴 부위로 동원된다. 제1 기전은 혈관 내의 응괴의 용해를 담당하는 주요 기전인 것으로 나타난다. 제2 기전은 응괴 용해를 매개할 수는 있지만 조직 재형성, 세포 이동 및 염증에 주요 역할을 할 수 있다.
또한, 응괴 용해는 2가지 방식으로 조절된다. 첫째, 효과적인 플라스민 활성화 및 피브린용해는 응괴 표면에 또는 세포막 위에 형성된 복합체에서만 일어나고, 혈액에 유리 상태인 단백질은 비효과적 촉매로서 빠르게 불활성화된다. 둘째, 플라스미노겐 활성인자 및 플라스민은 플라스미노겐 활성인자에 작용하는 플라스미노겐 활성인자 저해제 1형(PAI-1) 및 PAI-2와 같은 분자 및 플라스민을 불활성화시키는 α2-안티플라스민 및 α2-마크로글로불린과 같은 분자들에 의해 불활성화된다. 정상적인 상황에서, 응고와 피브린용해 간에 시기적절한 균형은 혈관 상해 후 효과적인 응괴 형성 및 제거를 야기하고, 동시에 불필요한 혈전성 또는 출혈 에피소드를 예방한다.
예시적 응고인자, 보조인자 및 조절 단백질과 이들의 활성은 이하 표 4에 정리한다.
응고인자 자이모겐 및 보조인자
인자 명칭 활성
세린 프로테아제의 자이모겐
제XII 인자 혈관벽 상해 부위에서 노출된 교원섬유에 결합하고, 고MW 키니노겐 및 칼리크레인에 의해 활성화됨
제XI 인자 제XIIa 인자에 의해 활성화됨
제IX 인자 제XIa 인자 + Ca2+ 에 의해 활성화됨
제VII 인자 트롬빈, 제X 인자, 제IXa 인자 또는 제XIIa 인자 + Ca2+ 에 의해 활성화됨 또는 자가활성화
제X 인자 혈소판 표면에서 테나제 복합체(FIXa/FVIIa)에 의해 활성화됨; 또한 제VIIa 인자 + 조직인자 + Ca2+, 또는 제VIIa 인자 + Ca2+ 에 의해 활성화됨
제II 인자 혈소판 표면에서 프로트롬비나제 복합체(FXa/FVa)에 의해 활성화됨
보조인자
제VIII 인자 트롬빈에 의해 활성화됨; 제VIIIa 인자는 제X 인자의 활성화에서 제IXa 인자의 보조인자로서 작용한다.
제V 인자 트롬빈에 의해 활성화됨; 제Va 인자는 프로트롬빈의 활성화에서 제Xa 인자의 보조인자로서 작용한다.
제III 인자(조직 인자) 제VIIa 인자의 보조인자로서 작용한다.
피브리노겐
제I 인자(피브리노겐) 트롬빈에 의해 절단되어 피브린을 형성한다.
트랜스글루타미나제
제XIII 인자 트롬빈 + Ca2 + 에 의해 활성화됨; 피브린의 공유 가교결합을 촉진한다.
조절 단백질 및 기타 단백질
폰 빌레브란트 인자(vWF) GPIb-V-IX 복합체와 교원섬유 간에 가교로서 작용한다.
단백질 C 트롬보모둘렌에 결합된 트롬빈에 의해 활성화됨; Ca는 제VIIIa 인자 및 제Va 인자를 분해한다.
단백질 S 단백질 C의 보조인자로서 작용한다.
트롬보모둘린 내피세포 표면 단백질; 단백질 C를 활성화시키는 트롬빈에 결합한다.
안티트롬빈 III 주로 트롬빈 및 제Xa 인자의 응고 저해제이나, 제IXa, XIa 및 XIIa 인자 및 TF와 복합체화된 제VIIa 인자의 응고 저해제이기도 함.
조직인자 경로 저해제(TFPI) FXa에 결합한 뒤, TF/FVIIa와 4차 구조를 형성하여 TF/FVIIa 활성을 저해한다.
* 이 표는 M.W.King(2006) med.unibs.it/~marchesi/blood.html에서 발췌된 것임
C. 제 VII 인자( FVII )
제VII 인자는 포유동물을 비롯한 동물에서 간의 단일쇄 자이모겐으로서 합성되어 혈류로 분비되는 비타민 K-의존적 세린 프로테아제 당단백질이다. 전술한 바와 같이, FVII은 트롬빈 생성 및 피브린 침착에 이어지는 단백분해 사건의 캐스캐이드의 개시를 담당하는 응고 프로테아제이다. 이것은 이 활성의 하류 효과가 내인성 경로에 상당히 영향을 미치기는 하지만, 외인성 경로의 일부이다. 응괴 형성에 있어서 이의 중대한 역할은 임상적인 항응고 및 지혈 요법의 표적으로서 FVII에 상당한 관심을 끌었다. 예를 들어, 재조합 활성화된 FVII(rFVIIa)는 혈우병 피검체 및 다른 출혈 병태가 있는 피검체에 사용되는 지혈제로서 개발되었다. 본 발명은 활성화 시에 증가된 응고 활성을 보유하도록 설계되고 제VII 인자 요법으로 고칠 수 있는 질환 및 병태를 치료하는 개량된 치료제로서 작용할 수 있는 변형 FVII 폴리펩타이드를 제공한다.
1. FVII 구조 및 구성
사람 FVII 유전자(F7)는 염색체 13 상의 13q34에 위치하고, 9개의 엑손을 보유하는 12.8kb 길이이다. FVII 유전자는 프로트롬빈, 제IX 인자, 제X 인자 및 단백질 C와 같은 기타 비타민 K 의존적 단백질을 암호화하는 유전자와 유의적인 구성적 유사성을 공유한다. FVII의 mRNA는 선택적 스플라이싱을 일으켜 2개의 전사체, 즉 변이체 1(진뱅크 등록번호 NM_000131, 서열번호 108) 및 변이체 2(진뱅크 등록번호 NM_019616, 서열번호 109)를 생산한다. 간에서 더 풍부한 형태인 전사체 변이체 2는 엑손 1b를 포함하지 않아서, 전사체 변이체 1에 의해 암호화된 466개 아미노산전구체 폴리펩타이드(FVII 이소폼 a 전구체; 서열번호 1)에 비해 짧은 444개 아미노산의 전구체 폴리펩타이드(FVII 이소폼 b 전구체; 서열번호 2)를 암호화한다. FVII 이소폼 b 전구체 폴리펩타이드에 존재하지 않는 아미노산은 FVII 이소폼 a 전구체의 아미노산 위치 22 내지 43에 상응한다. 이러한 아미노산은 프로펩타이드 서열의 일부로서, 절두형 FVII 이소폼 b 프로펩타이드를 산출한다. 전구체 폴리펩타이드들은 다음과 같은 분절과 도메인으로 구성되어 있다: 소수성 시그널 펩타이드(서열번호 1과 2의 aa 1-20), 프로펩타이드(서열번호 1의 aa 21-60 및 서열번호 2의 aa 21-38), Gla 도메인(서열번호 1의 aa 39-83 및 서열번호 2의 aa 61-105), B형 표피 성장인자 도메인(EGF계 1, 서열번호 1의 aa 84-120 및 서열번호 2의 aa 106-142), A형 표피 성장인자 도메인(EGF형 2, 서열번호 1의 aa 125-166 및 서열번호 2의 aa 147-188), 및 세린 프로테아제 도메인(서열번호 1의 aa 191-430, 및 서열번호 2의 aa 213-452).
FVII 폴리펩타이드의 406개 아미노산 성숙 형태(서열번호 3)는 시그널 펩타이드와 프로펩타이드 서열이 결실되며, 이것이 유래되는 이소폼 전구체에 상관없이 길이와 서열이 동일하다. FVII 폴리펩타이드의 성숙 형태에서, 위에서 언급한 도메인의 상응하는 아미노산 위치는 다음과 같다: Gla 도메인(서열번호 3의 aa 1-45), EGF계 1(서열번호 3의 aa 46-82), EGF계 2(서열번호 3의 aa 87-128), 및 세린 프로테아제 도메인(서열번호 3의 aa 153-392).
FVII의 Gla 도메인은 칼슘 이온의 존재 하에 포스파티딜세린을 포함하는 인지질 막과 상호작용하는 막 결합 모티프(motif)이다. 또한, Gla 도메인은 FVIIa 보조인자인 조직 인자(TF)에 결합하는데 있어서 역할을 한다. TF와 복합체화 시, FVIIa의 Gla 도메인에는 7개의 Ca2+ 이온이 부하되어 있고, 세포 표면 상의 인지질과 상호작용을 위해 세포막 방향으로 3개의 소수성 측쇄가 돌출되어 있어, TF의 C-말단 도메인과 유의적인 접촉을 한다. Gla 도메인은 프로트롬빈, 응고인자 VII, IX 및 X, 단백질 C, S 및 Z와 같은 비타민 K 의존적 단백질 중에서 보존적이다. 이러한 단백질들은 이 단백질들의 N-말단 Gla 도메인에 밀집되어 있는 아미노산인 γ-카르복시글루탐산의 해독후 합성에 비타민 K를 필요로 한다. 이 도메인에 존재하는 모든 글루탐산 잔기는 잠재적 카르복실화 부위이며, 이에 따라 이들 중 대부분은 카르복실화에 의해 변형된다.
Gla 도메인 외에, 성숙 FVII 단백질은 또한 2개의 EGF계 도메인을 함유한다. 제1 EGF계 도메인(EGF계 1 또는 EGF1)은 칼슘 결합 EGF 도메인으로서, 여기서 6개의 보존적 코어 시스테인은 3개의 이황화 가교결합을 형성한다. FVII의 EGF1 도메인은 하나의 Ca2 + 이온만을 결합시키지만, Gla 도메인에서 관찰되는 것보다 훨씬 높은 친화도를 나타낸다(Banner et al.(1996) Nature 380: 41-46). 이와 같이 결합된 Ca2+ 이온은 FVII의 EGF1 도메인과 TF 사이에 강한 상호작용을 촉진한다(Osterbund et al.(2000) Eur J Biochem 267: 6204-6211). 제2 EGF계 도메인(EGF계 2 또는 EGF2)은 칼슘 결합 도메인이 아니지만, 3개의 이황화 가교결합을 형성한다. FVII의 다른 도메인과 같이, EGF2 도메인은 TF와 상호작용한다. 또한, 큰 접촉 계면을 공유하는 프로테아제 도메인과 함께 이황화 결합되기도 한다.
마지막으로, FVII의 세린 프로테아제 도메인은 FVIIa의 단백분해 활성을 담당하는 도메인이다. FVII의 촉매성 도메인에 존재하는 아미노산 서열은 트립신 및 키모트립신과 같은 다른 세린 프로테아제와 높은 서열 동일성 및 3차 구조 유사성을 나타낸다(Jin et al.(2001) J Mol Biol, 307: 1503-1517). 예를 들어, 이러한 세린 프로테아제들은 키모트립신 번호매김을 기초로 한, 공통 촉매성 3인조 H57, D102, S195를 공유한다. 하지만, 다른 세린 프로테아제와 달리, FVIIa의 절단은 자이모겐을 완전 활성 효소로 완전히 전환시키는데 충분하지 않다. 대신에, 이하에 논의한 바와 같이, FVIIa는 세포 표면 수용체 TF에 결합함으로써, 자이모겐 유사 불활성 상태에서 촉매성 활성 효소로 변환시키는 FVIIa 프로테아제 도메인의 입체형태 변화를 유도하여 촉매성 기능이 알로스테릭하게 활성화된다. FVIIa의 보조인자 결합 부위와 활성 부위(즉, 키모트립신 번호매김에 기초한 잔기 163-170에 상응하는 아미노산 잔기 위치 305-321) 사이의 나선 루프 영역은 FVIIa의 알로스테리 및 자이모겐성에 중요하다(Persson et al.(2004) Biochem. J., 379: 497-503). 이영역은 짧은 α 나선(아미노산 잔기 위치 307-312)과 그 다음 루프로 구성되어진다. 나선의 N-말단부는 프로테아제 도메인과 TF 사이의 계면의 일부를 형성하고 TF에 대한 최적의 결합과 단백분해성 기능에 중요한 다수의 잔기를 함유한다. FVIIa 단독 및 TF와 복합체화된 FVIIa의 결정 구조의 비교는 FVIIa가 TF를 결합시킬 때 α 나선에 유의적인 입체형태 변화가 일어난다는 것을 시사한다. FVIIa 단독의 α 나선은 비틀리고 단축되며 다르게 배향되어 있는 것으로 나타난다. 이는 인접 루프 구조에 영향을 미쳐, 이 구조가 활성 부위에서 멀어지게 한다. 이에 반해, TF와 복합체화된 FVIIa의 α 나선은 안정화되어 있고, 이웃 루프는 활성 부위에 더욱 가까이 위치한다. 이러한 안정화는 FVII의 아미노산 위치 306(키모트립신 번호매김에 의한 아미노산 잔기 Met164)에 적어도 메티오닌을 포함시키는 기전을 통해 실시된다(Pike et al., (1999) PNAS 8925-8930).
2. 해독후 변형
FVII 전구체 폴리펩타이드(제VII 인자 유전자의 어느 한 이소폼)는 소포체(ER) 내로 삽입하여 막을 통한 전위를 개시하는, 소수성 시그널 펩타이드에 의한 세포 분비 경로로 표적화된다. 이 단백질이 ER 막을 통해 전위하는 동안에, 20개 아미노산 시그널 펩타이드는 ER 내강 내의 시그널 펩티다제에 의해 절단되고, 그 후 폴리펩타이드는 추가로 해독후 변형, 예컨대 N-글리코실화 및 O-글리코실화, N-말단 글루탐산의 γ-카르복시글루탐산으로의 비타민 K 의존적 카르복실화, 및 아스파르트산의 β-하이드록시아스파르트산으로의 하이드록실화 등을 일으킨다.
이 폴리펩타이드는 FVII 프로펩타이드 내의 10개 잔기의 양친매성 α-나선을 인식하는 비타민 K-의존적 카르복실라제를 위한 결합 부위를 제공한다. 결합후, 카르복실라제는 FVII 폴리펩타이드의 Gla 도메인 내에 10개 글루탐산 잔기를 γ-카르복실화하여, 서열번호 2에 제시된 FVII 전구체 아미노산 서열 대비, 위치 E66, E67, E74, E76, E79, E80, E85, E86, E89 및 E95에서 γ-카르복시글루타밀 잔기를 생산한다. 이 위치들은 서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드의 위치 E6, E7, E14, E19, E20, E25, E26, E29 및 E35에 상응한다. 최적 활성을 위해, FVII 분자는 폴리펩타이드를 결합시켜 TF 및 지질과 FVIIa의 결합에 필요한 입체형태적 변화를 촉진하는 칼슘을 필요로 한다. γ-카르복실화된 Gla 도메인은 다양한 친화도로 7개의 Ca2+ 이온을 결합시키고, 이는 Gla 도메인이 TF의 C-말단 도메인, 및 혈소판 막 위의 포스파딜세린 또는 다른 음하전성 인지질과 상호작용할 수 있게 하는 입체형태적 변화를 유도한다.
N-연결 글리코실화는 성숙 단백질(서열번호 3)의 아미노산 잔기 145 및 262에 상응하는 위치에 있는 FVII 폴리펩타이드의 2개의 아스파라긴 잔기로 Glc3Man9(GlcNAc)의 전이에 의해 수행된다. O-연결 글리코실화는 성숙 폴리펩타이드의 아미노산 잔기 52 및 60에서 일어나고, β-하이드록시아스파르트산에 대한 하이드록실화는 위치 63에 있는 아스파르트산 잔기에서 일어난다. 이러한 O-글리코실화된 세린 잔기 및 β-하이드록실화된 아스파르트산 잔기는 FVII의 EGF-1 도메인에 존재한다. 이러한 변형은 폴리펩타이드의 성숙 형태로의 최종 프로세싱 전에 ER과 골지 복합체에서 실시된다.
3. FVII 프로세싱
변형된 프로-FVII 폴리펩타이드는 세포로부터 단백질이 분비되기 직전에 프로펩티다제에 의해 프로펩타이드가 절단되는 트랜스-골지 구획으로 골지 내강을 통해 수송된다. PACE/푸린(여기서 PACE는 쌍 염기성 아미노산 절단 효소의 머리글자이다)은 서열 모티프 Arg-[임의의 잔기]-(Lys 또는 Arg)-Arg의 카르복시말단 측에서 많은 단백질들을 절단하는 골지 막에 국재화된 엔도펩티다제이다. 이 프로펩티다제는 프로-제IX 인자 및 프로-vWF 폴리펩타이드와 같은 비타민 K-의존적 당단백질을 절단하여(Himmelspach et al.(2000) Thromb Research 97; 51-67), 성숙 단백질로부터 프로펩타이드를 방출시킨다. 재조합 제VII 인자 전구체에 적당한 PACE/푸린 인식 부위의 삽입은 재조합 폴리펩타이드의 정확한 프로세싱 및 분비를 촉진한다(Margaritas et al.(2004) Clin Invest 113(7): 1025-1031). PACE/푸린 또는 다른 서브틸리싱-계 프로펩티다제 효소는 프로FVII의 FVII로의 단백분해 프로세싱을 담당하는 것으로 생각된다. 이 효소는 서열번호 1에 제시된 서열의 아미노산 위치 35-38 및 서열번호 2에 제시된 서열의 57-60에 있는 -Arg-Arg-Arg-Arg- 컨센서스 모티프를 인식하여 결합할 수 있고, 결과적으로 프로펩타이드를 절단하여 성숙 단백질을 분비 방출시킨다.
4. FVII 활성화
혈액에 존재하는 FVII의 대다수는 불활성화된 단일쇄 자이모겐 형태이고, 소량은 이중쇄 활성화된 형태로 존재하기도 한다. FVII의 활성화는 Arg152-Ile153 결합(서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드에 상대적인 위치)의 단백분해 절단 시에 일어나며, 결과적으로 152개 아미노산 경쇄(약 20kDa)가 이황화 가교결합에 의해 254개 아미노산 중쇄(약 30kDa)에 연결된 이중쇄 폴리펩타이드를 제공한다. FVIIa의 경쇄는 Gla 도메인과 EGF계 도메인을 함유하는 반면, 중쇄는 이 분자의 촉매성 또는 세린 프로테아제 부를 함유한다. 단일쇄 FVII의 이중쇄 FVIIa로의 전환은 FIXa, FXa, FXIIa, 트롬빈에 의한 절단에 의해 또는 내인성 FVIIa에 의한 자가촉매성 방식으로 매개된다(Butenas et al.(1996) Biochem 35: 1904-1910; Nakagaki et al. (1991) Biochem 30: 10819-10824). 혈행에서 나타나는 미량의 FVIIa는 FXa 및 FIXa의 작용으로부터 생긴 것 같다.
위에서 논한 바와 같이, 자이모겐 형태로부터 FVIIa로의 FVII의 절단은 완전한 활성에 충분한 것은 아니다. FVIIa는 완전한 활성을 위해 TF와의 연합을 필요로 한다(Higashi et al.(1996) J Biol Chem 271: 26569-26574). 이러한 필요성 때문에, FVIIa 단독은 자이모겐 폴딩 및 형태를 디스플레이하고 비교적 낮은 활성을 나타내는 자이모겐 유사 특징물인 것으로 생각되었다. 이러한 TF와 연합되지 않은 FVIIa의 자이모겐 유사 특징은 자이모겐 형태보다 세린 프로테아제의 활성 형태에 주로 작용하는 안티트롬빈 III(AT-III) 및 다른 서핀들에 비교적 내성이게 한다. 또한, TF/FVIIa 활성의 주요 저해제인 TFPI는 FVIIa의 "불활성" 미복합체화된 형태에는 효과적으로 결합하지 않는다.
TF와 복합체화 시에, FVIIa는 이 분자의 완전 활성을 허용하는 입체형태적 변화를 일으킨다. FVII 도메인들은 모두 TF와의 상호작용에 관련되어 있지만, 일어나는 입체형태 변화는 FVIIa의 프로테아제 도메인에만 국한되어 있다. 예를 들어, FVIIa와 TF의 알로스테릭 상호작용 시에 일어나는 입체형태 변화는 확대된 거대분자 기질 결합 엑소사이트(exosite)의 생성을 포함한다. 이와 같이 확대된 결합 부위는 제X 인자의 FVII 매개의 단백분해 활성화를 크게 증강시킨다.
FVIIa의 활성은 세포 표면 발현성 TF와 FVIIa의 상호작용이 있을 때 더욱 증가된다(즉, 1000배). 이것은 포스파티딜세린과 같은 음하전성 인지질을 함유하는 인지질 막이, Gla 도메인을 통해 결합하는 FIX 및 FX와 같은 다른 비타민 K 의존적 응고 인자들의 상호작용 부위이기 때문이다. 이러한 비타민 K 의존적 단백질의 국소 농도는 세포 표면에서 높아서, TF/FVIIa 복합체와의 상호작용을 촉진한다.
5. FVII 기능
FVIIa는 TF에 의한 알로스테릭 활성화 후에 증가된 활성을 나타내지만, FVIIa 단독이 응고를 개시시킬 수 있는 기전이 존재한다는 증거가 있다. 이에 따라, FVII는 TF 의존적 방식 및 TF 독립적 방식으로 기능할 수 있다. 후자의 경로는 정상 지혈에서 훨씬 적은 역할을 할 수 있지만, 출혈 장애의 상황 및 이의 치료 시에 고려될 때에는 중요할 수 있다.
a. 조직인자 의존적 FVIIa 활성
혈행 FVII는 세포 표면 TF를 결합시키고 FIXa, FXa, 트롬빈에 의해 활성화되거나, 또는 전술한 내인성 FVIIa에 의해 자가촉매적 방식으로 활성화된다. 또는, 국소량의 혈행성 FVIIa가 TF를 직접 결합시킬 수 있다. TF/FVIIa 복합체는 그 다음 혈장 FX의 소분획을 결합시키고, FVIIa 촉매성 도메인은 FX를 절단하여 FXa를 생산한다. FXa가 FVa와 복합체를 형성하고 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시킬 때 TF 보유 세포의 표면에서 외인성 경로를 통해 트롬빈이 형성된다(도 3). 또한, FIX는 TF/FVIIa 복합체에 의해 활성화되어, 활성화된 혈소판 표면에서 작용하는 내인성 경로에 연계되기도 한다. 전술한 응고 캐스캐이드에서 양성 피드백 시스템은 다량의 트롬빈이 생산되는 수단을 제공하여, 피브리노겐을 피브린으로 절단하여 응괴를 형성시킨다.
b. 조직인자 독립적 FVIIa 활성
FX를 FXa로 활성화시키는 TF 의존적 기전 외에도, TF의 부재하에 FVIIa가 FX를 활성화시킬 수 있다는 증거가 있다. 활성화된 혈소판은 포스파티딜세린 및 다른 음하전성 인지질을 외측 혈장 지향성 표면으로 전위시킨다(Hemker et al.(1983) Blood Cells 9:303-317). 이들은 TF에 대한 FVIIa의 결합 친화성보다 1000배 낮은 비교적 낮은 친화도에도 불구하고 FVIIa가 결합할 수 있는 대체 "수용체"를 제공한다(Monroe et al.(1997) Br J Haematol 99: 542-7). 이러한 상호작용은 Gla 도메인 내의 잔기들을 통해 매개된다(Harvey et al. (2003) 278: 8363-8369). 그 다음, FVIIa는 활성화된 혈소판 표면에서 FX를 FXa로, FIX를 FIXa로 전환시킬 수 있다(Hoffman et al. (1998) Blood Coagul Fibrinolysis 9: S61-S65). FXa는 혈소판 표면과 연합된 상태를 유지하고, 이 표면에서 FVa에 결합하여 프로트롬빈으로부터 충분한 트롬빈을 생성시킬 수 있으며, 새로 형성된 FIXa는 FVIIIa와 회합하여 더 많은 FX의 FXa로의 활성화를 촉진할 수 있다(도 3). TF 부재 하에서의 지혈은 그 다음 전술한 양성 피드백 및 전파 기전에 의해 달성될 수 있다. 하지만, FVIIIa가 활성화된 혈소판에서의 응고 과정에 기여할 수는 있지만, FVIIIa의 존재가 TF 독립적 기전의 트롬빈 생성에 필요한 것은 아니라는 점은 주목할만하다(도 3). 따라서, 혈우병 환자들에서와 같이 FVIII의 부재 하에, FVIIa가 상기 제2 기전을 통해 트롬빈 생성을 개시 및/또는 증폭시킬 수 있고, 응괴 형성을 실시할 수 있다는 증거가 있다.
6. 생물약제로서의 FVII
FVII는 혈액 응고를 개시시키는 작용을 한다. 재조합 FVIIa(NovoSeven®; rFVIIa)는 출혈 에피소드의 치료용으로 또는 제VIII 인자 또는 제IX 인자에 대한 저해제를 이용하는 혈우병 A 또는 B 환자들 및 선천적 제VII 인자 결핍증 환자의 외과적 또는 침습적 처치에서 출혈 예방용으로 승인된 제품이다. Novoseven®은 어린 햄스턴 신장(BHK) 세포를 이용하는 포유동물 발현계에서 생산된 제VIIa 인자의 유전자 조작된 제제이다. 이 제제는 구조와 기능에 있어서 혈장 유래의 제VIIa 인자와 거의 동일하다(Ratko et al.(2004), P&T, 29: 712-720).
재조합 FVIIa(rFVIIa)의 투여는 혈우병을 앓고 있는 환자에서 혈액 응고를 촉진하는 것으로 밝혀져 있고, FVIIa 용량으로의 치료는 사람 피검체에 안전하고 양호한 용인성인 것으로 밝혀져 있다. 일반적으로, rFVIIa의 사용은 제VIII 인자 또는 제IX 인자에 대한 저해제(즉, 알로항체)를 발생시킨 환자에서 이루어졌다. 응고제로서 rFVIIa의 사용은 다른 출혈 장애, 예컨대 글란즈만 혈소판무력증; 광범한 출혈과 관련된 기타 사건들, 예컨대 외상 또는 간 이식, 전립선 수술 및 출혈성 외상을 비롯한 이에 국한되지 않는 수술의 결과; 신생아 응고병증, 중증 간 질환; 골수 이식, 저혈소판증 및 혈소판 기능 장애; 경구 항응고의 급반전; 제V, VII, X 및 XI 인자의 선천적 결핍; 및 폰빌레브란트 인자에 대한 저해제에 의한 폰빌레브란트 질환 등의 치료에까지 확대되었다.
치료 효과의 달성에는 고용량의 rFVII가 필요하다. 이러한 rFVII 투여에 필요한 용량 및 용량투여 방법은 임상 징후에 따라 달라진다. 예를 들어, 알로항체를 보유하는 혈우병 A 또는 혈우병 B 환자에서 출혈 에피소드에 전형적인 rFVII 투여량은 정맥내(IV) 주사로 투여 시 90㎍/kg 이다. rFVII는 반감기가 2시간이기 때문에 반복 용량투여가 필요하다. 추가의 용량투여는 지혈이 달성될 때까지 2시간마다 제공할 수 있다. 용량 범위는 병태의 중증도에 따라 변경될 수 있다. 예를 들어, 35 내지 120㎍/kg 범위의 용량이 효능적이었다. 또한, 용량 및 용량투여 방법은 다른 징후들에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 수술을 받은 혈우병 A 또는 혈우병 B 환자는 수술 직전에 90㎍/kg의 초회 용량을 투여받고, 수술 동안과 수술 후에 2시간마다 반복 용량투여를 받을 수 있다. 수술과 출혈 에피소드의 중증도에 따라서, 일시 IV 주입을 치유가 달성될 때까지 2 내지 6시간마다 지속시킬 수 있다. 선천적 FVII 결핍 환자에서 rFVII는 보통 수술 또는 다른 침습적 처치 중의 출혈 방지를 위해 지혈이 달성될 때까지 매 4 내지 6시간마다 15 내지 30㎍/kg으로 투여된다.
지혈을 개시시키는 rFVIIa의 작용 기전은 고용량의 필요성을 설명한다. 혈우병 환자는 정상적인 응고 개시 단계를 보유하고, 여기서 TF/FVIIa 복합체는 FX를 FXa로 활성화시키고 TF 보유 세포 부위에서 트롬빈 생산을 야기한다. 하지만, 그 후 혈우병 환자는 FVIII(혈우병 A) 또는 FIX(혈우병 B)가 결여되어 있어 응고 과정이 붕괴되고, 이에 따라 전술한 증폭 및 전파 단계에서 다량의 FX를 FXa로 활성화시키는 작용을 하는 것이 정상적인 활성화된 혈소판의 표면에서 FVIIIa/FIXa 복합체를 형성할 수 없다. TFPI 및 AT-III과 같은 저해제의 존재로 인해, TF/FVIIa에 의한 절단 후에 TF 보유 세포에서 생산되는 FXa는 세포 표면 사이에서 쉽게 확산할 수 없다. 결과적으로, 활성화된 혈소판 표면에서의 대량 트롬빈 생성은 일어나지 않고 응괴가 형성되지 않는다.
고용량의 rFVIIa의 지혈 효과는 활성화된 혈소판 위의 rFVIIa에 의한 FXa의 TF 의존적 및/또는 TF 독립적 생성을 통해 달성될 수 있다는 증거가 있다(도 3). TF 종속적 트롬빈 생성은 내인성 FVIIa 및 rFVIIa에 의한 TF 분자의 포화로 매우 빠르게 최대화될 수 있다. 일부 경우에, 고용량 rFVIIa는 활성화된 혈소판을 결합시킬 수 있고 FX를 FXa로 전환시킬 수 있다. 표면 연합된 FXa는 FVa를 활성화시켜 지혈에 충분한 트롬빈을 생성한다. rFVII는 낮은 친화도로 혈소판 표면에 결합하기 때문에 트롬빈 생성을 위해 더욱 높은 용량의 rFVII가 필요로 될 수 있다. 활성화된 혈소판에서 FXa의 활성화는 rFVIIa 매개의 지혈이 상해 부위에 국한되게 한다.
rFVII의 투여량을 감소시키는 수단은 약물로서 rFVII의 유용성과 효율을 향상시킬 수 있다. 본 발명은 변형된 FVII 폴리펩타이드를 제공한다. 이 중에는 TFPI에 대한 증가된 내성, AT-III에 대한 증가된 내성, 향상된 약동학적 성질, 예컨대 증가된 반감기, TF의 존재 및/또는 부재 하에서의 증가된 촉매 활성, 및/또는 활성화된 혈소판에 대한 증가된 결합성 등을 나타내는 변형 FVII 폴리펩타이드가 있다. 이러한 FVII 폴리펩타이드는 증가된 응고 활성을 나타낼 수 있다. 본 명세서에 제시된 FVII 폴리펩타이드는, FXa가 생산되고 트롬빈이 생성되게 하는 TF 의존적 및/또는 TF 독립적 기전으로 지혈을 개시시키는 치료에 사용될 수 있다.
D. 변형 FVII 폴리펩타이드
본 발명은 변형 FVII 폴리펩타이드를 제공한다. FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 하나 이상의 활성 또는 성질의 변경을 나타낸다. 변형의 결과로서 변경될 수 있는 활성 또는 성질로는, 응고 또는 응고제 활성; 응고촉진 활성; 제X 인자(FX) 활성화 또는 제IX 인자(FIX) 활성화를 실시하는 것과 같은 단백분해 또는 촉매 활성; 항원성(항-FVII 항체에 대한 결합을 위해 폴리펩타이드와 경쟁하거나 결합하는 능력); 조직 인자, 제X 인자 또는 제IX 인자를 결합시키는 능력; 활성화된 혈소판의 세포 표면에 결합하는 능력; 인지질에 결합하는 능력; 반감기; 3차원 구조; pI; 및/또는 입체형태가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 일반적으로, 변형 FVII 폴리펩타이드는 응고촉진 활성을 나타낸다. 본 발명은 단일쇄 자이모겐 형태로부터 활성화 시에 증가된 응고제 활성을 나타내는 변형 FVII 폴리펩타이드를 제공한다. 이러한 변형 FVII 폴리펩타이드는 출혈 장애 또는 사건, 예컨대 혈우병 또는 상해의 치료에 사용될 수 있고, 여기서 FVII 폴리펩타이드는 혈액 응고를 촉진하는 작용을 할 수 있다. 이러한 변형 FVII 폴리펩타이드 중에는 조직인자 경로 저해제(TFPI) 및 안티트롬빈 III(AT-III)과 같은 저해제에 대한 증가된 내성을 가진 폴리펩타이드, TF의 존재 및/또는 부재 하에 증가된 촉매 활성을 가진 폴리펩타이드, 향상된 약동학적 성질, 예컨대 증가된 반감기를 가진 폴리펩타이드, 및 혈소판 표면에 대한 증가된 결합 및/또는 친화도를 가진 폴리펩타이드가 포함된다. 특히, 이러한 변형 FVII 폴리펩타이드는 응고제 활성을 제공하면서 동시세 FVIIIa 및 FIXa의 필요성을 피하도록 질환 또는 병태에 사용될 수 있다. 일 예에서, 본 명세서에 제시된 변형 FVII 폴리펩타이드는 FVIIIa 및 FIXa에 대한 자가항체를 보유하는 혈우병 환자에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 제시된 변형 FVII 폴리펩타이드는 지혈을 위한 혈청에서 활성 FVII의 충분한 농도를 유지하는데 필요한 FVII 투여량의 감소를 비롯한 장점을 제공한다. 이것은, 예컨대 비슷한 생물학적 효과를 달성하는데 필요한 저용량 및/또는 투여 빈도, 치료 유익의 조속한 개시, 급성 출혈 에피소드의 급속한 호전, 피검체에 의한 높은 편안함 및 용인성 및 2차적인 무익 효과의 약화 등을 야기할 수 있다.
FVII 폴리펩타이드의 변형은 임의의 형태의 FVII 폴리펩타이드, 예컨대 대립유전자 및 종변이체, 스플라이싱 변이체, 당업계에 공지된 변이체, 또는 하이브리드 또는 키메릭 FVII 분자 등에 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제시된 변형은 서열번호 1 또는 2에 제시된 전구체 FVII 폴리펩타이드, 서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드, 또는 서열번호 1 내지 3에 제시된 임의의 FVII 폴리펩타이드와 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 보유하는 임의의 종 변이체, 대립유전자 변이체 또는 변형된 변이체 및 이의 활성 단편에 이루어질 수 있다. FVII의 대립유전자 변이체로는, 서열번호 18 내지 74에 제시된 아미노산 서열 중 임의의 서열을 보유하는 임의의 전구체 폴리펩타이드가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 당해의 변형을 위한 예시적 종 변이체로는, 사람 및 비-사람 폴리펩타이드, 예컨대 소, 마우스, 피그미 침팬지, 침팬지, 토끼, 래트, 리서스 마커스, 돼지, 개, 지브라 피쉬, 복어류, 닭, 오랑우탄 및 고릴라 FVII 폴리펩타이드를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니며, 상기 서열들은 서열번호 4 내지 17에 각각 제시되어 있다. FVII 폴리펩타이드의 변형은 추가로 다른 변형을 함유하는 FVII 폴리펩타이드, 예컨대 1차 서열의 변형 및 폴리펩타이드의 1차 서열에서가 아닌 변형을 비롯한 당업계에 기술된 변형 등을 함유하는 FVII 폴리펩타이드에 이루어질 수 있다.
또한, FVII 폴리펩타이드의 변형은 공지의 폴리펩타이드 서열에 기초하여 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 합성되거나 작제되거나 또는 재조합 제조된 합성 FVII 폴리펩타이드 및 상이한 FVII 폴리펩타이드들의 하이브리드인 폴리펩타이드의 변형도 포함한다. 예를 들어, 제IX 인자(FIX) 또는 제X 인자(FX)와 같은 다른 응고 인자 패밀리 구성원들과 FVII의 정렬을 기초로 하여, 패밀리 구성원들 중에서 상동성 도메인들은 쉽게 확인된다. FVII 아미노산 서열 내의 하나 이상의 아미노산 또는 전체 도메인을 상응하는 패밀리 구성원의 아미노산 서열을 사용하여 교체시킨 FVII 폴리펩타이드의 키메릭 변이체도 작제할 수 있다. 또한, 키메릭 FVII 폴리펩타이드는 하나 이상의 아미노산 또는 전체 도메인이 다른 종의 아미노산 서열을 사용하여 사람 FVII 아미노산 서열에 교체된 것을 포함한다(예컨대, Williamson et al.(2005) J Thromb Haemost 3: 1250-6). 이러한 키메릭 단백질은 본 발명에서 출발 비변형 FVII 폴리펩타이드로서 사용될 수 있다.
본 명세서에 제공된 출발 비변형 참조 폴리펩타이드의 변형으로는, 아미노산 교체 또는 치환, 아미노산의 부가 또는 결실, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 변형 FVII 폴리펩타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 또는 그 이상의 변형된 위치를 포함한다. 또한, 본 발명은 출발 참조 FVII 폴리펩타이드에 비해 2 이상의 변형을 보유하는 변형 FVII 폴리펩타이드도 제공한다. 변형 FVII 폴리펩타이드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 또는 그 이상의 변형 위치를 보유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서에 제공된 임의의 변형은 최종 변형 FVII 폴리펩타이드가 이중쇄 또는 활성화된 형태에 있을 때 증가된 응고 활성을 나타내는 한, 당업자에게 공지된 임의의 다른 변형과 조합될 수 있다. 일반적으로, 변형 FVII 폴리펩타이드는 증가된 응고제 활성을 나타낼 수 있다. 변형의 결과로서 변경될 수 있는 활성 또는 성질에는, 응고 또는 응고제 활성; 응고촉진 활성; 제X 인자(FX) 활성화 또는 제IX 인자(FIX) 활성화를 실시하는 것과 같은 단백분해 또는 촉매 활성; 항원성(항-FVII 항체에 대한 결합을 위해 폴리펩타이드와 경쟁하거나 결합하는 능력); 조직 인자, 조직인자 저해인자(TFPI), 안티트롬빈 III, 제X 인자 또는 제IX 인자를 결합시키는 능력; 활성화된 혈소판의 세포 표면에 결합하는 능력; 인지질에 결합하는 능력; 혈청 반감기; 3차원 구조; pI; 및/또는 입체형태가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 명세서에 제공된 변형 FVII 폴리펩타이드 중에는, 조직인자 경로 저해제(TFPI)에 대한 증가된 내성, 안티트롬빈 III(AT-III)에 대한 증가된 내성, TF의 존재 및/또는 부재 하에 증가된 촉매 활성, 증가된 약동학적 성질, 예컨대 증가된 혈청 반감기, 증가된 내인성 활성 및/또는 활성화된 혈소판에 대한 증가된 친화성 및/또는 결합성을 보유하는 것이 포함된다.
일부 예에서, 변형은 FVII 폴리펩타이드의 2 이상의 성질 또는 활성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 변형은 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 변형 FVII 폴리펩타이드의 증가된 촉매 활성 및 증가된 TFPI 내성을 초래할 수 있다. 본 명세서에 제공된 변형 FVII 폴리펩타이드는 변형의 효과 범위를 확인하기 위해 각 성질 및 활성에 대해 분석될 수 있다. 이러한 분석법은 당업계에 공지되어 있고, 이하에 설명된다. 또한, 본 명세서에 제공된 변형 FVII 폴리펩타이드는 세포 기전에 의해 추가로 변형된 FVII 폴리펩타이드를 포함하고, 예컨대 글리코실화된, γ-카르복실화된 및 β-카르복실화된 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 제공된 FVII 폴리펩타이드에 대한 변형은 TFPI 내성 증가, AT-III 내성 증가, 약동학적 성질의 개선, 예컨대 혈청 반감기 증가, TF의 존재 및/또는 부재 하에 촉매 활성의 증가 및/또는 활성화된 혈소판에 대한 친화도 및/또는 결합성 증가를 위해 이루어진다. 예를 들어, FVII 폴리펩타이드는 혈소판에 대한 결합 및 TFPI 내성 중 하나 또는 둘 모두를 증가시키는 변형(들)을 포함할 수 있다. 다른 예에 따르면, 본 명세서에 제공된 임의의 변형은 최종 변형된 FVII 폴리펩타이드가 이중쇄 형태일 때 증가된 응고 활성을 나타내는 한, 당업자에게 공지된 임의의 다른 변형과 조합될 수 있다. 일반적으로, 이러한 증가된 응고 활성은 TFPI에 대한 내성 증가, 약동학적 성질의 개선, 예컨대 혈청 반감기 증가, AT-III에 대한 내성 증가, 변경된 글리코실화, 촉매 활성 증가 및/또는 인지질에 대한 결합 및/또는 친화도 증가때문이다. 일부 예에 따르면, 특정 활성 또는 성질을 변경시키기 위해 FVII 폴리펩타이드에 도입된 변형들은 또한 다른 활성 또는 성질에도 영향을 미칠 수 있다. 즉, 본 명세서에 제공된 변형들은 하나 이상의 다른 성질 또는 활성에 영향을 미치도록 설계된 활성 또는 성질에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, TFPI 내성을 증가시키기 위해 FVII 폴리펩타이드에 이루어진 변형은 혈청 반감기와 같은 약동학적 성질을 향상시킬 수 있다. 일부 예에서, 단일 변형, 예컨대 단일 아미노산 치환은 FVII 폴리펩타이드의 2, 3, 4가지 또는 그 이상의 성질 또는 활성을 변경시킨다. 본 명세서에 제시된 변형 FVII 폴리펩타이드는 변형의 효과 범위를 확인하기 위해 각 성질과 활성에 대해 분석될 수 있다. 이러한 분석법은 당업계에 공지되어 있고, 이하에 기술된다. 또한, 본 명세서에 제시된 변형 FVII 폴리펩타이드는 세포 기전에 의해 추가로 변형된 FVII 폴리펩타이드를 포함하고, 예컨대 글리코실화된, γ-카르복실화된 및 β-카르복실화된 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 제시된 변형은 당업자에게 통상적인 기술과 같은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 달성될 수 있다. 표적 단백질에 임의의 하나 이상의 아미노산의 돌연변이를 실시하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법이 이용될 수 있다. 그 방법으로는, 암호화 핵산 분자의 표준 부위 지시된 돌연변이유발(예컨대, 스트라타진에서 입수할 수 있는 QuikChange와 같은 키트의 사용) 또는 고상 폴리펩타이드 합성법을 포함한다. 또한, 본 명세서에 제공된 변형 키메릭 단백질(즉, Gla 도메인 교환)은 통상의 재조합 DNA 기술로 생산할 수 있다. 예를 들어, 키메릭 폴리펩타이드는 원하는 키메릭 폴리펩타이드 성분의 통상적인 서브클로닝을 위한 클로닝 방법론 및 제한효소를 이용하여 생산할 수 있다.
또한, 폴리펩타이드의 1차 서열에 이루어지거나 1차 서열에 이루어지지 않는 다른 변형들도 변형 FVII 폴리펩타이드, 또는 이의 접합체에 포함될 수 있으며, 그 예로는 탄수화물 잔기의 부가, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 잔기의 부가, Fc 도메인의 부가 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, 이러한 추가의 변형은 단백질의 안정성 또는 반감기를 증가시키는데 이루어질 수 있다.
최종 변형된 FVII 폴리펩타이드는 단일쇄 자이모겐 또는 활성 폴리펩타이드인 것, 또는 단일쇄 또는 이중쇄 자이모겐 유사 폴리펩타이드인 것을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 단일쇄 자이모겐 폴리펩타이드인 임의의 변형 폴리펩타이드는 다른 응고 인자에 의해 활성화되거나 자가활성화되어 이중쇄 형태인 변형 FVII(즉, FVIIa)를 생성할 수 있다. 변형 FVII 폴리펩타이드의 활성은 일반적으로 이중쇄 형태일 때 나타난다.
본 명세서에 제공된 변형 FVII 폴리펩타이드는 증가된 TFPI 내성, 증가된 AT-III 내성, TF의 존재 및/또는 부재 하에 증가된 촉매 활성, 향상된 약동학적 성질, 예컨대 혈청 반감기의 증가 및/또는 인지질에 대한 친화도 및/또는 결합성의 증가를 나타낼 수 있다. 일반적으로, 이러한 본 명세서에 제공된 변형 FVII 폴리펩타이드의 성질 및/또는 활성은 TF에 대한 결합성 및/또는 FV의 결합 및 활성화(이에 국한되지 않음) 등의 다른 FVII 활성 또는 성질을 유지하면서 달성된다. 따라서, 본 명세서에 제공된 변형 FVII 폴리펩타이드는 FVII 폴리펩타이드의 야생형 또는 출발형과 비교했을 때 TF 결합 및/또는 FX 결합 및 활성화를 유지한다. 일반적으로, 이러한 활성은 야생형 또는 출발 단백질에 비해 실질적으로 변화되지 않은 것이다(1%, 5%, 10%, 20% 또는 30% 미만으로 변화됨). 다른 예에서, 변형 FVII 폴리펩타이드의 활성은 야생형 또는 출발 FVII 폴리펩타이드에 비해 증가되거나 또는 감소된다. 활성은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 평가될 수 있고, 비변형 FVII 폴리펩타이드, 예컨대 성숙 야생형 천연 FVII 폴리펩타이드(서열번호 3), 야생형 전구체 FVII 폴리펩타이드(서열번호 1 또는 2), 또는 출발 물질로 사용되는 당업자에게 공지된 임의의 다른 FVII 폴리펩타이드의 활성과 비교될 수 있다.
따라서, 본 명세서에 제공된 변형으로 인해, 변형 FVII 폴리펩타이드는 TF 의존적 및/또는 TF 독립적 방식으로 증가된 응고 활성을 나타낼 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 제공된 변형 FVII 폴리펩타이드의 증가된 응고 활성은 적당한 분석법으로 시험관내에서 관찰할 수 있고, 또는 사람 또는 비-사람 피검체와 같은 피검체에 투여 후에 관찰할 수도 있다. 변형 FVII 폴리펩타이드의 증가된 활성은 출발 또는 비변형 FVIIa 폴리펩타이드 활성과 비교했을 때 적어도 또는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 증강될 수 있다.
1. 저해제에 대한 내성 증가
대부분의 생물계처럼, 응고 캐스캐이드는 양성 및 음성 기전에 의해 조절된다. 이러한 기전은 종종 캐스캐이드에 관련된 하나 이상의 인자들의 활성을 직접 또는 간접적으로 저해하거나 증강시켜 작용한다. 따라서, 당해의 치료 응고인자는 음성적으로 활성을 조절하는 저해 기전에 내성인 응고인자이다. 구체적으로, 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 정상적으로 FVII 활성을 저해하는 저해 분자에 내성인 폴리펩타이드이다. TF/FVIIa 복합체의 주요 조절인자는 조직인자 경로 저해제(TFPI)이다. 또한, 안티트롬빈 III(AT-III)도 저해 정도는 적지만 FVIIa 활성에 저해성이다.
a. TFPI
조직인자 경로 저해제는 염색체 2q31-q32.1에 위치한 9개의 엑손들에 의해 암호화된 단일쇄 폴리펩타이드이다. TFPI(TFPI-1이라고도 불림)는 주로 내피세포에 의해 합성되고 음하전성 아미노 말단 영역, 3개의 직렬 쿠니츠형 저해제 도메인 및 고 염기성 카르복시 말단 테일을 함유하는 쿠니츠(Kunitz)형 저해제이다(Wun et al., J.Biol.Chem. 263: 6001(1988)). 선택적 mRNA 스플라이싱(splicing)을 통해 2가지 다른 형태의 TFPI, 즉 TFPIα 및 β가 생성된다. TFPIα는 분자량이 약 46kDa인 분비 단백질이다. 이 전구체 폴리펩타이드는 304개 아미노산 길이(서열번호 101)를 갖고, 28개 아미노산 시그널 펩타이드의 절단에 의해 프로세싱되어 276개 아미노산 성숙 당단백질(서열번호 102)을 분비시킨다. 성숙 단백질은 18개의 시스테인 잔기를 함유하여, 정확하게 폴딩될 때 9개의 이황화 가교결합을 형성한다. 또한, 1차 서열은 위치 145, 195 및 256에 위치한 아스파라긴 잔기인, 3개의 Asn-X-Ser/Thr N-연결 글리코실화 컨센서스 부위를 함유한다. 쿠니츠-1 및 -2 도메인은 각각 TF/FVIIa 복합체 및 FXa의 결합과 저해를 담당한다(도 4 참조). 프로테이나제 저해 활성이 결여된 쿠니츠-3 도메인 및 TFPIα의 C-말단은 이의 세포 표면 국재화에 관여하는 것으로 밝혀졌다(Piro et al.(2004) Circulation 110: 3567-3572).
TFPIβ는 TFPI의 선택적 스플라이싱 형태로, 쿠니츠-3 도메인 및 TFPIα의 C-말단 영역이 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커의 부착을 유도하는 무관련 C-말단 영역으로 교체되어 있다. 전구체 폴리펩타이드(서열번호 103)는 223개 아미노산(서열번호 104)인 성숙 단백질로 프로세싱된다. 단백질 질량을 근거로 할 때, TFPIβ(28kDa)는 TFPIα(36kDa)보다 상당히 작다. 둘 모두 소듐 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 동일한 겉보기 분자량(46kDa)으로 이동하여, 해독후 변형의 차이를 암시한다. TFPIα 및 β는 GPI 의존적 방식으로 세포 표면에 결합되어 있다. TFPIβ는 C-말단에 GPI-앵커를 함유하는 반면, TFPIα는 외관상 아직 확인되지 않은 GPI 연결 단백질(들)에 결합되어있다. TFPIβ는 총 표면-TFPI의 20%만을 나타내지만, 이것이 항-TF/FVIIa 활성의 대부분을 차지하여, 세포 표면 TFPIα의 대안적 역할의 잠재성, 예컨대 FXa의 결합 및 제거를 암시한다(Piro et al.(2005) J Thromb Haemost 3: 2677-2683).
TFPI는 적어도 2가지 방식, 즉 FXa의 활성 부위에 결합하여, 그리고 TF/FVIIa 복합체를 불활성화시켜 응고 캐스캐이드를 저해한다(도 4 참조). 제1 쿠니츠 도메인은 FVIIa를 결합시키고, 제2 도메인은 FXa를 결합시킨다(Girard et al. (1989) Nature 338: 518-520). 유리 TFPI는 FXa의 결합과 비교했을 때 FVIIa를 매우 느리게 결합시킨다. 하지만, FXa에 결합된 후에, TFPI/FXa 복합체는 TF/FVIIa 복합체에 대해 강한 친화도를 나타낸다. 이들의 상호작용은 FVIIa가 촉매적으로 불활성인 내피세포 표면에서 이종사량체 복합체를 형성시킨다(도 4). 따라서, 이러한 4차 구조는 응고 캐스캐이드의 TF/FVIIa 개시를 방해한다.
TFPI의 적어도 하나의 다른 동족체인 TFPI-2는 사람에 존재하고, 이는 태반 단백질 5(PP5) 및 기질-연합된 세린 프로테아제 저해제(MSPI)로도 알려져 있다. TFPI-2는 트립신, 플라스민, 키모트립신, 카텝신 G, 혈장 칼리크레인 및 제VIIa 인자-조직 인자 복합체를 비롯한 광범위한 프로테이나제에 대하여 저해 활성을 나타내는 32kDa 기질-연합 쿠니츠형 세린 프로테이나제 저해제이다. 213개 아미노산의 성숙 TFPI-2 단백질(서열번호 105)은 TFPI 쿠니츠형 도메인 1, 2 및 3과 각각 43%, 35% 및 53% 1차 서열 동일성을 나타내는 3개의 쿠니츠형 도메인을 함유한다. 사람 TFPI-2의 첫번째 쿠니츠형 도메인은 세린 프로테아제의 저해를 위한 모든 구조적 요소를 함유하지만, 반응속도론 및 분자 연구는 TFPI-2가 다른 여러 세린 프로테이나제, 예컨대 TF/FVIIa보다 더욱 효과적인 플라스민 저해제임을 시사한다(Chand et al.(2004) J Biol Chem 279: 17500-17507). 이것은 세포외 기질 분해 및 재형성의 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 이러한 상황에서, TFPI-2의 합성 감소는 염증, 혈관형성, 아테롬성경화증, 망막변성 및 종양 성장/전이와 같은 수많은 병태생리학적 과정과 관련이 있었다(Chand et al.(2005) Thromb Haemost 94: 1122-30). 따라서, TFPI와 상동성이지만, TFPI-2는 응고 경로의 중요 인자인 것으로 생각되지 않는다. TFPI-1 및 TFPI-2의 쿠니츠-1 도메인 서열의 서열 정렬은 도 6b에 제시했다.
토끼 모델에서 TFPI의 면역고갈은 응고를 향상시켰고(Warn-Cramer et al.(1993) Arterioscl Thromb 13: 1551-1557, Ragni et al.(2000) Circulation 102: 113-117), 이는 TF/FVIIa-TFPI/FXa 4차 복합체의 형성 붕괴가 응고의 TF/FVIIa 개시의 음성 조절을 저해할 수 있다는 것을 시사한다. 또한, TFPI와 FVIIa의 상호작용의 붕괴는 FVIIa 제거율을 감소시킬 수 있다. 제거율 감소는 반감기 증가로 명백해질 수 있다. 또한, 세포 표면 TF에 결합된 FVIIa는 내재화될 수 있고 세포 표면 상의 TF를 고갈시킴이 없이 분해될 수 있다. 이러한 내재화 및 분해의 형태는 세포 표면 TF/FVIIa와 4차 복합체를 형성하는 TFPI/FXa의 존재 하에서 유의적으로 증가된다. 결합 이후 내재화 및 분해는 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질(LRP) 의존적 코팅된 피트(pit) 경로를 통해 매개된다(Iakhiaev et al.,(1999) J.Biol.Chem. 274: 36995-37003). 또한, TFPI는 다른 기전, 예컨대 간 또는 신장 제거 기전을 통해 FVIIa 제거를 매개하는 것을 도울 수 있다.
TFPI에 대한 내성을 증가시키는 변형
본 발명은 TFPI에 대한 내성 증가를 나타내는 변형 FVII 폴리펩타이드를 제공한다. 이러한 TFPI에 대한 내성은 예를 들어 TFPI와의 상호작용 및 결합에 관여하는 FVII 중의 하나 이상의 잔기를 상기 결합을 저하시키거나 방해하도록 돌연변이시켜, 응고 개시와 관련 있는 TFPI의 자연 저해 효과에 내성인 변형 FVII 폴리펩타이드를 제조함으로써 달성할 수 있다. 응고촉진 치료제로서 피검체에 투여한 후와 같이 적당한 시험관내 분석 또는 생체내에서 평가했을 때, 변형된 TFPI 내성 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드와 비교했을 때 증가된 응고제 활성을 나타낼 수 있다. 증가된 TFPI 내성을 나타내는 FVIIa 돌연변이체 중에는 반감기가 증가된 돌연변이체가 있다. 예를 들어, 실시예 9에 기술된 돌연변이체는 반감기 증가를 나타낸다.
본 발명은 FVII/TFPI 접촉 잔기 또는 이 상호작용 계면에 인접한 잔기들에 하나 이상의 돌연변이를 보유하는 변형 FVII 폴리펩타이드를 제공한다. 이러한 접촉 잔기들로는 서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드의 아미노산 위치들에 상대적인 번호매김 시, 위치 196의 아스파르트산 잔기(D196, Asp196), 위치 197의 리신 잔기(K197, Lys197), 위치 199의 리신 잔기(K199, Lys199), 위치 239의 트레오닌 잔기(T239, Thr239), 위치 290의 아르기닌 잔기(R290, Arg290) 및 위치 341의 리신 잔기(K341, Lys341)를 포함한다. 키모트립신 번호매김으로 확인했을 때에는, 상기 잔기들은 D60, K60a, K60c, T99, R147 및 K192에 상응한다(도 7). FVII/TFPI 계면에 인접해 있고 입체 장애를 유발하도록 변형될 수 있는 잔기는 성숙 FVII 번호매김 시의 위치 237에 있는 글리신 잔기(G237, Gly237)이며, 이는 키모트립신 번호매김 시 G97(Gly97)에 상응한다.
확인된 잔기들은 아미노산 교체, 결실 또는 치환 등에 의해 변형시킬 수 있다. 대안적으로, 아미노산 삽입을 사용하여 표적 아미노산 잔기 부근의 단백질 구조 또는 표적 아미노산 잔기의 입체형태를 변경시킬 수도 있다. 예를 들어, 확인된 잔기는 FVII와 TFPI 간에 상호작용을 방해하고 두 단백질의 효과적인 결합을 저해하도록 다른 아미노산으로 교체 또는 치환될 수 있으며, 이에 따라 TFPI 내성의 변형 FVII 폴리펩타이드가 생성된다. 예를 들어, FVII와 TFPI의 상호작용을 입체적으로 방해하는 아미노산의 치환이 고려된다(즉, Gly237(Gly97)의 다른 더 큰 아미노산으로의 치환). 다른 양태에 따르면, TFPI 내성의 변형 FVII 폴리펩타이드는 접촉 잔기를 확인된 위치에서 하전 역전 또는 하전 중화가 달성되도록 하는 대안적 아미노산으로 교체시켜 생성시킬 수 있다. 이러한 종류의 돌연변이는 치환된 FVII 아미노산의 정전기적 기여도에 유의적으로 영향을 미치고 접촉 잔기와 상응하는 TFPI 접촉 잔기(들)의 정상적인 상호작용을 파괴한다. 예를 들어, 정상적으로 TFPI 중의 양하전성 아르기닌 잔기와 우선적으로 상호작용할 수 있는 FVII 중의 음하전성 아스파르트산 잔기는 최초의 유리한 정전기적 상호작용을 없앨 뿐만 아니라 잔기들 간에 반발력이 일어나고 단백질의 효과적인 결합을 방해하도록 양하전성 리신으로 교체시킬수 있다. 따라서, 이러한 돌연변이는 단백질의 효과적인 결합을 방해한다. 이에 따라, 아스파르트산(Asp, D) 또는 글루탐산(Glu, E)과 같은 음하전성 아미노산(즉, 산성 아미노산)은 리신(Lys, K), 아르기닌(Arg, R) 또는 히스티딘(His, H)과 같은 양하전성 아미노산(즉, 염기성 아미노산)으로 치환될 수 있다. 이에 반해, 리신(Lys, K), 아르기닌(Arg, R) 또는 히스티딘(His, H)과 같은 염기성 아미노산은 아스파르트산(Asp, D) 또는 글루탐산(Glu, E)과 같은 산성 아미노산으로 치환될 수 있다. 또한, 임의의 접촉 잔기는 알라닌(Ala, A), 티로신(Tyr, Y), 메티오닌(Met, M), 류신(Leu, L), 이소류신(Ile, I), 발린(Val, V), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P) 또는 글리신(GIy, G), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 아스파라긴(Asn, N), 글루타민(GIn, Q), 트립토판(Trp, W) 및 시스테인(Cys, C)과 같은 중성 아미노산으로 치환될 수 있다. 중성 아미노산의 예로는 소수성 아미노산, 예컨대 이소류신(Ile, I), 페닐알라닌(Phe, F), 발린(VaI, V), 류신(Leu, L), 트립토판(Trp, W), 메티오닌(Met, M), 알라닌(Ala, A), 글리신(GIy, G), 시스테인(Cys, C) 및 타이로신(Tyr, Y)이 있다.
일부 양태에서는 성숙 FVII 번호매김 시에 위치 237에 있는 글리신을 교체시켜, 신규 아미노산이 입체 장애를 유발하고 FVII와 TFPI 간에 상호작용을 저해하도록 한다. 글리신은 아미노산 중에서 가장 작고 가장 간단한 아미노산으로, 측쇄에 하나의 수소 원자만을 함유한다. 작은 크기로 인해, 글리신은 작은 공간에 들어갈 수 있고 다른 아미노산들이 할 수 없는 특정 입체형태에 적응할 수 있다. 위치 237에 있는 글리신을 측쇄기가 더 큰 아미노산으로 치환시키는 것은 FVII 단백질 내의 다른 아미노산들과 입체 장애를 유발할 수 있어, TFPI 결합 계면의 입체형태를 변경시키고/시키거나 TFPI 단백질의 아미노산들과 함께 입체 장애를 일으킨다. 이러한 두 상황은 FVII와 TFPI의 상호작용과 결합을 약화시킬 수 있고, 이로써 TFPI의 저해 효과에 대한 변형 FVII 폴리펩타이드의 내성을 증가시킬 수 있다. 19개의 천연 아미노산은 모두 글리신보다 큰 측쇄를 함유하고 FVII 폴리펩타이드를 변형시키는데 사용될 수 있다. 이러한 예로는 트립토판(Trp, W), 이소류신(Ile, I), 발린(Val, V) 및 트레오닌(Thr, T)이 있다.
다른 예로서, TFPI와 FVII 사이에 상호작용을 방해하기 위해 FVII 폴리펩타이드의 확인된 잔기 부근에 아미노산 삽입이 포함된다. FVII 폴리펩타이드에는 하나 이상의 위치에 하나 이상의 아미노산 잔기가 삽입될 수 있다. 예를 들어, 타이로신 잔기는 D196과 K197(키모트립신 번호매김 시, 각각 D60과 K60a에 상응함) 사이에 삽입될 수 있다. 이러한 변형은 D196K197insY(즉, D196과 K197은 이 사이에 타이로신이 삽입되는(insY) 위치이다)이다. 다른 예에서는 TFPI와 상호작용에 중요한 곳으로 확인된 위치에 2개의 아미노산 잔기가 삽입된다. 예를 들어, G237과 T238(키모트립신 번호매김 시 각각 G97과 T98에 상응함) 사이에 알라닌과 세린이 삽입되어 G237T238insAS 변형이 초래된다. 이러한 삽입 돌연변이는 FVII와 TFPI의 상호작용과 결합을 약화시킬 수 있고, 이로써 TFPI의 저해 효과에 대한 변형 FVII 폴리펩타이드의 내성이 증가된다.
표 5는 서열번호 3에 제시된 바와 같은 성숙 FVII 폴리펩타이드의 아미노산 위치에 상응하는, 확인된 잔기들의 아미노산 교체의 예를 비제한적으로 예시한 것이다. 언급된 바와 같이, 이러한 FVII 폴리펩타이드는 FVII/TFPI 결합을 저해하여 TFPI에 대한 내성이 증가하도록 설계되고, 이에 따라 증가된 응고제 활성을 나타낸다. 이러한 돌연변이에 대한 언급으로, 첫번째 아미노산(1문자 약어)은 치환되는 아미노산에 상응하고, 숫자는 서열번호 3과 관련된 성숙 FVII 폴리펩타이드 서열의 위치에 상응하고, 두번째 아미노산(1문자 약어)은 이 위치에서 첫번째 아미노산을 교체하는 선택된 아미노산에 상응한다. 또한, 돌연변이되는 아미노산 위치들은 키모트립신 번호매김 체계에 따라 언급되기도 한다. 이하 표 5에서는 변형 FVII 폴리펩타이드의 예시적 아미노산 서열이 제시된 서열 식별자(서열번호) 및 임의의 폴리펩타이드 식별 번호가 확인된다.
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또 다른 양태에 따르면, 조합 돌연변이체가 생성될 수 있다. 이러한 조합 돌연변이체 중에는 서열번호 3에 제시된 성숙 FVII의 번호매김을 기초로 한 잔기 D196, K197, K199, G237, T239, R290 또는 K341(키모트립신 번호매김을 기초로 한 D60, K60a, K60c, G97, T99, R147 및 K192에 각각 상응함)의 2 이상의 돌연변이를 보유하는 것이다. 예를 들어, 변형 FVII 폴리펩타이드는 확인된 위치들 중 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 위치에 아미노산 치환을 보유할 수 있다. 앞에서 언급한 바와 같이, 잔기들은 FVIIa와 TFPI 간에 유리한 상호작용이 없어지고, 하나 이상의 위치에 바람직하지 않은 상호작용이 도입되거나 입체 장애가 도입되도록 교체된다. 따라서, 변형된 폴리펩타이드는 입체 장애, 하전 역전, 하전 중화 또는 기타 바람직하지 않은 상호작용, 또는 이의 조합 중 하나 이상을 제공하는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 돌연변이를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 2 이상의 돌연변이가 도입될 수 있고, 이에 따라 아스파르트산(Asp, D) 또는 글루탐산(Glu, E)과 같은 음하전성 아미노산이 리신(Lys, K), 아르기닌(Arg, R) 또는 히스티딘(His, H)과 같은 양하전성 아미노산으로 치환될 수 있거나, 그 반대일 수도 있으며, 또는 임의의 아미노산이 예컨대 알라닌(Ala, A), 타이로신(Tyr, Y), 메티오닌(Met, M), 또는 류신(Leu, L), 이소류신(Ile, I), 발린(Val, V), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P) 또는 글리신(Gly, G), 세린(Ser, S), 트레오닌(Thr, T), 아스파라긴(Asn, N), 글루타민(Gln, Q), 트립토판(Tip, W) 및 시스테인(Cys, C) 또는 이의 임의의 조합으로 교체되어 중성 치환이 이루어질 수 있다. 중성 아미노산의 예는 소수성 아미노산, 예컨대 이소류신(Ile, I), 페닐알라닌(Phe, F), 발린(VaI, V), 류신(Leu, L), 트립토판(Trp, W), 메티오닌(Met, M), 알라닌(Ala, A), 글리신(GIy, G), 시스테인(Cys, C) 및 타이로신(Tyr, Y)이다. 다른 예에서는, 2 이상의 돌연변이가 이루어질 수 있고, 여기서 적어도 하나는 하전 역전 또는 하전 중화 돌연변이이고 다른 돌연변이는 측쇄가 더 큰 아미노산, 예컨대 트립토판(Trp, W), 이소류신(Ile, I), 발린(Val, V) 및 트레오닌(Thr, T)으로 글리신을 교체하는 치환이다. 다른 예에 따르면, 변형 FVII 폴리펩타이드에 삽입 돌연변이가 다른 삽입 돌연변이들과 함께 또는 하나 이상의 아미노산 치환, 예컨대 FVII와 TFPI 사이에 입체 장애 또는 바람직하지 않은 상호작용을 도입시키는 아미노산 치환과 함께 포함될 수 있다. 조합의 임의의 순열은 상기 표 5에 제시된 변형을 사용하여 변형 FVII 폴리펩타이드에 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제시된 FVII 폴리펩타이드는 D196K 및 아미노산 위치 K197, K199, G237, T239, R290 및/또는 K341에 하나 이상의 추가의 교체 변형, 및/또는 D196, K197 및/또는 G237 후에 삽입을 함유할 수 있다. 당업자는 표 5에 제시된 변형을 이용하여 가능한 모든 조합물을 쉽게 제조할 수 있다.
예를 들어, FVII 변이체는 서열번호 3에 제시된 성숙 FVII의 번호매김을 기초로 한 위치 197의 아미노산 치환을 돌연변이들 중의 하나로 포함하는 변이체를 포함한다. 비변형 FVII 폴리펩타이드 중의 위치 197을 차지하는 리신 잔기 대신에 임의의 아미노산 잔기가 치환될 수 있다. 일부 양태에 따르면, 리신은 타이로신(Y), 알라닌(A), 글루탐산(E), 아스파르트산(D), 류신(L), 메티오닌(M), 이소류신(I), 발린(V), 페닐알라닌(F) 또는 트립토판(W) 잔기로 교체된다. 예를 들어, 변형 FVII 폴리펩타이드의 예는 치환 K197L 또는 K197E를 함유하는 것이다. 다른 예에 따르면, 위치 197에 변형(교체, 결실 또는 부가 등)을 함유하는 FVII 폴리펩타이드는 추가로 다른 위치에 다른 변형을 포함할 수도 있다. 일반적으로, 이러한 다른 변형은 TFPI와 FVII의 상호작용을, 예컨대 바람직한 상호작용을 제거하거나, 바람직하지 않은 상호작용을 만들거나, 입체 장애를 도입하거나 또는 이들의 조합을 통해 변조시키는 것으로 고찰된 위치에서의 변형이다. 이러한 추가의 변형 중에는 전술한 바와 같은 D196, K199, G237, T239, R290 또는 K341에 상응하는 아미노산 위치에서의 변형이 포함된다. 또한, 이하에 기술된 바와 같이 당업계에 공지된 다른 추가의 변형도 고찰되기도 한다. 따라서, 위치 197에서의 변형 외에, FVII 폴리펩타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 아미노산 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 위치 197에 적어도 하나의 변형을 보유하는 FVII 변이체의 예는 D196F 및 K197E와 같이 2개의 치환을 함유하는 변이체, D196R, K197M 및 K199E와 같이 3개의 치환을 함유하는 변이체, D196R, K197E, K199E 및 R290E와 같이 4개의 치환을 함유하는 변이체, K197L, K199D, G237T, R290D 및 K341Q와 같이 5개의 치환을 함유하는 변이체, D196F, K197L, K199E, G237V, T239A 및 R290D와 같이 6개의 치환을 함유하는 변이체, 및 D196Y, K197L, K199A, G237T, T239A, R290D 및 K341R과 같이 7개의 치환을 함유하는 변이체를 포함한다. 서열번호 3에 제시된 성숙 FVII의 번호매김을 기초로 한 위치 197에 아미노산 치환을 돌연변이들 중의 하나로 포함하는 FVII 조합 돌연변이체의 예는 표 6에 제시한다.
서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드의 아미노산 위치에 상응하는 D196, K197, K199, G237, T239, R290 또는 K341 중 하나 이상의 아미노산 잔기에서 2 이상의 아미노산 교체를 함유하는 FVII 폴리펩타이드의 예는 표 6에 제시된다. 이 표에는, 돌연변이되는 아미노산 위치가 키모트립신 번호매김 체계에 따라 언급되기도 한다. 이러한 변형은 TFPI에 대한 FVII 결합을 저해하여 TFPI에 대한 내성을 증가시키고, 이에 따라 응고 활성을 증가시키도록 설계된 것이다.
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전술한 잔기들에 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 FVII 폴리펩타이드는 문헌[국제특허 공개번호 WO 2004/083361, Neuenschwander et al., (1995) Biochemistry 34: 8701-8707, Chang et al., (1999) Biochemistry 38: 10940-10948, 및 Iakhiaev et al., (2001) Thromb. Haemost. 85: 458-463]에 기술된 것과 같은 추가의 돌연변이를 함유할 수도 있다. 즉, 한 양태에 따르면, 당해의 FVII 폴리펩타이드는 서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드의 아미노산 위치에 상응하는 Q176, D196, K197, K199, G237, T239, R290, E296, K341 및 Q366의 하나 이상의 아미노산 잔기에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 추가의 돌연변이는 Q176A, D196N, G237L, E296A, K341N, K341Q, K341E, Q366A, Q366E 및 Q366G 중 어느 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
b. 안티트롬빈 III( AT - III )
안티트롬빈 III(안티트롬빈 또는 AT-III으로도 알려져 있음)은 중요한 항응고제 서핀(세린 프로테아제 저해제)이다. AT-III은 464개 아미노산 잔기(서열번호 122)를 함유하는 전구체 단백질로서 합성된다. 분비 과정에서, 32개 잔기의 시그널 펩타이드가 절단되어 432개 아미노산의 성숙 사람 안티트롬빈(서열번호 123)이 생성된다. 58kDa AT-III 당단백질은 혈액에서 순환하고 응고계의 다수의 세린 프로테아제를 저해하는 세린 프로테아제 저해제(서핀)로서 기능한다. AT-III의 주요 표적은 트롬빈 및 제Xa 인자이며, 또한 AT-III은 FIXa, FXIa, FXIIa 및 이보다 정도는 적지만 FVIIa의 활성을 저해하는 것으로 밝혀져 있다. AT-III의 작용은 글리코스아미노글리칸, 예컨대 자연발생의 헤파란 설페이트 또는 임상에서 항응고제로 널리 사용되는 다양한 조직 유래의 헤라핀 등에 의해 크게 증강된다. AT-III은 반응성 중심 루프에서 입체형태 변화를 유도하는 헤파린의 독특한 펜타사카라이드 서열에 매우 특이적 방식으로 결합한다. 이러한 입체형태에서, AT-III의 반응성 중심 루프는 세린 프로테아제의 반응성 부위와 더욱 효과적으로 상호작용하여 저해를 실시할 수 있다.
AT-III은 일반적으로 유리 혈장 FVIIa를 헤파린의 존재 하에서도 저해하지 않는데, 그 이유는 아마도 AT-III과 효과적인 상호작용을 방해하는 FVIIa의 자이모겐 유사 입체형태 때문일 것이다. 하지만, FVIIa가 일단 TF와 복합체를 형성하면 AT-III의 저해 효과는 증가한다. TF/FVIIa 복합체에 대한 AT-III의 결합은 TF로부터 FVIIa를 방출시킬 수 있고 AT-III과 불활성 복합체로 FVIIa를 유지시킬 수 있다. FVIIa 단독에 비해 TF 결합된 FVIIa에 대한 AT-III의 증가된 친화도는 아마도 TF와 복합체를 형성할 때 FVIIa의 활성 부위의 성숙을 반영하고, 이에 따라 AT-III 결합에 순종할 수 있게 된다(Rao et al.(1993) Blood 81: 2600-2607). 따라서, FVIIa에 미치는 AT-III의 영향은 FVIIa 분자 자체의 내적 활성에 비례한다. FVIIa가 자이모겐 유사 입체형태를 유지하는 동안에는 AT-III은 거의 영향을 미치지 않는다. 하지만, FVIIa가 TF 결합 또는 특정 시험관내 변형 등에 의해 더 활성 형태로 입체형태를 변화시키면, AT-III 저해는 유의적으로 증가한다. 내적 활성이 증가하도록 변형된 FVIIa 폴리펩타이드는 종종 AT-III 저해에 대한 감수성의 동시 증가를 나타낸다. 예를 들어, FVIIa의 활성화 포켓에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 변형, 예컨대 K337A, L305V, M298Q, V158D 및 E296V(서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 서열 대비) 치환에 상응하는 아미노산 교체 등에 의한 변형은 AT-III에 대한 FVIIa 폴리펩타이드의 감수성을 증가시켜 FVIIa 활성을 90%까지 저해한다(Persson et al.(2001) PNAS 98: 13583-13588). 다른 예에 따르면, FVIIa의 α-나선에 관련되어 있는 아미노산의 변형에 의한 더욱 더 자이모겐과 유사한 입체형태의 유도는 변형 FVIIa 단백질의 활성을 증가시키면서, AT-III에 대한 감수성도 증가시킨다(Persson et al.(2004) Biochem J 379: 497-503).
AT-III에 대한 내성을 증가시키는 변형
AT-III에 의한 저해에 대한 내성을 증가시키는 변형도 FVII 폴리펩타이드에 이루어질 수 있다. 일반적으로, 이와 같이 변형된 FVII 폴리펩타이드는 FVII 폴리펩타이드의 적어도 하나의 활성을 유지한다. 일반적으로, 이러한 변형은 FVIIa(또는 TF/FVIIa 복합체)와 AT-III의 상호작용에 직접 관여하는 FVII 폴리펩타이드의 임의의 위치, 또는 FVIIa(또는 TF/FVIIa 복합체)와 AT-III 간의 상호작용에 직접 관여하는 잔기들의 입체형태 또는 위치에 영향을 미치는 다른 잔기들에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. AT-III에 대한 증가된 내성을 보유하는 변형 FVII 폴리펩타이드는 AT-III에 의한 저해의 2차 속도 상수 또는 특정 조건 하에서의 저해 정도가 생체내, 생체외 또는 시험관내 중 어느 하나에서 비변형 또는 야생형 FVII 폴리펩타이드의 저해에 대한 2차 속도 상수 또는 저해 정도와 비교했을 때 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 감소된 것일 수 있다. 따라서, 변형 FVII 폴리펩타이드는 응고 개시에 관하여 AT-III의 자연 저해 효과에 내성이다. 응고촉진제 치료로서 피검체에 투여한 후와 같이 적당한 생체내, 시험관내 또는 생체외 분석으로 평가했을 때, 변형 AT-III 내성 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드와 비교했을 때 증가된 응고제 활성을 나타낸다.
이하에 기술되는 바와 같이, 당업자는 AT-III에 대한 증가된 내성을 나타내는 변형 FVII 폴리펩타이드를 실험적으로 또는 추론적으로 설계할 수 있다. 이러한 변형 FVII 폴리펩타이드는 이와 같이 변형된 FVII 폴리펩타이드가 AT-III에 대한 증가된 내성을 나타내는지를 측정하는 당업자에게 공지된 분석법으로 시험할 수 있다. 예를 들어, 상기 변형 FVIIa 폴리펩타이드에 대해 AT-III에 의한 저해의 2차 속도 상수를 측정할 수 있다. 일반적으로, AT-III에 대한 증가된 내성을 보유하는 변형 FVII 폴리펩타이드는 특정 조건 하에(예컨대 환자에게 단백질의 고정량을 주사한 후) 결합성 감소 및/또는 AT-III에 의한 저해 감소를 나타낼 것이다. 일반적으로, 이러한 분석법은 FVII의 활성화된 형태(FVIIa)와 같은 FVII의 이중쇄 형태를 가지고 수행한다. 또한, AT-III의 효과를 측정하는 분석법은 일반적으로 헤파린의 존재 및 조직 인자의 존재 하에 수행되지만, 이러한 보조인자 중 어느 하나 또는 둘 모두의 부재하에서도 수행될 수 있다.
AT-III에 대한 증가된 내성을 보유하는 변형 FVII 폴리펩타이드는 AT-III에 의한 저해의 2차 속도 상수 또는 특정 조건 하에서의 저해 정도가 생체내, 생체외 또는 시험관내 중 어느 하나에서 비변형 또는 야생형 FVII 폴리펩타이드의 저해에 대한 2차 속도 상수 또는 저해 정도와 비교했을 때 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 감소된 것일 수 있다. 이와 같이 수득되는, AT-III에 대한 증가된 내성을 보유하는 변형 FVII 폴리펩타이드는 AT-III에 대한 결합 및/또는 친화도가 생체내 또는 시험관내에서 비변형 또는 야생형 FVII 폴리펩타이드의 결합 및/또는 친화도에 비해 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 감소된 것일 수 있다. 또한, 이러한 변형 FVII 폴리펩타이드에 의한 AT-III에 대한 내성 증가는 AT-III의 존재 하에 응고 활성의 증가로서 명백해질 수도 있다. AT-III 변형 FVII 폴리펩타이드의 응고 활성은 생체내, 생체외 또는 시험관내에서의 비변형 또는 야생형 FVII 폴리펩타이드의 응고 활성에 비해 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 증가될 수 있다.
2. 활성화된 혈소판에 대한 결합
또한, 응고의 TF 의존적 및/또는 TF 독립적 개시 동안 응고 활성을 증가시키는 FVII 폴리펩타이드에도 변형이 이루어질 수 있다. TF 독립적 응고 개시의 제안된 기전은 활성화된 혈소판의 표면에서 실시되는 FVIIa(TF와의 복합체 상태가 아닌)에 의한 FX 및 FIX의 직접 활성화를 수반한다. FVIIa는 FVIIa 폴리펩타이드의 Gla 도메인 중의 잔기들과, 혈소판 표면에서 발현되는 포스파티딜세린 및 다른 음하전성 인지질 간에 상호작용을 통해 활성화된 혈소판을 결합시킨다. 이러한 상호작용은 비교적 약해서, 응고 동안 일반적으로 관찰되는 트롬빈 생산의 초기 폭발에 유의적인 역할을 할 것 같지 않으며, 상기 초기 폭발은 TF 의존적 활성의 결과일 가능성이 높다. 앞에서 논한 바와 같이, TF 독립적 응고 개시 및 혈소판 표면과 FVIIa의 비교적 약한 상호작용은 임상에서 효능을 획득하는데 요구되는 고용량의 rFVIIa의 투여 필요성을 설명할 수 있다. 예를 들어, 혈장에서 10nM FVII의 약 1% 만이 TF/FVIIa로 존재하지만, 혈장에서 rFVIIa의 치료 용량은 상기 수준보다 훨씬 높은 90㎍/kg 또는 약 50nM이다. 따라서, 고용량의 rFVIIa는 활성화된 혈소판에 대한 rFVIIa의 저친화도 결합을 보상해주어, 치료동안 치료제의 충분한 응고제 활성을 나타낸다. 따라서, 당해의 치료제는 활성화된 혈소판에 대한 결합 및/또는 친화도 증가로 인해, 응고 개시를 실시하기에 충분한 낮은 투여량으로 투여될 수 있는 변형 FVII 폴리펩타이드이다. 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 Gla 도메인의 변형을 통해 활성화된 혈소판에 대한 증가된 결합 및/또는 친화도를 나타내도록 설계된다.
비타민 K 의존적 혈장 단백질, 예컨대 FVII, FIX, FX, 프로트롬빈, 단백질 C 및 단백질 S, 및 막 표면 상의 음하전성 인지질 등의 γ-카르복실화된 Gla 도메인에서 잔기들의 상호작용은 지혈에 중요하다. 비타민 K 의존적 혈장 단백질의 Gla 도메인은 일반적으로 약 45개 아미노산을 함유하고, 이 중 9 내지 12개의 글루탐산 잔기는 비타민 K 의존적 카르복실화에 의해 해독후 변형되어 γ-카르복시글루타메이트(Gla)를 형성한다. Gla 도메인을 형성하는 아미노산은 단백질의 시그널 펩타이드와 프로펩타이드를 형성하는 아미노산 직후에 위치하여, 전구체 폴리펩타이드의 성숙 단백질로의 프로세싱 및 절단 후에는 N-말단에 위치한다. 예를 들어, FVII의 Gla 도메인을 형성하는 아미노산은 서열번호 1에 제시된 전구체 폴리펩타이드의 위치 39-83, 서열번호 2에 제시된 전구체 폴리펩타이드의 위치 61-105, 및 서열번호 3에 제시된 성숙 폴리펩타이드의 위치 1 내지 45에 존재한다. 이 중에서, 서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드의 위치 E6, E7, E14, E19, E20, E25, E26, E29 및 E35에 있는 10개의 글루탐산 잔기는 카르복실화에 의해 변형되어 γ-카르복시글루타메이트(Gla) 잔기를 생성한다.
글루탐산은 단지 약한 Ca2 + 킬레이터이고 γ-카르복시글루타메이트는 훨씬 강한 킬레이터이기 때문에, 비타민 K 카르복실라제에 의한 상기 변형 단계는 단백질 Gla 도메인의 Ca2+ 결합 친화도를 유의적으로 증가시킨다. 또한, 칼슘은 FVIIa의 프로테아제 도메인에 결합하고, 여기서 최적 활성에 필요한 입체형태 변화를 촉진한다. FVIIa의 Gla 도메인 및 프로테아제 도메인 부위 모두에 대한 결합을 통해, 칼슘은 TF 및 인지질에 대한 결합뿐만 아니라 FX의 활성화를 위한 촉매 효율도 증강시킨다. γ-카르복실화된 Gla 도메인은 다양한 친화도로 7개의 Ca2+ 이온을 결합시키고, 이는 Gla 도메인이 TF의 C-말단 도메인과 상호작용할 수 있도록 입체형태적 변화를 유도한다. 또한, Ca2 + 결합은 혈소판 막 위에 존재하는, 포스파티딜세린이 대부분인 음하전성 인지질과 FVIIa의 상호작용을 촉진한다. 포스파티딜세린(PS)은 혈액 응고를 지지하는 음하전성 막의 주요 성분이다. 대부분의 세포에서, PS는 세포막의 내엽에 존재하여 혈장에 노출되지 않는다. 혈소판 활성화와 같은 특정 세포 과정이 외측 혈장 지향 표면으로 PS를 전위시켜, 비타민 K 의존적 단백질의 Gla 도메인에 대한 결합 부위를 제공한다(Hemker et al.(1983) Blood Cells 9: 303-317).
FVIIa의 Gla 도메인은 또한 TF 및 활성화된 혈소판과 FVIIa의 상호작용에 관여하는 것 외에도 FX의 결합 및 활성화에 관련되어 있다. 이는 FVIIa Gla 도메인이 FX의 FXa로의 활성화에 중요한 단계인 FX의 Gla 도메인과 TF의 Lys165 및 Lys166을 정렬시키는 것을 돕는 간접 기전을 통해 일어날 수 있다. 대안적으로, FVIIa의 Gla 도메인은 FX의 Gla 도메인과 직접 상호작용하여 활성화 전에 효소와 기질을 정확하게 정렬시킨다(Neuenschwander et al.(1994) J Biol Chem 269: 8007-8013, Huang et al.(1996) J Biol Chem 271: 21752-21757). FVIIa의 위치 36에 있는 아르기닌은 인지질의 부재 하에 FX Gla 도메인의 효과적인 도킹(docking)에 중요한 것으로 밝혀졌고, 이는 FVIIa의 Gla 도메인이 FX와의 단백질-단백질 상호작용에 관여한다는 것을 입증한다(Ruf et al.(1999) Biochemistry 38: 1957-1966).
여러 비타민 K 의존적 혈장 단백질의 Gla 도메인은 유의적인 상동성을 나타내지만, 음하전성 인지질 막을 해리 상수(Kd)가 1000배 이상 다르게 매우 다른 친화도로 결합시킨다. 사람 FVII는 이러한 단백질 중에서 인지질 막에 대한 친화도가 가장 낮은 것 중 하나이다(McDonald et al.(1997) Biochemistry 36: 5120-5127). PS에 대한 Gla 도메인의 결합을 담당하는 정확한 상호작용은 완전히 이해되지 않았지만, 이 도메인 내의 각 아미노산 잔기가 관찰된 여러 친화도에 기여할 것으로 생각된다. 종래 연구에서는 위치 10, 32 및 33(성숙 FVII 단백질 대비)의 아미노산들과 전체 막 친화도 간에 상관관계가 있음을 시사했다(McDonald et al.(1997) Biochemistry 36: 5120-5127). 또한, 후속 돌연변이분석은 특정 잔기가 결합 친화도에 기여한다는 것을 밝혀냈다. 예를 들어, 단백질 C의 성숙 형태에서 위치 10의 히스티딘과 프롤린의 치환은 막 친화도를 3배 감소시켰다(Shen et al.(1997) Biochemistry 36: 16025-16031). 이에 반해, 비타민 K 의존적 혈장 단백질의 Gla 도메인에 존재하는 특정 잔기들의 돌연변이는 막 친화도가 높고 기능이 증강된 단백질을 생산할 수 있다. 하지만, Gla 도메인 내의 특정 위치들에서의 돌연변이 효과는 여러 단백질 중에서 반드시 보존되지는 않는다. 예를 들어, 소 단백질 C의 Q31E 및 N33D 치환에 의한 돌연변이는 막 결합의 큰 증가를 매개했지만, 사람 단백질 C에서의 상응하는 돌연변이는 결합의 최소 변화를 나타냈다. 사람 FVII의 유사 돌연변이(K32E)는 야생형 FVII 단백질에 비해 결합 친화도를 13배 증가시켰다(Harvey et al.(2003) J Biol Chem 278: 8363-8369).
a. 이종 Gla 도메인의 도입에 의해 변형
활성화된 혈소판의 비교적 낮은 결합 친화도로 인해, FVII의 Gla 도메인은 변형 FVII와 인지질 막 간의 상호작용을 증가시켜 응고 활성을 증가시키기 위한 목적의 변형에 대한 표적이다. 변형은 상기 상호작용에 관여하는 특정 아미노산의 치환에 의해 달성될 수 있다(예컨대, Shah et al. PNAS 95: 4429-4234, Harvey et al.(2003) J Biol Chem 278: 8363-8369). 대안적으로, 변형은 다른 비타민 K 의존적 단백질의 Gla 도메인과 전체 Gla 도메인의 치환, 즉 Gla 도메인 교환에 의해 달성될 수 있다. 이러한 유형의 변형은 단백질 C의 Gla 도메인이 FVII의 Gla 도메인으로 교체되었을 때 나타나는 것과 같이 키메라 단백질을 제공한다(Geng et al.(1997) Thromb Haemost 77: 926-933).
일반적으로, 이러한 변형은 키메릭 변형 FVII 폴리펩타이드를 제조하기 위한, FVII 폴리펩타이드 영역 내로 이종 Gla 도메인, 또는 인지질 결합을 실시하기에 충분한 부분의 부가 또는 치환 등에 의한 도입을 포함한다. 일반적으로, 이러한 키메릭 FVII 폴리펩타이드는 FVII의 적어도 하나의 활성을 유지한다. 활성화된 혈소판에 대한 Gla-변형 FVII 폴리펩타이드의 결합 및/또는 친화도는 생체내 또는 시험관내에서 비변형 또는 야생형 FVII 폴리펩타이드의 결합 및/또는 친화도에 비해 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 증가될 수 있다. 또한, 활성화된 혈소판에 대한 변형 FVII 폴리펩타이드의 결합 및/또는 친화도는 응고 활성의 증가로 명백해질 수 있다. Gla-변형 FVII 폴리펩타이드의 응고 활성은 생체내 또는 시험관내에서 비변형 또는 야생형 FVII 폴리펩타이드의 응고 활성에 비해 적어도 또는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 증가될 수 있다.
임의의 폴리펩타이드 내에 함유된 Gla 도메인 또는 이의 충분한 일부는 FVII 폴리펩타이드의 일정 영역의 교체 또는 도입을 위한 이종 Gla 도메인의 급원으로 사용될 수 있다. 일반적으로,이러한 이종 Gla 도메인은 인지질, 예컨대 활성화된 혈소판 표면에 존재하는 인지질에 대한 결합 친화도를 나타낸다. 일반적으로, 이종 Gla 도메인은 FVII의 Gla 도메인의 친화도와 비교했을 때 인지질에 대해 더 높은 친화도를 나타내는 것을 선택한다. FVII 폴리펩타이드의 변형을 위한 이종 도메인으로 사용된 정확한 Gla 도메인 또는 이의 충분한 일부는 추론적 또는 실험적으로 결정될 수 있다. 다른 Gla 함유 폴리펩타이드의 예로는 FIX, FX, 프로트롬빈, 단백질 C, 단백질 S, 오스테오칼신, 기질 Gla 단백질, 성장-지연-특이적 단백질 6(Gas6), 및 단백질 Z를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 예시적 단백질들의 Gla 도메인은 서열번호 110-118, 120 및 121 중 어느 하나에 제시된다. 예를 들어, 이종 Gla 도메인의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 또는 그 이상의 인접 아미노산 또는 전체 Gla 도메인은 FVII 폴리펩타이드 내로 도입될 수 있다. 또한, FVII 폴리펩타이드 내로 Gla 도메인의 도입은 이종 폴리펩타이드의 Gla 도메인의 부분이 아닌 추가의 아미노산을, 이러한 추가의 아미노산이 도입된 Gla 도메인의 인지질 결합능을 유의적으로 약화시키지 않는 한, 추가로 포함할 수 있다.
일부 예에서, 도입은 변형 FVII 폴리펩타이드가 적어도 하나의 FVII 활성을 유지하는 한 FVII폴리펩타이드의 내인성 Gla 도메인 또는 다른 영역 또는 도메인에 이종 Gla 도메인이 삽입되도록 하는, FVII 폴리펩타이드의 Gla 도메인의 부가에 의해 이루어진다. 이러한 예에서, FVII 폴리펩타이드의 천연 Gla 도메인은 폴리펩타이드 내에 유지되지만, 일부 경우에는 천연 Gla 도메인을 구성하는 아미노산 서열이 중단되기도 한다. 다른 예에서, 이종 Gla 도메인 또는 이의 충분한 일부는 천연 Gla 도메인이 중단되지 않도록 천연 Gla 도메인의 N-말단 또는 C-말단 중 어느 하나에 인접하게 삽입된다. 또 다른 예에서, 이종 Gla 도메인 또는 이의 충분한 일부는 FVII 폴리펩타이드의 다른 도메인에 삽입된다.
또한, 본 발명은 변형 FVII 폴리펩타이드가 FVII의 적어도 하나의 활성을 유지하는 한, FVII의 내인성 Gla 도메인 전체 또는 근접부가 제거되고 이종 Gla 도메인 또는 인지질 결합을 실시하기에 충분한 일부로 교체된 변형 Gla 도메인 FVII 폴리펩타이드를 제공한다. 또한, 이러한 변형은 Gla 도메인 교환이라고도 한다. 예를 들어, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열의 아미노산 1 내지 45에 상응하는 서열번호 119에 제시된 바와 같은 FVII의 Gla 도메인 전부 또는 일부는 FVII 폴리펩타이드로부터 제거될 수 있고 이종 Gla 도메인 또는 이의 충분한 일부로 교체될 수 있다. 이종성 일부는 서열번호 110-118, 120 및 121 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 보유하는 Gla 도메인을 비롯하여(이에 국한되지 않는다), 인지질에 결합하는 당업자에게 공지된 임의의 Gla 도메인을 포함한다. 일부 경우에, Gla 도메인의 충분한 일부, 예컨대 인지질 결합을 실시하기에 충분한 서열번호 110-118, 120 및 121 중 어느 하나의 일부는 FVII의 내인성 Gla 도메인 또는 내인성 Gla 도메인의 일부를 교체할 수 있다. 예를 들어, FVII의 Gla 도메인은 서열번호 113에 제시된 단백질 C의 Gla 도메인으로 교환될 수 있다. 그 결과 수득되는 변형 FVII 폴리펩타이드는 단백질 C 유래의 Gla 도메인과 이어서 자신의 EGF-1, EGF-2 및 세린 프로테아제 도메인을 함유한다.
일부 예에서, 이종 Gla 도메인은 인지질 결합의 증가로 인한, 활성화된 혈소판에 대한 결합을 추가로 증가시키는 돌연변이를 함유한다. 예를 들어, 단백질 C Gla 도메인이 변형 FVII 폴리펩타이드의 생성을 위해 도입된다면, 단백질 C Gla 도메인은 인지질 결합의 증가를 부여하는 아미노산 돌연변이를 함유할 수 있다.
다른 예에서, 이종 Gla 도메인은 Gla 도메인에 FVII 유사 기능을 부여하는 추가의 돌연변이를 함유할 수 있다. 에를 들어, 앞에서 지적한 바와 같이, 서열번호 119에 제시된 FVII Gla 도메인의 R36은 FX와의 상호작용에 관여할 수 있다. 따라서, 이종 Gla 도메인은 추가의 변형, 예컨대 서열번호 3에 제시된 바와 같은 성숙 FVII 폴리펩타이드의 위치 36에 아르기닌을 유지시키는데 필요한 임의의 변형, 또는 변형 FVIIa 폴리펩타이드의 FX-활성화 성질을 유지시키는데 필요한 임의의 다른 변형을 함유할 수 있다(Ruf et al.(1999) Biochem 38: 1957-1966). 따라서, 일부 예에 따르면, R36에 상응하는 돌연변이가 이종 Gla 도메인에 이루어질 수 있다. 상응하는 위치는 아미노산 서열의 정렬 등을 통해 당업자에 의해 결정될 수 있다.
이하에 설명되는 바와 같이, 당업자는 최종 FVII 폴리펩타이드가 적어도 하나의 FVII 활성을 유지하도록 이종 Gla 도메인을 함유하는 변형 FVII 폴리펩타이드를 실험적 또는 추론적으로 설계할 수 있다. 일반적으로, 이와 같이 변형된 FVII 폴리펩타이드는 FX에 결합하고 활성화시키는 능력을 유지한다. 일부 경우에, 이와 같이 변형된 FVII 폴리펩타이드는 FIX에 결합하고 활성화시키는 능력을 유지한다. 최종 Gla 변형 FVII 폴리펩타이드는 TF에 결합하는 능력을 유지하는 것을 포함한다. 또한, Gla 교환된 변형 FVII폴리펩타이드는 TF의 부재 하에 내인성 활성이 증가된 것을 포함한다. 따라서, 최종 Gla 변형 FVII 폴리펩타이드는 야생형 FVIIa와 비교 시, TF에 결합하지 않거나 또는 TF에 약하게 결합하는 것을 포함한다. 일반적으로, 이러한 변형 FVII 폴리펩타이드는 증가된 인지질 결합을 나타낸다. 특히, 이러한 변형 FVII 폴리펩타이드는 포스파티딜세린에 대한 증가된 결합을 나타낸다. 인지질에 대한 증가된 결합은 분리된 인지질에 대해 또는 활성화된 혈소판 표면에서 분석될 수 있다. 이러한 분석법은 일반적으로 FVII의 이중쇄 형태, 예컨대 FVII의 활성화된 형태(FVIIa)를 가지고 수행한다.
본 발명은 이종 Gla 도메인을 함유하는 변형 FVII 폴리펩타이드를 제공한다. 이러한 변형 FVII 폴리펩타이드의 예는 내인성 Gla 도메인이 FIX(서열번호 110), FX(서열번호 111), 트롬빈(서열번호 112), 단백질 C(서열번호 113) 또는 단백질 S(서열번호 114) 중 어느 하나의 Gla 도메인 전부 또는 일부로 교체된 것이다. 이러한 변형 FVII 폴리펩타이드는 활성화된 혈소판에 대한 증가된 결합을 나타내어 응고제 활성 증가를 나타낼 수 있다. 표 7은 내인성 Gla 도메인을 FIX, FX, 단백질 C, 단백질 S 또는 트롬빈의 Gla 도메인으로 교체하는 FVII 폴리펩타이드에 이루어질 수 있는 예시적 변형을 정리한 것이다. 이 표는 변형의 명칭(예, Gla 교환 FX) 및 변형의 세부사항, 예컨대 외인성 Gla 도메인이 FVII 폴리펩타이드에 삽입된 아미노산 위치 및 외인성 Gla 도메인의 서열을 제공한다. 서열 식별자(서열번호)도 제공되며, 여기에 변형 FVII 폴리펩타이드의 예시적 아미노산 서열도 제시되고, 또한 임의의 폴리펩타이드 식별번호도 제시된다. 예를 들어, "Gla 교환 FIX" 변형(A1Y44delinsYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQY)은 아미노산 잔기 A1 내지 Y44(서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드에 상응하는 잔기)의 결실 및 서열번호 110에 제시된 FIX Gla 도메인의 아미노산 잔기 Y1 내지 Y45에 상응하는 45개 아미노산 잔기의 삽입에 의한 내인성 FVII Gla 도메인의 결실을 수반한다. 이와 유사하게, Gla 교환 FX 변형은 아미노산 잔기 A1 내지 Y44(서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드에 상응하는 잔기)의 결실 및 서열번호 111에 제시된 FX Gla 도메인의 A1 내지 Y44에 상응하는 44개 아미노산 잔기의 삽입을 수반한다. Gla 교환 트롬빈 변형은 아미노산 잔기 A1 내지 Y44(서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드에 상응하는 잔기)의 결실 및 서열번호 112에 제시된 트롬빈 Gla 도메인의 아미노산 잔기 Y1 내지 Y44에 상응하는 44개 아미노산 잔기의 삽입을 수반한다. Gla 교환 단백질 C 변형은 아미노산 잔기 A1 내지 Y44(서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드에 상응하는 잔기)의 결실 및 서열번호 113에 제시된 단백질 C Gla 도메인의 아미노산 잔기 A1 내지 H44에 상응하는 44개 아미노산 잔기의 삽입을 수반한다. Gla 교환 단백질 S 변형은 아미노산 잔기 A1 내지 Y44(서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드에 상응하는 잔기)의 결실 및 서열번호 114에 제시된 단백질 S Gla 도메인의 아미노산 잔기 Y1 내지 Y44에 상응하는 44개 아미노산 잔기의 삽입을 수반한다.
Figure 112009069306018-PCT00007
이종 Gla 도메인을 함유하는 변형 FVII 폴리펩타이드는 활성화된 혈소판에 대한 증가된 결합 및/또는 친화도로 인해, NovoSeven®과 같은 야생형 FVII 분자에 비해 낮은 투여량으로 증가된 응고제 활성을 나타낼 수 있다. Gla 변형 FVII 폴리펩타이드의 응고 활성은 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 비변형 또는 야생형 FVII 폴리펩타이드의 응고 활성에 비해 적어도 또는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 증가될 수 있다.
3. 조합 및 추가의 변형
증가된 TFPI 내성, 증가된 AT-III 내성, 증가된 TF 의존적 및/또는 TF 독립적 촉매 활성, 향상된 약동학적 성질, 예컨대 증가된 반감기 및/또는 인지질 막에 대한 증가된 결합 및/또는 친화도를 보유하게 하는 FVII 폴리펩타이드의 변형 외에도, 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 추가로 전술한 성질을 하나보다 많이 나타내는 것도 포함한다. 예를 들어, FVII 폴리펩타이드는 최종 폴리펩타이드가 인지질에 대한 증가된 결합 및/또는 친화도 및 TFPI에 대한 증가된 내성을 나타내도록 변형시킬 수 있다. 따라서, FVII 폴리펩타이드는 다른 비타민 K 의존적 혈장 단백질 유래의 이종 Gla 도메인의 도입 및 서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드 대비 위치 196, 197, 199, 237, 239, 290 또는 341에 있는 어느 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 변형될 수 있다.
또한, 당해의 임의의 변형 FVII 폴리펩타이드는 당업계에 개시된 하나 이상의 다른 변형을 함유할 수도 있다. 일반적으로, 이러한 추가의 변형은 변형 폴리펩타이드의 증가된 응고제 활성 및/또는 폴리펩타이드의 증가된 안정성을 산출하는 변형이다. 따라서, 최종 변형 FVII 폴리펩타이드는 증가된 응고제 활성을 나타내다. 추가의 변형은 예를 들어, 당업계에 공지된 임의의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입, 일반적으로 FVII 폴리펩타이드의 응고제 활성 및/또는 안정성을 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 당해의 임의의 변형 FVII 폴리펩타이드는 최종 변형 FVII 폴리펩타이드가 야생형 또는 비변형 폴리펩타이드의 FVII 활성을 유지하는 한, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 추가의 아미노산 변형을 함유할 수 있다.
일 예로서, 추가의 변형은 다른 인자, 분자 및 단백질과의 상호작용이 변경되도록 FVII 폴리펩타이드 서열에 이루어질 수 있다. 예를 들어, 조직인자(TF)와의 상호작용에 수반되는 아미노산 잔기는 변형 FVII 폴리펩타이드의 TF에 대한 친화도가 증가되도록 교체될 수 있다. 다른 변형으로는, 제X 인자, 제IX 인자, TFPI 및 AT-III과의 상호작용에 수반되는 아미노산의 변형을 포함하며, 이에 국한되지 않는다.
또한, 추가의 변형은 폴리펩타이드의 입체형태 또는 폴딩을 변경시키는 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드에 이루어질 수 있다. 그 예로는, 새로운 이황화 결합이 형성되도록 하는 시스테인으로의 하나 이상의 아미노산의 교체, 또는 α-나선 입체형태를 안정화시키는 변형이 포함되며, 이로써 변형 FVII 폴리펩타이드에 증가된 활성이 부여된다.
또한, 추가의 변형은 해독후 변형에 영향을 미치도록 FVII 폴리펩타이드에 이루어질 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 최종 변형 FVII 폴리펩타이드가 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 증가된 글리코실화를 갖도록 추가의 글리코실화 부위를 포함하는 변형이 이루어질 수 있다. 또한, 변형은 변형 FVII 폴리펩타이드의 안정성을 증가시키는 작용을 하는 것과 같은 화학적 잔기에 후속적으로 연결될 수 있는 아미노산 잔기를 도입하도록 이루어질 수 있다. 또한, FVII 폴리펩타이드는 내인성 프로테아제의 잠재적 절단 부위(들)를 변형시켜, FVIIa 변이체의 분해를 저하시키고 변형 FVII 폴리펩타이드의 안정성을 증가시키도록 변경될 수 있다.
또한, 아미노산 치환, 결실 또는 삽입은 변형 FVII 폴리펩타이드가 인지질 막에 대한 증가된 결합 및/또는 친화도를 나타내도록 내인성 또는 이종 Gla 도메인에 이루어질 수 있다. 다른 예에서, 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 정상적으로 감마-카르복실화되는 위치의 치환 또는 내인성 Gla 도메인의 결실을 나타낼 수 있다(US 20070037746).
다음 섹션은 FVII폴리펩타이드의 증가된 안정성 및/또는 응고제 활성에 영향을 미치는 당업계에 기술된 예시적 변형의 비제한적 에를 설명한다. 앞에서 논한 바와 같이, 이러한 변형들은 당해의 임의의 변형 FVII 폴리펩타이드에 추가로 포함될 수 있다. 이하에 언급된 아미노산 위치는 서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드에 상응한다. 상응하는 돌연변이는 서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드의 대립유전자 변이체, 종 변이체 또는 스플라이싱 변이체와 같이 다른 FVII 폴리펩타이드에 이루어질 수 있다.
a. 내인성 활성을 증가시키는 변형
일 예로서, 추가의 변형은 제X 인자 및/또는 제IX 인자에 대한 증가된 촉매 활성을 나타내도록 변형 제VII 인자 폴리펩타이드에 이루어질 수 있다. 예를 들어, 변형은 최종 변형 FVII 폴리펩타이드가 TF에 대한 증가된 친화도를 보유하여 FX 및 /또는 FIX에 대한 증가된 활성을 나타내도록 보조인자 TF와의 상호작용에 수반되는 아미노산에 이루어질 수 있다. 또한, 변형은 FX 및/또는 FIX에 대한 변형 FVII 폴리펩타이드의 내인성 활성이 비변형 폴리펩타이드의 활성에 비해 증가되도록 FVII 폴리펩타이드의 활성화 포켓에 이루어질 수 있다. 활성을 증가시키는 다른 변형 전략은 단백질의 폴딩 및 입체형태가 더욱 활성 형태로 변경되거나 또는 고활성과 불활성(또는 저활성) 입체형태 간의 평형이 고활성 입체형태(들)에 유리하게 이동되도록 하는 FVII 폴리펩타이드의 변형을 수반한다. 또한, 더욱 활성인 폴리펩타이드는 FVII 폴리펩타이드의 β-가닥에 수반되는 아미노산의 변형에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 변형 FVII 폴리펩타이드를 더욱 활성 형태로 "고정"시키는 기능을 할 수 있는 새로운 이황화 결합을 형성할 수 있는 새로운 시스테인 쌍을 도입시키는 아미노산 치환이 이루어질 수 있다.
변형 FVII 폴리펩타이드의 내인성 활성을 증가시키기 위해 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드에 포함될 수 있는 추가의 변형의 예로는 문헌[Persson et al. (2004) Biochem J. 379:497-503, Maun et al. (2005) Prot Sci 14:1171-1180, Persson et al. (2001) PNAS 98:13583-13588, Persson et al. (2002) Eur J Biochem 269:5950- 5955, Soejima et al. (2001) J Biol Chem 276:17229-17235, Soejima et al. (2002) J Biol Chem 277:49027-49035, WO200183725, WO2002022776, WO2002038162, WO2003027147, WO200338162, WO2004029090, WO2004029091, WO2004108763 및 WO2004111242]에 기술된 것을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 변형 FVII 폴리펩타이드의 내인성 활성을 증가시킬 수 있는 당업계에 기술된 예시적 아미노산 변형의 비제한적 예로는 S278C/V302C, L279C/N301C, V280C/V301C, S281C/V299C, S314E, L39E, L39Q, L39H, I42R, S43Q, S53N, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, T83K, El 16D, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, R304Y, R304F, R304L, R304M, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L3O5K, L305R, L305H, L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K.337R, K337H, K337D, K337Q, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, 및 위치 300-322, 305-322, 300-312, 또는 305-312의 트립신, 트롬빈 또는 FX 유래의 상응하는 아미노산으로의 치환, 및 위치 310-329, 311-322 또는 233-329의 트립신 유래의 상응하는 아미노산으로의 치환 중 어느 하나 이상을 포함한다.
b. 프로테아제에 대한 내성을 증가시키는 변형
당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 또한 프로테아제에 대한 폴리펩타이드의 내성을 증가시키는 추가의 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 잠재적 단백분해 절단 부위를 제거하는 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이에 따라 변형 FVII 폴리펩타이드는 프로테아제에 대해 더욱 내성이 되어, 변형 폴리펩타이드의 안정성 및 반감기를 증가시킬 수 있다.
프로테아제에 대한 내성을 증가시키기 위해 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드에 포함될 수 있는 추가의 변형의 예로는 미국 특허 US 5580560 또는 국제출원 공개번호 WO 1988010295 및 WO 2002038162에 기술된 것이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 저해제 및/또는 프로테아제에 대한 변형 FVII 폴리펩타이드의 내성을 증가시킬 수 있는 당업계에 기술된 예시적 변형의 비제한적 예로는 다음 중 어느 하나 이상을 포함한다: K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32A, K32S, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, I42N, I42S, I42A, I42Q, Y44N, Y44S, Y44A, Y44Q, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, K341E, K341Q, K341G, K34lT, K341A 및 K341S.
c. 인지질에 대한 친화성을 증가시키는 변형
FVII의 응고제 활성은 활성화된 혈소판의 표면에서 발현되는 것과 같이, 인지질에 대한 폴리펩타이드의 결합 및/또는 친화도를 증가시킴으로써 증강될 수 있다. 예를 들어, 추가의 아미노산 치환은 포스파티딜세린 및 다른 음하전성 인지질을 결합시키는 능력이 증가된 변형 FVII 폴리펩타이드를 초래하는 FVII 폴리펩타이드의 내인성 Gla 도메인 내의 특정 위치에서 이루어질 수 있다. 따라서, 이러한 변형은 이와 같이 변형된 FVII 폴리펩타이드가 내인성 Gla 도메인을 보유하는 한, 즉 다른 비타민 K 의존적 단백질의 Gla 도메인과 내인성 Gla 도메인의 치환을 초래하는 변형으로 이미 처리된 것이 아니라면, 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드에 포함될 수 있다.
내인성 FVII Gla 도메인을 함유하는 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드에 이루어질 수 있고 인지질 결합 및/또는 친화도를 증가시키는 추가의 변형의 예로는, 문헌[Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278:8363-8369, US20030100506, US20040220106, US20060240526, US6017882, US6693075, US6762286, WO200393465 및 WO2004111242]에 기술된 것이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 이러한 변형의 예로는 다음 중 어느 하나 이상을 포함한다: 위치 4에서 타이로신의 삽입, 또는 P10Q, P10E, P10D, P10N, R28F, R28E, K32E, K32D, D33F, D33E, D33K A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, K38E 및 K38D 중 어느 하나 이상의 변형.
d. 글리코실화를 변경시키는 변형
단백질의 글리코실화 수준의 변경은 면역원성 감소, 안정성 증가, 투여 빈도의 감소 및/또는 염증과 같은 부작용의 감소 수단으로써 당업계에 기술된 바 있다. 일반적으로, 이 변경은 글리코실화 수준을 증가시켜 수행된다. 글리코실화 부위(들)는 폴리펩타이드가 글리코실화할 수 있는 진핵생물 세포에서 생산될 때 글리코시화되도록 폴리펩타이드 상에 탄수화물 잔기의 부착 부위를 제공한다.
FVII에는 4개의 자연 발생의 글리코실화 부위가 있으며, 이는 서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드이 아미노산 위치에 상응하는 N145 및 N322에 2개의 N-글리코실화 부위 및 S52와 S60에 2개의 O-글리코실화 부위이다. 한 양태에 따르면, 상기 부위들에서 글리코실화가 붕괴되도록 당해의 FVII 폴리펩타이드에 추가의 변형이 이루어질 수 있다. 그 결과, 응고제 활성이 증가된 변형 FVII 폴리펩타이드가 산출된 수 있다(예컨대, WO 2005/123916 참조). 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 변형 FVII 폴리펩타이드의 활성을 증가시키고 글리코실화를 감소시킬 수 있는 당업계에 기술된 예시적 변형의 비제한적 예로는 N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W 및 N322C가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
다른 양태에 따르면, 추가의 글리코실화 부위가 도입되어 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 변형 FVII 폴리펩타이드의 글리코실화 수준이 증가하도록, 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 추가의 변형이 이루어질 수 있다. 글리코실화 부위는 N-연결된 또는 O-연결된 글리코실화 부위일 수 있다. 하나 이상의 새로운 글리코실화 부위가 도입되는 FVII 폴리펩타이드에 이루어질 수 있는 변형의 예로는 US 6806063 및 WO 200393465에 기술된 것을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 변형 FVII 폴리펩타이드의 글리코실화를 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 증가시킬 수 있는 당업계에 기술된 예시적 변형의 비제한적 예로는 F4S, F4T, P10N, Q21N, W41N, S43N, A51N, G58N, L65N, G59S, G59T, E82S, E82T, N95S, N95T, G97S, G97T, YlOlN, D104N, T106N, K109N, G117N, G124N, S126N, T128N, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, V253N, E265N, T267N, E270N, R277N, L280N, G291N, P303S, P303ST, L305N, Q312N, G318N, G331N, D334N, K337N, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, V376N, R379N, M391N, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S, Y44N/D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S/, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/K316S, S314N/K316T, Q313N/R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/D343S, K341N/D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/R392S, L390N/R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S 및 P404N/P406T가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
e. 화학 그룹 결합을 촉진하는 변형
또한, 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드의 추가의 변형은 후속되는 화학 그룹의 결합을 촉진하도록 이루어질 수 있다. 하나 이상의 아미노산 치환 또는 삽입은 이러한 치환된 아미노산을 통해 화학 그룹이 변형 FVII 폴리펩타이드에 연결될 수 있도록 이루어질 수 있다. 예를 들어, 시스테인은 변형 FVII 폴리펩타이드에 도입될 수 있고, 여기에 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 잔기가 연결되어, 증가된 안정성 및 혈청 반감기를 부여할 수 있다. 다른 부착 잔기로는 리신, 아스파르트산 및 글루탐산 잔기가 있다. 일부 양태에서, 아미노산 잔기는 가능한 결합 위치의 수를 감소시키도록 교체된다. 예를 들어, 리신의 수는 감소될 수 있다. 화학 그룹과 후속 결합을 촉진할 수 있는 FVII 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 이루어질 수 있는 변형의 예로는, 문헌[US20030096338, US20060O19336, US6806063, WO200158935 및 WO2002077218]에 기술된 것을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 화학 그룹과의 후속 결합을 촉진할 수 있는 FVII 폴리펩타이드의 예시적 변형의 비제한적 예로는 Q250C, R396C, P406C, I42K, Y44K, L288K, D289K, R290K, G291K, A292K, T293K, Q313K, S314K, R315K, V317K, L390K, M391K, R392K, S393K, E394K, P395K, R396K, P397K, G398K, V399K, L400K, L401K, R402K, A403K, P404K, F405K, I30C, K32C, D33C, A34C, T37C, K38C, W41C, Y44C, S45C, D46C, L141C, E142C, K143C, R144C, L288C, D289C, R290C, G291C, A292C, S314C, R315C, K316C, V317C, L390C, M391C, R392C, S393C, E394C, P395C, R396C, P397C, G398C, V399C, L401C, R402C, A403C, P404C, I30D, K32D, A34D, T37D, K38D, W41D, Y44D, S45D, D46C, L141D, E142D, K143D, R144D, L288D, R290D, G291D, A292D, Q313D, S314D, R315D, K316D, V317D, L39OD, M391D, R392D, S393D, P395D, R396D, P397D, G398D, V399D, L401D, R402D, A403D, P404D, 130E, K32E, A34E, T37E, K38E, W41E, Y44E, S45E, D46C, L141E, E142E, K143E, R144E, L288E, R290E, G291E, A292E, Q313E, S314E, R315E, K316E, V317E, L390E, M391E, R392E, S393E, P395E, R396E, P397E, G398E, V399E, L401E, R402E, A403E, P404E, Kl8R, K32R, K38R, K62R, K85R, K109R, K137R, K143R, K148R, K157R, K161R, K197R, K199R, K316R, K337R, K341R, K389R, Kl8Q, K32Q, K38Q, K62Q, K85Q, K109Q, K137Q, K143Q, K148Q, K157Q, K161Q, K197Q, K199Q, K316Q, K337Q, K341Q, K389Q, K18N, K32N, K38N, K62N, K85N, K109N, K137N, K143N, K148N, K157N, K161N, K197N, K199N, K316N, K337N, K341N, K389N, K18H, K32H, K38H, K62H, K85H, K109H, K137H, K143H, K148H, K157H, K161H, K197H, K199H, K316H, K337H, K341H 및 K389H를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
f. 예시적 조합 변형
본 발명은 비변형 FVII 폴리펩타이드의 하나 이상의 활성 또는 성질에 영향을 미치도록 설계된 2 이상의 변형을 보유하는 변형 FVII 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 예에서, 2 이상의 변형은 FVII 폴리펩타이드의 2 이상의 성질 또는 활성을 변경시킨다. 이러한 변형은 TFPI에 대한 내성, AT-III에 대한 내성, 내인성 활성, 아미드용해 활성, 촉매 활성(TF의 존재 또는 부재 하에), 인지질 결합 및/또는 친화도, 글리코실화, 프로테아제에 대한 내성, 반감기 및 FX, FIX와 같은 다른 인자 또는 분자와의 상호작용 및/또는 활성화 중 하나 이상이 변경되도록 FVII 폴리펩타이드에 이루어질 수 있다. 일반적으로, 2 이상의 변형은 최종 변형 FVII 폴리펩타이드가 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 증가된 응고제 활성, 증가된 응고제 활성기간 및/또는 증강된 치료 지수를 보유하도록 조합된다. 이러한 변형 FVIIa 폴리펩타이드는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 응고제 활성의 더욱 빠른 개시를 나타낼 수 있다. 이러한 변형들은 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 2 이상의 변형을 함유하는 변형 FVII 폴리펩타이드의 응고제 활성 증가, 응고제 활성 기간 증가, 응고제 활성 개시 증가 및/또는 치료 지수 증강은 출발 또는 비변형 FVIIa 폴리펩타이드의 활성에 비해 적어도 또는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상 증가될 수 있다.
본 발명은 2개 이상의 활성 또는 성질을 변경시키기 위해 비변형 FVII 폴리펩타이드에 도입되는 2개 이상의 변형을 함유하는 변형 FVII 폴리펩타이드를 제공한다. 변형 FVII 폴리펩타이드는 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 변형을 함유할 수 있다. 또한, 각 변형은 하나 이상의 아미노산 잔기를 수반할 수 있다. 예를 들어, 변형 FVII 폴리펩타이드는 각각 단일 아미노산 치환인 2개의 변형을 포함할 수 있다. 다른 예에 따르면, 변형 FVII 폴리펩타이드는 하나는 단일 아미노산 치환이고 다른 하나는 하나보다 많은 아미노산 잔기의 결실과 이어서 하나보다 많은 아미노산 잔기의 삽입을 수반하는 변형인 2개의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 내인성 활성을 증가시키는 아미노산 치환 M298Q(서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드에 상응하는 잔기) 및 아미노산 잔기 A1 내지Y44(서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드에 상응하는 잔기)를 결실시킴에 의한 내인성 FVII Gla 도메인의 결실 및 서열번호 110에 제시된 FIX Gla 도메인의 아미노산 잔기 Y1 내지 Y45에 상응하는 45개 아미노산 잔기의 삽입을 수반하는 Gla 교환 FIX 변형을 포함할 수 있다.
당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 오로지 표 5 내지 8에 제시된 것 중에서 선택되는 2 이상의 변형을 보유할 수 있다. 다른 예에 따르면, 변형 FVII 폴리펩타이드는 표 5 내지 8에 제시된 것 중에서 선택되는 하나 이상의 변형과 표 5 내지 8에 제시되지 않은 추가의 변형, 예컨대 당업계에 기술된 변형 중 하나 이상의 변형인, 2 이상의 변형을 함유한다. 일부 예에 따르면, 하나 이상의 추가의 변형은 상기 섹션 D.3. a-e에 제시된 것 중에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 변형 FVII 폴리펩타이드는 TFPI에 대한 내성을 증가시킬 수 있는, 서열번호 3에 제시되는 성숙 FVII의 번호매김을 기준으로 한 아미노산 잔기 D196, K197, K199, G237, T239, R290 또는 K341(키모트립신 번호매김을 기준으로 하면 각각 D60, K60a, K60c, G97, T99, R147 및 K192에 상응함)에 하나 이상의 변형, 및 내인성 활성에 영향을 미치는 하나 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 Vl58 및 M298(키모트립신 번호매김을 기준으로 하면 각각 V21 및 M156에 상응함)에 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형 FVII 폴리펩타이드는 TFPI에 대한 내성을 증가시키는 2개의 아미노산 치환, 예컨대 K197E 및 G237V와, 내인성 활성을 증가시키는 하나의 아미노산 치환, 예컨대 M298Q를 함유하여, 응고제 활성이 증가된 FVII 폴리펩타이드를 산출할 수 있다.
예시적 조합 변형의 비제한적 예는 표 9에 제시한다. 이러한 예시적 조합 변형은, FVII 폴리펩타이드의 2 이상의 활성 또는 성질, 예컨대 TFPI에 대한 내성, AT-III에 대한 내성, 내인성 활성, 아미드용해 활성, 촉매 활성(TF의 존재 및/또는 부재 하에), 인지질 결합 및/또는 친화도, 글리코실화, 프로테아제에 대한 내성, 반감기 및 FX, FIX와 같은 다른 인자 또는 분자와의 상호작용 및/또는 활성화 등, 이에 국한되지 않는 활성 또는 성질을 변경하도록 설계된 2 이상의 변형을 포함한다. 이러한 조합 변형을 함유하는 변형 FVII 폴리펩타이드는 증가된 응고제 활성, 증가된 응고제 활성 기간, 증가된 응고제 활성 개시 및/또는 증강된 치료 지수를 보유할 수 있다. 이하 표 8에 제시되는 변형은 상기 표 5 내지 7에 기술된 동일한 명명과 번호매김 체계를 사용한다. 예를 들어, "Gla 교환 FIX" 변형은 전술한 바와 같이, 아미노산 잔기 A1 내지 Y44(서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드에 상응하는 잔기)를 결실시킴에 의한 내인성 FVII Gla 도메인의 결실 및 서열번호 110에 제시된 FIX Gla 도메인의 아미노산 잔기 Y1 내지 Y45에 상응하는 45개 아미노산 잔기의 삽입을 수반한다. 아미노산 위치는 서열번호 3에 제시된 성숙 FVII 폴리펩타이드의 아미노산 위치에 상응하고, 또한 키모트립신 번호매김 체계에 의해 언급되기도 한다. 이하 표 9에서는 변형 FVII 폴리펩타이드의 예시적 아미노산 서열이 제시된 서열 식별자(서열번호) 및 임의의 폴리펩타이드 식별 번호가 확인된다.
Figure 112009069306018-PCT00008
E. FVII 를 변형시키는 설계 및 방법
본 발명은 변형 FVII 폴리펩타이드를 제공한다. 이 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 하나 이상의 활성 또는 성질에 변경을 나타낼 수 있도록 변형된다. 변형의 결과로서 변경될 수 있는 활성 및 성질은 응고 또는 응고제 활성; 응고촉진 활성; 단백분해 또는 촉매 활성, 예컨대 제X 인자(FX) 활성화 또는 제IX 인자(FIX) 활성에 영향을 미치는 활성; 항-FVII 항체에 결합하기 위해 폴리펩타이드와 경쟁하거나 항-FVII 항체에 결합하는 능력으로 평가되는 것과 같은 항원성; 인지질에 결합하는 능력; 반감기; 3차원 구조; pI; 및/또는 입체형태를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드 중에는 응고제 활성이 증가된 것이 있다. 이 중에서, 응고제 활성의 증가가 변형 FVII의 TFPI에 대한 내성 증가, AT-III에 대한 내성 증가, 약동학적 성질의 향상, 예컨대 반감기 증가, 촉매 활성의 증가 및/또는 활성화된 혈소판에 대한 결합 증가 등을 수반하거나 그들로부터 초래되는 것이 있다. 본 발명은 이러한 변형 FVII 폴리펩타이드를 확인하는 예시적 방법 및 변형 폴리펩타이드를 제공한다. 예를 들어, TFPI에 대한 내성 증가, AT-III에 대한 내성 증가 및/또는 활성화된 혈소판에 대한 결합 증가를 나타내는 변형 FVII 폴리펩타이드는, (a) 상기 성질들에 연관된 것으로 생각되는 부위를 추론적으로 표적화하거나, (b) 기능 분석법으로 TFPI에 대한 내성, AT-III에 대한 내성, 약동학적 성질의 향상, 예컨대 반감기 증가, 및/또는 인지질 또는 활성화된 혈소판에 대한 결합 증가에 대해 변형 FVII 폴리펩타이드를 실험적으로 시험하여, 추론적 또는 실험적으로 수득할 수 있다. 많은 경우에는 추론적 및 실험적 설계 시도들의 조합을 사용하여 변형 FVII 폴리펩타이드를 수득할 수 있다.
추론적 또는 실험적 시도를 이용하여 변형될 도메인, 영역 또는 아미노산이 확인되면, 표적 단백질에 임의의 하나 이상의 아미노산을 돌연변이시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 이 방법으로는, 암호화 핵산 분자의 표준 부위 지시된 돌연변이유발(예컨대, 스트라타진에서 입수용이한 QuikChange와 같은 키트 등의 사용), 또는 고상 폴리펩타이드 합성 방법들이 있다. 또한, 당해의 변형 키메릭 단백질(즉, Gla 도메인 교환)은 통상의 재조합 DNA 기술을 통해 수득할 수 있다. 예를 들어, 키메릭 폴리펩타이드는 목적하는 키메릭 폴리펩타이드 성분들의 통상의 서브클로닝을 위한 제한효소 및 클로닝 방법론을 사용하여 수득할 수 있다. 일단 확인되고 수득되면, 변형 FVII 폴리펩타이드는 그 다음 이하에 기술되거나 당업계에 공지된 다양한 분석법 중 어느 하나 이상을 사용하여 촉매 활성 또는 응고제 활성과 같은 활성에 대해 평가할 수 있다.
1. 추론적
일부 예에서, 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 응고제 활성을 증가시키는 추론적 변형으로 설계된다. 이러한 방법에서, FVII 폴리펩타이드의 활성을 담당하는 도메인, 영역 또는 아미노산은 공지되어 있거나 추론적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 공개 도메인의 다양한 데이터베이스는 야생형 FVII에 관련된 서열 및 도메인 정보를 제공한다(예컨대, ExPASyProteomics server ca.expasy.org 참조). 공개 도메인의 다른 정보는 특정 상호작용 또는 활성에 관여하는 FVII 폴리펩타이드의 아미노산, 영역 및/또는 도메인을 측정하기 위해 평가할 수 있다. 이러한 급원으로는, 과학 저널, 서열 및 기능 데이터베이스 또는 특허 데이터베이스 등이 있다. 일부 경우에는 직접적인 증거를 사용하여 주어진 상호작용 또는 활성에 미치는 하나 이상의 아미노산의 영향을 측정할 수 있다. 다른 예에서는, 유사한 활성 및/또는 상호작용을 나타내는 관련 단백질에 관한 증거 또는 정보 등으로부터 간접적으로 추정한다. 이러한 예에서, 관련 단백질의 활성 또는 상호작용을 담당하는 아미노산은 서열 및/또는 구조 유사성을 기초로 한 FVII 폴리펩타이드와 관련 폴리펩타이드의 정렬을 통해 FVII 폴리펩타이드 내의 상응하는 아미노산인지를 측정하는데 사용할 수 있다. 이에 따라, 주어진 활성 또는 상호작용에 관여할 것 같은 FVII 폴리펩타이드의 아미노산이 측정될 수 있다. 또한, 단백질/단백질 상호작용의 형성 및/또는 안정성에 중요한 역할을 하는 잔기를 예측하기 위해 상동성 모델링을 사용할 수 있고, 이 정보는 성질이 향상된 변이체를 설계하는데 사용할 수 있다.
FVII 폴리펩타이드의 활성을 담당하는 도메인, 영역 및/또는 아미노산이 결정되면, 폴리펩타이드의 응고제 활성을 증가시킬 것으로 예상되는 변형을 실시할 수 있다. 이러한 변형은 표적인 활성 또는 상호작용에 따라 여러가지 방식으로 실시될 수 있다. 일부 예에서는 다른 단백질 또는 분자에 대한 변형 FVII의 친화도를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실이 이루어질 수 있다.
한 예에 따르면, 변형은 다른 단백질들에 대한 변형 FVII의 친화도 또는 상호작용이 변형될 표적 상호작용에 따라 변경, 즉 증가 또는 감소되도록 임의의 도메인, 영역 또는 아미노산(들)에 이루어질 수 있다. 이러한 변형을 실시하기 위해, 이러한 상호작용에 관여하거나 관여할 것으로 생각되는 도메인, 영역 및/또는 아미노산은 공지되어 있거나, 추론적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 변형 FVII는 변형 FVII 폴리펩타이드의 응고제 활성을 증가시키기 위해, TFPI 또는 AT-III과 같은 저해성 단백질과의 상호작용이 감소되도록 추론적으로 설계될 수 있다. TFPI와의 상호작용이 감소된 FVII 폴리펩타이드를 추론적으로 설계하는 방법은 실시예 1에 제시된다. FVII가 상호작용하거나 결합하는 것으로 알려진 임의의 다른 폴리펩타이드와 FVII의 상호작용을 증가시키거나 감소시키기 위해, 유사한 시도들이 수행될 수 있다.
예를 들어, FVII는 TFPI에 대한 증가된 내성을 나타내도록 변형되었다. FXa와 복합체 상태의 TFPI는 TF/FVIIa 복합체에 결합하여, FVIIa의 촉매 활성이 저해된 4차 복합체를 형성한다. TFPI-1의 첫번째 쿠니츠 도메인(TFPI-1 K1)은 FVIIa와 상호작용 및 FVIIa의 저해를 담당하는 도메인이다. 이러한 상호작용에 관여하는 FVII 아미노산 잔기의 확인은 TFPI에 내성인 FVII 폴리펩타이드의 설계를 용이하게 할 수 있다. 이러한 상호작용에 관여하는 FVII의 아미노산 잔기를 측정하는 데에는 다양한 시도들, 예컨대 돌연변이유발, 스캐닝 시도, 및 컴퓨터 모델링과 같은 추론적 설계 등(이에 국한되지 않는다)을 사용할 수 있다. TFPI와 복합체를 이룬 FVIIa의 결정 구조는 접촉 잔기를 측정하기 위한 기본으로서 사용될 수 있다. 대안적으로, 실시예 1에 기술된 바와 같이 결정 구조가 입수용이하지 않다면, 관련 단백질의 공지된 구조 및 서열과 서로 간의 상호작용으로부터 일련의 정렬 및 외삽법을 통해 컴퓨터 모델링이 수득될 수 있다.
컴퓨터 모델링의 결과는 목적한 표적 단백질, 예컨대 TFPI와의 접촉에 직접 관여하는 잔기, 및/또는 접촉 잔기들에 인접함 등으로 인해, 상호작용에 간접적으로 관여하는 잔기들의 확인에 사용될 수 있다. 예를 들어, 실시예 1에 제시된 컴퓨터 모델링 결과를 사용하여, TFPI-1 및 TFPI-2 첫번째 쿠니츠 도메인들을 정렬시켜, TFPI-1의 상응하는 "접촉" 잔기를 결정했다(도 5b). 표적 단백질과 FVII 폴리펩타이드의 상호작용을 변경시키기 위해 교체 아미노산을 확인할 수 있다. 교체 아미노산은 총 19개 이하의 다른 자연발생의 아미노산, 뿐만 아니라 "비자연" 아미노산일 수 있다. 대안적으로, 이러한 교체 아미노산들은 상호작용의 추론적 가정을 기초로 하여, 컴퓨터 모의 돌연변이유발을 통해 확인될 수 있다. 실시예 1은 교체 아미노산의 확인을 위한 컴퓨터 모의 시도를 제시하며, 이로써 컴퓨터 모델 분석이 제VII 인자와 TFPI-1 K1 간의 정전기적 상보성에 관여하는 잔기를 밝혀냈다. 예를 들어, FVII의 음하전성 D60(키모트립신 번호매김)은 TFPI-1의 양하전성 R20과 정전기적 상호작용에 관여하는 것으로 보인다. 따라서, 이 잔기는 TFPI의 R20과 정전기적 상보성을 없애는 돌연변이유발의 후보이며, 이로써 TFPI에 대한 내성이 증가된 변형 FVII 폴리펩타이드가 수득된다. 이것은 하전 역전 또는 하전 중화 치환을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 치환은 음하전성 아스파르트산을 양하전성 리신으로 교체하여 실시할 수 있다. 이러한 하전 역전 치환은 이 부위에서 반발 하전-하전 상호작용을 형성시켜, FVIIa와 TFPI의 결합 및 상호작용을 방해한다. 다른 예에서는, FVII의 음하전성 D60이 염기성 아르기닌으로 교체되어 TFPI의 R20과 양성의 정전기적 상보성을 무효화하고 바람직하지 않은 상호작용을 도입시킬 수 있다. 이와 같이 추론적으로 설계된 변형은 TFPI의 잔기와 직접 또는 간접 접촉 및 상호작용에 관여하는 것으로 측정된 하나 이상의 FVII 잔기에 이루어질 수 있다.
다른 예에 따르면, FVII 폴리펩타이드의 추론적 변형은 폴리펩타이드의 도메인이나 영역의 공지된 기능을 기초로 할 수 있다. 예를 들어, FVII의 Gla 도메인은 매우 약하지만, 활성화된 혈소판 상에서 나타나는 인지질과 같은 인지질에 대한 FVIIa의 결합을 담당하는 것으로 알려져 있다. 다른 비타민 K 의존적 단백질, 예컨대 FIX, FX, 프로트롬빈, 단백질 C 및 단백질 S는 많은 경우에 FVII의 Gla 도메인보다 훨씬 큰 친화도로, 음하전성 인지질에 대한 단백질의 결합을 실시하는 Gla 도메인을 보유한다. FVII 폴리펩타이드에 이종성 Gla 도메인의 도입은 인지질에 대한 FVII의 친화도를 증가시키는 것으로 생각되고 있다. 예를 들어, FX(및 FXa)는 FVII(및 FVIIa)에 비해 인지질에 대한 비교적 높은 친화도를 나타낸다. 따라서, 일 예에 따르면, FX의 Gla 도메인 또는 인지질 결합을 실시하는 FX의 Gla 도메인의 충분한 일부는 FVII 폴리펩타이드 내로 도입되어 키메릭 변형 FVII 폴리펩타이드를 생산할 수 있다.
필요하다면, 추론적 및 실험적 방법의 조합은 FVII 폴리펩타이드를 설계하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Gla 도메인 함유 폴리펩타이드의 결합은 혈소판 표면 등에 존재하는 인지질에 대한 최고의 결합 및/또는 친화도를 나타내는 폴리펩타이드의 확인을 위해 시험 및 선별될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 인지질에 대한 최고의 친화도 및/또는 결합을 나타내는 키메릭 폴리펩타이드를 측정하기 위해, 다양한 이종 Gla 도메인 또는 이의 충분한 일부의 도입을 포함하는 일련의 FVII 폴리펩타이드를 시험할 수 있다.
2. 실험적(즉, 선별)
또한, 변형 FVII 폴리펩타이드는 실험적으로 제조한 뒤, 고찰되는 특정 활성 또는 성질을 보유한 폴리펩타이드를 확인하기 위해 시험 또는 선별할 수 있다. 예를 들어, 변형 FVII 폴리펩타이드는 당업계(또한, 미국 특허 출원번호 2004/0146938 참조)에 일반적으로 공지된 임의의 방법을 사용하여 FVII 폴리펩타이드의 어느 하나 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 제조할 수 있다. 이와 같이 변형된 FVII 폴리펩타이드는 응고제 활성을 증가시키는 "적중물(Hits)"인지를 측정하기 위해 응고의 기능 분석법으로 시험할 수 있다. 적중물은 다시 TFPI 또는 AT-III과 같은 저해제에 대한 증가된 내성을 나타내는지 및/또는 반감기 증가와 같은 향상된 약동학적 성질 또는 인지질에 대한 증가된 결합성을 나타내는지를, 당업자에게 공지되거나 본 명세서에 기술된 임의의 분석법으로 시험할 수 있다.
FVII를 돌연변이시키는 방법의 예로는 전체 서열을 따라 무작위 돌연변이유발을 초래하는 방법, 또는 FVII 서열의 선택 영역 또는 도메인의 초점식 돌연변이유발을 초래하는 방법이 포함된다. 한 예로서, 폴리펩타이드에 이루어진 돌연변이의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40 또는 그 이상이다.
a. 무작위 돌연변이유발
돌연변이유발을 기초로 한 지시된 단백질 진화를 위해, 임의의 다양한 일반적 시도들이 이용될 수 있다. 이 중 어느 하나 또는 임의의 조합 시도가 사용되어 FVII와 같은 폴리펩타이드가 변형되어 원하는 성질을 획득할 수 있다. 이러한 방법으로는, 출발 단백질 서열의 아미노산들이 동일 분자 상의 여러 아미노산 위치들에서 동시에 다중 교체 또는 단일 교체에 의해 20가지 자연 아미노산(뿐만 아니라 비자연 아미노산) 전체(또는 그룹)로 교체되는 무작위 돌연변이유발을 포함한다. 또 다른 방법인 제한적 무작위 돌연변이유발은 20가지 자연 아미노산(뿐만 아니라 비자연 아미노산) 또는 DNA 편재성 잔기들 전체 또는 일부를 도입시킨다. 이러한 편재성은 "발생"되는 생물학적 활성에 관련된 것으로 이미 공지된 단백질의 제한된 또는 소정의 영역 내에 있는, DNA 서열을 기초로 하는 것이며, 확률적 또는 반확률적 방식으로 단백질 서열을 기초로 하는 것이 아니다. 프로테아제를 변형시키는 방법의 예는 본 발명에 전문이 참고인용되는 미국 특허출원 10/677,977에 기술되어 있다. 또한, 당업계에 공지된 모든 방법은 FVII 프로테아제 폴리펩타이드와 같이 프로테아제 폴리펩타이드 서열을 변형 또는 변경시키는데 사용될 수 있다.
무작위 돌연변이유발 방법으로는, 예컨대 이.콜라이 XL1red, UV 조사, 탈아민화, 알킬화 또는 염기 유사체 돌연변이원 등에 의한 화학적 변형, 또는 DNA 셔플링, 카세트 돌연변이유발, 부위 지시된 무작위 돌연변이유발 또는 오류 빈발(error-prone) PCR과 같은 PCR 방법의 사용 등을 포함한다(예컨대, 미국 특허출원 2006-0115874). 이러한 예로는 하이드록실아민에 의한 화학적 변형(Ruan, H., et al. (1997) Gene 188:35-39), dNTP 유사체의 사용(Zaccolo, M., et al (1996) J. Mol. Biol. 255:589-603), 또는 시판되는 무작위 돌연변이유발 키트, 예컨대 GeneMorph PCR-기반의 무작위 돌연변이유발 키트(Stratagene) 또는 Diversify 무작위 돌연변이유발 키트(Clontech)가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. Diversify 무작위 돌연변이유발 키트는 반응 혼합물 내에 망간(Mn2+) 함량 또는 dGTP의 함량을 변화시킴으로써, 주어진 DNA 서열에 바람직한 돌연변이율(2 내지 8개의 돌연변이/1000개 염기쌍)의 선택을 가능하게 한다. 먼저, 망간 수준을 상승시켜 돌연변이율을 증가시키고, 그 다음 dGTP의 농도를 증가시켜 돌연변이율을 추가로 증가시킨다. 이보다 훨씬 높은 돌연변이율은 PCR의 추가의 순환을 수행하여 달성할 수 있다.
b. 초점식 돌연변이유발
초점식 돌연변이는 유전자 서열의 소정의 영역, 예컨대 촉매 활성을 매개하는 프로테아제 도메인의 영역, 인지질에 결합하는 Gla 도메인의 영역, TFPI, AT-III 또는 Zn2 +와 같은 저해제 또는 분자에 결합하는 FVII 폴리펩타이드의 영역, 예컨대 본 발명에서 제공하는 영역, 또는 FVIIa의 제거에 관여하는 인자 또는 수용체와 상호작용하는 단백질 영역, 예컨대 본 발명에서 제공하는 영역 등에 하나 이상의 돌연변이를 만들어 달성할 수 있다. 한 예에 따르면, 폴리펩타이드의 어느 하나 이상의 아미노산은 QuikChange(Stratagene)와 같은 임의의 표준 단일 또는 다중 부위 지시된 돌연변이유발 키트를 사용하여 돌연변이시킨다. 다른 예로서, 프로테아제의 어느 하나 이상의 아미노산은 포화 돌연변이유발(Zheng et al. (2004) Nucl. Acids. Res., 32:115)에 의해 돌연변이된다. 하나의 예시적 양태에서, 영역 또는 도메인의 잔기(들)가 20개의 가능한 자연 아미노산(뿐만 아니라 비자연 아미노산) 각각으로 돌연변이되는 포화 돌연변이유발 기술이 사용된다(예컨대, 쿤클(Kunkle) 방법 참조, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Media Pa.). 이러한 기술에서, 선택된 아미노산(들)을 암호화하는 목적 코돈(들)에 뉴클레오타이드 무작위화를 함유하는 축퇴성 돌연변이원성 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 합성될 수 있다. 무작위화 방식의 예로는 NNS- 또는 NNK-무작위화(여기서, N은 임의의 뉴클레오타이드, S는 구아닌 또는 사이토신, K는 구아닌 또는 티민을 나타낸다)를 포함한다. 축퇴성 돌연변이원성 프라이머는 단일 표준 DNA 주형에 어닐링되고, DNA 폴리머라제를 첨가하여 주형의 상보성 가닥을 합성한다. 연결 후에, 이본쇄 DNA 주형으로 증폭용 이.콜라이를 형질전환시킨다.
추가의 예에 따르면, 초점식 돌연변이유발은 초기 선별 순환 시에 핫스팟(hot spot)으로 확인된 아미노산에 제한될 수 있다. 예를 들어, 무작위 돌연변이유발된 조합 라이브러리로부터 변형 FVII 폴리펩타이드의 선택 후, 불균등한 수의 돌연변이가 특정 위치 또는 영역에서 관찰될 수 있다. 이를 "핫스팟"으로 표시하며, 1회 이상의 돌연변이유발 및 선별의 순환을 통해 관찰할 수 있다. 그 다음, 변형 FVII 폴리펩타이드에 기능 분석을 수행하여, 핫스팟의 돌연변이가 하나 이상의 목적 성질 또는 활성과 상관성이 있는지를 측정할 수 있다. 핫스팟과 목적 활성 또는 성질 간에 상관성이 입증되면, 그 다음 초점식 돌연변이유발을 사용하여 상기 핫스팟을 추가의 돌연변이유발에 대해 특이적으로 표적화한다. 이러한 전략은 폴리펩타이드 서열의 무작위 돌연변이유발 후 일어나는 더욱 얕은 돌연변이유발에 반해 특별한 특정 위치에 더욱 다양하고 깊은 돌연변이유발을 허용한다. 예를 들어, 포화 돌연변이유발은 "핫스팟" 위치에 NNt/g 또는 NNt/c를 함유하는 올리고 등을 이용하여 "핫스팟"을 돌연변이시키는데 사용할 수 있다.
c. 선별
변형 폴리펩타이드는 개별적으로 선별 분석으로 시험하거나, 또는 라이브러리 등에서와 같이 수집물로 시험될 수 있다. 한 예에 따르면, FVII 변이체 폴리펩타이드는 돌연변이유발에 의해 무작위로 생성되고, 개별적으로 클로닝된다. 그 다음, 단백질 발현 및 적당한 활성의 측정 후, 각 개별 단백질 돌연변이체 분자에 대한 활성 평가를 개별적으로 수행한다. 일부 예에서, 개별 클론들은 서로 물리적으로 분리되어, 어레이 내의 위치에 따라 각 개별 폴리펩타이드의 신원을 알 수 있도록, 어드레스될 수 있는 어레이에서 분석될 수 있다. 예를 들어, 각 하나가 독립 돌연변이유발 반응의 단일 산물이라면, 특정 돌연변이는 서열분석할 필요없이 쉽게 측정될 수 있다. 대안적으로, 최종 변형 폴리펩타이드는 활성을 부여하는 돌연변이를 측정하기 위해 서열분석을 실시할 수 있다.
다른 예에 따르면, 변형 FVII 폴리펩타이드는 수집물로서 또는 라이브러리에서 선별될 수 있다. 예를 들어, FVII 폴리펩타이드의 라이브러리는 폴리펩타이드 잔기를 디스플레이할 수 있는 선별용 유전자 패키지, 예컨대 임의의 복제가능한 벡터, 예컨대 파지, 바이러스 또는 세균(이에 국한되지 않는다)에서 디스플레이될 수 있다. 복수의 디스플레이된 폴리펩타이드는 이 폴리펩타이드가 표적 폴리펩타이드와 상호작용 및/또는 결합하도록 하는 방식으로 유전자 패키지에 의해 디스플레이된다. 유전자 패키지의 예로는, 파지 디스플레이된 프로테아제와 같은 단백질의 디스플레이를 위해 박테리오파지(Clackson et al. (1991) Making Antibody Fragments Using Phage Display Libraries, Nature, 352:624-628; Glaser et al. (1992) Antibody Engineering by Condon-Based Mutagenesis in a Filamentous Phage Vector System, J. Immunol., 149:3903 3913; Hoogenboom et al. (1991) Multi-Subunit Proteins on the Surface of Filamentous Phage: Methodologies for Displaying Antibody (Fate) Heavy and 30 Light Chains, Nucleic Acids Res., 19:4133-41370), 배큘로바이러스(예컨대, Boublik et al. (1995) Eukaryotic Virus Display: Engineering the Major Surface Glycoproteins of the Autographa California Nuclear Polyhedrosis Virus (ACNPV) for the Presentation of Foreign Proteins on the Virus Surface, Bio/Technology, 13:1079-1084 참조), 세균 및 기타 적합한 벡터를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, 당해의 박테리오파지로는, T4 파지, M13 파지 및 HI 파지가 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 유전자 패키지는 임의로, 세균 숙주 등에서 증폭된다.
파지 디스플레이는 당업자에게 공지되어 있고, 예컨대 문헌[Ladner et al., 미국 특허 5,223,409; Rodi et al. (2002) Curr. Opin. Chem. Biol. 6:92-96; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271 ; WO 92/20791 ; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Rebar et al. (1996) Methods Enzymol. 267: 129-49; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133- 4137; 및 Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982]에 기술되어 있다. 파지 디스플레이에 적합한 핵산, 예컨대 파지 벡터는 당업계에 공지되어 있다[예컨대, Andris-Widhopf et al. (2000) J Immunol Methods, 28: 159-81, Armstrong et al. (1996) Academic Press, Kay et al, Ed. pp.35-53; Corey et al. (1993) Gene 128(l):129-34; Cwirla et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87(16):6378-82; Fowlkes et al. (1992) Biotechniques 13(3):422-8; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19(15):4133-7; McCafferty et al. (1990) Nature 348(6301):552-4; McConnell et al. (1994) Gene 151 (1-2):115-8; Scott and Smith (1990) Science 249(4967):386-90 참조].
또한, 선별을 위한 변이체 FVII 폴리펩타이드 라이브러리는 원핵생물 또는 진핵생물 세포 등의 세포 표면에서 발현될 수 있다. 세포 표면 발현을 위한 세포의 예로는 세균, 효모, 곤충 세포, 조류 세포, 식물 세포 및 포유동물 세포가 포함되나, 이에 국한되지 않는다(Chen and Georgiou (2002) Biotechnol Bioeng 79: 496-503). 한 예에서, 발현을 위한 세균 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)이다.
변이체 폴리펩타이드는 막 단백질 또는 세포 표면-연합된 단백질과 같은, 세포 표면에서 발현되는 단백질과 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 예를 들어, 변이체 프로테아제는 이.콜라이 외막 단백질(예, OmpA), 주요 이.콜라이 지단백질(Lpp)의 유전자 조작된 하이브리드 분자 및 외막 단백질 OmpA 또는 세포 표면-연합된 단백질(예, 섬모 및 편모 서브유닛)과 융합 단백질로 이.콜라이에서 발현될 수 있다. 일반적으로, 세균 외막 단백질이 이종 펩타이드 또는 단백질의 디스플레이에 사용될 때, 이는 운반체 단백질의 허용 부위로 유전자 삽입을 통해 달성된다. 이종 펩타이드 또는 단백질의 발현은 이 펩타이드 또는 단백질이 단백질의 N-말단 또는 C-말단에서의 융합체에 비해 허용 부위에 삽입되었을 때 더욱 속박되어 있는 바, 삽입된 단백질 도메인의 구조적 성질에 의존적이다. 융합 단백질에 대한 변형은 융합 단백질의 발현을 개선시키기 위해 수행될 수 있고, 그 예로는 가요성 펩타이드 링커 또는 스페이서 서열의 삽입 또는 세균 단백질의 변형(예컨대, 아미노산 서열 내에 돌연변이, 삽입 또는 결실에 의해)이 있다. 효소, 예컨대 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi)의 Cex 엑소글루카나제 및 β-락타마제는 이.콜라이 표면에서 Lpp-OmpA 융합 단백질로 성공적으로 발현되었다(Francisco J.A. and Georgiou G. Ann N Y Acad Sci 745:372-382 (1994) 및 Georgiou G. et al. Protein Eng. 9:239-247 (1996)). 15 내지 514개 아미노산의 다른 펩타이드는 OmpA의 표면에 존재하는 제2, 제3 및 제4 외측 루프에서 디스플레이되었다(Samuelson et al. J. Biotechnol. 96: 129-154 (2002)). 즉, 외막 단백질은 세균의 외측 표면에서 이종 유전자 산물을 운반 및 디스플레이할 수 있다.
또한, 변이체 폴리펩타이드의 라이브러리를 선별하기 위해 다른 디스플레이 포맷을 사용하는 것도 가능하다. 다른 디스플레이 포맷의 예로는 핵산-단백질 융합체, 리보자임 디스플레이(예컨대, Hanes and Pluckthun (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 13:4937-4942), 비드 디스플레이(Lam, K. S. et al. Nature (1991) 354, 82-84; , K. S. et al. (1991) Nature, 354, 82-84; Houghten, R. A. et al. (1991) Nature, 354, 84-86; Furka, A. et al. (1991) Int. J. Peptide Protein Res. 37, 487-493; Lam, K. S., et al. (1997) Chem. Rev., 97, 411-448; 미국 특허출원 공개 2004-0235054) 및 단백질 어레이(예컨대, Cahill (2001) J. Immunol. Meth. 250:81-91, WO 01/40803, WO 99/51773, 및 US2002-0192673-A1 참조)가 있다.
다른 특정 경우에 따르면, 변이체 폴리펩타이드 또는 변이체 폴리펩타이드를 발현하는 파지 라이브러리 또는 세포를 고체 지지체에 대신 부착시키는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 예에 따르면, 변이체 FVII 폴리펩타이드를 발현하는 세포는 비드 집단이 1 비드마다 단일 세포를 함유하도록 비드에 자연 흡착될 수 있다(Freeman et al. Biotechnol. Bioeng. (2004) 86:196-200). 유리 지지체에 고정화한 후, 마이크로콜로니를 성장시켜, 발색원성 또는 형광원성 기질로 선별할 수 있다. 또 다른 예에 따르면, 변이체 FVII 폴리펩타이드 또는 변이체 프로테아제를 발현하는 파지 라이브러리 또는 세포는 역가 평판에 배열되고 고정될 수 있다.
증가된 응고제 활성을 나타내는 변형 FVII 폴리펩타이드를 확인하기 위해, 변형 FVII 폴리펩타이드는 개별적으로 또는 라이브러리 내에서 선별하고, TFPI 및 AT-III과 같은 저해제에 대한 증가된 내성, 활성화된 혈소판의 인지질에 대한 결합 증가, 반감기 증가를 디스플레이하고/하거나 증가된 촉매 활성을 디스플레이하는 폴리펩타이드의 확인을 위해 기능 분석법으로 시험한다. 이러한 분석법은 본 명세서에 설명되어 있거나 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 변형 FVII 폴리펩타이드는 단백분해 활성에 대해 시험한다. FVII 폴리펩타이드는 단독으로 또는 TF의 존재 하에, 다양한 농도의 발색원성 기질, 예컨대 펩타이드성 기질 Spectrozyme FVIIa(CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA.AcOH)와 항온처리한다. 이 기질의 절단은 흡광도로 모니터하고, 기질 가수분해 속도는 입수용이한 소프트웨어를 사용하여 선형 회귀법으로 측정했다. 다른 예에 따르면, TFPI 또는 AT-III에 대한 변형 FVII 폴리펩타이드의 내성은 몇몇 경우 TF와 사전항온처리된 FVII 폴리펩타이드와 상기 저해제의 항온처리에 의해 평가한다. 그 다음, FVII의 활성은 당업계에 공지된 활성 또는 응고 분석법 중 어느 하나 이상을 사용하여 측정하고, TFPI 또는 AT-III에 의한 저해는 저해제와 함께 항온처된 FVII 폴리펩타이드의 활성을, 저해제와 항온처리되지 않은 FVII 폴리펩타이드의 활성과 비교하여 평가한다.
후보 폴리펩타이드의 구체적 돌연변이는 서열분석과 같은 통상의 재조합 DNA 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 일 양태에 따르면, "적중물"의 조합은 변형 FVII 폴리펩타이드의 성질 및/또는 응고 활성을 추가로 증가시키기 위해 실시될 수 있다.
3. FVII 변이체의 선택
전술한 시도들 중 어느 하나 이상의 시도들에 의해 설계되고 확인된 FVII 폴리펩타이드 변이체는 목적 성질 또는 활성을 나타내는 후보 FVII 폴리펩타이드를 확인하기 위해 선택될 수 있다. 변이체 FVII 폴리펩타이드의 선택은 1) 첫째, 변형되는 특정 활성 또는 성질에 대한 변이체 폴리펩타이드의 시험(즉, TFPI에 대한 내성, AT-III에 대한 내성, Zn2+ 결합성, 촉매 활성, 반감기, 인지질에 대한 결합 및/또는 친화도); 및 2) 둘째 지혈 및 응고에 필요한 FVII 활성의 유지에 대한 변이체 폴리펩타이드의 시험을 기초로 한다. 응고에 필요한 FVII 활성 중에는, 제X 인자(FX) 활성 또는 제IX 인자(FIX) 활성화 실시와 같은 효소적, 단백분해적 또는 촉매 활성이 포함된다. 평가될 수 있는 다른 FVII 활성에는 항원성, 조직 인자, 제X 인자 또는 제IX 인자에 결합하는 능력, 및 인지질에 결합하는 능력이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 따라서, 변형 FVII 폴리펩타이드, 예컨대 본 명세서에 제공된 모든 것 또는 여기에 제시된 방법들에서 확인된 모든 폴리펩타이드는 응고제 활성에 필요한, 증가하거나 감소된 어느 정도의 FVII 활성을 유지해야 한다. 당업계에 공지되거나 이하 명세서에 기술된 표준 분석법은 상기 2가지 평가를 각각 수행하기 위해 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, FVII의 단백분해 또는 촉매 활성은 합성 기질의 절단 측정 또는 제X 인자의 활성화 측정(예컨대 이하 실시예 4, 5 및 11 참조)을 비롯한 다양한 방법으로 평가할 수 있고, TFPI 또는 AT-III에 대한 내성은 각각 TFPI 또는 AT-III에 의한 저해(예컨대, 실시예 7, 12 및 16 참조)를 분석하여 평가할 수 있다. 또한, 응고촉진 활성을 위한 생체내 분석, 예컨대 실시예 8과 14에 기술된 분석도 이용할 수 있다.
임의의 후보 FVII 폴리펩타이드 변이체의 전반적 효과는 응고촉진 활성을 나타내기 위한 것이다. 예를 들어, 변이체 폴리펩타이드는 TFPI에 대한 내성, AT-III에 대한 내성, 반감기 및/또는 인지질에 대한 결합 및/또는 친화도가 증가할 수 있는 한편, 촉매 활성을 증가를 나타낼 수도 있다. 이러한 FVII 폴리펩타이드는 응고제 활성을 증가시키는 후보 FVII 변이체로 선택될 수 있을 것이다.
하지만, 일부 경우에 TFPI에 대한 내성 증가, AT-III에 대한 내성 증가, 반감기 증가 또는 인지질에 대한 결합 및/또는 친화도 증가 중 어느 하나 이상으로 인해 향상된 응고 활성을 보유하도록 변형된 FVII 폴리펩타이드는 또한 특정 변형의 결과로서 응고에 필요한 다른 활성 또는 촉매 활성의 감소를 나타낼 수도 있다. 이러한 효과는 예컨대 다른 분자와의 결합을 방해하는 변형 FVII 폴리펩타이드의 입체형태 변화, 변경된 활성 부위를 초래하는 입체형태 변화 또는 다른 분자와 상호작용을 담당하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 직접적으로 수반하는 아미노산 치환 등으로부터 초래될 수 있다.
따라서, 다른 예에 따르면, TFPI에 대한 내성, AT-III에 대한 내성, 반감기 및/또는 인지질에 대한 친화도가 증가된 변이체 폴리펩타이드는 촉매 활성의 동반 감소를 나타낼 수 있다. 향상된 응고제 활성을 보장하는 것으로 허용될 수 있는, 촉매 활성과 같은 FVII 활성의 감소 수준은 향상을 위해 변형되는 성질(즉, TFPI에 대한 내성 증가)의 동반 증가에 의존적이며, 실험적으로 측정될 수 있다. 따라서, 전술한 평가들의 결과는 응고를 실시하기에 적어도 충분한 FVII 활성, 즉 촉매 활성을 유지하는 동시에, 향상된 성질을 나타내는 변이체 폴리펩타이드를 확인하기 위해 비교 평가될 수 있다. 일반적으로, 변형을 위해 고찰된 성질의 증가가 클수록(즉, TFPI에 대한 내성의 증가가 클수록), 단백분해 또는 촉매 활성의 허용될 수 있는 감소도 커진다.
예를 들어, TFPI 또는 AT-III에 대한 내성의 100배 증가를 나타내는 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드의 활성에 비해 약 또는 1.5배, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90배 이상 감소된 단백분해 또는 촉매 활성의 감소를 나타낼 수 있고, 여전히 응고제 활성의 증가를 위한 확실한 후보일 수 있다. 이에 반해, TFPI 또는 AT-III에 대한 내성이 10배 증가하면, 전체 응고촉진 활성을 유지시키기 위한 촉매 활성의 감소 수준은 비변형 폴리펩타이드의 촉매 활성에 비해 약 또는 1.5배, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9배 이상이 감소될 수 있다. 당업자는 변형 FVII 폴리펩타이드가 응고촉진 치료제로, 예컨대 혈우병 환자의 출혈 에피소드를 치료하는데 유용한지 측정하기 위해, TFPI 내성, AT-III 내성, 활성화된 혈소판 결합, 반감기 및 단백분해 또는 촉매 활성, 또는 임의의 다른 활성 또는 성질의 동반 변화를 평가할 수 있다.
F. FVII 폴리펩타이드의 생산
FVII 폴리펩타이드, 예컨대 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 FVII 또는 다른 비타민 K 폴리펩타이드의 도메인은 단백질 정제 및 재조합 단백질 발현을 위한 당업계에 공지된 방법으로 수득할 수 있다. 목적 유전자를 암호화하는 핵산을 확인하기 위해 당업자에게 공지된 모든 방법이 사용될 수 있다. 당업계에서 이용할 수 있는 모든 방법은 간과 같은 세포 또는 조직 급원 등에서 유래되는 FVII 폴리펩타이드 또는 다른 비타민 K 폴리펩타이드를 암호화하는 전장(즉, 전체 암호화 영역 포함) cDNA 또는 게놈 DNA를 수득하는데 사용될 수 있다. 변형 FVII 폴리펩타이드는 본 명세서에 기술된 바와 같이, 예컨대 부위 지시된 돌연변이유발에 의해 유전자조작될 수 있다.
FVII는 핵산 분자를 클로닝 및 분리하는 당업계에 공지된 모든 유용한 방법으로 클로닝 또는 분리할 수 있다. 이러한 방법으로는 핵산의 PCR 증폭 및 라이브러리의 선별, 예컨대 핵산 하이브리드화 선별, 항체 기반 선별 및 활성 기반 선별을 포함한다.
핵산 증폭 방법은 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 분리하는데 사용될 수 있고, 그 예로는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 방법이 있다. 핵산 함유 물질은 FVII 암호화 핵산 분자가 분리될 수 있는 출발 물질로서 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 및 mRNA 제조물, 세포 추출물, 조직 추출물(예, 간 유래), 유체 샘플(예, 혈액, 혈청, 타액), 건강한 피검체 및/또는 환자 유래의 샘플이 증폭 방법에 사용될 수 있다. 또한, 핵산 라이브러리는 출발 물질의 급원으로서 사용될 수 있다. FVII 암호화 분자를 증폭시키기 위해 프라이머를 설계할 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 FVII가 수득되는 발현 서열을 기초로 하여 설계할 수 있다. 프라이머는 FVII 아미노산 서열의 역해독을 기초로 하여 설계할 수 있다. 증폭에 의해 수득된 핵산 분자는 서열분석되고 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는지 확인될 수 있다.
추가의 뉴클레오타이드 서열이 FVII 암호화 핵산 분자에 연결될 수 있고, 그 예로는 벡터, 예컨대 단백질 발현 벡터, 또는 코어 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 증폭을 위해 설계된 벡터 내로 합성 유전자를 클로닝하기 위한 목적의 제한효소 부위를 함유하는 링커 서열이 포함된다. 또한, 기능성 DNA 인자를 특정하는 추가의 뉴클레오타이드 서열은 FVII 암호화 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 서열의 예로는 세포내 단백질 발현을 촉진하도록 설계된 프로모터 서열, 및 단백질 분비를 촉진하도록 설계된 분비 서열이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 단백질 결합 영역을 특정하는 서열과 같은 추가의 뉴클레오타이드 서열도 FVII 암호화 핵산 분자에 연결될 수 있다. 이러한 영역들은 특정 표적 세포 내로 FVII의 흡수를 촉진하는 서열, 또는 그렇지않다면 합성 유전자의 약동학을 증강시키는 서열을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
확인 및 분리된 핵산은 그 다음 적당한 클로닝 벡터에 삽입될 수 있다. 당업자에게 공지된 다수의 벡터-숙주계가 사용될 수 있다. 가능한 벡터로는, 플라스미드 또는 변형 바이러스를 포함하나, 이에 국한되지 않고, 단 벡터계는 사용된 숙주계와 화합성이어야 한다. 이러한 벡터로는, 람다 유도체와 같은 박테리오파지, 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드 또는 Bluescript 벡터(Stratagene, La Jolla, CA). 클로닝 벡터 내로의 삽입은 예컨대 상보성 점착성 말단을 보유하는 클로닝 벡터에 DNA 단편의 연결을 통해 달성될 수 있다. 삽입은 TOPO 클로닝 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 실시할 수 있다. DNA를 단편화하는데 사용되는 상보성 제한효소 부위가 클로닝 벡터에 존재하지 않으면, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, DNA 말단에 뉴클레오타이드 서열(링커)를 연결시켜 바람직한 임의의 부위를 생산할 수 있고; 이러한 연결된 링커는 제한효소 인식 서열을 암호화하는 특정 화학적 합성된 올리고뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 대안적 방법으로, 절단된 벡터 및 FVII 단백질 유전자는 단독중합체성 테일링(tailing)에 의해 변형될 수 있다. 재조합 분자는 유전자 서열의 많은 카피가 생성되도록 형질전환, 형질감염, 감염, 전기침투 및 소노포레이션(sonoporation) 등을 통해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
특정 양태에 따르면, 분리된 FVII 단백질 유전자, cDNA 또는 합성된 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 이용한 숙주 세포의 형질전환은 이 유전자의 다중 카피의 생성을 가능하게 한다. 따라서, 이 유전자는 형질전환체의 성장, 이 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자의 분리, 및 필요하다면 분리된 재조합 DNA로부터 삽입된 유전자의 회수를 통해 다량으로 수득될 수 있다.
1. 벡터 및 세포
하나 이상의 FVII 단백질의 재조합 발현을 위해, FVII 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 전체 또는 일부를 함유하는 핵산은 적당한 발현 벡터, 즉 삽입된 단백질 암호화 서열의 전사 및 해독에 필요한 인자를 함유하는 벡터에 삽입될 수 있다. 이러한 벡터의 예는 임의의 포유동물 발현 벡터, 예컨대 pCMV이다. 또한, 필수 전사 및 해독 시그널은 FVII 유전자의 천연 프로모터 및/또는 이들의 인접 영역들에 의해 공급될 수 있다.
또한, 본 발명은 FVII 또는 변형 FVII를 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터를 제공한다. 또한, 벡터를 함유하는 세포도 제공한다. 세포는 진핵생물 및 원핵생물 세포를 포함하고, 벡터는 여기서 사용하기에 적합한 모든 것이다.
벡터를 함유하는 원핵생물 및 진핵생물 세포, 예컨대 내피세포가 제공된다. 이러한 세포는 세균 세포, 효모 세포, 진균 세포, 고세균(Archea), 식물 세포, 곤충 세포 및 동물 세포를 포함한다. 이 세포들은 암호화된 FVII 단백질이 세포에 의해 발현되는 조건 하에서 전술한 세포들을 성장시키고, 발현된 FVII 단백질을 회수하여 FVII 폴리펩타이드 또는 변형 FVII 폴리펩타이드를 생산하는데 사용된다. 본 발명의 목적을 위해, FVII는 배지로 분비될 수 있다.
한 양태에 따르면, FVII 활성을 보유하고 FVII 폴리펩타이드 전체 또는 일부를 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 다중 카피를 함유하는 벡터가 제공된다. 이 벡터는 FVII 단백질이 분비 단백질로서 발현되도록 또는 세포 내에서 FVII 폴리펩타이드 또는 이의 변형 FVII 폴리펩타이드가 발현되는 것으로 선택할 수 있다. FVII가 발현될 때, 핵산은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) α-교배 인자 시그널 또는 이의 일부와 같은 분비 시그널을 암호화하는 핵산, 또는 천연 시그널 서열에 연결되어 있다.
다양한 숙주-벡터계는 단백질 암호화 서열을 발현시키는데 사용될 수 있다. 그 예로는 바이러스(예컨대, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 기타 바이러스)로 감염된 포유동물 세포계; 바이러스(예, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포계; 효모 벡터를 함유하는 효모와 같은 미생물; 또는 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 세균이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 벡터의 발현 인자들은 강도와 특이성이 다양하다. 사용된 숙주-벡터계에 따라, 다수의 적당한 전사 및 해독 인자 중 어느 하나가 사용될 수 있다.
벡터에 DNA 단편을 삽입하기 위한 당업자에게 공지된 임의의 방법은 적당한 전사/해독 조절 시그널 및 단백질 암호화 서열을 함유하는 키메라 유전자 함유 발현 벡터의 작제에 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 시험관내 재조합 DNA와 합성 기술 및 생체내 재조합체(유전자 재조합)를 포함할 수 있다. FVII 폴리펩타이드 또는 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 이의 도메인, 유도체, 단편 또는 동족체를 암호화하는 핵산 서열의 발현은 이 유전자 또는 이의 단편들이 재조합 DNA 분자(들)로 형질전환된 숙주에서 발현되도록 제2 핵산 서열에 이해 조절될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 발현은 당업계에 공지된 임의의 프로모터/인핸서에 의해 조절될 수 있다. 특정 양태에서, 프로모터는 FVII 단백질의 유전자들에 대해 비천연성이다. 사용될 수 있는 프로모터로는 SV40 초기 프로모터(Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), 라우스 육종 바이러스의 3' 장말단 반복체에 함유된 프로모터(Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1441-1445 (1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); 원핵생물 발현 벡터, 예컨대 β-락타마제 프로모터(Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) 또는 tac 프로모터(DeBoer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983); 또한 "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": in Scientific American 242:79-94 (1980) 참조); 노팔린 신테타제 프로모터(Herrar-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)), 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터(Garder et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), 및 광합성 효소 리불로스 비스포스페이트 카르복실라제의 프로모터(Herrera- Estrella et al., Nature 370:115-120 (1984))를 함유하는 식물 발현 벡터; Gal 4 프로모터, 알콜 데하이드로게나제 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 프로모터, 알칼리 포스파타제 프로모터 및 조직 특이성을 나타내고 유전자도입 동물에 사용되었던, 다음과 같은 동물 전사 조절 영역: 췌장 선포세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역(Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역(Hanahan et al, Nature 375:115-122 (1985)), 림프양 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역(Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al, Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), 고환, 유방, 림프양 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방암 바이러스 조절 영역(Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역(Pinckert et al, Genes and Devel. 1:268-276 (1987)), 간에서 활성인 알파-태아단백 유전자 조절 영역(Krumlauf et al., Mol. Cell Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987)), 간에서 활성인 알파-1 항트립신 유전자 조절 영역(Kelsey et al., Genes and Devel 1:161-171 (1987)), 골수양 세포에서 활성인 베타 글로빈 유전자 조절 영역(Mogram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)), 뇌의 희소돌기아교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역(Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역(Sani, Nature 314:283-286 (1985)) 및 시상하부의 성선자극세포에서 활성인 성선자극성 방출 호르몬 유전자 조절 영역(Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986))을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
특정 양태에서, FVII 폴리펩타이드 또는 변형 FVII 폴리펩타이드, 이의 도메인, 단편, 유도체 또는 동족체를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 결합된 프로모터, 하나 이상의 복제 오리진, 및 임의로 하나 이상의 선택성 마커(예, 항생제 내성 유전자)를 함유하는 벡터가 사용된다. FVII 폴리펩타이드를 발현하는 벡터 및 시스템은 공지된 피치아(Pichia) 벡터(인비트로겐(San Diego, CA) 등에서 입수용이함), 특히 암호화된 단백질을 분비하도록 설계된 벡터를 포함한다. 포유동물 세포에서 발현시키기 위한 예시적 플라스미드 벡터로는 예컨대 pCMV가 포함된다. 이.콜라이 세포의 형질전환을 위한 플라스미드 벡터의 예로는, 예컨대 pQE 발현 벡터(Qiagen에서 입수용이함, Valencia, CA; 또한, 이 시스템을 설명하는 퀴아겐의 공개 자료 참조)를 포함한다. pQE 벡터는 이.콜라이에서 재조합 단백질의 엄중 조절성 고 수준의 발현을 제공하는 파지 T5 프로모터(이.콜라이 RNA 폴리머라제에 의해 인식됨) 및 이중 lac 오퍼레이터 억제 모듈, 효과적인 해독을 위한 합성 리보솜 결합 부위(RBS II), 6XHis 태그 암호화 서열, t0 및 T1 전사 터미네이터, ColE1 복제 기원 및 앰피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자를 보유한다. pQE 벡터는 재조합 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 6xHis 태그의 배치를 가능하게 한다. 이러한 플라스미드로는 총 3개의 판독 프레임을 위한 다중 클로닝 부위를 제공하고 N-말단 6xHis 태그화된 단백질의 발현을 제공하는 pQE32, pQE30 및 pQE31을 포함한다. 이.콜라이 세포의 형질전환을 위한 다른 예시적 플라스미드 벡터로는, 예컨대 pET 발현 벡터(예컨대, 미국 특허 4,952,496 참조; 노바겐(Madison, WI)에서 입수용이함; 또한, 노바겐에서 공개한 이 시스템을 설명하는 문헌 참조)를 포함한다. 이러한 플라스미드로는 T7lac 프로모터, T7 터미네이터, 유도성 이.콜라이 lac 오퍼레이터 및 lac 억제 유전자를 함유하는 pET 11a; T7 프로모터, T7 터미네이터 및 이.콜라이 ompT 분비 시그널을 함유하는 pET 12a-c; 및 His 컬럼 정제에 사용하기 위한 His-Tag™ 리더 서열 및 컬럼을 통한 정제 후에 절단을 허용하는 트롬빈 절단 부위, T7-lac 프로모터 영역 및 T7 터미네이터를 함유하는 pET 15b 및 pET19b(NOVAGEN, Madison, WI)를 포함한다.
2. 발현계
FVII 폴리펩타이드(변형 및 비변형)는 시험관내 및 생체내 방법을 비롯한 단백질 생산의 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있으며, 그 예로는 FVII를 암호화하는 핵산 분자의 숙주 세포, 숙주 동물 내로의 도입 및 시험관내 FVII를 암호화하는 핵산 분자로부터의 발현이 포함된다. FVII 및 변형 FVII 폴리펩타이드는 투여 및 치료에 필요한 FVII 폴리펩타이드이 필요한 함량 및 형태를 생산하는데 적합한 임의의 유기체에서 발현될 수 있다. 발현 숙주는 원핵생물 및 진핵생물 유기체, 예컨대 이.콜라이, 효모, 식물, 곤충 세포, 포유동물 세포, 구체적으로 사람 세포주 및 유전자도입 동물을 포함한다. 발현 숙주는 이들의 단백질 생산 수준뿐만 아니라 발현된 단백질에 존재하는 해독후 변형의 종류가 다를 수 있다. 발현 숙주의 선택은 이러한 인자 및 기타 인자들, 예컨대 조절 및 안전성 문제, 생산비용 및 정제의 필요와 방법 등을 기초로 하여 이루어질 수 있다.
진핵생물 숙주에서의 발현은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리아(Pichia pastoria)와 같은 효모, 드로소필라 세포 및 레피도프테란 세포와 같은 곤충 세포, 담배, 옥수수, 쌀, 조류(algae) 및 렘나(lemna)와 같은 식물 및 식물 세포에서의 발현을 포함할 수 있다. 발현용 진핵생물 세포로는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 어린 햄스터 신장(BHK) 세포와 같은 포유동물 세포주도 포함한다. 진핵생물 발현 숙주는 또한 유전자도입 동물에서의 생산, 예컨대 혈청, 젖 및 난(egg)에서의 생산을 포함한다. 야생형 FVII 폴리펩타이드를 생산하기 위한 유전자도입 동물은 당업계에 공지되어 있고(미국 특허 공개번호 20020166130 및 20040133930) 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드의 생산을 위해 개조될 수 있다.
많은 발현 벡터들이 이용가능하고 FVII의 발현을 위해 당업자에게 공지되어 있다. 발현 벡터의 선택은 숙주 발현계의 선택에 의해 영향을 받는다. 이러한 선택은 당업자의 기술 수준 안에 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터 및 임의로 인핸서, 해독 시그널 및 전사 및 해독 종결 시그널을 포함할 수 있다. 안정한 형질전환에 사용되는 발현 벡터는 일반적으로 형질전환된 세포의 선택 및 유지를 허용하는 선택성 마커를 보유한다. 일부 경우에, 복제 오리진은 세포에서 벡터의 카피수를 증폭시키는데 사용될 수 있다.
FVII 또는 변형 FVII 폴리펩타이드는 또한 단백질 융합체로서 사용되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, 융합은 폴리펩타이드에 추가의 기능성을 부가하기 위해 이루어질 수 있다. 융합 단백질의 예로는, 시그널 서열, 국재화 등을 위한 태그, 예컨대 his6 태그 또는 myc 태그 또는 정제용 태그, 예컨대 GST 융합, 및 단백질 분비 및/또는 막 연합의 유도용 서열을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
한 양태에 따르면, FVII 폴리펩타이드 또는 변형 FVII 폴리펩타이드는 활성형으로 발현될 수 있고, 이로써 활성화는 분비 후 폴리펩타이드의 자가활성화에 의해 달성된다. 다른 양태에 따르면, 프로테아제는 불활성 자이모겐 형태로 발현된다.
FVII 폴리펩타이드를 생산하는 방법은 FVII 폴리펩타이드의 생산에 도움을 줄 수 있는 하나 이상의 추가의 이종 폴리펩타이드의 공동발현을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 폴리펩타이드는 FII 폴리펩타이드의 해독후 프로세싱에 기여할 수 있다. 폴리펩타이드의 예로는 프로펩타이드 서열과 같은 FVII 전구체 서열의 절단에 도움을 주는 펩티다제, 및 글리코실화, 하이드록실화, 카르복실화 또는 인산화와 같은 FVII 폴리펩타이드의 변형에 관여하는 효소를 포함하고, 이에 국한되지는 않는다. FVII와 함께 공동발현될 수 있는 예시적 펩티다제는 FVII 프로펩타이드 서열의 절단을 돕는 PACE/푸린(또는 PACE-SOL)이다. FVII 폴리펩타이드의 카르복실화에 도움을 주는 단백질의 예는 비타민 K 의존적 γ-카르복실라제에 의한 보조인자로서 이용되는 환원된 비타민 K를 생산하는 와파린-감수성 효소 비타민 K 2,3-에폭사이드 리덕타제(VKOR)이다(Wajih et al., J. Biol. Chem. 280(36) 31603-31607). 이 효소의 서브유닛, VKORC1은 변형 FVII 폴리펩타이드와 공동발현되어 γ-카르복실화를 증가시킬 수 있다. 하나 이상의 추가의 폴리펩타이드는 FVII 폴리펩타이드와 동일한 발현 벡터로부터 또는 다른 벡터로부터 발현될 수 있다.
a. 원핵생물 발현
원핵생물, 특히 이.콜라이는 다량의 FVII를 생산하는 시스템을 제공한다(예컨대, Platis et al.(2003) Protein Exp. Purif. 31(2): 222-30; 및 Khalizzadeh et al. (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31(2): 63-69). 이.콜라이의 형질전환은 당업자에게 공지된 간단하고 신속한 기술이다. 이.콜라이의 발현 벡터는 숙주 세포에 약간의 독성을 나타내는 단백질의 발현 및 높은 수준의 단백질 발현의 유도에 유용한 유도성 프로모터를 함유할 수 있다. 유도성 프로모터의 예로는 lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 tac 프로모터, T7 및 SP6 RNA 프로모터 및 온도 조절 λPL 프로모터를 포함한다.
FVII는 이.콜라이의 세포질 환경에서 발현될 수 있다. 세포질은 환원성 환경이고, 이것은 일부 분자에 대해 불용성 봉입체의 형성을 초래할 수 있다. 디티오트레이톨 및 β-머캅토에탄올과 같은 환원제 및 변성제(예, 구아니딘-HCl 및 우레아)는 단백질의 재용해에 사용될 수 있다. 대안 시도는, 산화 환경과 샤페로닌(chaperonin) 유사 및 이황화 이소머라제를 제공하여 가용성 단백질의 생산을 야기하는 세균의 주변세포질 공간에서의 FVII의 발현이다. 일반적으로, 리더 서열은 단백질을 주변세포질 공간으로 유도하는, 발현될 단백질에 융합된다. 그 다음, 리더는 주변세포질 내의 시그널 펩티다제에 의해 제거된다. 주변세포질-표적화 리더 서열의 예로는 펙트산 리아제 유전자 유래의 pelB 리더 및 알칼리 포스파타제 유전자 유래의 리더를 포함한다. 일부 경우에, 주변세포질 발현은 발현 단백질의 배양 배지로의 유출을 허용한다. 단백질의 분비는 배양 상청액으로부터 빠르고 간단히 정제할 수 있게 한다. 분비되지 않은 단백질은 주변세포질로부터 삼투 용해에 의한 수득할 수 있다. 세포질 발현과 마찬가지로, 일부 경우에 단백질은 불용성이 될 수 있고, 가용화 및 리폴딩을 촉진하기 위해 변성제와 환원제를 사용할 수 있다. 또한, 유도 및 성장 온도는 발현 수준 및 용해도에 영향을 미칠 수 있다. 일반적으로, 25℃ 내지 37℃ 사이의 온도가 사용된다. 또한, 발현 단백질의 용해도를 증가시키기 위해 돌연변이를 사용할 수도 있다. 일반적으로, 세균은 아글리코실화 단백질을 생산한다. 따라서, 단백질이 기능을 위해 글리코실화를 필요로 하면, 글리코실화는 숙주 세포로부터 정제 후에 시험관내에서 부가될 수 있다.
b. 효모
사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)는 FVII의 유용한 발현 숙주이다(예컨대, Skoko et al.(2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38(Pt3): 257-65). 효모는 에피솜 복제 벡터에 의해 또는 상동 재조합을 통한 안정한 염색체 통합에 의해 형질전환될 수 있다. 일반적으로, 유전자 발현을 조절하기 위해 유도성 프로모터를 사용한다. 이러한 프로모터의 예로는 GAL1, GAL7 및 GAL5, 및 CUP1과 같은 메탈로티오네인 프로모터를 포함한다. 발현 벡터는 종종 형질전환된 DNA의 선택과 유지를 위한 선택성 마커, 예컨대 LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3을 포함한다. 효모에서 발현된 단백질은 종종 가용성이고, Bip 및 단백질 이황화물 이소머라제와 같은 샤페로닌과의 공동발현은 발현 수준 및 용해도를 향상시킬 수 있다. 또한, 효모에서 발현된 단백질은 사카로마이세스 세레비지에 유래의 효모 교배형 알파-인자 분비 시그널과 같은 분비 시그널 펩타이드 융합체 및 Aga2p 교배 부착 수용체 또는 아룩술라 아데노니보란스(Arxula adeninivorans) 글루코아밀라제와 같은 효모 세포 표면 단백질과의 융합체를 사용하여 분비되도록 유도될 수 있다. 프로테아제 절단 부위(예컨대, Kex-2 프로테아제)는 분비 경로를 이탈할 때 폴리펩타이드로부터 융합된 서열을 제거하도록 유전자조작될 수 있다. 또한, 효모는 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 글리코실화할 수 있다.
c. 곤충 및 곤충 세포
곤충 및 곤충 세포는, 특히 배큘로바이러스 발현계를 이용할 때, FVII 또는 이의 변형 형태와 같은 폴리펩타이드의 발현에 유용하다(예컨대, Muneta et al.(2003) J.Vet.Med.Sci. 65(2): 219-23). 혈림프절에서의 발현을 비롯하여 곤충 세포 및 곤충 유충은 단백질의 높은 수준을 발현하고 고등 진핵생물이 사용하는 해독후 변형의 대부분을 할 수 있다. 배큘로바이러스는 안정성을 향상시키고 진핵생물 발현의 조절 염려를 감소시키는 제한적인 숙주 범위를 나타낸다. 일반적으로, 발현 벡터는 고도의 발현 수준을 위한 배큘로바이러스의 폴리헤드린 프로모터와 같은 프로모터를 이용한다. 일반적으로 사용되는 배큘로바이러스 시스템은 오토그라파 캘리포니카 핵 다면증 바이러스(AcNPV) 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) 핵다면증 바이러스(BmNPV) 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 유래의 Sf9, 슈달레티아 유니펑타(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 다나우스 플렉시푸스(Danaus plexippus)(DpN1)와 같은 곤충 세포주를 포함한다. 높은 수준의 발현을 위해, 발현될 분자의 뉴클레오타이드 서열은 바이러스의 폴리헤드린 개시 코돈의 인접 하류에 융합된다. 포유동물 분비 시그널은 곤충 세포에서 정확하게 프로세싱되어 발현된 단백질을 배양 배지로 분비시키는데 사용될 수 있다. 또한, 세포주 슈달레티아 유니펑타(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 다나우스 플렉시푸스(Danaus plexippus)(DpN1)는 글리코실화 패턴이 포유동물 세포계와 유사한 단백질을 생산한다.
곤충 세포의 대안적 발현계는 안정하게 형질전환된 세포의 사용이다. 슈니더(Schnieder) 2(S2) 및 Kc 세포(드로소필라 멜라노가스터) 및 C7 세포(아에데스 알보픽터스(Aedes albopictus))와 같은 세포주가 발현을 위해 사용될 수 있다. 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터는 카드뮴 또는 구리를 이용한 중금속 유도의 존재 하에 높은 발현 수준을 유도하는데 사용될 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 네오마이신 및 하이그로마이신과 같은 선택성 마커의 사용에 의해 유지된다.
d. 포유동물 세포
포유동물 발현계는 FVII 폴리펩타이드의 발현에 사용될 수 있다. 발현 작제물은 아데노바이러스와 같은 바이러스 감염에 의해, 또는 리포좀, 인산칼슘, DEAE-덱스트란과 같은 직접 DNA 전이에 의해, 그리고 전기침투 및 미량주사와 같은 물리적 수단에 의해 포유동물 세포로 전이될 수 있다.
포유동물 세포의 발현 벡터는 일반적으로 mRNA 캡 부위, TATA 박스, 해독 개시 서열(코작 컨센서스 서열) 및 폴리아데닐화 인자를 포함한다. 이러한 벡터들은 종종 높은 발현 수준을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예컨대 SV40 프로모터-인핸서, 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 라우스 육종 바이러스(RSV)의 장말단 반복체를 포함한다. 이러한 프로모터-인핸서는 많은 세포 종류에서 활성적이다. 조직 및 세포형 프로모터 및 인핸서 영역도 역시 발현을 위해 사용될 수 있다. 예시적 프로모터/인핸서 영역은 엘라스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유방암 바이러스, 알부민, 알파-태아단백, 알파 1-안티트립신, 베타-글로빈, 미엘린 염기성 단백질, 미오신 경쇄-2 및 성선자극 방출 호르몬 유전자 조절과 같은 유전자 유래의 영역을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 선택성 마커는 발현 작제물을 보유한 세포를 선택하고 유지시키는데 사용될 수 있다. 선택성 마커 유전자의 예로는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아데노신 데아미나제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제 및 티미딘 키나제를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 세포 표면 시그널링 분자, 예컨대 TCR-ζ 및 FcεRI-γ와의 융합은 세포 표면에 활성 상태의 단백질을 직접 발현시킬 수 있다.
많은 세포주는 마우스, 래트, 사람, 원숭이 및 닭과 햄스터 세포를 비롯한 포유동물의 발현에 유용하다. 세포주의 예로는 BHK(즉, BHK-21 세포), 293-F, CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0(비분비형) 및 다른 골수종 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유아세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 293T, 2B8 및 HKB 세포를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 또한, 세포주는 세포 배양배지로부터 분비 단백질의 정제를 용이하게 하는 무혈청 배지에 쉽게 적응한다. 이러한 한 예는 무혈청 EBNA-1 세포주(Pham et al.,(2003) Biotechnol . Bioeng. 84: 332-42)이다. 혈장 유래의 FVII와 유사한 구조 및 해독후 변형을 나타내는 재조합 FVII 폴리펩타이드의 발현은 당업계에 공지되어 있다(예컨대, Jurlander et al.(2003) Semin Throm Hemost 참조). 비타민 K 의존적 단백질 발현을 최적화하는 방법은 공지되어 있다. 예를 들어, 배양 배지에 비타민 K의 보충 또는 비타민 K 의존적 γ-카르복실라제의 공동발현(Wajih et al., J.Biol.Chem. 280(36) 31603-31607)은 FVII 폴리펩타이드와 같은 비타민 K 의존적 단백질의 해독후 변형에 도움을 줄 수 있다.
e. 식물
유전자도입 식물 세포 및 식물은 FVII의 발현에 사용될 수 있다. 발현 작제물은 일반적으로 마이크로프로젝타일 충격과 같은 직접 DNA 전이 및 원형질 내로 PEG 매개 전이, 및 아그로박테리움 매개의 형질전환을 이용하여 식물 내로 전이된다. 발현 벡터는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사 종결 인자 및 해독 조절 인자를 포함할 수 있다. 발현 벡터와 형질전환 기술은 일반적으로 쌍떡잎식물 숙주, 예컨대 아라비돕시스 및 담배와 외떡잎식물 숙주, 예컨대 옥수수 및 쌀 간에 나누어진다. 발현에 사용되는 식물 프로모터의 예로는 꽃양배추 모자이크 바이러스 프로모터, 노팔린 신타제 프로모터, 리보스 비스포스페이트 프로모터 및 유비퀴틴 및 UBQ3 프로모터를 포함한다. 하이그로마이신, 포스포만노스 이소머라제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제와 같은 선택성 마커는 종종 형질전환된 세포의 선택 및 유지를 촉진하는데 사용된다. 형질전환된 식물 세포는 세포, 결집체(캘러스 조직)로서 배양물에서 유지되거나 또는 완전 식물로 재생될 수 있다. 식물은 포유동물 세포보다 다른 글리코실화 패턴을 갖기 때문에, 이들 숙주에서 FVII를 생산하는 대안에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 유전자도입 식물 세포는 단백질을 생산하도록 유전자조작된 조류를 포함할 수 있다(예컨대, Mayfield et al.(2003) PNAS 100: 438-442). 식물은 포유동물 세포와 다른 글리코실화 패턴을 보유하기 때문에, 이는 이들 숙주에서 FVII를 생산하는 대안에 영향을 미칠 수 있다.
2. 정제
숙주 세포로부터 FVII 폴리펩타이드를 정제하는 방법은 선택된 숙주 세포와 발현계에 따라 달라진다. 분비 분자인 경우, 단백질은 일반적으로 세포를 제거한 후 배양배지로부터 정제된다. 세포내 발현인 경우, 세포는 용해되고 이 추출물로부터 단백질이 정제된다. 유전자도입 식물 및 동물과 같은 유전자도입 유기체가 발현에 사용될 때에는, 조직 또는 기관을 출발 물질로서 사용하여 용해된 세포 추출을 제조한다. 또한, 유전자도입 동물 생산은 수집될 수 있는 젖이나 난에서의 폴리펩타이드의 생산을 포함할 수 있고, 필요하다면 단백질은 추가로 추출한 뒤, 당업계의 표준 방법을 사용해서 추가 정제할 수 있다.
FVII는 SDS-PAGE, 크기 분별 및 크기 배제 크로마토그래피, 황산암모늄 침전, 킬레이트 크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피를 비롯한, 이에 국한되지 않는 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 정제할 수 있다. 에를 들어, FVII 폴리펩타이드는 음이온교환 크로마토그래피로 정제할 수 있다. FVII 폴리펩타이드를 정제하는 방법의 예는 기능성 Gla 도메인을 보유하는 임의의 폴리펩타이드의 결합과 이어서 칼슘의 존재 하에 용출을 허용하는 이온교환 컬럼을 이용하는 방법이다(예컨대, 실시예 3 참조). 또한, 이 제조물의 효율과 순도를 향상시키기 위해 친화도 정제 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, FVII를 결합시키는 항체, 수용체 및 다른 분자는 친화도 정제에 사용될 수 있다. 다른 예에서, 정제는 또한 가용성 TF(sTF) 친화도 컬럼을 사용하여 증강될 수도 있다(Maun et al.(2005) Prot Sci 14: 1171-1180). 또한, 발현 작제물은 단백질에 대해 myc 에피토프, GST 융합 또는 His6과 같은 친화도 태그를 부가하도록 유전자조작되어, 각각 myc 항체, 글루타티온 수지 및 Ni-수지로 친화도 정제할 수도 있다. 순도는 겔 전기영동 및 염색과 분광분석 기술을 비롯한 당업계에 공지된 임의의 방법으로 평가할 수 있다.
FVII 프로테아제는 불활성 형태(자이모겐 형태)이도록 발현 및 정제될 수 있거나, 또는 대안적으로 발현된 프로테아제는 자가촉매작용 등에 의해 활성형으로 정제될 수 있다. 예를 들어, Arg152-Ile153의 단백분해 절단을 통해 활성화된 FVII 폴리펩타이드는 시험관내에서 제조될 수 있다(즉, FVIIa, 이중쇄 형태). FVII 폴리펩타이드는 먼저 포유동물 세포에서의 생산 및 그 다음 정제를 포함하는(이에 국한되지 않는다) 본 명세서에 기술된 임의의 생산방법으로 제조할 수 있다. 활성 프로테아제 형태, FVIIa로 FVII 폴리펩타이드의 절단은 여러 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 칼슘의 존재 하에 인지질 소포와의 항온배양 동안 자가활성화는 45분 내에 달성될 수 있다(Nelsestuen et al.(2001) J Biol Chem 276: 39825-31). 또한, FVII 폴리펩타이드는 칼슘의 존재 하에, 인지질과 함께 또는 인지질 없이 제Xa 인자, 제XIIa 인자 또는 TF와 항온처리에 의해 완전하게 활성화될 수 있다(예컨대, 실시예 3 및 Broze et al.(1980) J Biol Chem 255: 1242-1247, Higashi et al.(1996) J Biol Chem 271: 26569-26574, Harvey et al., J.Biol.Chem. 278: 8363-8369).
3. 융합 단백질
변형 FVII 폴리펩타이드 및 하나 이상의 다른 폴리펩타이드를 함유하는 융합 단백질도 제공된다. 이러한 융합 단백질을 적당한 경로를 통해 투여하기 위해 제형화한 약제학적 조성물도 제공한다. 융합 단백질은 변형 FVII 폴리펩타이드와 제제, 예컨대 항체 또는 이의 단편, 성장인자, 수용체, 리간드 및 FVII 폴리펩타이드의 정제를 용이하게 하고, 상기폴리펩타이드를 표적화된 세포 또는 조직으로 유도하는 등에 의해 FVII 폴리펩타이드의 약동학적 성질을 변경시키고/변경시키거나 FVII 폴리펩타이드의 발현 또는 분비를 증가시키기 목적의 다른 제제를 임의의 순서대로 연결시켜 제조한다. 전형적으로, 임의의 FVII 융합 단백질은 비융합 FVII 폴리펩타이드에 비해 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 응고제 활성, 예컨대 비융합 폴리펩타이드에 비해 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 응고제 활성을 유지한다.
다른 폴리펩타이드와 FVII 폴리펩타이드의 결합은 직접 또는 링커를 통해 간접적으로 실시될 수 있다. 한 예에 따르면, 결합은 이종이작용기제 또는 티올 결합 또는 이러한 다른 결합과 같은 화학적 결합에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 융합은 재조합 수단에 의해 달성될 수도 있다. FVII 폴리펩타이드와 다른 폴리펩타이드의 융합은 FVII 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 이루어질 수 있다. 당해의 FVII 폴리펩타이드와 융합 단백질에 사용될 수 있는 폴리펩타이드의 비제한적 예로는 예컨대 GST(글루타티온 S-트랜스퍼라제) 폴리펩타이드, 면역글로불린 G 유래의 Fc 도메인 또는 이종 시그널 서열을 포함한다. 융합 단백질은 세포들에 의한 단백질의 흡수에 도움을 주는 이.콜라이 말토스 결합 단백질(MBP)과 같은 추가 성분을 함유할 수 있다(예컨대, 국제 PCT 출원번호 WO 01/32711).
융합 단백질은 표준 재조합 기술로 생산할 수 있다. 예를 들어, 다른 폴리펩타이드 서열을 암호화하는 DNA 단편은 통상의 기술에 따라, 예컨대 평활말단 또는 점착말단성 연결 말단, 적당한 말단을 제공하기 위한 제한효소 분해, 적당한 경우 응집성 말단의 채움(filling-in), 불필요한 결합을 피하기 위한 알칼리 포스파타제, 및 효소적 연결의 이용 등과 같은 통상의 기술에 따라, 인프레임(in-frame)식으로 함께 연결될 수 있다. 다른 양태에 따르면, 융합 유전자는 자동 DNA 합성기를 포함하는 통상의 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 키메릭 유전자 서열을 생성하기 위해 후속해서 어닐링 및 재증폭될 수 있는 2개의 연속 유전자 단편들 사이에 상보성 오버행을 생성시키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행할 수 있다(예컨대, Ausubel et al.(eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). 더욱이, 많은 발현 벡터들은 이미 융합 잔기(예, GST 폴리펩타이드)를 암호화하는 벡터로, 시중에서 입수용이하다. FVII 암호화 핵산은 융합 잔기가 프로테아제 단백질에 인프레임식으로 연결되도록 상기 발현 벡터에 클로닝될 수 있다.
4. 폴리펩타이드 변형
변형 FVII 폴리펩타이드는 나출형 폴리펩타이드 사슬 또는 복합체로서 제조될 수 있다. 일부 응용예들에서는 해독후 변형 또는 다른 화학적 변형없이 변형 FVII를 "나출" 형태로 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 나출형 폴리펩타이드 사슬은 FVII를 해독후 변형시키지 않는 적합한 숙주 내에서 제조될 수 있다. 또한, 이러한 폴리펩타이드는 시험관내 시스템에서 화학적 폴리펩타이드 합성을 이용하여 제조할 수도 있다. 다른 응용예들에서는, 페길화, 알부민화, 글리코실화, 카르복실화, 하이드록실화, 인산화 또는 다른 공지된 변형을 비롯한 특정 변형이 바람직할 수 있다. 변형은 시험관내에서 이루어지거나, 또는 이러한 변형을 생산하는 적당한 숙주에서 변형 FVII를 생산하여 이루어질 수 있다.
5. 뉴클레오타이드 서열
FVII 또는 변형 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자가 제공된다. 핵산 분자는 임의의 암호화된 FVII 폴리펩타이드의 대립유전자 변이체 또는 스플라이싱 변이체를 포함한다. 당해의 핵산 분자의 예는 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 모든 핵산, 예컨대 서열번호 18-43, 125-150 또는 206-250 중 임의의 서열번호에 제시된 폴리펩타이드를 암호화하는 임의의 핵산이다. 한 양태에서, 당해의 핵산 분자는 당해의 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 임의의 핵산의 전체 길이의 적어도 70%를 따라 중간 또는 높은 엄중도 조건 하에 하이브리드하거나 또는 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 또는 99% 서열 동일성을 보유한다. 다른 양태에서, 핵산 분자는 당해의 임의의 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 축퇴성 코돈 서열을 보유하는 것을 포함할 수 있다.
G. 변형 FVII 폴리펩타이드의 활성 평가
FVII 폴리펩타이드의 활성 및 성질은 시험관내 및/또는 생체내에서 평가될 수 있다. 이러한 평가의 분석법은 당업자에게 공지되어 있고, 시험된 활성과 치료학적 및 생체내 활성에 대한 결과를 상호관련짓는 것으로 알려져 있다. 한 예에서, FVII 변이체는 비변형 및/또는 야생형 FVII에 비해 평가될 수 있다. 다른 예에서, 변형 FVII 폴리펩타이드의 활성은 TFPI 또는 AT-III에 대한 시험관내 또는 생체내 노출 후에 평가되고, TFPI 또는 AT-III에 노출되지 않은 변형 FVII 폴리펩타이드의 활성과 비교될 수 있다. 시험관내 분석은 당업자에게 공지된 임의의 실험실 분석, 예컨대 응고 분석, 결합 분석, 단백질 분석 및 분자생물학 분석을 비롯한 세포 기반 분석을 포함한다. 생체내 분석은 사람에 대한 투여뿐만 아니라 동물 모델에서의 FVII 분석을 포함한다. 일부 경우에, 생체내 FVII의 활성은 혈액, 혈청 또는 다른 체액을 분석 결정인자에 대해 평가하여 측정할 수 있다. FVII 변이체는 또한 치료 효과와 같은 활성 또는 특성을 평가하기 위해 생체내에서 시험될 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에 기술된 분석법은 FVII의 이중쇄 활성화된 형태, 즉 FVIIa에 관한 것이다. 이러한 분석법들은 음성 조절을 제공할 정도의 단일쇄 형태로도 수행될 수 있는데, 이러한 형태가 일반적으로 FVII의 응고제 활성에 필요한 단백분해 또는 촉매 활성을 함유하지 않기 때문이다. 또한, 이러한 분석법들은 몇몇 경우에 FVII의 활성을 증대시키는 TF와 같은 보조인자의 존재 하에서도 수행될 수 있다.
1. 시험관내 분석법
시험관내 분석법의 예로는 폴리펩타이드 변형 및 활성을 평가하는 분석법들이 있다. 변형은 γ-카르복실화 및 다른 해독후 변형을 평가하는 시험관내 분석, 단백질 분석 및 당업계에 공지된 입체형태 분석을 사용하여 평가할 수 있다. 활성 분석법으로는 TF, 제X 인자 및 제IX 인자와 같은 다른 응고 인자와 FVII 상호작용의 측정, FVII 폴리펩타이드의 단백분해 활성을 측정하는 단백분해 분석, 포스파티딜세린 및 다른 인지질에 대한 FVII 폴리펩타이드의 결합 및/또는 친화도를 측정하는 분석, 및 FVII 폴리펩타이드가 응고에 미치는 효과를 측정하는 세포 기반 분석을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
변형 FVII 폴리펩타이드는 농도는 당업계에 공지된 방법으로 평가할 수 있으며, 그 예로는 효소면역측정법(ELISA), SDS-PAGE; 브래드포드, 로우리, BCA 방법; UV 흡광도 및 다른 정량가능한 단백질 표지 방법, 예컨대 면역학적, 방사성, 형광 방법 및 관련 방법(이에 국한되지 않는다)을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
FVII 폴리펩타이드의 절단을 비롯한 단백분해 반응의 절단 산물 또는 FVII 프로테아제 활성에 의해 생산된 산물의 평가는 발색원성 기질 절단, HPLC, SDS-PAGE 분석, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 면역조직화학, 면역침전, NH2-말단 서열분석 및 단백질 표지화를 비롯한, 이에 국한되지 않는 방법을 사용해서 수행할 수 있다.
또한, 변형 FVII 폴리펩타이드의 구조적 성질도 평가될 수 있다. 예를 들어, 변형 FVII 폴리펩타이드의 X선 결정학, 핵자기공명(NMR) 및 저온전자 현미경(크라이오-EM)은 FVII 폴리펩타이드의 3차원 구조 및/또는 Ca2 + 또는 보조인자 결합과 같은 FVII 폴리펩타이드의 다른 성질을 평가하기 위해 수행할 수 있다.
또한, FVII 분해의 존재 및 정도는 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 전기영동된 FVII 함유 샘플의 웨스턴 블롯팅과 같은 표준 기술로 측정할 수 있다. 프로테아제에 노출된 FVII 폴리펩타이드는 변형 FVII 폴리펩타이드의 절단 부위의 위치 또는 변화를 측정하기 위해 N-말단 서열분석으로 처리될 수도 있다.
a. 해독후 변형
FVII 폴리펩타이드는 해독후 변형의 존재에 대해 평가할 수 있다. 이러한 분석법은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 글리코실화, 하이드록실화 및 카르복실화를 측정하는 분석법을 포함한다. 글리코실화에 대한 예시적 분석법에서는 탄수화물 분석이 예컨대 하이드라진분해 또는 엔도글리코시다제 처리에 노출된 FVII 폴리펩타이드의 SDS PAGE 분석에 의해 수행될 수 있다. 하이드라진분해는 무수 하이드라진과의 항온처리에 의해 당단백질로부터 N-연결 및 O-연결된 글리칸을 방출시키는 반면, 엔도글리코시다제 해리는 당단백질로부터 대부분의 N-글리칸을 방출시키는 PNGase F를 수반한다. FVII 폴리펩타이드의 하이드라진분해 또는 엔도글리코시다제 처리는 형광단 또는 발색단 라벨로 태그화될 수 있는 환원성 말단을 생성한다. 표지화된 FVII 폴리펩타이드는 형광단 보조의 탄수화물 전기영동(FACE)에 의해 분석될 수 있다. 글리칸을 위한 형광 태그는 또한 단당류 분석, HPLC에 의한 복합 글리코실화 패턴의 핑거프린팅 또는 프로파일링에 사용될 수 있다. 예시적 HPLC 방법으로는 소수성 상호작용 크로마토그래피, 전자 상호작용, 이온교환, 소수성 상호작용 및 크기배제 크로마토그래피를 포함한다. 글리칸 프로브의 예로는, 3-(아세틸아미노)-6-아미노아크리딘(AA-Ac) 및 2-아미노벤조산(2-AA)을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 또한, 탄수화물 잔기는 글리코실화된 FVII 폴리펩타이드를 인식하는 특정 항체의 사용을 통해 검출할 수도 있다. β-하이드록실화를 측정하는 예시적 분석법은 알칼리 가수분해로 처리된 FVII 폴리펩타이드의 역상 HPLC 분석을 포함한다(Przysiecki et al.(1987) PNAS 84: 7856-7860). FVII 폴리펩타이드의 카르복실화 및 γ-카르복실화는 당업계에 기술된 바와 같은(예컨대, Harvey et al., J Biol Chem 278: 8363-8369, Maum et al., Prot Sci 14: 1171-1180), MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight) 분석과 질량 분광분석을 사용하여 평가할 수 있다. 해독후 γ-카르복실레이트 변형을 담당하는 카르복실라제와 FVII 폴리펩타이드 함유 프로펩타이드(pro-FVII)와의 상호작용도 평가될 수 있다. 플루오레세인-표지된 pro-FVII 폴리펩타이드와 카르복실라제의 항온처리 후 해리 상수(Kd)는 결합된 카르복실라제의 양을 비등방성으로 측정함으로써 계측할 수 있다(Lin et al.(2004) J Biol Chem 279: 6560-6566).
b. 단백분해 활성
변형 FVII 폴리펩타이드는 단백분해 활성으로 시험할 수 있다. FVII의 단백분해 활성은 발색원성 기질, 예컨대 Chromozym t-PA(MeSO2-D-Phe-Gly-Arg-pNA), S-2288(H-D-IIe-Pro-Arg-pNA), S-2266(H-D-Val-Leu-Arg-pNA), S-2765(Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA), Spectrozyme FXa 및 Spectrozyme FVIIa(CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA)을 사용하여 측정할 수 있다. FVII 폴리펩타이드는 단독 또는 TF의 존재 하에 다양한 농도의 발색원성 기질과 항온처리한다. 기질의 절단은 입수용이한 소프트웨어를 사용하여 선형 회귀 분석으로 측정된 기질 가수분해 속도와 흡광도를 통해 모니터할 수 있다.
응고인자 기질, 예컨대 FX의 FVII 폴리펩타이드에 의한 활성화도 평가될 수 있다. FVII 폴리펩타이드는 TF와 사전항온처리 하에 또는 사전항온처리 없이 정제된 FX(시중에서 입수용이함)와 항온처리될 수 있다. FVII 폴리펩타이드와 항온처리의 결과로서 생산된 활성 FXa의 양은 발색원성 기질, 예컨대 S-2222 또는 Spectrafluor FXa(CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC.AcOH)에 대한 FXa의 활성으로서 측정되고, 이는 흡광도 변화를 통해 모니터된다(Harvey et al. J Biol Chem 278: 8363-8369, 또한 이하 실시예 5 참조). 또한, 인지질 급원이 FVII 및 FX의 항온처리에 첨가될 수 있다(Nelsestuen et al.(2001) J Biol Chem 276: 39825-31).
c. 응고 활성
FVII 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 분석법을 사용하여 응고 활성에 대해 시험할 수 있다. 예를 들어, 일부 분석법으로는 2단계 응고 분석법(Leibman et al.,(1985) PNAS 82: 3879-3883); 프로트롬빈 시간 분석(외인성 경로에서 FVIIa의 TF 의존적 활성을 측정할 수 있는 PT); PT 시험의 변형인 분석법; 활성화된 부분 트롬보플라스틴 분석법(aPTT, FVIIa의 TF 독립적 활성을 측정할 수 있다); 활성화된 응고 시간(ACT); 재석회화된 활성화된 응고 시간; Lee-White 응고 시간; 또는 트롬보엘라스토그래피(thromboelastography) (TEG) (Pusateri et al. (2005) Critical Care 9:S15-S24)를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, 변형 FVII 폴리펩타이드의 응고 활성은 FVII가 FVII 결핍 혈장으로 희석되고, 프로트롬빈 시간 시약(인지질 및 칼슘과 재조합 TF)(예컨대 Dade Behring에서 nnovin™으로 입수용이한 것)과 혼합되는 PT 기반 분석법으로 측정할 수 있다. 응괴 형성은 시각적으로 측정할 수 있고, 응괴까지의 시간을 측정하여 FVII 결핍 혈장 단독물과 비교했다.
d. 다른 단백질들에 대한 결합 및/또는 이들에 의한 저해
저해 분석법은 TFPI 및 AT-III과 같은 FVII 저해제 또는 Zn2 +와 같은 분자에 대한 변형 FVII 폴리펩타이드의 내성을 측정하는데 사용할 수 있다. 다른 저해제들에 대한 저해의 평가도 시험될 수 있고, 그 예로는 다른 세린 프로테아제 저해제, 및 FVII 특이적 항체가 있으나, 이에 국한되지 않는다. 저해는 TF와 예비항온처리된 FVII 폴리펩타이드와 TFPI, AT-III 또는 Zn2 + 등의 항온처리에 의해 평가될 수 있다. FVII의 활성은 그 다음, 전술한 어느 하나 이상의 활성 또는 응고 분석법을 사용하여 측정할 수 있고, TFPI, AT-III 또는 Zn2 +에 의한 저해는 저해제와 함께 항온처리된 FVII 폴리펩타이드의 활성과 저해제와 함께 항온처리되지 않은 FVII 폴리펩타이드의 활성을 비교하여 평가할 수 있다.
FVII 폴리펩타이드는 다른 응고 인자 및 저해제에 대한 결합성에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, TF와 같은 보조인자, FX 및 FIX와 같은 기질, 및 TFPI, 아안티트롬빈 III 및 헤파린과 같은 저해제와의 FVII 직접 및 간접 상호작용은 당업계에 공지된 임의의 결합 분석법, 예컨대 면역침전, 컬럼 정제, 비환원성 SDS-PAGE, BIAcore® 분석법, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 형광 공명 에너지 전이(FRET), 형광 편광(FP), 등온적정 열계량법(ITC), 원형 광이색성(CD), 단백질 단편 상보 분석법(PCA), 핵자기공명(NMR) 분광분석법, 광산란, 침강 평형, 소구역 겔 여과 크로마토그래피, 광 지연, 파(Far)-웨스턴 블롯팅, 형광 편광, 하이드록시-라디칼 단백질 풋프린팅, 파지 디스플레이, 및 다양한 이중 하이브리드 시스템 등(이에 국한되지 않는다)으로 평가할 수 있다. 한 예에 따르면, Zn2 + 결합은 평형 분석을 이용해서 평가한다(Petersen et al., (2000) Protein Science 9: 859-866).
e. 인지질 친화도
포스포티딜세린(PS) 및 다른 인지질에 대한 변형 FVII 폴리펩타이드 결합 및/또는 친화도는 당업계에 공지된 분석법을 이용해서 측정할 수 있다. 유기 용매 중의 고순도 인지질(예컨대, 공지된 농도의 소의 PS 및 난(egg) 포스파티딜콜린(PC), 시그마 등에서 시판되고 있음)은 작은 단층 인지질 소포를 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 PS/PC에 대한 FVII 폴리펩타이드 결합은 입사광에 대해 90°에서의 상대적 광산란을 통해 측정될 수 있다. PC/PS 단독일 때 및 PC/PSFVII와 함께일 때의 광산란의 강도는 해리 상수를 측정하기 위해 계측한다(Harvey et al., J Biol Chem 278: 8363-8369). BIAcore 바이오센서 기구에서와 같은 표면 플라즈마 공명은 인지질 막에 대한 FVII 폴리펩타이드의 친화도를 측정하는데 사용될 수 있다(Sun et al. Blood 101: 2277-2284).
2. 비-사람 동물 모델
비-사람 동물 모델은 변형 FVII 폴리펩타이드의 활성, 효능 및 안전성을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 비-사람 동물은 질환 또는 병태의 모델로서 사용될 수 있다. 비-사람 동물은 질환 및/또는 표현형 유도 물질을 주사맞은 후, 서열번호 18-43, 125-150 또는 206-250 중 어느 하나에 기술된 임의의 FVII 변이체와 같은 FVII 변이체를 투여함으로써 질환 진행에 미치는 효과를 모니터할 수 있다. 유전자 모델도 유용하다. 마우스와 같은 동물은 하나 이상의 유전자의 과잉발현, 과소발현 또는 녹아웃(knock-out)에 의해 질환 또는 병태를 모방하는 동물이 수득될 수 있고, 그 예로는 혈우병 A를 나타내는 제VIII 인자 녹아웃 마우스(Bi et al.(1995) Nat Gen 10: 119-121)이다. 이러한 동물은 당업계에 공지된 유전자도입 동물 생산 기술 또는 자연발생 또는 유도된 돌연변이 종을 사용하여 수득할 수 있다. FVII와 관련이 있는 질환의 유용한 비-사람 동물 모델의 예로는, 출혈 장애 모델, 특히 혈우병 또는 혈전증 질환 모델을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 또한, 상해의 비-사람 동물 모델이 FVII 폴리펩타이드의 활성, 예컨대 응고 활성을 평가하는데 사용될 수 있다. 이러한 비-사람 동물 모델은 야생형 FVII 폴리펩타이드에 비해 FVII 변이체의 활성을 모니터하는데 사용될 수 있다.
또한, 동물 모델은 변형 FVII 폴리펩타이드의 안정성, 반감기 및 제거율을 모니터하는 데에도 사용될 수 있다. 이러한 분석법은 변형 FVII 폴리펩타이드를 비교하고, 나아가 비-사람 동물 및 사람 시험을 위한 용량 및 투여 요법을 계산하는데 유용하다. 예를 들어, 서열번호 18-43, 125-150 또는 206-250 중 어느 하나에 기술된 임의의 서열을 비롯한 당해의 임의의 변형 FVII와 같은 변형 FVII 폴리펩타이드는 마우스의 꼬리 정맥으로 주사를 놓을 수 있다. 그 다음, 주사 후 시점들(예컨대, 분, 시간 및 일 이상)마다 혈액 샘플을 채취하고, 혈청 또는 혈장을 비롯한(이에 국한되지 않는다) 신체 샘플에 존재하는 변형 FVII 폴리펩타이드의 수준을 ELSIA 또는 방사선면역측정법 등으로 특정 시점에서 모니터할 수 있다. FVII 폴리펩타이드의 주사 후에 다양한 시점에서의 혈액 샘플은 또한 실시예 9 및 14에 기술된 것과 같은 다양한 방법에 의해 응고 활성이 시험될 수도 있다. 이러한 종류의 약동학적 연구는 FVII 폴리펩타이드의 반감기, 제거율 및 안정성에 관한 정보를 제공하여, 응고촉진제로서 투여하기에 적합한 투여량을 결정하는데 도움을 줄 수 있다.
변형 FVII 폴리펩타이드, 예컨대 서열번호 18-43, 125-150 또는 206-250 중 어느 하나에 기술된 것과 같은 변형 FVII 폴리펩타이드는 혈우병 동물 모델을 사용하여 치료 효과를 시험할 수 있다. 비제한적인 한 예에 따르면, 마우스와 같은 동물 모델이 사용될 수 있다. 혈우병 마우스 모델은 당업계에서 이용할 수 있고, 변형 FVII 폴리펩타이드를 시험하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 항-FVIII 항체 주사에 의해 생산되는 혈우병 A 마우스 모델은 FVII 폴리펩타이드의 응고제 활성을 평가하는데 사용될 수 있다(예컨대, 실시예 8 및 14 참조, Tranholm et al., Blood (2003) 102: 3615-3620). 또한, 혈우병 B의 마우스 모델도 FVII 폴리펩타이드를 시험하는데 사용될 수 있다(Margaritis et al.(2004) J Clin Invest 113: 1025-1031). 출혈 장애의 비마우스 모델도 존재한다. FVII 폴리펩타이드 활성은 와파린 유도성 출혈 또는 말라가트란 유도성 출혈이 있는 래트(Diness et al.(1992) Thromb Res 67: 233-241, Elg et al.(2001) Thromb Res 101: 145-157) 및 헤파린 유도성 출혈이 있는 토끼(Chan et al.(2003) J Thromb Haemost 1: 760-765)에서 평가될 수 있다. 또한, 심한 출혈을 나타내는 근교배 혈우병 A, 혈우병 B 및 폰빌레브란트 질환 개를 FVII 폴리펩타이드를 이용한 비-사람 동물 연구에 사용할 수도 있다(Brinkhous et al.(1989) PNAS 86: 1382-1386). 또한, FVII 폴리펩타이드의 활성은 감마 조사 및 혈소판 항체의 사용의 조합에 의해 저혈소판증이 유도된 출혈 토끼 모델에서도 평가될 수 있다(Tranholm et al.(2003) Thromb Res 109: 217-223).
전신 출혈 장애가 있는 동물 외에, 상해 및 외상 모델도 FVII 폴리펩타이드의 활성을 평가하고, 이의 응고 치료제로서의 안전성 및 효능을 평가하는데 사용될 수 있다. 이러한 모델의 비제한적 예로는 토끼 관상동맥협착증 모델(Fatorutto et al.(2004) Can J Anaesth 51: 672-679), 돼지 V 등급 상해 모델(Lynn et al.(2002) J Trauma 52: 703-707), 돼지 V 등급 간 손상 모델(Martinowitz et al.(2001) J Trauma 50: 721-729) 및 돼지 대동맥절개술 모델(Sondeem et al.(2004) Shock 22: 163-168)을 포함한다.
3. 임상 분석법
FVII의 활성을 임상용으로 평가하는데 사용할 수 있는 분석법은 다수가 있다. 이러한 분석법으로는, 응고, 단백질 안정성 및 생체내 반감기의 평가, 및 표현형 분석법을 포함할 수 있다. 표현형 분석법 및 FVII 치료의 치료 효과를 평가하는 분석법은 FVII의 혈액 수준의 평가(예컨대, 체질량지수(BMI)에 대해 보정한, 투여전 및 투여 후의 시점들, 예컨대 1차 투여후, 최종 투여 직후 및 시점들 사이 등에서의 혈청 FVII의 측정), FVII 치료 후에 전술한 방법을 이용한 시험관내 혈액 응고 평가(예, PT 분석), 및 비변형 및/또는 야생형 FVII 또는 위약 치료 피검체 대비 경시적으로 증상의 호전을 비롯한 FVII 치료에 대한 표현형 반응을 포함한다. FVII 폴리펩타이드 치료를 받은 환자는 혈액 상실, 수혈 필요 및 헤모글로빈에 대한 모니터를 받을 수 있다. 환자는 통상적인 투여 또는 반복 투여의 일정 시간 동안 정기적인 모니터를 받거나, 출혈, 외상 또는 수술 처치와 같은 급성 사건에 대하여 투여 후에 모니터 받을 수 있다.
H. 제형화 및 투여
출혈 장애의 치료에 사용되는 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 제VII 인자 폴리펩타이드의 치료 유효량을 함유한다. FVII 폴리펩타이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 유도체의 유효 농도는 전신, 국부 또는 국소 투여에 적합한 약제학적 담체 또는 비히클과 혼합된다. 화합물은 선택된 장애를 치료하는데 효과적으로 양으로 함유된다. 조성물에 활성 화합물의 농도는 활성 화합물의 흡수, 불활성화, 배출 속도, 투여량 계획 및 투여되는 함량 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 기타 요인들에 따라 달라질 것이다.
당해의 화합물의 투여에 적합한 약제학적 담체 또는 비히클은 특정 투여 방식에 적합한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 담체를 포함한다. 또한, 당해의 FVII 폴리펩타이드의 치료학적 유효량을 포함하는 약제학적 조성물은 투여 직전에 멸균수 등에 의해 재구성되는 동결건조 분말로 제공될 수도 있다.
1. 제형화
변형 FVII를 함유하는 약제학적 조성물은 통상적인 임의의 방식에 따라 폴리펩타이드의 선택 양과 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 혼합하여 제형화할 수 있다. 담체 또는 부형제의 선택은 투여 직업의 기술 범위 안에 있고, 다수의 매개변수에 따라 달라질 수 있다. 그 예에는, 투여 방식(즉, 전신, 경구, 비강, 폐, 국소, 국부 또는 임의의 다른 방식) 및 치료되는 장애를 포함한다. 당해의 약제학적 조성물은 단일 투여량(직접) 투여용으로 또는 희석이나 기타 변형용으로 제형화될 수 있다. 제형들 중에 화합물의 농도는 투여 시에 의도한 치료에 효과적인 양을 전달하는데 효과적인 농도이다. 일반적으로, 조성물은 단일 투여량 투여용으로 제형화된다. 조성물을 제형화하기 위해, 화합물 또는 이의 혼합물의 중량 분획이 치료 병태가 경감되거나 호전되는 유효 농도로 선택 비히클에 용해, 현탁, 분산 또는 기타 방식으로 혼합된다.
당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 이중쇄 FVIIa 단백질로 피검체에게 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 변형 FVII 폴리펩타이드는 제형화 전에 당업계에 공지된 임의의 방법으로 활성화될 수 있다. 예를 들어, FVII는 이온교환 크로마토그래피에 의한 정제 동안 자가활성화를 일으킬 수 있다(Jurlander et al.(2001) Semin Thromb Hemost 27: 373-384). 또한, 변형 FVII 폴리펩타이드는 비드 상에 고정화된 FXa와의 항온처리(Kemball-Cook et al.(1998) J Biol Chem 273: 8516-8521)에 의해, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 방법(이하 실시예 3 참조)에 의해 활성화될 수 있다. 이러한 방법들에서 칼슘의 첨가는 변형 FVIIa 단백질의 완전 활성화 및 정확한 폴딩을 보장해준다. 또한, 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 단일쇄 단백질로서 투여용으로 제형화될 수 있다. 단일쇄 FVII 폴리펩타이드는 절단이 방지되도록 정제될 수 있다(예컨대, US6677440 참조). 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 단일쇄 및 이중쇄 형태가 자가활성화를 일으키지 않거나 제어하도록 매질을 적당히 선택함으로써 임의의 비율로 약제학적 조성물에 포함된다.
화합물은 미크론 형태 또는 다른 적당한 형태로 현탁될 수 있고, 또는 더욱 가용성인 활성 산물로 유도체화될 수 있다. 최종 혼합물의 형태는 의도된 투여 방식 및 선택된 담체 또는 비히클에 화합물의 용해도 등을 비롯한 다수의 요인에 따라 달라진다. 최종 혼합물은 용액, 현탁액, 유탁액 및 이러한 기타 혼합물이고, 비수성 또는 수성 혼합물, 크림, 젤, 연고, 유탁액, 용액, 엘릭시르, 로션, 현탁액, 팅크제, 페이스트, 발포제, 에어로졸, 관주제, 스프레이, 좌약, 붕대, 또는 전신, 국부 또는 국소 투여용으로 적당한 임의의 다른 제형으로 제형화될 수 있다. 근육내, 비경구 또는 관절내 투여와 같은 국소 내부 투여 시에는, 폴리펩타이드를 등장성 식염수와 같은 수성계 매질에 현탁 용액으로서 제형화하거나, 내부 투여용인 생체화합성 지지체 또는 생체접착제와 조합한다. 유효 농도는 표적 병태를 호전시키기에 충분한 농도로, 실험적으로 측정될 수 있다. 조성물을 제형화하기 위해 화합물의 중량 분획은 표적 병태를 경감 또는 호전시킬 정도의 유효 농도로, 선택 비히클 내에 용해, 현탁, 분산 또는 다른 방식으로 혼합된다.
일반적으로, 약제학적으로 허용되는 조성물은 동물과 사람에 사용하기 위해 공인된 약전에 따라 제조하거나, 또는 규제기구의 승인을 고려하여 제조한다. 약제학적 조성물은 이소폼과 함께 투여되는 희석제, 보강제, 부형제 또는 비히클과 같은 담체를 포함할 수 있다. 이러한 약제학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 석유계, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일을 비롯한 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유 및 참깨유 등일 수 있다. 물은 약제학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 전형적인 담체이다. 또한, 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액도 액체 담체로서, 특히 주사 용액용 담체로서 이용될 수 있다. 조성물은 활성 성분과 함께 다음과 같은 성분을 포함할 수 있다: 락토스, 슈크로스, 디칼슘 포스페이트 또는 카르복시메틸셀룰로스와 같은 희석제; 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 및 탈크와 같은 윤활제; 및 결합제, 예컨대 전분, 천연 검, 예를 들어 아카시아 젤라틴, 글루코스, 몰라세스, 폴리비닐피롤리딘, 셀룰로스 및 이의 유도체, 포비돈, 크로스포비돈 및 기타 당업자에게 공지된 결합제. 적당한 약제학적 부형제로는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물 및 에탄올을 포함한다. 필요하다면, 조성물은 소량의 함습제 또는 유화제, 또는 pH 완충제, 예컨대 아세테이트, 소듐 시트레이트, 사이클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트, 트리에탄올아민 올레이트 및 이러한 기타 제제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 정제, 환제, 캡슐, 분말 형태 및 지속방출 제형일 수 있다. 또한, 치료 화합물과 적당한 분말 기제, 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하는, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 등의 캡슐 및 카트리지가 제형화될 수 있다. 조성물은 통상의 결합제 및 담체, 예컨대 트리글리세라이트를 이용하여 좌약으로 제형화될 수 있다. 경구 제형은 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 및 이러한 기타 제제 등의 표준 담체를 포함할 수 있다. 경구 투여용 제제는 또한 프로테아제 저해제, 예컨대 바우만-버크(Bowman-Birk) 저해제, 접합된 바우만-버크 저해제, 아프로티닌 및 카모스태트(camostat)와 함께 제형화되는 것이 적당할 수 있다. 적당한 약제학적 담체의 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 정제된 형태인 화합물의 치료학적 유효량과 피검체 또는 환자에게 적당한 투여 형태를 제공하기 위한 담체의 적당한 양을 함유할 수 있다.
제형은 투여 방식에 적합해야 한다. 예를 들어, 변형 FVII는 주사(예컨대, 일시 주사 또는 연속 주사)에 의한 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사성 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유탁액과 같은 형태일 수 있다. 또한, 멸균 주사성 제제는 1,4-부탄디올 중의 용액과 같은 비독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사성 용액 또는 현탁액일 수 있다. 멸균된 고정유는 통상적으로 용매 또는 현탁용 매질로서 이용되고 있다. 이러한 목적으로, 임의의 상표의 고정유가 이용될 수 있으며, 그 예로는 합성 모노- 및 디-글리세라이드, 지방산(예컨대, 올레산), 자연발생의 식물유, 예컨대 참깨유, 코코넛유, 땅콩유, 면실유 및 기타 오일, 또는 합성 지방산 비히클, 예컨대 에틸 올레이트 등을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 완충액, 보존제, 항산화제 및 적당한 성분은 필요하면 첨가될 수 있거나, 또는 제형에 포함될 수 있다.
폴리펩타이드는 조성물에 유일한 약제학적 활성 성분으로 제형화되거나 또는 다른 활성 성분과 조합될 수 있다. 폴리펩타이드는 항체와 같은 표적화제에 접합 등에 의해 전달을 위해 표적화할 수 있다. 리포좀 현탁액, 예컨대 조직 표적화된 리포좀도 약제학적으로 허용되는 담체로서 적합할 수 있다. 이는 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 리포좀 제형은 미국 특허 4,522,811에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 또한, 리포좀 전달은 피브로넥틴으로 변형된 리포좀 및 콜라겐 젤과 같은 약제학적 기질을 포함하는 서방형 제형을 포함할 수 있다(예컨대, Weiner et al.(1985) J Pharm Sci. 74(9): 922-5 참조). 당해의 조성물은 추가로 전달을 용이하게 위한 하나 이상의 보강제, 예컨대 불활성 담체, 또는 콜로이드성 분산계(이에 국한되지 않는다)를 포함할 수 있다. 이러한 불활성 담체의 대표적인 비제한적 예는 물, 이소프로필 알콜, 기체성 플루오로카본, 에틸 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 프로필렌글리콜, 겔생산성 물질, 스테아릴 알콜, 스테아르산, 스퍼마세티, 소르비탄 모노올레이트, 메틸셀룰로스 뿐만 아니라 2종 이상의 적당한 조합물 중에서 선택될 수 있다. 활성 화합물은 치료받는 피검체에 바람직하지 않은 부작용을 일으킴이 없이 치료학적으로 유용한 효과를 발휘하기에 충분한 양으로 약제학적으로 허용되는 담체에 포함된다. 치료학적 유효 농도는 본원에 제공된 분석법과 같은 공지된 시험관내 및 생체내계에서 화합물을 시험하여 실험적으로 측정할 수 있다.
a. 투여량
투여되는 치료제의 정확한 양 또는 용량은 특정 FVII 폴리펩타이드, 투여 경로 및 다른 고려사항, 예컨대 질환의 중증도 및 피검체의 체중 및 일반적인 상태에 따라 달라진다. 치료제의 국소 투여는 일반적으로 임의의 전신 투여방식보다 적은 투여량을 요구할 것이지만, 몇몇 경우에 치료제의 국소 농도는 전신 투여 시에 안전성이 달성될 수 있는 농도보다 국소 투여 후의 농도가 더 높을 수도 있다. 필요하다면, 특정 투여량 및 기간, 그리고 치료 프로토콜은 실험적으로 결정되거나 추정될 수 있다. 예를 들어, 재조합 및 천연 FVII 폴리펩타이드이 예시적 용량은 적당한 투여량을 결정하기 위한 출발점으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, rFVIIa로 활성화된 재조합 FVII(rFVIIa) 폴리펩타이드, Novoseven®은 출혈 에피소드를 실험하고 있는 혈우병 A 또는 혈우병 B 환자들에게, 적어도 2㎍/ml의 혈행 유효 수준을 달성하는, 일시 주입에 의한 90㎍/kg 투여량으로 2 내지 5분 동안 투여했다. 이 용량은 지혈이 달성될 때까지 매 2시간마다 반복한다. 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 상기 재조합 FVII에 비해 감소된 투여 함량 및/또는 빈도에서도 효과적일 수 있다. 예를 들어, 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 80㎍/kg, 70㎍/kg, 60㎍/kg, 50㎍/kg, 40㎍/kg, 30㎍/kg, 20㎍/kg, 15㎍/kg 또는 그 이하의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 양태에 따르면, 투여량은 100㎍/kg, 110㎍/kg, 120㎍/kg 또는 그 이상과 같은 고 투여량일 수 있다. 치료 기간 및 주사 간격은 출혈의 중증도 및 치료에 대한 환자의 반응에 따라 달라질 것이며, 이에 따라서 조정할 수 있다. 비변형 FVII에 비해 변형 FVII의 활성 수준 및 반감기와 같은 요인들은 투여량 결정시에 고려할 수 있다. 특정 투여량 및 방법은 실험적으로 결정할 수 있다.
다른 예에 따르면, rFVIIa로 활성화되는 재조합 FVII(rFVIIa) 폴리펩타이드, Novoseven®은 출혈 에피소드가 일어난 적이 있는 선천성 FVII 결핍증 환자에게, 일시 주입으로 15 내지 30㎍/kg 투여량으로 2 내지 5분 동안 투여했다. 이 용량은 지혈이 달성될 때까지 매 4 내지 6시간마다 반복한다. 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 상기 재조합 FVII에 비해 감소된 투여 함량 및/또는 빈도에서도 효과적일 수 있다. 예를 들어, 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 20㎍/kg, 15㎍/kg, 10㎍/kg, 5㎍/kg, 3㎍/kg 또는 그 이하의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 예에 따르면, 투여량은 35㎍/kg, 40㎍/kg, 45㎍/kg 또는 그 이상과 같은 고 투여량일 수 있다. 치료 기간 및 주사 간격은 출혈의 중증도 및 치료에 대한 환자의 반응에 따라 달라질 것이며, 이에 따라서 조정할 수 있다. 비변형 FVII에 비해 변형 FVII의 활성 수준 및 반감기와 같은 요인들은 투여량 결정시에 고려할 수 있다. 예를 들어, 비변형 FVII 폴리펩타이드보다 반감기가 긴 변형 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드보다 낮은 용량 및/또는 적은 빈도로 투여할 수 있다. 이와 마찬가지로, 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 응고제 활성이 증가된 변형 FVII 폴리펩타이드를 이용한 치료 효과에 필요한 투여량은 빈도와 함량이 감소될 수 있다. 구체적인 투여량과 요법은 당업자에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.
b. 투여형
약제학적 치료 활성 화합물 및 이의 유도체는 일반적으로 단위 투여형 또는 다중 투여형으로 제형화되고 투여된다. 제형은 사람과 동물에게 투여형으로 투여하기 위해 준비될 수 있으며, 그 예로는 화합물이나 이의 약제학적으로 허용되는 유도체를 적당한 함량으로 함유하는 정제, 캡슐, 환제, 분말, 과립, 멸균 비경구 용액 또는 현탁액, 경구 용액 또는 현탁액 및 수중유 유탁액이 포함되나, 이에 국한되지 않는다. 각 단위 용량은 필요한 약제학적 담체, 비히클 또는 희석제와 함께 목적한 치료 효과를 나타내기에 충분한 소정의 함량의 치료학적 활성 화합물을 함유한다. 단위 용량 형태의 예로는 앰플 및 주사기, 개별 포장된 정제 또는 캡슐을 포함한다. 일부 예에서, 단위 용량은 투여전에 재구성되는 동결건조 분말로 제공된다. 예를 들어, FVII 폴리펩타이드는 주사를 위한 단일 용량 용액으로 제조하기 위해 적당한 용액에 의해 재구성되는 동결건조 분말로서 제공될 수 있다. 일부 양태에 따르면, 동결건조된 분말은 FVII 폴리펩타이드와 추가 성분, 예컨대 염을 함유할 수 있으며, 이에 따라 멸균 증류수로 재구성 시에 완충 용액 또는 식염수 용액 중의 FVII 폴리펩타이드로 수득된다. 단위 용량 형태는 분획 또는 이의 다중 형태로 투여될 수 있다. 다중 용량 형태는 분리된 단위 용량 형태로 투여할 단일 용기 내에 포장된 복수의 동일한 단위 투여형이다. 다중 용량 형태의 예로는 바이엘, 정제 또는 캡슐의 병 또는 파인트 또는 갤론 병이 포함된다. 따라서, 다중 용량 형태는 포장으로 분리되어 있지 않은 다중 단위 용량이다.
2. 변형 FVII 폴리펩타이드의 투여
당해의 FVII 폴리펩타이드(즉, 활성 화합물)는 체액 또는 다른 조직 샘플과 같은 혼합물을 FVII 폴리펩타이드와 접촉시켜 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 투여될 수 있다. 예를 들어, 생체외로 화합물을 투여할 때, 피검체 유래의 체액 또는 조직 샘플은 튜브 또는 필터에 코팅된 FVII 폴리펩타이드, 예컨대 바이패스 기구 중의 튜브 또는 필터 등과 접촉될 수 있다. 생체내 투여될 때, 활성 화합물은 액체, 반액체 또는 고체 형태로 임의의 적당한 경로, 예컨대 경구, 비강, 폐, 비경구, 정맥내, 피내, 피하, 관절내, 두개골내, 안내, 뇌실내, 경막내, 근육내, 복강내, 기관내 또는 국부로 투여할 수 있을 뿐만 아니라 임의의 2종 이상의 조합물로 투여될 수 있고, 각 투여 경로에 적합한 방식으로 제형화된다. 변형 FVII 폴리펩타이드는 1회 또는 1회 이상, 예컨대 2회, 3회, 4회 또는 치료 효과를 달성하는데 필요한 임의의 횟수로 투여될 수 있다. 다중 투여는 임의의 경로 또는 경로의 조합을 통해 실시할 수 있고, 매시간마다, 매 2시간마다, 매 3시간마다, 매 4시간마다 또는 그 이상마다 투여될 수 있다.
가장 적합한 투여 경로는 치료받는 질환 상태, 예컨대 출혈 장애의 위치에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, FVII 폴리펩타이드는 투여(주입) 시간을 약 2 내지 5분으로 하여 정맥내 일시 주사로 투여될 것이다. 다른 예에 따르면, FVII의 바람직한 혈액 수준은 혈장 수준에 의해 확인되는 바와 같이 활성제의 연속 주입에 의해 유지될 수 있다. 물론, 주치의는 독성이나 골수, 간, 신장 기능이상 등으로 인해 치료를 종결하거나, 중단하거나 또는 낮은 투여량으로 조정하는 방법과 시기를 알고 있을 것이다. 이와 반대로, 주치의는 임상 반응이 적당하지 않다면(독성 부작용은 배제), 치료 수준을 높이는 방법 및 시기도 알고 있을 것이다. 다른 예로서, 출혈 장애의 위치는 FVII 제형이 대체 경로를 통해 투여되고 있음을 시사할 수도 있다. 예를 들어, 국소 투여, 예컨대 뇌 내로의 투여(예컨대, 뇌실내)는 뇌에 출혈이 있는 환자에게 실시될 수 있다. 이와 마찬가지로, 관절에 출혈이 있을 때의 치료는 치료제를 관절 내로 주사하는 국소 투여(즉, 관절내, 정맥내 또는 피하 방식)가 이용될 수 있다. 다른 예에 따르면, 치료제의 피부로의 국부 투여, 예컨대 크림, 젤 또는 연고로 제형화된 경우의 투여, 또는 흡입에 의한 폐로의 투여 또는 기관지내로의 투여는 출혈이 이 부위에 국한적일 때 적당할 것이다.
변형 FVII 폴리펩타이드가 데포(depot) 제제로 제형화되어야 하는 경우, 지속성 제형이 이식에 의해(예컨대, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예컨대 치료 화합물은 적합한 중합체 재료 또는 소수성 재료(예컨대, 허용되는 오일 중의 유탁액으로서) 또는 이온교환수지로 제형화되거나, 또는 난용성 유도체, 예컨대 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.
필요하다면, 조성물은 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형을 포함할 수 있는 패키지, 키트 또는 디스펜서 기구에 제공될 수 있다. 예를 들어, 패키지는 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 블리스터 팩을 함유한다. 팩 또는 디스펜서 기구는 투여 지침서를 동반할 수 있다. 활성제를 함유하는 조성물은 패키징재, 당해의 제제 및 이 제제가 제공되는 장애를 나타내는 라벨을 포함하는 제조품으로 포장될 수 있다.
3. 변형 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 투여(유전자 요법)
또한, 본 발명은 유전자 요법에 적합한 변형 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터 및 변형 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 조성물을 제공한다. 단백질 전달 대신에, 핵산은 생체내로, 예컨대 전신 또는 다른 경로로, 또는 생체외로, 예컨대 림프구를 비롯한 세포의 분리, 여기에 핵산의 도입 및 숙주 또는 화합성 수용체로의 재도입 등에 의해 투여될 수 있다.
변형 FVII 폴리펩타이드는 핵산 분자의 발현에 의해 세포 및 조직으로 전달될 수 있다. 변형 FVII 폴리펩타이드는 생체외 기술 및 직접 생체내 발현을 비롯해서, 변형 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자로 투여될 수 있다. 핵산은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 세포 및 조직으로 전달될 수 있다. 분리된 핵산 서열은 추가 조작을 위해 벡터에 혼입시킬 수 있다. 본 명세서에 사용된, 벡터(또는 플라스미드)는 발현 또는 복제를 위해 이종 DNA를 세포내로 도입시키는데 사용되는 분리된 구성요소를 의미한다. 이러한 비히클의 선택 및 사용은 당업자의 기술범위 내에 포함된다.
암호화 핵산 분자의 발현에 의한 변형 FVII 폴리펩타이드의 투여 방법은 재조합 벡터의 투여를 포함한다. 이 벡터는 복제 오리진의 부가 등에 의한 에피솜성을 유지하도록 설계되거나, 또는 세포의 염색체 내로 통합되도록 설계될 수 있다. 또한, 변형 FVII 폴리펩타이드는 비바이러스성 벡터를 이용하는 생체외 유전자 발현 요법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 변형 FVII 폴리펩타이드를 발현하도록 유전자조작될 수 있으며, 예컨대 이는 변형 FVII 폴리펩타이드 암호화 핵산을 조절 서열에 작동가능하게 연결시켜 게놈 위치에 통합시키거나 또는 상기 핵산을 게놈 위치의 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 통합시켜 실시할 수 있다. 이러한 세포는 그 다음 치료를 요하는 환자와 같은 피검체에게 국소 투여되거나 또는 전신 투여될 수 있다.
바이러스 벡터는 예컨대 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스(AAV), 폭스바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 및 유전자요법에 이용할 수 있도록 설계된 기타 형태를 포함한다. 벡터는 에피솜 형태를 유지할 수 있거나, 또는 치료받는 피검체의 염색체 내로 통합될 수 있다. 변형 FVII 폴리펩타이드는 치료를 요하는 피검체에게 투여되는 바이러스에 의해 발현될 수 있다. 유전자요법에 적합한 바이러스 벡터로는 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 백시니아 바이러스 및 앞에서 언급한 기타 바이러스를 포함한다. 예를 들어, 아데노바이러스 발현 기술은 당업계에 공지되어 있고, 아데노바이러스 생산 및 투여 방법도 잘 알려져 있다. 아데노바이러스 혈청형은 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(ATCC, Rockville, MD) 등에서 입수용이하다. 아데노바이러스는 생체외에서 사용될 수 있고, 예를 들어, 세포는 치료를 요하는 환자로부터 분리해서, 변형 FVII 폴리펩타이드를 발현하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입시킨다. 형질도입된 세포는 적당한 배양 기간 후에 피검체에게 국소적으로 및/또는 전신으로 투여한다. 또는, 변형 FVII 폴리펩타이드 발현성 아데노바이러스 입자는 분리하여, 피검체의 질환 또는 병태를 예방, 치료 또는 호전시키기에 치료학적으로 효과적인 양으로 전달하기 위해 약제학적으로 허용되는 담체 중에 제형화한다. 일반적으로, 아데노바이러스 입자는 피검체 체중 1kg당 입자 1 내지 1014개 범위, 일반적으로 피검체 체중 1kg당 입자 106 또는 108개 내지 1012개의 범위의 용량으로 전달한다. 일부 상황에서는, 핵산 급원에 세포를 표적화하는 제제, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, FVII는 특정 세포 유형으로 전달되도록 표적화될 수 있다. 예를 들어, FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 아데노바이러스 벡터는 간세포와 같이 비분열성 세포에서 안정한 발현용으로 사용될 수 있다(Margaritis et al.(2004) J Clin Invest 113: 1025-1031). 다른 예에 따르면, FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터는 후속 전달을 위해 분리된 세포 내로 도입될 수 있다. FVII의 발현 및 전달을 위한 추가의 세포 유형으로는 섬유아세포 및 내피 세포를 포함할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.
핵산 분자는 인공 염색체 및 다른 비바이러스성 벡터 내로 도입될 수 있다. 인공 염색체, 예컨대 ACES(Lindenbaum et al.(2004) Nucleic Acids Res. 32(21):e172 참조)는 이소폼을 암호화하여 발현하도록 유전자조작될 수 있다. 간략히 설명하면, 포유동물 인공 염색체(MAC)는 유전자 정보의 대형 페이로드(payload)를 세포 내로 자율 복제성 비통합 형식으로 도입시키는 수단을 제공한다. MAC 중에서 독특한, 포유동물 위성 DNA 기반의 인공 염색체 발현(ACE)은 여러 종의 세포주에서 재현가능하게 새로 제조될 수 있고, 숙주 세포의 염색체로부터 용이하게 정제될 수 있다. 정제된 포유동물 ACE는 그 다음 다양한 수용체 세포주로 재도입될 수 있고, 여기서 ACE계를 사용한 선택 압력의 부재 하에 장기간 동안 안정하게 유지되었다. 이러한 시도를 사용하여, 하나 또는 두개의 유전자 표적의 특이적인 부하가 LMTK(-) 및 CHO 세포에서 달성되었다.
변형 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 도입시키는 또 다른 방법은 효모 인공 염색체(YAC) 내에 클로닝된 완전 아데노바이러스 게놈(Ad2; Ketner et al.(1994) PNAS 91: 6186-6190) 및 YAC 클론 내의 특정 영역을 표적화하는 아데노바이러스 서열, 당해의 유전자를 위한 발현 카세트 및 양성 및 음성 선택성 마커를 함유하는 플라스미드를 출발 물질로 사용하는 효모의 2단계 유전자 교체 기술이다. YAC는 큰 유전자의 혼입을 허용하기 때문에 특히 유익하다. 이러한 시도는 포유동물 세포 또는 전체 동물로 유전자 전이를 하기 위해 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드 중 임의의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 보유하는 아데노바이러스 기반 벡터를 작제하는데 사용될 수 있다.
핵산은 세균 세포, 특히 약독화된 세균과 같은 세포로 도입되거나 또는 바이러스 벡터로 도입되거나, 또는 리포좀과 같은 비히클에 캡슐화될 수 있다. 예를 들어, 리포좀이 이용될 때에는, 세포내이입과 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질이 표적화 및/또는 흡수를 촉진하는데 사용될 수 있고, 그 예로는 특정 세포 종류에 지향성인 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 사이클링에서 내재화를 일으키는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국재화를 표적화하고 세포내 반감기를 증강시키는 단백질이 있다.
생체외 및 생체내 방법 시, 변형 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자는 적당한 공여체 또는 치료받는 피검체 유래인 세포 내로 도입된다. 치료 목적으로 핵산이 도입될 수 있는 세포로는, 예컨대 치료될 질환 또는 병태에 적당한 임의의 바람직한 입수용이한 세포 종류를 포함하며, 그 예로는 상피 세포, 내피 세포, 각질세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; 혈액 세포, 예컨대 T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거대핵세포, 과립세포; 다양한 줄기 또는 선조 세포, 구체적으로 조혈 줄기 또는 선조 세포, 예컨대 골수, 제대혈, 말초혈액, 태아간 및 기타 급원에서 수득된 줄기 세포를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
생체외 치료 시, 치료받는 피검체와 화합성인 공여체 유래의 세포 또는 세포를 치료해야 하는 피검체 유래의 세포를 분리하고, 이와 같이 분리된 세포에 핵산을 도입시킨 뒤, 변형된 세포를 피검체에 투여한다. 치료는 직접 투여, 예컨대 다공성 막에 캡슐화하여 환자에게 이식하는 투여(예컨대, 미국 특허 4,892,538 및 5,283,187 참조, 각각 전문이 참고인용됨)를 포함한다. 핵산을 시험관내에서 포유동물 세포 내로 전이시키기에 적합한 기술에는 리포좀 및 양이온성 지질(예, DOTMA, DOPE 및 DC-Chol) 전기침투, 미량주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란 및 인산칼슘 침전법의 사용을 포함한다. DNA 전달 방법은 생체내에서 변형 FVII 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 핵산의 리포좀 전달 및 나출형 DNA 전달, 예컨대 전기침투, 초음파 및 인산칼슘 전달 등과 같은 국소 및 전신 전달을 포함한다. 다른 기술로는 마량주사, 세포융합, 염색체 매개의 유전자 전이, 마이크로셀 매개의 유전자 전이 및 스페로플라스트 융합을 포함한다.
변형 FVII 폴리펩타이드의 생체내 발현은 추가 분자를 발현시키기 위해 연결될 수 있다. 예를 들어, 변형 FVII 폴리펩타이드의 발현은 유전자조작된 바이러스에서와 같은 세포독성 산물의 발현과 연결될 수 있고, 또는 세포독성 바이러스에서 발현될 수 있다. 이러한 바이러스는 치료 효과의 표적인 특정 세포 종류에 대해 표적화될 수 있다. 발현된 변형 FVII 폴리펩타이드는 바이러스의 세포독성을 증강시키기 위해 사용될 수 있다.
변형 FVII 폴리펩타이드의 생체내 발현은 세포 특이적 또는 조직 특이적 프로모터와 같은 특정 조절 서열에 변형 FVII 폴리펩타이드 암호화 핵산 분자를 작동가능하게 결합시키는 것을 포함할 수 있다. 또한, 변형 FVII 폴리펩타이드는 표적 세포 종류 및/또는 조직에서 특이적으로 감염 및/또는 복제되는 벡터로부터 발현될 수도 있다. 변형 FVII 폴리펩타이드 발현을 임의로 조절하기 위해 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 조절성 발현계의 예는 독시사이클린-유도성 유전자 발현계로서, 재조합 FVII 발현을 조절하는데 사용된 바 있다(Srour et al.(2003) Thromb Haemost. 90(3): 398-405).
나출형 핵산으로서 또는 벡터, 인공 염색체, 리포좀 및 다른 비히클 중의 핵산 분자는 전신 투여, 국부 투여, 국소 투여 및 다른 투여 경로에 의해 피검체에게 투여될 수 있다. 전신 및 생체내 투여 시에, 핵산 분자 또는 핵산 분자를 함유하는 비히클은 세포에 대해 표적화될 수 있다.
또한, 투여는 일반적으로 세포 또는 조직을 표적으로 하는 세포 또는 벡터의 투여 등에 의해 직접적일 수 있다. 예를 들어, 종양 세포 및 증식성 세포는 변형 FVII 폴리펩타이드의 생체내 발현을 위해 표적화된 세포일 수 있다. 또한, 변형 FVII 폴리펩타이드의 생체내 발현에 사용되는 세포는 환자 자신의 세포를 포함한다. 이러한 세포는 환자로부터 분리한 후, 변형 FVII 폴리펩타이드의 발현을 위한 핵산을 도입시키고, 그 다음 주사 또는 접목 등으로 환자에게 투여한다.
I. 치료 용도
당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 재조합 FVII가 이용되는 임의의 병태를 치료하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 치료는 응고의 증가, 예컨대 지혈 반응의 증가가 필요한 경우를 포함한다. 변형 FVII 폴리펩타이드는 단독으로 또는 다른 제제와 함께 치료 활성을 나타낸다. 당해의 변형 폴리펩타이드는 치료 활성을 유지하지만 변형된 성질, 특히 TFPI에 대한 증가된 내성, AT-III에 대한 증가된 내성, 증가된 촉매 활성, 증가된 반감기 및/또는 활성화된 혈소판에 대한 증가된 결합성 및/또는 친화도를 나타내도록 설계한다. 이와 같은 변형된 성질은 예컨대 변형 FVII 폴리펩타이드의 응고제 활성 증가로 인해 폴리펩타이드의 치료 효과를 향상시킬 수 있다. 본 섹션은 예시적인 투여 방법 및 용도를 제공한다. 여기에 기술되는 치료법은 예시적이며 변형 FVII 폴리펩타이드의 이용범위를 제한하지 않는다.
당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 FVII가 이용되는 진단 방법뿐만 아니라 다양한 치료 방법에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 이하에 설명되고 열거된 생리학적 및 의학적 병태의 치료 방법을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 동일한 효과를 달성하는 투여량 저하를 비롯하여, 야생형 FVII 대비 생체내 활성 및 치료 효과의 향상, 및 투여 빈도의 감소, 부작용 감소 및 치료 효과의 증가와 같은 기타 투여 및 치료 효과의 향상을 나타낼 수 있다. 물론 변형 FVII 폴리펩타이드는 FVII 자이모겐(즉, 단일쇄 형태)로 투여될 수 있지만, 일반적으로 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 자가활성화 또는 정제 중과 같은 다른 응고 인자에 의한 활성화 등을 거친 후의 활성화된 이중쇄 형태로 투여한다.
특히, 변형 FVII 폴리펩타이드는 FVI가 치료에 사용되어온 치료 방법들에 사용하고자 한다. 이러한 방법으로는, 혈액 응고 장애, 혈액병, 지혈 장애, 혈우병, 예컨대 혈우병 A, 혈우병 B 및 제VII 인자 결핍증, 후천적 혈액 장애, 예컨대 간 질환에 의해 유발된 후천적 제VII 인자 결핍증 등과 같은 질환 및 장애의 치료 방법을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 또한, 변형 FVII 폴리펩타이드는 추가의 출혈 질환 및 장애, 예컨대 비제한적으로 혈소판감소증(예, 화학치료 요법 등으로 인한), 폰빌레브란트 질환, 유전성 혈소판 장애(예, 저장 푸울 병, 예컨대 체디악-히가시(Chediak-Higashi) 및 헤르만스키-푸들락(Hermansky-Pudlak) 증후군, 트롬복산 A2 기능이상, 글란즈만(Glanzmann) 혈소판무력증 및 버나드-소울리에 증후군), 용혈요독증후군, 유전출혈모세혈관확장증, 랑뒤-오슬러-웨버 증후군이라고도 함, 알레르기성 자색반병(헤노흐 쉔라인 자색반병) 및 파종혈관내응고 등의 치료에도 사용될 수 있다.
일부 양태에서, FVII 폴리펩타이드에 의해 치료되는 출혈은 뇌, 내이 구역, 눈, 간, 폐, 종양 조직, 위장관과 같은 기관에서 일어난다. 다른 양태에서, 출혈은 출혈성 위염 및 과다 월경 출혈과 같이 광범위하다. 혈우병 A 및 B와 같은 출혈 장애가 있는 환자는 종종 수술이나 외상 중에 출혈 합병증의 위험이 있다. 이러한 출혈은 급성 혈관절증(관절의 출혈), 만성 혈우병 관절병증, 혈종(예, 근육, 복막뒤, 설하 및 인두뒤), 혈뇨(신장관 유래의 출혈), 중추신경계 출혈, 위장 출혈(예, UGI 출혈) 및 뇌출혈로 확인될 수 있고, 이 역시 변형 FVII 폴리펩타이드에 의해 치료될 수 있다. 또한, 수술(예, 간절제술) 또는 발치와 관련된 모든 출혈은 변형 FVII 폴리펩타이드에 의해 치료될 수 있다. 한 양태에서, 변형 FVII 폴리펩타이드는 피검체의 외상 또는 수술, 또는 혈소판의 수나 활성의 저하로 인한 출혈 에피소드를 치료하는데 사용될 수 있다. 수술을 받은 환자에 대한 예시적 방법은 출혈을 방지하는 치료 및 심장 수술, 혈관성형술, 폐수술, 복부 수술, 척추 수술, 뇌수술, 혈관 수술, 치아 수술 또는 기관이식수술, 예컨대 골수, 심장, 폐, 췌장 또는 간의 이식 등과 같은 수술 전, 수술 중 또는 수술 후의 치료를 포함한다.
변형 FVII 폴리펩타이드에 의한 질환 및 병태의 치료는 본 명세서에 기술된 적당한 제형을 이용한 임의의 적당한 투여 경로에 의해 달성될 수 있고, 그 예로는 주사, 폐, 구강 및 경피 투여를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 치료는 일반적으로 정맥내 일시 투여로 실시된다.
필요하다면, 특정 투여량 및 기간과 치료 프로토콜은 실험적으로 측정되거나 추정될 수 있다. 예를 들어, 재조합 FVII 폴리펩타이드 및 천연 FVII 폴리펩타이드의 예시적 용량은 적당한 투여량을 측정하기 위한 출발점으로써 사용될 수 있다. 예를 들어, rFVIIa로 활성화된 재조합 FVII(rFVIIa) 폴리펩타이드, Novoseven®은 출혈 에피소드를 경험한 적이 있는 혈우병 A 또는 혈우병 B 환자들에게, 적어도 2㎍/ml의 혈행 유효 수준을 달성하는 일시 주입에 의해 90㎍/kg 투여량으로 2 내지 5분 동안 투여했고 평균 반감기는 2.7시간이었다. 이 용량은 지혈이 달성될 때까지 매 2시간마다 반복한다. TFPI에 대한 내성 증가, AT-III에 대한 내성 증가, 촉매 활성 증가, 반감기 증가 및 활성화된 혈소판에 대한 결합성 및/또는 친화도 증가로 인한 응고제 활성 증가를 나타내는 변형 FVII 폴리펩타이드는 상기 재조합 FVII에 비해 감소된 투여 함량 및/또는 빈도에서도 효과적일 수 있다. 야생형 또는 비변형 FVII 폴리펩타이드의 투여량은 변형 FVII 폴리펩타이드의 투여량을 결정하기 위한 지침으로 사용될 수 있다. 이러한 결정을 실시하는데 있어서, 비변형 FVII 대비 변형 FVII의 활성 및 반감기 수준과 같은 인자들이 사용될 수 있다. 특정 투여량 및 요법은 실험적으로 결정될 수 있다.
투여량 수준 및 요법은 공지된 투여량 및 요법을 기초로 하여 결정할 수 있고, 필요하다면 변형 폴리펩타이드의 성질 변화를 기초로 하여 추정할 수 있고/있거나, 다양한 인자들을 기초로 하여 실험적으로 결정될 수 있다. 이러한 인자들은 개인의 체중, 일반적 건강, 연령, 이용된 특정 화합물의 활성, 성별, 식이, 투여 시간, 배출속도, 약물 조합, 질환의 중증도 및 경과, 및 질환에 대한 환자의 소인과 주치의의 판단을 포함한다. 활성 성분인 폴리펩타이드는 일반적으로 약제학적 유효 담체와 조합된다. 단일 투여형 또는 다회 투여형으로 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 호스트 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 수 있다.
FVII 폴리펩타이드가 혈액의 응고 시간에 미치는 영향은 당업계에 공지된 임의의 응고 시험을 통해 모니터할 수 있으며, 그 예로는 전혈 프로트롬빈 시간(PT), 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT), 활성화된 응고 시간(ACT), 재석회화 활성화된 응고 시간 또는 리-화이트(Lee-White) 응고 시간을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
환자 병태의 개선 후에는, 유지 용량의 화합물 또는 조성물이 필요에 따라 투여될 수 있고; 투여량, 투여형 또는 투여 빈도 또는 이의 조합은 변형될 수 있다. 일부 경우에, 피검체는 질환 증상의 임의의 재발 후에 장기간을 기준으로 한 간헐 치료 또는 계획 투여량을 기초로 한 간헐 치료를 필요로 할 수 있다. 다른 경우에는, 출혈, 외상 또는 수술 처치와 같은 급성 사건에 대한 반응으로 추가 투여를 필요로 할 수 있다.
다음은 FVII(FVIIa로서 투여됨)가 단독으로 또는 다른 제제와 함께 치료제로서 사용되었던 몇몇 예시적 병태를 설명한다.
1. 선천적 출혈 장애
a. 혈우병
선천적 혈우병은 혈장 중에 응고 인자가 감소된 수준이어서 응고 캐스캐이드의 붕괴와 반점 응고 시간의 증가로 이어지는 열성 혈액 장애이다. 모든 혈우병 증례의 약 85%를 차지하는 혈우병 A는 X 염색체 상의 제VIII 인자 유전자의 돌연변이(들)로 인해 야기되어 FVIII 단백질의 결핍 또는 기능이상으로 이어진다. 혈우병 B는 일반적으로 X 염색체에 존재하는 FIX 유전자의 점 돌연변이 또는 결실로 인한, 응고 인자 FIX의 결핍 또는 기능이상에 의해 유발된다. 혈우병 A의 세계적인 발생빈도는 남성 5000명당 약 1명이고, 혈우병 B는 남성 25000명당 1명 정도이다. 혈우병 A 및 B는 다시 경증, 중등증 및 중증으로 분류된다. 정상적으로 작용하는 제VIII 또는 IX 인자의 5% 내지 25%인 혈장 수준은 경증으로 분류되고, 1% 내지 5%는 중등증, 1% 미만은 중증으로 분류된다. FXI 결핍증이라고도 불리는 혈우병 C는 비교적 경미하고 드문 질환으로, 보통염색체 열성 방식으로 100000명당 약 1명이 걸린다.
혈우병 A 및 B는 다양한 방식으로 임상적으로 증명된다. 약간의 베임과 벗겨짐은 과다 출혈을 초래하지 않지만, 외상과 수술은 과다 출혈을 초래할 수 있다. 또한, 환자는 수많은 관절 및 근육 출혈과 쉬운 타박상을 겪을 수 있다. 혈관절증 또는 관절내 출혈은 혈우병의 주요 합병증 중 하나이며, 자발적으로 일어나거나 외상에 상응하여 일어날 수 있다. 무릎, 손목 및 발목과 같은 경첩 관절에서 가장 흔하게 나타난다. 엉덩이와 어깨는, 주위에 많은 근육조직을 보유하여 상해로부터 더욱 보호하는 절구공이 관절만큼 훨씬 적게 영향을 받는다. 출혈은 심한 급성 통증을 유발하고, 움직임을 제한하고, 윤활막 비대증을 비롯한 2차 합병증을 야기할 수 있다. 또한, 관절에 재발성 출혈은 만성 윤활막염을 유발할 수 있고, 이는 윤활막, 연골 및 뼈를 파괴하는 관절 손상을 유발할 수 있다. 생명을 위협하는 출혈, 예컨대 두개골내 출혈 및 중추신경계 출혈도 혈우병 피검체에 고통을 준다. 두개골내 출혈은 중증 혈우병 환자의 약 10%에서 일어나, 30% 치사율을 초래한다. 이에 반해, 혈우병 C는 훨씬 경미하다. 자발적 출혈은 드물게 관찰되고, 관절, 연조직 및 근육 내의 출혈도 드물다. 출혈은 일반적으로 신선 동결된 혈장(FFP)의 수혈, FXI 대치요법으로 일반적으로 치료되고, 또는 국부 치료, 외부 상처 또는 발치의 상기 치료, 피브린 글루로 치료된다.
혈우병 A 또는 B의 가장 일반적인 치료법은 환자에게 FVIII 또는 FIX를 투여하는 대치 요법이다. 제형은 혈장 유래 또는 재조합 산물로서 시중에서 입수용이하고, 재조합 단백질은 현재 치료받은 적이 없는 환자의 최상의 치료법이다. 이러한 치료법들은 매우 성공적일 수 있지만, 환자가 새로 투여된 제VIII 인자 또는 제IX 인자에 대한 저해제를 발생시킨다면 합병증이 일어난다. 저해제는 FVIII 또는 FIX와 반응하고 응고촉진 기능을 방해하는, 대부분 IgG4 서브클래스인 IgG 항체이다. 저해제는 중증 혈우병 A 환자 5명 중 약 1명에게 영향을 미친다. 대부분의 피검체는 유아기에 종종 이루어지는 제VIII 인자의 최초 주입 투여 직후에 상기 저해제를 발생시키나, 이후 생애에 발생시키는 피검체도 있다. 또한, 저해제는 경증 또는 중등증 혈우병 A 환자 15명 중 약 1명에게 영향을 미친다. 이러한 저해제들은 일반적으로 성인기에 발생하여, 투여된 외인성 FVIII를 파괴할 뿐만 아니라 내인성 FVIII도 파괴한다. 결과적으로, 경증 및 중등증의 혈우병이 중증이 된다. 임상적으로, 저해제에 의한 혈우병 A 환자는 FVIII에 다시 노출될 때 경험하는 기왕 반응의 강도에 따라 고 반응자와 저 반응자로 분류된다. 저해제는 혈우병 B 환자 100명 중 약 1명에게 영향을 미친다. 대부분의 증례에서, 저해제는 치료성 제IX 인자의 최초 주입 후에 발생하고 알레르기 반응을 동반할 수 있다.
당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 혈우병 환자, 특히 저해제에 의한 혈우병 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 재조합 FVIIa 제품(NovoSeven, Novo Nordisk)은 FVIII 또는 FIX에 대한 저해제에 의한 혈우병 A 또는 B 환자의 출혈 에피소드를 치료하고, FVIII 또는 FIX에 대한 저해제에 의한 혈우병 A 또는 B 환자의 수술 중재 또는 침습적 처치 시에 출혈을 예방하는 용도로 승인을 받고 라이센스를 받았다. rFVIIa에 의한 치료는 FVIIIa 및/또는 FIXa의 필요성을 피하면서 트롬빈 생성을 증강시킨다. 응고는 TF와 rFVIIa의 상호작용에 의해 상해 부위에서 개시되어, 초기 FX 활성화, 트롬빈 생성 및 혈소판 활성화를 야기한다. rFVIIa에 의한 완전한 응고는 TF 의존적 및 TF 독립적 기전에 의해 달성될 수 있고, 여기서 발생 트롬빈의 일부는, 인지질막과 저친화도 상호작용을 통해 활성화된 혈소판에 스스로 결합하는, rFVIIa 단독에 의해 활성화된 혈소판 상의 FX를 직접 활성화시켜 나타날 수 있다.
당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 혈우병의 치료 요법, 예컨대 수술적 중재 또는 침습적 처치 중에 출혈의 예방 및 출혈 에피소드의 치료 등에 사용될 수 있다. 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 TF/FVIIa 복합체 저해제, TFPI에 대한 내성 증가, AT-III에 대한 내성 증가, 촉매 활성 증가, 반감기 증가 및/또는 활성화된 혈소판에 대한 결합성 및/또는 친화도 증가를 제공한다. 따라서, FVII 폴리펩타이드는 TF 의존적 방식(예컨대, TFPI에 대한 증가된 내성을 통해) 및/또는 TF 독립적 방식(예컨대, 활성화된 혈소판에 대한 증가된 결합성 및/또는 친화도를 통해)으로 높은 응고제 활성을 나타낼 수 있다. 따라서, 변형 FVII 폴리펩타이드는 혈우병에 대한 더욱 활성적인 치료법을 전달하는데 사용될 수 있다. 변형 FVII 폴리펩타이드를 이용한 치료학적 개선의 예로는, 낮은 투여량, 투여 빈도의 저하, 부작용 감소 및 치료 효과의 증가를 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
변형 FVII 폴리펩타이드는 일반적으로 활성화된 FVII(FVIIa) 폴리펩타이드로 투여된다. 변형 FVII 폴리펩타이드는 동물 모델 등을 이용하여 치료 효과에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, 항체 유도성 혈우병 마우스 또는 혈우병에 대한 기타 공지된 임의의 질환 모델은 변형 FVII 폴리펩타이드로 치료할 수 있다. 질환 증상과 표현형의 진행을 모니터하여 변형 FVII 폴리펩타이드의 효과를 평가한다. 또한, 변형 FVII 폴리펩타이드는 임상 시험 등에서 피검체에게 투여되어, 비변형 FVII를 이용한 대조군 및/또는 위약 대조군 대비 생체내 효과를 평가할 수 있다.
b. FVII 결핍증
제VII 인자 결핍증은 500000명중 약 1명에서 영향을 미치는 보통염색체 열성 출혈 장애이다. FVII 결핍증은 임상적으로 경증, 중등증 및 중증일 수 있고, 경증 내지 중등증 결핍증은 수술 및 외상 후에 출혈 증가를 특징으로 한다. 중증 FVII 결핍증 환자(1% 미만의 FVII 활성)는 혈우병과 유사한 증상을 나타낸다. 예를 들어, FVII 결핍성 피검체는 관절 출혈, 자발적 코피, 위장 출혈, 요로 출혈을 일으키기 쉽다. 뇌내출혈과 근육 출혈도 보고되었고, 한편 여성은 중증 월경과다(심한 월경 출혈)를 나타낼 수 있다. 치료는 대치 요법으로 실시될 수 있다. 재조합 FVIIa 제품(NovoSeven®, Novo Nordisk)은 선천적 FVII 결핍증 환자의 출혈 에피소드를 치료하고, 선천적 FVII 결핍증 환자의 수술 중재 또는 침습적 처치 시에 출혈을 예방하는 용도로 승인을 받고 라이센스를 받았다. 따라서, 당해의 FVII 폴리펩타이드도 유사하게 사용될 수 있다. 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 FVII 결핍성 환자의 수술 중재 또는 침습적 처치 중에 출혈을 예방하고 출혈 에피소드를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 두개골내 출혈에 의한 중증 FVII 결핍증을 나타내는 신생아 환자는 응고를 실시하고 지혈을 유지하기 위해 정맥내 일시주사로 변형 FVII 폴리펩타이드 투여를 받을 수 있다. 일반적으로, 변형 FVII 폴리펩타이드는 활성화된 FVII(FVIIa) 폴리펩타이드로 투여된다.
c. 기타
기타 출혈 장애는 응고 촉진을 위해 당해의 FVII 폴리펩타이드로 치료될 수 있다. 제V 및 X 인자의 선천적 결핍증은 혈액 응고 시간의 증가로 나타나며, 아마도 FVII의 치료학적 용량의 투여에 의해 치료될 수 있을 것이다. 예를 들어, 제X 인자 결핍증 환자는 비장절제술과 관련된 출혈을 제어하기 위해 rFVIIa의 투여를 받을 수 있다(Boggio et al.(2001) Br J Haematol 112: 1074-1075). 폰빌레브란트 질환(vWD)과 관련이 있는 자발적 및 수술 관련 출혈 에피소드도 역시 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드를 사용하여 치료할 수 있다. vWD는 혈액 응고 단백질인 폰빌레브란트 인자(vWF)의 결손 또는 결핍에 의해 유발되는 출혈 장애이며, 집단의 1% 내지 2%가 나타내는 것으로 추정된다. 쉽게 vWD 타박상을 겪는 피검체는 재발성 코피, 발치후 출혈, 편도절제술 또는 기타 수술 후 출혈을 나타낸다. 변형 FVII 폴리펩타이드는 vWD 환자의 자발적 및 수술 관련 출혈을 호전시키는데 사용될 수 있다(von Depka et al.(2006) Blood Coagul Fibrin 17: 311-316). 다른 혈소판 관련 출혈 장애, 예컨대 글란즈만 혈소판무력증 및 헤르만스키-푸들락 증후군 등도 내인성 응고 활성의 감소와 관련이 있다. 혈소판 관련 출혈 장애가 있는 환자에서 과다 자발적 또는 수술 관련 출혈은 치료학적 용량의 변형 FVII 폴리펩타이드에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 수술을 받은 글란즈만 혈소판무력증 환자는 수술 전, 수술 중 및/또는 수술 후에 다량의 혈액 상실을 방지하기 위해 변형 FVII 폴리펩타이드 치료를 받을 수 있다(van Buuren et al.(2002) Dig Dis Sci 47: 2134-2136). 일반적으로, 변형 FVII 폴리펩타이드는 활성화된 FVII(FVIIa) 폴리펩타이드로 투여된다.
2. 후천적 출혈 장애
a. 화학요법 획득성 혈소판감소증
출혈 장애는 또한 선천성보다 후천성일 수 있다. 예를 들어, 백혈병 및 기타 암 등에 대한 화학요법 치료는 혈소판감소증을 초래할 수 있다. 이는 화학요법을 받은 환자의 골수에서 혈소판 생산의 상실때문일 가능성이 있고, 일반적으로 투약 후 6 내지 10일 후에 일어난다. 후천적 혈소판감소증의 치료는 일반적으로 혈소판, 적혈구 또는 혈장 수혈이며, 이는 혈소판 결핍증을 초래할 수 있는 임의의 비정상 자발적 출혈을 예방하는 작용을 한다. 화학요법 유도성 혈소판감소증 환자 또는 기타 다른 후천적 또는 선천적 혈소판감소증 환자의 출혈도 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드의 치료학적 함량의 투여에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 위장관에서와 같은 비조절성 출혈이 있는 혈소판감소증 환자는 출혈을 멈추기 위해 치료학적 함량의 FVII 폴리펩타이드를 정맥내 일시 주사가 처치될 수 있다(Gerotziafa et al.(2002) Am J Hematol 69: 219-222). 일반적으로, 변형 FVII 폴리펩타이드는 활성화된 FVII(FVIIa) 폴리펩타이드로 투여된다.
b. 기타 응고병증
기타 후천적 응고병증은 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드를 이용하여 치료할 수 있다. 응고병증은 전격간부전(FHF; 예컨대, 원인이 간독성 약물, 독소, 대사 질환, 감염성 질환 및 허혈인 것), 기타 간 질환, 예컨대 간경화 및 윌슨 질환과 관련된 질환, 비타민 K 결핍(예컨대, 원인이 항생제 치료 또는 식이인 것), 용혈요독증후군, 혈전성 혈소판감소증(TTC) 및 파종 혈관내 응고병증(DIC) 등을 비롯한, 이에 국한되지 않는 병태로부터 초래될 수 있다. 통상의 치료는 일반적으로 혈장, 적혈구(RBC) 또는 혈소판 수혈에 의하지만, 성공적이지 않을 수 있다. 한 양태에 따르면, 변형 FVII 폴리펩타이드는 출혈 방지를 위해 침습성 처치를 받은 FHF 환자에게 투여될 수 있다. 신선 동결된 혈장(FFP)을 이용한 통상의 치료는 종종 성공적이지 않고 다량의 혈장을 필요로 할 수 있어, 혈량 과부하 및 전신부종(피하 결합 조직 내로 부종액의 전신 침윤)을 일으킨다. 간 생검 또는 간 이식과 같은 침습적 수술 동안, 수술 전 및/또는 수술 후에 정맥내 일시주사에 의한 변형 FVII 폴리펩타이드 치료량을 이용한 치료는 FHF 환자에 출혈을 방지하고 지혈을 확립시킬 수 있다. 치료 효능을 측정하기 위해 환자는 혈액의 PT로 모니터할 수 있다(Shami et al.(2003) Liver Transpl 9: 138-143). 다른 양태로서, FVII는 응고병증과 관련이 있는 중증 출혈, 예컨대 통상의 수혈 주입에 반응하지 않은 간 기능이상 및 DIC와 관련이 있는 중증 제왕후 복분내 출혈 등이 있는 환자에게 투여될 수 있다(Moscardo et al.(2001) Br J Haematol 113: 174-176). 또한, 변형 FVII 폴리펩타이드는 신생아 및 소아 환자의 응고병증을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 신생아 및 소아 환자는 통상의 치료, 예컨대 RBC 및 혈소판 주입 등에 반응하지 않는다. 예를 들어, RBC 및 혈소판 수혈에 반응하지 않는, PR 증가와 관련된 중증 폐 출혈이 있는 신생아는 PT 감소 및 지혈 확립을 위해 변형 FVII 폴리펩타이드의 투여를 받을 수 있다(Olomu et al.(2002) J Perinatol 22: 672-674). 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 증강된 응고 활성을 나타내며, 따라서 저용량, 저빈도로 부작용이 적게 투여될 수 있다. 일반적으로, 변형 FVII 폴리펩타이드는 활성화된 FVII(FVIIa) 폴리펩타이드로 투여된다.
c. 이식 획득성 출혈
골수 이식(BMT) 및 줄기세포 이식(SCT) 후 중증 출혈은 혈소판 감소로 인해, 상기 처치들과 관련이 있는 비교적 일반적이고 생명을 위협하는 합병증이다. 예를 들어, 미만성 폐포 출혈(DAH)은 BMT의 폐 합병증으로, 이식 집단에서 추정되는 발생빈도가 1 내지 21%이고 치사율이 60 내지 100%이다. 이러한 출혈 에피소드들의 통상적인 치료법은 코르티코스테로이드 치료 및 혈장, 혈소판 및/또는 RBC 수혈을 포함하지만, 총 치사율이 약 50%로 대부분 성공적이지 못하다(Hicks et al.(2002) Bone Marrow Transpl 30: 975-978). 코르티코스테로이드 및/또는 혈소판 수혈을 동시에 치료하거나 동시에 치료함이 없이 정맥내 일시주사에 의한 FVII의 투여는 DAH를 치료하고 지혈을 확립시키기 위해 수행될 수 있다(Hicks et al.(2002) Bone Marrow Transpl 30: 975-978). 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 증강된 응고 활성을 나타내며, 이에 따라 저용량, 저빈도로 짧은 치료 기간 동안 투여할 수 있고, 동일한 생물학적 활성과 효능에 대한 부작용이 적다. 일반적으로, 변형 FVII 폴리펩타이드는 활성화된 FVII(FVIIa) 폴리펩타이드로 투여된다.
d. 항응고제 요법 유도성 출혈
혈전색전증과 같은 병태를 치료하기 위해 항응고제 요법을 받은 환자는 와파린, 헤파린 및 폰다파리눅스(fondaparinux)와 같은 항응고제의 급성 투여 시에 출혈 에피소드를 나타내거나 또는 이러한 요법의 장기 사용의 결과로서 출혈 장애를 발생시킬 수 있다. 출혈 에피소드의 치료는 일반적으로 헤파린을 중화시키는 프로타민, 외인성 FIX, 혈장, 비타민 K와 같은 응고촉진제의 투여를 포함한다. 또한, 외인성 FVII의 투여는 항응고제의 효과를 중화시키고, PT, aPTT 및/또는 다른 응고 마커를 증가시키고, 지혈을 확립시키기 위해 수행될 수 있다(Deveras et al.(2002) Ann Inten Med 137: 884-888). 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 항응고제 치료로 인해 후천적 출혈 장애가 있는 환자의 출혈 에피소드를 제어하는 치료에 사용될 수 있다. 일반적으로, 변형 FVII 폴리펩타이드는 활성화된 FVII(FVIIa) 폴리펩타이드로서 투여된다.
e. 후천적 혈우병
제VIII 인자 저해제는 다른 면에서 건강한 개체 중에서 자발적으로 발생하여, "후천적 혈우병"으로 알려진 병태를 초래한다. 후천적 혈우병은 드문 병태이며, 매년 발생빈도가 백만명당 0.2 내지 1.0명이다. 자가항체는 주로 IgG4 항체이고, 이는 FVII에 결합할 때, 트롬빈 절단, 폰빌레브란트 인자 상호작용 및/또는 인지질 결합을 방해하여 FVIII 활성을 저해한다. 그 결과, 환자의 약 87%에서 생명을 위협하는 출혈이 발생한다. 일반적인 출혈 부위는 피부, 점막, 근육 및 복막뒤이며, 주로 관절과 근육에서 출혈이 일어나는 유전성 혈우병 환자와 대조적이다. 후천적 혈우병은 출혈 에피소드를 제어하기 위해 활성화된 프로트롬빈 복합체 농축물 또는 재조합 활성화된 제VII 인자(NovoSeven®, Novo Nordisk)로 치료할 수 있다. 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 증강된 응고 활성을 나타내고, 이에 따라 저용량, 저빈도로 짧은 치료 기간 동안 투여되고, 동일한 생물학적 활성 및 효능에 대해 적은 부작용을 나타낼 수 있다. 일반적으로, 변형 FVII 폴리펩타이드는 활성화된 FVII(FVIIa) 폴리펩타이드로 투여된다.
3. 외상 및 수술 출혈
FVII 폴리펩타이드는 정상 응고계를 가진 피검체에서 수술중 및 외상성 혈액 상실과 관련이 있는 출혈을 치료하는 치료법으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, FVII 폴리펩타이드는 응고를 촉진하고 수술과 관련된 혈액 상실을 감소시키기 위해, 나아가 혈액 수혈의 필요성을 저하시키기 위해 환자에게 투여할 수 있다. 한 양태에 따르면, FVII 폴리펩타이드는 치골뒤 전립선절제술을 받은 피검체에게 투여할 수 있다. 치골뒤 전립선절제술은 종종 대량 혈액 상실과 관련되어, 이어서 수혈을 필요로 한다. 이러한 수술 또는 유사 수술을 받은 피검체는 수술 초기에 치료량의 FVII의 정맥내 일시주사를 투여받아 수술 부위의 응고를 증강시켜 수술중 혈액 상실을 감소시킬 수 있다. 혈액 상실의 감소는 이러한 환자들의 혈액 수혈의 필요성을 없애준다(Friederich et al.(2003) Lancet 361: 201-205). FVII 폴리펩타이드는 다른 종류의 수술을 받은 정상 응고작용을 나타내는 환자에게도 빠른 지혈을 달성하고 혈액 상실을 방지하기 위해 투여할 수 있다. 일반적으로 활성화된 형태(즉, FVIIa)로 투여되는 FVII가 수술중 출혈을 감소시키기 위한 치료법으로 사용될 수 있는 수술 처치의 비제한적 예에는 심장판막 수술(Al Douri et al.(2000) Blood Coag Fibrinol 11: S121-S127), 대동맥판막 대치(Kastrup et al.(2002) Ann Thorac Surg 74: 910-912), 재발 혈관주위세포종의 절제(Gerlach et al.(2002) J Neurosurg 96: 946-948), 암 수술(Sajdak et al.(2002) Eur J Gynaecol Oncol 23: 325-326) 및 십이지장 궤양에 대한 수술(Vlot et al.(2000) Am J Med 108: 421-423)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. FVII로의 치료는 수술 부위에서 지혈을 촉진하고 혈액 상실을 감소 또는 방지할 수 있어, 수혈을 필요성을 감소시키거나 없앨 수 있다. 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 증강된 응고 활성을 나타내도록 설계되고, 이에 따라 예컨대 저용량, 저빈도로 부작용이 적게 투여될 수 있다. 일반적으로, 변형 FVII 폴리펩타이드는 활성화된 FVII(FVIIa) 폴리펩타이드로 투여된다.
또한, 제VII 인자 폴리펩타이드는 외상성 상해가 있는 피검체에서 혈액 상실을 방지하고 응고를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 외상은 외인성 인자에 의한 생조직에 대한 상해로 정의되며, 미국에서 4번째 주요 사망원인이다. 외상은 둔기 외상(내부 압박, 기관 손상 및 내부 출혈을 초래함) 또는 침투성 외상(신체에 침투하여 조직, 혈관 및 기관을 파괴하여 외부 출혈을 초래하는 인자의 결과)으로 분류된다. 외상은 여러가지 사건에 의해 유발될 수 있으며, 그 예로는 차량 사고(둔기 및/또는 침투성 외상 유발), 총상(침투성 외상 유발), 자상(침투성 외상 유발), 기계 사고(침투성 및/또는 둔기 외상 유발) 및 상당한 높이에서의 추락(침투성 및/또는 둔기 외상 유발)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 외상의 결과로서 조절되지 않는 출혈은 대부분의 관련 사망률의 원인이다. 미만성 응고병증은 외상 환자와 관련이 있는 비교적 일반적인 합병증으로, 25 내지 36%의 피검체에서 일어난다. 응고병증은 상해 직후에 발생하여, 다양한 요인, 예컨대 응고인자 및 혈소판의 희석 및 소비, 섬유소용해, 산증 및 저체온증 등으로부터 야기된다. 통상적인 치료는 산증을 보정하고 저체온증을 치료하는, 신선 동결된 혈장(FFP) 혈소판, RBC 및/또는 동결침전제제의 수혈에 의한 대치 요법을 수반한다. 이 단계들은 출혈을 멈추고 사망을 예방하기에는 불충분하다. 치료량의 FVII의 투여에 의한 치료는 응고를 촉진하고 외상 환자의 혈액 상실을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 대량 출혈을 나타내는 총상 환자에게는 수술적 중재 외에, 응고병증성 출혈을 제어하기 위해 FVII가 투여되어야 한다(Kenet et al. (1999) Lancet 354: 1879). FVII를 이용한 응고제 요법은 둔기 및 침투성 외상 환자에서 혈액 상실 및 출혈을 효과적으로 감소시킬 수 있다(Rizoli et al.(2006) Crit Care 10: R178). 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드는 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 증강된 응고 활성을 나타내도록 설계하고, 이에 따라 예컨대 저용량, 저빈도로 부작용이 적게 투여될 수 있다. 일반적으로, 변형 FVII 폴리펩타이드는 활성화된 FVII(FVIIa) 폴리펩타이드로 투여된다.
J. 병용 요법
당해의 임의의 변형 FVII 폴리펩타이드는 다른 생물제제, 소분자 화합물 및 수술 등, 이에 국한되지 않는 다른 치료 제제 또는 처치와 함께, 그러한 처치 전에, 그러한 처치 중에 간헐적으로, 또는 그러한 처치에 이어서 투여될 수 있다. FVII(FVIIa 및 rFVIIA 포함해서)가 표시되거나 사용되었었고 다른 제제 및 치료가 이용가능한, 앞에서 예시한 모든 것을 포함한 임의의 질환 또는 병태에 대해, FVII는 병용해서 사용될 수 있다. 따라서, 당해의 변형 FVII 폴리펩타이드도 유사하게 사용될 수 있다. 치료할 질환 또는 병태에 따라, 예시적 병용은 다른 혈장 정제된 또는 재조합 응고 인자, 응고촉진제, 예컨대 비타민 K, 비타민 K 유도체 및 단백질 C 저해제, 혈장, 혈소판, 적혈구세포 및 코르티코스테로이드 등(이에 국한되지 않는다)과의 병용을 포함한다.
K. 제조품 및 키트
변형 FVII 폴리펩타이드 또는 변형 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 이의 유도체 또는 생물학적 활성부의 약제학적 화합물은 포장재, 혈액응고 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 약제학적 조성물, 및 혈액응고 질환 또는 장애를 치료하는데 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 핵산 분자가 사용된다는 것을 나타내는 라벨을 함유하는 제조품으로써 포장될 수 있다.
당해의 제조품은 포장재를 함유한다. 약제학적 산물의 포장에 사용되는 포장재는 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 전문이 참고인용되는 미국 특허 5,323,907, 5,052,558 및 5,033,352를 참조한다. 약제학적 포장재의 예로는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이엘, 용기, 주사기, 병 및 선택된 제형과 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 임의의 포장재를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 임의의 혈액응고 질환 또는 장애에 대해 다양한 치료법이 있는 만큼, 당해의 화합물과 조성물의 다양한 제형의 어레이가 예상된다.
또한, 변형 FVII 폴리펩타이드 및 핵산 분자는 키트로도 제공될 수 있다. 키트는 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물 및 투여 용품을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형 FVII는 주사기, 흡입기, 투여량 컵, 점적기 또는 도포기와 같은 투여용 기구와 함께 공급될 수 있다. 키트는 경우에 따라 투여량, 투여 방법 및 투여 방식의 지시를 포함하는 투여 지침서를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물 및 진단 용품을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 키트는 피검체의 FVII 조절계 또는 FVII의 농도, 양 또는 활성을 측정하기 위한 용품을 포함할 수 있다.
이하 실시예는 단지 예시하기 위한 목적으로, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 한다.
L. 실시예
실시예 1
컴퓨터 모의실험에 의한 TFPI에 대한 내성이 증가된 제VII 인자 변이체의 생성
A. 제VII 인자 및 TFPI 간의 상호작용의 모델링
제VII 인자와 이의 천연 저해제인 조직인자 경로 저해제(TFPI)-1 상의 제1 쿠니츠 도메인(K1)(TFPI-1 K1) 간의 상호작용의 컴퓨터 모델링은 상호작용 부위의 계면에서 접촉 아미노산 잔기를 측정하기 위해 수행했다. 단백질 데이터 뱅크(rcsb.org/pdb/)로부터의 공개 정보를 이용하여 상동성 모델을 제작했다. 하지만, TFPI-1 K1 단독의 결정 구조 및 TF/FVIIa/TFPI-1/FXa 간에 4차 복합체의 결정 구조는 아직 밝혀지지 않았다. 대신, 이 공정의 출발 모델로서 TF, FVII 및 소 췌 장 트립신 저해제의 5L15 변이체(BPTI5L15; PDB 코드 1FAK_1) 간에 3차 복합체의 2.1Å 결정 구조를 이용하고, 그 다음 트립신/TFPI-2 복합체의 결정 구조에 대한 정보를 이용하여 컴퓨터 모델링을 수행했다(도 6). BPTI5L15는 쿠니츠 도메인형 세린 프로테아제이고, TFPI-1 및 TFPI-2와 상동성을 나타낸다. BPTI5L15의 제1 쿠니츠 도메인(K1)(서열번호 106)은 제1 쿠니츠 도메인(K1)에서 45% 1차 서열 동일성을 나타낸다(도 5). TFPI-2K1의 결정 구조의 좌표는 트립신/TFPI-2 복합체의 결정 구조를 도시하고 있는 단백질 데이터 뱅크의 프로그램 데이터베이스(pdb) 파일 1TFX에서 뽑아냈다. 이 TFPI-2 K1 좌표를, TF/FVIIA/BPTI5L15의 BPTI 3차원 좌표 위에, PyMol 소프트웨어 스위트(pymol . sourceforge . net /)의 강체 c-α 백본 정렬 프로그램을 이용하여 정렬시켰다. 중첩 측정에 의한 모델에의 TFPI-2 K1의 적합도 분석은 1Å 미만의 RMSD(제곱평균제곱근편차)를 산출했다. 이는, 두 구조 간에 정확한 정렬 및 신뢰할 수 있는 FVII와 TFPI-2 K1 복합체 모델의 생성을 시사했다.
이 모델에서 FVII 표면과 밀접하게 접촉되어 있는 것으로 관찰된 TFPI-2 K1 상의 측쇄는 확인하여, TFPI-1 K1에 존재하는 측쇄에 상응하도록 컴퓨터 모의 실험으로 돌연변이유발시켰다. 이 분석의 결과는 활성 부위에 바로 인접한 여러 잔기들(즉, 2번째 구형 잔기)에서 제VII 인자와 TFPI-1 K1 간에 정전기성 상보성이 있음을 보여주었다. 상기 상동성 분석에 기초하여 TFPI-1 K1과의 상호작용에 수반되는 FVII의 잔기는 키모트립신 번호매김 시에 D60, K60a, K60c, T99, R147 및 K192 이며, 이는 성숙 FVII 번호매김 시에 각각 D196, K197, K199, T239, R290 및 K341에 상응한다(도 7). 모델화된 상호작용을 조사한 결과, 키모트립신 번호매김 시의 위치 97(G97)에 있는 글리신 잔기(성숙 FVII 번호매김 시에 G237에 상응함)는 접촉 잔기와 밀접한 위치에 있는 것으로 나타났다. 이 위치의 변형은 TFPI와 FVII의 상호작용을 붕괴시킬 수 있는 입체 장애를 야기할 수 있다.
B. 컴퓨터 모의실험에 의한 TFPI-1 K1에 대한 내성 증가를 제공하는 제VII 인자의 돌연변이
FVII/TFPI-1 K1 상호작용의 계면 또는 그 부근에 위치한 아미노산 잔기는 앞에서 기술한 바와 같이 확인했다. 아미노산 변화에 의한 FVII의 변이체는 a) FVII와 TFPI-1 간에 상보성 정전기적 접촉을 반발성 하전-하전 접촉으로 교체하고 및/또는 b) FVII 상의 하전성 잔기를 중성 잔기로 교체하여 양성 정전기성 접촉을 무력화시키며 및/또는 c) 작은 측쇄를 함유하는 잔기를 큰 측쇄를 함유하는 잔기로 교체하여 입체 장애를 유발하는 것으로 설계했다. 변이체의 예는 이하 표 9에 정리했다.
Figure 112009069306018-PCT00009
Figure 112009069306018-PCT00010
실시예 2
FVII의 클로닝 및 발현
A. FVII의 클로닝
466개 아미노산의 사람 FVII 이소폼 전구체 폴리펩타이드(P08709; 서열번호 1)를 암호화하는 뉴클레오타이드는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 함유하는 포유동물 발현 벡터인 pCMV Script(Stratagene; 서열번호 151)에 클로닝했다. 간략히 설명하면, FVII 서열을 주형으로서 사람 FVII cDNA(Invitrogen)를 사용하여 PCR로 증폭시키기 위해, CBO-125(서열번호 152) 및 CBO-126(서열번호 153) 올리고뉴클레오타이드를 각각 정방향 및 역방향 프라이머로서 사용했다. CBO-125 프라이머는 BamHI 제한효소 부위(진한 글씨), 코작 서열(이중선 밑줄친 부분), 그 다음 ATG 개시 코돈을 포함하여 FVII cDNA 서열의 5' 말단에 상동성이 있는 18개 뉴클레오타이드(밑줄친 부분)를 포함했다. CBO-126 프라이머는 EcoRI 제한효소 부위(진한 글씨), 종결 코돈(이중 밑줄친 부분) 및 FVII cDNA 서열의 3' 말단과 상동성이 있는 21개 뉴클레오타이드(밑줄친 부분)를 포함했다.
CBO-125 정방향 프라이머
Figure 112009069306018-PCT00011
CBO-126 역방향 프라이머
Figure 112009069306018-PCT00012
KoD HiFi PCR 키트(EMD Biosciences)에 이 제조업자가 추전하는 표준 PCR 반응 및 열순환 조건을 사용했다. PCR 산물은 BamHI 및 EcoRI 제한효소로 분해하고, 표준 분자 기술을 사용하여 pCMV Script 벡터의 BamHI 및 EcoRI 제한효소 부위에 연결시켰다. 이 벡터로 그 다음 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)를 형질전환시켰다. 선택한 콜로니를 증식시키고 세균 세포를 수거하여 통상의 분자생물학 기술로 플라스미드를 정제했다.
B. FVII 변이체 제조
FVII 변이체는 새로 합성되는 DNA에 특정 돌연변이를 혼입시키는 프라이머로서 작용하는 특수 설계된 올리고뉴클레오타이드와 함께, QuikChange II XL 부위 지시된 돌연변이유발 키트(Stratagene)를 제조업자의 지시에 따라 사용하여 제조했다. QuikChange 방법은 PfuUltra 고정확도 DNA 폴리머라제에 의한 주형 DNA의 선형 증폭을 수반한다. 목적한 돌연변이를 포함하는 상보성 프라이머는, 클로닝된 FVII cDNA 서열을 주형으로써 포함하는 정제된 이본쇄 초나선형 pCMV Script 벡터를 사용하여 사이클링 동안 신장시켰다. 프라이머를 신장시킨 결과, 새로 합성된 가닥에는 당해의 돌연변이가 포함되었고, 그 결과 점착형 닉(nick)을 보유하는 돌연변이 플라스미드가 수득되었다. 증폭 후에, 이.콜라이 유래의 pCMV Script 벡터의 dam-메틸화된 모 가닥을 절단하는 Dpn I으로 핵산을 처리했다. 이로써, 메틸화되지 않은, 새로 합성된 돌연변이 플라스미드가 "선택"되었다. 목적한 돌연변이(들)를 함유하는 벡터 DNA로 XL10-Gold 울트라컴피턴트 이.콜라이 세포를 형질전환시켰고, 여기서 세균 리가제가 닉을 수복시켜 정상 복제가 일어나게 했다.
단일 아미노산 치환을 보유한 FVII 변이체는 성숙 FVII 번호매김에 의한 위치 D196, K197, K199, G237, T239, R290 및 K341(키모트립신 번호매김 시에 D60, K60a, K60c, G97, T99, R147 및 K192에 상응함)를 표적으로 삼아 제조했다. 위치 D196, K197 및 K199에 다중 돌연변이를 보유한 FVII 변이체 또는 위치 D196 및 K197에 돌연변이를 보유한 FVII 변이체도 제조했다. FVII 변이체를 제조하는데 사용된 각 상보성 프라이머 쌍 유래의 올리고뉴클레오타이드 중 하나의 뉴클레오타이드 서열은 표 10에 제시했다. 비교하기 위해 상응하는 야생형 서열도 제시했다. 치환된 아미노산을 암호화하는 3개의 염기쌍 서열은 진한 글씨로 나타낸 부분이다. 예를 들어, 치환 D196K(키모트립신 번호매김 시 D60K; CB554, 서열번호 18)를 함유하는 FVII 변이체를 제조하기 위해, CBO-157 D60K 올리고뉴클레오타이드 및 CBO-157 D60K에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 QuickChange II XL 부위 지시된 돌연변이유발 키트와 함께 사용하여 3 염기쌍 "gac" 야생형 서열을 3 염기쌍 "aag" 서열로 교체시켰다. D196K 치환을 함유하는 FVII 변이체 폴리펩타이드를 암호화하는 돌연변이된 벡터를 이용하여 그 다음 XL10-Gold 울트라컴피턴트 이.콜라이 세포를 형질전환시켰다.
Figure 112009069306018-PCT00013
Figure 112009069306018-PCT00014
Figure 112009069306018-PCT00015
C. FVII 폴리펩타이드의 발현
ELISA 및 웨스턴 블롯에 의한 1차 발현 분석을 위해, FVII 폴리펩타이드를 BHK-21 세포에서 발현시켰다. 이하에 기술되는 바와 같은 생화학적 분석을 위해, FVII 폴리펩타이드는 FreestyleTM 293-F 세포(Invitrogen)에서 발현시켰다.
야생형 제VII 인자 폴리펩타이드(CB553-02, 서열번호 3) 및 변이체 FVII 폴리펩타이드는 먼저 어린 햄스터 신장 세포주 BHK-21(ATCC CRL 1632)에서 발현시켰다. BHK-21 세포는 100mm 배양 접시에 담긴 10% 태아 송아지 혈청(FCS)이 보충된 이글스 최소 필수 배지(EMEM, Invitrogen)에서 37℃, 5% CO2 하에 배양했다. 약 90% 융합도까지 성장한 후, 세포를 리포펙타민 2000 키트(Invitrogen)를 제조업자의 지시에 따라 사용하여 24㎍ FVII 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 배지는 형질감염 6시간 후, 1㎍/ml 비타민 K1(Sigma)을 함유하는 무혈청 EMEM으로 교체하고, 세포를 다시 72시간 동안 항온배양했다. 세포 배양 배지에서 FVII의 발현은 ELISA 또는 웨스턴 블롯으로 분석했다.
생화학적 분석법을 이용한 후속 분석을 위해, 야생형 제VII 인자 폴리펩타이드(CB553-02, 서열번호 3) 및 변이체 FVII 폴리펩타이드를 Freestyle™ 293-F 세포(Invitrogen)에서 발현시켰다. 세포를 통기형 캡이 있는 에를렌메이어 플라스크에 담긴 Freestyle™ 293 배지(Invitrogen)에서 37℃, 8% CO2 하에 배양했다. 세포는 제조업자의 제안 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 간략히 설명하면, 1x106 세포/ml까지 성장시킨 후, 세포를 원심분리하고 배지를 교환했다. 그 다음, 세포를 293fectin(Invitrogen)을 이용하여 세포 매 240ml마다 240㎍의 FVII 플라스미드 DNA를 사용하여 형질감염시켰다. 또한, 세포 매 240ml마다 에탄올 중의 비타민 K1(Sigma) 1mg/ml 스톡 50㎕를 첨가했다. 이 세포를 5일 동안 증식시키고 배양 상청액을 수거했다. 이 세포 배양 배지에서 FVII의 발현은 ELISA로 분석했다.
1. ELISA
면역분석법은 샘플 중의 사람 FVII와 FVIIa의 양을 정량분석하는데 사용했다. 사람 FVII에 대한 폴리클로날 항체는 용액 중의 프로테아제를 포획하고 검출하기 위해 사용했다. 면역분석법은 조정 배지 또는 정제된 스톡의 단백질 농도를 측정하거나 다른 샘플, 예컨대 사람 또는 마우스 혈장 샘플 중의 FVII 농도를 측정하는데 사용했다. 사람 혈액 중에 존재하는 FVII의 기본 농도는 약 50nM이고, 효소적 활성 형태 FVIIa는 약 1nM이다.
샘플 중의 사람 FVII 또는 FVIIa 단백질의 양을 측정하기 위해 샌드위치 ELISA를 수행했다. 96웰 평저 Maxisorp 면역평판(Nunc)은 5ng/㎕ 아비딘(NeutrAvidin, Pierce Biotech) 100㎕/웰로 코팅했다. 이 평판을 덮어서 실온(RT)에서 1시간 동안 진탕 항온처리한 후, 0.01% Tween-20 함유 PBS(PBST)로 4회 세척했다. 평판을 각 웰마다 200㎕/웰씩 첨가한 1% 소혈청알부민(BSA)(w/v) 함유 PBS와 진탕 항온처리하여 RT에서 최소 1시간 동안 차단시켰다. 차단된 평판은 그 다음 사용(최고 2주)할 때까지 4℃에서 보관했다.
사용 전에, 평판은 BSA를 제거하기 위해 PBST로 4회 세척하고, 1ng/㎕ 용액의 비오틴화된 항-제VII 인자 항체(R&D Systems) 100㎕/웰을 각 웰에 첨가하고, 이 평판을 실온에서 45분 동안 진탕 하에 항온처리하여 코팅된 아비딘을 복합체화시켰다. 과량의 미결합 항체는 평판을 PBST로 세척(4회)하여 제거했다.
50ng/㎕ 내지 0.8ng/㎕ 범위에서 연속 2배 희석된 FVII 표준물질(American Diagnostica; PBST에 희석됨)은 평판에 100㎕/웰씩 첨가했다. 임의의 FVII 없이 PBST를 함유하는 웰도 완충액 단독 대조군으로 포함시켰다. FVII 또는 FVIIa의 정제된 샘플(활성화 전 및 후, 실시예 3 참조)을 분석하기 위해, 샘플을 먼저 PBST에 1:25로 희석하고, 그 다음 연속 2배 희석한 희석물을 제조하여 25배, 50배, 100배 및 200배 희석물을 시험했다. 이렇게 희석된 샘플을 100㎕/웰씩 웰에 이반복으로 첨가했다. FVII 또는 FVIIa를 함유하는 혈장 샘플을 분석하기 위해, 혈장 샘플은 PBST에 1:100 및 1:400으로 희석하고, 100㎕/웰씩 이반복으로 웰에 첨가했다. 또한, FVII 또는 FVIIa가 없는 혈장 샘플도 배경 수준을 측정하기 위해 포함시켰다. 그 다음, 평판을 진탕 하에 RT에서 30분 동안 항온처리하여, 샘플 중의 임의의 FVII 또는 FVIIa가 항-FVII 항체와 복합체를 형성하도록 했다.
샘플과 항온처리 후 평판은 PBST로 4회 세척했다. 2차 항체인 말의 항-사람 FVII(American Diagnostics)는 PBST에 1:5000으로 희석하고 각 웰에 100㎕ 용적으로 첨가했다. 이 평판을 실온에서 진탕 하에 30분 동안 항온처리하여, 첨가된 항체가 평판 상의 FVII 또는 FVII 복합체에 결합하게 했다. 과량의 2차 항체를 제거하기 위해, PBST 중에 1:5000 희석율의 염소 항말 HRP 접합체 100㎕를 각 웰에 첨가했다. 진탕 하에 실온에서 30분 동안 항온처리한 후, 평판을 PBST로 4회 세척하고, TMB 기질과 과산화수소 용액 1:1 혼합물을 함유하는 용액(Pierce Biotech.) 100㎕/웰을 첨가했다. 평판을 실온에서 약 1분 동안 진탕시킨 뒤, 반응을 정지시키기 위해 2M H2SO4 100㎕/웰을 첨가했다. 450nm에서의 광학밀도를 Molecular Device M5 평판 판독기로 측정하고 각 웰의 측정값에서 이 평판의 배경값(PBST 단독을 측정한 값)을 감산했다. 표준곡선은 FVII 표준물의 농도 대 흡광도를 플로팅하여 작도했다. 약 0.2 - 50ng/ml의 표준 곡선 범위는 일반적으로 상기 ELISA 조건 하에서 수득되었다. 이 표준 곡선을 이용하여 각 샘플의 농도를 측정하고, 희석률로 곱해, 평균값과 표준편차를 기록했다.
2. 웨스턴 블롯
세포 배양 배지에서 FVII의 발현은 웨스턴 블롯으로 분석했다. 미희석 샘플, 또는 FVII 형질감염된 BHK-21 세포 유래의 세포 배양 배지를 PBS에 2배 연속 희석한 희석물 2개의 일정량을 Conc. 1 (미희석물), Conc. 2 (2배 희석물) 및 Conc. 3 (4배 희석물)로 표지했다. 이 샘플들을 SDS page 겔에 대조군 혈장 정제된 rFVII(American Diagnostica, CB553-01) 10, 25 및 50ng 다음에 부하했다. BHK-21 세포에 의해 생산된 FVII 단백질은 1차 폴리클로날 말 항-FVII 항체(American Diagnostica; 제조업자의 제안된 농도로 사용함) 및 HRP 접합된 항말 IgG 2차 항체(Zymed Laboratories 제품인 1mg/ml 용액의 1:2000 희석물)를 사용하여 웨스턴 블롯으로 검출했다. 발현 수준은 대조용 혈장 정제된 rFVII와 비교했다. 그 결과는 약 20ng 내지 50ng 이상의 농도 범위인 FVII가 세포 배양물 일정량에 존재하고 있음을 보여준다.
실시예 3
FVII 폴리펩타이드의 정제 및 활성화
FVII 폴리펩타이드는 기능성 Gla 도메인을 보유한 FVII 폴리펩타이드가 흡착하는 Q Sepharose Fast Flow(XK16) 컬럼을 이용해서, 후속 칼슘 용출 단계를 통해 정제했다. 형질감염된 Freestyle™ 293-F 세포 유래의 배양 상청액 240ml 용량을 20mM Tris pH8.0 및 0.01% Tween 20을 함유하는 용액으로 2배 희석하고, 이 희석된 샘플에 500mM EDTA pH 8.0을 1.5ml 첨가했다. 샘플을 여과한 뒤, 먼저 완충액 B(20mM Tris pH 8.0, 1M NaCl, 0.01% Tween 20), 그 다음 완충액 A(20mM Tris pH 8.0, 0.15M NaCl, 0.01% Tween 20)로 8ml/분의 속도로 예비평형화시킨 Q Sepharose Fast Flow(XK16) 위에 부하했다. 부하한 후, 280nm에서 관류물의 흡광도가 기준값에 도달할 때까지 완충액 A로 컬럼을 세척했다. 완충액 A를 완충액 C(20mM Tris pH 8.0, 0.15M NaCl, 0.01% Tween 20, 5mM CaCl2)으로 교체하고, 라인들의 완충액을 완전히 교체하기 위해 펌프 세척을 수행했다. 펌프 세척을 완료한 후, 완충액 C를 8ml/분의 속도로 컬럼에 적용하여 FVII 폴리펩타이드를 용출시키고, 이를 5ml 분획씩 60분 동안 수집했다. 용출 후에, 여전히 분획을 수집하면서 분홍색 안료(배양 배지 유래)가 컬럼에서 세척되어 나올때까지 완충액 B로 세척했다. 그 다음, 컬럼을 완충액 A로 세척하여 다음 샘플의 FVII 정제를 위해 준비했다.
용출된 분획은 다시 먼저 완충액 B로, 그 다음 완충액 A로 2ml/분의 속도로 예비평형화된 Mono Q 5/5 컬럼(수지 1ml 함유)을 사용하여 추가 정제했다. 상기 완충액 C에 의해 수집된 5번째 내지 8번째 5ml 분획을 모아서, 완충액 A로 2배 희석한 뒤, 500mM EDTA(pH 8.0) 1.6ml를 첨가했다. 이 시점에서 ELISA와 같은 분석을 위해 때로 소량(100㎕)을 채취했다. 함께 모은 샘플을 Mono Q 컬럼 위에 2ml/분의 속도로 부하한 뒤, 완충액 A로 세척했다. 결합된 FVII 폴리펩타이드를 용출시키기 위해, 0% 내지 30% 구배의 완충액 B를 컬럼을 통해 20분 동안 1ml/분의 속도로 유통시키고, 0.5ml 분획을 수집했다. 그 다음, 컬럼은 다음 샘플의 FVII 정제를 위한 준비로서 완충액 B와 그 다음 완충액 A로 세척했다.
정제된 FVII 폴리펩타이드는 제한 프로테아제 인자 Xa 절단 및 제거 키트(Roche)의 비오틴화된 제Xa 인자를 사용하여 FVIIa로 활성화시켰다. 일반적으로, Mono Q 정제 컬럼 유래의 7개 분획을 15ml 원추형 튜브에 모으고, 500mM CaCl2 388㎕, 증류수 중의 10% BSA 38.9㎕ 및 비오틴화된 제Xa 인자 3.2㎍을 첨가했다. 37℃에서 14 내지 16시간 동안 항온처리한 후, Immobilized Avidin(Pierce) 250㎕를 첨가하고, 샘플을 4℃에서 30분 동안 혼합했다. 수득되는 용액을 그 다음 Econo-pak 컬럼(Bio-Rad)을 통해 여과하고, 여과액을 다시 Immobilized Avidin 250㎕와 추가로 30분 동안 혼합했다. 용액을 다시 여과하고, 여과액을 Amicon Ultra-4 10kDa 원심분리 필터(Millipore)를 사용하여 약 300 내지 500㎕로 농축시켰다. FVIIa 농축은 그 다음 ELISA(실시예 2.C.1에 기술됨)로 분석하고, 제VII 인자 활성화 수준은 웨스턴 블롯으로 모니터했다. 웨스턴 블롯팅은 대부분 실시예 2.C.2에 기술된 바와 같이 수행하나, 단 토끼 항-사람 제VIIa 인자 항체(Haematologic Technologies, Inc.)를 1차 항체로서 1:2000 비율로 1시간 동안 사용하고, 그 다음 HRP-염소 항-토끼 IgG(H+L)(Invitrogen)을 1:5000 비율로 30분 동안 수행했다.
실시예 4
소분자 기질에 대한 FVIIa 의 아미드용해 활성의
마이켈리스 멘텐 반응속도상수 측정
FVII 변이체의 아미드용해 활성은 펩타이드 기질 Spectrozyme FVIIa(CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA.AcOH)에 대한 FVIIa 폴리펩타이드의 마이켈리스 멘텐 반응속도상수를 측정하여 평가했다. 지질화된 사람 정제된 조직인자(Innovin, Dade Behring, VWR Cat#68100-390)는 FVIIa의 최적 활성을 제공하기 위해 분석법에 첨가했다. TF-FVIIa 복합체는 고특이성 발색원성 기질로서 Spectrozyme FVIIa를 절단하여 파라니트로아닐린-발색단(pNA)을 방출시키며, 이는 405nm에서 흡광도를 측정하여 모니터할 수 있다. 효소 활성은 시간의 함수로서 수득된 유리 pNA의 405nm 흡광도를 모니터하여 측정했다.
반응은 3가지 다른 효소 농도에서 수행했다. 이 반응을 위해, FVIIa 변이체를 먼저 1.7ml 튜브(저 부착성 미세원심분리관, ISC Bioexpress 제품)에서 1x 직접 분석 완충액(100mM Tris pH8.4, 100mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.01% BSA)에 40nM로 희석했다. 다시 FVIIa를 TF(Innovin, Dade Behring)의 존재 하에, 12웰 폴리프로필렌 저장기(Axygen)에서 5x 직접 완충액(500mM Tris pH8.4, 500mM NaCl, 25mM CaCl2, 0.05% BSA) 720㎕, 40nM FVIIa 180㎕ 및 2x TF(10ml 물로 재구성시킨 6nM 스톡 용액) 2700㎕로 희석했다. 희석된 프로테아제를 실온에서 5분 동안 항온처리했다. FVIIa 2nM 스톡을 다시 2배 연속 희석하여, 각각 TF의 존재 하에 1nM 및 0.5nM 프로테아제 스톡을 제조했다. 연속 희석 반응은 다음과 같다: 먼저 상기 FVIIa/TF 2nM 스톡 1800㎕를 5X 직접 완충액 360㎕, 2x TF 900㎕ 및 물 540㎕로 희석한다. 그 다음, 이와 같이 희석된 스톡을 다시 직접 완충액 중의 1x TF 1800㎕에 1:1로 희석했다.
기질 Spectrozyme FVIIa(American Diagnostics)의 희석 평판을 제조했다. Spectrozyme FVIIa의 스톡 용액은 50μmol 바이엘을 증류수에 10mM로 재구성시켜 제조하고, 4℃에서 보관했다. 80㎕(10mM Spectrozyme FVIIa)와 60㎕ + 20㎕ 물(7.5mM Spectrozyme FVIIa)의 10mM Spectrozyme FVIIa를 96웰 폴리프로필렌 분석 평판(Costar)의 인접한 두 세로행의 웰에 첨가했다. 두 웰을 각 세로행의 8웰에 각각 연속 2배 희석하여 제1 세로행의 웰로부터는 10mM에서 78μM 농도 범위, 제2 세로행의 웰로부터는 7.5mM에서 58.6μM 농도 범위로 연속 희석된 10x 기질 농도를 제조했다.
각 Spectrozyme FVIIa 기질 희석물 5㎕를 96웰 투명 하프에어리어(half-area) 분석 평판(Costar)에 첨가했다. 각 3개의 FVIIa/TF 희석물 45㎕를 3 그룹으로 이루어진 기질 연속 희석물 세로행에 첨가했다. 이 단계 동안, 분석 웰에 기포가 도입되지 않게 주의가 필요했다. 기포가 도입되면, 각 분석을 시작하기 전에 깨끗한 바늘로 찔러 기포를 제거했다. 평판을 진탕 혼합했다. 분석을 개시하기 전에, 분석 웰의 광이동길이(pathlength)는 Spectramax Gemini M5 평판 판독기 분광분석기(Molecular Devices)로 종점 판독값을 얻고, 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) 소프트웨어(Molecular Devices)의 Pathcheck 특징을 사용하여 측정했다. 405nm에서 흡광도의 증가는 37℃에서 1시간 동안 매 30초마다 측정했다.
SoftMax Pro 소프트웨어는 405nm, 9600M-1cm-1에서 pNA 이탈기의 흡광계수 및 광이동길이를 사용하여 흡광도율(밀리유닛/초)을 pNA 방출 농도(μM/초)로 전환시키는데 사용했다. 전환방정식은 다음과 같다: 흡광도율 x (1/60 x 1000) x (1/9600 x 광이동길이) x 100000. 각 프로테아제 농도의 결과는 X 축에 기질 농도, Y 축에 측정된 μM/초 율로 하여 Graph Pad Prism 소프트웨어로 도표화했다. Graph Pad Prism 4 소프트웨어를 사용하여 Km 및 Ymax는 다음과 같은 마이켈리스 멘텐 방정식에 데이터를 넣어 측정했다:
Y = ((k cat K m /1000000) x X x [E])/(1+(X+K m)
여기서, X는 기질 농도(μM)이고,
Y는 효소 활성(μM/초)이고,
k cat K m 은 특이성 상수(M-1초-1)이고,
K m은 마이켈리스 상수(μM)이고,
E는 효소 농도(μM)이다.
초기 값은 E=1, 0.5 x Y max에서 Km=X 및 k cat K m = 1000으로 설정했다.
각 FVIIa 변이체, 야생형 FVIIa(CB553-02)의 비활성(munit/분/nM)은 420μM Spectrozyme FVIIa를 사용하여 전술한 분석법으로 측정했다(표 11). FVIIa 변이체의 활성은 일반적으로 야생형 FVIIa(2.7munit/분/nM)의 활성보다 컸다. FVII 변이체의 활성은 문헌에 기술된 변이체(CB591-CB594)와 비슷했고, 대부분의 FVII 변이체는 종래 문헌에 기술되었던 변이체의 활성과 비슷하거나 더 큰 것으로 확인되었다.
Figure 112009069306018-PCT00016
Figure 112009069306018-PCT00017
실시예 5
기질인 제X 인자에 대한 FVIIa 의 촉매 활성의 측정
FVIIa 변이체가 이의 기질인 제X 인자(FX)에 나타내는 촉매 활성은, FVIIa에 의한 활성화 시에 생성되는 FXa의 활성을 합성 기질 Spectrafluor FXa에 대해 분석하여 형광원성 분석으로 간접적으로 평가했다. 이 분석에 정제된 조직인자(TF)의 지질화된 형태를 첨가하여 FVIIa의 최적 활성을 제공했다. Spectrafluor FXa(CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC.AcOH)에 대한 FXa의 효소 활성은 생성된 유리 형광단, AMC(7-아미노-4-메틸쿠마린)의 흡광도 증가를 시간의 함수로서 측정하여 수득했다.
간략히 설명하면, FVIIa 변이체는 먼저 1x 직접 분석 완충액(100mM Tris pH 8.4, 100mM NaCl, 5mM CaCl2 및 0.01% BSA) 0.5μM로 희석하고, 다시 직접 분석 완충액으로 0.1nM로 희석했다. 지질화된 전체 길이의 TF(Innovin; Dade Behring)를 물 20mL로 재구성시켜 3nM 용액을 만들고, 1x 직접 분석 완충액으로 0.2nM로 희석했다. 0.1nM FVIIa 400㎕를 0.2nM TF 400㎕와 혼합하고 실온에서 5분 동안 항온처리했다. 이 용액을 다시 0.2nM TF를 함유하는 1x 직접 분석 완충액으로 다시 2회 2배 희석하여 총 3개의 FVIIa 희석물, 즉 각각 0.2nM TF를 함유하는 0.05nM, 0.025nM 또는 0.0125nM FVIIa 희석물(FVIIa/TF 용액)을 수득했다.
기질인 제X 인자(FX; American Diagnostics; 80㎍)는 증류수 135.6㎕로 재구성시켜 10μM 스톡을 제조하고, 일정량을 -80℃에 보관했다. 일정량은 1회보다 많이 동결 및 해동시키지 않았다. FX 스톡은 직접 분석 완충액에 800nM로 희석하고, 다시 2배 희석하여 800nM 내지 50nM 범위의 FX 용액을 수득했다.
Spectrofluor Xa(American Diagnostica; 10μmole)는 증류수 5mM로 재구성시키고 4℃에 보관했다. 96웰 블랙 하프에어리어 분석 평판(Costar)에, Spectrofluor Xa(American Diagnostica) 5㎕를 각 웰에 첨가했다. 그 다음, FX 용액 25㎕를 각 웰에 첨가했다. 평판 웰의 마지막 줄에는 FX가 첨가되지 않은 음성 대조군을 포함시켰다. 3가지 농도의 TF/FVIIa 용액을 이반복으로 20㎕씩 평판의 각 세로줄 웰에 첨가하여, 각 FX 희석물에 대해 각 TF/FVIIa 희석물을 분석했고, 세로줄 한 세트에는 TF/FVIIa를 첨가하지 않았다(즉, FX 단독물). 이 평판을 진탕 혼합했다. 형광도는 분광형광계로 경시적으로 측정하여 37℃에서 1시간 동안 30초마다 판독했고(Ex: 380nm, EM; 450nm, 컷오프: 435nm), 시간은 시간제곱 단위로 기록했다. 이 분석 후, 동일 평판 판독기에서 AMC 형광도의 표준 곡선을 만들어 형광 단위로부터 분석 중에 방출된 μM 기질로 전환시키는데 사용했다. DMSO 중의 1mM AMC(Invitrogen)는 1x 직접 분석 완충액 중에 0.02mM로 희석했다. AMC 2배 연속 희석물 6개를 1x 직접 분석 완충액으로 20nM부터 0.625nM까지의 범위로 제조했다. AMC의 형광도는 전술한 바와 같은 분석 조건을 사용하여 측정하고, AMC 농도에 대한 형광도 그래프를 플로팅했다. 직선의 기울기를 계산하고, 이를 후속 계산에서 RFU를 μM로 전환시키는 전환계수로 사용했다.
FX의 FVIIa 활성화 반응속도상수는 기질 농도의 역수 대 기질 절단 속도의 역수(초2 단위)에 대해 선형회귀분석을 수행하여 계산했고, Vmax , FVIIa는 y 절편의 역수로, Km , FVIIa는 y 절편에서의 기울기로, Vmax/Km , FVIIa는 기울기의 역수로 계산했다. 그 다음, kcat 값은 다음과 같은 방정식을 사용하여 수득했다:
kcat/Km , FVIIa = Vmax/Km , FVIIa x 1/(0.5 x k2 x [FVIIa, μM] x (RFU/μM 전환계수)
여기서, k2 = ([S] x kcat , FXa)/(Km , FXa + [S])이고, 여기서 kcat , FXa 및 Km , FXa는 kcat,FXa = 117초-1 및 Km , FXa = 164μM을 사용하여 실험적으로 측정한 SpectrofluorXa의 FXa 절단 상수이다.
상기 분석 조건을 사용하여 반응속도상수 k2는 88.1초-1인 것으로 측정되었다.
각 FVIIa 변이체의 Km 및 kcat는 이의 기질인 FX에 대해 각각의 촉매 활성 kcat/Km(M-1초-1)을 평가하기 위해 측정했다(표 12). 또한, 야생형 FVIIa 프로테아제(CB553-02)도 평가한 결과, 1.8 x 107 M-1초-1의 활성을 나타내는 것으로 관찰되었다. 문헌[Krishnaswamy, et al. J.Biol.Chem. (1998) 273: 8 4378-86]에 의해 측정된 제X 인자의 제VIIa 인자 활성화는 2.9 X 107 M-1초-1이다. 많은 변이체들은 비변형 프로테아제와 비슷한 활성을 나타냈다. 일부 경우에, FVIIa 변이체는 비변형 프로테아제에 비해 증강된 촉매 활성을 나타냈다. 에를 들어, CB558, CB561 및 CB563은 5.2x107, 4.3x107 및 5.9x107 M-1초-1의 촉매 활성을 나타냈다.
Figure 112009069306018-PCT00018
Figure 112009069306018-PCT00019
실시예 6. 용액 중에 촉매적 활성 프로테아제 농도의 측정
스톡 용액 중의 촉매적 활성 FVIIa 농도는 FVIIa의 비가역 펩타이드 저해제인 Phe-Phe-Arg-클로로메틸케톤(FFR-CMK)으로 제VIIa 인자와 가용성 조직인자(sTF)의 복합체를 적정하여 측정했다. 저해제는 FVIIa에 결합하나 FVII에는 결합하지 않는다. 고농도 FVIIa(50nM)의 연장된 항온처리는 프로테아제를 완전한 적정을 보장해준다. FFR-CMK와 항온처리 후에 FVIIa/TF 복합체의 잔류 활성은 최초 스톡 용액 중의 촉매적 활성 FVIIa의 농도를 측정하기 위해 계측했다.
A. 96웰 분석 평판 포맷
96웰 투명 하프에어리어 분석 평판(Nunc)은 각 웰에 1x 평판 완충액(100mM Tris pH8.4, 100mM NaCl, 0.01% BSA, 0.01% Tween-20) 150㎕/웰을 첨가하고 37℃에서 최소 1시간 동안 항온처리하여 예비처리했다. 완충액은 종이타월로 빨아들이고, 평판을 뒤집어 원심분리하여 남아있는 모든 완충액을 완전히 제거하고, 평판을 1시간 동안 공기건조한 뒤, 덮은 상태에서 실온(RT)에서 보관했다.
FVIIa/sTF/FFR-CMK 반응 혼합물을 제조하기 위해, FVIIa 스톡(American Diagnostica; 50% 글리세롤(v/v)에 5μM로 희석하고, 일정량은 -20℃에서 저온 보관했다) 또는 FVIIa 변이체를 먼저 1x 직접 분석 완충액(100mM Tris pH 8.4, 100mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.01% BSA)으로 500nM로 희석했다. 그 다음, 증류수 90㎕를 5x 직접 분석 완충액 36㎕, 500nM FVIIa 18㎕ 및 5μM sTF(재조합 사람 응고인자 III/가용성 조직인자; R&D Systems; 사용된 스톡 용액은 50% 글리세롤 중의 19.6μM이고, 1x 직접 분석 완충액으로 5μM로희석하고, 4℃에서 2주까지 보관했다) 18㎕와 혼합하여 FVIIa/sTF 혼합물을 제조했다. 그 다음, 상기 성분들이 실온에서 5분 동안 복합체를 형성하게 했다.
DMSO 중의 10mM FFR-CMK(Bachem) 스톡 용액(-20℃ 보관)은 물로 3.5μM로 희석했다. 폴리프로필렌 불투명 보관 평판(Costar #3363)의 한 줄을 사용하여, FFR-CMK를 물에 희석한 연속 2배 희석물을 96웰 불투명 평판의 11웰을 따라 제조하고, 이 줄의 마지막 웰에는 대조군으로써 물만을 첨가했다. 이것은 10x FFR-CMK 저해제 시리즈 용액이다. 예비처리된 96웰 투명 하프에어리어 분석 평판의 한 줄에 있는 각 웰에 FVIIa/sTF 혼합물 10.8㎕를 첨가하고, 그 다음 10x FFR-CMK 저해제 시리즈 1.2㎕를 첨가했다. 이 용액들을 잘 혼합하고, 평판을 <3000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 웰에 물방울을 없앴다. 평판을 덮어 37℃에서 8시간 동안 항온처리했다.
FVIIa/TF 복합체의 잔류 활성을 분석하기 위해, 기질 Spectrozyme FVIIa(American Diagnostica, #217L; 50μmol 바이엘을 5ml 증류수에 10mM로 재구성시킨 스톡, 4℃ 보관됨)와 5X 직접 완충액(500mM Tris pH 8.4, 500mM NaCl, 25mM CaCl2 및 0.05% BSA)의 혼합물은, 먼저 5x 직접 분석 완충액 360㎕를 Spectrozyme FVIIa 10mM 용액 180㎕ 및 물 1080㎕와 혼합하여 제조했다. 분석 평판의 각 웰에, 제조된 기질 용액 108㎕를 첨가했다. 이 웰을 혼합하고, 평판을 37℃에서 항온처리했다. 405nm에서 흡광도의 증가는 Spectramax Gemini M5 평판 판독기(Molecular Devices)에서 37℃ 하에 1시간 동안 매 30초마다 측정했다.
SoftMax Pro 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여, 흡광도율을 측정하고, 저해제와 항온처리된 프로테아제의 활성 분율(fractional activity)은 측정된 흡광도율을 미저해된 프로테아제의 흡광도율로 나누어 측정했다. 활성 분율은 FFR-CMK의 농도에 대하여 도표화하고, 미저해된 활성의 >90% 또는 <10%인 점들은 제외시켰다. 그 다음, 남은 점들을 통해 선을 작도하여 x 절편을 측정했고, 이것은 용액 중의 활성 프로테아제의 농도를 나타낸다. 다회 분석으로부터 값을 측정하고 평균화하여 표준편차를 측정했다.
B. 384웰 분석 포맷
적정의 정확도와 처리량을 증가시키기 위해, 상기 분석법을 384웰 평판 기반의 포맷으로 변형시켰다. 항온처리는 400nM 내지 53nM 범위에 걸친 FFR-CMK 농도 시리즈와 고 프로테아제 농도(250nM)에서 7시간 동안 실시했다. 잔류 활성은 FVIIa 기질(메실-dFPR-ACC)을 첨가하고 경시적으로 형광 시그널의 변화를 계측하여 측정했다.
간략히 설명하면, 384웰 블랙 분석 평판(Nunc)을 실시예 6에서와 같이 전처리했다. 그 다음, FVIIa/sTF 용액은 1μM FVIIa 32.5㎕ + 5μM sTF 19.5㎕ + 5X AST 완충액(100mM Na Hepes, pH 7.5, 750mM NaCl, 25mM CaCl2, 0.5% BSA, 0.5% PEG 8000) 6.5㎕와 dH2O 6.5㎕를 혼합하여 제조했다. 이 반응은 실온에서 5분 동안 항온처리했다. 384웰 평판의 절반에는 3반복으로 측정된 5개 프로테아제, 및 하나의 분석 대조 샘플을 담는다. FVIIa/sTF 항온처리 동안, 20mM FFR-CMK를 1mM HCl에 8μM로 희석시킨 후, 96웰 평판을 따라 9개의 연속 1.25배 희석을 실시했다. 이 줄의 남은 두 웰에는 1mM HCl만을 남겨두었다. 이 줄은 다시 1X AST 완충액으로 10배 희석하고, 혼합하여 800nM에서 107nM까지 FFR-CMK 농도 시리즈를 만들었다. 384웰 평판의 각 줄에, FFR-CMK 희석 시리즈 4㎕를 피펫팅했다. 그 다음, FVIIa/sTF 용액 4㎕를 평판의 11개 컬럼을 따라 저해제 시리즈와 혼합했다. 마지막 세로행에는 평판 블랭크로 작용하는 1X AST 완충액 4㎕를 주입했다. 평판을 원심분리하고, 밀봉한 뒤, 실온에서 진탕하에 7시간 동안 항온처리했다. 분석은 1X AST 완충액에 희석된 110μM 메실-dFPR-ACC 72㎕로 개시했다. 형광도의 증가는 Ex:380nm 및 Em:460nm 하에 37℃에서 45초마다 판독하여 20분 동안 모니터했다. 데이터는 다음과 같은 정제하에, 실시예 6에서와 같은 방식으로 분석했다. 첫째, 잔류 활성은 프로테아제 단독 활성의 20%와 80% 사이의 활성에만 국한시켰다. 둘째, 선형 적합의 y 절편은 0.9와 1.1 사이에 오도록 제한했다. 셋째, x 절편은 125nM과 375nM 사이이도록 제한했다. 각 프로테아제의 3 반복물의 x 절편은 평균을 내어, 그 값과 표준편차를 기록했다.
실시예 7
FVIIa/TF의 TFPI 저해에 대한 IC 50 의 측정
TFPI와 FVIIa/TF 복합체 간에 상호작용의 역가는 스펙트라자임 VIIa에 대한 FVIIa/TF의 촉매 활성에 미치는 다양한 농도의 TFPI의 저해 수준을 측정하여 평가했다. 50% 저해(IC50)에 요구되는 TFPI의 농도는 각 FVII 변이체 및 FVIIa 표준물질마다 계산했다.
96웰 투명 하프에어리어 분석 평판(Nunc)은 각 웰에 1x 평판 완충액(100mM Tris pH 8.4, 100 mM NaCl, 0.01% BSA, 0.01% Tween-20) 150㎕/웰을 첨가하고 최소 1시간 동안 37℃에서 평판을 항온처리하여 전처리했다. 완충액은 평판을 진탕시킨 다음 압지로 빨아들이고 평판을 뒤집어 원심분리하여 남아있는 완충액을 제거함으로써 완전히 제거했다. 평판을 1시간 동안 공기건조하고 실온(RT)에서 보관했다.
1.7ml 미세원심분리관(저 부착 미세원심분리관, ISC Bioexpress 제품)에서, FVIIa/TF의 혼합물은 250nM FVIIa(American Diagnostica, CB553-02 또는 각 시험 변이체) 9㎕, 2x TF(Innovin; Dade Behring; 동결건조 제품을 10mL 증류수에 재현탁하여 2X TF를 만들고, 이는 7nM 지질화된 TF와 대략 동일하다) 337.5㎕, 5x 분석 완충액(500mM Tris pH 8.4, 500mM NaCl, 25mM CaCl2, 0.05% BSA) 90㎕ 및 물 13.5㎕와 혼합하여 총 용적 450㎕인 5nM FVIIa와 5.2nM TF를 함유하는 용액을 만들었다. 이 혼합물을 실온에서 5분 동안 항온처리하여 성분들을 복합체화시켰다. 전처리된 96웰 투명 하프에어리어 분석 평판의 2 세로줄의 각 웰에, 각 FVIIa/sTF 혼합물 25㎕를 첨가하고, 평판을 덮어서 증발을 방지했다.
사람 재조합 TFPI(R&D Systems)는 먼저 50% 글리세롤(v/v) 33㎕에 용해하여, -20℃에서 보관하기 위한 10μM 스톡을 제조했다. TFPI 스톡은 다시 다음과 같이 폴리프로필렌 보관 평판에 최종 1X 직접 완충액(100mM Tris pH 8.4, 100mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.01% BSA)으로 1.5μM로 희석했다: 시험된 각 프로테아제마다, 1.5μM 농도의 TFPI 87.5㎕는 13.1㎕ 10μM TFPI와 17.5㎕ 5x 분석 완충액 및 56.9㎕ 증류수를 혼합하여 제조했다. TFPI 용액의 3배 희석물 시리즈는 27.5㎕ TFPI를 55㎕ 1x 분석 완충액에 혼합해 1x 분석 완충액으로 제조하여, 750nM, 250nM, 83.3nM, 27.8nM, 9.26nM, 3.1nM 및 1.03nM TFPI를 함유하는 용액을 제조했다. 이 시리즈의 최종 웰에는 대조군으로서 1X 직접 완충액만을 함유하게 했다.
각 TFPI 희석물 25㎕를 FVIIa/TF 혼합물을 함유하는 96웰 투명 하프에어리어 분석 평판의 2 세로줄의 2 웰(즉, 이반복)에 첨가하여, 프로테아제 혼합물이 각 TFPI 희석물과 이반복으로 분석되게 했다. TFPI 무함유 1x 분석 완충액 용액은 FVIIa/TF 혼합물을 함유하는 2웰에 음성 대조군으로 첨가했다. 평판은 순간 교반하고, 3000rpm에서 5분 동안 원심분리한 뒤, 37℃에서 1.5시간 동안 항온처리했다.
스펙트라자임 VIIa(American Diagnostica) 스톡 용액은 50μmol을 5ml 증류수에서 10mM로 재구성시키고, 사용할 때까지 4℃에 보관했다. 사용직전에, 용액을 증류수에 600μM로 희석했다. 상기 분석 평판의 항온처리 후, 분석 평판의 각 웰에 희석된 스펙트라자임 VIIa 10㎕를 첨가했다. 반응물을 혼합하고, 평판을 37℃에서 항온처리했다. 405nm에서의 흡광도 증가는 37℃에서 1시간동안 매30초 마다 측정하고, 흡광도율은 SoftMax Pro 소프트웨어(Molecular Devices)로 계산했다.
TFPI에 의한 저해도를 측정하기 위해, TFPI를 함유하는 프로테아제 반응의 흡광도율을 먼저 TFPI 무함유 반응물(대조군 샘플)의 흡광도율로 나누어 활성 분율을 수득하고, 각 TFPI 농도의 log10을 측정했다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여, log10[TFPI]는 각 프로테아제의 활성 분율에 대해 플로팅하고, 활성 데이터의 상한과 하한을 각각 1과 0으로 정하였을 때 곡선 적합으로 용량 반응 곡선을 작도했다. 상기 소프트웨어를 사용하여, TFPI 저해를 각 프로테아제마다 log IC50(pIC50) 값과 절대 IC50(TFPI 저해도, nM)으로 측정하고, 이의 평균과 표준편차를 구하였다.
sTF와 복합체를 형성한 각 FVIIa 변이체의 TFPI 저해도는 IC50 또는 pIC50으로 측정하여 나타냈다(표 13). sTF와 복합체를 형성한 비변형 FVIIa(CB553-02)의 활성을 저해하는 TFPI의 정도도 측정했고, IC50은 88nM인 것으로 관찰되었다. 수득된 FVIIa 변이체 9가지는 IC50 값의 증가로 반영되듯이 TFPI와의 상호작용의 감소된 역가를 나타냈다.
Figure 112009069306018-PCT00020
Figure 112009069306018-PCT00021
실시예 8
야생형 FVIIa 응고촉진 활성의 생체내 평가
혈우병 A의 마우스 모델은 FVIIa 폴리펩타이드의 응고촉진 활성을 평가하기 위해 형성시켰다. 혈우병 A는 항-FVII 항체를 투여하여 CD-1 마우스에 유도했고, 그 다음 출혈을 일으키기 위해 꼬리 끝을 수술로 절단했다. 그 다음, 마우스를 FVIIa 폴리펩타이드로 치료하고, 출혈이 멈출때까지의 시간과 이 시간동안 흘린 혈액의 양을 측정하여 FVIIa 폴리펩타이드의 응고촉진 활성을 수득했다.
수컷 CD-1 마우스는 티오바르비탈 소듐 100mg/kg과 케타민 100mg/kg을 복강내 투여하여 마취시켰다. 리도카인은 감수성을 감소시키기 위해 복측 목으로 피하 주사하여 투여했다. 기관지는 경동맥에는 목에 작은 피부 절개를 통해 캐뉼라를 삽입하여 정상 호흡과 항-제VIII 인자 항체, 재조합 사람 제VIIa 인자(rhFVIIa) 및/또는 변형 FVII 폴리펩타이드의 투여를 용이하게 했다.
캐뉼라 삽입된 마우스에게 3.76mg 양-항-사람 FVIII 항체(Affinity Biologicals, lot IG129R4, 612 마우스 BU/ml) 40㎕를 투여했다. 이 용량은 항-사람-FVIII 0.376, 0.94, 1.88 및 3.76mg을 사용하는 항체와 초기 용량 반응 실험을 수행하고, 혈액 유실 및 출혈 시간을 평가하여 측정했다. 20분 후, 마우스의 꼬리는 39℃ 인산염 완충 식염수(PBS)를 함유한 15ml 튜브에 10분 동안 넣어두었다. 30분째, 꼬리에서 PBS 용액을 간단히 제거하고, 꼬리 끝 5mm를 잘라 출혈을 일으켰다. 출혈 개시 시간을 기록했다. 그 다음, 꼬리를 다시 39℃ PBS를 함유하는 튜브에 넣고, 마우스가 항-FVIII 항체에 반응하는지 확인하기 위해 5분 동안 출혈이 나게 방치했다(예비출혈). 예비출혈 후, 마우스에게 FVIIa 폴리펩타이드 또는 FVIIa 단백질이 제조되고 전달되는 비히클을 투여했다. FVIIa 폴리펩타이드는 PBS 또는 52mM 염화나트륨, 10.2mM 염화칼슘 탈수화물, 9.84mM 글리실글리신, 0.01% 폴리소르베이트 80 및 165mM 만니톨로 구성된 완충액에 희석했다. FVIIa 제조물은 경동맥 캐뉼라를 통해 3ml/kg과 동등한 용량으로 1, 3 또는 10mg/kg을 투여하고, 꼬리를 39℃ PBS를 함유하는 새 튜브에 넣었다. 출혈을 20분 동안 모니터하고, 출혈이 멈춘 시간을 기록했다. 총 출혈 시간은 예비출혈 동안의 출혈 기간과 FVIIa 폴리펩타이드, PBS 또는 완충액의 투여 후의 출혈 기간의 합으로 계산했다.
출혈 에피소드 동안 흘린 혈액의 양을 측정하기 위해, 15ml 튜브의 내용물을 가지고 헤모글로빈 함량을 분석했다. 트리톤 X-100을 멸균수에 1:4로 희석하고 100㎕를 샘플 1ml에 첨가하여 지혈을 용혈을 유발했다. 그 다음, 샘플의 흡광도를 546nm의 파장에서 측정했다. 흘린 혈액의 양을 계산하기 위해, PBS에 희석하여 전술한 바와 같이 트리톤 X 100으로 용혈시킨, 공지된 용적의 쥐 혈액의 546nm에서의 흡광도를 측정하여 작도한 표준 곡선에 대하여 흡광도를 판독했다.
전술한 바와 같이 수득된 rhFVIIa(CB533)를 시판 재조합 사람 FVIIa(NovoSeven®, Novo Nordisk)와 비교하는 실험을 수행하고, 각 단백질 3mg/kg 용량을 투여한 후의 혈액 유실을 평가했다. 비히클 그룹(완충액, n=15)에서의 혈액 유실은 20분 기간 동안 671.9±57.89㎕이었다. 이것은 카탈리스트 바이오사이언시스에서 만든 rhFVIIa에 의해 264.1±56.59㎕로, NovoSeven®에 의해 273.7±53.93㎕(n=14)로 감소되었다. 본 실험은 두 단백질 간의 동등성을 입증했다.
실시예 9
FVIIa 폴리펩타이드의 약동학적 분석
FVIIa 폴리펩타이드의 약동학적 성질은 마우스 혈장에 존재하는 사람 제VIIa 인자의 양을 측정하여 평가했다. 혈장 중의 FVIIa를 정량분석하기 위해 2가지 분석법을 사용했다. 마우스 혈장 중의 총 FVIIa 단백질을 정량하기 위해 ELISA를 사용했고, 혈장 중의 FVIIa 폴리펩타이드의 응고제 활성을 정량하기 위해 FVIIa-의존적 응고 분석(FVII:C)을 사용했다.
A. 마우스에 FVIIa 폴리펩타이드의 투여
변형 FVIIa 폴리펩타이드 및 비변형 재조합 사람 FVIIa(rhRVIIa) 단백질(NovoSeven®, Novo Nordisk)은 약동학 연구에서 평가했다. 각 연구를 위해, 18마리의 수컷 CD-1 마우스에 정맥내 일시주사 용량(0.1-3.0mg/kg, 연구에 따라)의 rFVIIa를 주사했다. 주사후 5, 15, 30, 60, 120 및 240분에 각 주사 프로토콜로부터 마우스 3마리를 CO2 질식으로 안락사시키고, 경피 심장 천공을 통해 1.0ml 주사기로 약 1.0ml의 혈액을 뽑아냈다. 각 주사기에는 혈액 1ml당 3.2%의 최종 농도가 되도록 충분한 시트르산나트륨을 미리 주입해 두었다. 혈액 샘플은 그 다음 9000rpm으로 4℃에서 8분 동안 원심분리했다. 표지된 각 1.5ml 튜브(Eppendorf)에 혈장을 분리해내고, 액체 질소에서 순간 동결시킨 후, -80℃에 보관했다. 또한, 실험마다 마우스 1마리에게는 비히클만을 주사하고(모의), 이 마우스 유래의 혈장은 FVIIa 활성 측정의 배경으로 사용했다.
B. ELISA 분석
ELISA로 혈청 중의 FVII 단백질을 측정하기 위해 시판 키트, IMUBIND® Factor VII ELISA(American Diagnostica)를 사용했다. 이 키트는 단백질 포착을 위해 항-FVII/FVIIa 항체로 사전코팅된 평판을 이용하고, 스트렙타비딘 표지된 양고추냉이 퍼옥시아제를 통해 검출하기 위해 비오틴화된 항-FVII 항체를 이용한다. 이 키트는 다음을 제외하고는 제조업자의 지시에 따라 사용했다: 첫째, 표준 곡선은 전체 농도 범위에서 선형 범위가 되도록 협소화시켰고, 농도 범위는 0.88ng/ml에서 10ng/ml이다; 둘째, 항체 친화도의 차이때문에 키트에서 제공하는 FVII 표준물보다는 정제된 FVIIa 변이체 자체를 표준 곡선에 사용했다. 본 실험은 FVIIa의 잠재적 혈장 저해제인 안티트롬빈 III(ATIII)과 FVIIa의 복합체가 75%의 유리 프로테아제 수준에서 검출되며, 이는 이 분석법이 혈장 샘플에 활성 및 비활성 형태로 존재하는 총 FVIIa를 검출할 수 있다는 것임을 시사했다.
간략히 설명하면, 혈장 샘플은 실온에서 해동하고, 샘플 완충액(PBS + 0.1% Triton X-100 + 1.0% BSA)에 10배로 희석한 뒤, 연속 5.5배 희석하여 4개의 희석물을 수득했다. 희석된 4개의 샘플을 ELISA 평판 위에 2배 희석하여, 20, 110, 605, 3327.5배의 최종 샘플 희석물을 수득했다. 이러한 4개의 마우스 혈장 희석물은 프로테아제 농도 범위 33,000ng/ml부터 20ng/ml에 이르는 것이었다. 각 샘플은 2개의 다른 분석 평판에서 측정하고, 표준 곡선 범위 내의 상기 측정값을 이용하여 혈장 샘플 중의 FVIIa 변이체의 농도를 계산했다.
C. 응고 분석
시판 키트(STACLOT FVIIa-rTF, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ)를 응고 분석에 사용했다. 활성 FVIIa 폴리펩타이드의 응고제 활성을 측정하기 위해, 혈장 샘플을 FVIIa 의존적 응고 분석법(FVII:C)으로 분석했다. 이 분석법은 시판 키트에서 제공하는 시약과 기구를 사용하여 수행했고, 응고 시간은 전기기계적 응괴 검출 기구(STArt4, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ)를 사용하여 측정했다. 키트는 다음과 같은 예외 하에 제조업자의 지시에 따라 사용했다: 첫째, 정제된 FVIIa 변이체 자체는 키트에서 제공한 rhFVIIa 표준물보다 표준 곡선을 작도하는데 사용했고; 둘째, 다음과 같은 벌크 시판 시약을 통상의 약동학 스크리닝 연구에 사용했고, 키트 시약[가용성 조직인자(CalBioChem, La Jollar, Ca) 및 합성 인지질 블렌드(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), TBSA 완충액(Tris-NaCl, pH7.5, 1% BSA; DiaPharma, West Chester, Ohio) 및 25μM 염화칼슘 용액(Diagnostica Stago, Parsippany, NJ]과 비슷한 결과를 제공했다.
응고 분석은 다음과 같이 수행했다. 동결된 혈장 샘플은 실온에서 약 45분 동안 해동시키고, 그 다음 완충액에 1:5000으로 희석했다. 희석된 혈장 50㎕를 제VII 인자 결핍성 사람 혈장 50㎕ 및 재지질화된 조직인자 50㎕와 배합하고, 180초 동안 사전항온처리했다. 사전항온처리 후, 응고 개시를 위해 염화칼슘 용액(25μM) 50㎕를 첨가했다. 응고 시간은 전기기계적 응괴 검출을 사용하여 측정했다. 각 혈장 샘플은 이반복으로 분석했다. 이 시스템은 분석되는 특이적 FVIIa 변이체의 공지된 양을 함유하는 완충액의 연속 희석물의 응고 시간으로 표준 곡선을 작도하여 보정했다. 마우스 혈장 샘플 중의 FVIIa 농도는 log FVIIa 대 Log 응고 시간 표준 곡선의 선형 부분으로부터 계산했다. 제VII 인자 결핍성 혈장에서 응고를 유도하는 혈장 샘플의 능력은 모의 처리된 마우스 유래의 혈장에 존재하는 내인성 야생형 FVIIa의 배경 감산 후에 마우스 혈장의 FVIIa/ml로 기록했다.
각 FVII 단백질의 반감기는 통상적으로 직선에 대해 활성의 자연 log의 통상적인 적합(fit)을 만들고, FVIIa 단백질의 활성이 절반으로 감소되는 시간을 계측하여 통상적으로 측정했다. 다중 지수 붕괴를 보유하는 FVII 단백질에 대해 log 혈장 대 시간 프로필의 마지막 부분에서 반감기를 측정했다. 추가의 약동학적 매개변수는 시판 소프트웨어(WinNonLin v5.1, Pharsight Corporation, Mountain View, CA)를 사용하여 계산했다.
D. CB728, CB735 및 CB945의 약동학적 성질
상기 프로토콜을 사용하여, 야생형 FVIIa 및 2개의 FVIIa 변이체, 즉 CB728, CB735 및 CB945의 약동학적 성질을 평가했다. 그 결과는 표 14에 제시했다. CB735 및 CB945는 야생형 FVIIa에 비해 향상된 약동학적 매개변수를 나타냈다.
Figure 112009069306018-PCT00022
E. CB558 의 약동학적 성질
약간의 변형 하에 전술한 바와 유사한 약동학 연구에서 TFPI에 대한 내성 증가를 나타내는 변형 FVIIa 폴리펩타이드(CB-558: K297E 돌연변이 함유)의 반감기를 측정하고, 비변형 재조합 사람 FVIIa(rhFVIIa) 단백질(NovoSeven®, Novo Nordisk)의 반감기와 비교했다. 15마리의 수컷 CD-1 마우스에게 CB-558 0.5mg/kg 정맥내 일시주사 용량을 주사하고, 15마리 마우스에게 rhFVIIa 0.5mg/kg 정맥내 일시주사 용량을 주사했다. 주사 후 5, 15, 30, 60 및 120분째, 각 주사 프로토콜의 마우스 3마리를 CO2 질식으로 안락사시키고, 경피 심장 천공을 통해 1.0ml 주사기로 약 1.0ml의 혈액을 뽑아냈다. 각 주사기에는 혈액 1ml당 3.2%의 최종 농도가 되도록 충분한 시트르산나트륨을 미리 주입해 두었다. 혈액 샘플은 그 다음 9000rpm으로 4℃에서 8분 동안 원심분리했다. 표지된 각 1.5ml 튜브(Eppendorf)에 혈장을 분리해내고, 액체 질소에서 순간 동결시킨 후, -80℃에 보관했다.
활성 FVIIa 폴리펩타이드의 응고제 활성 및 반감기를 측정하기 위해, 혈장 샘플은 FVIIa 의존적 응고 분석(FVII:C) 및 자동 지혈 기구(AMAX 190plus, Trinity Biotech)를 이용하여 Machaon Diagnostics, Inc.(Oakland, CA)에서 평가했다. 간략히 설명하면, 동결 혈장 샘플을 37℃ 수조에서 5분 동안 해동시키고, 그 다음 베로날 완충액에 1:40으로 희석했다. 희석 혈장 6㎕를 큐벳 중의 베로날 완충액 54㎕에 첨가하고, 금속 비드와 혼합했다. 이 큐벳에 그다음 동량(60㎕)의 제VII 인자 결핍성 사람 혈장(Precision Biologic)을 첨가하고, 일정한 혼합 하에 37℃에서 60초 동안 항온처리했다.
반응 타이밍의 시작을 개시시키기 위해, 트롬보플라스틴(토끼 뇌 근원, 트롬보플라스틴-DS; Pacific Hemostasis) 120㎕을 큐벳에 첨가하고, 일정한 혼합을 유지시켰다. 응고 반응은 피브린 형성을 검출하기 위해 405nm에서 광학적으로 모니터했다. 이 시스템은 공개된 FVII 수준의 대조 혈장의 연속 희석물(Percision Biologic)의 응고 시간을 분석한 뒤, 정상 대조군 혈장(Precision Biologic) 및 비정상 대조군 혈장(Precision Biologic)의 응고 시간을 분석하여 보정했다.
제VII 인자 결핍성 혈장에서 응고를 유도하는 혈장 샘플의 능력은 정상 사람 혈장에서 관찰된 응고 시간의 백분율로 기록했다. FVIIa(NovoSeven®)-처리 및 CB-558 처리된 마우스 유래의 혈장의 응고제 활성은 경시적으로 감소했다. 각 FVII 단백질의 반감기는 직선에 대한 활성의 자연 log의 통상적인 적합을 만들고 FVIIa 단백질의 활성이 절반으로 감소되는데 걸리는 시간을 계측하여 측정했다. CB-558의 반감기는 FVIIa(NovoSeven®) 반감기의 약 2배인 것으로 관찰되었다; 156분 대 67분.
실시예 10
다른 FVII 변이체의 제조
연속 추가 FVII 돌연변이체는 FVII의 하나 또는 그 이상의 성질 및/또는 활성을 변경시키기 위해 제조했다. TFPI 내성을 증가시키는 변형 외에, AT-III에 대한 내성 증가, 촉매 활성 증가, 반감기 증가 및/또는 활성화된 혈소판과 같은 인지질에 대한 친화도 및/또는 결합성 증가를 도모하는 변형을 설계했다. 이 변형들은 아미노산 교체, 삽입 및 결실을 포함한다. 또한, 2 이상의 변형을 함유하는 FVII 변이체도 제조했다. 표 23에는 제조되어 Freestyle™ 293-F 세포에서 발현되는 FVII 변이체를 제시한다. 아미노산 교체는 적당한 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 상기 실시예 2.B에 기술된 방법에 따라 FVII 폴리펩타이드에 혼입시켰다.
이하 표 15는 제조된 다른 FVII 변이체를 설명한다. Gla 교환 FVII 변이체는 야생형 FVII 단백질의 N-말단에 아미노산 잔기 A1 내지 Y44(성숙 FVII 번호매김에 의해)를 FIX, FX, 단백질 C, 단백질 S 또는 트롬빈의 Gla 도메인에 상응하는 아미노산 잔기로 교체하여 제조했다. "Gla 교환 FIX" FVII 변이체(즉, 내인성 Gla 도메인을 FIX의 Gla 도메인으로 교체시킨 FVII 폴리펩타이드)는 N-말단에 서열번호 110의 아미노산 잔기 A2 내지 Y45를 함유하고; "Gla 교환 FX" FVII 변이체는 N-말단에 서열번호 111의 아미노산 잔기 A1 내지 Y44를 함유하며; "Gla 교환 단백질 C" FVII 변이체는 N-말단에 서열번호 113의 아미노산 잔기 A1 내지 H44를 포함하고; "Gla 교환 단백질 S" FVII 변이체는 N-말단에 서열번호 114의 아미노산 잔기 A1 내지 Y44를 함유하고; "Gla 교환 트롬빈" FVII 변이체는 N-말단에 서열번호 115의 아미노산 잔기 A1 내지 Y44를 함유한다.
Figure 112009069306018-PCT00023
Figure 112009069306018-PCT00024
실시예 11
기질인 제X 인자에 대한 FVIIa 변이체의 촉매 활성의 분석
기질인 제X 인자(FX)에 대한 FVIIa 변이체의 촉매 활성은 FVIIa에 의해 활성화 시에 생성되는 FXa가 합성 기질 Spectrafluor FXa에 대해 나타내는 활성을 분석하여 2가지 종류의 발색원성 분석을 통해 간접적으로 평가했다. 두 분석법은 TF 의존적 및 TF 독립적 활성을 평가하기 위해 지질화된 조직인자의 존재 또는 부재 하에 수행했다. FVII 변이체는 상기 실시예 2 및 3에 기술된 바와 같이 발현, 정제 및 FVIIa로 활성화시켰다. 대부분의 FVII 변이체는 Freestyle™ 293-F 세포에서만 발현되었지만, 일부는 BHK-21 세포에서도 발현되었다.
지질화된 조직인자 간접 검정법
조직인자의 존재 하에 FVIIa 변이체의 촉매 활성은 약간의 변형 하에 상기 실시예 5에 기술된 분석법을 사용하여 평가했다. 이러한 1가지 변형은 배경 활성을 감소시키기 위해 ERG-CMK 및 FFR-CMK로 처리한 제X 인자 기질 프로테아제(Molecular Innovations)를 사용한 것이다. 2가지 다른 검정법을 사용하여 2가지 종류의 데이터 분석을 수행했다: 선형 범위 분석 검정법 및 쌍곡선 범위 분석 검정법. 선형 범위 분석 검정법은 용량 곡선의 선형 범위에서 반응속도 상수의 정확한 측정을 위해 0 내지 150nM 사이의 제X 인자 농도 범위를 사용했다. 이에 반해, 쌍곡선 범위 분석 검정법은 포화(쌍곡선) 용량 곡선으로 반응속도상수를 정확히 측정하기 위해 0 내지 1.44μM 사이의 제X 인자 농도 범위를 사용했다.
선형 범위 데이터 분석을 이용한 지질화된 조직인자 간접 검정법은 다음과 같은 변형외에 대부분 상기 실시예 5에 기술된 바와 같이 수행했다. FVIIa 변이체/TF 용액은 0.1nM FVIIa/0.4nM TF 용액으로 제조하고, 30분간 항온처리한 후, 0.4nM TF에 2배 희석하여 1.5625 pM FVIIa/0.4nM TF를 함유하는 용액을 수득했다. FVIIa/TF 용액 25㎕를, 1.0mM Spectrofluor FXa(American Diagnostica) 및 300nM, 200nM, 133.3nM, 88.9nM, 59.3nM, 39.5nM, 36.3nM 또는 0nM의 제X 인자(Molecular Innovations) 중 하나를 함유하는 기질 용액 25㎕와 혼합했다. 따라서, 이 검정법의 최종 농도는 50㎕/웰 중에 0.8pM FVIIa, 0.2nM TF, 0.5mM Spectrofluor FXa 및 150nM, 100nM, 66.7nM, 44.4nM, 29.6nM, 19.8nM, 13.2nM 또는 0nM의 제X 인자(Molecular Innovations)였다. 후속 계산에서 RFU의 μM로의 전환 인자로서 사용된 AMC 표준 곡선은 0μM 내지 100μM AMC를 커버하는 용량 범위를 포함하도록 연장시켰다.
쌍곡선 범위 데이터 분석을 이용한 지질화된 조직인자 간접 검정법은 다음과 같은 변형외에 대부분 상기 실시예 5에 기술된 바와 같이 수행했다. FVIIa 변이체/TF 용액은 0.1nM FVIIa/0.4nM TF 용액으로 제조하고, 30분간 항온처리한 후, 0.4nM TF에 2배 희석하여 1.5625 pM(또는 고활성인 것으로 예상되는 프로테아제는 0.78pM) FVIIa/0.4nM TF를 함유하는 용액을 수득했다. FVIIa/TF 용액 25㎕를, 1.0mM Spectrofluor FXa(American Diagnostica) 및 1440nM, 720nM, 360nM, 180nM, 90nM, 45nM, 22.5nM 또는 0nM의 제X 인자(Molecular Innovations) 중 하나를 함유하는 기질 용액 25㎕와 혼합했다. 따라서, 이 검정법의 최종 농도는 50㎕/웰 중에 0.8(또는 0.39)pM FVIIa, 0.2nM TF, 0.5mM Spectrofluor FXa 및 7nM, 720nM, 360nM, 180nM, 90nM, 45nM, 22.5nM, 11.25nM 또는 0nM의 제X 인자(Molecular Innovations)였다. 형태 (Vmax/(1+(Km/x))의 마이켈리스 멘텐 쌍곡선 방정식을 사용하여 kcat 및 Km 매개변수를 계산했다. 후속 계산에서 RFU의 μM로의 전환 인자로서 사용된 AMC 표준 곡선은 0μM 내지 100μM AMC를 커버하는 용량 범위를 포함하도록 연장시켰다.
FX의 FVIIa 또는 FVIIa 변이체 활성화를 위한 반응속도 상수를 측정하기 위해, SoftMax Pro 어플리케이션(Molecuar Devices)으로 수집한 미가공 데이터는 .XML 파일로 전송시켰다. 자동 곡선 적합용 소프트웨어 패키지 XLfit4 및 마이크로소프트 엑셀 스프레드시트 환경 내의 통계 분석(IDBS 소프트웨어)을 시용하여 추가의 데이터 선형 및 비선형 분석을 수행했다.
선형 범위 검정법으로 수집한 데이터에 대해서는, kcat/Km(M-1초-1) 반응속도 상수를 FX 농도 대 형광원성 기질 절단 속도(μM/초2)의 선형 회귀 분석의 기울기로부터 직접 계산했다(kcat/Km = 기울기/[FVIIa] x 0.5 x k2]. 보정계수 k2는 실시예 5에 기술된 방법을 이용하여 45로 측정되었고, Spectrofluor FXa의 FXa 절단의 반응속도 상수는, 활성 부위가 사전에 AT-III/헤파린으로 적정된, 활성화된 FX(FXa)를 이용하여 실험으로 측정된 kcat , FXa = 56 초-1 및 Km , FXa = 126nM이었다. 0.98 미만의 R2 값을 제공하는 데이터점의 배제는 통상의 적합에 사용되는 데이터 세트의 선형성을 보장해 주었다.
쌍곡선 범위 검정법을 이용하여 수집한 데이터의 분석들은 FX 농도 대 형광원성 기질 절단의 속도(μM/초2)의 비선형 회귀 분석으로부터 계산했다. 각 kcat 및 Km 매개변수는 (Vmax/(1+(Km/x))) 형태의 마이켈리스 멘텐 쌍곡선 방정식을 이용하는 적합 매개변수로 계산하며, 여기서 kcat = Vmax/[FVIIa] x 0.5 x k2 였다. 반응속도 상수 kcat/Km은 각 kcat 및 Km이 적합된 매개변수로부터 계산되었다.
조직인자 독립적인 간접 검정법
조직인자의 존재 하에 FVIIa 변이체의 촉매 활성은 조직인자가 포함되어 있지 않은 점외에는 전술한 바와 유사한 간접 검정법으로 평가했다. 따라서, TF 독립적 활성을 평가하는 분석법은 다음과 같은 변형 하에 대부분 전술한 바와 같이 수행했다. FVIIa 변이체 용액은 50nM로 희석했다. 각 FVIIa 용액 25㎕를, 1.0mM Spectrofluor FXa(American Diagnostica) 및 1050nM, 700nM, 466.7nM, 311.1nM, 207.4nM, 138.3nM, 92.2nM 또는 0nM의 제X 인자(Molecular Innovations) 중 하나를 함유하는 기질 용액 25㎕와 혼합했다. 따라서, 이 검정법의 최종 농도는 50㎕/웰 중에 25nM FVIIa, 0.5mM Spectrofluor FXa 및 525nM, 350nM, 233.3nM, 155.6nM, 103.7nM, 69.1nM, 46.1nM 또는 0nM의 제X 인자(Molecular Innovations)였다. 데이터 분석은 어떠한 변형없이 상기 선형 범위 검정법에 기술된 바와 같이 수행했다.
표 16 내지 18은 FVIIa 변이체의 촉매 활성을 측정하기 위해 수행한 검정법의 결과를 제공한다. 표 15 및 16은 293-F 세포 및 BHK-21 세포로부터 각각 발현된 FVIIa 폴리펩타이드를 이용한 TF 종속적인 간접 검정법에서 측정된 촉매 활성을 제공하며, 표 17은 293-F 세포 및/또는 BHK-21 세포로부터 발현된 FVIIa 폴리펩타이드를 이용해서 TF 독립적 간접 검정법으로 측정한 촉매 활성을 제공한다. 결과들은 촉매 활성의 반응속도 상수, kcat/Km(M-1초-1)로 제공하고, 활성이 기질 FX에 대한 각 FVIIa 변이체의 촉매 활성 kcat/Km(M-1초-1)인, 야생향 FVIIa 활성의 백분율로서 나타낸다. 또한, 선형 또는 쌍곡선 범위데이터 분석의 사용도 이 표들에 제시된 값들을 위해 제시한다. 모든 FVIIa 변이체가 각 검정법으로 분석되지는 않았다. 상기 실시예 5에서 분석된 FVII 변이체의 일부는 실시예 5에 기술된 검정법에 비해 이 검정법들의 세트에서 FX의 약간 감소하거나 증가된 촉매 활성을 나타냈다. 실시예 5에서 관찰된 활성과 다른 활성 차이는 아메리칸 다이애그노스티카(American Diagnostica)에서 입수한 FX 기질에 존재하는 잔류 FXa의 상이한 배경 활성때문이다. 여러 FVIIa 변이체는 야생형 FVIIa 분자에 비해 증가된 촉매 활성을 나타냈다.예를 들어, Q366V 돌연변이를 함유하는 CB760은 야생형 FVIIa의 1.5 내지 5배 사이의 촉매 활성을 나타낸다.
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Figure 112009069306018-PCT00026
Figure 112009069306018-PCT00027
Figure 112009069306018-PCT00028
Figure 112009069306018-PCT00029
실시예 12
AT - III /헤파린에 의한 FVIIa / TF 또는 FVIIa 의 저해도 측정
가용성 조직인자(sTF)의 존재 또는 부재 하에, 즉 TF 의존적 또는 TF 독립적인, AT-III/헤파린 복합체와 FVIIa 간의 상호작용의 역가는 기질 메실-FPR-ACC에 대한 FVIIa/sTF의 촉매 활성에 미치는 다양한 농도의 AT-III의 저해 수준을 측정하여 평가했다. 시험된 각 FVIIa 변이체에 대해, 실온(약 25℃)에서 30분 검정법 중에 FVIIa 변이체를 50% 저해(IC50)하는데 필요한 AT-III의 몰 농도에 상응하는 K0 .5 값을 측정했다.
2가지 다른 검정법을 준비했는데, 하나는 TF 존재하의 검정법이고 다른 하나는 TF 부재하의 검정법이다. 2μM AT-III/헤파린 용액(최종 5mM 헤파린)은 151.7 μM AT-III(혈장 정제된 사람 AT-III; Molecular Innovations) 26.4㎕와 0.2mM LMW 헤파린(CalBiochem) 50㎕, 5x 분석 완충액(100mM Hepes, 750mM NaCl, 25mM CaCl2, 0.05% BSA, 0.5% PEG 8000, pH 7.4) 400㎕ 및 시약등급수 1.523ml를 혼합하여 제조했다. 이 용액은 TF 의존적 검정법에서 최고 농도로 사용하기 위한 것이다. TF 독립적 검정법에서 사용하기 위해, 151.7 μM AT-III(Molecular Innovations) 52.8㎕와 0.2mM LMW 헤파린(CalBiochem) 50㎕, 5x 분석 완충액 400㎕ 및 시약등급수 1.497ml를 혼합하여 4μM AT-III/헤파린 함유 용액(최종 5mM 헤파린)을 제조했다. 이 AT-III/헤파린 용액은 실온에서 5 내지 10분 동안 항온처리한 후, 깊은 96웰 폴리프로필렌 평판에서 5μM 헤파린을 함유하는 최종 1ml 용량으로 2배씩 희석하여, 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 및 0nM, 또는 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5 및 0nM의 희석물을 수득했다. FVIIa 변이체와 야생형 FVIIa는 1x 분석 완충액(20mM Hepes, 150mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.01% BSA, 0.1% PEG 8000, pH 7.4)에 250nM로 희석했다. TF 의존적 검정법을 위해, 5nM FVIIa/50nM sTF 복합체는 FVIIa 20㎕와 5μM sTF(R&D Systems Human Coagulation Factor III: #2339-PA) 10㎕, 5x 분석 완충액 200㎕ 및 시약등급수 770㎕를 혼합하고, 이 용액을 실온에서 10 내지 15분 동안 항온처리하여 제조했다. TF 독립적 검정법을 위해, FVIIa 100㎕는 5x 분석 완충액 200㎕ 및 시약등급수 700㎕와 혼합하여 25nM의 FVIIa 용액을 수득했다. 검정법을 개시하기 위해, FVIIa/TF 또는 FVIIa 단독 용액 25㎕를 각각 AT-III/헤파린 각 희석물 25㎕와 96웰 블랙 하프에어리어 분석 평판(Nunc)의 웰에서 혼합했다. TF 의존적 검정법의 최종 분석 조건은 2.5nM FVIIa/25nM sTF 및 1000nM 내지 0nM 범위의 AT-III/헤파린 농도였다. TF 독립적 검정법에서, FVIIa 농도는 12.5nM이고 AT-III/헤파린 농도는 2000nM 내지 0nM 범위였다. 평판들은 실온(약 25℃)에서 진탕하에 30분 동안 항온처리했다.
FVIIa 기질(메실-FPR-ACC)의 스톡 용액은 DMSO에 기질을 20mM로 용해한 뒤, 1x 분석 완충액에 0.5mM의 작업 용액을 준비하여 제조했다. 상기 분석 평판의 항온처리 후, FVIIa 기질 50㎕를 분석 평판의 각 웰에 첨가했다. 반응물을 혼합하고, FVIIa의 잔류 활성은 30℃로 설정된 형광 판독기에서 15분 동안 초기 기질 절단 속도 이후 평가했다.
FVIIa 또는 FVIIa 변이체에 대한 AT-III/헤파린의 저해 정도를 측정하기 위해, SoftMax Pro 어플리케이션(Molecuar Devices)으로 수집한 미가공 데이터는 .XML 파일로 전송시켰다. 추가의 비선형 데이터 분석은 자동 곡선 적합용 소프트웨어 패키지 XLfit4 및 마이크로소프트 엑셀 스프레드시트 환경 내의 통계 분석(IDBS 소프트웨어)을 사용하여 수행했다. 스프레드시트 주형은 AT-III 희석 시리즈, AT-III 대 FVIIa의 비율, 및 각 실험 AT-III 농도에서 각 FVIIa 복제물의 Vi/Vo 비를 계산하는데 사용했다. 잔류 FVIIa 활성(Vi/Vo 로 표시) 대 AT-III 농도의 비선형 회귀 분석은 ((C+(Amp*(1-(X/(K0.5+X))))) 형태의 쌍곡선 저해 방정식 및 XLfit4를 이용하여 수행했다; 여기서 C = 오프셋(분석 과정 동안 100% 저해에 도달하지 않는 데이터 세트의 외삽을 허용하기 위해 0으로 고정시킴), Amp = 적합의 진폭, 및 분석 조건 하에 최대의 1/2 저해에 필요한 AT-III 농도에 해당하는 K0.5. 여러 FVIIa 변이체에 대해, AT-III은 AT-III의 최종 시험 농도에서 총 프로테아제 활성의 20 내지 25% 미만으로 저해했고, 이는 이 검정법의 검출 상한을 나타낸다. 따라서, 20 내지 25% 미만의 최대 저해를 나타내는 변이체에는 낮은 범위의 K0 .5 값이 지정되었고(TF 의존적 검정 시 5μM 및 TF 독립적 검정 시 10μM), 대부분의 경우에 AT-III 내성은 보고된 값보다 큰 것으로 예상되었다.
표 19 및 20은 각각 TF의 존재 및 부재 하에 Freestyle™ 293-F 세포 및/또는 BHK-21 세포에서 발현된 FVIIa 변이체를 이용하여 수행한 검정법의 결과를 제공한다. 결과는 적합된 K0.5 매개변수 및 야생형 FVIIa 대비 각 변이체의 AT-III 내성의 정도를 이들의 적합된 K0 .5 값의 비로 표현한 값(K0 .5 변이체/K0 .5 야생형)으로 제시했다. 여러 FVIIa 변이체는 야생형 FVIIa에 비해 AT-III에 대한 증가된 내성을 나타냈다.
Figure 112009069306018-PCT00030
Figure 112009069306018-PCT00031
실시예 13
FVIIa 변이체의 TFPI에 대한 내성의 측정
TFPI에 대한 다양한 FVIIa 변이체의 내성은 상기 실시예 7에 기술된 검정법을 이용하여 평가했다. 표 21은 이 검정법의 결과를 제공한다. 결과는 야생형 FVIIa 대비 TFPI에 대한 각 FVIIa 변이체의 내성 배수로 나타냈다.
Figure 112009069306018-PCT00032
Figure 112009069306018-PCT00033
실시예 14
FVIIa 폴리펩타이드 응고촉진 활성의 생체내 평가
혈우병 A의 마우스 모델은 FVIIa 폴리펩타이드의 응고촉진 활성을 평가하기 위해 형성시켰다. 혈우병 A는 항-FVII 항체를 투여하여 CD-1 마우스에 유도했고, 그 다음 출혈을 일으키기 위해 꼬리 끝을 수술로 절단했다(실시예 8에서 기술한 바와 유사함). 또한, FVIII 결핍성 마우스(FVIII-/- 마우스)를 사용하고, 항-FVIII 항체로 처리하지 않았다. 그 다음, 마우스를 FVIIa 폴리펩타이드로 치료하고, 20분 동안 흘린 혈액의 양을 측정하여 FVIIa 폴리펩타이드의 응고촉진 활성을 수득했다.
A. 혈우병 A가 유도된 CD-1 마우스에서 FVIIa 응고제 활성의 분석
1차 실험은 CD-1 마우스에 혈우병을 유도하기 위해 복강내 경로로 투여하는 경우, 항-사람 FVIII 항체의 필요 용량 및 작용 시기 및 작용 기간을 측정하기 위해 실시했다. 항-FVIII의 제1 로트(lot 1: Affinity Biologicals, lot IG129R4)에서는 먼저 상기 실시예 8에 기술한 캐뉼라삽입 실험에 사용한 용량을 기초로 했다. 혈우병 상태를 유발하는 것으로 측정된 용량(20분 분석 기간 동안 제어되지 않는 출혈)은 7.54mg/마우스(94.25mg/ml 스톡 용액 80㎕)였다. 이 로트의 중화 활성은 612 마우스 BU/ml였다. 항-사람 FVIII의 제2 로트(lot 2; Affinity Biologicals, lot IG1577R2, 중화 활성 474 마우스 BU/ml)에서는 사용된 용량이 11.98mg/마우스(99.8 mg/ml 스톡 용액 120㎕)이었고, 꼬리 절단하기 6시간 전에 투여했다.
혈우병을 유도하기 위해, 수컷 CD-1 마우스(25-35g)에게 실험전에 항-FVIII lot1 또는 lot2를 복강내로 투여했다. 수컷 CD-1 및 FVIII-/- 마우스는 케타민/자일라진 칵테일(100mg/ml 용액)을 복강내 투여하여 마취시키고, 체온이 떨어지지 않도록 가열대(39℃)에 놓았다. 시술실의 온도는 82℉로 유지시켰다. 꼬리 절단 10분 전에, 꼬리는 예열된 PBS(15ml 원심분리관; 39℃) 10ml에 침지시켰다. 8 내지 10마리의 마우스에게 단일 주사로 꼬리 정맥을 통해, 52mM 염화나트륨, 10.2mM 염화칼슘 탈수물, 9.84mM 글리실글리신, 0.01% 폴리소르베이트 80 및 165mM 만니톨을 함유하는 완충액으로 희석된 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 재조합 사람 FVIIa(Novoseven®, Novo Nordisk)를 주사했다. 대조군으로서 마우스 1 그룹에게는 비히클만을 주사했다. 주사를 맞지 않았다면, 그 동물은 연구에서 배제시켰다. 시험 약제 또는 비히클 주사는 꼬리 절단 5분 전에 실시했다. 꼬리 절단은 꼬리 끝에서 5mm를 면도날을 이용하여 실시했고, 혈액을 20분 동안 PBS에 수집했다. 수집이 끝나면, 총 혈액 유실량을 측정했다. 수집 튜브를 혼합해서, 각 샘플 1ml 일정량을 분취해서 헤모글로빈 함량에 대해 분석했다. 트리톤 X-100은 멸균수에 1:4로 희석하고, 용혈이 일어나도록 1ml 샘플에 100㎕를 첨가했다. 그 다음, 샘플의 흡광도를 546nm 파장에서 측정했다. 흘린 혈액 양을 계산하기 위해, 흡광도는 공지된 용량의 쥐 혈액을 PBS에 희석하고 트리톤 X 100으로 상기와 같이 용혈한 후 546nm 흡광도를 측정하여 수득한 표준 곡선에 대하여 판독했다.
또한, CB553(야생형 FVIIa) 0.3, 1 또는 3mg/kg이 평가된 용량 반응 연구도 수행했다. 비히클만을 투여받은 마우스는 20분 분석 내에 1002.3 ± 60.71㎕의 유실량을 나타냈다. 이 양은 CB553 3mg/kg을 투여한 마우스에서 415.5±90.85㎕(p<0.05, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 다음 던(Dunn)의 포스트 시험을 사용 시)로 유의적으로 감소했다. 1mg/kg으로 용량 감소 시, 혈액 유실량은 679.57±83.95㎕였고, 더 낮은 0.3mg/kg 용량에서는 852.42±94.46㎕의 혈액 유실을 나타냈다.
별도의 연구에서, CB735(K341D) 및 CB945(M298Q/K341D)는 3mg/kg의 용량으로 평가했다. 대조군으로는 비히클 단독 주사를 사용했다. 비히클만 주사맞은 마우스 그룹은 20분 분석에서 803±92.18㎕와 813.1±82.66㎕ 사이의 혈액을 유실했다. 이것은 각각 746±110.5㎕와 870.9±78.38㎕의 혈액 유실을 나타낸 CB735 또는 CB945 처리 시와 유사했다.
B. FVIII -/- 마우스에서 FVIIa 응고제 활성의 분석
FVIII 결손성 마우스(FVIII-/- 마우스)를 이용한 혈우병 A 마우스 모델도, 항-FVIII 항체로 처리하지 않는 것을 제외하고는 전술한 바와 같은 프로토콜을 사용하여 FVIIa 폴리펩타이드의 응고제 활성을 평가하는데 사용했다.
1. 야생형 FVIIa 응고제 활성을 평가하는 용량 반응 연구
FVIII-/- 마우스에서 0.3, 1, 3 및 6mg/kg의 NovoSeven® 및 CB553의 응고제 활성을 평가하는 용량 반응 연구를 수행했다. NovoSeven® 실험에서, 비히클 그룹의 혈액 유실은 912.79±38.32㎕였고, 이는 NovoSeven® 6 및 3mg/kg 처리 시에 유의적으로 감소했다(각각 361.74±55.28㎕ 및 586.98±60.56㎕; p<0.05, 크루스칼-왈리스 다음 던의 포스트 시험 이용 시). 1mg/kg으로 용량 감소 시, 혈액 유실은 674.88±46.88㎕였고, 시험된 최저 용량에서는 801.08±41.39㎕였다. CB553 실험에서, 비히클 대조군은 904.08±15.38㎕의 혈액 유실을 나타냈다. 이것은 6mg/kg의 CB553으로 처리 시에 451.04±74.17㎕로 유의적으로 감소했다(p<0.05, 크루스칼-왈리스 다음 던의 포스트 시험 시). 3mg/kg으로 용량 감소 시, 혈액 유실값은 695.75±60.50㎕였고, 이 용량을 1 및 0.3mg/kg으로 더욱 낮추면, 혈액 유실값은 거의 비히클 대조군 수준(각각 846.08±34.17㎕ 및 936.43±31.39㎕)이었다.
실시예 15
가용성 조직인자에 대한 제VIIa 인자의 결합성 측정
HEK 293 또는 BHK 세포로부터 발현된 FVIIa 변이체가 가용성 조직인자(sTF)에 결합하는 능력은 바이어코어 표면 플라스몬 공명법으로 평가했다. FVIIa 변이체는 2개의 다른 수준의 sTF를 Biacore CM5 칩에 결합시켜, 2가지 이반복 실험으로 3개의 프로테아제 농도에서의 결합 프로필의 측정을 통해 평가했다.
새로운 Series S CM5 센서 칩(GE Healthcare Cat #BR 1006-68)에 Biacore T100 기구를 이용해서 소혈청 알부민 및 가용성 조직인자를 커플링시켰다. 커플링은 Amine 커플링 키트(GE Healthcare Cat # BR-1000-50) 및 Biacore T100 소프트웨어 중의 프로토콜 위저드와 함께 Biacore 커플링 완충액(30mM Na Hepes pH7.4, 135mM NaCl, 1mM EDTA, 0.01% Tween-20)을 사용하여 실시했다. 고정화를 위해, 총 4가지 셀의 칩을 사용했다. 셀 1 및 3에는 아세테이트 완충액 pH 4.0으로 희석한 500 반응 단위(RU) 소혈청 알부민 참조 단백질을 커플링시키고, 셀 2와 4에는 아세테이트 완충액 pH 4.5로 희석한 500 및 250RU의 sTF(R&D Systems)를 커플링시켰다.
각 FVIIa 변이체 및 야생형 FVIIa 프로테아제는 3개의 농도와 이반복으로 시험했다. 프로테아제는 96웰 분석 평판에서 100㎕ Biacore 분석 완충액(200mM Na Hepes, pH 7.4, 150mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.1% PEG 8000, 0.1% BSA, 0.01% Tween-20)으로 60nM, 30nM 및 15nM로 희석했다. 각 분석 샘플은 Biacore T100 기구에서 120초의 접촉시간과 그 다음 10㎕/분 유속으로 180초의 해리 시간을 이용해서 분석했다. 완충액 블랭크도 분석했다. 칩은 50mM EDTA, pH 7.0으로 60초, 그 다음 30초 처리하여 재생시켰다. sTF에 대한 야생형 FVIIa의 결합성을 측정하는 분석법은 약 8nM의 Kd를 제공하는 3개의 곡선 세트를 산출해야 한다.
데이터를 분석하기 위해 Biacore T100 평가 소프트웨어를 사용했다. 구체적으로, 데이터를 랑뮈르 등온식에 적합시키는 반응속도/친화도 1:1 결합 분석법을 이용했고, 데이터는 2 반응 단위 커플링에서 각 변이체의 2 복제물에 각각 적합시켰다. 4개의 적합 Kd 값을 평균화하여 표 22에 제시했다. M156Q 돌연변이를 함유하는 FVIIa 폴리펩타이드는 더욱 낮은 Kd 결과를 나타내고 이에 따라 sTF에 더욱 강하게 결합하는 경향이 있었다.
Figure 112009069306018-PCT00034
실시예 16
TFPI에 대한 내성에 있어서 FVIIa 변이체의 표면 플라스몬 공명(SPR) 스크리닝
사람 재조합 가용성 TFPI에 의한 저해에 대한 다양한 FVIIa 변이체의 상대적 내성은 Biacore T100 기구를 이용하는 고처리량 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석법으로 평가했다. TFPI에 의한 저해에 대하여 FVIIa 변이체가 나타내는 상대적 내성은 표준화된 주사 시간과 프로테아제 농도 이후 결합된 야생형 FVIIa의 양과 비교하여, Biacore CM5 센서 칩에 고정된 가용성 TFPI에 결합되는 FVIIa 변이체의 상대적 양을 측정하여 평가했다.
모든 실험에서, 가용성 TFPI(R&D Systems)는 아민 커플링 키트(Amine Coupling Kit; GE Healthcare)에 구비된 시약과 Biacore T-100 조절 소프트웨어(GE Healthcare) 내에서 이용가능한 아민 커플링 프로토콜을 사용하여 새로운 4-유동 셀 Biacore CM5 Series S 센서 칩(GE Healthcare)에 고정시켰다. 총 4가지 유용한 유동 셀을, 2가지 다른 밀도의 TFPI와 소혈청 알부민(BSA)(참조 셀에서 차단제로 사용됨)의 고정화에 사용했다. BSA는 아세트산나트륨(pH 4.0)에 5㎍/ml로 희석하고, 유동셀 1 및 3에서 각각 1000 및 2000 반응단위(RU)로 고정시켰다. TFPI 고정화를 위해, 동결건조된 가용성 TFPI(10㎍)를 1X 커플링 완충액(30mM Hepes, 135mM NaCl, 1mM EDTA, 0.01% Tween-20, pH 7.4) 100㎕에 0.1mg/ml 농도로 재현탁시켰다. 유동 셀 2와 4에 각각 1000 및 2000 RU로 고정시키기 위해, 0.1mg/ml TFPI 총 20㎕를 아세트산나트륨(pH 4.0)에 10㎍/ml로 희석했다. 커플링 완충액은 고정화 단계 동안 전개 완충액으로 사용했다.
FVIIa 각 샘플은 620nM sTF(Human Coagulation Factor III; R&D Systems)를함유하는 1X 전개 완충액(20mM Hepes, 150mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.1% PEG 8000, 0.1% BSA, 0.01% Tween-20, pH7.4)에 320nM의 최종 농도로 제조했다. 일반적으로, 각 FVIIa 변이체는 320nM로 최종 희석하기 전에 1X 전개 완충액에 10배씩 희석했다. FVIIa/sTF 복합체는 최고 48개의 특이한 FVIIa 변이체가 96웰 보관 평판에 부하되도록 120㎕의 최종 용량으로 이반복으로 제조하고, 단일 실험 진행에서 이반복 주사로 평가했다. FVIIa/sTF 복합체는 RT에서 10 내지 15분 동안 항온처리한 후, 1차 샘플 주사를 개시했다.
표준화된 결합 분석 방법은 Biacore Control Software(GE Healthcare) 내에서, 결합 시간 180초와 그 다음 10㎕/분의 유속 하에 짧은 60초의 해리 시간이 되도록 모든 FVIIa 복제물을 주입하여 수행했다. 센서 칩의 재생 이후, 10mM 글리신, 500mM NaCl, pH3.0으로 30초 처리하는 해리 단계와 그 다음 동일한 10㎕/분 유속의 1X 전개 완충액으로 처리하는 60초 안정화 기간을 수행했다. 각 전개와 후속 데이터 분석을 위해, 2가지 분석 참조 지점을 기록했는데, 그 하나는 결합 단계(결합)의 마지막 5초전이고 다른 하나는 해리 단계(해리)의 마지막 5초전이었다. 전체 분석을 개시하기 전에, 센서 칩은, 유동 셀 2(1000RU) 및 4(200RU)에 각각 약 400 내지 450RU 및 750 내지 850 RU의 결합 반응을 제공하는, 180초 동안 320nM 야생형 FVIIa/sTF의 단일 주입으로 시험했다.
데이터 분석은 먼저 Biacore T100 Evaluation Software(GE Healthcare)로 수행하여, 참조 세포에 대한 결합이 최소임을 입증하는 것, 기준선 상승(drift) 및 대조 블랭크 주입액(전개 완충액)의 결합을 포함하는 분석 확인 매개변수를 조사했다. 본 실험에서 결합 기록점과 해리 기록점 모두에서 결합된 FVIIa 변이체의 양(RU)을 나타내는 데이터 표가 수득되었다. 데이터 표는 이어서 마이크로소프트 엑셀 스프레트시트 환경에서 추가 분석하기 위해 전송했다. 미가공 데이터 점(결합된 RU)은 센서 칩에 대한 대조 결합성에 대해 보정하고, 그 다음 각 매개변수마다 야생형 FVIIa 결합량(RU) 대 FVIIa 변이체 결합량(RU)의 비를 구하고, 결합(야생형/변이체) 및 해리(야생형/변이체)로 기록했다. TFPI 저해에 대한 내성은 평가된 매개변수들 중 하나 또는 둘 모두에 대한 비의 증가로 반영된다. 예를 들어, 특정 FVIIa 변이체의 결합(야생형/변이체) 또는 해리(야생형/변이체) 값 20은 상기 변이체가 야생형 FVIIa보다 TFPI 저해에 대한 내성이 20배 더 크다는 것을 시사한다. 여러 변이체가 TFPI 저해에 대한 증가된 내성을 나타냈다. 예를 들어, CB609, CB637, CB691, CB856 및 CB857은 20 내지 60배의 내성을 나타내는 그룹이고, 성숙 FVII 번호매김(키모트립신 번호매김에 상응)시에 K341D를 함유하는 변이체, 예컨대 CB735는 TFPI에 대한 유의적인 내성(50 내지 150배 이상)을 나타내며, K192D 돌연변이를 함유하는 변이체(9CB945)는 TFPI에 대한 유의적인 내성을 나타내는 비(40 내지 150배 이상)이다. 일부 경우에, 해리율이 결합률보다 큰 영향을 미쳤다. 이러한 프로필을 나타내는 변이체들의 일부 예는 CB735, CB854, CB855, CB856 및 CB857이다.
Figure 112009069306018-PCT00035
실시예 17
활성 부위 적정제 4- 메틸움벨리페릴 p ' - 구아니디노벤조에이트(MUGB)를 이용한
촉매적 활성 프로테아제의 농도 측정
스톡 용액 중에 촉매적 활성 FVIIa의 농도는 FVIIa와 가용성 조직인자(sTF) 복합체를, 트립신 유사 세린 프로테아제의 활성 부위로 개발된 형광원성 에스테르 기질인 4-메틸움벨리페릴 p'-구아니디노벤조에이트(MUGB)로 적정하여 측정했다. 이 분석법은 약간의 변형은 있지만 대부분 문헌[Payne et al., Biochemistry (1996) 35: 7100-7106]에 기술된 바와 같이 수행했다. MUGB는 FVII 또는 불활성 프로테아제와는 반응하지 않지만, FVIIa와 쉽게 반응하여, MUGB의 농도가 포화 농도이고 탈아실화가 특히 느려서 촉매작용의 속도 제한성인 조건 하에서 효과적으로 안정한 아실-효소 중간체를 형성한다. 이러한 조건 하에서, FVIIa 프로테아제는 단일 촉매적 턴오버(turnover)를 일으켜 4-메틸움벨리페론 형광단(4-MU)을 방출한다. 형광도의 1차 폭발이 4-MU 형광도의 외부 농도 표준 곡선으로 보정될 때, 활성 부위의 농도가 계산될 수 있다.
분석은 연속 교반 하에 1cm x 1cm 석영 큐벳 중의 2ml 반응 용량으로 수행했다. 각 반응물은 50mM Hepes, 100mM NaCl, 5mM CaCl2 및 0.1% PEG 8000 pH 7.6을 함유하는 분석 완충액에 0.5μM sTF(R&D Systems Human)를 함유했다. 4-MU 표준 용액은 DMSO에 0.5M의 스톡 농도로 새로 제조하고, 이 농도는 50mM Tris 완충액 pH 9.0 중에서 흡광계수 19,000 M-1cm-1 하에 360nm에서 흡광분광분석법으로 확인했다. MUGB는 DMSO에 건조중량을 기준으로 0.04M의 스톡 농도로 제조했다. 분석은 1x 분석 완충액 중의 0.5μM sTF 용액(49.4μM sTF 20.2㎕)에 4mM MUGB를 4㎕(8μM 최종 농도) 첨가하고, 먼저 MUGB의 배경 가수분해를 약 150 내지 200초 동안 측정한 뒤, FVIIa 또는 FVIIa 변이체를 초기 ELISA(실시예 2C.1)에 기초하여 약 100 내지 200nM의 최종 농도로 첨가하거나, FFR-CMK로 활성 부위 적정하여(실시예 6) 개시했다. 반응의 폭발기에 4-MU 형광의 방출은 추가로 1000 내지 1200초 동안 추적했다. 유리 4-MU의 표준 곡선은 0.5μM sTF를 20nM 단계로 최종 농도 250nM까지 함유하는 1x 분석 완충액으로 흡광도 보정된 4-MU를 적정하여 작도했다.
데이터 분석을 위해, 반응물 미량을 Graphpad Prism 소프트웨어 패키지로 보내고, 배경 가수분해의 기여도는, 일반적으로 총 형광 폭발의 5% 미만인, 자발적 MUGB 가수분해의 초기 측정률을 외삽하여 곡선으로부터 감산했다. 보정된 곡선은 △형광도 = Amp(1-e- kt) + Bt 형식인, 선형 요소를 보유하는 단일 지수 방정식에 일치했다(상기 식에서, Amp = 전술한 포화 분석 조건 하에 폭발기의 진폭이고, k는 아실-효소 형성의 관찰된 1차 속도 상수이며 B는 MUGB의 완전 턴오버와 관련된 벌크 속도 상수이다). 활성 FVIIa 프로테아제의 농도는 4-MU 표준 곡선에 대한 진폭의 적합 매개변수를 비교하여 계산했다. 다회 분석값을 측정하고, 평균을 냈고, 표준 편차를 측정했다.
당업계의 숙련된 자에게는 변형이 명백한 바, 본 발명은 후속 청구의 범위에 의해서만 한정되는 것으로 생각되어야 한다.
<110> Catalyst Biosciences, Inc. <120> Modified factor VII polypeptides and uses thereof <130> 119357-00067/4913PC <150> US 60/923,512 <151> 2007-04-13 <160> 250 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Factor VII precursor isoform a <400> 1 Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln 1 5 10 15 Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30 Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gln 35 40 45 Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60 Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80 Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95 Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr 115 120 125 Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140 Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln 145 150 155 160 Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175 Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190 Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205 Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220 Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240 Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255 Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270 Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val 275 280 285 Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala 290 295 300 Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320 Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335 Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350 Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln 355 360 365 Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr 370 375 380 Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400 Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415 Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430 His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln 435 440 445 Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460 Phe Pro 465 <210> 2 <211> 444 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Factor VII precursor isoform b <400> 2 Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln 1 5 10 15 Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val 20 25 30 Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro 35 40 45 Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu 50 55 60 Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile 65 70 75 80 Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly 85 90 95 Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro 100 105 110 Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile 115 120 125 Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr 130 135 140 Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala 145 150 155 160 Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile 165 170 175 Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val 180 185 190 Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu 195 200 205 Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile 210 215 220 Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg 225 230 235 240 Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly 245 250 255 Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr 260 265 270 Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln 275 280 285 Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg 290 295 300 Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser 305 310 315 320 Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met 325 330 335 Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser 340 345 350 Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala 355 360 365 Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly 370 375 380 Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val 385 390 395 400 Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr 405 410 415 Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu 420 425 430 Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 435 440 <210> 3 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Factor VIIa <400> 3 Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 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precursor <400> 5 Met Val Pro Gln Ala His Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Leu Leu Gln 1 5 10 15 Leu Gln Gly Pro Leu Gly Thr Ala Val Phe Ile Thr Gln Glu Glu Ala 20 25 30 His Gly Val Leu His Arg Gln Arg Arg Ala Asn Ser Leu Leu Glu Glu 35 40 45 Leu Trp Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Asn Glu Glu Gln Cys Ser 50 55 60 Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Ser Pro Glu Arg Thr Lys Gln 65 70 75 80 Phe Trp Ile Val Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Asn Pro Cys 85 90 95 Gln Asn Gly Gly Thr Cys Gln Asp His Leu Lys Ser Tyr Val Cys Phe 100 105 110 Cys Leu Leu Asp Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Lys Ser Lys Asn Glu 115 120 125 Gln Leu Ile Cys Ala Asn Glu Asn Gly Asp Cys Asp Gln Tyr Cys Arg 130 135 140 Asp His Val Gly Thr Lys Arg Thr Cys Ser Cys His Glu Asp Tyr Thr 145 150 155 160 Leu Gln Pro Asp Glu Val Ser Cys Lys Pro Lys Val Glu Tyr Pro Cys 165 170 175 Gly Arg Ile Pro Val Val Glu Lys Arg Asn Ser Ser Ser Arg Gln Gly 180 185 190 Arg Ile Val Gly Gly Asn Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln 195 200 205 Ala 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Gln Ala Arg Gly Leu Gly Leu Cys Ser Leu Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gln Ala Ser Leu Ala Ala Val Phe Ile Thr Gln Glu Glu Ala His Ser 20 25 30 Val Leu Arg Arg Gln Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg 35 40 45 Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Leu Cys Ser Phe Glu 50 55 60 Glu Ala Arg Glu Val Phe Gln Ser Thr Glu Arg Thr Lys Gln Phe Trp 65 70 75 80 Ile Thr Tyr Asn Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Asn Pro Cys Gln Asn 85 90 95 Gly Gly Ser Cys Glu Asp Gln Ile Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu 100 105 110 Ala Asp Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Lys Asn Lys Asn Asp Gln Leu 115 120 125 Ile Cys Met Tyr Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His 130 135 140 Val Gly Ser Gln Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Thr Leu Leu 145 150 155 160 Pro Asn Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Asp Tyr Pro Cys Gly Lys 165 170 175 Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Gly Ala Ser Asn Pro Gln Gly Arg Ile 180 185 190 Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Ala 195 200 205 Leu Met Asn Gly Ser Thr Leu Leu 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Homo sapiens <220> <223> Factor VIIa variant D60R <400> 19 Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Arg Lys Ile Lys Asn Trp Arg 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agcgagcacg acggggatga gcagagccgg 900 cgggtggcgc aggtcatcat ccccagcacg tacgtcccgg gcaccaccaa ccacgacatc 960 gcgctgctcc gcctgcacca gcccgtggtc ctcactgacc atgtggtgcc cctctgcctg 1020 cccgaacgga cgttctctga gaggacgctg gccttcgtgc gcttctcatt ggtcagcggc 1080 tggggccagc tgctggaccg tggcgccacg gccctggagc tcatggtcct caacgtgccc 1140 cggctgatga cccaggactg cctgcagcag tcacggaagg tgggagactc cccaaatatc 1200 acggagtaca tgttctgtgc cggctactcg gatggcagca aggactcctg caagggggac 1260 agtggaggcc cacatgccac ccactaccgg ggcacgtggt acctgacggg catcgtcagc 1320 tggggccagg gctgcgcaac cgtgggccac tttggggtgt acaccagggt ctcccagtac 1380 atcgagtggc tgcaaaagct catgcgctca gagccacgcc caggagtcct cctgcgagcc 1440 ccatttccct agcccagcag ccctggcctg tggagagaaa gccaaggctg cgtcgaactg 1500 tcctggcacc aaatcccata tattcttctg cagttaatgg ggtagaggag ggcatgggag 1560 ggagggagag gtggggaggg agacagagac agaaacagag agagacagag acagagagag 1620 actgagggag agactctgag gacatggaga gagactcaaa gagactccaa gattcaaaga 1680 gactaataga gacacagaga tggaatagaa aagatgagag gcagaggcag acaggcgctg 1740 gacagagggg caggggagtg ccaaggttgt cctggaggca gacagcccag ctgagcctcc 1800 ttacctccct tcagccaagc ccacctgcac gtgatctgct ggcctcaggc tgctgctctg 1860 ccttcattgc tggagacagt agaggcatga acacacatgg atgcacacac acacacgcca 1920 atgcacacac acagagatat gcacacacac ggatgcacac acagatggtc acacagagat 1980 acgcaaacac accgatgcac acgcacatag agatatgcac acacagatgc acacacagat 2040 atacacatgg atgcacgcac atgccaatgc acgcacacat cagtgcacac ggatgcacag 2100 agatatgcac acaccgatgt gcgcacacac agatatgcac acacatggat gagcacacac 2160 acaccaatgc gcacacacac cgatgtacac acacagatgc acacacagat gcacacacac 2220 cgatgctgac tccatgtgtg ctgtcctctg aaggcggttg tttagctctc acttttctgg 2280 ttcttatcca ttatcatctt cacttcagac aattcagaag catcaccatg catggtggcg 2340 aatgccccca aactctcccc caaatgtatt tctcccttcg ctgggtgccg ggctgcacag 2400 actattcccc acctgcttcc cagcttcaca ataaacggct gcgtctcctc cgcacacctg 2460 tggtgcctgc cacccactgg gttgcccatg attcattttt ggagcccccg gtgctcatcc 2520 tctgagatgc tcttttcttt cacaattttc aacatcactg aaatgaaccc tcacatggaa 2580 gctatttttt aaaaacaaaa gctgtttgat agatgtttga ggctgtagct cccaggatcc 2640 tgtggaattg gatgttctct ccctgccaca gcccttgtca atgatatttc acagagaccc 2700 tgggagcacc tgctcaagag tcagggacac acgcatcact aaatgcaagt tcccaggccc 2760 tggctgcagt gggaggacct ggcaagctgc actcttgctg agtccccagg gtggtggaag 2820 aagaatgaga aacacatgaa cagagaaatg gggaggtgac aaacagtgcc cccactcaga 2880 ctccggcaag cacggctcag agagtggact cgatgccatc cctgcagggc cgtcctgggc 2940 accactggca ctcacagcag caaggtgggc accattggca ctcacagcag caaggcaggc 3000 accagcaacc cacctcgggg gcactcaggc atcatctact tcagagcaga cagggtctat 3060 gaactacagc cgtgggctgc ttccaaggca ccctgctctt gtaaataaag ttttatggga 3120 acacaaaaaa aaaaaaaaaa a 3141 <210> 109 <211> 3075 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> FVII transcript variant 2 <400> 109 agtcccatgg ggaatgtcaa caggcagggg cagcactgca gagatttcat catggtctcc 60 caggccctca ggctcctctg ccttctgctt gggcttcagg gctgcctggc tgcagtcttc 120 gtaacccagg aggaagccca cggcgtcctg caccggcgcc ggcgcgccaa cgcgttcctg 180 gaggagctgc ggccgggctc cctggagagg gagtgcaagg aggagcagtg ctccttcgag 240 gaggcccggg agatcttcaa ggacgcggag aggacgaagc tgttctggat ttcttacagt 300 gatggggacc agtgtgcctc aagtccatgc cagaatgggg gctcctgcaa ggaccagctc 360 cagtcctata tctgcttctg cctccctgcc ttcgagggcc ggaactgtga gacgcacaag 420 gatgaccagc tgatctgtgt gaacgagaac ggcggctgtg agcagtactg cagtgaccac 480 acgggcacca agcgctcctg tcggtgccac gaggggtact ctctgctggc agacggggtg 540 tcctgcacac ccacagttga atatccatgt ggaaaaatac ctattctaga aaaaagaaat 600 gccagcaaac cccaaggccg aattgtgggg ggcaaggtgt gccccaaagg ggagtgtcca 660 tggcaggtcc tgttgttggt gaatggagct cagttgtgtg gggggaccct gatcaacacc 720 atctgggtgg tctccgcggc ccactgtttc gacaaaatca agaactggag gaacctgatc 780 gcggtgctgg gcgagcacga cctcagcgag cacgacgggg atgagcagag ccggcgggtg 840 gcgcaggtca tcatccccag cacgtacgtc ccgggcacca ccaaccacga catcgcgctg 900 ctccgcctgc accagcccgt ggtcctcact gaccatgtgg tgcccctctg cctgcccgaa 960 cggacgttct ctgagaggac gctggccttc gtgcgcttct cattggtcag cggctggggc 1020 cagctgctgg accgtggcgc cacggccctg gagctcatgg tcctcaacgt gccccggctg 1080 atgacccagg actgcctgca gcagtcacgg aaggtgggag actccccaaa tatcacggag 1140 tacatgttct gtgccggcta ctcggatggc agcaaggact cctgcaaggg ggacagtgga 1200 ggcccacatg ccacccacta ccggggcacg tggtacctga cgggcatcgt cagctggggc 1260 cagggctgcg caaccgtggg ccactttggg gtgtacacca gggtctccca gtacatcgag 1320 tggctgcaaa agctcatgcg ctcagagcca cgcccaggag tcctcctgcg agccccattt 1380 ccctagccca gcagccctgg cctgtggaga gaaagccaag gctgcgtcga actgtcctgg 1440 caccaaatcc catatattct tctgcagtta atggggtaga ggagggcatg ggagggaggg 1500 agaggtgggg agggagacag agacagaaac agagagagac agagacagag agagactgag 1560 ggagagactc tgaggacatg gagagagact caaagagact ccaagattca aagagactaa 1620 tagagacaca gagatggaat agaaaagatg agaggcagag gcagacaggc gctggacaga 1680 ggggcagggg agtgccaagg ttgtcctgga ggcagacagc ccagctgagc ctccttacct 1740 cccttcagcc aagcccacct gcacgtgatc tgctggcctc aggctgctgc tctgccttca 1800 ttgctggaga cagtagaggc atgaacacac atggatgcac acacacacac gccaatgcac 1860 acacacagag atatgcacac acacggatgc acacacagat ggtcacacag agatacgcaa 1920 acacaccgat gcacacgcac atagagatat gcacacacag atgcacacac agatatacac 1980 atggatgcac gcacatgcca atgcacgcac acatcagtgc acacggatgc acagagatat 2040 gcacacaccg atgtgcgcac acacagatat gcacacacat ggatgagcac acacacacca 2100 atgcgcacac acaccgatgt acacacacag atgcacacac agatgcacac acaccgatgc 2160 tgactccatg tgtgctgtcc tctgaaggcg gttgtttagc tctcactttt ctggttctta 2220 tccattatca tcttcacttc agacaattca gaagcatcac catgcatggt ggcgaatgcc 2280 cccaaactct cccccaaatg tatttctccc ttcgctgggt gccgggctgc acagactatt 2340 ccccacctgc ttcccagctt cacaataaac ggctgcgtct cctccgcaca cctgtggtgc 2400 ctgccaccca ctgggttgcc catgattcat ttttggagcc cccggtgctc atcctctgag 2460 atgctctttt ctttcacaat tttcaacatc actgaaatga accctcacat ggaagctatt 2520 ttttaaaaac aaaagctgtt tgatagatgt ttgaggctgt agctcccagg atcctgtgga 2580 attggatgtt ctctccctgc cacagccctt gtcaatgata tttcacagag accctgggag 2640 cacctgctca agagtcaggg acacacgcat cactaaatgc aagttcccag gccctggctg 2700 cagtgggagg acctggcaag ctgcactctt gctgagtccc cagggtggtg gaagaagaat 2760 gagaaacaca tgaacagaga aatggggagg tgacaaacag tgcccccact cagactccgg 2820 caagcacggc tcagagagtg gactcgatgc catccctgca gggccgtcct gggcaccact 2880 ggcactcaca gcagcaaggt gggcaccatt ggcactcaca gcagcaaggc aggcaccagc 2940 aacccacctc gggggcactc aggcatcatc tacttcagag cagacagggt ctatgaacta 3000 cagccgtggg ctgcttccaa ggcaccctgc tcttgtaaat aaagttttat gggaacacaa 3060 aaaaaaaaaa aaaaa 3075 <210> 110 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> factor IX Gla domain <400> 110 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30 Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val 35 40 45 <210> 111 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> factor X Gla domain <400> 111 Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu 20 25 30 Asp Ser Asp 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coagulation factor Xa-like protease - Gla domain <400> 121 Ser Asn Ser Leu Phe Glu Glu Ile Arg Pro Gly Asn Ile Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Ile Glu Glu Lys Cys Ser Lys Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu 20 25 30 Asp Asn Glu Lys Thr Glu Thr Phe Trp Asn Val Tyr Val Asp 35 40 45 <210> 122 <211> 464 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antithrombin III precursor <400> 122 Met Tyr Ser Asn Val Ile Gly Thr Val Thr Ser Gly Lys Arg Lys Val 1 5 10 15 Tyr Leu Leu Ser Leu Leu Leu Ile Gly Phe Trp Asp Cys Val Thr Cys 20 25 30 His Gly Ser Pro Val Asp Ile Cys Thr Ala Lys Pro Arg Asp Ile Pro 35 40 45 Met Asn Pro Met Cys Ile Tyr Arg Ser Pro Glu Lys Lys Ala Thr Glu 50 55 60 Asp Glu Gly Ser Glu Gln Lys Ile Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val 65 70 75 80 Trp Glu Leu Ser Lys Ala Asn Ser Arg Phe Ala Thr Thr Phe Tyr Gln 85 90 95 His Leu Ala Asp Ser Lys Asn Asp Asn Asp Asn Ile Phe Leu Ser Pro 100 105 110 Leu Ser Ile Ser Thr Ala Phe Ala Met Thr Lys Leu Gly Ala Cys Asn 115 120 125 Asp Thr Leu Gln Gln Leu Met Glu Val 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Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Val Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gln Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 246 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> G237V/M298Q/K341Q <400> 246 Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Val Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gln Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 247 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> M298Q/Gla Swap FIX <400> 247 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30 Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Ser Asp Gly 35 40 45 Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60 Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg 65 70 75 80 Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn 85 90 95 Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser 100 105 110 Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys 115 120 125 Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys 130 135 140 Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys 145 150 155 160 Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala 165 170 175 Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala 180 185 190 Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val 195 200 205 Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg 210 215 220 Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240 Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr 245 250 255 Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 260 265 270 Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu 275 280 285 Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gln Val Leu Asn Val Pro 290 295 300 Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp 305 310 315 320 Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335 Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350 Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly 355 360 365 Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr 370 375 380 Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 385 390 395 400 Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 248 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> K197E/M298Q <400> 248 Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Glu Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gln Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 249 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> M298Q/K341D <400> 249 Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gln Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Asp Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 250 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> K197E/K199E/K341Q <400> 250 Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys 20 25 30 Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln 50 55 60 Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80 Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95 Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110 Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125 Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg 130 135 140 Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160 Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln 165 170 175 Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190 His Cys Phe Asp Glu Ile Glu Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu 195 200 205 Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg 210 215 220 Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240 His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255 His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270 Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu 275 280 285 Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300 Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320 Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335 Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350 Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys 355 360 365 Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile 370 375 380 Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400 Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405

Claims (118)

  1. 제VII 인자(FVII) 폴리펩타이드, 이의 대립유전자 변이체 및 종 변이체 또는 이의 활성 단편에 변형을 포함하는 변형 FVII 폴리펩타이드로서,
    상기 변형이, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 보유하는 FVII 폴리펩타이드 내의 위치 D196, K197 또는 K199에 상응하는 위치 또는 FVII 폴리펩타이드 내의 상응하는 잔기에서 이루어지고;
    상기 변형은 소수성 또는 산성 아미노산에 의한 교체이며,
    상기 소수성 또는 산성 아미노산이 Val(V), Leu(L), Ile(I), Phe(F), Trp(W), Met(M), Tyr(Y), Cys(C), Asp(D) 및 Glu(E) 중에서 선택되는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, FVII 폴리펩타이드 내의 변형이 D196F, D196W, D196L, D196I, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199D, 및 K199E 중에서 선택되는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서, FVII 폴리펩타이드 내의 변형이 D196Y 또는 K197Y인 변형 FVII 폴리펩타이드.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, FVII 폴리펩타이드 내의 다른 위치에 추가의 변 형을 추가로 포함하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 추가의 변형이 아미노산 교체, 삽입 또는 결실인 변형 FVII 폴리펩타이드.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 추가의 변형이 D196, K197, K199, G237, T239, R290 및 K341 중에서 선택되는 위치에 상응하는 위치에서의 아미노산 교체 또는 삽입이고, 이때 제1 변형과 제2 변형은 상이한 아미노산에서 이루어지는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  7. 제4항 또는 제5항에 있어서, 추가의 아미노산 변형이 D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D 및 K341Q 중에서 선택되는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  8. 제5항에 있어서, 추가의 변형이 G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA 및 K197I198insS 중에서 선택되는 아미노산 삽입인 변형 FVII 폴리펩 타이드.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, D196R/K197E/K199E, D196K/K197E/K199E, D196R/K197E/K199E/R290E, D196R/K197M/K199E, D196R/K197M/K199E/R290E, D196K/K197L, D196F/K197L, D196L/K197L, D196M/K197L, D196W/K197L, D196F/K197E, D196W/K197E, K196V/K197E, K197E/K341Q, K197L/K341Q, K197E/G237V/K341Q, K197E/K199E, K197E/G237V, K199E/K341Q 및 K197E/K199E/K341Q 중에서 선택되는 변형을 포함하는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  10. 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 보유하는 FVII 폴리펩타이드에서 또는 FVII 폴리펩타이드 내의 상응하는 잔기에서 D196R, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197E, K197D, K197L, K197M, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199D, K199E, G237W, G237I, G237V, R290M, R290V, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA 또는 K197I198insS에 상응하는 아미노산 변형 중에서 선택되는, FVII 폴리펩타이드, 이의 대립유전자 또는 종 변이체 또는 이의 활성 단편 내의 변형을 포함하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  11. 제10항에 있어서, FVII 폴리펩타이드 내의 다른 위치에 추가의 변형을 포함 하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  12. 제11항에 있어서, 추가의 변형이 아미노산 교체, 삽입 또는 결실인 변형 FVII 폴리펩타이드.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 추가의 변형이 D196, Kl97, Kl99, G237, T239, R290 및 K341 중에서 선택되는 위치에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 교체이고, 상기 추가의 변형이 제1 변형과 상이한 위치에서 이루어지는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  14. 제12항에 있어서, 추가의 아미노산 변형이 D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196M, D196W, D196L, D196I, Kl97Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, Kl97I, Kl97V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D 및 K341Q 중에서 선택되는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  15. 제13항에 있어서, D196R/R290E, D196R/R290D, D196R/K197E/K199E, D196K/K197E/K199E, D196R/K197E/K199E/R290E, D196R/K197M/K199E, D196R/K197M/K199E/R290E, D196K/K197L, D196F/K197L, D196L/K197L, D196M/K197L, D196W/K197L, D196F/K197E, D196W/K197E, K197L/K341Q, G237V/K341Q, K197E/G237V/K341Q, K197E/K199E, K197E/G237V, K199E/K341Q, K197E/K199E/K341Q 및 K196V/K197E 중에서 선택되는 변형을 포함하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  16. 제VII 인자(FVII) 폴리펩타이드, 이의 대립유전자 및 종 변이체 또는 이의 활성 단편에 2개 이상의 변형을 포함하는 변형 FVII 폴리펩타이드로서,
    상기 2개 이상의 아미노산 변형은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 보유하는 FVII 폴리펩타이드에서 또는 FVII 폴리펩타이드 내의 상응하는 잔기에서의 D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196M, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D, K341Q, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA 또는 K197I198insS에 상응하는 아미노산 변형 중에서 선택되는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  17. 제15항에 있어서, FVII 폴리펩타이드가 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 변형을 포함하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, D196R/R290E, D196K/R290E, D196R/R290D, D196R/K197E/K199E, D196K/K197E/K199E, D196R/K197E/K199E/R290E, D196R/K197M/K199E, D196R/K197M/K199E/R290E, D196K/K197L, D196F/K197L, D196L/K197L, D196M/K197L, D196W/K197L, D196F/K197E, D196W/K197E, D196V/K197E, K197E/K341Q, K197L/K341Q, G237V/K341Q, K197E/G237V/K341Q, K197E/K199E, K197E/G237V, K199E/K341Q, K197E/K199E/K341Q 및 K197E/G237V/M298Q 중에서 선택되는 변형을 포함하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 조직인자 경로 저해제(TFPI)에 대한 내성 증가를 나타내는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  20. 제19항에 있어서, 변형 FVII 폴리펩타이드가 TFPI에 대해 적어도 약 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 내성인 변형 FVII 폴리펩타이드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 Gla 도메인 또는 이의 인지질 결합 달성에 충분한 부분을 추가로 포함하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  22. 이종 Gla 도메인 또는 이의 인지질 결합 달성에 충분한 부분을 포함하는 변 형 제VII 인자(FVII) 폴리펩타이드.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 충분한 부분이 이종 Gla 도메인의 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 포함하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  24. 제21항 또는 제22항에 있어서, 이종 Gla 도메인이 제IX 인자(FIX), 제X 인자(FX), 프로트롬빈, 단백질 C, 단백질 S, 오스테오칼신, 기질 Gla 단백질, 성장-정지-특이적 단백질 6(Growth-arrest-specific protein 6; Gas6) 및 단백질 Z 내의 Gla 도메인 중에서 선택되는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 Gla 도메인이 서열번호 110 내지 118, 120 및 121 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열 또는 인지질 결합 달성에 충분한 상기 서열의 부분을 보유하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 천연 FVII Gla 도메인의 전부 또는 인접부가 제거되고, 이종 Gla 도메인 또는 이의 인지질 결합 달성에 충분한 부분으로 교체되는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  27. 제26항에 있어서, 천연 FVII Gla 도메인이 서열번호 3에 제시된 아미노산 서 열을 보유하는 FVII 폴리펩타이드 또는 FVII 폴리펩타이드 내의 상응하는 잔기에 존재하는 아미노산 1-45를 포함하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, Gla 교환(Swap) FIX, Gla 교환 FX, Gla 교환 단백질 C, Gla 교환 단백질 S 및 Gla 교환 트롬빈 중에서 선택되는 변형을 포함하는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 증가된 인지질 친화도 또는 결합성을 나타내는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  30. 제29항에 있어서, 변형 FVII 폴리펩타이드가 적어도 약 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상의 증가된 인지질 친화도 또는 결합성을 나타내는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  31. 제21항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 FVII 폴리펩타이드가 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 조직인자 경로 저해제(TFPI)에 대해 증가된 내성을 나타내는 추가의 변형을 포함하는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  32. 제31항에 있어서, 추가의 변형이 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 보유 하는 FVII 폴리펩타이드 또는 FVII 폴리펩타이드 내의 상응하는 잔기 중에 D196, K197, K199, G237, T239, R290 및 K341 중에서 선택되는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 변형(들)인, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  33. 제32항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 변형(들)이 D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196M, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D, K341Q, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA 및 K197I198insS 중에서 선택되는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  34. 제33항에 있어서, 하나 이상의 아미노산 변형(들)이 D196R/R290E, D196K/R290E, D196R/R290D, D196R/K197E/K199E, D196K/K197E/K199E, D196R/K197E/K199E/R290E, D196R/K197M/K199E 및 D196R/K197M/K199E/R290E 중에서 선택되는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 보유하는 FVII 폴리펩타이드 또는 FVII 폴리펩타이드 내의 상응하는 잔기에 서 위치 Q176, M298 또는 E296에 하나 이상의 추가의 아미노산 변형(들)을 포함하는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  36. 제33항에 있어서, 아미노산 변형이 Q176A, M298Q, E296V 및 E296A 중에서 선택되는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  37. 제36항에 있어서, V158D/G237V/E296V/M298Q, K197E/G237V/M298Q, K197E/G237V/M298Q/K341Q, K197E/K199E/G237V/M298Q/K341Q, G237V/M298Q, G237V/M298Q/K341Q, M298Q/Gla 교환 FIX, K197E/M298Q 및 M298Q/K341D 중에서 선택되는 아미노산 변형을 포함하는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 안티트롬빈-III(AT-III)에 대한 내성 증가, 인지질에 대한 결합성 및/또는 친화도 증가, 조직인자(TF)에 대한 친화도 증가, 고유 활성 증가, TF 의존적 촉매 활성 또는 응고제 활성의 증가, 응고제 활성의 증가, 효소형성성(zymogenicity) 변경을 위한 폴리펩타이드의 입체형태 변경, 고활성 입체형태를 위하여 고활성 및 저활성 FVIIa 입체형태 간의 평형 이동에 의한 촉매 활성 또는 응고제 활성의 증가, 프로테아제에 대한 내성 증가, 글리코실화 감소, 글리코실화 증가, 면역원성 감소, 안정성 증가 및/또는 화학 그룹 결합의 촉진을 일으키는 하나 이상의 추가의 아미노산 변형(들)을 포함하는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  39. 제38항에 있어서, 변경된 효소형성성이 자이모겐과 더욱 유사한 형태 또는 자이모겐과 덜 유사한 형태를 부여하는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  40. 제1항 내지 39항 중 어느 한 항에 있어서, S278C/V302C, L279C/N301C, V280C/V301C, S281C/V299C, 위치 4에 타이로신의 삽입, F4S, F4T, P10Q, P10E, P10D, P10N, Q21N, R28F, R28E, I30C, I30D, I30E, K32D, K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32C, K32A, K32S, D33C, D33F, D33E, D33K, A34C, A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, T37C, T37D, T37E, K38C, K38E, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, L39E, L39Q, L39H, W41N, W41C, W41E, W41D, I42R, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42K, S43Q, S43N, Y44K, Y44C, Y44D, Y44E, S45C, S45D, S45E, D46C, A51N, S53N, G58N, G59S, G59T, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, L65N, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, E82S, E82T T83K, N95S, N95T, G97S, G97T, YlOlN, D104N, T106N, K109N, El16D, Gl17N, G124N, S126N, T128N, L141C, L141D, L141E, E142D, E142C, K143C, K143D, K143E, R144E, R144C, R144D, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, Q250C, V253N, E265N, T267N, E270N, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, R277N, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, L280N, L288K, L288C, L288D, D289C, D289K, L288E, R290C, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R290D, R290E, G291E, G291D, G291C, G291N, G291K, A292C, A292K, A292D, A292E, T293K, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, P3O3S, P3O3ST, R304Y, R304F, R304L, R304M, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L3O5P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L3O5Q, M306D, M306N, D309S, D309T, Q312N, Q313K, Q313D, Q313E, S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C, V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A, K341S, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, V376N, R379N, L390C, L390K, L390D, L390E, M391D, M391C, M391K, M391N, M391E, R392C, R392D, R392E, S393D, S393C, S393K, S393E, E394K, P395K, E394C, P395D, P395C, P395E, R396K, R396C, R396D, R396E, P397D, P397K, P397C, P397E, G398K, G398C, G398D, G398E, V399C, V399D, V399K, V399E, L400K, L401K, L401C, L401D, L401E, R402D, R402C, R402K, R402E, A403K, A403C, A403D, A403E, P404E, P404D, P404C, P404K, F405K, P406C, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I3ON/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/ Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S, Y44N/D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S/, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/K316S, S314N/K316T, Q313N/R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/D343S, K341N/D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/R392S, L390N/R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S 및 P404N/P406T 중에서 선택되는 하나 이상의 추가의 아미노산 변형(들)을 포함하는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 300-322, 305-322, 300-312 또는 305-312 아미노산의 트립신, 트롬빈 또는 FX 유래의 상응하는 아미노산으로의 치환, 또는 위치 310-329, 311-322 또는 233-329 아미노산의 트립신 유래의 상응하는 아미노산으로의 치환을 포함하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형 FVII 폴리펩타이드가 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열을 보유하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  43. 제40항에 있어서, 서열번호 18-43, 125-146 및 206-250 중 어느 하나에 제시 된 아미노산 서열을 보유하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형 FVII 폴리펩타이드가 서열번호 3에 제시된 폴리펩타이드의 대립유전자 또는 종 변이체인, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  45. 제44항에 있어서, 대립유전자 또는 종 변이체가 아미노산 변형(들)을 제외하고는, 서열번호 3에 제시된 폴리펩타이드에 대해 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 보유하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 폴리펩타이드인 변형 FVII 폴리펩타이드.
  47. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 비-사람 폴리펩타이드인 변형 FVII 폴리펩타이드.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 또는 성숙 폴리펩타이드인 변형 FVII 폴리펩타이드.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 서열만이 변형된, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  50. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 변형 또는 해독후 변형을 추가로 포함하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, FVII 폴리펩타이드가 글리코실화, 카르복실화, 하이드록실화, 황산화, 인산화, 알부민화되거나 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 잔기에 접합되는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 단일쇄 폴리펩타이드인 변형 FVII 폴리펩타이드.
  53. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 이중쇄 폴리펩타이드인 변형 FVII 폴리펩타이드.
  54. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 활성이거나 활성화되는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  55. 제54항에 있어서, 활성화가 자가활성화에 의한 단백분해 절단, 제IX 인 자(FIXa)에 의한 절단, 제X 인자(FXa)에 의한 절단, 제XII 인자(FXIIa)에 의한 절단 또는 트롬빈에 의한 절단에 의해 달성되는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형 FVII 폴리펩타이드의 하나 이상의 활성을 유지하는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  57. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드가 비변형 FVII 폴리펩타이드의 적어도 하나의 FVII 활성을 유지하는 한, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 또는 60개의 아미노산 위치에서 변형을 포함하는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 변형 폴리펩타이드가 비변형 FVII 폴리펩타이드 활성의 적어도 약 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상의 활성을 유지하는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 활성이 조직인자(TF) 결합, 제X 인자(FX) 활성화, 제IX 인자(FIX) 활성화, 인지질 결합 및 응고 활성 중에서 선택되는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  60. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 유지되는 활성이 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 증가되는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  61. 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 유지되는 활성이 비변형 FVII 폴리펩타이드에 비해 감소되는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 응고 활성이 증가되는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 활성이 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 측정되는, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 따른 변형 FVII 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  65. 재64항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  66. 제65항에 있어서, 원핵생물 벡터, 바이러스 벡터 또는 진핵생물 벡터인 벡터.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 포유동물 벡터인 벡터.
  68. 제66항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스 및 사이토메갈로바이러스 중에서 선택되는 벡터.
  69. 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 세포.
  70. 제69항에 있어서, 진핵생물 세포인 세포.
  71. 제70항에 있어서, 진핵생물 세포가 포유동물 세포인 세포.
  72. 제71항에 있어서, 포유동물 세포가 어린 햄스터 신장 세포(BHK-21) 또는 293 세포 또는 CHO 세포 중에서 선택되는 세포.
  73. 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 FVII 폴리펩타이드를 발현하는 세포.
  74. 제69항에 있어서, 효모 세포인 세포.
  75. 제74항에 있어서, 피치아 종(Pichia sp.) 세포인 세포.
  76. 제75항에 있어서, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 세포인 세포.
  77. 제71항 내지 제76항 중 어느 한 항에 따른 세포에 의해 생산되는 변형 FVII 폴리펩타이드.
  78. 제1항 내지 제63항 및 제77항 중 어느 한 항에 따른 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 제64항에 따른 핵산 분자 또는 제65항 내지 제68항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 따른 세포의 치료학적 유효 농도 또는 양을 약제학적으로 허용되는 비히클 내에 포함하는 약제학적 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 국소, 전신 또는 국부 투여용으로 제형화된 약제학적 조성물.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 경구, 비강, 폐, 구강, 경피, 피하, 십이지장내, 장, 비경구, 정맥내 또는 근육내 투여용으로 제형화된 약제학적 조성물.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 제어 방출형으로 제형화된 약제학적 조성물.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 투여량 투여용으로 제형화된 약제학적 조성물.
  83. FVII 또는 응고촉진제의 투여에 의해 치료되는 질환이나 병태를 보유한 피검체를, 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 투여하여 치료함을 포함하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 질환 또는 병태가 자이모겐형 또는 활성형의 FVII의 투여에 의해 치료되는 방법.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 약제학적 조성물로의 치료가 상기 질환 또는 병태와 관련된 증상을 호전시키거나 경감시키는 방법.
  86. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, FVII 투여 또는 다른 응고촉진제 요법에 의해 치료되는 질환 또는 병태와 관련이 있는 증상의 변화에 대해 피검체를 모니터함을 추가로 포함하는 방법.
  87. 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 치료할 질환 또는 병태가 혈액 응고 장애, 혈액학적 장애, 출혈성 장애(hemorrhagic disorder), 혈우병, 제VII 인 자 결핍, 출혈 장애(bleeding disorder), 수술 출혈 또는 외상에 의한 출혈 중에서 선택되는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 혈우병이 혈우병 A 또는 혈우병 B 또는 혈우병 C인 방법.
  89. 제88항에 있어서, 혈우병이 선천적 혈우병인 방법.
  90. 제88항에 있어서, 혈우병이 후천적 혈우병인 방법.
  91. 제83항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 병태가 외상이나 수술로 인한 출혈 합병증으로 인한 것인, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 출혈이 급성 혈관절증, 만성 혈우병 관절병증, 혈종, 혈뇨, 중추신경계 출혈, 위장 출혈 또는 뇌출혈로 나타나는, 방법.
  93. 제91항에 있어서, 출혈이 발치로 인한 것인 방법.
  94. 제91항에 있어서, 수술이 심장 수술, 혈관성형술, 폐수술, 복부수술, 척추수술, 뇌수술, 혈관수술, 치아수술 또는 기관 이식 수술인 방법.
  95. 제94항에 있어서, 이식 수술이 골수, 심장, 폐, 췌장 및 간 이식 중에서 선택되는 방법.
  96. 제83항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 피검체가 제VIII 인자 또는 제IX 인자에 대한 자가항체를 보유하는 방법.
  97. 제83항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 응고 인자를 투여함을 추가로 포함하는 방법.
  98. 제97항에 있어서, 하나 이상의 추가의 응고 인자가 혈장 정제형 또는 재조합 응고인자, 비타민 K, 비타민 K 유도체 및 단백질 C 저해제와 같은 응고촉진제, 혈장, 혈소판, 적혈구 및 코르티코스테로이드 중에서 선택되는 방법.
  99. 제1항 내지 제63항 및 제77항 중 어느 한 항에 있어서, FVII 또는 응고촉진제의 투여에 의해 치료되는 질환 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한, 변형 FVII 폴리펩타이드.
  100. FVII 또는 응고촉진제의 투여에 의해 치료되는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물의 용도.
  101. 질환 또는 병태가 자이모겐형 또는 활성형 FVII의 투여에 의해 치료되는, 제99항에 따른 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 제100항에 따른 용도.
  102. 약제학적 조성물로의 치료가 질환 또는 병태와 관련된 증상을 호전시키거나 경감시키는, 제99항 또는 제101항에 따른 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 제100항 또는 제101항에 따른 용도.
  103. FVII의 투여 또는 다른 응고촉진제 요법에 의해 치료되는 질환 또는 병태와 관련이 있는 증상의 변화에 대해 피검체를 모니터함을 추가로 포함하는, 제99항, 제101항 및 제102항 중 어느 한 항에 따른 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  104. 치료할 질환 또는 병태가 혈액 응고 장애, 혈액학적 장애, 출혈성 장애(hemorrhagic disorder), 혈우병, 제VII 인자 결핍, 출혈 장애(bleeding disorder), 수술 출혈 또는 외상에 의한 출혈 중에서 선택되는, 제99항 및 제101항 내지 제103항 중 어느 한 항에 따른 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  105. 제104항에 있어서, 혈우병이 혈우병 A 또는 혈우병 B 또는 혈우병 C인, 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 용도.
  106. 제105항에 있어서, 혈우병이 선천적 혈우병인, 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 용도.
  107. 제105항에 있어서, 혈우병이 후천적 혈우병인, 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 용도.
  108. 제104항에 있어서, 질환 또는 병태가 외상이나 수술로 인한 출혈 합병증으로 인한 것인, 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 용도.
  109. 제104항에 있어서, 출혈이 급성 혈관절증, 만성 혈우병 관절병증, 혈종, 혈뇨, 중추신경계 출혈, 위장 출혈 또는 뇌출혈로 나타나는, 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 용도.
  110. 제108항에 있어서, 출혈이 발치로 인한 것인, 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 용도.
  111. 제108항에 있어서, 수술이 심장 수술, 혈관성형술, 폐수술, 복부수술, 척추수술, 뇌수술, 혈관수술, 치아수술 또는 기관 이식 수술인, 변형 FVII 폴리펩타이 드 또는 용도.
  112. 제111항에 있어서, 이식 수술이 골수, 심장, 폐, 췌장 및 간 이식 중에서 선택되는, 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 용도.
  113. 피검체가 제VIII 인자 또는 제IX 인자에 대한 자가항체를 보유하는, 제99항 및 제101항 내지 제112항 중 어느 한 항에 따른 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 제100항 내지 제112항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  114. 하나 이상의 추가의 응고 인자를 투여함을 추가로 포함하는, 제99항 및 제101항 내지 제112항 중 어느 한 항에 따른 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 제100항 내지 제113항 중 어느 한 항에 따른 용도.
  115. 제114항에 있어서, 하나 이상의 추가의 응고 인자가 혈장 정제형 또는 재조합 응고인자, 비타민 K, 비타민 K 유도체 및 단백질 C 저해제와 같은 응고촉진제, 혈장, 혈소판, 적혈구 및 코르티코스테로이드 중에서 선택되는, 변형 FVII 폴리펩타이드 또는 용도.
  116. 포장재와 당해 포장재 내에 함유된 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 포함하는 제조품.
  117. 제116항에 있어서, 변형 FVII 폴리펩타이드가 FVII 매개 질환 또는 장애의 치료에 효과적이고, 포장재는 상기 변형 FVII 폴리펩타이드가 FVII 매개 질환 또는 장애의 치료용으로 사용됨을 나타내는 라벨을 포함하는 제조품.
  118. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물, 상기 조성물의 투여를 위한 장치 및 임의로 투여 지침서를 포함하는 키트.
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Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7700341B2 (en) * 2000-02-03 2010-04-20 Dendreon Corporation Nucleic acid molecules encoding transmembrane serine proteases, the encoded proteins and methods based thereon
SG166001A1 (en) * 2002-10-02 2010-11-29 Catalyst Biosciences Inc Methods of generating and screening for proteases with altered specificity
US7939304B2 (en) * 2002-10-02 2011-05-10 Catalyst Biosciences, Inc. Mutant MT-SP1 proteases with altered substrate specificity or activity
DK1735439T3 (da) 2004-04-12 2012-02-06 Catalyst Biosciences Inc Spaltning af VEGF og VEGF receptor ved hjælp af vild-type og mutant MT-SP1
AU2006304804B2 (en) 2005-10-21 2011-06-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified proteases that inhibit complement activation
EP2423305A1 (en) * 2006-06-19 2012-02-29 Catalyst Biosciences, Inc. Modified coagulation factor IX polypeptides and use thereof for treatment
SG175602A1 (en) 2006-07-05 2011-11-28 Catalyst Biosciences Inc Protease screening methods and proteases identified thereby
EP2147096B1 (en) * 2007-04-13 2015-03-25 Catalyst Biosciences, Inc. Modified factor VII polypeptides and uses thereof
TWI538916B (zh) 2008-04-11 2016-06-21 介控生化科技公司 經修飾的因子vii多肽和其用途
EP2177624A1 (en) * 2008-10-02 2010-04-21 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Blood coagulation assays
RU2563231C2 (ru) * 2009-06-25 2015-09-20 Дзе Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл Химерные молекулы фактора vii
GB0916578D0 (en) * 2009-09-22 2009-10-28 Malmsten Nils M Polypeptides and uses thereof
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
US8663624B2 (en) 2010-10-06 2014-03-04 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
EP2624859B1 (en) 2010-10-06 2017-03-01 Medimmune Limited Factor ii alone or in combination with further factors for treatment of impaired haemostasis associated with dilutional coagulopathy
US8895291B2 (en) 2010-10-08 2014-11-25 Terumo Bct, Inc. Methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system with control conditions
TWI557135B (zh) 2010-11-03 2016-11-11 介控生化科技公司 經修飾之第九因子多胜肽及其用途
SG10201800873WA (en) 2011-04-22 2018-03-28 Univ California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
WO2012149463A1 (en) * 2011-04-29 2012-11-01 The University Of North Carolina At Chapel Hill Chimeric factor vii molecules with enhanced half life and methods of use
EP2554161A1 (en) 2011-08-02 2013-02-06 LFB Biotechnologies Pharmaceutical composition comprising factor VII encapsulated in micelles
CA2863328A1 (en) * 2012-01-12 2013-07-18 Biogen Idec Ma Inc. Chimeric factor viii polypeptides and uses thereof
SG11201406492YA (en) 2012-04-16 2014-11-27 Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd Optimised subcutaneous therapeutic agents
WO2013177584A2 (en) * 2012-05-25 2013-11-28 The Children's Hospital Of Philadelphia FVIIa VARIANTS EXHIBITING ALTERED INTERACTION WITH ENDOTHELIAL PROTEIN C RECEPTOR (EPCR) AND METHODS OF USE THEREOF FOR MODULATING HEMOSTASIS
US8986991B2 (en) * 2012-07-03 2015-03-24 Expression Therapeutics, Llc High yield suspension cell line, system and method for making same
ES2704083T3 (es) 2012-07-25 2019-03-14 Catalyst Biosciences Inc Polipéptidos de factor x modificados y usos de los mismos
US20150259665A1 (en) 2012-10-15 2015-09-17 Novo Nordisk Health Care Ag Factor vii conjugates
MY193211A (en) 2013-03-15 2022-09-26 Bayer Healthcare Llc Gla domains as targeting agents
JP6600624B2 (ja) 2013-05-31 2019-10-30 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア アデノ随伴ウイルス変異体及びその使用方法
CN103397009B (zh) * 2013-08-16 2015-06-03 安源生物科技(上海)有限公司 改良型人凝血因子FVII-Fc融合蛋白及其制备方法与用途
MX2016004702A (es) 2013-10-15 2016-07-22 Novo Nordisk Healthcare Ag Polipeptidos del factor vii de coagulacion.
US9617506B2 (en) 2013-11-16 2017-04-11 Terumo Bct, Inc. Expanding cells in a bioreactor
EP3119798B1 (en) 2014-03-17 2020-08-05 Adverum Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for enhanced gene expression in cone cells
EP3613841B1 (en) 2014-03-25 2022-04-20 Terumo BCT, Inc. Passive replacement of media
CN106536566A (zh) 2014-05-26 2017-03-22 莱顿教学医院 用于出血治疗的促止血蛋白
CN106715676A (zh) 2014-09-26 2017-05-24 泰尔茂比司特公司 按计划供养
WO2016141078A1 (en) 2015-03-02 2016-09-09 Avalanche Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for intravitreal delivery of polynucleotides to retinal cones
US10883117B2 (en) 2015-03-24 2021-01-05 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus variants and methods of use thereof
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
US11965175B2 (en) 2016-05-25 2024-04-23 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
EP3827812A1 (en) 2016-07-29 2021-06-02 The Regents of the University of California Adeno-associated virus virions with variant capsid and methods of use thereof
US11192925B2 (en) 2016-10-19 2021-12-07 Adverum Biotechnologies, Inc. Modified AAV capsids and uses thereof
US11702634B2 (en) 2017-03-31 2023-07-18 Terumo Bct, Inc. Expanding cells in a bioreactor
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
CN111108196A (zh) 2017-05-09 2020-05-05 爱莫里大学 凝血因子变体及其用途
WO2018222503A1 (en) * 2017-05-31 2018-12-06 The Regents Of The University Of California Adeno-associated virus with variant capsid and methods of use thereof
CN110709511A (zh) 2017-08-28 2020-01-17 加利福尼亚大学董事会 腺相关病毒衣壳变体及其使用方法
US20200407422A1 (en) 2017-09-05 2020-12-31 GLAdiator Biosciences, Inc. A method of intracellular delivery
US11560556B2 (en) 2018-08-03 2023-01-24 Duke University Protein C-factor VII chimeras
US20210069306A1 (en) 2019-08-15 2021-03-11 Catalyst Biosciences, Inc. Modified factor vii polypeptides for subcutaneous administration and on-demand treatment

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
GR860984B (en) * 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
DK323587D0 (da) 1987-06-25 1987-06-25 Novo Industri As Protein
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
EP1892296A1 (en) 1988-09-02 2008-02-27 Dyax Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5033352A (en) 1989-01-19 1991-07-23 Yamaha Corporation Electronic musical instrument with frequency modulation
US5580560A (en) 1989-11-13 1996-12-03 Novo Nordisk A/S Modified factor VII/VIIa
WO1991011514A1 (en) * 1990-01-29 1991-08-08 Zymogenetics, Inc. Anticoagulant proteins
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5817788A (en) * 1991-02-28 1998-10-06 Zymogenetics, Inc. Modified factor VII
US20040087498A1 (en) * 1991-02-28 2004-05-06 Novo Nordisk Health Care Ag Modified factor VII
US5861374A (en) * 1991-02-28 1999-01-19 Novo Nordisk A/S Modified Factor VII
US5788965A (en) * 1991-02-28 1998-08-04 Novo Nordisk A/S Modified factor VII
JP4146512B2 (ja) 1991-03-01 2008-09-10 ダイアックス コープ． 小型タンパク質
CA2108147C (en) 1991-04-10 2009-01-06 Angray Kang Heterodimeric receptor libraries using phagemids
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5323907A (en) 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
ATE455552T1 (de) 1997-02-14 2010-02-15 American Nat Red Cross Expression des active human factor ix im brustdrüsengewebe transgener tiere
US20050032690A1 (en) * 1997-09-10 2005-02-10 Rojkjaer Lisa Payne Factor VII polypeptides for preventing formation of inhibitors in subjects with haemophilia
US6693075B1 (en) 1997-10-23 2004-02-17 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US6017882A (en) 1997-10-23 2000-01-25 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
US7247708B2 (en) * 1997-10-23 2007-07-24 Regents Of The University Of Minnesota Modified vitamin K-dependent polypeptides
WO1999051773A1 (en) 1998-04-03 1999-10-14 Phylos, Inc. Addressable protein arrays
DE19937219A1 (de) 1999-08-06 2001-02-08 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Reindarstellung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease, ihres Proenzyms oder eines Gemisches beider Proteine mittels Ionenaustauscherchromatographie
AU1436401A (en) 1999-10-21 2001-05-14 Board Of Trustees Of The University Of Arkansas, The RepO-associated virus AAV REP78 major regulatory protein, mutants thereof and uses thereof
GB9928787D0 (en) 1999-12-03 2000-02-02 Medical Res Council Direct screening method
RU2278123C2 (ru) * 2000-02-11 2006-06-20 Максиджен Холдингз Лтд. Молекулы, подобные фактору vii или viia
US6905683B2 (en) * 2000-05-03 2005-06-14 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII variants
AU2001254624A1 (en) 2000-05-03 2001-11-12 Novo-Nordisk A/S Human coagulation factor vii variants
EP1282438B1 (en) * 2000-05-10 2005-08-03 Novo Nordisk Health Care AG Use of pharmaceutical composition comprising a factor viia and a factor xiii
JP4361728B2 (ja) 2000-09-13 2009-11-11 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト ヒト凝固因子ｖｉｉ変異型
CA2420892A1 (en) * 2000-09-13 2002-03-21 Novo Nordisk A/S Human coagulation factor vii variants
DE60137950D1 (de) * 2000-10-02 2009-04-23 Novo Nordisk Healthcare Ag Verfahren zur herstellung vitamin-k-abhängiger proteine
AU2002218029A1 (en) * 2000-11-09 2002-05-21 The Scripps Research Institute Modified factor viia
CA2434139C (en) 2001-01-23 2014-05-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleic-acid programmable protein arrays
US20040133930A1 (en) 2002-03-11 2004-07-08 Cooper Julian D. Production of high levels of transgenic factor ix without gene rescue, and its therapeutic uses
CA2441580A1 (en) 2001-03-22 2002-10-03 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor vii derivatives
US7235638B2 (en) * 2001-03-22 2007-06-26 Novo Nordisk Healthcare A/G Coagulation factor VII derivatives
US20030134298A1 (en) * 2001-07-03 2003-07-17 Madison Edwin L. Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 20, the encoded polypeptides and methods based thereon
US7419949B2 (en) * 2001-07-16 2008-09-02 Novo Noridsk Healthcare A/G Single-dose administration of factor VIIa
US6882883B2 (en) * 2001-08-31 2005-04-19 Medtronic, Inc. Implantable medical device (IMD) system configurable to subject a patient to a stress test and to detect myocardial ischemia within the patient
US7052868B2 (en) * 2001-09-27 2006-05-30 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
ES2376694T3 (es) 2001-09-27 2012-03-16 Novo Nordisk Health Care Ag Polipã‰ptidos del factor vii de coagulaciã“n humano.
PL368119A1 (en) * 2001-10-02 2005-03-21 Novo Nordisk Health Care Ag Method for production of recombinant proteins in eukaryote cells
WO2003031585A2 (en) * 2001-10-09 2003-04-17 Dendreon Corporation Transmembrane serine protease 25
JP3862996B2 (ja) 2001-10-31 2006-12-27 帝人ファイバー株式会社 ポリトリメチレンテレフタレートフィラメント糸およびその製造方法
US6960657B2 (en) * 2001-11-02 2005-11-01 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
US7291587B2 (en) * 2001-11-09 2007-11-06 Novo Nordisk Healthcare A/G Pharmaceutical composition comprising factor VII polypeptides and TAFI polypeptides
AU2002357004A1 (en) * 2001-11-20 2003-06-10 Dendreon San Diego Llc Nucleic acid molecules encoding serine protease 17, the encoded polypeptides and methods based thereon
KR20040065278A (ko) * 2001-12-21 2004-07-21 노보 노르디스크 에이/에스 변경된 인자 ⅶ 폴리펩티드의 액체 조성물
IL162618A0 (en) * 2001-12-21 2005-11-20 Novo Nordisk As Liquid composition of modified factor vii polypeptides
US7700733B2 (en) * 2002-04-30 2010-04-20 Bayer Healthcare Llc Factor VII or VIIa polypeptide variants
US20040009918A1 (en) * 2002-05-03 2004-01-15 Hanne Nedergaard Stabilised solid compositions of modified factor VII
US20040001801A1 (en) * 2002-05-23 2004-01-01 Corvas International, Inc. Conjugates activated by cell surface proteases and therapeutic uses thereof
MXPA04012496A (es) * 2002-06-21 2005-09-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformos del factor vii pegilados.
WO2004005471A2 (en) * 2002-07-02 2004-01-15 Dendreon Corporation Serine protease 16
DE60315847T2 (de) 2002-09-25 2008-05-15 Novo Nordisk Health Care Ag Varianten des menschliche koagulationsfaktors vii
US6911323B2 (en) * 2002-09-25 2005-06-28 Novo Nordisk Healthcare A/G Human coagulation factor VII polypeptides
ATE505487T1 (de) * 2002-09-30 2011-04-15 Bayer Healthcare Llc Fvii- oder fviia-varianten mit erhöhter koagulationswirkung
SG166001A1 (en) 2002-10-02 2010-11-29 Catalyst Biosciences Inc Methods of generating and screening for proteases with altered specificity
ES2327044T3 (es) * 2003-03-20 2009-10-23 Bayer Healthcare Llc Variantes de fvii o fviia.
FI20030413A (fi) 2003-03-20 2004-09-21 Suomen Intech Oy Kaasulaakerointi
US7897734B2 (en) * 2003-03-26 2011-03-01 Novo Nordisk Healthcare Ag Method for the production of proteins
WO2004087933A2 (en) 2003-03-28 2004-10-14 The Regents Of The University Of California A novel encoding method for 'one-bead one-compound' combinatorial libraries
CA2528239A1 (en) 2003-06-05 2004-12-16 Canadian Blood Services Mutants of the factor vii epidermal growth factor domain
US20060116324A1 (en) * 2003-06-13 2006-06-01 Novo Nordisk Healthcare A/G Novel formulations
NZ544728A (en) 2003-06-19 2009-04-30 Bayer Healthcare Llc Factor VII or VIIa Gla domain variants
ES2381110T3 (es) * 2003-09-09 2012-05-23 Novo Nordisk Health Care Ag Polipéptidos de factor VII de coagulación
WO2005032581A2 (en) * 2003-10-07 2005-04-14 Novo Nordisk Health Care Ag Hybrid molecules having factor vii/viia activity
US20070072271A1 (en) * 2004-01-07 2007-03-29 Novo Nordisk Healthcare A/G Method for the production of recombinant proteins
WO2005075635A2 (en) * 2004-02-03 2005-08-18 Novo Nordisk Health Care Ag Coagulation factor vii/viia variants lacking a functional lipid membrane binding domain
DK1735439T3 (da) * 2004-04-12 2012-02-06 Catalyst Biosciences Inc Spaltning af VEGF og VEGF receptor ved hjælp af vild-type og mutant MT-SP1
EP1761630A2 (en) * 2004-06-21 2007-03-14 Novo Nordisk Health Care AG Glycosylation-disrupted factor vii variants
WO2006014253A2 (en) * 2004-07-02 2006-02-09 Genentech, Inc. Factor viia variants
WO2006114105A2 (en) * 2005-04-26 2006-11-02 Maxygen Holdings Ltd. Use of modified factor vii for treating bleeding
WO2007031559A2 (en) * 2005-09-14 2007-03-22 Novo Nordisk Health Care Ag Human coagulation factor vii polypeptides
JP2009508510A (ja) * 2005-09-21 2009-03-05 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー ヒト凝固第ｖｉｉ因子ポリペプチド
AU2006304804B2 (en) * 2005-10-21 2011-06-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Modified proteases that inhibit complement activation
EP2423305A1 (en) * 2006-06-19 2012-02-29 Catalyst Biosciences, Inc. Modified coagulation factor IX polypeptides and use thereof for treatment
SG175602A1 (en) * 2006-07-05 2011-11-28 Catalyst Biosciences Inc Protease screening methods and proteases identified thereby
EP2147096B1 (en) * 2007-04-13 2015-03-25 Catalyst Biosciences, Inc. Modified factor VII polypeptides and uses thereof
TWI538916B (zh) * 2008-04-11 2016-06-21 介控生化科技公司 經修飾的因子vii多肽和其用途
RU2563231C2 (ru) * 2009-06-25 2015-09-20 Дзе Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл Химерные молекулы фактора vii
TWI557135B (zh) * 2010-11-03 2016-11-11 介控生化科技公司 經修飾之第九因子多胜肽及其用途
ES2704083T3 (es) * 2012-07-25 2019-03-14 Catalyst Biosciences Inc Polipéptidos de factor x modificados y usos de los mismos

Also Published As

Publication number Publication date
CR11058A (es) 2010-02-09
EP2481797A1 (en) 2012-08-01
MX2009010997A (es) 2009-11-02
NI200900187A (es) 2010-10-11
PT2147096E (pt) 2015-07-21
KR20150067772A (ko) 2015-06-18
UA101155C2 (ru) 2013-03-11
RU2009141510A (ru) 2011-05-20
ZA201109181B (en) 2012-08-29
ZA200906854B (en) 2012-03-28
IL218776A0 (en) 2012-05-31
ES2537328T3 (es) 2015-06-05
CO6231052A2 (es) 2010-12-20
EP2147096A2 (en) 2010-01-27
BRPI0810172A2 (pt) 2014-10-14
SI2147096T1 (sl) 2015-07-31
NZ579985A (en) 2012-02-24
SG174077A1 (en) 2011-09-29
EP2147096B1 (en) 2015-03-25
RU2571931C2 (ru) 2015-12-27
AU2008239586A1 (en) 2008-10-23
CN101743309A (zh) 2010-06-16
US20100166729A9 (en) 2010-07-01
JP5761782B2 (ja) 2015-08-12
GT200900268A (es) 2015-03-25
NZ593611A (en) 2012-06-29
HN2009002098A (es) 2012-03-12
CN103451172A (zh) 2013-12-18
ECSP099735A (es) 2010-01-29
CN101743309B (zh) 2014-01-29
PL2147096T3 (pl) 2015-08-31
WO2008127702A2 (en) 2008-10-23
JP2016155836A (ja) 2016-09-01
US20090098103A1 (en) 2009-04-16
WO2008127702A3 (en) 2009-03-19
DK2147096T3 (da) 2015-06-15
CA2683443A1 (en) 2008-10-23
SV2009003393A (es) 2010-04-30
HK1134520A1 (en) 2010-04-30
AU2008239586B2 (en) 2013-09-26
JP2014042523A (ja) 2014-03-13
PH12014501960A1 (en) 2015-10-19
IL201173A0 (en) 2011-08-01
JP2010523150A (ja) 2010-07-15

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KR101623602B1 (ko) 변형된 제ⅶ 인자 폴리펩티드 및 그의 용도
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