JP2010523150A - 改変第vii因子ポリペプチド及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 なし
Description
2007年4月13日に出願された、Edwin Madison、Christopher Thanos、Sandra Waugh Ruggles及びShaun Coughlinの「MODIFIED FACTOR VII POLYPEPTIDES AND USES THEREOF」という名称の米国特許仮出願第60/923,512号明細書の優先権の利益を主張する。
改変された治療用タンパク質が提供される。詳細には、第VIIa因子及び他の型の第VII因子を含む改変第VII因子ポリペプチド、並びにその使用が提供される。
止血は、出血の停止に至る複雑な生理的プロセスである。血小板、血漿タンパク質、血管及び内皮細胞は、このプロセスの3つの構成成分であり、それぞれが、組織損傷の次に直ちに起こり、正常な状況では血餅が迅速に形成する事象において重要な役割を果たす。この中心にあるのが凝固カスケードという一連のタンパク質分解事象であり、特定の血漿タンパク質(又は凝固因子)が、以前に活性化した別の凝固因子によって「カスケード」中で順次活性化され、トロンビンの迅速な生成に至る。次いで、このカスケード中で産生された大量のトロンビンが働いてフィブリノゲンを切断して、血餅形成に必要なフィブリンペプチドにする。
改変第VII因子(FVII)ポリペプチドが本明細書で提供される。具体的には、凝固促進活性を示す改変FVIIポリペプチドが本明細書で提供される。そのFVIIポリペプチドは、非改変FVIIポリペプチドと比較して一次配列が改変され、アミノ酸の挿入、欠失及び交換を含み得る。本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドは、組織因子経路阻害因子(TFPI)の阻害効果に対する抵抗性の増大、アンチトロンビンIII(AT−III)の阻害効果に対する抵抗性の増大、Zn2+結合の低下、半減期の増大などの薬物動態特性の向上、TFの存在及び/若しくは不在下での触媒活性の増大、並びに/又は活性化血小板との結合の増大を示すFVIIポリペプチドを含む。改変FVIIポリペプチドは、本明細書で提供される改変の任意の組合せを含有し得、それによって、ポリペプチドの1つ又は複数の活性又は特性が非改変FVIIポリペプチドと比較して変化する。典型的には、改変FVIIポリペプチドは凝固促進活性を保持する。改変FVIIポリペプチドをコード/発現する核酸分子、ベクター及び細胞も本明細書で提供される。医薬組成物、製品、キット及び治療方法も本明細書で提供される。FVIIポリペプチドは、他の活性及び/又は特性に影響を及ぼす改変を有する、対立遺伝子及び種変異体及びポリペプチド並びに他の変異体を含む。本明細書で提供される改変を含むFVIIポリペプチドの活性断片も含まれる。配列番号3に示すアミノ酸の配列を含むもの、並びにそれと60%、65%、70%、75%、80%、85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の配列同一性を有するその変異体は、FVIIポリペプチドを例示するものである。
アウトライン
A.定義
B.止血の概要
1.血小板接着及び凝集
2.凝固カスケード
a.開始
b.増幅
c.伝播
3.凝固の制御
C.第VII因子(FVII)
1.FVII構造及び構成
2.翻訳後修飾
3.FVIIプロセシング
4.FVII活性化
5.FVII機能
a.組織因子依存性FVIIa活性
b.組織因子非依存性FVIIa活性
6.生物製剤としてのFVII
D.改変FVIIポリペプチド
1.阻害因子に対する抵抗性
a.TFPI
TFPIに対する抵抗性の増大をもたらすための改変
b.アンチトロンビンIII(AT−III)
AT−IIIに対する抵抗性の増大をもたらすための改変
2.活性化血小板への結合
異種Glaドメインの導入による改変
3.組合せ及び追加の改変
a.固有活性を増大させる改変
b.プロテアーゼに対する抵抗性を増大させる改変
c.リン脂質に対する親和性を増大させる改変
d.グリコシル化を変化させる改変
e.化学基連結を容易にするための改変
f.例示的なFVII組合せ変異体
E.FVIIの改変の設計及び方法
1.論理的
2.実証的(即ちスクリーニング)
a.ランダム突然変異誘発
b.集中的な突然変異誘発
c.スクリーニング
3.FVII変異体の選択
F.FVIIポリペプチドの生成
1.ベクター及び細胞
2.発現系
a.原核性の発現
b.酵母
c.昆虫及び昆虫細胞
d.哺乳動物細胞
e.植物
2.精製
3.融合タンパク質
4.ポリペプチドの修飾
5.ヌクレオチド配列
G.改変FVIIポリペプチドの活性の評価
1.in vitroでのアッセイ
a.翻訳後修飾
b.タンパク質分解活性
c.凝固活性
d.他のタンパク質への結合及び/又は他のタンパク質による阻害
e.リン脂質の親和性
2.ヒト以外の動物モデル
3.臨床アッセイ
H.製剤及び投与
1.製剤
a.用量
b.投与形態
2.改変FVIIポリペプチドの投与
3.改変FVIIポリペプチドをコードする核酸の投与(遺伝子治療)
I.治療的使用
1.先天性出血障害
a.血友病
b.FVII欠乏症
c.その他
2.後天性出血障害
a.化学療法による後天性の血小板減少症
b.他の凝固障害
c.移植による後天性の出血
d.抗凝固療法誘発性の出血
e.後天性血友病
3.外傷及び外科手術での出血
J.組合せ療法
K.製品及びキット
L.実施例
別段に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。すべての特許、特許出願、公開された出願及び公報、Genbank配列、データベース、ウェブサイト並びに本明細書全体の開示で言及されるその他の公開された資料は、別段に記載しない限り、その全体が参照により組み込まれる。本明細書における用語について複数の定義がある場合、この項のものが優勢である。URL若しくは他のそのような識別子又はアドレスに言及する場合、そのような識別子は変更でき、インターネット上の特定の情報は移り変わり可能であるが、同等の情報はインターネットを検索することにより見出すことができる。それらへの言及は、そのような情報の利用可能性及び公共での普及の証拠である。
本明細書において、改変第VII因子(FVII)ポリペプチドが提供される。そのようなFVIIポリペプチドは、凝固活性が増大するように設計される。よって、これらのポリペプチドは、例えば、止血及びその他の関連する生物学的プロセスを調節するための治療剤としての種々の使用及び適用を有する。本明細書で提供される改変及びそのような改変FVII分子の使用を認識するために、止血システム及び血液凝固カスケードを理解することが有利である。以下の記載は、そのような背景、第VII因子及びその改変の論述についての序文を提供する。
血液の凝血は、通常の条件下では能動的に回避されている。血管内皮は、血管拡張を支持し、血小板接着及び活性化を阻害し、凝固を抑制し、フィブリン切断を増進し、抗炎症性の性質である。血管内皮細胞は、血小板凝集を阻害して血管を広げる亜酸化窒素(NO)及びプロスタサイクリンなどの分子を分泌する。これらの分子の放出により、可溶性グアニル酸シクラーゼ(sGC)及びcGMP依存性プロテインキナーゼI(cGKI)が活性化され、環状グアノシン1リン酸(cGMP)レベルが増大し、このことが、血管壁内の平滑筋の弛緩を引き起こす。さらに、内皮細胞は、CD39などの細胞表面ADPアーゼを発現し、これが、血小板から放出されたADPをアデニンヌクレオチド血小板阻害因子に変換することにより血小板の活性化及び凝集を調節する。内皮は、フィブリン溶解カスケードにおける酵素の制御においても重要な役割を演じる。内皮細胞は、プラスミノゲン(アネキシンII)及びウロキナーゼの受容体の発現、並びに組織型プラスミノゲン活性化因子及びウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子の分泌(これらはすべて凝血塊の除去を促進する)によりプラスミンの生成を直接促進する。血栓形成促進性の制御の最終相において、内皮細胞は、トロンビン及びその他の凝固因子のアンチトロンビンIII阻害の速度論を増大するヘパラン硫酸の生成により、凝固カスケードの阻害において能動的な役割を演じる。
凝固経路は、それぞれの酵素が血漿中に酵素原又は不活性形として存在するタンパク質分解経路である。酵素原の切断は、前駆分子から活性形を放出するように制御される。糖タンパク質FVIII及びFVなどの活性化されたプロテアーゼの補因子も、カスケード反応において活性化され、凝血塊形成において役割を演じる。経路は、活性化プロセスを調節する一連の正及び負のフィードバックループとして機能し、最終ゴールはトロンビンの生成であり、これは、次いで、可溶性フィブリノゲンをフィブリンに変換して凝血塊を形成できる。凝固における因子は、典型的に、活性化された形を示す小文字の「a」が添えられたローマ数字で示される。以下の表3は、因子の一般名、及び凝固カスケードにおけるそれらの役割を含む、因子の例示的なリストを示す。一般に、これらのタンパク質は、凝固の内因性、外因性又は共通する経路の1つ又は複数により血液凝固に関与する(図1を参照されたい)。以下に論述するように、これらの経路は相互に連絡しており、血液凝固は、第VII因子(FVII)が凝固の主要な開示剤である細胞ベースの活性化モデルにより発生すると考えられている。
FVIIは、凝固カスケードの開始を担う凝固因子であると考えられ、この開始は、TFとのその相互作用に依存する。TFは、平滑筋細胞、繊維芽細胞、単核細胞、リンパ球、顆粒球、血小板及び内皮細胞などの種々の細胞により発現される膜貫通糖タンパク質である。骨髄細胞及び内皮細胞は、炎症促進性サイトカインなどによって、それらが刺激されたときだけTFを発現する。しかし、平滑筋細胞及び繊維芽細胞は、TFを構成的に発現する。よって、これらの細胞が、組織損傷の後に血流と一旦接触すると、凝固カスケードは、TFの、血漿中の第VII因子又はFVIIaへの結合により直ちに開始される。
増幅は、トロンビンが血小板に結合して活性化するときに起こる。活性化血小板は、それらのアルファ顆粒からFVを放出し、これは、トロンビンによりFVaに活性化される。トロンビンも放出され、血小板膜上のFVIII/vWF複合体からのFVIIIを活性化し、FXIをFXIaに切断する。これらの反応は、それらの表面にFVa、FVIIIa及びFIXaを有する活性化血小板を生成し、これが伝播段階の間の大量のトロンビン生成のための舞台を設定する。
凝固の伝播は、損傷部位での多数の血小板の表面上で生じる。上記のように、活性化血小板はFXIa、FVIIIa及びFVaをそれらの表面上に有する。ここで、外因性経路が起こるのである。FXIaは、FIXをFIXaに活性化し、これが次いで、FVIIIaに結合できる。このプロセスが、TFを有する細胞上のTF/FVIIa複合体によるFIXの切断により生成される少量のFIXaと共に、多数のFXIa/FVIIIa複合体を生成し、これが次いで、著しい量のFXをFXaに活性化できる。FXa分子は、FVaに結合して、プロトロンビナーゼ複合体を生成し、これがプロトロンビンをトロンビンに活性化する。トロンビンは、正のフィードバックループ内で作用して、さらにより多くの血小板を活性化し、増幅段階について記載したプロセスを再び開始する。
凝固の間に、カスケードは、さらなる凝血塊形成を阻害する構成性及び刺激性のプロセスにより制御される。そのような制御機構について、いくつかの理由がある。まず、制御は、フィブリン凝血塊形成による組織の虚血を制限する必要がある。次に、制御は、凝血塊形成を組織損傷部位だけに局在化させることにより、広範な血栓形成を妨げる。
第VII因子は、哺乳動物を含めた動物において、肝臓における一本鎖酵素原として合成され、血流へ分泌されるビタミンK依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質である。上記のように、FVIIは、トロンビン生成及びフィブリン沈着へと導くタンパク分解性事象のカスケードを開始することに関与する凝固プロテアーゼである。それは外因性経路の一部であるが、その活性の下流効果は、内因性経路にも大きな影響を与える。この血塊形成に不可欠な役割により、臨床上の抗凝固療法及び止血治療のための標的としてFVIIに大きな関心が寄せられている。例えば、組換え活性化FVII(rFVIIa)は、血友病患者及び他の出血性状態を有する患者に用いる止血剤として開発されている。活性化によって凝固活性が増大するように設計され、第VII因子治療を受け入れられる疾患及び状態を治療するための改善された治療薬として働くことができる改変FVIIポリペプチドが本明細書で提供される。
ヒトFVII遺伝子(F7)は、第13染色体の13q34に位置し、9個のエクソンを含む12.8kb長である。FVII遺伝子は、プロトロンビン、第IX因子、第X因子、及びプロテインCなどの他のビタミンK依存性タンパク質をコードする遺伝子と有意な構成的類似性を共有する。FVIIのmRNAは、選択的スプライシングを受けて、以下の2つの転写産物を生じる:変異体1(配列番号108に示す、ジェンバンクアクセッション番号NM_000131)及び変異体2(配列番号109に示す、ジェンバンクアクセッション番号NM_019616)。肝臓においてより豊富にある型である転写産物変異体2は、エクソン1bを含まず、したがって、転写産物変異体1にコードされる466個のアミノ酸の前駆ポリペプチド(FVIIアイソフォームa前駆体;配列番号1)と比較して、444個のアミノ酸のより短い前駆ポリペプチド(FVIIアイソフォームb前駆体;配列番号2)をコードする。FVIIアイソフォームb前駆ポリペプチドに存在しないアミノ酸は、FVIIアイソフォームa前駆体のアミノ酸位置22〜43に対応する。これらのアミノ酸は、プロペプチド配列の一部であり、結果として、切断型のFVIIアイソフォームbプロペプチドを生じる。前駆ポリペプチドは、以下のセグメント及びドメインで構成されている:疎水性シグナルペプチド(配列番号1及び2のアミノ酸1〜20位)、プロペプチド(配列番号1のアミノ酸21〜60位;及び配列番号2のアミノ酸21〜38位)、Glaドメイン(配列番号1のアミノ酸39〜83位;及び配列番号2のアミノ酸61〜105位)、B型上皮増殖因子ドメイン(EGF様1、配列番号1のアミノ酸84〜120位、及び配列番号2のアミノ酸106〜142位)、A型上皮増殖因子ドメイン(EGF様2、配列番号1のアミノ酸125〜166位;及び配列番号2のアミノ酸147〜188位)、及びセリンプロテアーゼドメイン(配列番号1のアミノ酸191〜430位、及び配列番号2のアミノ酸213〜452位)。
FVII前駆ポリペプチド(第VII因子遺伝子のアイソフォームのいずれでも)は、小胞体(ER)へ挿入して膜を横切っての転位を惹起する疎水性シグナルペプチドによって細胞分泌経路へ標的化される。そのタンパク質がER膜を通って転位する間、20個のアミノ酸シグナルペプチドは、ER内腔内のシグナルペプチダーゼによって切り離され、その後、そのポリペプチドは、N−グリコシル化及びO−グリコシル化、N−末端グルタミン酸のγ−カルボキシグルタミン酸へのビタミンK依存性カルボキシル化、並びにアスパラギン酸のβ−ヒドロキシアスパラギン酸へのヒドロキシル化を含めた、さらなる翻訳後修飾を受ける。
修飾されたプロFVIIポリペプチドは、ゴルジ内腔を通って、トランスゴルジコンパートメントへと輸送され、そこで、そのプロペプチドは、そのタンパク質の細胞からの分泌直前にプロペプチダーゼによって切断される。PACE/フューリン(PACEは対塩基性アミノ酸切断酵素(Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme)の頭字語である)は、多くのタンパク質を配列モチーフArg−[任意の残基]−(Lys又はArg)−Argのカルボキシ末端側で切断するゴルジ膜に局在しているエンドペプチダーゼである。このプロペプチダーゼは、プロ第IX因子及びプロvWFポリペプチドなどのビタミンK依存性糖タンパク質を切断し(Himmelspachら、(2000)Thromb Research 97;51〜67)、成熟タンパク質からプロペプチドを放出する。適切なPACE/フューリン認識部位を組換え第VII因子前駆体へ包含させることによって、組換えポリペプチドの正しいプロセシング及び分泌が容易になる(Margaritasら、(2004)Clin Invest 113(7):1025〜1031)。PACE/フューリン又は別のサブチリシン様プロペプチダーゼ酵素は、プロFVIIのFVIIへのタンパク分解性プロセシングに関与する可能性が高い。それは、配列番号1に示す配列のアミノ酸位置35〜38及び配列番号2に示す配列のアミノ酸位置57〜60における−Arg−Arg−Arg−Arg−共通モチーフを認識且つ結合し、プロペプチドを切断して、成熟タンパク質を分泌として放出することができる。
血液中の大多数のFVIIは、不活性化一本鎖酵素原の形をとっているが、少量は二本鎖活性化型で存在する。FVIIの活性化は、Arg152−Ile153結合(配列番号3に示す成熟FVIIポリペプチドに関しての位置)のタンパク分解性切断で起こり、ジスルフィド架橋によって254個のアミノ酸重鎖(約30kDa)に連結した152個のアミノ酸軽鎖(約20kDa)を含有する二本鎖ポリペプチドを生じる。FVIIaの軽鎖は、Glaドメイン及びEGF様ドメインを含有し、一方、重鎖は、その分子の触媒性又はセリンプロテアーゼ部分を含有する。一本鎖FVIIの二本鎖FVIIaへの変換は、FIXa、FXa、FXIIa、トロンビンによる切断により、又は内在性FVIIaによる自己触媒性様式で媒介される(Butenasら、(1996)Biochem 35:1904〜1910;Nakagakiら、(1991)Biochem 30:10819〜10824)。循環中に存在する痕跡量のFVIIaは、FXa及びFIXaの作用から生じる可能性が高い。
FVIIaは、TFによるアロステリック活性化後、活性の増大を示すが、FVIIa単独で凝固を開始することができる機構が存在するという証拠がある。したがって、FVIIは、TF依存性様式及びTF非依存性様式で機能することができる。この後者の経路は、通常の止血においては、よりはるかに小さい役割を果たすことができるにすぎないが、出血性障害及びその治療との関連において考えられる場合、それは重要であり得る。
循環FVIIは、上記のように、細胞表面TFを結合し、FIXa、FXa、トロンビンによって、又は内在性FVIIaによる自己触媒的様式で、活性化される。或いは、極少量の循環FVIIaが直接、TFを結合することができる。その後、TF/FVIIa複合体は、ほんのわずかの血漿FXを結合し、FVIIa触媒ドメインがFXを切断して、FXaを生じる。したがって、トロンビンは、TF含有細胞の表面上で外因性経路を介して形成され、そのとき、FXaがFVaと複合体を形成して、プロトロンビンをトロンビンに活性化する(図3)。FIXもまた、TF/FVIIa複合体によって活性化され、活性化血小板の表面上で作動する内因性経路へのリンクを提供する。上記の凝固カスケードにおけるポジティブフィードバック系は、大量のトロンビンが生成され、それがフィブリノゲンをフィブリンへと切断して血塊を形成する手段を提供する。
FXのFXaへの活性化についてのTF依存性機構に加えて、FVIIaがまたTFの不在下でFXを活性化できるという証拠がある。活性化血小板は、ホスファチジルセリン及び他の負荷電リン脂質を外側の血漿配向性表面に転位させる(Hemkerら、(1983)Blood Cells 9:303〜317)。これは、FVIIaのTFへの結合親和性の1000分の1である相対的に低い親和性ではあるが、FVIIaが結合することができる代替の「受容体」を提供する(Monroeら、(1997)Br J Haematol 99:542〜7)。この相互作用は、Glaドメインにおける残基を通して媒介される(Harveyら、(2003)278:8363〜8369)。その後、FVIIaは、活性化血小板表面上で、FXをFXaへ、及びFIXをFIXaへ変換することができる(Hoffmanら、(1998)Blood Coagul Fibrinolysis 9:S61〜S65)。FXaは血小板表面と会合したままであり、そこで、それはFVaに結合して、プロトロンビンから十分なトロンビンを生成することができ、同時に、新しく形成されたFIXaは、FVIIIaと集合して、より多くのFXのFXaへの活性化を触媒する(図3)。その後、TFの不在下における止血は、上記のポジティブフィードバック及び伝播機構によって達成することができる。しかしながら、FVIIIaが活性化血小板上で凝固過程に寄与することができるが、その存在は、TF非依存性機構においてトロンビン生成に必要とされないことは注目に値する(図3)。したがって、血友病患者においてのようなFVIIIの不在下において、FVIIaが、この二次機構を通してトロンビン生成を開始及び/又は増幅し、血塊形成をもたらすことができるという証拠がある。
FVIIは血液凝固を開始するように機能する。組換えFVIIa(NovoSeven(登録商標);rFVIIa)は、第VIII因子又は第IX因子の阻害因子を有する血友病A又はBに罹患する患者、及び先天性第VII因子欠乏症に罹患する患者における出血症状の治療、又は外科手術若しくは侵襲的方法での出血予防として認められている。Novoseven(登録商標)は、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞を用いて哺乳動物発現系で産生される第VIIa因子の遺伝子組換え型調製物である。その作用物質は、その構造及び機能において血漿由来第VIIa因子とほぼ同一である(Ratkoら、(2004)、P&T、29:712〜720)。
改変FVIIポリペプチドが本明細書で提供されている。FVIIポリペプチドは、非改変FVIIポリペプチドと比較して、1つ又は複数の活性又は性質の変化を示す。改変の結果として変化することができる活性又は性質には、それだけに限らないが、凝固若しくは凝固活性;凝固促進活性;第X因子(FX)活性化若しくは第IX因子(FIX)活性化をもたらすなどのタンパク分解性活性若しくは触媒活性;抗原性(抗FVII抗体への結合に関してポリペプチドに結合する、又はポリペプチドと競合する能力);組織因子、第X因子、若しくは第IX因子を結合する能力;活性化血小板の細胞表面に結合する能力;リン脂質に結合する能力;半減期;三次元構造;pI;及び/又は高次構造が挙げられる。典型的には、改変FVIIポリペプチドは、凝固促進活性を示す。一本鎖酵素原型からの活性化で凝固活性の増大を示す改変FVIIポリペプチドが本明細書で提供されている。そのような改変FVIIポリペプチドは、血友病又は傷害などの出血性障害又は事象の治療に用いることができ、FVIIポリペプチドは血液凝固を促進するように機能することができる。そのような改変FVIIポリペプチドの中には、組織因子経路阻害因子(TFPI)及びアンチトロンビンIII(AT−III)などの阻害因子に対する抵抗性が増大しているもの、TFの存在下及び/又は不在下で触媒活性が増大しているもの、半減期の増大などの薬物動態学的性質が向上しているもの、並びに血小板表面への結合及び/又は親和性が増大しているものが含まれる。特に、そのような改変FVIIポリペプチドは、凝固活性を供給しながらも、同時にFVIIIa及びFIXaの必要性を迂回するように、疾患又は状態に用いることができる。一例では、本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドは、FVIIIa及びFIXaに対する自己抗体を有する血友病患者に用いることができる。したがって、本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドは、止血のために血清中十分な濃度の活性FVIIを維持するために必要とされるFVII投与量の低下を含めた利点を与える。これは、例えば、匹敵する生物学的効果を達成するのに必要なより少ない用量及び/又は投薬頻度、治療効果のより速い発現、急性出血症状のより速い改善、対象によるより高い快適性及び許容性、並びに二次的な非有益的効果の減弱をもたらすことができる。
ほとんどの生命システムと同様に、凝固カスケードは、ポジティブ及びネガティブ機構によって制御される。これらの機構はしばしば、直接的か又は間接的かのいずれかで、カスケードに関与する1つ又は複数の因子の活性を阻害又は増強することによって作用する。したがって、それらの活性をネガティブに制御する阻害機構に対して抵抗性である治療的凝固因子を対象とする。特に、通常FVII活性を阻害する阻害分子に対して抵抗性である改変FVIIポリペプチドを対象とする。TF/FVIIa複合体の主要な制御因子は組織因子経路阻害因子(TFPI)である。また、FVIIa活性に対して阻害性であるのは、より少ない程度ではあるが、アンチトロンビンIII(AT−III)である。
組織因子経路阻害因子は、染色体2q31〜q32.1に位置する9個のエクソンによってコードされる一本鎖ポリペプチドである。TFPI(TFPI−1とも呼ばれる)は、主として内皮細胞によって合成されるクニッツ型阻害因子であり、負荷電アミノ末端領域、3つの直列クニッツ型阻害因子ドメイン、及び高塩基性カルボキシル末端部を含有する(Wunら、J.Biol.Chem.263:6001(1988))。選択的mRNAスプライシングによって、以下の2つの異なる型のTFPIが生じる:TFPIα及びTFPIβ。TFPIαは、およそ46kDaの分子量を有する分泌タンパク質である。前駆ポリペプチドは、長さが304個のアミノ酸であり(配列番号101)、28個のアミノ酸のシグナルペプチドの切断によってプロセシングされ、276個のアミノ酸の成熟糖タンパク質(配列番号102)の分泌を生じる。成熟タンパク質は、18個のシステイン残基を含有し、正しく折り畳まれる場合、9つのジスルフィド架橋を形成する。一次配列はまた、3つのAsn−X−Ser/Thr N−結合型グリコシル化共通部位を含有し、アスパラギン残基は位置145、195、及び256に位置する。クニッツ−1及びクニッツ−2ドメインは、それぞれ、TF/FVIIa複合体及びFXaの結合及び阻害に関与する(例えば、図4参照)。プロテイナーゼ阻害活性を欠く、TFPIαのクニッツ−3ドメイン、及びTFPIαのC末端は、その細胞表面局在性に関与することが示されている(Piroら、(2004)Circulation 110:3567〜3572)。
TFPIに対する抵抗性の増大を示す改変FVIIポリペプチドが本明細書で提供される。そのようなTFPIに対する抵抗性は、例えば、TFPIとの相互作用及び結合に関与するFVIIにおける1つ又は複数の残基を突然変異させて、そのような結合を低減又は阻止し、それにより、改変FVIIポリペプチドを、凝固開始に関するTFPIの自然の阻害効果に対して抵抗性にすることにより達成することができる。適切なin vitroのアッセイにおいて、又は凝固促進治療薬としての対象への投与後などのin vivoで評価される場合、改変TFPI抵抗性FVIIポリペプチドは、非改変FVIIポリペプチドと比較して凝固活性の増大を示すことができる。TFPI抵抗性の増大を示すFVIIa突然変異体の中には、半減期が増大している突然変異体がある。例えば、実施例9に記載された突然変異体は、半減期の増大を示す。
アンチトロンビンIII(アンチトロンビン又はAT−IIIとしても知られている)は重要な抗凝固セルピン(セリンプロテアーゼ阻害因子)である。AT−IIIは、464個のアミノ酸残基を含有する前駆タンパク質(配列番号122)として合成される。分泌の過程において、32残基のシグナルペプチドが切断されて、432個のアミノ酸の成熟ヒトアンチトロンビン(配列番号123)を生じる。58kDa AT−III糖タンパク質は、血液中を循環し、セリンプロテアーゼ阻害因子(セルピン)として、凝固系の多数のセリンプロテアーゼを阻害するように機能する。AT−IIIの主要な標的は、トロンビン及び第Xa因子であるが、AT−IIIはまた、FIXa、FXIa、FXIIa、及びより少ない程度で、FVIIaの活性を阻害することが示されている。AT−IIIの作用は、天然に存在するヘパラン硫酸、又は臨床診療で抗凝固薬として広く用いられている様々な組織由来ヘパリンなどのグリコサミノグリカンによって大いに増強される。AT−IIIは、反応中心ループに高次構造変化を引き起こす、ヘパリンにおける独特の五糖配列に非常に特異的な様式で、結合する。そのような高次構造において、AT−IIIの反応中心ループは、セリンプロテアーゼの反応部位とより効率的に相互作用し、阻害をもたらすことができる。
AT−IIIによる阻害に対する抵抗性を増大させる改変を、FVIIポリペプチドに行うことができる。一般的に、そのような改変FVIIポリペプチドは、FVIIポリペプチドの少なくとも1つの活性を保持する。典型的には、そのような改変は、FVIIa(又はTF/FVIIa複合体)のAT−IIIとの相互作用に直接関与するFVIIポリペプチドの任意の位置において、又はFVIIa(又はTF/FVIIa複合体)とAT−IIIの間の相互作用に直接関与する残基の位置又は高次構造に影響を及ぼす他の残基において、1つ又は複数のアミノ酸置換を含む。AT−IIIに対する抵抗性が増大している改変FVIIポリペプチドは、特定の条件下でのAT−IIIによる阻害の程度において、又はAT−IIIによる阻害についての二次速度定数において、in vivo、ex vivo、又はin vitroのいずれかで、非改変又は野生型FVIIポリペプチドの阻害の程度、又は阻害についての二次速度定数と比較して少なくとも約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%、300%、400%、500%、又はそれ以上、低減を示すことができる。したがって、改変FVIIポリペプチドは、凝固開始に関するAT−IIIの自然の阻害効果に対して抵抗性である。適切なin vitro若しくはex vivoのアッセイにおいて、又は凝固促進治療薬としての対象への投与後などのin vivoで評価される場合、改変AT−III抵抗性FVIIポリペプチドは、非改変FVIIポリペプチドと比較して凝固活性の増大を示す。
TF依存性及び/又はTF非依存性凝固開始中の凝固活性を増大させる改変もまたFVIIポリペプチドに行うことができる。この提唱された、TF非依存性凝固開始の機構は、FVIIa(TFとの複合体中ではない)によるFX及びFIXの直接的活性化に関わり、それは活性化血小板の表面上で実行される。FVIIaは、FVIIaポリペプチドのGlaドメインにおける残基と、血小板表面上に発現したホスファチジルセリン及び他の負荷電リン脂質との間の相互作用を通して活性化血小板を結合する。この相互作用は比較的弱く、凝固中に通常、観察される初期の大量のトロンビン生成には重要な役割を果たしていない可能性が高く、それはTF依存性活性の結果である可能性が非常に高い。上記で論じるように、TF非依存性凝固開始及びFVIIaの血小板表面との比較的弱い相互作用が、臨床において効力を得るための高用量のrFVIIaの投与の必要性の理由となり得る。例えば、血漿中10nM FVIIのたった約1%がTF/FVIIaとして存在するだけであるが、rFVIIaの治療量は、このレベルよりはるかに上の、90μg/kg又は血漿中約50nMである。したがって、高用量のrFVIIaが、活性化血小板へのrFVIIaの低親和性結合を代償し、治療中、その治療薬の十分な凝固活性を生じる。したがって、凝固開始をもたらすのに十分な、活性化血小板への結合及び/又は親和性の増大によってより低用量で投与することができる改変FVIIポリペプチドを治療の対象とする。本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドは、Glaドメインの改変を通して活性化血小板への結合及び/又は親和性の増大を示すように設計されている。
改変FVIIとリン脂質膜の間の相互作用を増強し、それにより凝固活性を増大させることを目的とする場合、活性化血小板へのそれの比較的低い結合親和性を理由に、FVIIのGlaドメインが改変の標的となる。改変は、この相互作用に関与する特定のアミノ酸の置換によって実行することができる(例えば、Shahら、PNAS 95:4429〜4234、Harveyら、(2003)J Biol Chem 278:8363〜8369参照)。或いは、改変は、Glaドメイン全体の別のビタミンK依存性タンパク質のGlaドメインでの置換、即ち、Glaドメインスワップによって実行することができる。この型の改変は、プロテインCのGlaドメインがFVIIのGlaドメインと交換されたときに生じたものなどのキメラタンパク質を生じる(Gengら、(1997)Thromb Haemost 77:926〜933)。
TFPI抵抗性の増大、AT−IIIに対する抵抗性の増大、TF依存性及び/若しくはTF非依存性触媒活性の増大、半減期増大などの薬物動態学的性質の向上、並びに/又はリン脂質膜に対する結合及び/若しくは親和性の増大を示すためのFVIIポリペプチドの改変に加えて、本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドには、上記性質のうちの1つより多くを示すものも挙げられる。例えば、FVIIポリペプチドは、結果として生じるポリペプチドがリン脂質に対する結合及び/又は親和性の増大を示し、且つまたTFPIに対する抵抗性の増大も示すように改変することができる。したがって、FVIIポリペプチドは、別のビタミンK依存性血漿タンパク質由来の異種Glaドメインの導入、及び配列番号3に示す成熟FVIIポリペプチドに関して位置196、197、199、237、239、290、又は341のアミノ酸の任意の1つ又は複数の置換によって改変することができる。
一例では、結果として第X因子及び/又は第IX因子への触媒活性の増大を生じる追加の改変を、本明細書で提供される改変第VII因子ポリペプチドに行うことができる。例えば、結果として生じる改変FVIIポリペプチドが、TFに対する親和性が増大し、それによりFX及び/又はFIXへの活性の増大を示すように、それの補因子、TFとの相互作用に関与するアミノ酸に改変を行うことができる。FX及び/又はFIXへの改変FVIIポリペプチドの固有活性が非改変ポリペプチドの活性と比較して増大しているように、FVIIポリペプチドの活性化ポケットにも改変を行うことができる。結果として活性の増大を生じる別の改変ストラテジーは、タンパク質のフォールディング及び高次構造がより高活性の型へ変化している、又は高活性高次構造と不活性(又はより低活性)高次構造との間の平衡が、高活性高次構造(複数可)の方を選んでシフトしているようなFVIIポリペプチドの改変を伴う。より高活性のポリペプチドはまた、FVIIポリペプチドのβストランドに関与するアミノ酸の改変によって達成することができる。例えば、改変FVIIポリペプチドをより高活性の型へと「ロックする」ように機能することができる新しいジスルフィド結合を形成することができる新しいシステイン対を導入するアミノ酸置換を行うことができる。
本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドはまた、結果としてポリペプチドのプロテアーゼに対する抵抗性の増大を生じる追加の改変を含有することができる。例えば、1つ又は複数の潜在的タンパク分解性切断部位を除去するアミノ酸置換を行うことができる。したがって、改変FVIIポリペプチドは、プロテアーゼに対する抵抗性がより高められ、それにより、改変ポリペプチドの安定性及び半減期を増大することができる。
FVIIの凝固活性は、活性化血小板の表面上に発現するものなどのリン脂質に対するポリペプチドの結合及び/又は親和性を増大させることにより増強することができる。例えば、結果としてホスファチジルセリン及び他の負荷電リン脂質を結合する能力の増大を示す改変FVIIポリペプチドを生じる追加のアミノ酸置換は、FVIIポリペプチドの内在性Glaドメインにおける特定の位置に行うことができる。したがって、そのような改変FVIIポリペプチドが内在性Glaドメインを有する、即ち、内在性Glaドメインと別のビタミンK依存性タンパク質のそれとの置換を生じる改変をまだ受けていないとの条件で、そのような改変はまた、本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドに含むことができる。
タンパク質のグリコシル化レベルの変化は、免疫原性を低減し、安定性を増大させ、投与頻度を低減し、及び/又は炎症などの有害な副作用を低減するための手段として当技術分野において記載されている。通常、これは、グリコシル化レベルを増大させることによってもたらされる。グリコシル化部位(複数可)は、ポリペプチドがグリコシル化の能力がある真核細胞で産生される場合、それがグリコシル化されるように、ポリペプチド上に糖部分付着のための部位を提供する。
本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドの追加の改変はまた、後の化学基の連結を容易にするために行うことができる。化学基が、置換されたアミノ酸を介して改変FVIIポリペプチドに連結することができるように、1つ又は複数のアミノ酸置換又は挿入を行うことができる。例えば、システインを改変FVIIポリペプチドに導入することができ、それにポリエチレングリコール(PEG)部分を連結させて、安定性及び血中半減期の増大を与えることができる。他の付着残基には、リシン残基、アスパラギン酸残基、及びグルタミン酸残基が挙げられる。いくつかの実施形態では、潜在的連結位置の数を低減するためにアミノ酸残基を交換する。例えば、リシンの数を低減することができる。後の化学基との連結を容易にすることができるFVIIポリペプチドのアミノ酸配列に行うことができる改変の例には、それだけに限らないが、米国特許出願公開第2003/0096338号明細書、米国特許出願公開第2006/0019336号明細書、米国特許第6806063号明細書、国際公開第2001/58935号パンフレット、及び国際公開第2002/077218号パンフレットに記載されているものが挙げられる。後の化学基との連結を容易にすることができる、FVIIポリペプチドの例示的な改変の非限定的な例には、それだけに限らないが、Q250C、R396C、P406C、I42K、Y44K、L288K、D289K、R290K、G291K、A292K、T293K、Q313K、S314K、R315K、V317K、L390K、M391K、R392K、S393K、E394K、P395K、R396K、P397K、G398K、V399K、L400K、L401K、R402K、A403K、P404K、F405K、I30C、K32C、D33C、A34C、T37C、K38C、W41C、Y44C、S45C、D46C、L141C、E142C、K143C、R144C、L288C、D289C、R290C、G291C、A292C、S314C、R315C、K316C、V317C、L390C、M391C、R392C、S393C、E394C、P395C、R396C、P397C、G398C、V399C、L401C、R402C、A403C、P404C、I30D、K32D、A34D、T37D、K38D、W41D、Y44D、S45D、D46C、L141D、E142D、K143D、R144D、L288D、R290D、G291D、A292D、Q313D、S314D、R315D、K316D、V317D、L390D、M391D、R392D、S393D、P395D、R396D、P397D、G398D、V399D、L401D、R402D、A403D、P404D、I30E、K32E、A34E、T37E、K38E、W41E、Y44E、S45E、D46C、L141E、E142E、K143E、R144E、L288E、R290E、G291E、A292E、Q313E、S314E、R315E、K316E、V317E、L390E、M391E、R392E、S393E、P395E、R396E、P397E、G398E、V399E、L401E、R402E、A403E、P404E、K18R、K32R、K38R、K62R、K85R、K109R、K137R、K143R、K148R、K157R、K161R、K197R、K199R、K316R、K337R、K341R、K389R、K18Q、K32Q、K38Q、K62Q、K85Q、K109Q、K137Q、K143Q、K148Q、K157Q、K161Q、K197Q、K199Q、K316Q、K337Q、K341Q、K389Q、K18N、K32N、K38N、K62N、K85N、K109N、K137N、K143N、K148N、K157N、K161N、K197N、K199N、K316N、K337N、K341N、K389N、K18H、K32H、K38H、K62H、K85H、K109H、K137H、K143H、K148H、K157H、K161H、K197H、K199H、K316H、K337H、K341H及びK389Hが挙げられる。
非改変FVIIポリペプチドの1つ又は複数の性質又は活性に影響を及ぼすように設計された2つ以上の改変を有する改変FVIIポリペプチドが本明細書で提供される。いくつかの例では、2つ以上の改変が、FVIIポリペプチドの2つ以上の性質又は活性を変化させる。TFPIに対する抵抗性、AT−IIIに対する抵抗性、固有活性、アミド分解活性、触媒活性(TFの存在下又は不在下)、リン脂質結合及び/又は親和性、グリコシル化、プロテアーゼに対する抵抗性、半減期、並びに、FX及びFIXなどの他の因子又は分子との相互作用及び/又はそれらの活性化のうちの1つ又は複数が変化しているように、FVIIポリペプチドに改変を行うことができる。典型的には、結果として生じる改変FVIIポリペプチドが、非改変FVIIポリペプチドと比較して、凝固活性が増大し、凝固活性の持続時間が増大し、及び/又は治療指数が増強しているように、2つ以上の改変が組み合わされる。改変FVIIaポリペプチドは、in vitro、ex vivo、又はin vivoのいずれかで、凝固活性のより速い開始を示してもよい。改変は、アミノ酸置換、挿入、又は欠失を含むことができる。2つ以上の改変を含有する改変FVIIポリペプチドの凝固活性の増大、凝固活性の持続時間の増大、凝固活性の開始の増進、及び/又は治療指数の増強は、出発又は非改変FVIIaポリペプチドの活性と比較して、少なくとも又は約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、300%、400%、500%、又はそれ以上、増大することができる。
本明細書において、改変FVIIポリペプチドが提供される。FVIIポリペプチドは、非改変FVIIポリペプチドと比較して1つ又は複数の活性又は特性において変化を示し得るように改変される。改変の結果、変化し得る活性及び特性には、それだけに限らないが、凝固若しくは凝固活性、凝固促進活性、第X因子(FX)の活性化若しくは第IX因子(FIX)の活性化をもたらす活性などのタンパク質分解活性若しくは触媒活性、ポリペプチドに結合する能力若しくは抗FVII抗体への結合についてポリペプチドと競合する能力により評価されるような抗原性、組織因子、第X因子若しくは第IX因子に結合する能力、リン脂質に結合する能力、半減期、三次元構造、pI、及び/又は高次構造が含まれる。本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドの中には、凝固活性が増大したものが存在する。これらの中には、凝固活性の増大が、TFPIに対する改変FVIIの抵抗性の増大、AT−IIIに対する抵抗性の増大、半減期の増大などの薬物動態特性の向上、触媒活性の増大、及び/又は活性化血小板への結合の増大の結果であるもの、或いは凝固活性の増大がこれらを伴うものが存在する。そのような改変FVIIポリペプチドを同定する例示的な方法及び改変ポリペプチドが、本明細書で提供される。例えば、TFPIに対する抵抗性の増大、AT−IIIに対する抵抗性の増大、及び/又は活性化血小板への結合の増大を示す改変FVIIポリペプチドは、(a)そのような特性に関与すると考えられる部位を論理的に標的化すること、或いは(b)TFPIに対する抵抗性、AT−IIIに対する抵抗性、半減期の増大などの薬物動態特性の向上、及び/又はリン脂質若しくは活性化血小板への結合の増大について、改変FVIIポリペプチドを機能アッセイにおいて実証的に試験することによって、論理的に又は実証的に生成することができる。多くの場合では、改変FVIIポリペプチドを生成するために、論理的及び実証的な設計アプローチの組合せを用いることができる。
いくつかの例では、本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドは、凝固活性が増大するように論理的な改変によって設計される。そのような方法において、FVIIポリペプチドの活性に関与するドメイン、領域、又はアミノ酸は知られているか、又は論理的に決定することができる。例えば、公共の様々なデータベースは、野生型FVIIに関する配列及びドメインの情報を提供している(例えば、ExPASy Proteomics server ca.expasy.orgを参照されたい)。特定の相互作用又は活性に関与する、FVIIポリペプチドにおけるアミノ酸、領域、及び/又はドメインを決定するために、公共の他の情報にアクセスすることができる。そのような情報源には、例えば、科学雑誌、配列及び機能のデータベース、又は特許データベースが含まれる。いくつかの場合では、直接的な証拠を用いて、所与の相互作用又は活性に対する1つ又は複数のアミノ酸の影響を決定することができる。他の例では、これは、例えば、類似の活性及び/又は相互作用を示す関連タンパク質に関する証拠又は情報から、間接的に推定することができる。そのような実施例では、関連タンパク質における活性又は相互作用に関与するアミノ酸を用いて、関連ポリペプチドとFVIIポリペプチドとを配列及び/又は構造の類似性に基づいて整列させることによって、どれが対応するアミノ酸であるかをFVIIポリペプチドにおいて決定することができる。このようにして、所与の活性又は相互作用に関与すると考えられるFVIIポリペプチドにおけるアミノ酸を決定することができる。さらに、ホモロジーモデリングを用いて、タンパク質/タンパク質相互作用の形成及び/又は安定化において重要な役割を有する残基を予想することができ、そして、この情報を用いて、特性が向上した変異体を設計することができる。
改変FVIIポリペプチドはまた、実証的に生成し、次に、試験又はスクリーニングを行って、目的の特定の活性又は特性を有するものを同定することができる。例えば、改変FVIIポリペプチドは、当技術分野において一般に知られている任意の方法を用いて、FVIIポリペプチドの任意の1つ又は複数のアミノ酸残基を突然変異させることによって生成することができる(米国特許出願公開第2004/0146938号明細書も参照されたい)。そのような改変FVIIポリペプチドを、凝固の機能アッセイにおいて試験して、それらが凝固活性の増大についての「ヒット」であるかを決定することができる。ヒットは、それらがTFPI又はAT−IIIなどの阻害剤に対する抵抗性の増大を示すかどうか、及び/又はそれらがリン脂質への結合の増大若しくは半減期の増大などの薬物動態特性の向上を示すかどうかを決定するために、本明細書に記載されるか又は当業者に知られている任意のアッセイを用いて、さらに試験することができる。
突然変異誘発に基づくタンパク質の指向的な変化のための、任意の様々な通常のアプローチを用いることができる。所望の特性を得るために、これらのいずれかを、単独で又は組み合わせて、FVIIなどのポリペプチドの改変に用いることができる。そのような方法にはランダム突然変異誘発が含まれ、これは、開始タンパク質の配列におけるアミノ酸が、同一の分子上の異なるアミノ酸位置で同時に、単一又は複数の交換で20個の天然アミノ酸のすべて(又は群)(及び非天然アミノ酸)によって交換されるものである。別の方法である制限ランダム突然変異誘発では、20個の天然アミノ酸(及び非天然アミノ酸)のすべて若しくは一部又はDNA偏向残基が導入される。偏向は、DNAの配列に基づくものであり、「変化」している生物学的活性に関与することが予め知られているタンパク質の、それぞれ制限された領域又は所定の領域における確率的な又は半確率的なタンパク質の配列に基づくものではない。プロテアーゼを改変するための例示的な方法は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許仮出願第10677977号明細書に記載されている。さらに、当技術分野で知られている任意の方法を、FVIIプロテアーゼのポリペプチドなどのプロテアーゼのポリペプチド配列を改変又は変化させるために用いることができる。
集中的な突然変異は、遺伝子配列の所定の領域、例えば、触媒活性に介在するプロテアーゼドメインの領域、リン脂質に結合するGlaドメインの領域、本明細書で提供されるような、TFPI、AT−III、若しくはZn2+などの阻害剤若しくは分子を結合するFVIIポリペプチドの領域、又は、本明細書で提供されるような、FVIIaのクリアランスに関与する因子又は受容体と相互作用するタンパク質の領域において、1つ又は複数の突然変異を生じさせることにより行うことができる。一例では、ポリペプチドの任意の1つ又は複数のアミノ酸を、例えばQuikChange(Stratagene)などの、任意の標準的な単一の又は複数の部位特異的突然変異誘発キットを用いて突然変異させる。別の例では、プロテアーゼの任意の1つ又は複数のアミノ酸を、飽和突然変異誘発により突然変異させる(Zhengら(2004)Nucl.Acids.Res.、32:115)。例示的な一実施形態では、領域又はドメインの残基(複数可)を20個の可能な天然アミノ酸(及び非天然アミノ酸)のそれぞれに突然変異させる飽和突然変異誘発技術が用いられる(例えば、Kunkle method,Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons,Inc.、Media Pa.を参照されたい)。そのような技術において、選択されたアミノ酸(複数可)をコードする所望のコドン(複数可)でのヌクレオチドのランダム化を含有する縮重突然変異誘発オリゴヌクレオチドプライマーを合成することができる。例示的なランダム化方法には、Nが任意のヌクレオチドを示し、Sがグアニン又はシトシンを示し、Kがグアニン又はチミンを示す、NNSランダム化又はNNKランダム化が含まれる。縮重突然変異誘発プライマーを一本鎖DNA鋳型にアニーリングし、DNAポリメラーゼを加えて、鋳型の相補鎖を合成する。ライゲーションの後、二本鎖DNA鋳型を、増幅のために、大腸菌内に形質転換する。
改変ポリペプチドは、スクリーニングアッセイにおいて個々に試験することができるか、又はライブラリーなどにおけるコレクションとして試験することができる。一例では、FVII変異体のポリペプチドは突然変異誘発によってランダムに生成し、個々にクローニングされる。次に、タンパク質の発現及び適当な活性の測定に従って、個々の各タンパク質突然変異体分子に対して活性の評価を個々に行う。いくつかの例では、個々のクローンが互いに物理的に分離され、個々の各ポリペプチドがアレイにおけるその位置に基づいて分かるように、アドレス可能なアレイにおいて個々のクローンをアッセイすることができる。例えば、それぞれの1つが、独立した突然変異誘発反応の単一の生成物である場合、特定の突然変異を、配列決定する必要なく容易に決定することができる。或いは、得られた改変ポリペプチドを配列決定し、活性をもたらす突然変異を決定することができる。
任意の1つ又は複数の上記のアプローチによって設計及び同定されたFVIIポリペプチド変異体を、所望の特性又は活性を示す候補FVIIポリペプチドを同定するために選択することができる。変異FVIIポリペプチドの選択は、1)まず、改変する特定の活性又は特性(即ち、TFPIに対する抵抗性、AT−IIIに対する抵抗性、Zn2+結合、触媒活性、半減期、リン脂質に対する結合及び/又は親和性)について変異ポリペプチドを試験し、2)第2に、止血及び凝固に必要なFVII活性の保持について変異ポリペプチドを試験することに基づく。凝固に必要なFVII活性には、例えば、第X因子(FX)の活性化又は第IX因子(FIX)の活性化をもたらすためなどの、酵素活性、タンパク質分解活性、又は触媒活性が含まれる。評価し得る他のFVII活性には、それだけに限らないが、抗原性、組織因子、第X因子又は第IX因子を結合する能力、及びリン脂質に結合する能力が含まれる。したがって、本明細書で提供されるか、又は本明細書で提供される方法において同定される任意のもののような、改変FVIIポリペプチドは、増大又は低下したある程度のレベルの、凝固活性に必要なFVII活性を保持していなくてはならない。上記の2つの評価のそれぞれを行うために、当技術分野において知られているか又は本明細書において以下に記載される標準的なアッセイをin vitro又はin vivoで行うことができる。例えば、FVIIのタンパク質分解活性又は触媒活性を、合成基質の切断の測定又は第X因子の活性化の測定を含めた様々な方法を用いて評価することができ(例えば、以下の実施例4、5、及び11を参照されたい)、TFPI又はAT−IIIに対する抵抗性を、それぞれTFPI又はAT−IIIによる阻害についてアッセイすることにより評価することができる(例えば、実施例7、12、及び16を参照されたい)。さらに、例えば実施例8及び14に記載されているような、凝固促進活性についてのin vivoでのアッセイも用いることができる。
改変FVIIポリペプチドを含めたFVIIポリペプチド、又はFVII若しくは他のビタミンKポリペプチドにおけるそのドメインは、タンパク質精製及び組換えタンパク質発現のための、当技術分野で周知の方法によって得ることができる。所望の遺伝子をコードする核酸を同定するための、当業者に知られている任意の方法を用いることができる。当技術分野で利用可能な任意の方法を用いて、例えば肝臓などの細胞源又は組織源などから、FVIIポリペプチド又は他のビタミンKポリペプチドをコードする完全長の(即ち、全コード領域を含む)cDNA又はゲノムDNAのクローンを得ることができる。改変FVIIポリペプチドは、部位特異的突然変異誘発などによって、本明細書に記載されるように操作することができる。
1つ又は複数のFVIIタンパク質の組換え発現のために、FVIIタンパク質をコードするヌクレオチド配列のすべて又は一部を含有する核酸を、適切な発現ベクター、即ち、挿入されたタンパク質コード配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含有するベクター内に挿入することができる。例示的なそのようなベクターは、例えばpCMVなどの、任意の哺乳動物発現ベクターである。FVII遺伝子の天然プロモーター及び/又はそれらのフランキング領域により、必要な転写シグナル及び翻訳シグナルも供給され得る。
FVIIポリペプチド(改変型及び非改変型)は、例えば、宿主細胞、宿主動物へのFVIIをコードする核酸分子の導入、及びFVIIをコードする核酸分子からのin vitroでの発現などの、in vitro及びin vivoでの方法を含むタンパク質の生成のための、当技術分野において知られている任意の方法によって生成することができる。FVIIポリペプチド及び改変FVIIポリペプチドは、投与及び治療に必要な所望の量及び形態のFVIIポリペプチドの生成に適している、任意の生物において発現させることができる。発現宿主には、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株を含む哺乳動物細胞、及びトランスジェニック動物などの、原核生物及び真核生物が含まれる。発現宿主は、タンパク質生成レベル、及び発現したタンパク質上に存在する翻訳後修飾のタイプにおいて異なり得る。発現宿主の選択は、これらの要素と、制御上及び安全上の検討事項、生成コスト、並びに精製の必要性及び方法などの他の要素とに基づいて行うことができる。
原核生物、とりわけ大腸菌は、大量のFVIIを生成するための系を提供するものである(例えば、Platisら(2003)Protein Exp.Purif.31(2):222〜30、及びKhalizzadehら(2004)J.Ind.Microbiol.Biotechnol.31(2):63〜69を参照されたい)。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の単純で迅速な技術である。大腸菌のための発現ベクターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するため及び宿主細胞に対するいくらかの毒性を示すタンパク質を発現させるために有用な誘導性プロモーターを含有し得る。誘導性プロモーターの例には、lacプロモーター、trpプロモーター、ハイブリッドtacプロモーター、T7及びSP6 RNAプロモーター、並びに温度制御されたλPLプロモーターが含まれる。
Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Kluyveromyces lactis、及びPichia pastorisなどの酵母は、FVIIの有用な発現宿主である(例えば、Skokoら(2003)Biotechnol.Appl.Biochem.38(Pt3):257〜65を参照されたい)。酵母は、エピソーム複製ベクターを用いて、又は相同組換えによる安定な染色体組み込みによって、形質転換することができる。典型的には、誘導性プロモーターを用いて遺伝子発現を制御する。そのようなプロモーターの例には、GAL1、GAL7、及びGAL5、並びにCUP1などのメタロチオネインプロモーターが含まれる。発現ベクターには、形質転換DNAの選択及び維持のために、LEU2、TRP1、HIS3、及びURA3などの選択可能なマーカーが含まれることが多い。酵母内で発現したタンパク質は可溶性であることが多く、Bipなどのシャペロニン及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの共発現により、発現レベル及び溶解度が向上し得る。さらに、酵母内で発現したタンパク質は、Saccharomyces cerevisiaeから得た酵母接合型α因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合体、及び、Aga2p接合接着受容体又はArxula adeninivoransのグルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合体を用いて、分泌に指向され得る。ポリペプチドが分泌経路を出るようにポリペプチドから融合配列を除去するために、プロテアーゼ切断部位(例えば、Kex−2プロテアーゼ)を操作することができる。酵母はまた、Asn−X−Ser/Thrモチーフでのグリコシル化も可能である。
とりわけバキュロウイルス発現系を用いた、昆虫及び昆虫細胞は、FVII又はその改変形態などのポリペプチドの発現に有用である(例えば、Munetaら(2003)J.Vet.Med.Sci.65(2):219〜23を参照されたい)。血リンパにおける発現を含む昆虫細胞及び昆虫の幼虫は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物により用いられる翻訳後修飾のほとんどが可能である。バキュロウイルスは、安全性を向上させ真核性発現の制御上の懸念を低減させる、制限的な宿主範囲を有する。典型的には、発現ベクターは、高レベルの発現のために、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを用いる。一般に用いられるバキュロウイルス系には、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)、及びカイコガ核多角体病ウイルス(BmNPV)、並びに、ヨウトガ、Pseudaletia unipuncta(A7S)、及びオオカバマダラ(DpN1)に由来するSf9などの昆虫細胞系などのバキュロウイルスが含まれる。高レベルの発現のためには、発現させようとする分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリンの開始コドンの下流に直接に融合する。哺乳動物の分泌シグナルは昆虫細胞内で正確にプロセシングされ、培地内への発現したタンパク質の分泌に用いることができる。さらに、細胞株Pseudaletia unipuncta(A7S)及びオオカバマダラ(DpN1)は、哺乳動物細胞系に類似したグリコシル化パターンを有するタンパク質を生成する。
哺乳動物発現系をFVIIポリペプチドの発現に用いることができる。アデノウイルスなどのウイルス感染によって、又はリポソーム、リン酸カルシウム、DEAE−デキストランなどの直接的なDNAの導入によって、並びにエレクトロポレーション及びマイクロインジェクションなどの物理的手段によって、発現構築物を哺乳動物細胞に移すことができる。哺乳動物細胞のための発現ベクターには、典型的には、mRNAのキャップ部位、TATAボックス、翻訳開始配列(Kozakコンセンサス配列)、及びポリアデニル化エレメントが含まれる。このようなベクターには、例えばSV40プロモーター−エンハンサーなどの高レベルな発現のための転写プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス(RSV)の長い末端反復が含まれることが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは多くの細胞型において活性である。組織型及び細胞型のプロモーター及びエンハンサーの領域も発現に用いることができる。例示的なプロモーター/エンハンサー領域には、それだけに限らないが、エラスターゼI、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳腺腫瘍ウイルス、アルブミン、α−フェトプロテイン、α1−抗トリプシン、β−グロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖−2、及び性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節などの遺伝子から得られたものが含まれる。選択可能なマーカーを用いて、発現構築物を有する細胞を選択及び維持することができる。選択可能なマーカーの遺伝子の例には、それだけに限らないが、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、及びチミジンキナーゼが含まれる。TCR−ζ及びFcεRI−γなどの細胞表面シグナル伝達分子との融合は、細胞表面上での活性な状態でのタンパク質の発現を導き得る。
トランスジェニック植物細胞及びトランスジェニック植物を、FVIIの発現に用いることができる。発現構築物は、典型的には、微粒子銃及びプロトプラストへのPEG媒介性導入などの直接的なDNA導入を用いて、並びにアグロバクテリウム媒介性形質転換を用いて、植物に移される。発現ベクターは、プロモーター配列及びエンハンサー配列、転写終結エレメント、並びに翻訳調節エレメントを含み得る。発現ベクター及び形質転換技術は、通常、アラビドプシス及びタバコなどの双子葉植物宿主と、トウモロコシ及びコメなどの単子葉植物宿主との間で分けられる。発現に用いられる植物プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、リボースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーター、並びにユビキチン及びUBQ3プロモーターが含まれる。ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼ、及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択可能なマーカーが、形質転換細胞の選択及び維持を容易にするために用いられることが多い。形質転換された植物細胞は、細胞、凝集体(カルス組織)として培養において維持するか、又は、植物全体に再生することができる。植物は哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するため、これはこれらの宿主においてFVIIを生成するという選択に影響を及ぼし得る。トランスジェニック植物細胞にはまた、タンパク質を生成するように操作された藻類も含まれ得る(例えば、Mayfieldら(2003)PNAS 100:438〜442を参照されたい)。植物は哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するため、これはこれらの宿主においてFVIIを生成するという選択に影響を及ぼし得る。
宿主細胞からFVIIポリペプチドを精製するための方法は、選択された宿主細胞及び発現系に依存する。分泌された分子では、タンパク質は通常、細胞を除去した後に培地から精製される。細胞内発現では、細胞を溶解し、タンパク質を抽出物から精製することができる。トランスジェニック植物及びトランスジェニック動物などのトランスジェニック生物を発現に用いる場合、組織又は器官を、溶解細胞抽出物を得るための開始材料として用いることができる。さらに、トランスジェニック動物の生成には、回収し得る乳又は卵におけるポリペプチドの生成が含まれ得、必要であればさらに、当技術分野において標準的な方法を用いて、タンパク質を抽出し、さらに精製することができる。
改変FVIIポリペプチド及び1つ又は複数の他のポリペプチドを含有する融合タンパク質も提供される。適切な経路によって投与するために製剤された、そのような融合タンパク質を含有する医薬組成物が提供される。融合タンパク質は、改変FVIIポリペプチドと、抗体又はその断片、成長因子、受容体、リガンド、及び他のそのような作用物質などの作用物質とを任意の順序で連結することにより形成され、この作用物質は、FVIIポリペプチドの精製を容易にすること、例えば標的細胞若しくは標的組織へのポリペプチドの指向などの指向によりFVIIポリペプチドの薬力学的特性を変化させること、並びに/又はFVIIポリペプチドの発現若しくは分泌を増大させることを目的としたものである。典型的には、任意のFVII融合タンパク質は、非融合ポリペプチドと比較して96%、97%、98%、99%、又はそれ以上の凝固活性を含む、非融合FVIIポリペプチドと比較して少なくとも約30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、又は95%の凝固活性を保持する。
改変FVIIポリペプチドは、裸のポリペプチド鎖又は複合体として調製することができる。いくつかの適用では、改変FVIIを、翻訳後修飾又は他の化学的修飾を行わずに「裸の」形態で調製することが望ましい場合がある。裸のポリペプチド鎖は、FVIIの翻訳後修飾を行わない適切な宿主において調製することができる。そのようなポリペプチドはまた、in vitro系において、及び化学的ポリペプチド合成を用いて調製することができる。他の適用では、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、カルボキシル化、ヒロドキシル化、リン酸化、又は他の既知の修飾を含めた、特定の修飾が望ましい場合がある。修飾は、in vitroで実施することができるか、又は、例えば、このような修飾をもたらす適切な宿主において改変FVIIを生成することにより実施することができる。
本明細書において、FVIIポリペプチド又は改変FVIIポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。核酸分子には、任意のコードされたFVIIポリペプチドの対立遺伝子変異体又はスプライス変異体が含まれる。本明細書で提供される例示的な核酸分子は、配列番号18〜43、125〜150、又は206〜250のいずれかに示すポリペプチドをコードする任意の分子などの、本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドをコードする任意の分子である。一実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、少なくとも50、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、若しくは99%の配列同一性を有するか、又は、本明細書で提供されるFVIIポリペプチドをコードする任意の核酸の全長の少なくとも70%と、中ストリンジェンシー若しくは高ストリンジェンシーの条件下においてハイブリダイズする。別の実施形態では、核酸分子には、本明細書で提供される任意のFVIIポリペプチドをコードする縮重コドン配列を有するものが含まれ得る。
FVIIポリペプチドの活性及び特性をin vitro及び/又はin vivoで評価することができる。そのような評価のためのアッセイは当業者に知られており、試験した活性及び結果を治療活性及びin vivoでの活性に関連付けるために知られているものである。一例では、非改変FVII及び/又は野生型FVIIと比較して、FVII変異体を評価することができる。別の例では、改変FVIIポリペプチドの活性を、in vitro又はin vivoでTFPI又はAT−IIIに曝露した後に評価し、TFPI又はAT−IIIに曝露していない改変FVIIポリペプチドの活性と比較することができる。in vitroでのアッセイには、例えば、凝固アッセイ、結合アッセイ、タンパク質アッセイ、及び分子生物学的アッセイを含む、細胞に基づいたアッセイなどの、当業者に知られている任意の実験用アッセイが含まれる。in vivoでのアッセイには、動物モデルにおけるFVIIアッセイ、及びヒトへの投与が含まれる。いくつかの場合では、in vivoでのFVIIの活性を、血液、血清、又はアッセイの決定要因のための他の体液を評価することにより決定することができる。FVII変異体はまた、治療効果などの活性又は特性を評価するためにin vivoで試験することができる。
例示的なin vitroでのアッセイには、ポリペプチドの改変及び活性を評価するためのアッセイが含まれる。改変は、当技術分野において知られている、γ−カルボキシル化及び他の翻訳後修飾を評価するin vitroでのアッセイ、タンパク質アッセイ、並びに高次構造アッセイを用いて評価することができる。活性のアッセイには、それだけに限らないが、TF、第X因子、及び第IX因子などの他の凝固因子とのFVIIの相互作用の測定、FVIIポリペプチドのタンパク質分解活性を決定するためのタンパク質分解アッセイ、ホスファチジルセリン及び他のリン脂質に対するFVIIポリペプチドの結合及び/又は親和性を決定するためのアッセイ、並びに凝固に対するFVIIポリペプチドの効果を決定するための細胞に基づいたアッセイが含まれる。
FVIIポリペプチドはまた、翻訳後修飾の存在について評価することができる。そのようなアッセイは当技術分野において知られており、グリコシル化、ヒドロキシル化、及びカルボキシル化を測定するためのアッセイが含まれる。グリコシル化についての例示的なアッセイにおいて、例えば、ヒドラジン分解又はエンドグリコシダーゼ処理にさらされたFVIIポリペプチドのSDS page分析を用いて、炭水化物の分析を行うことができる。ヒドラジン分解では、無水ヒドラジンとのインキュベーションによって糖タンパク質からN結合型グリカン及びO結合型グリカンが放出され、一方、エンドグリコシダーゼの放出には、糖タンパク質からほとんどのN−グリカンを放出させるPNGase Fが関与する。FVIIポリペプチドのヒドラジン分解又はエンドグリコシダーゼ処理では、フルオロフォア標識又はクロモフォア標識をタグ付けし得る還元末端が生じる。標識されたFVIIポリペプチドは、フルオロフォアを用いた炭水化物電気泳動(FACE)によって分析することができる。HPLCによる、複雑なグリコシル化パターンの単糖分析、プロファイリング、又はフィンガープリンティングのために、グリカンに対する蛍光タグも用いることができる。例示的なHPLC法には、親水性相互作用クロマトグラフィー、電子的相互作用、イオン交換、疎水性相互作用、及びサイズ排除クロマトグラフィーが含まれる。例示的なグリカンプローブには、それだけに限らないが、3−(アセチルアミノ)−6−アミノアクリジン(AA−Ac)及び2−アミノ安息香酸(2−AA)が含まれる。炭水化物部分も、グリコシル化したFVIIポリペプチドを認識する特異的抗体を用いて検出することができる。β−ヒドロキシル化を測定するための例示的なアッセイは、アルカリ加水分解を行ったFVIIポリペプチドの逆相HPLC分析を含有する(Przysieckiら(1987)PNAS 84:7856〜7860)。FVIIポリペプチドのカルボキシル化及びγ−カルボキシル化は、技術文献に記載されているように、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI−TOF)分析での質量分析を用いて評価することができる(例えば、Harveyら、J Biol Chem 278:8363〜8369;Maumら、Prot Sci 14:1171〜1180を参照されたい)。翻訳後のγ−カルボン酸塩の修飾に関与するカルボキシラーゼとの、プロペプチドを含有するFVIIポリペプチド(pro−FVII)の相互作用も評価することができる。カルボキシラーゼを、フルオレセイン標識したプロFVIIポリペプチドとインキュベートした後の解離定数(Kd)を、結合したカルボキシラーゼの量を異方性によって決定することにより、測定することができる(Linら(2004)J Biol Chem 279:6560〜6566)。
改変FVIIポリペプチドをタンパク質分解活性について試験することができる。FVIIのタンパク質分解活性は、Chromozym t−PA(MeSO2−D−Phe−Gly−Arg−pNA)、S−2288(H−D−Ile−Pro−Arg−pNA)、S−2266(H−D−Val−Leu−Arg−pNA)、S−2765(Z−D−Arg−Gly−Arg−pNA)、Spectrozyme FXa及びSpectrozyme FVIIa(CH3SO2−D−CHA−But−Arg−pNA)などの発色基質を用いて測定することができる。FVIIポリペプチドを単独で、又はTFの存在下で、様々な濃度の発色基質とインキュベートする。基質の切断は吸光度によりモニターすることができ、基質の加水分解の速度は、容易に入手可能なソフトウェアを用いた線形回帰によって決定する。
FVIIポリペプチドは、当技術分野において周知のアッセイを用いることにより、凝固活性について試験することができる。例えば、アッセイのいくつかには、それだけに限らないが、2段階の凝固アッセイ(Leibmanら(1985)PNAS 82:3879〜3883)、プロトロンビン時間アッセイ(PT、外因性経路におけるFVIIaのTF依存性活性を測定し得る)、PT試験の改変型であるアッセイ、活性化部分トロンボプラスチン時間(aPTT、FVIIaのTF非依存性活性を測定し得る)、活性化凝固時間(ACT)、再石灰化活性化凝固時間、Lee−White凝固時間、又はトロンボエラストグラフィー(TEG)(Pusateriら(2005)Critical Care 9:S15〜S24)が含まれる。例えば、改変FVIIポリペプチドの凝固活性は、FVIIをFVII欠乏性血漿に希釈し、Dade Behringからイノビン(Innovin)(商標)として入手可能なものなどのプロトロンビン時間試薬(リン脂質とカルシウムとを有する組換えTF)と混合する、PTに基づいたアッセイによって決定することができる。凝固物の形成を任意選択で検出し、凝固までの時間を決定して、FVII欠乏性血漿単独と比較する。
阻害アッセイを用いて、例えばTFPI及びAT−IIIなどのFVII阻害剤又はZn2+などの分子に対する改変FVIIポリペプチドの抵抗性を測定することができる。他の阻害剤に対する阻害の評価も試験することができ、それだけに限らないが、他のセリンプロテアーゼ阻害剤及びFVII特異的抗体が含まれる。阻害は、例えばTFPI、AT−III、又はZn2+と、TFとプレインキュベートしたFVIIポリペプチドとをインキュベートすることにより評価することができる。次に、FVIIの活性を、上述した任意の1つ又は複数の活性アッセイ又は凝固アッセイを用いて測定することができ、TFPI、AT−III、又はZn2+による阻害を、阻害剤とインキュベートしたFVIIポリペプチドの活性と、阻害剤とインキュベートしていないFVIIポリペプチドの活性とを比較することにより評価することができる。
ホスホチジルセリン(PS)及び他のリン脂質に対する改変FVIIポリペプチドの結合及び/又は親和性を、当技術分野において周知のアッセイを用いて決定することができる。有機溶媒中の純度の高いリン脂質(例えば、Sigmaなどから市販されている、既知の濃度のウシPS及び卵ホスファチジルコリン(PC))を用いて、小さな単層リン脂質ベシクルを調製することができる。これらのPS/PCベシクルに結合しているFVIIポリペプチドを、入射光に対して90度での相対的な光散乱によって決定することができる。PC/PS単独での及びPC/PS/FVIIでの光散乱の強さを測定して、解離定数を決定する(Harveyら、J Biol Chem 278:8363〜8369)。ビアコアバイオセンサー装置などでの表面プラズマ共鳴も、リン脂質膜に対するFVIIポリペプチドの親和性を測定するために用いることができる(Sunら、Blood 101:2277〜2284)。
ヒト以外の動物モデルを用いて、改変FVIIポリペプチドの活性、有効性、及び安全性を評価することができる。例えば、ヒト以外の動物を、疾患又は状態のモデルとして用いることができる。ヒト以外の動物に、配列番号18〜43、125〜150、又は206〜250のいずれかに示す任意のFVII変異体などのFVII変異体を投与する前に、疾患誘発性及び/又は表現型導性の物質を注射して、疾患の進行に対する効果をモニターすることができる。遺伝モデルも有用である。1つ又は複数の遺伝子の過剰発現、過小発現、又はノックアウトにより疾患又は状態を模倣する、マウスなどの動物、例えば血友病Aを示す第VIII因子ノックアウトマウスなどを生成することができる(Biら(1995)Nat Gen 10:119〜121)。そのような動物は、当技術分野において周知のトランスジェニック動物生成技術により、又は天然に存在するか若しくは誘導された突然変異系を用いて生成することができる。FVIIに関与する疾患の有用なヒト以外の動物モデルの例には、それだけに限らないが、出血性障害、とりわけ血友病又は血栓症のモデルが含まれる。FVIIポリペプチドの凝固活性などの活性を評価するために、損傷についてのヒト以外の動物モデルも用いることができる。これらのヒト以外の動物モデルを用いて、FVII変異体の活性を野生型FVIIポリペプチドと比較してモニターすることができる。
多くのアッセイが、臨床的使用のためのFVIIの活性の評価に利用可能である。そのようなアッセイには、in vivoでの凝固、タンパク質安定性、及び半減期の評価、並びに表現型アッセイが含まれ得る。表現型アッセイ及びFVII治療の治療効果を評価するためのアッセイには、FVIIの血中レベルの評価(例えば、ボディーマスインデックス(BMI)について補正した、投与前の、並びに、最初の投与の後、最後の投与の直後、及び最中の各時点を含む、投与後の各時点での、血清FVIIの測定)、FVIIでの治療後の、上述の方法を用いたin vitroでの血液凝固の評価(例えばPTアッセイ)、並びに、非改変FVII及び/若しくは野生型FVII又はプラセボで治療した対象と比較した、経時的な症状の改善を含む、FVII治療に対する表現型の応答が含まれる。FVIIポリペプチドで治療した患者は、血液の損失、輸血の必要性、及びヘモグロビンについてモニターすることができる。患者は、通常の投与若しくは反復投与のための期間にわたり定期的にモニターすることができるか、又は、出血、外傷、若しくは外科的処置などの急性事象に応じた投与の後にモニターすることができる。
出血性障害の治療に用いるための組成物が本明細書で提供される。そのような組成物は、治療上有効な量の、本明細書に記載される第VII因子ポリペプチドを含有する。有効な濃度のFVIIポリペプチド又はその薬学的に許容される誘導体を、全身投与、局所投与、又は局部投与のために、適切な薬学的担体又は媒体と混合する。化合物は、選択された障害を治療するために有効な量で含まれる。組成物における活性化合物の濃度は、吸光度、不活性化、活性化合物の排出速度、投与スケジュール、及び投与量、並びに当業者に知られている他の要素に依存する。
改変FVIIを含有する医薬組成物は、選択された量のポリペプチドと1つ又は複数の生理学的に許容される担体又は賦形剤とを混合することによる、任意の従来の方法で製剤することができる。担体又は賦形剤の選択は、投与の専門の技術の範囲内であり、パラメータの数に依存し得る。これらには、例えば、投与の様式(即ち、全身、経口、経鼻、経肺、局部、局所、又は任意の他の様式)及び治療する障害が含まれる。本明細書で提供される医薬組成物は、単一用量(直接的な)投与のため、又は希釈若しくは他の改変のために製剤することができる。製剤における化合物の濃度は、投与の際の、目的の治療に有効な量の送達に有効なものである。典型的には、組成物は単一用量投与のために製剤される。組成物を製剤するために、化合物の重量分率又はその混合物を、選択された媒体内に、治療する状態が軽減若しくは改善するような有効な濃度で溶解し、懸濁し、分散し、又はその他の形で混合する。
投与される治療物質の正確な量又は用量は、特定のFVIIポリペプチド、投与経路、並びに、疾患の重篤度や対象の体重及び全身状態などの他の検討事項に依存する。治療物質の局部投与は、典型的には、全身投与の任意の態様よりも必要な用量は少ないが、局部投与の後の治療物質の局部の濃度は、いくつかの場合では、全身投与で安全に得られるものよりも高くなり得る。必要であれば、特定の用量及び時間及び治療プロトコルは、実証的に決定又は推定することができる。例えば、組換えFVIIポリペプチド及び天然FVIIポリペプチドの例示的な用量を、適切な用量を決定するための開始点として用いることができる。例えば、rFVIIaであるノボセブン(Novoseven)(登録商標)に活性化された組換えFVII(rFVIIa)ポリペプチドを、出血症状を有している、血友病A又は血友病Bを有する患者に、2〜5分にわたるボーラス注入によって90μg/kgの用量で投与して、少なくとも2μg/mlの有効な循環レベルを達成している。投与は、止血が得られるまで2時間毎に繰り返す。本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドは、そのような組換えFVIIと比較して、少ない投与量及び/又は頻度で有効であり得る。例えば、本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドは、80μg/kg、70μg/kg、60μg/kg、50μg/kg、40μg/kg、30μg/kg、20μg/kg、15μg/kg、又はそれ未満の用量で投与することができる。いくつかの実施形態では、用量は、100μg/kg、110μg/kg、120μg/kg、又はそれ以上のように、より高くてもよい。治療期間及び注射間隔は、出血の重篤度及び治療に対する患者の応答で変化し、適宜調節することができる。非改変FVIIと比較した、改変FVIIの活性レベル及び半減期などの要素を、用量を決定する際に考慮することができる。特定の用量及びレジメンは実証的に決定することができる。
薬学的な治療活性を有する化合物及びその誘導体は、典型的には、単位投与形態又は複数投与形態で製剤及び投与される。製剤は、それだけに限らないが、錠剤、カプセル、ピル、粉末、粒子、無菌の非経口溶液又は懸濁液、経口溶液又は懸濁液、及び、適切な量の化合物又はその薬学的に許容される誘導体を含有する油水乳濁液を含む投与形態でヒト及び動物に投与するために提供され得る。それぞれの単位用量は、所望の治療効果を得るために十分な所定の量の治療上活性な化合物を、所望の薬学的担体、媒体、又は希釈剤と組み合わせて含有する。単位投与形態の例には、アンプル及びシリンジ及び個々に包装された錠剤又はカプセルが含まれる。いくつかの例では、単位用量は、投与の前に戻される凍結乾燥粉末として提供される。例えば、FVIIポリペプチドは、注射のための単一用量溶液を得るために適切な溶液で再構成される凍結乾燥粉末として提供され得る。いくつかの実施形態では、凍結乾燥粉末は、FVIIポリペプチド、及び塩などのさらなる構成要素を含有し得、それによって、滅菌蒸留水で再構成することにより、緩衝溶液又は食塩水中のFVIIポリペプチドが得られる。単位投与形態は、画分又は多画分で投与することができる。複数投与形態は、分離された単位投与形態で投与される単一容器に包装された、複数の同一の単位投与形態である。複数投与形態の例には、バイアル、錠剤若しくはカプセルのボトル、又はパイント若しくはガロンのボトルが含まれる。したがって、複数投与形態は、包装に分離されていない複数の単位用量である。
本明細書で提供されるFVIIポリペプチド(即ち活性化合物)は、体液又は他の組織試料などの混合物とFVIIポリペプチドとを接触させることにより、in vitro、ex vivo、又はin vivoで投与することができる。例えば、化合物をex vivoで投与する場合、対象から得た体液又は組織試料を、例えばバイパス機器のチューブ又はフィルターなどのチューブ又はフィルター上に被覆されているFVIIポリペプチドに接触させることができる。in vivoで投与する場合、活性化合物は、例えば経口、経鼻、経肺、非経口、静脈内、皮内、皮下、関節内、脳槽内、眼内、脳室内、髄腔内、筋肉内、腹腔内、気管内、又は局所の任意の適切な経路により、及びその任意の2つ以上の任意の組合せにより、液体、半液体、又は固体の形態で投与され得、また、それぞれの投与経路に適した様式で製剤される。改変FVIIポリペプチドは、1回、又は2回、3回、4回、若しくは治療効果を得るために必要な任意の回数などの複数回、投与することができる。複数投与は、任意の経路又は経路の組合せを介して行うことができ、1時間毎、2時間毎、3時間毎、4時間毎、又はそれ以上で投与することができる。
遺伝子治療に適している、改変FVIIポリペプチドをコードする核酸分子の組成物及びそれをコードする発現ベクターも提供される。タンパク質を運搬するよりもむしろ、核酸は、全身投与若しくは他の経路などでin vivoで投与することができるか、又は、リンパ球を含む細胞の除去、そこへの核の導入、及び宿主若しくは適合レシピエントへの再導入などにより、ex vivoで投与することができる。
本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドは、組換えFVIIが用いられる任意の状態の治療に用いることができる。典型的には、そのような治療には、止血応答の増大などの凝固の増大が望まれるものが含まれる。改変FVIIポリペプチドは、単独で、又は他の作用物質と組み合わせて、治療活性を有する。本明細書で提供される改変ポリペプチドは、治療活性を保持するが、改変された特性、とりわけTFPIに対する抵抗性の増大、AT−IIIに対する抵抗性の増大、触媒活性の増大、半減期の増大、並びに/又は活性化血小板に対する結合及び/若しくは親和性の増大を示すように設計される。そのような改変された特性により、例えば、改変FVIIポリペプチドの凝固活性の向上のために、ポリペプチドの治療有効性が向上し得る。この節は、例示的な使用及び投与の方法を提供する。これらの記載された治療は例示的なものであり、改変FVIIポリペプチドの適用を限定するものではない。
a.血友病
先天性血友病は、血漿中の凝固因子のレベルが低下し、それにより凝固カスケードの破壊及びブロット凝固時間の増大が生じる、劣性の血液障害である。血友病の全症例の約85%を占める血友病Aは、X染色体上の第VIII因子遺伝子における突然変異(複数可)の結果生じるものであり、FVIIIタンパク質の欠乏又は機能障害をもたらす。血友病Bは、凝固因子FIXの欠乏又は機能障害により生じ、通常は、X染色体上のFIX遺伝子における点突然変異又は欠失の結果によるものである。血友病Aの世界的な発生率は5000人の男性につき約1例であり、血友病Bでは、25000人の男性につき1例である。血友病A及びBはさらに、軽度、中度、又は重度に分類される。5%〜25%の正常に機能する第VIII因子又はIXの血漿レベルは軽度と分類され、1%〜5%は中度、1%未満は重度と分類される。FXI欠乏症といわれることが多い血友病Cは、比較的軽度で稀な疾患であり、常染色体劣性の様式で10万人に約1人が罹患する。
第VII因子欠乏症は、50万人に約1人が罹患する常染色体劣性の出血障害である。FVII欠乏症は、臨床的に軽度、中度、又は重度であり得、軽度から中度の欠乏症は、外科手術及び外傷後の出血の増大に特徴を有する。重度のFVII欠乏症(1%未満のFVII活性)を有する患者は、血友病と類似の症状を有する。例えば、FVII欠乏症の対象は、関節出血、自然発生的な鼻血、消化管の出血、腎管の出血を起こしやすい。脳内出血及び筋肉出血もまた報告されており、一方、女性は重度の月経過多(重い月経出血)を有し得る。治療は、補充療法によって行うことができる。組換えFVIIa製品(ノボセブン(登録商標)、Novo Nordisk)は、先天性FVII欠乏症を有する患者における出血症状の治療、及び先天性FVII欠乏症を有する患者における外科的介入又は侵襲的処置における出血の予防について、認可及び許諾されている。したがって、本明細書における改変FVIIポリペプチドを同様に用いることができる。本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドは、出血症状の治療、及びFVII欠乏症患者における外科的介入又は侵襲的処置における出血の予防に用いることができる。例えば、頭蓋内出血を伴う重度のFVII欠乏症を有する新生児の患者に、静脈内ボーラスによって改変FVIIポリペプチドを投与することで、凝固をもたらし、止血を維持することができる。通常、改変FVIIポリペプチドは、活性化FVII(FVIIa)ポリペプチドとして投与される。
他の出血障害は、本明細書で提供される、凝固を促進するためのFVIIポリペプチドを用いて治療することができる。第V及びX因子の先天性欠乏症もまた、血液凝固時間の増大を示し、治療用量のFVIIを投与することで治療できる可能性がある。例えば、第X因子欠乏症を有する患者にrFVIIaを投与して、脾臓摘出に関連する出血を調節することができる(Boggioら(2001)Br J Haematol 112:1074〜1075)。フォンウィルブランド病(vWD)に関連する、自然発生的な及び外科的に関連している出血症状もまた、本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドを用いて治療することができる。VWDは、血液凝固タンパク質であるフォンウィルブランド因子(vWF)の欠陥及び欠乏により生じる出血障害であり、人口の1%〜2%に生じると推定されている。vWDを有する対象はあざができやすく、再発性の鼻血、抜歯、扁桃摘出又は他の外科手術の後の出血を有し、女性の患者は生理出血が増大し得る。改変FVIIポリペプチドは、vWD患者における、自然発生的な及び外科的に関連している出血を改善するために用いることができる(von Depkaら(2006)Blood Coagul Fibrin 17:311〜316)。例えばグランツマン血小板無力症及びヘルマンスキーパドラック症候群などの、他の血小板関連出血障害もまた、内因性の凝固活性の低減に関連するものである。血小板関連出血障害を有する患者における、過剰な、自然発生的な又は外科的に関連する出血もまた、治療用量の改変FVIIポリペプチドによって調節することができる。例えば、外科手術を受けているグランツマン血小板無力症の患者は、大量の血液の損失を防ぐために、外科手術の前、最中、及び/又は後に、改変FVIIポリペプチドで治療することができる(van Buurenら(2002)Dig Dis Sci 47:2134〜2136)。通常、改変FVIIポリペプチドは活性化FVII(FVIIa)ポリペプチドとして投与される。
a.化学療法による後天性の血小板減少症
出血障害はまた、先天性よりもむしろ後天性のものであり得る。例えば、白血病及び他の癌などの化学療法治療により、血小板減少症が生じ得る。これは、化学療法を受けた患者の骨髄における血小板の生成の低下によるものと考えられ、典型的には、薬物投与の6〜10日後に生じる。後天性血小板減少症の治療は、通常、血小板の欠乏から生じ得る任意の異常な自然発生的な出血の予防に役立つ、血小板、赤血球、又は血漿の輸血により行われる。化学療法誘発性の血小板減少症又は任意の他の後天性若しくは先天性の血小板減少症を有する患者における出血もまた、治療用量の、本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドを投与することにより調節することができる。例えば、消化管などにおける調節されていない出血を有する血小板減少症の患者に、治療用量のFVIIポリペプチドを静脈内ボーラス注入で投与して、出血を止めることができる(Gerotziafasら(2002)Am J Hematol 69:219〜222)。通常、改変FVIIポリペプチドは、活性化FVII(FVIIa)ポリペプチドとして投与される。
他の後天性凝固障害を、本明細書において示される改変FVIIポリペプチドを用いて治療することができる。凝固障害は、それだけに限らないが、劇症肝不全(FHF、肝毒性薬、毒素、代謝性疾患、感染性疾患、及び虚血により生じるものなど)、肝硬変及びウィルソン病に関連する疾患を含む他の肝臓疾患、ビタミンK欠乏症(抗生物質治療又はダイエットにより生じるものなど)、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少症(TTC)、並びに播種性血管内凝固障害(DIC)を含む状態の結果生じ得る。従来の治療は、通常、血漿、赤血球(RBC)、又は血小板の輸血によるものであるが、成功しない場合がある。一実施形態では、改変FVIIポリペプチドを、侵襲的処置を受けているFHFを有する患者に投与して、出血を防ぐことができる。新鮮な冷凍血漿(FFP)を用いる従来の治療は成功しないことが多く、大量の血漿を必要として容量負荷及び全身浮腫(皮下結合組織への浮腫液の全身性浸潤)をもたらす場合がある。例えば肝臓生検又は肝臓移植などの侵襲的外科手術の最中、前、及び/又は後に静脈内ボーラスを行うことによる、治療用量の改変FVIIポリペプチドを用いた治療は、FHF患者において、出血を防ぎ、止血を確立することができる。患者を、血液のPTによりモニターして、治療の効力を決定することができる(Shamiら(2003)Liver Transpl 9:138〜143)。別の実施形態では、従来の輸血注入に応答しない、凝固障害に関連する重度の出血、例えば、肝機能障害及びDICに関連する帝王切開後の重度の腹腔内出血などを有する患者に、FVIIを投与することができる(Moscardoら(2001)Br J Haematol 113:174〜176)。さらに、改変FVIIポリペプチドを用いて、新生児及び小児の患者における凝固障害を治療することができる。特定の実施形態では、新生児及び小児の患者は、RBC及び血小板の注入などの従来の治療に対して応答しない。例えば、RBC及び血小板の輸血に応答しない、PTの増大に関連する重度の肺出血を有する新生児に、改変FVIIポリペプチドを投与することで、PTを低下させ、止血を確立することができる(Olomuら(2002)J Perinatol 22:672〜674)。本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドは、非改変FVIIポリペプチドと比較して増強した凝固活性を示し、したがって、例えば低い用量、少ない頻度、及び少ない有害反応で投与することができる。通常、改変FVIIポリペプチドは、活性化FVII(FVIIa)ポリペプチドとして投与される。
骨髄移植(BMT)及び幹細胞移植(SCT)の後の重度の出血は、血小板の低減に起因する、これらの処置に関連する比較的一般的な、及び生命に関わる合併症である。例えば、びまん性肺胞出血(DAH)は、推定上の発生率が移植人口の1〜21%であり、死亡率が60〜100%である、BMTの肺における合併症である。そのような出血症状の従来の治療には、コルチコステロイド治療、並びに血漿、血小板、及び/又はRBCの輸血が含まれるが、これらは多くの場合成功せず、全体的な死亡率は約50%である(Hicksら(2002)Bone Marrow Transpl 30:975〜978)。コルチコステロイド及び/又は血小板の注入との同時の治療を伴って又は伴わずに、静脈内ボーラスによりFVIIを投与して、DAHを治療し、止血を確立することができる(Hicksら(2002)Bone Marrow Transpl 30:975〜978)。本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドは、非改変FVIIポリペプチドと比較して増強した凝固活性を示し、したがって、例えば低い用量、少ない頻度、短い治療期間、及び少ない有害反応で投与して、同じ生物学的活性及び効力を得ることができる。通常、改変FVIIポリペプチドは、活性化FVII(FVIIa)ポリペプチドとして投与される。
血栓塞栓症などの状態の治療のために抗凝固療法を受けている患者は、ワルファリン、ヘパリン、及びフォンダパリヌクスなどの抗凝固物質を急性投与すると出血症状を示し得るか、又は、そのような療法を長期にわたり用いた結果、出血障害を発現し得る。出血症状の治療には、典型的には、ビタミンK、血漿、外因性FIX、及びヘパリンを中和するためのプロタミンなどの凝固促進剤の投与が含まれる。外因性FVIIの投与もまた、抗凝固物質の効果を中和するため、PT、aPTT、及び/又は他の凝固マーカーを増大させるため、並びに止血を確立するために行うことができる(Deverasら(2002)Ann Inten Med 137:884〜888)。本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドを治療に用いて、抗凝固治療に起因する後天性の出血障害を有する患者における出血症状を調節することができる。通常、改変FVIIポリペプチドは、活性化FVII(FVIIa)ポリペプチドとして投与される。
第VIII因子阻害剤は、他の点では健康な個体において自然発生的に発現し、「後天性血友病」として知られている状態をもたらす。後天性血友病は、毎年100万人の人口当たり0.2〜1.0で発生する稀な状態である。自己抗体は主にIgG4抗体であり、これは、FVIIIに結合すると、トロンビン切断、フォンウィルブランド因子の相互作用、及び/又はリン脂質の結合に干渉することにより、FVIII活性を阻害する。これにより、罹患した患者の約87%に、生命に関わる出血が生じる。出血の一般的な部位は、遺伝性血友病の患者が主に関節及び筋肉において出血するのに対し、皮膚、粘膜、筋肉、及び後腹膜である。後天性血友病は、活性化プロトロンビン複合体濃縮物又は組換え活性化第VII因子(ノボセブン(登録商標)、Novo Nordisk)を用いて治療し、出血症状を調節することができる。本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドは、非改変FVIIポリペプチドと比較して増強した凝固活性を示し、したがって、例えば低い用量、少ない頻度、短い治療期間、及び少ない有害反応で投与して、同じ生物学的活性及び効力を得ることができる。通常、改変FVIIポリペプチドは、活性化FVII(FVIIa)ポリペプチドとして投与される。
FVIIポリペプチドを、正常な凝固系を有する対象における、周術期及び外傷での血液損失に関連する出血を治療するための療法として用いることができる。例えば、FVIIポリペプチドを患者に投与して、凝固を促進し、外科手術に関連する血液損失を低減させ、さらに、輸血の必要性を低減させることができる。一実施形態では、FVIIポリペプチドを、恥骨後前立腺摘除術を受けている対象に投与することができる。恥骨後前立腺摘除術は、大量の血液損失及びその後の輸血の必要性に関連することが多い。そのような又は類似の外科手術を受けている対象に、手術の初期に治療用量のFVIIを静脈内ボーラスして、外科手術部位での凝固を増強することによって周術期の血液損失を低減させることができる。血液損失を低減させることにより、これらの患者における輸血の必要性がなくなる(Friederichら(2003)Lancet 361:201〜205)。FVIIポリペプチドを、他のタイプの外科手術を受けている正常な凝固を示す患者に投与して、迅速な止血を得、血液損失を防ぐことができる。典型的には活性形態(即ちFVIIa)で投与されるFVIIを、周術期の出血を低減させるための療法に用いることができる、外科的処置の非限定的な例には、それだけに限らないが、心臓弁手術(Al Douriら(2000)Blood Coag Fibrinol 11:S121〜S127)、大動脈弁交換(Kastrupら(2002)Ann Thorac Surg 74:910〜912)、再発性血管周囲細胞腫の切除(Gerlachら(2002)J Neurosurg 96:946〜948)、癌手術(Sajdakら(2002)Eur J Gynaecol Oncol 23:325〜326)、及び十二指腸潰瘍の手術(Vlotら(2000)Am J Med 108:421〜423)が含まれる。FVIIを用いた治療は、外科手術の部位での止血を促進し、血液損失を低減又は予防し、それにより、輸血の必要性を低減させるか又はなくす。本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドは、非改変FVIIポリペプチドと比較して増強した凝固活性を示すように設計され、したがって、例えば低い用量、少ない頻度、及び少ない有害反応で投与することができる。通常、改変FVIIポリペプチドは、活性化FVII(FVIIa)ポリペプチドとして投与される。
本明細書に記載される任意の改変FVIIポリペプチドは、それだけに限らないが、他の生物学的製剤、小分子化合物、及び外科手術を含む他の治療物質又は治療処置と組み合わせて、その前に、その合間に、又はそれに続けて、投与することができる。FVII(FVIIa及びrFVIIaを含む)が指定されるか又は用いられており、且つ他の作用物質及び治療が利用可能な、上記に例示したすべてのものを含む任意の疾患又は状態に対して、FVIIをそれらと組み合わせて用いることができる。したがって、本明細書で提供される改変FVIIポリペプチドも同様に用いることができる。治療しようとする疾患又は状態に応じて、例示的な組合せには、それだけに限らないが、他の血漿精製凝固因子又は組換え凝固因子、ビタミンK、ビタミンK誘導体、及びプロテインC阻害剤などの凝固促進剤、血漿、血小板、赤血球、並びにコルチコステロイドとの組合せが含まれる。
改変FVIIポリペプチド、若しくは改変FVIIポリペプチドをコードする核酸、又はその誘導体若しくは生物学的に活性な部分の医薬化合物を、包装材料、止血疾患又は止血障害の治療に有効な医薬組成物、及び改変FVIIポリペプチド又は核酸分子が止血疾患又は止血障害の治療に用いられていることを示すラベルを含有する製品として包装することができる。
TFPIに対する増大した抵抗性を有する第VII因子変異体のin silico生成
A.第VII因子とTFPIの間の相互作用のモデリング
第VII因子とその天然阻害剤、組織因子経路阻害剤(TFP1)−1における第1のクニッツドメイン(K1)(TFPI−1のK1)の間の相互作用のコンピュータモデリングを実施して、相互作用部位の界面における接触アミノ酸残基を決定した。蛋白質構造データバンク(resb.org/pdb/)から公に入手可能な情報を使用して、相同性モデルを作製した。TFPI−1のK1単独、又はTF/FVIIa/TFPI−1/FXa間の四量体複合体に関する結晶構造のいずれも解明されていない。代わりに、トリプシン/TFPI−2複合体の結晶構造に関する情報に従い(図6)、このプロセス用の出発モデルとしてTF、FVII及びウシ膵臓トリプシン阻害剤の5L15変異体(BPTI5LI5;PDBコード1FAK_1)の間の三重複合体の2.1Å結晶構造を使用して、コンピュータモデリングを実施した。BPTI5LI5はクニッツドメイン型セリンプロテアーゼであり、且つTFPI−1及びTFPI−2に対して相同性を示す。BPTI5LI5(配列番号106)の第1のクニッツドメイン(K1)は、その第1のクニッツドメイン(K1)中で45%の一次配列同一性を示す(図5)。TFPI−2のK1の結晶構造の座標は、トリプシン/TFPI−2複合体の結晶構造を示す、蛋白質構造データバンクのプログラムデータベース(pdb)ファイル1TFXから抽出した。TFPI−2のK1の座標は、PyMolソフトウェアスイート(pymol.sourceforge.net/)における剛体c−α骨格のアラインメントプログラムを使用して、TF/FVIIA/BPTI5LI5(pdbファイル1FAK1)の結晶構造のBPTI5LI5三次元座標に合わせた。重複の測定によるモデルへのTFPI−2のK1の適合性の分析は、1Å未満の標準偏差(RMSD)をもたらした。これは2構造間の正確なアラインメント、及びFVIIとTFPI−2のK1の複合体の信頼できるモデルの生成を示した。
FVII/TFPI−1のK1の相互作用の界面又はその近辺に位置するアミノ酸残基を、前に記載したのと同様に同定した。a)FVIIとTFPI−1の間の相補的静電性接触部位を反発電荷−電荷接触部位と交換した、及び/又はb)中性残基とFVII上の帯電残基を交換することによって正の静電性接触部位を無効にする、及び/又はc)大きな側鎖を含有する複数の残基と小さな側鎖を含む1残基の交換によって立体障害を引き起こすいずれかの、複数のアミノ酸の変化があるFVIIの変異体を設計した。例示的な変異体は表9中に列挙する。
FVIIのクローニング及び発現
A.FVIIのクローニング
466のアミノ酸ヒトFVIIアイソフォーム前駆体ポリペプチド(P08709;配列番号1に示す)をコードするヌクレオチドを、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを含有する、哺乳動物発現ベクター、pCMV Script(Stratagene;配列番号151)にクローニングした。簡単にいうと、CBO−125(配列番号152)及びCBO−126(配列番号153)オリゴヌクレオチドを、それぞれ順方向プライマー及び逆方向プライマーとして使用して、鋳型としてヒトFVIIのcDNA(Invitrogen)を使用するPCRによりFVII配列を増幅した。CBO−125プライマーは、BamHI制限部位(太線)、Kozak配列(二本下線)、次にATG開始コドンを含むFVIIのcDNA配列の5’末端と相同性を有する18ヌクレオチド(一本下線)を含有していた。CBO−126プライマーは、EcoRI制限部位(太線)、停止コドン(二本下線)、及びFVIIのcDNA配列の3’末端と相同性を有する21ヌクレオチド(一本下線)を含有していた。
CBO−125順方向プライマー
5’ gcatcatgacgtgacggatccgccaccatggtctcccaggccctc 3’
CBO−126逆方向プライマー
5’ gatcgtacgatacgtgaattcctagggaaatggggctcgcaggag 3’
新たに合成されたDNAに特定の突然変異を取り込むプライマーとして働く特異的に設計されたオリゴヌクレオチドを用いて、製造者の説明書に従いQuikChange II XL部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を使用して、FVII変異体を生成した。QuikChangeの方法は、PfuUltra高忠実度DNAポリメラーゼによる鋳型DNAの直線的増幅を含む。望ましい突然変異を含む相補的プライマーは、鋳型としてクローニングFVIIcDNA配列を含有する、精製した、二本鎖スーパーコイル状pCMV Scriptベクターを使用してサイクル中に伸長した。プライマーの伸長は新たに合成された鎖への対象の突然変異の取り込みをもたらし、互い違いのニックを有する突然変異プラスミドをもたらした。増幅後、大腸菌由来pCMV Scriptベクターのdamメチル化親鎖を消化するDpnIで、核酸を処理した。これは、メチル化されなかった、新たに合成された突然変異プラスミドの「淘汰」をもたらした。(1つ又は複数の)望ましい突然変異を含有するベクターDNAをXL10−Goldウルトラコンピテント大腸菌細胞に形質転換し、この場合細菌リガーゼがニックを修復し、正常な複製が起こるのを可能にした。
ELISA及びウェスタンブロットによる初期発現の分析用に、FVIIポリペプチドをBHK−21細胞中で発現させた。以下に記載したアッセイなどの生化学的アッセイ用に、FVIIポリペプチドをFreestyle(商標)293−F細胞(Invitrogen)中で発現させた。
イムノアッセイを使用して、試料中のヒトFVII及びFVIIaの量を定量化した。ヒトFVIIに対するポリクローナル抗体を使用して、溶液中のプロテアーゼを捕捉及び検出した。イムノアッセイを使用して、馴化培地又は精製ストックのタンパク質濃度を決定することができ、或いは他の試料、例えばヒト又はマウス血漿試料中のFVIIの濃度を決定することができる。ヒト血液中のFVIIのベースライン濃度は約50nMであり、且つ酵素活性型、FVIIaは約1nMである。
細胞培養培地中でのFVIIの発現は、ウェスタンブロットによってもアッセイした。FVIIトランスフェクトBHK−21細胞由来の細胞培養培地の非希釈試料、又はPBSに希釈した2つの連続2倍希釈液を含有する複数のアリコートを、濃度1(非希釈)、濃度2(2倍希釈)及び濃度3(4倍希釈)で標識した。試料はSDSページゲル上で10、25、及び50ナノグラムの対照血漿精製rFVII(American Diagnostica、CB553−01)の隣に添加した。BHK−21細胞によって生成されたFVIIタンパク質は、一次ポリクローナルウマ抗FVII抗体(American Diagnostica;製造者の提案する濃度で使用した)及びHRPコンジュゲート抗ウマIgG二次抗体(Zymed Laboratoriesからの1mg/ml溶液の1:2000希釈液)を使用してウェスタンブロットによって検出した。発現レベルの比較は対照血漿精製rFVIIと行った。これらの結果は、約20ng〜50ngを超える範囲の濃度のFVIIが、細胞培養物のアリコート中に存在したことを示す。
FVIIポリペプチドの精製及び活性化
FVIIポリペプチドは、機能的Glaドメインを有するFVIIポリペプチドがそこに吸着するQ Sepharose Fast Flow(XK16)カラム、次にカルシウム溶出ステップを使用して精製した。トランスフェクトしたFreestyle(商標)293−F細胞由来の240ml体積の培養物上清を、20mMのトリスpH8.0及び0.01%のTween20を含有する溶液で2倍希釈し、次いで1.5mlの500mM EDTA pH8.0を希釈試料に加えた。試料を濾過した後、8ml/分で最初にバッファーB(20mMのトリスpH8.0、1MのNaCl、0.01%のTween20)、次いでバッファーA(20mMのトリスpH8.0、0.15MのNaCl、0.01%のTween20)で予め平衡状態にしたQ Sepharose Fast Flow(XK16)カラムに添加した。添加した後、280nmでの流入液の吸光度がベースラインに達するまで、バッファーAでカラムを洗浄した。バッファーAをバッファーC(20mMのトリスpH8.0、0.15MのNaCl、0.01%のTween20、5mMのCaCl2)と交換し、ポンプによる洗浄を実施して系中のバッファーを完全に交換した。ポンプによる洗浄の終了時に、バッファーCを8ml/分でカラムに施して、FVIIポリペプチドを溶出させ、60分間で5mlの複数の分画に回収した。溶出後、(培養培地由来の)ピンク色の色素がカラムから洗浄除去されるまで、分画をさらに回収しながらカラムをバッファーBで洗浄した。次いでカラムをバッファーAで洗浄して、それを次の試料由来のFVIIの精製用に調製した。
小分子基質におけるFVIIaのアミド分解活性のミカエリスメンテン反応速度定数の決定
FVII変異体のアミド分解活性を、ペプチジル基質Spectrozyme FVIIa(CH3SO2−D−CHA−But−Arg−pNA.AcOH)に対するFVIIaポリペプチドのミカエリスメンテン反応速度定数を測定することによって評価した。脂質化ヒト精製組織因子(Innovin、Dade Behring、VWRカタログ番号68100−390)をアッセイ中に含めて、FVIIaの最適活性を与えた。TF−FVIIa複合体が非常に特異的な発色性基質であるSpectrozyme FVIIaを切断すると、パラニトロアニリン−発色団(pNA)が放出し、これは405nmでの吸収を測定することによってモニターすることができる。酵素活性は、時間の関数として生成した遊離pNAの405nmでの吸光度をモニターすることによって決定する。
Y=((kcatKm/1000000)×X×[E])/(1+(X+Km)
上式で;Xは基質濃度であり(μM)
Yは酵素活性であり(μM/秒)
kcatKmは特異性定数であり(M−1秒−1)
Kmはミカエリスの定数であり(μM)
Eは酵素濃度であり(μM)
E=1、Km=0.5×YmaxでのX及びkcatKm=1000の初期値を設定した。
基質第X因子に対するFVIIaの触媒活性の決定
基質第X因子(FX)に対するFVIIa変異体の触媒活性を、合成基質Spectrafluor FXaにおいてFVIIaによる活性化によって生成したFXaの活性をアッセイすることによって、蛍光アッセイ中で間接的に評価した。脂質化型の精製組織因子(TF)をアッセイ中に含めて、FVIIaの最適活性を与えた。Spectrafluor FXa(CH3SO2−D−CHA−Gly−Arg−AMC.AcOH)に対するFXaの酵素活性は、時間の関数として、生成した遊離フルオロフォア、AMC(7−アミノ−4−メチルクマリン)の吸光度の増大を測定することによって決定した。
kcat/Km,FVIIa=Vmax/Km,FVIIa×1/(0.5×k2×[FVIIa、μM単位]×(RFU/μM変換係数))
上式で;k2=([S]×kcat,FXa)/(Km,FXa+[S])、前式でkcat,FXa及びKm,FXaは、kcat,FXa=117秒−1、及びKm,FXa=164μMとして、FXa標準を使用して実験により決定した、SpectrofluorXaのFXa切断に関する定数である。
溶液中の触媒として存続可能なプロテアーゼの濃度の決定
ストック溶液中の触媒として存続可能なFVIIaの濃度を、FVIIaの不可逆性ペプチド阻害剤、Phe−Phe−Arg−クロロメチルケトン(FFR−CMK)で因子FVIIaと可溶性組織因子(sTF)の複合体を滴定することによって決定した。この阻害剤はFVIIaとは結合するが、FVIIとは結合しない。高濃度のFVIIa(50nM)での長時間のインキュベーションは、プロテアーゼの完全な滴定を確実にする。FFR−CMKとのインキュベーション後のFVIIa/TF複合体の残留活性を測定して、元のストック溶液中の触媒として存続可能なFVIIaの濃度を決定した。
96ウェルのクリアな半領域アッセイプレート(Nunc)を、150μl/ウェルの1×プレートバッファー(100mMのトリスpH8.4、100mMのNaCl、0.01%のBSA、0.01%のTween−20)をそれぞれのウェルに加えること、及び少なくとも1時間37℃でプレートをインキュベートすることによって前処理した。ペーパータオルで吸い取ること、及びプレートを逆さまの状態で遠心分離にかけて残留バッファーを除去することによって、バッファーを完全に除去し、プレートは1時間空気乾燥させ、室温(RT)においてカバーした状態で保存した。
滴定の精度及びスループットを高めるために、以前のアッセイを384ウェルプレートベースの形式に改変した。高いプロテアーゼ濃度(250nM)及び400nM〜53nMの範囲に及ぶ一連のFFR−CMK濃度で、インキュベーションを7時間実施した。FVIIa基質(Mesyl−dFPR−ACC)を加えること、及び経時的に蛍光シグナルの変化を測定することによって、残留活性を測定した。
FVIIa/TFのTFPI阻害に関するIC50の決定
TFPIとFVIIa/TF複合体の間の相互作用の有効性を、基質、Spectrazyme VIIaに対するFVIIa/TFの触媒活性における様々な濃度のTFPIの阻害のレベルを測定することによって評価した。50%の阻害に必要とされたTFPIの濃度(IC50)は、それぞれのFVII変異体、及びFVIIa標準に関して計算した。
in vivoでの野生型FVIIaの凝固促進活性の評価
血友病Aのマウスモデルを確立して、FVIIaポリペプチドの凝固促進活性を評価した。抗FVIII抗体の投与、次に尾の先端を外科手術により除去して出血を開始させることによって、CD−1マウスにおいて血友病Aを誘導した。次いでマウスをFVIIaポリペプチドで治療して、出血を止めるのに要した時間、及びこの時間中に失われた血液の量を測定して、FVIIaポリペプチドの凝固促進活性を決定した。
FVIIaポリペプチドの薬物動態分析
FVIIaポリペプチドの薬物動態性を、マウス血漿中のヒト第VIIa因子の量を測定することによって評価した。2つのアッセイを使用して血漿中のFVIIaを定量化した。ELISAを使用してマウス血漿中の全FVIIaタンパク質を定量化し、FVIIa依存性凝血アッセイ(FVII:C)を使用して血漿中のFVIIaポリペプチドの凝固活性を定量化した。
改変FVIIaポリペプチド及び非改変組換え型ヒトFVIIa(rhFVIIa)タンパク質(NovoSeven(登録商標)、Novo Nordisk)を、薬物動態試験において評価した。それぞれの試験用に、18匹の雄CD−1マウスにrFVIIaを静脈内ボーラス投与で注射した(試験に応じて0.1〜3.0mg/kg)。注射後5、15、30、60、120、及び240分で、それぞれの注射プロトコルからの3匹のマウスをCO2窒息を使用して安楽死させ、経皮的心穿刺によって約1.0mLの血液を1.0mLのシリンジに取り出した。それぞれのシリンジに十分なクエン酸ナトリウムを予め充填して、1mLの血液中に3.2%の最終濃度を得た。次いでこれらの血液試料を、4℃において8分間9000rpmで遠心分離にかけた。血漿を標識した個々の1.5mlチューブ(エッペンドルフ)に除去し、液体窒素中で瞬間凍結させ、−80℃で保存した。さらに、実験当たり1匹のマウスに媒体のみを注射し(擬似)、このマウス由来の血漿はバックグラウンドのFVIIa活性の決定に使用した。
市販のキット、IMUBIND(登録商標)第VII因子ELISA(American Diagnostica)を使用して、ELISAによって血清中のFVIIタンパク質を検出した。このキットは、タンパク質を捕捉するために抗FVII/FVIIa抗体で予めコーティングしたプレート、及びストレプトアビジン標識ホースラディッシュペルオキシダーゼを介した検出用のビオチン化抗FVII抗体を利用する。このキットは以下の例外以外は製造者の指示に従って使用した:第1に、標準曲線を限定して、全濃度範囲にわたって直線的な範囲となり、0.88ng/ml〜10ng/mlの濃度に及ぶことを確実にした;第2に、抗体親和性の違いのために、キットに与えられたFVII標準ではなく、精製FVIIa変異体自体を標準曲線に使用した。複数の実験が、FVIIaと抗トロンビンIII(ATIII)の複合体、FVIIaの考えられる血漿阻害剤が遊離プロテアーゼのレベルの75%で検出されることを示し、このアッセイは、活性型と不活性型の両方で血漿試料中の全FVIIaを検出することができることを確実にした。
市販のキット(STACLOT FVIIa−rTF、Diagnostica Stago、Parsippany、NJ)を、凝血アッセイ用として使用した。活性FVIIaポリペプチドの凝固活性を決定するために、FVIIa依存性凝血アッセイ(FVII:C)を使用して血漿試料をアッセイした。アッセイは市販のキット中に与えられた試薬及び説明書を使用して実施し、凝血時間は電気機械的凝血検出装置(STArt4、Diagnostica Stago、Parsippany、NJ)を使用して測定した。このキットは以下の例外以外は製造者の指示に従って使用した:第1に、キットに与えられたrhFVIIa標準ではなく、精製FVIIa変異体自体を標準曲線に使用した;第2に、以下の多量の市販の試薬を通常の薬物動態スクリーニング試験に使用して、キットの試薬に匹敵する結果を得た:可溶性組織因子(CalBioChem、La Jolla、Ca)及び合成リン脂質混合物(Avanti Polar Lipids、Alabaster、AL)、TBSAバッファー(Tris−NaCl、pH7.5及び1%のBSA;DiaPharma、West Chester、Ohio)、及び25μMの塩化カルシウム溶液(Diagnostica Stago、Parsippany、NJ)。
前述のプロトコルを使用して、野生型FVIIa及び2個のFVIIa変異体:CB728、CB735及びCB945の薬物動態性を評価した。これらの結果は表14中に示す。CB735及びCB945は、野生型FVIIaと比較して改善された薬物動態パラメータを示した。
TFPI(CB−558;K297E突然変異を含有する)に対する抵抗性の増大を示した改変FVIIaポリペプチドの半減期を測定し、幾分改変した前に記載したのと同様の薬物動態試験において、非改変組換え型ヒトFVIIa(rhFVIIa)タンパク質(NovoSeven(登録商標)、Novo Nordisk)の半減期と比較した。15匹の雄CD−1マウスにCB−558を0.5mg/kg静脈内ボーラス投与で注射し、15匹のマウスにはrhFVIIaを0.5mg/kgで静脈内ボーラス投与した。注射後5、15、30、60、及び120分で、それぞれの注射プロトコルからの3匹のマウスをCO2窒息を使用して安楽死させ、経皮的心穿刺によって約1.0mLの血液を1.0mLのシリンジに取り出した。それぞれのシリンジに十分なクエン酸ナトリウムを予め充填して、1mLの血液中に3.2%の最終濃度を得た。次いでこれらの血液試料を、4℃において8分間9000rpmで遠心分離にかけた。血漿を標識した個々の1.5mlチューブ(エッペンドルフ)に移し、液体窒素に瞬間凍結させ、−80℃で保存した。
追加的なFVII変異体の生成
一連の追加的なFVII突然変異体を生成してFVIIの1つ又は複数の性質及び/又は活性を変化させた。TFPI抵抗性を増大させるための改変以外に、AT−IIIに対する抵抗性を増大させるため、触媒活性を増大させるため、半減期を増大させるため、及び/又は活性化血小板上のリン脂質などのリン脂質との親和性及び/又は結合を増大させるための改変を設計した。これらの改変には、アミノ酸交換、挿入及び欠失がある。2つ以上の改変を含有するFVII変異体も生成した。表23は、Freestyle(商標)293−F細胞において生成し発現させたFVII変異体を示す。複数のアミノ酸交換を、適切なオリゴヌクレオチドを用いて、前述の実施例2.B中に記載した方法を使用してFVIIポリペプチドに組み込んだ。
基質第X因子に対するFVIIa変異体の触媒活性の分析
基質第X因子(FX)に対するFVIIa変異体の触媒活性を、合成基質Spectrafluor FXaにおいてFVIIaによる活性化によって生成したFXaの活性をアッセイすることによって、2つのタイプの発色アッセイで間接的に評価した。この2つのアッセイは脂質化組織因子の存在下又は不在下のいずれかで実施して、TF依存性活性とTF非依存性活性の両方を評価した。実施例2及び3中に前に記載したように、FVII変異体を発現させ、精製しFVIIaに活性化した。大部分のFVII変異体はFreestyle(商標)293−F細胞中でのみで発現したが、いくつかのFVII変異体はBHK−21細胞中でも発現した。
組織因子の存在下でFVIIa変異体の触媒活性を、わずかな改変で前述の実施例5中に記載したアッセイを使用して評価した。1つのこのような改変は、ERG−CMK及びFFR−CMKで処理してバックグラウンド活性を低減させた第X因子基質プロテアーゼの使用であった(Molecular Innovations)。2つの別個のアッセイ;直線範囲の分析アッセイ及び双曲線範囲の分析アッセイを使用して、2つのタイプのデータ分析を実施した。直線範囲の分析アッセイは0nMと150nMの間の範囲の第X因子濃度を使用して、用量曲線の直線範囲中の反応速度定数の正確な測定を確実にした。対照的に、双曲線範囲の分析アッセイは0μMと1.44μMの間の範囲の第X因子濃度を使用して、飽和(双曲線)用量曲線を用いた反応速度定数の正確な測定を確実にした。
組織因子の存在下でFVIIa変異体の触媒活性を、組織因子をアッセイ中に含めなかったこと以外、前に記載したアッセイと同様の間接的アッセイにおいて評価した。したがって、TF非依存性活性を評価するためのアッセイを、以下の改変で前に記載したのと本質的に同様に実施した。FVIIa変異体の溶液は50nMに希釈した。25μLのそれぞれのFVIIa溶液を、1.0mMのSpectrofluor FXa(American Diagnostica)及び1050nM、700mM、466.7nM、311.1nM、207.4nM、138.3nM、92.2nM又は0nMの第X因子(Molecular Innovations)の1つを含有していた25μLの基質溶液と混合した。したがって、アッセイに関する最終濃度は、25nMのFVIIa、0.5mMのSpectrofluor FXa及び525mM、350nM、233.3nM、155.6nM、103.7nM、69.1nM、46.1nM又は0nMの第X因子(Molecular Innovations)、50μL/ウェル中であった。データ分析は、改変なしで前の直線範囲のアッセイに関して記載したのと同様に実施した。
AT−III/ヘパリンによるFVIIa/TF又はFVIIaの阻害の決定
可溶性組織因子(sTF)の存在下又は不在下、即ちTF依存性又はTF非依存性のAT−III/ヘパリン複合体とFVIIaの間の相互作用の有効性を、基質、Mesyl−FPR−ACCに対するFVIIa/sTFの触媒活性における様々な濃度のAT−IIIの阻害のレベルを測定することによって評価した。試験したそれぞれのFVIIa変異体に関して、室温(〜25°)における30分のアッセイ中にFVIIa変異体の50%阻害に必要とされたAT−IIIのモル濃度(IC50)に相当する、K0.5の値を決定した。
FVIIa変異体のTFPIに対する抵抗性の決定
TFPIに対する様々なFVIIa変異体の抵抗性を、前述の実施例7中に記載したアッセイを使用して評価した。表21は、これらのアッセイの結果を与える。これらの結果は、野生型FVIIaと比較したTFPIに対するそれぞれのFVIIa変異体の抵抗性倍数として表す。
in vivoでのFVIIaポリペプチドの凝固促進活性の評価
血友病Aのマウスモデルを確立して、FVIIaポリペプチドの凝固促進活性を評価した。(実施例8中で前に記載したのと同様に)抗FVIII抗体の投与、次に尾の先端を外科手術により除去して出血を開始させることによって、CD−1マウスにおいて血友病Aを誘導した。FVIIIが欠損したマウス(FVIII−/−マウス)も使用したが、抗FVIII抗体で治療しなかった。次いでマウスをFVIIaポリペプチドで治療して、20分中に失われた血液の量を測定して、FVIIaポリペプチドの凝固促進活性を決定した。
初期実験を実施して、CD−1マウスにおいて血友病を誘導するために腹腔内経路によって与えたときの、必要とされた用量並びに抗ヒトFVIII抗体の影響の時間及び期間を決定した。抗FVIIIの第1ロット(ロット1;Affinity Biologicals、ロットIG129R4)に関して、これは最初は、実施例8中で前に記載したカニューレ挿入実験に使用した用量に基づいた。血友病状態(20分のアッセイ時間中の制御不能な出血)を引き起こすと決定した用量は、7.54mg/マウス(80μlの94.25mg/mlストック溶液)であった。このロットは、612マウスBU/mlの中和活性を有していた。抗ヒトFVIIIの第2ロット(ロット2;Affinity Biologicals、ロットIG1577R2、474マウスBU/mlの中和活性)に関して、使用した用量は11.98mg/マウス(120μlの99.8mg/mlストック溶液)であり、尾部切断6時間前に投与した。
FVIIIが欠損したマウス(FVIII−/−マウス)を使用する血友病Aのマウスモデルも使用して、マウスを抗FVIII抗体で治療しなかったこと以外は前に記載したのと同じプロトコルを使用して、FVIIaポリペプチドの凝固活性を評価した。
0.3、1、3及び6mg/kgでのFVIII−/−マウスにおけるNovoSeven(登録商標)及びCB553の凝固活性を評価するための用量応答試験を実施した。NovoSeven(登録商標)の実験では、媒体群中の血液消失は912.79±38.32μLであり、これは6及び3mg/kgでのNovoSeven(登録商標)治療によって有意に低減した(361.74±55.28μL及び586.98±60.56μLに;クラスカル−ワリス次にダンの事後検定を使用してp<0.05)。1mg/kgに用量を低減することによって674.84±46.88μLの血液消失をもたらし、且つ試験した最小用量ではその値は801.08±41.39μLであった。CB553の実験では、媒体対照群は904.08±15.38μLの血液消失をもたらした。これはCB553によって6mg/kgで451.04±74.17μLに有意に低減した(クラスカル−ワリス次にダンの事後検定を使用してp<0.05)。3mg/kgに用量を低減することによって695.75±60.50μLの血液消失値をもたらし、一方1及び0.3mg/kgにさらに用量を低下させることによって、媒体対照レベル及びその近辺の血液消失値をもたらした(それぞれ846.08±34.17μL及び936.43±31.39μL)。
可溶性組織因子との第VIIa因子結合の決定
HEK293又はBHK細胞から発現したFVIIa変異体の可溶性組織因子(sTF)と結合する能力を、Biacore表面プラズモン共鳴を使用して評価した。FVIIa変異体は、Biacore CM5チップと結合した2つの異なるレベルのsTFを使用して、2つの二連実験における3つのプロテアーゼ濃度での結合プロファイルの測定によって評価する。
TFPIに対する抵抗性に関するFVIIa変異体の表面プラズモン共鳴(SPR)スクリーニング
ヒト組換え可溶性TFPIによる阻害に対する様々なFVIIa変異体の相対的抵抗性を、Biacore T100装置を用いてハイスループット表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイを使用して評価した。TFPIによる阻害に対するFVIIa変異体の相対的抵抗性は、注入時間及びプロテアーゼ濃度の標準化の後に、結合した野生型FVIIaの量と比較した、Biacore CM5センサーチップに固定された可溶性TFPIと結合したFVIIa変異体の相対量の測定によって評価した。
活性部位滴定剤4−メチルウンベリフェリルp’−グアニジノ安息香酸(MUGB)を使用した触媒活性プロテアーゼの濃度の決定
ストック溶液中の触媒活性FVIIaの濃度を、4−メチルウンベリフェリルp’−グアニジノ安息香酸(MUGB)、トリプシン様セリンプロテアーゼの活性部位として発色する蛍光エステル基質で、複合体FVIIa及び可溶性組織因子(sTF)を滴定することによって決定した。このアッセイは、数個のわずかな改変でPayneら(Biochemistry(1996)35:7100〜7106ページ)によって記載されたのと本質的に同様に実施した。MUGBはFVII又は不活性プロテアーゼではなくFVIIaと容易に反応して、MUGBの濃度が飽和状態であり脱アシル化が非常に遅く触媒作用が律速である条件下で、効率よく安定状態になるアシル−酵素中間体を形成する。これらの条件下では、FVIIaプロテアーゼは1回の触媒代謝回転を経て、4−メチルウンベリフェロンフルオロフォア(4−MU)を放出する。初期の蛍光発生を4−MU蛍光の外部濃度標準曲線に調整すると、活性部位の濃度を計算することができる。
Claims (118)
- 第VII因子(FVII)ポリペプチド中の改変を含む改変FVIIポリペプチドであって、
改変が、配列番号3に示すアミノ酸の配列を有するFVIIポリペプチド中の位置D196、K197若しくはK199、又はFVIIポリペプチド中の対応する残基における前記位置と対応する位置にあり、
改変が、疎水性又は酸性アミノ酸による交換であり、
疎水性又は酸性アミノ酸が、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)、Tyr(Y)、Cys(C)、Asp(D)及びGlu(E)の中から選択される、
改変FVIIポリペプチド、その対立遺伝子及び種変異体又はその活性断片。 - FVIIポリペプチド中の改変が、D196F、D196W、D196L、D196I、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199D、及びK199Eの中から選択される、請求項1に記載の改変FVIIポリペプチド。
- FVIIポリペプチド中の改変がD196Y又はK197Yである、請求項1に記載の改変FVIIポリペプチド。
- FVIIポリペプチド中の別の位置におけるさらなる改変をさらに含む、請求項1又は2に記載の改変FVIIポリペプチド。
- さらなる改変がアミノ酸の交換、挿入又は欠失である、請求項4に記載の改変FVIIポリペプチド。
- さらなる改変が、D196、K197、K199、G237、T239、R290及びK341の中から選択される位置と対応する位置におけるアミノ酸の交換又は挿入であり、第1の改変及び第2の改変が異なるアミノ酸にある、請求項4又は5に記載の改変FVIIポリペプチド。
- さらなるアミノ酸改変が、D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D及びK341Qの中から選択される、請求項4又は5に記載の改変FVIIポリペプチド。
- さらなる改変が、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA及びK197I198insSの中から選択されるアミノ酸の挿入である、請求項5に記載の改変FVIIポリペプチド。
- D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、K196V/K197E、K197E/K341Q、K197L/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q及びK197E/K199E/K341Qの中から選択される改変を含む、請求項4〜8のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 配列番号3に示すアミノ酸の配列を有する第VII因子(FVII)ポリペプチド中のD196R、D196Y、D196F、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197E、K197D、K197L、K197M、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199D、K199E、G237W、G237I、G237V、R290M、R290V、K341M、K341D、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA又はK197I198insS、又はFVIIポリペプチド中の対応する残基における前記改変と対応するアミノ酸改変の中から選択される、FVIIポリペプチド中の改変を含む改変FVIIポリペプチド、その対立遺伝子若しくは種変異体又はその活性断片。
- FVIIポリペプチド中の別の位置におけるさらなる改変をさらに含む、請求項10に記載の改変FVIIポリペプチド。
- さらなる改変がアミノ酸の交換、挿入又は欠失である、請求項11に記載の改変FVIIポリペプチド。
- さらなる改変が、位置D196、K197、K199、G237、T239、R290及びK341の中から選択される位置と対応する位置における1つ又は複数のアミノ酸の交換であり、さらなる改変が、第1の改変と異なる位置にある、請求項11又は12に記載の改変FVIIポリペプチド。
- さらなるアミノ酸改変が、D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D、及びK341Qの中から選択される、請求項12に記載の改変FVIIポリペプチド。
- D196R/R290E、D196R/R290D、D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、K197L/K341Q、G237V/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q、K197E/K199E/K341Q及びK196V/K197Eの中から選択される改変を含む、請求項13に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 第VII因子(FVII)ポリペプチド中の2つ以上の改変を含む改変FVIIポリペプチドであって、
2つ以上のアミノ酸改変が、配列番号3に示すアミノ酸の配列を有するFVIIポリペプチド中のD196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D、K341Q、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA又はK197I198insS、又はFVIIポリペプチド中の対応する残基における前記改変に対応するアミノ酸改変の中から選択される、
改変FVIIポリペプチド、その対立遺伝子及び種変異体又はその活性断片。 - 2、3、4、5、6又は7つの改変を含有する、請求項15に記載の改変FVIIポリペプチド。
- D196R/R290E、D196K/R290E、D196R/R290D、D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、D196R/K197M/K199E/R290E、D196K/K197L、D196F/K197L、D196L/K197L、D196M/K197L、D196W/K197L、D196F/K197E、D196W/K197E、D196V/K197E、K197E/K341Q、K197L/K341Q、G237V/K341Q、K197E/G237V/K341Q、K197E/K199E、K197E/G237V、K199E/K341Q、K197E/K199E/K341Q及びK197E/G237V/M298Qの中から選択される改変を含む、請求項15又は16に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 非改変FVIIポリペプチドと比較して組織因子経路阻害因子(TFPI)に対する抵抗性の増大を示す、請求項1〜18のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- TFPIに対して(少なくとも約)1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%以上の抵抗性がある、請求項19に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 異種Glaドメイン、又はリン脂質結合を行うのに十分なその部分をさらに含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 異種Glaドメイン、又はリン脂質結合を行うのに十分なその部分を含む改変第VII因子(FVII)ポリペプチド。
- 十分な部分が、異種Glaドメインの30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上を含む、請求項21又は22に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 異種Glaドメインが、第IX因子(FIX)、第X因子(FX)、プロトロンビン、プロテインC、プロテインS、オステオカルシン、マトリックスGlaタンパク質、増殖停止特異的タンパク質6(Gas6)又はプロテインZ中のGlaドメインの中から選択される、請求項21又は22に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 異種Glaドメインが、配列番号110〜118、120及び121のいずれかに示すアミノ酸の配列、又はリン脂質結合を行うのに十分なその部分を有する、請求項21〜24のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 天然FVII Glaドメインの全部又は連続した部分が除去され、異種Glaドメイン、又はリン脂質結合を行うのに十分なその部分と交換されている、請求項21〜25のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 天然FVII Glaドメインが、配列番号3に示すアミノ酸の配列を有するFVIIポリペプチド中のアミノ酸1〜45、又はFVIIポリペプチド中の対応する残基における前記アミノ酸を含む、請求項26に記載の改変FVIIポリペプチド。
- GlaスワップFIX、GlaスワップFX、GlaスワップProtC、GlaスワップProtS、Glaスワップトロンビンの中から選択される改変を含む、請求項26又は27に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 非改変FVIIポリペプチドと比較してリン脂質の親和性又は結合の増大を示す、請求項21〜28のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- (少なくとも約)1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%以上のリン脂質の親和性又は結合の増大を示す、請求項29に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 非改変FVIIポリペプチドと比較して組織因子経路阻害因子(TFPI)に対する抵抗性の増大を示すさらなる改変を含有する、請求項21〜32のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- さらなる改変が、配列番号3に示すアミノ酸の配列を有するFVIIポリペプチド中のD196、K197、K199、G237、T239、R290、及びK341、又はFVIIポリペプチド中の対応する残基における前記位置の中から選択される位置における1つ又は複数のアミノ酸改変(複数可)である、請求項31に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 1つ又は複数のアミノ酸改変(複数可)が、D196K、D196R、D196A、D196Y、D196F、D196M、D196W、D196L、D196I、K197Y、K197A、K197E、K197D、K197L、K197M、K197I、K197V、K197F、K197W、K199A、K199D、K199E、G237W、G237T、G237I、G237V、T239A、R290A、R290E、R290D、R290N、R290Q、R290K、K341E、K341R、K341N、K341M、K341D、K341Q、G237T238insA、G237T238insS、G237T238insV、G237T238insAS、G237T238insSA、D196K197insK、D196K197insR、D196K197insY、D196K197insW、D196K197insA、D196K197insM、K197I198insE、K197I198insY、K197I198insA及びK197I198insSの中から選択される、請求項32に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 1つ又は複数のアミノ酸改変(複数可)が、D196R/R290E、D196K/R290E、D196R/R290D、D196R/K197E/K199E、D196K/K197E/K199E、D196R/K197E/K199E/R290E、D196R/K197M/K199E、及びD196R/K197M/K199E/R290Eの中から選択される、請求項33に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 配列番号3に示すアミノ酸の配列を有するFVIIポリペプチド中の位置Q176、M298若しくはE296、又はFVIIポリペプチド中の対応する残基における前記位置にある1つ又は複数のさらなるアミノ酸改変(複数可)を含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- アミノ酸改変が、Q176A、M298Q、E296V及びE296Aの中から選択される、請求項33に記載の改変FVIIポリペプチド。
- V158D/G237V/E296V/M298Q、K197E/G237V/M298Q、K197E/G237V/M298Q/K341Q、K197E/K199E/G237V/M298Q/K341Q、G237V/M298Q、G237V/M298Q/K341Q、M298Q/Gla Swap FIX、K197E/M298Q及びM298Q/K341Dの中から選択されるアミノ酸改変を含む、請求項36に記載の改変FVIIポリペプチド。
- アンチトロンビンIII(AT−III)に対する抵抗性の増大、リン脂質との結合及び/若しくは親和性の増大、組織因子(TF)に対する親和性の増大、固有活性の増大、TF依存性触媒若しくは凝固活性の増大、凝固活性の増大、酵素原性を変化させるポリペプチドの高次構造の変化、高度に活性なFVIIa高次構造と活性でないFVIIa高次構造との平衡を高度に活性な高次構造に有利に移動させることによる触媒若しくは凝固活性の増大、プロテアーゼに対する抵抗性の増大、グリコシル化の低下、グリコシル化の増大、免疫原性の低減、安定性の増大、並びに/又は化学基連結の容易化を起こす1つ又は複数のさらなるアミノ酸改変(複数可)を含む、請求項1〜37のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 酵素原性の変化が、より酵素原様の形状又はより酵素原様でない形状をもたらす、請求項38に記載の改変FVIIポリペプチド。
- S278C/V302C、L279C/N301C、V280C/V301C、S281C/V299C、位置4でのチロシンの挿入、F4S、F4T、P10Q、P10E、P10D、P10N、Q21N、R28F、R28E、I30C、130D、I30E、K32D、K32Q、K32E、K32G、K32H、K32T、K32C、K32A、K32S、D33C、D33F、D33E、D33K、A34C、A34E、A34D、A34I、A34L、A34M、A34V、A34F、A34W、A34Y、R36D、R36E、T37C、T37D、T37E、K38C、K38E、K38T、K38D、K38L、K38G、K38A、K38S、K38N、K38H、L39E、L39Q、L39H、W41N、W41C、W41E、W41D、I42R、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42N、I42S、I42A、I42Q、I42K、S43Q、S43N、Y44K、Y44C、Y44D、Y44E、S45C、S45D、S45E、D46C、A51N、S53N、G58N、G59S、G59T、K62E、K62R、K62D、K62N、K62Q、K62T、L65Q、L65S、L65N、F71D、F71Y、F71E、F71Q、F71N、P74S、P74A、A75E、A75D、E77A、E82Q、E82N、E82S、E82T T83K、N95S、N95T、G97S、G97T、Y101N、D104N、T106N、K109N、E116D、G117N、G124N、S126N、T128N、L141C、L141D、L141E、E142D、E142C、K143C、K143D、K143E、R144E、R144C、R144D、N145Y、N145G、N145F、N145M、N145S、N145I、N145L、N145T、N145V、N145P、N145K、N145H、N145Q、N145E、N145R、N145W、N145D、N145C、K157V、K157L、K157I、K157M、K157F、K157W、K157P、K157G、K157S、K157T、K157C、K157Y、K157N、K157E、K157R、K157H、K157D、K157Q、V158L、V158I、V158M、V158F、V158W、V158P、V158G、V158S、V158T、V158C、V158Y、V158N、V158E、V158R、V158K、V158H、V158D、V158Q、A175S、A175T、G179N、I186S、I186T、V188N、R202S、R202T、I205S、I205T、D212N、E220N、I230N、P231N、P236N、G237N、Q250C、V253N、E265N、T267N、E270N、A274M、A274L、A274K、A274R、A274D、A274V、A274I、A274F、A274W、A274P、A274G、A274T、A274C、A274Y、A274N、A274E、A274H、A274S、A274Q、F275H、R277N、F278S、F278A.F278N、F278Q、F278G、L280N、L288K、L288C、L288D、D289C、D289K、L288E、R290C、R290G、R290A、R290S、R290T、R290K、R290D、R290E、G291E、G291D、G291C、G291N、G291K、A292C、A292K、A292D、A292E、T293K、E296V、E296L、E296I、E296M、E296F、E296W、E296P、E296G、E296S、E296T、E296C、E296Y、E296N、E296K、E296R、E296H、E296D、E296Q、M298Q、M298V、M298L、M298I、M298F、M298W、M298P、M298G、M298S、M298T、M298C、M298Y、M298N、M298K、M298R、M298H、M298E、M298D、P303S、P303ST、R304Y、R304F、R304L、R304M、R304G、R304T、R304A、R304S、R304N、L305V、L305Y、L305I、L305F、L305A、L305M、L305W、L305P、L305G、L305S、L305T、L305C、L305N、L305E、L305K、L305R、L305H、L305D、L305Q、M306D、M306N、D309S、D309T、Q312N、Q313K、Q313D、Q313E、S314A、S314V、S314I、S314M、S314F、S314W、S314P、S314G、S314L、S314T、S314C、S314Y、S314N、S314E、S314K、S314R、S314H、S314D、S314Q、R315K、R315G、R315A、R315S、R315T、R315Q、R315C、R315D、R315E、K316D、K316C、K316E、V317C、V317K、V317D、V317E、G318N、N322Y、N322G、N322F、N322M、N322S、N322I、N322L、N322T、N322V、N322P、N322K、N322H、N322Q、N322E、N322R、N322W、N322C、G331N、Y332S、Y332A、Y332N、Y332Q、Y332G、D334G、D334E、D334A、D334V、D334I、D334M、D334F、D334W、D334P、D334L、D334T、D334C、D334Y、D334N、D334K、D334R、D334H、D334S、D334Q、S336G、S336E、S336A、S336V、S336I、S336M、S336F、S336W、S336P、S336L、S336T、S336C、S336Y、S336N、S336K、S336R、S336H、S336D、S336Q、K337L、K337V、K337I、K337M、K337F、K337W、K337P、K337G、K337S、K337T、K337C、K337Y、K337N、K337E、K337R、K337H、K337D、K337Q、K341E、K341Q、K341G、K341T、K341A、K341S、G342N、H348N、R353N、Y357N、I361N、F374P、F374A、F374V、F374I、F374L、F374M、F374W、F374G、F374S、F374T、F374C、F374Y、F374N、F374E、F374K、F374R、F374H、F374D、F374Q、V376N、R379N、L390C、L390K、L390D、L390E、M391D、M391C、M391K、M391N、M391E、R392C、R392D、R392E、S393D、S393C、S393K、S393E、E394K、P395K、E394C、P395D、P395C、P395E、R396K、R396C、R396D、R396E、P397D、P397K、P397C、P397E、G398K、G398C、G398D、G398E、V399C、V399D、V399K、V399E、L400K、L401K、L401C、L401D、L401E、R402D、R402C、R402K、R402E、A403K、A403C、A403D、A403E、P404E、P404D、P404C、P404K、F405K、P406C、K32N/A34S、K32N/A34T、F31N/D33S、F31N/D33T、I30N/K32S、I30N/K32T、A34N/R36S、A34N/R36T、K38N/F40S、K38N/F40T、T37N/L39S、T37N/L39T、R36N/K38S、R36N/K38T、L39N/W41S、L39N/W41T、F40N/I42S、F40N/I42T、I42N/Y44S、I42N/Y44T、Y44N/D46S、Y44N/D46T、D46N/D48S、D46N/D48T、G47N/Q49S、G47N/Q49T、K143N/N145S、K143N/N145T、E142N/R144S、E142N/R144T、L141N/K143S、L141N/K143T、I140N/E142S/、I140N/E142T、R144N/A146S、R144N/A146T、A146N/K148S、A146N/K148T、S147N/P149S/、S147N/P149T、R290N/A292S、R290N/A292T、D289N/G291S、D289N/G291T、L288N/R290S、L288N/R290T、L287N/D289S、L287N/D289、A292N/A294S、A292N/A294T、T293N/L295S、T293N/L295T、R315N/V317S、R315N/V317T、S314N/K316S、S314N/K316T、Q313N/R315S、Q313N/R315T、K316N/G318S、K316N/G318T、V317N/D319S、V317N/D319T、K341N/D343S、K341N/D343T、S339N/K341S、S339N/K341T、D343N/G345S、D343N/G345T、R392N/E394S、R392N/E394T、L390N/R392S、L390N/R392T、K389N/M391S、K389N/M391T、S393N/P395S、S393N/P395T、E394N/R396S、E394N/R396T、P395N/P397S、P395N/P397T、R396N/G398S、R396N/G398T、P397N/V399S、P397N/V399T、G398N/L400S、G398N/L400T、V399N/L401S、V399N/L401T、L400N/R402S、L400N/R402T、L401N/A403S、L401N/A403T、R402N/P404S、R402N/P404T、A403N/F405S、A403N/F405T、P404N/P406S及びP404N/P406Tの中から選択される1つ又は複数のさらなるアミノ酸改変(複数可)を含む、請求項1〜39のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 位置300〜322、305〜322、300〜312、若しくは305〜312と、トリプシン、トロンビン若しくはFXの対応するアミノ酸の置換、又は位置310〜329、311〜322若しくは233〜329と、トリプシンの対応するアミノ酸の置換を含む、請求項1〜40のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 非改変FVIIポリペプチドが、配列番号3に示すアミノ酸の配列を有する、請求項1〜41のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 配列番号18〜43、125〜146及び206〜250のいずれかに示すアミノ酸の配列を有する、請求項40に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 非改変FVIIポリペプチドが、配列番号3に示すポリペプチドの対立遺伝子又は種変異体である、請求項1〜43のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 対立遺伝子又は種変異体が、アミノ酸改変(複数可)を除外して、配列番号3に示すポリペプチドと40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有する、請求項44に記載の改変FVIIポリペプチド。
- ヒトポリペプチドである、請求項1〜45のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 非ヒトポリペプチドである、請求項1〜45のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 活性又は成熟ポリペプチドである、請求項1〜47のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 一次配列だけが改変されている、請求項1〜48のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 化学修飾又は翻訳後修飾をさらに含む、請求項1〜48のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- FVIIポリペプチドが、グリコシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、硫酸化、リン酸化、アルブミン化され、又はポリエチレングリコール(PEG)部分とコンジュゲートしている、請求項1〜50のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 単一鎖ポリペプチドである、請求項1〜51のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 二本鎖ポリペプチドである、請求項1〜51のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 活性であり、又は活性化されている、請求項1〜51のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 活性化が、自己活性化によるタンパク質分解性切断、第IX因子(FIXa)による切断、第X因子(FXa)による切断、第XII因子(FXIIa)による切断、又はトロンビンによる切断によって行われる、請求項54に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 非改変FVIIポリペプチドの1つ又は複数の活性を保持する、請求項1〜55のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 非改変FVIIポリペプチドの少なくとも1つのFVII活性を保持する限り、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50又は60個のアミノ酸の位置における改変を含む、請求項1〜55のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 非改変FVIIポリペプチドの活性の(少なくとも約)1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、300%、400%、500%以上を保持する、請求項56又は57に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 1つ又は複数の活性が、組織因子(TF)結合、第X因子(FX)活性化、第IX因子(FIX)活性化、リン脂質結合、及び凝固活性の中から選択される、請求項56〜58のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 保持されている活性が、非改変FVIIポリペプチドと比較して増大している、請求項56〜58のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 保持されている活性が、非改変FVIIポリペプチドと比較して低下している、請求項56〜59のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- 凝固活性が増大している、請求項1〜61のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 活性が、in vitro、in vivo又はex vivoで測定される、請求項56〜62のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
- 請求項1〜63のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含む核酸分子。
- 請求項64に記載の核酸分子を含むベクター。
- 原核生物ベクター、ウイルスベクター、又は真核生物ベクターである、請求項65に記載のベクター。
- 哺乳動物ベクターである、請求項65又は66に記載のベクター。
- ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、及びサイトメガロウイルスの中から選択される、請求項66に記載のベクター。
- 請求項65〜68のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
- 真核細胞である、請求項69に記載の細胞。
- 真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項70に記載の細胞。
- 哺乳動物細胞が、仔ハムスター腎細胞(BHK−21)又は293細胞又はCHO細胞の中から選択される、請求項71に記載の細胞。
- 改変FVIIポリペプチドを発現する、請求項69〜72のいずれか一項に記載の細胞。
- 酵母細胞である、請求項69に記載の細胞。
- ピキア属種細胞である、請求項74に記載の細胞。
- ピキア・パストリス細胞である、請求項75に記載の細胞。
- 請求項71〜76のいずれか一項に記載の細胞によって産生された改変FVIIポリペプチド。
- 薬学的に許容される媒体中に、治療に有効な濃度又は量の請求項1〜63及び77のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド、又は請求項64に記載の核酸分子又は請求項65〜68のいずれか一項に記載のベクター又は請求項69〜76のいずれか一項に記載の細胞を含む医薬組成物。
- 局部、全身、又は局所投与用に製剤される、請求項78に記載の医薬組成物。
- 経口、経鼻、肺、口腔、経皮、皮下、十二指腸内、経腸、非経口、静脈内、又は筋内投与用に製剤される、請求項78又は79に記載の医薬組成物。
- 制御放出用に製剤される、請求項78〜80のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 単回投与用に製剤される、請求項78〜81のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 請求項78〜82のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することにより対象を治療することを含む方法であって、対象が、FVII又は凝固促進物質の投与により治療される疾患又は状態を有する方法。
- 疾患又は状態が、酵素原又は活性型のFVIIの投与によって治療される、請求項83に記載の方法。
- 医薬組成物での治療が、疾患又は状態に伴う症状を改善又は緩和する、請求項83又は84に記載の方法。
- FVIIの投与又は他の凝固促進療法により治療される疾患又は状態に伴う症状の変化について対象をモニターすることをさらに含む、請求項83〜85のいずれか一項に記載の方法。
- 治療する疾患又は状態が、血液凝固障害、血液系障害、出血性障害、血友病、第VII因子欠損、出血障害、手術による出血、又は外傷から生じる出血の中から選択される、請求項83〜86のいずれか一項に記載の方法。
- 血友病が、血友病A又は血友病B又は血友病Cである、請求項87に記載の方法。
- 血友病が先天性である、請求項88に記載の方法。
- 血友病が後天性である、請求項88に記載の方法。
- 疾患又は状態が、手術又は外傷による出血性合併症に起因する、請求項83〜87のいずれか一項に記載の方法。
- 出血が、急性関節血症、慢性血友病性関節症、血腫、血尿、中枢神経系出血、胃腸出血、又は脳溢血として現れる、請求項91に記載の方法。
- 出血が抜歯に起因する、請求項91に記載の方法。
- 手術が、心臓手術、血管形成術、肺手術、腹部手術、脊髄手術、脳手術、血管手術、歯科手術、又は臓器移植手術である、請求項91に記載の方法。
- 移植手術が、骨髄、心臓、肺、膵臓、及び肝臓の移植の中から選択される、請求項94に記載の方法。
- 対象が、第VIII因子又は第IX因子に対する自己抗体を有する、請求項83〜95のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ又は複数のさらなる凝固因子を投与することをさらに含む、請求項83〜96のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ又は複数のさらなる凝固因子が、血漿精製又は組換え凝固因子、ビタミンK、ビタミンK誘導体やプロテインC阻害因子などの凝固促進物質、血漿、血小板、赤血球及びコルチコステロイドの中から選択される、請求項97に記載の方法。
- FVII又は凝固促進物質の投与により治療される疾患又は状態を治療する際に使用する、請求項1〜63及び77のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド。
- FVII又は凝固促進物質の投与により治療される疾患又は状態を治療するための医薬品の調製における、請求項78〜82のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
- 疾患又は状態が、酵素原又は活性型のFVIIの投与によって治療される、請求項99に記載の改変FVIIポリペプチド又は請求項100に記載の使用。
- 医薬組成物での治療が、疾患又は状態に伴う症状を改善又は緩和する、請求項99若しくは101に記載の改変FVIIポリペプチド又は請求項100若しくは101に記載の使用。
- FVIIの投与又は他の凝固促進療法により治療される疾患又は状態に伴う症状の変化について対象をモニターすることをさらに含む、請求項99、101若しくは102のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド又は請求項100〜102のいずれか一項に記載の使用。
- 治療する疾患又は状態が、血液凝固障害、血液系障害、出血性障害、血友病、第VII因子欠損、出血障害、手術による出血、又は外傷から生じる出血の中から選択される、請求項99及び101〜103のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド又は請求項100〜103のいずれか一項に記載の使用。
- 血友病が、血友病A又は血友病B又は血友病Cである、請求項104に記載の改変FVIIポリペプチド又は使用。
- 血友病が先天性である、請求項105に記載の改変FVIIポリペプチド又は使用。
- 血友病が後天性である、請求項105に記載の改変FVIIポリペプチド又は使用。
- 疾患又は状態が、手術又は外傷による出血性合併症に起因する、請求項104に記載の改変FVIIポリペプチド又は使用。
- 出血が、急性関節血症、慢性血友病性関節症、血腫、血尿、中枢神経系出血、胃腸出血、又は脳溢血として現れる、請求項104に記載の改変FVIIポリペプチド又は使用。
- 出血が抜歯に起因する、請求項108に記載の改変FVIIポリペプチド又は使用。
- 手術が、心臓手術、血管形成術、肺手術、腹部手術、脊髄手術、脳手術、血管手術、歯科手術、又は臓器移植手術である、請求項108に記載の改変FVIIポリペプチド又は使用。
- 移植手術が、骨髄、心臓、肺、膵臓、及び肝臓の移植の中から選択される、請求項111に記載の改変FVIIポリペプチド又は使用。
- 対象が、第VIII因子又は第IX因子に対する自己抗体を有する、請求項99及び101〜112のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド又は請求項100〜112のいずれか一項に記載の使用。
- 1つ又は複数のさらなる凝固因子を投与することをさらに含む、請求項99及び101〜112のいずれか一項に記載の改変FVIIポリペプチド又は請求項100〜113のいずれか一項に記載の使用。
- 1つ又は複数のさらなる凝固因子が、血漿精製又は組換え凝固因子、ビタミンK、ビタミンK誘導体やプロテインC阻害因子などの凝固促進物質、血漿、血小板、赤血球及びコルチコステロイドの中から選択される、請求項114に記載の改変FVIIポリペプチド又は使用。
- パッケージング材料及びパッケージング材料に入った請求項78〜82のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む製品。
- 改変FVIIポリペプチドが、FVIIが媒介する疾患又は状態の治療に有効であり、パッケージング材料が、FVIIが媒介する疾患又は状態の治療に改変FVIIポリペプチドが使用されることを示すラベルを含む、
請求項116に記載の製品。 - 請求項78〜82のいずれか一項に記載の医薬組成物、組成物を投与するためのデバイス、及び任意選択で投与についての説明書を含むキット。
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