CN103451172A

CN103451172A - 修饰的因子vii多肽及其应用

Info

Publication number: CN103451172A
Application number: CN201310367450XA
Authority: CN
Inventors: E·L·麦迪逊; C·D·萨诺斯; S·W·拉格尔斯; S·库格林
Original assignee: Catalyst Biosciences Inc
Current assignee: Gyre Therapeutics Inc
Priority date: 2007-04-13
Filing date: 2008-04-11
Publication date: 2013-12-18
Also published as: HN2009002098A; GT200900268A; JP2016155836A; SV2009003393A; RU2571931C2; US20090098103A1; WO2008127702A3; KR20100016462A; ZA200906854B; DK2147096T3; EP2147096B1; CO6231052A2; RU2009141510A; UA101155C2; ES2537328T3; EP2481797A1; JP2014042523A; NZ579985A; SG174077A1; NZ593611A

Abstract

本发明提供了修饰的因子VII多肽及其应用。这种修饰的FVII多肽包括因子VIIa及其它形式的因子VII。本发明提供的修饰的FVII多肽是活性改变的那些多肽，通常具有改变的促凝血活性，包括促凝血活性增加。因此，这种修饰的多肽是治疗剂。

Description

修饰的因子VII多肽及其应用

本申请是申请日为2008年4月11日的申请号为200880016982.6标题为“修饰的因子VII多肽及其应用”的申请的分案申请。

相关申请

要求2007年4月13日提交的题为“MODIFIED FACTOR VIIPOLYPEPTIDES AND USES THEREOF”的美国临时申请No.60/923,512的优先权,该临时申请的申请人为Edwin Madison,Christopher Thanos,SandraWaugh Ruggles和Shaun Coughlin。

本申请涉及对应的美国申请No.12/082,662，题为“MODIFIEDFACTOR VII POLYPEPTIDES AND USES THEREOF”，申请人为EdwinMadison,Christopher Thanos,Sandra Waugh Ruggles和Shaun Coughlin，也要求美国临时申请No.60/923,512的优先权。

在允许的情况下，上述申请的每一个的主题都全文包含在内作为参考。

发明领域

本发明提供了修饰的治疗性蛋白质。本发明特别提供了修饰的因子VII多肽及其应用，所述多肽包括因子VIIa及其它形式的因子VII。

发明背景

止血是使出血停止的一个复杂的生理学过程。血小板、血浆蛋白、血管和内皮细胞是这个过程的三个成分，每个成分在组织损伤后的紧接事件中起重要作用，并且在正常情况下使血凝块快速形成。关键的是凝血级联反应，这是一系列蛋白酶解事件，其中某些血浆蛋白(或者凝血因子)在“级联”中相继被另一先被活化的凝血因子激活，导致凝血酶的迅速形成。随后在这个级联中产生的大量凝血酶使纤维蛋白原裂解为血凝块形成所需的纤维蛋白肽。

凝血因子作为无活性的单链酶原循环，在一或多个部位被活化而产生双链活性形式的蛋白质。因子VII(FVII)是维生素K依赖性血浆蛋白，最初在血液中以酶原形式循环。FVII酶原在单一位置Arg¹⁵²-Ile¹⁵³被蛋白酶解，产生由一个二硫键连接的双链蛋白酶(FVIIa)。FVIIa结合其辅因子-组织因子(TF)-形成复合物，其中FVIIa可有效地使因子X(FX)活化为FXa，从而起始导致纤维蛋白形成和止血的一系列事件。

虽然在大多数情况中实现正常止血，但是该过程中的缺陷可以导致出血性疾病，其中血凝块形成的时间延长。这种疾病可以是先天或者后天的。例如，血友病A和B是遗传性疾病，特征分别在于因子VIII(FVIII)和因子IX(FIX)的缺陷。替代治疗是血友病A和B的传统治疗方法，包括静脉内给予从人血浆中制备的或者作为重组蛋白质的FVIII或者FIX。然而在许多情况中，患者产生注入的蛋白质的抗体(也称作抑制剂)，其降低治疗效力或者使治疗无效。已经许可重组FVIIa

用于治疗具有FVIII或FIX抑制剂的血友病A或者B患者，且还用于终止与外伤和/或手术相关的出血事件或者防止出血。重组FVIIa也被许可用于治疗先天性FVII缺陷的患者，并越来越多地用于适应症外使用(off-label use)，如治疗与非血友病患者中先天性或者获得性出血疾病、外伤和手术相关的出血。

重组FVIIa促进血凝块形成的应用突出了其治疗治疗剂的越来越重要的特点。FVIIa治疗明显未满足临床需要。例如，给予临床试验数据，需要在6小时或更多的时间平均3剂的FVIIa以处理血友病患者的急性出血事件。需要更有效的FVIIa变体以减少这些需求。因此，本发明的一个目的是提供修饰的FVII多肽，其被修饰为具有改良的治疗性质。

发明概述

本发明提供了修饰的因子VII(FVII)多肽。本发明特别提供了呈现促凝血活性的修饰的FVII多肽。该FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比在一级序列中被修饰，且可包括氨基酸插入、缺失和置换。本发明提供的修饰的FVII多肽包括这样的多肽，其呈现出对于组织因子途径抑制剂(TFPI)的抑制作用抗性增加、对于抗凝血酶-III(AT-III)的抑制作用抗性增加、Zn²⁺结合力降低、药动学性质改良如半衰期延长、在有和/或无TF的条件下催化活性增加，和/或与活化的血小板的结合增强。所述修饰的FVII多肽可含有本文提供的修饰的任何组合，由此与未修饰的FVII多肽相比一或多个活性或者性质被改变。典型地，修饰的FVII多肽保留促凝血活性。本发明还提供了编码/表达修饰的FVII多肽的核酸分子、载体和细胞。本发明还提供了药物组合物、制品、试剂盒和治疗方法。FVII多肽包括等位基因和种变体以及具有影响其它活性和/或性质的修饰的多肽和其它变体。本发明还包括包含本发明提供的修饰的FVII多肽的活性片段。举例FVII多肽是包含所示氨基酸序列的那些多肽以及与其具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列相同性的变体。

本发明的因子VII(FVII)多肽与未修饰的FVII多肽相比在一级序列中被修饰，所述修饰可包括氨基酸插入、缺失和置换。本发明提供的修饰的FVII多肽包括这样的FVII多肽，其呈现出对于TFPI的抑制作用抗性增加，对于AT-III的抑制作用抗性增加，Zn²⁺结合力下降，药动学性质改良，如半衰期延长，在有和/或无(组织因子)TF条件下催化活性增加，和/或与活化的血小板结合增强。所述修饰的FVII多肽可含有本发明提供的修饰的任意组合，从而与未修饰的FVII多肽相比该多肽的一或多种活性或者性质被改变。所述FVII多肽可包括改变性质和/或活性的其它修饰。典型地，所述修饰的FVII多肽保留促凝血活性。本发明还提供了编码/表达修饰的FVII多肽的核酸分子、载体和细胞。本发明也提供了药物组合物、制品、试剂盒和治疗方法。

特别地，本发明提供的修饰的因子VII(FVII)多肽的等位基因和种变体或者其活性片段或者其它变体。本发明提供了FVII多肽，包括其等位基因变体和种变体或者其活性片段，其在对应具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽的D196、K197或者K199位置或者在FVII多肽包括其等位基因变体和种变体、活性片段的对应残基具有修饰，本发明还提供了针对其它活性或者性质修饰的其它FVII多肽。所述FVII多肽在对应含有SEQ IDNO:3所示氨基酸序列的FVII多肽中D196、K197或K199的位置或者在FVII多肽的对应位置含有至少一个修饰。所述修饰是选自如下的疏水性或者酸性氨基酸的插入和/或置换：Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)、Tyr(Y)、Cys(C)、Asp(D)和Glu(E)。当提供活性片段时，该活性片段包含这种修饰。例如，本发明提供了这样修饰的因子VII(FVII)多肽、其等位基因和种变体或者其活性片段或其它变体，其也包含选自如下的置换：D196F、D196W、D196L、D196I、D196Y、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199D、K199E和K197Y。

此外，本发明提供的修饰的FVII多肽在其另一位置可含有进一步的修饰，包括氨基酸置换、插入和缺失。在一些实例中，所述进一步修饰是在对应选自D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341的位置的氨基酸置换，其中第一个修饰和第二个修饰位于不同的氨基酸。这些修饰可包括但不限于：D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D和K341Q。其它举例的氨基酸插入修饰例如但不限于是如下任意插入：G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA和K197I198insS。其它举例的修饰的FVII多肽包括如下修饰：D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、K196V/K197E、K197E/K341Q、K197L/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q或K197E/K199E/K341Q。

本发明还提供了这样修饰的FVII多肽，包括其等位基因和种变体或者其活性片段或其它变体，其也可含有对应具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽或者FVII多肽对应位置中如下任一或多个氨基酸修饰：D196R、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197E、K197D、K197L、K197M、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199D、K199E、G237W、G237I、G237V、R290M、R290V、K341M、K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA或者K197I198insS。此外，这些修饰的FVII多肽可含有在另一位置的进一步的修饰，包括氨基酸置换、插入或者缺失。在一些实例中，所述进一步修饰可以是在对应D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341位置的氨基酸置换，其中所述进一步修饰与第一个修饰在不同位置。例如，所述修饰的FVII多肽可另外含有选自如下的氨基酸置换：D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D和K341Q。举例的这种修饰的FVII多肽是包含选自如下修饰的那些多肽：D196R/R290E、D196R/R290D、D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、K197L/K341Q、G237V/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q、K197E/K199E/K341Q和K196V/K197E。

在一些情况中，修饰的因子VII(FVII)多肽、包括其等位基因和种变体或者其活性片段或者其它变体，可包含FVII多肽中两或多个修饰，其中至少两个氨基酸修饰对应具有或包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽如下修饰或者FVII多肽中对应残基的修饰：D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D、K341Q、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA或者K197I198insS。所述多肽可包含多于两个的修饰，例如2、3、4、5、6或者7个修饰。

举例的这些多肽是这样的FVII多肽，其包含选自如下的修饰：D196R/R290E、D196K/R290E、D196R/R290D、D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、D196V/K197E、K197E/K341Q、K197L/K341Q、G237V/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q、K197E/K199E/K341Q和K197E/G237V/M298Q。

上述任何修饰的FVII多肽均可呈现出与未修饰的FVII多肽比对于组织因子途径抑制剂(TFPI)的抗性增加。在一些实例中，所述修饰的FVII多肽的TFPI抗性是至少大约或是1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或更高。此外，这些修饰的FVII多肽也可以含有实现磷脂结合的异源Gla结构域或者其足够部分。

本发明还提供了这样修饰的FVII多肽，其含有实现磷脂结合的异源Gla结构域或者其足够部分，如30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的异源Gla结构域。上述任何及所有修饰的FVII多肽也可包含Gla交换(swap)，包括本文举例和描述的Gla交换。

异源Gla结构域可选自因子IX(FIX)、因子X(FX)、凝血酶原、C蛋白、S蛋白、骨钙素、基质Gla蛋白、生长阻滞特异蛋白(Growth-arrest-specificprotein)6(Gas6)或者Z蛋白的Gla结构域。在一些实例中，本发明提供的修饰的FVII多肽中的异源Gla结构域具有SEQ ID NO:110-118、120和121所示任一氨基酸序列或者其足够部分以实现磷脂结合。对FVII多肽的修饰可以通过除去天然FVII Gla结构域的所有或者邻近部分而实现，这可包括具有或者包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽中1-45位氨基酸或者FVII多肽中对应残基，并且用异源Gla结构域或者其足够部分置换以实现磷脂结合，例如增加磷脂结合。这种修饰可导致修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比呈现出磷脂结合力增强。例如，所述修饰的FVII多肽可呈现出磷脂结合力增强至少大约或者增强1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或更高。

所述修饰的FVII多肽的全部或者邻近部分的天然FVII Gla结构域被除去，并用异源Gla结构域或者其足够部分置换以实现磷脂结合。举例的这种多肽是这样的多肽，其中天然FVII Gla结构域包含具有或包含SEQ IDNO:3所示氨基酸序列的FVII多肽中1-45位氨基酸或者FVII多肽中对应残基。Gla修饰包括但不限于Gla Swap FIX、Gla Swap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S和Gla Swap凝血酶。

通过交换，修饰的FVII多肽可呈现出磷脂结合力增强。这种磷脂结合增强可以是增强至少大约或者增强0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或更高。

含有异源Gla结构域的修饰的FVII多肽在某些位置可含有进一步修饰，导致或者呈现出与未修饰的FVII多肽相比对于组织因子途径抑制剂(TFPI)的抗性增加。举例的这种修饰是在具有或包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽中D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341位置或者FVII多肽对应残基中的一或多个氨基酸修饰。特别地，这种修饰可包括选自如下的一或多个氨基酸修饰：D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D、K341Q、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA和K197I198insS。例如，含有异源Gla结构域的修饰的FVII多肽也可含有氨基酸置换和/或氨基酸插入，例如但不限于：D196R/R290E、D196K/R290E、D196R/R290D、D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E以及D196R/K197M/K199E/R290E。

在一些情况中，这种进一步修饰导致修饰的多肽与不含有修饰-即未修饰的FVII多肽相比对于TFPI的抗性增加。

上述任何修饰的FVII多肽，包括呈现出对于TFPI抗性增加或者磷脂结合力增强或者这些性质的任意组合的多肽，可另外含有其它修饰，包括本领域所述的任何修饰。这种进一步的氨基酸修饰可增加对抗凝血酶-III(AT-III)的抗性，增加与磷脂的结合和/或亲和性，增加对于组织因子(TF)的亲和性，增强内在活性，改变多肽的构象以改变酶原性，包括使构象改变为更具酶原样形状或者更不具备酶原样形状，增加蛋白酶抗性，降低糖基化，增加糖基化，降低免疫原性，提高稳定性，和/或促进化学基团连接。例如，本发明提供的修饰的FVII多肽可含有在具有或包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的Q176、M298或者E296位置或者FVII多肽中对应残基中的修饰。在一些实例中，修饰的FVII多肽可另外含有选自Q176A、M298Q、E296V和/或E296A的的氨基酸修饰。在其它实例中，修饰的FVII多肽除了Gla交换和/或其它指定的修饰之外，可另外含有一或多个如下进一步的氨基酸修饰：S278C/V302C、L279C/N301C、V280C/V301C、S281C/V299C、在第4位的酪氨酸插入、F4S、F4T、P10Q、P10E、P10D、P10N、Q21N、R28F、R28E、I30C、I30D、I30E、K32D、K32Q、K32E、K32G、K32H、K32T、K32C、K32A、K32S、D33C、D33F、D33E、D33K、A34C、A34E、A34D、A34I、A34L、A34M、A34V、A34F、A34W、A34Y、R36D、R36E、T37C、T37D、T37E、K38C、K38E、K38T、K38D、K38L、K38G、K38A、K38S、K38N、K38H、L39E、L39Q、L39H、W41N、W41C、W41E、W41D、I42R、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42K、S43Q、S43N、Y44K、Y44C、Y44D、Y44E、S45C、S45D、S45E、D46C、A51N、S53N、G58N、G59S、G59T、K62E、K62R、K62D、K62N、K62Q、K62T、L65Q、L65S、L65N、F71D、F71Y、F71E、F71Q、F71N、P74S、P74A、A75E、A75D、E77A、E82Q、E82N、E82S、E82T T83K、N95S、N95T、G97S、G97T、Y101N、D104N、T106N、K109N、E116D、G117N、G124N、S126N、T128N、L141C、L141D、L141E、E142D、E142C、K143C、K143D、K143E、R144E、R144C、R144D、N145Y、N145G、N145F、N145M、N145S、N145I、N145L、N145T、N145V、N145P、N145K、N145H、N145Q、N145E、N145R、N145W、N145D、N145C、K157V、K157L、K157I、K157M、K157F、K157W、K157P、K157G、K157S、K157T、K157C、K157Y、K157N、K157E、K157R、K157H、K157D、K157Q、V158L、V158I、V158M、V158F、V158W、V158P、V158G、V158S、V158T、V158C、V158Y、V158N、V158E、V158R、V158K、V158H、V158D、V158Q、A175S、A175T、G179N、I186S、I186T、V188N、R202S、R202T、I205S、I205T、D212N、E220N、I230N、P231N、P236N、G237N、Q250C、V253N、E265N、T267N、E270N、A274M、A274L、A274K、A274R、A274D、A274V、A274I、A274F、A274W、A274P、A274G、A274T、A274C、A274Y、A274N、A274E、A274H、A274S、A274Q、F275H、R277N、F278S、F278A、F278N、F278Q、F278G、L280N、L288K、L288C、L288D、D289C、D289K、L288E、R290C、R290G、R290A、R290S、R290T、R290K、R290D、R290E、G291E、G291D、G291C、G291N、G291K、A292C、A292K、A292D、A292E、T293K、E296V、E296L、E296I、E296M、E296F、E296W、E296P、E296G、E296S、E296T、E296C、E296Y、E296N、E296K、E296R、E296H、E296D、E296Q、M298Q、M298V、M298L、M298I、M298F、M298W、M298P、M298G、M298S、M298T、M298C、M298Y、M298N、M298K、M298R、M298H、M298E、M298D、P303S、P303ST、R304Y、R304F、R304L、R304M、R304G、R304T、R304A、R304S、R304N、L305V、L305Y、L305I、L305F、L305A、L305M、L305W、L305P、L305G、L305S、L305T、L305C、L305N、L305E、L305K、L305R、L305H、L305D、L305Q、M306D、M306N、D309S、D309T、Q312N、Q313K、Q313D、Q313E、S314A、S314V、S314I、S314M、S314F、S314W、S314P、S314G、S314L、S314T、S314C、S314Y、S314N、S314E、S314K、S314R、S314H、S314D、S314Q、R315K、R315G、R315A、R315S、R315T、R315Q、R315C、R315D、R315E、K316D、K316C、K316E、V317C、V317K、V317D、V317E、G318N、N322Y、N322G、N322F、N322M、N322S、N322I、N322L、N322T、N322V、N322P、N322K、N322H、N322Q、N322E、N322R、N322W、N322C、G331N、Y332S、Y332A、Y332N、Y332Q、Y332G、D334G、D334E、D334A、D334V、D334I、D334M、D334F、D334W、D334P、D334L、D334T、D334C、D334Y、D334N、D334K、D334R、D334H、D334S、D334Q、S336G、S336E、S336A、S336V、S336I、S336M、S336F、S336W、S336P、S336L、S336T、S336C、S336Y、S336N、S336K、S336R、S336H、S336D、S336Q、K337L、K337V、K337I、K337M、K337F、K337W、K337P、K337G、K337S、K337T、K337C、K337Y、K337N、K337E、K337R、K337H、K337D、K337Q、K341E、K341Q、K341G、K341T、K341A、K341S、G342N、H348N、R353N、Y357N、I361N、F374P、F374A、F374V、F374I、F374L、F374M、F374W、F374G、F374S、F374T、F374C、F374Y、F374N、F374E、F374K、F374R、F374H、F374D、F374Q、V376N、R379N、L390C、L390K、L390D、L390E、M391D、M391C、M391K、M391N、M391E、R392C、R392D、R392E、S393D、S393C、S393K、S393E、E394K、P395K、E394C、P395D、P395C、P395E、R396K、R396C、R396D、R396E、P397D、P397K、P397C、P397E、G398K、G398C、G398D、G398E、V399C、V399D、V399K、V399E、L400K、L401K、L401C、L401D、L401E、R402D、R402C、R402K、R402E、A403K、A403C、A403D、A403E、P404E、P404D、P404C、P404K、F405K、P406C、K32N/A34S、K32N/A34T、F31N/D33S、F31N/D33T、I30N/K32S、I30N/K32T、A34N/R36S、A34N/R36T、K38N/F40S、K38N/F40T、T37N/L39S、T37N/L39T、R36N/K38S、R36N/K38T、L39N/W41S、L39N/W41T、F40N/I42S、F40N/I42T、I42N/Y44S、I42N/Y44T、Y44N/D46S、Y44N/D46T、D46N/D48S、D46N/D48T、G47N/Q49S、G47N/Q49T、K143N/N145S、K143N/N145T、E142N/R144S、E142N/R144T、L141N/K143S、L141N/K143T、I140N/E142S/、I140N/E142T、R144N/A146S、R144N/A146T、A146N/K148S、A146N/K148T、S147N/P149S/、S147N/P149T、R290N/A292S、R290N/A292T、D289N/G291S、D289N/G291T、L288N/R290S、L288N/R290T、L287N/D289S、L287N/D289、A292N/A294S、A292N/A294T、T293N/L295S、T293N/L295T、R315N/V317S、R315N/V317T、S314N/K316S、S314N/K316T、Q313N/R315S、Q313N/R315T、K316N/G318S、K316N/G318T、V317N/D319S、V317N/D319T、K341N/D343S、K341N/D343T、S339N/K341S、S339N/K341T、D343N/G345S、D343N/G345T、R392N/E394S、R392N/E394T、L390N/R392S、L390N/R392T、K389N/M391S、K389N/M391T、S393N/P395S、S393N/P395T、E394N/R396S、E394N/R396T、P395N/P397S、P395N/P397T、R396N/G398S、R396N/G398T、P397N/V399S、P397N/V399T、G398N/L400S、G398N/L400T、V399N/L401S、V399N/L401T、L400N/R402S、L400N/R402T、L401N/A403S、L401N/A403T、R402N/P404S、R402N/P404T、A403N/F405S、A403N/F405T、P404N/P406S和P404N/P406T、V158D/G237V/E296V/M298Q、K197E/G237V/M298Q、K197E/G237V/M298Q/K341Q、K197E/K199E/G237V/M298Q/K341Q、G237V/M298Q、G237V/M298Q/K341Q、M298Q/Gla Swap FIX、K197E/M298Q和M298Q/K341D。

本发明提供的任何修饰的FVII多肽可含有一或多个进一步的氨基酸修饰，所述修饰增加对抗凝血酶-III(AT-III)的抗性，增加与磷脂的结合和/或亲和性，增加与组织因子(TF)的亲和性，增强内在活性，改变多肽构象以改变酶原性，增加蛋白酶抗性，降低糖基化，增加糖基化，降低免疫原性，增强稳定性，和/或促进化学基团连接。例如，改变的酶原性可赋予更具酶原样形状或者更不具备酶原样形状。这种修饰的。这种修饰的FVII多肽例如可包括在300-322、305-322、300-312或者305-312位置由来自胰蛋白酶、凝血酶或者FX的对应氨基酸取代，或者在310-329、311-322或者233-329位置由来自胰蛋白酶的对应氨基酸取代。

本发明提供的修饰的多肽包括这样的多肽，即其中未修饰的FVII多肽仅含有或者包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。举例的修饰的FVII多肽是具有或者包含SEQ ID NO:18-43、125-150和206-250所示任何氨基酸序列的多肽，或者其等位基因或种变体或者其它变体。所述等位基因或种变体或者其它变体与SEQ ID NO:3所示多肽除了氨基酸修饰之外可具有40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高的序列相同性。FVII多肽的来源包括人和其它非人物种。所述多肽可以是成熟多肽或者前体多肽。在一些实施方案中，仅修饰FVII多肽的一级序列。另外，FVII多肽可包含化学修饰或者翻译后修饰，例如但不限于糖基化、羧化、羟化、磺化、磷酸化、白蛋白化(albumination)，或者与另一组分如聚乙二醇(PEG)组分缀合。

本发明提供的修饰的FVII多肽可以是单链多肽或者单链形式与双链或者多链形式的混合物，或者是双链、三链、或者其它多链形式。本发明提供的修饰的FVII多肽可以是无活性多肽或者活性多肽。可以例如通过蛋白酶解、通过自身激活、通过因子IX(FIXa)裂解、通过因子X(FXa)裂解、通过因子XII(FXIIa)裂解、或者通过凝血酶裂解而实现活化。

修饰的FVII多肽典型保留未修饰的FVII多肽的一或多种活性或者性质。修饰可包括在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或者60个氨基酸位置的修饰，只要所述多肽保留未修饰的FVII多肽至少一种FVII活性即可。活性的保持可以是保持未修饰的FVII多肽的至少大约或者保持未修饰的FVII多肽的1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%的活性。活性包括例如组织因子(TF)结合、因子X(FX)活化、因子IX(FIX)活化、磷脂结合以及血液凝固活性。活性可以被增加或者降低。在本发明提供的修饰的多肽中，其血液凝固活性被增加。活性可以在体外或者在体内评估。

本发明还提供了核酸分子，其包含编码任何修饰的FVII多肽的核苷酸序列。本发明也提供了载体，例如原核载体或者真核载体，包括哺乳动物载体和病毒载体。举例的病毒载体包括腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒和巨细胞病毒。本发明还提供了含有所述核酸分子或者载体的细胞。所述细胞可以是真核细胞，例如哺乳动物细胞或者酵母细胞，或者原核细胞。哺乳动物细胞包括例如幼仓鼠肾细胞(BHK-21)或者293细胞和CHO细胞。所属细胞可以在一定条件下生长，从而修饰的FVII多肽被表达。其可以是分泌的。本发明提供了由这种细胞产生的修饰的FVII多肽。

本发明还提供了含有本发明提供的修饰的FVII多肽的组合物。特别地，本发明提供了含有这种多肽的药物学组合物。所述组合物可含有在药物可接受的载体中的治疗有效浓度或者有效量的本发明提供的修饰的FVII多肽或者核酸分子或者载体或者细胞。药物组合物可以配制成单一给药剂量或者多重给药剂量形式。所述药物组合物可以是任何形式，例如液体、凝胶或者固体，在胶囊、容器或者其它合适运载体中提供。它们可以被配制成在给药之前进行稀释的稀释液或者任何合适形式。给药量可以依赖于治疗的病症和/或治疗的个体，且如果必需则可以根据经验确定。所述药物组合物可以根据任何给药途径配制，包括例如局部(local)、全身或者局域(topical)给予，或者配制为口服、经鼻、肺、口腔、皮肤、皮下、十二指肠内、肠道、肠道外、静脉内或者肌内途径给药。所述药物组合物可以配制为控制释放形式。

本发明还提供了治疗方法和所述组合物在治疗中的应用。所述药物组合物给予或者配制给予这样的对象，其患有通过给予FVII进行治疗的疾病或病症，包括通过给予活性FVII(FVIIa)进行治疗的疾病或病症。用所述药物组合物治疗改善或者减轻了与所述疾病或病症相关的症状。可以在给药之后或者同时监测对象与FVII介导的疾病或病症相关的症状的变化。用于治疗的疾病或病症包括但不限于凝血疾病、血液疾病、出血性病症(hemorrhagic disorder)、血友病、因子VII缺陷和出血疾病(bleedingdisorders)。举例的这些疾病是血友病A或者血友病B或者血友病C。血友病可以是先天性血友病或者获得性血友病，例如由于手术或者外伤所致出血性并发症导致。出血可以是急性关节积血(haemarthroses)，慢性血友病关节病、血肿、血尿、中枢神经系统出血、胃肠道出血，或者脑出血，且可以得自例如拔牙或者手术，例如血管成形术、肺手术、腹部手术、脊髓手术、脑手术、血管手术、牙齿手术或者器官移植术，例如骨髓移植、心脏移植、肺移植、胰腺移植和肝移植。所述对象可具有因子VIII或者因子IX的自身抗体。治疗可以伴随或者相继或间断给予一或多种额外的凝血因子，例如血浆纯化的或者重组的凝血因子、促凝血剂如维生素K、维生素K衍生物和C蛋白抑制剂，血浆、血小板、红细胞和皮质类固醇激素。所述药物组合物可以与含有这种其它凝血因子的组合物一起使用。

本发明提供了制品，其含有包装材料和包含在包装材料中的本发明提供的药物组合物，以及任选含有给药说明书。例如，药物组合物中的修饰的FVII多肽可以用于治疗FVII-介导的疾病或病症，包装材料可包含标示修饰的FVII多肽用于治疗FVII-介导的疾病或病症的标签。本发明还提供了试剂盒，其含有所述药物组合物和给予该组合物的装置以及任选含有给药说明书。

附图简述

图1描述了凝血级联反应。图中示出不依赖于FXa产生的凝血内源性途径和外源性途径，以及途径趋同为共有途径，以产生形成血凝块的凝血酶和纤维蛋白。这些途径是互相联系的。该图描述了参与活化级联的分子的顺序，其中酶原通过一或多个肽键的裂解而被转变为活化的蛋白酶。然后该活化的蛋白酶作为级联中下一酶原的激活蛋白酶，最后导致血凝块形成。

图2描述了基于细胞的凝血模型(见例如Hoffman et al.(2001)ThrombHaemost85:958-965)。该图描述了分为三个阶段的凝血事件，其中凝血的开始是通过TF-携带细胞上TF/FVIIa复合物使FX活化为FXa而引起的，导致FXa/FVa活化后少量凝血酶产生。当凝血酶结合并激活血小板时发生放大(Amplification)，并启始足够数量的适当凝血因子活化以形成FVIIIa/FIXa和FVa/FXa复合物。在损伤部位大量活化的血小板表面上发生的凝血传播，导致大量凝血酶产生，足以从纤维蛋白原中产生足够的纤维蛋白以在损伤部位形成血凝块。

图3描述了FVIIa可启始凝血酶形成的机制。该图例证了凝血酶产生的TF-依赖性途径，其在TF-携带细胞的表面起作用并参与FVIIa与TF的复合，随后使FX活化为FXa。该图还描述了FVIIa凝血酶产生的TF-非依赖性途径，在此期间FVIIa结合活化的血小板上的磷脂并使FX活化为FXa，FXa随后与FVa复合使得凝血酶原裂解为凝血酶。

图4描述了当TFPI/FXa复合物与TF/FVIIa复合物结合时获得的四元抑制复合物。TFPI含有三个Kunitz结构域。Kunitz结构域2(K-2)与FXa相互作用作用并抑制其，而Kunitz domain(K-1)与FVIIa相互作用并抑制其。

图5描述了(a)BPTI^5L15(SEQ ID NO:106的第1-55位氨基酸)和TFPI-2(SEQ ID NO:105的第14-65位氨基酸)以及(b)TFPI-1(SEQ ID NO:102的第26-76位氨基酸)和TFPI-2(SEQ ID NO:105的第14-65位氨基酸)的第一个Kunitz结构域的氨基酸序列对比，并且示出保守的氨基酸。

图6描述了用于确定在FVIIa与TFPI之间相互作用界面的接触残基的同源性模型。TFPI-2的Kunitz结构域1(K1)的结构取自胰蛋白酶/TFPI复合物晶体结构，且建模(model)在TF/FVIIa/BPTI^5L15晶体结构上的BPTI^5L15上。进行In silico诱变以使得TFPI-1K1的对应氨基酸符合模型。鉴别可能参与在蛋白质-蛋白质界面与TFPI相互作用的FVIIa的接触残基，并且确定作为在揭示TFPI-抗性FVII多肽中诱变候选物。

图7描述了FVIIa与TFPI之间的模拟的相互作用。特别地，该图描述了FVII接触在FVIIa与TFPI相互作用界面存在的残基，以及对应TFPI接触残基，形成互补的静电接触。

详细描述

结构概述

A.定义

B.止血综述

1.血小板粘附与聚集

2.凝血级联

a.启动

b.放大(Amplification)

c.传播(Propagation)

3.凝血的调节

C.因子VII(FVII)

1.FVII结构与组构

2.翻译后修饰

3.FVII加工(processing)

4.FVII活化

5.FVII功能

a.组织因子-依赖性FVIIa活性

b.组织因子-非依赖性FVIIa活性

6.FVII作为生物制药

D.修饰的FVII多肽

1.抑制剂抗性

a.TFPI

使TFPI抗性增加的修饰

b.抗凝血酶III(AT-III)

使AT-III抗性增加的修饰

2.结合活化的血小板

通过导入异源Gla结构域的修饰

3.组合的及额外的修饰

a.增加内在活性的修饰

b.增加蛋白酶抗性的修饰

c.增加与磷脂结合的修饰

d.改变糖基化的修饰

e.促进化学基团连接的修饰

f.举例的FVII组合突变体

E.修饰FVII的设计与方法

1.理性(Rational)

2.经验性的(即筛选)

a.随机诱变

b.聚焦(Focused)诱变

c.筛选

3.选择FVII变体

F.FVII多肽的产生

1.载体和细胞

2.表达系统

a.原核表达

b.酵母

c.昆虫和昆虫细胞

d.哺乳动物细胞

e.植物

2.纯化

3.融合蛋白

4.多肽修饰

5.核苷酸序列

G.评估修饰的FVII多肽的活性

1.体外测定

a.翻译后修饰

b.蛋白酶解活性

c.凝血活性

d.与其它蛋白质结合和/或被其它蛋白质抑制

e.磷脂结合

2.非人动物模型

3.临床试验

H.配制与给药

1.配制

a.剂量

b.剂型

2.给予修饰的FVII多肽

3.给予编码修饰的FVII多肽的核酸(基因治疗)

I.治疗应用

1.先天性出血疾病

a.血友病

b.FVII缺陷

c.其它疾病

2.获得性出血疾病

a.化疗获得性血小板减少症

b.其它凝血病

c.移植获得性出血

d.抗凝血治疗诱导的出血

e.获得性血友病

3.外伤与手术出血

J.组合治疗

K.制品与试剂盒

L.实施例

A.定义

除非另有说明，所有技术和科学术语都具有本领域技术人员常见的含义。本文引用的所有专利，专利申请，公开申请和公开出版物，GenBank序列，数据库，网站以及其它公开材料除非另有说明包含在此作为参考。如果本发明的术语有多种定义，以本部分中为准。描述URL或其它鉴定子或地址时，应理解所述鉴定子可改变并且因特网上的具体信息随时更新，相关信息可通过搜索因特网找到。其公开内容可作为公众所得的依据。

如本文所用，凝血途径或者凝血级联是指一系列的活化事件，导致不可溶的纤维蛋白血凝块形成。在凝血级联或途径中，丝氨酸蛋白酶的无活性蛋白质(也称作酶原)通过裂解一或多个肽键而被转变为活性蛋白酶，其然后作为该级联中下一酶原分子的激活蛋白酶。在该级联的最后蛋白酶解步骤中，纤维蛋白原通过凝血酶被蛋白酶解为纤维蛋白，随后其在损伤部位交联形成血凝块。

如本文所用，“止血”是指使器官或者机体一部分的出血或者血流停止。术语止血可包含血液凝固的全过程，以防止在血管损伤后血液流失以及随后组织修复后血凝块的解离。

如本文所用，“血液凝块”或者“血液凝固”是指不溶的纤维蛋白血凝块的形成，或者凝血级联中血液凝血因子互相影响的过程，最后导致不溶的纤维蛋白血凝块形成。

如本文所用，“蛋白酶”是催化共价肽键水解的酶。这些名称包括酶原形式及其活化的单链、双链和多链形式。为清晰起见，提及蛋白酶时是指所有形式。蛋白酶包括例如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，依赖于其活性位点的催化活性以及裂解靶底物的肽键的机制。

如本文所用，丝氨酸蛋白酶或者丝氨酸内肽酶是指一类肽酶，通过酶的活性位点中丝氨酸残基的存在而鉴定。丝氨酸蛋白酶参与机体的许多功能，包括血液凝固和炎症，以及在原核生物和真核生物中发挥消化酶的功能。由丝氨酸蛋白酶裂解的机制基于丝氨酸对于靶向的肽键的亲核攻击。与天冬氨酸或者金属相关的半胱氨酸、苏氨酸或者水分子也可以发挥该作用。丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的排列的侧链形成大多数丝氨酸蛋白酶共有的催化三联体。丝氨酸蛋白酶的活性位点是裂口形状，在此结合肽底物。

如本文所用，因子VII(FVII，F7；也称作因子7，凝血因子VII，血清因子VII，血清凝血酶原转变加速因子，SPCA，转变加速因子前体和eptacogalpha)是指是凝血级联一部分的丝氨酸蛋白酶。FVII包含一个Gla结构域，两个EGF结构域(EGF-1和EGF-2)以及一个丝氨酸蛋白酶结构域(或者肽酶S1结构域)，其在丝氨酸蛋白酶的肽酶S1家族的所有成员中是高度保守的，例如糜蛋白酶。举例的具有信号肽和前肽的前体FVII的序列如SEQ ID NO:1示出。举例的成熟FVII多肽如SEQ ID NO:3示出。FVII作为单链酶原、酶原样双链多肽和完全活化的双链形式出现。在构象改变时发生的从酶原样形式的完全活化在结合其辅因子组织因子时发生。另外，也可以导入突变以使得在没有组织因子的肽键下发生构象改变。因此，提及FVII时包含其单链和双链形式，包括酶原样和完全活化的双链形式。

提及FVII多肽时也包括具有活性的单链或者双链形式的、截短形式的其前体多肽和成熟FVII多肽，以及包括等位基因变体和种变体、由剪接变体编码的变体及其它变体，包括与SEQ ID NO:1所示前体多肽或其成熟形式具有至少40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或者更高序列相同性的多肽。本发明包括修饰的FVII多肽，例如SEQ ID NO:18-43、125-150或者206-150所示那些多肽及其变体。本发明还包括保留FVII的至少一种活性如TF结合、因子X结合、磷脂结合和/或凝血活性的那些多肽。通过保留活性，所述活性与野生型FVII的活性相比可以被改变，例如降低或者增加，只要保留的活性水平足以产生可检测的作用即可。FVII多肽包括但不限于其组织特异性同种型和等位基因变体，通过核酸翻译制备的合成分子，通过化学合成产生的蛋白质，例如包括较短多肽的连接、通过重组方法的合成体，分离自人和非人组织和细胞的蛋白质，嵌合的FVII多肽及其修饰的形式。FVII多肽还包括足够长的或者包含适当区域以保留全长成熟多肽的至少一种活性(如果需要基于活化)的FVII的片段或者一部分。FVII多肽还包括含有化学或者翻译后修饰的那些多肽，以及不含有化学或者翻译后修饰的那些多肽。这种修饰包括但不限于PEG化、白蛋白化(albumination)、糖基化、法尼基化(farnysylation)、羧化、羟化、磷酸化及本领域已知的其它多肽修饰。

举例的FVII多肽是来源于哺乳动物包括人的那些多肽。举例的人源FVII的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、2和3所示。举例的这种人FVII多肽的变体包括SEQ ID NO:44-100所示任何前体多肽。FVII多肽还包括任何非人源包括但不限于鼠、狗、猫、兔、鸟类、牛、羊、猪、马、鱼类、蛙科动物及其它灵长类动物因子VII多肽。举例的非人源FVII多肽包括例如牛(Bos taurus,SEQ ID NO:4)、小鼠(Mus musculus,SEQ ID NO:5)、小黑猩猩(Pan paniscus,SEQ ID NO:6)、黑猩猩(Pan troglodytes,SEQ ID NO:7)、兔(Oryctolagus cuniculus,SEQ ID NO:8)、大鼠(Rattus norvegicus,SEQ ID NO:9)、rhesus macaque(Macaca mulatta,SEQ ID NO:10)、猪(Sus scrofa,SEQ IDNO:11)、狗(Canis familiaris,SEQ ID NO:12)、斑马(Brachydanio rerio,SEQ IDNO:13)、日本河豚(Fugu rubripes,SEQ ID NO:14)、鸡(Gallus gallus,SEQ IDNO:15)、猩猩(Pongo pygmaeus,SEQ ID NO:16)和大猩猩(Gorilla gorilla,SEQ ID NO:17)。

本领域技术人员意识到提及的成熟因子VII多肽(SEQ ID NO:3)的位置与SEQ ID NO:1所示同种型a前体FVII多肽(其是含有信号肽和前肽序列的同种型a因子VII多肽)对比时有60个氨基酸残基不同。因此，SEQ ID NO:3的第1个氨基酸残基“对应于”SEQ ID NO:1的第61个氨基酸残基。本领域技术人员还意识到提及的成熟因子VII多肽(SEQ ID NO:3)的位置与SEQ ID NO:2所示前体FVII多肽(其是含有信号肽和前肽序列的同种型b因子VII多肽)对比时有38个氨基酸残基不同。因此，SEQ ID NO:3的第1个氨基酸残基“对应于”SEQ ID NO:2的第39个氨基酸残基。

如本文所用，对应残基是指位于对比的基因座的残基。通过本领域技术人员熟知的任何方法排列对比相关的或者变体多肽。这种方法典型最大化匹配，且包括如使用人工排列对比及通过使用众多可利用的排列对比程序(例如BLASTP)以及本领域技术人员已知的其它方法。通过对比多肽序列，技术人员使用保守和相同的氨基酸残基作为指导可以鉴别对应的残基。例如，通过对比因子VII多肽的序列，技术人员使用保守和相同的氨基酸残基作为指导可以鉴别对应的残基。例如，SEQ ID NO:3(成熟因子VII)的第1个氨基酸位置(A1)中的丙氨酸对应于SEQ ID NO:1的第61个氨基酸位置(A61)中的丙氨酸，以及对应于SEQ ID NO:2的第39个氨基酸位置(A39)中的丙氨酸。在其它情况中，可以鉴别对应区域。例如，Gla结构域对应于SEQ ID NO:3的A1-F45氨基酸位置，对应于SEQ ID NO:1的A61-S105氨基酸位置，以及对应于SEQ ID NO:2的A39-S83位置。本领域技术人员还应用保守的氨基酸残基作为指导以发现人与非人序列之间和之中的对应氨基酸残基。例如，SEQ ID NO:3(人)的氨基酸残基S43和E163对应于SEQ IDNO:4(牛)的S83和E203残基。对应位置也可以基于结构对比，例如通过使用计算机模拟S蛋白结构进行。在其它情况中，可以鉴别对应区域。

如本文所用，“前(pro)区”、“前肽”或者“前序列”是指被裂解产生成熟蛋白质的区域或节段。这可以包括发挥抑制蛋白酶解活性功能的节段，其通过掩蔽催化机制并因此阻止催化中间物形成而起作用(即通过位阻底物结合位点)。前区位于成熟的生物活性的多肽的氨基末端的氨基酸序列，且可以小如几个氨基酸或者可以是多结构域结构。

如本文所用，“成熟因子VII”是指缺少信号序列和前肽序列的FVII多肽。典型地，信号序列靶向蛋白质通过内质网(ER)-高尔基体途径分泌，并且在翻译期间插入ER之后被裂解。前肽序列典型在蛋白质的翻译后修饰中起作用，并且在蛋白质从细胞中分泌之前被裂解。因此，成熟FVII多肽典型是分泌蛋白。在一个实例中，成熟人FVII多肽如SEQ ID NO:3所示。SEQ ID NO:3所示氨基酸序列与SEQ ID NO:1和2所示前体多肽的氨基酸序列不同，SEQ ID NO:3没有对应于SEQ ID NO:1和2的第1-20位氨基酸残基的信号序列，且也没有对应于SEQ ID NO:1的第21-60位氨基酸残基和SEQ ID NO:2的第21-38位氨基酸残基的的前肽序列。提及的成熟FVII多肽包含单链酶原形式和双链形式。

如本文所用，提及的“野生型”或者“天然”FVII是指由天然或者天然发生的FVII基因编码的FVII多肽，包括等位基因变体，其天然存在于生物体中，包括人和其它动物中。提及野生型因子VII而不提及物种是指包含任何物种的野生型因子VII。包括的野生型FVII多肽是编码的前体多肽、其片段，以及其加工形式，如没有信号肽的成熟形式以及任何翻译前或者翻译后加工或修饰的形式。还包括的天然FVII多肽是翻译后修饰的那些多肽，包括但不限于通过糖基化、羧化和羟化进行的修饰。天然FVII多肽还包括单链和双链形式。例如，人表达天然FVII。举例的野生型人FVII的氨基酸序列如SEQ ID NO:1,2,3所示，及SEQ ID NO:44-100所示等位基因变体及其成熟形式。其它动物产生天然FVII，包括但不限于牛(Bos Taurus,SEQ ID NO:4)、小鼠(Mus musculus,SEQ ID NO:5)、小黑猩猩(Pan paniscus,SEQ ID NO:6)、黑猩猩(Pan troglodytes,SEQ ID NO:7)、兔(Oryctolaguscuniculus,SEQ ID NO:8)、大鼠(Rattus norvegicus,SEQ ID NO:9)、猕猴(Macaca mulatta,SEQ ID NO:10)、猪(Sus scrofa,SEQ ID NO:11)、狗(Canisfamiliaris,SEQ ID NO:12)、斑马(Brachydanio rerio,SEQ ID NO:13)、日本河豚(Fugu rubripes,SEQ ID NO:14)、鸡(Gallus gallus,SEQ ID NO:15)、猩猩(Pongo pygmaeus,SEQ ID NO:16)以及大猩猩(Gorilla gorilla,SEQ IDNO:17)。

如本文所用，种变体是指不同物种的多肽变体，包括不同哺乳动物种，如小鼠和人。

如本文所用，等位基因变体是指相同物种成员中蛋白质变异。

如本文所用，剪接变体是指通过对基因组DNA的原始转录物进行不同加工产生的变体，导致一种类型以上的mRNA。

如本文所用，酶原是指通过蛋白酶解包括成熟裂解如活化裂解激活的蛋白酶，和/或与其它蛋白质和/或辅因子形成的复合物。酶原是蛋白酶的无活性前体。这种前体通常比活性形式长，尽管非必须较长。对于丝氨酸蛋白酶，酶原通过特异性裂解被转变为活性酶，包括催化和自催化裂解，或者通过结合活化辅因子产生活性酶。例如，酶原通常以单链形式存在。酶原通常是无活性的，且可以通过在一或多个蛋白酶解位点催化或者自催化裂解产生多链如双链多肽而被转变为成熟的活性多肽。因此，酶原是无活性蛋白质，通过激活物的作用而被转变为蛋白酶。可以通过自身激活实现裂解。许多凝血蛋白是酶原：它们是无活性的，但是在血管损伤后凝血系统启动时被裂解和活化。FVII多肽以酶原形式存在于血浆中，直至被蛋白酶例如活化的因子IX(FIXa)、活化的因子X(FXa)、活化的因子XII(FXIIa)、凝血酶裂解，或者自身激活产生酶原样双链形式，其完全活性需要进一步的构象变化。

如本文所用，“酶原样”蛋白质或多肽是指已经通过蛋白酶解激活，但是仍呈现出酶原相关性质的蛋白质，例如呈现较低活性或者无活性，或者其构象类似蛋白质的酶原形式的构象。例如，当其不结合组织因子时，FVII的双链活性形式是酶原样蛋白质，其保留与未裂解的FVII酶原相似的构象，并因此呈现出极低活性。在与组织因子结合时，FVII的双链活性形式经历构象变化，并获得其完全活性作为凝血因子。

如本文所用，活化序列是指酶原中的氨基酸序列，其是活化裂解或者成熟裂解以形成活性蛋白酶所需的位点。活化序列的裂解可以被自催化或者通过活化配体(activating partner)催化。

如本文所用，活化裂解是一种成熟裂解，其诱导为完全酶活性所需的构象改变。这是一个经典的活化途径，例如对于丝氨酸蛋白酶，其中裂解产生与蛋白酶的保守区域如糜蛋白酶中Asp194相互作用的新的N-末端，诱导活性所需的构象改变。活化可以导致多链形式的蛋白酶产生。在一些情况中，单链形式的蛋白酶可呈现出蛋白酶解活性。

如本文所用，“活化的因子VII”或者“FVIIa”是指任何双链形式的FVII多肽。双链形式典型得自蛋白酶解，但是也可以是合成产生的。因此，活化的因子VII包括低凝血活性的酶原样双链形式，基于与组织因子结合发生的完全活化形式(大约1000倍的活性)，以及存在于完全活化的双链形式中或者经历构象改变成为完全活化形式的突变形式。例如，单链形式的FVII多肽(见例如SEQ ID NO:3)在成熟FVII多肽的R152与I153氨基酸残基之间被蛋白酶解。裂解产物-FVII重链和FVII轻链-被二硫键连接在一起(在SEQ ID NO:3所示FVII的135C与162C氨基酸残基之间)，形成双链的活化FVII酶。蛋白酶解可以例如通过活化的因子IX(FIXa)、活化的因子X(FXa)、活化的因子XII(FXIIa)、凝血酶或者通过自身激活进行。

如本文所用，FVII多肽的“性质”是指物理或者结构性质，这种三维结构，pI，半衰期，构象及其它这种物理特性。

如本文所用，FVII多肽的“活性”是指因子VII多肽呈现的任何活性。这种活性可以在体外和/或在体内检测，包括但不限于凝血和凝血剂活性(coagulation or coagulant activity)，促凝血活性，蛋白酶解或者催化活性，如使得因子X(FX)活化或者因子IX(FIX)活化；抗原性(结合或者竞争多肽结合抗FVII-抗体的能力)；结合组织因子、因子X或因子IX的能力；和/或结合磷脂的能力。活性可以通过使用认可的测定法在体外或者在体内评估，例如通过在体外或体内测量凝血情况进行评估。这种测定的结果表明多肽呈现出与所述多肽在体内的活性相关的活性，其中体内活性可以被称作生物活性。确定修饰形式的FVII的功能性或者活性的测定为本领域技术人员所已知。举例的评估FVII多肽活性的测定法包括促凝血酶原激酶原时间(PT)测定或者激活部分凝血活酶时间(aPTT)测定，用以评估凝血活性，或者使用合成底物进行的生色测定，如实施例4、5和11所述，用以评估催化或者蛋白酶解活性。

如本文所用，“呈现至少一种活性”或者“保留至少一种活性”是指与相同形式的未修饰的FVII多肽在相同条件下对比由修饰的FVII多肽呈现的活性。例如，双链形式的修饰的FVII多肽与双链形式的未修饰的FVII多肽在相同实验条件下对比，其中这两个多肽的唯一差别是所研究的修饰。在另一实例中，单链形式的修饰的FVII多肽与单链形式的未修饰的FVII多肽在相同实验条件下对比，其中这两个多肽之间唯一差别是所研究的修饰。典型地，保留或者呈现相同形式的未修饰的FVII多肽的至少一种活性的修饰的FVII多肽保留足量的活性，由此当在体内给予时，该修饰的FVII多肽是治疗有效的促凝剂。通常地，对于保持作为促凝剂的治疗效力的修饰的FVII多肽而言，被保留的活性的量是呈现促凝剂治疗效力的相同形式的未修饰FVII多肽活性的大约0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或者更高的活性。如果需要，保持促凝剂治疗效力所需的活性的量可以根据经验确定。典型地，保持0.5%-20%、0.5%-10%、0.5%-5%的活性足以保留在体内作为促凝剂的治疗效力。

应理解由修饰的FVII多肽呈现或者保留的活性可以是任何活性，包括但不限于凝血或者凝血剂活性，促凝血活性，蛋白酶解或者催化活性，如使得因子X(FX)活化或者因子IX(FIX)活化；抗原性(结合或者竞争多肽结合抗FVII-抗体的能力)；结合组织因子、因子X或因子IX的能力；和/或结合磷脂的能力。在一些情况中，修饰的FVII多肽可以保留与未修饰的FVII多肽相比增加的活性。在一些情况中，修饰的FVII多肽可保留与未修饰的FVII多肽相比降低的活性。修饰的FVII多肽的活性可以是未修饰多肽的任何百分比水平，其中这两个多肽均是相同形式，包括但不限于与不含有修饰的多肽相比1%的活性，2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或更多的活性。例如，修饰的FVII多肽可以呈现出与相同形式的未修饰的FVII多肽相比增加或者降低的活性。例如，其可以保留未修饰的FVII多肽的至少大约或者1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或者至少99%的活性。在其它实施方案中，活性的改变是未修饰FVII活性的至少大约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍或者更多倍。保留的特定水平与所述多肽的指定用途相关，可以根据经验确定。可以例如使用体外或者体内测定法测量活性，例如在此描述或者下文实施例中描述的那些方法。

如本文所用，“凝血活性”或者“凝血剂活性”或者“促凝剂活性”是指多肽导致凝血的能力。评估凝血剂活性的测定为本领域技术人员已知，包括促凝血酶原激酶原时间(PT)测定或者激活部分凝血活酶时间(aPTT)测定。

如本文所用，FVII的“催化活性”或者“蛋白酶解活性”是指FVII蛋白催化底物蛋白酶解的能力，这些术语可互换使用。评估这种活性的测定法为本领域已知。例如，FVII的蛋白酶解活性可以通过使用生色底物如Spectrozyme FVIIa(CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA)测量，其中底物的裂解通过吸光度监测，底物水解的速度通过线性回归确定。

如本文所用，FVII多肽的“内在活性”是指在不存在组织因子的条件下，FVII蛋白的催化、蛋白酶解和/或凝血剂活性。

如本文所用，结构域(典型为3或多个、通常为5或7个或更多个氨基酸的序列)是指分子如蛋白质或者编码核酸的一部分，其与该分子的其它部分在结构和/或功能上不同且可以被鉴别。例如，结构域包括多肽链的那些部分，其可以形成蛋白质内由一或多个结构基序组成的独立折叠的结构，和/或通过功能活性如蛋白酶解活性而被识别。蛋白质可具有一或一个以上的结构域。例如，结构域可以通过与相关家族成员的序列同源例如与定义蛋白酶结构域或者gla结构域的基序同源而被鉴别、定义或者区别。在另一实例中，结构域可以通过其功能区别，如通过蛋白酶解活性或者与生物分子相互作用的能力如DNA结合、配体结合和二聚体化。结构域独立地可以呈现生物功能或活性，由此所述结构域独立地或者与另一分子融合可以进行活性，例如蛋白酶解活性或者配体结合。结构域可以是线性氨基酸序列或者非线性氨基酸序列。许多多肽含有多个结构域。本领域技术人员已知这种结构域并可以鉴别。为举例说明，本发明提供了定义，但是应理解本领域技术人员可以通过名称识别特定结构域。如果需要，可以应用适当的软件鉴别结构域。

如本文所用，蛋白酶结构域是蛋白酶的催化活性部分。提及的蛋白酶的蛋白酶结构域包括单链、双链和多链形式的任何这些蛋白质。蛋白质的蛋白酶结构域含有为其蛋白酶解活性所需的所有必备的性质，例如催化中心。对于FVII，蛋白酶结构域与糜蛋白酶/胰蛋白酶家族蛋白酶结构域呈现同源和结构特征，包括催化三联体。例如，在SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽中，蛋白酶结构域对应于第153-392位氨基酸。

如本文所用，γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域是指蛋白质例如维生素K依赖性蛋白质的一部分，其含有谷氨酸残基的翻译后修饰，通常但不是所有谷氨酸残基被维生素K依赖性羧化形成Gla。Gla结构域与钙离子的高亲和性结合以及与带负电磷脂的结合相关。典型地，Gla结构域在成熟形式维生素K依赖性蛋白质的N末端开始，以保守的芳族残基终止。在成熟FVII多肽中，Gla结构域对应举例的SEQ ID NO:3所示多肽的第1-45位氨基酸。Gla结构域为本领域熟知，其位点(locus)可以在特定多肽中鉴别。不同的维生素K依赖性蛋白质的Gla结构域呈现序列、结构和功能同源，包括N-末端疏水性残基聚集为疏水性板块(patch)，介导与细胞表面膜上带负电磷脂的相互作用。举例的其它含有Gla的多肽包括但不限于FIX、FX、凝血酶原、C蛋白、S蛋白、骨钙素、基质Gla蛋白、生长停滞特异性蛋白6(Gas6)和Z蛋白。这些及其它举例的蛋白质的Gla结构域在SEQ ID NO:110-121中示出。

如本文所用，“天然的”或者“内源的”Gla结构域是指与所有或者一部分具有Gla结构域的多肽相关的天然发生的Gla结构域。对于本发明，天然Gla结构域是相对于FVII多肽。例如，SEQ ID NO:119所示FVII的天然Gla结构域对应SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的第1-45位氨基酸。

如本文所用，异源Gla结构域是指来自相同或者不同物种的多肽的Gla结构域，其不是FVII Gla结构域。举例的异源Gla结构域是来自含有Gla多肽的Gla结构域，所述多肽包括但不限于FIX、FX、凝血酶原、C蛋白、S蛋白、骨钙素、基质Gla蛋白、生长停滞特异性蛋白6(Gas6)和Z蛋白。这些及其它举例的蛋白质的Gla结构域在SEQ ID NO:110-118、120和121中示出。

如本文所用，Gla结构域的邻近部分是指至少两或多个相邻的氨基酸，典型为2、3、4、5、6、8、10、15、20、30、40或者更多个直至组成Gla结构域的所有氨基酸。

如本文所用，“导致磷脂结合的Gla结构域的足够部分”包括该结构域的至少一个氨基酸，典型包括2、3、4、5、6、8、10、15或者更多个氨基酸，但是少于组成该结构域的所有氨基酸，只要该多肽含有呈现磷脂结合的这部分即可。

如本文所用，Gla结构域“置换”或者“Gla结构域交换”是指使用重组、合成或者其它方法用另一蛋白质的Gla结构域置换蛋白质的内源Gla结构域。在“Gla结构域交换”中，“Gla结构域”是足以保留磷脂结合活性的选自Gla结构域和相邻区域的任何氨基酸。典型地，Gla结构域交换包含用另一蛋白质的40-50个氨基酸置换内源蛋白质的40-50个氨基酸，但是可以包含较少或者更多的氨基酸。

如本文所用，表皮生长因子(EGF)结构域(EGF-1或EGF-2)是指与表皮生长因子(EGF)序列的特异的30-40个氨基酸部分呈现序列同源的蛋白质的一部分。EGF结构域包括六个半胱氨酸残基，已经示出其参与二硫键(在EGF中)。EGF结构域的主要结构是双链β-折叠，随后是环以及C末端短双链折叠。FVII含有两个EGF结构域：EGF-1和EGF-2。这些结构域分别对应SEQID NO:3所示成熟FVII多肽的第46-82位和第87-128位氨基酸。

如本文所用，“未修饰的多肽”或者“未修饰的FVII”是指针对本发明提供的修饰选择的起始多肽。所述起始多肽可以是天然发生的野生型多肽。另外，所述多肽可以被改变或者突变，由此其与天然野生型同种型不同，但是在此称作随后修饰的多肽的起始未修饰多肽。因此，可以选择已经被修饰的其特定活性或者性质与未修饰的参考蛋白质的活性相比增加或降低的本领域已知的现有蛋白质，并用作起始未修饰的多肽。例如，已经通过一或多个单一氨基酸改变而从其天然形式被修饰且其希望的性质增加或降低(例如氨基酸残基的变化以改变糖基化)的蛋白质可以是靶蛋白，在此称作未修饰的，以进一步修饰相同或者不同性质。举例的本领域已知的修饰的FVII多肽包括例如如下专利中描述的任何FVII多肽：美国专利No.5580560、6017882、6693075、6762286和6806063，美国专利出版物No.20030100506和20040220106以及国际专利出版物No.WO1988010295、WO200183725、WO2003093465、WO200338162、WO2004083361、WO2004108763、WO2004029090、WO2004029091、WO2004111242和WO2005123916。

如本文所用，“修饰的因子VII多肽”和“修饰的因子VII”是指与未修饰的因子VII多肽相比具有一或多个氨基酸差异的FVII多肽。所述一或多个氨基酸差异可以是氨基酸突变如一或多个氨基酸置换(取代)、插入或缺失，或者可以是插入或缺失全部结构域，以及任何组合修饰。典型地，修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比在一级序列中具有一或多个修饰。例如，本发明提供的修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50或者更多个氨基酸不同。只要所得多肽呈现天然FVII多肽相关的至少一种FVII活性，就包含这样的任何修饰，所述活性例如是催化活性、蛋白酶解活性、结合TF的能力或者结合活化的血小板的能力。

如本文所用，“凝血抑制剂”是指抑制或者阻止凝血或者血凝块形成的蛋白质或分子。凝血的抑制或者阻止可以在体内或者体外观测，且可以通过使用本领域已知的任何方法测定，所述方法包括但不限于促凝血酶原激酶原时间(PT)测定或者激活部分凝血活酶时间(aPTT)测定。

如本文所用，组织因子途径抑制剂(TFPI，也称作TFPI-1)是Kunitz-型抑制剂，其参与四元TF/FVIIa/TFPI/Fxa抑制复合物的形成，其中FVIIa的活性被抑制。TFPI在可变剪接之后被表达为两种不同的前体形式：TFPIα(SEQ ID NO:101)和TFPIβ(SEQ ID NO:103)前体，其在分泌期间被裂解分别产生276个氨基酸(SEQ ID NO:102)和223个氨基酸(SEQ ID NO:104)的成熟蛋白。TFPI含有3个Kunitz结构域，其中Kunitz-1结构域与FVIIa的结合和抑制相关。

如本文所用，TFPI-2(也称作胎盘蛋白5(PP5)和基质相关丝氨酸蛋白酶抑制剂(MSPI))是指TFPI的同系物。所述具有213个氨基酸的成熟TFPI-2蛋白(SEQ ID NO:105)含有3个Kunitz-型结构域，与TFPI-1Kunitz-型结构域1、2和3分别呈现43%、35%和53%的一级序列相同性。TFPI-2在调节胞外基质消化和重塑中起作用，不认为其是凝血途径中的重要因子。

如本文所用，抗凝血酶III(AT-III)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白)。AT-III作为含有464个氨基酸残基(SEQ ID NO:122)的前体蛋白合成，在分泌期间被裂解释放具有432个氨基酸的成熟抗凝血酶(SEQ ID NO:123)。

如本文所用，辅因子是指结合其它特异的蛋白质或分子以形成活性复合物的蛋白质或分子。在一些实例中，与辅因子结合是优化蛋白酶解活性必需的。例如，组织因子(TF)是FVIIa的辅因子。FVIIa与TF的结合诱导构象改变，导致FVIIa对于其底物FX和FIX的蛋白酶解活性增加。

如本文所用，组织因子(TF)是指具有263个氨基酸的跨膜糖蛋白(SEQID NO:124)，其发挥FVIIa的辅因子功能。其由平滑肌细胞和成纤维细胞组成型表达，且在当组织损伤后这些细胞与血流接触时通过结合FVII和FVIIa帮助起始凝血过程。

如本文所用，活化的血小板是指已经通过结合如胶原、血栓烷A2、ADP和凝血酶等分子经历最终促进凝血的形态学、表型和功能的各种改变而触发的血小板。例如，活化的血小板在形态上改变为具有突出指的更无定形的形状。活化的血小板也经历细胞膜的“翻转(flip)”，由此在细胞膜内层(leaflet)正常存在的磷脂酰丝氨酸及其它带负电的磷脂被转位至外层朝向血浆表面。活化的血小板的这些膜提供了表面，在其上实现许多凝血级联反应。活化的血小板也分泌含有这种促凝因子如vWF、FV、凝血酶、ADP和血栓烷A2的囊泡，并且彼此粘附形成血小板栓子，其由纤维蛋白稳定成为血凝块。

如本文所用，活化的血小板的增加的结合和/或亲和性是指多肽或者蛋白质例如FVII多肽结合活化的血小板表面的能力与参考多肽或者蛋白质相比增强。例如，修饰的FVII多肽结合活化的血小板的能力可以高于未修饰的FVII多肽结合活化的血小板的能力。多肽与活化的血小板的结合和/或亲和性与未修饰的多肽的结合和/或亲和性相比可增加至少大约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更高。确定多肽与活化的血小板的结合和/或亲和性的测定法为本领域已知。FVII多肽与活化的血小板的结合通过FVII多肽的Gla结构域中氨基酸与活化的血小板上带负电磷脂如磷脂酰丝氨酸的相互作用而介导。正如此，测定多肽如FVII多肽与活化的血小板的结合的测定法使用含有磷脂如磷脂酰丝氨酸的膜和囊泡。例如，多肽结合活化的血小板的能力受该多肽结合磷脂囊泡的能力的影响，这可以通过光散射技术测量。

如本文所用，与磷脂的结合和/或亲和性增加是指多肽或蛋白质结合磷脂的能力与参考多肽或蛋白质的对应能力相比增加。磷脂可包括任何磷脂，但是特别包括磷脂酰丝氨酸。多肽与磷脂的结合和/或亲和性与未修饰的多肽的对应结合和/或亲和性相比可增加至少大约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更多。确定多肽与磷脂的亲和性和/或结合的测定法为本领域已知。例如，FVII多肽与磷脂囊泡的结合可以通过在90°的入射光的相对光散射而确定。测量单独磷脂囊泡以及磷脂囊泡与FVII的光散射强度以确定解离常数。也可以使用如在BIAcore生物传感器设备上进行表面等离子共振以测量FVII多肽与磷脂膜的亲和性。

如本文所用，增加的对抑制剂的抗性或者“增加的对TFPI的抗性”或者“增加的对AT-III的抗性”是指多肽与参考多肽如未修饰的FVII多肽相比对于抑制剂如TFPI或AT-III的抑制作用的任何量的敏感性降低。例如，TFPI与FXa复合，其结合TF/FVIIa复合物。由此其抑制FVIIa的活性。因此，降低或者阻止TFPI与TF/FVIIa复合物结合且因此降低或者阻止TFPI-介导的FVIIa活性抑制的修饰的FVII多肽，表现出TFPI抗性增加。对于抑制剂如TFPI的抗性增加可以通过评估修饰的FVII多肽与抑制剂的结合而测定。对于抑制剂如TFPI的抗性增加也可以通过测量在存在TFPI条件下FVII多肽的内在活性或者促凝剂活性而测定。确定多肽与抑制剂如TFPI或AT-III结合的测定法为本领域已知。对于非共价抑制剂如TFPI，可以测量k_i。对于共价抑制剂如AT-III，可以测量抑制作用的二级速率常数(second order rate constant)。另外，例如在BIAcore生物传感器设备上进行的表面等离子共振也可用于测量FVII多肽与TFPI、AT-III或者其它抑制剂的结合。然而，对于共价抑制剂如AT-III，使用BIAcore仅可测量on-rate。确定例如TFPI对于FVII促凝剂活性或者内在活性的抑制作用的测定法也为本领域已知。例如，可以测量修饰的FVII多肽在存在或不存在TFPI的条件下裂解其底物FX的能力，确定TFPI抑制该反应的程度。可将其与未修饰的FVII多肽在存在或不存在TFPI的条件下裂解其底物FX的能力对比。呈现抑制剂抗性增加的修饰的多肽与未修饰的多肽相比对于抑制剂作用的抗性例如增加1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%或更多。

如本文所用，“生物活性”是指化合物的体内活性或者在体内给予化合物、组合物或者其它混合物时产生的生理反应。因此，生物学活性包含这种化合物、组合物和混合物的治疗效应和药物学活性。生物学活性可以在设计为检测或者使用这种活性的体外系统中观测到。因此，对于本发明，FVII多肽的生物学活性包含促凝剂活性。

如本文所用，术语“评估”及对应表达法是指包括定量和定性确定，获得多肽活性的绝对值以及获得表示活性水平的指数、比率、百分比、目测值或者其它值。可以进行直接或者间接评估。例如，检测多肽对底物的裂解可以通过直接测量产物进行，或者可以通过确定裂解的底物的所得活性而间接测量。

如本文所用，“糜蛋白酶编号”是指SEQ ID NO:107所示成熟糜蛋白酶多肽的氨基酸编号。可以将另一蛋白酶的蛋白酶结构域例如因子VII的蛋白酶结构域与糜蛋白酶进行序列对比。在这种情况中，对应糜蛋白酶的氨基酸的因子VII的氨基酸以糜蛋白酶氨基酸的编号给出。本领域技术人员使用人工序列对比或者通过使用可获得的许多序列对比程序(例如BLASTP)通过这种序列对比确定对应位置。对应位置也可以基于结构对比，例如通过使用计算机模拟的蛋白质结构对比进行。对应于揭示序列中氨基酸的多肽的氨基酸是指在所述多肽与揭示序列的对比时使用标准序列对比算法如GAP算法最大化相同性或者同源性(其中对比保守的氨基酸)而鉴别的氨基酸。表1提供了SEQ ID NO:3所示FVII多肽的第153-406位氨基酸的对应糜蛋白酶编号。SEQ ID NO:3所示序列的氨基酸位置是正常字体，在那些位置的氨基酸残基以黑体字示出，对应糜蛋白酶编号以斜体字示出。例如，在成熟因子VII(SEQ ID NO:3)与成熟糜蛋白酶(SEQ ID NO:107)进行序列对比时，在因子VII中第153氨基酸位置的异亮氨酸(I)的糜蛋白酶编号是I16。据此对随后的氨基酸编号。在一个实例中，成熟因子VII(SEQ ID NO:3)的第210氨基酸位置的谷氨酸(E)基于糜蛋白酶编号对应E70氨基酸位置。在残基在蛋白酶中存在而在糜蛋白酶中不存在的情况中，氨基酸残基以字母符号示出。例如，基于糜蛋白酶编号，糜蛋白酶中是具有60个氨基酸的环的一部分的残基但是插入在因子VII序列中与糜蛋白酶对比，被称作K60a、I60b、K60c或者N60d。这些残基分别对应成熟因子VII序列(SEQ IDNO:3)编号的K197、I198、K199和N200。

表1：因子VII的糜蛋白酶编号

如本文所用，核酸包括DNA、RNA及其类似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可以使单链或者双链的。当提及探针或引物时，包含单链分子，所述探针或引物任选例如用可检测的标记物如荧光或者放射性标记物标记。这种分子的长度典型是其靶位在统计学上是唯一的或者低拷贝数的(典型少于5个、通常少于3个)以探查或者引发(priming)文库。通常地，探针或者引物含有与感兴趣的基因互补或者相同的至少14、16或者30个连续核酸的序列。探针和引物的长度可以是10、20、30、50、100或者更多个核酸。

如本文所用，肽是指长度为2-40个氨基酸的多肽。

如本文所用，在本发明提供的各个氨基酸序列中存在的氨基酸根据其已知的三字母或者单字母缩写识别(表1)。在各个核酸片段中存在的核苷酸以本领域常规使用的的标准单字母名称命名。

如本文所用，“氨基酸”是一种有机化合物，其含有氨基和羧酸基团。多肽包含2或多个氨基酸。为本文目的，氨基酸包括20个天然发生的氨基酸、非天然氨基酸和氨基酸类似物(即其中α-碳具有侧链的氨基酸)。

与J.Biol.Chem.,243:3552-3559(1969)以及采用的37C.F.R..§§1.821-1.822中描述的标准多肽命名法一致，氨基酸残基的缩写在表1中示出：

表2-对应表

应理解本文由化学式代表的所有氨基酸残基序列从左至右方向是常规的氨基末端至羧基末端方向。另外，短语“氨基酸残基”广泛定义为包括对应表(表2)列出的氨基酸以及修饰的和不寻常的氨基酸，如37C.F.R.§§1.821-1.822所指的那些，其引入本文做参考。另外，应注意在氨基酸残基序列开头或结尾的短横线“－”是指与其它一或多个氨基酸残基的序列、氨基末端基团如NH₂或与羧基末端基团如COOH的肽键。

如本文所用，“疏水性氨基酸”包括使用Eisenberg hydrophobicityconsensus scale确定是疏水性的任一种氨基酸。举例的突然发生的疏水性氨基酸例如是异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和酪氨酸(Eisenberg et al.,(1982)Faraday Symp.Chem.Soc.17:109-120)。非天然发生的疏水性氨基酸也包括在内。

如本文所用，“酸性氨基酸”包括天然发生的氨基酸天冬氨酸和谷氨酸残基。非天然发生的酸性氨基酸也包括在内。

如本文所用，“天然存在的氨基酸”是指多肽中存在的20个L-氨基酸。

如本文所用，“非天然氨基酸”是指不是表2列出的天然发生的氨基酸之一的含有氨基基团和羧基基团的有机化合物。非天然发生的氨基酸因此包括例如除20个天然发生的氨基酸之外的氨基酸或氨基酸类似物，并包括但不限于氨基酸的D－立体异构体(isostereomer)。举例的非天然氨基酸是本领域技术人员已知的，且可以包括在修饰的因子VII多肽中。

如本文所用，DNA构建体是单链或者双链的线性或者环形DNA分子，其含有以在天然状态未发现的方式组合及并列的DNA节段。DNA构建体以人工操纵的结果存在，包括操纵分子的克隆及其它拷贝。

如本文所用，DNA节段是具有指定特性的较大的DNA分子的一部分。例如，编码特定多肽的DNA节段是较长DNA分子的一部分，如质粒或者质粒片段，当从5’至3’方向读取时编码特定多肽的氨基酸序列。

如本文所用，术语多核苷酸是指从5’至3’末端读取的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸碱基的单链或者双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，可以分离自天然来源、在体内合成、或者从天然与合成分子的组合中制备。多核苷酸分子的长度在本文以核苷酸(缩写为nt)或者碱基对(缩写为bp)形式给出。当该术语指代双链分子时，其用于表示全长，且应理解与术语碱基对同义。本领域技术人员意识到双链多核苷酸的两个链的长度可以略有不同，其末端可以错列，因此双链多核苷酸内的所有核苷酸不是都可以成对。这种不成对的末端长度通常不超过20个核苷酸。

如本文所用，“一级序列”是指多肽中氨基酸残基序列。

如本文所用，两个蛋白质或者核酸之间“相似性”是指蛋白质的氨基酸序列或者核酸的核苷酸序列之间的相关性。相似性可以基于残基序列及其中包含的残基的相同性和/或同源性程度。评估蛋白质或者核酸之间相似性程度的方法为本领域技术人员已知。例如，在评估序列相似性的一种方法中，以一定方式排列两个氨基酸或者核苷酸序列，以在序列之间产生最大水平相同性。“相同性”是指氨基酸或者核苷酸序列的不变程度。氨基酸序列以及某些范围的核苷酸序列的对比也可以考虑到氨基酸(或者核苷酸)中的保守差异和/或频繁取代。保守差异是保持包含的残基的物理-化学性质的那些差异。序列对比可以是整体对比(全长序列对比，包括所有残基)或者局部对比(一部分序列对比，仅包括最相似的区域)。

如本文所用，术语“同源性”和“相同性”可互换使用，但是蛋白质的同源性可包括保守氨基酸变化。与鉴别对应位置中一样，氨基酸序列被对比以便获得最高级匹配(见例如Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing: Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;and Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991;Carillo et al.(1988)SIAM J Applied Math48:1073)。

如本文所用，“序列相同性”是指在测试和参考多肽或多核苷酸之间比较中相同的氨基酸(或核苷酸碱基)数。同源多肽是指预定数目的相同或同源氨基酸残基。同源性包括保守氨基酸取代及相同残基。序列相同性可以通过标准对比算法程序确定，使用每个供应商确立的默认缺口罚分。同源核酸分子是指预定数目的相同或同源核苷酸。同源性包括不改变编码的氨基酸的取代(即“沉默取代”)及相同残基。基本上同源的核酸分子典型地在中等严格性或在高严格性在感兴趣核酸分子全长上或感兴趣核酸分子全长的至少大约70%、80%或90%上杂交。还包括这样的核酸分子，其含有简并密码子代替杂交核酸分子中的密码子。(为确定蛋白质的同源性，保守氨基酸及相同氨基酸可以被对比；在这种情况中，相同性百分比和同源性百分比不同)。任何两个核酸分子是否具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%“相同的”核苷酸序列(或者任何两个多肽是否具有这样的氨基酸序列)可以用已知的计算机算法如“FASTA”程序确定，使用例如Pearson et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444(1988)所述的默认参数(其它程序包括GCG程序包(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research12(I):387(1984)),BLASTP,BLASTN,FASTA(Atschul,S.F.,et al.,J.Molec.Biol.215:403(1990);Guide to Huge Computers,Martin J.Bishop,ed.,AcademicPress,San Diego(1994),以及Carillo et al.SIAM J Applied Math48:1073(1988))。例如，National Center for Biotechnology Information数据库的BLAST功能可用于确定相同性。其它商业或公共可利用程序包括DNAStar"MegAlign"program(Madison,WI)和University of Wisconsin GeneticsComputer Group(UWG)"Gap"程序(Madison WI))。蛋白质和/或核酸分子的同源性或相同性百分比可以例如用GAP计算机程序比较序列信息而确定(例如Needleman et al.J.Mol.Biol.48:443(1970),由Smith and Waterman(Adv.Appl.Math.2:482(1981)修正)。简而言之，GAP程序确定相似性是将相似的对比符号(即核苷酸或氨基酸)数除以两个序列中较短者的符号总数而得到。GAP程序的默认参数可包括：(1)一元比较矩阵(1代表相同性，0代表非相同性)，Gribskov et al.Nucl.Acids Res.14:6745(1986)的加权比较矩阵，如Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358(1979)所述；(2)每个缺口罚分3.0，每个缺口每个符号的另外0.10罚分；及(3)末端缺口不罚分。

因此，如本文所用，术语“相同性”代表测试和参考多肽或多核苷酸之间的比较。在一个非限制性实例中，“至少90%相同”是指相对于参考多肽从90至100%的相同性百分比。在90%或以上水平的相同性表明如下事实，假定为举例目的，长度为100个氨基酸的测试和参考多肽被比较，测试多肽中不超过10%(即100个中的10个)氨基酸不同于参考多肽的氨基酸。类似的比较可以在测试和参考多核苷酸之间进行。这种差异可以是随机分布于氨基酸序列全长的点突变，或者它们可以簇集在一或多个不同长度的位置，直至可允许的例如10/100个氨基酸差异(约90%相同性)。差异被定义为核酸或氨基酸取代、插入或缺失。在高于大约85-90%的同源性或相同性水平，结果应该不依赖于程序和缺口参数集；这种高水平相同性可以容易地评估，通常无需依赖软件。

如本文所用，还应理解术语“基本上相同”或“相似”随上下文变化，相关领域技术人员理解这一点。

如本文所用，排列对比的序列是指使用同源性(相似性和/或相同性)排列对比核苷酸或者氨基酸序列中对应位置。典型地，排列对比50%或者更高相同性的两或多个序列。序列对比系列是指在对应位置排列对比的两或多个序列，可包括衍生自RNA的对比序列，如EST及其它cDNA，与基因组DNA序列排列对比。

如本文所用，“特异性杂交”是指通过互补碱基配对，核酸分子(例如寡核苷酸)与靶核酸分子退火。本领域技术人员熟知影响特异性杂交的体外和体内参数，如特定分子的长度和组成。体外杂交特别相关的参数进一步包括退火和洗涤温度，缓冲液成分以及盐浓度。在高度严格条件下除去非特异性结合的核酸分子的举例的洗涤条件是0.1xSSPE、0.1%SDS、65℃；在中等严格条件下是0.2xSSPE、0.1%SDS、50℃。本领域已知相等的严格条件。技术人员可易于调节这些参数以实现核酸分子与适于特定应用的靶核酸分子的特异性杂交。

如本文所用，分离的或者纯化的多肽或者蛋白质或者其生物学活性部分是基本上无该蛋白质从中衍生的来自组织细胞的细胞材料或者其它污染蛋白，或者当化学合成时基本上无化学前体或者其它化合物。如果制备物没有可易于通过标准分析方法检测的杂质，则确定该制备物是基本上纯的或者足够纯的，所述方法例如是本领域技术人员用于评估这种纯度的薄层层析(TLC)、凝胶电泳和高效液相层析(HPLC)，由此进一步纯化不可察觉地改变所述物质的物理和化学性质，如蛋白酶解和生物学活性。纯化化合物以产生在化学上基本纯的化合物的方法为本领域技术人员已知。然而，在化学上基本纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况中，进一步纯化可增加该化合物的特异性活性。

术语基本上没有细胞材料包括这样的蛋白质制备物，其中所述蛋白质与该蛋白质从中分离或者重组产生的细胞的细胞成分分离。在一个实施方案中，术语基本上无细胞材料包括蛋白酶蛋白制备物具有少于大约30%(干重)的非蛋白酶蛋白(在此也称作污染蛋)，通常少于大约20%的非蛋白酶蛋白或者10%的非蛋白酶蛋白或者少于大约5%的非蛋白酶蛋白。当蛋白酶或者其活性部分是重组产生的时，其也基本上没有培养基，即所述蛋白酶蛋白质制备物中培养基的存在少于大约或者等于20%、10%或者5%体积。

如本文所用，术语基本上无化学前体或者其它化合物包括这样的蛋白酶蛋白制备物，其中所述蛋白质与蛋白质合成中包含的化学前体或者其它化合物分离。该术语包括这样的蛋白酶蛋白制备物，其具有少于大约30%(干重)、20%、10%、5%或者更少的化学前体或者非蛋白酶化合物或者成分。

如本文所用，用重组DNA方法经重组方式产生是指使用分子生物学熟知的方法表达由克隆的DNA编码的蛋白质。

如本文所用，载体(或者质粒)是指用于将异源核酸导入细胞中以表达和复制其的独立元件。载体典型保留附加体，但是可以设计为使得基因或者其一部分整合进基因组染色体中。还包含人工染色体载体，例如细菌人工染色体、酵母人工染色体以及哺乳动物人工染色体。这种载体的选择和应用为本领域技术人员熟知。

如本文所用，表达是指核酸被转录进mRNA中并且翻译成肽、多肽或者蛋白质的过程。如果核酸衍生自基因组DNA，如果选择适当的真核宿主细胞或者生物体，则表达可以包括如mRNA剪接这样的加工。

如本文所用，表达载体包括能表达与调节序列如启动子区域可操纵地连接的DNA的载体，能使得这种DNA片段表达。这种额外的节段可包括启动子和终止子序列，以及任选可包括一或多个复制起点、一或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等。表达载体通常衍生自质粒或者病毒DNA，或者可以含有这两个元件。因此，表达载体是指重组DNA或者RNA构建体，如质粒、噬菌体、重组病毒或者其它载体，在导入合适宿主细胞中时，使得克隆的DNA表达。合适的表达载体为本领域技术人员熟知，包括可以在真核细胞和/或与原核细胞中复制的那些载体，以及保留附加体的那些载体或者整合进宿主细胞基因组中那些载体。

如本文所用，载体还包括“病毒载体”。病毒载体是工程病毒，其可操作地与外源基因连接以将该外源基因转移(作为运载体或穿梭体)进细胞。

如本文所用，腺病毒是指任一组含有DNA的病毒，其导致人体结膜炎以及上呼吸道感染。

如本文所用，裸DNA是指无组蛋白DNA，其可以用于免疫接种和基因治疗。裸DNA是遗传物质，在称作转化或者转染的基因转移期间在细胞之间传代。在转化或者转染中，由受体细胞摄取的纯化的或者裸DNA为该受体细胞提供新的特性或者表型。

如本文所用，当针对DNA节段时所用术语可操纵地连接是指该节段经排列而发挥其指定功能，例如在启动子中转录起始以及通过编码节段行进至终止子。

如本文所用，调节蛋白质活性或者基因或核酸表达的物质降低或者增加或者另外改变该蛋白质的活性，或者以某些方式正调节或者负调节或者另外改变该核酸在细胞中的表达。

如本文所用，“嵌合蛋白”或者“融合蛋白”是指与不同多肽可操纵地连接的多肽。本发明提供的嵌合蛋白或者融合蛋白可包括一或多种FVII多肽或者其一部分，以及一或多个其它多肽，如任一或多个转录/翻译控制信号、信号序列、定位标记、纯化标记、免疫球蛋白G的结构域，和/或靶向剂。嵌合FVII多肽还包括具有其内源结构域或者用另一多肽置换的多肽区域的那些多肽。这些嵌合蛋白或者融合蛋白包括通过重组方式作为融合蛋白产生的那些蛋白，通过化学方式通过化学结合例如与巯基结合的那些蛋白，以及通过任何其它方法使得至少一个多肽(即FVII)或者其一部分与另一多肽直接连接或者通过接头间接连接产生的那些蛋白。

如本文所用，当描述融合蛋白时使用的术语可操纵地连接是指符合读框地彼此融合的蛋白酶多肽和非蛋白酶多肽。所述非蛋白酶多肽可以融合所述蛋白酶多肽的N末端或者C末端。

如本文所用，靶向剂是任何部分，例如蛋白质或者其有效部分，其提供与细胞表面分子的特异性结合，这种细胞表面受体在一些情况中可以使结合的缀合物或者其一部分内在化。靶向剂也可以是促进或者推动例如如下功能的物质，例如缀合物的亲和性分离或纯化、缀合物与表面的附着，或者缀合物或者含有该缀合物的复合物的检测。

如本文所用，分子的衍生物或者类似物是指衍生自分子的一部分或者修饰的分子。

如本文所用，“疾病或病症”是指生物体病变，其得自包括但不限于感染、获得性因素(acquired conditions)、遗传因素(genetic conditions)，特征在于可确认的症状。本发明感兴趣的疾病和病症是包含凝血的那些病症，包括通过凝血蛋白介导的那些病症以及其中凝血蛋白在病因学或病理学中起作用的那些病症。疾病和病症也包括由于蛋白质缺乏导致的那些病症，如血友病，特别感兴趣的是其中由于凝血蛋白的缺陷导致的不发生凝血的那些病症。

如本文所用，“促凝剂”是指促进血液凝固的任何物质。

如本文所用，“抗凝剂”是指抑制血液凝固的任何物质。

如本文所用，“血友病”是指由于凝血因子缺陷导致的出血性疾病。血友病可以是例如凝血因子缺乏、表达降低或者功能降低导致的疾病。最常见的血友病类型是血友病A，其是由于因子VIII缺陷所致。其次最常见的血友病类型是血友病B，其得自因子IX的缺陷。血友病C也称作FXI缺陷，是较轻且不太常见的血友病类型。

如本文所用，“先天性血友病”是指遗传性血友病类型。先天性血友病得自凝血因子基因的突变、缺失、插入或者其它修饰，其中凝血因子的产生不足、降低或者无功能。例如，凝血因子如因子VIII和因子IX基因中遗传突变分别导致先天性血友病A和B。

如本文所用，“获得性血友病”是指在成人中使FVIII失活的自身抗体产生而发生的血友病类型。

如本文所用，“出血性病症”是指其中对象控制出血能力下降的病症。出血性病症可以是先天性或者获得性的，且可以得自例如凝血途径中的缺陷、血小板活性的缺陷或不足，或者血管缺陷。

如本文所用，“获得性出血性病症”是指由于如肝脏疾病、维生素K缺乏或者coumadin(华法令阻凝剂)或者其它抗凝治疗引起的凝血缺陷所致病症。

如本文所用，“治疗”患病对象是指给予对象本发明提供的多肽、组合物或者其它制品。

如本文所用，治疗剂、治疗方案、辐射防护剂(radioprotectant)或者化学治疗是指本领域技术人员熟知的常规药物和药物治疗，包括接种。放射治疗剂为本领域熟知。

如本文所用，治疗是指改善或者另外有益地改变病症、失调或者疾病的症状的任何方式。因此，治疗包含预防、治疗和/或治愈。治疗还包含本发明组合物的任何药物学应用。治疗还包含本发明提供的修饰的FVII和组合物的任何药物学应用。

如本文所用，通过治疗例如给予药物组合物或者其它治疗剂而使得特定疾病或病症的症状改善是指归因于或者与给予组合物或者治疗剂相关的无论持久或是临时的、持续或者暂时的症状的任何减轻情况。

如本文所用，预防是指其中发生疾病或病症的危险被降低的方法。预防包括降低发生疾病或病症的危险和/或防止疾病的症状恶化或进展，或者降低疾病的症状或进展的恶化危险。

如本文所用，治疗特定疾病的化合物或组合物的有效量是足以改善或者以某些方式减少与疾病相关症状的量。这种量可以作为单剂量给予，或者可以根据治疗方案给予，从而其是有效的。所述量可以治愈疾病，但是典型是为了改善疾病症状而给予。典型地，需要重复给予以实现希望的症状改善。

如本文所用，“治疗有效量”或者“治疗有效剂量”是指至少足以产生治疗效力的制剂、化合物、材料或者含有化合物的组合物的量。有效量是治疗剂预防、治愈、改善、抑制或者部分抑制疾病或病症症状必需的数量。

如本文所用，被治疗的“患者”或者“对象”包括人或者非人动物，包括哺乳动物。哺乳动物包括灵长类动物，如人、黑猩猩、大猩猩和猴；驯养动物如狗、马、猫、猪、牛；以及啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和沙鼠。

如本文所用，组合是指两或多个项目的任何关联。所述关联可以是空间关联，或者是指为了共同目的使用两或多个项目。

如本文所用，组合物是指两或多种产物或者化合物(例如制备物、调节剂(modulator)、调节剂(regulator)等)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊状物、水溶液或者非水溶液配制物，或者这些物质的任意组合。

如本文所用，“生产制品”是指生产并销售的产品。在本申请书中，该术语包含包装的修饰的蛋白酶多肽及核酸。

如本文所用，液体是指可流动的任何组合物。液体因此包含半固体形式、糊状物、溶液、水溶液混合物、凝胶、洗剂、乳液形式的组合物及其它这种组合物。

如本文所用，“试剂盒”是指包装的组合物，任选包括试剂及使用组合元件进行本发明方法的其它产物和/或成分。例如本发明提供了这样的试剂盒，其含有本发明提供的修饰的蛋白酶多肽或核酸分子与另一项目的组合，所述项目用于包括但不限于给药、诊断和评价生物学活性或性质的目的。试剂盒任选地包括使用说明。

如本文所用，抗体包括抗体片段，如Fab片段，其由轻链和重链可变区组成。

如本文所用，受体是指对于特定配体具有亲和性的分子。受体可以是天然发生的分子或者合成的分子。受体在本领域也可以称作抗配体。

如本文所用，动物包括任何动物，例如但不限于灵长类动物，包括人、大猩猩和猴；啮齿动物，如小鼠和大鼠；家禽，如鸡；反刍动物，如山羊、牛、鹿、绵羊；ovine，如猪及其它动物。非人动物除外人。本发明提供的蛋白酶来自任何来源，动物、植物、原核生物和真菌。

如本文所用，基因治疗包括异源核酸如DNA转移进患有这种治疗尝试处理的病症的哺乳动物特别是人的某些细胞-靶细胞中。核酸如DNA被直接或者在载体或者其它运载体中被导入选择的靶细胞中，由此异源核酸如DNA被表达，且由此产生编码的治疗产物。或者，异源核酸如DNA可以某些方式介导DNA的表达，所述DNA表达治疗产物，或者其可以编码产物如肽或者RNA，其以某些方式直接或者间接介导治疗产物表达。遗传治疗也可用于输送编码基因产物的核酸，其置换缺陷的基因或者补充导入其的哺乳动物或者细胞产生的基因产物。导入的核酸可编码治疗化合物，如蛋白酶或者修饰的蛋白酶，其在哺乳动物宿主中通常不产生或者不以治疗有效量或不在治疗有效时间产生。编码治疗产物的异源核酸如DNA可以被修饰之后导入患病宿主细胞中，以增强或者另外改变产物或者其表达。遗传治疗也可以包括输送基因表达的抑制剂或者阻抑物或者其它调节剂。

如本文所用，异源核酸是不由表达其的细胞在体内正常产生的核酸，或者由所述细胞产生，但是在不同基因座产生或者不同表达的核酸，或者通过转录、翻译或者其它可调节的生物化学过程介导或编码改变内源核酸如DNA表达的核酸。异源核酸对于导入其的细胞通常不是内源的，而是得自另一细胞或者是合成制备的。异源核酸可以是内源的，但是是从不同基因座表达的核酸或者改变其表达的核酸。通常地，尽管非必需，这种核酸编码不是正常由表达其的细胞产生的RNA和蛋白质。异源核酸如DNA也可以被称作外来核酸，如DNA。因此，本文中异源核酸或外来核酸包括不以在基因组中发现的对应核酸分子如DNA的精确方向和位置存在的核酸分子。其也可以指来自另一生物体或物种的核酸分子(即外源的)。

本领域技术人员确认或者认为对于表达核酸的细胞是异源或者外源的任何核酸如DNA在本文均包含在异源核酸范围内；异源核酸包括也被内源表达的经外源加入的核酸。举例的异源核酸包括但不限于编码可追踪的标记蛋白如赋予药物抗性的核酸，编码治疗有效物质如抗癌剂、酶和激素的核酸，以及编码其它类型蛋白质如抗体的核酸，如DNA。由异源核酸编码的抗体可以在已经导入所述异源核酸的细胞表面分泌或表达。

如本文所用，基因治疗的治疗有效产物是指由异源核酸典型由DNA编码的产物，在所述核酸导入宿主中时，产物被表达，由此改善或者消除症状、表现(manifestations)先天性或者获得性疾病或者治愈疾病。本发明还包括生物活性核酸分子，如RNAi和反义分子。

如本文所用，多肽“基本由所述氨基酸序列组成”是指仅存在全长多肽的所述部分或者其片段。所述多肽可任选且通常包含来自另一来源的其它氨基酸或者可以插入另一多肽中。

如本文所用，除非特别之处，则单数形式“一”及“所述”包括其复数。因此，例如，提及化合物时，“一胞外结构域”包括具有一或多个胞外结构域的化合物。

如本文所用，范围和量可以表达为“大约”特定值或者范围。大约也包括精确量。因此，“大约5个碱基”是指“大约5个碱基”，也包括“5个碱基”。

如本文所用，“任选地”是指随后描述的事件或者情形发生或不发生，且所述描述包括其中所述事件或情形发生的情况以及不发生的情况。例如，任选取代的基团是指该基团是非取代的或者被取代。

如本文所用，对于任何保护基、氨基酸及其它化合物的缩写除非另有说明，否则符合其惯用法、认可的缩写或IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature(见(1972)Biochem.11:1726)。

B.止血综述

本发明提供了修饰的因子VII(FVII)多肽。这种FVII多肽被设计为具有增加的凝血活性。因此，这些多肽具有多种用途和应用。例如作为调节止血及其它相关生物过程的治疗剂。为了理解本发明提供的修饰以及这种修饰的FVII多肽的应用，关于止血系统和血液凝固级联的了解是有益的。如下论述提供了这种背景，是论述因子VII及其修饰的前言。

止血是阻止由于血管损伤所致的出血的生理机制。正常的止血依赖于细胞成分和可溶的血浆蛋白，包括一系列信号事件，最终导致血凝块形成。凝血在血管和内皮细胞被损坏后出现损伤后快速起始。在最初的凝血阶段中，血小板被活化在损伤部位形成止血栓子。继发的止血包括血浆凝血因子，其在蛋白酶解级联中起作用，导致纤维蛋白链形成，加强血小板栓子。

在血管损伤时，流向直接损伤区域的血流被血管收缩限制，使得血小板粘附于内皮下结缔组织上的新暴露的纤丝胶原蛋白。这一粘附依赖于vonWillebrand因子(vWF)，该因子在损伤3秒内结合于内皮，由此促进血小板粘附和聚集。聚集的血小板的活化导致各种因子的分泌，包括ADP、ATP、血栓烷及血清胺。粘附分子纤维蛋白原、vWF、血小板反应蛋白和纤连蛋白也被释放。这种分泌促进血小板的额外粘附和聚集，增加的血小板活化和血管收缩以及血小板表面上的作为血液凝固酶复合物组装平台的阴离子磷脂的暴露。血小板改变形状，导致伪足(pseudopodia)形成，其进一步促进与其它血小板的聚集，导致松散血小板栓子。

肽酶的凝固级联(凝血级联)同时启动。凝血级联涉及一系列涉及蛋白酶解的活化事件。在这种级联中，丝氨酸蛋白酶的无活性蛋白(也称为酶原)通过一或多个肽键的裂解被转化为活性蛋白酶，其然后作为级联中下一酶原分子的激活蛋白酶，最终导致通过纤维蛋白的交联形成凝块。例如，级联产生活化的分子如凝血酶(来自于凝血酶原的裂解)，其进一步激活血小板，以及还从纤维蛋白原的裂解产生纤维蛋白。纤维蛋白然后在血小板栓子周围形成交联的聚合物以稳定凝块。在修复损伤时，纤维蛋白被纤维蛋白溶解系统消化，该系统的主要成分是纤溶酶原和组织型纤溶酶原激活物(tPA)。这两种蛋白质均掺入到聚合纤维蛋白中，在此它们相互作用产生纤溶酶，纤溶酶随之作用于纤维蛋白以溶解预形成的凝块。在凝块形成过程中，凝血因子抑制物也通过血液循环以防止凝块形成超出损伤部位。

以下描述了系统的相互作用，从损伤至凝块形成和后续的纤维蛋白原溶解。

1.血小板粘附与聚集

在正常条件下血液凝固是被主动防止的。血管内皮支持血管舒张，抑制血小板粘附和活化，抑制凝血，促进纤维蛋白裂解并且性质是抗炎的。血管内皮细胞分泌诸如一氧化氮(NO)和前列环素(prostacylin)的分子，其抑制血小板聚集并扩张血管。这些分子的释放激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)和cGMP依赖性蛋白激酶I(cGKI)并增加环状鸟苷一磷酸(cGMP)水平，其导致血管壁中平滑肌的松弛。另外，内皮细胞表达细胞表面ADPase，如CD39，其通过将从血小板释放的ADP转化为腺苷酸血小板抑制剂而控制血小板活化和聚集。内皮还在纤维蛋白溶解级联中的酶的调节中起重要作用。内皮细胞通过表达纤溶酶原受体(膜联蛋白II)和尿激酶以及分泌组织型和尿激酶纤溶酶原激活物而直接促进纤溶酶产生，所有这些均促进凝块清除。在促血栓形成调节的最后一层中，内皮细胞通过产生类肝素硫酸酯而在抑制凝血级联中起积极作用，类肝素硫酸酯增加凝血酶和其它凝血因子的抗凝血酶III抑制的动力学。

然而，在急性血管创伤中，血管收缩机制占优势，内皮性质变成促血栓形成、促凝血和促炎性。这通过内皮扩张剂腺苷、NO和前列环素的降低以及ADP、血清胺和血栓烷对血管平滑肌细胞的直接作用使它们收缩而实现(Becker,Heindl et al..2000)。导致止血血栓形成的内皮功能变化的主要触发剂是血液和胞外基质(ECM)成分之间的内皮细胞屏障的丧失(Ruggeri(2002)Nat Med8:1227-1234)。循环的血小板鉴别并区分内皮损害区域并粘附于暴露的内皮下。它们与各种形成血栓的底物和局部产生或释放的激动剂的相互作用导致血小板活化。这一过程被描述为具有两个阶段，1)粘附：最初束缚于表面，及2)聚集：血小板-血小板内聚(Savage et al.(2001)CurrOpin Hematol8:270-276)。

血小板粘附当循环血小板结合于暴露的胶原蛋白时被启动，所述结合是通过与细胞表面上的胶原蛋白结合蛋白相互作用及通过与也存在于内皮上的vWF的相互作用而进行。vWF蛋白是可变大小的多聚结构，以两个方向被内皮分泌；沿基底外侧(basolaterally)及进入血液。vWF还结合因子VIII，其在因子VIII的稳定化及其在循环中的存活中很重要。

血小板粘附及随后的活化当vWF通过其A1结构域与GPIb(血小板糖蛋白受体复合物GPIb-IX-V的部分)结合时而实现。vWF和GPIb之间的相互作用被剪切力调节，从而剪切应力增加导致vWF对GPIb的亲和性对应增加。整联蛋白α1β2在白细胞上也已知为VLA-2，是血小板上主要的胶原蛋白受体，通过这一受体的结合产生胞内信号，有助于血小板活化。通过α1β2的结合促进较低亲和性胶原蛋白受体GP VI的结合。这是免疫球蛋白超家族的部分并且是产生血小板活化的最强胞内信号的受体。血小板活化导致释放腺苷二磷酸(ADP)，其转化为血栓烷A2。

血小板活化还导致血小板糖蛋白IIb-IIIa(GP IIb-IIIa)受体的表面表达，GP IIb-IIIa受体使得通过纤维蛋白原分子通过这些受体连接血小板而使血小板互相粘附。这导致在损伤部位形成血小板栓子，以帮助防止进一步失血，同时损伤的血管组织释放因子，启动凝血级联和在血小板栓子周围形成稳定化的纤维蛋白网。

2.凝血级联

凝血途径是一种蛋白酶解途径，其中每种酶作为酶原或无活性形式存在于血浆中。酶原的裂解被调节以从前体分子释放活性形式。激活的蛋白酶的辅因子如糖蛋白FVIII和FV也在级联反应中被活化并且在凝块形成中起作用。这一途径作为一系列正和负反馈环起作用，控制激活过程，其最终目的是产生纤溶酶，该纤溶酶可以然后将可溶性纤维蛋白原转化为纤维蛋白以形成凝块。凝血中的因子典型地被给予罗马数字变化，并附有小写字母“a”表示活化形式。下表3列出了这些因子的举例列表，包括其通用名及其在凝血级联中的作用。通常，这些蛋白质通过一或多个内源性、外源性或共有凝血途径而参与血液凝固(参见图1)。如下讨论，这些途径是连通的，血液凝固据信是通过基于细胞的活化模型而发生，其中因子VII(FVII)是主要的凝血引发剂。

表3：凝血因子

*表从M.W.King(2006)med.unibs.it/～marchesi/blood.html修改而成

历史上凝血酶的产生被分为3个途径，内源性(提示该途径的所有成分均是血浆固有的)和外源性(提示该途径的一或多个成分是血浆之外的)途径，它们提供了替代途径用于产生活化的因子X(FXa),以及最终的共有途径，其导致凝血酶形成(图1)。这些途径一起参与一种连通的互相依赖的过程以实现凝血。开发了一种基于细胞的凝血模型，其描述了这些途径(图2)(Hoffman et al.(2001)Thromb Haemost85:958-965)。在这一模型中，“外源性”和“内源性”途径在不同的细胞表面上实现，分别为组织因子(TF)携带细胞和血小板。凝血过程被分为独立的阶段，启动、放大和传播，在此过程中外源性和内源性途径在不同阶段起作用以产生将足够量的纤维蛋白原转化为纤维蛋白以形成凝块所需的大量凝血酶。

a.启动

FVII被认为是负责启动凝血级联的凝血因子，所述启动依赖于其与TF的相互作用。TF是一种跨膜糖蛋白，由多种细胞如平滑肌细胞、成纤维细胞、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞、血小板和内皮细胞表达。骨髓细胞和内皮细胞只有当被刺激时、例如由促炎性细胞因子刺激时才表达TF。但是平滑肌细胞和成纤维细胞组成型表达TF。因此，一旦这些细胞在组织损伤后与血液接触时，凝血级联通过TF与血浆中的因子VII或FVIIa的结合而迅速启动。

如以下讨论的，血液中大部分FVII是酶原形式，少量约1%以FVIIa存在。但是在缺乏TF结合时，甚至FVIIa也具有酶原样特征，不展示显著活性，直至其与TF复合。因此，血浆FVII需要被蛋白酶解激活以及通过与TF相互作用而发生额外构象变化以具有完全活性。一系列蛋白酶、包括因子IXa、Xa、XIIa和凝血酶已示出能体外裂解FVII，该过程在TF存在下被加速。FVIIa本身也可以在TF存在下激活FVII，该过程称为自身激活。血液中的少量FVIIa可能是由于被FXa和/或FIXa活化(Wildgoose et al.(1992)Blood80:25-28,及Butenas et al.(1996)Biochemistry35:1904-1910)。TF/FVIIa复合物因此可以通过FVIIa与TF的直接结合或通过FVII与TF结合随后FVII被血浆蛋白酶如FXa、FIXa、FXIIa或FVIIa本身激活而形成。TF/FVIIa复合物保持锚定于TF携带细胞，在此其在称为凝血的“外源性途径”中使少量FX活化为FXa。

TF/FVIIa复合物也裂解少量FIX为FIXa。FXa与其辅因子FVa结合也在TF携带细胞上形成复合物，该复合物可以随后将凝血酶原转化为凝血酶。但是所产生的少量凝血酶不足以支持完全凝血所需的纤维蛋白形成。此外，任何活性FXa和FIXa在循环中均被抗凝血酶III(AT-III)和其它丝氨酸蛋白酶抑制蛋白抑制，见下述详细讨论。这正常情况下会防止循环中形成凝块。但是在存在损伤时，对脉管系统的损害导致在这一凝血酶形成部位的血小板聚集和活化，由此使得放大凝血信号。

b.放大

当凝血酶结合并使血小板活化时发生放大。活化的血小板从它们的α粒释放FV，其被凝血酶活化为FVa。凝血酶还从血小板膜上的FVIII/vWF复合物释放并激活FVIII，并且裂解FXI为FXIa。这些反应产生在表面上具有FVa、FVIIIa和FIXa的活化的血小板，其为传播阶段大量产生凝血酶提供了基础。

c.传播

凝血的传播发生了损伤部位的大量血小板的表面上。如上所述，活化的血小板表面上具有FXIa、FVIIIa和FVa。在此外源性途径生效。FXIa使FIX活化为FIXa，其然后可以结合FVIIIa。除了少量FIXa是由TF携带细胞上的TF/FVIIa复合物裂解FIX产生之外，这一过程产生大量的FXIa/FVIIIa复合物，该复合物接着可以使显著量的FX活化为FXa。FXa分子结合FVa产生凝血酶发生酶(thrombinogenase)复合物以使凝血酶原活化为凝血酶。凝血酶在正反馈环中起作用以激活更多的血小板并再次启动放大阶段的过程。

非常短时间内，有足够数量的活化的血小板具有合适的复合物以产生凝血酶脉冲，其足够大到从纤维蛋白原产生足够量的纤维蛋白以形成止血纤维蛋白凝块。纤维蛋白原是在血浆中可溶的二聚体，其当被凝血酶裂解时释放血纤肽A和血纤肽B。血纤肽B然后被凝血酶裂解，由这一第二个蛋白酶解形成的纤维蛋白单体自发形成不溶的凝胶。聚合的纤维蛋白被非共价静电力结合在一起并且被转酰胺酶因子XIIIa(FXIIIa)稳定化，FXIIIa由凝血酶裂解FXIII而产生。凝血酶还激活TAFI，其通过降低凝块表面的纤溶酶产生而抑制纤维蛋白溶解。此外，凝血酶自身掺入凝块结构以进一步稳定化。这些不溶的纤维蛋白聚集体(凝块)与聚集的血小板(血栓块)一起阻断损伤血管并防止进一步出血。

3.凝血的调节

在凝血过程中，级联被组成型及刺激的过程调节以抑制进一步的凝块形成。这种调节机制有若干原因。首先，需要调节来限制由于纤维蛋白凝块形成所致的组织局部缺血。其次，调节通过将凝块形成仅限于组织损伤部位而防止广泛血栓形成。

调节是通过几种抑制分子的阳离子实现。例如，抗凝血酶III(AT-III)和组织因子途径抑制剂(TFPI)组成型工作以抑制凝血级联中的因子。AT-III抑制凝血酶、FIXa和FXa，而TFPI抑制FXa和FVIIa/TF复合物。另一种因子C蛋白经血小板活化而刺激，通过蛋白酶解和失活FVa和FVIIIa而调节凝血。S蛋白增强C蛋白的活性。另外，有助于凝血的另一个因子是膜内在蛋白质凝血酶调节素(thrombomodulin)，其由血管内皮细胞产生并作为凝血酶的受体。凝血酶与凝血酶调节素的结合抑制凝血酶促凝血活性并还有助于C蛋白活化。

纤维蛋白溶解是纤维蛋白凝块的降解，也提供了调节凝血的机制。凝块中交联的纤维蛋白多聚体被一种丝氨酸蛋白酶纤溶酶降解为可溶的多肽。纤溶酶可以从其无活性前体纤溶酶原产生并以两种方式募集到纤维蛋白凝块部位：通过与纤维蛋白凝块表面上的组织纤溶酶原激活物(tPA)相互作用，以及通过与细胞表面上的尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)相互作用。第一种机制看起来是负责溶解血管中的凝块的主要机制。第二种机制虽然能介导凝块溶解，可以在组织重塑、细胞迁移和炎症中起主要作用。

凝块溶解也以两种方式被调节。首先，有效的纤溶酶活化和纤维蛋白溶解仅发生在凝块表面或细胞膜上形成的复合物中，而游离在血液中的蛋白质是效率低的催化剂并被快速失活。其次，纤溶酶原激活物和纤溶酶被诸如作用于纤溶酶原激活物的1型纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)和PAI-2以及失活纤溶酶的α2-抗纤溶酶和α2-巨球蛋白的分子失活。在正常情况下，凝血和纤维蛋白之间的及时平衡导致血管损伤后凝块的有效形成和清除，同时防止不想要的血栓形成或出血事件。

下表4示出了举例性凝血因子、辅因子和调节蛋白的概述。

表4：凝血因子酶原和辅因子

*表从M.W.King(2006)med.unibs.it/～marchesi/blood.html修改而成

C.因子VII(FVII)

因子VII是维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶糖蛋白，其在动物包括哺乳动物中作为单链酶原在肝中合成并且分泌到血液中。如上所述，FVII是负责启动蛋白酶解事件级联导致凝血酶产生和纤维蛋白沉积的凝血蛋白酶。其是外源性途径的部分，尽管其活性的下游作用也极大地影响内源性途径。这一在凝块形成中的整体作用已经吸引了很大兴趣将FVII作为临床抗凝血和止血疗法。例如，已开发了重组活化的FVII(rFVIIa)作为止血剂用于血友病患者中，以及具有其它出血症状的对象中。本文提供了修饰的FVII多肽，其被设计为在活化时具有增加的凝血活性，以及可以作为改良的治疗剂以治疗适于因子VII治疗的疾病和症状。

1.FVII结构与组构

人FVII基因(F7)位于染色体13上的13q34，长度为12.8kb，具有9个外显子。FVII基因与编码其它维生素K依赖性蛋白质如凝血酶原、因子IX、因子X和C蛋白的基因具有显著的组构相似性。FVII的mRNA经历可变剪接产生两种转录物：变体1(Genbank Accession No.NM_000131,如SEQID NO:108所示)和变体2(Genbank Accession No.NM_019616,如SEQ IDNO:109所示)。转录物变体2是肝中最丰富形式，不包括外显子1b，因此编码较短的前体多肽，长度为444个氨基酸(FVII同种型b前体；SEQ IDNO:2)，转录物变体1编码466个氨基酸的前体多肽(FVII同种型a前体；SEQ ID NO:1)。FVII同种型b前体多肽中不存在的氨基酸对应于FVII同种型a前体的氨基酸位置22-43。这些氨基酸是前肽序列部分，导致截短的FVII同种型b前肽。前体多肽由下述节段和结构域组成：疏水性信号肽(SEQ IDNO:1和2的aa1-20)，前肽(SEQ ID NO:1的aa21-60，以及SEQ ID NO:2的aa21-38)，Gla结构域(SEQ ID NO:1的aa39-83，以及SEQ ID NO:2的aa61-105)，B型表皮生长因子结构域(EGF-like1,SEQ ID NO:1的aa84-120，以及SEQ ID NO:2的aa106-142)，A型表皮生长因子结构域(EGF-like2,SEQID NO:1的aa125-166；以及SEQ ID NO:2的aa147-188)，以及丝氨酸蛋白酶结构域(SEQ ID NO:1的aa191-430，以及SEQ ID NO:2的aa213-452)。

FVII多肽的406个氨基酸的成熟形式(SEQ ID NO:3)缺少信号肽和前肽序列，无论其源自哪种同种型前体，其长度和序列均相同。在FVII多肽的成熟形式中，上述结构域的对应氨基酸位置如下：Gla结构域(SEQ IDNO:3的aa1-45),EGF-like1(SEQ ID NO:3的aa46-82),EGF-like2(SEQ IDNO:3的aa87-128)，及丝氨酸蛋白酶结构(SEQ ID NO:3的aa153-392)。

FVII的Gla结构域是膜结合基序，其在存在钙离子时，与包括磷脂酰丝氨酸的磷脂膜相互作用。Gla结构域还在与FVIIa辅因子组织因子(TF)的结合中起作用。与TF复合，FVIIa的Gla结构域负载7个Ca²⁺离子，在细胞膜方向伸出3个疏水性侧链以与细胞表面上的磷脂相互作用，并与TF的C末端结构域显著接触。Gla结构域在维生素K依赖性蛋白质如凝血酶原、凝血因子VII、IX和X、C蛋白、S蛋白和Z蛋白中是保守的。这些蛋白质序列维生素K以翻译后合成γ-羧基谷氨酸，该氨基酸在这些蛋白质的N末端Gla结构域中簇集。结构域中存在的所有谷氨酸残基均是潜在的羧基化位点，它们中的许多因此被羧基化修饰。

除了Gla结构域之外，成熟FVII蛋白还含有2个EGF-like结构域。第一个EGF-like结构域(EGF-like1或EGF1)是钙结合EGF结构域，其中6个保守核心半胱氨酸形成3个二硫键。FVII的EGF1结构域只结合1个Ca²⁺离子，但是比Gla结构域观察到的亲和性显著更高(Banner et al.(1996)Nature380:41-46)。这一结合的Ca²⁺离子促进FVII的EGF1结构域与TF之间的强相互作用(Osterbund et al.(2000)Eur J Biochem267:6204-6211.)。第二个EGF-like结构域(EGF-like2或EGF2)不是钙结合结构域，但是也形成3个二硫键。与FVII中的其它结构域一样，EGF2结构域与TF相互作用。其也与蛋白酶结构域经二硫键结合在一起，并与之共享大的接触界面。

最后，FVII的丝氨酸蛋白酶结构域是负责FVIIa的蛋白酶解活性的结构域。FVII的催化结构域的氨基酸序列显示与其它丝氨酸蛋白酶如胰蛋白酶和糜蛋白酶具有高序列相同性和三级结构相似性(Jin et al.(2001)J MolBiol,307:1503-1517)。例如，这些丝氨酸蛋白酶共享一共同的催化三联体H57,D102,S195，这基于糜蛋白酶编号。但是，与其它丝氨酸蛋白酶不一样，FVIIa的裂解不足以完成酶原向完全活性酶的转变。相反，如以下讨论的那样，FVIIa的催化功能通过结合细胞表面受体TF而变构活化，其诱导FVIIa蛋白酶结构域的构象变化，使其从酶原样无活性状态变为催化活性酶。辅因子结合位点与FVIIa的活性位点(即氨基酸残基位置305-321，对应于基于糜蛋白酶编号的残基163-170i)之间的螺旋环区域对于FVIIa的变构状态和酶原性是重要的(Persson et al.(2004)Biochem J.,379:497-503)。这一区域由短α螺旋(氨基酸残基位置307-312)组成，其后为环。螺旋的N末端部分形成蛋白酶结构域和TF之间的界面，含有对蛋白酶解功能及与TF的最佳结合重要的一些残基。FVIIa单独与复合TF的FVIIa的晶体结构的比较表明当FVIIa结合TF时α螺旋经历显著构象变化。FVIIa单独的α螺旋看起来是变形的、缩短的和不同方向的。这影响了相邻的环结构，使得它们从活性位点离开。相反，当与TF复合时FVIIa的α螺旋被稳定化，相邻的环位于活性位点更近。稳定化是通过涉及FVII的至少氨基酸位置306的甲硫氨酸(糜蛋白酶编号的氨基酸残基Met¹⁶⁴)的机制实现的(Pike et al.(1999)PNAS8925-8930)。

2.翻译后修饰

FVII前体多肽(因子VII基因的任一同种型)通过疏水性信号肽被靶向细胞分泌途径，其插入内质网(ER)以启动跨膜转运。在蛋白质通过ER膜转运时，20个氨基酸的信号肽被ER腔内的信号肽酶裂解，之后多肽经历进一步的翻译后修饰，包括N-和O-糖基化，N末端谷氨酸被维生素K依赖性羧基化为γ-羧基谷氨酸，以及天冬氨酸被羟基化为β-羟基天冬氨酸。

前肽提供了维生素K依赖性羧化酶的识别位点，该酶识别FVII前肽中的10个残基的两亲性α螺旋。在结合后，羧化酶γ-羧基化FVII多肽的Gla结构域内的10个谷氨酸残基，产生在相对于SEQ ID NO:2所示的FVII前体氨基酸序列的位置E66,E67,E74,E76,E79,E80,E85,E86,E89和E95的γ-羧基谷氨酰残基。这些位置对应于SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽的位置E6,E7,E14,E19,E20,E25,E26,E29和E35。为了最佳活性，FVII分子需要钙，其结合多肽并促进FVIIa与TF和脂质结合所需的构象变化。γ-羧基化的Gla结构域以可变亲和性结合7个Ca²⁺离子，其诱导构象变化，使得Gla结构域与TF的C末端结构域以及磷脂酰丝氨酸或血小板膜上的其它带负电磷脂相互作用

N-连接糖基化通过转移Glc₃Man₉(GlcNAc)至FVII多肽中对应于成熟蛋白(SEQ ID NO:3)的氨基酸残基145和262的两个天冬酰胺残基而进行。O-连接糖基化在成熟蛋白的氨基酸残基52和60发生，羟基化为β-羟基天冬氨酸在位置63的天冬氨酸残基发生。这些O-糖基化丝氨酸残基和β-羟基化天冬氨酸残基在FVII的EGF-1结构域中。这些修饰在多肽被最终加工为其成熟形式之前在ER和高尔基体复合物中实现。

3.FVII加工

修饰的pro-FVII多肽通过高尔基体腔被转运至trans-Golgi室内，在此前肽在蛋白质即将从细胞分泌之前被前肽酶裂解。PACE/furin(其中PACE是成对碱性氨基酸裂解酶的简称)是位于高尔基体膜的内肽酶，其在序列基序Arg-[任一残基]-(Lys或Arg)-Arg的羧基末端侧裂解许多蛋白质。这一前肽酶裂解维生素K依赖性糖蛋白如pro-因子IX和pro-vWF多肽(Himmelspach et al.(2000)Thromb Research97;51-67)，将前肽从成熟蛋白释放。在重组因子VII前体中包括合适的PACE/furin识别位点促进重组多肽的正确加工和分泌(Margaritas et al.(2004)Clin Invest113(7):1025–1031)。PACE/furin或另一种subtilising-like前肽酶很可能负责pro-FVII被蛋白酶解加工为FVII。其可以识别并结合SEQ ID NO:1所示序列的氨基酸位置35-38以及SEQ ID NO:2所述序列的氨基酸位置57-60的–Arg-Arg-Arg-Arg–共有基序，裂解前肽并释放成熟蛋白用于分泌。

4.FVII活化

血液中的绝大部分FVII是无活性单链酶原形式，但是少量以二条链活化形式存在。FVII的活化在Arg¹⁵²-Ile¹⁵³键(相对于成熟FVII，如SEQ IDNO:3所示)的蛋白酶解时发生，给出二条链多肽，其含有152个氨基酸的轻链(约20kDa)经二硫键与254个氨基酸的重链(约30kDa)连接。FVIIa的轻链含有Gla结构域和EGF-like结构域，而重链含有分子的催化或丝氨酸蛋白酶部分。单链FVII转变为二条链FVIIa由FIXa、FXa、FXIIa、凝血酶的裂解介导，或者通过内源FVIIa以自催化方式介导(Butenas et al.(1996)Biochem35:1904-1910;Nakagaki et al.(1991)Biochem30:10819-10824)。在循环中确实发生的痕量FVIIa可能是由于FXa和FIXa的作用而产生。

如以上讨论，FVII从其酶原形式裂解为FVIIa不足以产生完全活性。FVIIa需要与TF结合而具有完全活性(Higashi et al.(1996)J Biol Chem271:26569-26574)。由于这一需要，FVIIa单独已被描述为酶原样特征，显示酶原折叠和形状，显示相对较低活性。FVIIa在缺少其与TF结合时的这一酶原样特征使得其对抗凝血酶III(AT-III)和通常主要作用于丝氨酸蛋白酶活性形式而非酶原形式的其它丝氨酸蛋白酶抑制蛋白有相对抗性。另外，TF/FVIIa活性的主要抑制剂TFPI也不有效结合“无活性”的非复合形式的FVIIa。

在与TF复合时，FVIIa经历构象变化，允许分子的完全活性。所有FVII的结构域均涉及与TF的相互作用，但是发生的构象变化位于FVIIa的蛋白酶结构域。例如，FVIIa和TF的变构相互作用时发生的构象变化包括产生延伸的大分子底物结合exosite。这一延伸的结合位点大大增强了FVII介导的因子X的蛋白酶解活化。

当FVIIa的相互作用是与细胞表面表达的TF时FVIIa的活性进一步增加(即1000倍)。这是因为含有带负电磷脂如磷脂酰丝氨酸的磷脂膜是其它维生素K依赖性凝血因子如FIX和FX(其通过其Gla结构域结合)的相互作用位点。因此，这些维生素K依赖性蛋白质的局部浓度在细胞表面是高的，促进它们与TF/FVIIa复合物的相互作用。

5.FVII功能

尽管FVIIa在被TF变构活化后显示增加的活性，有证据表明存在这样的机制，其中FVIIa单独可以启动凝血。因此，FVII可以以TF依赖性和TF不依赖性方式起作用。后一途径可以在正常止血中起小得多的作用，但是其在考虑到出血疾病及其治疗中可以是显著的。

a.组织因子-依赖性FVIIa活性

循环的FVII结合细胞表面TF并且如上所述被FIXa、FXa、凝血酶激活或者以自催化方式被内源FVIIa激活。或者，非常少量的循环FVIIa可以直接结合TF。所述TF/FVIIa复合物然后结合少部分血浆FX，FVIIa催化结构域裂解FX产生FXa。当FXa与FVa复合并使凝血酶原活化为凝血酶时，凝血酶由此通过外源性途径在TF携带细胞表面上形成(图3)。FIX也被TF/FVIIa复合物激活，提供了与在活化的血小板表面上运行的内源性途径的连接。上述凝血级联中的正反馈系统提供了产生大量凝血酶的手段，凝血酶裂解纤维蛋白原为纤维蛋白以形成凝块。

b.组织因子-非依赖性FVIIa活性

除了使FX活化为FXa的TF依赖性机制外，还有证据表明FVIIa还可以在不存在TF时激活FX。活化的血小板将磷脂酰丝氨酸和其它带负电磷脂转位到血浆方向外表面(Hemker et al.(1983)Blood Cells9:303-317)。这些提供了替代“受体”，通过它们FVIIa可以结合，尽管具有相对较低亲和性，亲和性比FVIIa与TF的结合亲和性低1000倍(Monroe et al.(1997)Br JHaematol99:542-7)。这一相互作用通过Gla结构域中的残基介导(Harvey etal.(2003)278:8363-8369)。FVIIa可以然后将活化的血小板表面上的FX转化为FXa，将FIX转化为FIXa(Hoffman et al.(1998)Blood CoagulFibrinolysis9:S61-S65)。FXa保持与血小板表面结合，在此其可以结合FVa并从凝血酶原产生足够的凝血酶，同时新形成的FIXa与FVIIIa组装以催化活化更多的FX为FXa(图3)。在TF不存在下的止血然后通过上述正反馈和传播机制实现。但是应注意的是尽管FVIIIa可以有助于在活化的血小板上的凝血过程，其存在却不是在TF不依赖性机制中凝血酶产生所需的(图3)。因此，在不存在FVIII时，如血友病患者，有证据表明FVIIa可以通过这一二级机制启动和/或放大凝血酶产生，及实现凝块形成。

6.FVII作为生物制药

FVII功能是启动凝血。重组FVIIa(

rFVIIa)被批准用于治疗出血事件或者在患有血友病A或B具有对因子VIII或因子IX的抑制剂的患者或具有先天性因子VII缺陷的患者的手术或侵入程序中防止出血。

是因子VIIa的基因工程制剂，用幼仓鼠肾(BHK)细胞在哺乳动物表达系统中生产。该制剂在结构和功能上与血浆来源的因子VIIa几乎相同(Ratko et al.(2004),P&T,29:712-720)。

给予重组FVIIa(rFVIIa)已示出在患有血友病的患者中促进凝血，用FVIIa剂量治疗已被发现在人类对象中是安全且耐受良好的。典型地，已在产生了对因子VIII或因子IX的抑制剂(即同种抗体)的患者中使用rFVIIa。使用rFVIIa作为凝血剂已延及其它出血疾病的治疗，例如Glanzmann’s血小板机能不全；其它与广泛出血相关的事件，如创伤或手术的结果，包括但不限于肝移植，前列腺手术和出血性创伤；新生儿凝血疾病(coagulophathies)，重症肝病；骨髓移植，血小板减少和血小板功能障碍；口服抗凝血的紧急逆转；因子V、VII、X和XI的先天性缺陷；及具有对von Willebrand因子的抑制剂的von Willebrand疾病。

需要高剂量rFVII实现治疗效果。rFVII给药所需的剂量和给药方案根据临床适应症而变化。例如，用于具有同种抗体的患有血友病A或血友病B的患者中的出血事件的rFVII的典型剂量是静脉(IV)注射给药90μg/kg。由于rFVII的半衰期是2小时，需要重复给药。额外的给药可以每2小时给予直至实现止血。剂量范围可以根据症状严重性而改变。例如，35–120μg/kg的剂量范围是有效的。还有，剂量和给药方案可以随其它适应症而变化。例如，进行手术的血友病A或血友病B患者可以在即将手术前给予初始剂量90μg/kg，在手术过程中或之后每2小时给予重复剂量。根据手术和出血事件的严重性，每2-6小时可以持续IV推注直至实现愈合。在先天性FVII缺陷患者中，rFVII典型地以每4-6小时给予15–30μg/kg以防止手术或其它侵入程序中的出血直至实现止血。

rFVIIa启动止血的作用机制解释了高剂量的需要。血友病患者具有正常的凝血初始阶段，其中TF/FVIIa复合物使FX活化为FXa并导致在TF携带细胞的部位产生凝血酶。但是，之后凝血过程被停止因为血友病患者缺乏FVIII(血友病A)或FIX(血友病B)，并因此不能在活化的血小板表面上形成FVIIIa/FIXa复合物，该复合物正常情况下在前述放大和传播阶段使大量FX活化为FXa。由于存在抑制剂，如TFPI和AT-III，在被TF/FVIIa裂解后在TF携带细胞上产生的FXa不能容易地在细胞表面之间扩散。结果，在活化的血小板表面上不发生大规模凝血酶产生，不形成凝块。

有证据表明高剂量rFVIIa的止血效果可以使用TF依赖性和/或TF不依赖性FXa生成由rFVIIa在活化的血小板上实现(图3)。TF依赖性凝血酶生成可以由内源性FVIIa和rFVIIa对TF分子的饱和而非常迅速地最大化。在一些情况中，高剂量rFVIIa可以结合活化的血小板并将FX转变为FXa。表面结合的FXa使FVa活化以产生足够的凝血酶用于止血。由于rFVII以低亲和性结合血小板表面，可以需要较高剂量的rFVII用于凝血酶产生。活化的血小板上FXa的激活保证了rFVIIa介导的止血位于损伤部位。

降低rFVII剂量的手段可以改善其作为药物的用途和功效。本文提供了修饰的FVII多肽。在这些中是如下修饰的FVII多肽，其显示增加的对TFPI的抗性，增加的对AT-III的抗性，改善的药物代谢动力学性质，如增加的半衰期，在TF存在和/或不存在下增加的催化活性，和/或增加的与活化的血小板的结合。这些FVII多肽可以显示增加的凝血活性。本文提供的FVII可以用于治疗中以TF依赖性和/或TF不依赖性机制启动止血，以便产生FXa和凝血酶。

D.修饰的FVII多肽

本文提供了修饰的FVII多肽。所述FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比在一或多种活性或性质中显示改变。可作为修饰的结果被改变的活性或性质包括但不限于凝血或凝血剂活性；促凝血剂活性；蛋白酶解或催化活性如实现因子X(FX)活化或因子IX(FIX)活化；抗原性(结合或与多肽竞争结合抗FVII抗体的能力)；结合组织因子、因子X或因子IX的能力；结合活化的血小板的细胞表面的能力；结合磷脂的能力；半衰期；三维结构；pI；和/或构象。典型地，修饰的FVII多肽显示促凝血剂活性。本文提供了修饰的FVII多肽，它们在从它们的单链酶原形式活化后显示增加的凝血剂活性。这种修饰的FVII多肽可以用于治疗出血疾病或事件，如血友病或损伤，其中FVII多肽可以促进凝血。这种修饰的FVII多肽包括具有对抑制剂如组织因子途径抑制剂(TFPI)和抗凝血酶III(AT-III)的增加的抗性的那些修饰的FVII多肽，在存在和/或不存在TF时具有增加的催化活性的那些修饰的FVII多肽，具有改善的药物代谢动力学性质如增加的半衰期的那些修饰的FVII多肽，以及具有对血小板表面的增加的结合和/或亲和性的那些修饰的FVII多肽。特别地，这种修饰的FVII多肽可以用于疾病或病症中以提供凝血剂活性同时不需要FVIIIa和FIXa。在一个实例中，本文提供的修饰的FVII多肽可以用于具有对FVIIIa和FIXa的自身抗体的血友病患者中。因此，本文提供的修饰的FVII多肽提供了优势，包括降低了维持血清中活性FVII的足够浓度以用于止血所需的FVII给药量。这可以导致例如，更低的实现相当的生物学作用所需的剂量和/或给药频率，更快产生治疗效益更快缓解急性出血事件，对象更高的舒适度和接受性，以及减轻继发的非有益作用。

FVII多肽中的修饰可以在任何形式的FVII多肽中产生，包括等位基因和种变体、剪接变体、本领域已知的变体或杂种或嵌合FVII分子。例如本文提供的修饰可以在SEQ ID NO:1或2所示的前体FVII中产生，在SEQ IDNO:3所示的成熟FVII多肽中产生，或在与SEQ ID NO:1-3所示任一FVII多肽具有40%,50%,60%,70%,80%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%序列相同性的其任何物种、等位基因或修饰的变体和活性片段中产生。FVII的等位基因变体包括但不限于具有SEQ ID NO:18-74任一所示氨基酸序列的那些前体多肽中的任一个。用于本文修饰的举例的种变体包括但不限于人和非人多肽，包括来自牛、小鼠、倭黑猩猩、黑猩猩、兔、大鼠、猕猴、猪、狗、斑马鱼、河豚、鸡、猩猩和大猩猩FVII多肽的FVII多肽，其序列分别示于SEQ ID NO:4-17。FVII多肽中的修饰可以在也含有其它修饰的FVII多肽中产生，所述其它修饰例如本领域描述的那些，包括一级序列的修饰以及不在多肽的一级序列中的修饰。

FVII多肽的修饰还包括这样的多肽的修饰，所述多肽是不同FVII多肽的杂种，以及重组制备的或合成的或通过本领域已知的其它方法基于已知多肽的序列构建的合成FVII多肽。例如，基于FVII与其它凝血因子家族成员如因子IX(FIX)或因子X(FX)的序列对比，可以容易地鉴别家族成员中的同源结构域。FVII多肽的嵌合变体可以被构建，其中一或多个氨基酸或者完整结构域在FVII氨基酸序列中用对应的家族成员的氨基酸序列置换。此外，嵌合FVII多肽包括其中一或多个氨基酸或者完整结构域在人FVII氨基酸序列中用不同物种的氨基酸序列置换的那些(见例如Williamson et al.(2005)J Thromb Haemost3:1250-6)。这种嵌合蛋白可以作为本文的起始未修饰FVII多肽使用。

本文提供的起始未修饰的参考多肽的修饰包括氨基酸置换或氨基酸的取代、添加或缺失或其任何组合。例如，修饰的FVII多肽包括具有1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,30,40,50或更多个修饰的位置的那些多肽。本文还提供了与起始参考FVII多肽相比具有二个或多个修饰的修饰的FVII多肽。修饰的FVII多肽包括具有2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,30,40,50或更多个修饰位置的那些多肽。本文提供的任何修饰可以与本领域技术人员已知的任何其它修饰组合，只要所得修饰的FVII多肽当在其二条链或活化形式显示凝血活性即可。典型地，修饰的FVII多肽显示增加的凝血活性。可以作为修饰的结果被改变的活性或性质包括但不限于凝血或凝血剂活性；促凝血剂活性；蛋白酶解或催化活性如实现因子X(FX)活化或因子IX(FIX)活化；抗原性(结合或与多肽竞争结合抗FVII抗体的能力)；结合组织因子、组织因子抑制因子(TFPI)、抗凝血酶III、因子X或因子IX的能力；结合活化的血小板的细胞表面的能力；结合磷脂的能力；血清半衰期；三维结构；pI；和/或构象。本文提供的修饰的FVII多肽包括具有对组织因子途径抑制剂(TFPI)增加的抗性，对抗凝血酶III(AT-III)增加的抗性，在存在和/或不存在TF时增加的催化活性，改善的药物代谢动力学性质如增加的血清半衰期，增加的固有活性和/或对血小板表面的增加的亲和性和/或结合的那些修饰的FVII多肽。

在一些实例中，修饰可以影响FVII多肽的两种或多种性质或活性。例如，修饰可以导致修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比有增加的TFPI抗性和增加的催化活性。本文提供的修饰的FVII多肽可以被测定每种性质和活性以鉴别修饰作用范围。这种测定是本领域已知的并见下述。本文提供的修饰的FVII多肽还包括用细胞机制额外修饰的FVII多肽，包括例如糖基化、γ-羧基化和β-羟基化多肽。

进行本文提供的对FVII多肽的修饰以增加TFPI抗性，增加AT-III抗性，改善药物代谢动力学性质如增加血清半衰期，增加在存在和/或不存在TF下的催化活性和/或增加对活化的血小板的亲和性和/或结合。例如，FVII可包括增加TFPI抗性和结合血小板其一或这两者的修饰。在其它实例中，本文提供的任何修饰可以与本领域技术人员已知的任何其它修饰组合，只要所得修饰的FVII多肽当在其二条链形式显示凝血活性即可。典型地，这种增加的凝血活性是由于增加的对TFPI的抗性、改善的药物代谢动力学性质如增加的血清半衰期、增加的对AT-III的抗性、改变的糖基化、增加的催化活性和/或增加的对磷脂的结合和/或亲和性所致。在一些实例中，导入FVII多肽以改变特异活性或性质的修饰还可以或者代之以可以影响另一种活性或性质。因此，本文提供的修饰可以影响它们设计用于影响的性质或活性以及一或多种其它性质或活性。例如，对FVII多肽进行的增加TFPI抗性的修饰也可以改善药物代谢动力学性质如血清半衰期。在一些实例中，单修饰如单氨基酸取代改变FVII多肽的2、3、4或更多种性质或活性。本文修饰的FVII多肽可以被测定每种性质和活性以鉴别修饰作用范围。这种测定是本领域已知的并见下述。本文提供的修饰的FVII多肽还包括用细胞机制额外修饰的FVII多肽，包括例如糖基化、γ-羧基化和β-羟基化多肽。

本文提供的修饰可以用标准重组DNA技术如本领域技术人员已知的技术产生。可以采用本领域已知的任何实现在靶蛋白中的任一或多个氨基酸突变的方法。方法包括编码核酸分子的标准的定点诱变(使用例如试剂盒，如得自Stratagene的QuikChange)，或者通过固相多肽合成方法。另外，本文提供的修饰的嵌合蛋白(即Gla结构域swap)可以用常规重组DNA技术产生。例如，嵌合多肽可以用用于常规亚克隆所需嵌合多肽成分的限制酶和克隆方法学产生。

在或不在多肽一级序列中的其它修饰也可包括在修饰的FVII多肽或其缀合物中，包括但不限于添加碳水化合物部分，添加聚乙二醇(PEG)部分，添加Fc结构域等。例如，这种额外的修饰可以用于增加蛋白质的稳定性或半衰期。

所得修饰的FVII多肽包括单链酶原或活性多肽或者一条链或二条链酶原样多肽。例如，本文提供的是单链酶原多肽的任何修饰的多肽可以被自身激活或者被其它凝血因子激活以产生二条链形式的修饰的FVII(即FVIIa)。修饰的FVII多肽的活性典型地在其二条链形式中显示。

本文提供的修饰的FVII多肽可以显示增加的TFPI抗性、增加的AT-III抗性、增加的在存在和/或不存在TF下的催化活性、改善的药物代谢动力学性质如增加的血清半衰期、和/或增加的对磷脂的结合和/或亲和性。典型地，本文提供的修饰的FVII多肽的这种性质和/或活性被产生而同时保持其它FVII活性或性质，例如但不限于与TF的结合和/或FX的结合和活化。因此，本文提供的修饰的FVII多肽与野生型或起始形式的FVII多肽相比保持TF结合和/或FX结合和活化。典型地，这种活性与野生型或起始蛋白相比基本上未改变(改变小于1%、5%、10%、20%或30%)。在其它实例中，修饰的FVII多肽的活性与野生型或起始FVII多肽相比被增加或降低。活性可以体外、离体或体内测定，可以与未修饰的FVII多肽如成熟的野生型天然FVII多肽(SEQ ID NO:3)、野生型前体FVII多肽(SEQ ID NO:1或2)或本领域技术人员已知的用作起始材料的任何其它FVII多肽相比较。

因此，根据本文提供的修饰，修饰的FVII多肽可以显示TF依赖性和/或TF不依赖性方式的增加的凝血活性。典型地，本文提供的修饰的FVII多肽的增加的凝血活性可以在合适的测定中于体外观测，或者体内观测，如在给予对象如人或非人对象后。修饰的FVII多肽的增加的活性与起始或未修饰的FVIIa多肽相比可以增强至少或大约1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%,110%,120%,130%,140%,150%,160%,170%,180%,190%,200%,300%,400%,500%或更高。

1.增加的对抑制剂的抗性

与大多数生物学系统一样，凝血级联由正和负机制调节。这些机制经常通过直接或间接抑制或增强参与级联的一或多种因子的活性而起作用。因此，感兴趣的是对阴性调节其活性的抑制机制有抗性的治疗性凝血因子。特别地，感兴趣的是修饰的FVII多肽，它们对正常抑制FVII活性的抑制分子是抗性的。TF/FVIIa复合物的主要调节物是组织因子途径抑制剂(TFPI)。另外的对FVIIa活性有抑制的但程度较低的是抗凝血酶III(AT-III)。

a.TFPI

组织因子途径抑制剂是单链多肽，由位于染色体2q31-q32.1上的9个外显子编码。TFPI(也称作TFPI-1)是Kunitz型抑制剂，其主要由内皮细胞合成并含有带负电的氨基末端区，3个串联Kunitz型抑制剂结构域和高度碱性羧基末端尾(Wun et al.,J.Biol.Chem.263:6001(1988)。通过可变mRNA剪接，产生两种不同形式的TFPI：TFPIα和β。TFPIα是分子量大约46kDa的分泌蛋白。前体多肽长度为304个氨基酸(SEQ ID NO:101)，通过裂解28个氨基酸的信号肽而加工，导致分泌276个氨基酸的成熟糖蛋白(SEQ ID NO:102)。成熟蛋白含有18个半胱氨酸残基并且当正确折叠时形成9个二硫键。一级氨基酸序列还含有3个Asn-X-Ser/Thr N-连接的糖基化共有位点，位于位置145、195和256的天冬酰胺残基。Kunitz-1和Kunitz-2结构域分别负责结合和抑制TF/FVIIa复合物和FXa(参见例如图4)。缺少蛋白酶抑制活性的Kunitz-3结构域以及TFPIα的C末端已示出参与其细胞表面定位(Piro et al.(2004)Circulation110:3567-3572)。

TFPIβ是TFPI的可变剪接形式，其中TFPIα的Kunitz-3结构域和C末端区被指导糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚的无关C末端区置换。前体多肽(SEQ IDNO:103)被加工为223个氨基酸的成熟蛋白(SEQ ID NO:104)。基于蛋白质质量，TFPIβ(28kDa)显著小于TFPIα(36kDa)。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中两者均以相同表观分子量(46kDa)迁移，提示翻译后修饰的差异。TFPIα和β以GPI依赖性方式结合在细胞表面。TFPIβ在其C末端含有GPI锚，而TFPIα看起来结合于尚未鉴别的GPI连接的蛋白质。尽管TFPIβ仅占20%的总表面TFPI，但是它负责大部分抗TF/FVIIa活性，提示针对细胞表面TFPIα的潜在替代作用，如结合和清除

(Piro et al.(2005)J Thromb Haemost3:2677-2683)。

TFPI以至少两种方式抑制凝血级联；通过结合FXa的活性位点，及通过失活TF/FVIIa复合物(参见例如图4)。第一个Kunitz结构域结合FVIIa，而第二个结构域结合FXa(Girard et al.(1989)Nature338:518-520)。与结合FXa相比，游离的TFPI结合FVIIa非常缓慢。但是一旦结合了FXa，TFPI/FXa复合物显示对TF/FVIIa复合物的强亲和性。它们的相互作用导致在内皮细胞表面形成异四聚体复合物，其中FVIIa是催化无活性的(图4)。这种四元结构因此阻止了凝血级联的TF/FVIIa启动。

人类中存在至少一种TFPI的其它同系物，TFPI-2，也已知为胎盘蛋白5(PP5)和基质结合丝氨酸蛋白酶抑制剂(MSPI)。TFPI-2是一种32kDa基质结合的Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，其显示对广谱蛋白酶包括胰蛋白酶、纤溶酶、糜蛋白酶、组织蛋白酶G、血浆激肽释放酶和因子VIIa-组织因子复合物的抑制活性。213个氨基酸的成熟TFPI-2蛋白(SEQ ID NO:105)含有3个Kunitz型结构域，与TFPI Kunitz型结构域1、2和3分别有43%、35%和53%一级序列相同性。人TFPI-2的第一个Kunitz型结构域含有用于抑制丝氨酸蛋白酶的所有结构元件，但是动力学和分子学研究表明相比于几种其它丝氨酸蛋白酶包括TF/FVIIa，TFPI-2是纤溶酶的更有效抑制剂(Chand etal.(2004)J Biol Chem279:17500-17507)。据认为其在调节胞外基质消化和重塑中起重要作用。在这一情况中，TFPI-2合成降低与许多病理学过程如炎症、血管发生、动脉粥样硬化、视网膜变性和肿瘤生长/转移相关(Chand et al.(2005)Thromb Haemost94:1122-30)。因此，尽管与TFPI同源，不认为TFPI-2是一种凝血途径的重要因子。TFPI-1和TFPI-2的Kunitz-1结构域的序列对比如图6b所示。

在兔模型中免疫耗竭TFPI增强了凝血(Warn-Cramer et al.(1993)Arterioscl Thromb13:1551-1557,Ragni et al.(2000)Circulation102:113-117)，提示破坏TF/FVIIa-TFPI/FXa四元复合物的形成可以抑制TF/FVIIa启动凝血的负调节。此外，破坏FVIIa与TFPI的相互作用可以降低FVIIa的清除。降低的清除可以表现为增加的半衰期。另外，结合于细胞表面TF的FVIIa可以被内化和降解，而不耗竭细胞表面上的TF。这种形式的内化和降解在与细胞表面TF/FVIIa形成四元复合物的TFPI/FXa存在下被显著增加。结合后的内化和降解通过低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)依赖性有被小窝途径介导(Iakhiaev et al.,(1999)J.Biol.Chem274:36995-37003)。TFPI还可以帮助介导通过其它机制的FVIIa清除，如肝或肾清除机制。

实现增加的对TFPI的抗性的修饰

本文提供了显示增加的对TFPI的抗性的修饰的FVII多肽。这种对TFPI的抗性可以例如通过突变FVII中参与与TFPI的相互作用和结合的一或多个残基以降低或防止这种结合而实现，由此使得修饰的FVII多肽对TFPI对凝血启动的天然抑制作用有抗性。当在合适的体外测定或者体内如在作为促凝剂治疗剂给予对象后评价时，修饰的TFPI抗性FVII多肽可以显示与未修饰FVII多肽相比增加的凝血剂活性。显示增加的TFPI抗性的FVIIa突变体中包括具有增加的半衰期的突变体。例如，实施例9所述突变体显示增加的半衰期。

本文提供了修饰的FVII多肽，其在FVII/TFPI接触残基或者与相互作用界面紧密接近的残基中具有一或多个突变。这种接触残基包括在位置196的天冬氨酸残基(D196,Asp¹⁹⁶)，在位置197的赖氨酸残基(K197,Lys¹⁹⁷)，在位置199的赖氨酸残基(K199,Lys¹⁹⁹)，在位置239的苏氨酸残基(T239,Thr²³⁹)，在位置290的精氨酸残基(R290,Arg²⁹⁰)，以及在位置341的赖氨酸残基(K341,Lys³⁴¹)，其中编号相对于SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置。当用糜蛋白酶编号标示时，这些残基对应于D60,K60a,K60c,T99,R147和K192(图7)。与FVII/TFPI界面紧密接近的残基并且可以被修饰以导致立体位阻的残基是在基于成熟FVII编号的位置237的甘氨酸残基(G237,Gly²³⁷)，其对应于基于糜蛋白酶编号的G97(Gly⁹⁷)。

所述的残基可以被例如氨基酸置换、缺失或取代而修饰。或者，可以使用氨基酸插入以改变靶向氨基酸残基的构象或者在靶向氨基酸残基附近的蛋白质结构。例如，所述残基可以被另一个氨基酸置换或取代以破坏FVII与TFPI之间的相互作用，及抑制这两种蛋白质的有效结合，由此产生TFPI抗性修饰的FVII多肽。例如，涉及立体阻碍FVII和TFPI的相互作用的氨基酸的取代(即用另一个较大氨基酸取代Gly²³⁷(Gly⁹⁷))。在其它实施方案中，TFPI抗性修饰的FVII多肽可以通过用替代氨基酸置换接触残基而产生，由此在所述位置实现电荷逆转或电荷中和。这些类型的突变可以显著影响被取代的FVII氨基酸的静电作用并破坏接触残基与对应的TFPI接触残基的正常相互作用。例如，FVII中的带负电天冬氨酸残基可以正常情况下有利地与TFPI中的带正电精氨酸残基相互作用，其可以用带正电赖氨酸置换以便不仅消除原来的有利静电相互作用，而且在残基间产生排斥力并干扰蛋白质的有效结合。这一突变因此干扰蛋白质的有效结合。因此，带负电氨基酸(即酸性氨基酸)如天冬氨酸(Asp,D)或谷氨酸(Glu，E)可以用带正电氨基酸(即碱性氨基酸)如赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg,R)或组氨酸(His，H)取代。相反，碱性氨基酸如赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg,R)或组氨酸(His，H)可以用酸性氨基酸如天冬氨酸(Asp,D)或谷氨酸(Glu，E)取代。另外，任何接触残基可以用中心氨基酸如丙氨酸(Ala,A),酪氨酸(Tyr,Y)甲硫氨酸(Met,M),或亮氨酸(Leu,L),异亮氨酸(Ile,I),缬氨酸(Val,V),苯丙氨酸(Phe,F),脯氨酸(Pro,P)或甘氨酸(Gly,G),丝氨酸(Ser,S),苏氨酸(Thr,T),天冬酰胺(Asn,N),谷氨酰胺(Gln,Q),色氨酸(Trp,W)和半胱氨酸(Cys,C)取代。举例的中心氨基酸是疏水性氨基酸，其包括异亮氨酸(Ile,I),苯丙氨酸(Phe,F),缬氨酸(Val,V),亮氨酸(Leu,L),色氨酸(Trp,W),甲硫氨酸(Met,M),丙氨酸(Ala,A),甘氨酸(Gly,G),半胱氨酸(Cys,C)和酪氨酸(Tyr,Y)。

在一些实施方案中，成熟FVII编号的位置237的甘氨酸被置换，从而新的氨基酸导致立体位阻并抑制FVII和TFPI之间的相互作用。甘氨酸是最小的和最简单的氨基酸，仅在其侧链含有一个氢原子。由于其小尺寸，甘氨酸可以适合进小空间并且可以采取其它氨基酸不能采取的特定构象。用具有较大侧链的氨基酸取代在位置237的甘氨酸可以导致与FVII蛋白中的其它氨基酸的立体位阻，由此改变TFPI结合界面的构象，和/或导致与TFPI蛋白中的氨基酸的立体位阻。两种情况均可以导致FVII与TFPI的相互作用和结合受损，由此增加修饰的FVII多肽对TFPI的抑制作用的抗性。19个天然氨基酸的任一个均含有大于甘氨酸的侧链，可以用于修饰FVII多肽。举例的是色氨酸(Trp,W),异亮氨酸(Ile,I),缬氨酸(Val,V)和苏氨酸(Thr,T)。

在其它实例中，氨基酸插入被掺入FVII多肽中所述残基附近以干扰TFPI与FVII之间的相互作用。可以在FVII多肽中的一或多个位置插入一或多个氨基酸残基。例如酪氨酸残基可以插入在D196和K197(分别对应于基于糜蛋白酶编号的D60和K60a)之间。这一修饰为D196K197insY(即D196和K197是酪氨酸被插入其间(insY)的位置)。在另一个实例中，两个氨基酸残基被插入对于与TFPI的相互作用重要的位置。例如，丙氨酸和丝氨酸可以插入G237和T238(分别对应于基于糜蛋白酶编号的G97和T98)之间，导致修饰G237T238insAS。这种插入突变可以导致FVII与TFPI的相互作用和结合受损，由此增加修饰的FVII多肽对TFPI的抑制作用的抗性。

表5提供了在对应于SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置的所述残基处的举例性氨基酸置换的非限制性例子。如所示出的，这种FVII多肽设计用于提供抑制FVII/TFPI结合而增加对TFPI的抗性，并因此具有增加的凝血剂活性。在指明这种突变时，第一个氨基酸(单字母缩写)对应于被置换的氨基酸，数字对应于在SEQ ID NO:3的成熟FVII多肽中的位置，第二个氨基酸(单字母缩写)对应于选择用于置换在该位置的第一个氨基酸的氨基酸。用于突变的氨基酸位置也基于糜蛋白酶编号方案指出。在下表5中，序列标识符(SEQ ID NO)被标出，其中修饰的FVII多肽的举例氨基酸序列被示出，以及任何多肽标识编号。

表5

在进一步的实施方案中，可以产生组合突变体。包括在这种组合突变体中的是具有基于SEQ ID NO:3所示成熟FVII的编号的残基D196,K197,K199,G237,T239,R290或K341(分别对应于基于糜蛋白酶编号的D60,K60a,K60c,G97,T99,R147和K192)的两或多个突变的突变体。例如，修饰的FVII多肽可以具有在2、3、4、5、6或7个所述位置的氨基酸取代。如上所述，残基被置换，从而FVIIa和TFPI之间的有利的相互作用被消除，不利的相互作用被导入，或者在一或多个位置立体位阻被导入。因此，修饰的多肽可以显示1、2、3、4、5、6或7个突变，其提供立体位阻、电荷逆转、电荷中和或其它不利相互作用或其组合中的一或多种。例如，可以产生两个或多个突变，由此带负电氨基酸如天冬氨酸(Asp,D)或谷氨酸(Glu,E)可以被带正电氨基酸如赖氨酸(Lys,K),精氨酸(Arg,R)或组氨酸(His,H)取代，或反之，或者可以产生中性取代，通过用例如，丙氨酸(Ala,A),酪氨酸(Tyr,Y)甲硫氨酸(Met,M),或者亮氨酸(Leu,L),异亮氨酸(Ile,I),缬氨酸(Val,V),苯丙氨酸(Phe,F),脯氨酸(Pro,P)或者甘氨酸(Gly,G),丝氨酸(Ser,S),苏氨酸(Thr,T),天冬酰胺(Asn,N),谷氨酰胺(Gln,Q),色氨酸(Trp,W)和半胱氨酸(Cys,C)置换任何氨基酸，或其任何组合。中性氨基酸的举例是疏水性氨基酸，其包括异亮氨酸(Ile,I),苯丙氨酸(Phe,F),缬氨酸(Val,V),亮氨酸(Leu,L),色氨酸(Trp,W),甲硫氨酸(Met,M),丙氨酸(Ala,A),甘氨酸(Gly,G),半胱氨酸(Cys,C)和酪氨酸(Tyr,Y)。在另一个实例中，可以产生两个或多个突变，其中至少一个是电荷逆转或电荷中和，另一个是取代，用含有更大侧链的氨基酸如色氨酸(Trp,W)、异亮氨酸(Ile,I)、缬氨酸(Val,V)和苏氨酸(Thr,T)置换甘氨酸。在其它实例中，可以将插入突变包括在具有其它插入突变或具有一或多个氨基酸取代如导入FVII和TFPI之间的不利相互作用或立体位阻的修饰的FVII多肽中。使用上述表5示出的修饰可以在修饰的FVII多肽中包括任何组合置换。例如，本文提供的FVII多肽可以含有D196K和一或多个在氨基酸位置K197、K199、G237、T239、R290和/或K341的另外的置换修饰和/或在D196、K197和/或G237之后的插入。本领域技术人员用表5所示修饰可以容易地产生所有可能的组合。

例如，FVII变体包括那些变体，其包括基于SEQ ID NO:3所示的成熟FVII的编号的位置197的氨基酸取代作为它们的突变之一。任何氨基酸残基均可取代未修饰的FVII多肽中的位置197的赖氨酸。在一些实施方案中，所述赖氨酸被酪氨酸(Y),丙氨酸(A),谷氨酸(E),天冬氨酸(D),亮氨酸(L),甲硫氨酸(M),异亮氨酸(I),缬氨酸(V),苯丙氨酸(F),或色氨酸(W)残基置换。例如，修饰的FVII多肽的举例是含有取代K197L或K197E的多肽。在另一个实例中，含有在位置197的修饰(如置换、缺失或添加)的FVII多肽还可以包括在另一个位置的另一个修饰。通常这种其它修饰是在预期调节FVII与TFPI的相互作用的位置，例如通过除去有利的相互作用，产生不利的相互作用，导入立体位阻或其组合。包括在这种另外的修饰中的是在对应于D196,K199,G237,T239,R290或K341的氨基酸位置的修饰，如上所述。还涉及本领域已知的其它另外的修饰，如下所述。因此，除了在位置197的修饰之外，FVII多肽可以含有1、2、3、4、5、6或更多个氨基酸修饰。例如，具有至少在位置197的修饰的FVII变体的举例包括那些含有2个取代如D196F和K197E的变体，那些含有3个取代如D196R,K197M和K199E的变体，那些含有4个取代如D196R,K197E,K199E和R290E的变体，那些含有5个取代如K197L,K199D,G237T,R290D和K341Q的变体，那些含有6个取代如D196F,K197L,K199E,G237V,T239A和R290D的变体，及那些含有7个取代如D196Y,K197L,K199A,G237T,T239A,R290D和K341R的变体。包括基于SEQ ID NO:3所示成熟FVII的编号在位置197的氨基酸取代作为它们的取代之一的举例的FVII组合突变体包括在表6中。

含有在对应于SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置D196,K197,K199,G237,T239,R290或K341之一或多个氨基酸残基的两个或多个氨基酸置换的举例性FVII多肽是表6提供的那些。在表中，突变的氨基酸位置基于糜蛋白酶编号方案。这种修饰被设计用于通过抑制FVII结合TFPI而增加对TFPI的抗性，由此增加凝血活性。

表6

在上述残基含有一或多个氨基酸取代的FVII多肽也可以含有另外的突变，如在International Patent Publication No.WO2004/083361,Neuenschwander et al.,(1995)Biochemistry34:8701-8707,Chang et al.,(1999)Biochemistry38:10940-10948,and Iakhiaev et al.,(2001)Thromb.Haemost.85:458-463所述的那些。因此，在一个实施方案中，本文提供的FVII多肽可以在对应于SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置的Q176,D196K197,K199,G237,T239,R290,E296,K341和Q366的一或多个氨基酸残基含有一或多个氨基酸取代。例如，所述一或多个另外的突变可以包括但不限于Q176A,D196N,G237L,E296A,K341N,K341Q,K341E,Q366A,Q366E和Q366G的任一或多个。

b.抗凝血酶III(AT-III)

抗凝血酶III(也称为抗凝血酶或AT-III)是重要的抗凝血丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(丝氨酸蛋白酶抑制剂)。AT-III作为含有464个氨基酸残基(SEQ IDNO:122)的前体蛋白合成。在分泌过程中，32个残基的信号肽被裂解，产生432个氨基酸的成熟人抗凝血酶(SEQ ID NO:123)。58kDa AT-III糖蛋白在血液中循环并作为丝氨酸蛋白酶抑制剂(丝氨酸蛋白酶抑制蛋白)抑制凝血系统的大量丝氨酸蛋白酶。AT-III的主要靶是凝血酶和因子Xa，AT-III也示出抑制FIXa、FXIa、FXIIa的活性，及程度较轻地抑制FVIIa。AT-III的作用由糖胺聚糖如天然发生的类肝素硫酸酯或临床实践中广泛用作抗凝剂的各种组织衍生的肝素而大大增强。AT-III以高度特异方式结合肝素中的独特戊糖序列，诱导反应中心环中的构象变化。在这种构象中，AT-III的反应中心环可以更有效地与丝氨酸蛋白酶的反应位点相互作用，实现抑制。

AT-III正常情况下不抑制游离的血浆FVIIa，甚至在肝素存在下也不抑制，可能是由于FVIIa的酶原样构象阻止了与AT-III的有效相互作用。然而当FVIIa与TF复合时，AT-III的抑制作用确实增加。AT-III与TF/FVIIa复合物的结合可以从TF释放FVIIa，并保持其与AT-III呈无活性复合物。与单独FVIIa相比，AT-III对TF结合的FVIIa的增加的亲和性被假设反映了当其与TF复合时FVIIa的活性位点的成熟，因此使得其适于AT-III结合(Rao et al.(1993)Blood81:2600-2607)。因此AT-III对FVIIa的影响与FVIIa分子本身的固有活性成比例。当FVIIa保持其酶原样构象时，AT-III作用很小。但是如果FVIIa例如通过结合TF或通过特异性体外修饰而改变构象成为更活性形式时，AT-III抑制显著增加。被修饰而具有增加的固有活性的FVIIa多肽经常显示对AT-III抑制的敏感性同时增加。例如，修饰FVIIa的活化口袋中的一或多个氨基酸，例如通过对应于K337A,L305V,M298Q,V158D和E296V取代(相对于SEQ ID NO:3所示的成熟FVII序列)的氨基酸置换，导致FVIIa多肽对AT-III的敏感性增加，由此抑制FVIIa活性高达90%(Persson et al.(2001)PNAS98:13583-13588)。在另一个实例中，通过修饰参与FVIIa的α-螺旋的氨基酸而诱导更酶原样构象，在增加修饰的FVIIa蛋白的活性的同时，也增加其对AT-III的敏感性(Persson et al.(2004)Biochem J379:497-503)。

实现增加的对AT-III的抗性的修饰

可以对FVII多肽进行修饰以增加其对AT-III的抑制的抗性。通常，这种修饰的FVII多肽保持FVII多肽的至少一种活性。典型地，这种修饰包括在直接参与FVIIa(或TF/FVIIa复合物)与AT-III的相互作用的FVII多肽的任何位置的一或多个氨基酸取代，或者在影响直接参与FVIIa(或TF/FVIIa复合物)与AT-III的相互作用的残基的位置或构象的其它残基中的一或多个氨基酸取代。与未修饰的或野生型FVII多肽的抑制程度或抑制的二级速率常数相比，在体内、离体或体外，具有增加的对AT-III的抗性的修饰的FVII多肽可以显示在特定条件下AT-III所致抑制程度或抑制的二级速率常数降低至少大约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更多。修饰的FVII多肽因此对于AT-III针对凝血启动的天然抑制作用是抗性的。当在合适的体外或离体测定中评估时，如在作为促凝剂治疗剂给予对象后，修饰的AT-III抗性FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比显示增加的凝血剂活性。

如本文下述，本领域技术人员可以经验性或合理地涉及显示增加的对AT-III的抗性的修饰的FVII多肽。这种修饰的FVII多肽可以在本领域技术人员已知的测定中进行测试以确定是否这些修饰的FVII多肽显示增加的对AT-III的抗性。例如，可以测量这种修饰的FVIIa多肽的AT-III抑制的二级速率常数。通常具有增加的对AT-III的抗性的修饰的FVII多肽会显示在特定条件下(例如在给患者注射固定量的蛋白质后)降低的结合和/或降低的AT-III的抑制。典型地，这种测定在二条链形式的FVII上进行，如活化形式的FVII(FVIIa)。另外，确定AT-III的作用的测定通常在肝素的存在下及在组织因子的存在下进行，这种测定也可以在一种或这两种辅因子不存在下进行。

与未修饰的或野生型FVII多肽的抑制程度或抑制的二级速率常数相比，在体内或体外具有增加的对AT-III的抗性的修饰的FVII多肽可以显示在特定条件下AT-III所致抑制程度或抑制的二级速率常数降低至少大约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更多。在体内或体外这种所得的具有增加的对AT-III的抗性的修饰的FVII多肽与未修饰的或野生型FVII多肽的结合和/或亲和性相比可以显示对AT-III的结合和/或亲和性降低至少大约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更多。这种修饰的FVII多肽增加的对AT-III的抗性也可以表现为在AT-III存在下增加的凝血活性。在体内、离体或体外，AT-III修饰的FVII多肽的凝血活性与未修饰的或野生型FVII多肽的凝血活性相比可以增加至少大约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更多。

2.结合活化的血小板

也可以修饰FVII多肽以增加其在TF依赖性和/或TF不依赖性凝血启动过程中的凝血活性。这一提出的TF不依赖性凝血启动机制涉及FX和FIX被FVIIa直接活化(不与TF复合)，其在活化的血小板表面上实现。FVIIa通过FVIIa多肽的Gla结构域中的残基与血小板表面上表达的磷脂酰丝氨酸和其它带负电磷脂的小孩子在一而结合活化的血小板。这一相互作用相对较弱，很可能不在凝血中正常观测到的最初凝血酶脉冲产生中起显著作用，其很可能是TF依赖性活性的结果。如以上讨论，TF不依赖性凝血启动和FVIIa与血小板表面相对较弱的相互作用可以解释需要给予高剂量rFVIIa以实现临床效果。例如，血浆中的10nM FVII仅有大约1%以TF/FVIIa存在，但是rFVIIa的治疗剂量是90μg/kg或大约50nM于血浆中，远远超过这一水平。因此，高剂量的rFVIIa补偿了rFVIIa与活化的血小板的低亲和性结合，导致在治疗过程中足够的治疗凝血活性。因此，治疗感兴趣的是修饰的FVII多肽，其由于对活化的血小板的增加的结合和/或亲和性可以以更低剂量给予，足以实现凝血启动。本文提供的修饰的FVII多肽涉及用于通过修饰Gla结构域而显示对结合的血小板的增加的结合和/或亲和性。

维生素K依赖性血浆蛋白如FVII、FIX、FX、凝血酶原、C蛋白和S蛋白的γ-羧基化Gla结构域中的残基和膜表面上的带负电磷脂的相互作用对于止血是重要的。维生素K依赖性血浆蛋白的Gla结构域典型地含有大约45个氨基酸，其中9-12个谷氨酸残基被维生素K依赖性羧基化翻译后修饰而形成γ-羧基谷氨酸(Gla)。形成Gla结构域的氨基酸位于形成蛋白质的信号肽和前肽的氨基酸的直接之后，因此在前体多肽加工和裂解为成熟蛋白质后位于N末端。例如，形成FVII的Gla结构域的氨基酸在SEQ IDNO:1所示前体多肽的位置38-83，在SEQ ID NO:2所示前体多肽的位置61-105，在SEQ ID NO:3的成熟多肽的位置1-45.在这些中，在SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽的位置E6,E7,E14,E19,E20,E25,E26,E29和E35的10个谷氨酸残基被羧基化修饰产生γ-羧基谷氨酸(Gla)残基。

由于谷氨酸仅仅是弱的Ca²⁺螯合剂，而γ-羧基谷氨酸强得多，因此维生素K羧化酶进行的这一修饰步骤增加了蛋白质的Gla结构域的Ca²⁺结合亲和性。钙还结合FVIIa的蛋白酶结构域，在此其促进最佳活性所需的构象变化。通过与FVIIa的Gla和蛋白酶结构域中的位点的结合，钙增强与TF和磷脂的结合以及催化活化FX的效率。γ-羧基化Gla结构域以可变亲和性结合7个Ca²⁺离子，其诱导构象变化，使得Gla结构域与TF的C末端结构域相互作用。Ca²⁺结合还促进FVIIa与血小板膜上的带负电磷脂的相互作用，所述磷脂的大部分是磷脂酰丝氨酸。磷脂酰丝氨酸(PS)是带负电膜的关键成分，其支持凝血。在大多数细胞中，PS存在于细胞膜的内叶中，因此不暴露于血浆。特异的细胞过程如血小板活化导致PS转位到血浆方向的外表面，为维生素K依赖性蛋白的Gla结构域提供结合位点(Hemker et al.(1983)Blood Cells9:303-317)。

除了其产于FVIIa与TF和活化的血小板的相互作用之外，FVIIa的Gla结构域还参与FX的结合和活化中。这可以通过间接机制，其中FVIIa Gla结构域帮助将TF的Lys¹⁶⁵和Lys¹⁶⁶与FX的Gla结构域排列，这是FX活化为FXa的一个重要步骤。或者，FVIIa的Gla结构域直接与FX的Gla结构域相互作用以在活化前正确排列酶和底物(Neuenschwander et al.(1994)J Biol Chem269:8007-8013,Huang et al.(1996)J Biol Chem271:21752-21757)。FVIIa位置36的精氨酸已示出对于在磷脂不存在下FXGla结构域的有效锚定是重要的，证实FVIIa的Gla结构域参与与FX的蛋白质-蛋白质相互作用(Ruf et al.(1999)Biochemistry38:1957-1966)。

尽管不同维生素K依赖性血浆蛋白的Gla结构域显示显著同源性，但是它们与带负电磷脂膜的结合有非常不同的亲和性，解离常数(K_d)变化1000倍以上。在这些蛋白质中人FVII显示最低的对磷脂膜的亲和性之一(McDonald et al.(1997)Biochemistry36:5120-5127)。负责Gla结构域与PS的结合的精确相互作用尚未完全了解，但是看起来这一结构域内的各个氨基酸残基导致观测到的不同亲和性。早期研究表明位置10、32和33的氨基酸(相对于成熟FVII蛋白)与整体膜亲和性之间有相关性(McDonald etal.(1997)Biochemistry36:5120-5127)。随后的突变分析也揭示了特异的残基有助于结合亲和性。例如用脯氨酸置换成熟形式C蛋白的位置10的组氨酸导致膜亲和性降低3倍(Shen et al.(1997)Biochemistry36:16025-16031)。相反，维生素K依赖性血浆蛋白的Gla结构域中特异残基的突变可以产生具有更高膜亲和性和增强的功能的蛋白质。在Gla结构域内某些位置的突变的作用在不同蛋白质之间却不是必需是保守的。例如，Q32E和N33D取代的牛C蛋白突变介导了膜结合中的大幅度增加，而在人C蛋白中的对应突变显示很小的结合变化。人FVII的类似突变(K32E)导致与野生型FVII蛋白相比结合亲和性增加13倍(Harvey et al.(2003)J Biol Chem278:8363-8369)。

a.通过导入异源Gla结构域的修饰

由于其对活化的血小板的相对低的结合亲和性，FVII的Gla结构域是修饰的靶，目的在于增强修饰的FVII和磷脂膜之间的相互作用，由此增加凝血活性。修饰可以通过取代参与这一相互作用的特异氨基酸而实现(见例如Shah et al.PNAS95:4429-4234,Harvey et al.(2003)J Biol Chem278:8363-8369)。或者，修饰可以通过用另一种维生素K依赖性蛋白质的Gla结构域取代完整Gla结构域即Gla结构域交换而实现。这种类型的修饰产生嵌合蛋白，如当C蛋白的Gla结构域用FVII的Gla结构域置换时所产生的那样(Geng et al.(1997)Thromb Haemost77:926-933)。

典型地，这种修饰包括导入，如通过添加或取代异源Gla结构域或其实现磷脂结合的足够部分进入FVII多肽的区域以产生嵌合的修饰的FVII多肽。通常，这种嵌合FVII多肽保留至少一种FVII的活性。Gla修饰的FVII多肽对活化的血小板的结合和/或亲和性与未修饰的或野生型FVII多肽的体外或体内结合和/或亲和性相比可以增加至少或大约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更多。修饰的FVII多肽对活化的血小板的结合和/或亲和性还可以体现为增加的凝血活性。Gla修饰的FVII多肽的凝血活性与未修饰的或野生型FVII多肽的体内或体外凝血活性相比可以增加至少或大约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更多。

包含在任何多肽内的Gla结构域或其足够部分可以用作异源Gla结构域的来源以导入或置换FVII多肽的区域。典型地，这种异源Gla结构域显示对磷脂的结合亲和性，例如存在于活化的血小板表面上的磷脂。通常，异源Gla结构域的选择是与FVII的Gla结构域的亲和性相比显示更高的对磷脂的亲和性的Gla结构域。用作修饰FVII多肽的异源结构域的精确Gla结构域或其足够部分可以合理地或经验性确定。其它的含有Gla的多肽的举例包括但不限于FIX、FX、凝血酶原、C蛋白、S蛋白、骨钙素、基质Gla蛋白、生长停滞特异性蛋白6(Gas6)和Z蛋白。这些举例蛋白质的Gla结构域SEQ ID NO:110-118,120和121所示。例如，异源Gla结构域的2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40或更多个连续氨基酸或者完整Gla结构可以被导入FVII多肽。另外，将Gla结构域导入FVII多肽也可以包括不是异源多肽的Gla结构域的部分的额外氨基酸，只要所述额外氨基酸不显著削弱导入的Gla结构域的磷脂结合活性即可。

在一些实例中，导入是通过将Gla结构域添加至FVII多肽而进行，从而异源Gla结构域被插入内源Gla结构域或插入FVII多肽的另一区域或结构域，只要所述修饰的FVII多肽保留至少一种FVII的活性即可。在这种实例中，FVII多肽的天然Gla结构域被保留在多肽中，尽管在一些情况中组成天然Gla结构域的氨基酸序列被中断。在其它实例中，异源Gla结构域或其足够部分被插入到天然Gla结构域的N末端或C末端邻近，从而天然Gla结构域不被中断。在另一个实例中，异源Gla结构域或其足够部分被插入FVII多肽的另一个结构域中。

本文还提供了修饰的Gla结构域FVII多肽，其中FVII的内源Gla结构域的全部或邻近部分(contiguous portion)被除去并用异源Gla结构域或其足够部分置换以实现磷脂结合，只要所述修饰的FVII多肽保留至少一种FVII活性即可。这种修饰也被称为Gla结构域交换。例如，对应于SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的氨基酸1-45的全部或部分FVII Gla结构域，如SEQ IDNO:119所示，可以从FVII多肽除去并用异源Gla结构域或其足够部分置换。所述异源部分包括本领域技术人员已知的结合磷脂的任何Gla结构域，包括但不限于具有SEQ ID NO:110-118,120和121任一所示氨基酸序列的Gla结构域。在一些情况中，实现磷脂结合的足够部分的Gla结构域，如SEQ ID NO:110-118,120和121任一的足够部分可以置换FVII的内源Gla结构域，或内源Gla结构域的一部分。例如，FVII的Gla结构域可以用SEQID NO:113所示C蛋白的Gla结构域交换。所得修饰的FVII多肽含有来自C蛋白的Gla结构域，之后是其自己的EGF-1,EGF-2和丝氨酸蛋白酶结构域。

在一些实例中，异源Gla结构域含有进一步实现由于增加的磷脂结合所致的与活化的血小板的增加的结合的突变。例如，如果C蛋白Gla结构域被导入以产生修饰的FVII多肽，所述C蛋白Gla结构域可以含有赋予增加的磷脂结合的突变。

在其它实例中，异源Gla结构域可以含有赋予Gla结构域FVII样功能的进一步突变。例如，如上所述，SEQ ID NO:119所示FVII Gla结构域的R36可以参与与FX的相互作用。因此，异源Gla结构域可以含有进一步的修饰，如保持如SEQ ID NO:3所示的成熟FVII多肽的位置36为精氨酸所需的任何修饰，或者保持修饰的FVIIa多肽的FX活化性质所需的任何其它修饰(Ruf et al.(1999)Biochem38:1957-1966)。因此，在一些实例中，对应于R36的突变可以在异源Gla结构域中产生。对应的位置可以由本领域技术人员如根据氨基酸序列对比而确定。

如下所述，本领域技术人员可以实验性或合理地设计含有异源Gla结构域的修饰的FVII多肽，从而所得FVII多肽保持至少一种FVII活性。典型地，这种修饰的FVII多肽保持其结合和活化FX的能力。在一些情况中，这种修饰的FVII多肽还保持其结合和活化FIX的能力。所得Gla修饰的FVII多肽包括保持其结合TF的能力的那些多肽。Gla-交换的修饰的FVII多肽还包括在不存在TF时具有增加的固有活性的那些多肽。因此，所得的Gla修饰的FVII多肽包括那些不结合TF或者与野生型FVIIa相比结合TF很弱的那些多肽。典型地，这种修饰的FVII多肽展示增加的磷脂结合。特别地，这种修饰的FVII多肽显示增加的与磷脂酰丝氨酸的结合。增加的与磷脂的结合可以在分离的磷脂上或者在活化的血小板表面上测定。这种测定典型地在二条链形式的FVII上进行，如活化修饰的FVII(FVIIa)。

本文提供了含有异源Gla结构域的修饰的FVII多肽。这种修饰的FVII多肽的举例是其中内源Gla结构域被FIX(SEQ ID NO:110)、FX(SEQ IDNO:111)、凝血酶(SEQ ID NO:112)、C蛋白(SEQ ID NO:113)或S蛋白(SEQ ID NO:114)之任一的Gla结构域的全部或一部分置换的那些多肽。这种修饰的FVII多肽可以显示增加的与活化的血小板的结合，导致增加的凝血剂活性。表7示出可以在FVII多肽中进行的举例性修饰以将内源性Gla结构域用FIX、FX、C蛋白、S蛋白或凝血酶的置换。该表提供了修饰的名称(例如Gla Swap FX)及修饰细节，包括外源Gla结构域插入FVII多肽的氨基酸位置，以及外源Gla结构域的序列。也提供了序列标识符(SEQ ID NO)，其中示出修饰的FVII多肽的举例性氨基酸序列，以及任何多肽鉴别编号。例如，“Gla swap FIX”修饰(A1Y44delinsYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQY)涉及通过缺失氨基酸残基A1-Y44(对应于SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽的残基)而缺失内源性FVII Gla结构域以及插入对应于SEQ IDNO:110所示FIX Gla结构域的氨基酸残基Y1-Y45的45个氨基酸残基。类似地，Gla Swap FX修饰涉及缺失氨基酸残基A1-Y44(对应于SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽的残基)和插入对应于SEQ ID NO:111所示FX Gla结构域的A1-Y44的44个氨基酸氨基。Gla Swap Thrombin修饰涉及缺失氨基酸残基A1-Y44(对应于SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽的残基)和插入对应于SEQ ID NO:112所示凝血酶Gla结构域的Y1-Y44的44个氨基酸氨基。GlaSwap Prot C修饰涉及缺失氨基酸残基A1-Y44(对应于SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽的残基)和插入对应于SEQ ID NO:113所示C蛋白Gla结构域的A1-H44的44个氨基酸氨基。Gla Swap Prot S修饰涉及缺失氨基酸残基A1-Y44(对应于SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽的残基)和插入对应于SEQID NO:114所示S蛋白Gla结构域的Y1-Y44的44个氨基酸氨基。

表7

含有异源Gla结构域的修饰的FVII多肽可呈现出与野生型FVII分子如相比在较低剂量增强的凝血活性，由于与活化的血小板的结合和/或亲和性增加所致。Gla-修饰的FVII多肽的凝血活性与未修饰或野生型FVII多肽的凝血活性相比可以增加至少或大约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%或更多，无论在体内、离体或者在体外。

3.组合的及额外的修饰

除了FVII多肽修饰以增加TFPI抗性、增加AT-III抗性、增强TF依赖性和/或TF非依赖性催化活性、改良药动学性质如延长半衰期和/或增加与磷脂膜的结合和/或亲和性之外，本发明提供的修饰的FVII多肽还包括呈现一种以上上述性质的那些多肽。例如，FVII多肽可以这样被修饰，由此所得多肽表现出与磷脂的结合和/或亲和性增加，以及也表现出TFPI抗性增加。因此，可以通过导入来自另一维生素K依赖性血浆蛋白的异源Gla结构域以及通过取代SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽第196、197、199、237、239、290或者341位的任一或多个氨基酸进行修饰FVII多肽。

此外，本发明提供的任何修饰的FVII多肽也可以含有本领域所述的一或多个其它修饰。典型地，这种额外的修饰是其自身导致修饰的多肽的凝血活性增强和/或多肽的稳定性增加的那些修饰。因此，所得修饰的FVII多肽呈现出凝血活性增强。所述额外的修饰可包括例如本领域已知的特别是增强所述FVII多肽的凝血活性和/或稳定性的的任何氨基酸取代、缺失或插入。本发明提供的任何修饰的FVII多肽可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或者更多个氨基酸修饰，只要所得修饰的FVII多肽保留野生型或者未修饰多肽的FVII活性即可。

在一个实例中，可以对FVII多肽序列进行额外修饰，由此改变其与其它因子、分子和蛋白质的相互作用。例如，可以置换参与与组织因子(TF)相互作用的氨基酸残基，由此增加修饰的FVII多肽与TF的亲和性。其它修饰包括但不限于参与与因子X、因子IX、TFPI和AT-III相互作用的氨基酸修饰。

也可以对本发明提供的修饰的FVII多肽进行额外修饰，以改变该多肽的构象或折叠。这些修饰包括例如用半胱氨酸置换一或多个氨基酸，由此形成新的二硫键，或者稳定α-螺旋构象的修饰，从而使得修饰的FVII多肽活性增强。

也可以对FVII多肽进行额外修饰以进行翻译后修饰。例如，可以对多肽进行修饰以使其包含额外的糖基化位点，由此所得修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比糖基化水平增加。也可以进行导入氨基酸残基的修饰，所述残基随后与如增加修饰的FVII多肽稳定性的化学成分连接。也可以通过修饰内源蛋白酶的潜在裂解位点改变FVII多肽，从而降低FVIIa变体的降解并增强修饰的FVII多肽的稳定性。

另外，可以在内源或者异源Gla结构域中进行氨基酸取代、缺失或插入，由此修饰的FVII多肽表现出与磷脂膜的结合和/或亲和性增加。在其它实例中，本发明提供的修饰的FVII多肽可以表现出内源Gla结构域中的缺失，或者通常被γ-羧化的位置中的取代(US20070037746)。

如下章节描述了本领域所述使得FVII多肽的稳定性和/或凝血活性增加的举例的修饰。如上所述，这种修饰也可以另外包含于本发明提供的任何修饰的FVII多肽中。下文提及的氨基酸位置对应于SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽中的氨基酸位置。可以在其它FVII多肽中进行对应突变，如SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽的等位基因、种或剪接变体。

a.增加内在活性的修饰

在一个实例中，可以对本发明提供的因子VII多肽进行额外修饰，使得其对于因子X和/或因子IX的催化活性增加。例如，可以对参与与其辅因子如TF相互作用的氨基酸进行修饰，由此所得修饰的FVII多肽对于TF的亲和性增加，从而表现出对于FX和/或FIX的活性增加。也可以对FVII多肽的活化包(activation pocket)进行修饰，由此修饰的FVII多肽对于FX和/或FIX的内在活性与未修饰的多肽的活性相比增加。导致活性增加的另一修饰策略包括对FVII多肽的修饰，由此蛋白质的折叠和构象被改变为更活性形式，或者高活性与无活性(或者低活性)构象之间平衡被改变为高活性构象。更活性的多肽也可以通过修饰参与FVII多肽β-链的氨基酸获得。例如，可以进行导入新半胱氨酸对的氨基酸取代，其可形成新二硫键，可以发挥“锁定”修饰的FVII多肽处于更活性形式。

包含在本发明提供的修饰的FVII多肽中增加修饰的FVII多肽的内在活性的额外修饰的例子包括但不限于在Persson et al.(2004)Biochem J.379:497-503,Maun et al.(2005)Prot Sci14:1171-1180、Persson et al.(2001)PNAS98:13583-13588、Persson et al.(2002)Eur J Biochem269:5950-5955、Soejima et al.(2001)J Biol Chem276:17229-17235、Soejima et al.(2002)JBiol Chem277:49027-49035、WO200183725、WO2002022776、WO2002038162、WO2003027147、WO200338162、WO2004029090、WO2004029091、WO2004108763和WO2004111242中所述那些修饰。可导致修饰的FVII多肽内在活性增加的本领域描述的氨基酸修饰非限制性例如包括如下任一或多个修饰：S278C/V302C、L279C/N301C、V280C/V301C、S281C/V299C、S314E、L39E、L39Q、L39H、I42R、S43Q、S53N、K62E、K62R、K62D、K62N、K62Q、K62T、L65Q、L65S、F71D、F71Y、F71E、F71Q、F71N、P74S、P74A、A75E、A75D、E77A、E82Q、E82N、T83K、E116D、K157V、K157L、K157I、K157M、K157F、K157W、K157P、K157G、K157S、K157T、K157C、K157Y、K157N、K157E、K157R、K157H、K157D、K157Q、V158L、V158I、V158M、V158F、V158W、V158P、V158G、V158S、V158T、V158C、V158Y、V158N、V158E、V158R、V158K、V158H、V158D、V158Q、A274M、A274L、A274K、A274R、A274D、A274V、A274I、A274F、A274W、A274P、A274G、A274T、A274C、A274Y、A274N、A274E、A274H、A274S、A274Q、F275H、E296V、E296L、E296I、E296M、E296F、E296W、E296P、E296G、E296S、E296T、E296C、E296Y、E296N、E296K、E296R、E296H、E296D、E296Q、M298Q、M298V、M298L、M298I、M298F、M298W、M298P、M298G、M298S、M298T、M298C、M298Y、M298N、M298K、M298R、M298H、M298E、M298D、R304Y、R304F、R304L、R304M、L305V、L305Y、L305I、L305F、L305A、L305M、L305W、L305P、L305G、L305S、L305T、L305C、L305N、L305E、L305K、L305R、L305H、L305D、L305Q、M306D、M306N、D309S、D309T、S314A、S314V、S314I、S314M、S314F、S314W、S314P、S314G、S314L、S314T、S314C、S314Y、S314N、S314E、S314K、S314R、S314H、S314D、S314Q、D334G、D334E、D334A、D334V、D334I、D334M、D334F、D334W、D334P、D334L、D334T、D334C、D334Y、D334N、D334K、D334R、D334H、D334S、D334Q、S336G、S336E、S336A、S336V、S336I、S336M、S336F、S336W、S336P、S336L、S336T、S336C、S336Y、S336N、S336K、S336R、S336H、S336D、S336Q、K337L、K337V、K337I、K337M、K337F、K337W、K337P、K337G、K337S、K337T、K337C、K337Y、K337N、K337E、K337R、K337H、K337D、K337Q、F374P、F374A、F374V、F374I、F374L、F374M、F374W、F374G、F374S、F374T、F374C、F374Y、F374N、F374E、F374K、F374R、F374H、F374D、F374Q，以及用来自胰蛋白酶、凝血酶或者FX的对应氨基酸在300-322、305-322、300-312或者305-312位置的取代，以及用来自胰蛋白酶的对应氨基酸在310-329、311-322或者233-329位置的取代。

b.增加蛋白酶抗性的修饰

本发明提供的修饰的FVII多肽也可含有导致多肽对于蛋白酶的抗性增加的额外修饰。例如，可以进行氨基酸取代以除去一或多个潜在蛋白酶裂解位点。修饰的FVII多肽可因此对于蛋白酶抗性更强，从而增加修饰的多肽的稳定性和半衰期。

可包含在本发明提供的修饰的的FVII多肽中增加蛋白酶抗性的额外修饰的例子包括但不限于在美国专利No.US5580560或者国际公开申请No.WO1988010295和WO2002038162中所述那些修饰。本领域描述的可导致修饰的多肽对于抑制剂和/或蛋白酶的抗性增加的修饰非限制性例如包括如下任一或多个修饰：K32Q、K32E、K32G、K32H、K32T、K32A、K32S、K38T、K38D、K38L、K38G、K38A、K38S、K38N、K38H、I42N、I42S、I42A、I42Q、Y44N、Y44S、Y44A、Y44Q、F278S、F278A、F278N、F278Q、F278G、R290G、R290A、R290S、R290T、R290K、R304G、R304T、R304A、R304S、R304N、R315G、R315A、R315S、R315T、R315Q、Y332S、Y332A、Y332N、Y332Q、Y332G、K341E、K341Q、K341G、K341T、K341A和K341S。

c.增加与磷脂亲和性的修饰

FVII多肽的凝血活性可以通过增加该多肽与磷脂的结合和/亲和性而增强，所述磷脂如在活化的血小板表面上表达的那些磷脂。例如，可以在FVII多肽的内源Gla结构域中特定位置进行额外氨基酸取代，导致修饰的FVII多肽结合磷脂酰丝氨酸及其它负电荷磷脂的能力增强。因此，这种修饰也可以包含在本发明提供的修饰的FVII多肽中，条件是这种修饰的FVII多肽具有内源Gla结构域，即未进行导致内源Gla结构域由另一维生素K依赖性蛋白质的结构域取代的修饰。

增加磷脂结合和/或亲和性且可以对本发明提供的含有内源FVII Gla结构域修饰的FVII多肽进行的额外修饰的例子包括但不限于Harvey et al.(2003)J Biol Chem278:8363-8369,US20030100506、US20040220106、US20060240526、US6017882、US6693075、US6762286、WO200393465和WO2004111242中所述那些修饰。这种修饰的例子包括如下任一或多种修饰：在第4位插入酪氨酸，或者如下任一或多种修饰：P10Q、P10E、P10D、P10N、R28F、R28E、K32E、K32D、D33F、D33E、D33K A34E、A34D、A34I、A34L、A34M、A34V、A34F、A34W、A34Y、R36D、R36E、K38E和K38D。

d.改变糖基化的修饰

本领域已经描述了改变蛋白质的糖基化水平作为降低免疫原性、增加稳定性、降低给药频率和/或减少不利的副作用如炎症的方式。这个目的通常通过增加糖基化水平实现。糖基化位点提供了碳水化合物部分在多肽上附着的部位，由此当所述多肽在能糖基化的真核细胞中产生时被糖基化。

在FVII中有四个天然发生的糖基化位点：两个N-糖基化位点在N145和N322，两个O-糖基化位点在S52和S60，对应SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽中氨基酸位置。在一个实施方案中，可以对本发明提供的修饰的FVII多肽进行额外修饰，由此在上述位点的糖基化被破坏。这可以导致修饰的FVII多肽具有增加的凝血活性(见例如WO2005123916)。本领域描述的可导致修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比糖基化水平降低及活性增加的修饰非限制性例子包括但不限于如下修饰：N145Y、N145G、N145F、N145M、N145S、N145I、N145L、N145T、N145V、N145P、N145K、N145H、N145Q、N145E、N145R、N145W、N145D、N145C、N322Y、N322G、N322F、N322M、N322S、N322I、N322L、N322T、N322V、N322P、N322K、N322H、N322Q、N322E、N322R、N322W和N322C。

在另一个实施方案中，可以对本发明提供的修饰的FVII多肽的氨基酸序列进行进一步修饰，由此导入额外的糖基化位点，因此修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比糖基化水平增加。所述糖基化位点可以是N-连接的或者O-连接的糖基化位点。可以对FVII多肽进行的导入一或多个新糖基化位点的修饰的例子包括但不限于在US6806063和WO200393465中描述的那些修饰。本领域描述的可导致修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比糖基化水平增加的修饰的非限制性例子包括但不限于如下修饰：F4S、F4T、P10N、Q21N、W41N、S43N、A51N、G58N、L65N、G59S、G59T、E82S、E82T、N95S、N95T、G97S、G97T、Y101N、D104N、T106N、K109N、G117N、G124N、S126N、T128N、A175S、A175T、G179N、I186S、I186T、V188N、R202S、R202T、I205S、I205T、D212N、E220N、I230N、P231N、P236N、G237N、V253N、E265N、T267N、E270N、R277N、L280N、G291N、P303S、P303ST、L305N、Q312N、G318N、G331N、D334N、K337N、G342N、H348N、R353N、Y357N、I361N、V376N、R379N、M391N、K32N/A34S、K32N/A34T、F31N/D33S、F31N/D33T、I30N/K32S、I30N/K32T、A34N/R36S、A34N/R36T、K38N/F40S、K38N/F40T、T37N/L39S、T37N/L39T、R36N/K38S、R36N/K38T、L39N/W41S、L39N/W41T、F40N/I42S、F40N/I42T、I42N/Y44S、I42N/Y44T、Y44N/D46S、Y44N/D46T、D46N/D48S、D46N/D48T、G47N/Q49S、G47N/Q49T、K143N/N145S、K143N/N145T、E142N/R144S、E142N/R144T、L141N/K143S、L141N/K143T、I140N/E142S/、I140N/E142T、R144N/A146S、R144N/A146T、A146N/K148S、A146N/K148T、S147N/P149S/、S147N/P149T、R290N/A292S、R290N/A292T、D289N/G291S、D289N/G291T、L288N/R290S、L288N/R290T、L287N/D289S、L287N/D289、A292N/A294S、A292N/A294T、T293N/L295S、T293N/L295T、R315N/V317S、R315N/V317T、S314N/K316S、S314N/K316T、Q313N/R315S、Q313N/R315T、K316N/G318S、K316N/G318T、V317N/D319S、V317N/D319T、K341N/D343S、K341N/D343T、S339N/K341S、S339N/K341T、D343N/G345S、D343N/G345T、R392N/E394S、R392N/E394T、L390N/R392S、L390N/R392T、K389N/M391S、K389N/M391T、S393N/P395S、S393N/P395T、E394N/R396S、E394N/R396T、P395N/P397S、P395N/P397T、R396N/G398S、R396N/G398T、P397N/V399S、P397N/V399T、G398N/L400S、G398N/L400T、V399N/L401S、V399N/L401T、L400N/R402S、L400N/R402T、L401N/A403S、L401N/A403T、R402N/P404S、R402N/P404T、A403N/F405S、A403N/F405T、P404N/P406S和P404N/P406T。

e.促进化学基团连接的修饰

也可以对本发明提供的修饰的FVII多肽进行额外修饰以促进随后的化学基团连接。可以进行一或多个氨基酸取代或插入，由此化学基团通过取代的氨基酸与修饰的FVII多肽连接。例如，可以将半胱氨酸导入修饰的FVII多肽，聚乙二醇(PEG)部分可以与其连接使得稳定性增加和血清半衰期延长。其它附着残基包括赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基。在一些实施方案中，氨基酸残基被置换以降低潜在连接位置数目。例如，赖氨酸数目降低。可以对FVII多肽的氨基酸序列进行的可促进随后与化学基团连接的修饰的例子包括但不限于在US20030096338、US20060019336、US6806063、WO200158935和WO2002077218中所述那些修饰。可促进随后与化学基团连接的FVII多肽的修饰的非限制性例子包括但不限于如下修饰：Q250C、R396C、P406C、I42K、Y44K、L288K、D289K、R290K、G291K、A292K、T293K、Q313K、S314K、R315K、V317K、L390K、M391K、R392K、S393K、E394K、P395K、R396K、P397K、G398K、V399K、L400K、L401K、R402K、A403K、P404K、F405K、I30C、K32C、D33C、A34C、T37C、K38C、W41C、Y44C、S45C、D46C、L141C、E142C、K143C、R144C、L288C、D289C、R290C、G291C、A292C、S314C、R315C、K316C、V317C、L390C、M391C、R392C、S393C、E394C、P395C、R396C、P397C、G398C、V399C、L401C、R402C、A403C、P404C、I30D、K32D、A34D、T37D、K38D、W41D、Y44D、S45D、D46C、L141D、E142D、K143D、R144D、L288D、R290D、G291D、A292D、Q313D、S314D、R315D、K316D、V317D、L390D、M391D、R392D、S393D、P395D、R396D、P397D、G398D、V399D、L401D、R402D、A403D、P404D、I30E、K32E、A34E、T37E、K38E、W41E、Y44E、S45E、D46C、L141E、E142E、K143E、R144E、L288E、R290E、G291E、A292E、Q313E、S314E、R315E、K316E、V317E、L390E、M391E、R392E、S393E、P395E、R396E、P397E、G398E、V399E、L401E、R402E、A403E、P404E、K18R、K32R、K38R、K62R、K85R、K109R、K137R、K143R、K148R、K157R、K161R、K197R、K199R、K316R、K337R、K341R、K389R、K18Q、K32Q、K38Q、K62Q、K85Q、K109Q、K137Q、K143Q、K148Q、K157Q、K161Q、K197Q、K199Q、K316Q、K337Q、K341Q、K389Q、K18N、K32N、K38N、K62N、K85N、K109N、K137N、K143N、K148N、K157N、K161N、K197N、K199N、K316N、K337N、K341N、K389N、K18H、K32H、K38H、K62H、K85H、K109H、K137H、K143H、K148H、K157H、K161H、K197H、K199H、K316H、K337H、K341H和K389H。

f.举例的组合修饰

本发明提供了修饰的FVII多肽，其具有设计为影响未修饰的FVII多肽的一或多种性质或活性的两或多个修饰。在一些实例中，所述两或多个修饰改变FVII多肽的两或多种性质或活性。可以对FVII多肽进行修饰，由此改变如下一或多种性质或活性：TFPI抗性，AT-III抗性，内在活性，蛋白质裂解(amidolytic)活性，催化活性(存在或不存在TF)，磷脂结合和/或亲和性，糖基化，蛋白酶抗性，半衰期，以及与其它因子或分子如FX和FIX的相互作用和/或活化。典型地，组合所述两或多个修饰，由此所得修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比凝血活性增加、凝血活性持续时间延长和/或治疗指数增强。修饰的FVIIa多肽可呈现出在体外、离体或者体内更快速起始凝血活性。所述修饰可包括氨基酸取代、插入或者缺失。含有两或多个修饰的修饰的FVII多肽的凝血活性增加、凝血活性持续时间延长、凝血活性起始加速和/或治疗指数增强与起始或未修饰的FVIIa多肽的活性相比可增加至少或大约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、300%、400%、500%或更多。

本发明提供了含有导入未修饰的FVII多肽中的改变两或多种活性或性质的两或多个修饰的修饰的FVII多肽。修饰的FVII多肽可含有2、3、4、5、6或者更多个修饰。此外，每个修饰均可包含一或多个氨基酸残基。例如，修饰的FVII多肽可含有两个修饰，每个修饰均是单一氨基酸取代。在另一实例中，修饰的FVII多肽可含有两个修饰，其一是单一氨基酸取代，另一个包含多于一个的氨基酸残基缺失及然后插入多于一个的氨基酸残基。例如，本发明提供的修饰的FVII多肽可含有氨基酸取代M298Q(对应SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽残基)以增加内在活性，以及Gla Swap FIX修饰，其包含由于氨基酸残基A1-Y44缺失所致内源FVII Gla结构域的缺失(对应SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽残基)，以及插入45个氨基酸残基，其对应SEQ ID NO:110所示FIX Gla结构域的Y1-Y45氨基酸残基。

本发明提供的修饰的FVII多肽可具有单独选自表5-8所示那些修饰的两或多个修饰。在其它实例中，修饰的FVII多肽含有两或多个修饰，其中一或多个修饰选自表5-8所示那些修饰，以及一或多个修饰是不在表5-8所示那些修饰中的额外修饰，例如本领域描述的修饰。在一些实例中，所述一或多个修饰可选自上述章节D.3.a-e所示那些修饰。例如，修饰的FVII多肽可含有在基于SEQ ID NO:3所示成熟FVII多肽编号的D196、K197、K199、G237、T239、R290或者K341等一或多个氨基酸残基的修饰(基于糜蛋白酶编号，分别对应D60、K60a、K60c、G97、T99、R147和K192)，这种修饰可增加TFPI抗性；以及含有影响内在活性的一或多个氨基酸残基修饰，如V158和M298(基于糜蛋白酶编号，分别对应V21和M156)。例如，修饰的FVII多肽可含有增加TFPI抗性的两个氨基酸取代，如K197E和G237V，以及增加内在活性的一个氨基酸取代，如M298Q，导致FVII多肽凝血活性增强。

表9中提供了组合修饰的非限制性例子。这些举例的组合修饰包括被设计为改变FVII多肽的两或多种活性或性质的两或多个修饰，所述活性或性质包括但不限于：TFPI抗性，AT-III抗性，内在活性，蛋白质裂解活性，催化活性(存在或不存在TF)，磷脂结合和/或亲和性，糖基化，蛋白酶抗性，半衰期，以及与其它因子或分子如FX和FIX的相互作用和/或活化。含有这种组合修饰的修饰的FVII多肽可具有增加的凝血活性，延长的凝血活性持续时间，加快的凝血活性起始和/或增强的治疗指数。下表8中示出的修饰使用与上表5-7相同命名和编号系统。例如，“Gla Swap FIX”修饰包含由于氨基酸残基A1-Y44的缺失所致内源FVII Gla结构域的缺失(对应SEQID NO:3所示成熟FVII多肽残基)以及插入45个氨基酸残基，对应SEQ IDNO:110所示FIX Gla结构域的氨基酸残基Y1-Y45。氨基酸位置对应SEQ IDNO:3所示成熟FVII多肽的氨基酸位置，也称作糜蛋白酶编号方案。在下表9中，确定序列标识符(SEQ ID NO)，其中示出了举例的修饰的FVII多肽的氨基酸序列，以及任何多肽鉴别编号。

表8

E.修饰FVII的设计与方法

本发明提供了修饰的FVII多肽。所述FVII多肽被修饰，由此其可呈现出与未修饰的FVII多肽相比一或多种活性或性质被改变。由于修饰的结果而可以被改变的活性和性质包括但不限于凝血或者促凝剂活性；促凝血活性；蛋白质水解或者催化活性，如使得因子X(FX)活化或者因子IX(FIX)活化的活性；抗原性，如通过结合或者与多肽竞争结合抗FVII抗体的能力评估；结合组织因子、因子X或者因子IX的能力；结合磷脂的能力；半衰期；三维结构；pI；和/或构象。本发明提供的修饰的FVII多肽是凝血活性增加的那些多肽。在这些多肽中是其凝血活性得自或者包含修饰的FVII对于TFPI抗性增加、对于AT-III抗性增加、药动学性质改良如半衰期延长、催化活性增加和/或与活化的血小板结合增加的那些多肽。本文提供了举例的鉴别这种修饰的FVII多肽和修饰的多肽的方法。例如，呈现出TFPI抗性增加、AT-III抗性增加和/或与活化的血小板结合增加的修饰的FVII多肽可以通过如下方法合理地或者根据经验产生：(a)合理地靶向预期参与这种性质位点，或者(b)在功能测定中根据经验检测修饰的FVII多肽的TFPI抗性、AT-III抗性、改良的药动学性质如延长的半衰期，和/或与磷脂或活化的血小板结合增加。在许多情况中，合理与经验设计方案组合可用于产生修饰的FVII多肽。

一旦使用合理或经验方法鉴别了进行修饰的结构域、区域或者氨基酸，可应用本领域已知的任何方法在靶蛋白中产生任一或多个氨基酸突变。所述方法包括对编码核酸分子的标准定位诱变(使用例如得自Stratagene的QuikChange试剂盒)，或者通过固相多肽合成方法。此外，本发明提供的修饰的嵌合蛋白(即Gla结构域swap)可以通过常规重组DNA技术产生。例如，嵌合多肽可以通过使用限制酶及克隆方法产生，以亚克隆希望的嵌合多肽成分。一旦鉴别和产生，随后可以评估修饰的FVII多肽的活性，如催化活性或者凝血活性，使用本领域已知或者下文描述的任一或多种测定法进行。

1.理性(Rational)

在一些实例中，本发明提供的修饰的FVII多肽通过合理修饰设计以增加凝血活性。在这种方法中，已知或者可以合理确定与FVII多肽活性相关的结构域、区域或者氨基酸。例如，公有领域中各种数据库提供了野生型FVII的序列和结构域信息(见例如the ExPASy Proteomics serverca.expasy.org)。可以访问公有领域的其它信息以确定FVII多肽中参与特异性相互作用或者活性的氨基酸、区域和/或结构域。这种来源包括例如学术杂志、序列和功能数据库，或者专利数据库。在一些情况中，直接迹象可用于确定一或多个氨基酸对于指定相互作用或活性的影响。在其它实例中，这可以从例如关于展示相似活性和/或相互作用的相关蛋白质的信息中间接推断。在这种实例中，与相关蛋白质中活性和相互作用相关的这些氨基酸可用于确定FVII多肽中对应氨基酸，通过相关多肽与FVII多肽的序列对比，基于序列和/或结构相似性确定。因此，可以确定FVII多肽中可能参与制定活性或者相互作用的氨基酸。此外，同源建模可用于预测在蛋白质/蛋白质相互作用的形成和/或稳定化中起重要作用的残基，这个信息可用于设计具有改良性质的变体。

一旦确定了与FVII多肽的活性相关的结构域、区域和/或氨基酸，其可以被修饰，预测所述修饰导致多肽的凝血活性增加。这可以根据指定活性或相互作用以某些方式实现。在一些实例中，可以进行一或多个氨基酸取代、插入或者缺失，以增加修饰的FVII与其它蛋白质或分子的亲和性。

在一个实例中，可以对任何结构域、区域或者氨基酸进行修饰，由此修饰的FVII与其它蛋白质的亲和性或相互作用被改变，即根据被修饰的指定相互作用而增加或降低。为实现这种修饰，参与或者预期参与这种相互作用的结构域、区域和/或氨基酸已知或者可以合理地确定。例如，修饰的FVII可以合理地设计为与抑制性蛋白质如TFPI或AT-III的相互作用降低，以增加修饰的FVII多肽的凝血活性。合理地设计与TFPI相互作用降低的FVII多肽的方法在实施例中阐述。可以进行相似方法以增加或者降低FVII与已知FVII与其相互作用或结合的任何其它蛋白质的相互作用。

例如，FVII被修饰为呈现TFPI抗性增加。TFPI与FXa复合，结合TF/FVIIa复合物形成四元复合物，其中FVIIa的催化活性被抑制。TFPI-1的第一个Kunitz结构域(TFPI-1K1)是与FVIIa相互作用及抑制相关的结构域。参与这种相互作用的FVII氨基酸残基的鉴别可便于TFPI抗性FVII多肽的设计。许多方法可用于确定FVII中参与这种相互作用的氨基酸残基，所述方法包括但不限于诱变、扫描和合理设计如计算机建模。与TFPI复合的FVIIa的晶体结构可以用作确定接触残基的基础。或者，如实施例1所述，其中晶体结构不可利用，通过一系列序列对比及从习惯蛋白质的已知结构和序列及其彼此相互作用中推断可以产生计算机建模。

计算机建模的结果可用于鉴别直接参与与希望的靶蛋白如TFPI接触的残基，和/或例如由于与接触残基紧密接触间接参与该相互作用的那些残基。例如，使用实施例1所述计算机建模结果，进行TFPI-1与TFPI-2第一个Kunitz结构域序列对比，以确定TFPI-1中对应“接触”残基(图5b)。可以鉴别置换氨基酸以改变FVII多肽与靶蛋白的相互作用。所述置换氨基酸可以是直至所有19个天然发生的氨基酸，以及“非天然氨基酸”。或者，这种置换氨基酸可以通过in silico诱变基于相互作用的合理推断鉴别。实施例1阐述了鉴别置换氨基酸的in silico方法，从而分析参与因子VII与TFPI-1K1之间静电互补性的计算机建模显示的残基。例如，FVII的负电荷D60(通过糜蛋白酶编号)看起来参与与TFPI-1的正电荷R20的静电相互作用。整个残基因此是诱变候选物，与TFPI的R20的这种静电互补性被消除，从而产生TFPI抗性增加的修饰的FVII多肽。这可以通过电荷逆转或者电荷中和取代而实现。例如，可以进行氨基酸取代以用正电荷赖氨酸置换负电荷天冬氨酸。这种电荷逆转取代在这个部位产生排斥性电荷-电荷相互作用，并干扰TFPI与FVIIa的结合与相互作用。在另一实例中，FVII的负电荷D60可以用碱性精氨酸置换，以抵消与TFPI的R20的静电互补性，并导入不适宜的相互作用。可以对精确定参与与TFPI残基直接或间接接触和相互作用的一或多个FVII残基进行这种合理设计的修饰。

在另一实例中，可以基于多肽的结构域或区域的已知功能队FVII多肽进行合理修饰。例如，已知FVII的Gla结构域与FVIIa与磷脂的结合相关(虽然非常微弱)，如在活化血小板上展示的那些磷脂。其它维生素K依赖性蛋白质如FIX、FX、凝血酶原、C蛋白和S蛋白也具有影响蛋白质与负电荷磷脂结合的Gla结构域，在许多情况中具有比FVII的Gla结构域更强的亲和性。在FVII多肽中导入异源Gla结构域预期可增加FVII对于磷脂的亲和性。例如，FX(和FXa)与FVII(和FVIIa)相比表现出相对高的磷脂亲和性。因此，在一个实例中，FX的Gla结构域或者FX的Gla结构域的实现磷脂结合的足够部分可以被导入FVII多肽中，产生嵌合的修饰的FVII多肽。

如果需要，可以组合使用合理与经验方法设计FVII多肽。例如，可以检测并筛选含有Gla结构域的多肽的结合，以鉴别与磷脂如血小板表面上的磷脂呈现最高结合和/或亲和性的多肽。或者或另外，可以检测含有导入的各种异源Gla结构域或者其足够部分的一系列FVII多肽，以确定于磷脂呈现最高亲和性和/或结合力的嵌合多肽。

2.经验性(即筛选)

也可以根据经验产生修饰的FVII多肽，并进行检测或者筛选以鉴别具有预期的特定活性或者性质的那些多肽。例如，修饰的FVII多肽可以通过使用本领域已知的任何方法突变FVII多肽的任一或多个氨基酸残基而产生(也见于公开的U.S.Appln.No.2004/0146938所述)。这种修饰的FVII多肽可以在凝血功能测定中检测，以确定其是否增加凝血活性的“Hits”。可以对所述Hits进行进一步检测，以确定其是否呈现出抑制剂如TFPI或AT-III抗性增加，和/或是否呈现出与磷脂的结合增加，或者改良药动学性质如半衰期延长，使用本文所述或者本领域技术人员已知测定法进行。

突变FVII的实例包括导致在完整序列中随机诱变的方法，或者导致FVII序列的选择区或结构域的定点诱变(focused mutagenesis)的方法。在一个实例中，对多肽进行突变的数目是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40或更多。

a.随机诱变

可以应用基于诱变的定向蛋白质进化的任何一般方法。单独或者组合这些方法可用于修饰多肽如FVII，以获得希望的性质。这种方法包括随机诱变，其中起始蛋白质序列中的氨基酸用全部(或一组)20个氨基酸(以及非天然氨基酸)同时在相同分子的不同氨基酸位置产生单一或多个置换。另一方法是限制性随机诱变，导入全部20个天然氨基酸或者其中的一些氨基酸(以及非天然氨基酸)或DNA偏倚(DNA-biased)残基。偏倚是基于DNA序列而非基于蛋白质序列，以随机或半随机方式分别在预先已知参与被“进化的”生物活性的蛋白质的限制或预定区域内。举例的修饰蛋白酶的方法在U.S.application No.10/677,977中描述，在此以其全部内容并入本文作参考。另外，本领域已知的任何方法均可用于修饰或改变蛋白酶多肽序列，如FVII蛋白酶多肽。

随机诱变方法包括例如使用E.coli XL1red、UV照射、化学修饰乳通过脱氨化、烷基化或者碱基类似物诱变剂(base analog mutagens)，或者PCR方法如DNA改组、盒式诱变、定向随机诱变或者易错PCR(见例如U.S.Application No.:2006-0115874)。这种实例包括但不限于通过羟胺化学修饰(Ruan,H.,et al.(1997)Gene188:35–39)、使用dNTP类似物(Zaccolo,M.,et al.(1996)J.Mol.Biol.255:589–603)或者使用可商购的随机诱变试剂盒，例如GeneMorph基于PCR随机诱变试剂盒(Stratagene)或者Diversify随机诱变试剂盒(Clontech)。Diversify随机诱变试剂盒通过改变反应混合物中锰(Mn²⁺)或者dGTP的量而使得可以选择指定DNA序列的希望的突变率(2-8个突变/1000碱基对)。锰水平增加最初增加突变率，通过增加dGTP的浓度增加进一步的突变率。通过进行额外的PCR循环可以实现甚至更高的突变率。

b.定点诱变(Focused Mutagenesis)

定点突变可以通过在基因序列的预定区域中进行一或多个突变而实现，例如在介导催化活性的蛋白酶结构域区域、结合磷脂的Gla结构域区域、结合抑制剂或者分子如TFPI、AT-III或Zn²⁺的FVII多肽的区域，或者与参与FVIIa的清除相关的因子或受体相互作用的蛋白质区域，如本文提供那些区域。在一个实例中，使用任何标准的单一或多重定位诱变试剂盒如QuikChange(Stratagene)试剂盒突变多肽的任一或多个氨基酸。在另一实例中，通过饱和诱变突变蛋白酶的任一或多个氨基酸(Zheng et al.(2004)Nucl.Acids.Res.,32:115)。在一个举例的实施方案中，使用饱和诱变技术，其中某区域或结构域的残基被突变为20个可能天然氨基酸(以及非天然氨基酸)的每一个氨基酸(见例如Kunkle方法，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.,Media Pa.)。在这种技术中，可以合成简并诱变寡核苷酸引物，其含有编码选择的氨基酸的希望密码子的核苷酸随机化。举例的随机化方案包括NNS-或NNK-随机化，其中N表示任何核苷酸，S表示鸟嘌呤或者胞嘧啶，K表示鸟嘌呤或胸腺嘧啶。简并诱变引物与单链DNA模板退火，加入DNA聚合酶以合成该模板的互补链。在连接后，将双链DNA模板转化进大肠杆菌中以进行扩增。

在另一个实例中，定点诱变可以限于在最初的筛选中经鉴别为热点(hotspot)的氨基酸。例如，在从随机诱变的组合文库中选择修饰的FVII多肽之后，在特定位置或区域可观测到不相称的突变数目。这些被称作“热点hotspots”可以通过一个以上的诱变和筛选循环而观测到。然后可以对修饰的FVII多肽进行功能测定，以确定在热点的突变是否与一或多种希望的性质或活性相关。如果证实热点与希望的活性或性质之间的相关性，则可以使用定点诱变特异性靶向这些热点进一步诱变。与在多肽序列随机诱变后出现的较肤浅的诱变相反，这个方法可以在特定位置进行更多样和深入的诱变。例如，饱和诱变可用于在这些位置突变“热点”，例如通过使用含有NNt/g或NNt/c的寡核苷酸进行。

c.筛选

可以在筛选测定中单独检测修饰的多肽，或者在如文库中集中检测。在一个实例中，通过诱变随机产生及单独克隆FVII变体多肽。然后在蛋白质表达及测量适当活性后，对每个单独蛋白质突变的分子单独进行活性评估。在一些实例中，可以在可寻址阵列中测定单独的克隆，由此其彼此分离，以便基于其在阵列中的位置获知每个单独多肽的相同性。例如，如果每个克隆是单独诱变反应的单一产物，则可以简便确定特异突变而不需要测序。或者，可以对所得修饰的多肽进行测序，以确定赋予活性的那些突变。

在另一实例中，可以集合或者在文库中筛选修饰的FVII多肽。例如，可以将FVII多肽文库在遗传包装上展示，以筛选包括但不限于可展示多肽部分的任何可复制载体，如噬菌体、病毒或细菌。通过遗传包装展示多个展示的多肽，由此使得所述多肽与靶多肽结合和/或相互作用。举例的遗传包装包括但不限于噬菌体(见例如Clackson et al.(1991)Making AntibodyFragments Using Phage Display Libraries,Nature,352:624-628、Glaser et al.(1992)Antibody Engineering by Condon-Based Mutagenesis in a FilamentousPhage Vector System,J.Immunol.,149:39033913、Hoogenboom et al.(1991)Multi-Subunit Proteins on the Surface of Filamentous Phage:Methodologies forDisplaying Antibody(Fate)Heavy and30Light Chains,Nucleic Acids Res.,19:4133-41370)、杆状病毒(见例如Boublik et al.(1995)Eukaryotic VirusDisplay:Engineering the Major Surface Glycoproteins of the AutographaCalifornia Nuclear Polyhedrosis Virus(ACNPV)for the Presentation of ForeignProteins on the Virus Surface,Bio/Technology,13:1079-1084)、细菌及展示蛋白质的其它合适载体，如噬菌体展示蛋白酶。例如感兴趣的噬菌体包括但不限于T4噬菌体、M13噬菌体和HI噬菌体。遗传包装任选如在细菌宿主中扩增。

噬菌体展示为本领域技术人员已知，且在例如Ladner et al.,U.S.Pat.No.5,223,409、Rodi et al.(2002)Curr.Opin.Chem.Biol.6:92-96、Smith(1985)Science228:1315-1317、WO92/18619、WO91/17271、WO92/20791、WO92/15679、WO93/01288、WO92/01047、WO92/09690、WO90/02809、deHaard et al.(1999)J.Biol.Chem274:18218-30、Hoogenboom et al.(1998)Immunotechnology4:1-20、Hoogenboom et al.(2000)Immunol Today2:371-8、Fuchs et al.(1991)Bio/Technology9:1370-1372、Hay et al.(1992)HumAntibod Hybridomas3:81-85、Huse et al.(1989)Science246:1275-1281、Griffiths et al.(1993)EMBO J12:725-734、Hawkins et al.(1992)J Mol Biol226:889-896、Clackson et al.(1991)Nature352:624-628、Gram et al.(1992)PNAS89:3576-3580、Garrard et al.(1991)Bio/Technology9:1373-1377、Rebaret al.(1996)Methods Enzymol.267:129-49、Hoogenboom et al.(1991)NucAcid Res19:4133-4137以及Barbas et al.(1991)PNAS88:7978-7982中描述。适于噬菌体展示的核酸如噬菌体载体为本领域已知(见例如Andris-Widhopfet al.(2000)J Immunol Methods,28:159-81、Armstrong et al.(1996)AcademicPress,Kay et al.,Ed.pp.35-53、Corey et al.(1993)Gene128(1):129-34、Cwirlaet al.(1990)Proc Natl Acad Sci USA87(16):6378-82、Fowlkes et al.(1992)Biotechniques13(3):422-8、Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Res19(15):4133-7、McCafferty et al.(1990)Nature348(6301):552-4、McConnell etal.(1994)Gene151(1-2):115-8、Scott and Smith(1990)Science249(4967):386-90所述)。

备筛选的变体FVII多肽的文库也可以在细胞例如原核细胞或真核细胞表面上表达。举例的在细胞表面表达的细胞包括但不限于细菌、酵母、昆虫细胞、禽类细胞、植物细胞和哺乳动物细胞(Chen and Georgiou(2002)Biotechnol Bioeng79:496-503)。在一个实例中，进行表达的细菌细胞是大肠杆菌。

变体多肽可以作为与在细胞表面上表达的蛋白质如膜蛋白或者细胞表面相关蛋白的融合蛋白表达。例如，变体蛋白酶可以在大肠杆菌中作为与大肠杆菌外膜蛋白(例如OmpA)、主要的大肠杆菌脂蛋白(Lpp)的遗传工程化的杂合分子以及外膜蛋白OmpA或者细胞表面相关蛋白(例如pili和flagellar亚单位)的融合蛋白表达。通常地，当细菌外膜蛋白用于展示异源肽或蛋白质时，通过遗传插入载体蛋白的许可位点而实现。异源肽或蛋白质的表达依赖于插入的蛋白质结构域的结构性质，因为所述肽或蛋白质当被插入许可位点时与在蛋白质的N或C末端融合相比更受限。可以对融合蛋白进行修饰以改良该融合蛋白的表达，例如插入柔性肽接头或者间隔序列或者修饰细菌蛋白(例如通过在氨基酸序列中进行突变、插入或者缺失而修饰)。酶如来自Cellulomonas fimi的β-内酰胺酶和Cex外切葡聚糖酶，已经在大肠杆菌表面上成功表达为Lpp-OmpA融合蛋白(Francisco J.A.andGeorgiou G.Ann N Y Acad Sci.745:372–382(1994)和Georgiou G.et al.Protein Eng.9:239–247(1996))。具有15-514个氨基酸的其它肽已经在OmpA表面上第二、第三和第四个外环中展示(Samuelson et al.J.Biotechnol.96:129-154(2002))。因此，外膜蛋白可携带并在细菌外表面上展示异源基因产物。

也可以使用其它展示方式筛选变体多肽文库。举例的其它展示形式包括核酸-蛋白质融合、核酶展示(见例如Hanes and Pluckthun(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.13:4937-4942)、珠展示(Lam,K.S.et al.Nature(1991)354,82-84;K.S.et al.(1991)Nature,354,82-84;Houghten,R.A.et al.(1991)Nature,354,84-86;Furka,A.et al.(1991)Int.J.Peptide Protein Res.37,487-493;Lam,K.S.,et al.(1997)Chem.Rev.,97,411-448;U.S.PublishedPatent Application2004-0235054)以及蛋白质阵列(见例如Cahill(2001)J.Immunol.Meth.250:81-91、WO01/40803、WO99/51773和US2002-0192673-A1)。

在一些其它情况中，可以有利地代之为将变体多肽或者表达变体多肽的噬菌体文库或细胞附着于固体支持物上。例如，在一些实例中，表达变体FVII多肽的细胞可以天然地附着于珠上，由此这一群珠种每个珠含有一个细胞(Freeman et al.Biotechnol.Bioeng.(2004)86:196-200)。在固定于玻璃支持物上之后，使小集落(microcolonies)生长，并使用生色或者荧光底物筛选。在另一实例中，可以将变体FVII多肽或者表达变体蛋白酶的噬菌体文库或细胞排列在滴定平板中并固定。

为了鉴别呈现出凝血活性增加的那些修饰的FVII多肽，单独或者在库(library)中筛选修饰的FVII多肽，并在功能测定中进行检测，以检测表现出抑制剂如TFPI和AT-III抗性增加、与活化的血小板磷脂结合增加、半衰期延长和/或催化活性增加的那些多肽。这种测定法在本文描述或者为本领域技术人员已知。例如，检测修饰的FVII多肽的蛋白质水解性质。将FVII多肽单独或者在存在TF条件下与不同浓度的生色底物一起保温，所述底物如肽底物Spectrozyme FVIIa(CH₃SO₂-D-CHA-But-Arg-pNA.AcOH)。通过吸光度监测底物的的裂解，使用可利用的软件通过线性回归确定底物水解率。在进一步的实例中，评估修饰的FVII多肽对TFPI或AT-III的抗性，通过将该抑制剂与在一些情况中已经与TF预保温的FVII多肽保温。然后使用本领域已知的任一或多种活性或凝血测定法测量FVII活性，TFPI或AT-III抑制作用通过对比与该抑制剂保温的FVII多肽的活性与未与该抑制剂保温的FVII多肽的活性进行评估。

候选多肽的特异突变可以通过使用常规重组DNA技术如测序确定。在一个实施方案中，可以进行“Hits”组合以进一步增加修饰的FVII多肽的性质和/或凝血活性。

3.选择FVII变体

可以选择通过上述一或多种方法设计和鉴别的FVII多肽变体，以鉴别呈现出希望的性质或活性的那些候选FVII多肽。变体FVII多肽的选择基于：1)首先，检测变体多肽被修饰的特异活性或性质(即TFPI抗性、AT-III抗性、Zn²⁺结合力、催化活性、半衰期、与磷脂的结合和/或亲和性)；2)其次，检测变体多肽为止血和凝血所需的FVII多肽活性的保持力。为凝血所需的FVII多肽的活性包括例如酶活性、蛋白质水解活性或催化活性，如使得因子X(FX)活化或者因子IX(FIX)活化。可以评估的其它FVII活性包括但不限于抗原性、结合组织因子、因子X或者因子IX的能力，以及结合磷脂的能力。因此，如本发明提供的或者在本发明方法中鉴别的任何修饰的FVII多肽必须保持为凝血活性所需的一定水平的FVII活性，无论是增加还是降低。可以在体外或者体内进行本领域已知的或者下文描述的标准测定法，以进行上述两种评估。例如，FVII的蛋白质水解或者催化活性可以通过使用各种方法评估，包括测量合成底物的裂解，或者测量因子X的活化(见例如下文所述实施例4、5和11)，TFPI或AT-III抗性可以通过分别测定TFPI或AT-III的抑制作用而评估(见例如实施例7、12和16)。此外，可以应用如在实施例8和14中描述的促凝血活性的体内测定法。

任何候选FVII多肽变体的全部作用是呈现促凝血活性。例如，可以增加变体多肽的TFPI抗性、AT-III抗性、延长半衰期和/或增强与磷脂的结合和/或亲和性，同时也出呈现出催化活性增强。选择这种FVII多肽作为候选FVII变体以增加凝血活性。

然而，在一些情况中，由于TFPI抗性增加、AT-III抗性增加、半衰期延长或者与磷脂的结合和/或亲和性增加的任一或多种修饰而被修饰为具有改良的凝血活性的FVII多肽也表现出由于特定修饰的结果而为凝血所需的催化活性或者其它活性降低。这些作用可得自例如修饰的FVII多肽中干扰与另一分子结合的构象改变，导致活性位点改变或者直接包含与另一分子相互作用相关的一或多个氨基酸残基的或者氨基酸取代的构象改变。

因此，在另一实例中，其TFPI抗性、AT-III抗性、半衰期和/或磷脂结合和/或亲和性增加的变体多肽可表现出其催化活性伴随降低。保证改良凝血活性可接受的FVII活性如催化活性水平的降低依赖于被修饰以改良的性质(即TFPI抗性增加)的伴随增加，可以根据经验确定。因此，可以平衡上述这种评估的结果，以鉴别呈现出改良的性质而同时保留至少足够FVII活性即催化活性以实现凝血的那些变体多肽。典型地，预期修饰的性质增加越大(即TFPI抗性增加越大)，则可接受的蛋白质水解或催化活性降低越多。

例如，表现出TFPI或AT-III抗性增加100倍的FVII多肽可表现出蛋白质水解或者催化活性降低，与未修饰的FVII多肽的活性相比降低大约1.5倍、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或者更多倍，且仍是增加凝血活性的可行候选物。相反，如果TFPI或AT-III抗性增加10倍，则其支撑全部促凝血活性的催化活性与未修饰的多肽的催化活性相比降低大约1.5-倍、2、3、4、5、6、7、8、9-或者更多倍。本领域技术人员可以评估TFPI抗性、AT-III抗性、活化的血小板结合、半衰期以及蛋白质水解或催化活性或者任何其它活性或性质中的伴随改变，以确定修饰的FVII多肽是否可用作促凝血治疗剂，例如治疗血友病患者中的出血事件。

F.FVII多肽的产生

FVII多肽、包括修饰的FVII多肽或FVII的结构域或其它维生素K多肽可以通过本领域熟知的蛋白质纯化和重组蛋白表达方法获得。可以使用本领域技术人员已知的鉴别编码希望的基因的核酸的任何方法。可以使用本领域已知的任何方法获得编码FVII多肽或其它维生素K多肽的全长(即包含完整编码区)cDNA或基因组DNA克隆，如来自细胞或组织来源，例如来自肝。修饰的FVII多肽可以如本文所述工程化，如通过定点诱变工程化。

FVII可以用本领域已知的克隆和分离核酸分子的任何方法克隆或分离。这种方法包括核酸的PCR扩增及文库筛选，包括核酸杂交筛选、基于抗体筛选和基于活性筛选。

可以使用扩增核酸的方法分离编码FVII多肽的核酸分子，包括例如聚合酶链反应(PCR)方法。含有核酸的材料可以用作起始材料，从其可以分离编码FVII的核酸分子。例如，DNA和mRNA制备物、细胞提取物、组织提取物(例如来自肝)、液体样品(例如血液、血清、唾液)、来自健康和/或患病对象的样品可以用于扩增方法中。核酸文库也可以用作起始材料来源。可以设计引物扩增编码FVII的分子。例如，可以基于产生FVII的表达序列设计引物。引物可以基于FVII氨基酸序列的逆翻译而设计。扩增产生的核酸分子可以被测序并证实编码FVII多肽。

可以将额外的核苷酸序列与FVII编码核酸分子结合，包括含有限制性内切酶位点的接头序列，用于将合成基因克隆进载体，例如蛋白质表达载体或设计用于扩增核心蛋白编码DNA序列的载体。另外，限定功能性DNA元件的额外的核苷酸序列可以可操纵地与FVII编码核酸分子连接。这种序列的例子包括但不限于设计用于促进FVII摄入特异靶细胞或另外增强合成基因的药物代谢动力学的序列。

鉴别的及分离的核酸然后可以插入合适的克隆载体。可以使用本领域已知的大量载体-宿主系统。可能的载体包括但不限于质粒或修饰的病毒，但是载体系统必须与所用宿主细胞相容。这种载体包括但不限于噬菌体如衍生物，或者质粒如pBR322或pUC质粒衍生物或者Bluescript载体(Stratagene,La Jolla,CA)。插入到克隆载体可以例如通过将DNA片段连接进具有互补粘性末端的克隆载体而实现。插入可以用TOPO克隆载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)实现。如果用于片段化DNA的互补限制位点不存在于克隆载体中，则DNA分子的末端可以酶修饰。或者，可以通过将核苷酸序列(接头)连接在DNA末端而产生任何希望的位点；这些连接的接头可以含有特异化学合成的编码限制性内切酶序列的寡核苷酸。在另一个方法中，切割的载体和FVII蛋白基因可以通过同聚加尾(homopolymeric tailing)修饰。重组分子可以通过例如转化、转染、感染、电穿孔和sonoporation导入宿主细胞，以便产生许多拷贝的基因序列。

在特异的实施方案中，宿主细胞用重组DNA分子转化掺入分离的FVII蛋白基因、cDNA或合成DNA序列，使得产生多拷贝基因。因此，可以通过生长转化体、从转化体分离重组DNA分子及需要时从分离的重组DNA中提取插入的基因而大量获得基因。

1.载体和细胞

为了重组表达一或多个FVII蛋白，含有全部或部分编码FVII蛋白的核苷酸序列的核酸可以插入合适的表达载体，即含有转录和翻译插入的蛋白质编码序列的必须元件的载体。这种载体的举例是任何哺乳动物表达载体例如pCMV。必须的转录和翻译信号也可以由FVII基因的天然启动子和/或它们的侧翼区提供。

还提供了含有编码FVII或修饰的FVII的核酸的载体。含有载体的细胞也被提供。所述细胞包括真核和原核细胞，载体是适合用于其中的任何载体。

提供了含有载体的原核和真核细胞，包括内皮细胞。这种细胞包括细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、Archea、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞。细胞用于产生FVII多肽或修饰的FVII多肽，其是在编码的FVII蛋白被细胞表达的条件下生长上述细胞，以及回收表达的FVII蛋白。为本文目的，FVII可以被分泌进培养基中。

在一个实施方案中，提供了含有编码具有FVII活性并含有FVII多肽的全部或部分的多肽的核苷酸序列或其多拷贝的载体。载体可以选择用于在细胞中表达FVII多肽或修饰的FVII多肽，或者FVII蛋白作为分泌蛋白表达。当FVII被表达时，核酸与编码分泌信号的核酸连接，所述分泌信号例如酿酒酵母α-交配因子信号序列或其部分，或者天然信号序列。

可以使用各种宿主-载体系统表达蛋白质编码序列。这些包括但不限于用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒及其它病毒)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；微生物如含有酵母载体的酵母；或者用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件的强度及特异性不同。根据所用的宿主-载体系统，可以使用大量合适的转录和翻译元件中的任一种。

可以使用本领域技术人员已知的将DNA片段插入载体的任何方法构建含有嵌合基因的表达载体，所述嵌合基因含有合适的转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列。这些方法可以包括体外重组DNA和合成技术及体内重组体(遗传重组)。编码FVII多肽或修饰的FVII多肽或其结构域、衍生物、片段或同系物的核酸序列的表达可以用另一种核酸序列调节，从而基因或其片段在用重组DNA分子转化的宿主中表达。例如，蛋白质的表达可以用本领域已知的任何启动子/增强子控制。在一个特异的实施方案中，启动子不是FVII蛋白的基因天然的。可以使用的启动子包括但不限于SV40早期启动子(Bernoist and Chambon,Nature290:304-310(1981)),Rous肉瘤病毒3’长末端重复中所含的启动子(Yamamoto et al.Cell22:787-797(1980)),疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1441-1445(1981)),金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster et al.,Nature296:39-42(1982))；原核表达载体如β-内酰胺酶启动子(Jay et al.,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:5543)或tac启动子(DeBoer et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:21-25(1983))；也参见“Useful Proteins from Recombinant Bacteria”:in Scientific American242:79-94(1980))；含有胭脂氨酸合成酶启动子的植物表达载体(Herrar-Estrella et al.,Nature303:209-213(1984))或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Garder et al.,Nucleic Acids Res.9:2871(1981)),以及光合作用酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella et al.,Nature310:115-120(1984))；来自酵母和其它真菌的启动子元件如Gal4启动子，醇脱氢酶启动子，磷酸甘油激酶启动子，碱性磷酸酶启动子，和显示组织特异性并已被用于转基因动物的下述动物转录控制区：弹性蛋白酶I基因控制区，其在胰腺腺泡细胞中有活性(Swift et al.,Cell38:639-646(1984)；Ornitz et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50:399-409(1986)；MacDonald,Hepatology7:425-515(1987))；胰岛素基因控制区，其在胰腺β细胞中有活性(Hanahan et al.,Nature315:115-122(1985)),免疫球蛋白基因控制区，其在淋巴细胞中有活性(Grosschedl et al.,Cell38:647-658(1984)；Adams et al.,Nature318:533-538(1985)；Alexander et al.,Mol.Cell Biol.7:1436-1444(1987)),小鼠乳腺肿瘤病毒控制区，其在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性(Leder et al.,Cell45:485-495(1986)),白蛋白基因控制区，其在肝中有活性(Pinckert et al.,Genes and Devel.1:268-276(1987)),甲胎蛋白基因控制区，其在肝中有活性(Krumlauf et al.,Mol.Cell.Biol.5:1639-1648(1985)；Hammer et al.,Science235:53-581987)),α-1抗胰蛋白酶基因控制区，其在肝中有活性(Kelsey et al.,Genes and Devel.1:161-171(1987)),β珠蛋白基因控制区，其在骨髓细胞中有活性(Mogram et al.,Nature315:338-340(1985)；Kollias et al.,Cell46:89-94(1986)),髓磷脂碱性蛋白基因控制区，其在脑的少突胶质细胞中有活性(Readhead et al.,Cell48:703-712(1987)),肌球蛋白轻链-2基因控制区，其在骨骼肌中有活性(Sani,Nature314:283-286(1985)),及促性腺激素释放激素基因控制区，其在下丘脑的促性腺激素细胞中有活性(Mason et al.,Science234:1372-1378(1986))。

在具体的实施方案中，使用的载体含有与编码FVII多肽或修饰的FVII多肽或其结构域、片段、衍生物或同系物的核酸可操纵地连接的启动子，一或多个复制起点，及任选地一或多个选择标记(例如抗生素抗性基因)。用于表达FVII多肽的载体和系统包括熟知的毕赤酵母载体(例如可得自Invitrogen,San Diego,CA)，特别是那些设计用于分泌编码的蛋白质的那些。举例的用于在哺乳动物细胞中表达的质粒载体包括，例如pCMV。举例的用于转化大肠杆菌细胞的质粒载体包括例如pQE表达载体(得自Qiagen,Valencia,CA；也参见Qiagen出版的描述该系统的文献)。pQE载体具有噬菌体T5启动子(由大肠杆菌RNA聚合酶识别)和双lac操纵子阻遏模块以提供在大肠杆菌中紧密调节的高水平重组蛋白表达，合成的核糖体结合位点(RBS II)用于有效翻译，6XHis标记编码序列，t₀和T1转录终止子，ColE1复制起点，和赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。pQE载体使得6xHis标记置于重组蛋白的N或C末端。这种质粒包括pQE32,pQE30和pQE31，其为全部三个阅读框提供了多克隆位点并提供了N末端6xHis标记的蛋白质的表达。用于转化大肠杆菌的其它举例质粒载体包括例如pET表达载体(参见美国专利4,952,496；得自NOVAGEN,Madison,WI；也参见Novagen出版的描述该系统的文献)。这种质粒包括pET11a,其含有T7lac启动子，T7终止子，可诱导的大肠杆菌lac操纵子及lac阻遏基因；pET12a-c,其含有T7启动子,T7终止子,和大肠杆菌ompT分泌信号；pET15b和pET19b(NOVAGEN,Madison,WI),其含有His-Tag^TM前导序列，用于用His柱纯化，及凝血酶切割位点，其允许在柱纯化后进行切割，T7-lac启动子区和T7终止子。

2.表达系统

FVII多肽(修饰的和未修饰的)可通过本领域已知任何蛋白制备方法来制备,包括体外及体内方法，例如将编码FVII的核酸分子导入宿主细胞，宿主动物并在体外从编码FVII的核酸分子表达。FVII和修饰的FVII多肽可以在适于生产给药和治疗所需量和形式的FVII多肽的任何生物体中表达。表达宿主包括原核和真核生物体如大肠杆菌,酵母，植物，昆虫细胞，哺乳动物细胞包括人细胞系和转基因动物。表达宿主的蛋白产生水平以及存在表达的蛋白质上的翻译后修饰类型可以不同。表达宿主的选择可基于这些和其它因子，诸如审批和安全考虑，制备成本以及纯化的需要和方法。

在真核宿主中的表达可包括在酵母诸如酿酒酵母和巴氏毕赤酵母，昆虫细胞诸如果蝇细胞和鳞翅类细胞，植物和植物细胞诸如烟草,玉米,稻,藻类,以及浮萍中的表达。用于表达的真核细胞也包括哺乳动物细胞系诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或幼仓鼠肾(BHK)细胞。真核表达宿主也包括在转基因动物中制备，例如包括在血清、尿液、乳液和卵中进行制备。用于制备野生型FVII多肽的转基因动物是本领域已知的(U.S.Patent PublicationNos.20020166130和20040133930)并可以被适应以制备本发明的修饰的FVII多肽。

本领域技术人员可利用并已知许多表达载体可用于表达FVII。表达载体的选择受宿主表达系统选择的影响。所述选择是本领域技术人员能力范围内的。通常，表达载体可包括转录启动子以及任选的增强子，翻译信号以及转录和翻译终止信号。用于稳定转化的表达载体通常具有选择标记，其允许选择并维持转化的细胞。一些情况中，复制起点可用于扩增细胞中载体的拷贝数。

FVII或修饰的FVII多肽也可以作为蛋白质融合体使用或表达。例如可以产生融合体以向多肽添加额外的功能性。融合蛋白的例子包括但不限于信号序列融合体，标记如用于定位，例如his₆标记或myc标记，或纯化标记例如GST融合体，用于指导蛋白质分泌和/或膜结合的序列。

在一个实施方案中，FVII多肽或修饰的FVII多肽可以以活性形式表达，其中活化是通过分泌后多肽的自身激活而实现。在另一个实施方案中，蛋白酶以无活性酶原形式表达。

制备FVII多肽的方法可包括共表达辅助FVII多肽产生的一或多个另外的异源多肽。例如,这种多肽可有助于FVII多肽的翻译后加工。举例的多肽包括但不限于帮助裂解FVII前体序列如前肽(propeptide)序列的肽酶，以及参与FVII多肽的修饰的酶，如通过糖基化、羟化、羧化或磷酸化的修饰。可以与FVII共表达的举例的肽酶是PACE/furin(或PACE-SOL)，其帮助裂解FVII前肽序列。帮助FVII多肽的羧化的举例的蛋白质是华法令敏感性酶维生素K2,3-环氧化物还原酶(VKOR)，其产生还原的维生素K，用作维生素K依赖性γ-羧化酶辅因子(Wajih et al.,J.Biol.Chem.280(36)31603-31607)。这一酶的亚基VKORC1可以与修饰的FVII多肽共表达以增加γ-羧化。所述一或多种另外的多肽可从与FVII多肽相同或不同的表达载体表达。

a.原核表达

原核生物，尤其是大肠杆菌，提供产生大量FVII多肽的系统(见例如Platis et al.(2003)Protein Exp.Purif.31(2):222-30；和Khalizzadeh et al.(2004)J.Ind.Microbiol.Biotechnol.31(2):63-69)。大肠杆菌的转化是本领域已知的简单并快速的技术。大肠杆菌表达载体可包含用于诱导高水平蛋白质表达以及表达显示对宿主细胞具有一些毒性的蛋白质的可诱导启动子。可诱导启动子的实例包括lac启动子、trp启动子、杂合tac启动子、T7和SP6RNA启动子以及温度调节的λP_L启动子。

FVII可以在大肠杆菌的胞浆环境中表达。胞浆是还原环境，并且对于一些分子，可导致不溶内涵体形成。还原剂诸如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇以及变性剂(例如诸如胍-HCl和尿素)可用于再溶解所述蛋白质。另一种方法是在细菌的胞质周间隙中表达FVII，其提供氧化环境以及伴侣分子样和二硫化物异构酶，导致可溶蛋白产生。典型地，前导序列融合于待表达的蛋白，指导所述蛋白到周质。前导序列随后通过周质内的信号肽酶去除。举例的靶向周质的前导序列包括来自果胶裂合酶基因的pelB前导序列，并且所述前导序列源自碱性磷酸酶基因。在一些情况中，周质表达使得表达的蛋白质漏入培养基。蛋白质的分泌允许从培养物上清快速并简单地纯化。没有分泌的蛋白质可通过渗透裂解得自周质。与胞质表达类似，一些情况中蛋白质可变为不溶的，且可以利用变性剂和还原剂来促进溶解和再折叠。诱导和生长的温度也可影响表达水平和溶解度。典型地，使用25℃和37℃的温度。也可利用突变增加表达的蛋白质的溶解度。典型地，细菌产生糖基化的蛋白。因此，如果蛋白需要糖基化以发挥功能，糖基化可在体外纯化自宿主细胞后加入。

b.酵母

酵母诸如酿酒酵母，粟酒裂殖酵母，Yarrowia lipolytica，乳糖克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)是用于表达FVII的宿主(见例如Skoko et al.(2003)Biotechnol.Appl.Biochem.38(Pt3):257-65)。酵母可利用游离体复制载体转化或通过同源重组进行稳定染色体整合。典型地，可诱导启动子用于调节基因表达。举例的这种启动子的实例包括GAL1、GAL7和GAL5以及金属硫蛋白启动子诸如CUP1。表达载体通常包括可选标记如LEU2、TRP1、HIS3和URA3，用于选择和保持转化的DNA。酵母中表达的蛋白质通常可溶并与伴侣分子共表达，诸如Bip和蛋白二硫化物异构酶，从而可改良表达水平和溶解度。此外，酵母中表达的蛋白质可与分泌信号肽诸如来自酿酒酵母的酵母交配型α-因子分泌信号融合以及与酵母细胞表面蛋白诸如Aga2p交配粘附受体或Arxula adeninivorans葡糖淀粉酶融合来引导分泌。蛋白酶裂解位点(例如Kex-2蛋白酶)可经工程化，从而它们离开分泌途径时从所述多肽去除融合的序列。酵母也能在Asn-X-Ser/Thr基序糖基化。

c.昆虫和昆虫细胞

昆虫和昆虫细胞，特别是利用杆状病毒表达系统，可用于表达多肽，诸如FVII或者其修饰形式(见例如Muneta et al.(2003)J.Vet.Med.Sci.65(2):219-23)。昆虫细胞和昆虫幼虫，包括在血淋巴中表达，其表达高水平蛋白并能够进行大多数高等真核动物使用的翻译后修饰。杆状病毒具有限制的宿主范围，其安全性提高且减少真核表达的调节问题。典型地，表达载体利用启动子诸如杆状病毒多角体蛋白启动子用于高水平表达。通常使用的杆状病毒系统包括杆状病毒诸如Autographa californica核多角体病毒(AcNPV)，Bombyx mori核多角体病毒(BmNPV)和昆虫细胞系诸如Sf9，其来自Spodoptera frugiperda,Pseudaletia unipuncta(A7S)和Danaus plexippus(DpN1)。对于高水平表达，待表达分子的核苷酸序列与病毒多角体蛋白起始密码子下游紧密融合。哺乳动物分泌信号在昆虫细胞中精确加工并可用于将表达的蛋白分泌到培养基。此外，细胞系Pseudaletia unipuncta(A7S)和Danaus plexippus(DpN1)产生具有与哺乳动物细胞系统相似的糖基化模式的蛋白质。

昆虫细胞中另一天然表达系统是利用稳定转化的细胞。细胞系诸如Schnieder2(S2)和Kc细胞(Drosophila melanogaster)以及C7细胞(Aedesalbopictus)可用于表达。果蝇金属硫蛋白启动子可用于在重金属诱导存在下利用镉或铜诱导高水平表达。表达载体通常通过利用选标记诸如新霉素和潮霉素保持。

d.哺乳动物细胞

哺乳动物表达系统可用于表达FVII多肽。表达构建体可通过病毒诸如腺病毒的感染，或通过直接DNA转移诸如脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖以及通过物理方法诸如电穿孔和显微注射而转移进哺乳动物细胞中。哺乳动物细胞的表达载体通常包括mRNA帽位点、TATA框、翻译起始序列(Kozak共有序列)以及聚腺苷酸元件。这种载体通常包括转录启动子-增强子用于高水平表达，例如SV40启动子-增强子、人巨细胞病毒(CMV)启动子，以及Rous肉瘤病毒(RSV)的长末端重复。这些启动子-增强子在许多细胞类型中都具有活性。组织和细胞类型启动子以及增强子区域也可用于表达。举例的启动子/增强子区域包括但不限于来自以下基因的那些区域：诸如弹性蛋白酶I、胰岛素、免疫球蛋白、小鼠乳腺肿瘤病毒、白蛋白、甲胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶、β-球蛋白、髓磷脂碱蛋白、肌球蛋白轻链-2，以及促性腺激素释放激素基因控制。选择标记可用于选择并保持具有表达构建体的细胞。举例的选择标记基因包括但不限于潮霉素B磷酸转移酶、腺苷脱氨酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、氨基葡糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶以及胸苷激酶。与细胞表面信号分子诸如TCR-ζ和Fc_εRI-γ的融合可指导活性状态的蛋白质在细胞表面的表达。

用于哺乳动物表达的许多细胞系包括小鼠、大鼠、人、猴、鸡和仓鼠细胞。举例的细胞系包括但不限于BHK(即BHK-21细胞)、293-F、CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、小鼠NS0(非分泌性)及其它骨髓瘤细胞系、杂交瘤和异源杂交瘤细胞系、淋巴细胞、成纤维细胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、293T、2B8以及HKB细胞。细胞系也可适于无血清培养基，其有利于从细胞培养基纯化分泌的蛋白质。一个这样的实例是无血清EBNA-1细胞系(Pham et al.,(2003)Biotechnol.Bioeng.84:332-42)。本领域已知表达与血浆衍生的FVII具有相似结构和翻译后修饰的重组FVII多肽的表达(见例如Jurlander et al.(2003)Semin Throm Hemost)。优化维生素K依赖性蛋白质表达的方法也为本领域已知。例如，在培养基中补充维生素K或者共表达维生素K依赖性γ-羧化酶(Wajih et al.,J.Biol.Chem.280(36)31603-31607)，可有助于维生素K依赖性蛋白质如FVII多肽的翻译后修饰。

e.植物

转基因植物细胞和植物可用于表达FVII。表达构建体通常利用直接DNA转移诸如显微注射轰击和PEG介导的转移进原生质体以及使用农杆菌介导的转化而被转移至植物。表达载体可包括启动子和增强子序列、转录终止元件，以及翻译控制元件。表达载体和转化技术通常分别用于双子叶宿主诸如拟南芥和烟草，以及单子叶植物宿主，诸如玉米和水稻。用于表达的植物启动子的例子包括花椰菜花叶病毒启动子，胭脂碱合酶启动子,核糖二磷酸羧化酶(ribose bisphosphate carboxylase)启动子以及遍在蛋白(ubiquitin)和UBQ3启动子。选择标记诸如潮霉素、磷酸甘露糖异构酶以及新霉素磷酸转移酶通常用于促进选择和维持转化的细胞。转化的植物细胞可作为细胞、聚集体(愈伤组织)保持在培养基中或再生成完整的植物。由于植物具有不同于哺乳动物的糖基化模式，这可以影响在这些宿主中产生FVII的选择。转基因植物细胞也可包括经工程化的产生蛋白质的藻类(见例如Mayfield et al.(2003)PNAS100:438-442)。由于植物具有不同于哺乳动物细胞的糖基化模式，这可影响在这些宿主中产生FVII的选择。

2.纯化

从宿主细胞纯化FVII多肽的方法依赖于选择的宿主细胞和表达系统。对于分泌的分子，通常在去除细胞之后从培养基纯化蛋白质。对于细胞内表达，细胞可被裂解并且从提取物纯化蛋白质。当使用转基因生物体诸如转基因植物和动物进行表达时，可使用组织或器官作为起始物质以制备裂解的细胞提取物。此外，转基因动物生产可包括在乳汁或卵内产生多肽，所述的多肽可被收集并且如果需要所述蛋白质可利用本领域标准方法提取并随后进行纯化。

FVII多肽可利用本领域已知的标准蛋白质纯化技术纯化，所述技术包括但不限于SDS-PAGE、大小分级分离和大小排阻层析、硫酸铵沉淀、螯合层析和离子交换层析。例如，FVII多肽可以通过阴离子交换层析纯化。举例的纯化FVII多肽的方法是使用离子交换层析柱，使得具有功能性Gla结构域的任何多肽结合，随后在存在钙的条件下洗脱(见例如施例3)。亲和性纯化技术也可用于改善制备物的效力和纯度。例如，结合FVII的抗体、受体及其它分子可用于亲和性纯化中。在另一实例中，也可以使用可溶TF(sTF)亲和性层析柱(Maun et al.(2005)Prot Sci14:1171-1180)增强纯化。表达构建体也可以工程化为在蛋白质上添加亲和性标记如myc表位、GST融合体或者His₆，并且分别用myc抗体、谷胱甘肽树脂和Ni-树脂进行亲和性纯化。纯度可以通过本领域已知的任何方法评估，包括凝胶电泳和染色以及分光光度法。

FVII蛋白酶可以无活性形式(酶原形式)表达和纯化，或者表达的蛋白酶可以例如通过自动催化被纯化为活性形式。例如，可以在体外制备通过Arg¹⁵²-Ile¹⁵³的蛋白酶解活化的FVII多肽(即FVIIa，双链形式)。FVII多肽首先可以通过本文所述任何生产方法制备，包括但不限于在哺乳动物细胞中生产，随后纯化。FVII多肽裂解为火星蛋白酶形式FVIIa可以通过某些方式实现。例如，可以在45分钟内在存在钙的条件下与磷脂载体保温期间实现自身激活(Nelsestuen et al.(2001)J Biol Chem276:39825-31)。FVII多肽也可以通过与因子Xa、因子XIIa或者TF在存在钙以及有或无磷脂的条件下保温而被完全活化(见例如实施例3和Broze et al.(1980)J Biol Chem255:1242-1247,Higashi et al.(1996)J Biol Chem271:26569-26574,Harvey etal.J Biol Chem278:8363-8369)。

3.融合蛋白

本发明还提供了含有修饰的FVII多肽及一或多种其它多肽的融合蛋白。本发明提供了针对通过合适途径给予而配制的含有这种融合蛋白的药物组合物。融合蛋白是通过以任何顺序连接修饰的FVII多肽与例如抗体或其片段、生长因子、受体、配体这样的物质以及其它这种物质而形成，目的是促进FVII多肽的纯化、通过例如指导多肽至靶向细胞或组织改变FVII多肽的药效学性质，和/或增加FVII多肽的表达或分泌。典型地，任何FVII融合蛋白于非融合FVII多肽相比保留至少大约30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%或者95%促凝剂活性，包括与非融合多肽相比96%,97%,98%,99%或者更高的促凝剂活性。

FVII多肽与另一多肽可以直接连接或者通过接头间接连接。在一个实例中，连接可以是化学连接，如通过异双功能剂或硫氢基连接(thiol linkage)或其它这种连接。融合蛋白可以通过重组方式获得。FVII多肽与另一多肽的融合可以是与FVII多肽的N末端或者C末端融合。可以与本发明提供的FVII多肽一起用于融合蛋白中的多肽非限制性地例如包括GST(谷胱甘肽S-转移酶)多肽、免疫球蛋白G的Fc结构域，或者异源信号序列。融合蛋白可含有额外的成分，如大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)，其有助于蛋白质被细胞吸收(见国际PCT申请No.WO01/32711)。

融合蛋白可以通过标准重组技术产生。例如，根据常规技术，编码不同多肽序列的DNA片段可以符合读框地连接在一起，例如通过应用平端或者交错末端进行连接，或者通过限制酶消化以提供合适的末端，适当填充粘端，碱性磷酸酶处理以避免不希望的连接以及通过酶连接。在另一实施方案中，融合基因可以通过常规技术包括利用自动DNA合成仪合成。或者，可以使用锚定(anchor)引物通过PCR扩增基因片段，在两个连续基因片段之间产生互补突出端，随后可被退火及再扩增产生嵌合的基因序列(见例如Ausubel et al.(eds.)CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,1992)。此外，可商购编码融合部分(例如GST多肽)的许多表达载体。FVII-编码核酸可以克隆进这种表达载体中，由此所述融合部分与蛋白酶蛋白符合读框地连接。

4.多肽修饰

修饰的FVII多肽可作为裸多肽链或作为复合物制备。对于一些应用，需要制备“裸”形式的修饰的FVII，其没有翻译后或其它化学修饰。裸多肽链可在适宜宿主中制备，其在翻译后不修饰FVII。这种多肽也可在体外系统中利用化学多肽合成法制备。对于其它应用，需要的特别修饰包括PEG化、白蛋白化、糖基化、羧化、羟基化、磷酸化，或其它已知修饰。修饰可在体外进行，或例如通过在产生这种修饰的适宜宿主中产生修饰的FVII。

5.核苷酸序列

本发明提供了编码FVII或者修饰的FVII多肽的核苷酸序列。核酸分子包括任何编码的FVII多肽的等位基因变体或者剪接变体。举例的本发明提供的核酸分子是编码本发明提供的修饰的FVII多肽的任何核酸分子，例如编码SEQ ID NO:18-43、125-150或者206-250所示多肽的任何核酸分子。在一个实施方案中，本发明的提供的核酸分子与编码本发明提供的FVII多肽的任何核酸全长的70%具有至少50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95或者99%序列相同性，或者在中等或者高严格条件下杂交。在另一实施方案中，核酸分子可包括具有编码本发明提供的任意FVII多肽的简并密码子序列的那些核酸分子。

G.评估修饰的FVII多肽活性

FVII多肽活性和性质可在体外和/或体内评估。这种评估测定为本领域已知，并且已知与受试活性相关并导致治疗和体内活性。在一个实例中，FVII变体可相较于未修饰的和/或野生型FVII评估。在另一实例中，可评估修饰的FVII多肽在体外或体内暴露于TFPI或者AT-III蛋白之后的活性，并且与未暴露于TFPI或AT-III的修饰的FVII多肽对比。体外测定包括任何本领域已知的实验室测定，例如基于细胞的测定包括凝血试验、结合测定、蛋白质测定以及分子生物学测定。体内测定包括在动物模型中的FVII测定以及对人的给药。在一些情况中，FVII体内活性可通过评估血液、血清或其它体液的实验测定物来确定。也可在体内检测FVII变体以评估活性或性质，如治疗效果。

典型地，本文描述的测定是关于双链活性形式FVII，即FVIIa。这种测定也可以用单链形式进行，例如提供阴性对照物，因为这种形式不含有FVII凝血活性需要的蛋白酶解活性或者催化活性。此外，这种测定也可以在存在辅因子的条件下进行，所述辅因子如TF，其在一些情况中增加FVII活性。

1.体外测定

举例的体外测定包括评估多肽修饰和活性的测定。修饰可以使用本领域已知的评估γ-羧化及其它翻译后修饰的体外测定法、蛋白质测定以及构象测定法评估。活性测定包括但不限于测量FVII与其它凝血因子如TF、因子X和因子IX的相互作用，确定FVII多肽的蛋白酶解活性的蛋白酶解测定，确定FVII多肽与磷脂酰丝氨酸及其它磷脂的结合和/或亲和性的测定，以及确定FVII多肽对于凝血作用的基于细胞的测定。

修饰的FVII多肽的浓度可通过本领域熟知的方法评估，包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、SDS-PAGE；Bradford,Lowry,BCA法；UV吸光度，和其它可定量蛋白标记法，诸如但不限于免疫学、放射活性、荧光、和相关方法。

评估的蛋白酶解反应的裂解产物包括FVII多肽的裂解或者通过FVII蛋白酶活性产生的产物可利用本领域已知的标准方法进行，包括但不限于生色底物裂解(chromogenic substrate cleavage)、HPLC、SDS-PAGE分析、ELISA、Western印迹、免疫组化、免疫沉淀、NH₂-末端测序以及蛋白标记。

也可以评估修饰的FVII多肽的结构性质。例如，可以对修饰的FVII多肽进行X-线结晶学、核磁共振(NMR)和冷冻电子显微镜术(cryo-EM)，以评估FVII多肽的三维结构和/或其它性质，如Ca²⁺或者辅因子结合性质。

此外，FVII降解的存在和程度可以通过标准技术测量，例如十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及对经电泳的含有FVII的样品进行Western印迹。对暴露于蛋白酶的FVII多肽也可以进行N末端测序，以确定修饰的FVII多肽的裂解位点中的位置或改变。

a.翻译后修饰

也可以评估FVII多肽中翻译后修饰的存在。这种测定为本领域已知，包括测量糖基化、羟基化和羧化。在举例的糖基化测定中,可以进行碳水化合物分析，例如利用SDS page分析暴露于肼解作用或糖苷内切酶处理的FVII多肽。通过与无水肼保温，肼解作用从糖蛋白释放N或O连接的多糖，糖苷内切酶释放涉及PNGase F，其从糖蛋白释放大多数N-聚糖。FVII多肽的肼解作用或糖苷内切酶处理产生可被荧光基团或发色团标记的还原末端。标记的FVII多肽可以通过荧光基团-辅助的碳水化合物电泳(FACE)分析。多糖的荧光标记也可用于单糖分析，通过HPLC对复杂糖基化模式作图或指纹。举例的HPLC方法包括亲水作用层析、电作用层析、离子交换层析、疏水作用层析和大小排阻层析。举例的多糖探针包括但不限于3-(乙酰氨基)-6-氨基氮蒽(AA-Ac)和2-氨基苯甲酸(2-AA)。碳水化物部分也可以通过使用特异性抗体检测，所述抗体识别糖基化的FVII多肽。

举例的测量β-羟基化的测定包括对已经进行碱水解的FVII多肽的反相HPLC分析(Przysiecki et al.(1987)PNAS84:7856-7860)。FVII多肽的羧化和γ-羧化可以通过使用质谱分析及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析，如本领域所述(见例如Harvey et al.J Biol Chem278:8363-8369,Maum et al.Prot Sci14:1171-1180)。也可以评估含有前肽的FVII多肽(pro-FVII)与翻译后修饰γ-羧化修饰相关的羧化酶的相互作用。在羧化酶与荧光标记的pro-FVII多肽保温后的解离常数(K_d)可以通过各向异性确定结合的羧化酶的量而测量(Lin et al.(2004)J Biol Chem279:6560-6566)。

b.蛋白酶解活性

可以检测修饰的FVII多肽的蛋白酶解活性。FVII的蛋白酶解活性可以通过使用生色底物测量，所述生色底物如Chromozym t-PA(MeSO₂-D-Phe-Gly-Arg-pNA)、S-2288(H-D-Ile-Pro-Arg-pNA)、S-2266(H-D-Val-Leu-Arg-pNA)、S-2765(Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA)、Spectrozyme FXa和Spectrozyme FVIIa(CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA)。将FVII多肽单独或者在存在TF条件下与不同浓度的生色底物保温。底物的裂解可以通过吸光度和使用可利用的软件通过线性回归分析确定的底物水解速度监测。

也可以评估FVII多肽对于凝血因子底物如FX的活化作用。可以将与TF预保温或者未预保温的FVII多肽与纯化的FX(可商购)一起保温。测量作为与FVII多肽保温的结果产生的活性FXa的量，作为FXa对于生色底物如S-2222或者Spectrafluor FXa(CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC.AcOH)的活性，其通过吸光度改变监测(Harvey et al.J Biol Chem278:8363-8369，也见下文实施例5)。磷脂的来源也可以包含在FVII与FX的保温中(Nelsestuenet al.(2001)J Biol Chem276:39825-31)。

c.凝血活性

可以通过本领域熟知的测定法检测FVII多肽的凝血活性。例如，这样的一些测定包括但不限于二期凝血测定(Leibman et al.,(1985)PNAS82:3879-3883)；凝血酶原时间测定(PT，其可以测量外源途径中FVIIa的TF依赖性活性)；对PT检测加以修改的测定；活化部分凝血酶原时间(activatedpartial thromboplastin time)(aPTT，其可以测量,FVIIa的TF非依赖性活性)；活化凝血时间(ACT)；再钙化的活化凝血时间(recalcified activated clottingtime)；Lee-White凝血时间；或者凝血弹性描记法(TEG)(Pusateri et al.(2005)Critical Care9:S15-S24)。例如，修饰的FVII多肽的凝血活性可以通过基于PT的测定确定，其中将FVII在无FVII的血浆中稀释，并且与凝血酶原时间检测试剂(具有磷脂和钙的重组TF)混合，如得自Dade Behring的Innovin^TM。目测血凝块的形成，确定凝结时间并与无FVII的血浆对比。

d.与其它蛋白质结合和/或被其它蛋白质抑制

抑制测定可用于测量修饰的FVII多肽对于FVII抑制剂的抗性，所述抑制剂例如TFPI和AT-III，或者如Zn²⁺这样的分子。也可以检测对于其它抑制剂的抑制作用，包括但不限于其它丝氨酸蛋白酶抑制剂以及FVII特异性抗体。可以通过将例如TFPI、AT-III或者Zn²⁺与已经与TF预保温的FVII多肽一起保温而评估抑制作用。然后FVII活性可以通过使用上述任一或多种活性或凝血测定测量，TFPI、AT-III或Zn²⁺抑制作用可以通过和已经与所述抑制剂保温的FVII多肽活性以及未与所述抑制剂保温的FVII多肽的活性对比进行评估。

可以检测FVII多肽与其它凝血因子和抑制剂的结合。例如，FVII与辅因子如TF、底物如FX和FIX以及与抑制剂如TFPI、抗凝血酶III和肝素的直接和间接相互作用，可以通过使用本领域已知的任何结合测定法评估，包括但不限于免疫沉淀、柱纯化、非还原SDS-PAGE、

测定、表面等离子共振(SPR)、荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer)(FRET)、荧光偏振(FP)、等温滴定量热法(ITC)、圆二色性(CD)、蛋白片段互补测定(PCA)、核磁共振(NMR)谱、光散射、沉降平衡、小区域凝胶过滤层析(small-zone gel filtration chromatography)、凝胶阻留法、Far-western印迹、荧光偏振、羟基-自由基蛋白足迹法(hydroxyl-radical proteinfootprinting)、噬菌体展示和各种双杂合系统。在一个实例中，使用平衡分析评估Zn²⁺结合(Petersen et al.,(2000)Protein Science9:859-866)。

e.磷脂亲和性

修饰的FVII多肽与磷脂酰丝氨酸(PS)及其它磷脂的结合和/或亲和性可以通过使用本领域熟知的测定法确定。在有机溶剂中的高纯度磷脂(例如已知浓度的牛PS和蛋卵磷脂(PC)，其可商购自例如Sigma)可用于制备小型单层磷脂囊泡。FVII多肽与这些PS/PC囊泡的结合可以通过与入射光成90°的相对光散射(relative light scattering at90° to the incident light)确定。测量与PC/PS以及与PC/PS/FVII的光散射强度，以确定解离常数(Harvey et al.JBiol Chem278:8363-8369)。如在BIAcore生物传感器设备上进行的表面等离子共振也可用于测量FVII多肽与磷脂膜的亲和性(Sun et al.Blood101:2277-2284)。

2.非人动物模型

非-人动物模型可用于评估修饰的FVII多肽的活性、效力和安全性。例如，非-人动物可用于评估疾病或病症的模型。可以为非人动物注射疾病和/或表型诱导物质，然后给予FVII变体如SEQ ID NO:18-43、125-150或206-250所示任何FVII变体，监测对疾病进程的影响。基因模型也可用。动物，诸如小鼠可产生为通过过表达、低表达或剔除一或多个基因来模拟疾病或病症，例如，因子VIII剔除小鼠表现为血友病A(Bi et al.(1995)NatGen10:119-121)。这种动物可通过本领域熟知的转基因动物制备技术产生，或者利用天然发生的或者诱导的突变株产生。与FVII相关的可用非人动物疾病模型例如包括但不限于出血性疾病、特别是血友病或者血栓形成性疾病模型。外伤非人动物模型也可以用于评估如FVII多肽的凝血活性。这些非人动物模型可用于通过与野生型FVII多肽对比而监测FVII变体活性。

动物模型也可以用于监测修饰的FVII多肽的稳定性、半衰期以及清除。这种测定法可用于比较修饰的FVII多肽以及用于计算对于其它非人动物和人体试验的剂量和给药方案。例如，修饰的FVII多肽如本发明提供的任何FVII变体包括例如SEQ ID NO:18-43、125-150或者206-250所示任何变体，可注射入小鼠的尾静脉。在注射后在各个时间点(诸如之后的以分钟、小时和天计算的时间)取血液样品，机体样品包括但不限于血清或血浆中修饰的FVII多肽的水平可在特定时间点通过例如ELISA或放射免疫测定监测。也可以使用如实施例9和14所述的各种方法检测在注射FVII多肽后不同时间点获取的血液样品的凝血活性。这些类型的药动学研究可提供关于FVII多肽的半衰期、清除和稳定性的信息，这些信息可有助于确定作为促凝剂的合适给予剂量。

可以使用血友病动物模型检测修饰的FVII多肽如SEQ ID NO:18-43、125-150或者206-250所示任何多肽的治疗效力。在一个非限制性实例中，可以使用动物模型如小鼠。本领域可获得血友病小鼠模型，用于检测修饰的FVII多肽。例如，通过注射抗FVIII抗体产生的血友病A小鼠模型可用于评估FVII多肽的凝血活性(见例如实施例8和14以及Tranholm et al.Blood(2003)102:3615-3620)。血友病B小鼠模型也可用于检测FVII多肽(Margaritis et al.(2004)J Clin Invest113:1025-1031)。出血性疾病的非小鼠模型也存在。可以在如下模型中评估FVII多肽活性：warfarin诱导的出血或者melagatran诱导的出血大鼠模型(Diness et al.(1992)Thromb Res67:233-241,Elg et al.(2001)Thromb Res101:145-157)，以及肝素诱导的出血大鼠模型(Chan et al.(2003)J Thromb Haemost1:760-765)。呈现严重出血的狗先天性血友病A、血友病B和von Willebrand病模型也可以用于FVII多肽的非人动物研究中(Brinkhous et al.(1989)PNAS86:1382-1386)。FVII多肽活性也可以在出血兔模型中评估，其中血小板减少是通过组合γ-射线照射以及使用血小板抗体诱导的(Tranholm et al.(2003)Thromb Res109:217-223)。

除了具有一般化出血疾病的动物之外，外伤和创伤模型也可用于评估FVII多肽作为促凝治疗剂的活性、安全性和效力。这种模型非限制性例如包括兔冠状动脉狭窄模型(Fatorutto et al.(2004)Can J Anaesth51:672-679)、猪V级肝损伤模型(Lynn et al.(2002)J Trauma52:703-707)、猪V级肝损伤模型(Martinowitz et al.(2001)J Trauma50:721-729)和猪主动脉切开术模型(Sondeem et al.(2004)Shock22:163-168)。

3.临床试验

许多测定法可用于评估FVII的临床应用活性。这种测定法可包括评估凝血、蛋白质稳定性和体内半衰期以及表型测定。表型测定以及用于评估FVII临床治疗效果的测定包括评估FVII的血液水平(例如测量给药前、给药后各个时间点包括第一次给药后、最后一次给药后即刻，以及之间的不同时间点的血清FVII，并相对于体重指数(BMI)进行校正)，使用上述方法评估用FVII处理后体外血液凝固情况(例如PT测定)，以及FVII治疗的表型反应包括与用未修饰的和/或野生型FVII或安慰剂处理的对象相比症状随时间的改善。可以监测用FVII治疗的患者的失血、输血需求以及血红蛋白情况。应急性事件如出血、外伤或者手术之要求，可以在常规或者重复给药或者给药后的一段时间内定期监测患者。

H.配制与给药

本发明提供了治疗出血性疾病的组合物。这种组合物含有治疗有效量的本发明所述因子VII多肽。可以将有效浓度的FVII多肽或者其药物可接受的衍生物与合适的药物载体或者运载体混合以系统、局域(topical)或者局部(local)给予。组合中包含有效量的化合物以治疗选择的疾病。组合物中活性化合物的浓度依赖于该活性化合物的吸收、失活、排泄率、给药方案和给予量以及本领域技术人员已知的其它因素。

适于给予本发明提供的化合物的药物载体或者运载体包括本领域技术人员已知适于特定给药途径的任何这种载体。包含治疗有效量本发明所述FVII多肽的药物组合物可以是冻干粉末形式，在即将给药之前用无菌注射用水重建。

1.配制

可以通过任何常规方式混合选择量的多肽与一或多种生理学可接受的载体或赋形剂配制含有修饰的FVII的药物组合物。载体或赋形剂的选择为本领域技术人员已知，可以根据许多参数确定。这些参数包括例如给药模式(即系统给药、口服、经鼻、肺、局部(local)、局域(topical)或者任何其它形式)及治疗的疾病。本发明提供的药物组合物可配制成单剂(直接)给药或者配制成稀释液或其它形式。配制物中的化合物浓度在给药时有效递送一定的量，所述量对于指定治疗有效。典型地，所述组合物配制成用于单剂给药。为了配制组合物，化合物的一部分或其混合物可以有效浓度溶解、悬浮、分散或另外混合在选定的载体中，从而缓解或改善治疗的疾病。

本发明提供的修饰的FVII多肽可以配制为双链FVIIa蛋白给予对象。修饰的FVII多肽在配制之前可以通过本领域已知的任何方法活化。例如，FVII可以在纯化期间通过离子交换层析自身激活(Jurlander et al.(2001)Semin Thromb Hemost27:373-384)。纯化的FVII多肽也可以通过与固定在珠上的FXa保温而活化(Kemball-Cook et al.(1998)J Biol Chem273:8516-8521)，或者通过本领域已知的任何其它方法活化(见下文实施例3)。这些方法中钙的包含保证了修饰的FVIIa蛋白的完全活化和正确折叠。本发明提供的修饰的FVII多肽也可以配制成单链蛋白给予对象。所述单链FVII多肽可以这样的方式纯化以防止裂解(见例如US6677440)。本发明提供的修饰的FVII多肽可以这样配制，由此在药物组合物中以任何比率包含单链和双链形式，适当选择培养基以消除或者控制自身激活。

所述化合物可以微粉化或者其它合适形式悬浮，或者可以被衍生化产生更可溶的活性产物。所得混合物的形式依赖于许多因素，包括给予模式和所述化合物在选择的载体或者运载体中的溶解性。所得混合物是溶液、悬浮液、乳状液及其它这种混合物，且可以配制为非水溶液或者水溶液混合物、乳液、凝胶、软膏剂、乳状液、溶液、酏剂、洗剂、悬浮液、酊剂、糊剂、泡沫剂、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带，或者适于系统、局域(topical)或者局部(local)给予的任何其它配制物。对于局部(local)内在给予，如肌内、肠道外或者关节内给予，所述多肽可以配制为在水溶液介质中的溶液悬浮液，如等渗缓冲盐水，或者与用于内在给予的生物相容的支持物或者生物粘合剂组合。有效浓度是足以改善指定病症的浓度，可以根据经验确定。为了配制组合物，将化合物的重量含量以有效浓度溶解、悬浮、分散或者另外混合于选择的运载体中，由此减轻或者改善指定的病症。

通常地，药物可接受的组合物根据管理机构的许可制备，或者根据用于动物和人的公认的药典制备。药物组合物可包括载体如稀释剂、佐剂、赋形剂，或者运载体，利用其基于同种型。这种药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括源于石油、动物、植物或者合成的油，如花生油、大豆油、矿物质油以及芝麻油。当所述药物组合物经静脉内给予时，水是典型的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可以用作液体载体，特别是可注射溶液。组合物随同活性成分一起还包含：稀释剂，如乳糖、蔗糖、磷酸氢钙或者羧甲基纤维素；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸钙和滑石；结合剂如淀粉、天然树胶如gum acaciagelatin、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯比咯烷酮、纤维素及其衍生物、聚维酮(povidone)、crospovidones及本领域技术人员已知的其它这种结合剂。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、凝胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、无水脱脂奶、甘油、丙烯、乙二醇、水和乙醇。如果需要，组合物也可以含有微量增湿剂或者乳化剂，或者pH缓冲剂，例如乙酸酯、柠檬酸钠、环糊精衍生物、山梨聚糖月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯及其它这种物质。这些组合物可以使溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉末形式以及缓释配制形式。用于吸入器或者吹药器中的例如凝胶胶囊和药芯(cartridges)可以配制为含有治疗化合物和合适的粉末基质如乳糖或者淀粉的粉末状混合物。组合物可以配制为具有传统结合剂和载体如甘油三酸酯的栓剂。口服配制物可包含标准载体如药物级别甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁及其它这种物质。口服制备物也可以具有蛋白酶抑制剂适当配制，如Bowman-Birk抑制剂、缀合的Bowman-Birk抑制剂、aprotinin和camostat。举例的合适药物载体在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中描述。这种组合物含有通常是纯化形式的治疗有效量的化合物，以及适量的载体以提供正确给予对象或患者的形式。

所述配制物应适于给予模式。例如，修饰的FVII可以配制为通过注射的肠道外给予模式(例如通过推注或者持续灌注)。可注射的组合物可以采取这样的形式，如在油性或者水溶液运载体中的悬浮液、溶液或者乳状液。无菌可注射的制备物也可以是在无毒肠道外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或者悬浮液，例如于1-4丁二醇中的溶液。无菌不挥发油常规用作溶剂或者悬浮介质。为此，可以应用任何无刺激性的不挥发油，包括但不限于合成的甘油酯或者甘油二酯、脂肪酸(包括油酸)、天然发生的植物油如芝麻油、椰子油、花生油、棉籽油及其它油，或者合成的脂肪载体如油酸乙酯。如果需要可以掺入缓冲液、防腐剂、抗氧化剂以及合适成分，或者可包含所述配制物。

所述多肽可以配制为组合物中唯一药物活性成分，或者可以组合其它活性成分。所述多肽可以例如通过与靶向剂如抗体缀合而靶向输送。脂质体悬浮液包括靶向组织的脂质体也可以适用作药物可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知方法制备。例如，脂质体配制物可以如美国专利No.4,522,811所述制备。脂质体输送也可以包括缓释配制物，包括药物基质如用纤连蛋白修饰的胶原凝胶和脂质体(见例如Weiner et al.(1985)JPharm Sci.74(9):922-5)。本发明提供的组合物进一步可含有便于输送的一或多种佐剂，例如但不限于惰性载体或者胶质分散系统。这种惰性载体的代表性和非限制性例子可以选自水、异丙醇、气相碳氟化合物、乙醇、聚丙烯吡咯烷酮、丙二醇、产生凝胶的材料、硬脂醇、硬脂酸、鲸蜡、山梨聚糖单油酸酯、甲基纤维素，以及上述两或多种物质的适当组合。所述活性化合物以足以发挥治疗效力的量包含于药物可接受的载体中，对于治疗对象无不良副作用。治疗有效浓度可以通过在已知的体外和体内系统如本发明提供的测定中检测所述化合物而根据经验确定。

a.剂量

给予的治疗剂的精确量或剂量根据特定的FVII多肽、给予途径及其它因素如疾病的严重性以及对象的体重和一般状况而定。尽管在一些情况中治疗剂的局部浓度在局部给予之后可高于系统给药可安全达到的浓度，但是局部(Local)给予治疗剂与任何系统给药模式相比典型需要较小剂量。如果需要，可以根据经验确定或者推断特定的剂量和持续时间以及治疗方案。例如，举例的重组和天然FVII多肽的剂量可用作起始点以确定合适剂量。例如，已经活化为rFVIIa

的重组FVII(rFVIIa)多肽通过推注2-5分钟给予经历出血事件的血友病A或者血友病B患者，剂量为90μg/kg，达到有效循环水平为至少2μg/ml。每2小时重复给予该剂量直至达到止血。本发明提供的修饰的FVII多肽可以在与重组FVII相比较低的剂量和/或频率达到有效治疗。例如，可以给予的本发明提供的修饰的FVII多肽的剂量是80μg/kg、70μg/kg、60μg/kg、50μg/kg、40μg/kg、30μg/kg、20μg/kg、15μg/kg或更低。在一些实施方案中，该剂量可以更高，如100μg/kg、110μg/kg、120μg/kg或更高。治疗持续时间以及注射间隔根据出血严重程度以及患者对治疗的反应而有所不同，可以因此而调整。当确定剂量时，可以考虑与未修饰的FVII相比修饰的FVII的活性水平和半衰期等这样的因素。特定剂量和给药方案可以根据经验确定。

在另一实例中，已经被活化为rFVIIa(

)的重组FVII(rFVIIa)多肽通过推注2-5分钟给予经历出血事件的先天性FVII缺陷患者，剂量为15-30μg/kg。每4-6小时重复给予该剂量脂质达到止血。本发明提供的修饰的FVII多肽与这种重组FVII相比可以在较低剂量和/或频率达到有效治疗效果。例如，可以给予的本发明提供的修饰的FVII多肽的剂量是20μg/kg、15μg/kg、10μg/kg、5μg/kg、3μg/kg或更低。在一些实例中，该剂量可以更高，如35μg/kg、40μg/kg、45μg/kg或更高。治疗持续时间以及注射间隔根据出血严重程度以及患者对治疗的反应而有所不同，可以因此而调整。当确定剂量时，可以考虑与未修饰的FVII相比修饰的FVII的活性水平和半衰期等这样的因素。例如，呈现比未修饰的FVII多肽较长的半衰期的修饰的FVII多肽可以与未修饰的FVII多肽相比较低剂量和/或较低频率给予。相似地，使用与未修饰的FVII多肽比凝血活性增加的修饰的FVII多肽达到治疗效力需要的剂量可以是频率和量降低。特定剂量和给药方案可以由本领域技术人员根据经验确定。

b.剂型

药物治疗活性化合物及其衍生物以单位剂量形式或者多剂量形式配制和给予。给予人和动物的配制物的剂量形式包括但不限于含有适量化合物的或者其药物可接受的衍生物的片剂、胶囊、丸剂、粉末、颗粒剂、无菌肠道外溶液或者悬浮液、口服溶液或者悬浮液，以及油水乳状液。每个单位剂量含有预定数量的足以产生预期治疗效力的治疗活性化合物，以及需要的药物载体、运载体或者稀释剂。举例的单位剂量形式包括安瓿和注射器以及单独包装的片剂或胶囊。在一些实例中，单位剂量是在给予之前重建的冻干粉末。例如，FVII多肽可以是冻干粉末，用合适溶液重建产生单一剂量溶液以进行注射。在一些实施方案中，冻干粉末可含有FVII多肽及其它成分，如盐，由此用无菌蒸馏水重建获得于缓冲的或者盐水溶液中的FVII多肽。单位剂量形式可以部分或者成倍给予。多剂量形式是包装在一个容器中的多个相同单位剂量形式，以分开的单位剂量形式给予。举例的多剂量形式包括片剂或胶囊小瓶、瓶或者品脱或加仑瓶。因此，多剂量形式是在包装中未分开的多个剂量单位。

2.给予修饰的FVII多肽

本发明提供的FVII多肽(即活性化合物)可以在体外、离体或者在体内给予，通过将如体液或者其它组织样品等混合物与FVII多肽接触给予。例如，当离体给予化合物时，可以将对象的体液或组织样品与FVII多肽接触，所述FVII多肽包被于试管或者滤膜上，例如bypass仪中的试管或滤膜。当在体内给予时，活性化合物可以通过任何合适途径给予，例如在液体、半液体或固体形式中口服，经鼻，经肺，胃肠外，静脉内，皮内，皮下、关节内、脑池内、眼内、脑室内、鞘内、肌内、腹膜内、气管内或者局部给予以及上述任两或多种方式的任意组合，并以适宜每种给药途径的方式配制。修饰的FVII多肽可以一次或者一次以上给予，例如给予2、3、4次或者达到治疗效力需要的任何次数。可以通过任何途径或者途径组合多次给药，且可以每小时、每2小时、每3小时、每4小时或者更多小时给药一次。

最合适的给药途径根据治疗的疾病状况而不同，例如出血性疾病的部位。通常地，FVII多肽通过静脉内推注给予，给药(灌注)时间为大约2-5分钟。在其它实例中，希望的FVII血液水平可以通过持续灌注活性剂而维持，由血浆水平确定。应注意主治医生知道由于毒性或者骨髓、肝或肾功能障碍而怎样及何时结束、中断或者调整治疗以降低剂量。相反，如果临床反应不足(排除毒性副作用)，主治医生也已知怎样及何时调整治疗方案至较高水平。在其它实例中，出血性疾病的部位可指示FVII配制物通过另外途径给予。例如，当患者在脑部出现出血时，可进行局部(local)给予，包括给予脑中(例如脑室内给药)。相似地，治疗关节出血时，可以将治疗剂经注射局部给予关节内(即关节内、静脉内或者皮下给药方式)。在其它实例中，当在皮肤或者肺发生出血时，可以适当地将治疗剂例如配制成乳液、凝胶或者软膏剂局域(topical)给予皮肤，或者通过吸入或者气管内给药方式给予肺。

在修饰的FVII多肽配制成长效制剂(depot preparation)形式的情况中，可以通过植入(例如皮下或肌内)或者通过肌内注射给予长效制剂。因此，例如所述治疗化合物可以与合适的聚合或者疏水性材料(例如于可接受的油中的乳状液)或者离子交换树脂配制，或者配制为略溶的衍生物，例如略溶的盐。

如果需要，所述组合物可以存在于包装、试剂盒或者分散装置中，其可含有一或多种含有活性成分的单位剂量形式。所述包装例如含有金属或者塑料箔，如发泡包装。所述包装或分散装置可附带使用说明。含有活性成分的组合物可包装成含有包装材料、本发明提供的药剂以及说明所述药剂治疗的疾病的标签的制品。

3.给予编码修饰的FVII多肽的核酸(基因治疗)

本发明提供了适于基因治疗的编码修饰的FVII多肽的核酸分子及编码其的表达载体的组合物。与蛋白质的递送不同，核酸可以在体内给予，例如系统给药或通过其它途径或离体给药，诸如通过取出细胞包括淋巴细胞，导入本发明的核酸，以及再导入宿主或相容受体中。

修饰的FVII多肽可通过表达核酸分子递送到细胞和组织。修饰的FVII多肽可作为编码修饰的FVII多肽的核酸分子给药，包括离体技术和直接体内表达。核酸可通过本领域技术人员已知的任何方法递送。分离的核酸序列可掺入载体以进一步操作。如本文所用，载体(或质粒)是指分离的元件，用于将异源DNA导入细胞进行表达或复制。这种载体的选择或利用为本领域技术人员已知。

通过表达编码核酸分子来给予修饰的FVII多肽的方法包括给予重组载体。所述载体可设计为保持附加型，诸如通过包含复制起点，或可设计为整合进入细胞中的染色体。修饰的FVII多肽也可利用非病毒载体用于离体基因表达中。例如，细胞可经工程化表达修饰的FVII多肽，诸如通过将编码修饰的FVII多肽的核酸整合进入基因组位置，所述核酸可操纵地连接于调节序列，或者其被置于基因组中与调节序列可操纵地连接的位置。这种细胞随后可局部或系统给予对象，诸如需要所述治疗的患者。

可使用病毒载体，包括例如腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、痘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒以及设计为用于基因治疗的其它病毒。所述载体可保持附加型或者可整合进入治疗对象的染色体中。修饰的FVII多肽可由病毒表达，将其给予需要治疗的对象。适于基因治疗的病毒载体包括腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、痘苗病毒以及其它上述病毒。例如,腺病毒表达技术是本领域熟知技术，并且腺病毒产生和给予方法也为本领域熟知。腺病毒血清型可得自例如美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville,MD)。腺病毒可离体使用，例如从需要治疗的患者分离细胞，并利用表达修饰的FVII多肽的腺病毒载体转导。在适宜的培养时间之后，将转导的细胞局部和/或系统地给予对象。或者，分离表达修饰的FVII多肽的腺病毒颗粒，并且在药物可接受的载体中配制以递送治疗有效量来预防、治疗或改善对象的疾病或病症。典型地，腺病毒颗粒以1-10¹⁴个颗粒/公斤对象体重的剂量范围递送，通常为10⁶或10⁸个颗粒到10¹²颗粒/公斤对象体重。在一些情况中，需要提供核酸来源以及靶向细胞的药剂，诸如细胞表面膜蛋白或靶细胞特异性抗体，或靶细胞受体的配体。FVII多肽也可被靶向递送到特定细胞类型，例如编码FVII多肽的腺病毒载体可用于在不分裂的细胞如肝细胞中稳定表达(Margaritis et al.(2004)J Clin Invest113:1025-1031)。在另一实例中，编码FVII多肽的病毒或非病毒载体可被转导进分离的细胞中用于随后的递送。用于表达和递送FVII多肽的其它细胞类型可包括但不限于成纤维细胞和内皮细胞。

核酸分子可被导入人工染色体和其它非-病毒载体中。人工染色体，诸如ACES(见Lindenbaum et al.(2004)Nucleic Acids Res.32(21):e172)可经工程化编码和表达同种型。简而言之，在非整合模式的自主复制中，哺乳动物人工染色体(MACs)提供将高有效负载的遗传信息导入细胞的方式。MAC的独特之处是基于哺乳动物卫星DNA的人工染色体表达(ACE)可以在不同物种的细胞系中可再生地重新产生，且可易于从宿主细胞染色体中纯化。纯化的哺乳动物ACE可再导入多种受体细胞系，其中它们在缺乏选择性压力的条件下利用ACE系统稳定保持延长的时间。利用该方法，一或两个基因靶的特定负载可在LMTK(-)和CHO细胞中实现。

导入编码修饰的FVII多肽的核酸的另一方法是在酵母中的两步基因置换技术，使用在酵母人工染色体(YAC)中克隆的完整腺病毒基因组(Ad2；Ketner et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:6186-6190)、含有靶向YAC克隆中特定区域的腺病毒序列的质粒、感兴趣的基因表达盒以及阳性和阴性选择标记开始。YAC是特别感兴趣的，因为它们允许掺入较大的基因。这种方法可用于构建基于腺病毒的载体，其携带编码任何所述修饰的FVII多肽的核酸用于向哺乳动物细胞或完整动物的基因转移。

核酸可以在载体诸如脂质体中制成胶囊，或导入细胞诸如细菌细胞特别是弱化的细菌中，或导入病毒载体中。例如，当利用脂质体时，结合与胞吞相关的细胞表面膜蛋白的蛋白质可用于靶向和/或促进摄取，例如具有特定细胞类型向性的病毒衣壳蛋白或其片段，经历循环中的内化的蛋白的抗体，以及靶向细胞内定位和延长细胞内半衰期的蛋白。

对于离体和体内方法,编码修饰的FVII多肽的核酸分子被导入来自适宜供体或待治疗对象的细胞。可导入核酸用于治疗目的的细胞包括例如任何希望的可利用的适于待治疗的疾病或病症的细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌肉细胞、肝细胞；血液细胞诸如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干或祖细胞，特别是造血干或祖细胞，例如得自骨髓、脐带血、外周血、胎肝和其它来源的干细胞。

对于离体治疗，取来自与待治疗对象相容的供体的细胞或待治疗细胞出，将核酸导入这些分离的细胞中，并将修饰的细胞给予对象。治疗包括直接给药，诸如在多孔膜内制成胶囊，将其植入患者(见例如美国专利No.4,892,538和5,283,187，每篇文献均以其全部内容并入本文作参考)。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括利用脂质体和阳离子脂质(例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)电穿孔，显微注射，细胞融合，DEAE-葡聚糖和磷酸钙沉淀法。DNA递送方法用于在体内表达修饰的FVII多肽。这种方法包括核酸的脂质体递送以及裸DNA递送，包括局部(local)和系统递送，诸如利用电穿孔，超声和磷酸钙递送。其它技术包括显微注射，细胞融合，染色体介导的基因转移，微细胞介导的基因转移和原生质球融合。

修饰的FVII多肽的体内表达可与其它分子的表达连接。例如，修饰的FVII多肽的表达可与细胞毒性产物如在工程化病毒中的表达连接或在细胞毒性病毒中表达。这种病毒可靶向特定细胞类型，该细胞是治疗效应的靶位。表达的修饰的FVII多肽可用于增强病毒的细胞毒性。

修饰的FVII多肽的体内表达可包括编码修饰的FVII多肽的核酸分子与特定的调节序列如细胞特异性或组织特异性载体的可操纵地连接。修饰的FVII多肽也可从特异性感染和/或在靶细胞类型和/或组织中复制的载体中表达。可诱导的启动子可用于选择性调节修饰的FVII多肽表达。举例的可调节表达系统是强力霉素-可诱导基因表达系统，其已经被用于调节重组FVII表达(Srour et al.(2003)Thromb Haemost.90(3):398-405)。

核酸分子，作为裸核酸或在载体、人工染色体、脂质体和其它载体中，可通过系统性、局域(topical)、局部(local)或其它给药途径给予对象。当系统性或体内给药时，所述核酸分子或含有所述核酸分子的载体可靶向细胞。

给药也可直接进行，例如通过给予典型靶向细胞或组织的载体或细胞。例如肿瘤细胞和增殖可以是修饰的FVII多肽的体内表达的靶向细胞。用于体内表达修饰的FVII多肽的细胞也包括患者的自体细胞。这种细胞可从患者取出，导入表达修饰的FVII多肽的核酸，然后通过注射或移植物植入给予患者。

I.治疗应用

本发明提供的修饰的FVII多肽可用于治疗利用重组FVII治疗的任何病症。典型地，这种治疗包括其中希望增强凝血，如增强止血反应的那些病症。修饰的FVII多肽具有单独的治疗活性或与其它药剂组合。本发明提供的修饰的多肽设计为保持治疗活性但显示改变的性质，特别是TFPI抗性增加、AT-III抗性增加、催化活性增强、半衰期延长和/或与活化的血小板的结合和/或亲和性增强。所述改变的性质，例如由于修饰的FVII多肽的凝血活性增强而可改善所述多肽的治疗效力。这个章节提供了举例的应用和给药方法。这些治疗是示例性的并且不限制修饰的FVII多肽的应用。

本发明提供的修饰的FVII多肽可用于其中利用FVII的多种治疗以及诊断方法中。这种方法包括但不限于治疗下文描述和列举的生理和临床疾病的方法。本发明提供的修饰的FVII多肽显示体内活性和治疗效果与野生型FVII多肽相比改善，包括较低的剂量即可实现相同的效果，其它给药和治疗方面的改善如较少和/或更低给药频率、副作用降低以及治疗效力增强。尽管理解修饰的FVII多肽可以作为FVII酶原(即单链形式)给予，但是本发明提供的修饰的FVII多肽是以活性的双链形式给予，例如在纯化期间自身激活或者由其它凝血因子活化。

特别地，修饰的FVII多肽意图用于利用FVII进行治疗的治疗方法中。这种方法包括但不限于治疗疾病和病症的方法，所述疾病和病症例如但不限于血液凝固失调，出血性疾病，血友病，如血友病A、血友病B，和因子VII缺陷，以及获得性血液疾病，如因肝病导致的获得性因子VII缺陷。修饰的FVII多肽也可用于治疗其它出血性疾病和病症，例如但不限于血小板减少症(例如化疗所致)，Von Willebrand's病，遗传性血小板功能障碍(例如贮存池病如Chediak-Higashi和Hermansky-Pudlak综合症，凝血噁烷A2功能失调，Glanzmann’s血小板机能不全和Bernard-Soulier综合症)，溶血性尿毒症综合征，遗传性出血性毛细血管扩张症-也称作Rendu-Osler-Weber综合症，过敏性紫癜(Henoch Schonlein紫癜)以及播散性血管内凝血。

在一些实施方案中，通过FVII治疗的出血发生在如脑、内耳、眼、肝、肺、肿瘤组织、胃肠道这样的器官。在其它实施方案中，所述出血是播散性的，如出血性胃炎和血崩。患有出血性疾病如血友病A和血友病B的患者在手术或外伤期间通常处于出血并发症的危险中。这种出血可以是急性关节血肿(关节内出血)、慢性血友病关节病、血肿(例如肌肉、腹膜后、舌下和咽后血肿)、血尿(来自肾的出血)、中枢神经系统出血、胃肠道出血(例如UGI出血)以及脑出血，其也可以用修饰的FVII多肽治疗。此外，与手术(例如肝切除术)或者拔牙相关的任何出血均可以用修饰的FVII多肽治疗。在一个实施方案中，修饰的FVII多肽可用于治疗由于外伤或者手术或者对象血小板计数或活性较低引起的出血。举例的对手术患者的处理方法包括防止出血的处理以及在术前、术中和术后的处理，所述手术包括但不限于心脏手术、血管成形术、肺手术、腹部手术、脊柱手术、脑手术、血管手术、牙齿手术或者器官移植术，包括骨髓移植、心脏移植、肺移植、胰腺移植或者肝移植。

利用修饰的FVII多肽治疗疾病和病症可通过任何适宜给药途径利用本文所述适宜配制剂进行，包括但不限于注射、经肺、口服和透皮给药。典型通过静脉内推注药物进行治疗。

如果需要，可以根据经验确定或者推断特定剂量和持续时间以及治疗方案。例如，重组和天然FVII多肽的示例性剂量可用作起始点来确定适宜的剂量。例如，已经被活化为rFVIIa(

)的重组FVII(rFVIIa)多肽已经通过推注2-5分钟给予发生出血的血友病A或者血友病B患者，剂量为90μg/kg，达到有效循环水平为至少2μg/ml，平均半衰期为2.7小时。每2小时重复给予该剂量直至达到止血。由于TFPI抗性增加、AT-III抗性增加、催化活性增强、半衰期延长和/或与活化的血小板结合和/或亲和性增加而导致凝血活性增强的修饰的FVII多肽，与这种重组FVII相比以较低剂量和/或给药频率即可达到有效治疗效果。野生型或未修饰的FVII多肽的剂量可用作确定修饰的FVII多肽剂量的指导。如修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比的活性水平和半衰期等因素可用于进行这样的确定。特定剂量和方案可以根据经验确定。

剂量水平和方案可基于已知的剂量和方案确定，如果需要可基于修饰的多肽的性质的改变推断，和/或可基于多种因素根据经验确定。这样的因素包括个体的体重，一般状况，年龄，所用特定化合物的活性，性别，饮食，给药时间，排泄速度，药物组合，疾病严重度和病程，以及患者的疾病倾向和医师的判断。活性成分多肽典型与药物有效载体组合。可以与载体材料组合产生单剂量形式或多剂量形式的活性成分的量可根据治疗的宿主以及给药的具体模式而不同。

FVII多肽对于血液凝血时间的作用可以通过使用本领域已知的任何凝血试验监测，包括但不限于全血凝血酶原时间(PT)、活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)、活化凝血时间(ACT)、重钙化活化凝血时间或者Lee-White凝血时间测定。

患者病情改善后，如果需要可给予维持剂量的化合物或组合物；剂量、剂型以及给药频率或其组合可以改变。一些情况中，所述对象需要针对任何疾病症状的复发的间断长期治疗，或有计划的给药。其它情况中，需要另外给药应对急性事件诸如出血、创伤或外科手术。

下文内容是一些示例性疾病，其中FVII(以FVIIa形式给予)可用作单独的治疗剂或与其它药剂组合。

1.先天性出血疾病

a.血友病

先天性血友病是一种隐性血液疾病，其中血浆中凝血因子水平降低，导致血液凝固级联中断以及凝血时间延长。血友病A占所有血友病病例的大约85%，是由于X染色体上因子VIII基因突变，导致FVIII蛋白缺陷或者功能障碍所致。血友病B是由于凝血因子FIX缺陷或者功能障碍所致，通常是由于X染色体上FIX基因点突变或者缺失所致。世界范围内血友病A的发病率是大约每5000个男性1例，血友病B的发病率是每25000个男性1例。血友病A和B进一步分为轻度、中度或者严重三类。血浆水平有5%-25%正常起作用的因子VIII或IX是轻度血友病，1%-5%是中度血友病，低于1%是严重血友病。血友病C通常被称作FXI缺陷，是相对较轻和罕见的疾病，以常染色体隐性方式影响大约1/100000的人。

血友病A和B在临床上以多种方式显现。轻微的割伤和擦伤不引起过多的出血，但是外伤和手术则引起过多出血。患者还将出现最多关节和肌肉出血，且易于皮下出血。关节血肿或者关节内出血是血友病的一个主要并发症，且可以是自发的或者由于外伤引起。屈戍关节如膝关节、肘关节和踝关节是最易受累的关节。臀和肩较少受影响，因为球窝关节具有更多的肌肉组织环绕关节，因此更多地保护其免于损伤。出血可导致严重疼痛、活动受限，以及导致继发并发症包括滑膜增生。此外，关节内反复发生出血可以导致慢性滑膜炎，这可导致关节损伤、破坏滑膜、软骨和骨。血友病患者也会发生危及生命的出血如颅内出血和中枢神经系统出血。大约10%的严重血友病患者发生颅内出血，导致30%死亡率。相反，血友病C病情更轻一些。自发出血较罕见，且关节、软组织和肌肉中的出血也不常见。出血通常通过输注新鲜冷冻血浆(FFP)、FXI替代治疗，或者对于外伤或者拔牙可以采取用纤维蛋白胶进行局部治疗。

血友病A或B的最常用的治疗是替代治疗，其中给予患者FVIII或者FIX。所述配制品可作为血浆衍生的或者产物产物商购，目前选择重组蛋白治疗先前未经治疗的患者。虽然这些治疗方法可以非常成功，但是如果患者产生新给予的因子VIII或者因子IX的抑制剂，则发生并发症。抑制剂是IgG抗体，主要是IgG4类别，其与FVIII或FIX反应且干扰促凝血功能。抑制剂影响大约1/5严重血友病A患者。大多数患者在第一次输注给予因子VIII后不久即产生抑制剂，虽然可以在生命较后期发生，但这个事件通常在儿童早期发生。抑制剂还影响大约1/15的轻度或者中度血友病A患者。这些抑制剂通常在成人期发生，且不仅破坏给予的外源FVIII，而且还破坏内源FVIII。结构，轻度和中度血友病变成严重血友病。在临床上，具有抑制剂的血友病A患者根据其再次暴露于FVIII时经历的回忆反应的强度而被分为高反应和低反应类别。抑制剂影响大约1/100血友病B患者。在大多数情况中，抑制剂在第一次输注治疗性因子IX之后产生，且可以伴随变态反应。

本发明的修饰的FVII多肽可用于治疗血友病患者，特别是具有抑制剂的血友病患者。重组FVIIa产物(NovoSeven,Novo Nordisk)已经被批准并许可用于治疗具有FVIII或FIX抑制剂的血友病A或B患者出血事件，以及用于预防具有FVIII或FIX抑制剂的血友病A或B患者的手术干预或者创伤手术术中的出血。用rFVIIa治疗增强凝血酶产生，减少(bypassing)FVIIIa和/或FIXa的需求。凝血在损伤部位通过rFVIIa与TF的相互作用而起始，导致最初FX活化、凝血酶产生以及血小板活化。通过TF依赖性和TF非依赖性机制可实现rFVIIa所致完全凝血，其中一些产生的凝血酶可以得自FX对由单独的rFVIIa活化的血小板的直接活化作用，其通过与磷脂膜的低亲和性相互作用而自身结合活化的血小板。

本发明提供的修饰的FVII多肽可用于治疗血友病，包括治疗出血事件和预防手术或者创伤手术中的出血。本发明提供的修饰的FVII多肽增加TF/FVIIa复合抑制剂抗性、增加TFPI抗性、增加TFPI抗性、增加催化活性、延长半衰期、和/或增强与活化血小板的结合和/或亲和性。FVII多肽因此可呈现更高的TF依赖性(如通过TFPI抗性增加)和/或TF非依赖性(如通过与活化血小板的结合和/或亲和性增加)凝血活性。因此，修饰的FVII多肽可用于为血友病患者输送更多的活性治疗剂。使用修饰的FVII多肽获得的治疗改善例如包括但不限于剂量减少、给药频率降低和/或更低、副作用降低以及治疗效力增加。

修饰的FVII多肽典型作为活化的FVII(FVIIa)多肽给予。可以例如通过动物模型检测修饰的FVII多肽的治疗效力。例如可以用修饰的FVII多肽治疗抗体诱导的血友病小鼠或者任何其它已知血友病模型。监测疾病症状的进展和表型，以评估修饰的FVII多肽的效力。修饰的FVII多肽也可以给予临床实验对象，以评估与安慰剂对照组和/或使用未修饰的FVII对照组对比修饰的FVII多肽的体内效力。

b.FVII缺陷

因子VII缺陷是一种常染色体隐性出血性疾病，其影响大约1/500000的人。FVII缺陷可以临床轻、中或重度缺陷，轻度至中度缺陷特征在于手术和外伤后出血增加。严重FVII缺陷的患者(低于1%FVII活性)表现出与血友病相似症状。例如，FVII-缺陷患者趋向于关节出血、自发鼻子出血、胃肠道出血、尿道出血。脑内出血和肌出血也有报道，妇女可出现严重月经过多(严重月经出血)。可以通过替代疗法进行治疗。重组FVIIa产物(

Novo Nordisk)已经被批准和许可用于治疗先天性FVII缺陷患者中的出血事件以及用于预防先天性FVII缺陷患者的手术或创伤手术中的出血。因此，修饰的FVII多肽可相似地应用。本发明提供的修饰的FVII多肽可用于治疗FVII缺陷患者的出血事件以及预防手术或创伤手术中的出血。例如，可以通过静脉内推注给予具有颅内出血的严重FVII缺陷的新生儿患者修饰的FVII多肽，以实现凝血并保持止血。通常修饰的FVII多肽作为活化的FVII(FVIIa)多肽给予。

c.其它

可以用本发明提供的FVII多肽治疗其它出血性疾病以促进凝血。先天性因子V和X缺陷也表现为血液凝固时间延长，可以通过给予治疗剂量的FVII治疗。例如，可以给予因子X缺陷患者rFVIIa以控制与脾切除术相关的出血(Boggio et al.(2001)Br J Haematol112:1074-1075)。与von Willebrand病(vWD)相关的自发出血和手术出血事件也可以通过使用本发明提供的修饰的FVII多肽治疗。VWD是由于凝血蛋白von Willebrand因子(vWF)的不足或缺陷导致的出血性疾病，据估计在1%-2%人群中发生。vWD患者易于发生瘀伤，反复发作的鼻出血，拔牙、扁桃体摘除或者其它手术后出血，以及女性患者可出现月经出血量增多。修饰的FVII多肽可用于改善vWD患者的自发及手术相关的出血(von Depka et al.(2006)Blood Coagul Fibrin17:311-316)。其它血小板相关出血性疾病例如Glanzmann’s血小板机能不全和Hermansky-Pudlak综合症也与内源凝血活性降低相关。血小板相关出血性疾病患者中过量的自发出血或者手术相关出血也可以通过治疗剂量的修饰的FVII多肽控制。例如，Glanzmann’s血小板机能不全患者进行手术可以在术前、术中和/或术后用修饰的FVII多肽治疗，以防止大量血液丧失(vanBuuren et al.(2002)Dig Dis Sci47:2134-2136)。通常地，修饰的FVII多肽以活化的FVII(FVIIa)多肽给予。

2.获得性出血疾病

a.化疗获得性血小板减少症

出血性疾病也可以不是先天性而是获得性的。例如，针对如白血病及其它癌症实施的化疗可导致血小板减少症。这可能是由于接受化疗的患者骨髓中血小板产生减少所致，典型在治疗后6-10天发生。获得性血小板减少症的治疗通常是输注血小板、红细胞或者血浆，以防止可由于血小板缺陷导致的任何异常自发出血。化疗诱导的血小板减少症或者任何其它获得性或者先天性血小板减少症患者的出血事件，也可以通过给予治疗量的本发明提供的修饰的FVII多肽控制。例如，血小板减少症患者出现不可控制的出血如胃肠道出血，可以静脉内推注治疗量的FVII多肽以终止出血(Gerotziafas et al.(2002)Am J Hematol69:219-222)。通常地，修饰的FVII多肽作为活化的FVII(FVIIa)多肽给予。

b.其它凝血病

其它凝血病也可以使用本发明提供的修饰的FVII多肽治疗。凝血病可由于这样的情况导致，包括但不限于爆发性肝衰竭(FHF；如肝毒性药物、毒素、代谢性疾病、感染性疾病以及缺血导致)，其它肝脏疾病，包括肝硬化和Wilson’s病相关疾病，维生素K缺乏(如抗生素治疗或者饮食所致)，溶血性尿毒症综合征，血栓性血小板减少症(TTC)以及播散性血管内凝血(DIC)。常规治疗通常是输注血浆、红细胞(RBC)或者血小板，但是也可能不成功。在一个实施方案中，修饰的FVII多肽可以给予进行创伤手术的FHF患者以防止出血。使用新鲜冷冻血浆(FFP)进行的常规治疗通常不成功，且需要大量血浆，产生体积过负荷和全身性水肿(水肿液渗入皮下结缔组织中)。在例如FHF患者进行肝活检或者肝移植术这样创伤手术前、术中和/或术后通过静脉内推注治疗量的修饰的FVII多肽治疗，可以预防出血及确立止血。通过血液PT监测患者，以确定治疗效力(Shami et al.(2003)LiverTranspl9:138-143)。在另一实施方案中，可以给予凝血病相关的严重出血患者FVII，例如对常规输血无反应的、与肝功能不良和DIC相关的严重剖腹产后腹内出血(Moscardo et al.(2001)Br J Haematol113:174-176)。此外，修饰的FVII多肽可用于治疗新生儿和小儿凝血病。在一特别的实施方案中，新生儿和小儿患者对于常规治疗如输注红细胞和血小板无反应。例如，可以给予对输注红细胞和血小板无反应的PT延长相关的严重非出血的新生儿修饰的FVII多肽，以降低PT及确立止血(Olomu et al.(2002)J Perinatol22:672-674)。本发明提供的修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比呈现出凝血活性增强，因此可以较低剂量、较低频率给予，并且具有较少的不利反应。通常所述修饰的FVII多肽作为活化的FVII(FVIIa)多肽给予。

c.移植获得性出血

在骨髓移植(BMT)和肝细胞移植(SCT)后出现的严重出血是与这些移植相关的由于血小板减少而引起的较常见的且危及生命的并发症。例如，弥漫性肺泡出血(DAH)是BMT的肺部并发症，据估计在移植人群发病率为1-21%，死亡率为60-100%。这种出血事件的常规治疗包括皮质类固醇治疗以及输注血浆。血小板和/或红细胞，但是仍有大量不成功案例，总死亡率为大约50%(Hicks et al.(2002)Bone Marrow Transpl30:975-978)。通过静脉内推注给予FVII，同时给予或不给予皮质类固醇和/或输注血小板治疗，可以治疗DAH并确立止血(Hicks et al.(2002)Bone Marrow Transpl30:975-978)。本发明提供的修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比呈现出最强的凝血活性，并因此可以较低剂量、较低频率给予，缩短治疗持续时间并且具有较少的不利反应，获得相同的生物学活性和效力。通常所述修饰的FVII多肽作为活化的FVII(FVIIa)多肽给予。

d.抗凝血治疗诱导的出血

对例如血栓经抗凝血治疗的患者在急性给予抗凝剂如warfarin、肝素和fondaparinux时可以发生出血事件，或者由于长期使用这种治疗而发生出血性疾病。治疗出血事件典型包括给予促凝剂，如维生素K，血浆，外源FIX以及鱼精蛋白以中和肝素。给予外源FVII也可以中和抗凝血剂的作用，延长PT、aPTT，和/或其它凝血标记物以及确立止血(Deveras et al.(2002)AnnInten Med137:884-888)。本发明提供的修饰的FVII多肽可用于控制由于抗凝剂治疗导致获得性出血性疾病患者中的出血事件的治疗中。通常所述修饰的FVII多肽以活化的FVII(FVIIa)多肽给予。

e.获得性血友病

因子VIII抑制剂可以在其它健康个体中自发产生，导致称作“获得性血友病”的病症。获得性血友病是一种罕见病症，每年发病率为0.2-1.0/百万人口。自身抗体主要是IgG4抗体，当与FVIII结合时，通过妨碍凝血酶裂解、von Willebrand因子相互作用和/或磷脂结合而抑制FVIII活性。由此导致大约87%患者出现危及生命的出血。出血常见部位是皮肤、粘膜、肌肉和腹膜后腔，相反遗传性血友病患者的出血主要在关节和肌肉。获得性血友病可以用活化的凝血酶原复合物浓缩物或者重组活化的因子VII(Novo Nordisk)治疗，以控制出血。本发明提供的修饰的FVII多肽与未修饰的多肽相比呈现增强的凝血活性，因此可以给予较低剂量、较低频率、较短治疗持续时间以及较少的不利作用而获得相同生物学活性和效力。通常所述修饰的FVII多肽以活化的FVII(FVIIa)多肽给予。

3.外伤与手术出血

FVII多肽可用于治疗具有正常凝血系统的对象在围手术期和外伤时血液丧失相关的出血。例如，可以给予患者FVII多肽以促进凝血病降低与手术相关的血液丧失，并且进一步降低输血的需求。在一个实施方案中，FVII多肽可以给予进行耻骨后前列腺切除术的患者。耻骨后前列腺切除术通常与大量血液丧失相关，随后需要输血。可以在手术早期经静脉内推注给予经历这种或者相似手术的对象治疗量的FVII，以通过增强手术部位的凝血功能而降低围手术期血液丧失。降低血液丧失可以使得这些患者不需要输血(Friederich et al.(2003)Lancet361:201-205)。FVII多肽可以给予正常凝血功能的其它类型手术患者，以快速止血及预防血液丧失。其中典型以活化形式给予的FVII(即FVIIa)可用作降低围手术期出血的治疗剂的手术非限制性例如包括但不限于心脏瓣膜手术(Al Douri et al.(2000)Blood CoagFibrinol11:S121-S127)、大动脉瓣置换手术(Kastrup et al.(2002)Ann ThoracSurg74:910-912)、复发血管外皮细胞瘤切除术(Gerlach et al.(2002)JNeurosurg96:946-948)、癌症手术(Sajdak et al.(2002)Eur J Gynaecol Oncol23:325-326)以及十二指肠溃疡手术(Vlot et al.(2000)Am J Med108:421-423)。用FVII治疗可促进手术部位止血，并降低或者预防血液丧失，从而降低或者消除输血需求。本发明提供的修饰的FVII多肽被设计为与未修饰的FVII多肽相比凝血活性增强，并因此可例如给予较低剂量、较低频率，并且不利反应较少。通常所述修饰的FVII多肽以活化的FVII(FVIIa)多肽给予。

因子VII多肽可用于在外伤对象中促进凝血及防止血液丧失。外伤被定义为由于外界因素导致活组织损伤，在美国是导致死亡的第四大因素。外伤分为钝伤(导致内挤压、器官损害和内出血)或者穿透伤(外来物质穿透机体并破坏组织、血管和器官的结果，导致外出血)。外伤可以由许多事件引起，包括但不限于交通意外(导致钝伤和/或穿透伤)、枪击伤(导致穿透伤)、刺伤(导致穿透伤)、机械事故(导致穿透伤和/或钝伤)，以及高处跌落(导致穿透伤和/或钝伤)。由于外伤导致的不受控制的出血是造成大多数相关死亡率的原因。播散性凝血是外伤患者相关的相对常见的并发症，发生率为25–36%。凝血病可以在损伤后不久即发生，由于多种因素如凝血因子和血小板的稀释和消耗、纤维蛋白溶解、酸中毒以及体温降低等导致。常规的治疗措施包括替代疗法，输注新鲜冷冻血浆(FFP)、血小板、红细胞和/或冷凝蛋白质，纠正酸中毒以及治疗体温过低。这些步骤通常不足以终止出血和预防死亡。通过给予外伤患者治疗量的FVII治疗可以促进凝血并减少血液丧失。例如，对大失血的枪击伤患者除了进行手术治疗之外，可以给予FVII以控制凝血病变出血(Kenet et al.(1999)Lancet354:1879).在钝伤和穿透伤患者中用FVII进行凝血治疗可有效地减少血液丧失和出血(Rizoli et al.(2006)Crit Care10:R178)。本发明提供的修饰的FVII多肽被设计为与未修饰的FVII多肽相比呈现出凝血活性增强，因此可以例如给予较低剂量、较低频率，且不利反应较少。通常所述修饰的FVII多肽以活化的FVII(FVIIa)多肽给予。

J.组合治疗

本发明所述任何修饰的FVII多肽可以与其它治疗剂或方法组合、在其它治疗剂之前、与其它治疗剂间歇或在其它治疗剂之后给药，所述其它治疗剂包括但不限于其它生物小分子化合物和手术。对于任何可以或已经利用FVII(包括FVIIa和rFVIIa)治疗或可用其它药剂和疗法治疗的疾病或病症，包括上文所述的所有那些疾病，FVII可与其它药剂组合使用。因此，本发明提供的修饰的FVII多肽可相似地使用。根据待治疗疾病或病症，举例的组合包括但不限于组合其它血浆纯化的或重组凝血因子，促凝剂如维生素K、维生素K衍生物和C蛋白抑制剂，血浆，血小板，红细胞和皮质类固醇。

K.制品与试剂盒

修饰的FVII多肽或编码所述修饰的FVII多肽的核酸或其衍生物或生物活性部分的药物化合物可包装成制品，其含有包装材料、有效治疗止血疾病或病症(hemostatic disease or disorder)的药物组合物以及指示修饰的FVII多肽或核酸分子用于治疗止血疾病疾病或病症的说明书。

本发明提供的制品含有包装材料。用于包装药物产品的包装材料为本领域技术人员熟知。见例如美国专利5,323,907、5,052,558和5,033,352所述，每篇文章均以其全部内容并入本文作参考。举例的药物包装材料包括但不限于发泡包装，瓶，管，吸入器，泵，包，小瓶，容器，注射器，瓶以及适于所选配制剂和指定给药方式和治疗的任何包装材料。本发明包含本发明提供的化合物和组合物的多种配制剂，用于任何止血疾病或病症的的各种治疗。

修饰的FVII多肽及核酸分子也可制成试剂盒。试剂盒可包括本发明的药物组合物以及给药说明。例如修饰的FVII多肽可利用给药装置提供，诸如注射器、吸入器、计量杯、滴管或敷料。所述试剂盒可任选包括给药说明，包括剂量、给药方案以及给药模式的说明。试剂盒还可包括本文所述药物组合物及诊断说明。例如这种试剂盒可包括用于测定FVII的浓度、量或活性的装置或对象的FVII调节系统。

以下实施例仅仅用于说明而并非限制本发明的范围。

L.实施例

实施例1

In silico产生具有增加的对TFPI的抗性的因子VII变体

A.因子VII和TFPI之间相互作用的建模

进行了因子VVI与其天然抑制剂组织因子途径抑制剂(TFP1)-1上的第一Kunitz结构域(K1)之间相互作用的计算机建模，以确定在相互作用位点的界面的接触氨基酸残基。使用来自蛋白质数据库(rcsb.org/pdb/)的公共可获得信息建立同源性模型。TFPI-1K1单独的晶体结构及TF/FVIIa/TFPI-1/FXa之间的四元复合物的晶体结构均尚未解析。取而代之，计算机建模采用TF,FVII和牛胰腺胰蛋白酶抑制剂(BPTI^5L15;PDB编码1FAK_1)的5L15变体之间的三元复合物的2.1

晶体结构作为该方法的起始模型，随后是关于胰蛋白酶/TFPI-2复合物的晶体结构信息(图6)。BPTI^5L15是Kunitz结构域型丝氨酸蛋白酶，展示与TFPI-1及TFPI-2的同源性。BPTI^5L15的第一Kunitz结构域(K1)(SEQ ID NO:106)展示在第一Kunitz结构域(K1)中的45%一级序列相同性(图5)。TFPI-2K1晶体结构的坐标从蛋白质数据库的程序数据库(pdb)文件1TFX中提取，该文件描述了胰蛋白酶/TFPI-2复合物的晶体结构。使用PyMol软件包(pymol.sourceforge.net/)中的刚性体c-α骨架对比程序，将TFPI-2K1坐标匹配到TF/FVIIA/BPTI^5L15晶体结构的BPTI^5L15三维坐标(pdb file1FAKl)上。通过测量重叠分析TFPI-2K1拟合进模型，产生小于1

的均方根差(RMSD)。这表明两个结构间的精确匹配，产生了FVII和TFPI-2K1复合物的可靠模型。

鉴别了由模型显示与FVII表面密切接触的TFPI-2K1上的侧链并insilico诱变以对应于TFPI-1K1中存在的侧链。这一分析结果揭示了因子VII和TFPI-1K1之间在直接邻近活性位点的若干残基(即2^nd球(sphere)残基)中的静电互补性。基于上述同源性分析，FVII中参与与TFPI-1K1的相互作用的残基是基于糜蛋白酶编号的D60,K60a,K60c,T99,R147和K192，其分别对应于基于成熟FVII编号的D196,K197,K199,T239,R290和K341(图7)。检查建模的相互作用表明基于糜蛋白酶编号的位置97的甘氨酸残基(G97)即对应于成熟FVII编号的G237与接触残基密切接近。在这一位置的修饰可以产生立体位阻，破坏FVII与TFPI的相互作用。

B.In silico突变因子VII以提供增加的对TFPI-1K1的抗性

位于或邻近FVII/TFPI-1K1相互作用界面的氨基酸残基如上所述被鉴别。设计具有氨基酸变化的FVII变体，其a)用相斥电荷-电荷接触置换FVII和TFPI-1之间的互补性静电接触，和/或b)通过用中性残基置换FVII上的带电残基而消除阳性静电接触，和/或c)通过用含有较大侧链的残基置换含有小侧链的残基而导致立体位阻。举例性变体如表9所示。

表9.举例性因子VII变体

实施例2

FVII的克隆和表达

A.FVII的克隆

编码466个氨基酸的人FVII同种型前体多肽(P08709;如SEQ ID NO:1所示)的核苷酸被克隆进哺乳动物表达载体pCMV Script(Stratagene;SEQID NO:151)中，该表达载体含有巨细胞病毒(CMV)启动子。简而言之，使用CBO-125(SEQ ID NO:152)和CBO-126(SEQ ID NO:153)寡核苷酸分别作为正向和反向引物，用人FVII cDNA(Invitrogen)作为模板经PCR扩增FVII序列。CBO-125引物含有BamHI限制位点(黑体)、Kozak序列(双下划线)，后接与FVII cDNA序列的5’末端具有同源性的18个核苷酸(下划线)，包括ATG起始密码子。CBO-126引物含有EcoRI限制位点(黑体)、终止密码子(双下划线)和与FVII cDNA序列的3’末端具有同源性的21个核苷酸(下划线)。

CBO-125正向引物

5’ gcatcatgacgtgac

atggtctcccaggccctc 3’

CBO-126反向引物

5’ gatcgtacgatacgt

gggaaatggggctcgcaggag 3’

如厂商推荐，使用标准PCR反应和热循环条件及KoD HiFi PCR试剂盒(EMD Biosciences)。PCR产物用BamH I和EcoR I限制酶消化并用标准分子学技术连接进pCMV Script载体的BamH I和EcoR I限制位点。载体然后转化进大肠杆菌。生长选择的菌落，收获细菌细胞，用标准分子生物学技术纯化质粒。

B.产生FVII变体

用QuikChange II XL定点诱变试剂盒(Stratagene)根据厂商指导产生FVII变体，用特殊设计的寡核苷酸作为引物，在新合成的DNA中掺入特定突变。QuikChange方法涉及用PfuUltra高保真DNA聚合酶线性扩增模板DNA。包括所希望突变的互补引物在循环期间延伸，使用含有克隆的FVIIcDNA序列的纯化的双链超螺旋pCMV Script载体作为模板。引物延伸导致感兴趣突变掺入新合成链中，并产生具有交错切口的突变质粒。在扩增后，核酸用Dpn I处理，其消化大肠杆菌来源的pCMV Script载体的dam-甲基化亲代链。这导致“选择”未被甲基化的新合成的突变质粒。含有所希望突变的载体DNA转化进XL10-Gold超感受态大肠杆菌细胞，在此细菌连接酶修复切口，使得发生正常复制。

通过靶向基于成熟FVII编号的位置D196,K197,K199,G237,T239,R290和K341(对应于基于糜蛋白酶编号的D60,K60a,K60c,G97,T99,R147和K192)制备具有单氨基酸取代的FVII变体。还产生了具有在位置D196,K197和K199的多重突变或在位置D196和K197的突变的FVII变体。表10提供了用于产生FVII变体的每一互补引物对的寡核苷酸之一的核苷酸序列。还示出对应的野生型序列以用于比较。编码取代的氨基酸的3碱基对序列以黑体示出。例如，为产生含有取代D196K的FVII变体(基于糜蛋白酶编号的D60K；CB554,SEQ ID NO:18)，CBO-157D60K寡核苷酸和互补于CBO-157D60K的寡核苷酸与QuickChange II XL定点诱变试剂盒一起用于用3碱基对“aag”序列置换3碱基对“gac”野生型序列。编码含有D196K取代的FVII变体多肽的突变的载体然后转化进XL10-Gold超感受态E.coli细胞。

表10.用于产生FVII变体的寡核苷酸

C.FVII多肽的表达

为通过ELISA和Western印迹进行初始表达分析，FVII多肽在BHK-21细胞中表达。为进行生物化学分析，如下述那些，FVII多肽在FreestyleTM293-F细胞(Invitrogen)中表达。

野生型因子FVII多肽(CB553-02,SEQ ID NO:3)和变体FVII多肽最初在幼仓鼠肾细胞系BHK-21(ATCC CRL1632)中表达。BHK-21细胞在100mm培养皿中的具有10%胎牛血清(FCS)的Eagle’s最小基本培养基(EMEM,Invitrogen)中在37℃和5%CO₂下培养。生长至大约90%铺满后，细胞用Lipofectamine2000试剂盒(Invitrogen)经厂商指导用24μg FVII质粒DNA转染。在转染后6小时培养基用含有1μg/ml维生素K1(Sigma)的无血清EMEM置换，细胞再保温72小时。细胞培养基中FVII的表达用ELISA或Western印迹测定。

为了使用生物化学测定的后续分析，野生型因子VII多肽(CB553-02,SEQ ID NO:3)和变体FVII多肽在Freestyle^TM293-F细胞(Invitrogen)中表达。细胞在具有通气盖的Erlenmeyer培养瓶中在Freestyle^TM293培养基(Invitrogen)中于37℃和8%CO₂下培养。细胞用厂商推荐的方案转染。简而言之，在生长至1×10⁶细胞/ml后，离心细胞并更换培养基。然后使用293fectin(Invitrogen)，每240ml细胞用240μg FVII质粒DNA转染细胞。另外，每240ml细胞加入50μl于乙醇中的1mg/ml维生素K₁(Sigma)原液。细胞生长5天，然后收获培养上清。用ELISA测定细胞培养基中的FVII表达。

1.ELISA

使用免疫测定定量样品中人FVII和FVIIa的量。抗人FVII的多克隆抗体被用于捕获和检测溶液中的蛋白酶。免疫测定可以用于确定条件培养基或纯化原液的蛋白质浓度或者确定另一样品例如人或小时血浆样品中的FVII浓度。人类血液中的FVII基线浓度是大约50nM，酶学活性形式FVIIa的基线浓度是大约1nM。

为确定样品中人FVII或FVIIa的量，进行夹心ELISA。96孔平底Maxisorp immuno平板(Nunc)用100μl/孔5ng/μl抗生物素蛋白(NeutrAvidin,Pierce Biotech.)包被。覆盖平板并在室温(RT)振荡保温1小时，随后在具有0.01%Tween-20的PBS(PBST)中洗4次。通过与以200μl/孔加入到每孔中的在PBS中的1%牛血清白蛋白(BSA)(w/v)在RT振荡保温最少1小时而封闭平板。封闭的平板然后在4℃储存备用(至多2周)。

在使用前，在PBST中洗平板4次以除去BSA，向每孔中加入100μl/孔1ng/μl生物素化抗因子VII抗体溶液(R&D Systems)，平板在室温振荡保温45分钟以与包被的抗生物素蛋白复合。用PBST洗平板(4次)除去过量的未结合抗体。

从50ng/μl至0.8ng/μl的FVII标准的2倍系列稀释液(AmericanDiagnostica;在PBST中稀释)以100μl/孔被加入到平板中。还包括了含有PBST不含任何FVII的孔用作仅缓冲液对照。为测定FVII或FVIIa的纯化样品(在活化之前和之后，见实施例3)，样品首先在PBST中1:25稀释，然后制备系列2倍稀释液，从而测试25倍、50倍、100倍和200倍稀释液。稀释样品以100μl/孔加入到双份孔中。为测定含有FVII或FVIIa的血浆样品，将血浆样品在PBST中1:100和1:400稀释并以100μl/孔加入到双份孔中。不含FVII或FVIIa的血浆样品也包括进来以确定背景水平。然后在室温振荡保温平板30分钟以使得样品中的任何FVII或FVIIa与抗FVII抗体复合。

在与样品保温后，平板用PBST洗4次。在PBST中1:5000稀释第二抗体马抗人FVII(American Diagnostica)，并以100μl体积加入到每孔中。在室温振荡保温平板30分钟以使得加入的抗体与平板上的FVII或FVIIa复合物结合。为除去过量的第二抗体，将平板用PBST洗(4次)。为检测结合的第二抗体，将100μl在PBST中1:5000稀释的山羊抗马HRP缀合物加入到每孔中。在室温振荡保温30分钟后，平板用PBST洗4次，加入100μl/孔含有TMB底物和过氧化氢溶液(Pierce Biotech.)的1:1混合物的溶液。平板在室温振荡大约1分钟，之后加入100μl/孔2M H₂SO₄终止反应。用Molecular Device M5Plate reader测量450nm的光密度，从每孔测量值中减去平板背景值(用PBST单独测量得到)。通过将FVII标准浓度对吸光度绘图产生标准曲线。在上述ELISA条件下典型产生大约0.2–50ng/ml标准曲线范围。每一样品的浓度随后用标准曲线并乘以稀释倍数确定，报道了平均值和标准差。

2.Western印迹

细胞培养基中FVII的表达也用Western印迹进行了测定。含有未稀释样品的等份或者来自FVII转染的BHK-21细胞的细胞培养基的在PBS中的系列2倍稀释液被标为Conc.1(未稀释的),Conc.2(2倍稀释)和Conc.3(4倍稀释)。样品加样于SDS page凝胶上，与10、25和50ng对照血浆纯化的rFVII(American Diagnostica,CB553-01)相邻。由BHK-21细胞产生的FVII蛋白用一级多克隆马抗FVII抗体(American Diagnostica;如厂商推荐浓度使用)和HRP缀合的抗马IgG第二抗体(来自Zymed Laboratories的1mg/ml的1:2000稀释液)经Western印迹检测。与对照血浆纯化的rFVII进行表达水平比较。结果显示大约20ng至50ng以上的FVII的浓度存在于细胞培养物等份中。

实施例3

FVII多肽的纯化和活化

FVII多肽用Q Sepharose Fast Flow(XK16)柱纯化，该柱吸附具有功能性Gla结构域的FVII多肽，随后进行钙洗脱步骤。来自转染的FreestyleTM293-F细胞的240ml培养上清用含有20mM Tris pH8.0和0.01%Tween20的溶液2倍稀释，然后向稀释样品中加入1.5ml500mM EDTA pH8.0。过滤样品后加样到已先用缓冲液B(20mM Tris pH8.0,1M NaCl,0.01%Tween20)、然后用缓冲液A(20mM Tris pH8.0,0.15M NaCl,0.01%Tween20)以8ml/min预平衡的Q Sepharose Fast Flow(XK16)柱上。加样后，用缓冲液A洗柱直至流经液在280nm的吸光度达到基线。用缓冲液C(20mMTris pH8.0,0.15M NaCl,0.01%Tween20,5mM CaCl₂)置换缓冲液A，进行泵洗(pump wash)以完全置换线中的缓冲液。在泵洗完成后，将缓冲液C以Upon completion of the,Buffer C was applied to the column at8ml/min加到柱中以洗脱FVII多肽，所述多肽以5ml级分收集60分钟。洗脱后，用缓冲液B洗柱，同时仍收集级分，直至粉红色数(来自柱介质)从柱中洗掉。然后用缓冲液A洗柱以制备柱，用于从下一样品纯化FVII。

洗脱的级分进一步用Mono Q5/5柱(含有1ml树脂)纯化，该柱最初用缓冲液B、然后用缓冲液A以2ml/min预平衡。合并用上述缓冲液C收集的第5至第8个5ml级分并用缓冲液A进行2倍稀释，之后加入1.6ml的500mM EDTA,pH8.0。在这一点任选地取小等份(100μl)进行分析，例如用ELISA分析。组合的样品以2ml/min上样到Mono Q柱，然后用缓冲液A洗涤。为洗脱结合的FVII多肽，在20分钟期间，以1ml/min使0%至30%缓冲液B梯度流过柱，收集0.5ml级分。柱然后用缓冲液A洗，然后用缓冲液A洗以制备柱，用于从下一样品纯化FVII。

纯化的FVII多肽用来自Restriction Protease Factor Xa Cleavage andRemoval Kit(Roche)的生物素化因子Xa活化为FVIIa。典型地，来自MonoQ纯化的7个级分合并在15ml锥形试管中，加入388μl500mM CaCl₂,38.9μl于蒸馏水中的10%BSA和3.2μg生物素化因子Xa。在37℃保温14-16小时后，加入250μl固定化抗生物素蛋白(Pierce)，样品在4℃混合30分钟。所得溶液然后经Econo-pak柱(Bio-Rad)过滤，滤液与另一250μl固定化抗生物素蛋白混合30分钟。再次过滤溶液，滤液用Amicon Ultra-410kDa离心过滤器(Millipore)浓缩至大约300-500μl。然后用ELISA分析FVIIa浓度(如实施例2.C.1所述)，因子VII活化水平用Western印迹监测。基本上如实施例2.C.2所述进行Western印迹，但是使用1:2000兔抗人因子VIIa抗体1小时作为第一抗体，随后为1:5000的HRP-山羊抗兔IgG(H+L)(Invitrogen)30分钟。

实施例4

在小分子底物上确定FVIIa的酰胺裂解活性的Michaelis Menten动力学常数

FVII变体的酰胺裂解活性通过测量FVIIa多肽在肽底物SpectrozymeFVIIa(CH₃SO₂-D-CHA-But-Arg-pNA.AcOH)上的Michaelis Menten动力学常数而评估。测定中包括脂化的人纯化组织因子(Innovin,Dade Behring,VWR Cat#68100-390)以提供FVIIa的最佳活性。TF-FVIIa复合物裂解高特异性生色底物Spectrozyme FVIIa，释放对硝基苯胺-生色团(pNA)，其可以通过测量405nm的吸光度监测。酶活性通过监测作为时间函数的产生的游离pNA的405nm吸光度而确定。

反应在3种不同酶浓度下进行。为进行反应，FVIIa变体首先在1.7ml试管(来自ISC Bioexpress的低粘附微离心管)中的1×直接测定缓冲液(100mM Tris pH8.4,100mM NaCl,5mM CaCl₂,0.01%BSA)中稀释至40nM。FVIIa进一步在TF(Innovin,Dade Behring)存在下稀释，通过在12孔聚丙烯reservoir(Axygen)中如下稀释至2nM：720μl5×直接缓冲液(500mM TrispH8.4,500mM NaCl,25mM CaCl₂,0.05%BSA),180μl40nM FVIIa,和2700μl2×TF(在10mL水中重建的6nM原液)。稀释的蛋白酶在室温保温5分钟。也在TF存在下，FVIIa的2nM原液进一步稀释成2倍系列稀释液，产生分别为1nM和0.5nM的蛋白酶原液。系列稀释反应如下：首先，1800μl2nM上述FVIIa/TF原液稀释进360μl5X直接缓冲液,900μl2×TF,和540μl水。这一稀释原液再次1:1稀释进1800μl于直接缓冲液中的1×TF。

制备底物Spectrozyme FVIIa(American Diagnostica)的稀释平板。Spectrozyme FVIIa的原液通过将50μmoles小瓶在蒸馏水中重配至10mM制备并储存在4℃。向96孔聚丙烯测定板(Costar)的两相邻列的孔中加入80μl(10mM Spectrozyme FVIIa)和60μl10mM Spectrozyme FVIIa+20μl水(7.5mM Spectrozyme FVIIa)。两个孔2倍系列稀释至各自列的8个孔中的每一个，以在第一列的孔中产生范围为10mM至78μM底物的10×底物浓度系列以及在第二列孔中产生7.5mM至58.6μM底物的10×底物浓度系列。

将5μl每种Spectrozyme FVIIa底物稀释液加至96孔透明半区测定板(Costar)。将各45μl的三种FVIIa/TF稀释液的每一种加入到底物系列稀释液的三列中。在这一步骤中，小心避免在测定孔中导入气泡。如果导入气泡，通过在每个测定开始前用清洁针刺破而除去气泡。平板振荡混合。在测定开始前，用Spectramax Gemini M5plate reader分光光度计(MolecularDevices)取终点阅读值并使用SoftMax Pro软件(Molecular Devices)的Pathcheck特征测定测定孔的路径长度(pathlength)。在37℃每30秒测量405nm吸光度的增加，共测量1小时。

用SoftMax Pro软件通过使用路径长度和pNA离去基团在405nm的消光系数9600M^-1cm^-1将吸光度速率(absorbance rate)(milliunits/sec)转化为释放的pNA浓度(μM/sec)。转化公式如下：速率×(1/60×1000)×(1/9600×路径长度)×100000。每种蛋白酶浓度结果用Graph Pad Prism软件作图，其中x轴为底物浓度，Y轴为确定的μM/sec速率。使用Graph Pad Prism4软件，通过将数据拟合进如下Michaelis Menten方程而确定Km和Ymax：

Y=((k_catK_m/1000000)×X×[E])/(1+(X+K_m)

其中;X是底物浓度(μM)

Y是酶活性(μM/sec)

k_catK_m是特异性常数(M^-1sec^-1)

K_m是Michaelis常数(μM)

E是酶浓度(μM)

设定初始值为E=1,在0.5×Y max时Km=X及k_catK_m=1000。

用420μM Spectrozyme FVIIa(表11)用上述测定确定每种FVIIa变体、野生型FVIIa(CB553-02)的比活性(munits/min/nM)。.FVIIa变体的活性典型地大于野生型FVIIa的活性(在2.7munits/min/nM测量)。FVII变体的活性与文献中的变体(CB591-CB594)比较，发现大多数FVII变体具有相当于或高于文献中描述的变体的活性。

表11.FVIIa变体的比活性

实施例5

确定FVIIa对其底物因子X的催化活性

FVIIa变体对其底物因子X(FX)的催化活性在荧光测定中间接评估，其是在合成底物Spectrafluor FXa上测定由FVIIa活化产生的FXa的活性而评估。测定中包括脂质化形式的纯化的组织因子(TF)以提供FVIIa的最佳活性。FXa对Spectrafluor FXa(CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC.AcOH)的酶活性通过测量作为时间函数的所产生的游离荧光团AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)的吸光度的增加而确定。

简而言之，在1×直接测定缓冲液(100mM Tris pH8.4,100mM NaCl,5mM CaCl2,和0.01%BSA)中将FVIIa变体最初稀释至0.5μM，然后在直接测定缓冲液中进一步稀释至0.1nM。脂质化全长TF(Innovin;Dade Behring)在20mL水中重配得到3nM溶液并在in1×直接测定缓冲液中稀释至0.2nM。将400μl0.1nM FVIIa与400μl0.2nM TF混合并在室温保温5分钟。在含有0.2nM TF的1×直接测定缓冲液中将所述溶液进一步2倍稀释2次，以获得总共3种FVIIa稀释液，即各含有0.2nM TF的0.05nM,0.025nM,或0.0125nM FVIIa(FVIIa/TF溶液)。

底物因子X(FX;American Diagnostica;80μg)在135.6μl蒸馏水中重配产生10μM原液并等份储存在-80℃。等份冷冻和解冻不超过1次。将FX原液在直接测定缓冲液中稀释至800nM，然后系列2倍稀释，获得范围为800nM至50nM的FX溶液。

Spectrofluor Xa(American Diagnostica;10μmoles)在蒸馏水中重配至5mM并储存在4℃。向96孔黑色半区测定板(Costar)每孔中加入5μlSpectrofluor Xa(American Diagnostica)。然后，向每孔中加入25μl FX溶液。向板的最后一排孔中加入测定的阴性对照，其中不加入FX。各20μl的3种浓度的TF/FVIIa溶液以双份加入到板的各列孔中，从而每种TF/FVIIa稀释液对每种FX稀释液进行测定，有一列不含添加的TF/FVIIa(即仅FX)。振荡混合平板。用荧光分光光度计在37℃每30秒读数而随时间测量荧光，共测量1小时(Ex:380nm,EM:450nm,截留值:435nm)，时间以时间平方单位(time squared units)报道。在测定后，产生在同一读板器中的AMC荧光标准曲线以将荧光单位换算成在测定中释放的uM底物。1mM AMC于DMSO中(Invitrogen)在1×直接缓冲液中稀释至0.02mM。在1×直接测定缓冲液中制备范围为20nM至0.625nM的6个AMC2倍系列稀释液。用上述相同测定条件测量AMC荧光并将荧光对AMC浓度作图。计算线的斜率，其作为后续计算中将RFU换算为μM的换算因数。

FX的FVIIa活化的动力学常数通过进行线性回归分析计算，所述线性回归分析在底物浓度倒数对底物裂解速率(单位为秒²)倒数上进行，其中V_max,FVIIa计算为y截距的倒数，K_m,FVIIa为y截距的斜率，V_max/K_m,FVIIa为斜率的倒数。然后用如下等式求出k_cat值：

k_cat/K_m,FVIIa=V_max/K_m,FVIIa×1/(0.5×k2×[μM FVIIa]×(RFU/μM换算因数))

其中，k2=([S]×k_cat,FXa)/(K_m,FXa+[S]),其中k_cat,FXa和K_m,FXa是SpectrofluorXa的FXa裂解常数，其用FXa标准k_cat,FXa=117sec^-1及K_m,FXa=164μM实验性确定。

使用上述测定条件，动力学常数k2确定为88.1sec^-1。

确定了每种FVIIa的K_m和k_cat以评估催化活性，即每种FVIIa对其底物FX的k_cat/K_m(M^-1sec^-1)(表12)。也评估了野生型FVIIa蛋白酶(CB553-02)并且发现其显示活性为1.8×10⁷M^-1sec^-1。由Krishnaswamy,et al.(J.Biol.Chem.(1998)273:84378-86)测量的因子X的因子VIIa活化是2.9X10⁷M^-1sec^-1。许多变体显示了与未修饰蛋白酶相当的活性。在一些情况中，FVIIa变体显示与未修饰蛋白酶相比增加的催化活性。例如CB558、CB561和CB563显示的催化活性为5.2×10⁷,4.3×10⁷和5.9×10⁷M^-1sec^-1。

表12.FVIIa变体的催化活性

大约值.

实施例6

确定溶液中催化活性蛋白酶(Catalytically Viable Protease)的浓度

原液中催化活性FVIIa的浓度通过用FVIIa的不可逆肽抑制剂Phe-Phe-Arg-氯甲基酮(FFR-CMK)滴定因子VIIa和可溶性组织因子(sTF)的复合物而确定。所述抑制剂结合FVIIa但不结合FVII。在高浓度FVIIa(50nM)延长保温保证蛋白酶滴定完全。测量与FFR-CMK保温后FVIIa/TF复合物的残余活性以确定原始原液中催化活性FVIIa的浓度。

A.96孔测定板格式

96孔透明半区测定板(Nunc)通过向每孔添加150μl/孔1×平板缓冲液(100mM Tris pH8.4,100mM NaCl,0.01%BSA,0.01%Tween-20)并将平板在37℃保温最少1小时而预处理。通过印迹在纸巾上并将平板面朝下离心除去剩余的缓冲液而完全除去缓冲液，将平板空气干燥1小时，覆盖储存在室温(RT)。

为制备FVIIa/sTF/FFR-CMK反应混合物，将FVIIa原液(AmericanDiagnostica;在50%甘油(v/v)中稀释至5μM并等份冷冻储存在-20℃)或者FVIIa变体首先在1×直接测定缓冲液(100mM Tris pH8.4,100mM NaCl,5mM CaCl₂,0.01%BSA)中稀释至500nM。然后通过将90μl蒸馏水与36μl5×直接测定缓冲液,18μl500nM FVIIa和18μl5μM sTF(重组人凝血因子III/可溶性组织因子;R&D Systems;所用原液是在50%甘油中19.6μM并在1×直接测定缓冲液中稀释至5μM，在4℃储存最多2周)混合而制备FVIIa/sTF混合物。然后使各组分在室温复合5分钟。

在DMSO中的10mM FFR-CMK(Bachem)原液(在-20℃储存)在水中稀释至3.5μM。使用一排聚丙烯不透明储存板(Costar#3363)，在96孔不透明板的11个孔中制备FFR-CMK在水中的系列2倍稀释液，该排最后一个孔仅含有水作为对照。这是10×FFR-CMK抑制剂系列溶液。向预处理的96孔透明半区测定板的一排各孔中加入10.8μl FVIIa/sTF混合物，随后加入1.2μl10×FFR-CMK抑制剂系列。混合溶液并在<3000rpm离心平板5分钟以除去孔中水滴。覆盖平板并在37℃保温8小时。

为测定FVIIa/TF复合物的残余活性，首先通过将360μl5×直接测定缓冲液与180μl10mM Spectrozyme FVIIa溶液和1080μl水混合而制备底物Spectrozyme FVIIa(American Diagnostica,#217L;在5mL蒸馏水中重配50μmole小瓶原液至10mM并在4℃储存)和5X直接缓冲液(500mMTris pH8.4,500mM NaCl,25mM CaCl₂和0.05%BSA)的混合物。向测定板的每孔中加入108μl所制备的底物溶液。混合各孔并将平板在37℃保温。在来自Molecular Devices的Spectramax Gemini M5读板器上在37℃每30秒测量405nm吸光度的增加，共测量1小时。

用SoftMax Pro软件(Molecular Devices)，测量吸光度速率并通过用测定的速率除以未抑制的蛋白酶的速率确定蛋白酶活性分数。活性分数对FFR-CMK浓度作图，去掉>90%或<10%未抑制活性的点。然后沿剩余的点画直线以确定x截距，其代表溶液中活性蛋白酶的浓度。测量来自多个测定的值，取平均并确定标准差。

B.384孔测定格式

为了增加滴定精度和通量，修饰先前的测定为基于384孔板格式。在高蛋白酶浓度(250nM)进行与范围为400nM至53nM的FFR-CMK浓度系列的保温7小时。通过加入FVIIa底物(Mesyl-dFPR-ACC)并测量荧光信号随时间的变化而测量残余活性。

简而言之，如实施例6所述预处理384孔黑色测定板(Nunc)。然后，通过混合32.5μl1μM FVIIa+19.5μl5μM sTF+6.5μl5X AST缓冲液(100mM Na Hepes,pH7.5,750mM NaCl,25mM CaCl₂,0.5%BSA,0.5%PEG8000)和6.5μl dH₂O制备FVIIa/sTF溶液。这一反应在室温保温5分钟。384孔板的一半共一式三份测量5种蛋白酶和1种测定对照样品。在FVIIa/sTF保温期间，将20mM FFR-CMK在1mM HCl中稀释至8μM，随后在96孔板进行9次系列1.25倍稀释。该排的其余两个孔仅含1mM HCl。这排孔然后在1X AST缓冲液中10倍稀释并混合产生从800nM到107nM的FFR-CMK浓度系列。向384孔板的每排中加入4μl所述FFR-CMK稀释系列。然后，在板的11列中将4μl FVIIa/sTF溶液与所述抑制剂系列混合。最后一列加入4μl1X AST缓冲液作为平板空白。离心平板、密封并室温振荡保温7小时。测定用72μl在1X AST缓冲液中稀释的110μMMesyl-dFPR-ACC起始。在Ex:380nm和Em:460nm监测荧光增加20分钟，在37℃每45秒读数。以实施例6相同方式分析数据，进行如下修正。首先，残余活性限制为在蛋白酶单独活性的20%至80%之间的活性。第二，线性拟合的y截距限制为在0.9和1.1之间。第三，x截距限制为在125nM和375nM之间。每种蛋白酶的3份重复的x截距被平均，报道平均值和标准差。

实施例7

确定FVIIa/TF的TFPI抑制的IC₅₀

TFPI与FVIIa/TF复合物之间相互作用强度通过测量各种浓度TFPI对FVIIa/TF催化底物Spectrazyme VIIa的活性的抑制水平而评估。对每一FVII变体和FVIIa标准计算50%抑制所需的TFPI浓度(IC₅₀)。

96孔透明半区测定板(Nunc)通过向每孔加入150μl/孔1×平板缓冲液(100mM Tris pH8.4,100mM NaCl,0.01%BSA,0.01%Tween-20)并在37℃保温平板至少1小时而预处理。通过振荡和吸印平板并将平板面朝下离心除去剩余缓冲液而完全除去缓冲液。将平板空气干燥1小时，并在室温(RT)储存。

在1.7ml微离心管(低粘附微离心管，来自ISC Bioexpress)，制备总体积为450μl的FVIIa/TF混合物，其是将9μl250nM FVIIa(AmericanDiagnostica,CB553-02或待测的对应变体)与337.5μl2×TF(Innovin;DadeBehring;冻干产品重悬于10mL蒸馏水中以产生2X TF，其大约等于7nM脂质化TF),90μl5×测定缓冲液(500mM Tris pH8.4,500mM NaCl,25mM CaCl₂,0.05%BSA)和13.5μl水混合，产生含有5nM FVIIa和5.2nMTF的溶液。该混合物在室温保温5分钟以使得各成分复合。向预处理的96孔透明半区测定板的2列各孔中加入25μl对应FVIIa/sTF混合物，覆盖平板以防止蒸发。

人重组TFPI(R&D Systems)最初溶解在33μl50%甘油(v/v)中以产生10μM原液储存在-20℃。在聚丙烯储存平板中如下在最终的1X直接缓冲液(100mM Tris pH8.4,100mM NaCl,5mM CaCl₂,0.01%BSA)中将TFPI原液进一步稀释至1.5μM：对于每种测试的蛋白酶，通过将13.1μl10μM TFPI与17.5μl5×测定缓冲液和56.9μl蒸馏水混合物而制备87.5μl1.5μMTFPI溶液。通过将27.5μl TFPI混合进55μl1×测定缓冲液中在1×测定缓冲液中制备TFPI溶液的系列3倍稀释液，从而产生含有750nM,250nM,83.3nM,27.8nM,9.26nM,3.1nM和1.03nM TFPI的溶液。该系列最后一孔仅含有1X直接缓冲液作为对照。

25μl每种TFPI稀释液加入到含有FVIIa/TF混合物的96孔透明半区测定板的2列中的2个孔中(即一式二份)，从而蛋白酶混合物用每种TFPI稀释液一式二份进行测定。不含TFPI的1×测定缓冲液也被加入到含有FVIIa/TF混合物的2个孔中作为阴性对照。短暂振荡平板，然后以3000rpm离心5分钟，之后在37℃保温1.5小时。

Spectrazyme VIIa(American Diagnostica)原液通过将50μmoles在5ml蒸馏水中重配至10mM而制备并储存在4℃直至使用。在即将使用之前，将该原液在蒸馏水中稀释至600μM。在保温上述测定平板后，向测定板每孔中加入10μl稀释的Spectrazyme VIIa。混合反应并将平板在37℃保温。在37℃每30秒测量405nm吸光度的增加共测量1小时，用SoftMax Pro软件(Molecular Devices)计算吸光度速率。

为确定TFPI抑制程度，含有TFPI的蛋白酶反应的吸光度速率首先除以不含TFPI的反应(对照样品)的吸光度速率以获得活性分数，并确定每种TFPI浓度的log₁₀。使用GraphPad Prism Software,log₁₀[TFPI]对每种蛋白酶的活性分数作图，并用曲线拟合产生剂量应答曲线，该曲线拟合假定活性数据最高和最低分别固定为1和0。用所述软件确定TFPI抑制，作为针对每一蛋白酶的log IC₅₀(pIC₅₀)值和绝对IC₅₀(以nM表示的TFPI抑制)，确定其平均值和标准差。

确定在与sTF的复合物中的每种FVIIa的TFPI抑制水平并表示为IC₅₀或pIC₅₀(表13)。TFPI抑制与sTF复合的未修饰的FVIIa(CB553-02)活性的程度也被确定，发现IC₅₀是88nM。所产生的9个FVIIa展示降低的与TFPI相互作用的强度，这由增加的IC₅₀值反映出。

表13.TFPI对FVIIa变体的抑制

实施例8

野生型FVIIa促凝血活性的体内评估

血友病A的小鼠模型被建立以评估FVIIa多肽的促凝血活性。血友病A在CD-1小鼠中通过给予抗FVIII抗体而诱导，然后手术除去尾巴尖以启动出血。小鼠然后用FVIIa多肽处理，测量停止出血时间及这段时间中丧失的血量以确定FVIIa多肽的促凝血活性。

雄性CD-1小鼠通过腹膜内给予100mg/kg硫巴比妥钠和100mg/kg氯胺酮而麻醉。将利多卡因皮下注射进腹侧颈而降低敏感性。通过在颈部进行小皮肤切口而将导管插入气管和颈动脉以促进呼吸不受限，以及给予抗因子VIII抗体、重组人因子VIIa(rhFVIIa)和/或修饰的FVII多肽。

插管小鼠被给予40μL的3.76mg绵羊抗人FVIII抗体(AffinityBiologicals,lot IG129R4,612小鼠BU/ml)。这一剂量是通过用抗体进行初始剂量应答实验而确定，该实验使用0.376,0.94,1.88和3.76mg抗人FVIII，并评估失血和出血时间。在20分钟后，将小鼠尾巴置于含有39℃磷酸盐缓冲盐水(PBS)的15mL试管中10分钟。在30分钟，将尾巴从PBS溶液中取出，切断最后5mm尾巴以启动出血。记录开始出血时间。然后将尾巴放回含有39℃PBS的试管并出血5分钟(预出血)以保证小鼠已应答抗FVIII抗体。在预出血后，给予小鼠FVIIa多肽或其中FVIIa蛋白已制备和输送的运载体。FVIIa多肽在PBS或由52mM氯化钠、10.2mM氯化钙二水合物、9.84mM甘氨酰甘氨酸,0.01%polysorbate80和165mM甘露糖醇组成的缓冲液中稀释。以1、3或10mg/kg、相当于3mL/kg的体积将FVIIa制备物经颈动脉插管给予，并将尾巴置于含有39℃PBS的新鲜试管中。监控出血20分钟，记录出血停止时间。总出血时间计算为预出血时间与给予FVIIa多肽或PBS或缓冲液后出血时间之和。

为确定出血期间失血量，测定15mL试管内含物的血红蛋白含量。将Triton X-100在无菌水中1:4稀释，并将100μL加入到1mL样品中以导致溶血。然后在546nm波长测量样品吸光度。为计算失血量，对标准曲线读取吸光度，所述标准曲线是通过测量在PBS中稀释并如上所述用Triton X100溶血的已知体积的小鼠血液在546nm的吸光度而产生。

进行实验比较如上所述产生的rhFVIIa(CB533)与可商购的重组人FVIIa(

Novo Nordisk)，在给予3mg/kg剂量的每种蛋白质后评估失血量。运载体组(缓冲液,n=15)的失血量是20分钟内671.9±57.89μl。Catalyst Biosciences生产的rhFVIIa将这一失血量降至264.1±56.59μl，

将这一失血量降至273.7±53.93μl(n=14)。实验证实两种蛋白质之间的等价性。

实施例9

FVIIa多肽的药物代谢动力学分析

FVIIa多肽的药物代谢动力学性质通过测量小鼠血浆中的人因子VIIa的量而评估。使用两种测定定量血浆中的FVIIa。用ELISA定量小鼠血浆中的总FVIIa蛋白，用FVIIa依赖性凝血测定(FVII:C)定量血浆中FVIIa多肽的凝血活性。

A.将FVIIa多肽给予小鼠

修饰的FVIIa多肽及未修饰的重组人FVIIa(rhFVIIa)蛋白(

Novo Nordisk)在药物代谢动力学研究中评估。对于每一研究，给18只雄性CD-1小鼠注射静脉推注剂量(0.1-3.0mg/kg,取决于研究)的rFVIIa。在注射后5、15、30、60、120和240分钟，来自每一注射方案的3只小鼠用CO₂窒息安乐死，通过经皮心脏穿刺将大约1.0mL的血液吸进1.0mL针管。每一针管预先装有足够的柠檬酸钠以便在1mL血液中达到终浓度为3.2%。血样然后在4℃以9000rpm离心8分钟。将血浆转移到做标记的各个1.5mL试管(Eppendorf)中，在液氮中速冻并储存在-80℃。另外，每个实验有1只小鼠仅用运载体注射(假实验(sham))，这一小鼠的血浆用于背景FVIIa活性测定。

B.ELISA测定

用市售试剂盒

Factor VII ELISA(American Diagnostica)经ELISA检测血清中的FVII蛋白。该试剂盒采用用抗FVII/FVIIa抗体预包被的板捕获蛋白质，以及采用生物素化抗FVII抗体以通过链霉抗生物素蛋白标记的辣根过氧化物酶进行检测。该试剂盒根据厂商指导进行使用，有以下例外：首先，缩窄标准曲线以保证在整个浓度范围均为线性范围并且浓度范围为0.88ng/ml至10ng/ml；其次，因为抗体亲和性的差异，用纯化的FVIIa变体本身作为标准曲线，而不使用试剂盒提供的FVII标准。实验表明FVIIa与FVIIa的潜在血浆抑制剂抗凝血酶III(ATIII)的复合物以游离蛋白酶水平的75%被检测到，保证了测定可以检测血浆样品中的活性及非活性形式的总FVIIa。

简而言之，在室温解冻血浆样品并在样品缓冲液(PBS+0.1%TritonX-100+1.0%BSA)中稀释10倍，然后系列5.5倍稀释4个稀释度。将该4个稀释样品稀释2倍置于ELISA板上，最终样品稀释度为20,110,605和3327.5倍。小鼠血浆的这4个稀释液覆盖了从33,000ng/ml到20ng/ml的蛋白酶浓度。每个样品在两个独立的测定平板上进行测量，使用在标准曲线范围内的那些测量值计算血浆样品中的FVIIa变体浓度。

C.凝血测定

用市售试剂盒(STACLOT FVIIa-rTF,Diagnostica Stago,Parsippany,NJ)作为凝血测定。为确定活性FVIIa多肽的凝血活性，用FVIIa依赖性凝血测定(FVII:C)测定血浆样品。用市售试剂盒中提供的试剂和说明书进行测定，用电机凝血检测仪(STArt4,Diagnostica Stago,Parsippany,NJ)测量凝血时间。根据厂商指导使用该试剂盒，有如下例外：首先，用纯化的FVIIa变体本身作为标准曲线，而不使用试剂盒提供的rhFVIIa标准；其次，使用下述大批量市售试剂用于常规药物代谢动力学筛选研究，并给出与试剂盒试剂相当的结果：可溶性组织因子(CalBioChem,La Jolla,Ca)和合成的磷脂混合物(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL),TBSA缓冲液(Tris-NaCl,pH7.5，含有1%BSA;DiaPharma,West Chester,Ohio),和25μM氯化钙溶液(Diagnostica Stago,Parsippany,NJ)。

凝血测定如下进行。在室温解冻冷冻血浆样品大约45分钟，然后在缓冲液中1:5000稀释。将50μl稀释血浆与50μL因子VII缺陷型人血浆和50μL再脂质化(relipidated)组织因子合并并预保温180秒。预保温后，加入50μL氯化钙溶液(25μM)以起始凝血。用电机凝血检测确定凝血时间。每一血浆样品一式二份进行测定。通过构建标准曲线校准系统，所述标准曲线用含有已知量的具体被测FVIIa变体的系列稀释缓冲液的凝血时间构建。小鼠血浆样品中的FVIIa浓度从log FVIIa对log凝血时间标准曲线的线性部分计算。血浆样品诱导因子VII缺陷型血浆凝血的能力报道为减去来自假处理小鼠血浆中内源性野生型FVIIa背景后的ng FVIIa/mL小鼠血浆。

每种FVII蛋白的半衰期常规测定，其是将活性的自然log常规拟合成直线并测量FVIIa蛋白活性减半所需时间而测定。对于具有多指数衰变(multi exponential decay)的FVII蛋白，半衰期是从log血浆VS时间图谱的末端部分确定。另外的药物代谢动力学参数用市售软件(WinNonLin v5.1,Pharsight Corporation,Mountain View,CA)计算。

D.CB728、CB735和CB945的药物代谢动力学性质

用上述方法评估了野生型FVIIa和两种FVIIa变体：CB728,CB735和CB945的药物代谢动力学性质。结果见表14。CB735和CB945显示了与野生型FVIIa相比改良的药物代谢动力学参数。

表14.FVIIa变体的小鼠药物代谢动力学参数

E.CB558的药物代谢动力学性质

显示增加的对TFPI抗性的修饰的FVIIa多肽(CB-558；含有K297E突变)的半衰期被测量并在与上述类似的药物代谢动力学研究中与未修饰的重组人FVIIa(rhFVIIa)蛋白(Novo Nordisk)相比较，所述研究有如下修改。15只雄性CD-1小鼠用0.5mg/kg静脉推注剂量的CB-558进行注射，15只小鼠用0.5mg/kg静脉推注剂量的rhFVIIa进行注射。在注射后5、15、30、60和120分钟，来自每一注射方案的3只小鼠用CO₂窒息安乐死，通过经皮心脏穿刺将大约1.0mL的血液吸进1.0mL针管。每一针管预先装有足够的柠檬酸钠以便在1mL血液中达到终浓度为3.2%。血样然后在4℃以9000rpm离心8分钟。将血浆转移到做标记的各个1.5mL试管(Eppendorf)中，在液氮中速冻并储存在-80℃。

为确定活性FVIIa多肽的凝血活性和半衰期，血浆样品在MachaonDiagnostics,Inc.(Oakland,CA)用FVIIa依赖性凝血测定(FVII:C)和自动化止血仪(AMAX190plus,Trinity Biotech)进行评估。简而言之，在37℃水浴解冻冷冻血浆样品5分钟，然后在Veronal缓冲液中1:40修饰。将6μl修饰血浆加入到小池中的54μl Veronal缓冲液中并与金属珠混合。然后向小池中加入等量(60μl)因子VII缺陷型人血浆(Precision Biologic)，在恒定混合同时将其在37℃保温60秒。

为起始反应起始时间，将120μL促凝血酶原激酶(兔脑来源，Thromboplastin-DS;Pacific Hemostasis)加入到小池中并保持其中的恒定混合。在405nm光学检测凝血反应以检测纤维蛋白形成。通过分析具有公布FVII水平的参照血浆(Precision Biologic)的系列稀释液的凝血时间，然后分析正常对照血浆(Precision Biologic)和异常对照血浆(Precision Biologic)的凝血时间而校准系统。

血浆样品诱导因子VIIa缺陷型血浆凝血的能力报道为在正常人血浆中观察到的凝血时间的百分比。来自FVIIa(

)-处理的和CB-558处理的小鼠的血浆的凝血活性均随时间降低。每种FVII蛋白的半衰期通过将活性的自然log常规拟合成直线并测量FVIIa蛋白活性减半所需时间而测定。观察到CB-558的半衰期是FVIIa(

)的半衰期的大约2倍；为156分钟，后者为67分钟。

实施例10

额外的FVII变体的产生

产生了一系列额外的FVII突变体以改变FVII的一或多个性质和/或活性。除了增加TFPI抗性的修饰之外，还设计了修饰以增加对AT-III的抗性，增加催化活性，增加半衰期和/或增加与例如在活化血小板上的磷脂的亲和性和/或结合。修饰包括氨基酸置换、插入和缺失。也产生了含有两个或多个修饰的FVII变体。表23示出了在Freestyle^TM293-F细胞中产生的和表达的FVII变体。用实施例2.B的方法用合适的寡核苷酸将氨基酸置换掺入FVII多肽中。

下表15示出了产生的额外FVII变体。产生的Gla swap FVII变体是野生型FVII蛋白的N末端的氨基酸残基A1至Y44(基于成熟FVII编号)用对应于FIX、FX、蛋白C、蛋白S或凝血酶的Gla结构域的氨基酸残基置换。“Gla Swap FIX”FVII变体(即内源性Gla结构域被来自FIX的Gla计划于置换的FVII多肽)在N末端含有SEQ ID NO:110的氨基酸残基A2至Y45；“Gla Swap FX”FVII变体在N末端含有SEQ ID NO:111的氨基酸残基A1至Y44；“Gla Swap Protein C”FVII变体在N末端含有SEQ ID NO:113的氨基酸残基A1至H44；“Gla Swap Protein S”FVII变体在N末端含有SEQID NO:114的氨基酸残基A1至Y44；“Gla Swap thrombin”FVII变体在N末端含有SEQ ID NO:115的氨基酸残基A1至Y44。

表15.举例的因子VII变体

实施例11

FVIIa变体对底物因子X的催化活性的分析

FVIIa变体对底物因子X(FX)的催化活性在两种类型的生色测定中通过测定由FVIIa活化时产生的FXa对合成底物Spectrafluor FXa的活性而间接评估。这两种测定在脂质化组织因子的存在或不存在下进行，以评估TF依赖性和TF不依赖性活性。如以上实施例2和3所述表达、纯化FVII变体并活化为FVIIa。尽管大多数FVII变体仅在Freestyle^TM293-F细胞中表达，但是一些也在BHK-21细胞中表达。

脂质化组织因子间接测定

FVIIa变体在组织因子存在下的催化活性使用稍作修改的上述实施例5所述测定进行评估。一个修改是使用已用ERG-CMK和FFR-CMK处理的因子X底物蛋白酶以降低背景活性(Molecular Innovations)。用两个独立测定进行两种类型数据分析；线性范围分析测定和双曲线范围测定。线性范围分析测定使用0和150nM之间的因子X浓度范围以保证在剂量曲线线性范围内精确测量动力学常数。相反，双曲线范围分析测定使用0和1.44μM之间的因子X浓度范围以保证用饱和(双曲线)剂量曲线精确测定动力学常数。

使用线性范围数据分析的脂质化组织因子测定基本上如上述实施例5所述进行，进行如下修改。FVIIa变体/TF溶液制备为0.1nM FVIIa/0.4nMTF溶液并保温30分钟，之后在0.4nM TF中向下2倍稀释为含有1.5625pMFVIIa/0.4nM TF的溶液。将25μL所述FVIIa/TF溶液与25μL含有1.0mMSpectrofluor FXa(American Diagnostica)和300nM、200mM、133.3nM、88.9nM、59.3、39.5nM、36.3nM或0nM因子X(Molecular Innovations)之一的底物溶液混合。因此，用于测定的最终浓度是0.8pM FVIIa、0.2nMTF、0.5mM Spectrofluor FXa以及150nM、100mM、66.7nM、44.4nM、29.6nM、19.8nM、13.2nM或0nM因子X(Molecular Innovations)，50μL/孔。在后续计算中用作从RFU向μM的换算因数的AMC标准曲线被扩大以包括从0μM到100μM AMC的剂量范围。

使用双曲线范围数据分析的脂质化组织因子间接测定基本上如上述实施例5所述进行，进行如下修改。FVIIa variant/TF溶液被制备为0.1nMFVIIa/0.4nM TF溶液，并保温30分钟，之后在0.4nM TF中向下2倍稀释为1.5625pM(或者0.78pM，对于预期具有高活性的蛋白酶)FVIIa/0.4nMTF的溶液。将25μL所述FVIIa/TF溶液与25μL含有1.0mM SpectrofluorFXa(American Diagnostica)和1440nM、720mM、360nM、180nM、90nM、45nM、22.5nM或0nM因子X(Molecular Innovations)之一的底物溶液混合。因此用于测定的终浓度为0.8(或0.39)pM FVIIa、0.2nM TF、0.5mMSpectrofluor FXa以及7nM、720mM、360nM、180nM、90nM、45nM、22.5nM、11.25nM或0nM因子X(Molecular Innovations)，50μL/孔。参数k_cat和K_m用(V_max/(1+(K_m/x)))形式的Michaelis Menton双曲线方程计算。在后续计算中用作从RFU向μM的换算因数的AMC标准曲线被扩大以包括从0μM到100μM AMC的剂量范围。

为确定FVIIa的动力学速率常数或者FVIIa变体对FX的活化，将用SoftMax Pro application(Molecular Devices)收集的原始数据输出为XML文件。进一步的数据线性和非线性分析用XLfit4进行，其是一种在MicrosoftExcel电子表格环境中的自动化曲线拟合和统计分析的软件包(IDBSSoftware)。

对于用线性范围测定收集的数据，直接从FX浓度对荧光底物裂解速度(以μM/sec²表示)的线性回归分析的斜率计算k_cat/K_m(M^-1sec^-1)动力学常数，其中k_cat/K_m=斜率/[FVIIa]×0.5×k₂。校正因数k₂用实施例5的方法确定为45，Spectrofluor FXa的FXa裂解的动力学常数k_cat,FXa=56sec-1，K_m,FXa=126nM,其是用先前用AT-III/肝素进行活性位点滴定的活化的FX(FXa)实验性确定。排除产生小于0.98的R²值的数据点保证了用于拟合程序的数据集的线性。

用双曲线范围测定收集的数据的分析计算自FX浓度对荧光底物裂解速度(以μM/sec²表示)的非线性回归分析。用Michaelis Menton双曲线方程(V_max/(1+(K_m/x)))将各个k_cat和K_m参数计算为拟合参数，其中k_cat=V_max/[FVIIa]×0.5×k₂。动力学常数k_cat/K_M从各个k_cat和K_m拟合的参数计算。

组织因子不依赖性间接测定

FVIIa变体在组织因子存在下的催化活性在类似于如上所述的间接测定中评估，例外是组织因子不包括在测定中。因此，评估TF不依赖性活性的测定基本上如上所述，但具有如下修改。FVIIa变体溶液稀释至50nM。25μL每种FVIIa溶液与25μL含有1.0mM Spectrofluor FXa(AmericanDiagnostica)和1050nM,700mM,466.7nM,311.1nM,207.4nM,138.3nM,92.2nM或0nM因子X(Molecular Innovations)之一的底物溶液混合。因此，测定的终浓度是25nM FVIIa,0.5mM Spectrofluor FXa和525mM,350nM,233.3nM,155.6nM,103.7nM,69.1nM,46.1nM或0nM因子X(MolecularInnovations)，于50μL/孔中。数据分析如上述线性范围测定进行，无修改。

表16-18提供了测量FVIIa变体的催化活性的测定结果。表15和16提供了在TF依赖性间接测定中用分别表达自293-F细胞和BHK-21细胞的FVIIa多肽测量的催化活性，表17提供了在TF不依赖性间接测定中用表达自293-F细胞和/或BHK-21细胞的FVIIa多肽测量的催化活性。结果以催化活性的动力学常数k_cat/K_m(M^-1sec^-1)示出，也表示为野生型FVIIa活性的百分比，其中所述活性是每种FVIIa变体对其底物FX的催化活性k_cat/K_m(M^-1sec^-1)。对于表中所示值，也示出线性或双曲线范围数据分析的应用。不是所有FVIIa均在每个测定中测定。与实施例5所述的测定相比，这组测定中上述实施例5中测定的一些FVII变体显示略微降低的或增加的对FX的催化活性。与实施例中所见的活性差异很可能是由于在得自AmericanDiagnostica的FX底物中残余FXa的变化的背景活性所致。几种FVIIa变体与野生型FVIIa分子相比显示增加的催化活性。例如，含有Q366V突变的CB760具有是野生型FVIIa的1.5至5倍之间的催化活性。

表16.FVIIa变体的催化活性：使用来自293-F细胞的FVIIa多肽的TF依赖性间接测定

表17.FVIIa变体的催化活性：使用来自BHK-21细胞的FVIIa多肽的TF依赖性间接测定

表18.FVIIa变体的催化活性：TF不依赖性间接测定

实施例12

AT-III/肝素对FVIIa/TF或FVIIa的抑制的确定

通过测量各种浓度的AT-III对FVIIa/sTF对底物Mesyl-FPR-ACC的催化活性的抑制水平，在可溶性组织因子(sTF)存在或不存在下即TF依赖性和TF不依赖性AT-III/肝素复合物与FVIIa之间的相互作用效力。对所测试的每个FVIIa，确定了K_0.5值，其对应于在室温(～25°)的30分钟测定中FVIIa变体的50%抑制(IC₅₀)所需的AT-III的摩尔浓度。

准备两个独立的测定，一个使用TF，一个不使用TF。通过将26.4μL151.7μM AT-III(血浆纯化的人AT-III;Molecular Innovations)与50μL0.2mM LMW肝素(CalBiochem),400μL5×测定缓冲液(100mM Hepes,750mM NaCl,25mM CaCl₂,0.05%BSA,0.5%PEG8000,pH7.4)和1.523mL试剂级水混合而制备2μM AT-III/肝素溶液(最终5mM肝素)。这一溶液用作TF依赖性测定中的最高浓度。制备含有4μM AT-III/肝素(最终5mM肝素)的溶液用于TF不依赖性测定中，其是将52.8μL151.7μM AT-III(Molecular Innovations)与50μL0.2mM LMW肝素(CalBiochem),400μL5×测定缓冲液和1.497mL试剂级水混合而制备。将AT-III/肝素溶液在室温保温5-10分钟，然后在96孔深孔聚丙烯板中2倍稀释，终体积1mL，含有5μM肝素，产生2000,1000,500,250,125,62.5,31.25和0nM,或者4000,2000,1000,500,250,125,62.5,及0nM的稀释液。FVIIa变体和野生型FVIIa在1×测定缓冲液(20mM Hepes,150mM NaCl,5mM CaCl₂,0.01%BSA,0.1%PEG8000,pH7.4)中稀释至250nM。对于TF依赖性测定，通过将20μL FVIIa与10μL5μM sTF(R&D Systems Human CoagulationFactor III:#2339-PA)、200μL5×测定缓冲液和770μL试剂级水混合并将溶液在室温保温10-15分钟而形成5nM FVIIa/50nM sTF复合物。对于TF不依赖性测定，将100μL FVIIa与200μL5×测定缓冲液和700μL试剂级水混合而产生FVIIa的25nM溶液。为起始测定，将25μL FVIIa/TF或FVIIa单独的溶液独立地与25μL每种AT-III/肝素稀释液在96孔黑色半区测定板(Nunc)的孔中混合。TF依赖性测定的最终测定条件是2.5nM FVIIa/25nMsTF及AT-III/肝素浓度从1000nM到0nM。对于TF不依赖性测定，FVIIa浓度是12.5nM FVIIa及AT-III/肝素浓度范围从2000nM到0nM。平板在室温(～25℃)振荡保温30分钟。

FVIIa底物(Mesyl-FPR-ACC)的原液通过将底物在DMSO中溶解至20mM然后在1×测定缓冲液中制备0.5mM工作溶液而制备。如上保温测定平板后，向测定平板每孔中加入50μl FVIIa底物。混合反应，在设定为30℃的荧光阅读仪中跟踪底物裂解起始速率而评估FVIIa的残余活性。

为确定AT-III/肝素对FVIIa或FVIIa变体的抑制程度，用将用SoftMaxPro application(Molecular Devices)收集的原始数据输出为.XML文件。进一步的非线性数据分析用XLfit4进行，其是一种在Microsoft Excel电子表格环境中的自动化曲线拟合和统计分析的软件包(IDBS Software)。使用电子表格模板计算AT-III稀释系列，AT-III与FVIIa之比，及在每一实验AT-III浓度每个FVIIa重复的Vi/Vo比率。用XLfit4和双曲线抑制方程((C+(Amp*(1-(X/(K_0.5+X)))))处理残余FVIIa活性(表示为Vi/Vo)对AT-III浓度的非线性回归分析；其中C=偏移量(设定为0以允许在测定过程中未达到100%抑制的数据集的外推)，Amp=拟合振幅，K_0.5对应于在测定条件下半数最大抑制所需的AT-III浓度。对于一些FVIIa变体，在最高的AT-III测试浓度，AT-III抑制小于20-25%的总蛋白酶活性，表示测定的检测上限。具有小于20-25%最大抑制的变体因此被赋予下限K_0.5值(对于TF依赖性的为5μM，对于TF不依赖性的为10μM)，在大多数情况下预期具有大于报道值的AT-III抗性。

表19和20分别提供了用在Freestyle TM293-F细胞和/或BHK-21细胞中表达的FVIIa变体在TF存在和不存在下进行的测定结果。结果表示为拟合的K_0.5参数及表示为它们的拟合的K_0.5值的比率(K_0.5变体/K_0.5野生型)的每种变体与野生型FVIIa相比的AT-III抗性程度的代表。几种FVIIa变体显示与野生型相比增加的对AT-III的抗性。

表19.AT-III/肝素在TF存在下对FVIIa变体的抑制

表20.AT-III/肝素在TF不存在下对FVIIa变体的抑制

实施例13

确定FVIIa变体对TFPI的抗性

用上述实施例7所述的测定评估各种FVIIa变体对TFPI的抗性。表21提供了测定结果。结果以相对于野生型FVIIa每个FVIIa变体对TFPI抗性倍数表示。

表21.TFPI对FVIIa变体的抑制

实施例14

体内评估FVIIa多肽促凝血活性

建立血友病A的小鼠模型以评估FVIIa多肽的促凝血活性。在CD-1小鼠中诱导血友病A，其通过给予抗FVIII抗体，随后手术除去尾尖以起始出血(类似于实施例8所述)进行。FVIII缺陷的小鼠(FVIII^-/-小鼠)也被使用，但是不用抗FVIII抗体处理。小鼠然后用FVIIa多肽处理，测量在20分钟中的失血量以确定FVIIa多肽的促凝血活性。

A.在具有诱导的血友病A的CD-1小鼠中分析FVIIa凝血活性

进行初始实验以确定抗经腹膜内途径给予而在CD-1小鼠中诱导血友病时抗人FVIII抗体作用的所需剂量、时间及持续时间。对于第一批抗FVIII(lot1;Affinity Biologicals,lot IG129R4)，这最初是基于实施例8所述的插管实验所用的剂量。确定的导致血友病状态(在20分钟测定期间无控制出血)的剂量是7.54mg/小鼠(80μl的94.25mg/ml原液)。这一批具有的中和活性是612小鼠BU/m。对于第二批抗人VIII(lot2;Affinity Biologicals,lotIG1577R2,中和活性为474小鼠BU/ml)，所用剂量是11.98mg/小鼠(120μl99.8mg/ml原液)并且在切断尾巴之前6小时给予。

为诱导血友病，在实验之前将第一批或第二批抗FVIII腹膜内给予雄性CD-1小鼠(25-35g)雄性CD-1和FVIII^-/-小鼠通过腹膜内给予氯胺酮/甲苯噻嗪混合物(100mg/mL溶液)而麻醉并置于加热平台(39℃)上以保证体温不降低。手术室保持在82°F。在切断尾巴之前10分钟，将尾巴浸入10ml预热的PBS(15ml离心管；39℃)中。8-10只小鼠用在缓冲液中稀释的重组人FVII(

Novo Nordisk)或修饰的FVII多肽经尾静脉单次注射，所述缓冲液由52mM氯化钠、10.2mM氯化钙二水合物、9.84mM甘氨酰甘氨酸、0.01%polysorbate80和165mM甘露糖醇组成。也将运载体注射进一组小鼠作为对照。如果错过注射，则动物被排除在研究外。用测试物质或运载体注射是在切断尾巴之前5分钟进行。用剃须刀片从尾巴末端5mm切断，在20分钟期间将血液收集到PBS中。在收集期结束时，评估总失血量。混合收集试管，每种样品取1ml并测定血红蛋白含量。在无菌水中1:4稀释Triton X-100并将100μL加到所述1mL样品中以导致溶血。样品吸光度然后在546nm波长测量。为计算失血量，对标准曲线读吸光度，所述标准曲线是通过测量已知体积的在PBS中稀释的并如上用Triton X100溶血的小鼠血液在546nm的吸光度而产生。

还进行了剂量应答研究，其中评估了0.3、1或3mg/kg CB553(野生型FVIIa)。接受运载体的小鼠在20分钟测定中丧失了1002.3±60.71μL。在接受3mg/kg CB553的小鼠中这显著降低至415.5±90.85μL(p<0.05，用Kruskal-Wallis随后Dunn’s post test)。降低剂量至1mg/kg产生679.57±83.95μL的失血量，更低剂量0.3mg/kg产生852.42±94.46μL的失血量。

在独立的研究中，评估了3mg/kg剂量的CB735(K341D)和CB945(M298Q/K341D)。仅运载体注射用作对照。接受仅运载体的小鼠组在20分钟测定中失血量在803±92.18μL至813.1±82.66μL之间。这类似于用CB735或CB945的处理，其分别产生746±110.5μL和870.9±78.38μL的失血量。

B.在FVIII^-/-小鼠中FVIIa凝血活性的分析

还使用了使用FVIII缺陷小鼠(FVIII^-/-小鼠)的血友病A小鼠模型评估FVIIa多肽的凝血活性，使用上述相同方案，除了小鼠未用抗FVIII抗体处理。

1.评估野生型FVIIa凝血活性的剂量应答研究

在FVIII^-/-小鼠中进行了0.3,1,3和6mg/kg

和CB553凝血活性的评估。在

实验中，运载体组的失血量是912.79±38.32μL，其由6和3mg/kg的

处理显著降低(至361.74±55.28μL和586.98±60.56μL;p<0.05，使用Kruskal-Wallis随后Dunn’s post test)。降低剂量至1mg/kg产生674.84±46.88μL的失血量，在最低测试剂量，该值是801.08±41.39μL。在CB553实验中，运载体对照组产生的失血量是904.08±15.38μL。这由6mg/kg CB553显著降低(p<0.05，使用Kruskal-Wallis随后Dunn’s post test)至451.04±74.17μL。降低剂量至3mg/kg产生的失血量是695.75±60.50μL，而进一步降低剂量至1和0.3mg/kg导致失血量接近或为运载体对照水平(分别为846.08±34.17μL和936.43±31.39μL)。

实施例15

确定因子VIIa对可溶性组织因子的结合

从HEK293或BHK细胞表达的FVIIa变体结合可溶性组织因子(sTF)的能力用Biacore表面等离子体共振进行评估。通过在两个重复实验中用与Biacore CM5芯片结合的两种不同水平的sTF测量三种蛋白酶浓度下的结合谱而评估FVIIa变体。

将新的Series S CM5传感器芯片(GE Healthcare Cat#BR1006-68)用Biacore T100装置与牛血清白蛋白和可溶性组织因子偶联。用Biacore偶联缓冲液(30mM Na Hepes pH7.4,135mM NaCl,1mM EDTA,0.01%Tween-20)和氨偶联试剂盒(GE Healthcare Cat#BR-1000-50)及BiacoreT100软件中的方案向导实现偶联。对于固定化，使用芯片的所有4个池(cell)。池1和3与在醋酸盐缓冲液,pH4.0中稀释的500应答单位(RU)牛血清白蛋白参照蛋白偶联，池2和4与在在醋酸盐缓冲液,pH4.5中稀释的500和250RU的sTF(R&D Systems)偶联。

在三种浓度一式双份测试每种FVIIa变体和野生型FVIIa蛋白酶。蛋白酶在96孔测定板中在100μL Biacore测定缓冲液(200mM Na Hepes,pH7.4,150mM NaCl,5mM CaCl₂,0.1%PEG8000,0.1%BSA,0.01%Tween-20)中稀释至60nM,30nM和15nM。每种样品在Biacore T100装置中用120秒接触时间随后以10μL/min流速180秒解离时间而测定。还测定了缓冲液空白。芯片用50mM EDTA,pH7.0再生60秒，然后30秒。测量野生型FVIIa与sTF的结合的测定应产生3组曲线，给出大约8nM的K_d。

Biacore T100评价软件用于分析数据。具体地，使用动力学/亲和性1:1结合分析，其拟合数据进兰格缪尔等温线(Langmuir isotherm)，对于以两个应答单位偶联的每个变体的两个重复逐个拟合数据。4个拟合K_d值被平均并在表22中示出。含有M156Q突变的FVIIa多肽倾向于具有较低的K_d结果，因此更紧密地与sTF结合。

表22.FVIIa变体与可溶性TF的结合

实施例16

FVIIa变体的TFPI抗性的表面等离子体共振(SPR)筛选

各种FVIIa变体对人重组可溶性TFPI的抑制的相对抗性使用高通量表面等离子体共振(SPR)测定经Biacore T100装置评价。FVIIa变体对TFPI的抑制的相对抗性通过测量在标准化注射时间和蛋白酶浓度后相比于所结合的野生型FVIIa的量，与固定化在Biacore CM5传感器芯片上的可溶性TFPI结合的FVIIa变体的相对量而评估。

对于每个实验，用由Biacore T-100control Software(GE Healthcare)提供的胺偶联方案及Amine Coupling Kit(GE Healthcare)提供的试剂将可溶性TFPI(R&D Systems)固定化到新的4-流动池Biacore CM5Series S传感器芯片(GE Healthcare)上。所有4个可利用的流动池用于固定化两种不同密度的TFPI和牛血清白蛋白(BSA)，BSA作为对照池中的封闭剂。BSA在醋酸钠(pH4.0)中稀释至5μg/mL并分别以1000和2000应答单位(RU)固定化在流动池1和3中。对于TFPI的固定化，将冻干的可溶性TFPI(10μg)重悬于100μL1X偶联缓冲液(30mM Hepes,135mM NaCl,1mM EDTA,0.01%Tween-20,pH7.4)中至浓度为0.1mg/mL。总共20μL的0.1mg/mL TFPI在醋酸钠pH4.0中稀释至10μg/mL用于分别以1000和2000RU固定化在流动池2和4中。用偶联缓冲液作为固定化步骤中的操作缓冲液。

在含有620nM sTF(Human Coagulation Factor III;R&D Systems)的1X操作缓冲液(20mM Hepes,150mM NaCl,5mM CaCl2,0.1%PEG8000,0.1%BSA,0.01%Tween-20,pH7.4)中制备终浓度为320nM的每种FVIIa样品。一般地，每种FVIIa变体在1X操作缓冲液中稀释10倍，之后制备320nM的终稀释液。制备终体积为120μL的双份FVIIa/sTF复合物以使得多达48种独特的FVIIa变体被加样到96孔储存平板中并在单轮中二次注射而评价。FVIIa/sTF复合物在RT保温10-15分钟，之后开始第一次样品注射。

在Biacore Control Software(GE Healthcare)中建立标准化结合分析方法，其中注射每种FVIIa重复样品，允许180秒缔合时间，之后以流速10μL/min解离60秒。解离期后用10mM甘氨酸、500mM NaCl，pH3.0再生传感器芯片30秒，然后是用1X操作缓冲液以相同的10μL/min流速进行60秒稳定期。对于每一轮及随后的数据分析记录两个测定参照点，一个是缔合期(结合)结束前5秒，第二个是解离期(解离)结束前5秒。在开始全测定之前，传感器芯片用单次注射320nM野生型FVIIa/sTF180秒而测试，其应该给出大约400-450RU的应答及750-850RU对流动池2(1000RU)和4(200RU)的结合。

首先用Biacore T100Evaluation Software(GE Healthcare)进行数据分析以检查测定有效性参数，其包括验证对参照池的结合是最小的，基线漂移及对照空白注射(操作缓冲液)的结合。在这一应用中产生数据表，其显示在结合报告点和解离报告点所结合的FVIIa变体的量(以RU表示)。随后输出数据表以在Microsoft Excel电子表格环境中进行进一步分析。原始数据点(结合的RU)根据与传感器芯片的对照结合而校正，然后对每一参数取结合的野生型FVIIa的量(以RU表示)与结合的FVIIa变体的量(以RU表示)的比率，并报道为结合(wt/变体)和解离(wt/变体)。对TFPI抑制的抗性反映为一或两种所评价参数的比率的增加。例如，对于特定FVIIa的结合(wt/变体)或解离(wt/变体)值为20表示变体对TFPI抑制的抗性是野生型FVIIa的20倍。几种变体显示出增加的对TFPI的抗性。例如，CB609,CB637,CB691,CB856和CB857处于显示20-60倍抗性的组中，含有基于FVII编号K341D(对应于基于糜蛋白酶编号)的变体如CB735具有显示对TFPI的显著抗性的比率(大于50-150倍)，含有K192D突变9CB945的变体具有显示对TFPI的显著抗性的比率(大于40-150倍)。在一些情况中，解离速率比结合速率更被影响。显示这种图谱的变体的一些例子是CB735,CB854,CB855,CB856和CB857。

表23.FVIIa变体对TFPI抑制的抗性

实施例17

用活性位点滴定剂4-甲基伞形酮(methylumbelliferyl)p’-胍基苯甲酸(guanidinobenzoate)(MUGB)确定催化活性蛋白酶的浓度

原液中催化活性FVIIa的浓度通过用4-甲基伞形酮p’-胍基苯甲酸(MUGB)滴定FVIIa和可溶性组织因子(sTF)复合物而确定，MUGB是一种荧光酯底物，其作为胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性位点而显色。基本上如Payne et al.(Biochemistry(1996)35:7100-7106)所述进行测定，有一些小的修改。在MUGB浓度是饱和的并且脱酰化作用特别缓慢并且是催化限速的条件下，MUGB易于与FVIIa反应形成有效的稳定酰基-酶中间体，但是不与FVII或无活性蛋白酶反应。在这些条件下，FVIIa蛋白酶经历单催化周转，释放4-甲基伞形酮荧光团(4-MU)。当最初的荧光脉冲被校正于4-MU荧光外部浓度标准曲线时，活性位点的浓度可以被计算。

测定用2mL反应体积在1cmx1cm石英池中于连续搅拌下进行。每个反应含有0.5μM sTF(R&D Systems Human)于测定缓冲液中，所述测定缓冲液含有50mM Hepes,100mM NaCl,5mM CaCl₂和0.1%PEG8000,PH7.6。4-MU标准溶液新鲜制备，原液浓度为0.5M于DMSO中，所述浓度用于50mM Tris缓冲液,pH9.0中19,000M-1cm-1的消光系数在360nm的吸光度光谱学证实。MUGB制备为基于干重0.04M于DMSO中的原液浓度。通过将4μL4mM MUGB(8μM终浓度)加入到0.5μM sTF(20.2μL of49.4μM sTF)在1×测定缓冲液的溶液中而开始测定，首先测量MUGB的背景水解大约150-200秒，之后基于最初的ELISA(实施例2C.1)或者用FFR-CMK的活性位点滴定(实施例6)加入FVIIa或FVIIa变体至终浓度为～100-200nM。4-MU在反应的脉冲期(burst phase)的荧光释放再被跟踪1000-1200秒。制备游离4-MU的标准曲线，其是通过以20nM规格直到250nM终浓度将吸光度校准的4-MU滴定进含有0.5μM sTF的1×测定缓冲液中而制备。

为进行数据分析，将反应迹线(traces)输入Graphpad Prism软件包并通过外推初始测量的自发MUGB水解速率而从曲线中减去背景水解，其典型地小于总荧光脉冲(fluorescence burst)的5%。校正的曲线拟合进单指数方程，其具有如下形式线性分量(linear component)(以解决脱酰作用的慢速率)：荧光=Amp(1-e^-kt)+Bt,其中Amp=在上述饱和测定条件下脉冲期振幅(amplitude of the burst phase)，k是观察到的酰基酶形成的一级速率常数，B是与MUGB的完全周转相关的溶解速率(bulk rate)常数。活性FVIIa蛋白酶浓度通过将振幅拟合参数与4-MU标准曲线进行比较而计算。测量了来自多个测定的值，进行平均并确定标准差。

因为修改对于本领域技术人员而言是明显的，因此本发明仅由所附权利要求书范围限制。

Claims

1.修饰的因子VII(FVII)多肽，其包含异源γ-羧基谷氨酸(Gla)结构域或者其实现磷脂结合的足够部分，其中:

所述修饰的FVII多肽具有促凝血剂活性；

所述异源Gla结构域选自因子X(FX)、凝血酶原、C蛋白、S蛋白、骨钙素、基质Gla蛋白、生长停滞特异性蛋白6(Gas6)和Z蛋白中的Gla结构域;以及

所述足够部分是来自所述异源Gla结构域的30个或更多个连续氨基酸，由此与具有天然Gla结构域的FVII多肽相比，所述FVII多肽的磷脂结合被改变。

2.修饰的FVII多肽，其包含异源Gla结构域或者其实现磷脂结合的足够部分，其中:

所述异源Gla结构域选自因子IX(FIX)、因子X(FX)、凝血酶原、C蛋白、S蛋白、骨钙素、基质Gla蛋白、生长停滞特异性蛋白6(Gas6)和Z蛋白中的Gla结构域;

所述修饰的FVII多肽具有促凝血剂活性；

所述足够部分是来自所述异源Gla结构域的30个或更多个连续氨基酸，由此与具有天然Gla结构域的FVII多肽相比，所述FVII多肽的磷脂结合被改变；以及

所述修饰的FVII多肽包含一或多个进一步的氨基酸修饰，其中所述修饰选自：增加对抗凝血酶-III(AT-III)的抗性、增强对磷脂的结合和/或亲和性、增加对组织因子(TF)的亲和性、增加内在活性、增加TF依赖性催化或者凝血活性、增加凝血活性、改变多肽构象以改变酶原性、通过改变高活性与低活性FVIIa构象之间的平衡使之有利于高活性构象而增加催化或凝血活性、增加对蛋白酶的抗性、降低糖基化、增加糖基化、降低免疫原性、增加稳定性、和/或促进化学基团连接的插入、缺失和取代。

3.权利要求1的修饰的FVII多肽，其中所述异源Gla结构域具有SEQ ID NO:110-118、120和121任一项所示的氨基酸序列，或者其实现磷脂结合的足够部分。

4.权利要求2的修饰的FVII多肽，其中所述异源Gla结构域具有SEQ ID NO:110-118、120和121任一项所示的氨基酸序列，或者其实现磷脂结合的足够部分。

5.权利要求2的修饰的FVII多肽，其包含选自Gla Swap FIX、GlaSwap FX、Gla Swap Prot C、Gla Swap Prot S、和Gla Swap凝血酶的修饰。

6.权利要求1的修饰的FVII多肽，其包含位于如下位置处的一或多个进一步的氨基酸修饰，所述位置选自具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽中的D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341或FVII多肽中的对应残基。

7.权利要求2的修饰的FVII多肽，其中：

修饰的FVII多肽含有进一步的修饰，与未修饰的FVII多肽相比表现出对组织因子途径抑制剂(TFPI)的抗性增强。

8.权利要求7的修饰的FVII多肽，其中所述进一步修饰是位于如下位置处的一或多个氨基酸修饰，所述位置选自具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽中的D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341或FVII多肽中的对应残基。

9.权利要求8的修饰的FVII多肽，其中所述一或多个氨基酸修饰选自对应于如下的置换：D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D、K341Q、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA和K197I198insS。

10.权利要求9的修饰的FVII多肽，其中所述一或多个氨基酸修饰选自对应于如下的置换：D196R/R290E、D196K/R290E、D196R/R290D、D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E和D196R/K197M/K199E/R290E。

11.核酸分子，其包含编码权利要求1-10任一项的修饰的FVII多肽的核苷酸序列。

12.载体，其包含权利要求11的核酸分子。

13.权利要求12的载体，其中所述载体是原核载体、病毒载体或者真核载体。

14.权利要求12或13的载体，其是哺乳动物载体。

15.权利要求13的载体，其中所述载体是选自腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒和巨细胞病毒载体的病毒载体。

16.分离的细胞或培养的细胞，其包含权利要求12-15任一项的载体或者权利要求11的核酸分子。

17.细胞，其包含权利要求12-15任一项的载体或者权利要求11的核酸分子，其中所述细胞是真核细胞。

18.权利要求17的细胞，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。

19.权利要求18的细胞，其中所述哺乳动物细胞选自幼仓鼠肾细胞(BHK-21)、293细胞和CHO细胞。

20.权利要求17的细胞，其是酵母细胞。

21.权利要求20的细胞，其是毕赤酵母(Pichia sp.)细胞。

22.权利要求21的细胞，其是巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

23.药物组合物，其在药物可接受的载体中包含治疗有效浓度或量的权利要求1-10任一项的修饰的FVII多肽，或者权利要求11的核酸分子，或者权利要求12-15任一项的载体，或者权利要求17-20任一项的细胞。

24.权利要求23的药物组合物，其被配制为用于局部、系统或者局域给予。

25.权利要求23或24的药物组合物，其被配制为用于口服、经鼻、肺、颊、透皮、皮下、十二指肠内、肠道、胃肠外、静脉内或者肌内给予。

26.权利要求23-25任一项的药物组合物，其被配制为用于控制释放。

27.权利要求23-25任一项的药物组合物，其被配制为用于单一剂量给予。

28.权利要求1-10任一项的修饰的FVII多肽，用于治疗选自如下的疾病或病症：血液凝固病症、血液病、出血性病症、血友病、因子VII缺陷、出血病症、手术出血或者外伤导致的出血。

29.权利要求23-27任一项的药物组合物在制备治疗疾病或病症的药物中的应用，所述疾病或病症选自：血液凝固病症、血液病、出血性病症、血友病、因子VII缺陷、出血病症、手术出血或者外伤导致的出血。

30.权利要求28的修饰的FVII多肽，其中所述疾病或病症是是血友病A、血友病B或者血友病C。

31.权利要求28的修饰的FVII多肽，其中所述疾病或病症是先天性或获得性血友病。

32.权利要求28的修饰的FVII多肽，其中所述疾病或病症是由于手术或外伤所致的出血并发症所导致。

33.权利要求32的修饰的FVII多肽，其中出血表现为急性关节积血、慢性血友病性关节病、血肿、血尿、中枢神经系统出血、胃肠道出血，或者脑出血。

34.权利要求32的修饰的FVII多肽，其中手术是心脏手术、血管成形术、肺手术、腹部手术、脊椎手术、脑手术、血管手术、口腔手术，或者器官移植术。

35.权利要求34的修饰的FVII多肽，其中手术是选自骨髓、心、肺、胰腺和肝的移植术。

36.修饰的因子VII(FVII)多肽，所述修饰的因子VII(FVII)多肽在FVII多肽、其等位基因和种变体或者其活性片段中包含修饰，其中

所述修饰是在对应于具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽的D196、K197和K199的一或多个位置或在FVII多肽的对应残基的氨基酸置换；以及

所述修饰对应于选自如下的置换：D196F、D196W、D196L、D196I、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197Y、K197F、K197W、K199D和K199E，由此

所述修饰的FVII多肽与未修饰的FVII多肽相比表现出对组织因子途径抑制剂(TFPI)的抗性增强、对ATIII抑制的抗性增强和/或凝血活性增强。

37.权利要求36的修饰的FVII多肽，其中FVII多肽中的修饰对应于选自K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199D和K199E的置换。

38.权利要求36的修饰的FVII多肽，其中FVII多肽中的修饰对应于用Y置换197位的氨基酸。

39.权利要求36的修饰的FVII多肽，其进一步包含在FVII多肽中另一位置的进一步修饰。

40.权利要求39的修饰的FVII多肽，其中所述进一步修饰是氨基酸置换、插入或者缺失。

41.权利要求39的修饰的FVII多肽，其中所述进一步修饰是氨基酸置换或者插入，所述氨基酸置换或插入的位置对应于选自D196、K197、K199、G237、T239、R290和K341的位置，其中第一个修饰与第二个修饰在不同氨基酸。

42.权利要求39的修饰的FVII多肽，其中所述进一步氨基酸修饰选自对应于如下的置换：D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D和K341Q。

43.权利要求41的修饰的FVII多肽，其中所述进一步修饰是选自如下的氨基酸插入：G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA和K197I198insS。

44.权利要求42的修饰的FVII多肽，其包含选自对应于如下置换的修饰：D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、K196V/K197E、K197E/K341Q、K197L/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q和K197E/K199E/K341Q。

45.权利要求36的修饰的因子VII(FVII)多肽，所述修饰的因子VII(FVII)多肽在FVII多肽、其等位基因或种变体或者其活性片段中包含两或多个修饰，其中：

所述两或多个氨基酸修饰选自对应于具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽中的两或多个如下氨基酸修饰或者在FVII多肽的对应残基中的氨基酸修饰：D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D、K341Q、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA或K197I198insS；

至少一个修饰选自D196F、D196W、D196L、D196I、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197Y、K197F、K197W、K199D和K199E，并且第二个修饰与第一个修饰不同。

46.权利要求45的修饰的FVII多肽，其中所述FVII多肽含有2、3、4、5、6或7个修饰。

47.权利要求45的修饰的FVII多肽，其包含选自如下的修饰：D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、D196V/K197E、K197E/K341Q、K197L/K341Q、G237V/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q、K197E/K199E/K341Q和K197E/G237V/M298Q。

48.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，其与未修饰的FVII多肽相比表现出组织因子途径抑制剂(TFPI)抗性增加。

49.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，其进一步包含异源Gla结构域或者其实现磷脂结合的足够部分。

50.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，其包含一或多个进一步的氨基酸修饰，该修饰增加对抗凝血酶-III(AT-III)的抗性、增强磷脂结合力和/或亲和性、增加组织因子(TF)亲和性、增加内在活性、增加TF依赖性催化或者凝血活性、增加凝血活性、改变多肽构象以改变酶原性、通过改变高活性与低活性FVIIa构象之间的平衡使之有利于高活性构象而增加催化或凝血活性、增加蛋白酶抗性、降低糖基化、增加糖基化、降低免疫原性、增加稳定性，和/或促进化学基团连接。

51.权利要求36的修饰的FVII多肽，其包含在具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的FVII多肽中的Q176、M298或E296位置或者在FVII多肽的对应残基中的一或多个进一步修饰。

52.权利要求51的修饰的FVII多肽，其中所述氨基酸修饰选自Q176A、M298Q、E296V和E296A。

53.权利要求52的修饰的FVII多肽，其包含选自如下的氨基酸修饰：K197E/G237V/M298Q、K197E/G237V/M298Q/K341Q、K197E/K199E/G237V/M298Q/K341Q、和K197E/M298Q。

54.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，其包含选自如下的一或多个进一步的氨基酸修饰：S279C/V302C、L280C/N301C、V281C/V302C、S282C/V299C、在位置4插入酪氨酸、F4S、F4T、P10Q、P10E、P10D、P10N、Q21N、R28F、R28E、I30C、130D、I30E、K32D、K32Q、K32E、K32G、K32H、K32T、K32C、K32A、K32S、D33C、D33F、D33E、D33K、A34C、A34E、A34D、A34I、A34L、A34M、A34V、A34F、A34W、A34Y、R36D、R36E、T37C、T37D、T37E、K38C、K38E、K38T、K38D、K38L、K38G、K38A、K38S、K38N、K38H、L39E、L39Q、L39H、W41N、W41C、W41E、W41D、I42R、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42K、S43Q、S43N、Y44K、Y44C、Y44D、Y44E、S45C、S45D、S45E、D46C、A51N、S53N、G58N、G59S、G59T、K62E、K62R、K62D、K62N、K62Q、K62T、L65Q、L65S、L65N、F71D、F71Y、F71E、F71Q、F71N、P74S、P74A、A75E、A75D、E77A、E82Q、E82N、E82S、E82TT83K、N95S、N95T、G97S、G97T、Y101N、D104N、T106N、K109N、E116D、G117N、G124N、S126N、T128N、L141C、L141D、L141E、E142D、E142C、K143C、K143D、K143E、R144E、R144C、R144D、N145Y、N145G、N145F、N145M、N145S、N145I、N145L、N145T、N145V、N145P、N145K、N145H、N145Q、N145E、N145R、N145W、N145D、N145C、K157V、K157L、K157I、K157M、K157F、K157W、K157P、K157G、K157S、K157T、K157C、K157Y、K157N、K157E、K157R、K157H、K157D、K157Q、V158L、V158I、V158M、V158F、V158W、V158P、V158G、V158S、V158T、V158C、V158Y、V158N、V158E、V158R、V158K、V158H、V158D、V158Q、A175S、A175T、G179N、I186S、I186T、V188N、R202S、R202T、I205S、I205T、D212N、E220N、I230N、P231N、P236N、G237N、Q250C、V253N、E265N、T267N、E270N、A274M、A274L、A274K、A274R、A274D、A274V、A274I、A274F、A274W、A274P、A274G、A274T、A274C、A274Y、A274N、A274E、A274H、A274S、A274Q、F275H、R277N、F278S、F278A.F278N、F278Q、F278G、L280N、L288K、L288C、L288D、D289C、D289K、L288E、R290C、R290G、R290A、R290S、R290T、R290K、R290D、R290E、G291E、G291D、G291C、G291N、G291K、A292C、A292K、A292D、A292E、T293K、E296V、E296L、E296I、E296M、E296F、E296W、E296P、E296G、E296S、E296T、E296C、E296Y、E296N、E296K、E296R、E296H、E296D、E296Q、M298Q、M298V、M298L、M298I、M298F、M298W、M298P、M298G、M298S、M298T、M298C、M298Y、M298N、M298K、M298R、M298H、M298E、M298D、P303S、P303ST、R304Y、R304F、R304L、R304M、R304G、R304T、R304A、R304S、R304N、L305V、L305Y、L305I、L305F、L305A、L305M、L305W、L305P、L305G、L305S、L305T、L305C、L305N、L305E、L305K、L305R、L305H、L305D、L305Q、M306D、M306N、D309S、D309T、Q312N、Q313K、Q313D、Q313E、S314A、S314V、S314I、S314M、S314F、S314W、S314P、S314G、S314L、S314T、S314C、S314Y、S314N、S314E、S314K、S314R、S314H、S314D、S314Q、R315K、R315G、R315A、R315S、R315T、R315Q、R315C、R315D、R315E、K316D、K316C、K316E、V317C、V317K、V317D、V317E、G318N、N322Y、N322G、N322F、N322M、N322S、N322I、N322L、N322T、N322V、N322P、N322K、N322H、N322Q、N322E、N322R、N322W、N322C、G331N、Y332S、Y332A、Y332N、Y332Q、Y332G、D334G、D334E、D334A、D334V、D334I、D334M、D334F、D334W、D334P、D334L、D334T、D334C、D334Y、D334N、D334K、D334R、D334H、D334S、D334Q、S336G、S336E、S336A、S336V、S336I、S336M、S336F、S336W、S336P、S336L、S336T、S336C、S336Y、S336N、S336K、S336R、S336H、S336D、S336Q、K337L、K337V、K337I、K337M、K337F、K337W、K337P、K337G、K337S、K337T、K337C、K337Y、K337N、K337E、K337R、K337H、K337D、K337Q、K341E、K341Q、K341G、K341T、K341A、K341S、G342N、H348N、R353N、Y357N、I361N、F374P、F374A、F374V、F374I、F374L、F374M、F374W、F374G、F374S、F374T、F374C、F374Y、F374N、F374E、F374K、F374R、F374H、F374D、F374Q、V376N、R379N、L390C、L390K、L390D、L390E、M391D、M391C、M391K、M391N、M391E、R392C、R392D、R392E、S393D、S393C、S393K、S393E、E394K、P395K、E394C、P395D、P395C、P395E、R396K、R396C、R396D、R396E、P397D、P397K、P397C、P397E、G398K、G398C、G398D、G398E、V399C、V399D、V399K、V399E、L400K、L401K、L401C、L401D、L401E、R402D、R402C、R402K、R402E、A403K、A403C、A403D、A403E、P404E、P404D、P404C、P404K、F405K、P406C、K32N/A34S、K32N/A34T、F31N/D33S、F31N/D33T、I30N/K32S、I30N/K32T、A34N/R36S、A34N/R36T、K38N/F40S、K38N/F40T、T37N/L39S、T37N/L39T、R36N/K38S、R36N/K38T、L39N/W41S、L39N/W41T、F40N/I42S、F40N/I42T、I42N/Y44S、I42N/Y44T、Y44N/D46S、Y44N/D46T、D46N/D48S、D46N/D48T、G47N/Q49S、G47N/Q49T、K143N/N145S、K143N/N145T、E142N/R144S、E142N/R144T、L141N/K143S、L141N/K143T、I140N/E142S/、I140N/E142T、R144N/A146S、R144N/A146T、A146N/K148S、A146N/K148T、S147N/P149S/、S147N/P149T、R290N/A292S、R290N/A292T、D289N/G291S、D289N/G291T、L288N/R290S、L288N/R290T、L287N/D289S、L287N/D289、A292N/A294S、A292N/A294T、T293N/L295S、T293N/L295T、R315N/V317S、R315N/V317T、S314N/K316S、S314N/K316T、Q313N/R315S、Q313N/R315T、K316N/G318S、K316N/G318T、V317N/D319S、V317N/D319T、K341N/D343S、K341N/D343T、S339N/K341S、S339N/K341T、D343N/G345S、D343N/G345T、R392N/E394S、R392N/E394T、L390N/R392S、L390N/R392T、K389N/M391S、K389N/M391T、S393N/P395S、S393N/P395T、E394N/R396S、E394N/R396T、P395N/P397S、P395N/P397T、R396N/G398S、R396N/G398T、P397N/V399S、P397N/V399T、G398N/L400S、G398N/L400T、V399N/L401S、V399N/L401T、L400N/R402S、L400N/R402T、L401N/A403S、L401N/A403T、R402N/P404S、R402N/P404T、A403N/F405S、A403N/F405T、P404N/P406S和P404N/P406T。

55.权利要求54的修饰的FVII多肽，其中未修饰的FVII多肽具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。

56.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，其中未修饰的FVII多肽具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。

57.权利要求36-56任一项的修饰的FVII多肽，其具有SEQ ID NO:225-230、232、233、235、242-244和250任一项所示氨基酸序列。

58.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，其是人多肽。

59.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，其是非人多肽。

60.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，其是活性或者成熟多肽。

61.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，其中仅一级序列被修饰。

62.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，其进一步包含化学修饰或者翻译后修饰。

63.权利要求62的修饰的FVII多肽，其中FVII多肽被糖基化、羧化、羟化、硫酸化、磷酸化、白蛋白化，或者与聚乙二醇(PEG)部分缀合。

64.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，其是单链多肽。

65.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，其是双链多肽。

66.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，其是活化的多肽。

67.权利要求66的修饰的FVII多肽，其中活化通过自身激活蛋白酶解、因子IX(FIXa)裂解、因子X(FXa)裂解、因子XII(FXIIa)裂解或者凝血酶裂解实现。

68.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，其保留未修饰的FVII多肽的一或多种活性。

69.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或60个氨基酸位置的修饰，条件是所述多肽保留未修饰的FVII多肽的至少一种FVII活性，

其中所述一或多种活性选自组织因子(TF)结合、因子X(FX)活化、因子IX(FIX)活化、磷脂结合力以及凝血活性。

70.核酸分子，其包含编码权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽的核苷酸序列。

71.载体，其包含权利要求70的核酸分子。

72.权利要求71的载体，其中所述载体是原核载体、病毒载体或者真核载体。

73.权利要求71的载体，其中所述载体是哺乳动物载体。

74.权利要求71的载体，其中所述载体是选自腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒和巨细胞病毒的病毒载体。

75.分离的细胞或细胞培养物，其包含权利要求71的载体。

76.权利要求75的细胞或细胞培养物，其是真核细胞。

77.权利要求76的细胞或细胞培养物，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。

78.权利要求77的细胞或细胞培养物，其中所述哺乳动物细胞选自幼仓鼠肾细胞(BHK-21)或者293细胞或者CHO细胞。

79.细胞，其包含权利要求71的载体，其中所述细胞是酵母细胞。

80.权利要求79的细胞，其是毕赤酵母(Pichia sp.)细胞。

81.权利要求79的细胞，其是巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

82.药物组合物，其包含治疗有效浓度或量的权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽。

83.权利要求82的药物组合物，其被配制为经局部、系统或者局域(topical)给予的形式。

84.权利要求82的药物组合物，其被配制为经口服、经鼻、肺、颊、透皮、皮下、十二指肠内、肠道、胃肠外、静脉内或者肌内给予的形式。

85.权利要求82的药物组合物，其被配制为控制释放形式。

86.权利要求82的药物组合物，其被配制为单一剂量给予形式。

87.权利要求36-47任一项的修饰的FVII多肽，用于治疗通过给予FVII或者促凝剂治疗的疾病或病症。

88.权利要求82的药物组合物在制备治疗通过给予FVII或者促凝剂治疗的疾病或病症的药物中的应用，其中要治疗的疾病或病症选自血液凝固疾病、血液病、出血性疾病、血友病、因子VII缺陷、出血疾病、手术出血或者外伤导致的出血。

89.权利要求87的修饰的FVII多肽，其中被治疗的疾病或病症选自血液凝固疾病、血液病、出血性疾病（hemorrhagic disorder）、血友病、因子VII缺陷、出血疾病(bleeding disorder)、手术出血或者外伤导致的出血。

90.权利要求89的修饰的FVII多肽，其中所述疾病是血友病A或者血友病B或者血友病C。

91.权利要求89的修饰的FVII多肽，其中所述疾病是先天性或获得性血友病。

92.权利要求89的修饰的FVII多肽，其中所述疾病或病症是由于手术或外伤所致出血并发症导致。

93.权利要求92的修饰的FVII多肽，其中出血是急性关节积血、慢性血友病性关节病、血肿、血尿、中枢神经系统出血、胃肠道出血，或者脑出血。

94.权利要求92的修饰的FVII多肽，其中手术是心脏手术、血管成形术、肺手术、腹部手术、脊椎手术、脑手术、血管手术、口腔手术，或者器官移植术。

95.权利要求94的修饰的FVII多肽，其中所述手术是选自骨髓、心、肺、胰腺和肝的移植术的器官移植手术。