ES2537328T3

ES2537328T3 - Polipéptidos de factor VII modificados y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2537328T3
Application number: ES08742852.0T
Authority: ES
Inventors: Edwin L. Madison; Christopher D. Thanos; Sandra Waugh Ruggles; Shaun Coughlin
Original assignee: Catalyst Biosciences Inc
Current assignee: Gyre Therapeutics Inc
Priority date: 2007-04-13
Filing date: 2008-04-11
Publication date: 2015-06-05
Anticipated expiration: 2028-04-11
Also published as: HN2009002098A; GT200900268A; JP2016155836A; SV2009003393A; RU2571931C2; US20090098103A1; WO2008127702A3; KR20100016462A; ZA200906854B; DK2147096T3; EP2147096B1; CO6231052A2; RU2009141510A; UA101155C2; EP2481797A1; JP2014042523A; NZ579985A; SG174077A1; NZ593611A; NI200900187A

Abstract

Un polipéptido del factor VII (FVII) modificado, que comprende: un domino Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para efectuar unión con fosfolípidos, por lo que el polipéptido de FVII modificado muestra afinidad o unión con fosfolípidos aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado que no contiene el dominio Gla heterólogo, donde: la parte suficiente contiene 30 o más aminoácidos contiguos del dominio Gla heterólogo; y el dominio Gla heterólogo se selecciona de entre un dominio Gla en el factor IX (FIX), Factor X (FX), protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína específica de detención del Crecimiento 6 (Gas6) y proteína Z; y una o más modificaciones de aminoácidos adicionales que aumentan la resistencia a antitrombina III (AT-III), aumentan la afinidad por el factor tisular (FT), aumentan la actividad intrínseca, aumentan la actividad catalítica o coagulante dependiente de FT, aumentan la actividad coagulante, alteran la conformación del polipéptido para alterar la zimogenicidad, aumentan la actividad catalítica o coagulante desplazando el equilibrio entre conformaciones de FVIIa altamente activo y menos activo a favor de las conformaciones altamente activas, aumentan la resistencia a proteasas, reducen la glucosilación, aumentan la glucosilación, reducen la inmunogenicidad, aumentan la estabilidad y/o facilitan el enlace de grupos químicos.

Description

Polipéptidos de factor VII modificados y usos de los mismos

Campo de la invención 5

Se proporcionan proteínas terapéuticas modificadas. En particular se proporcionan polipéptidos del Factor VII modificados, que incluyen el Factor VIIa y otras formas de Factor VII y usos de los mismos.

Antecedentes 10

La hemostasis es el proceso fisiológico complejo que conduce al cese de la hemorragia. Las plaquetas, las proteínas del plasma, los vasos sanguíneos y las células endoteliales son los tres componentes de este proceso que desempeñan cada uno un papel importante en los acontecimientos que siguen inmediatamente a lesión tisular y que, en circunstancias normales, da como resultado la formación rápida de un coágulo. Es vital para esto la cascada 15 de coagulación, una serie de acontecimientos proteolíticos en los que ciertas proteínas del plasma (o factores de coagulación) se activan secuencialmente en una “cascada” por otro factor de coagulación previamente activado, lo que conduce a la rápida generación de trombina. Las grandes cantidades de trombina producidas en esta cascada actúan después para escindir fibrinógeno en los péptidos de fibrina que se requieren para la formación del coágulo.

Los factores de coagulación circulan como zimógenos monocatenarios inactivos, y se activan por escisión en una o más posiciones para generar una forma activada bicatenaria de la proteína. El factor VII (FVII), una proteína del plasma dependiente de vitamina K, circula inicialmente en la sangre como un zimógeno. El zimógeno FVII se activa por escisión proteolítica en un solo sitio, Arg152-Ile153, dando como resultado una proteína de dos cadenas que están unidas por un solo enlace disulfuro (FVIIa). El FVIIa se une con su cofactor, el factor tisular (FT), para formar un 25 complejo en el que el FVIIa puede activar eficazmente el factor X (FX) al FXa, iniciando de este modo la serie de acontecimientos que dan como resultado la formación de fibrina y la hemostasis.

Aunque en la mayoría de los casos se consigue hemostasis normal, los defectos en el proceso pueden conducir a trastornos hemorrágicos en los que se prolonga el tiempo que tarda en formarse el coágulo. Dichos trastornos 30 pueden ser congénitos o adquiridos. Por ejemplo, la hemofilia A y B son enfermedades hereditarias caracterizadas por déficits del factor VIII (FVIII) y del factor IX (FIX), respectivamente. La terapia de reemplazo es el tratamiento tradicional para la hemofilia A y B, e implica la administración intravenosa de FVIII o FIX, bien preparado a partir de plasma humano o bien como proteínas recombinantes. En muchos casos, sin embargo, los pacientes desarrollan anticuerpos (también conocidos como inhibidores) contra las proteínas infundidas, que reducen o anulan la eficacia 35 del tratamiento. El FVIIa recombinante (Novoseven®) se ha aprobado para el tratamiento de pacientes con hemofilia A o B que tienen inhibidores contra FVIII o FIX, y también se usa para detener episodios hemorrágicos o prevenir la hemorragia asociada con el traumatismo y/o la cirugía. El FVIIa recombinante también se ha aprobado para el tratamiento de pacientes con déficit congénito de FVII, y en pacientes no hemofílicos, se está utilizando cada vez más en usos no contemplados, tales como el tratamiento de la hemorragia asociada con otros trastornos 40 hemorrágicos congénitos o adquiridos, traumatismo y cirugía.

El uso de FVIIa recombinante para promover la formación de coágulos subraya su creciente importancia como un agente terapéutico. La terapia con FVIIa deja sin satisfacer necesidades médicas significativas. Por ejemplo, basándose en los datos de ensayo clínico, se requiere un promedio de 3 dosis de FVIIa durante un periodo de 45 tiempo de 6 horas o más para tratar episodios de hemorragia aguda en pacientes con hemofilia. Se necesitan variantes más eficaces de FVIIa para reducir estos requisitos. Por lo tanto, entre los objetos del presente documento, un objeto es proporcionar polipéptidos de FVII modificados que se diseñan para que tengan propiedades terapéuticas mejoradas.

El documento WO 2004/083661 proporciona variantes de FVII o FVIIa que comprenden al menos una modificación de aminoácido en la posición 196, 237 o 341 en relación con hFVII o hFVIIa. Las variantes muestran una actividad de coagulación aumentada, es decir tiempo de coagulación reducido, en comparación con rhFVIIa.

El documento WO 2004/111242 proporciona variantes de dominio Gla del Factor VII humano o del Factor VIIa 55 humano, que comprenden 1-15 modificaciones de aminoácidos en relación con el Factor VII humano o Factor VIIa humano, en las que se ha introducido un resto de aminoácido hidrófobo por sustitución en la posición 34, o que tienen una sustitución de aminoácido en la posición 36, o que tienen sustituciones de aminoácidos en las posiciones 10 y 32 y al menos una sustitución de aminoácido adicional en una posición seleccionada de 74, 77 y 116.

Sumario

En una primera realización la invención proporciona un polipéptido de factor VII (FVII) modificado, que comprende: un dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para efectuar la unión fosfolipídica, mediante la cual el polipéptido de FVII modificado muestra afinidad o unión con fosfolípidos aumentada en comparación con un 65 polipéptido FVII no modificado que no contiene el dominio Gla heterólogo en el que: la parte suficiente contiene 30 o

más aminoácidos contiguos del dominio Gla heterólogo, y el dominio Gla heterólogo se selecciona de entre un dominio Gla en el Factor IX (FIX), Factor X (FX), protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína específica de detención del crecimiento 6 (Gas6) y proteína Z; y una o más modificaciones de aminoácidos adicionales que aumentan la resistencia a antitrombina III (AT-III), aumentan la afinidad por el factor tisular (FT), aumentan la actividad intrínseca, aumentan la actividad catalítica o coagulante dependiente de FT, aumentan la 5 actividad coagulante, alteran la formación del polipéptido para alterar la cimogenicidad, aumentan la actividad catalítica o coagulante desplazando el equilibrio entre conformaciones de FVIIa altamente activas y menos activas a favor de las conformaciones altamente activas, aumenta la resistencia a proteasas, reducen la glucosilación, aumentan la glucosilación, reducen la inmunogenicidad, aumentan la estabilidad y/o facilitan enlace de grupos químicos. 10

En una realización adicional la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de FVII modificado , un vector recombinante de dicho nucleótido y una célula que comprende dicho vector.

En una realización adicional la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una concentración terapéuticamente eficaz o cantidad de dicho polipéptido FVII modificado, molécula de ácido nucleico, vector o célula en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En una realización adicional la invención proporciona dicho polipéptido de FVII modificado para su uso en el 20 tratamiento de una enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un procoagulante.

En una realización adicional la invención proporciona el uso de dicha composición farmacéutica en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un procoagulante. 25

En el presente documento se proporcionan polipéptidos del Factor VII (FVII) modificados. En particular, en el presente documento se proporcionan polipéptidos de FVII modificados que muestran actividades procoagulantes. Los polipéptidos de FVII se modifican en su secuencia primaria en comparación con un polipéptido de FVII no modificado, y pueden incluir inserciones, deleciones y reemplazos de aminoácidos. Los polipéptidos de FVII 30 modificados proporcionados en el presente documento incluyen polipéptidos de FVII que muestran resistencia aumentada a los efectos inhibidores del inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT), resistencia aumentada a los efectos inhibidores de antitrombina III (AT-III), reducción de la unión de Zn2+, aumento de las propiedades farmacocinéticas, tales como semivida aumentada, actividad catalítica aumenta en presencia y/o ausencia de FT y/o unión aumentada a plaquetas activadas. Los polipéptidos de FVII modificados pueden contener cualquier 35 combinación de modificaciones proporcionadas en el presente documento, por las que una o más actividades o propiedades del polipéptido están alteradas en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Típicamente el polipéptido de FVII modificado conserva la actividad procoagulante. En el presente documento también se proporcionan moléculas de ácido nucleico, vectores y células que codifican/expresan polipéptidos de FVII modificados. En el presente documento también se proporcionan composiciones farmacéuticas, artículos de 40 fabricación, kits y métodos de tratamiento. Los polipéptidos de FVII incluyen variantes alélicas y de especie y polipéptidos y otras variantes que tienen modificaciones que afectan a otras actividades y/o propiedades. También se incluyen fragmentos activos de los polipéptidos de FVII que incluyen una modificación proporcionada en el presente documento. Son ejemplos de polipéptidos de FVII los que incluyen la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3, así como variantes de la misma que tienen 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 91 45 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con la misma.

Los polipéptidos de factor VII (FVII) se modifican en su secuencia primaria en comparación con un polipéptido de FVII no modificado, y pueden incluir inserciones, deleciones y reemplazos de aminoácidos. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento incluyen polipéptidos de FVII que muestran resistencia 50 aumentada a los efectos inhibidores de IRFT, resistencia aumentada a los efectos inhibidores de AT-III, reducción de la unión de Zn2+, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida aumentada, actividad catalítica aumentada en presencia y/o ausencia de FT (factor tisular) y/o unión con plaquetas activadas aumentada. Los polipéptidos de FVII modificados pueden contener cualquier combinación de modificaciones proporcionadas en el presente documento, mediante las cuales una o más actividades o propiedades del polipéptido están alteradas en 55 comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Los polipéptidos de FVII pueden incluir otras modificaciones que alteran otras propiedades y/o actividades. Típicamente, el polipéptido de FVII modificado conserva la actividad procoagulante. En el presente documento también se proporcionan moléculas de ácido nucleico, vectores y células que codifican/expresan polipéptidos de FVII modificados. En el presente documento también se proporcionan composiciones farmacéuticas, artículos de fabricación, kits y métodos de tratamiento. 60

En particular, se proporcionan polipéptidos de factor VII (FVII) modificados, variantes alélicas y de especie de los mismos o fragmentos activos u otras variantes de los mismos. En el presente documento se proporcionan polipéptidos de FVII, incluyendo variantes alélicas y de especie de los mismos o fragmentos activos de los mismos, que contienen una modificación que está en una posición correspondiente a la posición D196, K197 o K199 en un 65 polipéptido de FVII con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3, o en restos correspondientes en

un polipéptido de FVII, incluyendo variantes alélicas y de especie del mismo, fragmentos activos y otros polipéptidos de FVII modificados para otras actividades o propiedades. Los polipéptidos de FVII contienen al menos una modificación en una posición correspondiente a las posiciones D196, K197 o K199 en un polipéptido de FVII que contiene una secuencia de aminoácidos como se expone en SEC ID Nº: 3 o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII. La modificación es una inserción y/o un reemplazo por un aminoácido hidrófobo o ácido 5 seleccionado de entre Val (V), Leu (L), Ile (I), Phe (F), Trp (W), Met (M), Tyr (Y), Cys (C), Asp (D) y Glu (E). Cuando se proporciona un fragmento activo, el fragmento activo incluye dicha modificación. Por ejemplo, se proporcionan polipéptidos de factor VII (FVII) modificados, variantes alélicas y de especie de los mismos o fragmentos activos u otras variantes de los mismos que también incluyen un remplazo seleccionado de entre D196F, D196W, D196L, D196I, D196Y, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199D, K199E y K197Y. 10

Adicionalmente, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados pueden contener una modificación adicional, incluyendo un reemplazo, una inserción o una deleción de aminoácidos, en otra posición en el polipéptido de FVII. En algunos ejemplos, la modificación adicional es un reemplazo de un aminoácido en una posición correspondiente a una posición seleccionada de entre D196, K197, K199, G237, T239, R290 y K341, en el que la primera 15 modificación y la segunda modificación están en aminoácidos diferentes. Estas modificaciones pueden incluir, pero sin limitación D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D y K341Q. Otros ejemplos de modificaciones que son inserciones de aminoácidos, tales como, pero sin limitación, cualquiera de las siguientes 20 inserciones: G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA y K197I198insS. Otros polipéptidos de FVII modificados ejemplares incluyen las siguientes modificaciones: D196R/K197E/K199E, D196K/K197E/K199E, D196R/K197E/K199E/R290E, D196R/K197M/K199E, D196R/K197M/ K199E/R290E, D196K/K197L, D196F/ K197L, D196L/K197L, D196M/K197L, D196W/K197L, 25 D196F/K197E, D196W/K197E, K196V/K197E, K197E/K341Q, K197L/K341Q, K197E/G237V/K341Q, K197E/K199E, K197E/G237V, K199E/K341Q o K197E/K199E/K341Q.

También se proporcionan polipéptidos de FVII modificados, incluyendo variantes alélicas y de especie de los mismos o fragmentos activos u otras variantes de los mismos, que también pueden contener modificaciones de aminoácidos 30 correspondientes a una cualquiera o más de D196R, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197E, K197D, K197L, K197M, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199D, K199E, G237W, G237I, G237V, R290M, R290V, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA o K197I198insS en un polipéptido de FVII que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC 35 ID Nº: 3 o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII. Adicionalmente, estos polipéptidos de FVII modificados pueden contener una modificación adicional, incluyendo un reemplazo, una inserción o una deleción de un aminoácido en otra posición en el polipéptido de FVII. En algunos ejemplos, la modificación adicional puede ser un reemplazo de un aminoácido en una posición correspondiente a una posición D196, K197, K199, G237, T239, R290 y K341, en el que la modificación adicional es una posición diferente de la primera modificación. Por ejemplo, 40 el polipéptido de FVII modificado puede contener adicionalmente un reemplazo de un aminoácido seleccionado de entre D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196M, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D y K341Q. Son ejemplos de dichos polipéptidos de FVII modificados los que incluyen modificaciones seleccionadas de entre D196R/R290E, 45 D196R/R290D, D196R/K197E/K199E, D196K/K197E/K199E, D196E/K197E/K199E/R290E, D196R/K197M/K199E, D196R/K197M/K199E/R290E, D196K/K197L, D196F/K197L, D196L/K197L, D196M/K197L, D196W/K197L, D196F/K197E, D196W/K197E, K197L/K341Q, G237V/K341Q, K197E/G237V/K341Q, K197E/K199E, K197E/G237V, K199E/K341Q, K197E/K199E/K341Q y K196V/K197E.

En algunos casos, un polipéptido del factor VII (FVII) modificado, incluyendo variantes alélicas y de especie del mismo o fragmentos activos del mismo u otras variantes del mismo pueden incluir dos o más modificaciones en un polipéptido de FVII, en el que al menos dos de las modificaciones de aminoácidos corresponden a D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196M, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, 55 R290N, R290Q, R290K, K341E, K341 R, K341N, K341M, K341D, K341Q, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA o K197I198insS en un polipéptido de FVII que tiene o que incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII. El polipéptido puede incluir más de dos modificaciones tales como 2, 3, 60 4, 5, 6 o 7 modificaciones.

Son ejemplos de estos polipéptidos de FVII que incluyen comprenden modificaciones seleccionadas de entre D196R/R290E, D196K/R290E, D196R/R290D, D196R/ K197E/K199E, D196K/K197E/K199E, D196R/ K197E/K199E/R290E, D196R/K197M/K199E, D196R/K197M/K199E/R290E, D196K/K197L, D196F/ K197L, 65 D196L/K197L, D196M/K197L, D196W/ K197L, D196F/K197E, D196W/K197E, D196V/K197E, K197E/K341Q,

K197L/K341Q, G237V/K341Q, K197E/G237V/K341Q, K197E/K199E, K197E/G237V, K199E/K341Q, K197E/K199E/K341Q y K197E/G237V/M298Q.

Cualquiera de los polipéptidos de FVII modificados anteriormente mencionados pueden mostrar resistencia aumentada al inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT) en comparación con el polipéptido de FVII no modificado. 5 En algunos ejemplos, el polipéptido de FVII modificado es al menos aproximadamente, o es, un 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más, resistente al IRFT. Adicionalmente, estos polipéptidos de FVII modificados también pueden contener un domino Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para efectuar la unión a fosfolípidos. 10

En el presente documento también se proporcionan polipéptidos de FVII modificados que contienen un dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo, tal como 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o más, del domino Gla heterólogo, para efectuar la unión a fosfolípidos. Todos y cada uno de los polipéptidos de FVII modificados anteriormente indicados pueden incluir también un 15 intercambio de Gla, incluyendo intercambios de Gla como se ejemplifican y describen en el presente documento.

Un domino Gla heterólogo puede seleccionarse de los dominios Gla de Factor IX (FIX), Factor X (FX), protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína de matriz Gla, proteína específica de detención de Crecimiento 6 (Gas6) o proteína Z. En algunos ejemplos, el dominio Gla heterólogo en el polipéptido de FVII modificado 20 proporcionado en el presente documento tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEC ID Nº: 110-115, 117 y 118, o una parte suficiente del mismo para efectuar unión a fosfolípidos. Las modificaciones del polipéptido de FVII pueden efectuarse retirando toda o una parte contigua del dominio Gla de FVII nativo, que puede incluir los aminoácidos 1-45 en un polipéptido de FVII que tiene o que incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3, o en los restos correspondientes en un polipéptido de FVII, y reemplazándola con el 25 dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para afectar a la unión a fosfolípidos, tal como para aumentarla. Dichas modificaciones pueden dar como resultado el polipéptido de FVII modificado que muestra unión a fosfolípidos aumentada en comparación con el polipéptido de FVII no modificado. Por ejemplo, el polipéptido de FVII modificado puede mostrar al menos aproximadamente o 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 30 %, 300 %, 400 %, 500 % o más unión a fosfolípidos aumentada.

Los polipéptidos de FVII modificados pueden tener todo o una parte contigua del dominio Gla de FVII nativo retirado y reemplazado con el dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para efectuar unión a fosfolípidos. Son ejemplos de dichos polipéptidos en los que el dominio Gla de FVII nativo incluye los aminoácidos 1-45 en un 35 polipéptido de FVII que tiene o incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3, o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII. Las modificaciones de Gla incluyen, pero sin limitación, modificaciones entre un Intercambio entre Gla y FIX, Intercambio entre Gla y FX, Intercambio entre Gla y Prot C, Intercambio entre Gla y Prot S e Intercambio entre Gla y Trombina.

En virtud de un intercambio de Gla el polipéptido de FVII modificado puede mostrar unión a fosfolípidos aumentada. Dicho aumento puede ser de al menos aproximadamente o 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más, de unión a fosfolípidos aumentada.

Los polipéptidos de FVII modificados que contienen dominios Gla heterólogos pueden contener modificaciones adicionales en posiciones que dan como resultado o muestran resistencia aumentada al inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT) en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Son ejemplos de dichas modificaciones una o más modificaciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas de entre D196, K197, K199, G237, T239, R290 y K341 en un polipéptido de FVII que tiene o que incluye una secuencia de aminoácidos expuesta 50 en SEC ID Nº: 3 o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII. Específicamente, dichas modificaciones pueden incluir una o más modificaciones de aminoácidos seleccionadas de entre D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196M, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341 R, K341N, K341M, K341D, K341Q, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, 55 G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA y K197I198insS. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados que contienen un dominio Gla heterólogo también pueden contener los reemplazos y/o inserciones de aminoácidos tales como, pero sin limitación, D196R/R290E, D196K/R290E, D196R/R290D, D196R/K197E/K199E, D196K/K197E/K199E, D196R/K197E/K199E/R290E, D196R/ K197M/ K199E, y 60 D196R/K197M/K199E/R290E.

En algunos casos, dichas modificaciones adicionales dan como resultado una resistencia aumentada al IRFT del polipéptido modificado en comparación con el polipéptido de FVII que no contiene la modificación, es decir el polipéptido de FVII no modificado. 65

Cualquiera de los polipéptidos de FVII modificados descritos anteriormente, incluyendo los que muestran resistencia aumentada al IRFT o unión aumentada a fosfolípidos, o cualquier combinación de los mismos, pueden contener adicionalmente otras modificaciones, incluyendo cualquiera descrita en la técnica. Dichas modificaciones de aminoácidos adicionales pueden aumentar la resistencia a antitrombina III (AT-III), aumentar la unión y/o afinidad a fosfolípidos, aumentar la afinidad por el factor tisular (FT), aumentar la actividad intrínseca, alterar la conformación 5 de los polipéptidos para alterar la cimogenicidad, incluyendo alterar la conformación a una forma más de tipo zimógeno o a una forma menos de tipo zimógeno, aumentar la resistencia a proteasas, reducir la glucosilación, aumentar la glucosilación, reducir la inmunogenicidad, aumentar la estabilidad y/o facilitar el enlace de grupos químicos. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden contener una o más modificaciones en la posición Q176, M298 o E296 en un polipéptido de FVII que tiene o que 10 incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII. En algunos ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados pueden contener adicionalmente modificaciones de aminoácidos de entre Q176A, M298Q, E296V y/o E296A. En otros ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados pueden contener adicionalmente, además del intercambio de Gla y/u otras modificaciones observadas, una o más de las siguientes modificaciones de aminoácidos adicionales: S278C/V302C, L279C/N301C, V280C/V301C, 15 S281C/V299C, inserción de una tirosina en la posición 4, F4S, F4T, P10Q, P10E, P10D, P10N, Q21N, R28F, R28E, I30C, I30D, I30E, K32D, K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32C, K32A, K32S, D33C, D33F, D33E, D33K, A34C, A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, T37C, T37D, T37E, K38C, K38E, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, L39E, L39Q, L39H, W41N, W41C, W41E, W41D, I42R, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42K, S43Q, S43N, Y44K, Y44C, Y44D, Y44E, S45C, S45D, S45E, D46C, A51N, 20 S53N, G58N, G59S, G59T, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, L65N, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, E82S, E82T T83K, N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, K109N, E116D, G117N, G124N, S126N, T128N, LY41C, L141D, L141E, E142D, E142C, K143C, K143D, K143E, R144E, R144C, R144D, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, 25 K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, Q250C, V253N, E265N, T267N, E270N, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, 30 A274Q, F275H, R277N, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, L280N, L288K, L288C, L288D, D289C, D289K, L288E, R290C, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R290D, R290E, G291E, G291D, G291C, G291N, G291K, A292C, A292K, A292D, A292E, T293K, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, 35 P303S, P303T, R304Y, R304F, R304L, R304M, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, Q312N, Q313K, Q313D, Q313E, S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C, 40 V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, 45 K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A, K341S, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, V376N, R379N, L390C, L390K, L390D, L390E, M391D, M391C, M391K, M391N, M391E, R392C, R392D, R392E, S393D, S393C, S393K, S393E, E394K, P395K, E394C, P395D, P395C, P395E, R396K, R396C, R396D, 50 R396E, P397D, P397K, P397C, P397E, G398K, G398C, G398D, G398E, V399C, V399D, V399K, V399E, L400K, L401K, L401C, L401D, L401E, R402D, R402C, R402K, R402E, A403K, A403C, A403D, A403E, P404E, P404D, P404C, P404K, F405K, P406C, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S, Y44N/ D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, 55 G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S/, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/ K316S, S314N/ K316T, Q313N/R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, 60 K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/D343S, K341N/ D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/ R392S, L390N/ R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, 65 A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S y P404N/P406T, V1858D/G237V/E296V/M298Q,

K197E/G237V/M298Q, K197E/G237V/M298Q/K341Q, K197E/K199E/G237V/M298Q/K341Q, G237V/M298Q, G237V/M298Q/K341Q, M298Q/Intercambio de Gla FIX, K197E/M298Q y M298Q/K341D.

Cualquiera de los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento puede contener una o más modificaciones de aminoácidos adicionales que aumentan la resistencia a antitrombina III (AT-III), aumenta la 5 unión y/o afinidad con fosfolípidos, aumenta la afinidad por el factor tisular (FT), aumenta la actividad intrínseca, altera la conformación del polipéptido para alterar la cimogenicidad, aumenta la resistencia a proteasas, reduce la glucosilación, aumenta la glucosilación, reduce la inmunogenicidad, aumenta la estabilidad, y/o facilita el enlace de grupos químicos. Por ejemplo, la cimogenicidad alterada puede conferir una forma más de tipo zimógeno o una forma menos de tipo zimógeno. Dichos polipéptidos de FVII modificados, por ejemplo, pueden incluir sustitución de 10 las posiciones 300-322, 305-322, 300-312 o 305-312 con los aminoácidos correspondientes de tripsina, trombina o FX, o sustitución de las posiciones 310-329, 311-322 o 233-329 con los aminoácidos correspondientes de tripsina.

Los polipéptidos modificados proporcionados en el presente documento incluyen aquellos en los que el polipéptido de FVII no modificado contiene solamente o incluye una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3. Los 15 polipéptidos de FVII modificados ejemplares son polipéptidos que tienen o incluyen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEC ID Nº: 18-43, 125-150 y 206-250 o variantes alélicas o de especie de las mismas u otras variantes de las mismas. La variante alélicas o de especie u otra variante puede tener 40 %, 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 88 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más identidad de secuencia con el polipéptido expuesto en SEC ID Nº: 3, excluyendo la modificación o las modificaciones de 20 aminoácidos. Las fuentes de polipéptidos de FVII incluyen seres humanos y otras especies no humanas. Los polipéptidos pueden ser polipéptidos maduros o polipéptidos precursores. En algunas realizaciones, solamente se modifica la secuencia primaria del polipéptido de FVII. Además, los polipéptidos de FVII pueden incluir una modificación química o una modificación postraduccional, tal como, pero sin limitación, glucosilación, carboxilación, hidroxilación, sulfonación, fosforilación, albuminación o conjugación con otro resto, tal como un resto de 25 polietilenglicol (PEG).

Los polipéptidos de FVII modificados pueden proporcionarse como polipéptidos monocatenarios o como mezclas de formas monocatenarias y bicatenarias o múltiples cadenas, o como formas bicatenarias, tricatenarias u otras de múltiples cadenas. Los polipéptidos de FVII modificados pueden proporcionarse como polipéptidos inactivos o como 30 activados. La activación puede efectuarse, por ejemplo, por escisión proteolítica mediante autoactivación, por escisión mediante el Factor IX (FIXa), por escisión mediante el Factor X (FXa), por escisión mediante el Factor XII (FXIIa) o por escisión mediante trombina.

Los polipéptidos de FVII modificados típicamente conservan una o más actividades o propiedades del polipéptido de 35 FVII no modificado. Las modificaciones pueden incluir modificaciones en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 60 posiciones de aminoácidos siempre que el polipéptido conserve al menos una actividad de FVII del polipéptido de FVII no modificado. La conservación de la actividad puede ser de al menos aproximadamente o 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más de la actividad del polipéptido de FVII no modificado. Las actividades incluyen, por ejemplo, 40 unión con el factor tisular (FT), activación del factor X (FX), activación del Factor IX (FIX), unión a fosfolípidos y actividad de coagulación. Las actividades pueden aumentarse o reducirse. Entre los polipéptidos modificados proporcionados en el presente documento están aquellos en los que se aumenta la actividad de coagulación. La actividad puede evaluarse in vitro o in vivo.

También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que incluyen una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los polipéptidos de FVII modificados. También se proporcionan vectores, tales como vectores procariotas o vectores eucariotas, incluyendo vectores de mamífero y vectores virales. Los vectores virales ejemplares incluyen un adenovirus, un virus adenoasociado, un retrovirus, un herpesvirus, un lentivirus, un poxvirus y un vector de citomegalovirus. También se proporcionan células que contienen las moléculas de ácido nucleico o 50 los vectores. Las células pueden ser eucariotas, tales como células de mamífero o de levadura, o células procariotas. Las células de mamífero incluyen, por ejemplo, células de riñón de cría de hámster (BHK-21) o células 293 y células CHO. Las células pueden cultivarse en condiciones en las que se expresa el polipéptido de FVII modificado. Este puede secretarse. Se proporciona el polipéptido de FVII modificado producido por dichas células.

También se proporcionan composiciones que contienen los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento. En particular, se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen dichos polipéptidos. Las composiciones pueden contener la concentración o cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de FVII modificado, o una molécula de ácido nucleico o un vector o una célula proporcionado en el presente documento en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden 60 formularse para una administración de dosificación individual o de dosificación múltiple. La composición farmacéutica puede estar en cualquier forma, tal como un líquido, gel o sólido, y proporcionarse en cápsulas, recipientes y otros vehículos adecuados. Pueden formularse para la dilución antes de la administración o en cualquier forma adecuada. La cantidad puede depender del trastorno tratado y/o del individuo tratado y, si es necesario, puede determinarse de forma empírica. La composición farmacéutica puede formularse para cualquier vía 65 de administración, incluyendo, por ejemplo, administración local, sistémica o tópica, o formularse para administración

oral, nasal, pulmonar, bucal, transdérmica, subcutánea, intraduodenal, entérica, parenteral, intravenosa o intramuscular. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para liberación controlada.

También se proporcionan métodos de tratamiento y usos de las composiciones para el tratamiento. Las composiciones farmacéuticas se administran o se formulan para su administración a un sujeto que tiene una 5 enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII, incluyendo el tratamiento por administración de FVII activo (FVIIa). El tratamiento con la composición farmacéutica alivia o mejora los síntomas asociados con la enfermedad o afección. La administración puede realizarse después, o estar acompañada de, un control de un sujeto con respecto a cambios en los síntomas asociados con la enfermedad o afección mediada por FVII. Las enfermedades o afecciones tratadas incluyen, pero sin limitación, trastornos de la coagulación sanguínea, trastornos 10 hematológicos, trastornos hemorrágicos, hemofilias, déficit del factor FVII y trastornos de sangrado. Son ejemplos de estos la hemofilia A o hemofilia B o hemofilia C. La hemofilia puede ser congénita o adquirida, tal como debida a una complicación de hemorragia debido a cirugía o traumatismo. La hemorragia puede manifestarse como hemartrosis aguda, artropatía hemofílica crónica, hematomas, hematuria, hemorragias del sistema nervioso central, hemorragias gastrointestinales, o hemorragia cerebral, y pueden producirse, por ejemplo, por extracción o cirugía dental, tal 15 como, por ejemplo, angioplastia, cirugía pulmonar, cirugía abdominal, cirugía espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía dental o cirugía de trasplante de órgano, tal como trasplante de médula ósea, corazón, pulmón, páncreas e hígado. El sujeto puede tener autoanticuerpos contra el factor VIII o factor IX. El tratamiento puede acompañarse de o administrarse secuencial o intermitentemente con uno o más factores de coagulación adicionales, tales como, por ejemplo, factores de coagulación recombinantes o purificados en plasma, procoagulantes, tales 20 como vitamina K, derivado de vitamina K e inhibidores de proteína C, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y corticoesteroides. Las composiciones farmacéuticas pueden usarse con composiciones que contienen dichos otros factores de coagulación.

Se proporcionan artículos de fabricación que contienen material de envasado y una composición farmacéutica 25 proporcionada contenida dentro del material de envasado y opcionalmente instrucciones para su administración. Por ejemplo, el polipéptido de FVII modificado en la composición farmacéutica puede ser para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por FVII, y el material de envasado puede incluir una etiqueta que indique que el polipéptido de FVII modificado se usa para el tratamiento de una enfermedad o trastorno mediado por FVII. También se proporcionan kits que contienen las composiciones farmacéuticas y un dispositivo para administración de la 30 composición y, opcionalmente, instrucciones para su administración.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa la cascada de coagulación. La figura muestra la ruta intrínseca y la ruta extrínseca de la 35 coagulación para la producción independiente de FXa a y la convergencia de las rutas con una ruta común para generar trombina y fibrina para la formación de un coágulo. Estas rutas están interconectadas. La figura representa el orden de moléculas implicadas en la cascada de activación en la que un zimógeno se convierte en una proteasa activada por escisión de uno o más enlaces peptídicos. La proteasa activada actúa después como la proteasa activadora para la siguiente molécula de zimógeno en la cascada, produciendo finalmente la 40 formación de coágulo.

La Figura 2 representa el modelo de coagulación basado en células (véase, por ejemplo, Hoffman et al. (2001) Thromb Haemost 85: 958-965. La figura representa los acontecimientos de coagulación como separados en tres fases, en los que el inicio de la coagulación se efectúa por la activación de FX a FXa mediante el complejo de FT/FVIIa en la célula portadora de FT, dando como resultado la generación de una cantidad pequeña de 45 trombina después de la activación por FXa/FVa. La amplificación tiene lugar cuando la trombina se une con y activa las plaquetas, e inicia la activación de suficientes cantidades de los factores de coagulación apropiados para formar los complejos de FVIIIa/FIXa y FVa/FXa. La propagación de la coagulación se produce en la superficie de grandes números de plaquetas activadas en el sitio de la lesión, dando como resultado un estallido de generación de trombina que es suficientemente grande como para generar la suficiente fibrina a partir de 50 fibrógeno para establecer un coágulo en el sitio de lesión.

La Figura 3 representa los mecanismos por los que el FVIIa puede iniciar la formación de trombina. La figura ilustra la ruta dependiente de FT de la generación de trombina de FVIIa, que actúa en la superficie de una célula portadora de FT e implica la formación del complejo de FVIIa con FT antes de la activación de FX a FXa. La figura también representa la ruta independiente de FT de la generación de trombina de FVIIa, durante la que 55 FVIIa se une con fosfolípidos en la plaqueta activada y activa FX a FXa, que a su vez forma complejos con FVa para escindir la protrombina en trombina.

La Figura 4 representa el complejo inhibidor cuaternario que resulta cuando el complejo de IRFT /FXa se une con el complejo de FT/FVIIa. El IRFT contiene tres dominios de Kunitz. El dominio de Kunitz 2 (K-2) interacciona con e inhibe FXa, mientras que el dominio de Kunitz (K-1) interacciona con e inhibe FVIIa. 60

La Figura 5 representa el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de los primeros dominios de Kunitz de (a) ITPB5L15 (posiciones de aminoácidos 1 a 55 de SEC ID Nº: 106), IRFT -2 (posiciones de aminoácidos 14-65 de SEC ID Nº: 105) y (b) IRFT -1 (posiciones de aminoácidos 26-76 de SEC ID Nº: 102) e IRFT -2 (posiciones de aminoácidos 14-65 de SEC ID Nº: 105) y muestra aminoácidos conservados.

La Figura 6 representa el modelo de homología usado para determinar los restos de contacto en la interfaz de la 65 interacción entre el FVIIa y el IRFT. La estructura del dominio de Kunitz 1 (K1) del IRFT-2 se tomó de la

estructura cristalina del complejo de tripsina/ IRFT y se modeló en el ITPB5L15 en la estructura cristalina de FT/FVIIa/ ITPB5L15. Se realizó mutagénesis por ordenador para ajustar al modelo los aminoácidos correspondientes del dominio K1 del IRFT-1. Se identificaron los restos de contacto de FVIIa que están probablemente implicados en la interacción con el IRFT en la interfaz de proteína-proteína y se establecieron como candidatos para la mutagénesis en el desarrollo de polipéptidos de FVII resistentes al IRFT. 5

La Figura 7 representa la interacción modelada entre el FVIIa y el IRFT. En particular, la figura representa los restos de contacto del FVII que están presentes en la interfaz de la interacción del FVIIa y del IRFT, y los restos de contacto del IRFT correspondientes, que forman contactos electroestáticos complementarios.

Descripción detallada 10

Esquema

A. Definiciones

B. Visión de Conjunto de la Hemostasis 15

1. Adhesión y agregación de plaquetas

2. Cascada de coagulación

a. Inicio 20

b. Amplificación

c. Propagación

3. Regulación de la coagulación

C. Factor VII (FVII)

1. Estructura y organización de FVII

2. Modificaciones postraduccionales

3. Procesamiento de FVII 30

4. Activación de FVII

5. Función de FVII

a. Actividad de FVIIa dependiente de factor tisular

b. Actividad de FVIIa independiente del factor tisular 35

6. FVII como un producto biofarmacéutico

D. Polipéptidos de FVII modificados

1. Resistencia a inhibidores

a. IRFT

Modificaciones para efectuar resistencia aumentada a IRFT

b. Antitrombina III (AT-III) 45

Modificaciones para efectuar resistencia aumentada a AT-III

2. Unión con Plaquetas Activadas

Modificación por introducción de un dominio Gla heterólogo

3. Combinaciones y modificaciones adicionales 50

a. Modificaciones que aumentan la actividad intrínseca

b. Modificaciones que aumentan la resistencia a proteasas

c. Modificaciones que aumentan la unión a fosfolípidos

d. Modificaciones que alteran la glucosilación 55

e. Modificaciones que facilitan el enlace de grupos químicos

f. Mutantes de combinación de FVII ejemplares

E. Diseño y métodos para modificar FVII

1. Racional

2. Empírico (es decir exploración)

a. mutagénesis aleatoria

b. Mutagénesis centrada 65

c. Exploración

3. Selección de variantes de FVII

F. Producción de polipéptidos de FVII

1. Vectores y células 5

2. Sistemas de expresión

a. Expresión en procariotas

b. Levaduras

c. Insectos y células de insectos 10

d. Células de mamífero

e. Plantas

2. Purificación

3. Proteínas de fusión 15

4. Modificaciones de polipéptidos

5. Secuencias de nucleótidos

G. Evaluación de las actividades de polipéptidos de FVII modificados 20

1. Ensayos in vitro

a. Modificación postraduccional

b. Actividad proteolítica 25

c. Actividad de coagulación

d. Unión con y/o inhibición por otras proteínas

e. Unión a fosfolípidos

2. Modelos animales no humanos 30

3. Ensayos clínicos

H. Formulación y administración

1. Formulaciones 35

a. Dosificaciones

b. Formas de dosificación

2. Administración de polipéptidos de FVII modificados 40

3. Administración de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de FVII modificados (terapia génica)

I. Usos terapéuticos

1. Trastornos hemorrágicos congénitos 45

a. Hemofilia

b. Déficit del FVII

c. Otros

2. Trastornos hemorrágicos adquiridos

a. Trombocitopenia adquirida por quimioterapia

b. Otras coagulopatías

c. Hemorragia adquirida por trasplante 55

d. Hemorragia inducida por terapia anticoagulante

e. Hemofilia adquirida

3. Hemorragia traumática y quirúrgica

J. Terapias de Combinación

K. Artículos de fabricación y kits

L. Ejemplos

A. Definiciones

A no ser que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que habitualmente entiende un experto en la materia a la que pertenece la invención o las invenciones. En caso de que haya una pluralidad de definiciones para términos en el presente 5 documento, prevalecerán los de la presente sección. Cuando se haga referencia a una URL u otro identificador o dirección tal, se entiende que dichos identificadores pueden cambiar y la información particular en Internet puede aparecer y desaparecer, pero puede encontrase información equivalente buscando en Internet. La referencia a la misma demuestra la disponibilidad y difusión pública de dicha información.

Como se usa en el presente documento, la ruta de coagulación o cascada de coagulación se refiere a la serie de acontecimientos de activación que conduce a la formación de un coágulo de fibrina insoluble. En la cascada o ruta de coagulación, una proteína inactiva de una serina proteasa (también denominada zimógeno) se convierte a una proteasa activa por escisión de uno o más enlaces peptídicos, que después actúa como la proteasa activadora para la siguiente molécula de zimógeno en la cascada. En la etapa proteolítica final de la cascada, el fibrinógeno se 15 escinde proteolíticamente por trombina a fibrina, que después se reticula en el sitio de lesión para formar un coágulo.

Como se usa en el presente documento, “hemostasis” se refiere a la detención de la hemorragia o flujo sanguíneo en un órgano o parte del cuerpo. El término hemostasis puede abarcar todo el proceso de coagulación sanguínea para evitar la pérdida de sangre después de una lesión de vasos sanguíneos hasta la disolución posterior del 20 coágulo sanguíneo después de la reparación tisular.

Como se usa en el presente documento, “coagulación” se refiere a la formación de un coágulo de fibrina insoluble, o al proceso por el cual los factores de coagulación de la sangre interaccionan en la cascada de coagulación, produciendo finalmente la formación de un coágulo de fibrina insoluble. 25

Como se usa en el presente documento, una “proteasa” es una enzima que cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos covalentes. Estas designaciones incluyen formas de zimógeno y formas activadas monocatenarias, bicatenarias y de múltiples cadenas de las mismas. Para mayor claridad, la referencia a proteasas hace referencia a todas las formas. Las proteasas incluyen, por ejemplo, serina proteasas, cisteína proteasas, proteasas aspárticas, 30 treonina y metaloproteasas dependiendo de la actividad catalítica de su sitio activo y mecanismo de escisión de enlaces peptídicos de un sustrato diana.

Como se usa en el presente documento, las serina proteasas o serina endopeptidasas se refieren a una clase de peptidasas, que se caracteriza por la presencia de un resto de serina en el sitio activo de la enzima. Las serina 35 proteasas participan en una amplia serie de funciones en el organismo, incluyendo coagulación de la sangre e inflamación, y también actúan como enzimas digestivas en procariotas y eucariotas. El mecanismo de escisión por serina proteasas se basa en el ataque nucleófilo de un enlace peptídico diana por una serina. Las moléculas de cisteína, treonina o agua asociadas con aspartato o metales también pueden desempeñar este papel. Las cadenas laterales alineadas de serina, histidina y aspartato forman una triada catalítica común a la mayoría de las serina 40 proteasas. El sitio activo de las serina proteasas tiene forma de hendidura donde se une el sustrato polipeptídico.

Como se usa en el presente documento, el Factor VII (FVII, F7; también denominado Factor 7, factor de coagulación VII, factor de suero VII, acelerador de conversión de protrombina en suero, ACPS, proconvertina y eptacog alfa) se refiere a una serina proteasa que es parte de la cascada de coagulación. El FVII incluye un dominio Gla, dos 45 dominios EGF (EGF-1 y EGF-2) y un dominio de serina proteasa (o dominio de peptidasa S1) que está altamente conservado entre todos los miembros de la familia de peptidasa S1 de las serina proteasas, tal como por ejemplo con quimotripsina. La secuencia de un FVII precursor ejemplar que tiene un péptido señal y un propéptido se expone en SEC ID Nº: 1. Se expone un polipéptido de FVII maduro ejemplar en SEC ID Nº: 3. FVII aparece como un zimógeno monocatenario, un polipéptido bicatenario de tipo zimógeno y una forma bicatenaria completamente 50 activada. La activación completa, que se produce tras el cambio conformacional de una forma de tipo zimógeno, se produce tras la unión con su factor tisular cofactor. Además, pueden introducirse mutaciones que dan como resultado el cambio de conformación en ausencia de factor tisular. Por lo tanto, la referencia a FVII incluye formas monocatenarias y bicatenarias del mismo, incluyendo formas bicatenarias de tipo zimógeno y completamente activadas. 55

La referencia al polipéptido de FVII también incluye polipéptidos precursores y polipéptidos de FVII maduros en formas monocatenarias o bicatenarias, formas truncadas de las mismas que tienen actividad, e incluyen variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de corte y empalme, y otras variantes, incluyendo polipéptidos que tienen al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 60 99% o más identidad de secuencia con el polipéptido precursor expuesto en SEC ID Nº: 1 o la forma madura del mismo. Se incluyen polipéptidos de FVII modificados, tales como los de SEC ID Nos: 18-43, 125-150 o 206-150 y variantes de los mismos. También se incluyen los que conservan al menos una actividad de un FVII, tal como unión al FT, unión al factor X, unión a fosfolípidos y/o actividad coagulante de un FVII. Conservando la actividad, la actividad puede alterarse, tal como reducirse o aumentarse, en comparación con un FVII de tipo silvestre siempre 65 que el nivel de actividad conservado sea suficiente para producir un efecto detectable. Los polipéptidos de FVII

incluyen, pero sin limitación, isoformas específicas de tejido y variantes alélicas de las mismas, moléculas sintéticas preparadas por traducción de ácidos nucleicos, proteínas generadas por síntesis química, tal como síntesis que incluye el ligamiento de polipéptidos más cortos, mediante métodos recombinantes, proteínas aisladas de tejido y células humanas y no humanas, polipéptidos de FVII quiméricos y formas modificadas de los mismos. Los polipéptidos de FVII también incluyen fragmentos o partes de FVII que tienen suficiente longitud o que incluyen 5 regiones apropiadas para conservar al menos una actividad (tras la activación si es necesario) de un polipéptido maduro de longitud completa. Los polipéptidos de FVII también incluyen los que contienen modificaciones químicas o postraduccionales y los que no contienen modificaciones químicas o postraduccionales. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, pegilación, albuminación, glucosilación, farnisilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación y otras modificaciones de polipéptidos conocidas en la técnica. 10

Son polipéptidos de FVII ejemplares los de origen mamífero, incluyendo humano. Se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares de FVII de origen humano en SEC ID Nº: 1, 2 y 3. Las variantes ejemplares de dicho polipéptido de FVII humano, incluyen cualquiera de los polipéptidos precursores expuestos en SEC ID Nos: 44-100. Los polipéptidos FVII también incluyen cualquiera de origen no humano incluyendo, pero sin limitación, polipéptidos 15 de factor FVII murinos, caninos, felinos, leporinos, aviares, bovinos, ovinos, porcinos, equinos, de peces, de anfibios y de otros de primates. Los polipéptidos de FVII ejemplares de origen no humano incluyen, por ejemplo, de vaca (Bos taurus, SEC ID Nº: 4), de ratón (Mus musculus, SEC ID Nº: 5), de chimpancé pigmeo (Pan paniscus, SEC ID Nº: 6), de chimpancé (Pan troglodytes, SEC ID Nº: 7), de conejo (Oryctolagus cuniculus, SEC ID Nº: 8), de rata (Rattus norvegicus, SEC ID Nº: 9), de macaco rhesus (Macaca mulatta, SEC ID Nº: 10), de cerdo (Sus scrofa, SEC 20 ID Nº: 11), de perro (Canis familiaris, SEC ID Nº: 12), de pez cebra (Brachydanio rerio, SEC ID Nº: 13), de pez globo Japonés (Fugu rubripes, SEC ID Nº: 14), de pollo (Gallus, SEC ID Nº: 15), de orangután (Pongo pygmaeus, SEC ID Nº: 16) y de gorila (Gorilla, SEC ID Nº: 17).

Un experto en la materia reconoce que las posiciones referidas del polipéptido de factor FVII maduro (SEC ID Nº: 3) 25 difieren en 60 restos de aminoácidos cuando se compara con la isoforma un polipéptido de FVII precursor expuesto en SEC ID Nº: 1, que es la isoforma de un polipéptido de factor FVII que contiene el péptido señal y secuencias propeptídicas. Por lo tanto, el primer resto de aminoácido de SEC ID Nº: 3 “corresponde al” sexagésimo primer (61er) resto de aminoácido de SEC ID Nº: 1. Un experto en la materia también reconoce que las posiciones referidas del polipéptido de factor VII maduro (SEC ID Nº: 3) difieren en 38 restos de aminoácidos cuando se compara con el 30 polipéptido de FVII precursor expuesto en SEC ID Nº: 2, que es el polipéptido de factor VII de isoforma b que contiene el péptido señal y secuencias propeptídicas. Por lo tanto, el primer resto de aminoácido de SEC ID Nº: 3 “corresponde al” trigésimo noveno (39er) resto de aminoácido de SEC ID Nº: 2.

Como se usa en el presente documento, los restos correspondientes se refieren a restos que aparecen en loci 35 alineados. Se alinean polipéptidos relacionados o variantes por cualquier método conocido por los expertos en la materia. Dichos métodos típicamente maximizan las coincidencias, e incluyen métodos tales como el uso de alineamientos manuales y usando los numerosos programas de alineamiento disponibles (por ejemplo, BLASTP) y otros conocidos por los expertos en la materia. Alineando las secuencias de polipéptidos, un experto en la materia puede identificar restos correspondientes, usando restos de aminoácidos conservados e idénticos como guías. Por 40 ejemplo, alineando las secuencias de polipéptidos del factor VII, un experto en la materia puede identificar restos correspondientes, usando restos de aminoácidos conservados e idénticos como guías. Por ejemplo, la alanina en la posición de aminoácido 1 (A1) de SEC ID Nº: 3 (factor maduro VII) corresponde a la alanina en la posición de aminoácido 61 (A61) de SEC ID Nº: 1, y la alanina en la posición de aminoácido 39 (A39) de SEC ID Nº: 2. En otros casos, pueden identificarse regiones correspondientes. Por ejemplo, el dominio Gla corresponde a las posiciones de 45 aminoácidos A1 a F45 de SEC ID Nº: 3, a las posiciones de aminoácidos A61 a S105 de SEC ID Nº: 1 y a las posiciones de aminoácidos A39 a S83 de SEC ID Nº: 2. Un experto en la materia también puede emplear restos de aminoácidos conservados como guías para encontrar restos de aminoácidos correspondientes entre y en medio de secuencias humanas y no humanas. Por ejemplo, los restos de aminoácidos S43 y E163 de SEC ID Nº: 3 (humanos) corresponden a S83 y E203 de SEC ID Nº: 4 (bovino). Las posiciones correspondientes también pueden basarse en 50 alineamientos estructurales, por ejemplo usando alineamientos simulados por ordenador de la estructura proteica. En otros casos, pueden identificarse regiones correspondientes.

Como se usa en el presente documento, una “prorregión”, un “propéptido” o una “prosecuencia”, se refiere a una región o a un segmento que se escinde para producir una proteína madura. Esta puede incluir segmentos que 55 actúan suprimiendo la actividad proteolítica enmascarando la maquinaria catalítica y por lo tanto impidiendo la formación del producto intermedio catalítico (es decir, ocluyendo de forma estérica el sitio de unión al sustrato). Una prorregión es una secuencia de aminoácidos situada en el extremo amino terminal de un polipéptido maduro biológicamente activo y puede tener tan solo algunos aminoácidos o puede ser una estructura multidominio.

Como se usa en el presente documento, “factor maduro VII” se refiere a un polipéptido de FVII que carece de una secuencia señal y una secuencia propeptídica. Típicamente, una secuencia señal dirige una proteína para su secreción mediante la ruta del retículo endoplásmico (RE)-golgi y se escinde después de la inserción en el RE durante la traducción. Una secuencia propeptídica típicamente actúa en modificación postraduccional de la proteína y se escinde antes de la secreción de la proteína de la célula. Por lo tanto, un polipéptido de FVII maduro es 65 típicamente una proteína secretada. En un ejemplo, un polipéptido de FVII humano maduro se expone en SEC ID

Nº: 3. La secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 difiere de la de los polipéptidos precursores expuestos en SEC ID Nº: 1 y 2 por que la SEC ID Nº: 3 carece de la secuencia señal, que corresponde a los restos de aminoácidos 1-20 de SEC ID Nos: 1 y 2; y también carece de la secuencia propeptídica, que corresponde a los restos de aminoácidos 21-60 de SEC ID Nº: 1 y los restos aminoácidos 21-38 de SEC ID Nº: 2. La referencia a un polipéptido de FVII maduro abarca la forma de zimógeno monocatenaria y la forma bicatenaria. 5

Como se usa en el presente documento, “de tipo silvestre” o “nativo” con referencia a FVII se refiere a un polipéptido de FVII codificado por un gen de FVII nativo o de origen natural, incluyendo variantes alélicas, que está presente en un organismo, incluyendo un animal humano y otro, en la naturaleza. Se pretende que la referencia a factor VII de tipo silvestre sin referencia a una especie abarque cualquier especie de un factor VII de tipo silvestre. Se incluyen 10 entre los polipéptidos de FVII de tipo silvestre el polipéptido precursor codificado, fragmentos del mismo, y formas procesadas del mismo, tal como una forma madura que carece del péptido señal así como cualquier forma procesada o modificada pre o postraduccionalmente del mismo. También se incluyen entre polipéptidos de FVII nativos los que se modifican postraduccionalmente, incluyendo, pero sin limitación, modificación por glucosilación, carboxilación e hidroxilación. Los polipéptidos de FVII nativos también incluyen formas monocatenarias y 15 bicatenarias. Por ejemplo, los seres humanos expresan FVII nativo. La secuencia de aminoácidos de FVII humano de tipo silvestre ejemplar se expone en SEC ID Nos: 1, 2, 3 y las variantes alélicas se exponen en SEC ID Nos: 44-100 y las formas maduras de las mismas. Otros animales producen FVII nativo, incluyendo, pero sin limitación, de vaca (Bos taurus, SEC ID Nº: 4), de ratón (Mus musculus, SEC ID Nº: 5), de chimpancé pigmeo (Pan paniscus, SEC ID Nº: 6), de chimpancé (Pan troglodytes, SEC ID Nº: 7), de conejo (Oryctolagus cuniculus, SEC ID Nº: 8), de rata 20 (Rattus norvegicus, SEC ID Nº: 9), de macaco rhesus (Macaca mulatta, SEC ID Nº: 10), de cerdo (Sus scrofa, SEC ID Nº: 11), de perro (Canis familiaris, SEC ID Nº: 12), de pez cebra (Brachydanio rerio, SEC ID Nº: 13), de pez globo Japonés (Fugu rubripes, SEC ID Nº: 14), de pollo (Gallus gallus, SEC ID Nº: 15), de orangután (Pongo pygmaeus, SEC ID Nº: 16) y gorila (Gorilla gorilla, SEC ID Nº: 17).

Como se usa en el presente documento, las variantes de especies se refieren a variantes en polipéptidos entre diferentes especies, incluyendo diferentes especies de mamíferos, tales como ratón y ser humano.

Como se usa en el presente documento, las variantes alélicas se refieren a variaciones en las proteínas entre miembros de la misma especie. 30

Como se usa en el presente documento, una variante de corte y empalme se refiere a una variante producida por el procesamiento diferencial de un transcrito primario de ADN genómico que da como resultado más de un tipo de ARNm.

Como se usa en el presente documento, un zimógeno se refiere a una proteasa que se activa por escisión proteolítica, incluyendo escisión de maduración, tal como escisión de activación y/o formación de complejos con otra proteína u otras proteínas y/u otro cofactor u otros cofactores. Un zimógeno es un precursor inactivo de una enzima proteolítica. Dichos precursores son en general más grandes, aunque no necesariamente, más grandes, que la forma activa. Con referencia a las serina proteasas, los zimógenos se convierten en enzimas activas por escisión 40 específica, incluyendo escisión catalítica y autocatalítica, o mediante unión de un cofactor de activación, que genera una enzima activa. Por ejemplo, en general, los zimógenos están presentes en una forma monocatenaria. Los zimógenos, en general, están inactivos y pueden convertirse en polipéptidos activos maduros por escisión catalítica o autocatalítica en uno o más sitios proteolíticos para generar un polipéptido multicatenario, tal como uno bicatenario. Un zimógeno, por lo tanto, es una proteína enzimáticamente inactiva que se convierte en una enzima 45 proteolítica mediante la acción de un activador. La escisión puede efectuarse por autoactivación. Diversas proteínas de coagulación son zimógenos; se encuentran inactivas, pero llegan a escindirse y se activan tras el inicio del sistema de coagulación después de daño vascular. Con referencia a FVII existen polipéptidos en el plasma sanguíneo como zimógenos hasta su escisión por proteasas, tales como, por ejemplo, el factor IX activado (FIXa), el factor X activado (FXa), el factor XII activado (FXIIa), la trombina o por autoactivación para producir una forma 50 bicatenaria de tipo zimógeno, que después requiere cambio de conformación adicional para su actividad completa.

Como se usa en el presente documento, una proteína o polipéptido “de tipo zimógeno” se refiere a una proteína que se ha activado por escisión proteolítica, pero aún muestra propiedades que se asocian con un zimógeno, tales como, por ejemplo, baja o ninguna actividad, o una conformación que se asemeja a la conformación de la forma de 55 zimógeno de la proteína. Por ejemplo, cuando no está unida con el factor tisular, la forma activada bicatenaria de FVII es una proteína de tipo zimógeno; conserva una conformación similar a la del zimógeno FVII no escindido, y, por lo tanto, muestra muy baja actividad. Tras la unión con el factor tisular, la forma activada bicatenaria de FVII experimenta cambio conformacional y adquiere su actividad completa como un factor de coagulación.

Como se usa en el presente documento, una secuencia de activación se refiere a una secuencia de aminoácidos en un zimógeno que es el sitio requerido para la escisión de activación o la escisión de maduración para formar una proteasa activa. La escisión de una secuencia de activación puede catalizarse de forma autocatalítica o por compañeros de activación.

Como se usa en el presente documento, la escisión de activación es un tipo de escisión de maduración, que induce un cambio de conformación que se requiere para el desarrollo de la actividad enzimática completa. Esta es una ruta de activación clásica, por ejemplo, para serina proteasas en las que una escisión genera un nuevo extremo N terminal que interacciona con las regiones conservadas de la proteasa, tales como Asp194 en quimotripsina, para inducir cambios conformacionales requeridos para la actividad. La activación puede dar como resultado la 5 producción de formas multicatenarias de las proteasas. En algunos casos, las formas monocatenarias de la proteasa pueden mostrar actividad proteolítica.

Como se usa en el presente documento, “Factor VII activado” o “FVIIa” se refiere a cualquier forma bicatenaria de un polipéptido de FVII. Una forma bicatenaria típicamente resulta de la escisión proteolítica, pero puede producirse de 10 forma sintética. El factor VII activado, por lo tanto, incluye la forma bicatenaria de tipo zimógeno con baja actividad coagulante, una forma completamente activada (aproximadamente 1000 veces más actividad) de la que se produce tras la unión con el factor tisular, y formas mutadas que existen en una forma bicatenaria completamente activada o experimentan cambios de conformación a una forma completamente activada. Por ejemplo, una forma monocatenaria del polipéptido de FVII (véase, por ejemplo, SEC ID Nº: 3) se escinde proteolíticamente entre los 15 restos de aminoácidos R152 e I153 del polipéptido de FVII maduro. Los productos de escisión, la cadena pesada de FVII y la cadena ligera de FVII, que se mantienen juntos por un enlace disulfuro (entre los restos de aminoácidos 135C y 162C en el FVII de SEC ID Nº: 3), forman la enzima FVII activada bicatenaria. Puede llevarse a cabo escisión proteolítica, por ejemplo, por el factor IX activado (FIXa), factor X activado (FXa), factor XII activado (FXIIa), trombina o por autoactivación. 20

Como se usa en el presente documento, una “propiedad” de un polipéptido de FVII se refiere a una propiedad física o estructural, tal como estructura tridimensional, pI, semivida, conformación y otras de características físicas de este tipo.

Como se usa en el presente documento, una “actividad” de un polipéptido de FVII se refiere a cualquier actividad mostrada por un polipéptido de factor VII. Dichas actividades pueden ensayarse in vitro y/o in vivo e incluyen, pero sin limitación, coagulación o actividad coagulante, actividad pro-coagulante, actividad proteolítica o catalítica tal como para efectuar la activación del factor X (FX) o la activación del Factor IX (FIX); antigenicidad (capacidad para unirse a, o competir con, un polipéptido mediante la unión con un anticuerpo anti-FVII); capacidad para unir el factor 30 tisular, el factor X o el factor IX; y/o capacidad para unirse con fosfolípidos. La actividad puede evaluarse in vitro o in vivo usando ensayos reconocidos, por ejemplo, midiendo la coagulación in vitro o in vivo. Los resultados de dichos ensayos indican que un polipéptido muestra una actividad que puede correlacionarse con la actividad del polipéptido in vivo, en el que en la actividad in vivo puede denominarse actividad biológica. Los expertos en la materia conocen ensayos para determinar la funcionalidad o actividad de formas modificadas de FVII. Los ensayos ejemplares para 35 evaluar la actividad de un polipéptido de FVII incluyen, ensayo de tiempo de protromboplastina (TP) o el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) para evaluar la actividad coagulante, o ensayos cromogénicos usando sustratos sintéticos, tales como los descritos en los Ejemplos 4, 5 y 11, para evaluar la actividad catalítica o proteolítica.

Como se usa en el presente documento, “muestra al menos una actividad” o “conserva al menos una actividad” se refiere a la actividad mostrada por un polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado de la misma forma y en las mismas condiciones. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado en una forma bicatenaria se compara con un polipéptido de FVII no modificado en una forma bicatenaria, en las mismas condiciones experimentales, donde la única diferencia entre los dos polipéptidos es la modificación que se estudia. 45 En otro ejemplo, un polipéptido de FVII modificado en una forma monocatenaria se compara con un polipéptido de FVII no modificado en una forma monocatenaria, en las mismas condiciones experimentales, donde la única diferencia entre los dos polipéptidos es la modificación que se estudia. Típicamente, un polipéptido de FVII modificado que conserva o muestra al menos una actividad de un polipéptido de FVII no modificado de la misma forma, conserva una cantidad de la actividad suficiente de tal manera que, cuando se administra in vivo, el 50 polipéptido de FVII modificado es terapéuticamente eficaz como un agente terapéutico procoagulante. En general, para que un polipéptido de FVII modificado conserve la eficacia terapéutica como un procoagulante, la cantidad de actividad que se conserva es, o es aproximadamente de, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más de la actividad de un polipéptido de FVII no modificado de la misma forma que 55 presenta eficacia terapéutica como un procoagulante. La cantidad de actividad que se requiere para mantener la eficacia terapéutica como un procoagulante puede determinarse de forma empírica, si es necesario. Típicamente, una conservación del 0,5 % al 20 %, del 0,5 % al 10 %, del 0,5 % al 5 % de una actividad es suficiente para conservar la eficacia terapéutica como un procoagulante in vivo.

Se entiende que la actividad que muestra o que conserva un polipéptido de FVII modificado puede ser cualquier actividad, incluyendo, pero sin limitación, coagulación o actividad coagulante, actividad procoagulante; actividad proteolítica o catalítica, tal como para efectuar la activación del factor X (FX) o la activación del factor IX (FIX); antigenicidad (capacidad para unirse con o competir con un polipéptido por la unión con un anticuerpo anti-FVII); capacidad para unirse con el factor tisular, factor X o factor IX; y/o capacidad para unirse con fosfolípidos. En 65 algunos casos, un polipéptido de FVII modificado puede conservar una actividad que aumenta en comparación con

un polipéptido de FVII no modificado. En algunos casos, un polipéptido de FVII modificado puede conservar una actividad que se reduce en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. La actividad de un polipéptido de FVII modificado puede ser cualquier nivel de porcentaje de actividad del polipéptido no modificado, donde ambos polipéptidos están en la misma forma, incluyendo pero sin limitación, 1 % de la actividad, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 5 500 %, o más actividad en comparación con el polipéptido que no contiene la modificación en cuestión. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede mostrar actividad aumentada o reducida en comparación con el polipéptido de FVII no modificado en la misma forma. Por ejemplo, puede conservar al menos aproximadamente o 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 % de la actividad del polipéptido de FVII no modificado. En otras realizaciones, el cambio de la 10 actividad es de al menos aproximadamente 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces, o más veces mayor que el del FVII no modificado. El nivel particular para conservar está en función del uso pretendido del polipéptido y puede determinarse de forma empírica. La actividad puede medirse, por ejemplo, usando ensayos in vitro o in vivo 15 tales como los descritos en el presente documento o en los Ejemplos posteriores.

Como se usa en el presente documento, “actividad de coagulación” o “actividad coagulante” o “actividad pro-coagulante” se refiere a la capacidad de un polipéptido para efectuar coagulación. Los expertos en la materia conocen ensayos para evaluar la actividad coagulante, e incluyen el ensayo de tiempo de protromboplastina (TP) o 20 el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa).

Como se usa en el presente documento, “actividad catalítica” o “actividad proteolítica” con referencia a FVII se refiere a la capacidad de una proteína FVII para catalizar la escisión proteolítica de un sustrato, y se usan indistintamente. En la técnica se conocen ensayos para evaluar dichas actividades. Por ejemplo, la actividad 25 proteolítica de FVII puede medirse usando sustratos cromogénicos tales como FVIIa Spectrozyme (CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA), donde la escisión del sustrato la controla la absorbancia y la velocidad de hidrólisis del sustrato determinadas por regresión lineal.

Como se usa en el presente documento, “actividad intrínseca” con referencia a FVII se refiere a la actividad 30 catalítica, proteolítica y/o coagulante de una proteína FVII en ausencia del factor tisular.

Como se usa en el presente documento, el dominio (típicamente una secuencia de tres o más, generalmente de 5 o 7 o más aminoácidos) se refiere a una parte de una molécula, tal como proteínas o los ácidos nucleicos codificantes, que es estructuralmente y/o funcionalmente distinta de otras partes de la molécula y que es identificable. Por 35 ejemplo, los dominios incluyen las partes de una cadena polipeptídica que pueden formar una estructura plegada de forma independiente dentro de una proteína compuesta de uno o más motivos estructurales y/o que se reconocen en virtud de una actividad funcional, tal como actividad proteolítica. Una proteína puede tener un dominio, o más, distintos. Por ejemplo, un dominio puede identificarse, definirse o distinguirse por homología de la secuencia en el mismo con miembros de la familia relacionados, tales como homología con motivos que definen un dominio proteasa 40 o un dominio gla. En otro ejemplo, un dominio puede distinguirse por su función, tal como por su actividad proteolítica, o por una capacidad para interaccionar con una biomolécula, tal como la unión a ADN, unión a ligando y dimerización. Un dominio puede mostrar de forma independiente una función o actividad biológica de modo que el dominio de forma independiente o fusionado con otra molécula puede realizar una actividad, tal como, por ejemplo, actividad proteolítica o unión a ligando. Un dominio puede ser una secuencia lineal de aminoácidos o una secuencia 45 no lineal de aminoácidos. Muchos polipéptidos contienen una pluralidad de dominios. Los expertos en la materia conocen y pueden identificar dichos dominios. Para ejemplos del presente documento, se proporcionan definiciones, pero se entiende que está dentro de la experiencia de la técnica reconocer dominios particulares por su nombre. Si es necesario puede emplearse un programa informático apropiado para identificar dominios.

Como se usa en el presente documento, un dominio de proteasa es la parte catalíticamente activa de una proteasa. La referencia a un dominio de proteasa de una proteasa incluye las formas mono-, bi- y multicatenarias de cualquiera de estas proteínas. Un dominio de proteasa de una proteína contiene todas las propiedades necesarias de esa proteína que se requieren para realizar su actividad proteolítica, tales como, por ejemplo, el centro catalítico. En referencia a FVII, el dominio de proteasa comparte homología y características estructurales con los dominios de 55 proteasas de la familia de quimotripsina/tripsina, incluyendo la triada catalítica. Por ejemplo, en el polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3, el dominio de proteasa corresponde a las posiciones de aminoácidos 153 a 392.

Como se usa en el presente documento, un dominio de gamma-carboxiglutamato (Gla) se refiere a la parte de una proteína, por ejemplo, una proteína dependiente de vitamina K, que contiene modificaciones postraduccionales de 60 restos de glutamato, generalmente la mayoría, pero no todos los restos de glutamato, por carboxilación dependiente de vitamina K para formar Gla. El dominio Gla es responsable de la unión de alta afinidad de iones de calcio y de la unión con fosfolípidos con carga negativa. Típicamente, el dominio Gla comienza en el extremo N terminal de la forma madura de las proteínas dependientes de vitamina K y termina con un resto aromático conservado. En un polipéptido de FVII maduro el dominio Gla corresponde a las posiciones de aminoácidos 1 a 45 del polipéptido 65 ejemplar expuesto en SEC ID Nº: 3. Se conocen bien dominios Gla y su locus puede identificarse en polipéptidos

particulares. Los dominios Gla de las diversas proteínas dependientes de vitamina K comparten secuencia, homología estructural y funcional, incluyendo el agrupamiento de restos hidrófobos N terminales en un parche hidrófobo que media en la interacción con fosfolípidos con carga negativa en la membrana de la superficie celular. Otros polipéptidos ejemplares que contienen Gla incluyen, pero sin limitación, FIX, FX, protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína Gla de matriz, proteína específica de detención del crecimiento 6 (Gas6) y 5 proteína Z. Los dominios Gla de éstas y otras proteínas ejemplares se exponen en cualquiera de SEC ID Nos: 110-121.

Como se usa en el presente documento, “nativo” o “endógeno” con referencia a un dominio Gla se refiere al dominio Gla de origen natural asociado con todo, o con una parte de, un polipéptido que tiene un dominio Gla. Para los fines 10 del presente documento, un dominio Gla nativo es con referencia a un polipéptido de FVII. Por ejemplo, el dominio Gla nativo de FVII, expuesto en SEC ID Nº: 119, corresponde a los aminoácidos 1-45 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3.

Como se usa en el presente documento, un dominio Gla heterólogo se refiere al dominio Gla de un polipéptido, de la 15 misma especie o diferente, que no es un dominio Gla de FVII. Son ejemplos de dominios Gla heterólogos los dominios Gla de polipéptidos que contienen Gla incluyendo, pero sin limitación, FIX, FX, protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína Gla de matriz, proteína específica de detención del crecimiento 6 (Gas6) y proteína Z. Los dominios Gla de éstas y otras proteínas ejemplares se exponen en cualquiera de SEC ID Nos: 110-118, 120 y 121. 20

Como se usa en el presente documento, una parte contigua de un dominio Gla se refiere a al menos dos o más aminoácidos adyacentes, típicamente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40 o más hasta todos los aminoácidos que componen un dominio Gla.

Como se usa en el presente documento, “una parte suficiente de un dominio Gla para efectuar la unión a fosfolípidos” incluye al menos un aminoácido, típicamente en 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 o más aminoácidos del dominio, pero menos de todos los aminoácidos que componen el dominio siempre que el polipéptido que contiene dicha parte muestre unión a fosfolípidos.

Como se usa en el presente documento, “reemplazar” con respecto a un dominio Gla o “intercambio de dominio Gla” se refiere al proceso mediante el cual el dominio Gla endógeno de una proteína se reemplaza, usando métodos recombinantes, sintéticos u otros, con el dominio Gla de otra proteína. En el contexto de un “intercambio de dominio Gla”, un “dominio Gla” es cualquier selección de aminoácidos de un dominio Gla y regiones adyacentes que es suficiente para conservar la actividad de unión a fosfolípidos. Típicamente, un intercambio de dominio Gla implicará 35 el reemplazo de entre 40 y 50 aminoácidos de la proteína endógena con entre 40 y 50 aminoácidos de otra proteína, pero puede implicar menos o más aminoácidos.

Como se usa en el presente documento, un dominio de factor de crecimiento epidérmico (EGF, Epidermal Growth Factor) (EGF-1 o EGF-2) se refiere a la parte de una proteína que comparte homología de secuencia con una parte 40 de 30 a 40 aminoácidos específica de la secuencia del factor de crecimiento epidérmico (EGF). El dominio de EGF incluye seis restos de cisteína que se han mostrado (en EGF) que están implicados en enlaces disulfuro. La estructura principal de un dominio de EGF es una lámina beta bicatenaria seguida de un bucle en una lámina bicatenaria corta C terminal. FVII contiene dos dominios EGF: EGF-1 y EGF-2. Estos dominios corresponden a las posiciones de aminoácidos 46-82, y 87-128, respectivamente, del polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID 45 Nº: 3.

Como se usa en el presente documento, “polipéptido no modificado” o “FVII no modificado” y sus variaciones gramaticales, se refieren a un polipéptido de partida que se selecciona para la modificación como se proporciona en el presente documento. El polipéptido de partida puede ser una forma de origen natural, de tipo silvestre, de un 50 polipéptido. Además, el polipéptido de partida puede alterarse o mutarse, de modo que difiera de una isoforma de tipo de silvestre nativa aunque, no obstante, en el presente documento se denomina polipéptido de partida no modificado, en relación con los polipéptidos modificados posteriormente producidos en el presente documento. Por lo tanto, como polipéptido de partida no modificado, pueden seleccionarse y usarse proteínas existentes conocidas en la técnica que se han modificado para tener un aumento o una reducción deseados en una actividad o propiedad 55 particular en comparación con una proteína de referencia no modificada. Por ejemplo, una proteína que se ha modificado de su forma nativa mediante uno o más cambios de aminoácidos individuales y que posee bien un aumento o bien una reducción en una propiedad deseada, tal como un cambio en un resto o restos de aminoácidos para alterar la glucosilación, puede ser una proteína diana, denominada en el presente documento no modificada, para modificación adicional de la misma propiedad o una diferente. Los polipéptidos de FVII modificados ejemplares 60 conocidos en la técnica incluyen cualquier polipéptido de FVII descrito, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos 5580560, 6017882, 6693075, 6762286 y 6806063, Publicaciones de Patente de Estados Unidos Nº 20030100506 y 20040220106 y Publicaciones de Patente Internacional Nº. WO1988010295, WO200183725, WO2003093465, WO200338162, WO2004083361, WO2004108763, WO2004029090, WO2004029091, WO2004111242 y WO2005123916. 65

Como se usa en el presente documento, “polipéptidos de factor VII modificado” y “factor VII modificado” se refieren a un polipéptido de FVII que tiene una o más diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido de factor VII no modificado. La diferencia, o diferencias, de aminoácidos pueden ser mutaciones de aminoácidos tales como uno o más reemplazos (sustituciones), inserciones o deleciones de aminoácidos, o pueden ser inserciones o deleciones de dominios completos, y cualquier combinación de los mismos. Típicamente, un polipéptido de FVII 5 modificado tiene una o más modificaciones en la secuencia primaria en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, .14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más diferencias de aminoácidos en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Cualquier modificación se contempla siempre que el polipéptido resultante muestre al menos una actividad de FVII asociada con un polipéptido de FVII nativo, tal como, 10 por ejemplo, actividad catalítica, actividad proteolítica, la capacidad para unirse con FT o la capacidad para unirse a plaquetas activadas.

Como se usa en el presente documento, “inhibidores de coagulación” se refiere a proteínas o a moléculas que actúan para inhibir o prevenir la coagulación o formación de coágulos. La inhibición o prevención de coagulación 15 puede observarse in vivo o in vitro y puede ensayarse usando cualquier método conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitación, el ensayo de tiempo de protromboplastina (TP) o el ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa).

Como se usa en el presente documento, el inhibidor de la ruta de factor tisular (IRFT, también denominado IRFT-1) 20 es un inhibidor de tipo Kunitz que está implicado en la formación de un complejo cuaternario inhibidor de FT/FVIIa/ IRFT/FXa en el que se inhibe la actividad de FVIIa. El IRFT se expresa como dos formas precursoras diferentes después del corte y empalme alternativo, las formas precursoras IRFTa (SEC ID Nº: 101) y IRFTI (SEC ID Nº: 103), que se escinden durante la secreción para generar una proteína madura de 276 aminoácidos (SEC ID Nº: 102) y una de 223 aminoácidos (SEC ID Nº: 104), respectivamente. El IRFT contiene 3 dominios Kunitz, siendo el dominio 25 Kunitz-1 el responsable de la unión e inhibición de FVIIa.

Como se usa en el presente documento, el IRFT-2 (también conocido como proteína placentaria 5 (PP5) e inhibidor de serina proteasa asociada a matriz (ISPM) se refiere a un homólogo del IRFT. La proteína IRFT-2 madura de 213 aminoácidos (SEC ID Nº: 105) contiene tres dominios de tipo Kunitz que muestran una identidad de secuencia 30 primaria de 43 %, 35 % y 53 % con los dominios 1, 2 y 3 de tipo Kunitz del IRFT-1, respectivamente. El IRFT-2 desempeña un papel en la regulación de la digestión y remodelación de la matriz extracelular, y no se cree que sea un factor importante en la ruta de coagulación.

Como se usa en el presente documento, la antitrombina III (AT-III) es un inhibidor de serina proteasa (serpina). La 35 AT-III se sintetiza como una proteína precursora que contiene 464 restos de aminoácidos (SEC D Nº: 122) que se escinde durante la secreción para liberar una antitrombina madura de 432 aminoácidos (SEC ID Nº: 123).

Como se usa en el presente documento, los cofactores se refieren a proteínas o a moléculas que se unen con otras proteínas o moléculas específicas para formar un complejo activo. En algunos ejemplos, se requiere la unión con un 40 cofactor para la actividad proteolítica óptima. Por ejemplo, el factor tisular (FT) es un cofactor de FVIIa. La unión de FVIIa con FT induce cambios conformacionales que dan como resultado un aumento de la actividad proteolítica de FVIIa para sus sustratos, FX y FIX.

Como se usa en el presente documento, el factor tisular (FT) se refiere a una glucoproteína transmembrana de 263 45 aminoácidos (SEC ID Nº: 124) que actúa como un cofactor para FVIIa. Se expresa de forma constitutiva en células del músculo liso y fibroblastos, y ayuda a iniciar la coagulación uniendo el FVII y el FVIIa cuando estas células entran en contacto con la corriente sanguínea después de una lesión tisular.

Como se usa en el presente documento, plaqueta activada se refiere a una plaqueta que se ha activado por la unión 50 de moléculas tales como colágeno, tromboxano A2, ADP y trombina para experimentar diversos cambios en morfología, fenotipo y función que finalmente promueven la coagulación. Por ejemplo, una plaqueta activada cambia de estructura a una forma más amorfa con dedos de proyección. Las plaquetas activadas también experimentan una “inversión” de la membrana celular de modo que la fosfatidilserina y otros fosfolípidos con carga negativa, que normalmente están presentes en la lámina interna de la membrana celular, se traslocan a la superficie externa, 55 orientada en el plasma. Estas membranas de las plaquetas activadas proporcionan la superficie sobre la cual se efectúan muchas de las reacciones de la cascada de coagulación. Las plaquetas activadas también secretan vesículas que contienen factores procoagulantes tales como el FvW, el FV, la trombina, el ADP y el tromboxano A2, y se adhieren entre sí para formar un tapón plaquetario que se estabiliza por fibrina para convertirse en un coágulo.

Como se usa en el presente documento, el aumento de la unión y/o afinidad por plaquetas activadas, y cualquiera de sus variaciones gramaticales, se refiere a una capacidad potenciada de un polipéptido o proteína, por ejemplo, un polipéptido de FVII, para unirse con la superficie de una plaqueta activada, en comparación con un polipéptido o proteína de referencia. Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido de FVII modificado para unirse con plaquetas activadas puede ser mayor que la capacidad del polipéptido de FVII no modificado para unirse con plaquetas 65 activadas. La unión y/o afinidad de un polipéptido por plaquetas activadas puede aumentarse en al menos

aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la unión y/o afinidad de un polipéptido no modificado. En la técnica se conocen ensayos para determinar la unión y/o afinidad de un polipéptido por plaquetas activadas. La unión de un polipéptido de FVII con plaquetas activadas está mediada a través de la interacción de aminoácidos en el dominio Gla del polipéptido de FVII y de fosfolípidos con carga negativa, tales como 5 fosfatidilserina, en la plaqueta activada. Como tales, los métodos para ensayar con respecto a la unión de polipéptidos, tales como los polipéptidos de FVII, con plaquetas activadas, usan membranas y vesículas que contienen fosfolípidos, tales como fosfatidilserina. Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido para unirse con una plaqueta activada se refleja por la capacidad del polipéptido para unirse con vesículas fosfolipídicas, que puede medirse con técnicas de dispersión de la luz. 10

Como se usa en el presente documento, el aumento de la unión y/o afinidad por fosfolípidos, y cualquiera de sus variaciones gramaticales, se refiere a una capacidad potenciada de un polipéptido o proteína para unirse con fosfolípidos en comparación con un polipéptido o proteína de referencia. Los fosfolípidos pueden incluir cualquier fosfolípido, pero particularmente incluyen fosfatidilserina. La unión y/o afinidad de un polipéptido por fosfolípidos 15 puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la unión y/o afinidad de un polipéptido no modificado. En la técnica se conocen ensayos para determinar la afinidad y/o unión de un polipéptido con fosfolípidos. Por ejemplo, la unión del polipéptido de FVII con vesículas fosfolipídicas puede determinarse por dispersión de la luz relativa a 90º con respecto a la luz incidente. La intensidad de la dispersión de 20 la luz, solo con vesículas fosfolipídicas y con vesículas fosfolipídicas con FVII, se mide para determinar la constante de disociación. También puede usarse resonancia de plasmón superficial, tal como en un instrumento biodetector BIAcore, para medir la afinidad de polipéptidos de FVII por membranas fosfolipídicas.

Como se usa en el presente documento, el aumento de la resistencia a inhibidores o “aumento de la resistencia a 25 IRFT” o “aumento de la resistencia a AT-III” se refiere a cualquier cantidad de sensibilidad reducida de un polipéptido a los efectos inhibidores de un inhibidor, tal como IRFT o AT-III, en comparación con un polipéptido de referencia, tal como un polipéptido de FVII no modificado. Por ejemplo, el IRFT, formando complejo con FXa, se une con el complejo FT/FVIIa. Al hacer esto, inhibe la actividad de FVIIa. Por lo tanto, un polipéptido de FVII modificado que reduce o impide la unión de IRFT o el complejo de FT/FVIIa, y por lo tanto reduce o impide la inhibición mediada por 30 IRFT de la actividad de FVIIa, presenta resistencia aumentada a IRFT. La resistencia aumentada a un inhibidor, tal como IRFT, puede ensayarse evaluando la unión de un polipéptido de FVII modificado con un inhibidor. La resistencia aumentada a un inhibidor, tal como IRFT, también puede ensayarse midiendo la actividad intrínseca o actividad coagulante de un polipéptido de FVII en presencia de IRFT. En la técnica se conocen ensayos para determinar la unión de un polipéptido con un inhibidor, tal como IRFT o AT-III. Para inhibidores no covalentes, tales 35 como, por ejemplo, IRFT, puede medirse la ki. Para inhibidores covalentes, tales como, por ejemplo, AT-III, puede medirse una constante de velocidad de segundo orden para la inhibición. Además, también puede usarse resonancia de plasmón superficial, tal como en un instrumento biodetector BIAcore, para medir la unión de polipéptidos de FVII con IRFT, AT-III u otros inhibidores. Sin embargo, para inhibidores covalentes, tales como AT-III, solamente puede medirse una velocidad de disociación usando BIAcore. En la técnica se conocen ensayos para 40 determinar el efecto inhibidor, por ejemplo, del IRFT sobre la actividad coagulante o actividad intrínseca de FVII. Por ejemplo, puede medirse la capacidad de un polipéptido de FVII modificado para escindir su sustrato FX en presencia o ausencia de IRFT, y puede determinarse el grado al cual el IRFT inhibe la reacción. Esto puede compararse con la capacidad de un polipéptido de FVII no modificado para escindir su sustrato FX en presencia o ausencia de IRFT. Un polipéptido modificado que muestra resistencia aumentada a un inhibidor muestra, por ejemplo, un aumento de 1 45 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más resistencia a los efectos de un inhibidor en comparación con un polipéptido no modificado.

Como se usa en el presente documento, “actividad biológica” se refiere a las actividades in vivo de un compuesto o 50 respuestas fisiológicas que resultan tras la administración in vivo de un compuesto, composición u otra mezcla. La actividad biológica, por lo tanto, abarca efectos terapéuticos y actividad farmacéutica de dichos compuestos, composiciones y mezclas. Las actividades biológicas pueden observarse en sistemas in vitro diseñados para ensayar o usar dichas actividades. Por lo tanto, para los fines del presente documento una actividad biológica de un polipéptido de FVII abarca la actividad coagulante. 55

Como se usa en el presente documento, se pretende que el término “evaluar” y variaciones gramaticales del mismo, incluya la determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la actividad de un polipéptido, y también de obtener un índice, relación, porcentaje, valor visual u otro indicativo del nivel de la actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, la detección de la escisión de un sustrato por un 60 polipéptido puede ser por medición directa del producto, o puede medirse indirectamente determinando la actividad resultante del sustrato escindido.

Como se usa en el presente documento, “numeración de quimotripsina” se refiere a la numeración de aminoácidos de un polipéptido de quimotripsina maduro de SEC ID Nº: 107. El alineamiento de un dominio de proteasa de otra 65 proteasa, tal como, por ejemplo, el dominio de proteasa del factor VII, puede realizarse con quimotripsina. En este

caso, se proporcionan los aminoácidos del factor VII que corresponden a los aminoácidos de quimotripsina en la numeración de los aminoácidos de quimotripsina. Un experto en la materia puede determinar las posiciones correspondientes por dicho alineamiento usando alineamientos manuales o usando los numerosos programas de alineamiento disponibles (por ejemplo, BLASTP). Las posiciones correspondientes también pueden basarse en alineamientos estructurales, por ejemplo, usando alineamientos simulados por ordenador de la estructura proteica. 5 La enumeración de que los aminoácidos de un polipéptido corresponden a aminoácidos en una secuencia desvelada se refiere a aminoácidos identificados tras el alineamiento del polipéptido con la secuencia desvelada para maximizar la identidad u homología (donde se alineen aminoácidos conservados) usando un algoritmo de alineamiento convencional, tal como el algoritmo GAP. En la Tabla I se proporcionan los números de las posiciones de aminoácidos de quimotripsina correspondientes 153 a 406 del polipéptido de FVII expuestos en SEC ID Nº: 3. 10 Las posiciones de aminoácidos relativas a la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 3 están en letra normal, los restos de aminoácidos en esas posiciones están en negrita, y los números de quimotripsina correspondientes están en cursiva. Por ejemplo, después del alineamiento del factor VII maduro (SEC ID Nº: 3) con la quimotripsina madura (SEC ID Nº: 107), a la isoleucina (I) en la posición de aminoácido 153 en el factor VII se le da la numeración de 116 de la quimotripsina. Los aminoácidos posteriores se enumeran en consecuencia. En un ejemplo, un ácido glutámico 15 (E) en la posición de aminoácido 210 del factor VII maduro (SEC ID Nº: 3) corresponde a la posición de aminoácido E70 basándose en la numeración de la quimotripsina. Cuando en una proteasa existe un resto, pero este no está presente en la quimotripsina, al resto de aminoácido se le da una notación de una letra. Por ejemplo, los restos en la quimotripsina que son parte de un bucle con el aminoácido 60 basado en la numeración de quimotripsina, pero se insertan en la secuencia del factor VII en comparación con quimotripsina, se denominan por ejemplo, K60a, 160b, 20 K60c o N60d. Estos restos corresponden a K197, I198, K199 y N200, respectivamente, por numeración en relación con la secuencia de factor VII madura (SEC ID Nº: 3).

Tabla 1. Numeración de quimotripsina del factor VII

I: V G G K V C P K G E C P W Q

V: L L L V N G A Q L C G G T L

I: N T I W V V S A A H C F D K














: 60A

I: K N W R N L I A V L G E H D

60B: 60C 60D

L: S E H D G D E Q S R R V A Q

V: I I P S T Y V P G T T N H D

I: A L L R L H Q P V V L T D H

V
V: P L C L P E R T F S E R T












: 129A 129B 129C

L: A F V R F S L V S G W G Q
L

129D: 129E 129F 129G

L: D R G A T A L E L M V L N V

P: R L M T Q D C L Q Q S R K V










: 170A 170B 170C 170D 170E

G: D S P N I T E Y M F C A G Y

170F: 170G 170H 184A

S: D G S K D S C K G D S G G P



: 188A

H: A T H Y R G T W Y L T G I V

S: W G Q G C A T V G H F G V Y






: 221A

T: R V S Q Y I E W L Q K L M R

S: E P R P G V L L R A P F P

Como se usa en el presente documento, los ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN y análogos de los mismos, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (ANP) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser mono o bicatenarios. Cuando se hace referencia a sondas o cebadores, que están opcionalmente marcados, tal como con un marcador detectable, tal como un marcador fluorescente o radiomarcador, se contemplan moléculas 5 monocatenarias. Dichas moléculas tienen típicamente una longitud tal, que su diana es estadísticamente única o tiene un número de copias bajo (típicamente menos de 5, generalmente menos de 3) para explorar o preparar una biblioteca. En general una sonda o un cebador contienen al menos 14, 16 o 30 nucleótidos contiguos de secuencia complementaria o idéntica a un gen de interés. Los cebadores y las sondas pueden tener una longitud de 10, 20, 30, 50, 100 ácidos nucleicos o más. 10

Como se usa en el presente documento, un péptido se refiere a un polipéptido que tiene una longitud de 2 a 40 aminoácidos.

Como se usa en el presente documento, los aminoácidos que aparecen en las diversas secuencias de aminoácidos 15 proporcionadas en el presente documento se identifican de acuerdo con su abreviatura conocida de tres letras o de una letra (Tabla 1). Los nucleótidos que aparecen en los diversos fragmentos de ácido nucleico se designan con las designaciones convencionales de una letra usadas habitualmente en la técnica.

Como se usa en el presente documento, un “aminoácido” es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y 20 un grupo de ácido carboxílico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. Para fines del presente documento, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos de origen natural, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácidos (es decir, aminoácidos donde el carbono  tiene una cadena lateral).

De conformidad con la nomenclatura de polipéptidos convencional, descrita en J. Biol. Chem., 243: 3552-3559 25 (1969), y adoptada por el 37 C.F.R. (Code of Federal Regulations capítulo 37) §§ 1.821-1.822, en la Tabla 2 se muestran las abreviaturas de los restos de aminoácidos:

Tabla 2 – Tabla de Correspondencia

SÍMBOLO

1-Letra: 3-Letras AMINOÁCIDO

Y: Tyr Tirosina

G: Gly Glicina

F: Phe Fenilalanina

M: Met Metionina

A: Ala Alanina

S: Ser Serina

SÍMBOLO

1-Letra: 3-Letras AMINOÁCIDO

I: Ile Isoleucina

L: Leu Leucina

T: Thr Treonina

V: Val Valina

P: Pro prolina

K: Lys Lisina

H: His Histidina

Q: Gln Glutamina

E: Glu Ácido glutámico

Z: Glx Glu y/o Gin

W: Trp Triptófano

R: Arg Arginina

D: Asp Ácido aspártico

N: Asn Asparagina

B: Asx Asn y/o Asp

C: Lys Cisteína

X: Xaa Desconocido u otro

Debería observarse que todas las secuencias de restos de aminoácidos representadas en el presente documento por fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del extremo amino terminal al extremo carboxilo terminal. Además, la expresión “resto de aminoácido” se define en general para incluir los aminoácidos enumerados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 2) y aminoácidos modificados y poco habituales, 5 tales como los indicados en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.82. Además, debería observarse que un guión al comienzo o al final de una secuencia de restos de aminoácidos indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o más restos de aminoácidos, con un grupo amino terminal tal como NH2 o con un grupo carboxilo terminal tal como COOH.

Como se usa en el presente documento, un “aminoácido hidrófobo” incluye uno cualquiera de los aminoácidos que se ha determinado que son hidrófobos usando la escala consenso de hidrofobicidad de Eisenberg. Son ejemplares los aminoácidos hidrófobos de origen natural tales como isoleucina, fenilalanina, valina, leucina, triptófano, metionina, alanina, glicina, cisteína y tirosina (Eisenberg et al., (1982) Faraday Symp. Chem. Soc. 17: 109-120). También se incluyen aminoácidos hidrófobos de origen no natural. 15

Como se usa en el presente documento, un “aminoácido ácido” incluye entre los aminoácidos de origen natural restos de ácido aspártico y ácido glutámico. También se incluyen aminoácidos ácidos de origen no natural.

Como se usa en el presente documento, “aminoácidos de origen natural” se refiere a los 20 aminoácidos L que 20 aparecen en polipéptidos.

Como se usa en el presente documento, “aminoácido no natural” se refiere a un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo de ácido carboxílico que no es uno de los aminoácidos de origen natural enumerados en la Tabla 2. Por tanto, los aminoácidos de origen no natural incluyen, por ejemplo, aminoácidos o análogos de 25 aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos de origen natural e incluyen, pero sin limitación, los D-isoesterómeros de aminoácidos. Los expertos en la materia conocen aminoácidos no naturales ejemplares y éstos pueden incluirse en un polipéptido de factor VII modificado.

Como se usa en el presente documento, una construcción de ADN es una molécula de ADN mono o bicatenaria, 30 lineal o circular que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera que no se encuentra en la naturaleza. Las construcciones de ADN existen como resultado de la manipulación humana, e incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas.

Como se usa en el presente documento, un segmento de ADN es una parte de una molécula de ADN más grande 35 que tiene atributos específicos. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido específico es una parte de una molécula de ADN más larga, tal como un plásmido o fragmento plasmídico que, cuando se lee en la dirección de 5’ a 3’, codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido específico.

Como se usa en el presente documento, el término polinucleótido significa un polímero mono o bicatenario de bases 40 desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leídas del extremo 5’ al 3’. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden aislarse de fuentes naturales, sintetizarse in vitro, o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula polinucleotídica se proporciona en el presente documento con respecto a nucleótidos (abreviado “nt”) o pares de bases (abreviado “pb”). El término nucleótido se usa para moléculas mono y bicatenarias cuando el contexto lo permita. Cuando el término se aplica moléculas bicatenarias se 45 usa para indicar la longitud en general y se entenderá que es equivalente a la expresión pares de bases. Se

reconocerá por los expertos en la materia que las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente en su longitud y que sus extremos pueden estar alternados; por lo tanto no todos los nucleótidos dentro de una molécula polinucleotídica bicatenaria pueden estar emparejados. Dichos extremos no emparejados no excederán, en general, los 20 nucleótidos de longitud.

Como se usa en el presente documento, “secuencia primaria” se refiere a la secuencia de restos de aminoácidos en un polipéptido.

Como se usa en el presente documento, “similitud” entre dos proteínas o ácidos nucleicos se refiere a la relación entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos. La 10 similitud puede basarse en el grado de identidad y/u homología de secuencias de restos y los restos contenidos en los mismos. Los expertos en la materia conocen métodos para evaluar el grado de similitud entre proteínas o ácidos nucleicos. Por ejemplo, en un método para evaluar la similitud de secuencia, se alinean dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos de una manera que produce un nivel de identidad máximo entre las secuencias. La “identidad” se refiere al grado al cual las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son invariantes. El alineamiento 15 de secuencias de aminoácidos, y en algún grado de secuencias de nucleótidos, también puede tener en cuenta diferencias conservativas y/o sustituciones frecuentes en aminoácidos (o nucleótidos). Son diferencias conservativas las que conservan las propiedades físico-químicas de los restos implicados. Los alineamientos pueden ser globales (alineamiento de las secuencias comparadas sobre la longitud completa de las secuencias e incluyendo todos los restos a) o locales (el alineamiento de una parte de las secuencias que incluye solamente la región o las regiones 20 más similares).

Como se usa en el presente documento, los términos “homología” e “identidad” se usan de forma intercambiable, pero la homología para proteínas puede incluir cambios de aminoácidos conservativos. En general para identificar las posiciones correspondientes las secuencias de aminoácidos se alinean de modo que se obtenga la coincidencia 25 de mayor orden (véase, por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 30 48:1073).

Como se usa en el presente documento, “identidad secuencia” se refiere al número de aminoácidos (o bases nucleotídicas) idénticos en una comparación entre un ensayo y un polipéptido o polinucleótido de referencia. Los polipéptidos homólogos se refieren a un número predeterminado de restos de aminoácidos idénticos u homólogos. 35 La homología incluye sustituciones de aminoácidos conservativas así como restos idénticos. La identidad de secuencia puede determinarse por programas de algoritmos de alineamiento convencionales usados con penalizaciones de hueco por defecto establecidas por cada proveedor. Las moléculas de ácido nucleico homólogas se refieren a un número predeterminado de nucleótidos idénticos u homólogos. La homología incluye sustituciones que no cambian el aminoácido codificado (es decir, “sustituciones silenciosas”) así como restos idénticos. Las 40 moléculas de ácido nucleico sustancialmente homólogas hibridan típicamente a rigurosidad moderada o alta rigurosidad a lo largo de toda la longitud del ácido nucleico o a lo largo de al menos aproximadamente 70 %, 80 % 90 % de la molécula de ácido nucleico de longitud completa de interés. También se contemplan moléculas de ácido nucleico que contienen codones degradados en lugar de codones en la molécula de ácido nucleico de hibridación. (Para la determinación de la homología de las proteínas, pueden alinearse aminoácidos conservativos así como 45 aminoácidos idénticos; en este caso, el porcentaje de identidad y porcentaje de homología varía). Puede determinarse si dos moléculas de ácido nucleico cualesquiera tienen secuencias de nucleótidos (o dos polipéptidos cualesquiera tienen secuencias de aminoácidos) que son al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % “idénticos” usando algoritmos informáticos conocidos tales como el programa “FAST A” usando, por ejemplo, los parámetros por defecto como en Pearson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) (otros programas 50 incluyen el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994), y Carillo et al. SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)). Por ejemplo, la función BLAST de la base de datos del Centro Nacional para la Información Biotecnológica puede usarse para determinar la identidad. Otros programas disponibles públicamente o en el mercado incluyen el programa DNAStar 55 “MegAlign” (Madison, WI) y el programa “Gap” del Grupo de Informática Genética de la Universidad de Wisconsin (UWG)) (Madison WI)). Puede determinarse el porcentaje de homología o identidad de proteínas y/o moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, comparando la información de secuencia usando un programa informático GAP (por ejemplo, Needleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), como se revisa en Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)). Brevemente, un programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, 60 nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido entre el número total de símbolos en la más corta de las dos secuencias. Los parámetros por defecto para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unaria (que contiene un valor de 1 para identidades y de 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada de Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986), como se describe en Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358 (1979); (2) una penalización de 65 3,0 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo en cada hueco; y (3) sin penalización

para los huecos finales.

Por lo tanto, como se usa en el presente documento, el término “identidad” representa una comparación entre un polipéptido o polinucleótido de ensayo y uno de referencia. En un ejemplo no limitante, “al menos 90 % idéntico a” se refiere a porcentajes de identidad del 90 al 100 % en relación con los polipéptidos de referencia. La identidad a un 5 nivel del 90 % o más es indicativa del hecho de que, suponiendo para fines de ejemplificación que se comparan una longitud de polinucleótido de ensayo y de referencia de 100 aminoácidos, no más del 10 % (es decir, 10 de 100) de los aminoácidos en el polipéptido de ensayo difieren de los de los polipéptidos de referencia. Pueden realizarse comparaciones similares entre un polinucleótido de ensayo y uno de referencia. Dichas diferencias pueden representarse como mutaciones puntuales distribuidas aleatoriamente sobre la longitud completa de una secuencia 10 de aminoácidos o pueden agruparse en una o más localizaciones de diversa longitud hasta el máximo permisible, por ejemplo, diferencia de 10/100 aminoácidos (aproximadamente 90 % de identidad). Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones o deleciones de ácidos nucleicos o aminoácidos. Al nivel de homologías o identidades por encima de aproximadamente 85-90 %, el resultado debería ser independiente del programa y los parámetros de huecos establecidos; pudiendo dichos altos niveles de identidad evaluarse fácilmente, con frecuencia 15 sin basarse en programación informática.

Como se usa en el presente documento, también se entiende que las expresiones “sustancialmente idéntico” o “similar” varían con el contexto tal y como entienden los expertos en la técnica relevante, aunque dichos expertos puede realizar evaluaciones al respecto. 20

Como se usa en el presente documento, una secuencia alineada se refiere al uso de homología (similitud y/o identidad) para alinear posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Típicamente, se alinean dos o más secuencias que están relacionadas por 50 % o más de identidad. Un conjunto de secuencias alineado se refiere a 2 o más secuencias que se alinean en posiciones correspondientes y puede incluir alinear 25 secuencias derivadas de ARN, tales como de EST (marcadores de secuencia expresada) y otros ADNc, alineados con una secuencia de ADN genómico.

Como se usa en el presente documento, “hibrida específicamente” se refiere a la hibridación, por formación de pares de bases complementarias, de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido) con una molécula 30 de ácido nucleico diana. Los expertos en la materia están familiarizados con parámetros in vitro e in vivo que afectan a la hibridación específica, tal como la longitud y composición de la molécula particular. Los parámetros particularmente relevantes para la hibridación in vitro incluyen además atemperación y temperatura de lavado, composición de tampón y concentración salina. Las condiciones de lavado ejemplares para retirar moléculas de ácido nucleico no unidas específicamente a alta rigurosidad son SSPE 0,1 x, SDS 0,1 %, 65 ºC, y a rigurosidad 35 media son SSPE 0,2 x, SDS 0,1 %, 50 ºC. En la técnica se conocen condiciones de rigurosidad equivalentes. El experto en la materia puede ajustar fácilmente esos parámetros para conseguir la hibridación específica de una molécula de ácido nucleico con una molécula de ácido nucleico diana apropiada para una aplicación particular.

Como se usa en el presente documento, una proteína o un polipéptido aislado o purificado, o parte biológicamente 40 activa del mismo, está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula del tejido del cual procede la proteína, o está sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos, cuando se sintetizan químicamente. Pueden determinarse preparaciones sustancialmente libres si aparecen libres de impurezas fácilmente detectables como se determina por métodos convencionales de análisis, tales como cromatografía en capa fina (TLC), electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), usados 45 por los expertos en la materia para evaluar dicha pureza, o suficientemente puras de modo que una purificación adicional no alteraría de forma detectable las propiedades físicas y químicas, tales como actividades proteolíticas y biológicas, de la sustancia. Los expertos en la materia conocen métodos de purificación de los compuestos para producir compuestos sustancialmente puros desde el punto de vista químico. Sin embargo, un compuesto sustancialmente puro desde el punto de vista químico, puede ser una mezcla de estereoisómeros. En dichos casos, 50 la purificación adicional podría aumentar la actividad específica del compuesto.

La expresión sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteínas en las que la proteína se separa de componentes celulares de las células de las que se aísla o se produce de forma recombinante. La expresión sustancialmente libre de material celular puede incluir preparaciones de proteínas de proteasa que tienen 55 menos de aproximadamente 30 % (en peso seco) de proteínas no proteasa (también denominadas en el presente documento una proteína contaminante), generalmente menor de aproximadamente 20 % de proteínas no proteasa o 10 % de proteínas no proteasa o menor de aproximadamente el 5 % de proteínas no proteasa. Cuando la proteína proteasa o parte activa de la misma se produce de forma recombinante, también está sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de, aproximadamente, o igual a 20 %, 10 % o 5 % 60 del volumen de la preparación de proteína proteasa.

Como se usa en el presente documento, la expresión sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos incluye preparaciones de proteínas proteasa en las que la proteína se separa de precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. La expresión incluye 65 preparaciones de proteínas proteasa que tienen menos de aproximadamente 30 % (en peso seco), 20 %, 10 %, 5 %

o menos de precursores químicos o productos químicos o componentes no de proteasa.

Como se usa en el presente documento, la producción por métodos recombinantes usando métodos de ADN recombinantes se refiere al uso de los métodos bien conocidos de biología molecular, para expresar proteínas codificadas por ADN clonado. 5

Como se usa en el presente documento, vector (o plásmido) se refiere a elementos distintos que se usan para introducir ácido nucleico heterólogo en células bien para la expresión o replicación de los mismos. Los vectores típicamente permanecen episómicos, pero pueden diseñarse para efectuar integración de un gen o parte del mismo en un cromosoma del genoma. También se contemplan vectores que son cromosomas artificiales, tales como 10 cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura y cromosomas artificiales de mamífero. Los expertos en la materia conocen bien la selección y el uso de dichos vehículos.

Como se usa en el presente documento, la expresión se refiere al proceso por el cual el ácido nucleico se transcribe a ARNm y se traduce en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el ácido nucleico procede de ADN genómico, la 15 expresión puede, si se selecciona una célula u organismo hospedador eucariota apropiado, incluir procesamiento, tal como el corte y empalme del ARNm.

Como se usa en el presente documento, un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que está unido operativamente con secuencias reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la 20 expresión de dichos fragmentos de ADN. Dichos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación, y similares. Los vectores de expresión generalmente proceden de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos. Por lo tanto, un vector de expresión se refiere a una construcción de ADN o ARN recombinante, tal como un plásmido, un fago, virus recombinante u otro 25 vector que, tras la introducción en una célula hospedadora apropiada, da como resultado la expresión del ADN clonado. Los expertos en la materia conocen bien vectores de expresión apropiados e incluyen los que pueden replicarse en células eucariotas y/o células procariotas y los que permanecen episómicos o los que se integran en el genoma de la célula hospedadora.

Como se usa en el presente documento, el vector también incluye “vectores de virus” o “vectores virales”. Los vectores virales son virus modificados genéticamente que están unidos operativamente con genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas) los genes exógenos a las células.

Como se usa en el presente documento, un adenovirus se refiere a cualquiera de un grupo de virus que contienen 35 ADN que provocan conjuntivitis e infecciones del tracto respiratorio superior en seres humanos.

Como se usa en el presente documento, ADN desnudo se refiere a ADN sin histonas que puede usarse para vacunas y terapia génica. El ADN desnudo es el material genético que se pasa de célula a célula durante una transferencia génica procesada denominada trasformación o transfección. En la trasformación o transfección, el 40 ADN purificado o desnudo que capta la célula receptora proporcionará a la célula receptora una nueva característica o fenotipo.

Como se usa en el presente documento, unido operativamente o de forma operativa en referencia a segmentos de ADN, significa que los segmentos se disponen de modo que actúen en concierto para sus fines pretendidos, por 45 ejemplo, la transcripción se inicia en el promotor y continúa a través del segmento codificante hasta el terminador.

Como se usa en el presente documento, un agente que modula la actividad de una proteína o expresión de un gen o ácido nucleico bien reduce o bien aumenta o de otro modo altera la actividad de la proteína o, de alguna manera, regula positiva o negativamente o altera de otro modo la expresión del ácido nucleico en una cédula. 50

Como se usa en el presente documento, una “proteína quimérica” o “proteína de fusión” se refiere a un polipéptido unido operativamente a un polipéptido diferente. Una proteína quimérica o de fusión proporcionada en el presente documento puede incluir uno o más polipéptidos de FVII, o una parte de los mismos, y uno o más polipéptidos adicionales para una cualquiera o más de señales de control de la transcripción/traducción, secuencias señal, un 55 marcador de localización, un marcador de purificación, parte de un dominio de una inmunoglobulina G y/o un agente de dirección. Un polipéptido de FVII quimérico también incluye los que tienen sus dominios endógenos o regiones del polipéptido intercambiados con otro polipéptido. Estas proteínas quiméricas o de fusión incluyen las producidas por medios recombinantes, como proteínas de fusión, las producidas por medios químicos, tales como por acoplamiento químico, mediante, por ejemplo, acoplamiento con grupos de sulfhidrilo, y las producidas por cualquier 60 otro método mediante el cual al menos un polipéptido (es decir FVII), o una parte del mismo, se une, directa o indirectamente, a través de uno o más enlazadores, con otro polipéptido.

Como se usa en el presente documento, unido operativamente, cuando se refiere a una proteína de fusión, se refiere a un polipéptido de proteasa y a un polipéptido no de proteasa que se fusionan en fase entre sí. El polipéptido 65 no de proteasa puede fusionarse con el extremo N terminal o C terminal del polipéptido de proteasa.

Como se usa en el presente documento, un agente de dirección es cualquier resto, tal como una proteína o parte efectiva de la misma, que proporciona unión específica con una molécula de superficie celular, tal como un receptor de superficie celular, que en algunos casos puede internalizar un conjugado unido o parte del mismo. Un agente de dirección también puede ser uno que promueva o facilite, por ejemplo, el aislamiento o purificación de afinidad del conjugado; la unión del conjugado con una superficie; o la detección del conjugado o complejos que contienen el 5 conjugado.

Como se usa en el presente documento, un derivado o un análogo de una molécula se refiere a una parte derivada de o a una versión modificada de la molécula.

Como se usa en el presente documento, “enfermedad o trastorno” se refiere a una afección patológica en un organismo resultante de una causa o afección incluyendo, pero sin limitación, infecciones, afecciones adquiridas, afecciones genéticas, y caracterizadas por síntomas identificables. Las enfermedades y trastornos de interés del presente documento son las que implican coagulación, incluyendo las mediadas por proteínas de coagulación y aquellas en las que las proteínas de coagulación desempeñan un papel en la etiología o patología. Las 15 enfermedades y trastornos también incluyen las que están ocasionadas por la ausencia de una proteína tal como en hemofilia, y son de particular interés en el presente documento los trastornos en los que no se produce coagulación debido a un déficit o defecto de una proteína de coagulación.

Como se usa en el presente documento, “procoagulante” se refiere a cualquier sustancia que promueva la 20 coagulación sanguínea.

Como se usa en el presente documento, “anticoagulante” se refiere a cualquier sustancia que inhiba la coagulación sanguínea.

Como se usa en el presente documento, “hemofilia” se refiere a un trastorno hemorrágico provocado por un déficit de factores de coagulación sanguínea. La hemofilia puede ser el resultado, por ejemplo, de ausencia, expresión reducida, o función reducida de un factor de coagulación. El tipo más común de hemofilia es la hemofilia A, que resulta de un déficit del factor VIII. El segundo tipo más común de la hemofilia es la hemofilia B, que resulta de un déficit del factor IX. La hemofilia C, también denominada déficit del FXI, es una forma más leve y menos común de 30 hemofilia.

Como se usa en el presente documento, “hemofilia congénita” se refiere a tipos de hemofilia que se heredan. La hemofilia congénita resulta de mutación, deleción, inserción u otra modificación de un gen del factor de coagulación en el que la producción del factor de coagulación está ausente, reducida o no es funcional. Por ejemplo, las 35 mutaciones hereditarias en genes de factores de coagulación, tales como factor VIII y factor IX, dan como resultado las hemofilias congénitas, Hemofilia A y B, respectivamente.

Como se usa en el presente documento, “hemofilia adquirida” se refiere a un tipo de hemofilia que se desarrolla en adultos a partir de la producción de autoanticuerpos que inactivan el FVIII. 40

Como se usa en el presente documento, “trastorno hemorrágico” se refiere a una afección en la que el sujeto tiene una capacidad reducida para controlar la hemorragia. Los trastornos hemorrágicos pueden heredarse o adquirirse, y pueden resultar, por ejemplo, de defectos o déficits en la ruta de coagulación, defectos o déficits en la actividad de las plaquetas, o defectos vasculares. 45

Como se usa en el presente documento, “trastorno hemorrágico adquirido” se refiere a trastornos hemorrágicos producidos por déficits de coagulación causados por afecciones tales como enfermedad hepática, déficit de vitamina K o terapia con coumadina (warfarina) u otro anticoagulante.

Como se usa en el presente documento, “tratar” a un sujeto que tiene una enfermedad o afección significa que al sujeto se le administra un polipéptido, una composición u otro producto proporcionado en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, un agente terapéutico, régimen terapéutico, radioprotector o producto quimioterapéutico significa fármacos y terapias farmacológicas convencionales, incluyendo vacunas, conocidos por 55 los expertos en la materia. En la técnica se conocen bien agentes radioterapéuticos.

Como se usa en el presente documento, tratamiento significa cualquier manera en la que los síntomas de una afección, trastorno o enfermedad se mejoran o, de otra forma, se alteran beneficiosamente. Por lo tanto el tratamiento incluye profilaxis, terapia y/o cura. El tratamiento también incluye cualquier uso farmacéutico de las 60 composiciones del presente documento. El tratamiento también incluye cualquier uso farmacéutico de un FVII modificado y composiciones proporcionadas en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, la mejora de los síntomas de una enfermedad o trastorno particular por un tratamiento, tal como por la administración de una composición farmacéutica u otro producto terapéutico, se refiere a 65 cualquier reducción, bien permanente o bien temporal, duradera o transitoria, de los síntomas que pueden atribuirse

a o asociarse con la administración de la composición o producto terapéutico.

Como se usa en el presente documento, prevención o profilaxis se refiere a métodos en los que se reduce el riesgo de desarrollar una enfermedad o afección. La profilaxis incluye la reducción del riesgo de desarrollar una enfermedad o afección y/o una prevención del empeoramiento de los síntomas o progresión de una enfermedad o 5 reducción del riesgo de empeoramiento de síntomas o progresión de una enfermedad.

Como se usa en el presente documento una cantidad eficaz de un compuesto o composición para tratar una enfermedad particular es una cantidad que es suficiente para mejorar, o de alguna manera, reducir los síntomas asociados con la enfermedad. Dicha cantidad puede administrarse como una única dosificación o puede 10 administrarse de acuerdo con un régimen, por el que es eficaz. La cantidad puede curar la enfermedad pero, típicamente, se administra para mejorar los síntomas de la enfermedad. Típicamente, se requiere la administración repetida para conseguir una mejoría deseada de los síntomas.

Como se usa en el presente documento, “cantidad terapéuticamente eficaz” o “dosis terapéuticamente eficaz” se 15 refiere a un agente, compuesto, material o composición que contiene un compuesto que es al menos suficiente para producir un efecto terapéutico. Una cantidad eficaz es la cantidad necesaria de un agente terapéutico para prevenir, curar, mejorar, detener, o detener parcialmente, un síntoma de una enfermedad o trastorno.

Como se usa en el presente documento, “paciente” o “sujeto” a tratar incluye seres humanos y/o animales no 20 humanos, incluyendo mamíferos. Los mamíferos incluyen primates, tales como seres humanos, chimpancés, gorilas y monos; animales domésticos, tales como perros, caballos, gatos, cerdos, cabras, vacas; y roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y jerbos.

Como se usa en el presente documento, una combinación se refiere a cualquier asociación entre dos o entre más 25 elementos. La asociación puede ser espacial o referirse al uso de los dos o más elementos para un fin común.

Como se usa en el presente documento, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos o compuestos (por ejemplo, agentes, moduladores, reguladores, etc.). Puede ser una solución, una suspensión, un líquido, un polvo, una pasta, formulaciones acuosas o no acuosas o cualquier combinación de los mismos. 30

Como se usa en el presente documento, un “artículo de fabricación” es un producto que se prepara y se comercializa. Como se usa en toda la presente solicitud, se pretende que el término incluya polipéptidos de proteasa modificados y ácidos nucleicos contenidos en artículos de envasado.

Como se usa en el presente documento, fluido se refiere a cualquier composición que pueda fluir. Los fluidos incluyen por lo tanto composiciones que están en forma de semisólidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras composiciones de este tipo.

Como se usa en el presente documento, un “kit” se refiere a una combinación envasada, que incluye opcionalmente 40 reactivos y otros productos y/o componentes para llevar a la práctica los métodos usando los elementos de la combinación. Por ejemplo, en el presente documento se proporcionan kits que contienen un polipéptido de proteasa modificado o una molécula de ácido nucleico y otro elemento para un fin incluyendo, pero sin limitación, administración, diagnóstico y evaluación de una actividad o propiedad biológica. Los kits incluyen opcionalmente instrucciones para su uso. 45

Como se usa en el presente documento, anticuerpo incluye fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos Fab, que están compuestos de una cadena ligera y de la región variable de una cadena pesada.

Como se usa en el presente documento, un receptor se refiere a una molécula que tiene una afinidad por un ligando 50 particular. Los receptores pueden ser moléculas sintéticas o de origen natural. Los receptores también pueden denominarse en la técnica anti-ligandos.

Como se usa en el presente documento, animal incluye cualquier animal, tal como, pero sin limitación; primates incluyendo seres humanos, gorilas y monos; roedores, tales como ratones y ratas; aves de corral tales como pollos; 55 rumiantes, tales como cabras, vacas, ciervos, ovejas; ganado ovino, cerdos y otros animales. Los animales no humanos excluyen a los seres humanos como el animal contemplado. Las proteasas proporcionadas en el presente documento son de cualquier fuente, animal, vegetal, procariota y fúngica.

Como se usa en el presente documento, la terapia génica implica la transferencia de ácido nucleico heterólogo, tal 60 como ADN, a ciertas células, células diana, de un mamífero, particularmente un ser humano, con un trastorno o afección para el que se busca dicha terapia. El ácido nucleico, tal como ADN, se introduce en las células diana seleccionadas, tal como directamente o en un vector u otro vehículo de suministro, de tal manera que el ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, se exprese y se produzca un producto terapéutico codificado por el mismo. Como alternativa, el ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, puede mediar de alguna manera en la expresión de 65 ADN que codifica el producto terapéutico, o puede codificar un producto, tal como un péptido o ARN que de alguna

manera media, directa o indirectamente, en la expresión de un producto terapéutico. También puede usarse terapia génica para suministrar ácido nucleico que codifica un producto génico que reemplaza un gen defectuoso o complementa un producto génico producido por el mamífero o la célula en el que se introduce. El ácido nucleico introducido puede codificar un compuesto terapéutico, tal como una proteasa o proteasa modificada, que no se produce normalmente en el hospedador mamífero o que no se produce en cantidades terapéuticamente eficaces o 5 en un tiempo terapéuticamente útil. El ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, que codifica el producto terapéutico puede modificarse antes de su introducción en las células del hospedador aquejado para potenciar o de otro modo alterar el producto o expresión del mismo. La terapia génica también puede implicar el suministro de un inhibidor o represor u otro modulador de la expresión génica.

Como se usa en el presente documento, el ácido nucleico heterólogo es ácido nucleico que la célula, en la que se expresa, no produce normalmente in vivo o que produce la célula pero está en un locus diferente o se expresa de forma diferente o que media o codifica mediadores que alteran la expresión de ácido nucleico endógeno, tal como ADN, afectando a la transcripción, traducción, u otros procesos bioquímicos regulables. El ácido nucleico heterólogo generalmente no es endógeno de la célula en la que se introduce, sino que se ha obtenido de otra célula o se ha 15 preparado de forma sintética. El ácido nucleico heterólogo puede ser endógeno, pero es ácido nucleico que se expresa de un locus diferente o que su expresión está alterada. Generalmente, aunque no necesariamente, dicho ácido nucleico codifica ARN y proteínas que normalmente no produce la célula o en la misma manera en que se expresa en la célula. El ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, también puede denominarse ácido nucleico ajeno, tal como ADN. Por lo tanto, el ácido nucleico heterólogo o ácido nucleico ajeno incluye una molécula de ácido 20 nucleico no presente en la orientación o posición exacta en la que se encuentra en un genoma la molécula de ácido nucleico homóloga, tal como ADN. También puede referirse a una molécula de ácido nucleico de otro organismo o especie (es decir, exógena).

En el presente documento, por ácido nucleico, se incluye cualquier ácido nucleico, tal como ADN, que un experto en 25 la materia reconocería o consideraría heterólogo o ajeno a la célula en la que se expresa el ácido nucleico, ácido nucleico heterólogo incluye ácido nucleico añadido de forma exógena que también se expresa de forma endógena. Los ejemplos de ácido nucleico heterólogo, incluyen, pero sin limitación, ácido nucleico que codifica proteínas marcadoras rastreables, tales como una proteína que confiere resistencia a fármacos, ácido nucleico que codifica sustancias terapéuticamente eficaces, tales como agentes antineoplásicos, enzimas y hormonas, y ácido nucleico, 30 tal como ADN, que codifica otros tipos de proteínas, tales como anticuerpos. Los anticuerpos codificados por ácido nucleico heterólogo pueden secretarse o expresarse en la superficie de la célula en la que se ha introducido el ácido nucleico heterólogo.

Como se usa en el presente documento, un producto terapéuticamente eficaz para la terapia génica es un producto 35 codificado por ácido nucleico heterólogo, típicamente ADN que, tras la introducción del ácido nucleico en un hospedador, expresa un producto que mejora o elimina los síntomas, que exterioriza una enfermedad heredada o adquirida o que cura la enfermedad. También se incluyen moléculas de ácido nucleico biológicamente activas, tales como ARNi y antisentido.

Como se usa en el presente documento, la indicación de que un polipéptido “consiste esencialmente” en una secuencia de aminoácidos enumerada significa que solamente la parte enumerada, un fragmento de la misma, del polipéptido de longitud completa está presente. El polipéptido puede incluir opcionalmente, y en general incluirá, aminoácidos adicionales de otra fuente o puede insertarse en otro polipéptido.

Como se usa en el presente documento, las formas singulares “un”, “uno(a)”, y “el” incluyen referencias plurales a no ser que el contexto claramente dictamine otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a un compuesto, que comprende “un dominio extracelular” incluye compuestos con uno o una pluralidad de dominios extracelulares.

Como se usa en el presente documento, pueden expresarse intervalos y cantidades como “aproximadamente” un 50 valor o intervalo particular. Aproximadamente también incluye la cantidad exacta. Por lo tanto “aproximadamente 5 bases” significa “aproximadamente 5 bases” y también “5 bases”.

Como se usa en el presente documento, “opcional” u “opcionalmente” significa que el acontecimiento o circunstancia descrito a continuación sucede o no, y que la descripción incluye casos en los que dicho acontecimiento o 55 circunstancia sucede y casos en los que no. Por ejemplo, un grupo opcionalmente sustituido significa que el grupo está sustituido o que no está sustituido.

Como se usa en el presente documento, las abreviaturas para cualquier grupo protector, aminoácidos y otros compuestos son, a no ser que se indique de otro modo, de acuerdo con su uso habitual, abreviaturas reconocidas, o 60 la Comisión sobre Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB (véase, (1972) Biochem. 11: 726).

B. Generalidades de la hemostasis

En el presente documento se proporcionan polipéptidos de factor VII (FVII) modificados. Dichos polipéptidos de FVII 65 se diseñan para tener actividad coagulante aumentada. En consecuencia, estos polipéptido tienen una diversidad de

usos y aplicaciones, por ejemplo, como productos terapéuticos para modular la hemostasis, y otros procesos biológicos relacionados. Para apreciar las modificaciones proporcionadas en el presente documento y el uso de dichas moléculas de FVII modificadas, es ventajoso un entendimiento del sistema hemostático y la cascada de coagulación sanguínea. El siguiente análisis proporciona dicho trasfondo, previo a un análisis de factor VII, y modificaciones del mismo. 5

La hemostasis es el mecanismo fisiológico que detiene la hemorragia resultante de lesiones en la vasculatura. La hemostasis normal depende de componentes celulares y de proteínas solubles en plasma, e implica una serie de acontecimientos de señalización que, en última instancia, conducen a la formación de un coágulo sanguíneo. La coagulación se inicia rápidamente después de producirse una lesión en un vaso sanguíneo y dañarse las células 10 endoteliales. En la fase primaria de coagulación, las plaquetas se activan para formar un tapón hemostático en el sitio de la lesión. La hemostasis secundaria continúa implicando factores de coagulación en plasma, que actúan en una cascada proteolítica dando como resultado la formación de cadenas de fibrina que refuerzan el tapón plaquetario.

Tras la lesión de los vasos, el flujo sanguíneo al área lesionada inmediata se restringe por constricción vascular permitiendo que las plaquetas se adhieran al colágeno fibrilar recién expuesto en el tejido conectivo subendotelial. Esta adhesión depende del factor de von Willebrand (FvW) que se une con el endotelio a los tres segundos de producirse la lesión, facilitando de este modo la adhesión y la agregación plaquetaria. La activación de las plaquetas agregadas da como resultado la secreción de una diversidad de factores, incluyendo ADP, ATP, tromboxano y 20 serotonina. Se liberan también moléculas de adhesión, fibrinógeno, FvW, trombospondina y fibronectina. Dicha secreción promueve la adhesión y agregación adicional de plaquetas, aumenta la activación de plaquetas y la constricción de vasos sanguíneos, y la exposición de fosfolípidos aniónicos en la superficie de plaquetas que actúan como plataformas para el ensamblaje de complejos enzimáticos de coagulación sanguínea. Las plaquetas cambian de forma lo que conduce a la formación de pseudópodos, lo que facilita adicionalmente la agregación con otras 25 plaquetas dando como resultado un tapón de plaquetas sueltas.

Se inicia simultáneamente una cascada de coagulación de peptidasas (la cascada de coagulación). La cascada de coagulación implica una serie de acontecimientos de activación que implican escisión proteolítica. En dicha cascada, una proteína inactiva de una serina proteasa (también denominada zimógeno) se convierte en una proteasa activa 30 por escisión de uno o más enlaces peptídicos, que actúa después como la proteasa activadora para la siguiente molécula de zimógeno en la cascada, dando como resultado en última instancia la formación de coágulos por la reticulación de fibrina. Por ejemplo, la cascada genera moléculas activadas tales como trombina (a partir de la escisión de protrombina), que activa adicionalmente plaquetas, y también genera fibrina a partir de la escisión del fibrinógeno. La fibrina después forma un polímero reticulado alrededor del tapón de plaquetas para estabilizar el 35 coagulo. Tras la reparación de la lesión, la fibrina se digiere por el sistema fibrinolítico, cuyos componentes principales son el plasminógeno y el activador de plasminógeno de tipo tisular (tPA). Ambas de estas proteínas se incorporan en fibrina polimerizante, donde interaccionan para generar plasmina, que, a su vez, actúa en la fibrina para disolver el coágulo preformado. Durante la formación del coágulo, también circulan inhibidores de factores de coagulación a través de la sangre para impedir la formación de coágulos más allá del sitio de lesión. 40

La interacción del sistema, de la lesión a la formación del coágulo y posterior fibrinólisis, se describe posteriormente.

1. Adhesión y agregación plaquetaria

En condiciones normales la coagulación de la sangre se evita de forma activa. El endotelio vascular sustenta la vasodilatación, inhibe la adhesión y la activación de las plaquetas, suprime la coagulación, potencia la escisión de fibrina y es de carácter antiinflamatorio. Las células endoteliales vasculares secretan moléculas tales como óxido nitroso (NO) y prostaciclina, que inhiben la agregación plaquetaria y dilatan los vasos sanguíneos. La liberación de estas moléculas activa a las guanilato ciclasas solubles (sGC) y a la proteína quinasa I dependiente de cGMP (cGKI) 50 y aumenta los niveles de guanosín monofosfato cíclico (cGMP), lo que provoca la relajación del músculo liso en la pared vascular. Además, las células endoteliales expresan ADPasas de superficie celular, tales como CD39, que controlan la activación y agregación de las plaquetas convirtiendo el ADP liberado de las plaquetas en inhibidores de plaquetas del nucleótido de adenina. El endotelio también desempeña un papel importante en la regulación de las enzimas en la cascada fibrinolítica. Las células endoteliales promueven directamente la generación de plasmina a 55 través de la expresión de receptores de plasminógeno (anexina II) y uroquinasa, así como la secreción de activadores de plasminógeno de tipo tisular y uroquinasa, todos los cuales promueven la eliminación de coágulo. En una capa final de regulación protrombótica, las células endoteliales desempeñan un papel activo en la inhibición de la cascada de coagulación produciendo heparán sulfato que aumenta la cinética de inhibición por antitrombina III de trombina y otros factores de coagulación. 60

Sin embargo, con traumatismo vascular agudo, los mecanismos vasoconstrictores predominan y el endotelio se vuelve de naturaleza protrombótica, procoaguladora y proinflamatoria. Esto se consigue por una reducción de agentes de dilatación endotelial: adenosina, NO y prostaciclina; y por la acción directa de ADP, serotonina y tromboxano en células de músculo liso vasculares para suscitar su contracción (Becker, Heindl et al. 2000). El 65 desencadenante principal del cambio en la función endotelial que conduce a la formación de trombo hemostático es

la pérdida de la barrera celular endotelial entre los componentes de la sangre y de la matriz extracelular (MEC) (Ruggeri (2002) Nat Med 8: 1227-1234). Las plaquetas en circulación identifican y diferencian áreas de lesiones endoteliales y se adhieren al subendotelio expuesto. Su interacción con los diversos sustratos trombogénicos y agonistas liberados o generados localmente da como resultado la activación de plaquetas. Se describe que este proceso posee dos estadios, 1) adhesión: la unión inicial a una superficie, y 2) agregación: la cohesión plaqueta-5 plaqueta (Savage et al. (2001) Curr Opin Hematol 8: 270-276).

La adhesión plaquetaria se inicia cuando las plaquetas en circulación se unen con colágeno expuesto a través de la interacción con proteínas de unión a colágeno en la superficie celular, y mediante la interacción con el FvW, también presente en el endotelio. La proteína FvW es una estructura multimérica de tamaño variable, secretada en dos 10 direcciones por el endotelio; vasolateralmente y al torrente sanguíneo. El FvW también se une con el factor VIII, que es importante en la estabilización del factor VIII y en su supervivencia en la circulación.

La adhesión plaquetaria y posterior activación se consigue cuando el FvW, se une, a través de su dominio A1, con GPIb (parte del complejo del receptor de glucoproteínas de plaquetas GPIb-IX-V). La integración entre FvW y GPIb 15 se regula por esfuerzo cortante de modo que un aumento en la tensión de corte dá como resultado un aumento correspondiente en la afinidad del FvW por GPIb. La integrina 12, también conocida en leucocitos como VLA, es el principal receptor de colágeno en plaquetas, y la interacción mediante este receptor genera las señales intracelulares que contribuyen a la activación plaquetaria. La unión mediante 12 facilita la interacción del receptor de colágeno de menor afinidad, GP VI. Éste es parte de la súper familia de inmunoglobulina y es el receptor que 20 genera las señales intracelulares más potentes para la activación de plaquetas. La activación de plaquetas da como resultado la liberación de adenosín difosfato (ADP), que se convierte en tromboxano A2.

La activación plaquetaria también da como resultado la expresión en superficie de receptores de glucoproteína IIb-IIIa de plaquetas (GP IIb-IIIa), los receptores de GP IIb-IIIa permiten la adherencia de plaquetas entre sí (es decir, la 25 agregación) gracias a moléculas de fibrinógeno que unen las plaquetas mediante estos receptores. Esto da como resultado la formación de un tapón plaquetario en el sitio de lesión para ayudar a impedir la pérdida de sangre adicional, mientras que el tejido vascular dañado libera factores que inician la cascada de coagulación y la formación de una malla de fibrina estabilizante alrededor del tapón plaquetario.

2. Cascada de coagulación

La ruta de coagulación es una ruta proteolítica en la que cada enzima está presente en el plasma como un zimógeno, o forma inactiva. La escisión del zimógeno está regulada para liberar la forma activa de la molécula precursora. Los co-factores de las proteasas activadas, tales como las glucoproteínas FVII y FV, también se activan 35 en la reacción de cascada y desempeñan un papel en la formación de coágulos. La ruta actúa como una serie de bucles de retroalimentación positiva y negativa que controlan el proceso de activación, donde el objetivo final es producir trombina, que después puede convertir el fibrinógeno soluble en fibrina para formar un coágulo. Típicamente, los factores de coagulación se designan con un número romano, con una “a” minúscula adjunta para indicar una forma activada. La Tabla 3 a continuación expone una lista ejemplar de factores, incluyendo su nombre 40 común, y su papel en la cascada de coagulación. En general, estas proteínas participan en la coagulación sanguínea mediante uno o más de la ruta intrínseca, extrínseca o común de la coagulación (véase la Figura 1). Como se analiza posteriormente, estas rutas están interconectadas, y se cree que la coagulación sanguínea se produce a través de un modelo de activación basado en células siendo el factor VII (FVII) el iniciador primario de la coagulación. 45

Tabla 3

Factores de coagulación

Factor: Nombre común Ruta Característica

I

Fibrinógeno Ambas

-

II: Protrombina Ambas Contiene dominio Gla N-terminal

III

Factor tisular Extrínseca

-

IV

Calcio Ambas

-

V: Proacelerina, factor lábil, globulina aceleradora Ambas Cofactor proteico

VI (Va)

Acelerina

-

(Redundante para factor V)

VII: Proconvertina, acelerador de conversión de protrombina en suero (ACPS) cotromboplastina Extrínseca Endopeptidasa con dominio Gla

VIII: Factor antihemofílico A, globulina antihemofílica (GAH) Intrínseca Cofactor proteico

IX: Factor Christmas, factor antihemofílico B, componente de tromboplastina plasmática (CTP) Intrínseca Endopeptidasa con dominio Gla

X: Factor de Stuart-prower Ambas Endopeptidasa con dominio Gla

XI: Antecedente de tromboplastina plasmática (ATP) Intrínseca Endopeptidasa

Factores de coagulación

Factor: Nombre común Ruta Característica

XII: Factor de Hageman Intrínseca Endopeptidasa

XIII: Protransglutamidasa, factor estabilizante de fibrina (FEF), fibrinoligasa Ambas Transpeptidasa

* Tabla adaptada de M.W.King (2006) en med.unibs.it/-marchesi/blood.html

La generación de trombina se ha dividido históricamente en tres rutas, la rutas intrínseca (que sugiere que todos los componentes de la ruta son intrínsecos al plasma) y extrínseca (que sugiere que uno o más componentes de la ruta son extrínsecos al plasma) que proporcionan vías alternativas para la generación de factor X activado (FXa), y la ruta común final que da como resultado la formación de trombina (Figura 1). Estas rutas participan juntas en un 5 proceso interconectado e interdependiente para efectuar la coagulación. Se desarrolló un modelo de coagulación basado en células que describe estas rutas (Figura 2) (Hoffman et al. (2001) Thromb Haemost 85: 958-965). En este modelo, las rutas “extrínseca” e “intrínseca” se efectúan en diferentes superficies celulares, en la célula portadora de factor tisular (FT) y en la plaqueta, respectivamente. El proceso de coagulación se separa en distintas fases, inicio, amplificación y propagación, durante las cuales las rutas extrínseca e intrínseca actúan en diversos estadios para 10 producir el gran estallido de trombina requerido para convertir suficientes cantidades de fibrinógeno en fibrina para la formación de coágulos.

a. Inicio

Se considera que el FVII es el factor de coagulación responsable del inicio de la cascada de coagulación, siendo dicho inicio dependiente de su interacción con el FT. El FT es una glucoproteína transmembrana expresada por una diversidad de células tales como células de músculo liso, fibroblastos, monocitos, linfocitos, granulocitos, plaquetas y células endoteliales. Las células mieloides y células endoteliales solamente expresan FT cuando se estimulan, tal como por citocinas proinflamatorias. Las células del músculo liso y los fibroblastos, sin embargo, expresan FT de 20 forma constitutiva. En consecuencia, una vez que estas células entran en contacto con la corriente sanguínea después de lesión tisular, la cascada de coagulación se inicia rápidamente por la unión del FT con el factor VII o FVIIa en el plasma.

Como se analiza posteriormente, la mayoría del FVII en la sangre está en la forma de zimógeno con una cantidad 25 pequeña, aproximadamente 1 %, presente como FVIIa. Sin embargo, en ausencia de unión al FT, incluso el FVIIa tiene características de tipo zimógeno y no desempeña actividad significativa hasta que forma complejo con FT. Por lo tanto, el FVII en plasma requiere la activación por escisión proteolítica, y cambio conformacional adicional mediante la interacción con FT, para su actividad completa. Se ha mostrado que una serie de proteasas, incluyendo los factores IXa, Xa, XIIa y trombina, son capaces de escindir FVII in vitro, un proceso que se acelera en presencia 30 de FT. El propio FVIIa también puede activar FVII en presencia de FT, un proceso denominado autoactivación. Las cantidades pequeñas de FVIIa en sangre probablemente se deban a la activación por FXa y/o FIXa (Wildgoose et al. (1992) Blood 80: 25-28, y Butenas et al. (1996) Biochemistry 35: 1904-1910). Pueden por lo tanto formarse complejos de FT/FVIIa por la unión directa de FVIIa con FT, o por la unión de FVII con FT y después la activación posterior de FVII a FVIIa por una proteasa en plasma, tal como FXa, FIXa, FXIIa, o el propio FVIIa. El complejo de 35 FT/FVIIa permanece anclado a la célula portadora de FT donde activa pequeñas cantidades de FX a FXa en lo que se conoce como la “ruta extrínseca” de coagulación.

El complejo de FT/FVIIa también escinde pequeñas cantidades de FIX a FIXa. FXa se asocia con su cofactor FVa para formar también un complejo en la célula portadora de FT que puede después convertir la protrombina en 40 trombina. La cantidad pequeña de trombina producida es, sin embargo, inadecuada para sostener la formación de fibrina requerida para la coagulación completa. Adicionalmente, cualquier FXa y FIXa activo se inhibe en circulación por antitrombina III (AT-III) y otras serpinas, que se analizan con más detalle posteriormente. Esto impediría normalmente la formación de coagulas en la circulación. Sin embargo, en presencia de lesión, el daño a la vasculatura da como resultado la agregación y la activación plaquetaria en este sitio de formación de trombina, 45 permitiendo de este modo la amplificación de la señal de coagulación.

b. Amplificación

La amplificación tiene lugar cuando la trombina se une con las plaquetas y las activa. Las plaquetas activadas 50 liberan FV de sus gránulos alfa, que se activa por trombina a FVa. La trombina también libera y activa FVIII del complejo de FVIII/FvW en la membrana de las plaquetas, y escinde FXI en FXIa. Estas reacciones generan plaquetas activadas que tienen FVa, FIBA y FIXa en su superficie, que preparan el terreno para un gran estallido de generación de trombina durante el estadio de propagación.

c. Propagación

La propagación de la coagulación se produce en la superficie de grandes números de plaquetas en el sitio de lesión. Como se ha descrito anteriormente, las plaquetas activadas tienen FXIa, FVIIIa y FVa en su superficie. Es aquí donde se efectúa la ruta extrínseca. El FXIa activa FIX a FIXa, que después se puede unir con FVIIIa. Este proceso, 5 además de las cantidades pequeñas de FIXa que se generan por escisión de FIX por el complejo de FT/FVIIa en la célula portadora de FT, genera grandes números de complejos de FIXa/FVIIIa que a su vez pueden activar cantidades significativas de FX a FXa. Las moléculas de FXa se unen con FVa para generar los complejos de protrombinasa que activan la protrombina a trombina. La trombina actúa en un bucle de retroalimentación positivo para activar aún más plaquetas y de nuevo inicia de nuevo los procesos descritos para la fase de amplificación. 10

En muy poco tiempo, hay suficientes números de plaquetas activadas con los complejos apropiados para generar el estallido de trombina que es suficientemente grande para generar suficientes cantidades de fibrina a partir de fibrinógeno para formar un coágulo de fibrina hemostático. El fibrinógeno es un dímero soluble en plasma que, cuando se escinde por trombina, libera fibrinopéptido A y fibrinopéptido B. El fibrinopéptido B se escinde después 15 por trombina, y los monómeros de fibrina formados por esta segunda escisión proteolítica forman espontáneamente un gel insoluble. La fibrina polimerizada se mantiene unida por fuerzas no covalentes y electroestáticas y se estabiliza por el factor XIIIa de enzima de transamidación (FXIIIa), producido por la escisión de FXIII por trombina. La trombina también activa TAFI, que inhibe la fibrinolisis reduciendo la generación de plasmina en la superficie del coágulo. Adicionalmente, la propia trombina se incorpora en la estructura del coágulo para estabilización adicional. 20 Estos agregados de fibrina insolubles (coágulos), junto con plaquetas agregadas (trombos), bloquean el vaso sanguíneo dañado e impiden una hemorragia adicional.

3. Regulación de la coagulación

Durante la coagulación, la cascada se regula por procesos constitutivos y estimulados para inhibir la formación de coágulos adicionales. Hay varias razones para dichos mecanismos reguladores. En primer lugar, se requiere la regulación para limitar la isquemia de tejidos por formación de coágulos de fibrina. En segundo lugar, la regulación impide la trombosis generalizada localizando la formación de coágulos solamente en el sitio de lesión tisular.

Se consigue regulación mediante los cationes de varias moléculas inhibidoras. Por ejemplo, la antitrombina III (AT-III) y el inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT) actúan de forma constitutiva para inhibir factores en la cascada de coagulación. La AT-III inhibe la trombina, FIXa y FXa, mientras que el IRFT inhibe FXa y el complejo de FVIIa/FT. Un factor adicional, la Proteína C, que se estimula mediante la activación de plaquetas, regula la coagulación por escisión proteolítica e inactivación de FVa y FVIIIa. La Proteína S potencia la actividad de la Proteína C. Además, 35 otro factor que contribuye a la inhibición de la coagulación es la proteína de membrana integral, la trombomodulina, que se produce por células endoteliales vasculares y actúa como un receptor para trombina. La unión de trombina con trombomodulina inhibe las actividades procoagulantes de la trombina y también contribuye a la activación de la proteína C.

La fibrinolisis, la degradación del coágulo de fibrina, también proporciona un mecanismo para regular la coagulación. Los multímeros de fibrina reticulados en un coágulo se degradan en polipéptidos solubles por plasmina, una serina proteasa. La plasmina puede generarse a partir de su precursor inactivo, el plasminógeno y se acumula en el sitio de un coágulo de fibrina de dos maneras: por interacción con el activador de plasminógeno tisular (tPA) en la superficie de un coágulo de fibrina, y por la interacción con el activador de plasminógeno de uroquinasa (uPA) en una 45 superficie celular. El primer mecanismo parece ser el principal responsable de la disolución de coágulos dentro de vasos sanguíneos. El segundo, aunque es capaz de mediar en la disolución de coágulos, puede desempeñar un papel importante en la remodelación tisular, migración celular e inflamación.

La disolución de coágulos también se regula de dos maneras. En primer lugar, se produce activación de plasmina y 50 fibrinolisis eficaces solamente en complejos formados en la superficie del coágulo o en una membrana celular, mientras que las proteínas libres en la sangre son catalizadores ineficaces y se inactivan rápidamente. En segundo lugar, los activadores de plasminógeno y la plasmina se inactivan por moléculas tales como el inhibidor del activador de plasminógeno de tipo 1 (IAP-1) E IAP-2 que actúan en los activadores de plasminógeno, y antiplasmina 2 y macroglobulina 2 que inactivan la plasmina. En circunstancias normales, el equilibrio oportuno entre la coagulación 55 y la fibrinolisis da como resultado la formación eficaz y la eliminación de coágulos después de lesión vascular, impidiendo al mismo tiempo simultáneamente episodios trombóticos o hemorrágicos no deseados.

En la siguiente Tabla 4 se expone un resumen de factores de coagulación, cofactores y proteínas reguladoras ejemplares, y sus actividades. 60

Tabla 4

Zimógenos y Cofactores de Factores de Coagulación

Nombre del Factor: Actividad

Zimógenos de Serina Proteasas

Factor XII: Se une con colágeno expuesto en el sitio de la lesión de la pared vascular, activado por quininógeno y calicreína de alto PM

Factor XI: Activado por el Factor XIIa

Factor IX: Activado por el factor XIa + Ca2+

Factor VII: Activado por trombina, factor X, factor IXa o factor XIIa + Ca2+, o autoactivación

Factor X: Activado en la superficie de plaquetas por el complejo de tenasa (FIXa/FVIIIa); También activado por factor VIIa + factor tisular + Ca2+ o factor VIIa + Ca2+

Factor II: Activado en la superficie de plaquetas por el complejo de protrombinasa (FXa/FVa)

Cofactores

Factor VIII: Activado por trombina: el factor VIIIa actúa como cofactor para el factor IXa en la activación del factor X

Factor V: Activado por trombina; el factor Va actúa como cofactor para el factor Xa en la activación de protrombina

Factor III (factor Tisular): Actúa como cofactor para el factor VIIa

Fibrinógeno

Factor I (Fibrinógeno): Escindido por trombina para formar fibrina

Transglutaminasa

Factor XIII: Activado por trombina + Ca2+; promueve la reticulación covalente de la fibrina

Proteínas reguladoras y otras

Factor de von Willebrand (FvW): Actúa como puente entre el complejo GPIb-V-IX y el colágeno

Proteína C: Activado por trombina unida a trombomodulina; Ca degrada los factores VIIIa y Va

Proteína S: Actúa como cofactor de la proteína C

Trombomodulina: Proteína de superficie de célula endotelial; se une con trombina, que activa la proteína C

Antitrombina III: Inhibidor de coagulación, principalmente de trombina y del factor Xa, pero también de los factores IXa, XIa y XIIa, y del factor VIIa formando complejo con el FT

Inhibidor de la Ruta del Factor Tisular (IRFT): Se une con FXa y forma después una estructura cuaternaria con FT/FVIIa para inhibir la actividad de FT/FVIIa

*Tabla adaptada de M. W. King (2006) med.unibs.it/-marchesi/blood.html

C. Factor VII (FVII)

El Factor VII es una glucoproteína serina proteasa dependiente de vitamina K que se sintetiza en animales, 5 incluyendo mamíferos, como un zimógeno monocatenario en el hígado y se secreta en la corriente sanguínea. Como se ha descrito anteriormente, FVII es la proteasa de coagulación responsable del inicio de la cascada de acontecimientos proteolíticos que conducen a la generación de trombina y a la deposición de fibrina. Es parte de la ruta extrínseca, aunque los efectos aguas abajo de su actividad también afectan en gran medida a la ruta intrínseca. Este papel integral en la formación de coágulo ha atraído un interés significativo en FVII como una diana para 10 terapias anticoagulantes y hemostáticas clínicas. Por ejemplo, se ha desarrollado FVII activado recombinante (rFVIIa) como un agente hemostático para su uso en sujetos hemofílicos, y sujetos con otras afecciones hemorrágicas. En el presente documento se proporcionan polipéptidos de FVII modificados que se diseñan para tener actividad de coagulación aumentada tras su activación, y que pueden actuar como productos terapéuticos mejorados para tratar enfermedades y afecciones susceptibles de terapia con el factor VII. 15

1. Estructura y organización de FVII

El gen de FVII humano (F7) se localiza en el cromosoma 13 en 13q34 y tiene 12,8 kb de longitud con 9 exones. El gen de FVII comparte similitud organizacional significativa con genes que codifican otras proteínas dependientes de vitamina K, tales como la protrombina, el factor IX, factor X y la proteína C. El ARNm para FVII experimenta corte y 5 empalme alternativo para producir dos transcritos: la variante 1 (Nº de Referencia de Genbank NM_000131, expuesto en SEC ID Nº: 108) y la variante 2 (Nº de Referencia de Genbank NM_019616, expuesto en SEC ID Nº: 109). La variante del transcrito 2, que es la forma más abundante en el hígado, no incluye exón 1b y por lo tanto codifica un polipéptido precursor más corto de 444 aminoácidos (precursor de la isoforma b de FVII; SEC ID Nº: 2), en comparación con el polipéptido precursor de 466 aminoácidos codificado por la variante del transcrito 1 10 (precursor de la isoforma a de FVII; SEC ID Nº: 1). Los aminoácidos que no están presentes en el polipéptido precursor de la isoforma b de FVII corresponden a las posiciones de aminoácidos 22 a 43 del precursor de la isoforma a de FVII. Estos aminoácidos son parte de la secuencia propeptídica, que da como resultado el propéptido truncado de la isoforma b de FVII. Los polipéptidos precursores están compuestos de los siguientes segmentos y dominios: un péptido señal hidrófobo (aa 1-20 de SEC ID Nº: 1 y 2), un propéptido (aa 21-60 de SEC ID Nº: 1, y aa 15 21-38 de SEC ID Nº: 2), un dominio Gla (aa 39-83 de SEC ID Nº: 1, y aa 61-105 de SEC ID Nº: 2), un dominio de factor de crecimiento epidérmico de tipo B (tipo EGF-1, aa 84-120 de SEC ID Nº: 1, y aa 106-142 de SEC ID Nº: 2), un dominio del factor de crecimiento epidérmico de tipo A (tipo EGF 2, aa 125-166 de SEC ID Nº: 1; y aa 147-188 de SEC ID Nº: 2), y un dominio de serina proteasa (aa 191-430 de SEC ID Nº: 1, y aa 213-452 de SEC ID Nº: 2).

La forma madura de 406 aminoácidos del polipéptido de FVII (SEC ID Nº: 3) carece de las secuencias del propéptido y péptido señal, y es idéntica en longitud y secuencia independientemente del precursor de la isoforma del que se originó. En la forma madura del polipéptido de FVII las posiciones de aminoácidos correspondientes para los dominios anteriormente mencionados son las siguientes: dominio Gla (aa 1-45 de SEC ID Nº: 3), tipo EGF-1 (aa 46-82 de SEC ID Nº: 3), tipo EGF-2 (aa 87-128 de SEC ID Nº: 3), y dominio serina proteasa (aa 153-392 de SEC ID Nº: 25 3).

El dominio Gla de FVII es un motivo de unión a membrana que, en presencia de iones de calcio, interacciona con membranas fosfolipídicas que incluyen fosfatidilserina. El dominio de Gla también desempeña un papel en la unión con el cofactor de FVIIa, factor tisular (FT). En complejo con el FT, el dominio Gla de FVIIa se carga con siete iones 30 de Ca2+, proyecta tres cadenas laterales hidrófobas en la dirección de la membrana celular para su integración con fosfolípidos en la superficie celular y tiene un contacto significativo con el dominio C terminal del FT. El dominio Gla está conservado entre proteínas dependientes de vitamina K, tales como protrombina, factores de coagulación VII, IX y X, proteínas C, S y Z. Estas proteínas requieren vitamina K para la síntesis postraduccional del ácido -carboxiglutámico, un aminoácido agrupado en el dominio Gla N terminal de estas proteínas. Todos los restos 35 glutámicos presentes en el dominio son posibles sitios de carboxilación y muchos de ellos se modifican por lo tanto por carboxilación.

Además del dominio Gla, la proteína FVII madura también contiene dos dominios de tipo EGF. El primer dominio de tipo EGF (tipo EGF-1 o EGF1) es un dominio de EGF de unión a calcio, en el que seis cisteínas centrales 40 conservadas forman tres enlaces disulfuro. El dominio EGF de FVII se une solamente con un ión Ca2+, pero con afinidad significativamente mayor que la observada con el dominio Gla (Banner et al. (1996) Nature 380: 41-46). Este ión Ca2+ unido promueve la fuerte interacción entre el dominio EGF1 de FVII y FT (Osterbund et al. (2000) Eur J Biochem 267: 6204-6211). El segundo dominio de tipo EGF (tipo EGF-2 o EGF2) no es un dominio de unión a calcio, pero también forma 3 enlaces disulfuro. Como los otros dominios en FVII, el dominio EGF2 interacciona con FT. 45 También se une por enlaces disulfuro con el dominio proteasa, con el que comparte una interfaz de contacto grande.

Finalmente, el dominio de serina proteasa de FVII es el dominio responsable de la actividad proteolítica de FVIIa. La secuencia de aminoácidos de FVII en su dominio catalítico presenta alta identidad de secuencia y similitud de estructura terciaria con otras serina proteasas tales como tripsina y quimotripsina (Jin et al. (2001) J Mol Biol, 307: 50 1503-1517). Por ejemplo, estas serina proteasas comparten una triada catalítica común H57, D102, S195 basándose en la numeración de la quimotripsina. A diferencia de otras serina proteasas, sin embargo, la escisión de FVIIa no es suficiente para completar la conversión del zimógeno en una enzima completamente activa. En su lugar, como se analiza posteriormente, FVIIa se activa de forma alostérica en su función catalítica uniéndose con el receptor de superficie celular FT, que induce un cambio conformacional en el dominio proteasa de FVIIa 55 cambiándolo de un estadio inactivo de tipo zimógeno a una enzima catalíticamente activa. Una reacción de bucle en hélice entre el sitio de unión al cofactor y el sitio activo (es decir, las posiciones de restos de aminoácidos 305-321, correspondientes a los restos 163-170 basándose en la numeración de la quimotripsina) de FVIIa es importante para el alosterismo y la zimogenicidad de FVIIa (Persson et al. (2004) Biochem J., 379: 497-503). Esta región está compuesta de una hélice a corta (posiciones de restos de aminoácidos 307 a 312) seguido de un bucle. La parte N 60 terminal de la hélice forma parte de la interfaz entre el dominio de proteasa y FT, y contiene varios restos que son importantes para la función proteolítica y la unión óptima a FT. Una comparación de la estructura cristalina de FVIIa solo y FVIIa en complejo con FT indica que la hélice experimenta un cambio conformacional significativo cuando FVIIa se une con FT. La hélice a de FVIIa solo tiene un aspecto distorsionado, acortado y con orientación diferente. Esto afecta a estructuras en bucle adyacentes, alejándolas del sitio activo. Por el contrario, cuando la hélice a de 65 FVIIa forma un complejo con FT se estabiliza, y los bucles cercanos se sitúan más cerca del sitio activo. Esta

estabilización se efectúa mediante mecanismos que implican al menos la metionina en la posición de aminoácido 306 (resto de aminoácido Met164 según la numeración de la quimotripsina) de FVII (Pike et al. (1999) PNAS 8925-8930).

2. Modificaciones postraduccionales 5

El polipéptido precursor de FVII (una de las isoformas del gen del Factor VII) es la diana de la ruta secretora celular por el péptido señal hidrófobo, que se inserta en el retículo endoplásmico (RE) para iniciar la translocación a través de la membrana. Aunque la proteína se trasloca a través de la membrana del RE, el péptido señal de 20 aminoácidos se separa por escisión por una peptidasa señal dentro del lumen del RE, después de lo cual el 10 polipéptido experimenta modificaciones postraduccionales adicionales, incluyendo N y O glucosilación, carboxilación dependiente de vitamina K de los ácidos glutámicos N terminales a ácidos -carboxiglutámicos e hidroxilación de ácido aspártico a ácido -hidroxiaspártico.

El propéptido proporciona un sitio de unión para una carboxilasa dependiente de vitamina K que reconoce una hélice 15  anfipática de 10 restos en el propéptido de FVII. Después de la unión, la carboxilasa carboxila en  10 restos de ácido glutámico dentro del dominio Gla del polipéptido de FVII, produciendo restos de -carboxiglutamilo en las posiciones E66, E67, E74, E76, E79, E80, E85, E86, E89 y E95 en relación con la secuencia de aminoácidos del precursor de FVII expuesta en SEC ID Nº: 2. Estas posiciones corresponden a las posiciones E6, E7, E14, E19, E20, E25, E26, E29 y E35 del polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3. Para actividad óptima, la molécula 20 de FVII requiere calcio, que se une con el polipéptido y facilita los cambios conformacionales necesarios para la unión de FVIIa con FT y lípidos. El dominio Gla  carboxilado se une con siete iones Ca2+ con afinidad variable, lo que induce el cambio conformacional que permite que el dominio Gla interaccione con el dominio C terminal de FT, y también fosfatidilserinas u otros fosfolípidos con carga negativa en la membrana de plaquetas.

Se llevó a cabo glucosilación ligada a N por transferencia de Glc3Man9 (GlcNAc) a dos restos de asparagina en el polipéptido de FVII, en posiciones que corresponden a los restos de aminoácidos 145 y 262 de la proteína madura (SEC ID Nº: 3). Se produce glucosilación ligada a O en restos de aminoácidos 52 y 60 del polipéptido maduro, y se produce hidroxilación a un ácido -hidroxiaspártico en el resto de ácido aspártico en la posición 63. Estos restos de serina O-glucosilada y los restos de ácido aspártico -hidroxilado están en el dominio EGF-1 de FVII. Estas 30 modificaciones se efectúan en complejo RE y Golgi antes del procesamiento final del polipéptido a su forma madura.

3. Procesamiento de FVII

El polipéptido pro-FVII modificado se transporta a través del lumen del Golgi al compartimento trans-Golgi donde el 35 propéptido se escinde por una propeptidasa justo antes de la secreción de la proteína de la célula. La PACE/ furina (donde PACE es el acrónimo en inglés de Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme, Enzima de Escisión de Aminoácidos básicos Emparejados) es una endopeptidasa localizada en la membrana del Golgi que escinde muchas proteínas en el lado carboxiloterminal del motivo de la secuencia Arg-[cualquier resto]-(Lys o Arg)-Arg. Esta propeptidasa escinde glucoproteínas dependientes de vitamina K tales como los polipéptidos profactor IX y pro-FvW 40 (Himmelspach et al. (2000) Thromb Research 97; 51-67), liberando el propéptido de la proteína madura. La inclusión de un sitio de reconocimiento de PACE/furina apropiado en precursores del Factor VII recombinantes facilita el correcto procesamiento y secreción del polipéptido recombinante (Margaritas et al. (2004) Clin Invest 113(7): 1025-1031). La PACE/furina, u otra enzima propeptidasa de tipo subtilisina, es probablemente responsable del procesamiento proteolítico de pro-FVII a FVII. Puede reconocer y unirse con el motivo consenso -Arg-Arg-Arg-Arg- 45 en las posiciones de aminoácidos 35-38 de las secuencias expuestas en SEC ID Nº: 1, y 57-60 de la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 2, escindiendo el propéptido y liberando la proteína madura para su secreción.

4. Activación de FVII

La amplia mayoría de FVII en la sangre está en forma de un zimógeno monocatenario inactivado, aunque una pequeña cantidad está presente en una forma activada bicatenaria. La activación de FVII se produce tras la escisión proteolítica del enlace Arg152-Ile153 (posiciones relativas al polipéptido de FVII maduro, expuesto en SEC ID Nº: 3), dando lugar a un polipéptido bicatenario que contiene una cadena ligera de 152 aminoácidos (aproximadamente 20 kDa) unida por un enlace disulfuro con una cadena pesada de 254 aminoácidos (aproximadamente 30 kDa). La 55 cadena ligera de FVIIa contiene el dominio Gla y dominios de tipo EGF, mientras que la cadena pesada contiene la parte catalítica o serina proteasa de la molécula. La conversión del FVII monocatenario al FVIIa bicatenario está mediada por la escisión de FIXa, FXa, FXIIa, trombina o de una manera autocatalítica por FVIIa endógeno (Butenas et al. (1996) Biochem 35: 1904-1910; Nakagaki et al. (1991) Biochem 30: 10819-10824). La cantidad traza de FVIIa que aparece en circulación probablemente surja de la acción de FXa y FIXa. 60

Como se ha analizado anteriormente, la escisión de FVII de su forma de zimógeno a FVIIa no es suficiente para su actividad completa. FVIIa requiere la asociación con FT para su actividad completa (Higashi et al. (1996) J Biol Chem 271: 26569-26574). Debido a este requisito, se han asignado a FVIIa solo características de tipo zimógeno, presentando plegamiento y forma de zimógeno, y mostrando una actividad relativamente baja. Esta característica de 65

tipo zimógeno de FVIIa en ausencia de su asociación con FT lo hace relativamente resistente a antitrombina III (AT-III) y otras serpinas, que generalmente actúan sobre todo en las formas activas de serina proteasas en lugar de en la forma de zimógeno. Además, el IRFT, el principal inhibidor de la actividad de FT/FVIIa, tampoco se une eficazmente con la forma sin complejo “inactiva” de FVIIa.

Tras la formación del complejo con FT, FVIIa experimenta un cambio conformacional que permite la actividad completa de la molécula. Todos los dominios de FVII están implicados en la interacción con FT, pero los cambios conformacionales que se producen están localizados en el dominio proteasa de FVIIa. Por ejemplo, los cambios conformacionales que se producen tras la interacción alostérica de FVIIa y FT incluyen la creación de un exositio de unión a sustrato macromolecular extendido. Este sitio de unión extendido potencia enormemente la activación 10 proteolítica mediada por FVII del factor X.

La actividad de FVIIa se aumenta adicionalmente (es decir mil veces) cuando la interacción de FVIIa es con FT expresado en superficie celular. Esto se debe a que las membranas fosfolipídicas que contienen fosfolípidos con carga negativa, tales como fosfatidilserina, son un sitio de interacción de otros factores de coagulación dependientes de vitamina K tales como FIX y FX, que se unen mediante sus dominios Gla. Por lo tanto, la concentración local de 15 estas proteínas dependientes de vitamina K es alta en la superficie celular, promoviendo su interacción con el complejo de FT/FVIIa.

5. Función de FVII

Aunque el FVIIa muestra aumento de la actividad después de la activación alostérica por FT, hay pruebas de que existen mecanismos en los que FVIIa por sí solo puede iniciar la coagulación. Por lo tanto, FVII puede actuar de una manera dependiente de FT e independiente de FT. Esta última ruta puede desempeñar un papel mucho más pequeño en la hemostasis normal, aunque podría ser significativo cuando se considere en el contexto de trastornos de hemorragia, y el tratamiento de los mismos. 25

a. Actividad de FVIIa dependiente del factor tisular

El FVII en circulación se une con FT de superficie celular y se activa por FIXa, FXa, trombina o de una manera autocatalítica por FVIIa endógeno como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, la cantidad muy pequeña de 30 FVIIa en circulación puede unirse directamente con FT. El complejo de FT/FVIIa se une después con una fracción pequeña de FX en plasma y el dominio catalítico de FVIIa escinde FX para producir FXa. Se forma de esta manera trombina a través de la ruta extrínseca en la superficie de la célula portadora de FT, cuando FXa forma complejo con FVa y activa la protrombina a trombina (Figura 3). También se activa FIX por el complejo de FT/FVIIa, proporcionando un enlace con la ruta intrínseca que actúa en la superficie de la plaqueta activada. Los sistemas de 35 retroalimentación positiva en la cascada de coagulación descrita anteriormente proporcionan el medio por el que se producen grandes cantidades de trombina, que escinde fibrinógeno a fibrina para formar un coágulo.

b. Actividad de FVIIa independiente de factor tisular

Además del mecanismo dependiente de FT para la activación de FX a FXa, hay pruebas de que FVIIa también puede activar FX en ausencia de FT. Las plaquetas activadas traslocan fosfatidilserinas y otros fosfolípidos con carga negativa a la superficie externa, orientada al plasma. (Hemker et al. (1983) Blood Cells 9: 303-317). Estos proporcionan “receptores” alternativos a través de los que FVIIa puede unirse, aunque con una afinidad relativamente baja que es 1000 veces menor que la afinidad de unión de FVIIa por FT (Monroe et al. (1997) Br J 45 Haematol 99: 542-7). Esta interacción está mediada a través de restos en el dominio Gla (Harvey et al. (2003) 278: 8363-8369). FVIIa puede después convertir FX a FXa y FIX a FIXa en la superficie de plaquetas activadas (Hoffman et al. (1998) Blood Coagul Fibrinolysis 9: S61-S65). El FXa permanece asociado con la superficie de plaquetas, donde puede unirse con FVa y generar suficiente trombina a partir de protrombina, mientras que el FIXa recién formado se ensambla con FVIIIa para catalizar la activación de más FX a FXa (Figura 3). Después puede 50 conseguirse hemostasis en ausencia de FT por los mecanismos de retroalimentación positiva y propagación descritos anteriormente. Es notable, sin embargo, que aunque FVIIIa puede contribuir al proceso de coagulación en la plaqueta activada, su presencia no se requiere para la generación de trombina en el mecanismo independiente de FT (Figura 3). Por lo tanto, en ausencia de FVIII, tal como en pacientes con hemofilia, hay pruebas de que FVIIa puede iniciar y/o amplificar la generación de trombina a través de este mecanismo secundario, y efectuar la 55 formación de coágulo.

6. FVII como producto biofarmacéutico

FVII actúa iniciando la coagulación sanguínea. El FVIIa recombinante (NovoSeven®; rFVIIa) está aprobado para el 60 tratamiento de episodios de sangrado o prevención de sangrado en procedimientos quirúrgicos o invasivos en pacientes que tienen hemofilia A o B con inhibidores contra el Factor VIII o Factor IX, y en pacientes con déficit congénito del Factor VII. Novoseven® es una preparación obtenida por modificación por ingeniería genética del factor VIIa que se produce en un sistema de expresión de mamíferos usando células de riñón de cría de hámster (BHK). El agente es casi idéntico al factor VIIa derivado de plasma en su estructura y función (Ratko et al. (2004), P 65 & T, 29: 712-720).

Se ha mostrado que la administración de FVIIa recombinante (rFVIIa) promueve la coagulación sanguínea en pacientes que padecen hemofilia, y se ha descubierto que el tratamiento con dosis de FVIIa es seguro y se tolera bien en sujetos humanos. Típicamente, el uso de rFVIIa ha sido en pacientes que han desarrollado inhibidores (es decir aloanticuerpos) contra el Factor VIII o el Factor IX. El uso de rFVIIa como un coagulante se ha extendido al tratamiento de otros trastornos de sangrado, por ejemplo trombastenia de Glanzmann; otros acontecimientos 5 asociados con sangrado extensivo, tales como los producidos por traumatismo o cirugía incluyendo, pero sin limitación, trasplante de hígado, cirugía de próstata y traumatismo hemorrágico; coagulopatías neonatales, enfermedad hepática grave; trasplante de médula ósea, trombocitopenia y trastornos de la función plaquetaria; inversión urgente de anticoagulación oral; déficits congénitos de los factores V, VII, X y XI; y enfermedad de von Willebrand con inhibidores contra el factor de von Willebrand. 10

Se requiere una alta dosis de rFVII para conseguir un efecto terapéutico. La dosis y el régimen de dosificación requeridos para la administración de rFVII varían dependiendo de la indicación clínica. Por ejemplo, la dosificación típica de rFVII para episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia A o hemofilia B que tienen aloanticuerpos es de 90 g/kg administrado por inyección intravenosa (IV). Dado que el rFVII tiene una semivida de 2 horas, se 15 requiere dosificación repetida. Puede proporcionarse dosificación adicional cada 2 horas hasta que se consigue la hemostasis. El intervalo de dosis puede alterarse dependiendo de la gravedad de la afección. Por ejemplo, han sido eficaces dosis que varían de 35 a 120 g/kg. Además, la dosis y el régimen de dosificación pueden variar con otras indicaciones. Por ejemplo, a pacientes con hemofilia A o B, que se someten a cirugía, puede administrarse una dosis inicial de 90 g/kg inmediatamente antes de la cirugía, con dosificación repetida proporcionada cada 2 horas durante 20 y después de la cirugía. Dependiendo de la gravedad de la cirugía y del episodio de sangrado, la infusión en embolada por vía intravenosa, IV, puede continuar cada dos a seis horas hasta que se consiga la curación. En pacientes con déficit congénito del FVII, el rFVII se administra típicamente para evitar el sangrado en procedimientos quirúrgicos u otros procedimientos invasivos a 15-30 g/kg cada 4-6 horas hasta que se consigue la hemostasis.

El mecanismo de acción de rFVIIa para iniciar la hemostasis explica el requisito de alta dosis. Los pacientes con hemofilia tienen una fase de coagulación de inicio normal, donde el complejo de FT/FVIIa activa FX a FXa y conduce a la producción de trombina en el sitio de la célula portadora de FT. Sin embargo, después de esto, el proceso de coagulación se descompone ya que los pacientes con hemofilia carecen de FVIII (hemofilia A) o FIX (hemofilia B) y por tanto no pueden formar los complejos de FVIIIa/FIXa en la superficie de la plaqueta activada, que normalmente 30 actúa para activar grandes cantidades de FX a FXa en las fases de amplificación y propagación descritas previamente. Debido a la presencia de inhibidores, tales como IRFT y AT-III, el FXa que se produce en la célula portadora de FT después de escisión por FT/FVIIa puede difundirse fácilmente entre superficies celulares. Como resultado, no se produce generación de trombina a gran escala en la superficie de la plaqueta activada, y no se forma coágulo. 35

Hay constancia de que, en las plaquetas activadas (Figura 3), puede conseguirse un efecto hemostático de altas dosis de rFVIIa usando generación de FXa por rFVIIa, dependiente de FT y/o independiente de FT. La generación de trombina dependiente de FT puede maximizarse muy rápidamente con la saturación de moléculas de FT con FVIIa endógeno y rFVIIa. En algunos casos, el rFVIIa a altas dosis puede unirse a plaquetas activadas y convertir e 40 FX a FXa. El FXa asociado a la superficie activa el FVa para generar suficiente trombina para la hemostasis. Dado que el rFVII se a la superficie de las plaquetas con baja afinidad, puede requerirse una mayor dosis de rFVII para la generación de trombina. La activación de FXa en plaquetas activadas garantiza que la hemostasis mediada por rFVIIa se localiza en el sitio de la lesión.

Un medio para conseguir dosificación reducida de rFVII puede mejorar su utilidad y eficacia como un fármaco. En el presente documento se proporcionan polipéptidos de FVII modificados. Entre estos están los polipéptidos de FVII modificados que muestran resistencia aumentada a RIFT, resistencia aumenta a AT-III, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida aumentada, actividad catalítica aumentada en presencia y/o ausencia de FT y/o unión aumentada con plaquetas activadas. Estos polipéptidos de FVII pueden mostrar actividad 50 coagulante aumentada. Los polipéptidos de FVII proporcionados en el presente documento pueden usarse en tratamientos para iniciar la hemostasis en un mecanismo dependiente de FT y/o independiente de FT de modo que se produzca FXa y se genere trombina.

D. Polipéptidos de FVII modificados 55

En el presente documento se proporcionan polipéptidos de FVII modificados. Los polipéptidos de FVII muestran alteraciones en una o más actividades o propiedades en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Las actividades o propiedades que pueden alterarse como resultado de la modificación incluyen, pero sin limitación, coagulación o actividad coagulante; actividad procoagulante; actividad proteolítica o catalítica tal como para efectuar 60 la activación del factor X (FX) o activación del Factor IX (FIX); antigenicidad (capacidad para unirse con o competir con un polipéptido por la unión con un anticuerpo anti-FVII); capacidad para unirse con el factor tisular, factor X o factor IX, capacidad para unirse con la superficie celular de plaquetas activadas; capacidad para unirse con fosfolípidos; semivida; estructura tridimensional; pI; y/o conformación. Típicamente, los polipéptidos de FVII modificados muestran actividad procoagulante. En el presente documento se proporcionan polipéptidos de FVII 65 modificados que muestran actividad coagulante aumentada tras la activación de su forma de zimógeno

monocatenaria. Dichos polipéptidos FVII modificados pueden usarse en el tratamiento de trastornos o acontecimientos de hemorragia, tales como hemofilias o lesión, donde los polipéptidos de FVII pueden actuar para promover la coagulación sanguínea. Se incluyen entre dichos polipéptidos de FVII modificados los que tienen resistencia aumentada a inhibidores tales como inhibidor de la ruta del factor tisular (RIFT) y antitrombina III (AT-III), los que tienen actividad catalítica aumentada en presencia y/o ausencia de FT, los que tienen propiedades 5 farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida aumentada y los que tienen unión y/o afinidad aumentada por la superficie plaquetaria. En particular, dichos polipéptidos de FVII modificados pueden usarse en enfermedades o afecciones para proporcionar actividad coagulante evitando al mismo tiempo los requisitos para FVIIIa y FIXa. En un ejemplo, pueden usarse polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento en pacientes hemofílicos que tienen autoanticuerpos para FVIIIa y FIXa. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados 10 proporcionados en el presente documento ofrecen ventajas incluyendo una reducción en la cantidad de FVII administrado que se requiere para mantener una concentración suficiente de FVII activo en el suero para hemostasis. Esto puede conducir, por ejemplo, a dosis y/o frecuencia de dosificación menores necesarias para conseguir efectos biológicos comparables, aparición más rápida del beneficio terapéutico, mejora más rápida de los episodios de hemorragia aguda, mayor comodidad y aceptación por los sujetos y atenuación de los efectos 15 secundarios, no beneficiosos.

Pueden realizarse modificaciones en un polipéptido de FVII a cualquier forma de un polipéptido de FVII, incluyendo variantes alélicas y de especie, variantes de corte y empalme, variantes conocidas en la técnica, o molécula de FVII híbridos o quiméricas. Por ejemplo, las modificaciones proporcionadas en el presente documento pueden realizarse 20 en un polipéptido de FVII precursor expuesto en SEC ID Nº: 1 o 2, un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3, o cualquier variante de especie, alélicas o modificada y fragmentos activos de las mismas, que tenga 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con cualquiera de los polipéptidos de FVII expuestos en SEC ID Nº: 1-3. Las variantes alélicas de FVII incluyen, pero sin limitación, cualquiera de los polipéptidos precursores que tengan una secuencia de aminoácidos expuesta en 25 cualquiera de SEC ID Nº: 18-74. Las variantes de especies ejemplares para modificación en el presente documento incluyen, pero sin limitación, polipéptidos humanos y no humanos incluyendo polipéptidos de FVII de los polipéptidos de FVII de vaca, ratón, chimpancé pigmeo, chimpancé, conejo, rata, macaco rhesus, cerdo, perro, pez cebra, pez globo, pollo, orangután y gorila, cuyas secuencias se exponen en SEC ID Nº: 4-17 respectivamente. Pueden realizarse modificaciones en un polipéptido de FVII para un polipéptido de FVII que también contiene otras 30 modificaciones, tales como las descritas en la técnica, incluyendo modificaciones de la secuencia primaria y modificaciones no en la secuencia primaria del polipéptido.

La modificación de los polipéptidos de FVII también incluye modificación de polipéptidos que son híbridos de diferentes polipéptidos de FVII y también polipéptidos de FVII sintéticos preparados de forma recombinante o 35 sintetizados o construidos por otros métodos conocidos en la técnica basándose en la secuencia de polipéptidos conocidos. Por ejemplo, basándose en el alineamiento de FVII con otros miembros de la familia del factor de coagulación, tales como factor IX (FIX) o factor X (FX), se identifican fácilmente dominios homólogos entre los miembros de la familia. Pueden construirse variantes quiméricas de polipéptidos de FVII donde uno o más aminoácidos o dominios completos se reemplazan en la secuencia de aminoácidos de FVII usando las secuencias 40 de aminoácidos del miembro de la familia correspondiente. Adicionalmente, los polipéptidos de FVII quiméricos incluyen en los que uno o más aminoácidos o dominios completos se reemplazan en la secuencia de aminoácidos de FVII humano usando la secuencia de aminoácidos de una especie diferente (véase, por ejemplo, Williamson et al. (2005) J Thromb Haemost 3: 1250-6). Dichas proteínas quiméricas pueden usarse como el polipéptido de FVII de partida, no modificado, del presente documento. 45

Las modificaciones proporcionadas en el presente documento de un polipéptido de referencia, no modificado, de partida, incluyen reemplazos de aminoácidos o sustitución, adiciones o deleciones de aminoácidos, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados incluyen los que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más posiciones modificadas. También se proporcionan 50 en el presente documento polipéptidos de FVII modificados con dos o más modificaciones en comparación con un polipéptido de FVII de referencia de partida. Los polipéptidos de FVII modificados incluyen los que tienen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 o más posiciones modificadas. Cualquier modificación proporcionada en el presente documento puede combinarse con cualquier otra modificación conocida por un experto en la materia siempre que el polipéptido de FVII modificado resultante muestre actividad de coagulación aumentada 55 cuando esté en su forma bicatenaria o activada. Típicamente, los polipéptidos de FVII modificados muestran actividad coagulante aumentada. Las actividades o propiedades que pueden alterarse como resultado de la modificación incluyen, pero sin limitación, coagulación o actividad coagulante; actividad procoagulante; actividad proteolítica o catalítica tal como para efectuar activación del factor X (FX) o activación del Factor IX (FIX); antigenicidad (capacidad para unirse con, o competir con, un polipéptido por la unión con un anticuerpo anti FVII); 60 capacidad para unirse con el factor tisular, con el factor inhibidor del factor tisular (IRFT), con antitrombina III, con el factor X o factor IX; capacidad para unirse a la superficie de plaquetas activadas; capacidad para unirse a fosfolípidos; semivida en suero; estructura tridimensional; pI; y/o conformación. Se incluyen entre los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento los que tienen resistencia aumentada al inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT), resistencia aumentada a antitrombina III (AT-III), actividad catalítica aumentada en 65 presencia y/o ausencia de FT, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida en suero aumentada,

actividad intrínseca aumentada y/o afinidad y/o unión aumentada para plaquetas activadas.

En algunos ejemplos, una modificación puede afectar a dos o más propiedades o actividades de un polipéptido de FVII. Por ejemplo, una modificación puede dar como resultado aumento de la resistencia a IRFT y aumento de la actividad catalítica del polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. 5 Pueden ensayarse polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento con respecto a cada propiedad y actividad para identificar la serie de efectos de una modificación. Dicho ensayos se conocen en la técnica y se describen posteriormente. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento también incluyen polipéptidos de FVII que se modifican adicionalmente por la maquinaria celular e incluyen, por ejemplo, polipéptidos glucosilados,  carboxilados y  hidroxilados. 10

Las modificaciones proporcionadas en el presente documento a un polipéptido de FVII se realizan para aumentar la resistencia a IRFT, aumentar la resistencia a AT-III, mejorar las propiedades farmacocinéticas, tal como aumentar la semivida en suero, aumentar la actividad catalítica en presencia y/o ausencia de FT y/o aumentar la afinidad y/o unión para plaquetas activadas. Por ejemplo, un polipéptido de FVII puede incluir una modificación o modificaciones 15 que aumentan uno o ambos de resistencia a IRFT y unión con plaquetas. En otros ejemplos, cualquier modificación proporcionada en el presente documento puede combinarse con cualquier otro modificación conocida por un experto en la materia siempre que el polipéptido de FVII modificado resultante muestre actividad de coagulación aumentada cuando está en su forma bicatenaria. Típicamente, dicha actividad de coagulación aumentada se debe a resistencia aumentada a IRFT, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida en suero aumentada, resistencia 20 aumentada a AT-III, glucosilación alterada, actividad catalítica aumentada, y/o unión y/o afinidad por los fosfolípidos aumentada. En algunos ejemplos, las modificaciones que se introducen en un polipéptido de FVII para alterar una actividad o propiedad específica también, o en su lugar, pueden afectar a otra actividad o propiedad. Por lo tanto, las modificaciones proporcionadas en el presente documento pueden afectar a la propiedad o actividad para la que se diseñaron para afectar a una o más propiedades o actividades distintas. Por ejemplo, las modificaciones realizadas a 25 un polipéptido de FVII para aumentar la resistencia a IRFT también pueden mejorar las propiedades farmacocinéticas, tales como semivida en suero. En algunos ejemplos, una sola modificación, tal como una sola sustitución de aminoácido, altera 2, 3, 4 o más propiedades o actividades de un polipéptido de FVII. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden ensayarse con respecto a cada propiedad y actividad para identificar la serie de efectos de una modificación. Dichos ensayos se conocen en la técnica y se 30 describen posteriormente. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento también incluyen polipéptidos de FVII que se modifican adicionalmente por la maquinaria celular e incluyen, por ejemplo, polipéptidos glucosilados,  carboxilados y  hidroxilados.

Las modificaciones proporcionadas en el presente documento pueden realizarse por técnicas de ADN recombinante 35 convencionales tales como las rutinarias para un experto en la materia. Puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para efectuar la mutación de uno cualquiera o más aminoácidos en una proteína diana. Los métodos incluyen mutagénesis dirigida convencional (usando por ejemplo un kit, tal como QuikChange disponible de Stratagene) de moléculas de ácido nucleico codificantes, o mediante métodos de síntesis de polipéptidos de fase sólida. Además, pueden generarse proteínas quiméricas modificadas proporcionadas en el presente documento (es 40 decir intercambio de dominio Gla) por técnicas de ADN recombinante rutinarias. Por ejemplo, pueden generarse polipéptidos quiméricos usando enzimas de restricción y metodologías de clonación para subclonación rutinaria de los componentes polipeptídicos quiméricos deseados.

Otras modificaciones que están o no en la secuencia primaria del polipéptido también pueden incluirse en un 45 polipéptido de FVII modificado, o conjugado del mismo, incluyendo, pero sin limitación, la adición de un resto de carbohidrato, la adición de un resto de polietilenglicol (PEG), la adición de un dominio Fc, etc. Por ejemplo, dichas modificaciones adicionales pueden realizarse para aumentar la estabilidad o semivida de la proteína.

Los polipéptidos de FVII modificados resultantes incluyen los que son polipéptidos zimógenos monocatenarios o 50 activos o los que son polipéptidos de tipo zimógeno monocatenarios o bicatenarios. Por ejemplo, cualquier polipéptido modificado proporcionado en el presente documento que sea un polipéptido zimógeno monocatenario puede autoactivarse o activarse por otros factores de coagulación para generar un FVII modificado que es una forma bicatenaria (es decir FVIIa). Las actividades de un polipéptido de FVII modificado se muestran típicamente en su forma bicatenaria. 55

Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden mostrar resistencia a IRFT aumentada, resistencia a AT-III aumentada, actividad catalítica aumentada en presencia y/o ausencia de FT, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida en suero aumentada, y/o unión y/o afinidad por fosfolípidos aumentada. Típicamente, dichas propiedades y/o actividades de los polipéptidos de FVII modificados 60 proporcionados en el presente documento se realizan conservando otras actividades o propiedades de FVII, tales como, pero sin limitación, unión con FT y/o unión y activación de FX. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento conservan la unión a FT y/o unión a FX y su activación en comparación con una forma de tipo silvestre o de partida del polipéptido de FVII. Típicamente, dicha actividad está sustancialmente sin cambios (menos de 1 %, 5 %, 10 %, 20 % o 30 % cambiada) en comparación con una proteína 65 de tipo silvestre o de partida. En otros ejemplos, la actividad de un polipéptido de FVII modificado aumenta o se

reduce en comparación con un polipéptido de FVII de tipo silvestre o de partida. La actividad puede evaluarse in vitro, ex vivo o in vivo y puede compararse con la del polipéptido de FVII no modificado, tal como por ejemplo, el polipéptido de FVII maduro, nativo de tipo silvestre (SEC ID Nº: 3), el polipéptido de FVII precursor de tipo silvestre (SEC ID Nº: 1 o 2), o cualquier otro polipéptido de FVII conocido por los expertos en la materia que se use como el material de partida. 5

Por lo tanto, en virtud de las modificaciones proporcionadas en el presente documento, los polipéptidos de FVII modificados pueden mostrar actividad de coagulación aumentada de una manera dependiente de TF y/o independiente de TF. Típicamente, la actividad de coagulación aumentada de los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento puede observarse in vitro en ensayos apropiados, o in vivo, tal como tras 10 la administración a un sujeto, tal como un sujeto humano o no humano. La actividad aumentada de los polipéptidos de FVII modificados puede potenciarse en al menos o aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más en comparación con la actividad del polipéptido de FVIIa de partida o no modificado. 15

1. Resistencia aumentada a inhibidores

Como la mayoría de los sistemas biológicos, la cascada de coagulación está regulada por mecanismos positivos y negativos. Estos mecanismos actúan con frecuencia inhibiendo o potenciando la actividad de uno o más factores 20 implicados en la cascada, bien directa o bien indirectamente. Por lo tanto, son de interés los factores de coagulación terapéuticos que son resistentes a los mecanismos inhibidores que regulan negativamente su actividad. En particular, son de interés los polipéptidos de FVII modificados que son resistentes a las moléculas inhibidoras que normalmente inhiben la actividad de FVII. El regulador principal del complejo de FT/FVIIa es el inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT). También es inhibidor de la actividad de FVIIa, aunque en menor grado, la antitrombina III 25 (AT-III).

a. IRFT

El inhibidor de la ruta del factor tisular es un polipéptido monocatenario codificado por 9 exones localizados en el 30 cromosoma 2q31-q32.1. El IRFT (también denominado IRFT-1) es un inhibidor de tipo Kunitz que se sintetiza principalmente por células endoteliales y contiene una región amino terminal con carga negativa, tres dominios inhibidores de tipo Kunitz en tándem y una cola carboxilo terminal altamente básica (Wun et al., J. Biol. Chem. 263: 6001 (1988). A través de corte y empalme de ARNm alternativo, se generan dos formas diferentes de IRFT: IRFT  y . El IRFT es una proteína secretada con un peso molecular de aproximadamente 46 kDa. El polipéptido 35 precursor tiene una longitud de 304 aminoácidos (SEC ID Nº: 101) y se procesa por escisión del péptido señal de 28 aminoácidos, dando como resultado la secreción de una glucoproteína madura de 276 aminoácidos (SEC ID Nº: 102). La proteína madura contiene 18 restos de cisteína y forma 9 enlaces disulfuro cuando se pliega correctamente. La secuencia primaria también contiene tres sitios consenso de glucosilación ligada a N Asn-X-Ser/Thr, los restos de asparagina localizados en las posiciones 145, 195 y 256. Los dominios Kunitz-1 y 2 son responsables de la unión y 40 de la inhibición del complejo de FT/FVIIa y FXa, respectivamente (véase, por ejemplo, la Figura 4). Se ha mostrado que el dominio Kunitz-3, que carece de actividad inhibidora de proteinasa, y el extremo C terminal de IRFT, están implicados en su localización de superficie celular (Piro et al. (2004) Circulation 110: 3567-3572).

El IRFT es una forma de corte y empalme alternativo del IRFT en la que el dominio Kunitz-3 y la región C terminal 45 del IRFT se remplaza con una región C terminal no relacionada que dirige la unión de un anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI). El polipéptido precursor (SEC ID Nº: 103) se procesa a una proteína madura que tiene 223 aminoácidos (SEC ID Nº: 104). Basándose en la masa proteica, el IRFT (28 kDa) es considerablemente más pequeño que el IRFT (36 kDa). Ambos migran con la misma masa molecular aparente (46 kDa) en electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), lo que sugiere una diferencia en las modificaciones 50 postraduccionales. El IRFT y  se unen a la superficie celular de una manera dependiente de GPI. El IRFT contiene un anclaje de GPI en su extremo C terminal, mientras que el IRFT se une aparentemente con una proteína o proteínas unidas a GPI aún no identificadas. Aunque el IRFT representa solo el 20 % de la superficie total del IRFT, representa la mayoría de la actividad anti FTVIIa, lo que sugiere un posible papel alternativo para IRFT de superficie celular, tal como unión con y eliminación de FXa (Piro et al. (2005) J Thromb Haemost 3: 2677-55 2683).

El IRFT inhibe la cascada de coagulación de al menos dos maneras; uniéndose con el sitio activo de FXa, e inactivando el complejo de FT/FVIIa (véase, por ejemplo, la Figura 4). El primer dominio de Kunitz se une con FTVIIa, mientras que el segundo dominio se une con FXa (Girard et al. (1989) Nature 338: 518-520). El IRFT libre se 60 une con FVIIa muy lentamente en comparación con su unión con FXa. Una vez que se ha unido con FXa, sin embargo, el complejo de IRFT/FXa presenta una fuerte afinidad por el complejo de FT/FVIIa. Su interacción da como resultado la formación de un complejo heterotetramérico en la superficie de células endoteliales en la que FVIIa está catalíticamente inactivo (Figura 4). Esta estructura cuaternaria impide por lo tanto el inicio por FT/FVIIa de la cascada de coagulación. 65

Existe al menos otro homólogo del IRFT en seres humanos, el IRFT-2, también conocido como proteína placentaria 5 (PP5) e inhibidor de la serina proteasa asociada a matriz (ISPM). El IRFT-2 es un inhibidor de serina proteasa de tipo Kunitz asociado a matriz de 32 kDa que muestra actividad inhibidora hacia un amplio espectro de proteinasas, incluyendo tripsina, plasmina, quimiotripsina, catepsina G, calicreína de plasma y el complejo de factor VIIa-factor tisular. La proteína IRFT-2 madura de 213 aminoácidos (SEC ID Nº: 105) contiene tres dominios de tipo Kunitz que 5 muestran 43 %, 35 % y 53 % de identidad de secuencia primaria con los dominios de tipo Kunitz de IRFT 1, 2 y 3, respectivamente. El primer dominio de tipo Kunitz de IRFT-2 humano contiene todos los elementos estructurales para inhibición de la serina proteasas, aunque los estudios cinéticos y moleculares indican que el IRFT-2 es un inhibidor más eficaz de la plasmina que varias otras serina proteasas, incluyendo FT/FVIIa (Chand et al. (2004) J Biol Chem 279: 17500-17507). Se cree que desempeñan un papel importante en la regulación de la digestión y 10 remodelación de la matriz extracelular. En este contexto, la síntesis reducida de IRFT-2 se ha relacionado con numerosos procesos patofisiológicos tales como inflamación, angiogénesis, ateroesclerosis, degeneración retiniana y crecimiento tumoral/metástasis (Chand et al. (2005) Thromb Haemost 94: 1122-30). Por lo tanto, aunque es homólogo del IRFT, se cree que el IRFT-2 no es un factor tan importante en la ruta de coagulación. El alineamiento se secuencias de la secuencia del dominio Kunitz-1 de IRFT-1 e IRFT-2 se expone en la Figura 6b. 15

El inmunoagotamiento de IRFT en un modelo de conejo potenció la coagulación (Warn-Cramer et al. (1993) Arterioscl Thromb 13: 1551-1557, Ragni et al. (2000) Circulation 102: 113-117), lo que indica que la alteración de la formación del complejo cuaternario de FT/FVIIa-IRFT/FXa pueden inhibir la regulación negativa del inicio de coagulación por FT/FVIIa. Adicionalmente, la alteración de la interacción de FVIIa con IRFT puede reducir la 20 eliminación de FVIIa. La eliminación reducida puede manifestarse como semivida aumentada. Además, FVIIa unido al FT de superficie celular puede internalizarse y degradarse sin agotar el FT en la superficie celular. Esta forma de internalización y degradación aumenta significativamente en presencia de IRFT/FXa, que forma un complejo cuaternario con el FT/FVIIa de superficie celular. La internalización y degradación que sigue a la unión está mediada por una ruta de muesca recubierta dependiente de proteína relacionada con el receptor de lipoproteína (LRP) de 25 baja densidad (Iakhiaev et al., (1999) J. Biol. Chem 274: 36995-37003). El IRFT también puede ayudar a mediar en la eliminación de FVIIa a través de otros mecanismos, tales como mecanismos de eliminación hepática o renal.

Modificaciones para efectuar resistencia aumentada a IRFT

En el presente documento se proporcionan polipéptidos de FVII modificados que muestran resistencia aumenta a IRFT. Dicha resistencia a IRFT puede conseguirse, por ejemplo, por mutación de uno o más restos en FVII implicados en la interacción y unión con IRFT para reducir o impedir dicha unión, haciendo de este modo a los polipéptidos de FVII modificados resistentes a los efectos inhibidores de forma natural de IRFT con respecto al inicio de la coagulación. Cuando se evalúa en un ensayo in vitro, o in vivo, apropiado, tal como después de la 35 administración a un sujeto, como un producto terapéutico procoagulante, los polipéptidos de FVII resistentes a IRFT modificados pueden presentar actividad coagulante aumentada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados. Entre los mutantes de FVIIa que muestran resistencia a IRFT aumentada, están mutantes que tienen semivida aumentada. Por ejemplo, el mutante descrito en el Ejemplo 9 muestra semivida aumentada.

En el presente documento se proporcionan polipéptidos de FVII modificados que tienen una o más mutaciones de restos de contacto de FVII/IRFT o restos en proximidad estrecha a la interfaz de interacción. Dichos restos de contacto incluyen el resto de ácido aspártico en la posición 196 (D196, Asp196), el resto de lisina en la posición 197 (K197, Lys197), el resto de lisina en la posición 199 (K199, Lys199), el resto de treonina en la posición 239 (T239, Thr239), el resto de arginina en la posición 290 (R290, Arg290) y el resto de lisina en la posición 341 (K341, Lys341), 45 con la numeración relativa a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro expuesta en SEC ID Nº: 3. Cuando se identifican usando numeración de quimiotripsina, estos restos corresponden a D60, K60a, K60c, T99, R147 y K192 (Figura 7). Un resto que está en proximidad estrecha a la interfaz de FVII/IRFT, y que puede modificarse para provocar impedimento estérico, es el resto de glicina en la posición 237 (G237, Gly237) por numeración de FVII maduro, que corresponde a G97 (Gly97) por numeración de quimiotripsina. 50

Los restos identificados pueden modificarse tal como por reemplazo, deleción o sustitución de aminoácidos. Como alternativa, pueden usarse inserciones de aminoácidos para alterar la conformación de un resto de aminoácido diana o la estructura proteica en las cercanías de un resto de aminoácido diana. Por ejemplo, los restos identificados pueden reemplazarse o sustituirse con otro aminoácido para alterar la interacción entre FVII e IRFT e inhibir la unión 55 eficaz de las dos proteínas, generando de este modo un polipéptido de FVII modificado resistente a IRFT. Por ejemplo, se contempla la sustitución de un aminoácido que impide de forma estérica la interacción de FVII e IRFT (es decir sustitución de Gly237 (Gly97) con otro aminoácido mayor). En otras realizaciones, los polipéptidos de FVII modificados resistentes a IRFT pueden generarse reemplazando un resto de contacto con un aminoácido alternativo de modo que se consiga inversión de la carga o neutralización de la carga en la posición identificada. Estos tipos de 60 mutaciones pueden afectar significativamente a las contribuciones electroestáticas del aminoácido de FVII sustituido y alterar la interacción normal del resto de contacto con resto o restos de contacto de IRFT correspondientes. Por ejemplo, un resto de ácido aspártico con carga negativa en FVII, que podría interaccionar normalmente de forma favorable con un resto de arginina con carga positiva en IRFT, puede reemplazarse con una lisina con carga positiva para eliminar no solamente la interacción electroestática favorable original sino también crear una fuerza repulsiva 65 entre los restos e interferir con la unión eficaz de la proteínas. Esta mutación, por lo tanto, interfiere con la unión

eficaz de las proteínas. Por lo tanto, un aminoácido con carga negativa (es decir un aminoácido ácido) tal como ácido aspártico (Asp, D) o ácido glutámico (Glu, E) puede sustituirse con un aminoácido con carga positiva (es decir un aminoácido básico) tal como lisina (Lys, K), arginina (Arg, R), o histidina (His, H). Por el contrario, un aminoácido básico tal como lisina (Lys, K), arginina (Arg, R), o histidina (His, H) puede sustituirse con un aminoácido ácido tal como ácido aspártico (Asp, D) o ácido glutámico (Glu, E). Además, cualquier resto de contacto puede sustituirse con 5 un aminoácido neutro tal como alanina (Ala, A), tirosina (Tyr, Y) metionina (Met, M), o leucina (Leu, L), isoleucina (Ile, I), valina (Val, V), fenilalanina (Phe, F), prolina (Pro, P) o glicina (Gly, G), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), asparagina (Asn, N), glutamina (Gln, Q), triptófano (Trp, W) y cisteína (Cys, C). Son ejemplos de aminoácidos neutros los aminoácidos hidrófobos, que incluyen isoleucina (Ile, I), fenilalanina (Phe, F), valina (Val, V), leucina (Leu, L), triptófano (Trp, W), metionina (Met, M), alanina (Ala, A), glicina (Gly, G), cisteína (Cys, C) y tirosina (Tyr, Y). 10

En algunas realizaciones, la glicina en la posición 237 por numeración de FVII maduro se reemplaza de modo que el nuevo aminoácido provoque impedimento estérico e inhiba la interacción entre FVII e IRFT. La glicina es el más pequeño y más sencillo de los aminoácidos, conteniendo solo un único átomo de hidrógeno en su cadena lateral. Debido a su pequeño tamaño, la glicina puede ajustarse a espacios pequeños y puede adoptar conformaciones particulares que otros aminoácidos no pueden. La sustitución de la glicina en la posición 237 con un aminoácido con 15 una cadena lateral mayor podría provocar impedimento estérico con otros aminoácidos en la proteína FVII, alterando de este modo la conformación de la interfaz de unión a IRFT y/o provocar el impedimento estérico con aminoácidos en la proteína de IRFT. Ambas situaciones podrían dar como resultado interacción y unión alterada de FVII e IRFT, aumentando de este modo la resistencia del polipéptido de FVII modificado a los efectos inhibidores de IRFT. Cualquiera de los 19 aminoácidos naturales contiene cadenas laterales mayores que las de la glicina, y podrían 20 usarse para cuantificar el polipéptido de FVII. Son ejemplos de estos triptófano (Trp, W), isoleucina (Ile, I), valina (Val, V) y treonina (Thr, T).

En otros ejemplos, se incorporan inserciones de aminoácidos en el polipéptido de FVII cerca de los restos identificados para interferir con la interacción entre IRFT y FVII. Uno o más restos de aminoácidos pueden insertarse 25 en una o más posiciones en el polipéptido de FVII. Por ejemplo, puede insertarse un resto de tirosina entre D196 y K197 (correspondiente a D60 y K60a, respectivamente, por numeración de quimiotripsina). Esta modificación es D196K197insY (es decir D196 y K197 son las posiciones entre las que se ha insertado una tirosina (insY)). En otro ejemplo, se insertan dos restos de aminoácidos en una posición identificada como importante para la interacción con IRFT. Por ejemplo, puede insertarse una alanina y una serina entre G237 y T238 (correspondiente a G97 y T98, 30 respectivamente, por numeración de quimiotripsina), dando como resultado la modificación G237T238insAS. Dichas mutaciones de inserción podrían dar como resultado interacción y unión alteradas de FVII e IRFT, aumentando de este modo la resistencia del polipéptido de FVII modificado a los efectos inhibidores de IRFT.

La Tabla 5 proporciona ejemplos no limitantes de reemplazos de aminoácidos ejemplares en los restos identificados, 35 correspondientes a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro como se expone en SEC ID Nº: 3. Como se observa, dichos polipéptidos de FVII se diseñan para aumentar la resistencia a IRFT inhibiendo la unión de FVII/IRFT, y por lo tanto tienen actividad coagulante aumentada. En referencia a dichas mutaciones, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido de FVII maduro con referencia a SEC ID Nº: 3, y el segundo aminoácido 40 (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza el primer aminoácido en esa posición. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se indican por el esquema de numeración de quimiotripsina. En la Tabla 5 más adelante, se identifica el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado, y también cualquiera de los números de identificación del polipéptido. 45

Tabla 5.

Modificación - numeración de FVII maduro: Modificación -numeración de quimiotripsina Polipéptido ID número SEC ID Nº

D196K: D60K CB554

D196R: D60R CB555

D196A: D60A CB556

D196Y: D60Y CB601

D196F: D60F CB600

D196W: D60W CB602

D196L: D60L CB603

D196I: D60I CB604

K197Y: K60aY CB561

K197A: K60aA CB559

K197E: K60aE CB558

K197D: K60aD CB557

K197L: K60aL CB560

K197M: K60aM CB599

K197I: K60aI CB595

K197V: K60aV CB596

K197F: K60aF CB597

K197W: K60aW CB598

K199A: K60cA CB564

K199D: K60cD CB562

K 199E: K60cE CB563

G237W: G97W CB605

G237T: G97T CB606

G237I: G97I CB607

G237V: G97V CB608

T239A: T99A CB565

R290A: R1A7A CB568

R290E: R147E CB567

R290D: R147D CB566

R290N: R147N CB697

R290Q: R147Q CB698

R290K: R147K CB699

R290M: R147M CB700

R290V: R147V CB701

K341E: K192E

K341 R: K192R CB569

K341Q: K192Q CB609

K341N: K192N CB733

K341M: K192M CB734

K341 D: K192D CB735

G237T238insA: G97T98insA CB853

G237T238insS: G97T98insS CB854

G237T238insV: G97T98insV CB855

G237T238insAS: G97T98insAS CB856

G237T238insSA: G97T98insSA CB857

D196K197insK: D60K60ainsK CB858

D196K197insR: D60K60ainsR CB859

D196K197insY: D60K60ainsY CB860

D196K197insW: D60K60ainsW CB861

D196K197insA: D60K60ainsA CB862

D196K197insM: D60K60ainsM CB863

K197I198insE: K60aI60binsE CB864

K197I198insY: K60aI60binsY CB865

K197I198insA: K60aI60binsA CB866

K197I198insS: K60aI60binsS CB867

En una realización adicional, pueden generarse mutantes de combinación. Entre dichos mutantes de combinación se incluyen los que tienen dos o más mutaciones de los restos D196, K197, K199, G237, T239, R290 o K341 basándose en la numeración de un FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3 (correspondiente a D60, K60a, K60c, G97, T99, R147 y K 192, respectivamente, basándose en la numeración de quimiotripsina). Por ejemplo, un 5 polipéptido de FVII modificado puede poseer sustituciones de aminoácidos en 2, 3, 4, 5, 6 o 7 de las posiciones identificadas. Como se ha indicado anteriormente, se reemplazan restos de modo que se eliminen interacciones favorables entre FVIIa e IRFT, y se introducen interacciones desfavorables, o se introduce impedimento estérico, en una o más posiciones. Por lo tanto, un polipéptido modificado puede presentar 1, 2, 3,4, 5, 6 o 7 mutaciones que proporcionan uno o más de impedimento estérico, inmersión de carga, neutralización de carga u otra interacción 10 desfavorable, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, pueden realizarse dos o más mutaciones de modo que los aminoácidos con carga negativa, tales como el ácido aspártico (Asp, D) o el ácido glutámico (Glu, E), puedan sustituirse con un aminoácido con carga positiva tal como lisina (Lys, K), arginina (Arg, R), o histidina (His, H) o viceversa, o puedan realizarse sustituciones neutras por reemplazo de cualquier aminoácido con, por ejemplo, alanina (Ala, A), tirosina (Tyr, Y) metionina (Met, M), o leucina (Leu, L), isoleucina (Ile, I), valina (Val, V), fenilalanina 15 (Phe, F), prolina (Pro, P) o glicina (Gly, G), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), asparagina (Asn, N), glutamina (Gln, Q), triptófano (Trp, W) y cisteína (Cys, C) o cualquier combinación de los mismos. Son ejemplos de aminoácidos neutros los aminoácidos hidrófobos, que incluyen isoleucina (Ile, I), fenilalanina (Phe, F), valina (Val, V), leucina (Leu, L), triptófano (Trp, W), metionina (Met, M), alanina (Ala, A), glicina (Gly, G), cisteína (Cys, C) y tirosina (Tyr, Y). En otro ejemplo, pueden realizarse dos o más mutaciones donde al menos una es una inversión de carga o neutralización 20 de carga y otra es una sustitución que reemplaza glicina con aminoácidos que contienen una cadena lateral mayor, tal como triptófano (Trp, W), isoleucina (Ile, I), valina (Val, V) y treonina (Thr, T). En otros ejemplos, una mutación de inserción puede incluirse en el polipéptido de FVII modificado con otras mutaciones de inserción, o con una o más sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones de aminoácidos que introducen interacciones desfavorables o impedimento estérico entre FVII e IRFT. Puede incluirse cualquier permutación de combinaciones en un 25 polipéptido de FVII modificado usando las modificaciones expuestas en la Tabla 5, anterior. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII proporcionados en el presente documento pueden contener D196K y una o más modificaciones de reemplazo adicionales en la posición de aminoácidos K197, K199, G237, T239, R290 y/o K341, y/o una inserción de D196, K197 y/o G237. Un experto en la materia puede generar fácilmente todas las combinaciones posibles usando las modificaciones expuestas en la Tabla 5. 30

Por ejemplo, las variantes de FVII incluyen las que incluyen como una de sus mutaciones una sustitución de aminoácido en la posición 197, basándose en la numeración de un FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3. Cualquier resto de aminoácido puede sustituir el resto de lisina que ocupa la posición 197 en un polipéptido de FVII no modificado. En algunas realizaciones, la lisina se reemplaza por una tirosina (Y), una alanina (A), un ácido 35 glutámico (E), un ácido aspártico (D), una leucina (L), una metionina (M), una isoleucina (I), una valina (V), una fenilalanina (F), o un resto de triptófano (W). Por ejemplo, es un ejemplo de un polipéptido de FVII modificado uno que contiene la sustitución K197L o K197E. En otro ejemplo, un polipéptido de FVII que contiene una modificación en la posición 197 (tal como un reemplazo, deleción o adición) también puede incluir otra modificación en otra posición. En general dicha otra modificación está en una posición que se contempla que modula la interacción de 40 FVII con IRFT, tal como eliminando una interacción favorable, creando una interacción desfavorable, introduciendo impedimento estérico o una combinación de los mismos. Se incluyen entre dichas modificaciones adicionales modificaciones en posiciones de aminoácidos correspondientes a D196, K199, G237, T239, R290 o K341, tal como se ha descrito anteriormente. También se contemplan otras modificaciones adicionales conocidas en la técnica, tal como se describe posteriormente. Por lo tanto, además de la modificación en la posición 197, un polipéptido de FVII 45 puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más modificaciones de aminoácidos. Por ejemplo, los ejemplos de variantes de FVII

que tienen al menos una modificación en la posición 197 incluyen los que contienen 2 sustituciones, tales como D196F y K197E, los que contienen 3 sustituciones, tales como en D196R, K197M y K199E, los que contienen 4 sustituciones, tales como D196R, K197E, K199E y R290E, los que contienen 5 sustituciones, tales como K197L, K199D, G237T, R290D y K341Q, los que contienen 6 sustituciones tales como D196F, K197L, K199E, G237V, T239A y R290D, y los que contienen 7 sustituciones, tales como D196Y, K197L, K199A, G237T, T239A, R290D y 5 K341R. Los ejemplos de mutantes de combinación de FVII que incluyen como una de sus mutaciones una sustitución de aminoácido en la posición 197, basándose en la numeración de un FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3, se incluyen en la Tabla 6.

Son polipéptidos de FVII ejemplares que contienen dos o más reemplazos de aminoácidos en uno o más restos de aminoácidos de D196, K197, K199, G237, T239, R290 o K341, correspondientes a las posiciones de aminoácidos 10 de un polipéptido de FVII maduro como se expone en SEC ID Nº: 3, los proporcionados en la Tabla 6. En la tabla, las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema de numeración de quimiotripsina. Dichas modificaciones se diseñan para aumentar la resistencia a IRFT inhibiendo la unión de FVII con IRFT, y aumentar de este modo la actividad de coagulación.

Tabla 6.

D196R/R290E: D60R/R147E CB579

D196K/R290E: D60K/R147E CB580

D196R/R290D: D60R/R147D CB581

D196R/K197E/K199E: D60R/K60aE/K60cE CB586

D196K/K197E/K199E: D60K/K60aE/K60cE CB587

D196R/K197E/K199E/ R290E: D60R/K60aE/K60cE/ R147E CB588

D196R/ K197M/ K199E: D60R/K60aM/K60cE CB589

D196R/K197M/K199E/ R290E: D60R/K60aM/K60cE/ R147E CB590

D196K/K197L: D60K/K60aL CB610

D196F/K197L: D60F/K60aL CB612

D196L/K197L: D60L/K60aL CB611

D196M/K197L: D60M/K60aL CB613

D196W/K197L: D60W/K60aL CB614

D196F/K197E: D60F/K60aE CB615

D196W/K197E: D60W/K60aE CB616

D196V/K197E: D60V/K60aE CB617

K197E/K341Q: K60aE/K192Q CB637

K197L/K341Q: K60aL/K192Q CB638

G237V/K341Q: G97V/K192Q CB670

K197E/G237V/K341Q: K60aE/G97V/K192Q CB671

K197E/K199E: K60aE/K60cE CB688

K197E/G237V: K60aE/G97V CB689

K199E/K341Q: K60cE/K192Q CB694

K197E/K199E/K341Q: K60aE/K60cE/K192Q CB691

Los polipéptidos de FVII que contienen una o más sustituciones de aminoácidos en los restos anteriormente identificados también pueden contener mutaciones adicionales, tales como las descritas en la Publicación de Patente Internacional Nº WO2004/083361, Neuenschwander et al., (1995) Biochemistry 34: 8701-8707, Chang et al., 20 (1999) Biochemistry 38: 10940-10948, e Iakhiaev et al., (2001) Thromb. Haemost. 85: 458-463. Por lo tanto, en una realización, los polipéptidos de FVII proporcionados en el presente documento pueden contener una o más

sustituciones de aminoácidos en uno o más restos de aminoácidos de Q176, D196, K197, K199, G237, T239, R290, E296, K341 y Q366, correspondientes a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro como se expone en SEC ID Nº: 3. Por ejemplo, la o las mutaciones adicionales pueden incluir, pero sin limitación, una o más de Q176A, D196N, G237L, E296A, K341N, K341Q, K341E, Q366A, Q366E y Q366G.

b. Antitrombina III (AT-III)

La antitrombina III (también conocida como antitrombina o AT-III) es una serpina anticoagulante importante (inhibidor de serina proteasa). La AT-III se sintetiza como una proteína precursora que contiene 464 restos de aminoácidos (SEC ID Nº: 122). En el transcurso de la secreción se escinde un péptido señal de 32 restos para generar una 10 antitrombina humana madura de 432 aminoácidos (SEC ID Nº: 123). La glucoproteína de AT-III de 58 kDa circula en la sangre y actúa como un inhibidor de serina proteasa (serpina) para inhibir un gran número de serina proteasas del sistema de coagulación. Las principales dianas de AT-III son la trombina y el factor Xa, aunque también se ha mostrado que la AT-III inhibe las actividades de FIXa, FXIa, FXIIa y, en menor grado, FVIIa. La acción de la AT-III se potencia en gran medida por glucosaminoglucanos, tales como el heparán sulfato de origen natural o las diversas 15 heparinas derivadas de tejido que se usan ampliamente como anticoagulantes en la práctica clínica. La AT-III se une de una manera altamente específica con una secuencia de pentasacárido única en heparina que induce un cambio conformacional en el bucle del centro reactivo. En dicha conformación, el bucle del centro reactivo de la AT-III puede interaccionar más eficazmente con el sitio reactivo de la serina proteasa, y efectuar inhibición.

La AT-III no es normalmente inhibidor para FVIIa en plasma libre, incluso en presencia de heparina, probablemente debido a la conformación de tipo zimógeno de FVIIa que impide la interacción eficaz con la AT-III. Sin embargo, los efectos inhibidores de la AT-III aumentan, una vez que el FVIIa forma complejo con el FT. La unión de la AT-III con el complejo de FT/FVIIa puede liberar FVIIa de FT y lo mantiene en un complejo inactivo con AT-III. La afinidad aumentada de AT-III por FVIIa unido a FT en comparación con FT supuestamente solo refleja la maduración del sitio 25 activo de FVIIa cuando está en complejo con FT, haciéndolo de esta manera susceptible a unión con AT-III (Rao et al. (1993) Blood 81: 2600-2607). Por lo tanto, el impacto de AT-III en FVIIa es proporcional a la actividad intrínseca de la molécula de FVIIa en sí misma. Aunque el FVIIa conserva su conformación de tipo zimógeno, la AT-III tiene poco efecto. Sin embargo, si el FVIIa cambia de conformación a una forma más activa, tal como mediante unión con FT, o mediante modificaciones in vitro específicas, la inhibición de la AT-III aumenta significativamente. Los 30 polipéptidos de FVIIa que se modifican para tener actividad intrínseca aumentada con frecuencia presentan aumentos simultáneos en su susceptibilidad a inhibición por AT-III. Por ejemplo, la modificación de uno o más aminoácidos en el bolsillo de activación de FVIIa, tal como por reemplazos de aminoácidos correspondientes a sustituciones K337A, L305V, M298Q, V158D y E296V (en relación con la secuencia de FVII madura expuesta en SEC ID Nº: 3), da como resultado sensibilidad aumentada del polipéptido de FVIIa a AT-III inhibiendo de esta 35 manera la actividad de FVIIa hasta el 90 % (Persson et al. (2001) PNAS 98: 13583-13588). En otro ejemplo, la inducción de una conformación de tipo zimógeno por modificación de aminoácidos implicados en una hélice  de FVIIa, aumentando al mismo tiempo la actividad de la proteína FVIIa modificada, también aumenta su susceptibilidad a AT-III (Persson et al. (2004) Biochem J 379: 497-503).

Modificaciones para efectuar resistencia aumenta a AT-III

Pueden realizarse modificaciones a un polipéptido de FVII que aumentan su resistencia a la inhibición por AT-III. En general, dichos polipéptidos de FVII modificados conservan al menos una actividad de un polipéptido de FVII. Típicamente, dichas modificaciones incluyen una o más sustituciones de aminoácidos en cualquier posición del 45 polipéptido de FVII que están implicadas directamente en la interacción de FVIIa (o el complejo de FT/FVIIa) con AT-III o en otros restos que afectan a la posición o conformación de restos que están implicados directamente en interacciones entre FVIIa (o el complejo de FT/FVIIa) y AT-III. Los polipéptidos de FVII modificados que tienen resistencia aumentada para AT-III pueden mostrar una reducción en el alcance de la inhibición en condiciones específicas o en la constante de velocidad de segundo orden para inhibición de AT-III en al menos 50 aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con el grado de inhibición o la constante de velocidad de segundo orden para la inhibición de polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre in vivo, ex vivo o in vitro. Los polipéptidos de FVII modificados son por lo tanto resistentes a los efectos inhibidores de forma natural de AT-III con respecto al inicio de la coagulación. Cuando se evalúan en un ensayo in vitro o ex vivo apropiado, o in 55 vivo, tal como después de la administración a un sujeto como un producto terapéutico procoagulante, los polipéptidos de FVII resistentes a AT-III modificados presentan actividad coagulante aumentada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados.

Como se describe en el presente documento posteriormente, un experto en la materia puede diseñar de forma 60 empírica o racional polipéptidos de FVII modificados que presentan resistencia aumentada a AT-III. Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden ensayarse en ensayos conocidos por los expertos en la materia para determinar si dichos polipéptidos de FVII modificados presentan resistencia aumentada a AT-III. Por ejemplo, la constante de velocidad de segundo orden de la inhibición por AT-III puede medirse para dichos polipéptidos de FVIIa modificados. En general, un polipéptido de FVII modificado que tiene resistencia aumentada a AT-III mostrará unión 65 reducida en condiciones específicas (por ejemplo, después de inyección de una cantidad fija de proteína a un

paciente) y/o inhibición reducida por AT-III. Típicamente, dichos ensayos se realizan en una forma bicatenaria de FVII, tal como la forma activada de FVII (FVIIa). Además, se realizan en general ensayos para determinar los efectos de AT-III en presencia de heparina y presencia de factor tisular, aunque dichos ensayos también pueden realizarse en ausencia de uno o ambos cofactores.

Los polipéptidos de FVII modificados que tienen resistencia aumentada para AT-III pueden mostrar una reducción en el grado de inhibición en condiciones específicas o en la constante de velocidad de segundo orden para la inhibición por AT-III en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con el grado de inhibición o la constante de velocidad de segundo orden para la inhibición de polipéptido de FVII no modificado o de tipo 10 silvestre bien in vivo o bien in vitro. Dichos polipéptidos de FVII modificados resultantes que tienen resistencia aumentada para AT-III pueden mostrar una reducción en la unión y/o afinidad para AT-III en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la unión y/o afinidad de polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro. La resistencia aumentada a AT-III por dichos polipéptidos 15 de FVII modificados también puede manifestarse como actividad de coagulación aumentada en presencia de AT-III. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados por AT-III puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre in vivo, ex vivo o in vitro. 20

2. Unión con plaquetas activadas

También pueden realizarse modificaciones a un polipéptido de FVII que aumentan su actividad de coagulación durante el inicio de coagulación dependiente de FT y/o independiente de FT. Este mecanismo propuesto del inicio 25 de coagulación dependiente de FT implica la activación directa de FX y FIX por FVIIa (que no está en un complejo con FT), que se efectúa en la superficie de una plaqueta activada. El FVIIa se une con plaquetas activadas a través de una interacción entre restos en el dominio Gla del polipéptido de FVIIa, y fosfatidilserina y otros fosfolípidos con carga negativa expresados en la superficie plaquetaria. Esta interacción es relativamente débil, y probablemente no desempeñe un papel significativo en el estallido inicial de la producción de trombina normalmente observada durante 30 la coagulación, que es muy probablemente un resultado de la actividad dependiente de FT. Como se ha analizado anteriormente, el inicio de la coagulación independiente de FT y la interacción relativamente débil de FVIIa con la superficie plaquetaria podría explicar el requisito de la administración de altas dosis de rFVIIa para conseguir eficacia en la clínica. Por ejemplo, tan solo aproximadamente el 1 % del FVII 10 nM en plasma está presente como FT/FVIIa, pero la dosis terapéutica de rFVIIa es 90 g/kg o aproximadamente 50 nM en plasma, muy por encima de 35 este nivel. Por lo tanto, altas dosis de rFVIIa compensan la unión de baja afinidad de rFVIIa a plaquetas activadas, dando como resultado una actividad coagulante suficiente del producto terapéutico durante el tratamiento. Por lo tanto, son de interés terapéutico los polipéptidos de FVII modificados que pueden administrarse a dosificaciones menores debido a la unión y/o afinidad aumentada para plaquetas activadas, suficiente para efectuar el inicio de la coagulación. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento se diseñan para 40 mostrar unión y/o afinidad aumentada para plaquetas activadas mediante modificación del dominio de Gla.

La interacción de restos en el dominio Gla  carboxilado de proteínas del plasma dependientes de vitamina K, tales como FVII, FIX, FX, protrombina, proteína C y proteína S, y fosfolípidos con carga negativa en la superficie de membrana es importante para la hemostasis. Los dominios Gla de proteínas del plasma dependientes de vitamina K 45 típicamente contienen aproximadamente 45 aminoácidos, de los que 9 a 12 restos de ácido glutámico se modifican postraduccionalmente por carboxilación dependiente de vitamina K para formar -carboxiglutamato (Gla). Los aminoácidos que forman el dominio Gla se sitúan inmediatamente después de los que forman el péptido señal y propéptido de las proteínas, y se sitúan por lo tanto en el extremo N terminal después del procesamiento y la escisión de los polipéptidos precursores a las proteínas maduras. Por ejemplo, los aminoácidos que forman el 50 dominio Gla n FVII están en las posiciones 39-83 del polipéptido precursor expuesto en SEC ID Nº: 1, posiciones 61-105 del polipéptido precursor expuesto en SEC ID Nº: 2, y posiciones 1 a 45 del polipéptido maduro expuesto en SEC ID Nº: 3. De estos, los 10 restos de ácido glutámico en las posiciones E6, E7, E14, E19, E20, E25, E26, E29 y E35 del polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3 se modifican por carboxilación para generar restos de -carboxiglutamato (Gla). 55

Debido a que el ácido glutámico es solamente un quelante de Ca2+ débil y el -carboxiglutamato es uno mucho más fuerte, esta etapa de modificación por la carboxilasa de vitamina K aumenta significativamente la afinidad de unión por Ca2+ del dominio Gla de la proteína. El calcio también se une al dominio proteasa de FVIIa, donde facilita los cambios conformacionales requeridos para su actividad óptima. Mediante la unión con sitios en los dominios tanto 60 Gla como proteasa de FVIIa, el calcio potencia la unión con FT y fosfolípidos así como la eficacia catalítica para activación de FX. El dominio Gla  carboxilado se une con siete iones Ca2+ con afinidad variable, que induce el cambio conformacional que permite que el dominio Gla interaccione con el dominio C terminal de FT. La unión de Ca2+ también promueve la interacción de FVIIa con fosfolípidos con carga negativa en la membrana plaquetaria, cuyo grueso son fosfatidilserinas. La fosfatidilserina (PS) es un componente clave en la membrana con carga 65

negativa que soporta la coagulación sanguínea. En la mayoría de las células, la PS está presente en la cara interna de la membrana celular, y por lo tanto no se expone al plasma. Procesos celulares específicos, tales como activación de plaquetas, dan como resultado la traslocación de PS a la superficie externa, orientada al plasma, presentando un sitio de unión para el dominio Gla de proteínas dependientes de vitamina K (Hemker et al. (1983) Blood Cells 9: 303-317). 5

Además de su implicación en las interacciones de FVIIa con FT y plaquetas activadas, el dominio Gla de FVIIa también está implicado en la unión y activación de FX. Esto puede ser mediante un mecanismo indirecto, en el que el dominio Gla de FVIIa ayuda a alinear Lys165 y Lys166 de FT con el dominio Gla de FX, una etapa importante en la activación de FX a FXa. Como alternativa, el dominio Gla de FVIIa interacciona directamente con el domino Gla de 10 FX para alinear correctamente la enzima y el sustrato antes de su activación (Neuenschwander et al. (1994) J Biol Chem 269: 8007-8013, Huang et al. (1996) J Biol Chem 271: 21752-21757). Se ha mostrado que la arginina en la posición 36 de FVIIa es importante para el acoplamiento eficaz del dominio Gla d FX en ausencia de fosfolípidos, lo que demuestra que el dominio Gla de FVIIa participa en interacciones proteína-proteína con FX (Ruf et al. (1999) Biochemistry 38: 1957-1966). 15

Aunque los dominios Gla de las diferentes proteínas del plasma dependientes de vitamina K presentan homología significativa, se unen a membranas de fosfolípidos con carga negativa con afinidad muy diferente, con constantes de disociación (Kd) que varían en más de 1000 veces. El FVII humano presenta una de las afinidades más bajas para membranas de fosfolípidos entre estas proteínas (McDonald et al. (1997) Biochemistry 36: 5120-5127). Las 20 interacciones precisas responsables de la unión del dominio Gla con PS no se entienden completamente, aunque parece probable que los restos de aminoácidos individuales dentro de este dominio contribuyan a las diferentes afinidades observadas. Estudios realizados anteriormente han indicado que hay una correlación entre los aminoácidos en las posiciones 10, 32 y 33 (en relación con la proteína FVII madura) y la afinidad de membrana general (McDonald et al. (1997) Biochemistry 36: 5120-5127). El análisis de mutación posterior también ha revelado 25 que restos específicos contribuyen a la afinidad de unión. Por ejemplo, el reemplazo de la histidina en la posición 10 de la forma madura de la proteína C con una prolina dio como resultado una reducción triple en la afinidad de membrana (Shen et al. (1997) Biochemistry 36: 16025-16031). Por el contrario, la mutación de restos específicos en el dominio Gla de las proteínas del plasma dependientes de vitamina K puede producir proteínas con mayor afinidad de membrana, y función potenciada. Los efectos de la mutación en ciertas posiciones del dominio Gla, sin embargo, 30 no están necesariamente conservados entre las diferentes proteínas. Por ejemplo, la mutación de la proteína C bovina por sustitución de Q32E y N33D medió en un gran aumento en la unión a membrana, mientras que las mutaciones correspondientes en la proteína C humana mostraron cambios mínimos en la unión. La mutación análoga del FVII humano (K32E) dio como resultado un aumento de 13 veces en la afinidad de unión en comparación con la proteína FVII de tipo silvestre (Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278: 8363-8369). 35

a. Modificación por introducción de un dominio Gla heterólogo

Debido a su afinidad de unión relativamente baja para plaquetas activadas, el dominio Gla de FVII es una diana para la modificación, con el objetivo de potenciar la interacción entre el FVII modificado y la membrana de fosfolípidos, 40 aumentando de este modo la actividad de coagulación. La modificación puede efectuarse por sustitución de aminoácidos específicos que están implicados en esta interacción (véase, por ejemplo, Shah et al. PNAS 95: 4429-4234, Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278: 8363-8369). Como alternativa, la modificación puede efectuarse por sustitución del dominio Gla completo con el dominio Gla de otra proteína dependiente de vitamina K, es decir, intercambio de dominio Gla. Este tipo de modificación da como resultado una proteína quimérica, tal como la que 45 resultó cuando el dominio Gla de proteína C se reemplazó con el dominio Gla de FVII (Geng et al. (1997) Thromb Haemost 77: 926-933).

Típicamente, dicha modificación incluye la introducción, tal como por adición o sustitución, de un dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para efectuar la unión de los fosfolípidos en una región del polipéptido 50 de FVII para generar un polipéptido de FVII modificado quimérico. En general, dicho polipéptido de FVII quimérico conserva al menos una actividad de FVII. La unión y/o afinidad de polipéptidos de FVII modificados por Gla para plaquetas activadas puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más en comparación con la unión y/o afinidad de polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o in vitro. 55 La unión y/o afinidad para plaquetas activadas por polipéptidos de FVII modificados también puede manifestarse como actividad de coagulación aumentada. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados por Gla puede aumentarse en al menos o aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o in vitro. 60

Un dominio Gla, o una parte suficiente del mismo, contenido dentro de cualquier polipéptido puede usarse como una fuente de un dominio Gla heterólogo para la introducción o reemplazo de una región de un polipéptido de FVII. Típicamente, dicho dominio Gla heterólogo muestra afinidad de unión por fosfolípidos, por ejemplo, fosfolípidos presentes en la superficie de una plaqueta activada. En general, la elección de un dominio Gla heterólogo es una 65 que muestra mayor afinidad por fosfolípidos en comparación con la afinidad del dominio Gla de FVII. El dominio de

Gla exacto, o parte suficiente del mismo, usado como un dominio heterólogo para modificación de un polipéptido de FVII puede determinarse de forma racional o empírica. Los ejemplos de otros polipéptidos que contienen Gla incluyen, pero sin limitación, FX, FIX, protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína Gla de matriz, proteína específica de detención del crecimiento 6 (Gas6) y proteína Z. Los dominios Gla de estas proteínas ejemplares se exponen en cualquiera de SEC ID Nº: 110-118, 120 y 121. Por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 5 30, 40 o más aminoácidos contiguos, o el dominio Gla completo, de un dominio Gla heterólogo pueden introducirse en un polipéptido de FVII. Además, la introducción del dominio Gla en un polipéptido de FVII también puede incluir aminoácidos adicionales que no son parte del dominio Gla del polipéptido heterólogo siempre que los aminoácidos adicionales no debiliten significativamente la capacidad de unión del fosfolípidos del dominio Gla introducido.

En algunos ejemplos, la introducción es mediante la adición del dominio Gla al polipéptido de FVII de modo que el dominio Gla heterólogo se inserta en el dominio Gla endógeno o en otra región o dominio del polipéptido de FVII siempre que el polipéptido de FVII modificado conserve al menos una actividad de FVII. En dichos ejemplos, el dominio Gla nativo del polipéptido de FVII se conserva en el polipéptido, aunque en algunos casos la secuencia de aminoácidos que compone el domino Gla nativo está interrumpida. En otros ejemplos, el dominio Gla heterólogo, o 15 una parte suficiente del mismo, se inserta adyacente a, cualquiera de los extremos N o C, del dominio Gla nativo de modo que el dominio Gla nativo no se interrumpa. En un ejemplo adicional, el dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo, se inserta en otro dominio del polipéptido de FVII.

En el presente documento también se proporcionan polipéptidos de FVII de dominio Gla modificados donde todo, o 20 una parte contigua, del dominio Gla endógeno de FVII se retira y se reemplaza con un dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo, para efectuar unión a fosfolípidos, siempre que el polipéptido de FVII modificado conserve al menos una actividad de FVII. Dicha modificación también se denomina intercambio de dominio Gla. Por ejemplo, todo, o una parte, del dominio Gla de FVII, tal como se expone en SEC ID Nº: 119, correspondiente a los aminoácidos 1-45 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3, puede retirarse de un polipéptido de 25 FVII y reemplazarse con un dominio Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo. La parte heteróloga incluye cualquier dominio Gla conocido por el experto en la materia que se una con fosfolípidos, incluyendo, pero sin limitación, un dominio Gla que tenga la secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEC ID Nº: 110-118, 120 y 121. En algunos casos, una parte suficiente de un dominio Gla, tal como una parte suficiente de cualquiera de SEC ID Nº: 110-118, 120 y 121 para efectuar unión a fosfolípidos, puede reemplazar el dominio Gla endógeno, o 30 una parte del dominio Gla endógeno, de FVII. Por ejemplo, el dominio Gla de FVII puede intercambiarse con el dominio Gla de la proteína C expuesta en SEC ID Nº: 113. El polipéptido de FVII modificado resultante contiene un dominio Gla de la proteína C seguido de su propio dominio EGF-1, EGF-2 y serina proteasa.

En algunos ejemplos, el domino Gla heterólogo contiene mutaciones que efectúan adicionalmente unión aumentada 35 con plaquetas activadas, debido a unión de fosfolípidos aumentada. Por ejemplo, si el dominio Gla de la proteína C se introduce para generar un polipéptido de FVII modificado, el dominio Gla de la proteína C puede contener mutaciones de aminoácidos que confieren unión a fosfolípidos aumentada.

En otros ejemplos, el dominio Gla heterólogo puede contener mutaciones adicionales que confieren funciones de 40 tipo FVII al dominio Gla. Por ejemplo, como se ha indicado anteriormente, R36 del dominio Gla de FVII expuesto en SEC ID Nº: 119 puede estar implicado en interacciones con FX. Por lo tanto, el dominio Gla heterólogo puede contener modificaciones adicionales, tales como cualquiera requerida para mantener una arginina en la posición 36 del polipéptido de FVII maduro, como se expone en SEC ID Nº: 3, o cualquier otra modificación requerida para mantener las propiedades de activación de FX del polipéptido FVIIa modificado (Ruf et al. (1999) Biochem 38: 1957-45 1966). Por lo tanto, en algunos ejemplos, puede realizarse una mutación correspondiente a R36 en el dominio Gla heterólogo. La posición correspondiente puede determinarla un experto en la materia, tal como por alineamiento de secuencias de aminoácidos.

Como se describe posteriormente en el presente documento, un experto en la materia puede diseñar de forma 50 empírica o racional polipéptidos de FVII modificados que contienen un dominio Gla heterólogo de modo que el polipéptido de FVII resultante conserve al menos una actividad de FVII. Típicamente, dichos polipéptidos de FVII modificados conservan su capacidad para unirse con y activar FX. En algunos casos, dichos polipéptidos de FVII modificados también conservan su capacidad para unirse con y activar FIX. Los polipéptidos de FVII modificados por Gla resultantes incluyen los que conservan su capacidad para unirse con FT. Los polipéptidos de FVII modificados 55 con intercambio de Gla también incluyen los que tienen actividad intrínseca aumentada en ausencia de FT. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados con Gla resultantes incluyen los que no se unen con FT o los que se unen con FT escasamente en comparación con FVIIa de tipo silvestre. Típicamente, dichos polipéptidos de FVII modificados presentan unión a fosfolípidos aumentada. En particular, dichos polipéptidos de FVII modificados muestran unión aumentada a fosfatidilserina. La unión aumentada a fosfolípidos puede ensayarse en fosfolípidos 60 aislados o en la superficie de plaquetas activadas. Dichos ensayos se realizan típicamente en una forma bicatenaria de FVII, tal como la forma activada de FVII (FVIIa).

En el presente documento se proporcionan polipéptidos de FVII modificados que contienen un dominio Gla heterólogo. Son ejemplos de dichos polipéptidos de FVII modificados en los que el dominio Gla endógeno se 65 reemplaza con todo o una parte del dominio Gla de uno cualquiera de FIX (SEC ID Nº: 110), FX (SEC ID Nº: 111),

trombina (SEC ID Nº: 112), Proteína C (SEC ID Nº: 113) o Proteína S (SEC ID Nº: 114). Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden mostrar unión aumentada con plaquetas activadas, dando como resultado actividad coagulante aumentada. La Tabla 7 expone modificaciones ejemplares que pueden realizarse a un polipéptido de FVII para reemplazar el domino Gla endógeno con el de FIX, FX, proteína C, proteína S o trombina. La tabla proporciona el nombre de la modificación (por ejemplo intercambio de Gla FX) y los detalles de la modificación, incluyendo las 5 posiciones de aminoácidos en las que el dominio Gla exógeno se inserta en el polipéptido de FVII, y la secuencia del dominio Gla exógeno. También se proporciona el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado, y también cualquier número de identificación de polipéptidos. Por ejemplo, la modificación de “intercambio de Gla FIX” (A1Y44delinsYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWK QY) implica la deleción del dominio 10 Gla de FVII endógeno suprimiendo los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3) e inserción de 45 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos Y1 a Y45 del dominio Gla de FIX expuesto en SEC ID Nº: 110. De forma similar, la modificación de intercambio de Gla FX implica la deleción de los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3) e inserción de 44 restos de aminoácidos que corresponden a 15 A1 a Y44 del dominio Gla de FX expuesto en SEC ID Nº: 111. La modificación de intercambio de Gla Trombina implica la deleción de los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3) e inserción de 44 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos Y1 a Y44 del dominio Gla de Trombina expuesto en SEC ID Nº: 112. La modificación de intercambio de Gla Proteína C implica la deleción de los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII 20 maduro expuesto en SEC ID Nº: 3) e inserción de 44 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos A1 a H44 del dominio Gla de Proteína C expuesto en SEC ID Nº: 113. La modificación de intercambio de Gla Proteína S implica la deleción de los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3) e inserción de 44 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos Y1 a Y44 del dominio Gla de Proteína C expuesto en SEC ID Nº: 114. 25

Los polipéptidos de FVII modificados que contienen un dominio Gla heterólogo pueden mostrar actividad coagulante aumentada a dosificaciones menores en comparación con una molécula de FVII de tipo silvestre, tal como NovoSeven®, debido al aumento de la unión y/o afinidad para plaquetas activadas. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados con Gla puede aumentarse en al menos o aproximadamente el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 5 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre in vivo, ex vivo o in vitro.

3. Combinaciones y modificaciones adicionales

Además de la modificación de los polipéptidos de FVII para que tengan resistencia aumentada a IRFT, resistencia aumentada a AT-III, actividad catalítica dependiente de FT y/o independiente de FT aumentada, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida aumentada y/o unión y/o afinidad para membranas fosfolipídicas aumentada, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento también incluyen los que muestran más de una de las propiedades anteriormente indicadas. Por ejemplo, un polipéptido de FVII puede 15 modificarse de modo que el polipéptido resultante presente unión con y/o afinidad por fosfolípidos aumentada y también presente resistencia aumentada a IRFT. En consecuencia un polipéptido de FVII puede modificarse por introducción de un dominio Gla heterólogo de otra proteína de plasma dependiente de vitamina K y por sustitución de uno cualquiera o más de los aminoácidos en las posiciones 196, 197, 199, 237, 239, 290 o 341 en relación con el polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3. 20

Además, cualquier polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento también puede contener una o más modificaciones adicionales descritas en la técnica. Típicamente, dichas modificaciones adicionales son las que en sí mismas dan como resultado una actividad coagulante aumentada del polipéptido modificado y/o una estabilidad aumentada del polipéptido. En consecuencia, los polipéptidos de FVII modificados resultantes muestran 25 una actividad coagulante aumentada. Las modificaciones adicionales pueden incluir, por ejemplo, cualquier sustitución, deleción o inserción de aminoácidos conocida en la técnica, típicamente cualquiera que aumente la actividad coagulante y/o estabilidad del polipéptido de FVII. Cualquier polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más modificaciones de aminoácidos adicionales, siempre que el polipéptido de FVII modificado resultante conserve una 30 actividad de FVII del polipéptido de tipo silvestre o no modificado.

En un ejemplo, puede realizarse la modificación adicional en la secuencia del polipéptido de FVII de modo que su interacción con otros factores, moléculas y proteínas esté alterada. Por ejemplo, los restos de aminoácidos que están implicados en la interacción con el factor tisular (FT) pueden reemplazarse de modo que la afinidad del 35 polipéptido de FVII modificado por FT aumente. Otras modificaciones incluyen, pero sin limitación, modificación de aminoácidos que están implicados en interacciones con el factor X, factor IX, IRFT y AT-III.

También pueden realizarse modificaciones adicionales a un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento que alteren la conformación o el plegamiento del polipéptido. Estas incluyen, por ejemplo, el 40 reemplazo de uno o más aminoácidos con una cisteína de modo que se forme un nuevo enlace disulfuro, o modificaciones que estabilicen una conformación de hélice-, proporcionando de este modo actividad aumentada al polipéptido de FVII modificado.

También pueden realizarse modificaciones adicionales al polipéptido de FVII para efectuar modificaciones 45 postraduccionales. Por ejemplo, el polipéptido puede modificarse para incluir sitios de glucosilación adicionales de modo que el polipéptido de FVII modificado resultante tenga glucosilación aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. También pueden realizarse modificaciones para introducir restos de aminoácidos que puedan unirse posteriormente con un resto químico, tal como uno que actúe para aumentar la estabilidad del polipéptido de FVII modificado. También puede alterarse un polipéptido de FVII modificando uno o más sitios de 50 escisión posibles para proteasas endógenas, reduciendo de este modo la degradación de la variante de FVIIa y aumentando la estabilidad del polipéptido de FVII modificado.

Adicionalmente, pueden realizarse sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos en el dominio Gla endógeno o heterólogo de modo que el polipéptido de FVII modificado presente unión con y/o afinidad aumentada 55 por membranas fosfolipídicas. En otros ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden presentar deleciones en el dominio Gla endógeno, o sustituciones en las posiciones que normalmente están gamma-carboxiladas (documento US20070037746).

Las siguientes secciones describen ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares descritas en la técnica para 60 efectuar estabilidad aumentada y/o actividad coagulante de un polipéptido de FVII. Como se ha analizado anteriormente, dichas modificaciones también pueden incluirse adicionalmente en cualquier polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento. Las posiciones de aminoácidos a las que se hace referencia posteriormente corresponden al polipéptido de FVII maduro como se expone en SEC ID Nº: 3. Pueden realizarse mutaciones correspondientes en otros polipéptidos de FVII, tales como variantes alélicas, de especie o de corte y 65 empalme del polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3.

a. Modificaciones que aumentan la actividad intrínseca

En un ejemplo, pueden realizarse modificaciones adicionales a un polipéptido de factor VII modificado proporcionado en el presente documento que den como resultado una actividad catalítica aumentada hacia el factor X y/o factor IX. Por ejemplo, pueden realizarse modificaciones a los aminoácidos que están implicados en la interacción con su 5 cofactor, FT, de modo que el polipéptido de FVII modificado resultante tenga afinidad aumentada por FT, y presente de este modo actividad aumentada hacia FX y/o FIX. También pueden realizarse modificaciones al bolsillo de activación del polipéptido de FVII, de modo que la actividad intrínseca del polipéptido de FVII modificado hacia FX y/o FIX aumente en comparación con la actividad del polipéptido no modificado. Otra estrategia de modificación que da como resultado actividad aumentada, implica la modificación del polipéptido de FVII de modo que el plegamiento 10 y la conformación de la proteína estén alterados a una forma más activa o un equilibrio entre conformaciones altamente activas e inactivas (o menos activas) se desplace a favor de la conformación o conformaciones altamente activas. También puede conseguirse un polipéptido más activo mediante modificación de los aminoácidos implicados en las cadenas  del polipéptido de FVII. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos que introducen nuevos pares de cisteína que pueden formar nuevos enlaces disulfuro que pueden actuar para “bloquear” 15 el polipéptido de FVII modificado en una forma más activa.

Los ejemplos de modificaciones adicionales que pueden incluirse en los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento para aumentar la actividad intrínseca del polipéptido de FVII modificado incluyen, pero sin limitación, los descritos en Persson et al. (2004) Biochem J. 379: 497-503, Maun et al. (2005) Prot 20 Sci 14: 1171-1180, Persson et al. (2001) PNAS 98: 13583-13588, Persson et al. (2002) Eur J Biochem 269: 5950-5955, Soejima et al. (2001) J Biol Chem 276: 17229-17235, Soejima et al. (2002) J Biol Chem 277: 49027-49035, documentos WO200183725, WO2002022776, WO2002038162, WO2003027147, WO200338162, WO2004029090, WO2004029091, WO2004108763 y WO2004111242. Los ejemplos no limitantes de modificaciones de aminoácidos ejemplares descritas en el presente documento que pueden dar como resultado actividad intrínseca aumentada del 25 polipéptido de FVII modificado incluyen una cualquiera o más de S278C/V302C, L279C/N301C, V280C/V301C, S281C/V299C, S314E, L39E, L39Q, L39H, I42R, S43Q, S53N, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, T83K, E116D, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, 30 V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, R304Y, R304F, R304L, R304M, L305V, L305Y, L305I, 35 L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, S314A, S314V, S3141, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, 40 S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K3371, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, F374P, F374A, F374V, F3741, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, y sustitución de las posiciones 300-322, 305-322, 300-312, o 305-312 con los aminoácidos correspondientes de tripsina, trombina o FX, y sustitución de las posiciones 310-329, 311-322 o 233-329 con los 45 aminoácidos correspondientes de tripsina.

b. Modificaciones que aumentan la resistencia a proteasas

Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento también pueden contener 50 modificaciones adicionales que dan como resultado resistencia aumentada del polipéptido a proteasas. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos que retiren uno o más posibles sitios de escisión proteolítica. Los polipéptidos de FVII modificados pueden hacerse por lo tanto más resistentes a proteasas, aumentando de este modo la estabilidad y semivida del polipéptido modificado.

Los ejemplos de modificaciones adicionales que pueden incluirse en los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento para aumentar la resistencia a proteasas incluyen, pero sin limitación, los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº US5580560 o en las Solicitudes Publicadas Internacionales Nos WO1988010295 y WO2002038162. Los ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares descritas en la técnica que pueden dar como resultado resistencia aumentada del polipéptido de FVII modificado a inhibidores y/o 60 proteasas incluyen uno cualquiera o más de: K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32A, K32S, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, I42N, I42S, I42A, I42Q, Y44N, Y44S, Y44A, Y44Q, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, k341E, K341Q, K341G, K341T, K341A y K341S.

c. Modificaciones que aumentan la afinidad por fosfolípidos

La actividad coagulante de FVII puede potenciarse aumentando la unión y/o afinidad del polipéptido por fosfolípidos, tales como los expresados en la superficie de plaquetas activadas. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos adicionales en posiciones particulares en el domino Gla endógeno de un polipéptido de FVII que da 5 como resultado un polipéptido de FVII modificado con capacidad aumentada para unirse con fosfatidilserina y otros fosfolípidos con carga negativa. Por lo tanto, dichas modificaciones también pueden incluirse en un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento, siempre que dichos polipéptidos de FVII modificados posean un dominio Gla endógeno, es decir, no se hayan sometido ya a modificación dando como resultado la sustitución del dominio Gla endógeno con el de otra proteína dependiente de vitamina K. 10

Los ejemplos de modificaciones adicionales para aumentar la unión con y/o afinidad por fosfolípidos y que pueden realizarse a un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento que contiene un dominio Gla de FVII endógeno incluyen, pero sin limitación, los descritos en Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278: 8363-8369, documentos US20030100506, US20040220106, US20060240526, US6017882, US6693075, US6762286, 15 WO200393465 y WO2004111242. Los ejemplos de dichas modificaciones incluyen uno cualquiera o más de una inserción de una tirosina en la posición 4, o modificación de uno o cualquiera o más de P10Q, P10E, P10D, P10N, R28F, R28E, K32E, K32D, D33F, D33E, D33K A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, K38E y K38D.

d. Modificaciones que alteran la glucosilación

La alteración de los niveles de glucosilación de una proteína se ha descrito en la técnica como un medio para reducir la inmunogenicidad, aumentar la estabilidad, reducir la frecuencia de administración y/o reducir los efectos secundarios adversos, tales como inflamación. Normalmente, esto se efectúa aumentando los niveles de 25 glucosilación. El sitio (o sitios), de glucosilación proporcionan un sitio de unión para un resto de carbohidrato en el polipéptido, de modo que cuando el polipéptido se produzca en una célula eucariota capaz de realizar la glucosilación, este esté glucosilado.

Hay cuatro sitios de glucosilación de origen natural en FVII; dos sitios de N-glucosilación en N145 y N322, y dos 30 sitios de O-glucosilación en S52 y S60, correspondientes a las posiciones de aminoácidos en el polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3. En una realización, pueden realizarse modificaciones adicionales a un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento de modo que se altere la glucosilación en los sitios anteriores. Esto puede dar como resultado un polipéptido de FVII modificado con actividad coagulante aumentada (véase, por ejemplo, el documento WO2005123916). Los ejemplos no limitantes de modificaciones 35 ejemplares descritas en la técnica que pueden dar como resultado glucosilación reducida y actividad aumentada del polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado incluyen, pero sin limitación: N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W y N322C. 40

En otra realización, pueden realizarse modificaciones adicionales a la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento de modo que se introduzcan sitios de glucosilación adicionales, aumentando de este modo el nivel de glucosilación del polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. El sitio de glucosilación puede ser un sitio de glucosilación ligada a N o 45 ligada a O. Los ejemplos de modificaciones que pueden realizarse a un polipéptido de FVII que introducen uno o más nuevos sitios de glucosilación, incluyen, pero sin limitación, los que se describen en los documentos US6806063 y WO200393465. Los ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares descritas en la técnica que pueden dar como resultado glucosilación aumentada del polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado incluyen, pero sin limitación; F4S, F4T, P10N, Q21N, W41N, S43N, A51N, G58N, 50 L65N, G59S, G59T, E82S, E82T, N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, K109N, G117N, G124N, S126N, T128N, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, V253N, E265N, T267N, E270N, R277N, L280N, G291N, P303S, P303ST, L305N, Q312N, G318N, G331N, D334N, K337N, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, V376N, R379N, M391N, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, 130N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, 55 T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/142T, I42N/ Y44S, I42N/ Y44T, Y44N/ D46S, Y44N/ D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/ N145S, K143N/ N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S/, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289, 60 A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/K316S, S314N/K316T, Q313N/R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T,K341N/ D343S, K341N/ D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/ R392S, L390N/ R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, 65 P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T,

L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S y P404N/P406T.

e. Modificaciones para facilitar el enlace de grupos químicos

También pueden realizarse modificaciones adicionales de un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presenta documento para facilitar el enlace posterior de un grupo químico. Pueden realizarse una o más sustituciones o inserciones de aminoácidos de modo que pueda unirse un grupo químico con un polipéptido de FVII modificado mediante el aminoácido sustituido. Por ejemplo, puede introducirse una cisteína en un polipéptido de FVII modificado, al que puede unirse un resto de polietilenglicol (PEG) para conferir estabilidad y semivida aumentadas 10 en suero. Otros restos de unión incluyen restos de lisina, ácido aspártico y ácido glutámico. En algunas realizaciones, se reemplazan restos de aminoácidos para reducir el número de posiciones de posibles enlaces. Por ejemplo, puede reducirse el número de lisinas. Los ejemplos de modificaciones que pueden realizarse a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de FVII que puede facilitar el enlace posterior con un grupo químico incluyen, pero sin limitación, las que se describen en los documentos US20030096338, US20060019336, 15 US6806063, WO200158935 y WO2002077218. Los ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares de un polipéptido de FVII que pueden facilitar el enlace posterior con un grupo químico incluyen, pero sin limitación; Q250C, R396C, P406C, I42K, Y44K, L288K, D289K, R290K, G291K, A292K, T293K, Q313K, S314K, R315K, V317K, L390K, M391K, R392K, S393K, E394K, P395K, R396K, P397K, G398K, V399K, L400K, L401K, R402K, A403K, P404K, F405K, I30C, K32C, D33C, A34C, T37C, K38C, W41C, Y44C, S45C, D46C, L141C, E142C, K143C, 20 R144C, L288C, D289C, R290C, G291C, A292C, S314C, R315C, K316C, V317C, L390C, M391C, R392C, S393C, E394C, P395C, R396C, P397C, G398C, V399C, L401C, R402C, A403C, P404C, I30D, K32D, A34D, T37D, K38D, W41D, Y44D, S45D, D46C, L141D, E142D, K143D, R144D, L288D, R290D, G291D, A292D, Q313D, S314D, R315D, K316D, V317D, L390D, M391D, R392D, S393D, P395D, R396D, P397D, G398D, V399D, L401D, R402D, A403D, P404D, I30E, K32E, A34E, T37E, K38E, W41E, Y44E, S45E, D46C, L141E, E142E, K143E, R144E, L288E, 25 R290E, G291E, A292E, Q313E, S314E, R315E, K316E, V317E, L390E, M391E, R392E, S393E, P395E, R396E, P397E, G398E, V399E, L401E, R402E, A403E, P404E, K18R, K32R, K38R, K62R, K85R, K109R, K137R, K143R, K148R, K157R, K161R, K197R, K199R, K316R, K337R, K341R, K389R, K18Q, K32Q, K38Q, K62Q, K85Q, K109Q, K137Q, K143Q, K148Q, K157Q, K161Q, K197Q, K199Q, K316Q, K337Q, K341Q, K389Q, K18N, K32N, K38N, K62N, K85N, K109N, K137N, K143N, K148N, K157N, K161N, K197N, K199N, K316N, K337N, K341N, K389N, 30 K18H, K32H, K38H, K62H, K85H, K109H, K137H, K143H, K148H, K157H, K161H, K197H, K199H, K316H, K337H, K341H y K389H.

f. Modificaciones de combinación ejemplares

En el presente documento se proporcionan polipéptidos de FVII modificados que tienen dos o más modificaciones diseñadas para afectar a una o más propiedades o actividades de un polipéptido de FVII no modificado. En algunos ejemplos, las dos o más modificaciones alteran dos o más propiedades o actividades del polipéptido de FVII. Las modificaciones pueden realizarse a los polipéptidos de FVII de modo que se alteran una o más de resistencia a IRFT, resistencia a AT-III, actividad intrínseca, actividad amidolítica, actividad catalítica (en presencia o ausencia de 40 FT), unión a fosfolípidos y/o afinidad, glucosilación, resistencia a proteasas, semivida e interacción con y/o activación de otros factores o moléculas, tales como FX y FIX. Típicamente, las dos o más modificaciones se combinan de modo que el polipéptido de FVII modificado resultante tenga actividad coagulante aumentada, duración de la actividad coagulante aumentada y/o un índice terapéutico potenciado en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. El polipéptido de FVIIa modificado puede mostrar una aparición de actividad coagulante más rápida in 45 vitro, ex vivo o in vivo. Las modificaciones pueden incluir sustitución, inserción o deleción de aminoácidos. La actividad coagulante aumentada, duración de la actividad coagulante aumentada, aparición de la actividad coagulante aumentada, y/o un índice terapéutico potenciado del polipéptido de FVII modificado que contiene dos o más modificaciones puede aumentarse en al menos o aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 50 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación de la actividad de FVIIa de partida o no modificado.

En el presente documento se proporcionan polipéptidos de FVII modificados que contienen dos o más modificaciones que se introducen en un polipéptido de FVII no modificado para alterar dos o más actividades o 55 propiedades. Los polipéptidos de FVII modificados pueden contener 2, 3, 4, 5, 6 o más modificaciones. Además, cada modificación puede implicar uno o más restos de aminoácidos. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede contener dos modificaciones cada una de las cuales es una sustitución de un solo aminoácido. En otro ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede contener dos modificaciones, una de las cuales es una sustitución de un solo aminoácido y la otra de las cuales implica la deleción de más de un resto de aminoácido y después la 60 inserción de más de un resto de aminoácido. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento puede contener la sustitución de aminoácidos M298Q (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3) para aumentar la actividad intrínseca y una modificación de intercambio de Gla FIX, que implica la reelección del dominio de Gla de FVII endógeno suprimiendo los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3) e inserción de 45 65 restos de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos Y1 a Y45 del dominio Gla de FIX expuesto en

SEC ID Nº: 110.

Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden tener dos o más modificaciones seleccionadas solamente a partir de las expuestas en las Tablas 5 a 8. En otros ejemplos, el polipéptido de FVII modificado contiene dos o más modificaciones donde una o más modificaciones se seleccionan 5 de las expuestas en las Tablas 5 a 8 y una o más modificaciones son modificaciones adicionales que no se exponen en las Tablas 5 a 8, tales como, por ejemplo, modificaciones descritas en la técnica. En algunos ejemplos, la modificación o modificaciones adicionales pueden seleccionarse de las expuestas en la Sección D.3.a-e, anterior. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede contener una modificación en uno o más de los restos de aminoácidos D196, K197, K199, G237, T239, R290 o K341 basándose en la numeración de un FVII maduro 10 expuesto en SEC ID Nº: 3 (correspondiente a D60, K60a, K60c, G97, T99, R147 y K192, respectivamente, basándose en la numeración de quimiotripsina), que puede aumentar la resistencia a IRFT, y una modificación en uno o más restos de aminoácidos que afectan actividad intrínseca, tales como, por ejemplo, V158 y M298 (V21 y M156, respectivamente, basándose en la numeración de quimiotripsina). Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede contener dos sustituciones de aminoácidos que aumentan la resistencia a IRFT, tales como 15 K197E y G237V, y una sustitución de aminoácido que aumenta la actividad intrínseca, tal como MW98Q, dando como resultado un polipéptido de FVII con actividad coagulante aumentada.

En la Tabla 9 se proporcionan modificaciones de combinaciones ejemplares no limitantes. Estas modificaciones de combinaciones ejemplares incluyen dos o más modificaciones que se diseñan para alterar dos o más actividades o 20 propiedades de un polipéptido de FVII, incluyendo, pero sin limitación, resistencia a IRFT, resistencia a AT-III, actividad intrínseca, actividad amidolítica, actividad catalítica (en presencia y/o ausencia de FT), unión con y/o afinidad por fosfolípidos, glucosilación, resistencia a proteasas, semivida e interacción con y/o activación de otros factores o moléculas, tales como FX y FIX. Los polipéptidos de FVII modificados que contienen dichas modificaciones de combinación pueden tener actividad coagulante aumentada, duración de la actividad coagulante 25 aumentada, aparición de actividad coagulante aumentada y/o un índice terapéutico potenciado. Las modificaciones expuestas más adelante en la Tabla 8 usan la misma nomenclatura y sistemas de numeración que se han descrito en las Tablas 5 a 7, anteriores. Por ejemplo, la modificación de “Intercambio de Gla FIX” implica la deleción del dominio Gla de FVII endógeno suprimiendo los restos de aminoácidos A1 a Y44 (restos correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3) e inserción de 45 restos de aminoácidos que corresponden a 30 los restos de aminoácidos Y1 a Y45 del dominio Gla de FIX expuesto en SEC ID Nº: 110, como se ha descrito anteriormente. Las posiciones de aminoácidos corresponden a posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro como se expone en SEC I D Nº: 3 y también se denominan por el esquema de numeración de quimiotripsina. En la Tabla 8 siguiente, se identifica el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado, y también cualquiera de los números de 35 indicación de los polipéptidos.

Tabla 8

Modificación – numeración de FVII maduro: Modificación – numeración de quimiotripsina Polipéptido ID Nº SEC ID Nº

V158D/G237V/E296V/M298Q: V21D/G97V/E154V/M156Q CB669

K197E/G237V/M298Q: K60aE/G97V/M156Q CB690

K197E/G237V/M298Q/K341Q: K60aE/G97V/M156Q/K192Q CB692

K197E/K199E/G237V/M298Q/ K341Q: K60aE/K60cE/G97V/M156Q/ K192Q CB693

G237V/M298Q: G97V/M156Q CB695

G237V/M298Q/K341Q: G97V/M156Q/K192Q CB696

M298Q/intercambio de Gla FIX: M156Q/ intercambio de Gla FIX CB850

K197E/M298Q: K60aE/M156Q CB902

M298Q/K341D: CB945

E. Diseño y métodos para modificar FVII 40

En el presente documento se proporcionan polipéptidos de FVII modificados. Los polipéptidos de FVII se modifican de tal manera que muestran alteraciones en una o más actividades o propiedades en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Las actividades y propiedades que pueden alterarse como resultado de la modificación incluyen, pero sin limitación, coagulación o actividad coagulante; actividad procoagulante; actividad 45 proteolítica o catalítica, tal como actividad que efectúa activación del factor X (FX) o activación del Factor IX (FXI); antigenicidad, tal como la evaluada por la capacidad para unirse con o competir con un polipéptido por la unión con un anticuerpo anti-FVII; capacidad para unirse con el factor tisular, factor X o factor IX; capacidad para unirse con fosfolípidos; semivida; estructura tridimensional; pI; y/o conformación. Entre los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento están los que tienen actividad coagulante aumentada. Entre éstos están 50 aquellos cuyo aumento de actividad coagulante resulta de o implica la resistencia aumentada del FVII modificado a IRFT, resistencia aumentada a AT-III, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida aumentada, actividad catalítica aumentada, y/o unión aumentada a plaquetas activadas. En el presente documento se

proporcionan métodos ejemplares para identificar dichos polipéptidos de FVII modificados y los polipéptidos modificados. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado que muestra resistencia aumentada a IRFT, resistencia aumentada a AT-III y/o unión aumentada a plaquetas activadas, pueden generarse de forma racional o empírica: (a) dirigiéndose racionalmente a sitios que se contempla que están implicados en dichas propiedades o, (b) ensayando empíricamente la resistencia de los polipéptidos de FVII modificados en ensayos funcionales a IRFT, resistencia a 5 AT-III, propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida aumentada y/o unión aumentada a fosfolípidos o plaquetas activadas. En muchos casos, para generar polipéptidos de FVII modificados puede usarse una combinación de estrategias de diseños racionales y empíricos.

Una vez que se ha identificado un dominio, una región o un aminoácido para la modificación usando una estrategia 10 racional o empírica, puede emplearse cualquier método conocido en la técnica para efectuar la mutación de uno cualquiera o más aminoácidos en una proteína diana. Los métodos incluyen mutagénesis dirigida convencional (usando, por ejemplo, un kit, tal como, QuickChange, disponible de Strategene) de moléculas de ácido nucleico codificantes, o por métodos de síntesis de polipéptidos en fase sólida. Además, pueden generarse proteínas quiméricas modificadas proporcionadas en el presente documento (es decir intercambio de dominio Gla) por 15 técnicas de ADN recombinante rutinarias. Por ejemplo, pueden generarse polipéptidos quiméricos usando enzimas de restricción y metodologías de clonación para subclonación rutinaria de los componentes polipeptídicos quiméricos deseados. Una vez identificados y generados, la actividad de los polipéptidos de FVII modificados puede después evaluarse, tal como la actividad catalítica o actividad coagulante, usando uno cualquiera o más de los diversos ensayos conocidos en la técnica o descritos posteriormente en el presente documento. 20

1. Racional

En algunos ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento se diseñan por modificación racional para aumentar la actividad coagulante. En dicho método, los dominios, regiones o aminoácidos 25 responsables de la actividad de un polipéptido de FVII se conocen o pueden determinarse racionalmente. Por ejemplo, diversas bases de datos en el dominio público proporcionan información de secuencias y dominios en relación con el FVII de tipo silvestre (véase, por ejemplo, el servidor de ExPASy Proteomics ca.expasy.org). Puede accederse a otras informaciones del dominio público para determinar los aminoácidos, las regiones y/o los dominios en un polipéptido de FVII que están implicados en una interacción o actividad específica. Dichas fuentes incluyen, 30 por ejemplo, revistas científicas, bases de datos de secuencias y funciones, o bases de datos de patentes. En algunos casos, pueden usarse pruebas directas para determinar la influencia de uno o más aminoácidos en una interacción o actividad dada. En otros ejemplos, éstos se extrapolan directamente a partir, por ejemplo, de pruebas o información con respecto a proteínas relacionadas que presentan actividades y/o interacciones similares. En dichos ejemplos, los aminoácidos que son responsables de la actividad o interacción en la proteína relacionada pueden 35 usarse para determinar cuáles son los aminoácidos correspondientes en el polipéptido de FVII por alineamiento del polipéptido relacionado con el polipéptido de FVII, basándose en la secuencia y/o similitudes estructurales. Por lo tanto, en el polipéptido FVII pueden determinarse los aminoácidos que probablemente están implicados en la actividad o interacción dada. Además, puede usarse la modelación de homología para predecir los restos que desempeñan papeles importantes en la formación y/o estabilización de interacciones proteína/proteína, y esta 40 información puede usarse para diseñar variantes con propiedades mejoradas.

Una vez que se han determinado los dominios, las regiones y/o los aminoácidos responsables de la actividad de un polipéptido de FVII, éstos pueden modificarse de modo que se predice que las modificaciones dan como resultado actividad coagulante aumentada del polipéptido. Esto puede efectuarse de varias maneras dependiendo de la 45 actividad o interacción a la que se dirija. En algunos ejemplos, puede realizarse una o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos que aumentan la afinidad del FVII modificado por otras proteínas o moléculas.

En un ejemplo, pueden realizarse modificaciones a cualquier dominio, región o aminoácido o aminoácidos de tal manera que la afinidad o interacción del FVII modificado por otras proteínas se altera, es decir, aumenta o se reduce 50 dependiendo de la interacción diana a modificar. Para efectuar dicha modificación, los dominios, las regiones y/o los aminoácidos implicados, o que se contempla que están implicados en dicha interacción, se conocen o pueden determinarse racionalmente. Por ejemplo, un FVII modificado puede diseñarse racionalmente para que tenga una interacción reducida con una proteína inhibidora, tal como IRFT o AT-III, de tal manera que aumente la actividad coagulante del polipéptido de FVII modificado. Un método para diseñar racionalmente un polipéptido de FVII para 55 que tenga una interacción reducida con IRFT se expone en el Ejemplo 1. Pueden realizarse estrategias similares para aumentar o reducir la interacción de FVII con cualquier otro polipéptido con el que se sabe que interacciona o se une FVII.

Por ejemplo, el FVII se modificó para presentar resistencia aumentada a IRFT. El IRFT, en un complejo con FXa, se 60 une con el complejo de TF/FVIIa para formar un complejo cuaternario en el que se inhibe la actividad catalítica de FVIIa. El primer dominio de Kunitz de IRFT-1 (IRFT-1K1) es el dominio que es responsable de la interacción con, e inhibición de, FVIIa. La identificación de los restos de aminoácidos de FVII que están implicados en esa interacción puede facilitar el diseño de polipéptidos de FVII que son resistentes a IRFT. Pueden usarse diversas estrategias para determinar cuáles de los restos de aminoácidos en FVII están implicados en esta interacción, incluyendo, pero 65 sin limitación, mutagénesis, estrategias de exploración, y diseño racional tal como modelación informática. La

estructura cristalina de FVII en complejo con IRFT puede usarse como una base para determinar los restos de contacto. Como alternativa, y como se describe en el Ejemplo 1, cuando no está disponible una estructura cristalina, puede generarse un modelo informático mediante una serie de alineamientos y extrapolaciones a partir de estructuras y secuencias conocidas de proteínas relacionadas y sus interacciones entre sí.

Los resultados del modelo informático pueden usarse para identificar restos que están implicados directamente en el contacto con una proteína diana deseada, tal como, por ejemplo, el IRFT, y/o los restos que están implicados directamente en la interacción, por ejemplo, debido a su proximidad estrecha con restos de contacto. Por ejemplo, usando los resultados de modelos informáticos como se expone en el Ejemplo 1, se realizó un alineamiento de los primeros dominios de Kunitz de IRFT-1 e IRFT-2 para determinar cuáles eran los restos de “contacto” 10 correspondientes en IRFT-1 (Figura 5b). Pueden identificarse aminoácidos de reemplazo para alterar la interacción de polipéptido de FVII con la proteína diana. Los aminoácidos de reemplazo pueden ser hasta los otros 19 aminoácidos de origen natural, así como aminoácidos “no naturales”. Como alternativa, dichos aminoácidos de reemplazo pueden identificarse por mutagénesis por ordenador basándose en suposiciones racionales de la interacción. El Ejemplo 1 expone un estrategia por ordenador para la identificación de aminoácidos de reemplazo por 15 el que el análisis del modelo informático reveló restos implicados en la complementariedad electrostática entre el factor VII e IRFT-1 K1. Por ejemplo, el D60 con carga negativa de FVII (por numeración de quimiotripsina) parece estar implicado en una interacción electrostática con el R20 con carga positiva de IRFT-1. Este resto es por lo tanto un candidato para mutagénesis de modo que se anula la complementariedad electrostática con R20 de IRFT, generando de este modo un polipéptido de FVII modificado que tiene resistencia aumentada a IRFT. Esto puede 20 efectuarse por sustituciones de inversión de carga o de neutralización de carga. Por ejemplo, puede realizarse una sustitución de aminoácido para reemplazar el ácido aspártico con carga negativa con una lisina con carga positiva. Dicha sustitución de inversión de carga establece una interacción de carga-carga repulsiva en este sitio, e interfiere con la unión e interacción de IRFT con FVIIa. En otro ejemplo, el D60 con carga negativa de FVII puede reemplazarse con una arginina básica para negar la complementariedad electrostática positiva con R20 de IRFT e 25 introducir una interacción desfavorable. Dichas modificaciones con diseño racional pueden realizarse en uno o más de los restos de FVII que se determina que están implicados en el contacto directo o indirecto y la interacción con restos de IRFT.

En otro ejemplo, pueden realizarse modificaciones racionales de un polipéptido de FVII basándose en funciones 30 conocidas de dominios o regiones del polipéptido. Por ejemplo, se sabe que el dominio Gla de FVII es responsable de la unión de FVIIa con fosfolípidos, tales como los presentados en plaquetas activadas, aunque muy débilmente. Otras proteínas dependientes de vitamina K, tales como, por ejemplo, FIX, FX, protrombina, proteína C y proteína S, también poseen dominios Gla que efectúan la unión de la proteína con fosfolípidos con carga negativa, en muchos casos con una afinidad mucho mayor que el dominio Gla de FVII. Se contempla que la introducción de un dominio 35 Gla heterólogo en un polipéptido de FVII aumenta la afinidad de FVII por fosfolípidos. Por ejemplo, FX (y FXa) presentan una afinidad relativamente alta por fosfolípidos, en comparación con la del FVII (y FVIIa). Por lo tanto, en un ejemplo, el dominio Gla de FX, o una parte suficiente del dominio Gla de FX para efectuar la unión a fosfolípidos, puede introducirse en un polipéptido de FVII para generar un polipéptido de FVII modificado quimérico.

Si es necesario, para diseñar un polipéptido de FVII puede usarse una combinación de métodos racionales y empíricos. Por ejemplo, la unión de polipéptidos que contienen un dominio Gla pueden ensayarse y explorarse para identificar qué polipéptidos muestran la mayor unión y/o afinidad con fosfolípidos, tal como por ejemplo, en superficies de plaquetas. Como alternativa o adicionalmente, puede ensayarse una serie de polipéptidos de FVII que contiene la introducción de diversos dominios Gla heterólogos, o suficientes partes de los mismos, para determinar 45 qué polipéptido quimérico muestra la mayor afinidad y/o unión de fosfolípidos.

2. Empírica (es decir exploración)

También pueden generase de forma empírica polipéptidos de FVII modificados y después ensayarse o explorarse 50 para identificar los que tienen la actividad o propiedad particular contemplada. Por ejemplo, pueden generarse polipéptidos de FVII modificados mutando uno cualquiera o más restos de aminoácidos de un polipéptido de FVII usando cualquier método habitualmente conocido en la técnica (véase también la Solicitud de Estados Unidos publicada Nº 2004/0146938). Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden ensayarse en ensayos funcionales de coagulación para determinar si son “Aciertos” para aumento de la actividad coagulante. Los Aciertos pueden 55 ensayarse adicionalmente para determinar si presentan resistencia aumentada a inhibidores tales como IRFT o AT-III y/o presentan unión aumentada con fosfolípidos o propiedades farmacocinéticas mejoradas, tales como semivida aumentada, usando cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento o conocidos por los expertos en la materia.

Los ejemplos de métodos para mutar FVII incluyen métodos que dan como resultado mutagénesis aleatoria por toda la secuencia completa o métodos que dan como resultado mutagénesis centrada de una región o dominio seleccionado de la secuencia de FVII. En un ejemplo, el número de mutaciones realizado al polipéptido es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40 o más.

a. Mutagénesis aleatoria

Puede emplearse cualquiera de una diversidad de estrategias generales para la evolución de proteínas dirigida basada en mutagénesis. Cualquiera de éstos, en solitario o en combinación, puede usarse para modificar un polipéptido tal como FVII para conseguir una propiedad deseada. Dichos métodos incluyen mutagénesis aleatoria, 5 donde los aminoácidos en la secuencia de proteína de partida se reemplazan por todos (o un grupo) de los 20 aminoácidos naturales (así como aminoácidos no naturales) en reemplazos bien individuales o bien múltiples en diferentes posiciones de aminoácidos en la misma molécula, al mismo tiempo. Otro método, mutagénesis aleatoria restringida, introduce todos o algunos de los 20 aminoácidos naturales (así como aminoácidos no naturales) o restos con preferencia de ADN. La preferencia se basa en la secuencia del ADN y no en la de la proteína de una manera 10 estocástica o semiestocástica, respectivamente, dentro de regiones restringidas o predefinidas de la proteína que se sabe previamente que está implicada en la actividad biológica que se “evoluciona”. En el documento US 2004146938 se describen métodos ejemplares para modificar una proteasa. Adicionalmente, puede usarse cualquier método conocido en la técnica para modificar o alterar una secuencia polipeptídica de proteasa, tal como un polipéptido de proteasa FVII. 15

Los métodos de mutagénesis aleatoria incluyen, por ejemplo, uso de E. coli XL1red, irradiación de UV, modificación química tal como por desaminación, alquilación, o mutágenos análogos de bases, o métodos de PCR tales como barajado de ADN, mutagénesis de casete, mutagénesis aleatoria dirigida, o PCR propensa a error (véase, por ejemplo, la Solicitud de Estados Unidos Nº: 2006-0115874). Dichos ejemplos incluyen, pero sin limitación, 20 modificación química por hidroxilamina ((Ruan, H., et al. (1997) Gene 188: 35-39), el uso de análogos de dNTP (Zaccolo, M., et al. (1996) J. Mol. Biol. 255: 589-603), o el uso de kits de mutagénesis aleatoria disponibles en el comercio, tales como, por ejemplo, los kits de mutagénesis aleatoria basados en PCR GeneMorph (Strategene) o los kits de mutagénesis aleatoria de Diversify (Clontech). El kit de mutagénesis aleatoria de Diversify permite la selección de una tasa de mutación deseada para una secuencia de ADN dada (de 2 a 8 mutaciones/1000 pares de 25 bases) variando las cantidades de manganeso (Mn2+) o dGTP en la mezcla de reacción. La elevación de los niveles de manganeso aumenta inicialmente la tasa de mutación, con un aumento de la tasa de mutación adicional proporcionado por concentración aumentada de dGTP. Pueden conseguirse tasas de mutación aún mayores realizando ciclos adicionales de PCR.

b. Mutagénesis centrada

La mutación centrada puede conseguirse realizando una o más mutaciones en una región predeterminada de una secuencia génica, por ejemplo, en regiones del dominio de proteasa que median en la actividad catalítica, regiones del dominio Gla que se unen a fosfolípidos, regiones del polipéptido de FVII que se unen a inhibidores o moléculas 35 tales como IRFT, AT-III o Zn2+, tales como las proporcionadas en el presente documento, o regiones de la proteína que interaccionan con factores o receptores implicados en la eliminación de FVIIa, tales como los proporcionados en el presente documento. En un ejemplo, se mutan uno o más aminoácidos de un polipéptido usando cualquier kit de mutagénesis dirigida individual o múltiple convencional tales como por ejemplo QuikChange (Stratagene). En otro ejemplo, se mutan uno cualquiera o más aminoácidos de una proteasa por mutagénesis de saturación (Zheng et al. 40 (2004) Nucl. Acids. Res., 32: 115). En un ejemplo, se usa una técnica de mutagénesis de saturación en la que el resto o los restos de una región o dominio se mutan a cada uno de los 20 posibles aminoácidos naturales (así como aminoácidos no naturales) (véase por ejemplo el método de Kunkle, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Media Pa.). En dicha técnica, puede sintetizarse un cebador oligonucleotídico mutagénico degradado que contiene una selección aleatoria de nucleótidos en el codón o los codones deseados que codifican el 45 aminoácido o los aminoácidos seleccionados. Los esquemas de selección aleatoria ejemplares incluyen selección aleatoria de NNS o NNK, donde N representa cualquier nucleótido, S representa guanina o citosina y K representa guanina o timina. El cebador mutagénico degradado se hibrida con el molde de ADN monocatenario y se añade ADN polimerasa para sintetizar la cadena complementaria del molde. Después del ligamiento, el molde de ADN bicatenario se transforma en E. coli para amplificación. 50

En un ejemplo adicional, la mutagénesis centrada puede restringirse a aminoácidos que se identifican como puntos calientes en los ciclos de exploración iniciales. Por ejemplo, después de la selección de polipéptidos de FVII modificados de bibliotecas combinatorias mutadas aleatoriamente, puede observarse un número desproporcionado de mutaciones en posiciones o regiones específicas. Estos se designan “puntos calientes”, y pueden observarse 55 durante más de un ciclo de mutagénesis y exploración. Después pueden realizarse ensayos funcionales en los polipéptidos de FVII modificados para determinar si las mutaciones en los puntos calientes se correlacionan con la o las propiedades o actividades deseadas. Si se verifica correlación entre los puntos calientes y la actividad o propiedad deseada, puede después usarse la mutagénesis centrada para dirigirse específicamente a estos puntos calientes para mutagénesis adicional. Esta estrategia permite una mutagénesis más diversa y profunda en 60 posiciones específicas particulares, a diferencia de la mutagénesis más superficial que se produce después de mutagénesis aleatoria de una secuencia polipeptídica. Por ejemplo, puede usarse la mutagénesis de saturación para mutar “puntos calientes” tal como usando oligonucleótidos que contienen NNt/g o NNt/c en estas posiciones.

c. Exploración

Los polipéptidos modificados pueden ensayarse en ensayos de exploración individualmente, o pueden ensayarse como colecciones tales como en bibliotecas. En un ejemplo, los polipéptidos variantes de FVII se generan aleatoriamente por mutagénesis, y se clonan individualmente. Después se realiza una evaluación de la actividad 5 individualmente en cada molécula mutante proteica individual, después de la expresión de la proteína y medición de la actividad apropiada. En algunos ejemplos, los clones individuales pueden ensayarse en una matriz direccionable, de modo que estén separados físicamente entre sí para que la identidad de cada polipéptido individual se conozca basándose en su localización en la matriz. Por ejemplo, si cada uno es el producto individual de una reacción de mutagénesis independiente, la mutación específica puede determinarse fácilmente sin necesidad de secuenciación. 10 Como alternativa, puede realizarse secuenciación en los polipéptidos modificados resultantes para determinar las mutaciones que confieren una actividad.

En otro ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados pueden explorarse como colecciones o en una biblioteca. Por ejemplo, puede presentarse una biblioteca de polipéptidos de FVII en un paquete genético para exploración, 15 incluyendo, pero sin limitación cualquier vector replicable, tal como un fago, virus o bacteria, que pueda presentar un resto polipeptídico. La pluralidad de polipéptidos presentados se presenta por un paquete genético de tal manera que permita que el polipéptido se una y/o interaccione con un polipéptido diana. Los paquetes genéticos ejemplares incluyen, pero sin limitación, bacteriófagos (véase, por ejemplo, Clackson et al. (1991) Making Antibody Fragments Using Phage Display Libraries, Nature, 352: 624-628; Glaser et al. (1992) Antibody Engineering by Condon-Based 20 Mutagenesis in a Filamentous Phage Vector System, J. Immunol., 149: 3903 3913; Hoogenboom et al. (1991) Multi-Subunit Proteins on the Surface of Filamentous Phage: Methodologies for Displaying Antibody (Fate) Heavy and 30 Light Chains, Nucleic Acids Res., 19: 4133-41370), baculovirus (véase, por ejemplo, Boublik et al. (1995) Eukaryotic Virus Display: Engineering the Major Surface Glycoproteins of the Autographa California Nuclear Polyhedrosis Virus (ACNPV) for the Presentation of Foreign Proteins on the Virus Surface, Bio/Technology, 13: 1079-1084), bacterias y 25 otros vectores adecuados para presentar una proteína, tal como una proteasa presentada en fagos. Por ejemplo los bacteriófagos de interés incluyen, pero sin limitación, fago T4, fago M 13 y fago HI. Los paquetes genéticos se amplifican opcionalmente tal como en un hospedador bacteriano.

La presentación en fagos se conoce por los expertos en la materia y se describe, por ejemplo, en Ladner et al., 30 Patente de Estados Unidos Nº 5.223.409; Rodi et al. (2002) Curr. Opin. Chem. Biol. 6: 92-96; Smith (1985) Science 228: 1315-1317; documentos WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4: 1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2: 371-8; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 35 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Rebar et al. (1996) Methods Enzymol. 267: 129-49; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982. Se conocen en la técnica ácidos nucleicos adecuados para presentación en fagos, por ejemplo, vectores de fagos (véase, por ejemplo, Andris-Widhopf et al. (2000) J Immunol Methods, 28: 40 159-81, Armstrong et al. (1996) Academic Press, Kay et al., Ed. pp.35-53; Corey et al. (1993) Gene 128(1): 129-34; Cwirla et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87(16): 6378-82; Fowlkes et al. (1992) Biotechniques 13(3): 422-8; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19(15): 4133-7; McCafferty et al. (1990) Nature 348(6301): 552-4; McConnell et al. (1994) Gene 151(1-2): 115-8; Scott y Smith (1990) Science 249(4967): 386-90).

También pueden expresarse bibliotecas de polipéptidos de FVII variantes para exploración en la superficie de células, por ejemplo, células procariotas o eucariotas. Las células ejemplares para expresión en superficie celular incluyen, pero sin limitación, bacterias, levadura, células de insecto, células aviares, células vegetales y células de mamífero (Chen y Georgiou (2002) Biotechnol Bioeng 79: 496-503). En un ejemplo, las células bacterianas para expresión son Escherichia coli. 50

Pueden expresarse polipéptidos variantes como una proteína de fusión con una proteína que se expresa en la superficie de la célula, tal como una proteína de membrana o proteína asociada a superficie celular. Por ejemplo, una proteasa o variante puede expresarse en E. coli como una proteína de fusión con una proteína de membrana externa de E. coli (por ejemplo OmpA), una molécula híbrida obtenida por ingeniería genética de la lipoproteína de 55 E. coli principal (Lpp) y la proteína de membrana externa OmpA o una proteína asociada a superficie celular (por ejemplo subunidades de pilus y flagelares). Generalmente, cuando las proteínas de membrana externa bacteriana se usan para presentar péptidos o proteínas heterólogos, esto se consigue mediante inserción genética en sitios permisivos de las proteínas transportadoras. La expresión de un péptido o una proteína heterólogos dependen de las propiedades estructurales del dominio proteico insertado, ya que el péptido o la proteína está más restringido 60 cuando se inserta en un sitio permisivo en comparación con la fusión en el extremo N o C terminal de una proteína. Pueden realizarse modificaciones a la proteína de fusión para mejorar la expresión de la proteína de fusión, tal como la inserción de secuencias enlazadoras o espaciadoras peptídicas flexibles o modificación de la proteína bacteriana (por ejemplo por mutación, inserción o deleción, en la secuencia de aminoácidos). Se han expresado con éxito enzimas, tales como -lactamasa y la Cex exoglucanasa de Cellulomonas fimi, como proteínas de fusión Lpp-OmpA 65 en la superficie de E. coli (Francisco J. A. y Georgiou G. Ann N Y Acad Sci. 745: 372-382 (1994) y Georgiou G. et al.

Protein Eng. 9: 239-247 (1996)). Otros péptidos de 15-514 aminoácidos se han presentado en el segundo, tercer y cuarto bucles externos en la superficie de OmpA (Samuelson et al. J. Biotechnol. 96: 129-154 (2002)). Por lo tanto, las proteínas de membrana externa pueden transportar y presentar productos génicos heterólogos en la superficie externa de las bacterias.

También es posible usar otros formatos de presentación para explorar bibliotecas de polipéptidos variantes. Otros formatos de presentación ejemplares incluyen fusiones de ácido nucleico-proteína, presentación de ribozimas (véase por ejemplo Hanes y Pluckthun (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 13: 4937-4942), presentación en perlas (Lam, K. S. et al. Nature (1991) 354, 82-84;, K. S. et al. (1991) Nature, 354, 82-84; Houghten, R. A. et al. (1991) Nature, 354, 84-86; Furka, A. et al. (1991) Int. J. Peptide Protein Res. 37, 487-493; Lam, K. S., et al. (1997) Chem. Rev., 97, 411-10 448; Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos 2004-0235054) y matrices proteicas (véase por ejemplo Cahill (2001) J. Immunol. Meth. 250: 81-91, documentos WO 01/40803, WO 99/51773 y US2002-0192673-A1).

En otros casos específicos, puede ser ventajoso en su lugar unir los polipéptidos variantes o bibliotecas de fagos o células que expresan polipéptidos variantes con un soporte sólido. Por ejemplo, en algunos ejemplos, las células 15 que expresan polipéptidos de FVII variantes pueden adsorberse de forma natural en una perla, de modo que una población de perlas contenga una única célula por perla (Freeman et al. Biotechnol. Bioeng. (2004) 86: 196-200). Después de la inmovilización en un soporte de vidrio, pueden cultivarse microcolonias y explorarse con un sustrato cromogénico o fluorogénico. En otro ejemplo, los polipéptidos de FVII variantes o bibliotecas de fagos o células que expresan proteasas variantes pueden disponerse en placas de titulación e inmovilizarse. 20

Para identificar los polipéptidos de FVII modificados que muestran actividad coagulante aumentada, se exploran polipéptidos de FVII modificados individualmente o en una biblioteca y se ensayan en ensayos funcionales para identificar los que presentan resistencia aumentada a inhibidores tales como IRFT y AT-III, unión aumentada a plaquetas activadas de fosfolípidos, semivida aumentada y/o presentan actividad catalítica aumentada. Dichos 25 ensayos se describen en el presente documento o se conocen por los expertos en la materia. Por ejemplo, se ensayan polipéptidos de FVII modificados con respecto a actividad proteolítica. Se incuban polipéptidos de FVII, solos o en presencia de FT, con diversas concentraciones de sustrato cromogénico, tal como el sustrato de peptidilo FVIIa Spectrozyme (CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA.AcOH). La escisión del sustrato se controla por la absorbancia y la velocidad de hidrólisis de sustrato se determina por la regresión lineal usando un software fácilmente disponible. 30 En un ejemplo adicional, la resistencia de los polipéptidos de FVII modificados a IRFT o AT-III se evalúa por incubación del inhibidor con polipéptidos de FVII que, en algunos casos, se han preincubado con FT. La actividad de FVII se mide después usando uno cualquiera o más de los ensayos de actividad o coagulación conocidos en la técnica, y la inhibición por IRFT o AT-III se evalúa comparando la actividad de los polipéptidos de FVII incubados con el inhibidor, con la actividad de los polipéptidos de FVII que no se han incubado con el inhibidor. 35

La mutación específica del polipéptido candidato puede determinarse usando técnicas de ADN recombinantes rutinarias, tales como secuenciación. En una realización, pueden realizarse combinaciones de “Aciertos” para aumentar adicionalmente las propiedades y/o actividades coagulantes del polipéptido de FVII modificado.

3. Selección de variantes de FVII

Las variantes de polipéptidos de FVII diseñadas e identificadas por uno cualquiera o más de los enfoques descritos anteriormente, pueden seleccionarse para identificar los polipéptidos FVII candidatos que muestran las propiedades o actividades deseadas. La selección de polipéptidos de FVII variantes se basa en 1) en primer lugar, ensayar el 45 polipéptido variante con respecto a la actividad o propiedad específica que se modifica (es decir resistencia a IRFT, resistencia a AT-III, unión con Zn2+, actividad catalítica, semivida, unión y/o afinidad con fosfolípidos; y 2) en segundo lugar, ensayar el polipéptido variante con respecto a conservación de una actividad de FVII requerida para hemostasis y coagulación. Entre las actividades de FVII que se requieren para la coagulación se incluyen, por ejemplo, la actividad enzimática, proteolítica o catalítica tal como para efectuar activación del factor X (FX) o 50 activación del factor IX (FIX). Otras actividades de FVII que pueden evaluarse incluyen, pero sin limitación, antigenicidad, la capacidad para unirse con el factor tisular, factor X o factor IX, y la capacidad para unirse con fosfolípidos. Por lo tanto, un polipéptido de FVII modificado, tal como cualquiera proporcionado en el presente documento o identificado en los métodos proporcionados en el presente documento, debe conservar algún nivel, bien aumentado o bien reducido, de una actividad de FVII requerida para la actividad coagulante. Pueden realizarse 55 ensayos convencionales conocidos en la técnica o descritos en el presente documento in vitro o in vivo para realizar cada una de las dos evaluaciones anteriores. Por ejemplo, la actividad proteolítica o catalítica de FVII puede evaluarse usando diversos métodos, incluyendo medición de la escisión de un sustrato sintético, o medición de la activación del factor X (véase, por ejemplo, Ejemplos 4, 5 y 11 posteriores), y la resistencia a IRFT o AT-III puede evaluarse ensayando con respecto a inhibición por IRFT o AT-III, respectivamente (véase, por ejemplo, Ejemplos 7, 60 12 y 16). Además, también pueden emplearse ensayos in vivo para actividad procoagulante, tal como se describe, por ejemplo, en los Ejemplos 8 y 14.

El efecto general de cualquier variante de polipéptido de FVII candidato es mostrar una actividad procoagulante. Por ejemplo, un polipéptido variante puede aumentar su resistencia a IRFT, resistencia a AT-III, semivida y/o unión y/o 65 afinidad con fosfolípidos, mostrando al mismo tiempo un aumento de la actividad catalítica. Dicho polipéptido de FVII

se seleccionaría como una variante de FVII candidata para aumentar la actividad coagulante.

En algunos casos, sin embargo, un polipéptido de FVII modificado para que tenga actividad de coagulación mejorada debido a uno cualquiera o más de resistencia aumentada a IRFT, resistencia aumentada a AT-III, semivida aumentada o unión y/o afinidad con fosfolípidos aumentada, también puede mostrar una reducción en la actividad 5 catalítica u otra actividad requerida para la coagulación como resultado de la modificación particular. Estos efectos podrían ser el resultado de, por ejemplo, cambios conformacionales en los polipéptidos de FVII modificados que interfieren con la unión con otra molécula, cambios conformacionales que dan como resultado un sitio activo alterado, o sustituciones de aminoácidos que implican directamente uno o más restos de aminoácidos que son responsables de la interacción con otra molécula. 10

Por lo tanto, en otro ejemplo, un polipéptido variante que aumenta su resistencia a IRFT, resistencia a AT-III, semivida aumentada y/o afinidad por fosfolípidos puede mostrar una reducción conjunta en su actividad catalítica. El nivel de reducción en una actividad de FVII tal como una actividad catalítica, que sería aceptable para asegurar la actividad coagulante mejorada depende del aumento conjunto de la propiedad que se modifica para mejora (es decir 15 resistencia aumentada a IRFT), y puede determinarse empíricamente. Por lo tanto, los resultados de dichas evaluaciones expuestas anteriormente pueden equilibrarse para identificar los polipéptidos variantes que muestran propiedades mejoradas, mientras que conservan al mismo tiempo al menos una actividad de FVII suficiente, es decir, actividad catalítica, para efectuar coagulación. Típicamente, cuanto mayor sea el aumento en la propiedad contemplada para modificación (es decir cuanto mayor sea el aumento en la resistencia a IRFT), mayor será la 20 reducción aceptable en la actividad proteolítica o catalítica.

Por ejemplo, un polipéptido de FVII que muestra un aumento de 100 veces en su resistencia a IRFT o AT-III puede mostrar una reducción en la actividad proteolítica o catalítica que se reduce en o aproximadamente 1,5 veces, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 veces o más en comparación con la activad de un polipéptido de 25 FVII no modificado, y aún ser un candidato viable para aumentar la actividad coagulante. Por el contrario, si la resistencia a IRFT o AT-III aumenta en 10 veces, el nivel de reducción de la actividad catalítica para mantener una actividad procoagulante general sería típicamente una reducción de o aproximadamente 1,5 veces, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 veces o más en comparación con la actividad catalítica de un polipéptido no modificado. Un experto en la materia puede evaluar cambios conjuntos en la resistencia a IRFT, resistencia a AT-III, unión con plaquetas activadas, 30 semivida y actividad proteolítica o catalítica, o cualquier otra actividad o propiedad, para determinar si el polipéptido de FVII modificado sería útil como un producto terapéutico procoagulante, tal como, por ejemplo, para tratar episodios de hemorragia en pacientes con hemofilia.

F. Producción de polipéptidos de FVII 35

Los polipéptidos de FVII, incluyendo polipéptidos de FVII modificados, o dominios de los mismos de FVII u otro polipéptido de vitamina K, pueden obtenerse por métodos bien conocidos en la técnica para purificación de proteínas y expresión de proteínas recombinantes. Puede usarse cualquier método conocido por los expertos en la materia para la identificación de ácidos nucleicos que codifiquen genes deseados. Puede usarse cualquier método 40 disponible en la técnica para obtener un ADNc de longitud completa (es decir, que abarca la región codificante completa) o clon de ADN genómico que codifica un polipéptido de FVII u otro polipéptido de vitamina K, tal como de una fuente celular tisular, tal como por ejemplo de hígado. Los polipéptidos de FVII modificados pueden modificarse técnicamente como se describe en el presente documento, tal como por mutagénesis dirigida.

FVII puede clonarse o aislarse usando cualquier método disponible conocido en la técnica para clonar y aislar moléculas de ácido nucleico. Dichos métodos incluyen amplificación por PCR de ácidos nucleicos y exploración de bibliotecas, incluyendo exploración de hibridación de ácidos nucleicos, exploración basada en anticuerpos y exploración basada en actividad.

Los métodos para amplificación de ácidos nucleicos pueden usarse para aislar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de FVII, incluyendo por ejemplo, métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Puede usarse un material que contiene ácido nucleico como un material de partida a partir del que puede aislarse una molécula de ácido nucleico que codifica FVII. Por ejemplo, pueden usarse preparaciones de ADN y ARNm, extractos celulares, extractos tisulares (por ejemplo de hígado), muestras de fluidos (por ejemplo sangre, suero, 55 saliva), muestras de sujetos sanos y/o enfermos en métodos de amplificación. Las bibliotecas de ácido nucleico también pueden usarse como una fuente de material de partida. Los cebadores pueden diseñarse para amplificar una molécula que codifica FVII. Por ejemplo, pueden diseñarse cebadores basándose en secuencias expresadas a partir de las que se genera un FVII. Pueden diseñarse cebadores basándose en la retrotraducción de una secuencia de aminoácidos de FVII. Las moléculas de ácido nucleico generadas por amplificación pueden secuenciarse y puede 60 confirmarse que codifican un polipéptido de FVII.

Pueden unirse secuencias de nucleótidos adicionales con una molécula de ácido nucleico que codifica FVII, incluyendo secuencias enlazadoras que contienen sitios de endonucleasa de restricción con el fin de clonar el gen sintético en un vector, por ejemplo, un vector de expresión de proteínas o un vector diseñado para la amplificación 65 de secuencias de ADN que codifican proteínas del núcleo. Además, pueden unirse operativamente secuencias de

nucleótidos adicionales que especifican elementos de ADN funcionales con una molécula de ácido nucleico que codifica FVII. Los ejemplos de dichas secuencias incluyen, pero sin limitación, secuencias promotoras diseñadas para facilitar la expresión de proteínas intracelulares, y secuencias de secreción diseñadas para facilitar la secreción de proteínas. También pueden unirse secuencias de nucleótidos adicionales tales como secuencias que especifican regiones de unión a proteínas con moléculas de ácido nucleico que codifican FVII. Dichas regiones incluyen, pero 5 sin limitación, secuencias para facilitar la captación de FVII en células diana específicas, o potenciar de otro modo la farmacocinética del gen sintético.

Los ácidos nucleicos identificados y aislados pueden insertarse después en un vector de clonación apropiado. Puede usarse un gran número de sistemas de vector-hospedador conocidos en la técnica. Los posibles vectores 10 incluyen, pero sin limitación, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vector debe ser compatible con la célula hospedadora usada. Dichos vectores incluyen, pero sin limitación, bacteriófagos tales como derivados lambda, o plásmidos tales como derivados de plásmido pBR322 o pUC o el vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). La inserción en un vector de clonación puede conseguirse, por ejemplo, ligando el fragmento de ADN en un vector de clonación que tiene extremos cohesivos complementarios. La inserción puede efectuarse usando vectores 15 de clonación TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el ADN no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de ADN pueden modificarse de forma enzimática. Como alternativa, puede producirse cualquier sitio deseado ligando secuencias de nucleótidos (enlazadores) en los extremos de ADN; estos enlazadores ligados pueden contener oligonucleótidos sintetizados químicamente específicos que codifican secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción. En un 20 método alternativo, el vector escindido y el gen de proteína FVII pueden modificarse por adición de colas homopoliméricas. Pueden introducirse moléculas recombinantes en células hospedadoras mediante, por ejemplo, transformación, transfección, infección, electroporación y sonoporación, de modo que se generen muchas copias de la secuencia génica.

En ejemplos específicos, la transformación de células hospedadoras con moléculas de ADN recombinante que incorporan el gen de proteína FVII aislado, ADNc, o secuencia de ADN sintetizada permite la generación de múltiples copias del gen. Por lo tanto, el gen puede obtenerse en grandes cantidades cultivando transformantes, aislando las moléculas de ADN recombinante de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperando el gen insertado del ADN recombinante aislado. 30

1. Vectores y células

Para la expresión recombinante de una o más de las proteínas FVII, el ácido nucleico que contiene toda o una parte de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína FVII pueden insertarse en un vector de expresión apropiado, 35 es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de proteína insertada. Es un ejemplo de dicho vector cualquier vector de expresión de mamíferos, tal como, por ejemplo, pCMV. Las señales de transcripción y traducción necesarias también pueden proporcionarse por el promotor nativo para genes de FVII y/o sus regiones flanqueantes.

También de proporcionan vectores que contienen ácido nucleico que codifica el FVII o FVII modificado. También se proporcionan células que contienen los vectores. Las células incluyen células eucariotas y procariotas, y los vectores son cualquiera adecuado para su uso en las mismas.

Se proporcionan células procariotas y eucariotas, incluyendo células endoteliales, que contienen los vectores. 45 Dichas células incluyen células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, arqueas, células vegetales, células de insectos y células animales. Las células se usan para producir un polipéptido de FVII o polipéptido de FVII modificado del mismo cultivando las células anteriormente descritas en condiciones por las que la proteína de FVII codificada se expresa por las células, y recuperando la proteína de FVII expresada. Para fines del presente documento, el FVII puede secretarse al medio. 50

En una realización, se proporcionan vectores que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de FVII y contiene todo o una parte del polipéptido de FVII, o múltiples copias del mismo. Los vectores pueden seleccionarse para expresión del polipéptido de FVII o polipéptido de FVII modificado del mismo en la célula o de modo que la proteína FVII se exprese como una proteína secretada. Cuando el FVII se 55 expresa, el ácido nucleico se une con ácido nucleico que codifica una señal de secreción, tal como la secuencia señal del factor de apareamiento  de Saccharomyces cerevisiae o una parte de la misma, o la secuencia señal nativa.

Puede usarse una diversidad de sistemas de hospedador-vector para expresar la secuencia codificante de 60 proteínas. Estos incluyen pero sin limitación sistemas de células de mamífero infectadas con virus (por ejemplo virus vaccinia, adenovirus y otros virus); sistemas de células de insecto infectadas con virus (por ejemplo baculovirus); microorganismos tales como levadura que contiene vectores de levadura; o bacterias transformadas con bacteriófago, ADN, ADN plasmídico o ADN cosmídico. Los elementos de expresión de vectores varían en sus fuerzas y especificidades. Dependiendo del sistema de hospedador-vector usado, puede usarse uno cualquiera de 65 varios elementos de transcripción y traducción adecuados.

Cualquier método conocido por los expertos en la materia para la inserción de fragmentos de ADN en un vector puede usarse para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que contiene señales de control de la transcripción/traducción apropiadas y secuencias codificantes de proteínas. Estos métodos pueden incluir técnicas sintéticas y de ADN recombinante in vitro y recombinantes in vivo (recombinación genética). La expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido de FVII o polipéptido de FVII modificado, o dominios, 5 derivados, fragmentos u homólogos del mismo, puede regularse por una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que los genes o fragmentos de la misma se expresen en un hospedador transformado con la molécula o las moléculas de ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de las proteínas puede controlarse por cualquier promotor/potenciador conocido en la técnica. En un ejemplo, el promotor no es nativo de los genes para una proteína FVII. Los promotores que pueden usarse incluyen pero sin limitación el promotor temprano de SV40 10 (Bemoist and Chambon, Nature 290: 304-310 (1981)), el promotor contenido en la repetición terminal larga 3’ del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al. Cell 22: 787-797 (1980)), el promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1441-1445 (1981)), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al., Nature 296: 39-42 (1982)); vectores de expresión procariotas tales como el promotor de -lactamasa (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 5543) o el promotor de tac (DeBoer et al., Proc. 15 Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25 (1983)); véase también “Useful Proteins from Recombinant Bacteria”: en Scientific American 242: 79-94 (1980)); vectores de expresión de plantas que contienen el promotor de nopalina sintetasa (Herrar-Estrella et al., Nature 303: 209-213 (1984)) o el promotor de ARN 35S del virus del mosaico de la coliflor (Garder et al., Nucleic Acids Res. 9: 2871 (1981)) y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bisfosfato carboxilasa (Herrera-Estrella et al., Nature 310: 115-120 (1984)); elementos promotores de levadura y otros hongos 20 tales como el promotor de Gal4, el promotor del alcohol deshidrogenasa, el promotor de la fosfoglicerol quinasa, el promotor de la fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control de la trascripción de animales que muestran especificidad tisular y se han usado en animales transgénicos: región de control del gen de la elastasa I que está activo en células de acinos pancreáticos (Swift et al., Cell 38: 639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7: 425-515 (1987)); región de control del gen de la 25 insulina que está activa en células beta pancreáticas (Hanahan et al., Nature 315: 115-122 (1985)), región de control de genes de inmunoglobulina que está activo en células linfoides (Grosschedl et al., Cell 38: 647-658 (1984); Adams et al., Nature 318: 533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7: 1436-1444 (1987)), región de control del virus del tumor mamario de ratón que está activo en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., Cell 45: 485-495 (1986)), región de control del gen de la albúmina que está activa en el hígado (Pinckert et al., 30 Genes and Devel. 1: 268-276 (1987)), región de control del gen de la alfa-fetoproteína que está activa en el hígado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235: 53-58 1987)), región de control del gen de la antitripsina alfa-1 que está activa en el hígado (Kelsey et al., Genes and Devel. 1: 161-171 (1987)), región de control del gen de la beta globina que está activa en células mieloides (Mogram et al., Nature 315: 338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46: 89-94 (1986)), región de control del gen de la proteína básica de mielina que está 35 activa en oligodendrocitos del cerebro (Readhead et al., Cell 48: 703-712 (1987)), región de control del gen de la cadena ligera de miosina 2 que está activa en el músculo esquelético (Sani, Nature 314: 283-286 (1985)), y región de control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica que está activa en gonadotropos del hipotálamo (Mason et al., Science 234: 1372-1378 (1986)).

En una realización específica, se usa un vector que contiene un promotor unido operativamente con ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de FVII o polipéptido de FVII modificado, o un dominio, fragmento, derivado u homólogo del mismo, uno o más orígenes de replicación, y opcionalmente, uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). Los vectores y sistemas para la expresión de polipéptidos de FVII incluyen los vectores de Pichia bien conocidos (disponibles, por ejemplo, de Invitrogen, San Diego, CA), 45 particularmente los diseñados para secreción de las proteínas codificadas. Los vectores plasmídicos ejemplares par expresión de células de mamífero incluyen, por ejemplo, pCMV. Los vectores plasmídicos ejemplares para transformación de células E. coli, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pQE (disponibles de Qiagen, Valencia, CA; véase también la bibliografía publicada por Qiagen que describe el sistema). Los vectores pQE tienen un promotor T5 de fagos (reconocido por la ARN polimerasa de E. coli) y un módulo de represión de operador lac 50 doble para proporcionar expresión de alto nivel, estrechamente regulada de proteínas recombinantes en E. coli, un sitio de unión a ribosomas sintético (RBS II) para una traducción eficaz, una secuencia codificante de marcador His 6X, terminadores de la transcripción t0 y T1, origen de replicación ColE1, y un gen de beta-lactamasa para conferir resistencia a ampicilina. Los vectores pQE permiten la colocación de un marcador His 6x en el extremo N o en el extremo C terminal de la proteína recombinante. Dichos plásmidos incluyen pQE 32, pQE 30, y pQE 31 que 55 proporcionan múltiples sitios de clonación para las tres fases de lectura y posibilitan la expresión de proteínas marcadas con His 6x en el extremo N terminal. Otros vectores plasmídicos ejemplares para transformación de células de E. coli, incluyen, por ejemplo, los vectores de expresión pET (véase, patente de Estados Unidos 4.952.496; disponibles de NOVAGEN, Madison, WI; véase también la bibliografía publicada por Novagen que describe el sistema). Dichos plásmidos incluyen pET 11a, que contiene el promotor T71ac, el terminador T7, el 60 operador lac de E. coli inducible, y el gen represor de lac; pET 12a-c, que contiene el promotor de T7, terminador T7 y la señal de secreción de ompT de E. coli; y pET 15b y pET19b (NOVAGEN, Madison, WI), que contiene una secuencia líder His-Tag™ para su uso en la purificación con una columna de His y un sitio de escisión de trombina que permite la escisión después de la purificación sobre la columna, la región promotora de lac-T7 y el terminador de T7. 65

2. Sistemas de expresión

Pueden producirse polipéptidos de FVII (modificados y no modificados) por cualquier método conocido en la técnica para producción de proteínas incluyendo método in vitro e in vivo tales como, por ejemplo, la introducción de moléculas de ácido nucleico que codifican FVII en una célula hospedadora, animal hospedador y la expresión a 5 partir de moléculas de ácido nucleico que codifican FVII in vitro. FVII y polipéptidos de FVII modificados pueden expresarse en cualquier organismo adecuado para producir las cantidades y formas requeridas de un polipéptido de FVII necesario para la administración y tratamiento. Los hospedadores de expresión incluyen organismos procariotas y eucariotas tales como E. coli, levadura, plantas, células de insecto, células de mamífero, incluyendo líneas celulares humanas y animales transgénicos. Los hospedadores de expresión pueden diferir en sus niveles de 10 producción de proteínas así como en los tipos de modificaciones postraduccionales que están presentes en las proteínas expresadas. La elección de hospedador de expresión puede realizarse basándose en éstos y otros factores, tales como consideraciones reguladoras y de seguridad, costes de producción y la necesidad y los métodos de purificación.

La expresión en hospedadores eucariotas puede incluir la expresión en levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris, células de insecto tales como células de Drosophila y células de lepidópteros, plantas y células vegetales tales como tabaco, maíz, arroz, algas y lemna. Las células eucariotas para expresión también incluyen células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células de riñón de cría de hámster (BHK). Los hospedadores de expresión eucariotas también incluyen la producción en animales 20 transgénicos, por ejemplo, incluyendo producción en suero, leche y huevos. Se conocen en la técnica animales transgénicos para la producción de polipéptidos de FVII de tipo silvestre (Publicaciones de Patente de Estados Unidos Nº 20020166130 y 20040133930) y pueden adaptarse para la producción de polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento.

Muchos vectores de expresión están disponibles y se conocen por los expertos en la materia para la expresión de FVII. La elección del vector de expresión está influida por la elección del sistema de expresión hospedador. Dicha selección está dentro del nivel de experiencia de los expertos en la técnica. En general, los vectores de expresión pueden incluir promotores de la transcripción y opcionalmente potenciadores, señales de traducción y señales de terminación de la transcripción y de la traducción. Los vectores de expresión que se usan para transformación 30 estable típicamente tienen un marcador de selección que permite la selección y el mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, puede usarse un origen de replicación para amplificar el número de copias de los vectores en las células.

También pueden utilizarse FVII o polipéptidos de FVII modificados o expresarse como fusiones proteicas. Por 35 ejemplo, puede generarse una fusión para añadir funcionalidad adicional a un polipéptido. Los ejemplos de proteínas de fusión incluyen, pero sin limitación, fusiones de una secuencia señal, un marcador tal como para localización, por ejemplo, un marcador his6 o un marcador myc o un marcador para purificación, por ejemplo una fusión de GST y una secuencia para dirigir la secreción de proteínas y/o asociación a membrana.

En una realización, el polipéptido de FVII o polipéptidos de FVII modificados pueden expresarse en forma activa, por lo que se consigue activación por autoactivación del polipéptido después de secreción. En otro ejemplo, la proteasa se expresa en una forma inactiva de zimógeno.

Los métodos de producción de polipéptidos de FVII pueden incluir la coexpresión de uno o más polipéptidos 45 heterólogos adicionales que pueden ayudar en la generación de los polipéptidos de FVII. Por ejemplo, dichos polipéptidos pueden contribuir al procesamiento postraduccional de los polipéptidos de FVII. Los polipéptidos ejemplares incluyen, pero sin limitación, peptidasas que ayudan a escindir secuencias precursoras de FVII, tales como la secuencia de propéptido, y enzimas que participan en la modificación del polipéptido de FVII, tal como por glucosilación, hidroxilación, carboxilación o fosforilación, por ejemplo. Una peptidasa ejemplar que puede 50 coexpresarse con FVII es PACE/furina (o PACE-SOL), que ayuda en la escisión de la secuencia de propéptido de FVII. Una proteína ejemplar que ayuda a la carboxilación del polipéptido de FVII es la enzima sensible a warfarina, vitamina K 2,3-epóxido reductasa (VKOR), que produce vitamina K reducida para su utilización como un cofactor por la -carboxilasa dependiente de vitamina K (Wajih et al., J. Biol. Chem. 280(36)31603-31607). Una subunidad de esta enzima, VKORC1, puede coexpresarse con el polipéptido de FVII modificado para aumentar la -carboxilación. 55 El o los polipéptidos adicionales pueden expresarse a partir del mismo vector de expresión como el polipéptido de FVII o de un vector diferente.

a. Expresión procariota

Los procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de FVII (véase, por ejemplo, Platis et al. (2003) Protein Exp. Purif. 31(2): 222-30; y Khalizzadeh et al. (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31 (2): 63-69). La transformación de E. coli es una técnica sencilla y rápida bien conocida por los expertos en la materia. Los vectores de expresión para E. coli pueden contener promotores inducibles que son útiles para inducir altos niveles de expresión proteica y para expresar proteínas que muestran alguna toxicidad a las 65 células hospedadoras. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor

tac híbrido, los promotores de ARN T7 y SP6 y el promotor PL regulado por temperatura.

FVII puede expresarse en el ambiente citoplasmático de E. coli. El citoplasma es un ambiente reductor y para algunas moléculas esto puede dar como resultado la formación de cuerpos de inclusión insolubles. Pueden usarse agentes reductores tales como ditiotreitol y -mercaptoetanol y desnaturalizantes (por ejemplo, tales como 5 guanidina-HCl y urea) para resolubilizar las proteínas. Un enfoque alternativo es la expresión de FVII en el espacio periplásmico de bacterias que proporciona un ambiente de oxidación y isomerasas chaperoninas y disulfuro que conducen a la producción de proteínas solubles. Típicamente, una secuencia líder se fusiona con la proteína a expresar que dirige la proteína al periplasma. El líder se retira después por peptidasas señal dentro del periplasma. Los ejemplos de secuencias líder que se dirigen a periplasma incluyen el líder peIB del gen de pectato liasa y el líder 10 derivado del gen de fosfatasa alcalina. En algunos casos, la expresión periplásmica permite la fuga de la proteína expresada al medio de cultivo. La secreción de proteínas permite la purificación rápida y sencilla del sobrenadante de cultivo. Pueden obtenerse proteínas que no se secretan al periplasma por lisis osmótica. De forma similar a la expresión citoplasmática, en algunos casos las proteínas se pueden hacer insolubles y pueden usarse desnaturalizantes y agentes reductores para facilitar la solubilización y el replegamiento. La temperatura de 15 inducción y crecimiento también puede influir en los niveles de expresión y la solubilidad. Típicamente, se usan temperaturas entre 25 ºC y 37 ºC. También pueden usarse mutaciones para aumentar la solubilidad de proteínas expresadas. Típicamente, las bacterias producen proteínas aglucosiladas. Por lo tanto, si las proteínas requieren glucosilación para su función, puede añadirse glucosilación in vitro después de purificación de las células hospedadoras. 20

b. Levadura

Levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces

lactis, y Pichia pastoris son hospedadores de expresión útiles para FVII (véase, por ejemplo, Skoko et al. (2003) 25 Biotechnol. Appl. Biochem. 38(Pt3): 257-65). La levadura puede transformarse con vectores de replicación episómicos o por integración cromosómica estable por recombinación homóloga. Típicamente, se usan promotores inducibles para regular la expresión génica. Los ejemplos de dichos promotores incluyen GAL1, GAL7, y GAL5 y promotores de metalotioenina tales como CUP1. Los vectores de expresión incluyen con frecuencia un marcador de selección tal como LEU2, TRP1, HIS3, y URA3 para selección y mantenimiento del ADN transformado. Las 30 proteínas expresadas en levadura son con frecuencia solubles y la coexpresión con chaperoninas, tales como Bip y proteína disulfuro isomerasa, pueden mejorar los niveles de expresión y solubilidad. Adicionalmente, pueden dirigirse proteínas expresadas en levadura para secreción usando fusiones de péptidos de señal de secreción tales como la señal de secreción de factor alfa de tipo apareamiento de levadura de Saccharomyces cerevisiae y fusiones con proteínas de superficie celular de levadura tales como el receptor de adhesión de apareamiento Aga2p o la 35 glucoamilasa de Arxula adeninivorans. Un sitio de escisión de proteasa (por ejemplo, la proteasa Kex-2) puede modificarse técnicamente para retirar las secuencias fusionadas de los polipéptidos a medida que salen de la ruta de secreción. La levadura también es capaz de glucosilar en motivos Asn-X-Ser/Thr.

c. Insectos y células de insecto 40

Los insectos y células de insecto, particularmente usando sistemas de expresión de baculovirus son útiles para la expresión de polipéptidos tales como FVII o formas modificadas del mismo (véase, por ejemplo, Muneta et al. (2003) J. Vet. Med. Sci. 65(2): 219-23). Las células de insecto y larvas de insecto, incluyendo expresión en la hemolinfa, expresan altos niveles de proteínas y son capaces de la mayoría de las modificaciones postraduccionales usadas 45 por eucariotas superiores. Los baculovirus tienen un intervalo de hospedadores restrictivo que mejora la seguridad y reduce las preocupaciones reguladoras de la expresión eucariota. Típicamente, los vectores de expresión usan un promotor tal como el promotor de polihedrina de baculovirus para alto nivel de expresión. Los sistemas de baculovirus usados habitualmente incluyen baculovirus tales como el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV), y el virus de la polihedrosis nuclear de Bombyx mori (BmNPV) y una línea celular de insecto tal 50 como Sf9 derivada de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1). Para alto nivel de expresión, la secuencia de nucleótidos de la molécula que se va a expresar se fusiona inmediatamente cadena bajo del codón de inicio de la polihedrina del virus. Las señales de secreción de mamíferos se procesan con precisión en células de insecto y pueden usarse para secretar la proteína expresada al medio de cultivo. Además, las líneas celulares Pseudaletia unipuncta (A7S) y Danaus plexippus (DpN1) producen proteínas con patrones de 55 glucosilación similares a sistemas celulares de mamíferos.

Un sistema de expresión alternativo en células de insecto es el uso de células transformadas de forma estable. Pueden usarse para expresión líneas celulares tales como las células Schnieder 2 (S2) y Kc (Drosophila melanogaster) y células C7 (Aedes albopictus). El promotor de la metalotionenina de Drosophila puede usarse para 60 inducir altos niveles de expresión en presencia de inducción de metales pesados con cadmio o cobre. Los vectores de expresión se mantienen típicamente mediante el uso de marcadores de selección tales como neomicina e higromicina.

d. Células de mamífero

Pueden usar sistemas de expresión de mamíferos para expresar polipéptido de FVII. Las construcciones de expresión pueden transferirse a células de mamífero por infección viral tal como adenovirus o por transferencia directa de ADN tal como liposomas, fosfato cálcico, DEAE-dextrano y por medios físicos tales como electroporación 5 y microinyección. Los vectores de expresión para células de mamífero incluyen típicamente un sitio de protección terminal de ARNm, una caja TATA, una secuencia de inicio de la traducción (secuencia consenso de Kozak) y elementos de poliadenilación. Dichos vectores incluyen con frecuencia promotores-potenciadores de la transcripción para expresión de alto nivel, por ejemplo, el promotor-potenciador de SV40, el promotor de citomegalovirus humano (CMV), y la repetición terminal larga del virus de sarcoma de Rous (VSR). Estos promotores y potenciadores están 10 activos en muchos tipos celulares. También puede usarse para expresión promotores de tipo celular y tisular y regiones potenciadoras. Las regiones promotoras/potenciadoras ejemplares incluyen, pero sin limitación, las de genes tales como elastasa I, insulina, immunoglobulina, virus del tumor mamario de ratón, albúmina, alfa-fetoproteína, alfa 1-antitripsina, beta-globina, proteína básica de mielina, cadena ligera de miosina-2, y control del gen de la hormona liberadora gonadotrópica. Pueden usarse marcadores seleccionables para seleccionar y 15 mantener células con la construcción de expresión. Los ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen, pero sin limitación, higromicina B fosfotransferasa, adenosina desaminasa, xantina-guanina fosforibosil transferasa, aminoglucósido fosfotransferasa, dihidrofolato reductasa y timidina quinasa. La fusión con moléculas de señalización de superficie celular tales como TCR- y FcRI- puede dirigir la expresión de las proteínas en un sitio activo en la superficie celular. 20

Están disponibles muchas líneas celulares para expresión en mamíferos incluyendo células de ratón, rata, ser humano, mono, pollo y hámster. Las líneas celulares ejemplares incluyen, pero sin limitación, BHK (es decir, células BHK-21), 293-F, CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, NS0 de ratón (no secretoras) y otras líneas celulares de mieloma, hibridoma y líneas celulares de heterohibridoma, linfocitos, fibroblastos, células Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 25 293S, 293T, 2B8, y HKB. También están disponibles líneas celulares adaptadas a medio sin suero que facilita la purificación de proteínas secretadas del medio de cultivo celular. Uno de dichos ejemplos es la línea celular EBNA-1 sin suero (Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84: 332-42). Se conoce en la técnica la expresión de polipéptidos de FVII recombinantes que muestran estructura y modificaciones postraduccionales similares al FVII derivado del plasma (véase, por ejemplo, Jurlander et al. (2003) Semin Throm Hemost). Se conocen métodos para optimizar la 30 expresión de proteína dependiente de vitamina K. Por ejemplo, la complementación de vitamina K en medio de cultivo o coexpresión de -carboxilasas dependientes de vitamina K (Wajih et al., J. Biol. Chem. 280(36)31603-31607) puede ayudar en la modificación postraduccional de proteínas dependientes de vitamina K, tales como polipéptidos de FVII.

e. Plantas

Pueden usarse células vegetales y plantas transgénicas para la expresión de FVII. Típicamente se transfieren construcciones de expresión a plantas usando transferencia directa de ADN tal como bombardeo con microproyectiles y transferencia mediada por PEG a protoplastos, y con transformación mediada por agrobacterium. 40 Los vectores de expresión pueden incluir secuencias promotoras y potenciadoras, elementos de terminación de la transcripción y elementos de control de la traducción. Los vectores de expresión y técnicas de transformación habitualmente se dividen entre hospedadores dicotiledonios, tales como Arabidopsis y tabaco, y hospedadores monocotiledoneos tales como maíz y arroz. Los ejemplos de promotores vegetales usados para la expresión incluyen el promotor del virus del mosaico de la coliflor, el promotor de la nopalina sintasa, el promotor de la ribosa 45 bisfosfato carboxilasa y los promotores de ubiquitina y UBQ3. Con frecuencia se usan marcadores de selección tales como higromicina, fosfomanosa isomerasa y neomicina fosfotransferasa para facilitar la selección y el mantenimiento de células transformadas. Pueden mantenerse células vegetales transformadas en cultivo como células, agregados (tejido calloso) o regenerarse en plantas completas. Debido a que las plantas tienen patrones de glucosilación diferentes a las células de mamífero, esto puede influir en la elección para producir FVII en estos 50 hospedadores. Las células vegetales transgénicas también pueden incluir algas modificadas técnicamente para producir proteínas (véase, por ejemplo, Mayfield et al. (2003) PNAS 100: 438-442). Debido a que las plantas tienen patrones de glucosilación diferentes a las células de mamífero, esto puede influir en la elección para producir FVII en estos hospedadores.

2. Purificación

Los métodos para purificación de polipéptidos de FVII de células hospedadoras dependen de las células hospedadoras y los sistemas de expresión elegidos. Para moléculas secretadas, las proteínas se purifican en general del medio de cultivo después de retirar las células. Para expresión intracelular, las células puede lisarse y 60 las proteínas purificarse del extracto. Cuando se usan organismos transgénicos tales como plantas transgénicas y animales para expresión, pueden usarse tejidos u órganos como material de partida para realizar un extracto de células lisadas. Adicionalmente, la producción de animales transgénicos puede incluir la producción de polipéptidos en leche o huevos, que pueden recogerse, y si es necesario las proteínas pueden extraerse adicionalmente y purificarse adicionalmente usando métodos convencionales en la técnica. 65

FVII puede purificarse usando técnicas de purificación de proteínas convencionales conocidas en la técnica incluyendo, pero sin limitación, SDS-PAGE, cromatografía de fracción por tamaño y exclusión por tamaño, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía quelante y cromatografía de intercambio iónico. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII pueden purificarse por cromatografía de intercambio aniónico. Un ejemplo de un método para purificar polipéptidos de FVII es usar una columna de intercambio iónico que permite la unión de cualquier 5 polipéptido que tenga un dominio Gla funcional, seguido de elución en presencia de calcio (véase por ejemplo, Ejemplo 3). También pueden usarse técnicas de purificación de afinidad para mejorar la eficacia y pureza de las preparaciones. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos, receptores y otras moléculas que se unen con FVII en purificación de afinidad. En otro ejemplo, la purificación también puede potenciarse usando una columna de afinidad de FT soluble (FT) (Maun et al. (2005) Prot Sci 14: 1171-1180). Las construcciones de expresión también pueden 10 modificarse técnicamente para añadir un marcador de afinidad tal como un epítopo myc, fusión de GST o His6 y purificarse por afinidad con anticuerpo de myc, resina de glutatión y Ni-resina, respectivamente, a una proteína. La pureza puede evaluarse por cualquier método conocido en la técnica incluyendo electroforesis en gel y técnicas de tinción y espectrofotométricas.

La proteasa FVII puede expresarse y purificarse para estar en una forma inactiva (forma de zimógeno) o como alternativa la proteasa pesada puede purificarse a una forma activa, tal como por autocatálisis. Por ejemplo, pueden prepararse polipéptidos de FVII que se han activado mediante escisión proteolítica del ARg152-Ile153 in vitro (es decir, FVIIa; forma bicatenaria). Los polipéptidos de FVII pueden prepararse en primer lugar por cualquiera de los métodos de producción descritos en el presente documento, incluyendo, pero sin limitación producción en células de 20 mamífero seguido de purificación. Puede conseguirse escisión de los polipéptidos de FVII a la forma de proteasa activa, FVIIa por varios medios. Por ejemplo, puede conseguirse autoactivación durante la incubación con vesículas fosfolípidas en presencia de calcio en 45 minutos (Nelsestuen et al. (2001) J Biol Chem 276: 39825-31). También pueden activarse polipéptidos de FVII hasta su compleción por incubación con factor Xa, factor XIIa o FT en presencia de calcio, con o sin fosfolípidos (véase, por ejemplo, Ejemplo 3 y Broze et al. (1980) J Biol Chem 25 255:1242-1247, Higashi et al. (1996) J Biol Chem 271: 26569-26574, Harvey et al. J Biol Chem 278: 8363-8369).

3. Proteínas de fusión

También se proporcionan proteínas de fusión que contienen un polipéptido de FVII modificado y uno o más 30 polipéptidos adicionales. Se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen dichas proteínas de fusión formuladas para administración por una vía adecuada. Se forman proteínas de fusión uniendo en cualquier orden el polipéptido de FVII modificado y un agente, tal como un anticuerpo o fragmento del mismo, factor de crecimiento, receptor, ligando y otro agente tal con el fin de facilitar la purificación de un polipéptido de FVII, alterar las propiedades farmacodinámicas de un polipéptido de FVII, por ejemplo, por dirección de polipéptido a una célula o 35 tejido diana, y/o aumentando la expresión o secreción del polipéptido de FVII. Típicamente cualquier proteína de fusión de FVII conserva al menos aproximadamente un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 95 % de actividad coagulante en comparación con un polipéptido de FVII no de fusión, incluyendo un 96 %, 97 %, 98 % 99 % o más actividad coagulante en comparación con un polipéptido no de fusión.

Puede efectuarse enlace de un polipéptido de FVII con otro polipéptido directamente o indirectamente mediante un enlazador. En un ejemplo, el enlace puede ser por enlace químico, tal como por agentes heterobifuncionales o enlaces de tiol u otros enlaces tales. La fusión también puede efectuarse por medios recombinantes. La fusión de un polipéptido de FVII con otro polipéptido puede ser con el extremo N o C terminal del polipéptido de FVII. Los ejemplos no limitantes de polipéptidos que pueden usarse en proteínas de fusión con un polipéptido de FVII 45 proporcionado en el presente documento incluyen, por ejemplo, un polipéptido de GST (glutatión S-transferasa), dominio Fc de la inmunoglobulina G, o una secuencia señal heteróloga. Las proteínas de fusión pueden contener componentes adicionales, tales como proteína de unión a maltosa (MBP) de E. coli que ayuda en la captación de la proteína por células (véase, Solicitud PCT Internacional Nº WO 01/32711).

Una proteína de fusión puede producirse por técnicas recombinantes convencionales. Por ejemplo, pueden ligarse entre sí fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias polipeptídicas en fase de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, empleando extremos romos o escalonados para ligamento, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, rellenado de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión no deseable, y ligamento enzimático. En otro ejemplo, el gen 55 de fusión puede sintetizarse por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automáticos. Como alternativa, puede llevarse a cabo amplificación por PCR de fragmentos génicos usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden posteriormente hibridarse y reamplificarse para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Además, están disponibles en el 60 mercado muchos vectores de expresión que ya codifican un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). Un ácido nucleico que codifica FVII puede clonarse en dicho vector de expresión de modo que el resto de fusión esté unido en fase con la proteína proteasa.

4. Modificación de polipéptidos

Pueden prepararse polipéptidos de FVII modificados como cadenas polipeptídicas desnudas o como un complejo. Para algunas aplicaciones, puede ser deseable preparar FVII modificado en una forma “desnuda” sin modificaciones postraduccionales u otras químicas. Pueden prepararse cadenas polipeptídicas desnudas en hospedadores 5 adecuados que no modifican postraduccionalmente a FVII. Dichos polipéptidos también pueden prepararse en sistemas in vitro y usando síntesis química de polipéptidos. Para otras aplicaciones, pueden desearse modificaciones particulares incluyendo pegilación, albuminación, glucosilación, carboxilación, hidroxilación, fosforilación u otras modificaciones conocidas. Pueden realizarse modificaciones in vitro o, por ejemplo, produciendo el FVII modificado en un hospedador adecuado que produce dichas modificaciones. 10

5. Secuencias de nucleótidos

Se proporcionan en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican FVII o polipéptidos de FVII modificados. Las moléculas de ácido nucleico incluyen variantes alélicas o variantes de corte y empalme de 15 cualquier polipéptido de FVII codificado. Son ejemplos de moléculas de ácido nucleico proporcionadas en el presente documento cualquiera que codifique un polipéptido de FVII modificado proporcionado en el presente documento, tal como cualquiera que codifique un polipéptido expuesto en una cualquiera de SEC ID Nº: 18-43, 125-150 o 206-250. En una realización, las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en el presente documento tienen al menos 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, o 99 % de identidad de secuencia o hibridan en 20 condiciones de rigurosidad media o alta a lo largo de al menos el 70 % de la longitud completa de cualquier ácido nucleico que codifica un polipéptido de FVII proporcionado en el presente documento. En otra realización, una molécula de ácido nucleico puede incluir las que tienen secuencias codónicas degradadas que codifican cualquiera de los polipéptidos de FVII proporcionados en el presente documento.

G. Evaluación de las actividades de los polipéptidos FVII modificados

Las actividades y propiedades de los polipéptidos FVII pueden evaluarse in vitro y/o in vivo. Se conocen por los expertos en la materia ensayos para dicha evaluación y se sabe que se correlacionan con actividades ensayadas y resultados para actividades terapéuticas e in vivo. En un ejemplo, pueden evaluarse variantes de FVII en 30 comparación con FVII no modificado y/o de tipo silvestre. En otro ejemplo, la actividad del polipéptido FVII modificado puede evaluarse después de exposición in vitro o in vivo a IRFT o AT-III y en comparación con la del polipéptido de FVII modificados que no se han expuesto a IRFT o AT-III. Los ensayos in vitro incluyen cualquier ensayo de laboratorio conocido por un experto en la materia, tal como, por ejemplo, ensayos basados en células incluyendo ensayos de coagulación, ensayos de unión, ensayos de proteínas y ensayos de biología molecular. Los 35 ensayos in vivo incluyen ensayos de FVII en modelos animales así como administración a seres humanos. En algunos casos, la actividad de FVII in vivo puede determinarse evaluando la sangre, el suero u otro fluido corporal con respecto a determinantes de ensayo. Las variantes de FVII también pueden ensayarse in vivo para evaluar una actividad o propiedad tal como un efecto terapéutico.

Típicamente, los ensayos descritos en el presente documento son con respecto a la forma activada bicatenaria de FVII, es decir, FVIIa. Dichos ensayos también pueden realizarse con la forma monocatenaria, tal como para proporcionar un control negativo ya que tal forma típicamente no contiene la actividad proteolítica o catalítica requerida para la actividad coagulante de FVII. Además, dichos ensayos también pueden realizarse en presencia de cofactores, tales como FT, que en algunos casos aumenta la actividad de FVII. 45

1. Ensayos in vitro

Los ejemplos de ensayos in vitro incluyen ensayos para evaluar la modificación y actividad de los polipéptidos. Las modificaciones pueden evaluarse usando ensayos in vitro que evalúan la -carboxilación y otras modificaciones post-50 traduccionales, ensayos proteicos y ensayos conformacionales conocidos en la técnica. Los ensayos para actividad incluyen, pero sin limitación, medición de la interacción de FVII con otros factores de coagulación, tales como FT, factor X y factor IX, ensayos proteolíticos para determinar la actividad proteolítica de polipéptidos de FVII, ensayos para determinar la unión y/o afinidad de polipéptidos de FVII para fosfatidilserinas y otros fosfolípidos, y ensayos basados en células para determinar el efecto de los polipéptidos FVII en la coagulación. 55

Pueden evaluarse concentraciones de polipéptidos de FVII modificados por métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), SDS-PAGE; métodos de Bradford, Lowry, BCA; absorbancia de UV, y otros métodos cuantificables de marcaje de proteínas, tal como, pero sin limitación, métodos inmunológicos, radiactivos y fluorescentes y métodos relacionados. 60

Puede realizarse la evaluación de los productos de escisión de reacciones de proteólisis, incluyendo escisión de polipéptidos de FVII o productos producidos por actividad proteasa de FVII, usando métodos que incluyen, pero sin limitación, escisión de sustrato cromogénico, HPLC, análisis de SDS-PAGE, ELISA, transferencia de Western, inmunohistoquímica, inmunoprecipitación, secuenciación NH2 terminal, y marcaje de proteínas. 65

También pueden evaluarse las propiedades estructurales de polipéptidos de FVII modificados. Por ejemplo, puede realizarse cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear (RMN) y microscopía crioelectrónica (crio-EM) de polipéptidos de FVII modificados para evaluar la estructura tridimensional de los polipéptidos de FVII y/u otras propiedades de polipéptidos de FVII, tales como unión a Ca2+ o cofactor.

Adicionalmente, la presencia y grado de degradación de FVII puede medirse por técnicas convencionales tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE) y transferencia de Western de muestras que contienen FVII sometidas a electroforesis. Los polipéptidos de FVII que se han expuesto a proteasas también pueden someterse a secuenciación N-terminal para determinar la localización o cambios en sitios de escisión de los polipéptidos de FVII modificados. 10

a. Modificación post-traduccional

Los polipéptidos de FVII también pueden evaluarse con respecto a la presencia de modificaciones post-traduccionales. Dichos ensayos se conocen en la técnica e incluyen ensayos para medir la glucosilación, 15 hidroxilación y carboxilación. En un ensayo ejemplar para glucosilación, puede realizarse análisis de carbohidratos, por ejemplo, con análisis de SDS-PAGE de polipéptidos de FVII expuestos a hidrazinolisis o tratamiento con endoglucosidasa. La hidrazinolisis libera glucanos ligados a N y O de glucoproteínas por incubación con hidrazina anhidra, mientras que la liberación de endoglucosidasa implica PNGasa F, que libera la mayoría de N-glucanos de glucoproteínas. La hidrazinolisis o tratamiento con endoglucosidasa de polipéptidos de FVII genera un extremo 20 reductor que pueden marcarse con un marcador fluoróforo o cromóforo. Los polipéptidos de FVII marcados pueden analizarse por electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforo (FACE). El marcador fluorescente para glucanos también puede usarse para análisis de monosacáridos, realización de perfil o identificación genética de patrones de glucosilación complejos por HPLC. Los métodos de HPLC ejemplares incluyen cromatografía de interacción hidrófila, interacción electrónica, intercambio de iones, interacción hidrófoba y cromatografía de exclusión 25 por tamaño. Las sondas de glucano ejemplares incluyen, pero sin limitación, 3-(acetilamino)-6-aminoacridina (AA-Ac) y ácido 2-aminobenzoico (2-AA). También pueden detectarse restos de carbohidratos mediante el uso de anticuerpos específicos que reconocen el polipéptido de FVII glucosilado. Un ensayo ejemplar para medir la -hidroxilación comprende análisis de HPLC de fase inversa de polipéptidos de FVII que se han sometido a hidrólisis alcalina (Przysiecki et al. (1987) PNAS 84:7856-7860). La carboxilación y -carboxilación de polipéptidos de FVII 30 puede evaluarse usando espectrometría de masas con análisis de desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF), como se describe en la técnica (véase, por ejemplo, Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369, Maum et al. Prot Sci 14:1171-1180). La interacción de un polipéptido de FVII que contiene el propéptido (pro-FVII) con la carboxilasa responsable de la modificación de -carboxilato post-traduccional también puede evaluarse. La constante de disociación (Kd) después de incubación de carboxilasa con polipéptidos pro-FVII 35 marcados con flouresceina puede medirse determinando la cantidad de carboxilasa unida por anisotropía (Lin et al. (2004) J Biol Chem 279:6560-6566).

b. Actividad proteolítica

Los polipéptidos de FVII modificados pueden ensayarse con respecto a actividad proteolítica. La actividad proteolítica de FVII puede medirse usando sustratos cromogénicos tales como Chromozym t-PA (MeSO2-D-Phe-Gly-Arg-pNA), S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-pNA), S-2266 (H-D-Val-Leu-Arg-pNA), S-2765 (Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA), S-2765 (ZD-Arg-Gly-Arg-pNA), Spectrozyme FXa y Spectrozyme FVIIa (CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA). Se incubó polipéptidos de FVII, solos o en presencia de FT, con diversas concentraciones de sustrato cromogénico. La 45 escisión del sustrato puede controlarse por absorbancia y la tasa de hidrólisis del sustrato determinarse por regresión lineal usando software fácilmente disponible.

También puede evaluarse la activación de sustratos de factores de coagulación, tales como FX, por polipéptidos de FVII. Los polipéptidos de FVII, con o sin preincubación con FT, pueden incubarse con FX purificado (disponible en el 50 mercado). La cantidad de FXa activo producido como consecuencia de incubación con polipéptidos de FVII se mide como la actividad de FXa para un sustrato cromogénico, tal como S-2222 o Spectrafluor FXa (CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC.AcOH), que se controla mediante cambios de absorbancia (Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369, véase también Ejemplo 5 posterior). También puede incluirse una fuente de fosfolípidos en la incubación de FVII y FX (Nelsestuen et al. (2001) J Biol Chem 276:39825-31). 55

c. Actividad de coagulación

Los polipéptidos de FVII pueden ensayarse con respecto a actividad de coagulación usando ensayos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, algunos de los ensayos incluyen, pero sin limitación, un ensayo de coagulación de dos 60 estadios (Leibman et al., (1985) PNAS 82:3879-3883); el ensayo de tiempo de protrombina (PT, que puede medir la actividad dependiente de FT del FVIIa en la ruta extrínseca); ensayos que son modificaciones del ensayo de PT; el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT, que puede medir la actividad independiente de FT de FVIIa); el tiempo de coagulación activada (TCA); el tiempo de coagulación activada recalcificada; el tiempo de coagulación de Lee-White; o tromboelastografía (TEG) (Pusateri et al. (2005) Critical Care 9:S15-S24). Por ejemplo, la actividad de 65 coagulación de un polipéptido de FVII modificado puede determinarse por un ensayo basado en PT donde FVII se

diluye en plasma deficiente en FVII, y se mezcla con reactivo de tiempo de protrombina (FT recombinante con fosfolípidos y calcio), tal como el disponible de Innovin™ de Dade Behring. La formación de coágulos se detecta de forma óptica y el tiempo hasta el coágulo se determina y se compara frente a plasma deficiente en FVII solo.

d. Unión con y/o inhibición por otras proteínas 5

Los ensayos de inhibición pueden usarse para medir la resistencia de los polipéptidos de FVII modificados a inhibidores de FVII, tales como, por ejemplo, IRFT y AT-III, o moléculas tales como Zn2+. La evaluación de la inhibición de otros inhibidores también puede ensayarse e incluye, pero sin limitación, otros inhibidores de serina proteasa y anticuerpos específicos de FVII. La inhibición puede evaluarse por incubación de, por ejemplo, IRFT, AT-10 III o Zn2+ con polipéptidos de FVII que se han preincubado con FT. La actividad de FVII puede después medirse usando uno cualquiera o más de los ensayos de actividad o coagulación descritos anteriormente, y la inhibición por IRFT, AT-III o Zn2+ puede evaluarse comparando la actividad de polipéptidos de FVII incubados con el inhibidor, con la actividad de polipéptidos de FVII que no se han incubado con el inhibidor.

Los polipéptidos de FVII pueden ensayarse con respecto a la unión con otros factores de coagulación e inhibidores. Por ejemplo, las interacciones directas e indirectas de FVII con cofactores, tales como FT, sustratos, tales como FX y FIX, e inhibidores, tales como IRFT, antitrombina III y heparina pueden evaluarse usando cualquier ensayo de unión conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, inmunoprecipitación, purificación en columna, SDS-PAGE no reductora, ensayos de BIAcore®, resonancia de plasmón superficial (RPS), transferencia de energía por 20 resonancia de fluorescencia (TERF), polarización de fluorescencia (PF), calorimetría de titulación isotérmica (CTI), dicroísmo circular (DC), ensayos de complementación de fragmentos proteicos (CFP), espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN), dispersión lumínica, equilibrio de sedimentación, cromatografía de filtración en gel de zona pequeña, retardo en gel, transferencia de Western lejano, polarización de fluorescencia, determinación de huella proteica de radicales de hidroxilo, presentación en fagos y diversos sistemas de dos 25 híbridos. En un ejemplo, la unión a Zn2+ se evalúa usando análisis de equilibrio (Petersen et al., (2000) Protein Science 9:859-866).

e. Afinidad por fosfolípidos

La unión y/o afinidad de polipéptidos de FVII modificados con fosfatodiserina (PS) y otros fosfolípidos puede determinarse usando ensayos bien conocidos en la técnica. Pueden usarse fosfolípidos de alta pureza (por ejemplo, concentraciones conocidas de PS bovina y fosfatidilcolina (PC) de huevo, que están disponibles en el mercado, tal como de Sigma), para preparar vesículas fosfolipídicas unilamelares pequeñas. La unión de polipéptidos de FVII a estas vesículas de PS/PC puede determinarse por dispersión de la luz relativa a 90° con respecto a la luz incidente. 35 Se mide la intensidad de la dispersión de la luz con PC/PS solamente y con PC/PS/FVII para determinar la constante de disociación (Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369). También puede usarse resonancia de plasmón superficial, tal como en un instrumento biosensor BIAcore, para medir la afinidad de polipéptidos de FVII por membranas fosfolipídicas (Sun et al. Blood 101:2277-2284).

2. Modelos animales no humanos

Pueden usarse modelos animales no humanos para evaluar la actividad, eficacia y seguridad de polipéptidos de FVII modificados. Por ejemplo, pueden usarse animales no humanos como modelos para una enfermedad o afección. Puede inyectarse a animales no humanos sustancias inductoras de enfermedad y/o fenotipo antes de la 45 administración de variantes de FVII, tales como cualquier variante de FVII expuesta en cualquiera de las SEC ID Nº: 18-43, 125-150 o 206-250, para controlar los efectos en la progresión de la enfermedad. También son útiles los modelos genéticos. Pueden generarse animales, tales como ratones, que imitan una enfermedad o afección mediante la sobreexpresión, infraexpresión o anulación de uno o más genes, tales como, por ejemplo, ratones con anulación del factor VIII que presentan hemofilia A (Bi et al. (1995) Nat Gen 10:119-121). Dichos animales pueden 50 generarse por técnicas de producción de animales transgénicos bien conocidas en este campo o usando cepas mutantes de origen natural o inducidas. Los ejemplos de modelos animales no humanos de enfermedades asociadas con FVII útiles incluyen, pero sin limitación, modelos de trastornos hemorrágicos, en particular hemofilia o enfermedad trombótica. También pueden usarse modelos animales no humanos de lesión para evaluar una actividad, tal como la actividad de coagulación, de polipéptidos de FVII. Estos modelos animales no humanos 55 pueden usarse para comprobar la actividad de variantes de FVII en comparación con un polipéptido de FVII de tipo silvestre.

También pueden usarse modelos animales para controlar la estabilidad, semi-vida y eliminación de polipéptidos de FVII modificados. Dichos ensayos son útiles para comparar polipéptidos de FVII modificados y para calcular dosis y 60 regímenes de dosis para ensayos adicionales en animales no humanos y en seres humanos. Por ejemplo, puede inyectarse un polipéptido de FVII modificado, tal como cualquier variante de FVII proporcionada en el presente documento incluyendo, por ejemplo, cualquiera expuesta en cualquiera de las SEC ID Nº: 18-43, 125-150 o 206-250, en la vena de la cola de ratones. Después se toman muestras de sangre en puntos temporales después de la inyección (tales como minutos, horas y días después) y después puede controlarse el nivel de los polipéptidos de 65 FVII modificados en muestras corporales incluyendo, pero sin limitación, suero o plasma en puntos temporales

específicos por ejemplo por ELISA o radioinmunoensayo. También pueden ensayarse muestras de sangre de diversos puntos temporales después de la inyección de los polipéptidos de FVII con respecto a actividad de coagulación usando diversos métodos, tal como se describe en los Ejemplos 9 y 14. Estos tipos de estudios farmacocinéticos pueden proporcionar información con respecto a la semi-vida, eliminación y estabilidad de los polipéptidos de FVII, lo que puede ayudar a determinar dosificaciones adecuadas para su administración como un 5 procoagulante.

Pueden ensayarse polipéptidos de FVII modificados, tales como cualquiera expuesto en cualquiera de las SEC ID Nº: 18-43, 125-150 o 206-250, con respecto a su eficacia terapéutica usando modelos animales para hemofilia. En un ejemplo no limitante, puede usarse un modelo animal, tal como un ratón. Están disponibles en la técnica modelos 10 de ratón de hemofilia y pueden emplearse para ensayar polipéptidos de FVII modificados. Por ejemplo, puede usarse un modelo de ratón de hemofilia A que se produce por inyección con anticuerpos anti-FVIII para evaluar la actividad coagulante de polipéptidos de FVII (véanse, por ejemplo, los Ejemplos 8 y 14, y Tranholm et al. Blood (2003)102:3615-3620). También puede usarse un modelo de ratón de hemofilia B para ensayar polipéptidos de FVII (Margaritis et al. (2004) J Clin Invest 113:1025-1031). También existen modelos de trastornos hemorrágicos no de 15 ratón. Puede evaluarse la actividad de los polipéptidos de FVII en ratas con hemorragia inducida por warfarina o hemorragia inducida por melagatrán (Diness et al. (1992) Thromb Res 67:233-241, Elg et al. (2001) Thromb Res 101:145-157), y en conejos con hemorragia inducida por heparina (Chan et al. (2003) J Thromb Haemost 1:760-765). También pueden usarse perros endógamos con hemofilia A, hemofilia B y enfermedad de von Willebrand que presentan hemorragia grave en estudios animales no humanos con polipéptidos de FVII (Brinkhous et al. (1989) 20 PNAS 86:1382-1386). La actividad de los polipéptidos de FVII también puede evaluarse en un modelo de conejo de hemorragia en el que se induce trombocitopenia mediante una combinación de irradiación gamma y el uso de anticuerpos de plaquetas (Tranholm et al. (2003) Thromb Res 109:217-223).

Además de animales con trastornos hemorrágicos generalizados, también pueden usarse modelos de lesión y 25 traumatismo para evaluar la actividad de los polipéptidos de FVII y su seguridad y eficacia como un producto terapéutico coagulante. Los ejemplos no limitantes de dichos modelos incluyen un modelo de conejo de estenosis coronaria (Fatorutto et al. (2004) Can J Anaesth 51:672-679), un modelo de cerdo de lesión hepática de grado V (Lynn et al. (2002) J Trauma 52:703-707), un modelo de cerdo de lesión hepática de grado V (Martinowitz et al. (2001) J Trauma 50:721-729) y un modelo de cerdo de aortotomía (Sondeem et al. (2004) Shock 22:163-168). 30

3. Ensayos clínicos

Están disponibles muchos ensayos para evaluar la actividad de FVII para su uso clínico. Dichos ensayos pueden incluir la evaluación de la coagulación, estabilidad proteica y semi-vida in vivo, y ensayos fenotípicos. Los ensayos 35 fenotípicos y ensayos para evaluar el efecto terapéutico del tratamiento con FVII incluyen la evaluación de los niveles en sangre de FVII (por ejemplo medición de FVII en suero antes de la administración y puntos temporales después de las administraciones incluyendo, después de la primera administración, inmediatamente después de la última administración y puntos temporales entre medias, corrigiendo con respecto al índice de masa corporal (IMC)), la evaluación de la coagulación sanguínea in vitro usando los métodos descritos anteriormente después del 40 tratamiento con FVII (por ejemplo, ensayo de PT), y respuesta fenotípica al tratamiento con FVII incluyendo alivio de síntomas a lo largo del tiempo en comparación con sujetos tratados con un FVII no modificado y/o de tipo silvestre o placebo. Puede controlarse a los pacientes tratados con polipéptidos de FVII con respecto a pérdida de sangre, necesidad de transfusión, y hemoglobina. Los pacientes pueden controlarse regularmente durante un período de tiempo para administraciones rutinarias o repetidas, o después de la administración en respuesta a acontecimientos 45 agudos, tales como hemorragia, traumatismo o procedimientos quirúrgicos.

H. Formulación y administración

Se proporcionan en el presente documento composiciones para su uso en el tratamiento de trastornos 50 hemorrágicos. Dichas composiciones contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de factor VII tal como se describe en el presente documento. Se mezclan concentraciones eficaces de polipéptidos de FVII o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos con un vehículo o transportador farmacéutico adecuado para administración sistémica, tópica o local. Se incluyen compuestos en una cantidad eficaz para tratar el trastorno seleccionado. La concentración del compuesto activo en la composición dependerá de la absorción, inactivación, de 55 las tasas de excreción del compuesto activo, de la pauta de dosificación y de la cantidad administrada así como otros factores conocidos por los expertos en la materia.

Los vehículos o transportadores farmacéuticos adecuados para la administración de los compuestos proporcionados en el presente documento incluyen cualquiera de dichos vehículos que se sabe por los expertos en la materia que 60 son adecuados para el modo de administración particular. Las composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de FVII descrito en el presente documento también pueden proporcionarse como un polvo liofilizado que se reconstituye, tal como con agua estéril, inmediatamente antes de su administración.

1. Formulaciones

Pueden formularse composiciones farmacéuticas que contienen un FVII modificado de cualquier modo convencional mezclando una cantidad seleccionada del polipéptido con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables. La selección del vehículo o excipiente está dentro de la experiencia de la profesión de administración y 5 puede depender de varios parámetros. Estos incluyen, por ejemplo, el modo de administración (es decir, sistémico, oral, nasal, pulmonar, local, tópico o cualquier otro modo) y el trastorno tratado. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento pueden formularse para administración en dosificación individual (directa) o para dilución u otra modificación. Las concentraciones de los compuestos en las formulaciones son eficaces para el suministro de una cantidad, tras su administración, que es eficaz para el tratamiento previsto. Típicamente, las 10 composiciones se formulan para la administración de una única dosificación. Para formular una composición, la fracción en peso de un compuesto o mezcla del mismo se disuelve, suspende, dispersa o mezcla de otro modo en un vehículo seleccionado a una concentración eficaz de modo que la afección tratada se alivie o mejore.

Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden formularse para su 15 administración a un sujeto como una proteína FVIIa bicatenaria. Los polipéptidos de FVII modificados pueden activarse por cualquier método conocido en la técnica antes de la formulación. Por ejemplo, FVII puede experimentar autoactivación durante la purificación por cromatografía de intercambio iónico (Jurlander et al. (2001) Semin Thromb Hemost 27:373-384). Los polipéptidos de FVII modificados también pueden activarse por incubación con FXa inmovilizado en perlas (Kemball-Cook et al. (1998) J Biol Chem 273:8516-8521), o cualquier otro método conocido 20 en la técnica (véase también Ejemplo 3 más adelante). La inclusión de calcio en estos procesos asegura la activación completa y el plegamiento correcto de la proteína FVIIa modificada. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento también pueden formularse para administración en forma de una proteína monocatenaria. Los polipéptidos de FVII monocatenarios también pueden purificarse de tal modo que prevengan la escisión (véase, por ejemplo, el documento US6677440). Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el 25 presente documento pueden formularse de modo que las formas monocatenarias y bicatenarias estén contenidas en la composición farmacéutica, en cualquier proporción mediante la selección adecuada del medio para eliminar o controlar la autoactivación.

El compuesto puede suspenderse en forma micronizada u otra forma adecuada o puede derivatizarse para producir 30 un producto activo más soluble. La forma de la mezcla resultante depende de varios factores, incluyendo del modo previsto de administración y de la solubilidad del compuesto en el vehículo o transportador seleccionado. Las mezclas resultantes son soluciones, suspensiones, emulsiones y otras mezclas tales, y pueden formularse como una mezcla no acuosa o acuosa, cremas, geles, pomadas, emulsiones, soluciones, elixires, lociones, suspensiones, tinturas, pastas, espumas, aerosoles, irrigaciones, pulverizaciones, supositorios, vendas o cualquier otra formulación 35 adecuada para administración sistémica, tópica o local. Para administración interna local, tal como administración intramuscular, parenteral o intra-articular, los polipéptidos pueden formularse como una suspensión de solución en un medio de base acuosa, tal como solución salina tamponada de forma isotónica o se combinan con un soporte biocompatible o bioadhesivo previsto para administración interna. La concentración eficaz es suficiente para aliviar la afección diana y puede determinarse de forma empírica. Para formular una composición, la fracción en peso del 40 compuesto se disuelve, suspende, dispersa o mezcla de otro modo en un vehículo seleccionado a una concentración eficaz de modo que la afección diana se alivie o mejore.

En general, las composiciones farmacéuticamente aceptables se preparan a la vista de la aprobación por una agencia reguladora o se preparan de otro modo de acuerdo con una farmacopea generalmente reconocida para su 45 uso en animales y en seres humanos. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir transportadores tales como un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra una isoforma. Dichos transportadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y aceite de sésamo. El agua es un vehículo típico cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También pueden emplearse 50 soluciones salinas y soluciones de dextrosa acuosa y glicerol como transportadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Las composiciones pueden contener junto con un principio activo: un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicálcico o carboximetilcelulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato cálcico y talco; y un aglutinante tal como almidón, gomas naturales tales como goma arábiga, gelatina, glucosa, melaza, polivinilpirrolidona, celulosas y derivados de las mismas, povidona, crospovidonas y otros aglutinantes tales 55 conocidos por los expertos en la materia. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche en polvo desnatada, glicerol, propilenglicol, agua y etanol. Una composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponantes de pH, por ejemplo, acetato, citrato sódico, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitán, acetato sódico de 60 trietanolamina, oleato de trietanolamina y otros agentes tales. Dichas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos y formulaciones de liberación sostenida. Pueden formularse cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador, que contienen una mezcla en polvo de un compuesto terapéutico y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Puede formularse una composición en forma de supositorio, con aglutinantes y transportadores 65 tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir transportadores convencionales tales como

grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y otros agentes tales. También pueden formularse convenientemente preparaciones para administración oral con inhibidores de proteasa, tales como inhibidor de Bowman-Birk, un inhibidor de Bowman-Birk conjugado, aprotinina y camostat. Se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados en "Remington’s Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz 5 del compuesto, generalmente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma para administración adecuada a un sujeto o paciente.

La formulación debería ajustarse al modo de administración. Por ejemplo, el FVII modificado puede formularse para administración parenteral mediante inyección (por ejemplo, por inyección de bolo o infusión continua). Las 10 composiciones inyectables pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1,4-butanodiol. Se emplean convencionalmente aceites no volátiles, estériles, como medio disolvente o de suspensión. Para este fin puede emplearse cualquier aceite no volátil insípido, incluyendo, pero sin limitación, mono o diglicéridos sintéticos, 15 ácidos grasos (incluyendo ácido oleico), aceites vegetales de origen natural como aceite de sésamo, aceite de coco, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón y otros aceites o vehículos grasos sintéticos como oleato de etilo. Pueden incorporarse tampones, conservantes, antioxidantes y los ingredientes adecuados, según se requiera, o, como alternativa, pueden comprender la formulación.

Los polipéptidos pueden formularse como el único principio farmacéuticamente activo en la composición o pueden combinarse con otros principios activos. Los polipéptidos pueden dirigirse para suministro, tal como por conjugación con un agente de direccionamiento, tal como un anticuerpo. Las suspensiones liposómicas, incluyendo liposomas dirigidos a tejido, también pueden ser adecuados como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, pueden prepararse 25 formulaciones de liposomas como tal se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.522.811. El suministro liposómico también puede incluir formulaciones de liberación lenta, incluyendo matrices farmacéuticas tales como geles de colágeno y liposomas modificados con fibronectina. (véase, por ejemplo, Weiner et al. (1985) J Pharm Sci. 74(9): 922-5). Las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden contener además uno o más adyuvantes que facilitan el suministro, tal como, pero sin limitación, vehículos inertes, o sistemas de dispersión 30 coloidal. Pueden seleccionarse ejemplos representativos y no limitantes de dichos vehículos inertes de agua, alcohol isopropílico, fluorocarburos gaseosos, alcohol etílico, polivinilpirrolidona, propilenglicol, un material productor de gel, alcohol estearílico, ácido esteárico, espermaceti, monooleato de sorbitán, metilcelulosa, así como combinaciones adecuadas de dos o más de los mismos. El compuesto activo se incluye en el vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéuticamente útil en ausencia de efectos secundarios no 35 deseables en el sujeto tratado. La concentración terapéuticamente eficaz puede determinarse de forma empírica ensayando los compuestos en sistemas in vitro e in vivo conocidos, tales como los ensayos proporcionados en el presente documento.

a. Dosificaciones 40

La cantidad o dosis precisa del agente terapéutico administrado depende del polipéptido de FVII particular, de la vía de administración y de otras consideraciones, tales como la gravedad de la enfermedad y el peso y estado general del sujeto. La administración local del agente terapéutico requerirá típicamente una dosificación menor que cualquier modo de administración sistémico, aunque la concentración local del agente terapéutico puede ser, en algunos 45 casos, mayor después de la administración local que puede conseguirse con seguridad tras la administración sistémica. Si es necesario, puede determinarse o extrapolarse de forma empírica una dosificación y duración y protocolo de tratamiento particulares. Por ejemplo, pueden usarse dosis ejemplares de polipéptidos de FVII recombinantes y nativos como un punto de partida para determinar las dosificaciones apropiadas. Por ejemplo, se ha administrado un polipéptido de FVII recombinante (rFVIIa) que se ha activado a rFVIIa, Novoseven®, a pacientes 50 con hemofilia A o hemofilia B, que experimentan un episodio de hemorragia, a una dosificación de 90 g/kg por infusión de bolo durante 2 a 5 minutos, consiguiendo un nivel en circulación eficaz de al menos 2 g/ml. La dosis se repite cada 2 horas hasta que se consigue la hemostasis. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden ser eficaces a cantidades y/o frecuencias de dosificación reducidas en comparación con dicho FVII recombinante. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente 55 documento pueden administrarse a una dosificación de 80 g/kg, 70 g/kg, 60 g/kg, 50 g/kg, 40 g/kg, 30 g/kg, 20 g/kg, 15 g/kg o menos. En algunos ejemplos, las dosificaciones pueden ser mayores, tales como 100 g/kg, 110 g/kg, 120 g/kg, o mayores. La duración del tratamiento y el intervalo entre inyecciones variarán con la gravedad de la hemorragia y la respuesta del paciente al tratamiento, y pueden ajustarse en consecuencia. Pueden tenerse en cuenta factores tales como el nivel de actividad y semivida del FVII modificado en comparación con el 60 FVII no modificado cuando se realicen determinaciones de dosificación. Las dosificaciones y regimenes particulares pueden determinarse de forma empírica.

En otro ejemplo, un polipéptido de FVII recombinante (rFVIIa) que se ha activado a rFVIIa, Novoseven®, se ha administrado a pacientes con deficiencia de FVII congénita que experimentan un episodio de hemorragia, a una 65

dosificación de 15-30 g/kg por infusión de bolo durante 2 a 5 minutos. La dosis se repite cada 4-6 horas hasta que se consigue la hemostasis. Los polipéptidos FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden ser eficaces a cantidades y/o frecuencias de dosificación reducidas en comparación con dicho FVII recombinante. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden administrarse a una dosificación de 20 g/kg, 15 g/kg, 10 g/kg, 5 g/kg, 3 g/kg o menos. En algunos ejemplos, las dosificaciones 5 pueden ser mayores, tales como 35 g/kg, 40 g/kg, 45 g/kg, o mayores. La duración del tratamiento y el intervalo entre inyecciones variarán según la gravedad de la hemorragia y la respuesta del paciente al tratamiento, y pueden ajustarse en consecuencia. Pueden usarse factores tales como el nivel de actividad y semivida del FVII modificado en comparación con el FVII no modificado al realizar determinaciones de dosificación. Por ejemplo, un polipéptido de FVII que muestra una semivida más larga que un polipéptido de FVII no modificado puede administrarse a dosis 10 menores y/o menos frecuentemente que el polipéptido de FVII no modificado. De forma similar, las dosificaciones requeridas para el efecto terapéutico usando un polipéptido de FVII modificado que presenta actividad coagulante aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado pueden reducirse en su frecuencia y cantidad. Las dosificaciones y regimenes particulares pueden determinarse de forma empírica por un experto en la materia.

b. Formas de dosificación

Los compuestos farmacéuticos terapéuticamente activos y derivados de los mismos se formulan y administran típicamente en formas de dosificación unitarias o formas de dosificación múltiples. Las formulaciones pueden proporcionarse para administración a seres humanos y animales en formas de dosificación que incluyen, pero sin 20 limitación, comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones parenterales estériles, soluciones o suspensiones orales, y emulsiones de aceite en agua que contienen cantidades adecuadas de los compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de compuesto terapéuticamente activo suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el transportador, vehículo o diluyente farmacéutico requerido. Los ejemplos de formas de dosis 25 unitarias incluyen ampollas y jeringas y comprimidos o cápsulas envasados individualmente. En algunos ejemplos, la dosis unitaria se proporciona como un polvo liofilizado que se reconstituye antes de su administración. Por ejemplo, un polipéptido de FVII puede proporcionarse como un polvo liofilizado que se reconstituye con una solución adecuada para generar una solución de una única dosis para inyección. En algunos ejemplos, el polvo liofilizado puede contener el polipéptido de FVII y componentes adicionales, tales como sales, de modo que la reconstitución 30 con agua destilada estéril de cómo resultado un polipéptido de FVII en una solución tamponada o salina. Las formas de dosis unitaria pueden administrarse en fracciones o múltiplos de las mismas. Una forma de dosis múltiple es una pluralidad de formas de dosificación unitarias idénticas envasadas en un único recipiente para administrar en una forma dosis unitaria segregada. Los ejemplos de formas de dosis múltiples incluyen viales, frascos de comprimidos o cápsulas o frascos de pintas o galones. Por lo tanto, la forma de dosis múltiple es una multitud de dosis unitarias que 35 no se segregan en el envasado.

2. Administración de polipéptidos de FVII modificados

Los polipéptidos de FVII proporcionados en el presente documento (es decir compuestos activos) pueden 40 administrarse in vitro, ex vivo o in vivo poniendo en contacto una mezcla, tal como un fluido corporal u otra muestra tisular, con un polipéptido de FVII. Por ejemplo, cuando se administra un compuesto ex vivo, puede ponerse en contacto un fluido corporal o muestra tisular de un sujeto con los polipéptidos de FVII que recubren un tubo o filtro, tal como, por ejemplo, un tubo o filtro en una máquina de derivación. Cuando se administran in vivo, los compuestos activos pueden administrarse por una vía apropiada, por ejemplo, por vía oral, por vía nasal, por vía pulmonar, por 45 vía parenteral, por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía subcutánea, por vía intraarticular, por vía intracisternal, por vía intraocular, por vía intraventricular, por vía intratecal, por vía intramuscular, por vía intraperitoneal, por vía intratraqueal o por vía tópica, así como por cualquier combinación de cualesquiera dos o más de las mismas, en forma líquida, semilíquida o sólida y se formulan de una manera adecuada para cada vía de administración. Los polipéptidos de FVII modificados pueden administrarse una vez o más de una vez, tal como dos 50 veces, tres veces, cuatro veces o cualquier número de veces que se requieran para conseguir un efecto terapéutico. Pueden conseguirse múltiples administraciones por cualquier vía o combinación de vías, y pueden administrarse cada hora, cada dos horas, cada tres horas, cada cuatro horas o más.

La vía más adecuada para administración variará dependiendo de la patología a tratar, por ejemplo la localización 55 del trastorno hemorrágico. En general, los polipéptidos de FVII se administrarán por inyección de bolo intravenoso, con un tiempo de administración (infusión) de aproximadamente 2-5 minutos. En otros ejemplos, los niveles de FVII en sangre deseables pueden mantenerse mediante una infusión continua del agente activo como se determina por los niveles en plasma. Debería observarse que el médico a cargo sabrá cómo y cuándo terminar, interrumpir o ajustar la terapia a menor dosificación debido a la toxicidad o disfunciones de médula ósea, hígado o riñón. Por el 60 contrario, el médico a cargo también sabrá cómo y cuándo ajustar el tratamiento a niveles mayores si la respuesta clínica no es adecuada (evitando efectos secundarios tóxicos). En otros ejemplos, la localización del trastorno hemorrágico podría indicar que la formulación de FVII se administra por vías alternativas. Por ejemplo, la administración local, incluyendo administración al cerebro (por ejemplo, por vía intraventricular) podría realizarse cuando el paciente experimente hemorragia en esta región. De forma similar, para el tratamiento de hemorragia en 65 las articulaciones, puede emplearse administración local por inyección del agente terapéutico a la articulación (es

decir, por vía intraarticular, por medio intravenoso o subcutáneo). En otros ejemplos, la administración tópica del agente terapéutico a la piel, por ejemplo formulado como una crema, gel o pomada, o administración a los pulmones por inhalación o por vía intratraqueal, podría ser adecuada cuando la hemorragia se localice en estas áreas.

En los casos donde los polipéptidos de FVII modificados se van a formular como una preparación de depósito, 5 pueden administrarse formulaciones de acción prolongada mediante implante (por ejemplo, por vía subcutánea o por vía intramuscular) o por inyección intramuscular. Por lo tanto, por ejemplo, los compuestos terapéuticos pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, en forma de una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble. 10

Las composiciones, si se desea, pueden presentarse en un envase, en un kit o dispositivo dosificador, que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el principio activo. El envase, por ejemplo, contiene papel metálico o plástico, tal como un paquete de blister. El paquete o dispositivo dosificador puede estar acompañado de instrucciones para su administración. Las composiciones que contienen los agentes activos pueden 15 envasarse como artículos de fabricación que contienen material de envasado, un agente proporcionado en el presente documento, y una etiqueta que indica el trastorno para el que se proporciona el agente.

También se proporcionan composiciones de moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de FVII modificados y vectores de expresión que los codifican que son adecuados para terapia génica. En lugar de suministrar la proteína, el ácido nucleico puede administrarse in vivo, tal como por vía sistémica o por otra vía, o ex vivo, tal como por retirada de células, incluyendo linfocitos, introducción del ácido nucleico en los mismos, y la introducción en el hospedador o un receptor compatible. 25

Los polipéptidos de FVII modificados pueden suministrarse a células y tejidos por expresión de moléculas de ácido nucleico. Los polipéptidos de FVII modificados pueden administrarse como moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de FVII modificados, incluyendo técnicas ex vivo y expresión in vivo directa. Los ácidos nucleicos pueden suministrase a células y tejidos por cualquier método conocido por los expertos en la materia. Las 30 secuencias de ácido nucleico aisladas pueden incorporarse en vectores para manipulación adicional. Como se usa en el presente documento, el vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se usan para introducir ADN heterólogo en células para expresión o replicación de los mismos. La selección y uso de dichos vehículos está dentro de la experiencia del experto en la materia.

Los métodos para administrar polipéptidos de FVII modificados por expresión de moléculas de ácido nucleico codificantes incluyen la administración de vectores recombinantes. El vector puede diseñarse para que permanezca episómico, tal como por inclusión de un origen de replicación o puede diseñarse para integrarse en un cromosoma en la célula. También pueden usarse polipéptidos de FVII modificados en terapia de expresión génica ex vivo usando vectores no virales. Por ejemplo, las células pueden modificarse térmicamente para expresar un polipéptido 40 de FVII modificado, tal como integrando un ácido nucleico que codifica un polipéptido de FVII modificado en una localización genómica, bien unido operativamente a secuencias reguladoras o de modo que se coloque unido operativamente a secuencias reguladoras en una localización genómica. Dichas células pueden después administrarse por vía local o sistémica a un sujeto, tal como un paciente que necesite tratamiento.

Los vectores virales incluyen, por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados (VAA), poxvirus, virus del herpes, retrovirus y pueden emplearse otros diseñados para terapia génica. Los vectores pueden permanecer episómicos o pueden integrarse en cromosomas del sujeto tratado. Un polipéptido de FVII modificado puede expresarse por un virus, que se administra a un sujeto que necesite tratamiento. Los vectores virales adecuados para terapia génica incluyen adenovirus, virus adenoasociados (VAA), retrovirus, lentivirus, virus vaccinia y otros indicados 50 anteriormente. Por ejemplo, se conoce bien en este campo la tecnología de expresión de adenovirus y también se conocen métodos de producción y administración de adenovirus. Están disponibles serotipos de adenovirus, por ejemplo, de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Rockville, MD). Los adenovirus pueden usarse ex vivo, por ejemplo, se aíslan células de un paciente que necesite tratamiento, y se transducen con un vector de adenovirus que expresa un polipéptido de FVII modificado. Después de un periodo de cultivo adecuado, las células transducidas 55 se administran a un sujeto por vía local y/o por vía sistémica. Como alternativa se aíslan partículas de adenovirus que expresan polipéptidos de FVII modificados y se formulan en un vehículo farmacéuticamente aceptable para suministro de una cantidad terapéuticamente eficaz para prevenir, tratar o aliviar una enfermedad o afección de un sujeto, típicamente, se suministran partículas de adenovirus a una dosis que varía de 1 partícula a 1014 partículas por kilogramo de peso de un sujeto, generalmente entre 106 o 108 partículas y 1012 por kilogramo de peso del sujeto. 60 En algunas situaciones es deseable proporcionar una fuente de ácido nucleico con un agente que se dirija a células, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o una célula diana, o un ligando para un receptor en una célula diana. FVII también puede dirigirse para suministro a tipos celulares específicos. Por ejemplo, pueden usarse vectores adenovirales que codifican polipéptidos de FVII para expresión estable en células que no están en división, tales como células de hígado (Margaritis et al. (2004) J Clin Invest 113: 65 1025-1031). En otro ejemplo, pueden traducirse vectores virales o no virales que codifican polipéptidos de FVII a

células aisladas para suministro posterior. Los tipos celulares adicionales para expresión y suministro de FVII podrían incluir, pero sin limitación, fibroblastos y células endoteliales.

Las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse en cromosomas artificiales y otros vectores no virales. Los cromosomas artificiales, tales como ACES (véase, Lindenbaum et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32(21): e172) 5 pueden modificarse por ingeniería genética para codificar y expresar la isoforma. En resumen, los cromosomas artificiales de mamífero (MAC) proporcionan un medio para introducir grandes cargas de información genética en la célula en un formato no integrador de replicación autónoma. De forma única entre los MAC, la Expresión de Cromosoma Artificial (ECA) basado en ADN satélite de mamífero puede generarse de forma reproducible de novo en líneas celulares de diferentes especies y purificarse fácilmente de los cromosomas de las células hospedadoras. 10 Las ECA de mamífero purificadas pueden después reintroducirse en una diversidad de líneas celulares receptoras donde se han mantenido de forma estable durante periodos prolongados en ausencia de presión selectivos usando un Sistema de ECA. Usando este enfoque, se ha conseguido la carga específica de uno o dos genes diana en células LMTK(-) y CHO.

Otro método para introducir ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de FVII modificados es una técnica de reemplazo de genes de dos etapas en levadura, que comienza con un genoma de adenovirus completo (Ad2; Ketner et al. (1994) PNAS 91: 6186-6190) clonado en un Cromosoma Artificial de Levadura (YAC) y un plásmido que contiene secuencias de adenovirus para dirigir a una región específica en el clon de YAC, una casete de expresión para el gen de interés y un marcador de selección positivo y negativo. Los YAC son de particular interés porque 20 permiten la incorporación de genes mayores. Este enfoque puede usarse para la construcción de vectores basados en adenovirus que portan ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos de FVII modificados descritos para transferencia génica a células de mamífero o animales completos.

Los ácidos nucleicos pueden encapsularse en un vehículo, tal como un liposoma, o introducirse en una célula, tal 25 como una célula bacteriana, particularmente una bacteria atenuada o introducirse en un vector viral. Por ejemplo, cuando se emplean liposomas, pueden usarse proteínas que se unen a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis para dirigir y/o para facilitar la captación de, por ejemplo proteínas de la cápsida o fragmentos de las mismas que se dirigen a un tipo celular particular, anticuerpos para proteínas que se someten a internalización en ciclos, y proteínas que se dirigen a localización intracelular y potencian la semivida intracelular. 30

Para métodos ex vivo e in vivo, se introducen moléculas de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de FVII modificado en células que son de un donante adecuado o del sujeto a tratar. Las células en las que puede introducirse un ácido nucleico para fines de terapia incluyen, por ejemplo, cualquier tipo celular deseable, disponible, apropiado para la enfermedad o afección a tratar, incluyendo pero sin limitación células epiteliales, células 35 endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos; células sanguíneas tales como linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos, diversas células madre o progenitoras, en particular células madre o progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, tales como células madre obtenidas de médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica, hígado fetal y otras fuentes de las mismas. 40

Para tratamiento ex vivo, se retiran células de un donante compatible con el sujeto a tratar o células del sujeto a tratar, se introduce el ácido nucleico en estas células aisladas y se administran las células modificadas al sujeto. El tratamiento incluye administración directa, tal como, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas, que se implantan en el paciente (véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 4.892.538 y 5.283.187). Las 45 técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico a células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas y lípidos catiónicos (por ejemplo, DOTMA, DOPE y DC-Chol) electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano y métodos de precipitación con fosfato cálcico. Los métodos de suministro de ADN pueden usarse para expresar polipéptidos de FVII modificados in vivo. Dichos métodos incluyen suministro de liposomas de ácidos nucleicos y suministro de ADN desnudo, incluyendo suministro local sistémico tal como usando 50 electroporación, ultrasonidos y suministro por fosfato cálcico. Otras técnicas incluyen microinyección, fusión celular, transferencia génica mediada por cromosomas, transferencia génica mediada por microcélulas y fusión de esferoplastos.

La expresión in vivo de un polipéptido de FVII modificado puede ligarse a la expresión de moléculas adicionales. Por 55 ejemplo, la expresión de un polipéptido de FVII modificado puede ligarse a la expresión de un producto citotóxico tal como en un virus modificado técnicamente o expresado en un virus citotóxico. Dichos virus pueden dirigirse a un tipo celular particular que es una diana para un efecto terapéutico. El polipéptido de FVII modificado expresado puede usarse para potenciar la citotoxicidad del virus.

La expresión in vivo de un polipéptido de FVII modificado puede incluir unida operativamente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de FVII modificado con secuencias reguladoras específicas tales como un promotor específico de célula o específico de tejido. También pueden expresarse polipéptidos de FVII modificados de vectores que infectan específicamente y/o se replican en tipos celulares y/o tejidos diana. Los promotores inducibles pueden usarse para regular selectivamente la expresión de polipéptidos de FVU modificados. Un sistema 65 de expresión regulable ejemplar es el sistema de expresión génica inducible por doxiciclina, que se ha usado para

regular la expresión de FVII recombinante (Srour et al. (2003) Thromb Haemost. 90(3): 398-405).

Pueden administrarse al sujeto moléculas de ácido nucleico, como ácidos nucleicos desnudos o en vectores, cromosomas artificiales, liposomas y otros vehículos mediante administración sistémica, vías de administración tópicas, locales y otras. Cuando sea sistémica e in vivo, la molécula de ácido nucleico o vehículo que contiene la 5 molécula de ácido nucleico puede dirigirse a una célula.

La administración también puede ser directa, tal como mediante administración de un vector o células que se dirigen típicamente a una célula o tejido. Por ejemplo, pueden dirigirse células tumorales y en proliferación a células para expresión in vivo de polipéptidos de FVII modificados. Las células usadas para expresión in vivo de un polipéptido de 10 FVII modificado también incluyen células autólogas para el paciente. Dichas células pueden retirarse de un paciente, introducirse ácidos nucleicos para expresión de un polipéptido de FVII modificado, y después administrarse a un paciente tal como por inyección o injerto.

I. Usos terapéuticos 15

Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse para tratamiento de cualquier afección para la que se emplee FVII recombinante. Típicamente, dichos tratamientos incluyen aquellos donde se desea coagulación aumentada, tal como respuestas hemostáticas aumentadas. Los polipéptidos de FVII tienen actividad terapéutica solos o en combinación con otros agentes. Los polipéptidos modificados proporcionados 20 en el presente documento se diseñan para conservar la actividad terapéutica pero muestran propiedades modificadas, particularmente resistencia aumentada a IRFT, resistencia aumentada a AT-III, actividad catalítica aumentada, semivida aumentada y/o unión y/o afinidad con plaquetas activadas aumentada. Dichas propiedades modificadas, por ejemplo, pueden mejorar la eficacia terapéutica de los polipéptidos debido a la actividad coagulante aumentada de los polipéptidos de FVII modificados. Esta sección proporciona usos ejemplares y métodos de 25 administración. Estas terapias descritas son ejemplares y no limitan las aplicaciones de los polipéptidos de FVII modificados.

Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse en diversos métodos terapéuticos así como de diagnóstico en los que se emplee FVII. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, 30 métodos de tratamiento de afecciones fisiológicas y médicas descritas y enumeradas posteriormente. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden mostrar mejora de las actividades y efectos terapéuticos in vivo en comparación con FVII de tipo silvestre, incluyendo menor dosificación para conseguir el mismo efecto, y otras mejoras en la administración y el tratamiento tales como menos administraciones y/o menos frecuentes, efectos secundarios reducidos y efectos terapéuticos aumentados. Aunque 35 se entiende que los polipéptidos de FVII modificados pueden administrarse como un zimógeno de FVII (es decir forma monocatenaria), típicamente los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento se administran en la forma bicatenaria activada después de, por ejemplo, autoactivación o activación por otros factores de coagulación, tal como durante la purificación.

En particular, se pretende usar los polipéptidos de FVII modificados y métodos terapéuticos en los que se ha usado FVII para el tratamiento. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, métodos de tratamiento de enfermedades y trastornos, tales como, pero sin limitación, trastornos de coagulación de la sangre, trastornos hematológicos, trastornos hemorrágicos, hemofilias, tales como hemofilia A, hemofilia B y deficiencia de factor VII, y trastornos de la sangre adquiridos, tales como deficiencia de factor VII adquirida por enfermedad hepática. Los polipéptidos de FVII 45 modificados también pueden usarse en el tratamiento de enfermedades y trastornos hemorrágicos adicionales, tales como, pero sin limitación, trombocitopenia (por ejemplo, tal como debida a regimenes quimioterapéuticos), enfermedad de Von Willebrand, trastornos de las plaquetas hereditarios (por ejemplo, enfermedad de piscina de almacenamiento tal como síndromes de Chediak-Higashi y Hermansky-Pudlak, disfunción de tromboxano A2, trombastenia de Glanzmann y síndrome de Bernard-Soulier), síndrome hemolítico-urémico, Telangiectasia 50 Hemorrágica Hereditaria, también conocida como síndrome de Rendu-Osler-Weber, púrpura alérgica (púrpura de Henoch Schonlein) y coagulación intravascular diseminada.

En algunas realizaciones, las hemorragias a tratar por polipéptido de FVII aparecen en órganos tales como el cerebro, la región del oído interno, ojos, hígados, pulmón, tejido pulmonar, tracto gastrointestinal. En otras 55 realizaciones, la hemorragia es difusa, tal como en gastritis hemorrágica y sangrado uterino profuso. Los pacientes con trastornos de hemorragia, tales como por ejemplo, hemofilia A y B, tienen con frecuencia riesgo de complicaciones de hemorragia durante la cirugía o traumatismos. Dicha hemorragia puede manifestarse como hemaartrosis aguda (hemorragias en articulaciones), artropatía hemofílica crónica, hematomas (por ejemplo, muscular, retroperitoneal, sublingual y retrofaríngeo), hematuria (sangrado del tracto renal), sangrado del sistema 60 nerviosos central, sangrados gastrointestinales (por ejemplo, sangrados de UGI) y hemorragia cerebral, que también pueden tratarse con polipéptidos de FVII modificados. Adicionalmente, cualquier sangrado asociado con la cirugía (por ejemplo, hepatectomia), o extracción dental puede tratarse con polipéptidos de FVII modificados. En una realización, los polipéptidos de FVII modificados pueden usarse para tratar episodios de sangrado debidos a traumatismo, o cirugía, o recuento o actividad de plaquetas reducidos, en un sujeto. Los métodos ejemplares para 65 pacientes que se someten a cirugía incluyen tratamientos para evitar la hemorragia y tratamientos antes, durante o

después de cirugías tales como, pero sin limitación, cirugía cardiaca, angioplastia, cirugía de pulmón, cirugía abdominal, cirugía espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía dental o cirugía de trasplante de órganos, incluyendo trasplante de médula ósea, corazón, pulmón, páncreas o hígado.

El tratamiento de enfermedades y afecciones con polipéptidos de FVII modificados puede efectuarse por cualquier 5 vía adecuada de administración usando formulaciones adecuadas como se describen en el presente documento incluyendo, pero sin limitación, inyección, administración pulmonar, oral y transdérmica. El tratamiento típicamente se efectúa por administración de bolo intravenoso.

Si es necesario, puede determinarse empíricamente o extrapolarse una dosificación y duración y protocolo de 10 tratamiento particulares. Por ejemplo, pueden usarse dosis ejemplares de polipéptidos de FVII recombinantes y nativos como un punto de partida para determinar las dosificaciones apropiadas. Por ejemplo, se ha administrado un polipéptido de FVII recombinante (rFVIIa) que se ha activado a rFVIIa, Novoseven®, a pacientes con hemofilia A o hemofilia B, que experimentan un episodio de sangrado, a una dosificación de 90 g/kg por infusión de bolo durante 2 a 5 minutos, consiguiendo un nivel en circulación eficaz de al menos 2 g/ml, con una semivida media de 2,7 15 horas. La dosis se repite cada 2 horas hasta que se consigue la hemostasis. Los polipéptidos de FVII modificados que hay tienen una actividad coagulante aumentada, debido a resistencia aumentada a IRFT, resistencia aumentada a AT-III, actividad catalítica aumentada, semivida aumentada y/o unión y/o afinidad con plaquetas activadas aumentada, pueden ser eficaces a cantidades y/o frecuencias de dosificación reducidas en comparación con dicho FVII recombinante. Pueden usarse dosificaciones para polipéptidos de FVII de tipo silvestre o no modificados como 20 una orientación para determinar las dosificaciones para polipéptidos de FVII modificados. Pueden usarse factores tales como el nivel de actividad y semivida del FVII modificado en comparación con el FVII no modificado al realizar dichas determinaciones. Pueden determinarse empíricamente dosificaciones y regimenes particulares.

Los niveles y regimenes de dosificación pueden determinarse basándose en dosificaciones y regimenes conocidos, 25 y, si es necesario, pueden extrapolarse basándose en los cambios en propiedades de los polipéptidos modificados y/o pueden determinarse de forma empírica basándose en una diversidad de factores. Dichos factores incluyen el peso corporal del individuo, la salud general, la edad, la actividad del compuesto específico empleado, el sexo, la dieta, el momento de administración, la tasa de excreción, la combinación farmacológica, la gravedad y la evolución de la enfermedad, y la disposición del paciente a la enfermedad y el criterio del médico tratante. El principio activo, el 30 polipéptido, típicamente se combina con un vehículo farmacéuticamente eficaz. La cantidad de principio activo que puede combinarse con los materiales transportadores para producir una forma de una única dosificación o forma multidosificación puede variar dependiendo del hospedador tratado y el modo particular de administración.

El efecto de los polipéptidos de FVII en el tiempo de coagulación de la sangre puede controlarse usando cualquiera 35 de los ensayos de coagulación conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación, tiempo de protrombina en sangre completa (PT), el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT), el tiempo de coagulación activada (TCA), el tiempo de coagulación activada recalcificada, o el tiempo de Coagulación de Lee-White.

Tras la mejora del estado de un paciente, puede administrarse, si es necesario, una dosis de mantenimiento de un 40 compuesto o composiciones, y pueden modificarse la dosificación, la forma de dosificación, o la frecuencia de administración, o una combinación de las mismas. En algunos casos, un sujeto puede requerir tratamiento intermitente a largo plazo tras cualquier reaparición de síntomas de enfermedad o basándose en las dosificaciones programadas. En otros casos, pueden requerirse administraciones adicionales en respuesta a acontecimientos agudos tales como hemorragia, traumatismo o procedimientos quirúrgicos. 45

Las siguientes son algunas afecciones ejemplares para las que se ha usado FVII (administrado como FVIIa) como un agente de tratamiento solo o en combinación con otros agentes.

1. Trastornos de sangrado congénitos 50

a. Hemofilia

La hemofilia congénita es un trastorno recesivo de la sangre en el que hay niveles reducidos de factores de coagulación en plasma, que conducen a la alteración de la cascada de coagulación y al aumento del tiempo de 55 coagulación sanguínea. La hemofilia A, que representa aproximadamente el 85 % de todos los casos de hemofilia, es el resultado de una mutación o mutaciones en el gen del factor VIII en el cromosoma X, que conduce a una deficiencia o disfunción de la proteína FVIII. La hemofilia B está provocada por una deficiencia o disfunción del factor de coagulación, FIX, generalmente resultante de mutaciones o deleciones puntuales en el gen FIX en el cromosoma X. La incidencia global de la hemofilia A es aproximadamente 1 caso por cada 5000 individuos masculinos, y 1 caso 60 por cada 25000 hombres para hemofilia B. La hemofilia A y B se clasifican adicionalmente como leves, moderadas o graves. Un nivel en plasma con 5 %-25 % de factor VIII o IX con función normal se clasifica como leve, 1 %-5 % es moderada, y menos del 1 % es grave. La hemofilia C, con frecuencia denominada deficiencia de FXI, es una enfermedad relativamente leve y poco habitual, que afecta a aproximadamente 1 de cada 100000 personas de una manera recesiva autosómica. 65

La hemofilia A y B se manifiestan clínicamente de muchas maneras. Los cortes y abrasiones menores no darán como resultado sangrado excesivo, pero los traumatismos y las cirugías sí. El paciente tendrá numerosos sangrados de las articulaciones y los músculos y una fácil aparición de hematomas. La hemaartrosis o sangrado en las articulaciones es una de las principales complicaciones de la hemofilia, y puede aparece espontáneamente o en respuesta a un traumatismo. Las articulaciones en bisagra, tales como la rodilla, el codo y el talón, se ven afectadas 5 más frecuentemente. La cadera y el hombro se ven afectadas mucho menos frecuentemente ya que la articulación de rótula tiene más musculatura en torno a ella, protegiéndola de esta manera más de la lesión. La hemorragia puede provocar dolor agudo grave, restringir el movimiento y conducir a complicaciones secundarias incluyendo hipertrofia sinovial. Además, el sangrado recurrente en las articulaciones puede provocar sinovitis crónica, que puede provocar daño a las articulaciones, destruir el sinovio, el cartílago y el hueso. Las hemorragias con peligro 10 para la vida, tales como hemorragia intracraneal y sangrado del sistema nervioso central, también afectan a sujetos hemofílicos. Se produce sangrado intracraneal en aproximadamente el 10 % de los pacientes con hemofilia grave, dando como resultado una tasa de mortalidad del 30 %. Por el contrario, la Hemofilia C es más leve. Apenas se ven sangrados espontáneos, y el sangrado a las articulaciones, tejidos blandos y músculos también es poco habitual. El sangrado se trata generalmente con transfusión de plasma congelado nuevo (PCN), terapia de reemplazo de FXI o, 15 para tratamiento tópico, tal como tratamiento de heridas externas o extracciones dentales, pegamento de fibrina.

El tratamiento más habitual para hemofilia A o B es terapia de reemplazo, en la que se administra al paciente FVIII o FIX. Las formulaciones están disponibles en el mercado como productos derivados de plasma o recombinantes, siendo actualmente las proteínas recombinantes el tratamiento de elección en pacientes previamente no tratados. 20 Aunque estas terapias pueden ser muy exitosas, surgen complicaciones si el paciente desarrolla inhibidores para el factor VIII o factor IX recién administrado. Los inhibidores son anticuerpos IgG, principalmente de la subclase IgG4, que reaccionan con FVIII o FIX e interfieren con la función procoagulante. Los inhibidores afectan a aproximadamente 1 de cada 5 pacientes con hemofilia A grave. La mayoría de los sujetos desarrollan estos inhibidores poco después de la administración de las primeras infusiones de factor VIII, que son con frecuencia en la 25 infancia temprana, aunque algunos sujetos los desarrollan más tarde. Los inhibidores también afectan a aproximadamente 1 de cada 15 personas con hemofilia A leve o moderada. Estos inhibidores se desarrollan habitualmente durante la adultez y no solamente destruyen FVIII exógeno administrado, sino que también destruyen FVIII endógeno. Como resultado, los hemofílicos leves y moderados se convierten en graves. Clínicamente, los pacientes con hemofilia A con inhibidores se clasifican en pacientes con alta y baja respuesta de acuerdo con la 30 fuerza de la respuesta anamnésica que experimentan cuando se vuelven a exponer a FVIII. Los inhibidores afectan a aproximadamente uno de cada 100 pacientes con hemofilia B. En la mayoría de los casos, los inhibidores se desarrollan después de las primeras infusiones de factor IX terapéutico y pueden estar acompañados de reacciones alérgicas.

Los polipéptidos de FVII modificados presentados en el presente documento pueden usarse para tratar a pacientes con hemofilia, particularmente pacientes con hemofilia con inhibidores. Un producto de FVIIa recombinante (NovoSeven, Novo Nordisk) ha recibido aprobación y licencia para el tratamiento de episodios de sangrado en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores de FVIII o FIX y para la prevención de sangrado en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores para FVIII o FIX. El 40 tratamiento con rFVIIa potencia la generación de trombina evitando al mismo tiempo el requisito de FVIIIa y/o FIXa. La coagulación se inicia en el sitio de lesión por la interacción de rFVIIa con FT, dando como resultado una activación de FX inicial, generación de trombina y activación de plaquetas. Puede efectuarse coagulación completa por rFVIIa por los mecanismos dependientes de FT e independientes de FT, donde parte de la trombina generada puede resultar de la activación directa de FX en plaquetas activadas por rFVIIa solamente, que en sí mismo se une a 45 plaquetas activadas mediante interacciones de baja afinidad con las membranas fosfolipídicas.

Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse en terapias para la hemofilia, incluyendo el tratamiento de episodios de sangrado y la prevención de sangrado en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos. Los polipéptidos de FVII modificados del presente documento proporcionan 50 resistencia aumentada al inhibidor del complejo FT/FVIIa, IRFT, resistencia aumentada a AT-III, actividad catalítica aumentada, semivida aumentada y/o unión y/o afinidad a plaquetas activadas aumentada. Los polipéptidos de FVII pueden por lo tanto presentar mayor actividad coagulante de una manera dependiente de FT (tal como mediante resistencia aumentada a IFRT y/o de una manera independiente de FT (tal como mediante unión y/o afinidad a plaquetas activadas aumentada). Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados pueden usarse para suministrar 55 más terapias activas para la hemofilia. Los ejemplos de mejoras terapéuticas usando polipéptidos de FVII modificados incluyen por ejemplo, pero sin limitación, dosificaciones menores, menos administraciones y/o administraciones menos frecuentes, efectos secundarios reducidos y efectos terapéuticos aumentados.

Los polipéptidos de FVII modificados se administran típicamente como polipéptidos de FVII activados (FVIIa). Los 60 polipéptidos de FVII modificados pueden ensayarse con respecto a eficacia terapéutica, por ejemplo, usando modelos animales. Por ejemplo pueden tratarse ratones hemofílicos inducidos por anticuerpos, o cualquier otro modelo de enfermedad conocido para hemofilia, con polipéptidos de FVII modificados. La progresión de los síntomas y fenotipos de enfermedad se controla para evaluar los efectos de los polipéptidos de FVII modificados. Los polipéptidos de FVII modificados también pueden administrarse a sujetos, tal como en ensayos clínicos, para 65 evaluar la eficacia in vivo en comparación con controles de placebo y/o controles usando FVII no modificado.

b. Deficiencia de FVII

La deficiencia de factor VII es un trastorno recesivo autosómico de sangrado que afecta a aproximadamente 1 de cada 500000 personas. La deficiencia de FVII puede ser clínicamente leve, moderada o grave, caracterizándose la deficiencia de leve a moderada por sangrado aumentado después de cirugía y traumatismo. Los pacientes con 5 deficiencia de FVII grave (menos del 1 % de actividad de FVII) experimentan síntomas similares a la hemofilia. Por ejemplo, los sujetos deficientes en FVII son propensos a sangrados de las articulaciones, sangrados nasales espontáneos, sangrado gastrointestinal, sangrado del tracto urinario. También se han presentado hemorragia intracerebral y sangrados musculares, mientras que las mujeres pueden experimentar menorragia grave (sangrado menstrual abundante). El tratamiento puede efectuarse mediante terapia de reemplazo. Un producto de FVIIa 10 recombinante (NovoSeven®, Novo Nordisk) ha recibido aprobación y licencia para el tratamiento de episodios de sangrado en pacientes con deficiencia de FVII congénita y para la prevención de sangrado en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos en pacientes con deficiencia de FVII congénita. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados del presente documento pueden usarse de forma similar. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse en el tratamiento de episodios de sangrado y la 15 prevención de sangrado en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos en pacientes deficientes en FVII. Por ejemplo, a un paciente neonatal que presente deficiencia de FVII grave con hemorragia intracraneal se le puede administrar polipéptidos de FVII modificados mediante bolo intravenoso para efectuar la coagulación y mantener la hemostasis. En general los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa). 20

c. Otros

Otros trastornos de sangrado pueden tratarse con los polipéptidos de FVII proporcionados en el presente documento para promover la coagulación. Las deficiencias congénitas de factores V y X también presentan tiempos de 25 coagulación sanguínea aumentados y pueden tratarse potencialmente con la administración de dosis terapéuticas de FVII. Por ejemplo, a un paciente con deficiencia de factor X se le puede administrar rFVIIa para controlar el sangrado asociado con la esplenectomía (Boggio et al. (2001) Br J Haematol 112: 1074-1075). Los episodios de sangrado espontáneos y asociados con cirugía asociados con la enfermedad de von Willebrand (EvW) también pueden tratarse usando los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento. La EvW es 30 un trastorno de sangrado provocado por un defecto o una deficiencia de la proteína de coagulación sanguínea, el Factor de von Willebrand (FvW), y se estima que aparece en del 1 % al 2 % de la población. Los sujetos con EvW sufren hematomas fácilmente, tienen sangrados nasales recurrentes, sangran después de la extracción de piezas dentales, amigdalectomía u otra cirugía, y las pacientes mujeres pueden tener sangrado menstrual aumentado. Pueden usarse polipéptidos de FVII modificados para aliviar el sangrado espontáneo y asociado con cirugía en 35 pacientes con EvW (von Depka et al. (2006) Blood Coagul Fibrin 17: 311-316). Otros trastornos de sangrado relacionados con las plaquetas, tales como, por ejemplo, trombastenia de Glanzmann y síndrome de Hermansky-Pudlak también se asocian con actividad de coagulación endógena reducida. El sangrado espontáneo asociado con cirugía en exceso en pacientes con trastornos de sangrado relacionados con plaquetas también puede controlarse mediante dosis terapéuticas de los polipéptidos de FVII modificados. Por ejemplo, un paciente con trombastenia de 40 Glanzmann que se somete a cirugía puede tratarse antes, durante y/o después de la cirugía con los polipéptidos de FVII modificados para evitar una pérdida de sangre importante (van Buuren et al. (2002) Dig Dis Sci 47: 2134-2136). En general, los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).

2. Trastornos de sangrado adquiridos 45

a. Trombocitopenia adquirida por quimioterapia

Los trastornos de sangrado pueden ser adquiridos, en lugar de congénitos. Por ejemplo, el tratamiento con quimioterapia, tal como para la leucemia y otros cánceres, puede dar como resultado trombocitopenia. Esto se debe 50 probablemente a una pérdida de producción de plaquetas en la médula ósea de pacientes que reciben quimioterapia, y típicamente sucede 6-10 días después de la medicación. El tratamiento de la trombocitopenia adquirida es habitualmente mediante transfusión de plaquetas, glóbulos rojos o plasma, que actúa para evitar cualquier sangrado espontáneo anómalo que pueda ser el resultado de la deficiencia en plaquetas. El sangrado en pacientes con trombocitopenia inducida por quimioterapia, o cualquier otra trombocitopenia adquirida o congénita, 55 también puede controlarse por la administración de cantidades terapéuticas de los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, se le puede administrar a un paciente trombocitopénico con sangrado incontrolado, tal como en el tracto gastrointestinal, una inyección de bolo intravenoso de una cantidad terapéutica de polipéptido de FVII para detener la hemorragia (Qerotziafas et al. (2002) Am J Hematol 69: 219-222). En general, los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos FVII activados (FVIIa). 60

b. Otras coagulopatías

Pueden tratarse otras coagulopatías adquiridas usando los polipéptidos de FVII modificados presentados en el presente documento. La coagulopatía puede ser el resultado de afecciones incluyendo, pero sin limitación, 65 insuficiencia hepática fulminante (IHF; tal como provocada por fármacos hepatóxicos, toxinas, enfermedades

metabólicas, enfermedades infecciosas e isquemia), otra enfermedad hepática, incluyendo cirrosis y enfermedad asociada con enfermedad de Wilson, deficiencia de vitamina K (tal como provocada por tratamiento con antibióticos o dieta), síndrome urémico hemolítico, trombocitopenia trombótica (TCT) y coagulopatía intravascular diseminada (CID). El tratamiento convencional es generalmente por transfusión con plasma, glóbulos rojos (RBC), o plaquetas, pero puede no tener éxito. En un ejemplo, los polipéptidos FVII modificados pueden administrarse a un paciente con 5 FHF que se somete a procedimientos invasivos para evitar el sangrado. El tratamiento convencional con plasma congelado nuevo (PCN) con frecuencia no tiene éxito y puede requerir grandes cantidades de plasma, produciendo una sobrecarga de volumen y anasarca (una infiltración generalizada de fluido de edema en el tejido conectivo subcutáneo). El tratamiento con cantidades terapéuticas de polipéptidos de FVII modificados por bolo intravenoso durante, antes y/o después de la cirugía invasiva, tal como por ejemplo, biopsia hepática o trasplante de hígado, 10 puede evitar el sangrado y establecer la hemostasia en pacientes con IHF. Puede controlarse al paciente por PT de la sangre para determinar la eficacia del tratamiento (Shami et al. (2003) Liver Transpl 9: 138-143). En otro ejemplo, pueden administrarse FVII a un paciente con sangrado grave asociado a una coagulopatía, tal como, por ejemplo, sangrado intraabdominal postcesárea grave asociado con disfunción hepática y CID, que no responde a infusiones de transfusiones convencionales (Moscardo et al. (2001) Br J Haematol 113: 174-176). Además, los polipéptidos de 15 FVII modificados pueden usarse para tratar coagulopatías en pacientes neonatales y pediátricos. En un ejemplo particular, los pacientes neonatales y pediátricos no responden al tratamiento convencional, tal como infusión de RBC y plaquetas. Por ejemplo, a neonatos con hemorragia pulmonar grave asociada con PT aumentado que no responden a transfusión de RBC y plaquetas se les puede administrar polipéptidos de FVII modificados para aumentar el PT y establecer la hemostasia (Olomu et al. (2002) J Perinatol 22: 672-674). Los polipéptidos de FVII 20 modificados proporcionados en el presente documento muestran actividad de coagulación potenciada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados, y por lo tanto pueden administrarse, por ejemplo, a dosis menores, menos frecuentemente y con menos reacciones adversas. En general los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).

c. Sangrado adquirido por trasplante

El sangrado grave después de trasplante de médula ósea (TMO) y trasplante de células madre (TCM) es una complicación relativamente común y con peligro para la vida asociada a estos procedimientos, debido a la reducción de plaquetas. Por ejemplo, la hemorragia alveolar difusa (HAD) es una complicación pulmonar de TMO con una 30 incidencia estimada del 1-21 % en la población trasplantada, y con una tasa de mortalidad del 60-100 %. El tratamiento convencional de dichos episodios de sangrado incluye tratamiento con corticoesteroides y transfusión con plasma, plaquetas y/o RBC, aunque estos generalmente no son exitosos, con una tasa de mortalidad general de aproximadamente el 50 % (Hicks et al. (2002) Bone Marrow Transpl 30: 975-978). La administración de FVII por bolo intravenoso, con o sin tratamiento simultáneo con corticoesteroides y/o infusión de plaquetas, puede realizarse para 35 tratar la HAD y establecer la hemostasia (Hicks et al. (2002) Bone Marrow Transpl 30: 975-978). Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento muestran actividad de coagulación potenciada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados, y podrían por lo tanto administrarse, por ejemplo, a dosis menores, menos frecuentemente, durante una duración de tratamiento más corta y con menos reacciones adversas para la misma actividad y eficacia biológicas. En general los polipéptidos de FVII modificados se administran como 40 polipéptidos de FVII activados (FVIIa).

d. Sangrado inducido por terapia anticoagulante

Los pacientes que se someten a terapias anticoagulantes para el tratamiento de afecciones, tales como la 45 tromboembolia, pueden mostrar episodios de sangrado tras la administración aguda de anticoagulantes, tales como warfarina, heparina y fondaparinux, o desarrollan trastornos hemorrágicos como resultado del uso a largo plazo de dichas terapias. Los tratamientos para episodios de sangrado incluyen típicamente la administración de procoagulantes, tales como vitamina K, plasma, FIX exógeno y protaminas para neutralizar la heparina. La administración de FVII exógeno también puede realizarse para neutralizar el efecto de los anticoagulantes, aumentar 50 el PT, aPTT y/u otros marcadores de coagulación y establecer la hemostasia (Deveras et al. (2002) Ann Inten Med 137: 884-888). Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse en tratamientos para controlar los episodios de sangrado en pacientes con trastornos de sangrado adquiridos debido a tratamientos con anticoagulantes. En general los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa). 55

e. Hemofilia adquirida

Pueden desarrollarse espontáneamente inhibidores del factor VIII en individuos por lo demás sanos, dando como resultado una afección conocida como “hemofilia adquirida”. La hemofilia adquirida es una afección poco habitual, 60 con una incidencia anual de 0,2-1,0 por millón de población. Los autoanticuerpos son principalmente anticuerpos de IgG4 que, cuando se unen con FVIII, inhiben la actividad de FVIII interfiriendo con la escisión de trombina, la interacción con el factor de von Willebrand y/o la unión a fosfolípidos. Esto da como resultado hemorragia con peligro para la vida en aproximadamente el 87 % de los pacientes afectados. Son sitios comunes de sangrado la piel, mucosa, músculos y retroperitoneo, a diferencia de pacientes con hemofilia hereditaria que sangran 65 predominantemente en articulaciones y músculos. La hemofilia adquirida puede tratarse con un concentrado de

complejo de protrombina activada o factor VII activado recombinante (NovoSeven®, Novo Nordisk) para controlar los episodios de hemorragia. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento muestran actividad de coagulación potenciada en comparación con polipéptidos FVII no modificados, y pueden por lo tanto administrarse, por ejemplo, a dosis menores, menos frecuentemente, durante una duración del tratamiento más corta y con menos reacciones adversas para la misma actividad y eficacia biológicas. En general los polipéptidos de 5 FVIII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).

3. Sangrado por traumatismo y quirúrgico

Pueden usarse polipéptidos de FVII como terapia para tratar el sangrado asociado con la pérdida de sangre 10 perioperatoria y traumática en sujetos con sistemas de coagulación normales. Por ejemplo, pueden administrarse polipéptidos de FVII a un paciente para promover la coagulación y reducir la pérdida de sangre asociada con la cirugía y, además, reducir la necesidad de transfusión sanguínea. En un ejemplo, pueden administrarse polipéptidos de FVII a sujetos que se someten a prostatectomía retropúbica. La postatectomía retropúbica se asocia con frecuencia con una pérdida de sangre importante y una necesidad posterior de transfusión. A los sujetos que se 15 someten a dicha cirugía o a una similar se les puede proporcionar un bolo intravenoso de una cantidad terapéutica de FVII en la fase operatoria temprana para reducir la pérdida de sangre perioperatoria potenciando la coagulación en el sitio de cirugía. La reducción de la pérdida de sangre da como resultado la eliminación de la necesidad de transfusión sanguínea en estos pacientes (Friederich et al. (2003) Lancet 361: 201-205). Los polipéptidos de FVII pueden administrarse a pacientes con coagulación normal que se someten a otros tipos de cirugía para efectuar 20 hemostasia rápida y evitar la pérdida de sangre. Los ejemplos no limitantes de procedimientos quirúrgicos en los que pueden usarse FVII, típicamente administrado en forma activada (es decir FVIIa), en una terapia para reducir el sangrado perioperatorio incluyen, pero sin limitación, cirugía de válvula cardiaca (Al Douri et al. (2000) Blood Coag Fibrinol 11: S121-S127), reemplazo de válvula aórtica (Kastrup et al. (2002) Ann Thorac Surg 74: 910-912), resección de hemangiopericitoma recurrente (Gerlach et al. (2002) J Neurosurg 96: 946-948), cirugía de cáncer 25 (Sajdak et al. (2002) Eur J Gynaecol Oncol 23: 325-326) y cirugía de úlceras duodenales (Vlot et al. (2000) Am J Med 108: 421-423). El tratamiento con FVII pueden promover la hemostasia en el sitio de cirugía y reducir o prevenir la pérdida de sangre, reduciendo o anulando de esta manera la necesidad de transfusión. Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento se diseñan para mostrar actividad de coagulación potenciada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados, y podrían por lo tanto administrarse, por ejemplo, a dosis 30 menores, con menos frecuencia y con menos reacciones adversas. En general los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).

Los polipéptidos del factor VII también pueden usarse para promover la coagulación y evitar la pérdida de sangre en sujetos con lesión traumática. El traumatismo se define como una lesión en tejido vivo por un agente extrínseco, y es 35 la cuarta causa principal de muerte en los Estados Unidos. El traumatismo se clasifica como traumatismo cerrado (que da como resultado compresión interna, daño a los órganos y hemorragia interna) o traumatismo penetrante (una consecuencia de un agente que penetra en el cuerpo y destruye tejido, vasos y órganos, dando como resultado hemorragia externa). El traumatismo puede estar provocado por varios acontecimientos incluyendo, pero sin limitación, accidentes de vehículos (que provocan traumatismo cerrado y/o penetrante), heridas de bala (que 40 provocan traumatismo penetrante), heridas de arma blanca (que provocan traumatismo penetrante), accidentes de maquinaria (que provocan traumatismo penetrante y/o cerrado) y caídas desde alturas significativas (que provocan traumatismo penetrante y/o cerrado). La hemorragia incontrolada como resultado de traumatismo es responsable de la mayoría de la mortalidad asociada. La coagulopatía difusa es una complicación relativamente común asociada con pacientes con traumatismo, que aparece en hasta el 25-36 % de los sujetos. La coagulopatía puede 45 desarrollarse pronto después de la lesión, como resultado de una diversidad de factores tales como dilución y consumo de factores de coagulación y plaquetas, fibrinolisis, acidosis e hipotermia. El control convencional implica terapia de reemplazo mediante transfusión de plasma congelado nuevo (PCN), plaquetas, RBC y/o crioprecipitado, corrección de la acidosis y tratamiento de la hipotermia. Estas etapas son con frecuencia insuficientes para detener el sangrado y evitar la muerte. El tratamiento mediante administración de cantidades terapéuticas de FVII puede 50 promover la coagulación y reducir la pérdida de sangre en pacientes con traumatismo. Por ejemplo, a un paciente con una herida de bala que presenta sangrado masivo, además de la intervención quirúrgica, se le puede administrar FVII para controlar el sangrado coagulopático (Kenet et al. (1999) Lancet 354: 1879). La terapia coagulante con FVII puede reducir eficazmente la pérdida de sangre y la hemorragia en pacientes con traumatismo cerrado y penetrante (Rizoli et al. (2006) Crit Care 10: R178). Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados 55 en el presente documento se diseñan para mostrar actividad de coagulación potenciada en comparación con polipéptidos de FVII no modificados y podrían por lo tanto administrarse, por ejemplo, a dosis menores, menos frecuentemente y con menos reacciones adversas. En general los polipéptidos de FVII modificados se administran como polipéptidos de FVII activados (FVIIa).

J. Terapias de combinación

Cualquiera de los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento puede administrarse en combinación con, antes de, intermitentemente con, o después de, otros agentes terapéuticos o procedimientos incluyendo, pero sin limitación, otros productos biológicos, compuestos de moléculas pequeñas y cirugía. Para 65 cualquier enfermedad o afección, incluyendo todas las ejemplificadas anteriormente, para las que se está indicado o

se ha usado FVII (incluyendo FVIIa y rFVIIa) y para las que están disponibles otros agentes y tratamientos, puede usarse FVII en combinación con los mismos. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden usarse de forma similar. Dependiendo de la enfermedad o afección a tratar, las combinaciones ejemplares incluyen, pero sin limitación, combinación con otros factores de coagulación purificados o recombinantes del plasma, procoagulantes, tales como vitamina K, derivado de vitamina K e inhibidores de proteína 5 C, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y corticoesteroides.

K. Artículos de fabricación y kits

Los compuestos farmacéuticos de polipéptidos de FVII modificados o ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de 10 FVII modificados, o un derivado o una parte biológicamente activa de los mismos pueden envasarse como artículos de fabricación que contienen material de envasado, una composición farmacéutica que es eficaz para tratar una enfermedad o trastorno hemostático, y una etiqueta que indica que el polipéptido de FVII modificado o la molécula de ácido nucleico va a usarse para tratar una enfermedad o un trastorno hemostático.

Los artículos de fabricación proporcionados en el presente documento contienen materiales de envasado. Los materiales de envasado para su uso en el envasado de productos farmacéuticos se conoce bien por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 5.323.907, 5.052.558 y 5.033.352. Los ejemplos de materiales de envasado farmacéuticos incluyen, pero sin limitación, envases de blister, frascos, tubos, inhaladores, bombas, bolsas, viales, recipientes, jeringas, frascos, y cualquier material de envasado adecuado para una 20 formulación seleccionada y modo previsto de administración y tratamiento. Se contempla una amplia serie de formulaciones de los compuestos y composiciones proporcionados en el presente documento así como una diversidad de tratamientos para cualquier enfermedad o trastorno hemostático.

También pueden proporcionarse polipéptidos de FVII modificados y moléculas de ácido nucleico en forma de kits. 25 Los kits pueden incluir una composición farmacéutica descrita en el presente documento y un artículo para administración. Por ejemplo, un FVII modificado puede proporcionarse con un dispositivo para administración, tal como una jeringa, un inhalador, una vaso de dosificación, un cuentagotas o un aplicador. El kit puede, opcionalmente, incluir instrucciones para aplicación incluyendo dosificaciones, regimenes de dosificación e instrucciones para modos de administración. Los kits también pueden incluir una composición farmacéutica descrita 30 en el presente documento y un artículo para diagnóstico. Por ejemplo, dichos kits pueden incluir un artículo para medir la concentración, cantidad o actividad de FVII o un sistema regulador de FVII de un sujeto.

Los siguientes ejemplos se incluyen solamente para fines ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la invención. 35

L. Ejemplos

Ejemplo 1

Generación por ordenador de variantes de factor VII con resistencia aumentada a IRFT

A. Modelado de la interacción entre el factor VII e IRFT

Se realizó un modelado por ordenador de la interacción entre el factor VII y su inhibidor natural, el primer dominio 45 Kunitz (K1) en el Inhibidor de la Ruta del Factor Tisular (IRFT)-1 (IRFT-1 K1) para determinar los restos de aminoácidos de contacto en la interfaz del sitio de interacción. Se usó información públicamente disponible del banco de datos de proteínas (rcsb.org/pdb/) para crear el modelo de homología. No se ha resuelto aún ni la estructura cristalina de IRFT-1 K1 solo, ni del complejo cuaternario entre FT/FVIIa/IRFT-1/FXa. En su lugar, se realizó modelado por ordenador usando la estructura cristalina de 2,1 Å del complejo ternario entre FT, FVII y la 50 variante 5L15 del inhibidor de tripsina pancreática bovina (ITPB5L15; código PDB 1FAK_1) como un modelo de partida para el proceso, seguido de información acerca de la estructura cristalina del complejo de tripsina/IRFT-2 (Figura 6). ITPB5L15 es una serina proteasa de tipo dominio Kunitz, y presenta homología con IRFT-1 e IRFT-2. El primer dominio Kunitz (K1) de ITPB5L15 (SEC ID Nº: 106) presenta un 45 % de identidad de secuencia primaria en el primer dominio Kunitz (K1) (Figura 5). Las coordenadas para la estructura cristalina de IRFT-2 K1 se extrajeron del 55 archivo de base de datos del programa (pdb) 1TFX del banco de datos de proteínas, que representa la estructura cristalina del complejo de tripsina/IRFT-2. Se alinearon las coordenadas del IRFT-2 K1 en las coordenadas tridimensionales de ITPB5L15 de la estructura cristalina de FT/FVIIA/ITPB5L15 (archivo pdb 1FAK1) usando un programa de alineamiento de cadena principal de c- de cuerpo rígido en el paquete de software PyMol (pymol.sourceforge.net/). El análisis del ajuste de IRFT-2 K1 en el modelo por medición del solapamiento dio como 60 resultado una desviación cuadrática media (DCM) de menos de 1 Å. Esto indicó un alineamiento preciso entre las dos estructuras, y la generación de un modelo fiable de un complejo de FVII en IRFT-2 K1.

Se identificaron las cadenas laterales en IRFT-2 K1 que se demostró mediante el modelo que estaban en contacto estrecho con la superficie de FVII y se mutaron por ordenador que correspondiesen con las cadenas laterales 65 presentes en IRFT-1 K1. Los resultados de este análisis revelaron una complementariedad electroestática entre el

Factor VII e IRFT-1 K1 en varios restos directamente adyacentes al sitio activo (es decir restos de 2ª esfera). Los restos en FVII implicados en la interacción con IRFT-1 K1 basados en el análisis de homología anterior son D60, K60a, K60c, T99, R147 y K192 por numeración con quimiotripsina, que corresponde a D196, K197, K199, T239, R290 y K341, respectivamente, por numeración de FVII maduro (Figura 7). El examen de la interacción modelada indicó que el resto de glicina en la posición 97 por numeración con quimiotripsina (G97), que corresponde a G237 5 por numeración de FVII maduro, está muy próximo a los restos de contacto. La modificación en esta posición podría dar como resultado impedimento estérico que alteraría la interacción de FVII con IRFT.

B. Mutación por ordenador del factor VII para proporcionar resistencia aumentada a IRFT-1 K1

Se identificaron restos de aminoácidos situados en o cerca de la interfaz de la interacción de FVII/IRFT-1 K1 como se ha descrito anteriormente. Se diseñaron variantes de FVII con cambios de aminoácidos que a) reemplazaban los contactos electroestáticos entre FVII e IRFT-1 con contactos carga-carga repulsivos y/o b) niegan los contactos electroestáticos positivos por reemplazo de los restos con carga en FVII con un resto neutro y/o c) provocan impedimento estérico por reemplazo de un resto que contiene una cadena lateral pequeña con restos que contienen 15 cadenas laterales mayores. Se enumeran variantes ejemplares en la Tabla 9.

Tabla 9. Variantes del factor VII ejemplares

Variante (numeración de FVII maduro): Variante (numeración de Quimiotripsina) ID SEC ID Nº de Polipéptido variante

D196K: D60K CB554

D196R: D60R CB555

D196A: D60A CB556

D196Y: D60Y CB601

D196F: D60F CB600

D196W: D60W CB602

D196L: D60L CB603

D196I: D60I CB604

K197Y: K60aY CB561

K197A: K60aA CB559

K197E: K60aE CB558

K197D: K60aD CB557

K197L: K60aL CB560

K197M: K60aM CB599

K197I: K60aI CB595

K197V: K60aV CB596

K197F: K60aF CB597

K197W: K60aW CB598

K199A: K60cA CB564

K199D: K60cD CB562

K199E: K60cE CB563

G237W: G97W CB605

G237T: G97T CB606

G237I: G97I CB607

G237V: G97V CB608

T239A: T99A CB565

R290A: R147A CB568

R290E: R147E CB567

R290D: R147D CB566

K341E: K192E

K341R: K192R CB569

K341Q: K192Q CB609

D196R/R290E: D60R/R147E CB579

D196K/R290E: D60K/R147E CB580

D196R/R290D: D60R/R147D CB581

D196R/K197E/K199E: D60R/K60aE/K60cE CB586

D196K/K197E/K199E: D60K/K60aE/K60cE CB587

D196R/K197E/ K199E/R290E: D60R/K60aE/K60cE/R147E CB588

D196R/K197M/ K199E: D60R/K60aM/K60cE CB589

D196R/K197M/ K199E/R290E: D60R/K60aM/K60cE/R147E CB590

D196K/K197L: D60K/K60aL CB610

D196F/K197L: D60F/K60aL CB612

D196L/K197L: D60L/K60aL CB611

D196M/K197L: D60M/K60aL CB613

D196W/K197L: D60W/K60aL CB614

D196F/K197E: D60F/K60aE CB615

D196W/K197E: D60W/K60aE CB616

D196V/K197E: D60V/K60aE CB617

Ejemplo 2

Clonación y expresión de FVII

A. Clonación de FVII

Los nucleótidos que codifican el polipéptido precursor de isoforma de FVII humano de 466 aminoácidos (P08709; expuesto en SEC ID Nº: 1) se clonaron en el vector de expresión de mamíferos, pCMV Script (Stratagene; SEC ID Nº: 151), que contiene un promotor de citomegalovirus (CMV). En resumen, los oligonucleótidos CBO-125 (SEC ID 10 Nº: 152) y CBO-126 (SEC ID Nº: 153) se usaron como cebadores directo e inverso, respectivamente, para amplificar la secuencia de FVII por PCR usando ADNc de FVII humano (Invitrogen) como el molde. El cebador CBO-125 contenía un sitio de restricción BamHI (en negrita), una secuencia de Kozak (doble subrayado), seguido de 18 nucleótidos con homología con el extremo 5’ de la secuencia de ADNc de FVII (subrayada), incluyendo el codón de inicio ATG. El cebador CBO-126 contenía un sitio de restricción EcoRI (en negrita), un codón de terminación (doble 15 subrayado) y 21 nucleótidos con homología con el extremo 3’ de la secuencia de ADNc de FVII (subrayada).

Cebador directo CBO-125

5’ gcatcatgacgtgacggatccgccaccatggtctcccaggccctc 3’

Cebador inverso CBO-126

5’ gatcgtacgatacgtgaattcctagggaaatggggctcgcaggag 3’

Se usaron condiciones de termociclación y reacciones de PCR convencionales junto con el kit de PCR KoD HiFi (EMD Biosciences), según lo recomendado por el fabricante. El producto de PCR se digirió con enzimas de 25 restricción BamH I y EcoR I y se ligaron en los sitios de restricción BamH I y EcoR I del vector pCMV Script usando

técnicas moleculares convencionales. El vector se transformó después en Escherechia coli. Se cultivaron colonias seleccionadas y se recogieron células bacterianas para purificación del plásmido usando técnicas de biología molecular rutinarias.

B. Generación de variantes de FVII 5

Se generaron variantes de FVII usando el kit de Mutagénesis Dirigida QuikChange II XL (Stratagene) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con oligonucleótidos diseñados específicamente que actuaron como cebadores que incorporaban una mutación particular en ADN de nueva síntesis. El método QuikChange implica la amplificación lineal de ADN molde por la ADN polimerasa de alta fidelidad PfuUltra. Se extendieron cebadores complementarios 10 que incluían la mutación deseada durante la ciclación usando el vector pCMV Script superenrollado bicatenario, purificado, que contenía la secuencia de ADNc de FVII clonada como un molde. La extensión de los cebadores dio como resultado la incorporación de la mutación de interés en las cadenas de nueva síntesis, y dio como resultado un plásmido mutado con muescas escalonadas. Después de la amplificación, el ácido nucleico se trató con Dpn I, que digiere las cadenas parentales dam metiladas del vector pCMV Script derivado de E. coli. Esto dio como resultado la 15 “selección” de los plásmidos mutados de nueva síntesis, que no estaban metilados. El ADN de vector que contenía la mutación o las mutaciones deseadas se transformó en células E. coli ultracompetentes XL10-Gold, donde la ligasa bacteriana reparó las muescas y permitió que se produjera replicación normal.

Se realizaron variantes de FVII con sustituciones de aminoácidos individuales dirigiéndose a las posiciones D196, 20 K197, K199, G237, T239, R290 y K341, por numeración de FVII maduro (correspondiente a D60, K60a, K60c, G97, T99, R147 y K192 por numeración de quimiotripsina). También se generaron variantes de FVII y múltiples mutaciones en las posiciones D196, K197 y K199, o mutaciones en las posiciones D196 y K197; las secuencias de nucleótidos de uno de los oligonucleótidos de cada par de cebadores complementarios usado para generar las variantes de FVII se proporcionan en la Tabla 10. La secuencia de tipo silvestre correspondiente también se muestra 25 para comparación. La secuencia de 3 pares de bases que codifica el aminoácido sustituido se muestra en negrita. Por ejemplo, para generar una variante de FVII que contiene la sustitución D196K (D60K por numeración de quimiotripsina; CB554, SEC ID Nº: 18), se usó el oligonucleótido CBO-157 D60K, y un oligonucleótido que es complementario de CBO-157 D60K, con el kit de Mutagénesis Dirigida QuickChange II XL para reemplazar una secuencia de tipo silvestre de 3 pares de bases “gac” con una secuencia de 3 pares de bases “aag”. El vector 30 mutado que codifica un polipéptido variante de FVII que contiene una sustitución D196K, se transformó después en células E. coli ultracompetentes XL10-Gold.

C. Expresión de polipéptidos de FVII

Para el análisis de expresión inicial por ELISA y Transferencia de Western, se expresaron polipéptidos de FVII en células BHK-21. Para ensayos bioquímicos, tales como los descritos posteriormente, los polipéptidos de FVII se expresaron en células FreestyleTM 293-F (Invitrogen). 5

El polipéptido del Factor VII de tipo silvestre (CB553-02, SEC ID Nº: 3) y polipéptidos de FVII variantes se expresaron inicialmente en la línea celular de riñón de cría de hámster BHK-21 (ATCC CRL 1632). Las células BHK-21 se cultivaron en medio diferencial mínimo de Eagle (EMEM, Invitrogen) con suero de ternero fetal (FCS) al 10 % en placas de cultivo de 100 mm a 37 ºC y CO2 al 5 %. Después de cultivar hasta aproximadamente el 90 % de 10 confluencia, las células se transfectaron con 24 g de ADN plasmídico de FVII usando el kit de Lipofectamina 2000 (Invitrogen) como se instruyó por el fabricante. El medio se reemplazó 6 horas después de la transfección con EMEM sin suero que contenía vitamina K1 1 g/ml (Sigma) y las células se incubaron durante 72 horas adicionales. La expresión de FVII en el medio de cultivo celular se ensayó por ELISA o Transferencia de Western.

Para análisis posterior usando ensayos bioquímicos, el polipéptido de Factor VII de tipo silvestre (CB553-02, SEC ID Nº: 3) y polipéptidos de FVII variantes se expresaron en células Freestyle™ 293-F (Invitrogen). Las células se cultivaron en medio Freestyle™ 293 (Invitrogen) a 37 ºC y CO2 al 8 % en matraces Erlenmeyer con tapones ventilados. Las células se transfectaron usando el protocolo sugerido por el fabricante. En resumen, después de cultivar hasta 1 x 106 células/ml, las células se centrifugaron y se cambió el medio. Las células se transfectaron 20 después con 240 g de ADN plasmídico de FVII por cada 240 ml de células usando 293fectin (Invitrogen). Además, se añadieron 50 l de una reserva de Vitamina Vitamin K1 (Sigma) 1 mg/ml en etanol por cada 240 ml de células. Las células se cultivaron durante 5 días, después se recogió el sobrenadante de cultivo. La expresión de FVII en el medio de cultivo celular se ensayó por ELISA.

1. ELISA

Se usó un inmunoensayo para cuantificar la cantidad de FVII y FVIIa humano en una muestra. Se usaron anticuerpos policlonales para FVII humano para capturar y detectar la proteasa en la solución. El inmunoensayo puede usarse para determinar la concentración de proteínas de medio acondicionado o una reserva purificada o 30 para determinar la concentración de FVII en otra muestra, por ejemplo, una muestra de plasma humano o de ratón. La concentración inicial de FVII en sangre humana es de aproximadamente 50 nM y la de la forma enzimáticamente activa, FVIIa, es de aproximadamente 1 nM.

Para determinar la cantidad de proteína FVII o FVIIa humana en muestras se realizó un ELISA de tipo sándwich. Se 35 recubrieron inmunoplacas Maxisorp de fondo plano de noventa y seis pocillos (Nunc) con 100 l/pocillo de avidina 5 ng/l (NeutrAvidin, Pierce Biotech.). Las placas se cubrieron y se incubaron con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) seguido de lavado cuatro veces en PBS con Tween-20 0,01 (PBST). Las placas se bloquearon durante un mínimo de 1 hora a TA con agitación por incubación con albúmina de suero bovino al 1 % (BSA) (p/v) en PBS añadido a cada pocillo a 200 l/pocillo. Las placas bloqueadas se almacenaron después a 4 ºC 40 hasta su uso (hasta 2 semanas).

Antes de su uso, las placas se lavaron cuatro veces en PBST para retirar la BSA, y se añadieron 100 l/pocillo de una solución de 1 ng/l de anticuerpo anti Factor VII biotinilado (R&D Systems) a cada pocillo y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 45 minutos con agitación para permitir la formación de complejos con la avidina 45 extendida. El exceso de anticuerpo no unido se retiró por lavado de la placa con PBST (cuatro veces).

Se añadieron diluciones dobles en serie de un patrón de FVII (American Diagnostica; diluido en PBST), que variaba de 50 ng/l a 0,8 ng/l, a la placa a 100 l/pocillo. Se incluyó también un pocillo que contenía PBST sin ningún FVII como un control solo de tampón. Para ensayar las muestras purificadas (antes y después de la activación, véase 50 Ejemplo 3) de FVII o FVIIa, la muestra se diluyó en primer lugar a 1:25 en PBST, y después se realizaron diluciones dobles en serie de modo que se ensayaron diluciones 25 veces, 50 veces, 100 veces y 200 veces. Las muestras diluidas se añadieron a los pocillos por duplicado a 100 l/pocillo. Para ensayar muestras de plasma que contenían FVII o FVIIa, la muestra de plasma se diluyó a 1:100 y a 1:400 en PBST y se añadió a los pocillos por duplicado a 100 l/pocillo. También se incluyó una muestra de plasma sin FVII o FVIIa para determinar los niveles de fondo. Las 55 placas se incubaron después durante 30 minutos a TA con agitación para permitir que cualquier FVII o FVIIa en la muestra formara complejo con el anticuerpo anti-FVII.

Después de la incubación con la muestra, las placas se lavaron 4 veces con PBST. Se diluyó un anticuerpo secundario, Equino anti FVII humano (American Diagnostica), 1:5000 en PBST y se añadió a cada pocillo a un 60 volumen de 100 l. Las placas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación para permitir que el anticuerpo añadido se uniera con el FVII o complejos de FVII en la placa. Para retirar el exceso de anticuerpo secundario, las placas se lavaron con PBST (4 veces). Para detectar el anticuerpo secundario unido, se añadieron 100 l de conjugado de anticuerpo de cabra anti equino y HRP a una dilución 1:5000 en PBST a cada pocillo. Después de incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación, las placas se lavaron cuatro veces 65

con PBST y se añadieron 100 l/pocillo de una solución que contenía una mezcla 1:1 de sustrato TMB y solución de peróxido de hidrógeno (Pierce Biotech). Las placas se agitaron durante aproximadamente 1 minuto a temperatura ambiente antes de la adición de 100 l/pocillo de H2SO4 2 M para detener la reacción. La densidad óptica a 450 nm se midió usando un lector de Placas M5 de Molecular Device y el valor de fondo para la placa (medido con PBST solo) se restó del valor medido de cada pocillo. Se generó una curva patrón representando la concentración de los 5 patrones de FVII frente a la absorbancia. Típicamente, se generó un intervalo de curva patrón de aproximadamente 0,2 - 50 ng/ml en las condiciones de ELISA anteriores. Después se determinó la concentración de cada muestra usando la curva patrón y multiplicando por el factor de dilución, y se presentó un promedio y una desviación típica.

2. Transferencia de Western 10

La expresión de FVII en medio de cultivo celular también se ensayó por transferencia de Western. Las alícuotas que contenían la muestra no diluida, o dos diluciones dobles en serie en PBS, del medio de cultivo celular de células BHK-21 transfectadas con FVII se etiquetaron como Conc. 1 (no diluido), Conc. 2 (diluido doble) y Conc. 3 (diluido cuádruple). Las muestras se cargaron en un gel de SDS page junto a 10, 25 y 50 nanogramos de rFVII purificado en 15 plasma de control (American Diagnostica, CB553-01). Se detectó la proteína FVII producida por células BHK-21 por transferencia de Western usando un anticuerpo primario policlonal equino anti FVII (American Diagnostica; usado a la concentración sugerida por el fabricante) y un anticuerpo secundario anti IgG equino conjugado con HRP (una dilución 1:2000 de solución 1 mg/ml de Zymed Laboratories). Se realizó la comparación de los niveles de expresión con el rFVII purificado en plasma de control. Los resultados muestran que estaban presentes concentraciones que 20 variaban de aproximadamente 20 ng a más de 50 ng de FVII en las alícuotas de cultivo celular.

Ejemplo 3

Purificación y activación de polipéptidos de FVII 25

Se purificaron polipéptidos de FVII usando una columna de Q Sepharose Fast Flow (XK16), a la que se adsorberán polipéptidos de FVII con dominios Gla funcionales, seguido de una etapa de elución con calcio. Se diluyó 2 veces un volumen de 240 ml de sobrenadante de cultivo de las células FreestyleTM 293-F transfectadas con una solución que contenía Tris 20 mM pH 8,0 y Tween 20 0,01 %, y después se añadieron 1,5 ml de EDTA 500 mM pH 8,0 a la 30 muestra diluida. Las muestras se filtraron antes de cargarse en una columna de Q Sepharose Fast Flow (XK16) que se había preequilibrado en primer lugar con Tampón B (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 1 M, Tween 20 0,01 %), y después con Tampón A (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 0,15 M, Tween 20 0,01 %) a 8 ml/min. Después de cargarse, la columna se lavó con Tampón A hasta que la absorbancia del flujo continuo a 280 nm alcanzó una línea basal. El Tampón A se reemplazó co Tampón C (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 0,15 M, Tween 20 0,01 %, CaCl2 5 mM) y se realizó un lavado de 35 bomba para reemplazar completamente el tampón en las líneas. Después de completar el lavado de bomba, se aplicó Tampón C a la columna a 8 ml/min para eluir los polipéptidos de FVII, que se recogieron en fracciones de 5 ml durante 60 minutos. Después de la elución, la columna se lavó con Tampón B mientras que aún se recogían fracciones, hasta que se retiró por lavado el pigmento rosa (de medio de cultivo) de la columna. La columna se lavó después con Tampón A para prepararla para la purificación de FVII de la siguiente muestra. 40

Las fracciones eluídas se purificaron adicionalmente usando una columna Mono Q 5/5 (que contenía 1 ml de resina), que se preequilibró inicialmente con Tampón B, y después con tampón A, a 2 ml/min. Las fracciones 5ª a 8ª de 5 ml recogidas con el tampón C anterior se agruparon y se diluyeron 2 veces con Tampón A, antes de añadirse 1,6 ml de EDTA 500 mM. Se tomaron opcionalmente alícuotas pequeñas (100 l) en este punto para su análisis, tal como por 45 ELISA. La muestra combinada se cargó en la columna de Mono Q a 2 ml/min, y después se lavó con Tampón A. Para eluir los polipéptidos de FVII unidos, se procesó un gradiente de 0 % a 30 % de Tampón B a través de la columna durante un periodo de 20 minutos, a 1 ml/min, y se recogieron fracciones de 0,5 ml. La columna se lavó después con Tampón B seguido de Tampón A en preparación de la purificación de FVII de la siguiente muestra.

Se activaron polipéptidos de FVII purificados a FVIIa usando Factor Xa biotinilado del Kit de Escisión y Retirada del Factor Xa con Proteasa de Restricción (Roche). Típicamente, se agruparon 7 fracciones de la purificación de Mono Q en un tubo cónico de 15 ml y se añadieron 388 l de CaCl2 500 mM, 38,9 l de BSA 10 % en agua destilada, y 3,2 g de Factor Xa biotinilado. Después de la incubación durante 14-16 horas a 37 ºC, se añadieron 250 l de Avidina Inmovilizada (Pierce) y la muestra se mezcló a 4 ºC durante 30 minutos. La solución resultante se filtró después a 55 través de una columna Econo-pak (Bio-Rad), y el filtrado se mezcló con otros 250 l de Avidina inmovilizada durante 30 minutos adicionales. La solución se filtró de nuevo y el filtrado se concentró a aproximadamente 300-500 l usando un filtro de centrífuga de 10 kDa Amicon Ultra-4 (Millipore). La concentración de FVIIa se analizó después por ELISA (como se ha descrito en el Ejemplo 2.C.1) y el nivel de activación del Factor VII se supervisó por transferencia de Western. La transferencia de Western se realizó esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 60 2.C.2, pero usando en su lugar anticuerpo de conejo anti Factor VIIa humano (Haematologic Technologies, Inc.) a 1:2000 durante 1 h como anticuerpo primario, seguido de anticuerpo de cabra Anti IgG de Conejo-HRP (H+L) (Invitrogen) a 1:5000 durante 30 minutos.

Ejemplo 4

Determinación de la constante cinética de Michaelis Menten de la actividad amidolítica de FVIIa en un sustrato de molécula pequeña.

La actividad amidolítica de las variantes de FVII se evaluó midiendo la constante cinética de Michaelis Menten del polipéptido de FVIIa en el sustrato peptidílico Spectrozyme FVIIa (CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA.AcOH). Se incluyó factor tisular purificado humano lipidado (Innovin, Dade Behring, VWR Cat Nº 68100-390) en el ensayo para proporcionar la actividad óptima de FVIIa. El complejo FT-FVIIa escinde Spectrozyme FVIIa como un sustrato cromogénico altamente específico que libera un cromóforo de paranitroanilina (pNA), que puede controlarse 10 midiendo la absorción a 405 nm. La actividad enzimática se determina controlando la absorbancia a 405 nm del pNA libre generado en función del tiempo.

Las reacciones se realizaron a tres concentraciones de enzima diferentes. Para la reacción, las variantes de FVIIa se diluyeron en primer lugar a 40 nM en tampón de ensayo directo 1 X (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, CaCl2 5 15 mM, BSA 0,01 %) en un tubo de 1,7 ml (tubos de microcentrífuga de baja adhesión de ISC Bioexpress). El FVIIa se diluyó además en presencia de FT (Innovin, Dade Behring) diluyendo a 2 nM en un depósito de polipropileno de 12 pocillos (Axygen) de la siguiente manera: 720 l de tampón directo 5 X (Tris 500 mM pH 8,4, NaCl 500 mM, CaCl2 25 mM, BSA 0,05 %), 180 l de FVIIa 40 nM y 2700 l de FT 2 X (solución madre 6 nM reconstituida en 10 ml de agua). La proteasa diluida se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La reserva 2 nM de FVIIa se diluyó 20 adicionalmente en diluciones en serie dobles para proporcionar una reserva de proteasa 1 nM y 0,5 nM, respectivamente, también en presencia de FT. Las reacciones de dilución en serie fueron las siguientes: en primer lugar, 1800 l de reserva de FVIIA/FT 2 nM de lo anterior diluido en 360 l de tampón directo 5 X, 900 l de FT 2 X y 540 l de agua. Esta reserva diluida se diluyó de nuevo 1:1 en 1800 l de FT 1 X en tampón directo.

Se realizó una placa de dilución del sustrato Spectrozyme FVIIa (American Diagnostica). La solución de reserva de Spectrozyme FVIIa se realizó por reconstitución del vial de 50 moles en agua destilada a 10 mM y se almacenó a 4 ºC. Se añadieron 80 l (Spectrozyme FVIIa 10 mM) y 60 l + 20 l de agua (Spectrozyme FVIIa 7,5 mM) del Spectrozyme FVIIa 10 mM a pocillos de dos columnas adyacentes de una placa de ensayo de polipropileno de 96 pocillos (Costar). Los dos pocillos se diluyeron en serie 2 veces por cada uno de los 8 pocillos de la columna 30 respectiva para realizar una serie de concentraciones de sustrato 10 X que variaban de 10 mM a 78 M de sustrato debajo de los pocillos de la primera columna y de 7,5 mM a 58,6 M de sustrato debajo de los pocillos de la segunda columna.

Se añadieron cinco l de cada dilución de sustrato Spectrozyme FVIIa a una placa de ensayo de media área 35 transparente de 96 pocillos (Costar). Se añadieron cuarenta y cinco l de cada una de las tres diluciones de FVIIa/FT a tres grupos de columnas de las diluciones en serie de sustrato. Durante esta etapa, se tuvo cuidado de evitar la introducción de burbujas en los pocillos del ensayo. Si se introducían burbujas, se retiraban pinchando con una aguja limpia antes de empezar cada ensayo. Las placas se mezclaron por agitación. Antes del inicio del ensayo, se midió la longitud del recorrido de los pocillos de ensayo usando un espectrofotómetro lector de placas 40 Spectramax Gemini M5 (Molecular Devices) tomando una lectura de punto final y usando la herramienta Pathcheck del software SoftMax Pro (Molecular Devices). Se midió el aumento de la absorbancia a 405 nm cada 30 segundos durante una hora a 37 ºC.

Se usó el software SoftMax Pro para convertir la velocidad de absorbancia (miniunidades/segundo) en concentración 45 de pNA liberado (M/s) usando la longitud del recorrido y el coeficiente de extinción del grupo saliente de pNA a 405 nm, 9600 M-1cm-1. La ecuación de conversión es la siguiente: Velocidad x (1/60 x 1000) x (1/9600 x Longitud del recorrido) x 100000. Los resultados para cada concentración de proteasa se representaron gráficamente usando el software Graph Pad Prism con la concentración de sustrato en el eje X y las velocidades M/s determinadas en el eje Y. Usando el software Graph Pad Prism 4 se determinaron la Km e Ymáx ajustando los datos a una ecuación de 50 Michaelis Menten de la siguiente manera:

Y = ((kcatKm / 1000000) x X x [E])/(1+(X + Km)

en donde; 55

X es la concentración de un sustrato (M)

Y es la actividad enzimática (M/s)

kcatKm) es la constante de especificidad (M-1s-1)

Km es la constante de Michaelis (M) 60

E es la concentración de enzima (M)

Se establecieron valores iniciales de E=1, Km = X a 0,5 x Y máx y kcatKm = 1000.

La actividad específica (miniunidades/min/nM) de cada una de las variantes de FVIIa, FVIIa de tipo silvestre (CB553-02) se determinó con el ensayo anteriormente descrito usando Spectrozyme FVIIa 420 M (Tabla 11). Las actividades de las variantes de FVIIa típicamente fueron mayores que la del FVIIa de tipo silvestre (medida a 2,7 miliunidades/min/nM). Las actividades de las variantes de FVII se compararon con las de las variantes descritas en la bibliografía (CB591-CB594) y se descubrió que la mayoría de las variantes de FVII tenían actividad comparable a 5 o mayor que la actividad de las variantes que se habían descrito previamente en la bibliografía.

Tabla 11. Actividad específica de variantes de FVIIa

ID: SEC ID Nº Mutación (numeración de FVII maduro) Mutación (numeración de quimiotripsina) Actividad Específica (miliunidades/min/nM)

CB553-02: ninguna ninguna 2,7

CB554: D196K D60K 1,7

CB555: D196R D60R 1,9

CB556: D196A D60A 3,2

CB557: K197D K60aD 4,4

CB558: K197E K60aE 4,4

CB559: K197A K60aA 4,6

CB560: K197L K60aL 1,1

CB561: K197Y K60aY 5,2

CB562: K199D K60cD 5,5

CB563: K199E K60cE 5,2

CB564: K199A K60cA 3,8

CB565: T239A T99A 2,0

CB566: R290D R147D 5,5

CB567: R290E R147E 2,9

CB568: R290A R147A 3,9

CB569: K341R K192R 2,9

CB579: D196R/R290E D60R/R147E 2,9

CB580: D196K/R290E D60K/R147E 2,7

CB581: D196R/R290D D60R/R147D 3,1

CB586: D196R/K197E/ K199E D60R/K60aE/ K60cE 5,2

CB587: D196K/K197E/ K199E D60K/K60aE/ K60cE 4,8

CB588: D196R/K197E/ K199E/R290E D60R/K60aE/ K60cE/R147E 4,9

CB589: D196R/K197M/ K199E D60R/K60aM/ K60cE 5,4

CB590: D196R/K197M/ K199E/R290E D60R/K60aM/ K60cE/R147E 6,2

CB591: L305V/S314E/ L337A/F374Y L163V/S170bE/ K188A/F225Y 3,9

CB592: M298Q M156Q 3,6

CB593: V158D/E296V/ M298Q V21D/E154V/ M 156Q 3,9

CB594: V158D/E296V/ M298Q/K337A V21D/E154V/ M156Q/K188A 5,0

Ejemplo 5

Determinación de la actividad catalítica de FVIIa para su sustrato, Factor X

La actividad catalítica de las variantes de FVIIa para su sustrato, Factor X (FX), se evaluó indirectamente en un 5 ensayo fluorogénico ensayando la actividad de FXa, generada tras la activación de FVIIa, en el sustrato sintético Spectrafluor FXa. Se incluyó una forma lipidada del factor tisular (FT) purificado en el ensayo para proporcionar actividad óptima de FVIIa. Se determinó la actividad enzimática de FXa para Spectrafluor FXa (CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC.AcOH) midiendo el aumento de la absorbancia del fluoróforo libre generado, AMC (7-amino-4-metilcoumarina) en función del tiempo. 10

En resumen, las variantes de FVIIa se diluyeron inicialmente a 0,5 M en tampón de ensayo directo 1 X (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM y BSA 0,01 %), y después se diluyeron adicionalmente a 0,1 nM en tampón de ensayo directo. Se reconstituyó FT de longitud completa lipidado (Innovin; Dade Behring) en 20 ml de agua para realizar una solución 3 nM y se diluyó a 0,2 nM en tampón de ensayo directo 1 X. Se mezclaron 400 l de FVIIa 0,1 15 nM con 400 l de FT 0,2 nM y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. La solución se diluyó adicionalmente por dos diluciones dobles en tampón de ensayo directo 1 X que contenía FT 0,2 nM para obtener un total de tres diluciones de FVIIa de FVIIa 0,05 nM, 0,025 nM o 0,0125 nM, conteniendo cada una FT 0,2 nM (soluciones de FVIIa/FT).

El sustrato, Factor X (FX; American Diagnostica; 80 g) se reconstituyó en 135,6 l de agua destilada para proporcionar una reserva de 10 M y se almacenó en alícuotas a -80 ºC. Las alícuotas no se congelaron y se descongelaron más de una vez. La reserva de FX se diluyó a 800 nM en tampón de ensayo directo, y después se diluyó en serie 2 veces para obtener soluciones de FX que variaban de 800 nM a 50 nM.

Se reconstituyó Spectrofluor Xa (American Diagnostica; 10 moles) en agua destilada a 5 mM y se almacenó a 4 ºC. En una placa de ensayo de media área negra de 96 pocillos (Costar) se añadieron 5 l de Spectrofluor Xa (American Diagnostica) a cada pocillo. Después se añadieron 25 l de la solución de FX a cada pocillo. En la última fila de pocillos de la placa, también se incluyó en el ensayo un control negativo al que no se había añadido FX. Por duplicado, las tres concentraciones de las soluciones de FT/FVIIa se añadieron a 20 l a pocillos de columnas 30 respectivas de la placa de modo que se ensayó cada dilución de FT/FVIIa frente a cada dilución de FX, no conteniendo un conjunto de columnas ningún FT/FVIIa añadido (es decir, FX solo). Las placas se mezclaron por agitación. La fluorescencia se midió a lo largo del tiempo con un espectrofluorímetro ajustado para leer cada 30 segundos durante 1 hora a 37 ºC (Ex: 380 nm, EM: 450 nm, punto de Corte: 435 nm), y el tiempo se presentó en unidades de tiempo cuadráticas. Después del ensayo, se generó una curva patrón de fluorescencia de AMC en el 35 mismo lector de placas para convertir las unidades de fluorescencia en concentración M de sustrato liberado en el ensayo. Se diluyó una AMC 1 mM en DMSO (Invitrogen) a 0,02 mM en tampón de ensayo directo 1 X. Se realizaron seis diluciones en serie dobles de la AMC que variaban de 20 nM a 0,625 nM en tampón de ensayo directo 1 X. La fluorescencia de la AMC se midió usando las mismas condiciones de ensayo que se han descrito anteriormente y se representó un gráfico de fluorescencia frente a concentración de AMC. Se calculó la pendiente de la línea, que actuó 40 como el factor de conversión para UFR en M en cálculos posteriores.

Las constantes cinéticas para la activación de FX por FVIIa se calcularon realizando análisis de regresión lineal en la inversa de la concentración del sustrato frente a la inversa de la velocidad de escisión del sustrato (en unidades de segundos2), calculándose la Vmáx, FVIIa como la inversa de la ordenada en el origen, Km, FVIIa como la pendiente de 45 la ordenada en el origen y Vmáx/Km, FVIIa como la inversa de la pendiente. El valor de kcat se obtuvo después usando la ecuación:

kcat/Km,FVIIa = Vmáx/Km, FVIIa x 1/(0,5 x k2 x [FVIIA en M] x (RFU/M factor de conversión))

en donde: k2 = ([S] 3 kcat, Fxa)/(Km, FXa + [S]), en donde kcat, FXa y Km, FXa son las constantes para la escisión por FXa de SpectrofluorXa determinado experimentalmente usando patrones de FXa como kcat, FXa = 117 s-1, y Km, FXa = 164 M.

Usando las condiciones de ensayos anteriores, se determinó que la constante cinética k2 era 88,1 s-1. 55

Se determinó la Km y kcat para cada una de las variantes de FVIIa para evaluar la actividad catalítica, kcat/Km (M-1s-1) de cada uno para su sustrato, FX (Tabla 12). También se evaluó la proteasa FVIIa de tipo silvestre (CB553-02) y se descubrió que mostraba una actividad de 1,8 x 107 M-1s-1. La activación por el Factor FVIIa del Factor X, como se mide por Krishnaswamy, et al. (J. Biol. Chem. (1998) 273: 8 4378-86) es 2,9 X 107 M-1s-1. Muchas de las variantes 60 presentaron actividad comparable con la de la proteasa no modificada. En algunos casos, las variantes de FVIIa mostraban actividad catalítica potenciada en comparación con la proteasa no modificada. Por ejemplo, CB558, CB561 y CB563 mostraron actividades catalíticas de 5,2 x 107, 4,3 x 107 y 5,9 x 107 M-1s-1.

Tabla 12. Actividad catalítica de variantes de FVIIa

ID: Mutación (numeración de FVII maduro) Mutación (numeración de quimiotripsina) Actividad catalítica kcat/Km (M-1s-1) Log10 (kcat/ Km) Km (mM) kcat (s-1)

CB553-02: ninguna ninguna 1,8 x 107 7,3 0,039 0,71

CB554: D196K D60K 3,1 x 107 7,5 0,038 1,2

CB555: D196R D60R 2,6 x 107 7,4 0,036 0,95

CB556: D196A D60A 2,6 x 107 7,4 0,292 7,4

CB557: K197D K60aD 2,5 x 107 7,4 0,046 1,2

CB558: K197E K60aE 5,2 x 107 7,7 0,020 1,1

CB559: K197A K60aA 3,6 x 107 7,6 0,026 0,94

CB560: K197L K60aL 9,3 x 105 6,0 0,641 0,60

CB561: K197Y K60aY 4,3 x 107 7,6 0,041 1,8

CB562: K199D K60cD 1,4 x 107 7,2 0,070 1,0

CB563: K199E K60cE 5,9 x 107 7,8 0,041 2,4

CB564: K199A K60cA 8,4 x 106 6,9 0,103 0,87

CB565: T239A T99A 6,1 x 105 5,8 0,128 0,078

CB566: R290D R147D 1,2 x 106 6,1 0,045 0,053

CB567: R290E R147E 6,8 x 104 4,8 1,9 0,014

CB568: R290A R147A 4,1 x 106 6,6 0,018 0,074

CB569: K341R K192R 2,7 x 106 6,4 0,092 0,25

CB579: D196R/R290E D60R/R147E 1,4 x 106 6,1 0,032 0,044

CB580: D196K/R290E D60K/R147E 1,9 x 106 6,3 0,025 0,047

CB581: D196R/R290D D60R/R147D 3,0 x 106 6,5 0,28 0,085

CB586: D196R/K197E/ K199E D60R/K60aE/ K60cE 7,8 x 106 6,9 0,033 0,26

CB587: D196K/K197E/ K199E D60K/K60aE/ K60cE 3,7 x 106 6,6 0,062 0,26

CB588: D196R/K197E/ K199E/R290E D60R/K60aE/ K60cE/R147E 5,3 x 104 4,7 0,888 0,047

CB589: D196R/K197M/ K199E D60R/K60aM/ K60cE 1,1 x 107 7,0 0,049 0,54

CB590: D196R/K197M/ K199E/R290E D60R/K60aM/ K60cE/R147E 4,6 x 105†† 5,7 0,030 0,014

CB591: L305V/S314E/ L337A/F374Y L163V/S170bE/ K188A/F225Y 6,3 x 106 6,8 0,235 1,5

CB592: M298Q M156Q 3,1 x 107 7,5 0,085 2,7

CB593: V158D/E296V/ M298Q V21D/E154V/ M156Q 4,9 x 107 7,7 0,063 3,1

CB594: V158D/E296V/ M298Q/K337A V21D/E154V/ M156Q/K188A 1,2 x 108 8,1 0,035 4,1

†† Valor aproximado.

Ejemplo 6. Determinación de la concentración de proteasa catalíticamente viable en una solución

La concentración de FVIIa catalíticamente viable en una solución de reserva se determinó valorando un complejo de Factor VIIa y Factor Tisular soluble (FTs) con un inhibidor peptídico irreversible de FVIIa, Phe-Phe-Arg-Clorometilcetona (FFR-CMK). El inhibidor se une a FVIIa pero no a FVII. La incubación extendida a una alta 5 concentración de FVIIa (50 nM) asegura la valoración completa de la proteasa. Se midió la actividad residual del complejo de FVIIa/FT después de incubación con FFR-CMK para determinar la concentración de FVIIA catalíticamente viable en la solución de reserva original.

A. Formato de placas de ensayo de 96 pocillos 10

Se pretrató una placa de ensayo de media área transparente de 96 pocillos (Nunc) añadiendo 150 l/pocillo de tampón de placa 1 x (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, BSA 0,01 %, Tween-20 0,01 %) a cada pocillo e incubando la placa a 37 ºC durante un mínimo de 1 hora. El tampón se retiró completamente por transferencia en un papel absorbente y centrifugando la placa boca abajo para retirar cualquier tampón restante, y la placa se secó al aire 15 durante 1 hora y se almacenó cubierta a temperatura ambiente (TA).

Para preparar la mezcla de reacción de FVIIa/sTF/FFR-CMK, se diluyó en primer lugar una reserva de FVIIa (American Diagnostica; diluido a 5 M en glicerol 50 % (v/v) y almacenado en frío en alícuotas a -20 ºC) o una variante de FVIIa a 500 nM en tampón de ensayo directo 1 X (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, BSA 20 0,01 %). Después se obtuvo la mezcla de FVIIa/FTs mezclando 90 l de agua destilada con 36 l de tampón de ensayo directo 5 X, 18 l de FVIIa 500 nM y 18 l de FTs 5 M (Factor de Coagulación humano recombinante III/factor tisular soluble; R&D Systems; la solución de reserva usada fue de 19,6 M en glicerol al 50 % y se diluyó a 5 M en tampón de ensayo directo 1 X y se almacenó hasta dos semanas a 4 ºC). Después se dejó que los componentes formaran complejo durante 5 minutos a temperatura ambiente. 25

Se diluyó una solución de reserva de FFR-CMK 10 mM (Bachem) en DMSO (almacenado a -20 ºC) en agua hasta 3,5 M. Usando una fila de una placa de almacenamiento opaco de polipropileno (Costar Nº 3363), se realizaron diluciones dobles en serie en agua del FFR-CMK a través de 11 pocillos de una placa opaca de 96 pocillos, conteniendo el último pocillo de la fila solamente agua como control. Esta es la solución en serie inhibidora de FFR-30 CMK 10 X. En cada pocillo de una fila de la placa de ensayo de media área transparente de 96 pocillos pretratada, se añadieron 10,8 l de la mezcla de FVIIa/FTs, seguido de 1,2 l de la serie de inhibidores de FFR-CMK 10 X. Las soluciones se mezclaron bien y la placa se centrifugó a menos de 3000 rpm durante 5 minutos para retirar gotas en los pocillos, la placa se tapó y se incubó durante 8 horas a 37 ºC.

Para ensayar la actividad residual del complejo de FVIIa/FT, se preparó en primer lugar una mezcla del sustrato Spectrozyme FVIIa (American Diagnostica, Nº 217L; reserva reconstituida de vial de 50 moles en 5 ml de agua destilada a 10 mM y almacenado a 4 ºC) y tampón directo 5 X (Tris 500 mM pH 8,4, NaCl 500 mM, CaCl2 25 mM y BSA 0,05 %) mezclando 360 l de tampón de ensayo directo 5 X con 180 l de una solución 10 mM de Spectrozyme FVIIa y 1080 l de agua. A cada pocillo de la placa de ensayo, se añadieron 108 l de la solución del sustrato 40 preparada. Los pocillos se mezclaron y la placa se incubó a 37 ºC. El aumento de absorbancia a 405 nm se midió cada 30 segundos durante una hora a 37 ºC en un lector de placas Spectramax Gemini M5 de Molecular Devices.

Usando el software SoftMax Pro (Molecular Devices), se midieron las velocidades de absorbancia y se determinó la actividad fraccional de proteasas incubadas con un inhibidor dividiendo la velocidad medida por la velocidad de la 45 proteasa no inhibida. La actividad fraccional se representó gráficamente frente a la concentración de FFR-CMK, y se descartaron los puntos que eran > 90 % o < 10 % de la actividad no inhibida. Después se dibujó una línea a través de los puntos restantes para determinar la abscisa en el origen, que representa la concentración de proteasa activa en la solución. Se midieron y se promediaron los valores de múltiples ensayos y se determinó la desviación típica.

B. Formato de ensayo de 384 pocillos

Para aumentar la precisión y el rendimiento de la valoración, el ensayo previo se modificó para un formato basado en placa de 384 pocillos. Se llevó a cabo incubación durante siete horas a una alta concentración de proteasa (250 nM) con una serie de concentraciones de FFR-CMK que abarcaban el intervalo de 400 nM a 53 nM. La actividad 55 residual se midió añadiendo el sustrato de FVIIa (Mesilo-dFPR-ACC) y midiendo el cambio en la señal de fluorescencia a lo largo del tiempo.

Brevemente, se pretrató una placa de ensayo negra de 384 pocillos (Nunc) como en el Ejemplo 6. Después, se preparó una solución de FVIIa/FTs mezclando 32,5 l de FVIIa 1 M + 19,5 l de FTs 5 M + 6,5 l de tampón AST 60 5X (Na Hepes 100 mM, pH 7,5, NaCl 750 mM, CaCl2 25 mM, BSA 0,5 %, PEG 8000 0,5 %) y 6,5 l de dH2O. Esta reacción se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. La mitad de una placa de 384 pocillos aloja 5 proteasas medidas por triplicado, y una única muestra de control de ensayo. Durante la incubación de FVIIa/FTs, la FFR-CMK 20 mM se diluyó a 8 M en HCl 1 mM, seguido de 9 diluciones 1,25 veces en serie a través de una placa de 96 pocillos. Los dos pocillos restantes de la fila se dejaron con HCl 1 mM solamente. Esta fila se diluyó después 65

10 veces en tampón AST 1X y se mezcló para generar una serie de concentraciones de FFR-CMK de 800 nM a 107 nM. A cada fila de la placa de 384 pocillos, se pipetearon 4 l de la serie de diluciones de FFR-CMK. Después, se mezclaron 4 l de la solución de FVIIa/FTs con la serie inhibidora a través de once columnas de la placa. La columna final se cargó con 4 l de tampón AST 1X para actuar como el blanco de placa. La placa se centrifugó, se selló y se incubó a temperatura ambiente durante siete horas con agitación. El ensayo se inició con 72 l de Mesilo-5 dFPR-ACC 110 M diluido en tampón AST 1X. El aumento de fluorescencia se controló a Ex: 380 nm y Em: 460 nm durante 20 minutos con lecturas cada 45 segundos a 37 ºC. Los datos se analizaron de la misma manera que en el Ejemplo 6, con los siguientes ajustes. En primer lugar, la actividad residual se limitó a las actividades entre el 20 % y el 80 % de la actividad proteasa solamente. En segundo lugar, la ordenada en el origen del ajuste lineal se restringió a entre 0,9 y 1,1. En tercer lugar, la abscisa en el origen se restringió a entre 125 nM y 375 nM. La abscisa en el 10 origen para las tres repeticiones de cada proteasa se promedió y se presentó el valor y la desviación típica.

Ejemplo 7

Determinación de la CI50 para inhibición por IRFT de FVIIa/FT 15

La potencia de la interacción entre IRFT y el complejo de FVIIa/FT se evaluó midiendo el nivel de ihibición de diversas concentraciones de IRFT en la actividad catalítica de un FVIIa/FT hacia un sustrato, Spectrazyme VIIa. La concentración de IRFT que se requería para inhibición del 50 % (CI50) se calculó para cada variante de FVII, y un patrón de FVIIa. 20

Se pretrató una placa de ensayo de media área transparente de 96 pocillos (Nunc) añadiendo 150 l/pocillo de tampón de placa 1 x (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, BSA 0,01 %, Tween-20 0,01 %) a cada pocillo e incubando la placa a 37 ºC durante un mínimo de 1 hora. El tampón se retiró completamente agitando y transfiriendo de la placa y centrifugando la placa boca abajo para retirar el tampón restante. La placa se secó al aire durante 1 hora, y 25 se almacenó a temperatura ambiente (TA).

En un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml (tubo de microcentrífuga de baja adhesión de ISC Bioexpress), se preparó una mezcla de FVIIa/FT en un volumen total de 450 l mezclando 9 l de FVIIa 250 nM (American Diagnostica, CB553-02 o una variante respectiva para ensayar) con 337,5 l de FT 2 x (Innovin; Dade Behring; producto 30 liofilizado resuspendido en 10 ml de agua destilada para generar FT 2X, que equivale aproximadamente a 7 nM de FT lipidado), 90 l de tampón de ensayo de 5 x (Tris 500 mM pH 8,4, NaCl 500 mM, CaCl2 25 mM, BSA 0,05 %) y 13,5 l de agua, dando como resultado una solución que contenía FVIIa 5 nM y FT 5,2 nM. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir que los componentes formaran un complejo. A cada pocillo de 2 columnas en la placa de ensayo de media área transparente de 96 pocillos pretratada, se añadieron 25 l de la 35 mezcla de FVIIa/FTs respectiva y la placa se tapó para evitar la evaporación.

El IRFT Recombinante Humano (R&D Systems) se disolvió inicialmente en 33 l de glicerol al 50 % (v/v) para preparar una reserva 10 M para almacenamiento a -20 ºC. La reserva de IRFT se diluyó adicionalmente hasta 1,5 M en un tampón directo 1 X final (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, BSA 0,01 %) en una placa de 40 almacenamiento de polipropileno de la siguiente manera: para cada proteasa ensayada, se prepararon 87,5 l de una solución 1,5 M de IRFT mezclando 13,1 l de IRFT 10 M con 17,5 l de tampón de ensayo 5 x y 56,9 l de agua destilada. Se prepararon diluciones triples en serie de la solución de IRFT en tampón de ensayo 1 x mezclando 27,5 l de IRFT en 55 l de tampón de ensayo 1 x, de modo que se generaron soluciones que contenían IRFT 750 nM, 250 nM, 83,3 nM, 27,8 nM, 9,26 nM, 3,1 nM y 1,03 nM. El pocillo final de la serie contenía solamente tampón 45 directo 1X como control.

Se añadieron veinticinco l de cada dilución de IRFT a 2 pocillos (es decir por duplicado) de 2 columnas de la placa de ensayo de media área transparente de 96 pocillos que contenían la mezcla de FVIIa/FT, de modo que la mezcla de proteasas se ensayó por duplicado con cada dilución de IRFT. También se añadió una solución de tampón de 50 ensayo 1 x sin IRFT a 2 pocillos que contenían la mezcla de FVIIa/FT como un control negativo. La placa se agitó brevemente y después se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos antes de incubación a 37 ºC durante 1,5 horas.

Se preparó una solución de reserva de Spectrazyme VIIa (American Diagnostica) reconstituyendo 50 moles en 5 ml de agua destilada a 10 mM y almacenando a 4 ºC hasta su uso. Inmediatamente antes de su uso, la solución se 55 diluyó a 600 M en agua destilada. Después de la incubación de la placa de ensayo anterior, se añadieron 10 l del Spectrazyme VIIa diluido a cada pocillo de la placa de ensayo. Las reacciones se mezclaron y la placa se incubó a 37 ºC. El aumento de absorbancia a 405 nm se midió cada 30 segundos durante una hora a 37 ºC, y la velocidad de absorbancia se calculó usando software SoftMax Pro (Molecular Devices).

Para determinar el grado de inhibición por IRFT, las velocidades de absorbancia de reacciones de proteasa que contenían IRFT se dividieron en primer lugar por la velocidad de absorbancia de reacciones que no contenían IRFT (la muestra de control) para obtener la actividad fraccional, y se determinó el log10 de cada concentración de IRFT. Usando Software GraphPad Prism, se representó el log10 [IRFT] frente a la actividad fraccional para cada proteasa, y

se generó una curva de respuesta a dosis con un ajuste de curva que asumía que la parte superior e inferior de los datos de actividad estaban fijados en 1 y 0, respectivamente. El software se usó para determinar la inhibición de IRFT tanto como el valor de log de CI50 (pCI50), como la CI50 absoluta (inhibición de IRFT en nM) para cada proteasa, y se determinó su promedio y desviación típica.

El nivel de inhibición de IRFT de cada una de las variantes de FVIIa en complejo con FTs se determinó y se expresó como CI50 o pCI50 (Tabla 13). También se determinó el grado en que IRFT inhibió la actividad de FVIIa no modificado (CB553-02) en complejo con FTs, y se descubrió que la CI50 era 88 nM. Nueve de las variantes de FVIIa que se generaron presentaron una potencia reducida de su interacción con IRFT, como se refleja en valores de CI50 aumentados. 10

Tabla 13. Inhibición de variantes de FVIIa por IRFT

ID: Mutación (numeración de FVII maduro) Mutación (numeración de quimiotripsina) CI50 (nM) pCI50

CB553-02: ninguna ninguna 7,1

CB554: D196K D60K 7,4

CB555: D196R D60R 7,4

CB556: D196A D60A 8,3

CB557: K197D K60aD 6,7

CB558: K197E K60aE 6,5

CB559: K197A K60aA 7,3

CB560: K197L K60aL 5,9

CB561: K197Y K60aY 7,0

CB562: K199D K60cD 7,2

CB563: K199E K60cE 7,5

CB564: K199A K60cA 7,2

CB565: T239A T99A 6,5

CB566: R290D R147D 6,6

CB567: R290E R147E 6,4

CB568: R290A R147A 6,7

CB569: K341R K192R 6,5

CB579: D196R/R290E D60R/R147E 7,6

CB580: D196K/R290E D60K/R147E 7,3

CB581: D196R/R290D D60R/R147D 7,5

CB586: D196R/K197E/ K199E D60R/K60aE/ K60cE 7,9

CB587: D196K/K197E/ K199E D60K/K60aE/ K60cE 7,7

CB588: D196R/K197E/ K199E/R290E D60R/K60aE/ K60cE/R147E 7,6

CB589: D196R/K197M/ K199E D60R/K60aM/ K60cE 7,4

CB590: D196R/K197M/ K199E/R290E D60R/K60aM/ K60cE/R147E 7,2

CB591: L305V/S314E/ L337A/F374Y L163V/S170bE/ K188A/F225Y 7,4

CB592: M298Q M156Q 7,5

CB593: V158D/E296V/ M298Q V21D/E154V/ M156Q 7,4

CB594: V158D/E296V/ M298Q/K337A V21D/E154V/ M156Q/K188A 7,7

Ejemplo 8

Evaluación in vivo de actividad procoagulante de FVIIa de tipo silvestre

Se estableció un modelo de ratón de hemofilia A para evaluar la actividad procoagulante de polipéptidos de FVIIa. 5 Se indujo hemofilia A en ratones CD-1 mediante administración de anticuerpos anti FVIII, seguido de retirada quirúrgica de las puntas de las colas para iniciar el sangrado. Los ratones se trataron después con polipéptido de FVIIa y se midió el tiempo que se tardaba en detener el sangrado, y la cantidad de sangre perdida durante este tiempo, para determinar la actividad procoagulante de los polipéptidos de FVIIa.

Se anestesiaron ratones CD-1 macho por administración intraperitoneal tanto de tiobarbital sódico a 100 mg/kg, como de ketamina a 100 mg/kg. Se administró lidocaína por inyección subcutánea en el cuello ventral para reducir la sensibilidad. Se canularon la tráquea y la arteria carótida a través de una incisión pequeña en la piel en el cuello para facilitar la respiración sin restricciones y la administración de anticuerpos anti Factor VIII, Factor VIIa humano recombinante (rhFVIIa) y/o polipéptidos de FVII modificados. 15

Se administró a los ratones con cánulas 3,76 mg de anticuerpo de oveja anti FVIII humano (Affinity Biologicals, lote IG129R4, 612 BU de ratón/ml) en 40 l. Esta dosis se determinó realizando un experimento de respuesta a dosis inicial con el anticuerpo, usando 0,376, 0,94, 1,88 y 3,76 mg de anti FVIII humano, y evaluando la pérdida de sangre y el tiempo de sangrado. Después de 20 minutos, las colas de los ratones se colocaron en tubos de 15 ml que 20 contenían solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 39 ºC durante un periodo de 10 minutos. A los 30 minutos, las colas se retiraron brevemente de la solución de PBS y los últimos 5 mM de las colas se cortaron para iniciar el sangrado. Se observó el tiempo en el que comenzó el sangrado. Las colas se devolvieron después al tubo que contenía PBS a 39 ºC y se permitió que sangraran durante 5 minutos (presangrado) para asegurar que los ratones habían respondido al anticuerpo anti FVIII. Después del presangrado, se administró a los ratones polipéptidos de 25 FVIIa o el vehículo en el que se prepararon y suministraron las proteínas de FVIIa. Los polipéptidos de FVIIa se diluyeron en PBS o un tampón compuesto de cloruro sódico 52 mM, cloruro cálcico deshidratado 10,2 mM, glicilglicina 9,84 mM, polisorbato 80 0,01 % y manitol 165 mM. Las preparaciones de FVIIa se administraron a 1, 3 o 10 mg/kg, en un volumen equivalente a 3 ml/kg, a través de la cánula de la carótida y las colas se colocaron en tubos nuevos que contenían PBS a 39 ºC. El sangrado se controló durante un periodo de 20 minutos y se 30 observaron los tiempos en los que se detuvo el sangrado. Se calculó el tiempo de sangrado total como la suma de la duración del sangrado durante el presangrado, y la duración del sangrado después de la administración de polipéptidos de FVIIa, o PBS o tampón.

Para determinar la cantidad de sangre perdida durante los episodios de sangrado, se ensayaron los contenidos de 35 los tubos de 15 ml con respecto a contenido de hemoglobina. Se diluyó Triton X-100 1 en 4 en agua estéril y se añadieron 100 l a 1 ml de las muestras parar provocar hemólisis. Después se midió la absorbancia de las muestras a una longitud de onda de 546 nm. Para calcular la cantidad de sangre perdida, la absorbancia se leyó frente a una curva patrón generada midiendo la absorbancia a 546 nm de volúmenes conocidos de sangre murina, se diluyó en PBS y se hemolisó como anteriormente con Triton X 100. 40

Se realizó un experimento que comparaba rhFVIIa (CB533) generado como se ha descrito anteriormente con el FVIIa humano recombinante disponible en el mercado (NovoSeven®, Novo Nordisk) y se evaluó la pérdida de sangre después de administración de una dosis de 3 mg/kg de cada proteína. La pérdida de sangre en el grupo de vehículo (tampón, n = 15) fue de 671,9  57,89 l durante el periodo de 20 minutos. Esto se redujo por el rhFVIIa 45 producido por Catalyst Biosciences a 264,1  56,59 l y por NovoSeven® a 273,7  53,93 l (n = 14). Este experimento demostró la equivalencia entre las dos proteínas.

Ejemplo 9

Análisis farmacocinético de polipéptidos de FVIIa

Se evaluaron propiedades farmacocinéticas de polipéptidos de FVIIa midiendo la cantidad de Factor VIIa humano en plasma de ratón. Se usaron dos ensayos para cuantificar FVIIa en plasma. Se usó un ELISA para cuantificar la proteína FVIIa total en plasma de ratón y se usó un ensayo de coagulación dependiente de FVIIa (FVII:C) para 55 cuantificar la actividad coagulante de los polipéptidos de FVIIa en plasma.

A. Administración de polipéptidos de FVIIa a ratones

Se evaluaron polipéptidos de FVIIa modificados y la proteína FVIIa humana recombinante no modificada (rhFVIIa) 60 (NovoSeven®, Novo Nordisk) en estudios farmacocinéticos. Para cada estudio, se inyectó a 18 ratones macho CD-1 una dosis de embolada intravenosa (0,1-3,0 mg/kg, dependiendo del estudio) de rFVIIa. A los 5, 15, 30, 60, 120 y 240 minutos después de la inyección, se sacrificaron tres ratones de cada protocolo de inyección usando asfixia por CO2 y se extrajeron aproximadamente 1,0 ml de sangre a una jeringa de 1,0 ml mediante una punción cardiaca percutánea. Cada jeringa se precargó con citrato sódico suficiente para conseguir una concentración final de 3,2 % 65 en 1 ml de sangre. Las muestras de sangre se centrifugaron después a 9000 rpm durante 8 minutos a 4 ºC. El

plasma se retiró a tubos de 1,5 ml individuales marcados (Eppendorf), se congeló de forma instantánea en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 ºC. Adicionalmente, se inyectó a un ratón por experimento solamente vehiculo (simulación) y se usó plasma de este ratón para determinación de la actividad de FVIIa de fondo.

B. Ensayo ELISA 5

Se usó un kit disponible en el mercado, ELISA de Factor VII IMUBIND® (American Diagnostica) para detectar la proteína FVII en suero por ELISA. Este kit emplea una placa pre-recubierta con un anticuerpo anti FVII/FVIIa para capturar la proteína, y un anticuerpo anti FVII biotinilado para la detección mediante una peroxidasa de rábano rusticano marcada con estreptavidina. El kit se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante con las siguientes 10 excepciones: en primer lugar, la curva patrón se ha estrechado para asegurar un intervalo lineal sobre el intervalo de concentración completo y abarca las concentraciones de 0,88 ng/ml a 10 ng/ml; en segundo lugar, la variante de FVIIa purificada en sí misma se usó para la curva patrón en lugar del patrón de FVII proporcionado con el kit debido a diferencias en la afinidad de anticuerpos. Los experimentos han indicado que el complejo de FVIIa con antitrombina III (ATIII), un inhibidor de plasma potencial de FVIIa, se detecta al 75 % del nivel de la proteasa libre, 15 asegurando que el ensayo pueda detectar el FVIIa total en la muestra de plasma en las formas tanto activa como inactiva.

Brevemente, las muestras de plasma se descongelaron a temperatura ambiente y se diluyeron 10 veces en tampón de muestra (PBS + Triton X-100 0,1 % + BSA 1,0 %), después se diluyeron en serie 5,5 veces para cuatro 20 diluciones. Las cuatro muestras diluidas se diluyeron 2 veces en la placa de ELISA para diluciones de muestra finales de 20, 110, 605 y 3327,5 veces. Estas cuatro diluciones de plasma de ratón abarcaron un intervalo de concentraciones de proteasa de 33.000 ng/ml a 20 ng/ml. Cada muestra se midió en dos placas de ensayo separadas, y esas mediciones dentro del intervalo de la curva patrón se usaron para calcular la concentración de variante de FVIIa en la muestra de plasma. 25

C. Ensayo de coagulación

Se usó un kit disponible en el mercado (STACLOT FVIIa-rTF, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ) como el ensayo de coagulación. Para determinar la actividad coagulante de los polipéptidos de FVIIa activos, se ensayaron muestras 30 de plasma usando un ensayo de coagulación dependiente de FVIIa (FVII:C). El ensayo se realizó usando reactivos e instrucciones proporcionados en un kit comercial y el tiempo de coagulación se midió usando un instrumento de detección de coágulo electromecánico (STArt4, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ). El kit se usó de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes con las siguientes excepciones: en primer lugar, la variante de FVIIa purificada en sí misma se usó para la curva patrón en lugar del patrón de rhFVIIa proporcionado con el kit; en segundo lugar, se 35 usaron los siguientes reactivos comerciales a granel para estudios de exploración farmacocinética rutinarios y proporcionaron resultados comparables a los reactivos del kit: factor tisular soluble (CalBioChem, La Jolla, Ca) y mezcla de fosfolípidos sintética (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), tampón TBSA (Tris-NaCl, pH 7,5 con BSA 1 %; DiaPharma, West Chester, Ohio), y solución de cloruro cálcico 25 M (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ).

El ensayo de coagulación se realizó de la siguiente manera. Se descongelaron muestras de plasma congeladas a temperatura ambiente durante aproximadamente 45 minutos y después se diluyeron 1:5000 en tampón. Se combinaron cincuenta l del plasma diluido con 50 l de plasma humano deficiente en Factor VII y 50 l de factor tisular relipidado y preincubado durante 180 segundos. Después de la preincubación, se añadieron 50 l de solución de cloruro cálcico (25 M) para iniciar la coagulación. El tiempo de coagulación se determinó usando detección de 45 coágulos electromecánica. Cada muestra de plasma se ensayó por duplicado. El sistema se calibró construyendo una curva patrón usando el tiempo de coagulación de diluciones en serie de tampón que contenía una cantidad conocida de la variante de FVIIa específica que se ensayaba. Se calcularon concentraciones de FVIIa en muestras de plasma de ratón a partir de la parte lineal de la curva patrón de FVIIa logarítmico frente a tiempo de coagulación logarítmico. La capacidad de las muestras de plasma para inducir coagulación en plasma deficiente en Factor VII se 50 indicó como ng de FVIIa/ml de plasma de ratón después de restar el fondo de FVIIa de tipo silvestre endógeno en plasma de ratones tratados con simulación.

La semivida de cada proteína FVII se determinó de forma rutinaria realizando un ajuste convencional del logaritmo natural de la actividad a una línea recta, y midiendo el tiempo que tarda la actividad de las proteínas FVIIa en 55 reducirse a la mitad. Para proteínas FVII con degradación multiexponencial, se determinó la semivida a partir de la parte terminal del perfil del logaritmo de plasma frente al tiempo. Se calcularon parámetros farmacocinéticos adicionales usando software disponible en el mercado (WinNonLin v5.1, Phar-sight Corporation, Mountain View, CA).

D. Propiedades farmacocinéticas de CB728, CB735 y CB945

Usando el protocolo anterior, se evaluaron las propiedades farmacocinéticas de FVIIa de tipo silvestre y dos variantes de FVIIa: CB728, CB735 y CB945. Los resultados se exponen en la Tabla 14. CB735 y CB945 mostraron parámetros farmacocinéticos mejorados en comparación con FVIIa de tipo silvestre. 65

Tabla 14. Parámetros farmacocinéticos de ratón de variante de FVIIa

CB Nº: Mutación (numeración de FVII maduro) Dosis IV (mg/kg) AUC0-inf en plasma (g.min/ml)/Dosis Semivida (min) Cl (ml/min/kg) Vd (ml/kg) N

CB553: WT 0,1 35,1 2,02 98,8

CB553: WT 1,0 50,2 1,55

CB728: Intercambio de Gla FIX 0,1 19,9 4,85

CB735: K341D 0,1 0,14 22,0

CB945: M156Q/K192D 0,1 78,1 0,41 46,3

E. Propiedades farmacocinéticas de CB558

Se midió la semivida de un polipéptido de FVIIa modificado que mostraba resistencia aumentada a IRFT (CB-558; 5 que contenía una mutación K197E) y se comparó con la de una proteína FVIIa humana recombinante (rhFVIIa) no modificada (NovoSeven®, Novo Nordisk) en un estudio farmacocinético similar al descrito anteriormente, con algunas modificaciones. Se inyectó a quince ratones CD-1 macho una dosis de embolada intravenosa 0,5 mg/kg de CB-558, y se inyectó a 15 ratones una dosis de embolada intravenosa 0,5 mg/kg de rhFVIIa. A los 5, 15, 30, 60 y 120 minutos después de la inyección, se sacrificaron tres ratones de cada protocolo de inyección usado asfixia con 10 CO2 y se extrajeron aproximadamente 1,0 ml de sangre a una jeringa de 1,0 ml a través de una punción cardiaca percutánea. Cada jeringa se precargó con suficiente citrato sódico para conseguir una concentración final de 3,2 % en 1 ml de sangre. Las muestras de sangre se centrifugaron después a 9000 rpm durante 8 minutos a 4 ºC. El plasma se retiró a tubos de 1,5 ml individuales etiquetados (Eppendorf), se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ºC. 15

Para determinar la actividad coagulante y la semivida de los polipéptidos de FVIIa activos, se evaluaron las muestras de plasma en Machaon Diagnostics, Inc. (Oakland, CA) usando un ensayo de coagulación dependiente de FVIIa (FVII:C) y un instrumentos de hemostasia automático (AMAX 190plus, Trinity Biotech). Brevemente, las muestras de plasma congeladas se descongelaron en un baño de agua a 37 ºC durante 5 minutos y después se diluyeron 1:40 en 20 Tampón de Veronal. Se añadieron seis l del plasma diluido a 54 l de tampón Veronal en una cubeta y se mezclaron con una perla metálica. Después se añadió una cantidad igual (60 l) de plasma humano deficiente en Factor VII (Precision Biologic) a la cubeta, que se incubó a 37 ºC durante 60 segundos con mezcla constante.

Para iniciar el comienzo de la medición del tiempo de la reacción, se añadieron 120 l de tromboplastina (fuente de 25 cerebro de conejo, Tromboplastina-DS; Pacific Hemostasis) a la cubeta y se mantuvo en la misma mezclado constante. La reacción de coagulación se controló fotoópticamente a 405 nm para detectar la formación de fibrina. El sistema se calibró analizando el tiempo de coagulación de diluciones en serie de plasma de referencia con niveles de FVII publicados (Precision Biologic), y después analizando el tiempo de coagulación de plasma de control normal (Precision Biologic) y plasma de control anómalo (Precision Biologic). 30

La capacidad de las muestras de plasma para inducir la coagulación en plasma deficiente en Factor VII se ha indicado como un porcentaje del tiempo de coagulación observado en plasma humano normal. La actividad coagulante de plasma de ratones tanto tratados con FVIIa (NovoSeven®) como tratados con CB-558 se redujo a lo largo del tiempo. La semivida de cada proteína de FVII se determinó realizando un ajuste convencional del logaritmo 35 natural de la actividad a una línea recta, y midiendo el tiempo que se tarda en que la actividad de las proteínas FVIIa se reduzca a la mitad. Se observó que la semivida de CB-558 era aproximadamente dos veces la de FVIIa (NovoSeven®); 156 minutos en comparación con 67 minutos.

Ejemplo 10 40

Generación de variantes de FVII adicionales

Se generó una serie de mutantes de FVII adicionales para alterar una o más propiedades y/o actividades de FVII. Además de modificaciones para aumentar la resistencia a IRFT, se diseñaron modificaciones para aumentar la 45 resistencia a AT-III, aumentar la actividad catalítica, aumentar la semivida y/o aumentar la afinidad y/o unión con fosfolípidos, tal como los que están en plaquetas activadas. Las modificaciones incluyen reemplazo, inserción y deleción de aminoácidos. Se generaron también variantes de FVII que contenían dos o más modificaciones. La Tabla 23 expone las variantes de FVII que se generaron y se expresaron en células Freestyle™ 293-F. Se incorporaron reemplazos de aminoácidos en polipéptidos de FVII usando los métodos descritos en el Ejemplo 2.B, 50 anterior, con un oligonucleótido apropiado.

La Tabla 15 a continuación expone las variantes de FVII adicionales que se generaron. Se generaron variantes de FVII de intercambio de Gla en las que los restos de aminoácidos A1 a Y44 (por numeración de FVII maduro) en el extremo N terminal de la proteína FVII del tipo silvestre se reemplazaron con restos de aminoácidos correspondientes al dominio Gla de FIX, FX, Proteína C, Proteína S o trombina. La variante de FVII “Intercambio de Gla FIX” (es decir un polipéptido de FVII en el que el dominio Gla endógeno se ha reemplazado con el dominio Gla 5 de FIX) contiene los restos de aminoácidos A2 a Y45 de SEC ID Nº: 110 en el extremo N terminal; la variante de FVII “Intercambio de Gla FX” contiene los restos de aminoácidos A1 a Y44 de SEC ID Nº: 11 en el extremo N terminal; la variante de FVII “Intercambio de Gla Proteína C” contiene los restos de aminoácidos A1 a H44 de SEC ID Nº: 113 en el extremo N terminal; la variante de FVII “Intercambio de Gla Proteína S” contiene los restos de aminoácidos A1 a Y44 de SEC ID Nº: 114 en el extremo N terminal; y la variante de FVII “Intercambio de Gla 10 trombina” contiene los restos de aminoácidos A1 a Y44 de SEC ID Nº: 115 en el extremo N terminal.

Tabla 15. Variantes del factor VII ejemplares

ID: Variante (numeración de FVII maduro) Variante (numeración de Quimiotripsina) Polipéptido variante SEC ID Nº

CB697: R290N R147N

CB698: R290Q R147Q

CB699: R290K R147K

CB700: R290M R147M

CB701: R290V R147V

CB733: K341N K192N

CB734: K341M K192M

CB735: K341D K192D

CB853: G237T238insA G97T98insA

CB854: G237T238insS G97T98insS

CB855: G237T238insV G97T98insV

CB856: G237T238insAS G97T98insAS

CB857: G237T238insSA G97T98insSA

CB858: D196K197insK D60K60ainsK

CB859: D196K197insR D60K60ainsR

CB860: D196K197insY D60K60ainsY

CB861: D196K197insW D60K60ainsW

CB862: D196K197insA D60K60ainsA

CB863: D196K197insM D60K60ainsM

CB864: K197I198insE K60aI60binsE

CB865: K197I198insY K60aI60binsY

CB866: K197I198insA K60aI60binsA

CB867: K197I198insS K60aI60binsS

CB637: K197E/K341Q K60aE/K192Q

CB638: K197L/K341Q K60aL/K192Q

CB670: G237V/K341Q G97V/K192Q

CB688: K197E/K199E K60aE/K60cE

CB689: K197E/G237V K60aE/G97V

CB691: K197E/K199E/K341Q K60aE/K60cE/K192Q

CB694: K199E/K341Q K60cE/K192Q

CB671: K197E/G237V/K341Q K60aE/G97V/K192Q

CB669: V158D/G237V/E296V/M298Q V21D/G97V/E154V/M156Q

CB591: L305V/S314E/ L337A/F374Y L163V/S170bE/K188A/F225 Y

CB592: M298Q M156Q

CB593: V158D/E296V/ M298Q V21D/E154V/M156Q

CB594: V158D/E296V/ M298Q/K337A V21D/E154V/M156Q/K188 A

CB690: K197E/G237V/M298Q K60aE/G97V/M156Q

CB692: K197E/G237V/M298Q/K341Q K60aE/G97V/M156Q/K192Q

CB693: K197E/K199E/G237V/M298Q /K341Q K60aE/K60cE/G97V/M156Q /K192Q

CB695: G237V/M298Q G97V/M156Q

CB696: G237V/M298Q/K341Q G97V/M156Q/K192Q

CB902: K197E/M298Q K60aE/M156Q

CB945: M298Q/K341D M156Q/K192D

CB728: Intercambio de Gla FIX Intercambio de Gla FIX

CB729: Intercambio de Gla FX Intercambio de Gla FX

CB730: Intercambio de Gla Prot C Intercambio de Gla Prot C

CB731: Intercambio de Gla Prot S Intercambio de Gla Prot S

CB732: Intercambio de Gla Trombina Intercambio de Gla Trombina

CB850: M298Q/Intercambio de Gla FIX M156Q/Intercambio de Gla FIX

Ejemplo 11

Análisis de la actividad catalítica de variantes de FVIIa para el sustrato, Factor X

La actividad catalítica de las variantes de FVIIa para el sustrato, Factor X (FX), se evaluó de forma indirecta en dos tipos de ensayos cromogénicos ensayando con respecto a la actividad de FXa, generada tras la activación por FVIIa, en el sustrato sintético Spectrafluor FXa. Los dos ensayos se realizaron bien en presencia o bien en ausencia de factor tisular lipidado, para evaluar la actividad tanto dependiente de FT como independiente de FT. Las variantes de FVII se expresaron, purificaron y activaron a FVIIa como se ha descrito anteriormente en los Ejemplos 2 y 3. 10 Aunque la mayoría de las variantes de FVII se expresaron solamente en células Freestyle™ 293-F, algunas también se expresaron en células BHK-21.

Ensayo indirecto de factor tisular lipidado

La actividad catalítica de las variantes de FVIIa en presencia del factor tisular se evaluó usando el ensayo descrito en el Ejemplo 5, anterior, con modificaciones menores. Una de dichas modificaciones fue el uso de un sustrato de Factor X proteasa que se había tratado con ERG-CMK y FFR-CMK para reducir la actividad de fondo (Molecular Innovations). Se realizaron dos tipos de análisis de datos usando dos ensayos separados; un ensayo de análisis de intervalo lineal y un ensayo de análisis de intervalo hiperbólico. El ensayo de análisis de intervalo lineal usó un 20 intervalo de concentraciones de Factor X entre 0 y 150 nM para asegurar la medición precisa de las constantes cinéticas en el intervalo lineal de la curva de dosis. Por el contrario, el ensayo de análisis de intervalo hiperbólico usó un intervalo de concentraciones de Factor X entre 0 y 1,44 M para asegurar la medición precisa de las constantes cinéticas con una curva de dosis de saturación (hiperbólica).

El ensayo indirecto de factor tisular lipidado con análisis de datos de intervalo lineal se realizó esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 5, anterior, con las siguientes modificaciones. Las soluciones de variante de FVIIa/FT se prepararon como soluciones de FVIIa 0,1 nM/FT 0,4 nM y se incubaron durante 30 minutos antes de diluirse dos

veces en FT 0,4 nM hasta una solución que contenía FVIIa 1,5625 pm/ FT 0,4 nM. Se mezclaron veinticinco l de la solución de FVIIa/FT con 25 l de una solución de sustrato que contenía Spectrofluor FXa 1,0 mM (American Diagnostica) y uno de 300 nM, 200 mM, 133,3 nM, 88,9 nM, 59,3, 39,5 nM, 36,3 nM o 0 nM de Factor X (Molecular Innovations). Por lo tanto, las concentraciones finales para el ensayo fueron FVIIa 0,8 pM, FT 0,2 nM, Spectrofluor FXa 0,5 mM y Factor X 150 nM, 100 mM, 66,7 nM, 44,4 nM, 29,6 nM, 19,8 nM, 13,2 nM o 0 nM (Molecular 5 Innovations) en 50 l/pocillo. La curva patrón de AMC, que actuó como el factor de conversión para UFR a M en cálculos posteriores, se expandió para incluir un intervalo de dosis que abarcaba AMC de 0 M a 100 M.

El ensayo indirecto de factor tisular lipidado con análisis de datos de intervalo hiperbólico se realizó esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 5, anterior, con las siguientes modificaciones. Las soluciones de variante de 10 FVIIa/FT se prepararon como soluciones de FVIIa 0,1 nM/FT 0,4 nM y se incubaron durante 30 minutos antes de diluirse dos veces en FT 0,4 nM hasta FVIIa 1,5625 pM (o 0,78 pM para proteasas que se esperaba que tuvieran alta actividad)/FT 0,4 nM. Se mezclaron veinticinco l de la solución de FVIIa/FT con 25 l de una solución de sustrato que contenía Spectrofluor FXa 1,0 mM (American Diagnostica) y uno de Factor X 1440 nM, 720 mM, 360 nM, 180 nM, 90 nM, 45 nM, 22,5 nM o 0 nM (Molecular Innovations). Por lo tanto, las concentraciones finales para el 15 ensayo fueron FVIIa 0,8 (o 0,39) pM, FT 0,2 nM, Spectrofluor FXa 0,5 mM y Factor X 7 nM, 720 mM, 360 nM, 180 nM, 90 nM, 45 nM, 22,5 nM, 11,25 nM o 0 nM (Molecular Innovations) en 50 l/pocillo. Los parámetros kcat y Km se calculan usando la ecuación hiperbólica de Michaelis Menten de la forma (Vmáx/(1+(Kmx))). La curva patrón de AMC, que actuó como el factor de conversión para UFR a M en cálculos posteriores, se expandió para incluir un intervalo de dosis que abarcaba AMC de 0 M a 100 M. 20

Para determinar las constantes de velocidad cinética para la activación por FVIIa o variante de FVIIa de FX, los datos sin procesar recogidos con la aplicación SoftMax Pro (Molecular Devices) se exportaron como archivos .XML. Se realizaron análisis lineales y no lineales de datos adicionales con XLfit4, un paquete de software para ajuste de curvas automático y análisis estadístico dentro del ambiente de hojas de cálculo de Microsoft Excel (IDBS Software). 25

Para datos recogidos usando el ensayo de intervalo lineal, se calculan las contantes cinéticas kcat/Km (M-1 s-1) directamente a partir de la pendiente de análisis de regresión lineal de la concentración de FX frente a la velocidad de la escisión de sustrato fluorogénico (en M/s2) donde kcat/Km = pendiente/[FVIIa] x 0,5 x k2. Se determinó que el factor de corrección k2 era 45 usando el método descrito en el Ejemplo 5 y las constantes cinéticas para escisión por 30 FXa de Spectrofluor FXa de kcat,FXa = 56 s-1 y Km, FXa = 126 nM, determinado experimentalmente con FX activado (FXa) que era previamente un sitio activo valorado con AT-III/heparina. La exclusión de puntos de datos que daban como resultado valores de R2 menores de 0,98 aseguró la linealidad de los conjuntos de datos usados en la rutina de ajuste.

Los análisis de datos recogidos usando el ensayo de intervalo hiperbólico se calcularon a partir de los análisis de regresión no lineal de la concentración de FX frente a la velocidad de la escisión del sustrato fluorogénico (en M/s2). Los parámetros kcat y Km individuales se calcularon como parámetros de ajuste usando la ecuación hiperbólica de Michaelis Menten de la forma (Ymáx/(1+(Km/x))) donde kcat = Vmáx/[FVIIa] x 0,5 x k2. La constante cinética, kcat/KM se calculó a partir de los parámetros ajustados kcat y Km individuales. 40

Ensayo indirecto independiente de factor tisular

La actividad catalítica de las variantes de FVIIa en presencia del factor tisular se evaluó en un ensayo indirecto similar al descrito anteriormente excepto que el factor tisular no se incluyó en el ensayo. Por lo tanto, el ensayo para 45 evaluar la actividad independiente de FT se realizó esencialmente como se ha descrito anteriormente con las siguientes modificaciones. Las soluciones de variante de FVIIa se diluyeron a 50 nM. Se mezclaron veinticinco l de cada solución de FVIIa con 25 l de una solución de un sustrato que contenía Spectrofluor FXa 1,0 mM (American Diagnostica) y uno de Factor X 1050 nM, 700 mM, 466,7 nM, 311,1 nM, 207,4 nM, 138,3 nM, 92,2 nM o 0 nM (Molecular Innovations). Por lo tanto, las concentraciones finales para el ensayo fueron FVIIa 25 nM, Spectrofluor 50 FXa 0,5 mM y Factor X 525 mM, 350 nM, 233,3 nM, 155,6 nM, 103,7 nM, 69,1 nM, 46,1 nM o 0 nM (Molecular Innovations) en 50 l/pocillo. Se realizaron análisis de datos como se ha descrito para el ensayo de intervalo lineal, anteriormente sin modificaciones.

Las Tablas 16-18 proporcionan los resultados de los ensayos que se analizaron para medir la actividad catalítica de 55 las variantes de FVIIa. Las Tablas 15 y 16 proporcionan la actividad catalítica como se mide en un ensayo indirecto dependiente de FT usando polipéptidos de FVIIa expresados a partir de células 293-F y células BHK-21, respectivamente, y la Tabla 17 proporciona una actividad catalítica como se mide en un ensayo indirecto independiente de FT usando polipéptidos de FVIIa expresados de células 293-F y/o células BHK-21. Los resultados se presentan como la constante cinética para actividad catalítica, kcat/Km (M-1s-1), y también se expresaron como un 60 porcentaje de la actividad del FVIIa de tipo silvestre, donde la actividad es actividad catalítica, kcat/Km (M-1s-1) de cada variante de FVIIa para su sustrato, FX. El uso del análisis de datos de intervalo lineal o hiperbólico también se indica para los valores presentados en las Tablas. No todas las variantes de FVIIa se ensayaron en cada ensayo. Algunas de las variantes de FVII en el Ejemplo 5, anterior, presentaron actividad catalítica ligeramente reducida o aumentada para FX en este conjunto de ensayos en comparación con el ensayo descrito en el Ejemplo 5. Las 65

diferencias en las actividades con las vistas en el Ejemplo 5 son probablemente debidas a actividad de fondo variada de FX a residual en el sustrato de FX obtenido de American Diagnostica. Varias variantes de FVIIa mostraron actividad catalítica aumentada en comparación con la molécula FVIIa de tipo silvestre. Por ejemplo, CB760, que contiene la mutación Q366V, tiene una actividad catalítica entre 1,5 y 5 veces la de FVIIa de tipo silvestre.

Tabla 16. Actividad catalítica de variantes de FVIIa: ensayo indirecto dependiente de FT con polipéptidos de FVIIa de células 293-F

ID: Mutación (numeración de FVII maduro) Mutación (numeración de Quimiotripsina) Kcat /KM (M-1s-1) kcat/KM (% WT) Formato de Ensayo

CB553: WT WT 3,42 x 107 lineal

CB554: D196K D60K 1,10 x 107 hiperbólico

CB555: D196R D60R 2,25 x 107 hiperbólico

CB556: D196A D60A 2,58 x 107 hiperbólico

CB557: K197D K60aD 3,05 x 107 hiperbólico

CB558: K197E K60aE 1,54 x 107 hiperbólico

CB559: K197A K60aA 3,67 x 107 hiperbólico

CB560: K197L K60aL 1,51 x 107 hiperbólico

CB561: K197Y K60aY 5,16 x 107 hiperbólico

CB562: K199D K60cD 4,62 x 107 hiperbólico

CB563: K199E K60cE 3,63 x 107 hiperbólico

CB564: K199A K60cA 5,56 x 107 hiperbólico

CB565: T239A T99A 1,66 x 107 hiperbólico

CB566: R290D R147D 5,80 x 106 hiperbólico

CB567: R290E R147E 6,18 x 106 hiperbólico

CB568: R290A R147A 8,25 x 106 hiperbólico

CB569: K341R K192R 3,95 x 107 hiperbólico

CB579: D196R/R290E D60R/R147E 2,31 x 106 hiperbólico

CB580: D196K/R290E D60K/R147E 7,81 x 104 hiperbólico

CB581: D196R/R290D D60R/R147D 2,91 x 106 hiperbólico

CB586: D196R/K197E/K199E K60cE/K60aE/D60R 7,97 x 106 hiperbólico

CB587: D196K/K197E/K199E K60cE/K60aE/D60K 7,22 x 106 hiperbólico

CB588: D196R/K197E/ K199E/R290E K60cE/K60aE/D60R/R147E 3,66 x 105 hiperbólico

CB589: D196R/K197M/K199E K60cE/K60aM/D60R 1,81 x 107 hiperbólico

CB590: D196R/K197M/ K199E/R290E K60cE/K60aM/D60R/R147E 2,88 x 105 hiperbólico

CB591: L305V/S314E/L337A/F3 74Y L163V/S170bE/K188A/F225 Y 6,73 x 107 hiperbólico

CB592: M298Q M156Q 1,40 x 108 lineal

CB593: V158D/E296V/M298Q V21D/E154V/M156Q 1,67 x 108 lineal

CB594: V158D/E296V/M298Q/ K337A V21D/E154V/M156Q/K188 A 5,18 x 108 hiperbólico

CB595: K197I K60al 5,31 x 107 hiperbólico

CB596: K197V K60aV 5,15 x 107 hiperbólico

CB597: K197F K60aF 7,20 x 107 hiperbólico

CB598: K197W K60aW 6,25 x 107 hiperbólico

CB599: K197M K60aM 7,83 x 107 hiperbólico

CB600: D196F D60F 2,35 x 107 hiperbólico

CB601: D196Y D60Y 6,93 x 107 hiperbólico

CB602: D196W D60W 3,40 x 107 hiperbólico

CB603: D196L D60L 8,57 x 107 hiperbólico

CB604: D196I D60I 7,99 x 107 hiperbólico

CB605: G237W G97W 8,63 x 107 hiperbólico

CB606: G237T G97T 3,13 x 107 hiperbólico

CB608: G237V G97V 8,91 x 107 hiperbólico

CB609: K341Q K192Q 1,56 x 107 hiperbólico

CB611: K197L/D196L K60aL/D60L 4,39 x 107 hiperbólico

CB612: K197L/D196F K60aL/D60F 3,79 x 106 hiperbólico

CB613: K197L/D196M K60aL/D60M 1,86 x 107 hiperbólico

CB614: K197L/D196W K60aL/D60W 9,81 x 106 hiperbólico

CB615: K197E/D196F K60aE/D60F 1,87 x 107 hiperbólico

CB616: K197E/D196W K60aE/D60W 3,50 x 107 hiperbólico

CB617: K197E/D196V K60aE/D60V 6,50 x 106 hiperbólico

CB637: K197E/K341Q K60aE/K192Q 7,22 x 106 hiperbólico

CB638: K197L/K341Q K60aL/K192Q 6,66 x 106 hiperbólico

CB669: V158D/G237V/E296V/ M298Q V21D/E154V/M156Q/G97V 6,70 x 107 lineal

CB670: G237V/K341Q K192Q/G97V 1,57 x 107 hiperbólico

CB671: K197V/G237V/K341Q K60aE/K192Q/G97V 7,05 x 106 lineal

CB688: K197E/K199E K60aE/K60cE 9,85 x 106 hiperbólico

CB689: K197E/G237V K60aE/G97V 1,32 x 107 hiperbólico

CB690: K197E/G237V/M298Q K60aE/G97V/M156Q 3,19 x 107 lineal

CB691: K197E/K199E/K341Q K60aE/K60cE/K192Q 3,89 x 106 hiperbólico

CB692: K197E/G237V/M298Q/ K341Q K60aE/G97V/M156Q/K192Q 6,42 x 106 hiperbólico

CB693: K197E/K199E/G237V/ M298Q/K341Q K60aE/K60cE/G97V/M156Q /K192Q 3,49 x 106 hiperbólico

CB694: K199E/K341Q K60cE/K192Q 7,64 x 106 hiperbólico

CB695: G237V/M298Q G97V/M156Q 4,30 x 107 lineal

CB696: G237V/M298Q/K341Q G97V/M156Q/K192Q 4,25 x 107 lineal

CB697: R290N R 147N 1,36 x 107 hiperbólico

CB698: R290Q R147Q 8,59 x 106 hiperbólico

CB699: R290K R147K 1,52 x 107 hiperbólico

CB700: R290M R147M 1,23 x 107 hiperbólico

CB701: R290V R147V 2,66 x 106 hiperbólico

CB728: Intercambio de Gla FIX Intercambio de Gla FIX 3,83 x 107 lineal

CB729: Intercambio de Gla FX Intercambio de Gla FX 9,46 x 106 hiperbólico

CB730: Intercambio de Gla Proteína C Intercambio de Gla Prot C 3,19 x 106 hiperbólico

CB732: Intercambio de Gla Trombina Intercambio de Gla Trombina 1,04 x 107 hiperbólico

CB850: M298Q/Intercambio de Gla FIX M156Q/Intercambio de Gla FIX 7,51 x 107 lineal

CB733: K341N K192N 2,35 x 107 lineal

CB734: K341M K192M 8,35 x 106 hiperbólico

CB735: K341D K192D 1,44 x 107 lineal

CB854: G237T238insS G97T98insS 1,32 x 107 lineal

CB855: G237T238insV G97T98insV 1,23 x 107 lineal

CB856: G237T238insAS G97T98insAS 1,12 x 107 lineal

CB858: D196K197insK D60K60ainsK 3,03 x 107 lineal

CB859: D196K197insR D60K60ainsR 4,81 x 107 lineal

CB860: D196K197insY D60K60ainsY 3,93 x 107 lineal

CB866: K197I198insA K60aI60binsA 4,11 x 107 lineal

CB902: K197E/M298Q K60aE/M156Q 9,68 x 107 lineal

Tabla 17. Actividad catalítica de variantes de FVIIa: ensayo indirecto dependiente de FT con polipéptidos de FVIIa de células BHK-21

CB553: WT WT 5,42 x 107 lineal

CB592: M298Q M156Q 9,34 x 107 lineal

CB593: V158D/E296V/M298Q V21D/E154V/M156Q 2,04 x 108 lineal

CB728: Intercambio de Gla FIX Intercambio de Gla FIX 8,70 x 107 lineal

CB735: K341D K192D 1,02 x 107 lineal

CB853: G237T238insA G97T98insA 1,60 x 107 lineal

CB854: G237T238insS G97T98insS 1,67 x 107 lineal

CB855: G237T238insV G97T98insV 1,66 x 107 lineal

CB856: G237T238insAS G97T98insAS 1,68 x 107 lineal

CB857: G237T238insSA G97T98insSA 1,83 x 107 lineal

CB858: D196K197insK D60K60ainsK 3,55 x 107 lineal

CB859: D196K197insR D60K60ainsR 7,24 x 107 lineal

CB862: D196K197insA D60K60ainsA 4,31 3107 lineal

CB863: D196K197insM D60K60ainsM 3,61 x 107 lineal

CB864: K197I198insE K60aI60binsE 2,80 x 107 lineal

CB865: K197I198insY K60aI60binsY 4,27 x 107 lineal

CB867: K197I198insS K60aI60binsS 6,35 x 107 lineal

CB945: M298Q/K341D M156Q/K192D 1,04 x 107

Tabla 18. Actividad catalítica de variantes de FVIIa: ensayo indirecto independiente de FT

ID: Mutación (numeración de FVII maduro) Mutación (numeración de Quimiotripsina) Células 293-F Células BHK-21

Kcat /KM (M-1s-1): kcat/KM ( % WT) Kcat /KM (M-1s-1) kcat/KM ( % WT)

CB553: WT WT 22,60 1,58

CB592: M298Q M156Q 485,5 310,25

CB593: V158D/E296V/M29 8Q V21D/E154V/M156Q 5493,68 3217,77

CB669: V158D/G237V/E29 6V/M298Q V21D/E154V/M156Q/ G97V 2145,3

CB692: K197E/G237V/M29 8Q/K341Q K60aE/G97V/M156Q/ K192Q

CB695: G237V/M298Q G97V/M156Q 24,35

CB728: Intercambio de Gla FIX Intercambio de Gla FIX

CB850: M298Q/Intercambio de Gla FIX M156Q/Intercambio de Gla FIX 15,4

CB902: K197E/M298Q K60aE/M156Q 8,55

Ejemplo 12

Determinación de la inhibición de FVIIa/FT o FVIIa por AT-III/heparina

La potencia de la interacción entre el complejo de AT-III/heparina y FVIIa en presencia o ausencia de factor tisular soluble (FTs), es decir dependiente de FT o independiente de FT, se evaluó midiendo el nivel de inhibición de diversas concentraciones de AT-III en la actividad catalítica de FVIIa/FTs para un sustrato, Mesilo-FPR-ACC. El valor 10 de K0,5 se determinó para cada variante de FVIIa ensayada, que corresponde a la concentración molar de AT-III que se requería para inhibición del 50 % (CI50) de la variante de FVIIa en un ensayo de 30 minutos a temperatura ambiente (25 º).

Se prepararon dos ensayos separados, uno con FT y uno sin FT. Se preparó una solución 2 M de AT-III/heparina 15 (heparina final 5 mM) mezclando 26,4 l de AT-III 151,7 M (AT-III humano purificado en plasma; Molecular Innovations) con 50 l de heparina BPM 0,2 mM (CalBiochem), 400 l o tampón de ensayo 5 x (Hepes 100 mM, NaCl 750 mM, CaCl2 25 mM, BSA 0,05 %, PEG 8000 0,5 %, pH 7,4) y 1,523 ml de agua de calidad reactiva. Esta solución fue para su uso como la mayor concentración en el ensayo dependiente de FT. Se preparó una solución que contenía AT-III 4 M/heparina (heparina final 5 mM) para su uso en el ensayo independiente de FT mezclando 20 82,8 l de AT-III 151,7 M (Molecular Innovations) con 50 l de heparina BPM 0,2 mM (CalBiochem), 400 l de tampón de ensayo 5 x y 1,497 ml de agua de calidad reactiva. Las soluciones de AT-III/heparina se incubaron durante 5-10 minutos a temperatura ambiente y después se diluyeron dos veces en una placa de polipropileno de 96 pocillos profundos con un volumen final de 1 ml que contenía heparina 5 M, dando como resultado diluciones de 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 y 0 nM o 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 y 0 nM. Las variantes de 25 FVIIa y FVIIa de tipo silvestre se diluyeron a 250 nM en tampón de ensayo 1 x (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, BSA 0,01 %, PEG 8000 0,1 %, pH 7,4). Para el ensayo dependiente de FT, se formaron complejos de FVIIa 5

nM/FTs 50 nM mezclando 20 l de FVIIa con 10 l de FTs 5 M (Factor de Coagulación Humano III de R&D Systems: Nº 2339-PA), 200 l de tampón de ensayo 5 x y 770 l de agua de calidad reactiva incubando las soluciones durante 10-15 minutos a temperatura ambiente. Para ensayo independiente de FT, se mezclaron 100 l de FVIIa con 200 l de tampón de ensayo 5 x y 700 l de agua de uso reactivo para producir soluciones de FVIIa 25 nM. Para iniciar el ensayo, se mezclaron por separado 25 l de las soluciones de FVIIa/FT o FVIIa solo con 25 l de 5 cada dilución de AT-III/heparina en pocillos de una placa de ensayo de media área negra de 96 pocillos (Nunc). Las condiciones de ensayo finales para el ensayo dependiente de FT fueron FVIIa 2,5 nM/FTs 25 nM y concentraciones de AT-III/heparina que variaban de 1000 nM a 0 nM. Para el ensayo independiente de FT, las concentraciones de FVIIa fueron FVIIa 12,5 nM y las concentraciones de AT-III/heparina variaron de 2000 nM a 0 nM. Las placas se incubaron durante 30 minutos con agitación a temperatura ambiente (25 ºC). 10

Se preparó una solución de reserva de sustrato de FVIIa (Mesilo-FPR-ACC) disolviendo el sustrato en DMSO hasta 20 mM, preparando después una solución de trabajo de 0,5 mM en tampón de ensayo 1 x. Después de la incubación de la placa de ensayo anterior, se añadieron 50 l del sustrato de FVIIa a cada pocillo de la placa de ensayo. Las reacciones se mezclaron y la actividad residual de FVIIa se evaluó siguiendo las velocidades iniciales de escisión de 15 sustrato durante 15 minutos en un lector de fluorescencia ajustado a 30 ºC.

Para determinar el grado de inhibición por AT-III/heparina para FVIIA o variantes de FVIIa, los datos sin procesar recogidos con la aplicación SoftMax Pro (Molecular Devices) se exportaron como archivos .XML. Se realizaron análisis de datos no lineales adicionales con XLfit4, un paquete de software para ajuste de curvas automático y 20 análisis estadístico dentro del ambiente de hoja de cálculo de Microsoft Excel (IDBS Software). La plantilla de hoja de cálculo se usó para calcular la serie de diluciones de AT-III, la relación de AT-III y FVIIa y las relaciones de Vi/Vo para cada repetición de FVIIa a cada concentración de AT-III experimental. Se procesaron análisis de regresión no lineales de actividad de FVIIa residual (expresada como Vi/Vo) frente a la concentración de AT-III usado XLfit4 y una ecuación de inhibición hiperbólica de la forma ((C+(Amp*(1-(X/(K0,5+X))))); donde C = la compensación (fijada en 0 25 para permitir la extrapolación de conjuntos de datos que no alcanzan el 100 % de inhibición durante el transcurso del ensayo), Amp = la amplitud del ajuste y K0,5, que corresponde a la concentración de AT-III requerida para la inhibición semimáxima en las condiciones de ensayo. Para varias variantes de FVIIa, AT-III inhibió menos del 20-25 % de la actividad proteasa total a la mayor concentración ensayada de AT-III, representando un límite superior de detección para el ensayo. A las variantes con menos de 20-25 % de inhibición máxima se les asignó por lo tanto un 30 valor K0,5 de límite inferior (5 M para dependiente de FT y 10 M independiente de FT) y en la mayoría de los casos se esperaba que tuvieran resistencias a AT-III mayores que el valor indicado.

Las Tablas 19 y 20 proporcionan los resultados de los ensayos que se realizaron usando variantes de FVIIa expresadas en células Freestyle TM 293-F y/o células BHK-21 en presencia y ausencia de FT, respectivamente. Los 35 resultados se presentan tanto como el parámetro K0,5 ajustado como como una representación del alcance de la resistencia a AT-III para cada variante en comparación con el FVIIa de tipo silvestre expresado como una relación de sus valores de K0,5 ajustados (K0,5 variante/ K0,5 de tipo silvestre). Varias variantes de FVIIa mostraron resistencia aumentada a AT-III en comparación con FVIIa de tipo silvestre.

Tabla 19. Inhibición de las variantes de FVIIa por AT-III/heparina en presencia de FT

FVIIa: Mutación (numeración de FVII maduro) Mutación (numeración de Quimiotripsina) Ensayo de Resistencia a ATIII dependiente de FT

Células 293-F: Células BHK-21

K0,5 (nM): K0,5mut /K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut /K0,5wt

CB553: WT WT 72,3 1,0 56,0 1,0

CB593: V158D/E296V/M298Q V21D/E154V/M 156Q 75,1 1,0 79,0 1,4

CB609: K341Q K192Q 104,5 1,4

CB733: K341N K192N 41,2 0,6

CB734: K341M K192M 78,2 1,1

CB735: K341D K192D 1985,8 27,5

CB853: G237T238insA G97T98insA 169,5 3,0

CB854: G237T238insS G97T98insS 163,9 2,9

CB855: G237T238insV G97T98insV 189,6 2,6

CB856: G237T238insAS G97T98insAS 391,4 7,0

Células 293-F: Células BHK-21

K0,5 (nM): K0,5mut /K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut /K0,5wt

CB857: G237T238insSA G97T98insSA 266,9 4,8

CB858: D196K197insK D60K60ainsK 64,9 1,2

CB859: D196K197insR D60K60ainsR 34,0 0,6

CB860: D196K197insY D60K60ainsY 29,5 0,4

CB862: D196K197insA D60K60ainsA 60,7 1,1

CB863: D196K197insM D60K60ainsM 55,9 1,0

CB864: K197I198insE K60a160binsE 183,7 3,3

CB865: K197I198insY K60a160binsY 66,5 1,2

CB867: K197I198insS K60a160binsS 82,7 1,5

CB728: Intercambio de Gla FIX Intercambio de Gla FIX 68,8 1,0

Tabla 20. Inhibición de variantes de FVIIa por AT-III/heparina en ausencia de FT

FVIIa: Mutación (numeración de FVII maduro) Mutación (numeración de Quimiotripsina) Ensayo de Resistencia a ATIII independiente de FT

Células 293-F
Células 293-F

K0,5 (nM): K0,5mut /K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut /K0,5wt

CB553: WT WT 2265,8 1,0 2222,7 1,0

CB593: V158D/E296V/M29 8Q V21D/E154V/M156 Q 389,7 0,2 415,6 0,2

CB609: K341Q K192Q 4622,6 2,0

CB733: K341N K192N 1554,4 0,7

CB734: K341M K192M 5523,9 2,4

CB735: K341D K192D 10000,0 >4,4

CB853: G237T238insA G97T98insA 10000,0 >4,5

CB854: G237T238insS G97T98insS 10000,0 >4,5

CB855: G237T238insV G97T98insV 10000,0 >4,4

CB856: G237T238insAS G97T98insAS 10000,0 >4,5

CB857: G237T238insSA G97T98insSA 10000,0 >4,5

CB858: D196K197insK D60K60ainsK 9329,6 4,2

CB859: D196K197insR D60K60ainsR 4322,6 1,9

CB860: D196K197insY D60K60ainsY 2053,3 0,9

CB862: D196K197insA D60K60ainsA 7414,3 3,3

CB863: D196K197insM D60K60ainsM 7299,4 3,3

CB864: K197I198insE K60aI60binsE 10000,0 >4,5

CB865: K197I198insY K60aI60binsY 8800,4 4,0

Células 293-F
Células 293-F

K0,5 (nM): K0,5mut /K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut /K0,5wt

CB867: K197I198insS K60aI60binsS 10000,0 >4,5

CB728: Intercambio de Gla FIX Intercambio de Gla FIX 1005,2 0,4

Ejemplo 13

Determinación de la resistencia a IRFT de las variantes de FVIIa

La resistencia de diversas variantes de FVIIa a IRFT se evaluó usando el ensayo descrito en el Ejemplo 7, anterior. La Tabla 21 proporciona los resultados de los ensayos. Los resultados se expresan como el factor de resistencia de cada variante de FVIIa a IRFT en comparación con FVIIa de tipo silvestre.

Tabla 21. Inhibición de las variantes de FVIIa por IRFT 10

ID: Mutación (numeración de FVII maduro) Mutación (numeración de quimiotripsina) Factor de resistencia a IRFT

CB553: wt wt 1,0

CB554: D196K D60K 0,6

CB555: D196R D60R 0,5

CB556: D196A D60A <0,3

CB557: K197D K60aD 3,0

CB558: K197E K60aE 1,3

CB559: K197A K60aA 0,7

CB560: K197L K60aL 16,0

CB561: K197Y K60aY 1,5

CB562: K199D K60cD 0,9

CB563: K199E K60cE 1,3

CB564: K199A K60cA 0,9

CB565: T239A T99A 4,5

CB566: R290D R147D 3,3

CB567: R290E R147E 6,1

CB568: R290A R147A 2,8

CB569: K341R K192R 4,1

CB579: D196R/R290E D60R/R147E 0,4

CB580: D196K/R290E D60K/R147E 0,7

CB581: D196R/R290D D60R/R147D 0,4

CB586: D196R/K197E/K199E D60R/K60aE/K60cE <0,3

CB587: D196K/K197E/K199E D60K/K60aE/K60cE 0,3

CB588: D196R/K197E/ K199E/R290E D60R/K60aE/K60cE/R147E 0,4

CB589: D196R/K197M/K199E D60R/K60aM/K60cE 0,6

CB590: D196R/K197M/K199E/R290E D60R/K60aM/K60cE/R147E 0,9

CB591: L305V/S314E/L337A/F374Y L163V/S170bE/K188A/F225Y 0,6

CB592: M298Q M156Q 0,5

CB593: V158D/E296V/M298Q V21D/E154V/M156Q 0,8

CB594: V158D/E296V/M298Q/K337A V21D/E154V/M156Q/K188A 0,3

CB595: K197I K60aI 0,8

CB596: K197V K60aV 0,6

CB597: K197F K60aF <0,3

CB598: K197W K60aW <0,3

CB599: K197M K60aM 0,3

CB600: D196F D60F <0,3

CB601: D196Y D60Y <0,3

CB602: D196W D60W <0,3

CB603: D196L D60L <0,3

CB604: D196I D60I <0,3

CB605: G237W G97W <0,3

CB606: G237T G97T 0,3

CB608: G237V G97V 0,8

CB609: K341Q K192Q 12,2

CB611: K197L/D196L K60aL/D60L <0,3

CB612: K197L/D196F K60aL/D60F <0,3

CB614: K197L/D196W K60aL/D60W <0,3

CB615: K197F/D196F K60aE/D60F <0,3

CB617: K197E/D196V K60aE/D60V <0,3

CB637: K197E/K341Q K60aE/K192Q 80,7

CB638: K197L/K341Q K60aL/K192Q 39,0

CB670: G237V/K341Q G97V1K192Q 14,1

CB671: K197V/G237V/K341Q K60aE/G97V/K192Q 18,9

CB688: K197E/K199E K60aE/K60cE 2,1

CB689: K197F/G237V K6DaE/G97V 1,7

CB691: K197E/K199E/K341Q K60aE/K60cE/K192Q 34,3

CB692: K197E/G237V/M298Q/K341Q K60aE/G97V/M156Q/K192Q 15,2

CB693: K197E/K199E/G237V/M298Q/ K341Q K60aE/K60cE/G97V/M156Q/ K192Q 22,1

CB694: K199E/K341Q K60cE/K192Q 19,1

CB696: G237V/M298Q/K341Q G97V/M156Q/K192Q 3,2

CB697: R290N R147N 1,5

CB698: R290Q R147Q 1,2

CB699: R290K R147K 0,6

CB700: R290M R147M 1,0

CB701: R290V R147V 2,5

CB733: K341N K192N 10,7

CB734: K341M K192M 4,4

CB735: K341D K192D 148,0

Ejemplo 14

Evaluación in vivo de la actividad procoagulante de polipéptidos de FVIIa

Se estableció un modelo de ratón de hemofilia A para evaluar la actividad procoagulante de polipéptidos de FVIIa. Se indujo hemofilia A en ratones CD-1 por administración de anticuerpos anti FVIII, seguido de retirada quirúrgica de las puntas de las colas para iniciar el sangrado (similar al descrito anteriormente, en el Ejemplo 8). También se usaron ratones deficientes en FVIII (ratones FVIII-/-), pero no se trataron con anticuerpos anti FVIII. Los ratones se trataron después con polipéptido de FVIIa y se midió la cantidad de sangre perdida en 20 minutos para determinar la 10 actividad procoagulante de los polipéptidos de FVIIa.

A. Análisis de la actividad coagulante de FVIIa en ratones CD-1 con hemofilia A inducida

Se llevaron a cabo experimentos iniciales para determinar la dosis requerida y el tiempo y duración del efecto de 15 anticuerpos anti FVIII humano cuando se proporcionaron por la vía intraperitoneal para inducir hemofilia en ratones CD-1. Para el primer lote de anti FVIII (lote 1; Affinity Biologicals, lote IG129R4), esta se basó inicialmente en la dosis usada para los experimentos de canulación, descritos anteriormente en el Ejemplo 8. La dosis que se determinó que provocaba un estado hemofílico (sangrado incontrolado durante un periodo de ensayo de 20 minutos) fue de 7,54 mg/ratón (80 l de una solución de reserva 94,25 mg/ml). Este lote tuvo una actividad neutralizante de 20 612 BU de ratón/ml. Para el segundo lote de anti FVIII humano (lote 2; Affinity Biologicals, lote IG1577R2, actividad neutralizante de 474 BU de ratón/ml), la dosis usada fue de 11,98 mg/ratón (120 l de una solución de reserva 99,8 mg/ml) y se administró a 6 horas antes del corte de la cola.

Para inducir hemofilia, se dosificó a ratones CD-1 macho (25-35 g) por vía intraperitoneal con el lote 1 o el lote 2 de 25 anti FVIII antes del experimento. Se anestesió a ratones macho CD-1 y FVIII-/- por administración intraperitoneal de un cóctel de ketamina/xilacina (solución 100 mg/ml) y se colocaron en una plataforma caliente (39 ºC) para asegurar que no hubiera una bajada de la temperatura corporal. La habitación de procedimiento se mantuvo a una temperatura de 27,78 ºC. Diez minutos antes del corte de la cola, la cola se sumergió en 10 ml de PBS precalentado (tubo de centrífuga de 15 ml; 39 ºC). Se inyectó a de ocho a diez ratones FVIIa humano recombinante (Novoseven®, 30 Novo Nordisk) o polipéptidos de FVII modificados diluidos en un tampón compuesto de cloruro sódico 52 mM, cloruro cálcico deshidratado 10,2 mM, glicilglicina 9,84 mM, polisorbato 80 0,01 % y manitol 165 mM a través de la vena de la cola en una única inyección. También se inyectó solamente vehículo en un grupo de ratones como un control. Si no se realizó la inyección, el animal se excluyó del estudio. Se realizó una inyección con agente de ensayo o vehículo 5 minutos antes del corte de la cola. Se realizó un corte de la cola usando una cuchilla a 5 mm del 35 extremo de la cola y se recogió sangre en PBS durante un periodo de 20 minutos. Al final del periodo de recogida, se evaluó la pérdida de sangre total. Los tubos de recogida se mezclaron y se tomó una alícuota de 1 ml de cada muestra y se ensayó con respecto a contenido de hemoglobina. Se diluyó Triton X-100 1 en 4 en agua estéril y se añadieron 100 l a las muestras de 1 ml para provocar hemólisis. La absorbancia de las muestras se midió después a una longitud de onda de 546 nm. Para calcular la cantidad de sangre perdida, se leyó la absorbancia frente a una 40 curva patrón generada midiendo la absorbancia a 546 nm de volúmenes conocidos de sangre murina, diluida en PBS y hemolisada como anteriormente con Triton X 100.

También se realizó un estudio de respuesta a dosis en el que se evaluó 0,3, 1 o 3 mg/kg de CB553 (FVIIa de tipo silvestre). Los ratones que recibieron el vehículo perdieron 1002,3  60,71 l en el ensayo de 20 minutos. Esto se 45 redujo significativamente en ratones a los que se administraron 3 mg/kg de CB553, a 415,5  90,85 l (p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de post ensayo de Dunn). La reducción de la dosis a 1 mg/kg dio como resultado pérdida de sangre de 679,57  83,95 l y una dosis menor de 0,3 mg/kg dio como resultado pérdida de sangre de 852,42  94,46 l.

En un estudio separado, se evaluó CB735 (K341D) y CB945 (M298Q/K341D) a una dosis de 3 mg/kg. La inyección solo con vehículo se usó como un control. Los grupos de ratones que recibieron el vehículo solamente perdieron entre 803  92,18 l y 813,1  82,66 l de sangre en el ensayo de 20 minutos. Esto fue similar al tratamiento con CB735 o CB945, que dio como resultado 746  110,5 l y 870,9  78,38 l de pérdida de sangre, respectivamente.

B. Análisis de la actividad coagulante de FVIIa en ratones FVIII-/-

También se usó un modelo de ratón de hemofilia A usando ratones deficientes en FVIII (ratones FVIII-/-) para evaluar la actividad coagulante de polipéptidos de FVIIA, usando los mismos protocolos que se han descrito anteriormente excepto que los ratones no se trataron con anticuerpos anti FVIII. 5

1. Estudio de respuesta a dosis que evalúa la actividad coagulante de FVIIa de tipo silvestre

Se realizaron estudios de respuesta a dosis para evaluar la actividad coagulante de NovoSeven® y CB553 en ratones FVIII-/- a 0,3, 1, 3 y 6 mg/kg. En el experimento de NovoSeven®, la pérdida de sangre en el grupo de 10 vehículo fue de 912,79  38,32 l, lo que se redujo significativamente por el tratamiento con NovoSeven® a 6 y 3 mg/kg (hasta 361,74  55,28 l y 586,98  60,56 l; p < 0,05 usado Kruskal-Wallis seguido de post ensayo de Dunn). La reducción de la dosis a 1 mg/kg dio como resultado pérdida de sangre de 674,84  46,88 l y a la dosis menor ensayada el valor fue de 801,08  41,39 l. En el experimento de CB553, el grupo de control de vehículo produjo pérdida de sangre de 904,08  15,38 l. Esto se redujo significativamente (p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido 15 de post ensayo de Dunn) por CB553 a 6 mg/kg hasta 451,04  74,17 l. La reducción de la dosis a 3 mg/kg produjo un valor de pérdida de sangre de 695,75  60,50 l mientras que la reducción de la dosis adicionalmente a 1 y 0,3 mg/kg dio como resultado valores de pérdida de sangre cerca de y a niveles de control de vehículo (846,08  34,17 l y 936,43  31,39 l, respectivamente).

Ejemplo 15

Determinación de la unión del factor VIIa con factor tisular soluble

La capacidad de las variantes de FVIIa expresadas a partir de células HEK 293 o BHK para unirse con el factor 25 tisular soluble (FTs) se evaluó usando resonancia de plasmón superficial de Biacore. Las variantes de FVIIa se evalúan mediante medición del perfil de unión a tres concentraciones de proteasa en dos experimentos duplicados, usando dos niveles diferentes de FTs unido con una microplaca CM5 de Biacore.

Se acopló una nueva microplaca sensora CM5 Serie S (GE Healthcare Cat Nº BR1006-68) con albúmina de suero 30 bovino y factor tisular soluble usando un instrumento Biacore T100. El acoplamiento se efectuó usando Tampón de Acoplamiento Biacore (Hepes Na 30 mM pH 7,4, NaCl 135 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 0,01 %) con un kit de acoplamiento de Amina (GE Healthcare Cat Nº BR-1000-50) y el asistente de protocolo en el software de Biacore T100. Para la inmovilización, se usaron las cuatro celdas de la microplaca. Las celdas 1 y 3 se acoplaron con proteína de referencia de albúmina de suero bovino de 500 unidades de respuesta (UR) diluida en tampón de 35 acetato, pH 4,0 y las celdas 2 y 4 se acoplaron con 500 y 250 UR de FTs (R&D Systems) diluido en tampón de Acetato, pH 4,5.

Cada variante de FVIIa, y la proteasa FVIIA de tipo silvestre, se ensayaron a tres concentraciones y por duplicado. Las proteasas se diluyeron a 60 nM, 30 nM y 15 nM en 100 l del tampón de Ensayo Biacore (Hepes Na 200 mM, 40 pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, PEG 8000 0,1 %, BSA 0,1 %, Tween-20 0,01 %) en una placa de ensayo de 96 pocillos. Cada muestra de ensayo se evaluó en el instrumento Biacore T100 usando 120 segundos de tiempo de contacto seguido de 180 segundos de tiempo de disociación a un caudal de 10 l/minuto. También se ensayó un blanco de tampón. La microplaca se regeneró con EDTA 50 mM, pH 7,0 durante 60 segundos, después 30 segundos. El ensayo para medir la unión de FVIIa de tipo silvestre con FTs debería producir tres conjuntos de 45 curvas que proporcionan una Kd de aproximadamente 8 nM.

Se usó software Biacore T100 Evaluation para analizar los datos. Específicamente, se utilizó análisis de unión de Cinética/Afinidad 1:1, que ajusta los datos a la isoterma de Langmuir, y los datos se ajustaron individualmente para dos repeticiones de cada variante en dos acoplamientos de unidades de respuesta. Los cuatro valores de Kd 50 ajustados se promediaron y se presentan en la Tabla 22. Los polipéptidos de FVIIa que contenían la mutación M156Q tendieron a tener resultados de Kd menores y por lo tanto se unían más estrechamente a FTs.

Tabla 22. Unión de variantes de FVIIa con FT soluble

ID: Mutación (numeración de FVII maduro) Mutación (numeración de quimiotripsina) Kd de afinidad (nM)

HEK 293: BHK

CB553: WT WT 7,9 9,0

CB592: M298Q M156Q 3,9

CB593: V158D/E296V/M298Q V21D/E154V/M156Q 8,0

CB669: Q158D/G237V/E296V/M298Q V21D/E154V/M156Q/G97V 14,9

CB690: K197E/G237V/M298Q K60aE/G97V/M156Q 4,8

CB691: K197E/K199E/K341Q K60aE/K60cE/K192Q 6,6

CB692: K197E/G237V/M298Q/K341 Q K60aE/G97V/M156Q/K192Q 5,9

CB693: K197E/K199E/G237V/M298 Q/K341Q K60aE/K60cE/G97V/M156Q /K192Q 6,4

CB695: G237V/M298Q G97V/M156Q 3,8

CB696: G237V/M298Q/K341Q G97V/M156Q/K192Q 2,5

CB946: M298Q/K341D M156Q/K192D 7,9

Ejemplo 16

Exploración de resonancia de plasmón superficial (RPS) de variantes de FVIIa con respecto a resistencia a IRFT 5

Se evaluó la resistencia relativa de diversas variantes de FVIIA a la inhibición por IRFT soluble recombinante humano usando un ensayo de resonancia de plasmón superficial (RPS) de alto rendimiento con el instrumento Biacore T100. La resistencia relativa de variantes de FVIIa a la inhibición por IRFT se evaluó por medición de la cantidad relativa de la variante de FVIIa unida con IRFT soluble inmovilizado en una microplaca sensora CM5 10 Biacore en comparación con la cantidad de FVIIa de tipo silvestre unido después de un tiempo de inyección y concentración de proteasa normalizados.

Para cada experimento, se inmovilizó IRFT soluble (R&D Systems) en una nueva microplaca sensora Biacore CM5 Serie S de 4 celdas de flujo (GE Healthcare) usando el protocolo de acoplamiento de amina disponible dentro del 15 Software de control de Biacore T-100 (GE Healthcare) y los reactivos proporcionados con el Kit de Acoplamiento de Amina (GE Healthcare). Las cuatro celdas de flujo disponibles se utilizaron para inmovilización de dos densidades diferentes de IRFT y albúmina de suero bovino (BSA), que actuó como un agente de bloqueo en las celdas de referencia. BSA se diluyó a 5 g/ml en acetato sódico (pH 4,0) y se inmovilizó en las celdas de flujo 1 y 3 a 1000 y 2000 unidades de respuesta (UR), respectivamente. Para inmovilización de IRFT, se resuspendió IRFT soluble 20 liofilizado (10 g) en 100 l de Tampón de Acoplamiento 1X (Hepes 30 mM, NaCl 135 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 0,01 %, pH 7,4) a una concentración de 0,1 mg/ml. Se diluyó un total de 20 l de IRFT 0,1 mg/ml a 10 g/ml en acetato sódico pH 4,0 para inmovilización en células de flujo 2 y 4 a 1000 y 2000 UR, respectivamente. El tampón de acoplamiento se usó como el tampón de ejecución durante las etapas de inmovilización.

Cada muestra de FVIIA se preparó a una concentración final de 320 nM en Tampón de Ejecución 1X (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, PEG 8000 0,1 %, BSA 0,1 %, Tween-20 0,01 %, pH 7,4) que contenía FTs 620 nM (Factor de Coagulación Humano III; R&D Systems). En general, cada variante de FVIIa se diluyó 10 veces en Tampón de Ejecución 1X antes de la dilución final de 320 nM. Se prepararon complejos FVIIa/FTs a un volumen final de 120 l por duplicado permitiendo que se cargaran hasta 48 variantes de FVIIa únicas en una placa de 30 almacenamiento de 96 pocillos y se evaluó con inyecciones por duplicado en una única ejecución. El complejo de FVIIa/FTs se incubó a TA durante 10-15 minutos antes del inicio de la primera inyección de muestra.

Se creó un método de análisis de unión normalizado dentro del Software de Control Biacore (GE Healthcare) en el que cada repetición de FVIIa se inyecta durante 180 segundos del tiempo de asociación seguido de unos escasos 35 60 segundos de disociación a un caudal de 10 l/minuto. La regeneración de la microplaca sensora siguió a la fase de disociación durante 30 segundos con glicina 10 mM, NaCl 500 mM, pH 3,0 y después un periodo de estabilización de 60 segundos con Tampón de Ejecución 1X al mismo caudal de 10 l/minuto. Se registraron dos puntos de referencia de ensayo para cada ciclo y posterior análisis de datos, uno 5 segundos antes de la conclusión de la fase de asociación (unión) y un segundo indicado 5 segundos antes de la conclusión de la fase de disociación 40 (disociación). Antes de iniciar un ensayo completo, la microplaca sensora se ensayó con una única inyección de FVIIA de tipo silvestre/FTs 320 nM durante 180 segundos, que debería dar una respuesta de aproximadamente 400-450 UR y 750-850 UR para unión con las celdas de flujo 2 (1000 UR) y 4 (200 UR), respectivamente.

Se realizó en primer lugar análisis de datos con el Software de Evaluación Biacore T100 (GE Healthcare) para 45 inspeccionar los parámetros de validación de ensayo, que incluyen verificar que la unión con la celda de referencia es mínima, deriva de la línea basal y la unión de inyecciones de blanco de control (tampón de ejecución). Se generaron tablas de datos dentro de esta aplicación que indicaban la cantidad de FVIIa variante unida (en UR) tanto en el punto de notificación de unión como en el punto de notificación de disociación. Las tablas de datos se exportaron posteriormente para análisis adicional dentro del ambiente de hoja de cálculo de Microsoft Excel. Los 50 puntos de datos sin procesar (UR unido) se corrigieron con respecto a unión de control con la microplaca sensora y después se tomó una relación de la cantidad de FVIIa de tipo silvestre unido (en UR) con la cantidad de variante de

FVIIa unido (en UR) para cada parámetro y se presentó como unión (p/variante) y Disociación (p/variante). La resistencia a inhibición por IRFT se refleja como un aumento en la relación de uno o ambos de los parámetros evaluados. Por ejemplo, un valor de Unión (p/variante) o Disociación (p/variante) de 20 para una variante de FVIIa particular indica que esa variante es 20 veces más resistente a la inhibición por IRFT que FVIIa de tipo silvestre. Varias variantes mostraron resistencia aumentada a inhibición por IRFT. Por ejemplo, CB609, CB637, CB691, 5 CB856 y CB857 están entre el grupo que mostró resistencia de 20 a 60 veces y variantes que contenían la K341D por numeración de FVII maduro (correspondiente a por numeración de quimiotripsina) tal como CB735, tienen relaciones que indican resistencia significativa a IRFT (mayor de 50-150 veces) y variantes que contienen la mutación K192D (CB945) tienen una relación que indica resistencia significativa a IRFT (mayor de 40-150 veces). En algunos casos, la velocidad de disociación se vio afectada más que la velocidad de asociación. Algunos ejemplos 10 de variantes que mostraron este perfil son CB735, CB854, CB855, CB856 y CB857.

Ejemplo 17

Determinación de la concentración de proteasa catalíticamente activa usando el agente de valoración de sitio activo 4-metilumbeliferil p’-guanidinobenzoato (MUGB)

La concentración de FVIIa catalíticamente activo en una solución de reserva se determinó valorando un complejo de FVIIa y factor tisular soluble (FTs) con 4-metilumbeliferil p’-guanidinobenzoato (MUGB), un sustrato de éster fluorogénico desarrollado como un sitio activo para serina proteasas de tipo tripsina. El ensayo se llevó a cabo esencialmente como se describe en Payne et al. (Biochemistry (1996) 35: 7100-7106) con algunas modificaciones menores. MUGB reacciona fácilmente con FVIIa, pero no FVII o proteasa inactiva, para formar un intermedio de 10 acilo-enzima eficazmente estable en condiciones en las que la concentración de MUGB es de saturación y la desacilación es especialmente lenta y limitante de la velocidad para catálisis. En estas condiciones, la proteasa FVIIa experimenta una única renovación catalítica para liberar el fluoróforo de 4-metilumbeliferona (4-MU). Cuando el estallido inicial de fluorescencia se calibra para una curva patrón de concentración externa de fluorescencia de 4-MU, puede calcularse la concentración de sitios activos. 15

Se realizaron ensayos con un volumen de reacción de 2 ml en una cubeta de cuarzo de 1 cm x 1 cm con agitación continua. Cada reacción contenía FTs 0,5 M (R&D Systems Human) en un tampón de ensayo que contenía Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM y PEG 8000 0,1 %, pH 7,6. La solución convencional de 4-MU se preparó nueva a una concentración de reserva de 0,5 M en DMSO y la concentración se confirmó por espectroscopia de 20 absorbancia a 360 nm usando un coeficiente de extinción de 19.000 M-1 cm-1 en tampón de Tris 50 mM, pH 9,0. Se preparó MUGB a una concentración de reserva de 0,04 M en DMSO basándose en el peso seco. Los ensayos se iniciaron añadiendo 4 l de MUGB 4 mM (concentración final 8 M) a una solución de FTs 0,5 M (20,2 l de FTs 49,4 M) en tampón de ensayo 1X y midiendo en primer lugar la hidrólisis de fondo de MUGB durante 150-200 segundos antes de la adición de FVIIa o variante de FVIIa hasta una concentración final de 100-200 nM basándose 25 en el ELISA inicial (Ejemplo 2C. 1) o la valoración de sitio activo con FFR-CMK (Ejemplo 6). La liberación de fluorescencia de 4-MU en la fase de estallido de la reacción se siguió durante 1000-1200 segundos adicionales. Se prepara una curva patrón de 4-MU libre por valoración de la 4-MU con absorbancia calibrada en tampón de ensayo 1X que contenía FTs 0,5 M en etapas de 20 nM hasta una concentración final de 250 nM.

Para análisis de datos, se importaron rastros de reacción al paquete de software Graphpad Prism y se restó la contribución de la hidrólisis de fondo de la curva por extrapolación de la velocidad inicial medida de hidrólisis de MUGB espontánea, que era típicamente menor del 5 % del estallido de fluorescencia total. La curva corregida se ajustó a una única ecuación exponencial con un componente lineal (para explicar la lenta velocidad de desacilación) de la forma Fluorescencia = Amp(1-e-kt)+Bt, donde Amp = la amplitud de la fase de estallido en las condiciones de 35 ensayo de saturación perfiladas anteriormente, k es la constante de velocidad de primer orden observada para la formación de acilo-enzima y B es una constante de velocidad aparente asociada con renovación completa de MUGB. La concentración de proteasa FVIIa activa se calcula por comparación del parámetro de ajuste con respecto a amplitud con la curva patrón de 4-MU. Los valores de múltiples ensayos se midieron, se promediaron y se determinó la desviación típica. 40

Ya que resultarán evidentes para los expertos en esta materia modificaciones, se pretende que la presente invención se limite solamente por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS 45

<110> Catalyst Biosciences, Inc. Edwin Madison Christopher Thanos Sandra Waugh Ruggles Shaun Coughlin

<120> POLIPÉPTIDOS DE FACTOR VII MODIFICADOS Y USOS DE LOS MISMOS

<130> 119357-00067/4913PC

<140> Aún no asignado

<141> Con la presente

<150> 60/923.512

<151>

<160> 250

<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 466

<212> PRT 65

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Isoforma a del precursor del Factor VII

<400> 1

<210> 2

<211> 444

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Isoforma b del precursor del Factor VII

<400> 2

<210> 3

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Factor VIIa

<400> 3

<210> 4

<211> 447 5

<212> PRT

<213> Bos taurus

<220>

<223> Precursor del Factor VII

<400> 4

5

<210> 5

<211> 446

<212> PRT 5

<213> Mus musculus

<220>

<223> Precursor del Factor VII

<400> 5

<210> 6

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Pan paniscus

<220>

<223> Precursor del Factor VII

<220>

<221> INCIERTO

<222> (0)...(0)

<223> Xaa podría ser cualquier aminoácido 15

<400> 6

<210> 7

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Pan troglodytes

<220>

<223> Precursor del Factor VII

<220>

<221> INCIERTO

<222> (0)...(0)

<223> Xaa podría ser cualquier aminoácido

<400> 7

<210> 8

<211> 444

<212> PRT 5

<213> Oryctolagus cuniculus

<220>

<223> Precursor del Factor VII

<400> 8

<210> 9

<211> 446

<212> PRT 5

<213> Rattus norvegicus

<220>

<223> Precursor del Factor VII

<400> 9

<210> 10

<211> 469

<212> PRT 5

<213> Macaca mulatta

<220>

<223> Precursor del Factor VII

<400> 10

<210> 11

<211> 445

<212> PRT

<213> Sus scrofa 5

<220>

<223> Precursor del Factor VII (isoforma b)

<400> 11 10

<210> 12

<211> 446

<212> PRT 5

<213> Canis familiaris

<220>

<223> Precursor del Factor VII

<400> 12

<210> 13

<211> 433

<212> PRT 5

<213> Brachydanio rerio

<220>

<223> Precursor del Factor VII

<400> 13

<210> 14

<211> 441

<212> PRT 5

<213> Fugu rubripes

<220>

<223> Precursor del Factor VII

<400> 14

<210> 15

<211> 425

<212> PRT 5

<213> Gallus gallus

<220>

<223> Precursor del Factor VII

<400> 15

<210> 16

<211> 444

<212> PRT

<213> Pongo pygmaeus

<220>

<223> Factor VII (fragmento)

<400> 16

<210> 17

<211> 221

<212> PRT 5

<213> Gorilla gorilla

<220>

<223> Factor VII (fragmento)

<220>

<221> INCIERTO

<222> (0)...(0)

<223> Xaa podría ser cualquier aminoácido 15

<400> 17

<210> 18

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60K

<400> 18

<210> 19

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60R

<400> 19

<210> 20

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60A

<400> 20

<210> 21

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa K60aY

<400> 21

<210> 22

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa K60aA

<400> 22

<210> 23

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa K60aE

<400> 23

<210> 24

<211> 406 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa K60aD 10

<400> 24

<210> 25

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa K60aL

<400> 25

<210> 26

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 5

<223> Variante del factor VIIa K60aM

<400> 26

10

<210> 27

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<223> Variante del factor VIIa K60cA

<400> 27 10

<210> 28

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa K60cD

<400> 28

<210> 29

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa K60cE

<400> 29

<210> 30

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa T99A

<400> 30

5

<210> 31

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa R147A

<400> 31

<210> 32

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa R147E

<400> 32

<210> 33

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa R147D

<400> 33

<210> 34

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa K192E

<400> 34

<210> 35

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa K192R

<400> 35

<210> 36

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60R/R147E

<400> 36

<210> 37

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60K/R147E

<400> 37

5

<210> 38

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60R/R147D 5

<400> 38

10

<210> 39

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60R/K60aE/K60cE

<400> 39

<210> 40

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60K/K60aE/K60cE

<400> 40

<210> 41

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60R/K60aE/K60cE/R147E

<400> 41

<210> 42

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60R/K60aM/K60cE

<400> 42

<210> 43

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60R/K60aM/K60cE/R147E

<400> 43

<210> 44

<211> 466 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII L13P 10

<400> 44

<210> 45

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor F64L)

<400> 45

<210> 46

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor L73Q)

<400> 46

<210> 47

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor E79Q)

<400> 47

<210> 48

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor S120P)

<400> 48

<210> 49

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor C121F)

<400> 49

<210> 50

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor L125P)

<400> 50

<210> 51

<211> 466

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor Y128C)

<400> 51

<210> 52

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor R139K)

<400> 52

<210> 53

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor R139Q)

<400> 53

<210> 54

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor R139W)

<400> 54

<210> 55

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor C151S)

<400> 55

<210> 56

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor E154K)

<400> 56

<210> 57

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor G157C)

<400> 57

5

<210> 58

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor G157S)

<400> 58

<210> 59

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor G157V)

<400> 59

<210> 60

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor Q160R)

<400> 60

<210> 61

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor P194T)

<400> 61

<210> 62

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor C195R)

<400> 62

<210> 63

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor K197E)

<400> 63

<210> 64

<211> 466

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor R212Q)

<400> 64

<210> 65

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor G216D)

<400> 65

<210> 66

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor C238Y)

<400> 66

<210> 67

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor T241N)

<400> 67

<210> 68

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor C254Y)

<400> 68

<210> 69

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor A266T)

<400> 69

<210> 70

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor R283W)

<400> 70

<210> 71

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor V295D)

<400> 71

<210> 72

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor D302H)

<400> 72

<210> 73

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor D302N)

<400> 73

<210> 74

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor A304T)

<400> 74

<210> 75

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor A304V)

<400> 75

<210> 76

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor R307C)

<400> 76

<210> 77

<211> 466

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<223> Variante de FVII (precursor R307H)

<400> 77 10

<210> 78

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor V312M)

<400> 78

<210> 79

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor E325K)

<400> 79

<210> 80

<211> 466

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor T332M)

<400> 80

<210> 81

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor V341F)

<400> 81

<210> 82

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220 >

<223> Variante de FVII (precursor A352T)

<400> 82

<210> 83

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor A354V)

<400> 83

<210> 84

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor M358I)

<400> 84

<210> 85

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor M358V)

<400> 85

<210> 86

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor P363R)

<400> 86

<210> 87

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor R364Q)

<400> 87

<210> 88

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor T367S)

<400> 88

<210> 89

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor C370F)

<400> 89

<210> 90

<211> 466

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor C389G)

<400> 90

<210> 91

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor G391S)

<400> 91

<210> 92

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor G402E)

<400> 92

<210> 93

<211> 466

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<223> Variante de FVII (precursor G402R)

<400> 93 10

<210> 94

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor D403H)

<400> 94

<210> 95

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor R413Q)

<400> 95

<210> 96

<211> 466

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor T419M)

<400> 96

<210> 97

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor G435E)

<400> 97

<210> 98

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor E445K)

<400> 98

<210> 99

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor R375W)

<400> 99

5

<210> 100

<211> 466

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante de FVII (precursor R375K)

<400> 100

<210> 101

<211> 304

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Precursor de la isoforma a de IRFT

<400> 101

<210> 102

<211> 276

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Isoforma a de IRFT madura

<400> 102

<210> 103

<211> 251

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Precursor de la isoforma b de IRFT

<400> 103

<210> 104

<211> 222

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Isoforma b de IRFT madura

<400> 104

<210> 105 15

<211> 213

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 20

<223> IRFT-2 maduro

<400> 105

<210> 106

<211> 55

<212> PRT 5

<213> Bos taurus

<220>

<223> K-1 de ITPB 5L15

<400> 106

<210> 107 15

<211> 245

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 20

<223> Quimotripsinógeno B maduro

<400> 107

<210> 108

<211> 3141

<212> ADN 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante 1 de transcrito de FVII

<400> 108

<210> 109

<211> 3075

<212> ADN 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante 2 de transcrito de FVII

<400> 109

<210> 110

<211> 46

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> dominio Gla del factor IX

<400> 110

<210> 111

<211> 45

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> dominio Gla del factor X

<400> 111

<210> 112 15

<211> 46

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 20

<223> dominio Gla de protrombina/trombina

<400> 112

25

<210> 113

<211> 46

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30

<220>

<223> dominio Gla de proteína C

<400> 113 35

<210> 114

<211> 46 40

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> dominio Gla de proteína S

<400> 114

<210> 115 10

<211> 47

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 15

<223> dominio Gla de osteocalcina (proteína Gla del hueso)

<400> 115

20

<210> 116

<211> 47

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25

<220>

<223> dominio Gla de proteína Gla de la matriz

<400> 116 30

<210> 117

<211> 42 35

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> dominio Gla de proteína específica de detención del crecimiento 6 40

<400> 117

<210> 118

<211> 46

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> dominio Gla de proteína Z

<400> 118

<210> 119 15

<211> 45

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 20

<223> dominio Gla del factor VII

<400> 119

<210> 120

<211> 40

<212> PRT 30

<213> Notechis scutatus scutatus

<220>

<223> Proteasa de tipo factor de coagulación de veneno Xa - dominio Gla

<220>

<221> INCIERTO

<222> (0)...(0)

<223> Xaa podría ser cualquier aminoácido

<400> 120

<210> 121

<211> 46

<212> PRT 5

<213> Tropidechis carinatus

<220>

<223> Proteasa de tipo factor de coagulación de veneno Xa - dominio Gla

<400> 121

<210> 122 15

<211> 464

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 20

<223> Precursor de antitrombina III

<400> 122

<210> 123

<211> 432

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 5

<223> Antitrombina III madura

<400> 123

10

<210> 124

<211> 263

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<221> THIOLEST

<222> (0)...(0) 10

<223> Factor tisular maduro

<400> 124

15

<210> 125

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60Y

<400> 125

<210> 126

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60F

<400> 126

<210> 127

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60W

<400> 127

<210> 128

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60L

<400> 128

<210> 129

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60I

<400> 129

<210> 130

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa K60aI

<400> 130

<210> 131 5

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa K60aV

<400> 131

<210> 132

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 5

<223> Variante del factor VIIa K60aF

<400> 132

10

<210> 133

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa K60aW

<400> 133

<210> 134

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa G97W

<400> 134

<210> 135

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa G97T

<400> 135

<210> 136

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa G97I

<400> 136

<210> 137

<211> 406 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa G97V

<400> 137

5

<210> 138

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa K192Q

<400> 138

<210> 139

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60K/K60aL

<400> 139

<210> 140

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60F/K60aL

<400> 140

<210> 141

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60L/K60aL

<400> 141

<210> 142

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60M/K60aL

<400> 142

<210> 143

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60W/K60aL

<400> 143

<210> 144

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60F/K60aE

<400> 144

<210> 145 5

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60W/K60aE

<400> 145

<210> 146

<211> 406 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa D60V/K60aE 5

<400> 146

10

<210> 147

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<223> Variante del factor VIIa L163V/S170bE/K188A/F225Y

<400> 147 10

<210> 148

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa M156Q

<400> 148

<210> 149

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa V21D/E154V/M156Q

<400> 149

<210> 150

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Variante del factor VIIa V21D/E154V/M156Q/K188A

<400> 150

<210> 151

<211> 4278 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> vector pCMV Script

<400> 151

5

<210> 152

<211> 45

<212> ADN 5

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador directo de PCR del Factor VII CBO-125

<400> 152

gcatcatgac gtgacggatc cgccaccatg gtctcccagg ccctc 45

<210> 153

<211> 45 15

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador inverso de PCR del Factor VII CBO-126 20

<400> 153

gatcgtacga tacgtgaatt cctagggaaa tggggctcgc aggag 45

<210> 154 25

<211> 1398

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<223> ADNc de FVII (molde para PCR)

<400> 154 5

<210> 155

<211> 33 10

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de tipo silvestre D60 15

<400> 155

gcggcccact gtttcgacaa aatcaagaac tgg 33

<210> 156 20

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 25

<223> Cebador de D60K CBO-157

<400> 156

gcggcccact gtttcaagaa aatcaagaac tgg 33

<210> 157

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de D60R CBO-158

<400> 157

gcggcccact gtttcaggaa aatcaagaac tgg 33 40

<210> 158

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 5

<223> Cebador de D60A CBO-159

<400> 158

gcggcccact gtttcgcgaa aatcaagaac tgg 33

<210> 159

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de tipo silvestre K60a

<400> 159

gcccactgtt tcgacaaaat caagaactgg agg 33 20

<210> 160

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 25

<220>

<223> Cebador de K60aD CBO-160

<400> 160 30

gcccactgtt tcgacgacat caagaactgg agg 33

<210> 161

<211> 33

<212> ADN 35

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de K60aE CBO-161

<400> 161

gcccactgtt tcgacgagat caagaactgg agg 33

<210> 162

<211> 33 45

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<221> alelo 50

<222> (0)...(0)

<220>

<223> Cebador de K60aA CBO-162

<400> 162

gcccactgtt tcgacgcgat caagaactgg agg 33

<210> 163

<211> 33 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de K60aL CBO-163 65

<400> 163

gcccactgtt tcgacctcat caagaactgg agg 33

<210> 164

<211> 33 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de K60aY CBO-164 10

<400> 164

gcccactgtt tcgactatat caagaactgg agg 33

<210> 165 15

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20

<223> Cebador de tipo silvestre K60c

<400> 165

tgtttcgaca aaatcaagaa ctggaggaac ctg 33

<210> 166

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de K60cD CBO-165

<400> 166

tgtttcgaca aaatcgacaa ctggaggaac ctg 33 35

<210> 167

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 40

<220>

<223> Cebador de K60cE CBO-156

<400> 167 45

tgtttcgaca aaatcgagaa ctggaggaac ctg 33

<210> 168

<211> 33

<212> ADN 50

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de K60cA CBO-167

<400> 168

tgtttcgaca aaatcgcgaa ctggaggaac ctg 33

<210> 169

<211> 33 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de tipo silvestre T99 65

<400> 169

tacgtcccgg gcaccaccaa ccacgacatc gcg 33

<210> 170

<211> 33 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de T99A CBO-168 10

<400> 170

tacgtcccgg gcaccgcgaa ccacgacatc gcg 33

<210> 171 15

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20

<223> Cebador de tipo silvestre R147

<400> 171

ggccagctgc tggaccgtgg cgccacggcc ctg 33

<210> 172

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de R147D CBO-169

<400> 172

ggccagctgc tggacgacgg cgccacggcc ctg 33 35

<210> 173

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 40

<220>

<223> Cebador de R147E CBO-170

<400> 173 45

ggccagctgc tggacgaggg cgccacggcc ctg 33

<210> 174

<211> 33

<212> ADN 50

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de R147A CBO-171

<400> 174

ggccagctgc tggacgcggg cgccacggcc ctg 33

<210> 175

<211> 33 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de tipo silvestre K192 65

<400> 175

agcaaggact cctgcaaggg ggacagtgga ggc 33

<210> 176

<211> 33 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de K192R CBO-172 10

<400> 176

agcaaggact cctgccgcgg ggacagtgga ggc 33

<210> 177 15

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20

<223> Cebador de tipo silvestre de múltiples mutantes

<400> 177

gtggtctccg cggcccactg tttcgacaaa atcaagaact ggaggaacct gatcgcggtg 60

<210> 178

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de D60R / K60aE / K60cE CBO-177

<400> 178

gtggtctccg cggcccactg tttcagggag atcgaaaact ggaggaacct gatcgcggtg 60 35

<210> 179

<211> 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 40

<220>

<223> Cebador de D60 K K60aE / K60cE CBO-178

<400> 179 45

gtggtctccg cggcccactg tttcaaggag atcgaaaact ggaggaacct gatcgcggtg 60

<210> 180

<211> 60

<212> ADN 50

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de D60R / K60aM / K60cE CBO-179

<404> 180

gtggtctccg cggcccactg tttcaggatg atcgaaaact ggaggaacct gatcgcggtg 60

<210> 181

<211> 33 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de K60aI CBOLH-54 65

<400> 181

gcccactgtt tcgacatcat caagaactgg agg 33

<210> 182

<211> 33 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de K60aV CBOLH-55 10

<400> 182

gcccactgtt tcgacgtcat caagaactgg agg 33

<210> 183 15

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20

<223> Cebador de K60aF CBOLH-56

<400> 183

gcccactgtt tcgacttcat caagaactgg agg 33

<210> 184

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de K60aW CBOLH-57

<400> 184

gcccactgtt tcgactggat caagaactgg agg 33 35

<210> 185

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 40

<220>

<223> Cebador de K60aM CBOLH-58

<400> 185 45

gcccactgtt tcgacatgat caagaactgg agg 33

<210> 186

<211> 33

<212> ADN 50

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de D60F CBOLH-59

<400> 186

gcggcccact gtttctttaa aatcaagaac tgg 33

<210> 187

<211> 33 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de D60Y CBOLH-60 65

<400> 187

gcggcccact gtttcataaa aatcaagaac tgg 33

<210> 188

<211> 33 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de D60W CBOLH-61 10

<400> 188

gcggcccact gtttctggaa aatcaagaac tgg 33

<210> 189 15

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20

<223> Cebador de D60L CBOLH-62

<400> 189

gcggcccact gtttcgagaa aatcaagaac tgg 33

<210> 190

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de D60I CBOLH-63

<400> 190

gcggcccact gtttcatcaa aatcaagaac tgg 33 35

<210> 191

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 40

<220>

<223> Cebador de tipo silvestre G97

<400> 191 45

agcacgtacg tcccgggcac caccaaccac gac 33

<210> 192

<211> 33

<212> ADN 50

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de G97W CBOLH-64

<400> 192

agcacgtacg tcccgtggac caccaaccac gac 33

<210> 193

<211> 33 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de G97T CBOLH-65 65

<400> 193

agcacgtacg tcccgacgac caccaaccac gac 33

<210> 194

<211> 33 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de G97I CBOLH-66 10

<400> 194

agcacgtacg tcccgatcac caccaaccac gac 33

<210> 195 15

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20

<223> Cebador de G97V CBOLH-67

<400> 195

agcacgtacg tcccggtcac caccaaccac gac 33

<210> 196

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de K192Q CBOLH-68

<400> 196

agcaaggact cctgccaggg ggacagtgga ggc 33 35

<210> 197

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 40

<220>

<223> Cebador de tipo silvestre K60aL/D60

<400> 197 45

gcggcccact gtttcgacaa aatcaagaac tgg 33

<210> 198

<211> 33

<212> ADN 50

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de K60aL/D60K CBOLH-69

<400> 198

gcggcccact gtttcaagct catcaagaac tgg 33

<210> 199

<211> 33 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de K60aL/D60L CBOLH-70 65

<400> 199

gcggcccact gtttcctcct catcaagaac tgg 33

<210> 200

<211> 33 5

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador K60aL/D60F CBOLH-71 10

<400> 200

gcggcccact gtttctttct catcaagaac tgg 33

<210> 201 15

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20

<223> Cebador de K60aL/D60M CBOLH-72

<400> 201

gcggcccact gtttcatgct catcaagaac tgg 33

<210> 202

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de K60aL/D60W CBOLH-73

<400> 202

gcggcccact gtttctggct catcaagaac tgg 33 35

<210> 203

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 40

<220>

<223> Cebador de D60F CBOLH-74

<400> 203 45

gcggcccact gtttctttga gatcaagaac tgg 33

<210> 204

<211> 33

<212> ADN 50

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de D60W CBOLH-75

<400> 204

gcggcccact gtttctggga gatcaagaac tgg 33

<210> 205

<211> 33 60

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de D60V CBOLH-76 65

<400> 205

gcggcccact gtttcgtcga gatcaagaac tgg 33

<210> 206

<211> 406 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> R290N 10

<400> 206

<210> 207

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> R290Q

<400> 207

5

<210> 208

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> R290K

<400> 208

<210> 209

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> R290M

<400> 209

<210> 210

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> R290V

<400> 210

<210> 211

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K341N

<400> 211

<210> 212

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K341M

<400> 212

<210> 213 5

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K341D

<400> 213

<210> 214

<211> 407 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> G237T238insA 5

<400> 214

10

<210> 215

<211> 407

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 5

<223> G237T238insS

<400> 215

10

<210> 216

<211> 407

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> G237T238insV

<400> 216

<210> 217

<211> 408

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> G237T238insAS

<400> 217

<210> 218

<211> 408

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> G237T238insSA

<400> 218

<210> 219

<211> 407

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> D196K197insK

<400> 219

<210> 220

<211> 407

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> D196K197insR

<400> 220 5

<210> 221

<211> 407

<212> PRT

<213> Homo sapiens 5

<220>

<223> D196K197insY

<400> 221 10

<210> 222

<211> 407

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> D196K197insW

<400> 222

<210> 223

<211> 407

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> D196K197insA

<400> 223

<210> 224

<211> 407

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> D196K197insM

<400> 224

<210> 225

<211> 407

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K197I198insE

<400> 225

<210> 226

<211> 407

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K197I198insY

<400> 226

<210> 227 5

<211> 407

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K197I198insA

<400> 227

<210> 228

<211> 407 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K197I198insS

<400> 228

<210> 229

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K197E/K341Q

<400> 229

<210> 230

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K197L/K341Q

<400> 230

<210> 231

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> G237V/K341Q

<400> 231

<210> 232

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K197E/K199E

<400> 232

5

<210> 233

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K197E/G237V

<400> 233

<210> 234

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> 5

<223> K199E/K341Q

<400> 234

10

<210> 235

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K197E/G237V/K341Q

<400> 235

<210> 236

<211> 407

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Intercambio de Gla FIX

<400> 236

<210> 237

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Intercambio de Gla FX

<400> 237

<210> 238

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Intercambio de Gla Prot C

<400> 238

<210> 239

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Intercambio de Gla Prot S

<400> 239

<210> 240

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Intercambio de Gla trombina

<400> 240

<210> 241

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> V158D/G237V/E296V/M298Q

<400> 241

<210> 242

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K197E/G237V/M298Q

<400> 242

<210> 243

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K197E/G237V/M298Q/K341Q

<400> 243

<210> 244

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K197E/K199E/G237V/M298Q/K341Q

<400> 244

<210> 245

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> G237V/M298Q

<400> 245

<210> 246 5

<211> 406

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> G237V/M298Q/K341Q

<400> 246

<210> 247

<211> 407

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> M298Q/Intercambio de Gla FIX 5

<400> 247

<210> 248

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K197E/M298Q

<400> 248

<210> 249

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> M298Q/K341D

<400> 249

<210> 250

<211> 406

<212> PRT 5

<213> Homo sapiens

<220>

<223> K197E/K199E/K341Q

<400> 250

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido del factor VII (FVII) modificado, que comprende:

un domino Gla heterólogo, o una parte suficiente del mismo para efectuar unión con fosfolípidos, por lo que el 5 polipéptido de FVII modificado muestra afinidad o unión con fosfolípidos aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado que no contiene el dominio Gla heterólogo, donde:

la parte suficiente contiene 30 o más aminoácidos contiguos del dominio Gla heterólogo; y el dominio Gla heterólogo se selecciona de entre un dominio Gla en el factor IX (FIX), Factor X (FX), protrombina, proteína 10 C, proteína S, osteocalcina, proteína específica de detención del Crecimiento 6 (Gas6) y proteína Z; y

una o más modificaciones de aminoácidos adicionales que aumentan la resistencia a antitrombina III (AT-III), aumentan la afinidad por el factor tisular (FT), aumentan la actividad intrínseca, aumentan la actividad catalítica o coagulante dependiente de FT, aumentan la actividad coagulante, alteran la conformación del polipéptido para 15 alterar la zimogenicidad, aumentan la actividad catalítica o coagulante desplazando el equilibrio entre conformaciones de FVIIa altamente activo y menos activo a favor de las conformaciones altamente activas, aumentan la resistencia a proteasas, reducen la glucosilación, aumentan la glucosilación, reducen la inmunogenicidad, aumentan la estabilidad y/o facilitan el enlace de grupos químicos.
2. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 1, donde el dominio Gla heterólogo tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEC ID Nº: 110-115, 117 y 118, o la parte suficiente de la misma.
3. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde todo el dominio Gla de FVII nativo se retira y se reemplaza con el dominio Gla heterólogo. 25
4. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el dominio Gla heterólogo se selecciona de entre un dominio Gla en el Factor IX (FIX), Factor X (FX), protrombina, proteína C y proteína S.
5. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la modificación o las 30 modificaciones adicionales aumentan la resistencia al inhibidor de la ruta del factor tisular (IRFT) en comparación con un polipéptido de FVII no modificado.
6. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 5, donde la modificación o las modificaciones adicionales son una o más modificaciones de aminoácidos en posiciones seleccionadas de entre D196, K197, K199, G237, 35 T239, R290 y K341 en un polipéptido de FVII que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII, donde la modificación o las modificaciones adicionales confieren resistencia a IRFT aumentada.
7. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 6, donde la o las modificaciones de aminoácidos se 40 seleccionan de entre D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196M, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D, K341Q, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA y 45 K197I198insS.
8. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 7, donde la o las modificaciones de aminoácidos se seleccionan de entre D196R/R290E, D196K/R290E, D196R/R290D, D196R/ K197E/K199E, D196K/K197E/K199E, D196R/K197E/ K199E/R290E, D196R/ K197M/ K199E y D196R/ K197M/K199E/R290E. 50
9. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende una o más modificaciones de aminoácidos adicionales en las posiciones Q176, M298 o E296 en un polipéptido de FVII que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 o en restos correspondientes en un polipéptido de FVII. 55
10. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 9, donde las modificaciones de aminoácidos se seleccionan de entre Q176A, M298Q, E296V y E296A.
11. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 9 o reivindicación 10, que comprende M298Q/ 60 A1Y44delinsYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQY.
12. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende una o más modificaciones de aminoácidos adicionales seleccionadas de entre S279CN302C, L280C/N301C, V281C/V302C, S282C/V299C, inserción de una tirosina en la posición 4, F4S, F4T, P10Q, P10E, P10D, P10N, Q21N, R28F, R28E, 65 I30C, 130D, I30E, K32D, K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32C, K32A, K32S, D33C, D33F, D33E, D33K, A34C,

A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, T37C, T37D, T37E, K38C, K38E, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, L39E, L39Q, L39H, W41N, W41C, W41E, W41D, I42R, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42K, S43Q, S43N, Y44K, Y44C, Y44D, Y44E, S45C, S45D, S45E, D46C, A51N, S53N, G58N, G59S, G59T, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, L65N, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, E82S, E82T, T83K, N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, 5 D104N, T106N, K109N, E116D, G117N, G124N, S126N, T128N, L141C, L141D, L141E, E142D, E142C, K143C, K143D, K143E, R144E, R144C, R144D, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, 10 V158H, V158D, V158Q, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, Q250C, V253N, E265N, T267N, E270N, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, R277N, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, L280N, L288K, L288C, L288D, D289C, D289K, L288E, R290C, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R290D, R290E, G291E, G291D, G291C, G291N, G291K, 15 A292C, A292K, A292D, A292E, T293K, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, P303S, P303T, R304Y, R304F, R304L, R304M, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, 20 L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, Q312N, Q313K, Q313D, Q313E, S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C, V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, 25 D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A, K341S, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, F374P, F374A, F374V, F374I, 30 F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, V376N, R379N, L390C, L390K, L390D, L390E, M391D, M391C, M391K, M391N, M391E, R392C, R392D, R392E, S393D, S393C, S393K, S393E, E394K, P395K, E394C, P395D, P395C, P395E, R396K, R396C, R396D, R396E, P397D, P397K, P397C, P397E, G398K, G398C, G398D, G398E, V399C, V399D, V399K, V399E, L400K, L401K, L401C, L401D, L401E, R402D, R402C, R402K, R402E, A403K, A403C, A403D, A403E, P404E, P404D, 35 P404C, P404K, F405K, P406C, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/ Y44S, I42N/ Y44T, Y44N/ D46S, Y44N/ D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, 40 S147N/P149S, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/K316S, S314N/K316T, Q313N/R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/D343S, K341N/D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/R392S, L390N/R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, 45 S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397NN399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S y P404N/P406T.
13. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que comprende la sustitución de las posiciones 300-322, 305-322, 300-312 o 305-312 con los aminoácidos correspondientes de tripsina, trombina o FX, o sustitución de las posiciones 310-329, 311-322 o 233-329 con los aminoácidos correspondientes de tripsina.
14. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el polipéptido de FVII no 55 modificado tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3.
15. El polipéptido de FVII modificado de la reivindicación 14 que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 247.
16. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-15 que es un polipéptido activo o uno maduro.
17. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, donde solamente se modifica la secuencia primaria. 65
18. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, que comprende además una modificación química o una modificación postraduccional.
19. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de la reivindicación 18, donde el polipéptido de FVII está glucosilado, carboxilado, hidroxilado, sulfatado, fosforilado, albuminado o conjugado con un resto de polietilenglicol 5 (PEG).
20. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-19 que es un polipéptido monocatenario o es un polipéptido bicatenario.
21. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-20 que está activo o activado.
22. El polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-21, donde la actividad de coagulación aumenta.
23. Una molécula de ácido nucleico, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-22.
24. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 23.
25. El vector de la reivindicación 24, donde el vector es un vector procariota, vector viral o un vector eucariota.
26. El vector de la reivindicación 24 o reivindicación 25, donde el vector es un vector de mamífero.
27. El vector de la reivindicación 25, donde el vector es un vector viral seleccionado de entre un adenovirus, un virus 25 adenoasociado, un retrovirus, un virus del herpes, un lentivirus, un poxvirus y un citomegalovirus.
28. Una célula, que comprende el vector de cualquiera de las reivindicaciones 24-27.
29. La célula de la reivindicación 28 que es una célula eucariota. 30
30. La célula de la reivindicación 29, donde la célula eucariota es una célula de mamífero.
31. La célula de la reivindicación 30, donde la célula de mamífero se selecciona de entre células de riñón de cría de hámster (BHK-21) o células 293 o células CHO. 35
32. La célula de la reivindicación 28 que es una célula de levadura.
33. La célula de la reivindicación 32 que es una célula de Pichia sp.
34. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 28-33, donde la célula expresa el polipéptido de FVII modificado.
35. Un polipéptido de FVII modificado que se produce por la célula de cualquiera de las reivindicaciones 28-34.
36. Una composición farmacéutica, que comprende una concentración o cantidad terapéuticamente eficaz de un 45 polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-22 y 35, o una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 23 o un vector de cualquiera de las reivindicaciones 24-27 o una célula de cualquiera de las reivindicaciones 28-34, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
37. La composición farmacéutica de la reivindicación 36 que se formula para administración local, sistémica o tópica. 50
38. La composición farmacéutica de la reivindicación 36 o reivindicación 37 que se formula para administración oral, nasal, pulmonar, bucal, transdérmica, subcutánea, intraduodenal, entérica, parenteral, intravenosa o intramuscular.
39. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 36-38 que se formula para liberación 55 controlada.
40. Un polipéptido de FVII modificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-22 y 35 para uso en el tratamiento de una enfermedad o afección que se trata mediante la administración de FVII o un procoagulante.
41. Uso de una composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 36-39 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un procoagulante.
42. Un polipéptido de FVII modificado para uso de acuerdo con la reivindicación 40, o el uso de la reivindicación 41, 65 donde la enfermedad o afección se trata por administración de un zimógeno o forma activa de FVII.
43. Un polipéptido de FVII modificado para uso de acuerdo con la reivindicación 40 o reivindicación 42, o el uso de la reivindicación 41 o reivindicación 42, donde la enfermedad o afección para tratar se selecciona de entre trastornos de coagulación sanguínea, trastornos hematológicos, trastornos hemorrágicos, hemofilias, deficiencia del factor VII, trastornos de sangrado, sangrado quirúrgico y sangrado resultante de traumatismo o se debe a una complicación de sangrado debido a cirugía o traumatismo. 5
44. Un polipéptido de FVII modificado para uso de acuerdo con la reivindicación 43, o el uso de la reivindicación 43, donde la hemofilia es hemofilia A o hemofilia B o hemofilia C o es adquirida.