JP2014042523A - 改変第ｖｉｉ因子ポリペプチド及びその使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】改変第ＶＩＩ因子ポリペプチド及びその使用方法を提供する。
【解決手段】変ＦＶＩＩポリペプチドが、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増大した組織因子（ＴＦ）依存性凝固活性を示す、改変ＦＶＩＩポリペプチド、又はその活性断片。前記改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含む核酸分子。前記核酸分子を含むベクター。前記ベクターを含む細胞。前記細胞を培養する工程を含む、改変ＦＶＩＩポリペプチドの製造方法。薬学的に許容される媒体中に、治療に有効な濃度又は量の前記改変ＦＶＩＩポリペプチド、又は前記核酸分子又は前記ベクター又は前記細胞を含む医薬組成物。
【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明
［関連出願］
２００７年４月１３日に出願された、Ｅｄｗｉｎ Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｔｈａｎｏｓ、Ｓａｎｄｒａ Ｗａｕｇｈ Ｒｕｇｇｌｅｓ及びＳｈａｕｎ Ｃｏｕｇｈｌｉｎの「ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＦＡＣＴＯＲ ＶＩＩ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」という名称の米国特許仮出願第６０／９２３，５１２号明細書の優先権の利益を主張する。
本出願は、やはり米国特許仮出願第６０／９２３，５１２号明細書の優先権を主張する、Ｅｄｗｉｎ Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｔｈａｎｏｓ、Ｓａｎｄｒａ Ｗａｕｇｈ Ｒｕｇｇｌｅｓ及びＳｈａｕｎ Ｃｏｕｇｈｌｉｎの「ＭＯＤＩＦＩＥＤ ＦＡＣＴＯＲ ＶＩＩ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＵＳＥＳ ＴＨＥＲＥＯＦ」という名称の米国特許出願第１２／０８２，６６２号明細書に関連する。
許容される場合、それぞれの上記参照出願の内容は、その全体が参照により組み込まれる。
［発明の分野］
改変された治療用タンパク質が提供される。詳細には、第ＶＩＩａ因子及び他の型の第ＶＩＩ因子を含む改変第ＶＩＩ因子ポリペプチド、並びにその使用が提供される。
［背景］
止血は、出血の停止に至る複雑な生理的プロセスである。血小板、血漿タンパク質、血管及び内皮細胞は、このプロセスの３つの構成成分であり、それぞれが、組織損傷の次に直ちに起こり、正常な状況では血餅が迅速に形成する事象において重要な役割を果たす。この中心にあるのが凝固カスケードという一連のタンパク質分解事象であり、特定の血漿タンパク質（又は凝固因子）が、以前に活性化した別の凝固因子によって「カスケード」中で順次活性化され、トロンビンの迅速な生成に至る。次いで、このカスケード中で産生された大量のトロンビンが働いてフィブリノゲンを切断して、血餅形成に必要なフィブリンペプチドにする。
凝固因子は不活性な単一鎖の酵素原として循環し、１つ又は複数の位置での切断により活性化されて、二本鎖活性化型のタンパク質が生じる。第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）というビタミンＫ依存性血漿タンパク質は、最初は酵素原として血中を循環している。ＦＶＩＩ酵素原は単一の部位Ａｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３でのタンパク質分解性切断により活性化され、単一のジスルフィド結合によって連結した二本鎖プロテアーゼ（ＦＶＩＩａ）が生じる。ＦＶＩＩａは、その補因子である組織因子（ＴＦ）と結合して、ＦＶＩＩａが第Ｘ因子（ＦＸ）をＦＸａに効率よく活性化することができる複合体を形成し、それによって、フィブリン形成及び止血が生じる一連の事象が開始する。
ほとんどの場合で正常な止血が行われるが、そのプロセス中の欠陥により、血餅形成にかかる時間が延長する出血障害に至る可能性がある。そのような障害は、先天性である可能性もあり、又は後天性である可能性もある。例えば、血友病Ａ及びＢは、それぞれ第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）及び第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の欠損を特徴とする遺伝性疾患である。補充療法は、血友病Ａ及びＢの伝統的な治療であり、ヒト血漿から調製した、又は組換えタンパク質であるＦＶＩＩＩ又はＦＩＸを静脈内投与する。しかし、多くの場合、患者では注入したタンパク質に対する抗体（阻害因子としても知られる）が生じ、それがこの治療の有効性を低減し又は打ち消す。組換えＦＶＩＩａ（ノボセブン（Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ）（登録商標））は、ＦＶＩＩＩ又はＦＩＸに対する阻害因子を有する血友病Ａ又はＢ患者の治療について承認されており、出血の症状発生を止め、又は外傷及び／若しくは手術に伴う出血を防ぐのにも使用される。組換えＦＶＩＩａはまた、先天性ＦＶＩＩ欠損を有する患者の治療についても承認されており、他の先天性又は後天性出血障害、外傷、及び非血友病患者での手術に伴う出血の治療などの承認適応症外使用でもますます利用されつつある。
血餅形成を促進する組換えＦＶＩＩａの使用は、治療薬としてその重要性が大きくなりつつあることを強調するものである。ＦＶＩＩａ療法は、重大な、満たされていない医療上の必要性を残している。例えば、臨床試験データに基づくと、血友病患者の急性出血症状発生を管理するには、６時間以上の時間にわたって平均３回のＦＶＩＩａの投与が必要となる。ＦＶＩＩａのより有効な変異体が、これらの要件を減らすのに必要である。したがって、本明細書における目的の中で、一目的は、治療特性が向上するように設計された改変ＦＶＩＩポリペプチドを提供することである。
［概要］
改変第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドが本明細書で提供される。具体的には、凝固促進活性を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドが本明細書で提供される。そのＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して一次配列が改変され、アミノ酸の挿入、欠失及び交換を含み得る。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）の阻害効果に対する抵抗性の増大、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）の阻害効果に対する抵抗性の増大、Ｚｎ２＋結合の低下、半減期の増大などの薬物動態特性の向上、ＴＦの存在及び／若しくは不在下での触媒活性の増大、並びに／又は活性化血小板との結合の増大を示すＦＶＩＩポリペプチドを含む。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、本明細書で提供される改変の任意の組合せを含有し得、それによって、ポリペプチドの１つ又は複数の活性又は特性が非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して変化する。典型的には、改変ＦＶＩＩポリペプチドは凝固促進活性を保持する。改変ＦＶＩＩポリペプチドをコード／発現する核酸分子、ベクター及び細胞も本明細書で提供される。医薬組成物、製品、キット及び治療方法も本明細書で提供される。ＦＶＩＩポリペプチドは、他の活性及び／又は特性に影響を及ぼす改変を有する、対立遺伝子及び種変異体及びポリペプチド並びに他の変異体を含む。本明細書で提供される改変を含むＦＶＩＩポリペプチドの活性断片も含まれる。配列番号３に示すアミノ酸の配列を含むもの、並びにそれと６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するその変異体は、ＦＶＩＩポリペプチドを例示するものである。
その第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して一次配列が改変され、アミノ酸の挿入、欠失及び交換を含み得る。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＴＦＰＩの阻害効果に対する抵抗性の増大、ＡＴ−ＩＩＩの阻害効果に対する抵抗性の増大、Ｚｎ２＋結合の低下、半減期の増大などの薬物動態特性の向上、（組織因子）ＴＦの存在及び／若しくは不在下での触媒活性の増大、並びに／又は活性化血小板との結合の増大を示すＦＶＩＩポリペプチドを含む。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、本明細書で提供される改変の任意の組合せを含有し得、それによって、ポリペプチドの１つ又は複数の活性又は特性が非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して変化する。そのＦＶＩＩポリペプチドは、他の活性及び／又は特性を変化させる他の改変を含み得る。典型的には、改変ＦＶＩＩポリペプチドは凝固促進活性を保持する。改変ＦＶＩＩポリペプチドをコード／発現する核酸分子、ベクター及び細胞も本明細書で提供される。医薬組成物、製品、キット及び治療方法も本明細書で提供される。
具体的には、改変第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチド、その対立遺伝子及び種変異体、又はその活性断片若しくは他の変異体が提供される。配列番号３に示すアミノ酸の配列を有するＦＶＩＩポリペプチド中の位置Ｄ１９６、Ｋ１９７若しくはＫ１９９、又はその対立遺伝子及び種変異体、活性断片、並びに他の活性若しくは特性について改変された他のＦＶＩＩポリペプチドを含めたＦＶＩＩポリペプチド中の対応する残基におけるものと対応する位置にある改変を含有する、その対立遺伝子及び種変異体又はその活性断片を含めたＦＶＩＩポリペプチドが本明細書で提供される。そのＦＶＩＩポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸の配列を含有するＦＶＩＩポリペプチド中の位置Ｄ１９６、Ｋ１９７若しくはＫ１９９、又はＦＶＩＩポリペプチド中の対応する残基におけるものと対応する位置における少なくとも１つの改変を含有する。改変は、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ａｓｐ（Ｄ）及びＧｌｕ（Ｅ）の中から選択される疎水性又は酸性アミノ酸による挿入及び／又は交換である。活性断片が提供されるとき、活性断片はそのような改変を含む。例えば、Ｄ１９６Ｆ、Ｄ１９６Ｗ、Ｄ１９６Ｌ、Ｄ１９６Ｉ、Ｄ１９６Ｙ、Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｄ、Ｋ１９７Ｌ、Ｋ１９７Ｍ、Ｋ１９７Ｉ、Ｋ１９７Ｖ、Ｋ１９７Ｆ、Ｋ１９７Ｗ、Ｋ１９９Ｄ、Ｋ１９９Ｅ及びＫ１９７Ｙの中から選択される交換も含む、改変第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチド、その対立遺伝子及び種変異体、又はその活性断片若しくは他の変異体が提供される。
さらに、提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩポリペプチド中の別の位置におけるアミノ酸の交換、挿入又は欠失を含めたさらなる改変を含有し得る。いくつかの例では、さらなる改変は、Ｄ１９６、Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｇ２３７、Ｔ２３９、Ｒ２９０及びＫ３４１の中から選択される位置と対応する位置におけるアミノ酸の交換であり、第１の改変及び第２の改変は異なるアミノ酸にある。これらの改変には、それだけに限らないが、Ｄ１９６Ｋ、Ｄ１９６Ｒ、Ｄ１９６Ａ、Ｄ１９６Ｙ、Ｄ１９６Ｆ、Ｄ１９６Ｗ、Ｄ１９６Ｌ、Ｄ１９６Ｉ、Ｋ１９７Ｙ、Ｋ１９７Ａ、Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｄ、Ｋ１９７Ｌ、Ｋ１９７Ｍ、Ｋ１９７Ｉ、Ｋ１９７Ｖ、Ｋ１９７Ｆ、Ｋ１９７Ｗ、Ｋ１９９Ａ、Ｋ１９９Ｄ、Ｋ１９９Ｅ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｔ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｖ、Ｔ２３９Ａ、Ｒ２９０Ａ、Ｒ２９０Ｅ、Ｒ２９０Ｄ、Ｒ２９０Ｎ、Ｒ２９０Ｑ、Ｒ２９０Ｋ、Ｋ３４１Ｅ、Ｋ３４１Ｒ、Ｋ３４１Ｎ、Ｋ３４１Ｍ、Ｋ３４１Ｄ及びＫ３４１Ｑが含まれ得る。他の例は、それだけに限らないが、下記の挿入：Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＶ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＫ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＲ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＹ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＷ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＭ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＥ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＹ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＡ及びＫ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＳのいずれかなどのアミノ酸の挿入である改変を含む。他の例示的な改変ＦＶＩＩポリペプチドは、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｆ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｌ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｍ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｗ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｆ／Ｋ１９７Ｅ、Ｄ１９６Ｗ／Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９６Ｖ／Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｌ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ、Ｋ１９９Ｅ／Ｋ３４１Ｑ又はＫ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｋ３４１Ｑの改変を含む。
配列番号３に示すアミノ酸の配列を有するＦＶＩＩポリペプチド中のＤ１９６Ｒ、Ｄ１９６Ｙ、Ｄ１９６Ｆ、Ｄ１９６Ｗ、Ｄ１９６Ｌ、Ｄ１９６Ｉ、Ｋ１９７Ｙ、Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｄ、Ｋ１９７Ｌ、Ｋ１９７Ｍ、Ｋ１９７Ｍ、Ｋ１９７Ｉ、Ｋ１９７Ｖ、Ｋ１９７Ｆ、Ｋ１９７Ｗ、Ｋ１９９Ｄ、Ｋ１９９Ｅ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｖ、Ｒ２９０Ｍ、Ｒ２９０Ｖ、Ｋ３４１Ｍ、Ｋ３４１Ｄ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＶ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＫ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＲ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＹ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＷ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＭ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＥ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＹ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＡ又はＫ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＳのいずれか１つ若しくは複数、又はＦＶＩＩポリペプチド中の対応する残基におけるものと対応するアミノ酸改変も含有し得る、その対立遺伝子及び種変異体、又はその活性断片若しくは他の変異体を含めた改変ＦＶＩＩポリペプチドも提供される。さらに、これらの改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩポリペプチド中の別の位置におけるアミノ酸の交換、挿入又は欠失を含めたさらなる改変を含有し得る。いくつかの例では、さらなる改変は、位置Ｄ１９６、Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｇ２３７、Ｔ２３９、Ｒ２９０及びＫ３４１と対応する位置におけるアミノ酸の交換であり得、さらなる改変は、第１の改変と異なる位置にある。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、Ｄ１９６Ｋ、Ｄ１９６Ｒ、Ｄ１９６Ａ、Ｄ１９６Ｙ、Ｄ１９６Ｆ、Ｄ１９６Ｍ、Ｄ１９６Ｗ、Ｄ１９６Ｌ、Ｄ１９６Ｉ、Ｋ１９７Ｙ、Ｋ１９７Ａ、Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｄ、Ｋ１９７Ｌ、Ｋ１９７Ｍ、Ｋ１９７Ｉ、Ｋ１９７Ｖ、Ｋ１９７Ｆ、Ｋ１９７Ｗ、Ｋ１９９Ａ、Ｋ１９９Ｄ、Ｋ１９９Ｅ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｔ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｖ、Ｔ２３９Ａ、Ｒ２９０Ａ、Ｒ２９０Ｅ、Ｒ２９０Ｄ、Ｒ２９０Ｎ、Ｒ２９０Ｑ、Ｒ２９０Ｋ、Ｋ３４１Ｅ、Ｋ３４１Ｒ、Ｋ３４１Ｎ、Ｋ３４１Ｍ、Ｋ３４１Ｄ、及びＫ３４１Ｑの中から選択されるアミノ酸の交換をさらに含有し得る。Ｄ１９６Ｒ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｒ２９０Ｄ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｆ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｌ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｍ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｗ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｆ／Ｋ１９７Ｅ、Ｄ１９６Ｗ／Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｌ／Ｋ３４１Ｑ、Ｇ２３７Ｖ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ、Ｋ１９９Ｅ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｋ３４１Ｑ及びＫ１９６Ｖ／Ｋ１９７Ｅの中から選択される改変を含むポリペプチドは、そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドを例示するものである。
場合によっては、その対立遺伝子及び種変異体、又はその活性断片、又はその他の変異体を含めた改変第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドは、ＦＶＩＩポリペプチド中の２つ以上の改変を含み得、そのアミノ酸改変の少なくとも２つは、配列番号３に示すアミノ酸の配列を有する若しくは含むＦＶＩＩポリペプチド中のＤ１９６Ｋ、Ｄ１９６Ｒ、Ｄ１９６Ａ、Ｄ１９６Ｙ、Ｄ１９６Ｆ、Ｄ１９６Ｍ、Ｄ１９６Ｗ、Ｄ１９６Ｌ、Ｄ１９６Ｉ、Ｋ１９７Ｙ、Ｋ１９７Ａ、Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｄ、Ｋ１９７Ｌ、Ｋ１９７Ｍ、Ｋ１９７Ｉ、Ｋ１９７Ｖ、Ｋ１９７Ｆ、Ｋ１９７Ｗ、Ｋ１９９Ａ、Ｋ１９９Ｄ、Ｋ１９９Ｅ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｔ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｖ、Ｔ２３９Ａ、Ｒ２９０Ａ、Ｒ２９０Ｅ、Ｒ２９０Ｄ、Ｒ２９０Ｎ、Ｒ２９０Ｑ、Ｒ２９０Ｋ、Ｋ３４１Ｅ、Ｋ３４１Ｒ、Ｋ３４１Ｎ、Ｋ３４１Ｍ、Ｋ３４１Ｄ、Ｋ３４１Ｑ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＶ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＫ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＲ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＹ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＷ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＭ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＥ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＹ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＡ又はＫ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＳ、又はＦＶＩＩポリペプチド中の対応する残基におけるものに対応する。そのポリペプチドは、２、３、４、５、６又は７つの改変などの２つを超える改変を含み得る。
Ｄ１９６Ｒ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｒ２９０Ｄ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｆ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｌ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｍ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｗ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｆ／Ｋ１９７Ｅ、Ｄ１９６Ｗ／Ｋ１９７Ｅ、Ｄ１９６Ｖ／Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｌ／Ｋ３４１Ｑ、Ｇ２３７Ｖ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ、Ｋ１９９Ｅ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｋ３４１Ｑ及びＫ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ／Ｍ２９８Ｑの中から選択される改変を含むＦＶＩＩポリペプチドは、これらを例示するものである。
上記に挙げた改変ＦＶＩＩポリペプチドのいずれかは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）に対する抵抗性の増大を示し得る。いくつかの例では、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＴＦＰＩに対して（少なくとも約）１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上の抵抗性がある。さらに、これらの改変ＦＶＩＩポリペプチドは、異種Ｇｌａドメイン、又はリン脂質結合を行うのに十分なその部分も含有し得る。
異種Ｇｌａドメイン、又はリン脂質結合を行うのに十分な、異種Ｇｌａドメインの３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上などのその部分を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドも本明細書で提供される。上記に述べたあらゆる改変ＦＶＩＩポリペプチドは、本明細書で例示及び記載されるＧｌａスワップを含めたＧｌａスワップを含み得る。
異種Ｇｌａドメインは、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、プロトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質、増殖停止特異的タンパク質６（Ｇａｓ６）又はプロテインＺのＧｌａドメインから選択することができる。いくつかの例では、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチド中の異種Ｇｌａドメインは、配列番号１１０〜１１８、１２０及び１２１のいずれかに示すアミノ酸の配列、又はリン脂質結合を行うのに十分なその部分を有する。ＦＶＩＩポリペプチドに対する改変は、配列番号３に示すアミノ酸の配列を有する若しくは含むＦＶＩＩポリペプチド中のアミノ酸１〜４５、又はＦＶＩＩポリペプチド中の対応する残基におけるものを含み得る天然ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインの全部又は連続した部分を除去し、それを異種Ｇｌａドメイン、又はリン脂質結合を増大させるなどその結合に影響を及ぼすのに十分なその部分と交換することによって行うことができる。そのような改変の結果、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較してリン脂質結合の増大を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドが生じ得る。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、（少なくとも約）１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上のリン脂質結合の増大を示し得る。
改変ＦＶＩＩポリペプチドは、除去され、異種Ｇｌａドメイン、又はリン脂質結合を行うのに十分なその部分と交換された天然ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインの全部又は連続した部分を有し得る。天然ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインが、配列番号３に示すアミノ酸の配列を有する若しくは含むＦＶＩＩポリペプチド中のアミノ酸１〜４５、又はＦＶＩＩポリペプチド中の対応する残基におけるものを含むポリペプチドは、そのようなポリペプチドを例示するものである。Ｇｌａの改変には、それだけに限らないが、ＧｌａスワップＦＩＸ、ＧｌａスワップＦＸ、ＧｌａスワップＰｒｏｔＣ、ＧｌａスワップＰｒｏｔＳ及びＧｌａスワップトロンビンの中の改変がある。
Ｇｌａスワップによって、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、リン脂質結合の増大を示すことができる。そのような増大は、（少なくとも約）０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上のリン脂質結合の増大であり得る。
異種Ｇｌａドメインを含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）に対する抵抗性の増大が生じる又はそれを示す位置におけるさらなる改変を含有し得る。配列番号３に示すアミノ酸の配列を有する若しくは含むＦＶＩＩポリペプチド中のＤ１９６、Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｇ２３７、Ｔ２３９、Ｒ２９０及びＫ３４１、又はＦＶＩＩポリペプチド中の対応する残基におけるものの中から選択される位置における１つ又は複数のアミノ酸改変（複数可）は、そのような改変を例示するものである。具体的には、そのような改変は、Ｄ１９６Ｋ、Ｄ１９６Ｒ、Ｄ１９６Ａ、Ｄ１９６Ｙ、Ｄ１９６Ｆ、Ｄ１９６Ｍ、Ｄ１９６Ｗ、Ｄ１９６Ｌ、Ｄ１９６Ｉ、Ｋ１９７Ｙ、Ｋ１９７Ａ、Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｄ、Ｋ１９７Ｌ、Ｋ１９７Ｍ、Ｋ１９７Ｉ、Ｋ１９７Ｖ、Ｋ１９７Ｆ、Ｋ１９７Ｗ、Ｋ１９９Ａ、Ｋ１９９Ｄ、Ｋ１９９Ｅ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｔ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｖ、Ｔ２３９Ａ、Ｒ２９０Ａ、Ｒ２９０Ｅ、Ｒ２９０Ｄ、Ｒ２９０Ｎ、Ｒ２９０Ｑ、Ｒ２９０Ｋ、Ｋ３４１Ｅ、Ｋ３４１Ｒ、Ｋ３４１Ｎ、Ｋ３４１Ｍ、Ｋ３４１Ｄ、Ｋ３４１Ｑ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＶ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＫ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＲ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＹ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＷ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＭ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＥ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＹ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＡ及びＫ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＳの中から選択される１つ又は複数のアミノ酸改変（複数可）を含み得る。例えば、異種Ｇｌａドメインを含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、それだけに限らないが、Ｄ１９６Ｒ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｒ２９０Ｄ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ、及びＤ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅなどのアミノ酸の交換及び／又は挿入も含有し得る。場合によっては、そのようなさらなる改変の結果、改変を含有しないＦＶＩＩポリペプチド、即ち非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して改変ポリペプチドのＴＦＰＩに対する抵抗性が増大する。
ＴＦＰＩに対する抵抗性の増大若しくはリン脂質との結合の増大を示すものを含めた、上記に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチドのいずれか、又はその任意の組合せは、当技術分野に記載の任意のものを含めた他の改変をさらに含み得る。そのようなさらなるアミノ酸改変は、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）に対する抵抗性の増大、リン脂質との結合及び／若しくは親和性の増大、組織因子（ＴＦ）に対する親和性の増大、固有活性の増大、より酵素原様の形状又はより酵素原様でない形状への高次構造の変化を含めた酵素原性を変化させるポリペプチドの高次構造の変化、プロテアーゼに対する抵抗性の増大、グリコシル化の低下、グリコシル化の増大、免疫原性の低減、安定性の増大、並びに／又は化学基連結の容易化を起こすことができる。例えば、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸の配列を有する若しくは含むＦＶＩＩポリペプチド中の位置Ｑ１７６、Ｍ２９８若しくはＥ２９６、又はＦＶＩＩポリペプチド中の対応する残基におけるものにある改変（複数可）を含有し得る。いくつかの例では、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、Ｑ１７６Ａ、Ｍ２９８Ｑ、Ｅ２９６Ｖ及び／又はＥ２９６Ａの中のアミノ酸改変をさらに含有し得る。他の例では、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、Ｇｌａスワップ及び／又は述べた他の改変に加えて、下記のさらなるアミノ酸改変（複数可）：Ｓ２７８Ｃ／Ｖ３０２Ｃ、Ｌ２７９Ｃ／Ｎ３０１Ｃ、Ｖ２８０Ｃ／Ｖ３０１Ｃ、Ｓ２８１Ｃ／Ｖ２９９Ｃ、位置４でのチロシンの挿入、Ｆ４Ｓ、Ｆ４Ｔ、Ｐ１０Ｑ、Ｐ１０Ｅ、Ｐ１０Ｄ、Ｐ１０Ｎ、Ｑ２１Ｎ、Ｒ２８Ｆ、Ｒ２８Ｅ、Ｉ３０Ｃ、Ｉ３０Ｄ、Ｉ３０Ｅ、Ｋ３２Ｄ、Ｋ３２Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｋ３２Ｇ、Ｋ３２Ｈ、Ｋ３２Ｔ、Ｋ３２Ｃ、Ｋ３２Ａ、Ｋ３２Ｓ、Ｄ３３Ｃ、Ｄ３３Ｆ、Ｄ３３Ｅ、Ｄ３３Ｋ、Ａ３４Ｃ、Ａ３４Ｅ、Ａ３４Ｄ、Ａ３４Ｉ、Ａ３４Ｌ、Ａ３４Ｍ、Ａ３４Ｖ、Ａ３４Ｆ、Ａ３４Ｗ、Ａ３４Ｙ、Ｒ３６Ｄ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ３７Ｃ、Ｔ３７Ｄ、Ｔ３７Ｅ、Ｋ３８Ｃ、Ｋ３８Ｅ、Ｋ３８Ｔ、Ｋ３８Ｄ、Ｋ３８Ｌ、Ｋ３８Ｇ、Ｋ３８Ａ、Ｋ３８Ｓ、Ｋ３８Ｎ、Ｋ３８Ｈ、Ｌ３９Ｅ、Ｌ３９Ｑ、Ｌ３９Ｈ、Ｗ４１Ｎ、Ｗ４１Ｃ、Ｗ４１Ｅ、Ｗ４１Ｄ、Ｉ４２Ｒ、Ｉ４２Ｎ、Ｉ４２Ｓ、Ｉ４２Ａ、Ｉ４２Ｑ、Ｉ４２Ｎ、Ｉ４２Ｓ、Ｉ４２Ａ、Ｉ４２Ｑ、Ｉ４２Ｋ、Ｓ４３Ｑ、Ｓ４３Ｎ、Ｙ４４Ｋ、Ｙ４４Ｃ、Ｙ４４Ｄ、Ｙ４４Ｅ、Ｓ４５Ｃ、Ｓ４５Ｄ、Ｓ４５Ｅ、Ｄ４６Ｃ、Ａ５１Ｎ、Ｓ５３Ｎ、Ｇ５８Ｎ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｋ６２Ｅ、Ｋ６２Ｒ、Ｋ６２Ｄ、Ｋ６２Ｎ、Ｋ６２Ｑ、Ｋ６２Ｔ、Ｌ６５Ｑ、Ｌ６５Ｓ、Ｌ６５Ｎ、Ｆ７１Ｄ、Ｆ７１Ｙ、Ｆ７１Ｅ、Ｆ７１Ｑ、Ｆ７１Ｎ、Ｐ７４Ｓ、Ｐ７４Ａ、Ａ７５Ｅ、Ａ７５Ｄ、Ｅ７７Ａ、Ｅ８２Ｑ、Ｅ８２Ｎ、Ｅ８２Ｓ、Ｅ８２Ｔ Ｔ８３Ｋ、Ｎ９５Ｓ、Ｎ９５Ｔ、Ｇ９７Ｓ、Ｇ９７Ｔ、Ｙ１０１Ｎ、Ｄ１０４Ｎ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１０９Ｎ、Ｅ１１６Ｄ、Ｇ１１７Ｎ、Ｇ１２４Ｎ、Ｓ１２６Ｎ、Ｔ１２８Ｎ、Ｌ１４１Ｃ、Ｌ１４１Ｄ、Ｌ１４１Ｅ、Ｅ１４２Ｄ、Ｅ１４２Ｃ、Ｋ１４３Ｃ、Ｋ１４３Ｄ、Ｋ１４３Ｅ、Ｒ１４４Ｅ、Ｒ１４４Ｃ、Ｒ１４４Ｄ、Ｎ１４５Ｙ、Ｎ１４５Ｇ、Ｎ１４５Ｆ、Ｎ１４５Ｍ、Ｎ１４５Ｓ、Ｎ１４５Ｉ、Ｎ１４５Ｌ、Ｎ１４５Ｔ、Ｎ１４５Ｖ、Ｎ１４５Ｐ、Ｎ１４５Ｋ、Ｎ１４５Ｈ、Ｎ１４５Ｑ、Ｎ１４５Ｅ、Ｎ１４５Ｒ、Ｎ１４５Ｗ、Ｎ１４５Ｄ、Ｎ１４５Ｃ、Ｋ１５７Ｖ、Ｋ１５７Ｌ、Ｋ１５７Ｉ、Ｋ１５７Ｍ、Ｋ１５７Ｆ、Ｋ１５７Ｗ、Ｋ１５７Ｐ、Ｋ１５７Ｇ、Ｋ１５７Ｓ、Ｋ１５７Ｔ、Ｋ１５７Ｃ、Ｋ１５７Ｙ、Ｋ１５７Ｎ、Ｋ１５７Ｅ、Ｋ１５７Ｒ、Ｋ１５７Ｈ、Ｋ１５７Ｄ、Ｋ１５７Ｑ、Ｖ１５８Ｌ、Ｖ１５８Ｉ、Ｖ１５８Ｍ、Ｖ１５８Ｆ、Ｖ１５８Ｗ、Ｖ１５８Ｐ、Ｖ１５８Ｇ、Ｖ１５８Ｓ、Ｖ１５８Ｔ、Ｖ１５８Ｃ、Ｖ１５８Ｙ、Ｖ１５８Ｎ、Ｖ１５８Ｅ、Ｖ１５８Ｒ、Ｖ１５８Ｋ、Ｖ１５８Ｈ、Ｖ１５８Ｄ、Ｖ１５８Ｑ、Ａ１７５Ｓ、Ａ１７５Ｔ、Ｇ１７９Ｎ、Ｉ１８６Ｓ、Ｉ１８６Ｔ、Ｖ１８８Ｎ、Ｒ２０２Ｓ、Ｒ２０２Ｔ、Ｉ２０５Ｓ、Ｉ２０５Ｔ、Ｄ２１２Ｎ、Ｅ２２０Ｎ、Ｉ２３０Ｎ、Ｐ２３１Ｎ、Ｐ２３６Ｎ、Ｇ２３７Ｎ、Ｑ２５０Ｃ、Ｖ２５３Ｎ、Ｅ２６５Ｎ、Ｔ２６７Ｎ、Ｅ２７０Ｎ、Ａ２７４Ｍ、Ａ２７４Ｌ、Ａ２７４Ｋ、Ａ２７４Ｒ、Ａ２７４Ｄ、Ａ２７４Ｖ、Ａ２７４Ｉ、Ａ２７４Ｆ、Ａ２７４Ｗ、Ａ２７４Ｐ、Ａ２７４Ｇ、Ａ２７４Ｔ、Ａ２７４Ｃ、Ａ２７４Ｙ、Ａ２７４Ｎ、Ａ２７４Ｅ、Ａ２７４Ｈ、Ａ２７４Ｓ、Ａ２７４Ｑ、Ｆ２７５Ｈ、Ｒ２７７Ｎ、Ｆ２７８Ｓ、Ｆ２７８Ａ、Ｆ２７８Ｎ、Ｆ２７８Ｑ、Ｆ２７８Ｇ、Ｌ２８０Ｎ、Ｌ２８８Ｋ、Ｌ２８８Ｃ、Ｌ２８８Ｄ、Ｄ２８９Ｃ、Ｄ２８９Ｋ、Ｌ２８８Ｅ、Ｒ２９０Ｃ、Ｒ２９０Ｇ、Ｒ２９０Ａ、Ｒ２９０Ｓ、Ｒ２９０Ｔ、Ｒ２９０Ｋ、Ｒ２９０Ｄ、Ｒ２９０Ｅ、Ｇ２９１Ｅ、Ｇ２９１Ｄ、Ｇ２９１Ｃ、Ｇ２９１Ｎ、Ｇ２９１Ｋ、Ａ２９２Ｃ、Ａ２９２Ｋ、Ａ２９２Ｄ、Ａ２９２Ｅ、Ｔ２９３Ｋ、Ｅ２９６Ｖ、Ｅ２９６Ｌ、Ｅ２９６Ｉ、Ｅ２９６Ｍ、Ｅ２９６Ｆ、Ｅ２９６Ｗ、Ｅ２９６Ｐ、Ｅ２９６Ｇ、Ｅ２９６Ｓ、Ｅ２９６Ｔ、Ｅ２９６Ｃ、Ｅ２９６Ｙ、Ｅ２９６Ｎ、Ｅ２９６Ｋ、Ｅ２９６Ｒ、Ｅ２９６Ｈ、Ｅ２９６Ｄ、Ｅ２９６Ｑ、Ｍ２９８Ｑ、Ｍ２９８Ｖ、Ｍ２９８Ｌ、Ｍ２９８Ｉ、Ｍ２９８Ｆ、Ｍ２９８Ｗ、Ｍ２９８Ｐ、Ｍ２９８Ｇ、Ｍ２９８Ｓ、Ｍ２９８Ｔ、Ｍ２９８Ｃ、Ｍ２９８Ｙ、Ｍ２９８Ｎ、Ｍ２９８Ｋ、Ｍ２９８Ｒ、Ｍ２９８Ｈ、Ｍ２９８Ｅ、Ｍ２９８Ｄ、Ｐ３０３Ｓ、Ｐ３０３ＳＴ、Ｒ３０４Ｙ、Ｒ３０４Ｆ、Ｒ３０４Ｌ、Ｒ３０４Ｍ、Ｒ３０４Ｇ、Ｒ３０４Ｔ、Ｒ３０４Ａ、Ｒ３０４Ｓ、Ｒ３０４Ｎ、Ｌ３０５Ｖ、Ｌ３０５Ｙ、Ｌ３０５Ｉ、Ｌ３０５Ｆ、Ｌ３０５Ａ、Ｌ３０５Ｍ、Ｌ３０５Ｗ、Ｌ３０５Ｐ、Ｌ３０５Ｇ、Ｌ３０５Ｓ、Ｌ３０５Ｔ、Ｌ３０５Ｃ、Ｌ３０５Ｎ、Ｌ３０５Ｅ、Ｌ３０５Ｋ、Ｌ３０５Ｒ、Ｌ３０５Ｈ、Ｌ３０５Ｄ、Ｌ３０５Ｑ、Ｍ３０６Ｄ、Ｍ３０６Ｎ、Ｄ３０９Ｓ、Ｄ３０９Ｔ、Ｑ３１２Ｎ、Ｑ３１３Ｋ、Ｑ３１３Ｄ、Ｑ３１３Ｅ、Ｓ３１４Ａ、Ｓ３１４Ｖ、Ｓ３１４Ｉ、Ｓ３１４Ｍ、Ｓ３１４Ｆ、Ｓ３１４Ｗ、Ｓ３１４Ｐ、Ｓ３１４Ｇ、Ｓ３１４Ｌ、Ｓ３１４Ｔ、Ｓ３１４Ｃ、Ｓ３１４Ｙ、Ｓ３１４Ｎ、Ｓ３１４Ｅ、Ｓ３１４Ｋ、Ｓ３１４Ｒ、Ｓ３１４Ｈ、Ｓ３１４Ｄ、Ｓ３１４Ｑ、Ｒ３１５Ｋ、Ｒ３１５Ｇ、Ｒ３１５Ａ、Ｒ３１５Ｓ、Ｒ３１５Ｔ、Ｒ３１５Ｑ、Ｒ３１５Ｃ、Ｒ３１５Ｄ、Ｒ３１５Ｅ、Ｋ３１６Ｄ、Ｋ３１６Ｃ、Ｋ３１６Ｅ、Ｖ３１７Ｃ、Ｖ３１７Ｋ、Ｖ３１７Ｄ、Ｖ３１７Ｅ、Ｇ３１８Ｎ、Ｎ３２２Ｙ、Ｎ３２２Ｇ、Ｎ３２２Ｆ、Ｎ３２２Ｍ、Ｎ３２２Ｓ、Ｎ３２２Ｉ、Ｎ３２２Ｌ、Ｎ３２２Ｔ、Ｎ３２２Ｖ、Ｎ３２２Ｐ、Ｎ３２２Ｋ、Ｎ３２２Ｈ、Ｎ３２２Ｑ、Ｎ３２２Ｅ、Ｎ３２２Ｒ、Ｎ３２２Ｗ、Ｎ３２２Ｃ、Ｇ３３１Ｎ、Ｙ３３２Ｓ、Ｙ３３２Ａ、Ｙ３３２Ｎ、Ｙ３３２Ｑ、Ｙ３３２Ｇ、Ｄ３３４Ｇ、Ｄ３３４Ｅ、Ｄ３３４Ａ、Ｄ３３４Ｖ、Ｄ３３４Ｉ、Ｄ３３４Ｍ、Ｄ３３４Ｆ、Ｄ３３４Ｗ、Ｄ３３４Ｐ、Ｄ３３４Ｌ、Ｄ３３４Ｔ、Ｄ３３４Ｃ、Ｄ３３４Ｙ、Ｄ３３４Ｎ、Ｄ３３４Ｋ、Ｄ３３４Ｒ、Ｄ３３４Ｈ、Ｄ３３４Ｓ、Ｄ３３４Ｑ、Ｓ３３６Ｇ、Ｓ３３６Ｅ、Ｓ３３６Ａ、Ｓ３３６Ｖ、Ｓ３３６Ｉ、Ｓ３３６Ｍ、Ｓ３３６Ｆ、Ｓ３３６Ｗ、Ｓ３３６Ｐ、Ｓ３３６Ｌ、Ｓ３３６Ｔ、Ｓ３３６Ｃ、Ｓ３３６Ｙ、Ｓ３３６Ｎ、Ｓ３３６Ｋ、Ｓ３３６Ｒ、Ｓ３３６Ｈ、Ｓ３３６Ｄ、Ｓ３３６Ｑ、Ｋ３３７Ｌ、Ｋ３３７Ｖ、Ｋ３３７Ｉ、Ｋ３３７Ｍ、Ｋ３３７Ｆ、Ｋ３３７Ｗ、Ｋ３３７Ｐ、Ｋ３３７Ｇ、Ｋ３３７Ｓ、Ｋ３３７Ｔ、Ｋ３３７Ｃ、Ｋ３３７Ｙ、Ｋ３３７Ｎ、Ｋ３３７Ｅ、Ｋ３３７Ｒ、Ｋ３３７Ｈ、Ｋ３３７Ｄ、Ｋ３３７Ｑ、Ｋ３４１Ｅ、Ｋ３４１Ｑ、Ｋ３４１Ｇ、Ｋ３４１Ｔ、Ｋ３４１Ａ、Ｋ３４１Ｓ、Ｇ３４２Ｎ、Ｈ３４８Ｎ、Ｒ３５３Ｎ、Ｙ３５７Ｎ、Ｉ３６１Ｎ、Ｆ３７４Ｐ、Ｆ３７４Ａ、Ｆ３７４Ｖ、Ｆ３７４Ｉ、Ｆ３７４Ｌ、Ｆ３７４Ｍ、Ｆ３７４Ｗ、Ｆ３７４Ｇ、Ｆ３７４Ｓ、Ｆ３７４Ｔ、Ｆ３７４Ｃ、Ｆ３７４Ｙ、Ｆ３７４Ｎ、Ｆ３７４Ｅ、Ｆ３７４Ｋ、Ｆ３７４Ｒ、Ｆ３７４Ｈ、Ｆ３７４Ｄ、Ｆ３７４Ｑ、Ｖ３７６Ｎ、Ｒ３７９Ｎ、Ｌ３９０Ｃ、Ｌ３９０Ｋ、Ｌ３９０Ｄ、Ｌ３９０Ｅ、Ｍ３９１Ｄ、Ｍ３９１Ｃ、Ｍ３９１Ｋ、Ｍ３９１Ｎ、Ｍ３９１Ｅ、Ｒ３９２Ｃ、Ｒ３９２Ｄ、Ｒ３９２Ｅ、Ｓ３９３Ｄ、Ｓ３９３Ｃ、Ｓ３９３Ｋ、Ｓ３９３Ｅ、Ｅ３９４Ｋ、Ｐ３９５Ｋ、Ｅ３９４Ｃ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９５Ｃ、Ｐ３９５Ｅ、Ｒ３９６Ｋ、Ｒ３９６Ｃ、Ｒ３９６Ｄ、Ｒ３９６Ｅ、Ｐ３９７Ｄ、Ｐ３９７Ｋ、Ｐ３９７Ｃ、Ｐ３９７Ｅ、Ｇ３９８Ｋ、Ｇ３９８Ｃ、Ｇ３９８Ｄ、Ｇ３９８Ｅ、Ｖ３９９Ｃ、Ｖ３９９Ｄ、Ｖ３９９Ｋ、Ｖ３９９Ｅ、Ｌ４００Ｋ、Ｌ４０１Ｋ、Ｌ４０１Ｃ、Ｌ４０１Ｄ、Ｌ４０１Ｅ、Ｒ４０２Ｄ、Ｒ４０２Ｃ、Ｒ４０２Ｋ、Ｒ４０２Ｅ、Ａ４０３Ｋ、Ａ４０３Ｃ、Ａ４０３Ｄ、Ａ４０３Ｅ、Ｐ４０４Ｅ、Ｐ４０４Ｄ、Ｐ４０４Ｃ、Ｐ４０４Ｋ、Ｆ４０５Ｋ、Ｐ４０６Ｃ、Ｋ３２Ｎ／Ａ３４Ｓ、Ｋ３２Ｎ／Ａ３４Ｔ、Ｆ３１Ｎ／Ｄ３３Ｓ、Ｆ３１Ｎ／Ｄ３３Ｔ、Ｉ３０Ｎ／Ｋ３２Ｓ、Ｉ３０Ｎ／Ｋ３２Ｔ、Ａ３４Ｎ／Ｒ３６Ｓ、Ａ３４Ｎ／Ｒ３６Ｔ、Ｋ３８Ｎ／Ｆ４０Ｓ、Ｋ３８Ｎ／Ｆ４０Ｔ、Ｔ３７Ｎ／Ｌ３９Ｓ、Ｔ３７Ｎ／Ｌ３９Ｔ、Ｒ３６Ｎ／Ｋ３８Ｓ、Ｒ３６Ｎ／Ｋ３８Ｔ、Ｌ３９Ｎ／Ｗ４１Ｓ、Ｌ３９Ｎ／Ｗ４１Ｔ、Ｆ４０Ｎ／Ｉ４２Ｓ、Ｆ４０Ｎ／Ｉ４２Ｔ、Ｉ４２Ｎ／Ｙ４４Ｓ、Ｉ４２Ｎ／Ｙ４４Ｔ、Ｙ４４Ｎ／Ｄ４６Ｓ、Ｙ４４Ｎ／Ｄ４６Ｔ、Ｄ４６Ｎ／Ｄ４８Ｓ、Ｄ４６Ｎ／Ｄ４８Ｔ、Ｇ４７Ｎ／Ｑ４９Ｓ、Ｇ４７Ｎ／Ｑ４９Ｔ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｓ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ、Ｅ１４２Ｎ／Ｒ１４４Ｓ、Ｅ１４２Ｎ／Ｒ１４４Ｔ、Ｌ１４１Ｎ／Ｋ１４３Ｓ、Ｌ１４１Ｎ／Ｋ１４３Ｔ、Ｉ１４０Ｎ／Ｅ１４２Ｓ／、Ｉ１４０Ｎ／Ｅ１４２Ｔ、Ｒ１４４Ｎ／Ａ１４６Ｓ、Ｒ１４４Ｎ／Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｎ／Ｋ１４８Ｓ、Ａ１４６Ｎ／Ｋ１４８Ｔ、Ｓ１４７Ｎ／Ｐ１４９Ｓ／、Ｓ１４７Ｎ／Ｐ１４９Ｔ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｓ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ、Ｄ２８９Ｎ／Ｇ２９１Ｓ、Ｄ２８９Ｎ／Ｇ２９１Ｔ、Ｌ２８８Ｎ／Ｒ２９０Ｓ、Ｌ２８８Ｎ／Ｒ２９０Ｔ、Ｌ２８７Ｎ／Ｄ２８９Ｓ、Ｌ２８７Ｎ／Ｄ２８９、Ａ２９２Ｎ／Ａ２９４Ｓ、Ａ２９２Ｎ／Ａ２９４Ｔ、Ｔ２９３Ｎ／Ｌ２９５Ｓ、Ｔ２９３Ｎ／Ｌ２９５Ｔ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｓ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ、Ｓ３１４Ｎ／Ｋ３１６Ｓ、Ｓ３１４Ｎ／Ｋ３１６Ｔ、Ｑ３１３Ｎ／Ｒ３１５Ｓ、Ｑ３１３Ｎ／Ｒ３１５Ｔ、Ｋ３１６Ｎ／Ｇ３１８Ｓ、Ｋ３１６Ｎ／Ｇ３１８Ｔ、Ｖ３１７Ｎ／Ｄ３１９Ｓ、Ｖ３１７Ｎ／Ｄ３１９Ｔ、Ｋ３４１Ｎ／Ｄ３４３Ｓ、Ｋ３４１Ｎ／Ｄ３４３Ｔ、Ｓ３３９Ｎ／Ｋ３４１Ｓ、Ｓ３３９Ｎ／Ｋ３４１Ｔ、Ｄ３４３Ｎ／Ｇ３４５Ｓ、Ｄ３４３Ｎ／Ｇ３４５Ｔ、Ｒ３９２Ｎ／Ｅ３９４Ｓ、Ｒ３９２Ｎ／Ｅ３９４Ｔ、Ｌ３９０Ｎ／Ｒ３９２Ｓ、Ｌ３９０Ｎ／Ｒ３９２Ｔ、Ｋ３８９Ｎ／Ｍ３９１Ｓ、Ｋ３８９Ｎ／Ｍ３９１Ｔ、Ｓ３９３Ｎ／Ｐ３９５Ｓ、Ｓ３９３Ｎ／Ｐ３９５Ｔ、Ｅ３９４Ｎ／Ｒ３９６Ｓ、Ｅ３９４Ｎ／Ｒ３９６Ｔ、Ｐ３９５Ｎ／Ｐ３９７Ｓ、Ｐ３９５Ｎ／Ｐ３９７Ｔ、Ｒ３９６Ｎ／Ｇ３９８Ｓ、Ｒ３９６Ｎ／Ｇ３９８Ｔ、Ｐ３９７Ｎ／Ｖ３９９Ｓ、Ｐ３９７Ｎ／Ｖ３９９Ｔ、Ｇ３９８Ｎ／Ｌ４００Ｓ、Ｇ３９８Ｎ／Ｌ４００Ｔ、Ｖ３９９Ｎ／Ｌ４０１Ｓ、Ｖ３９９Ｎ／Ｌ４０１Ｔ、Ｌ４００Ｎ／Ｒ４０２Ｓ、Ｌ４００Ｎ／Ｒ４０２Ｔ、Ｌ４０１Ｎ／Ａ４０３Ｓ、Ｌ４０１Ｎ／Ａ４０３Ｔ、Ｒ４０２Ｎ／Ｐ４０４Ｓ、Ｒ４０２Ｎ／Ｐ４０４Ｔ、Ａ４０３Ｎ／Ｆ４０５Ｓ、Ａ４０３Ｎ／Ｆ４０５Ｔ、Ｐ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓ及びＰ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｔ、Ｖ１５８Ｄ／Ｇ２３７Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｇ２３７Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３４１Ｑ、Ｇ２３７Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｇ２３７Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３４１Ｑ、Ｍ２９８Ｑ／Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ、Ｋ１９７Ｅ／Ｍ２９８Ｑ及びＭ２９８Ｑ／Ｋ３４１Ｄの１つ又は複数をさらに含有し得る。
本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドのいずれかは、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）に対する抵抗性の増大、リン脂質との結合及び／若しくは親和性の増大、組織因子（ＴＦ）に対する親和性の増大、固有活性の増大、酵素原性を変化させるポリペプチドの高次構造の変化、プロテアーゼに対する抵抗性の増大、グリコシル化の低下、グリコシル化の増大、免疫原性の低減、安定性の増大、並びに／又は化学基連結の容易化を起こす１つ又は複数のさらなるアミノ酸改変（複数可）を含有し得る。例えば、酵素原性の変化は、より酵素原様の形状又はより酵素原様でない形状をもたらすことができる。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、例えば、位置３００〜３２２、３０５〜３２２、３００〜３１２、若しくは３０５〜３１２と、トリプシン、トロンビン若しくはＦＸの対応するアミノ酸の置換、又は位置３１０〜３２９、３１１〜３２２若しくは２３３〜３２９と、トリプシンの対応するアミノ酸の置換を含み得る。本明細書で提供される改変ポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドが配列番号３に示すアミノ酸の配列のみを含有し、又はその配列を含むポリペプチドを含む。例示的な改変ＦＶＩＩポリペプチドは、配列番号１８〜４３、１２５〜１５０及び２０６〜２５０のいずれかに示すアミノ酸の配列を有する若しくは含むポリペプチド、又はその対立遺伝子若しくは種変異体、又はその他の変異体である。対立遺伝子若しくは種変異体、又は他の変異体は、アミノ酸改変（複数可）を除外して、配列番号３に示すポリペプチドと４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し得る。ＦＶＩＩポリペプチドの供給源は、ヒト及び他の非ヒト種を含む。ポリペプチドは、成熟ポリペプチド又は前駆ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩポリペプチドの一次配列だけが改変されている。さらに、ＦＶＩＩポリペプチドは、それだけに限らないが、グリコシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、スルホン化、リン酸化、アルブミン化や、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの別の部分とのコンジュゲート化などの化学修飾又は翻訳後修飾を含み得る。
改変ＦＶＩＩポリペプチドは、単一鎖ポリペプチドとして、又は単一鎖及び二本鎖若しくは複数鎖型の混合物として、又は二本鎖、三本鎖、若しくは他の複数鎖型として提供することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、不活性又は活性化ポリペプチドとして提供することができる。活性化は、例えば、自己活性化によるタンパク質分解性切断、第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）による切断、第Ｘ因子（ＦＸａ）による切断、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）による切断、又はトロンビンによる切断によって行うことができる。
改変ＦＶＩＩポリペプチドは、典型的には、非改変ＦＶＩＩポリペプチドの１つ又は複数の活性又は特性を保持する。改変は、ポリペプチドが非改変ＦＶＩＩポリペプチドの少なくとも１つのＦＶＩＩ活性を保持する限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０又は６０個のアミノ酸の位置における改変を含み得る。活性の保持は、非改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性の（少なくとも約）１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上であり得る。活性には、例えば、組織因子（ＴＦ）結合、第Ｘ因子（ＦＸ）活性化、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性化、リン脂質結合、及び凝固活性がある。活性は、増大させることもでき、又は低下させることもできる。本明細書で提供される改変ポリペプチドの中には、凝固活性が増大しているものがある。活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。
改変ＦＶＩＩポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチドの配列を含む核酸分子も提供される。原核生物ベクター、又は哺乳動物ベクターを含めた真核生物ベクター、及びウイルスベクターなどのベクターも提供される。例示的なウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、及びサイトメガロウイルスがある。核酸分子又はベクターを含有する細胞も提供される。細胞は、哺乳動物や酵母細胞などの真核細胞でもよく、又は原核細胞でもよい。哺乳動物細胞には、例えば、仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１）又は２９３細胞及びＣＨＯ細胞がある。細胞は、改変ＦＶＩＩポリペプチドが発現する条件下で増殖させることができる。そのポリペプチドを分泌させることができる。そのような細胞によって産生された改変ＦＶＩＩポリペプチドが提供される。
本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドを含有する組成物も提供される。具体的には、そのようなポリペプチドを含有する医薬組成物が提供される。組成物は、薬学的に許容される媒体中に、本明細書で提供される、治療に有効な濃度又は量の改変ＦＶＩＩポリペプチド、又は核酸分子又はベクター又は細胞を含有し得る。医薬組成物は、単回投与又は複数回投与用に製剤することができる。医薬組成物は、液体、ゲルや固体などの任意の形態であり得、カプセル、容器及び他の適切な媒体に入れて提供することができる。その組成物は、投与前に希釈する形で、又は任意の適切な形態で製剤することができる。その量は、治療する障害及び／又は治療する個体に依存し得、必要なら、経験的に決定することができる。医薬組成物は、例えば、局部、全身、若しくは局所投与を含めた任意の投与経路用に製剤することもでき、又は経口、経鼻、肺、口腔、経皮、皮下、十二指腸内、経腸、非経口、静脈内、若しくは筋内投与用に製剤することもできる。医薬組成物は、制御放出用に製剤することができる。
治療方法及び治療のための組成物の使用も提供される。医薬組成物は、活性ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）の投与による治療を含めたＦＶＩＩの投与により治療される疾患又は状態を有する対象に投与され、又はその対象への投与用に製剤される。医薬組成物での治療は、疾患又は状態に伴う症状を改善又は緩和する。投与後に、又は投与と同時に、ＦＶＩＩが媒介する疾患又は状態に伴う症状の変化について対象をモニターすることができる。治療する疾患又は状態には、それだけに限らないが、血液凝固障害、血液系障害、出血性障害、血友病、第ＶＩＩ因子欠損及び出血障害がある。血友病Ａ又は血友病Ｂ又は血友病Ｃは、これらを例示するものである。血友病は、手術又は外傷による出血性合併症に起因するものなど、先天性又は後天性であり得る。出血は、急性関節血症、慢性血友病性関節症、血腫、血尿、中枢神経系出血、胃腸出血、若しくは脳溢血として現れる可能性もあり、又は例えば抜歯、若しくは例えば血管形成術、肺手術、腹部手術、脊髄手術、脳手術、血管手術、歯科手術や、骨髄、心臓、肺、膵臓、及び肝臓の移植などの臓器移植手術などの手術から生じる可能性もある。対象は、第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子に対する自己抗体を有する可能性がある。治療は、例えば血漿精製若しくは組換え凝固因子、ビタミンＫ、ビタミンＫ誘導体やプロテインＣ阻害因子などの凝固促進物質、血漿、血小板、赤血球及びコルチコステロイドなどの１つ若しくは複数のさらなる凝固因子を伴い、又はそれを順次若しくは断続的に投与することができる。そのような他の凝固因子を含有する組成物と共に、医薬組成物を使用することができる。
パッケージング材料及びパッケージング材料に入れて提供される医薬組成物、及び任意選択で投与についての説明書を含有する製品が提供される。例えば、医薬組成物中の改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩが媒介する疾患又は状態の治療用のものであり得、パッケージング材料は、ＦＶＩＩが媒介する疾患又は状態の治療に改変ＦＶＩＩポリペプチドが使用されることを示すラベルを含み得る。医薬組成物及び組成物を投与するためのデバイス、及び任意選択で投与についての説明書を含有するキットも提供される。
凝固カスケードを示す図である。この図は、ＦＸａの独立生成に関する凝固の内因性経路及び外因性経路、並びに血餅の形成に関するトロンビン及びフィブリンを生成するための共通経路へのこれらの経路の収束を示す。これらの経路は相互接続している。この図は、活性化カスケードと関係する分子の順序を示し、その中では、１つ又は複数のペプチド結合の切断によって酵素原が活性化プロテアーゼに変換される。次いで、活性化されたプロテアーゼは、カスケード中の次の酵素原分子のための活性化プロテアーゼとして働き、最終的には血餅の形成をもたらす。 凝固の細胞ベースモデルを示す図である（例えば、Ｈｏｆｆｍａｎら、（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ８５：９５８〜９６５ページを参照）。この図は３段階に分けた凝固事象を示し、この場合凝固の開始は、ＴＦ含有細胞上でのＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体によるＦＸａへのＦＸの活性化によって行われ、ＦＸａ／ＦＶａによる活性化後に少量のトロンビンの生成をもたらす。トロンビンが血小板に結合し活性化させ、且つ十分な量の適切な凝固因子の活性化を開始させてＦＶＩＩＩａ／ＦＩＸａ及びＦＶａ／ＦＸａ複合体を形成すると、増幅が生じる。凝固の伝播は損傷部位における多数の活性化血小板の表面上で起こり、フィブリノゲンから十分なフィブリンを生成して損傷部位における血餅を確定するほど十分大規模なトロンビン生成の突発をもたらす。 それによってＦＶＩＩａがトロンビン形成を開始することができる機構を示す図である。この図は、ＦＸａへのＦＸの活性化前にＴＦ含有細胞の表面で作用しＴＦとＦＶＩＩａの複合体形成が関与する、ＦＶＩＩａトロンビン生成のＴＦ依存性経路を例証する。この図はＦＶＩＩａトロンビン生成のＴＦ非依存性経路も示し、その中でＦＶＩＩａは活性化血小板上のリン脂質と結合し、ＦＸをＦＸａに活性化し、これは次いでＦＶａと複合体形成してプロトロンビンをトロンビンに切断する。 ＴＦＰＩ／ＦＸａ複合体がＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体と結合するときに生成する、四量体阻害性複合体を示す図である。ＴＦＰＩは３つのクニッツドメインを含有する。クニッツドメイン２（Ｋ−２）はＦＸａと相互作用しそれを阻害し、一方クニッツドメイン（Ｋ−１）はＦＶＩＩａと相互作用しそれを阻害する。 （ａ）ＢＰＴＩ５ＬＩ５（配列番号１０６のアミノ酸位置１〜５５）とＴＦＰＩ−２（配列番号１０５のアミノ酸位置１４〜６５）、及び（ｂ）ＴＦＰＩ−１（配列番号１０２のアミノ酸位置２６〜７６）とＴＦＰＩ−２（配列番号１０５のアミノ酸位置１４〜６５）の第１のクニッツドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示し、保存アミノ酸を示す図である。 ＦＶＩＩａとＴＦＰＩの間の相互作用の界面における接触残基を決定するために使用した、相同性モデルを示す図である。ＴＦＰＩ−２のクニッツドメイン（Ｋ１）の構造をトリプシン／ＴＦＰＩ複合体結晶構造から得て、ＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＢＰＴＩ５ＬＩ５結晶構造におけるＢＰＴＩ５ＬＩ５にモデル化した。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ突然変異誘発を実施してＴＦＰＩ−１のＫ１の対応するアミノ酸をこのモデルに適合させた。タンパク質−タンパク質界面におけるＴＦＰＩとの相互作用におそらく関与するＦＶＩＩａの接触残基を同定し、ＴＦＰＩ抵抗性ＦＶＩＩポリペプチドの発生中の突然変異誘発に関する候補として確定した。 ＦＶＩＩａとＴＦＰＩの間のモデル化した相互作用を示す図である。特にこの図は、ＦＶＩＩａとＴＦＰＩ相互作用の界面に存在するＦＶＩＩ接触残基、及び相補的静電性接触部位を形成する対応するＴＦＰＩ接触残基を示す。
［詳細な説明］
アウトライン
Ａ．定義
Ｂ．止血の概要
１．血小板接着及び凝集
２．凝固カスケード
ａ．開始
ｂ．増幅
ｃ．伝播
３．凝固の制御
Ｃ．第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）
１．ＦＶＩＩ構造及び構成
２．翻訳後修飾
３．ＦＶＩＩプロセシング
４．ＦＶＩＩ活性化
５．ＦＶＩＩ機能
ａ．組織因子依存性ＦＶＩＩａ活性
ｂ．組織因子非依存性ＦＶＩＩａ活性
６．生物製剤としてのＦＶＩＩ
Ｄ．改変ＦＶＩＩポリペプチド
１．阻害因子に対する抵抗性
ａ．ＴＦＰＩ
ＴＦＰＩに対する抵抗性の増大をもたらすための改変
ｂ．アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）
ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大をもたらすための改変
２．活性化血小板への結合
異種Ｇｌａドメインの導入による改変
３．組合せ及び追加の改変
ａ．固有活性を増大させる改変
ｂ．プロテアーゼに対する抵抗性を増大させる改変
ｃ．リン脂質に対する親和性を増大させる改変
ｄ．グリコシル化を変化させる改変
ｅ．化学基連結を容易にするための改変
ｆ．例示的なＦＶＩＩ組合せ変異体
Ｅ．ＦＶＩＩの改変の設計及び方法
１．論理的
２．実証的（即ちスクリーニング）
ａ．ランダム突然変異誘発
ｂ．集中的な突然変異誘発
ｃ．スクリーニング
３．ＦＶＩＩ変異体の選択
Ｆ．ＦＶＩＩポリペプチドの生成
１．ベクター及び細胞
２．発現系
ａ．原核性の発現
ｂ．酵母
ｃ．昆虫及び昆虫細胞
ｄ．哺乳動物細胞
ｅ．植物
２．精製
３．融合タンパク質
４．ポリペプチドの修飾
５．ヌクレオチド配列
Ｇ．改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性の評価
１．ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイ
ａ．翻訳後修飾
ｂ．タンパク質分解活性
ｃ．凝固活性
ｄ．他のタンパク質への結合及び／又は他のタンパク質による阻害
ｅ．リン脂質の親和性
２．ヒト以外の動物モデル
３．臨床アッセイ
Ｈ．製剤及び投与
１．製剤
ａ．用量
ｂ．投与形態
２．改変ＦＶＩＩポリペプチドの投与
３．改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸の投与（遺伝子治療）
Ｉ．治療的使用
１．先天性出血障害
ａ．血友病
ｂ．ＦＶＩＩ欠乏症
ｃ．その他
２．後天性出血障害
ａ．化学療法による後天性の血小板減少症
ｂ．他の凝固障害
ｃ．移植による後天性の出血
ｄ．抗凝固療法誘発性の出血
ｅ．後天性血友病
３．外傷及び外科手術での出血
Ｊ．組合せ療法
Ｋ．製品及びキット
Ｌ．実施例
Ａ．定義
別段に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。すべての特許、特許出願、公開された出願及び公報、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、データベース、ウェブサイト並びに本明細書全体の開示で言及されるその他の公開された資料は、別段に記載しない限り、その全体が参照により組み込まれる。本明細書における用語について複数の定義がある場合、この項のものが優勢である。ＵＲＬ若しくは他のそのような識別子又はアドレスに言及する場合、そのような識別子は変更でき、インターネット上の特定の情報は移り変わり可能であるが、同等の情報はインターネットを検索することにより見出すことができる。それらへの言及は、そのような情報の利用可能性及び公共での普及の証拠である。
本明細書において、凝固経路又は凝固カスケードとは、不溶性のフィブリン凝血塊を導く一連の活性化事象のことをいう。凝固カスケード又は凝固経路では、セリンプロテアーゼの不活性タンパク質（酵素原とも呼ばれる）が、１つ又は複数のペプチド結合の切断により活性プロテアーゼに変換され、これが、次いで、カスケード内の次の酵素原分子を活性化するプロテアーゼとして働く。カスケードの最終タンパク質分解ステップにおいて、フィブリノゲンは、トロンビンによりフィブリンにタンパク質分解切断され、これが、次いで、損傷部位にて架橋されて凝血塊を形成する。
本明細書において、「止血」とは、器官又は体の部分での出血又は血流の停止のことをいう。用語止血は、血管損傷の後の血液の損失を防ぐための血液の凝血から、その後の組織修復の後の血液の凝血塊の溶解までの全体のプロセスを包含できる。
本明細書において、「凝血」又は「凝固」とは、不溶性のフィブリン凝血塊の形成、又は血液凝固因子が凝固カスケードにおいて相互作用して、最終的に不溶性のフィブリン凝血塊の形成をもたらすプロセスのことをいう。
本明細書において、「プロテアーゼ」は、共有ペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である。これらの名称は、酵素原の形及びその活性化された一本鎖、二本鎖及び複数鎖の形を含む。明確化のために、プロテアーゼへの言及はすべての形を含む。プロテアーゼは、それらの活性部位の触媒活性及び標的基質のペプチド結合の切断機構に応じて、例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ及びメタロプロテアーゼを含む。
本明細書において、セリンプロテアーゼ又はセリンエンドペプチダーゼとは、酵素の活性部位にセリン残基が存在することを特徴とするペプチダーゼのクラスのことをいう。セリンプロテアーゼは、血液の凝血及び炎症を含む体内の広範囲の機能に関与すると共に、原核生物及び真核生物において消化酵素として機能する。セリンプロテアーゼによる切断機構は、セリンによる、標的にされたペプチド結合の求核的攻撃に基づく。システイン、スレオニン又はアスパラギン酸若しくは金属と会合する水分子も、この役割を行うことができる。セリン、ヒスチジン及びアスパラギン酸の整列された側鎖は、ほとんどのセリンプロテアーゼに共通する触媒三連構造を形成する。セリンプロテアーゼの活性部位は、ポリペプチド基質が結合する割れ目の形である。
本明細書において、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ、Ｆ７；第７因子、凝固第ＶＩＩ因子、血清第ＶＩＩ因子、血清プロトロンビン変換促進因子、ＳＰＣＡ、プロコンベルチン及びエプタコグアルファとも呼ばれる）とは、凝固カスケードの一部分であるセリンプロテアーゼのことをいう。ＦＶＩＩは、Ｇｌａドメイン、２つのＥＧＦドメイン（ＥＧＦ−１及びＥＧＦ−２）、及び例えばキモトリプシンのようなセリンプロテアーゼのペプチダーゼＳ１ファミリーのすべてのメンバーのうちで高度に保存されているセリンプロテアーゼドメイン（又はペプチダーゼＳ１ドメイン）を含む。シグナルペプチド及びプロペプチドを有する例示的な前駆ＦＶＩＩの配列を、配列番号１に示す。例示的な成熟ＦＶＩＩポリペプチドを、配列番号３に示す。ＦＶＩＩは、一本鎖酵素原、酵素原様二本鎖ポリペプチド及び完全に活性化された二本鎖の形として存在する。酵素原様の形からの高次構造変化により生じる完全な活性化は、その補因子組織因子への結合により生じる。また、組織因子の不在下での高次構造変化をもたらす突然変異を導入できる。よって、ＦＶＩＩへの言及は、その一本鎖の形、並びに酵素原様及び完全に活性化された二本鎖の形を含む二本鎖の形を含む。
ＦＶＩＩポリペプチドへの言及は、一本鎖又は二本鎖の形の前駆ポリペプチド及び成熟ＦＶＩＩポリペプチド、活性を有するその切断された形も含み、対立遺伝子変異体及び種変異体、スプライス変異体によりコードされる変異体、並びに配列番号１に示す前駆ポリペプチド又はその成熟形と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含むその他の変異体も含む。配列番号１８〜４３、１２５〜１５０又は２０６〜１５０のものなどの改変ＦＶＩＩポリペプチド及びその変異体が含まれる。ＴＦ結合、第Ｘ因子結合、リン脂質結合及び／又はＦＶＩＩの凝固活性などのＦＶＩＩの活性を少なくとも保持するものも含まれる。活性を保持することにより、保持された活性のレベルが検出可能な効果を生じるのに十分である限りは、活性は、野生型ＦＶＩＩと比較して、低減又は増大などの変化をさせることができる。ＦＶＩＩポリペプチドは、それだけに限らないが、その組織特異的アイソフォーム及び対立遺伝子変異体、核酸の翻訳により調製される合成分子、組換え法によるより短いポリペプチドの連結を含む合成などの化学合成により作製されるタンパク質、ヒト及び非ヒト組織及び細胞から単離されるタンパク質、キメラＦＶＩＩポリペプチド及びその改変形を含む。ＦＶＩＩポリペプチドは、全長成熟ポリペプチドの少なくとも１つの活性（必要であれば活性化により）を保持するのに十分な長さであるか又は適切な領域を含むＦＶＩＩの断片又は部分も含む。ＦＶＩＩポリペプチドは、化学的又は翻訳後の改変を有するもの、及び化学的又は翻訳後の改変を有さないものも含む。そのような改変は、それだけに限らないが、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルニシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化及び当技術分野で知られるその他のポリペプチド改変を含む。
例示的なＦＶＩＩポリペプチドは、ヒトを含む哺乳動物起源のものである。例示的なヒト起源のＦＶＩＩのアミノ酸配列は、配列番号１、２及び３に示す。そのようなヒトＦＶＩＩポリペプチドの例示的な変異体は、配列番号４４〜１００に示す前駆ポリペプチドの任意のものを含む。ＦＶＩＩポリペプチドは、それだけに限らないが、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、鳥類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚類、カエル（ｒａｎｉｎｅ）及びその他の霊長類の第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含む非ヒト起源の任意のものも含む。例示的な非ヒト起源のＦＶＩＩポリペプチドは、例えば、ウシ（Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ、配列番号４）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、配列番号５）、ピグミーチンパンジー（Ｐａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ、配列番号６）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、配列番号７）、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、配列番号８）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、配列番号９）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ、配列番号１０）、ブタ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ、配列番号１１）、イヌ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、配列番号１２）、ゼブラフィッシュ（Ｂｒａｃｈｙｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ、配列番号１３）、フグ（Ｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ、配列番号１４）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ、配列番号１５）、オランウータン（Ｐｏｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ、配列番号１６）及びゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ、配列番号１７）を含む。
当業者は、成熟第ＶＩＩ因子ポリペプチド（配列番号３）の言及される位置が、シグナルペプチド及びプロペプチド配列を含むアイソフォーム第ＶＩＩ因子ポリペプチドである配列番号１に示す前駆ＦＶＩＩポリペプチドのアイソフォームと比較して、６０アミノ酸残基と異なることを認識する。つまり、配列番号３の最初のアミノ酸残基は、配列番号１の６１番目のアミノ酸残基に「対応する」。当業者は、成熟第ＶＩＩ因子ポリペプチド（配列番号３）の言及される位置が、シグナルペプチド及びプロペプチド配列を含むアイソフォームｂ第ＶＩＩ因子ポリペプチドである配列番号２に示す前駆ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、３８アミノ酸残基と異なることも認識する。つまり、配列番号３の最初のアミノ酸残基は、配列番号２の３９番目のアミノ酸残基に「対応する」。
本明細書において、対応する残基とは、整列させた遺伝子座にある残基のことをいう。関連する又は変異体のポリペプチドは、当業者に知られる任意の方法により整列される。そのような方法は、典型的に、一致を最大にし、手動のアラインメントを用いること、並びに多くの利用可能なアラインメントプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰ）及び当業者に知られるその他の方法を用いることによるなどの方法を含む。ポリペプチドの配列を整列させることにより、当業者は、保存及び同一アミノ酸残基を手掛かりとして用いて、対応する残基を同定できる。例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの配列を整列させることにより、当業者は、保存及び同一アミノ酸残基を手掛かりとして用いて、対応する残基を同定できる。例えば、配列番号３（成熟第ＶＩＩ因子）のアミノ酸１位にあるアラニン（Ａ１）は、配列番号１のアミノ酸６１位にあるアラニン（Ａ６１）、及び配列番号２のアミノ酸３９位にあるアラニン（Ａ３９）に対応する。別の場合には、対応する領域を同定できる。例えば、Ｇｌａドメインは、配列番号３の位置Ａ１からＦ４５までのアミノ酸、配列番号１の位置Ａ６１からＳ１０５までのアミノ酸、及び配列番号２の位置Ａ３９からＳ８３までのアミノ酸に対応する。当業者は、ヒト及び非ヒト配列の間、又はこれらの配列のうちの対応するアミノ酸残基を見出すために、保存されたアミノ酸残基を手掛かりとして用いることもできる。例えば、配列番号３（ヒト）のアミノ酸残基Ｓ４３及びＥ１６３は、配列番号４（ウシ）のＳ８３及びＥ２０３に対応する。対応する位置は、例えばタンパク質構造のコンピュータシミュレーションされたアラインメントを用いることにより、構造アラインメントに基づくこともできる。別の場合には、対応する領域を同定できる。
本明細書において、「プロ領域」、「プロペプチド」又は「プロ配列」とは、切断されて成熟タンパク質を生成する領域又はセグメントのことをいう。これは、触媒機構をマスクして、触媒中間体の形成を妨げることにより（即ち、基質結合部位を立体的に遮ることにより）タンパク質分解活性を抑制するように機能するセグメントを含み得る。プロ領域は、成熟生物活性ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列であり、数アミノ酸ほど小さいことが可能であるか、又は多重ドメイン構造であり得る。
本明細書において、「成熟第ＶＩＩ因子」とは、シグナル配列及びプロペプチド配列を欠くＦＶＩＩポリペプチドのことをいう。典型的には、シグナル配列は、小胞体（ＥＲ）−ゴルジ経路を経由する分泌のためのタンパク質を標的とし、ＥＲへの挿入後、翻訳の間に切断される。プロペプチド配列は、典型的には、タンパク質の翻訳語修飾において機能し、細胞からのタンパク質の分泌の前に切断される。つまり、成熟ＦＶＩＩポリペプチドは、典型的には、分泌タンパク質である。ある例では、成熟ヒトＦＶＩＩポリペプチドは、配列番号３に示す。配列番号３に示すアミノ酸配列は、配列番号１及び２に示す前駆ポリペプチドのものとは、配列番号３が、配列番号１及び２のアミノ酸残基１〜２０に対応するシグナル配列を欠き、配列番号１のアミノ酸残基２１〜６０及び配列番号２のアミノ酸残基２１〜３８に対応するプロペプチド配列を欠く点で異なる。成熟ＦＶＩＩポリペプチドへの言及は、一本鎖の形の酵素原及び二本鎖の形を包含する。
本明細書において、ＦＶＩＩについての「野生型」又は「天然」とは、ヒト及びその他の動物を含む生物に、天然で存在する対立遺伝子変異体を含む、天然又は天然に存在するＦＶＩＩ遺伝子によりコードされるＦＶＩＩポリペプチドのことをいう。種に言及せずに野生型第ＶＩＩ因子への言及は、任意の種の野生型第ＶＩＩ因子を包含することを意図する。野生型ＦＶＩＩポリペプチドは、コードされる前駆ポリペプチド、その断片、並びにシグナルペプチドを欠く成熟形及びその任意の翻訳前若しくは翻訳後プロセシングを受けたか又は改変された形などのそのプロセシングされた形を含む。天然ＦＶＩＩポリペプチドは、それだけに限らないが、グリコシル化、カルボキシル化及びヒドロキシル化による修飾により翻訳後に修飾されたものを含む。天然ＦＶＩＩポリペプチドは、一本鎖及び二本鎖の形も含む。例えば、ヒトは、天然ＦＶＩＩを発現する。例示的な野生型ヒトＦＶＩＩのアミノ酸配列は、配列番号１、２、３及び配列番号４４〜１００に示す対立遺伝子変異体並びにそれらの成熟形に示す。それだけに限らないが、ウシ（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ、配列番号４）、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、配列番号５）ピグミーチンパンジー（Ｐａｎ ｐａｎｉｓｃｕｓ、配列番号６）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ、配列番号７）、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ、配列番号８）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、配列番号９）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ、配列番号１０）、ブタ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ、配列番号１１）、イヌ（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、配列番号１２）、ゼブラフィッシュ（Ｂｒａｃｈｙｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ、配列番号１３）、フグ（Ｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ、配列番号１４）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ、配列番号１５）、オランウータン（Ｐｏｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ、配列番号１６）及びゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ、配列番号１７）を含むその他の動物は、天然ＦＶＩＩを生成する。
本明細書において、種変異体とは、マウスとヒトなどの異なる哺乳動物種を含む異なる種の中のポリペプチドでの変異体のことをいう。
本明細書において、対立遺伝子変異体とは、同じ種のメンバーの中のタンパク質の変異体のことをいう。
本明細書において、スプライス変異体とは、１つを超えるｍＲＮＡの型をもたらすゲノムＤＮＡの１次転写産物の異なるプロセシングにより生成される変異体のことをいう。
本明細書において、酵素原とは、活性化切断などの成熟切断、及び／又は他のタンパク質（複数可）及び／又は補因子（複数可）との複合体形成を含む、タンパク質分解切断により活性化されるプロテアーゼのことをいう。酵素原は、タンパク質分解酵素の不活性前駆体である。そのような前駆体は、必ずしもより大きくないが、通常、活性形よりも大きい。セリンプロテアーゼについて、酵素原は、触媒及び自己触媒切断を含む特異的切断、又は活性酵素を生じる活性化補因子の結合により、活性酵素に変換される。例えば、通常、酵素原は、一本鎖の形で存在する。通常、酵素原は不活性であり、１つ又は複数のタンパク質分解部位で触媒又は自己触媒切断により成熟活性ポリペプチドに変換されて、二本鎖などの複数鎖ポリペプチドを生じることができる。つまり、酵素原は、活性化因子の作用によりタンパク質分解酵素に変換される酵素的に不活性なタンパク質である。切断は、自己活性化により行うことができる。いくつかの凝固タンパク質が、酵素原である。これらは不活性であるが、血管損傷後の凝固系の開始により切断されることとなり活性化される。ＦＶＩＩについて、ポリペプチドは、例えば活性第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、活性第Ｘ因子（ＦＸａ）、活性第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）、トロンビンなどのアプロテアーゼによるか、又は自己活性化による切断まで酵素原として血漿中に存在して、酵素原様の二本鎖形を生成し、これは、次いで、完全な活性のために、さらなる高次構造変化を必要とする。
本明細書において、「酵素原様」のタンパク質又はポリペプチドとは、タンパク質分解切断により活性化されたが、例えば活性が低いか若しくはないなどの酵素原が有する特性を、又はタンパク質の酵素原の形の高次構造に類似の高次構造をまだ示すタンパク質のことをいう。例えば、組織因子に結合していない場合、ＦＶＩＩの二本鎖活性形は、酵素原様タンパク質である。これは、未切断のＦＶＩＩ酵素原と同様の高次構造を保持し、よって、非常に低い活性を示す。組織因子への結合により、ＦＶＩＩの二本鎖活性形は、高次構造変化を受け、凝固因子としてのその完全な活性を獲得する。
本明細書において、活性化配列とは、活性プロテアーゼを形成するための活性化切断又は成熟切断のために必要な部位である、酵素原中のアミノ酸の配列のことをいう。活性化配列の切断は、自己触媒的に、又は活性化パートナーにより触媒される。
本明細書において、活性化切断は、完全な酵素活性の発生に必要とされる高次構造変化を誘導する成熟切断のある型である。これは、例えば、切断が新しいＮ末端を生じ、これがキモトリプシン中のＡｓｐ１９４のようなプロテアーゼの保存領域と相互作用して、活性に必要な高次構造変化を誘導する、セリンプロテアーゼについての伝統的な活性化経路である。活性化は、プロテアーゼの複数鎖形の生成をもたらし得る。ある場合には、プロテアーゼの一本鎖形が、タンパク質分解活性を示し得る。
本明細書において、「活性第ＶＩＩ因子」又は「ＦＶＩＩａ」とは、ＦＶＩＩポリペプチドの任意の二本鎖形のことをいう。二本鎖形は、典型的には、タンパク質分解切断に起因するが、合成的に生成できる。つまり、活性第ＶＩＩ因子は、凝固活性が低い酵素原様二本鎖形、組織因子への結合により生じる完全な活性形（約１０００倍高い活性）、及び完全活性二本鎖形で存在するか、又は高次構造変化を受けて完全活性形になる突然変異した形を含む。例えば、ＦＶＩＩポリペプチドの一本鎖形（例えば、配列番号３を参照されたい）は、成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸残基Ｒ１５２とＩ１５３との間でタンパク質分解により切断される。ジスルフィド結合（配列番号３のＦＶＩＩ中のアミノ酸残基１３５Ｃと１６２Ｃとの間）により一緒に維持される、切断生成物であるＦＶＩＩ重鎖及びＦＶＩＩ軽鎖は、二本鎖活性ＦＶＩＩ酵素を形成する。タンパク質分解切断は、例えば、活性第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）、活性第Ｘ因子（ＦＸａ）、活性第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）、トロンビンにより、又は自己活性化により行うことができる。
本明細書において、ＦＶＩＩポリペプチドの「特性」とは、３次元構造、ｐＩ、半減期、高次構造及びその他のそのような物理的特徴などの物理的又は構造の特性のことをいう。
本明細書において、ＦＶＩＩポリペプチドの「活性」とは、第ＶＩＩ因子ポリペプチドにより示される任意の活性のことをいう。そのような活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで試験でき、それだけに限らないが、凝固又は凝固活性、凝固促進活性、第Ｘ因子（ＦＸ）活性化若しくは第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性化を行うなどのタンパク質分解又は触媒活性；抗原性（抗ＦＶＩＩ抗体に結合し又はその抗体への結合についてポリペプチドと競合する能力）；組織因子、第Ｘ因子又は第ＩＸ因子に結合する能力；及び／又はリン脂質に結合する能力を含む。活性は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで凝固を測定することによる認証されたアッセイを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで評価できる。そのようなアッセイの結果は、ポリペプチドが、ｉｎ ｖｉｖｏでのポリペプチドの活性と相関させ得る活性を示すことを示し、ここで、ｉｎ ｖｉｖｏ活性は、生物活性ということができる。ＦＶＩＩの改変形の機能性又は活性を決定するアッセイは、当業者に知られている。ＦＶＩＩポリペプチドの活性を評価する例示的なアッセイは、凝固活性を評価するためのプロトロンボプラスチン時間（ＰＴ）アッセイ若しくは活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイ、又は触媒若しくはタンパク質分解活性を評価するための、実施例４、５及び１１に記載されるものなどの合成基質を用いる呈色アッセイを含む。
本明細書において、「少なくとも１つの活性を示す」又は「少なくとも１つの活性を保持する」とは、同じ形で同じ条件下の非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較した、改変ＦＶＩＩポリペプチドにより示される活性のことをいう。例えば、二本鎖形の改変ＦＶＩＩポリペプチドは、同じ実験条件下で、二本鎖形の非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較され、ここで、２つのポリペプチド間の違いは、調査中の改変のみである。別の例では、一本鎖形の改変ＦＶＩＩポリペプチドは、同じ実験条件下で、一本鎖形の非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較され、ここで、２つのポリペプチド間の違いは、調査中の改変のみである。典型的には、同じ形の非改変ＦＶＩＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持又は示す改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで投与されたときに、改変ＦＶＩＩポリペプチドが凝固促進治療薬として治療上有効であるような十分量の活性を保持する。通常、改変ＦＶＩＩポリペプチドが凝固促進剤として治療有効性を保持するためには、保持される活性量は、凝固促進剤として治療有効性を示す同じ形の非改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性の約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上である。凝固促進剤としての治療有効性を維持するために必要とされる活性量は、所望により、経験的に決定できる。典型的には、活性の０．５％〜２０％、０．５％〜１０％、０．５％〜５％の保持が、ｉｎ ｖｉｖｏで凝固促進剤としての治療有効性を保持するのに十分である。
改変ＦＶＩＩポリペプチドにより示されるか又は保持される活性は、それだけに限らないが、凝固又は凝固活性、凝固促進活性；第Ｘ因子（ＦＸ）活性化又は第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性化を行うなどのタンパク質分解又は触媒活性；抗原性（抗ＦＶＩＩ抗体に結合し又はその抗体への結合についてポリペプチドと競合する能力）；組織因子、第Ｘ因子又は第ＩＸ因子に結合する能力；及び／又はリン脂質に結合する能力を含む任意の活性であり得る。改変ＦＶＩＩポリペプチドが、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して増大した活性を保持できる場合がある。改変ＦＶＩＩポリペプチドが、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して低下した活性を示す場合もある。改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性は、それだけに限らないが、問題の改変を含まないポリペプチドと比較して、活性の１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上の活性を含む、非改変ポリペプチドの活性の任意のレベルのパーセンテージであり得、ここで、両方のポリペプチドは同じ形である。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、同じ形の非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増大又は低下した活性を示し得る。例えば、これは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性の（少なくとも約）１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％を保持できる。別の実施形態では、活性の変化は、非改変ＦＶＩＩよりも少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍以上大きい。保持される特定のレベルは、ポリペプチドの意図する機能であり、経験的に決定できる。活性は、例えば、本明細書若しくは以下の実施例に記載されるものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイを用いて測定できる。
本明細書において、「凝固の活性」又は「凝固活性」又は「凝固促進活性」とは、凝固をもたらすポリペプチドの能力のことをいう。凝固活性を評価するアッセイは、当業者に知られ、プロトロンボプラスチン時間（ＰＴ）アッセイ又は活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイを含む。
本明細書において、ＦＶＩＩについての「触媒活性」又は「タンパク質分解活性」とは、ＦＶＩＩタンパク質が基質のタンパク質分解切断を触媒する能力のことをいい、交換可能に用いられる。そのような活性を評価するアッセイは、当技術分野において知られている。例えば、ＦＶＩＩのタンパク質分解活性は、スペクトロザイムＦＶＩＩａ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｂｕｔ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）などの呈色基質を用いて測定でき、ここで、基質の切断は、吸光度及び線形回帰により決定される基質加水分解速度によりモニターされる。
本明細書において、ＦＶＩＩについての「固有活性」とは、組織因子の不在下でのＦＶＩＩタンパク質の触媒、タンパク質分解及び／又は凝固活性のことをいう。
本明細書において、ドメイン（典型的には、３つ以上、通常、５又は７つ以上のアミノ酸の配列）とは、タンパク質若しくはコード核酸などの分子の一部分であって、その分子の他の部分とは構造的及び／又は機能的に異なり、同定可能である一部分のことをいう。例えば、ドメインは、１つ以上の構造モチーフで構成されたタンパク質内の、独立して折り畳まれた構造を形成でき、及び／又はタンパク質分解活性などの機能的活性により認識されるポリペプチド鎖の一部分を含む。タンパク質は、１つ、又は１つ以上の異なるドメインを有し得る。例えば、ドメインは、プロテアーゼドメイン又はｇｌａドメインを定義するモチーフに対する相同性などの関連するファミリーメンバーに対するその配列の相同性により同定、定義又は区別できる。別の例では、ドメインは、タンパク質分解活性、又はＤＮＡ結合、リガンド結合などの生体分子と相互作用する能力、及び二量体形成などのその機能により区別できる。ドメインは、独立しているか、若しくは別の分子と融合したドメインが、例えばタンパク質分解活性若しくはリガンド結合などの活性を示し得るように、生物機能又は活性を独立して示し得る。ドメインは、アミノ酸の直鎖状配列又はアミノ酸の非直鎖状配列であり得る。多くのポリペプチドが、複数のドメインを含む。そのようなドメインは既知であり、当業者により同定され得る。本明細書では例示のために、定義が示されるが、特定のドメインが名称により認識されることは、当業者に周知であると理解される。必要であれば、適切なソフトウェアを用いて、ドメインを同定できる。
本明細書において、プロテアーゼドメインは、プロテアーゼの触媒活性部分である。プロテアーゼのプロテアーゼドメインへの言及は、任意のこれらのタンパク質の一本鎖、二本鎖及び複数鎖の形を含む。タンパク質のプロテアーゼドメインは、例えば触媒中心などのそのタンパク質分解活性に必要なそのタンパク質の必須の特性のすべてを有する。ＦＶＩＩに言及して、プロテアーゼドメインは、触媒三連構造を含むキモトリプシン／トリプシンファミリーのプロテアーゼドメインと、相同性及び構造の特性が共通する。例えば、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドでは、プロテアーゼドメインは、アミノ酸位置１５３〜３９２のアミノ酸に対応する。
本明細書において、ガンマ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）ドメインとは、タンパク質、例えば、ビタミンＫ依存性カルボキシル化によりＧｌａを形成する、グルタミン酸残基のすべてではないが通常、ほとんどのグルタミン酸残基の翻訳後修飾を含むビタミンＫ依存性タンパク質の部分のことをいう。Ｇｌａドメインは、カルシウムイオンの高親和性結合及び負に荷電したリン脂質への結合の原因である。典型的には、Ｇｌａドメインは、ビタミンＫ依存性タンパク質の成熟形のＮ末端の端から開始して、保存された芳香性残基で終了する。成熟ＦＶＩＩポリペプチドでは、Ｇｌａドメインは、配列番号３に示す例示的ポリペプチドのアミノ酸位置１〜４５のアミノ酸に対応する。Ｇｌａドメインは公知であり、それらの遺伝子座は、特定のポリペプチド内で同定できる。種々のビタミンＫ依存性タンパク質のＧｌａドメインは、細胞表面膜上の負に荷電したリン脂質との相互作用を媒介する疎水性パッチへのＮ末端疎水性残基のクラスタリングを含む、配列、構造及び機能的な相同性を共有する。例示的なその他のＧｌａ含有ポリペプチドは、それだけに限らないが、ＦＩＸ、ＦＸ、プロトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質、増殖停止特異的タンパク質６（Ｇａｓ６）及びプロテインＺを含む。これらの及びその他の例示的タンパク質のＧｌａドメインは、配列番号１１０〜１２１のいずれかに示す。
本明細書において、Ｇｌａドメインについて「天然」又は「内因性」とは、Ｇｌａドメインを有するポリペプチドの全部又は一部分に関連する天然に存在するＧｌａドメインのことをいう。本明細書での目的のために、天然Ｇｌａドメインは、ＦＶＩＩポリペプチドに関する。例えば、配列番号１１９に示すＦＶＩＩの天然Ｇｌａドメインは、配列番号３に示すアミノ酸配列のアミノ酸１〜４５に対応する。
本明細書において、異種Ｇｌａドメインとは、ＦＶＩＩ ＧＩａドメインでない、同じ又は異なる種からのポリペプチドからのＧｌａドメインのことをいう。例示的な異種Ｇｌａドメインは、それだけに限らないが、ＦＩＸ、ＦＸ、プロトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質、増殖停止特異的タンパク質６（Ｇａｓ６）及びプロテインＺを含むＧｌａ含有ポリペプチドからのＧｌａドメインである。これらの及びその他の例示的タンパク質のＧｌａドメインは、配列番号１１０〜１１８、１２０及び１２１のいずれかに示す。
本明細書において、Ｇｌａドメインの連続した部分とは、少なくとも２つ以上、又は典型的には２、３、４、５、６、８、１０、１５、２０、３０、４０以上であって、Ｇｌａドメインを構成するすべてのアミノ酸までの近接したアミノ酸のことをいう。
本明細書において、「リン脂質結合を行うのに十分なＧｌａドメインの部分」は、そのような部分を含むポリペプチドがリン脂質結合を示す限りは、ドメインの少なくとも１アミノ酸、典型的には２、３、４、５、６、８、１０、１５以上のアミノ酸であるが、ドメインを構成するすべてのアミノ酸より少ないアミノ酸を含む。
本明細書において、Ｇｌａドメインについての「交換」又は「Ｇｌａドメインスワップ」とは、それによりタンパク質の内因性Ｇｌａドメインが、組換え、合成又はその他の方法を用いて、別のタンパク質のＧｌａドメインと交換されるプロセスのことをいう。「Ｇｌａドメインスワップ」の文脈において、「Ｇｌａドメイン」は、リン脂質結合活性を保持するのに十分なＧｌａドメイン及び近接領域からのアミノ酸の任意の選択である。典型的には、Ｇｌａドメインスワップは、内因性タンパク質の４０〜５０アミノ酸と、別のタンパク質の４０〜５０アミノ酸との交換を含むが、より少ないか又はより多いアミノ酸を含み得る。
本明細書において、上皮増殖因子（ＥＧＦ）ドメイン（ＥＧＦ−１又はＥＧＦ−２）とは、上皮増殖因子（ＥＧＦ）配列の特定の３０〜４０アミノ酸部分との配列相同性を有するタンパク質の部分のことをいう。ＥＧＦドメインは、（ＥＧＦ中で）ジスルフィド結合に関与することが示されている６つのシステイン残基を含む。ＥＧＦドメインの主な構造は、Ｃ末端の短い二本鎖シートへのループが続く二本鎖ベータシートである。ＦＶＩＩは、２つのＥＧＦドメイン：ＥＧＦ−１及びＥＧＦ−２を有する。これらのドメインは、それぞれ、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドの位置４６〜８２、及び８７〜１２８のアミノ酸に対応する。
本明細書において、「非改変ポリペプチド」又は「非改変ＦＶＩＩ」及びそれらの文法上の変形とは、本明細書で行われる改変のために選択される出発ポリペプチドのことをいう。出発ポリペプチドは、ポリペプチドの天然に存在する野生型の形であり得る。さらに、出発ポリペプチドは、それが天然野生型アイソフォームとは異なるように変化又は突然変異させることができるが、それにもかかわらず、これは、本明細書において、本明細書で生成されるその後に改変されるポリペプチドに対する出発非改変ポリペプチドと呼ばれる。改変されて、非改変参照タンパク質と比較して特定の活性又は特性の所望の増大又は低下を有する、当技術分野において知られている既存タンパク質を、出発非改変ポリペプチドとして選択して用いることができる。例えば、その天然形から、１つ又は複数のアミノ酸残基におけるグリコシル化を変化させる変化などの１つ又は複数の単一アミノ酸変化により改変され、所望の特性の増大又は低下のいずれかを有するタンパク質は、本明細書において非改変と呼ばれる、同じ又は異なる特性のいずれかのさらなる改変のための標的タンパク質であり得る。当技術分野において知られる例示的な改変ＦＶＩＩポリペプチドは、例えば、米国特許第５５８０５６０号明細書、米国特許第６０１７８８２号明細書、米国特許第６６９３０７５号明細書、米国特許第６７６２２８６号明細書及び米国特許第６８０６０６３号明細書、米国特許出願公開第２００３０１００５０６号明細書及び米国特許出願公開第２００４０２２０１０６号明細書、並びに国際公開第１９８８０１０２９５号パンフレット、国際公開第２００１８３７２５号パンフレット、国際公開第２００３０９３４６５号パンフレット、国際公開第２００３３８１６２号パンフレット、国際公開第２００４０８３３６１号パンフレット、国際公開第２００４１０８７６３号パンフレット、国際公開第２００４０２９０９０号パンフレット、国際公開第２００４０２９０９１号パンフレット、国際公開第２００４１１１２４２号パンフレット、及び国際公開第２００５１２３９１６号パンフレットに記載される任意のＦＶＩＩポリペプチドを含む。
本明細書において、「改変第ＶＩＩ因子ポリペプチド」及び「改変第ＶＩＩ因子」とは、非改変第ＶＩＩ因子ポリペプチドと比較して、１つ又は複数のアミノ酸の差異を有するＦＶＩＩポリペプチドのことをいう。１つ又は複数のアミノ酸の差異は、１つ若しくは複数のアミノ酸の交換（置換）、挿入又は欠失などのアミノ酸の突然変異であり得るか、又はドメイン全体の挿入若しくは欠失、及びそれらの任意の組合せであり得る。典型的には、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、１次配列における１つ又は複数の改変を有する。例えば、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０以上のアミノ酸の差異を有し得る。得られるポリペプチドが、例えば触媒活性、タンパク質分解活性、ＴＦに結合する能力又は活性化血小板に結合する能力などの天然ＦＶＩＩポリペプチドと関連する少なくとも１つのＦＶＩＩ活性を示す限り、任意の改変が構想される。
本明細書において、「凝固阻害因子」とは、凝固又は凝血塊の形成を阻害又は妨害するために作用するタンパク質又は分子のことをいう。凝固の阻害又は妨害は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで観察でき、それだけに限らないが、プロトロンボプラスチン時間（ＰＴ）アッセイ又は活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）アッセイを含む、当技術分野において知られる任意の方法を用いてアッセイできる。
本明細書において、組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ、ＴＦＰＩ−１ともいう）は、ＦＶＩＩａの活性が阻害される四量体ＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＴＦＰＩ／ＦＸａ阻害複合体の形成に関係するクニッツ型阻害因子である。ＴＦＰＩは、選択的スプライシングの後に形成される２つの異なる前駆体の形であるＴＦＰＩα（配列番号１０１）及びＴＦＰＩβ（配列番号１０３）前駆体として発現され、これらは、分泌の間に切断されて、２７６アミノ酸（配列番号１０２）及び２２３アミノ酸（配列番号１０４）の成熟タンパク質をそれぞれ生じる。ＴＦＰＩは、３つのクニッツドメインを含有し、これらのうち、クニッツ−１ドメインは、ＦＶＩＩａの結合及び阻害の原因である。
本明細書において、ＴＦＰＩ−２（胎盤タンパク質５（ＰＰ５）及びマトリックス関連セリンプロテアーゼ阻害因子（ＭＳＰＩ）としても知られる）とは、ＴＦＰＩの同族体のことをいう。２１３アミノ酸の成熟ＴＦＰＩ−２タンパク質（配列番号１０５）は、ＴＦＰＩ−１のクニッツ型ドメイン１、２及び３とそれぞれ４３％、３５％及び５３％の１次配列同一性を示す３つのクニッツ型ドメインを含有する。ＴＦＰＩ−２は、細胞外基質消化及びリモデリングの制御において役割を演じ、凝固経路において重要な因子であるとは考えられない。
本明細書において、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）は、セリンプロテアーゼ阻害因子（セルピン）である。ＡＴ−ＩＩＩは、４６４アミノ酸残基を含有する前駆タンパク質（配列番号１２２）として合成され、これが分泌の間に切断されて、４３２アミノ酸の成熟アンチトロンビン（配列番号１２３）が放出される。
本明細書において、補因子とは、他の特定のタンパク質又は分子と結合して活性複合体を形成するタンパク質又は分子のことをいう。ある例では、補因子への結合は、最適タンパク質分解活性のために必要である。例えば、組織因子（ＴＦ）は、ＦＶＩＩａの補因子である。ＦＶＩＩａのＴＦへの結合は、高次構造変化を誘導し、これが、ＦＶＩＩａの、その基質であるＦＸ及びＦＩＸについてのタンパク質分解活性の増大をもたらす。
本明細書において、組織因子（ＴＦ）とは、ＦＶＩＩａの補因子として機能する２６３アミノ酸の膜貫通糖タンパク質（配列番号１２４）のことをいう。これは、平滑筋細胞及び繊維芽細胞により構成的に発現され、これらの細胞が、組織損傷の後に血流と接触すると、ＦＶＩＩ及びＦＶＩＩａと結合することにより、凝固を開始する助けとなる。
本明細書において、活性化血小板とは、コラーゲン、トロンボキサンＡ２、ＡＤＰ及びトロンビンなどの分子の結合により惹起されて形態、表現型及び機能の様々な変化を受けて、最終的に凝固を促進する血小板のことをいう。例えば、活性化血小板は、指状突起を有するより無定形の形状に変化する。活性化血小板は、細胞膜の内層に通常は存在するホスファチジルセリン及びその他の負に荷電したリン脂質が外側の血漿に指向する表面に転位するような、細胞膜の「反転」も受ける。活性化血小板のこれらの膜は、凝固カスケードの反応の多くが行われる表面を提供する。活性化血小板は、ｖＷＦ、ＦＶ、トロンビン、ＡＤＰ及びトロンボキサンＡ２などの凝固因子を含有する小胞も分泌し、互いに接着して、血小板血栓を形成し、これが、フィブリンにより安定化されて凝血塊になる。
本明細書において、活性化血小板についての結合及び／又は親和性の増大、並びにその文法上の任意の変形は、ポリペプチド又はタンパク質、例えばＦＶＩＩポリペプチドが、参照ポリペプチド又はタンパク質と比較して、活性化血小板の表面に結合する能力が増進されたことをいう。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドが活性化血小板に結合する能力は、非改変ＦＶＩＩポリペプチドが活性化血小板に結合する能力より大きいことが可能である。活性化血小板についてのポリペプチドの結合及び／又は親和性は、非改変ポリペプチドの結合及び／又は親和性に比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上増大できる。活性化血小板についてのポリペプチドの結合及び／又は親和性を決定するアッセイは、当技術分野において知られている。ＦＶＩＩポリペプチドの活性化血小板への結合は、ＦＶＩＩポリペプチドのＧｌａドメイン内のアミノ酸と、活性化血小板上のホスファチジルセリンなどの負に荷電したリン脂質との相互作用を介して媒介される。それ自体で、ＦＶＩＩポリペプチドなどのポリペプチドの活性化血小板への結合についてのアッセイの方法は、ホスファチジルセリンなどのリン脂質を含有する膜及び小胞を用いる。例えば、ポリペプチドが活性化血小板に結合する能力は、ポリペプチドがリン脂質小胞に結合する能力により反映され、これは、光散乱技術により測定できる。
本明細書において、リン脂質についての結合及び／又は親和性の増大、並びにその文法上の任意の変形は、参照ポリペプチド又はタンパク質と比較して、ポリペプチド又はタンパク質のリン脂質に結合する能力の増進をいう。リン脂質は、任意のリン脂質を含み得るが、特に、ホスファチジルセリンを含む。リン脂質についてのポリペプチドの結合及び／又は親和性は、非改変ポリペプチドの結合及び／又は親和性と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上増大できる。ポリペプチドのリン脂質への親和性及び／又は結合を決定するアッセイは、当技術分野において知られている。例えば、ＦＶＩＩポリペプチドのリン脂質小胞への結合は、入射光に対して９０°での相対光散乱により決定できる。リン脂質小胞単独及びＦＶＩＩを含むリン脂質小胞での光散乱強度を測定して、解離定数を決定する。ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサ装置などの表面プラズマ共鳴を用いて、リン脂質膜へのＦＶＩＩポリペプチドの親和性を測定することもできる。
本明細書において、阻害因子に対する抵抗性の増大又は「ＴＦＰＩに対する抵抗性の増大」又は「ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大」とは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドなどの参照ポリペプチドと比較した、ＴＦＰＩ又はＡＴ−ＩＩＩなどの阻害因子の阻害効果に対するポリペプチドの感受性の任意の量の低下のことをいう。例えば、ＦＸａと複合体を形成したＴＦＰＩは、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体に結合する。そのようにすることにより、これは、ＦＶＩＩａの活性を阻害する。つまり、ＴＦＰＩのＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体への結合を低減又は妨害し、それによりＴＦＰＩが媒介するＦＶＩＩａ活性の阻害を低減又は妨害する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＴＦＰＩに対して抵抗性の増大を示す。ＴＦＰＩなどの阻害因子に対する抵抗性の増大は、改変ＦＶＩＩポリペプチドの阻害因子への結合を評価することによりアッセイできる。ＴＦＰＩなどの阻害因子に対する抵抗性の増大は、ＴＦＰＩの存在下でのＦＶＩＩポリペプチドの固有活性又は凝固活性を測定することによってもアッセイできる。ＴＦＰＩ又はＡＴ−ＩＩＩなどの阻害因子へのポリペプチドの結合を決定するアッセイは、当技術分野において知られている。例えばＴＦＰＩなどの非共有結合性阻害因子について、ｋｉを測定できる。例えばＡＴ−ＩＩＩなどの共有結合性阻害因子については、阻害についての２次速度定数を測定できる。さらに、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサ装置などの表面プラズマ共鳴も、ＦＶＩＩポリペプチドの、ＴＦＰＩ、ＡＴ−ＩＩＩ又はその他の阻害因子への結合を測定するために用いることができる。しかし、ＡＴ−ＩＩＩなどの共有結合性阻害因子については、ＢＩＡｃｏｒｅを用いて、結合速度しか測定できない。例えば、ＦＶＩＩ凝固活性又は固有活性に対するＴＦＰＩの阻害効果を決定するアッセイも、当技術分野において知られている。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドがその基質ＦＸを、ＴＦＰＩの存否で切断する能力を測定でき、ＴＦＰＩが反応を阻害する程度を決定できる。これは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドが、その基質ＦＸを、ＴＦＰＩの存否で切断する能力と比較できる。阻害因子に対する抵抗性の増大を示す改変ポリペプチドは、例えば、非改変ポリペプチドと比較して、阻害因子の効果に対して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上の抵抗性の増大を示す。
本明細書において、「生物活性」とは、化合物のｉｎ ｖｉｖｏ活性又は化合物、組成物若しくはその他の混合物のｉｎ ｖｉｖｏ投与によりもたらされる生理的応答のことをいう。つまり、生物活性は、そのような化合物、組成物及び混合物の治療効果及び医薬活性を包含する。生物活性は、そのような活性を試験するか又は用いるために設計されたｉｎ ｖｉｔｒｏ系で観察できる。よって、本明細書での目的のために、ＦＶＩＩポリペプチドの生物活性は、凝固活性を包含する。
本明細書において、用語「評価する」及びその文法上の変形は、ポリペプチドの活性についての絶対値を得る意味、及び活性のレベルを示す指標、比、パーセンテージ、画像及びその他の値を得る意味での定量及び定性的決定を含むことを意図する。評価は、直接的又は間接的であり得る。例えば、ポリペプチドによる基質の切断の検出は、生成物の直接的な測定によるか、又は切断された基質によりもたらされる活性の決定による間接的な測定によることができる。
本明細書において、「キモトリプシン番号付け」とは、配列番号１０７の成熟キモトリプシンポリペプチドのアミノ酸番号付けのことをいう。例えば第ＶＩＩ因子のプロテアーゼドメインなどの別のプロテアーゼのプロテアーゼドメインのアラインメントは、キモトリプシンを用いて行うことができる。そのような場合、キモトリプシンのアミノ酸に対応する第ＶＩＩ因子のアミノ酸は、キモトリプシンアミノ酸の番号を付与される。対応する位置は、当業者が用いる手作業でのアラインメント、又は利用可能な多数のアラインメントプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰ）を用いることにより決定できる。対応する位置は、例えば、タンパク質構造のコンピュータシミュレーションされたアラインメントを用いることにより、構造アラインメントに基づくこともできる。ポリペプチドのアミノ酸が開示される配列内のアミノ酸に対応するという場合、ＧＡＰアルゴリズムなどの標準的なアラインメントアルゴリズムを用いて同一性又は相同性（保存アミノ酸が整列される）を最大限にする、そのポリペプチドと開示された配列とのアラインメント上で同定されたアミノ酸のことをいう。配列番号３に示すＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置１５３〜４０６の対応するキモトリプシン番号付けを、表１に示す。配列番号３に示す配列に対するアミノ酸の位置は通常のフォントであり、それらの位置のアミノ酸残基は太字であり、対応するキモトリプシン番号付けは斜体である。例えば、成熟第ＶＩＩ因子（配列番号３）の成熟キモトリプシン（配列番号１０７）とのアラインメントにより、第ＶＩＩ因子中のアミノ酸位置１５３でのイソロイシン（Ｉ）は、キモトリプシン番号付けＩ１６が与えられる。その後のアミノ酸は、それに応じて番号付けされる。ある例において、成熟第ＶＩＩ因子（配列番号３）のアミノ酸位置２１０でのグルタミン酸（Ｅ）は、キモトリプシン番号付けに基づいて、アミノ酸位置Ｅ７０に対応する。ある残基がプロテアーゼには存在するがキモトリプシンには存在しない場合、そのアミノ酸残基は、文字で表示される。例えば、キモトリプシン番号付けに基づいてアミノ酸６０を有するループの一部分であるが、キモトリプシンと比較して第ＶＩＩ因子配列に挿入されているキモトリプシンの残基は、例えばＫ６０ａ、Ｉ６０ｂ、Ｋ６０ｃ又はＮ６０ｄと呼ばれる。これらの残基は、成熟第ＶＩＩ因子配列（配列番号３）に関する番号付けにより、それぞれ、Ｋ１９７、Ｉ１９８、Ｋ１９９及びＮ２００に対応する。
Figure 2014042523
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本明細書において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を含むそれらの類似体並びにそれらの混合物を含む。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得る。蛍光又は放射性標識などの検出可能な標識などを用いて任意選択で標識されるプローブ又はプライマーについて言及する場合、一本鎖分子が構想される。そのような分子は、典型的には、プローブするか又はライブラリーをプライムするために、それらの標的が統計学的にユニークであるか又は低コピー数（典型的には５未満、通常、３未満）であるような長さである。通常、プローブ又はプライマーは、対象となる遺伝子と相補的又は同一である配列の少なくとも１４、１６又は３０の連続ヌクレオチドを含有する。プローブ及びプライマーは、１０、２０、３０、５０、１００以上の核酸長であり得る。
本明細書において、ペプチドとは、２〜４０アミノ酸長であるポリペプチドのことをいう。
本明細書において、本明細書で示される種々のアミノ酸配列内に存在するアミノ酸は、それらの既知の３文字又は１文字の省略形に従って同定される（表１）。種々の核酸断片内に存在するヌクレオチドは、当技術分野において通常用いられる標準的な１文字表記で示される。
本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基及びカルボン酸基を含有する有機化合物である。ポリペプチドは、２以上のアミノ酸を含有する。本明細書の目的のために、アミノ酸は、２０個の天然に存在するアミノ酸、非天然アミノ酸及びアミノ酸類似体（即ち、α炭素が側鎖を有するアミノ酸）を含む。
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４３：３５５２〜３５５９（１９６９）に記載され、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１〜１．８２２で採用される標準のポリペプチド命名法に調和して、アミノ酸残基の省略形を、表１に示す。
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本明細書において式により表されるすべてのアミノ酸残基配列は、左から右の方向に、アミノ末端からカルボキシル末端の通常の方向であることに注意すべきである。さらに、「アミノ酸残基」の句は、対応表（表２）に列挙するアミノ酸、並びに３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１〜１．８２２で言及され、本明細書に参照により組み込まれるものなどの修飾及び特殊アミノ酸を含むと広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始め又は最後のダッシュは、１つ又は複数のアミノ酸残基のさらなる配列、ＮＨ２などのアミノ末端基又はＣＯＯＨなどのカルボキシル末端基へのペプチド結合を示すことに注意すべきである。
本明細書において「疎水性アミノ酸」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ疎水性共通尺度を用いて疎水性であると決定されるアミノ酸のいずれか１つを含む。その例は、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、トリプトファン、メチオニン、アラニン、グリシン、システイン及びチロシンなどの天然に存在する疎水性アミノ酸である（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、（１９８２）Ｆａｒａｄａｙ Ｓｙｍｐ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１７：１０９〜１２０）。天然に存在しない疎水性アミノ酸も含まれる。
本明細書において、「酸性アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸のうちで、アスパラギン酸及びグルタミン酸残基を含む。天然に存在しない酸性アミノ酸も含まれる。
本明細書において、「天然に存在するアミノ酸」とは、ポリペプチドに存在する２０個のＬ−アミノ酸のことをいう。
本明細書において、「非天然アミノ酸」とは、表２に列挙する天然に存在するアミノ酸の１つでない、アミノ基及びカルボン酸基を含有する有機化合物のことをいう。天然に存在しないアミノ酸は、よって、例えば、２０個の天然に存在するアミノ酸以外のアミノ酸又はアミノ酸の類似体を含み、それだけに限らないが、アミノ酸のＤ立体異性体を含む。例示的な非天然アミノ酸は、当業者に知られ、改変第ＶＩＩ因子ポリペプチドに含まれ得る。
本明細書において、ＤＮＡ構築物は、天然で見出されない様式で組み合わされ配列されたＤＮＡのセグメントを含有する、一本鎖又は二本鎖で、直鎖状又は環状のＤＮＡ分子である。ＤＮＡ構築物は、人為的な操作の結果として存在し、クローン及び操作された分子のその他のコピーを含む。
本明細書において、ＤＮＡセグメントは、特定の属性を有するより大きいＤＮＡ分子の一部分である。例えば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、プラスミド又はプラスミド断片などのより長いＤＮＡ分子の一部分であり、これは、５’から３’方向に読んだときに、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする。
本明細書において、用語ポリヌクレオチドは、５’から３’末端に読まれる、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖の重合体を意味する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡを含み、天然供給源から単離されるか、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されるか、又は天然及び合成の分子の組合せから調製できる。ポリヌクレオチド分子の長さは、本明細書では、ヌクレオチド（「ｎｔ」と省略する）又は塩基対（「ｂｐ」と省略する）として示される。用語ヌクレオチドは、文脈が許容する場合、一本鎖及び二本鎖の分子について用いられる。この用語が二本鎖分子に適用される場合、全体の長さを示すように用いられ、用語塩基対と等しいと理解される。二本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖は、長さが少し異なることができ、その末端がずれることができ、よって、二本鎖ポリヌクレオチド分子中のすべてのヌクレオチドが対を形成できるわけではないことが当業者に認識される。そのような対を形成していない末端は、一般に、２０ヌクレオチド長を超えない。
本明細書において、「１次配列」とは、ポリペプチド中のアミノ酸残基の配列のことをいう。
本明細書において、２つのタンパク質又は核酸の間の「類似性」とは、タンパク質のアミノ酸の配列又は核酸のヌクレオチドの配列の間の関連性のことをいう。類似性は、残基の配列及びそこに含有される残基の同一性及び／又は相同性の程度に基づくことができる。タンパク質又は核酸の間の類似性の程度を評価する方法は、当業者に知られている。例えば、配列類似性を評価するある方法では、２つのアミノ酸又はヌクレオチドの配列を、配列間の同一性の最大限のレベルが得られるような様式で整列させる。「同一性」とは、アミノ酸又はヌクレオチドの配列が一定である程度のことをいう。アミノ酸配列、及びある程度はヌクレオチド配列のアラインメントは、アミノ酸（又はヌクレオチド）の保存的差異及び／又は頻出置換も考慮に入れることができる。保存的差異は、関連する残基の物理化学的特性が保存されるものである。アラインメントは、全体的（配列の全長にわたり、且つすべての残基を含む、比較される配列のアラインメント）又は局部的（最も類似する１つ又は複数の領域のみを含む配列の一部分のアラインメント）であり得る。
本明細書において、用語「相同性」及び「同一性」は、交換可能に用いられるが、タンパク質についての相同性は、保存アミノ酸変更を含み得る。一般に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列を、最高の順序の一致が得られるように整列させる（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；及びＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；Ｃａｒｉｌｌｏら（１９８８）ＳＩＡＭＪ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３を参照されたい）。
本明細書において、「配列同一性」とは、試験及び参照ポリペプチド又はポリヌクレオチド間の比較における同一アミノ酸（又はヌクレオチド塩基）の数のことをいう。相同ポリペプチドとは、同一又は相同なアミノ酸残基の予め決定された数のことをいう。相同性は、保存アミノ酸置換及び同一残基を含む。配列同一性は、それぞれの供給業者により確立されたデフォルトのギャップペナルティで用いられる標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムにより決定できる。相同核酸分子とは、同一又は相同ヌクレオチドの予め決定された数のことをいう。相同性は、コードされるアミノ酸を変更しない置換（即ち「サイレント置換」）及び同一残基を含む。実質的に相同な核酸分子は、典型的には、穏やかなストリンジェンシー又は高いストリンジェンシーにて、核酸の長さすべて、又は対象となる核酸分子の全長の少なくとも約７０％、８０％又は９０％でハイブリッド形成する。ハイブリッド形成する核酸分子内のコドンの代わりに縮重コドンを含有する核酸分子も構想される。（タンパク質の相同性を決定するために、保存アミノ酸及び同一アミノ酸を整列させ得る。この場合、同一性のパーセンテージ及びパーセンテージ相同性は変動する。）任意の２つの核酸分子（又は任意の２つのポリペプチド）が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が「同一」であるヌクレオチド配列（又はアミノ酸配列）を有するかは、例えばＰｅａｒｓｏｎらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）でのようなデフォルトパラメータを用いる「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定できる（その他のプログラムは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９４）及びＣａｒｉｌｌｏらＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８）を含む）。例えば、国立バイオテクノロジー情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ機能を用いて、同一性を決定できる。その他の商業的に又は公共で利用可能なプログラムは、ＤＮＡＳｔａｒ「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）及びウィスコンシン大学遺伝コンピュータグループ（ＵＷＧ）「Ｇａｐ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を含む。タンパク質及び／又は核酸分子のパーセント相同性又は同一性は、例えば、ＧＡＰコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定できる（例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）により改定されたようにＮｅｅｄｌｅｍａｎらＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０））。簡単に、ＧＡＰプログラムは、類似性を、２つの配列のより短いところの記号（即ちヌクレオチド又はアミノ酸）の合計数で除した、類似する整列された記号の数として定義する。ＧＡＰプログラムのデフォルトパラメータは：（１）Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ編、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、３５３〜３５８頁（１９７９）により記載されるような、単項比較行列（同一には１の値を、そして非同一には０を含有する）及びＧｒｉｂｓｋｏｖらＮｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５（１９８６）の重みつき比較行列；（２）それぞれのギャップについて３．０のペナルティ及びそれぞれのギャップ中のそれぞれの記号についてさらに０．１０のペナルティ；並びに（３）末端ギャップについてはペナルティなしを含み得る。
よって、本明細書において、用語「同一性」は、試験及び参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドの間の比較を表す。ある限定しない例において、「少なくとも９０％同一」とは、参照ポリペプチドに対して９０〜１００％のパーセント同一性のことをいう。９０％以上のレベルの同一性は、例示の目的で、１００アミノ酸長の試験及び参照ポリヌクレオチドを比較すると仮定して、試験ポリペプチド中のアミノ酸の１０％以下（即ち、１００のうち１０）が参照ポリペプチドのものと異なることを示す。同様の比較を、試験及び参照ポリヌクレオチドの間で行うことができる。そのような差異は、アミノ酸配列の全長にわたって無作為に分布する点突然変異として表すことができるか、又は許容される最大値、例えば１０／１００アミノ酸相違（およそ９０％同一性）までの変動する長さの１つ又は複数の位置にまとめることができる。差異は、核酸又はアミノ酸の置換、挿入又は欠失として定義される。約８５〜９０％を超える相同性又は同一性のレベルでは、結果は、プログラム及びギャップパラメータ設定に依存しないはずである。そのような高レベルの同一性は、しばしば、ソフトウェアに依存せずに容易に評価できる。
本明細書において、用語「実質的に同一」又は「同様」は、当業者により理解されるように、文脈により変動するが、当業者はそのようなことを評価できることも理解される。
本明細書において、整列された配列とは、ヌクレオチド又はアミノ酸の配列における対応する位置を整列させる相同性（類似性及び／又は同一性）の使用のことをいう。典型的には、５０％以上の同一性により関連する２つ以上の配列が、整列される。整列された配列の組とは、対応する位置で整列され、ゲノムＤＮＡ配列と整列させた、ＥＳＴなどのＲＮＡ及びその他のｃＤＮＡに由来する整列配列を含み得る２つ以上の配列のことをいう。
本明細書において、「特異的にハイブリッド形成する」とは、相補的塩基対形成による、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）の、標的核酸分子へのアニーリングのことをいう。当業者には、具体的な分子の長さ及び組成などの、特異的ハイブリッド形成に影響を及ぼすｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのパラメータはよく知られている。ｉｎ ｖｉｔｒｏハイブリッド形成に特に関連するパラメータは、アニーリング及び洗浄温度、緩衝液組成及び塩濃度をさらに含む。非特異的に結合した核酸分子を除去するための例示的な洗浄条件は、高いストリンジェンシーでは０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃であり、穏やかなストリンジェンシーでは０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃である。等価なストリンジェンシー条件は、当技術分野において知られている。当業者は、これらのパラメータを容易に調整して、具体的な適用のために適切な、標的核酸分子への核酸分子の特異的ハイブリッド形成を達成できる。
本明細書において、単離若しくは精製ポリペプチド又はタンパク質或いはそれらの生物活性部分は、細胞性物質又はそのタンパク質が由来する組織の細胞からのその他の混入タンパク質を実質的に含まず、又は化学合成された場合は、化学前駆体又はその他の化学物質を実質的に含まない。調製物は、そのような純度を評価するために当業者により用いられる薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動及び高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの標準的な分析方法により決定される容易に検出可能な不純物を含まないようであるか、又はさらなる精製が、タンパク質分解活性及び生物活性などの物質の物理的及び化学的特性を、検出可能に変化させないほど十分に純粋である場合に、実質的に含まないと決定できる。化合物を精製して、実質的に化学的に純粋な化合物を生成する方法は、当業者に知られている。実質的に化学的に純粋な化合物は、しかし、立体異性体の混合物であり得る。そのような場合、さらなる精製は、化合物の比活性を増大させ得る。
細胞性物質を実質的に含まないという用語は、タンパク質が単離されたか又は組換え生成された細胞の細胞性成分からタンパク質が分離されたタンパク質の調製物を含む。ある実施形態では、細胞性物質を実質的に含まないという用語は、約３０％未満（乾燥重量）の非プロテアーゼタンパク質（本明細書では混入タンパク質とも呼ばれる）、一般に、約２０％未満の非プロテアーゼタンパク質、又は１０％の非プロテアーゼタンパク質、又は約５％未満の非プロテアーゼタンパク質を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。プロテアーゼタンパク質又はその活性部分が組換え生成される場合、これも、培養培地を実質的に含まず、即ち、培養培地が、プロテアーゼタンパク質調製物の容量の約２０％、１０％又は５％以下である。
本明細書において、化学前駆体又はその他の化学物質を実質的に含まないという用語は、タンパク質の合成に関わる化学前駆体又はその他の化学物質からタンパク質が分離されたプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。この用語は、約３０％（乾燥重量）、２０％、１０％、５％以下の化学前駆体又は非プロテアーゼ化学物質若しくは成分を有するプロテアーゼタンパク質の調製物を含む。
本明細書において、組換えＤＮＡ法を用いる組換え法による生成とは、クローニングされたＤＮＡによりコードされるタンパク質を発現するための分子生物学の公知の方法の使用のことをいう。
本明細書において、ベクター（又はプラスミド）とは、異種核酸を細胞に、その発現又は複製のいずれかのために導入するために用いられる別個の要素のことをいう。ベクターは、典型的にはエピソームのままであるが、ゲノムの染色体に遺伝子又はその一部分を組み込むように設計できる。細菌人工染色体、酵母人工染色体及び哺乳動物人工染色体などの人工染色体であるベクターも構想される。そのような媒体の選択及び使用は、当業者に公知である。
本明細書において、発現とは、それにより核酸がｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に翻訳されるプロセスのことをいう。核酸がゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、適切な真核宿主細胞又は生物が選択されるならば、ｍＲＮＡのスプライシングなどのプロセシングを含み得る。
本明細書において、発現ベクターは、ＤＮＡ断片の発現を行うことができるプロモーター領域などの制御配列に作動的に連結したＤＮＡを発現できるベクターを含む。そのような付加的なセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列を含むことができ、１つ又は複数の複製起点、１つ又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを任意選択で含み得る。発現ベクターは、通常、プラスミド又はウイルスＤＮＡに由来するか、又は両方の要素を含有し得る。つまり、発現ベクターとは、プラスミド、ファージ、組換えウイルス又は適切な宿主細胞への導入により、クローニングされたＤＮＡの発現をもたらすその他のベクターなどの組換えＤＮＡ又はＲＮＡ構築物のことをいう。適切な発現ベクターは、当業者に公知であり、真核細胞及び／又は原核細胞で複製可能なもの、並びにエピソームのままであるか又は宿主細胞ゲノムに組み込まれるものを含む。
本明細書において、ベクターは、「ウイルスベクター」又は「ウイルス性ベクター」も含む。ウイルス性ベクターは、外因性遺伝子に作動的に連結されて、細胞に外因性遺伝子を運ぶ（媒体又はシャトルとして）工学的に改変されたウイルスである。
本明細書において、アデノウイルスとは、ヒトにおいて結膜炎及び上気道感染症を引き起こすＤＮＡ含有ウイルスの任意の群のことをいう。
本明細書において、裸のＤＮＡとは、ワクチン及び遺伝子療法に用い得るヒストンを含まないＤＮＡのことをいう。裸のＤＮＡは、形質転換又はトランスフェクションと呼ばれる遺伝子移動プロセスの間に細胞から細胞に移動する遺伝性物質である。形質転換又はトランスフェクションでは、受容者の細胞に取り込まれた精製又は裸のＤＮＡは、受容者の細胞に、新しい特徴又は表現型を与える。
本明細書において、ＤＮＡセグメントに言及する場合の作動的に又は作動的に連結されたとは、そのセグメントが、それらの意図する目的のために協力して機能する、例えば、転写がプロモーターで開始し、コードセグメントからターミネーターまで進行するようにセグメントが配置されることを意味する。
本明細書において、タンパク質の活性、又は遺伝子若しくは核酸の発現を調節する因子は、タンパク質の活性を低下若しくは増大するか、又はそうでなければ変化させるか、或いはある様式で細胞での核酸の発現を上方調節若しくは下方調節するか又はそうでなければ変化させる。
本明細書において、「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」とは、異なるポリペプチドに作動的に連結したポリペプチドのことをいう。本明細書で与えられるキメラ又は融合タンパク質は、１若しくは複数のＦＶＩＩポリペプチド、又はその一部分と、転写／翻訳調節シグナル、シグナル配列、局在化タグ、精製タグ、免疫グロブリンＧのドメインの一部分、及び／又はターゲティング因子の任意の１若しくは複数のための１つ又は複数のその他のポリペプチドとを含み得る。キメラＦＶＩＩポリペプチドは、別のポリペプチドと交換されたポリペプチドの内因性ドメイン又は領域を有するものも含む。これらのキメラ又は融合タンパク質は、融合タンパク質として組換え法により作製されたもの、例えばスルフヒドリル基への結合を介する化学結合などの化学法により作製されたもの、及びそれにより少なくとも１つのポリペプチド（即ちＦＶＩＩ）又はその一部分が直接若しくはリンカー（複数可）を介して間接的に別のポリペプチドに連結される任意の他の方法により作製されたものを含む。
本明細書において、融合タンパク質に言及する場合の作動的に連結したとは、互いにインフレームで融合したプロテアーゼポリペプチドと非プロテアーゼポリペプチドのことをいう。非プロテアーゼポリペプチドは、プロテアーゼポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合できる。
本明細書において、ターゲティング因子は、結合したコンジュゲート又はその一部分を内在化できる場合がある細胞表面受容体などの細胞表面分子への特異的結合を提供するタンパク質又はその有効部分などの任意の物質である。ターゲティング因子は、例えば、コンジュゲートの親和性による単離又は精製；コンジュゲートの表面への結合；又はコンジュゲート若しくはコンジュゲートを含有する複合体の検出を促進するか、又は容易にするものでもあり得る。
本明細書において、分子の誘導体又は類似体とは、その分子に由来する部分又は分子の改変されたバージョンのことをいう。
本明細書において、「疾患又は障害」とは、それだけに限らないが、感染、後天性状態、遺伝状態、及び同定可能な症状により特徴付けられるものを含む原因又は状態に起因する、生物での病的状態のことをいう。本明細書において対象となる疾患及び障害は、凝固タンパク質により媒介されるもの、及び凝固タンパク質が病因論及び病理学において役割を演じるものを含む、凝固に関するものである。疾患及び障害は、血友病などにおけるタンパク質の不在により引き起こされるものを含み、本明細書において特に対象となるのは、凝固タンパク質の欠陥の欠損のために凝固が発生しない障害である。
本明細書において、「凝固促進物質」とは、血液凝固を促進する任意の物質のことをいう。
本明細書において、「抗凝固物質」とは、血液凝固を阻害する任意の物質のことをいう。
本明細書において、「血友病」とは、血液凝血因子の欠損により引き起こされる出血障害のことをいう。血友病は、例えば、凝血因子の不在、発現の低減又は機能の低減を原因とし得る。血友病の最も一般的な型は、第ＶＩＩＩ因子の欠損に起因する血友病Ａである。血友病の２番目に最も一般的な型は、第ＩＸ因子の欠損に起因する血友病Ｂである。ＦＸＩ欠損症とも呼ばれる血友病Ｃは、より穏やかで一般性がより低い形態の血友病である。
本明細書において、「先天性血友病」とは、遺伝する血友病の型のことをいう。先天性血友病は、凝血因子の生成がない、低減する又は非機能的である凝血因子遺伝子の突然変異、欠失、挿入又はその他の改変に起因する。例えば、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子などの凝血因子遺伝子の遺伝的な突然変異は、それぞれ、先天性血友病である血友病Ａ及びＢをもたらす。
本明細書において、「後天性血友病」とは、ＦＶＩＩＩを不活性化する自己抗体の生成から成人期に発生する血友病の型のことをいう。
本明細書において、「出血障害」とは、対象の、出血を調節する能力が低下した状態のことをいう。出血障害は、遺伝的又は後天性であり得、例えば、凝固経路の欠陥若しくは欠損、血小板活性の欠陥若しくは欠損、又は血管の欠陥に起因し得る。
本明細書において、「後天性出血障害」とは、肝臓疾患、ビタミンＫ欠損症などの状態、又はクマジン（ワルファリン）若しくはその他の抗凝固物質療法により引き起こされる凝固欠損症に起因する出血障害のことをいう。
本明細書において、疾患又は障害を有する対象を「治療する」とは、本明細書で提供されるポリペプチド、組成物又はその他の生成物を、対象に投与することを意味する。
本明細書において、治療剤、治療レジメン、放射線防護剤又は化学療法剤は、当業者に知られる、ワクチンを含む通常の薬剤及び薬剤療法を意味する。放射線療法剤は、当技術分野において公知である。
本明細書において、治療は、状態、障害又は疾患の症状が緩和又はそうでなければ有益に変化される任意の方法を意味する。よって、治療は、予防、療法及び／又は治癒を包含する。治療は、本明細書における組成物の任意の医薬的な使用も包含する。治療は、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩ及び組成物の任意の医薬的な使用も包含する。
本明細書において、医薬組成物又はその他の治療剤の投与などによる治療による特定の疾患又は障害の症状の緩和とは、その組成物又は治療剤の投与に起因するか又は伴い得る、症状の永遠又は一時的、永続的又は一過的な任意の低下のことをいう。
本明細書において、防止又は予防とは、疾患又は状態の発生の危険性が低減される方法のことをいう。予防は、疾患若しくは状態の発生の危険性の低減、及び／又は症状の悪化又は疾患の進行の防止、又は症状の悪化若しくは疾患の進行の危険性の低減を含む。
本明細書において、特定の疾患を治療するための化合物又は組成物の有効量は、その疾患に伴う症状を緩和、又はある程度低減するのに十分な量である。そのような量は、１回投与量として投与できるか、又は有効であるレジメンに従って投与できる。量は、疾患を治癒できるが、典型的には、疾患の症状を緩和するために投与される。典型的には、症状の所望の緩和を達成するために、反復投与が必要である。
本明細書において、「治療有効量」又は「治療有効用量」とは、治療効果を生成するのに少なくとも十分な化合物を含有する剤、化合物、物質又は組成物のことをいう。有効量は、疾患又は障害の症状を防止、治癒、緩和、停止又は部分的に停止するのに必要な治療剤の量である。
本明細書において、治療される「患者」又は「対象」は、ヒト及び／又は哺乳動物を含む非ヒト動物を含む。哺乳動物は、ヒト、チンパンジー、ゴリラ及びサルなどの霊長類；イヌ、ウマ、ネコ、ブタ、ヤギ、ウシなどの家畜動物；及びマウス、ラット、ハムスター及びアレチネズミなどのげっ歯類を含む。
本明細書において、組合せは、２つ以上の項目の任意の連合のことをいう。連合は、空間的であり得るか、又は共通の目的のための２つ以上の項目の使用のことであり得る。
本明細書において、組成物は、２つ以上の生成物又は化合物（例えば剤、修飾因子、制御因子など）の任意の混合物のことをいう。これは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性若しくは非水性の製剤又は任意のこれらの組合せであり得る。
本明細書において、「製品」は、製造され販売される生成物である。本出願全体では、この用語は、包装中の物体に含有される改変プロテアーゼポリペプチド及び核酸を包含することを意図する。
本明細書において、流体は、流動できる任意の組成物のことをいう。よって、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームの形態である組成物及びその他のそのような組成物を包含する。
本明細書において、「キット」とは、組合せの構成要素を用いて方法を行うための試薬及びその他の生成物及び／又は成分を任意選択で含む、包装された組合せのことをいう。例えば、本明細書で提供される改変プロテアーゼポリペプチド又は核酸分子、及びそれだけに限らないが、投与、診断及び生物活性又は特性の評価を含む目的のための別の品目を含有するキットが提供される。キットは、使用説明書を任意選択で含む。
本明細書において、抗体は、軽鎖及び重鎖の可変領域で構成されるＦａｂ断片などの抗体断片を含む。
本明細書において、受容体とは、特定のリガンドに対する親和性を有する分子のことをいう。受容体は、天然に存在するか又は合成の分子であり得る。受容体は、当技術分野において、抗リガンドとも呼ぶことができる。
本明細書において、動物は、それだけに限らないが、ヒト、ゴリラ及びサルを含む霊長類；マウス及びラットなどのげっ歯類；ニワトリなどの家禽；ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジなどの反芻動物；ブタなどのヒツジ及びその他の動物などの任意の動物を含む。非ヒト動物は、構想される動物としてヒトを除く。本明細書で提供されるプロテアーゼは、任意の起源、動物、植物、原核生物及び菌類からである。
本明細書において、遺伝子療法は、ＤＮＡなどの異種核酸の、治療しようとする障害又は状態を有する哺乳動物、特にヒトの特定の細胞、標的細胞への移動を伴う。ＤＮＡなどの核酸は、ＤＮＡなどの異種核酸が発現し、それによりコードされる治療用生成物が生成されるような様式で、直接又はベクター若しくはその他の送達媒体内でなどで、選択された標的細胞に導入される。或いは、ＤＮＡなどの異種核酸は、治療用生成物をコードするＤＮＡの発現をある程度媒介できるか、又は治療用生成物の発現を直接若しくは間接的にある程度媒介するペプチド又はＲＮＡなどの生成物をコードできる。遺伝子療法を、欠陥遺伝子を交換するか、又は遺伝子生成物が導入される哺乳動物若しくは細胞により生成される遺伝子生成物を補う遺伝子生成物をコードする核酸を送達するために用いることもできる。導入される核酸は、哺乳動物宿主により通常は生成されないか、又は治療有効量で若しくは治療上有用な時間に生成されないプロテアーゼ又は改変プロテアーゼなどの治療用化合物をコードできる。治療用生成物をコードするＤＮＡなどの異種核酸は、苦しんでいる宿主の細胞に導入する前に、生成物若しくはその発現を増進又はそうでなければ変化させるために、改変できる。遺伝子治療は、遺伝子発現の阻害因子又は抑制因子又はその他の修飾因子の送達も伴い得る。
本明細書において、異種核酸は、それが発現される細胞によりｉｎ ｖｉｖｏで通常生成されないか、又は細胞により生成されるが異なる遺伝子座で若しくは異なって発現されるか、又はＤＮＡなどの内因性核酸の発現を、転写、翻訳若しくはその他の制御可能な生化学的プロセスに影響を及ぼすことにより変化させることを仲介する若しくは、その様なメディエータをコードする核酸である。異種核酸は、それが導入される細胞内で通常、内因性でないが、別の細胞から得られたか又は合成的に調製された。異種核酸は、内因性であり得るが、異なる遺伝子座から発現されるか又はその発現が変化される核酸である。一般に、必要でないが、そのような核酸は、細胞により通常生成されないか、又はそれが発現される細胞内とは同様に生成されないＲＮＡ及びタンパク質をコードする。ＤＮＡなどの異種核酸は、ＤＮＡなどの外来核酸ということができる。つまり、異種核酸又は外来核酸は、ＤＮＡなどの対応する核酸分子がゲノム内で見出されるのとまったく同じ向き又は位置に存在しない核酸分子を含む。これは、他の生物又は種（即ち外因性）からの核酸分子のことでもあり得る。
核酸が発現される細胞にとって異種又は外来であると当業者が認識又は見なすＤＮＡなどの任意の核酸は、本明細書において、異種核酸に包含される。異種核酸は、内因的に発現されもする外因的に加えられた核酸も含む。異種核酸の例は、それだけに限らないが、薬剤耐性を与えるタンパク質などの追跡可能なマーカータンパク質をコードする核酸、抗癌剤、酵素及びホルモンなどの治療有効物質をコードする核酸、並びに抗体などの他の型のタンパク質をコードするＤＮＡなどの核酸を含む。異種核酸によりコードされる抗体は、異種核酸が導入された細胞の表面上で分泌又は発現される。
本明細書において、遺伝子療法についての治療有効生成物は、宿主への核酸の導入により、症状、遺伝的若しくは後天性の疾患の発現を緩和又は除去するか、或いは疾患を治癒する生成物が発現される、異種核酸、典型的にはＤＮＡによりコードされる生成物である。ＲＮＡｉ及びアンチセンスなどの生物活性核酸分子も含まれる。
本明細書において、ポリペプチドが、言及されたアミノ酸配列「から本質的になる」との記載は、全長ポリペプチドの記載された部分、又はその断片だけが存在することを意味する。ポリペプチドは、別の供給源からのさらなるアミノ酸を任意選択で含むことができ、一般にそれを含み、又は別のポリペプチドに挿入できる。
本明細書において、単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈から別段に明記されていない限り、複数への言及を含む。つまり、例えば、「細胞外ドメイン」を含む化合物への言及は、１つ又は複数の細胞外ドメインを有する化合物を含む。
本明細書において、範囲及び量は、「およそ」の特定の値又は範囲として表すことができる。「約」は、厳密な量も含む。よって、「約５塩基」とは、「約５塩基」と「５塩基」も意味する。
本明細書において、「任意選択の」又は「任意選択で」は、その後に記載される事象又は状況が、発生するか又は発生せず、その記載が、その事象又は状況が発生する場合と、発生しない場合とを含むことを意味する。例えば、任意選択で置換された基は、非置換又は置換された基を意味する。
本明細書において、任意の保護基、アミノ酸及びその他の化合物の省略形は、別段に記載しない限り、それらの通常の使用、認識された省略形又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（（１９７２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：１７２６を参照されたい）に従う。
Ｂ．止血の概要
本明細書において、改変第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチドが提供される。そのようなＦＶＩＩポリペプチドは、凝固活性が増大するように設計される。よって、これらのポリペプチドは、例えば、止血及びその他の関連する生物学的プロセスを調節するための治療剤としての種々の使用及び適用を有する。本明細書で提供される改変及びそのような改変ＦＶＩＩ分子の使用を認識するために、止血システム及び血液凝固カスケードを理解することが有利である。以下の記載は、そのような背景、第ＶＩＩ因子及びその改変の論述についての序文を提供する。
止血は、脈管構造の損傷に起因する出血を止める生理的機構である。通常の止血は、細胞性成分及び可溶性血漿タンパク質に依存し、最終的に血液の凝血塊の形成を導く一連のシグナル伝達事象を伴う。凝固は、血管への損傷が発生し、内皮細胞が損傷を受けた後に速やかに開始される。凝固の最初の段階において、血小板が活性化されて、損傷部位で止血血栓を形成する。タンパク質分解カスケードにおいて作用して、血小板血栓を強化するフィブリン鎖の形成をもたらす血漿凝固因子を伴う２次止血が続く。
血管損傷により、その損傷領域への血液の流れは、血管収縮により制限され、内皮下結合組織上の新しく曝露されたフィブリル状コラーゲンへの血小板の接着を可能にする。この接着は、損傷から３秒以内に内皮に結合し、そのことにより血小板の接着及び凝集を容易にするフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）に依存する。凝集血小板の活性化は、ＡＤＰ、ＡＴＰ、トロンボキサン及びセロトニンを含む種々の因子の分泌をもたらす。接着分子、フィブリノゲン、ｖＷＦ、トロンボスポンジン及びフィブロネクチンも放出される。そのような分泌により、血小板のさらなる接着及び凝集、血小板の活性化及び血管収縮の増大、及び血液凝固酵素複合体の組み立てのためのプラットホームとなる血小板上面上での陰イオン性リン脂質の曝露が促進される。血小板は、形状を変えて仮足の形成を導き、これが、他の血小板への凝集を促進し、ゆるい血小板血栓をもたらす。
ペプチダーゼの凝血カスケード（凝固カスケード）は、同時に開始される。凝固カスケードは、タンパク質分解切断を伴う一連の活性化事象を伴う。そのようなカスケードにおいて、セリンプロテアーゼの不活性タンパク質（酵素原とも呼ばれる）は、１つ又は複数のペプチド結合の切断により活性プロテアーゼに変換され、これが、次いで、カスケード内の次の酵素原分子のための活性化プロテアーゼとして働き、最後には、フィブリンの架橋による凝血塊形成をもたらす。例えば、カスケードは、血小板をさらに活性化するトロンビンなどの活性化された分子を生じ（プロトロンビンの切断のため）、これがさらに血小板を活性化し、フィブリノゲンの切断からフィブリンも生じる。次いで、フィブリンは、血小板血栓の周囲に架橋重合体を形成して、凝血塊を安定化する。損傷の修復により、フィブリンは、その主要構成要素がプラスミノゲン及び組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）であるフィブリン溶解システムにより消化される。これらのタンパク質は共に、フィブリンの重合に組み込まれ、そこでそれらは相互作用してプラスミンを形成し、これが、次いで、フィブリンに作用して予め形成された凝血塊を溶解する。凝血塊形成の間に、凝固因子阻害因子は、また、血液中を循環して、損傷部位を超えて凝血塊が形成されることを防止する。
損傷から凝血塊形成及びその後のフィブリン溶解までのシステムの相互作用を、以下に記載する。
１．血小板接着及び凝集
血液の凝血は、通常の条件下では能動的に回避されている。血管内皮は、血管拡張を支持し、血小板接着及び活性化を阻害し、凝固を抑制し、フィブリン切断を増進し、抗炎症性の性質である。血管内皮細胞は、血小板凝集を阻害して血管を広げる亜酸化窒素（ＮＯ）及びプロスタサイクリンなどの分子を分泌する。これらの分子の放出により、可溶性グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）及びｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼＩ（ｃＧＫＩ）が活性化され、環状グアノシン１リン酸（ｃＧＭＰ）レベルが増大し、このことが、血管壁内の平滑筋の弛緩を引き起こす。さらに、内皮細胞は、ＣＤ３９などの細胞表面ＡＤＰアーゼを発現し、これが、血小板から放出されたＡＤＰをアデニンヌクレオチド血小板阻害因子に変換することにより血小板の活性化及び凝集を調節する。内皮は、フィブリン溶解カスケードにおける酵素の制御においても重要な役割を演じる。内皮細胞は、プラスミノゲン（アネキシンＩＩ）及びウロキナーゼの受容体の発現、並びに組織型プラスミノゲン活性化因子及びウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子の分泌（これらはすべて凝血塊の除去を促進する）によりプラスミンの生成を直接促進する。血栓形成促進性の制御の最終相において、内皮細胞は、トロンビン及びその他の凝固因子のアンチトロンビンＩＩＩ阻害の速度論を増大するヘパラン硫酸の生成により、凝固カスケードの阻害において能動的な役割を演じる。
急性血管外傷の下では、しかし、血管収縮機構が優勢であり、内皮は血栓形成促進性、凝固促進性及び炎症促進性の性質になる。これは、内皮拡張因子であるアデノシン、ＮＯ及びプロスタサイクリンの低減、及び血管平滑筋細胞の収縮を惹起するＡＤＰ、セロトニン及びトロンボキサンの血管平滑筋細胞への直接の作用（Ｂｅｃｋｅｒ，Ｈｅｉｎｄｌら２０００）により達成される。止血性の血栓の形成を導く内皮機能の変化のための主要なトリガーは、血液と細胞外基質（ＥＣＭ）成分との間の内皮細胞バリアの喪失である（Ｒｕｇｇｅｒｉ（２００２）Ｎａｔ Ｍｅｄ ８：１２２７〜１２３４）。循環している血小板は、内皮損傷領域を同定して区別し、曝露された内皮下に接着する。種々の血栓形成性基質及び局部で生成されたか又は放出された作用物質とのそれらの相互作用は、血小板の活性化をもたらす。このプロセスは、２つの段階、１）接着：表面への最初の固定化及び２）凝集：血小板−血小板密着を有すると記載されている（Ｓａｖａｇｅら（２００１）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ８：２７０〜２７６）。
血小板接着は、循環している血小板が、細胞表面のコラーゲン結合タンパク質との相互作用、及びこれもまた内皮上に存在するｖＷＦとの相互作用により、曝露されたコラーゲンに結合したときに開始される。ｖＷＦタンパク質は、種々のサイズの多量体構造であり、内皮により２方向、即ち側底及び血流中に分泌される。ｖＷＦは、第ＶＩＩＩ因子にも結合し、これは、第ＶＩＩＩ因子の安定化及び循環内でのその生存に重要である。
血小板の接着及びその後の活性化は、ｖＷＦがそのＡ１ドメインを介してＧＰＩｂ（血小板糖タンパク質受容体複合体ＧＰＩｂ−ＩＸ−Ｖの一部分）に結合するときに達成される。ｖＷＦとＧＰＩｂの間の相互作用は、せん断応力の増加がＧＰＩｂへのｖＷＦの親和性の対応する増加をもたらすようなせん断力により制御される。白血球上のＶＬＡ−２としても知られるインテグリンα１β２は、血小板上の主要コラーゲン受容体であり、この受容体を介する結合は、血小板の活性化に貢献する細胞内シグナルを生じる。α１β２を介する結合は、より低い親和性のコラーゲン受容体ＧＰ ＶＩの結合を容易にする。これは、免疫グロブリンスーパーファミリーの部分であり、血小板活性化についての最も効力のある細胞内シグナルを生じる受容体である。血小板活性化は、アデノシン２リン酸（ＡＤＰ）の放出をもたらし、これがトロンボキサンＡ２に変換される。
血小板活性化は、血小板糖タンパク質ＩＩｂ−ＩＩＩａ（ＧＰ ＩＩｂ−ＩＩＩａ）受容体の表面発現をもたらし、ＧＰ ＩＩｂ−ＩＩＩａ受容体は、血小板をそれらの受容体により連結させるフィブリノゲン分子により、血小板の互いの接着（即ち凝集）を可能にする。このことにより、損傷の部位での血小板血栓の形成がもたらされて、さらなる血液の損失が防止されるが、損傷を受けた血管組織は、凝固カスケード及び血小板血栓の周囲に安定化フィブリンメッシュの形成を開始する因子を放出する。
２．凝固カスケード
凝固経路は、それぞれの酵素が血漿中に酵素原又は不活性形として存在するタンパク質分解経路である。酵素原の切断は、前駆分子から活性形を放出するように制御される。糖タンパク質ＦＶＩＩＩ及びＦＶなどの活性化されたプロテアーゼの補因子も、カスケード反応において活性化され、凝血塊形成において役割を演じる。経路は、活性化プロセスを調節する一連の正及び負のフィードバックループとして機能し、最終ゴールはトロンビンの生成であり、これは、次いで、可溶性フィブリノゲンをフィブリンに変換して凝血塊を形成できる。凝固における因子は、典型的に、活性化された形を示す小文字の「ａ」が添えられたローマ数字で示される。以下の表３は、因子の一般名、及び凝固カスケードにおけるそれらの役割を含む、因子の例示的なリストを示す。一般に、これらのタンパク質は、凝固の内因性、外因性又は共通する経路の１つ又は複数により血液凝固に関与する（図１を参照されたい）。以下に論述するように、これらの経路は相互に連絡しており、血液凝固は、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）が凝固の主要な開示剤である細胞ベースの活性化モデルにより発生すると考えられている。
Figure 2014042523
トロンビンの生成は、伝統的に、３つの経路、活性第Ｘ因子（ＦＸａ）の生成のための代替経路を提供する内因性（経路のすべての成分が血漿に内因性であることを示す）、及び外因性（経路の１つ又は複数の成分が血漿に外因性であることを示す）経路、並びにトロンビン形成をもたらす最後の共通経路に分けられている（図１）。これらの経路は、相互に連絡し、相互に依存したプロセスに一緒に関与して、凝固をもたらす。凝固の細胞ベースのモデルが開発され、これは、これらの経路を記載する（図２）（Ｈｏｆｆｍａｎら（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ８５：９５８〜９６５）。このモデルにおいて、「外因性」及び「内因性」経路は、異なる細胞表面、組織因子（ＴＦ）を有する細胞、及び血小板でそれぞれ行われる。凝固のプロセスは、別個の段階である開始、増幅及び伝播に分けられ、これらの間に外因性及び内因性の経路が種々の段階で機能して、十分量のフィブリノゲンを凝血塊形成のためのフィブリンに変換するために必要な大量のトロンビンを生成する。
ａ．開始
ＦＶＩＩは、凝固カスケードの開始を担う凝固因子であると考えられ、この開始は、ＴＦとのその相互作用に依存する。ＴＦは、平滑筋細胞、繊維芽細胞、単核細胞、リンパ球、顆粒球、血小板及び内皮細胞などの種々の細胞により発現される膜貫通糖タンパク質である。骨髄細胞及び内皮細胞は、炎症促進性サイトカインなどによって、それらが刺激されたときだけＴＦを発現する。しかし、平滑筋細胞及び繊維芽細胞は、ＴＦを構成的に発現する。よって、これらの細胞が、組織損傷の後に血流と一旦接触すると、凝固カスケードは、ＴＦの、血漿中の第ＶＩＩ因子又はＦＶＩＩａへの結合により直ちに開始される。
以下で論述するように、血液中のＦＶＩＩのほとんどは酵素原の形であり、少量、ほぼ１％がＦＶＩＩａとして存在する。しかし、ＴＦの結合がなければ、ＦＶＩＩａでさえ酵素原様の特徴を有し、それがＴＦと複合体を形成するまで、著しい活性を示さない。よって、血漿ＦＶＩＩは、完全な活性のために、タンパク質分解切断、及びＴＦとの相互作用によるさらなる高次構造変化による活性化を必要とする。第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩＩａ因子及びトロンビンを含む一連のプロテアーゼは、ＴＦの存在下で促進されるプロセスであるＦＶＩＩ切断をｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができることが示されている。ＦＶＩＩａ自体も、ＴＦの存在下でＦＶＩＩを活性化でき、これは自己活性化と呼ばれるプロセスである。血液中の少量のＦＶＩＩａは、ＦＸａ及び／又はＦＩＸａによる活性化によるようである（Ｗｉｌｄｇｏｏｓｅら（１９９２）Ｂｌｏｏｄ ８０：２５〜２８、及びＢｕｔｅｎａｓら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：１９０４〜１９１０）。ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体は、よって、ＦＶＩＩａのＴＦへの直接の結合、又はＦＶＩＩのＴＦへの結合、次いでその後のＦＸａ、ＦＩＸａ、ＦＸＩＩａ又はＦＶＩＩａ自体などの血漿プロテアーゼによるＦＶＩＩのＦＶＩＩａへの活性化により形成できる。ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体は、ＴＦを有する細胞につながれたままであり、そこでこれは少量のＦＸを、凝固の「外因性経路」として知られる経路で、ＦＸａに活性化する。
ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体は、少量のＦＩＸをＦＩＸａにも切断する。ＦＸａは、その補因子であるＦＶａと会合して、これもまたＴＦを有する細胞上に複合体を形成し、これが、次いで、プロトロンビンをトロンビンに変換できる。生成される少量のトロンビンは、しかし、完全な凝血のために必要なフィブリン形成を支持するのに十分ではない。さらに、任意の活性ＦＸａ及びＦＩＸａは、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）及びその他のセルピンにより循環内で阻害され、このことは、以下でより詳細に論述する。このことが、循環内で凝血塊形成を通常は防止するのであろう。損傷の存在下では、しかし、脈管構造への損傷が、このトロンビン形成部位での血小板凝集及び活性化をもたらし、そのことにより凝固シグナルの増幅が可能になる。
ｂ．増幅
増幅は、トロンビンが血小板に結合して活性化するときに起こる。活性化血小板は、それらのアルファ顆粒からＦＶを放出し、これは、トロンビンによりＦＶａに活性化される。トロンビンも放出され、血小板膜上のＦＶＩＩＩ／ｖＷＦ複合体からのＦＶＩＩＩを活性化し、ＦＸＩをＦＸＩａに切断する。これらの反応は、それらの表面にＦＶａ、ＦＶＩＩＩａ及びＦＩＸａを有する活性化血小板を生成し、これが伝播段階の間の大量のトロンビン生成のための舞台を設定する。
ｃ．伝播
凝固の伝播は、損傷部位での多数の血小板の表面上で生じる。上記のように、活性化血小板はＦＸＩａ、ＦＶＩＩＩａ及びＦＶａをそれらの表面上に有する。ここで、外因性経路が起こるのである。ＦＸＩａは、ＦＩＸをＦＩＸａに活性化し、これが次いで、ＦＶＩＩＩａに結合できる。このプロセスが、ＴＦを有する細胞上のＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体によるＦＩＸの切断により生成される少量のＦＩＸａと共に、多数のＦＸＩａ／ＦＶＩＩＩａ複合体を生成し、これが次いで、著しい量のＦＸをＦＸａに活性化できる。ＦＸａ分子は、ＦＶａに結合して、プロトロンビナーゼ複合体を生成し、これがプロトロンビンをトロンビンに活性化する。トロンビンは、正のフィードバックループ内で作用して、さらにより多くの血小板を活性化し、増幅段階について記載したプロセスを再び開始する。
非常に短い間に、止血性フィブリン凝血塊を形成するのに十分量のフィブリンをフィブリノゲンから生成するのに十分大量である、大量のトロンビンを生成する適切な複合体を有する十分な数の活性化血小板が存在する。フィブリノゲンは、トロンビンにより切断されるとフィブリノペプチドＡ及びフィブリノペプチドＢを放出する、血漿に可溶性の２量体である。フィブリノペプチドＢは、次いで、トロンビンにより切断され、この２回目のタンパク質分解切断により形成されるフィブリン単量体は、自発的に不溶性のゲルを形成する。重合したフィブリンは、非共有結合力及び静電力により一緒に維持されて、トロンビンによるＦＸＩＩＩの切断により生成された、トランスアミド化酵素第ＸＩＩＩａ因子（ＦＸＩＩＩａ）より安定化される。トロンビンは、ＴＡＦＩも活性化し、これは、凝血塊表面でのプラスミンの生成を低減することにより、フィブリン溶解を阻害する。さらに、トロンビン自体は、さらなる安定化のために凝血塊の構造に組み込まれる。これらの不溶性フィブリン凝集体（凝血塊）は、凝集血小板（血栓）と共に、損傷を受けた血管を遮断し、さらなる出血を妨げる。
３．凝固の制御
凝固の間に、カスケードは、さらなる凝血塊形成を阻害する構成性及び刺激性のプロセスにより制御される。そのような制御機構について、いくつかの理由がある。まず、制御は、フィブリン凝血塊形成による組織の虚血を制限する必要がある。次に、制御は、凝血塊形成を組織損傷部位だけに局在化させることにより、広範な血栓形成を妨げる。
制御は、いくつかの阻害分子のカチオンにより達成される。例えば、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）及び組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）は、構成的に作動して、凝固カスケードの因子を阻害する。ＡＴ−ＩＩＩは、トロンビン、ＦＩＸａ及びＦＸａを阻害するが、ＴＦＰＩはＦＸａ及びＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体を阻害する。血小板活性化により刺激されるさらなる因子、プロテインＣは、タンパク質分解切断並びにＦＶａ及びＦＶＩＩＩａの不活性化により凝固を制御する。プロテインＳは、プロテインＣの活性を増進する。さらに、凝固阻害に貢献する別の因子が、膜内在性タンパク質トロンボモジュリンであり、これは、血管内皮細胞により生成され、トロンビンの受容体として働く。トロンビンのトロンボモジュリンへの結合は、トロンビンの凝固促進活性を阻害し、プロテインＣ活性化にも貢献する。
フィブリン凝血塊の分解であるフィブリン溶解も、凝固を制御する機構を提供する。凝血塊中の架橋されたフィブリン多量体は、セリンプロテアーゼであるプラスミンにより、可溶性ポリペプチドに分解される。プラスミンは、その不活性前駆体であるプラスミノゲンから生成され、２つの方法でフィブリン凝血塊の部位に動員されることができる：フィブリン凝血塊の表面での組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）との相互作用、及び細胞表面でのウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子（ｕＰＡ）との相互作用による。第１の機構は、血管内での凝血塊の溶解の原因である主要なものであるようである。凝血塊溶解を媒介できるが、第２の機構は、組織リモデリング、細胞遊走及び炎症において主要な役割を演じ得る。
凝血塊溶解も、２つの方法で制御される。第１に、効果的なプラスミン活性化及びフィブリン溶解は、凝血塊表面又は細胞膜上で形成された複合体でのみ生じるが、血液中の遊離タンパク質は、無能な触媒であり、迅速に不活性化される。第２に、プラスミノゲン活性化因子及びプラスミンは、プラスミノゲン活性化因子に対して作用するプラスミノゲン活性化因子阻害因子１型（ＰＡＩ−１）及びＰＡＩ−２、並びにプラスミンを不活性化するα２−アンチプラスミン及びα２−マクログロブリンなどの分子により不活性化される。通常の状況では、凝固とフィブリン溶解の適時の平衡が、血管損傷の後の凝血塊の効果的な形成及び除去をもたらすが、同時に、望ましくない血栓及び出血の発生を妨げる。
例示的な凝固因子、補因子及び制御タンパク質、並びにそれらの活性のまとめを、以下の表４に示す。
Figure 2014042523
Ｃ．第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）
第ＶＩＩ因子は、哺乳動物を含めた動物において、肝臓における一本鎖酵素原として合成され、血流へ分泌されるビタミンＫ依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質である。上記のように、ＦＶＩＩは、トロンビン生成及びフィブリン沈着へと導くタンパク分解性事象のカスケードを開始することに関与する凝固プロテアーゼである。それは外因性経路の一部であるが、その活性の下流効果は、内因性経路にも大きな影響を与える。この血塊形成に不可欠な役割により、臨床上の抗凝固療法及び止血治療のための標的としてＦＶＩＩに大きな関心が寄せられている。例えば、組換え活性化ＦＶＩＩ（ｒＦＶＩＩａ）は、血友病患者及び他の出血性状態を有する患者に用いる止血剤として開発されている。活性化によって凝固活性が増大するように設計され、第ＶＩＩ因子治療を受け入れられる疾患及び状態を治療するための改善された治療薬として働くことができる改変ＦＶＩＩポリペプチドが本明細書で提供される。
１．ＦＶＩＩ構造及び構成
ヒトＦＶＩＩ遺伝子（Ｆ７）は、第１３染色体の１３ｑ３４に位置し、９個のエクソンを含む１２．８ｋｂ長である。ＦＶＩＩ遺伝子は、プロトロンビン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、及びプロテインＣなどの他のビタミンＫ依存性タンパク質をコードする遺伝子と有意な構成的類似性を共有する。ＦＶＩＩのｍＲＮＡは、選択的スプライシングを受けて、以下の２つの転写産物を生じる：変異体１（配列番号１０８に示す、ジェンバンクアクセッション番号ＮＭ＿０００１３１）及び変異体２（配列番号１０９に示す、ジェンバンクアクセッション番号ＮＭ＿０１９６１６）。肝臓においてより豊富にある型である転写産物変異体２は、エクソン１ｂを含まず、したがって、転写産物変異体１にコードされる４６６個のアミノ酸の前駆ポリペプチド（ＦＶＩＩアイソフォームａ前駆体；配列番号１）と比較して、４４４個のアミノ酸のより短い前駆ポリペプチド（ＦＶＩＩアイソフォームｂ前駆体；配列番号２）をコードする。ＦＶＩＩアイソフォームｂ前駆ポリペプチドに存在しないアミノ酸は、ＦＶＩＩアイソフォームａ前駆体のアミノ酸位置２２〜４３に対応する。これらのアミノ酸は、プロペプチド配列の一部であり、結果として、切断型のＦＶＩＩアイソフォームｂプロペプチドを生じる。前駆ポリペプチドは、以下のセグメント及びドメインで構成されている：疎水性シグナルペプチド（配列番号１及び２のアミノ酸１〜２０位）、プロペプチド（配列番号１のアミノ酸２１〜６０位；及び配列番号２のアミノ酸２１〜３８位）、Ｇｌａドメイン（配列番号１のアミノ酸３９〜８３位；及び配列番号２のアミノ酸６１〜１０５位）、Ｂ型上皮増殖因子ドメイン（ＥＧＦ様１、配列番号１のアミノ酸８４〜１２０位、及び配列番号２のアミノ酸１０６〜１４２位）、Ａ型上皮増殖因子ドメイン（ＥＧＦ様２、配列番号１のアミノ酸１２５〜１６６位；及び配列番号２のアミノ酸１４７〜１８８位）、及びセリンプロテアーゼドメイン（配列番号１のアミノ酸１９１〜４３０位、及び配列番号２のアミノ酸２１３〜４５２位）。
ＦＶＩＩポリペプチドの４０６個のアミノ酸成熟型（配列番号３）は、シグナルペプチド配列及びプロペプチド配列を欠き、それの起源であるアイソフォーム前駆体に関係なく、長さ及び配列が同一である。ＦＶＩＩポリペプチドの成熟型において、上記のドメインについての対応するアミノ酸位置は以下のとおりである：Ｇｌａドメイン（配列番号３のアミノ酸１〜４５位）、ＥＧＦ様１（配列番号３のアミノ酸４６〜８２位）、ＥＧＦ様２（配列番号３のアミノ酸８７〜１２８位）、及びセリンプロテアーゼドメイン（配列番号３のアミノ酸１５３〜３９２位）。
ＦＶＩＩのＧｌａドメインは、カルシウムイオンの存在下において、ホスファチジルセリンを含むリン脂質膜と相互作用する膜結合モチーフである。Ｇｌａドメインはまた、ＦＶＩＩａ補因子である組織因子（ＴＦ）への結合において役割を果たす。ＴＦと複合体を形成して、ＦＶＩＩａのＧｌａドメインは、７個のＣａ２＋イオンを負荷され、細胞表面上のリン脂質との相互作用のために細胞膜の方向へ３個の疎水性側鎖を突出させ、ＴＦのＣ末端ドメインと重要な接触を生じる。Ｇｌａドメインは、プロトロンビン、凝固第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子、プロテインＣ、Ｓ、及びＺなどのビタミンＫ依存性タンパク質の間で保存されている。これらのタンパク質は、これらのタンパク質のＮ末端Ｇｌａドメインにクラスター形成されるアミノ酸である、γ−カルボキシグルタミン酸の翻訳後合成のためにビタミンＫを必要とする。そのドメインに存在するすべてのグルタミン酸残基は、潜在的カルボキシル化部位であり、したがって、それらの多くは、カルボキシル化によって修飾される。
Ｇｌａドメインに加えて、成熟ＦＶＩＩタンパク質はまた、２つのＥＧＦ様ドメインを含有する。第１のＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦ様１又はＥＧＦ１）は、カルシウム結合性ＥＧＦドメインであり、その中において、６個の保存されたコアのシステインが３つのジスルフィド架橋を形成する。ＦＶＩＩのＥＧＦ１ドメインは、たった１個のＣａ２＋イオンを結合するが、Ｇｌａドメインで観察されるものより有意に高い親和性で結合する（Ｂａｎｎｅｒら、（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８０：４１〜４６）。この結合したＣａ２＋イオンは、ＦＶＩＩのＥＧＦ１ドメインとＴＦの間の強い相互作用を促進する（Ｏｓｔｅｒｂｕｎｄら、（２０００）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６７：６２０４〜６２１１）。第２のＥＧＦ様ドメイン（ＥＧＦ様２又はＥＧＦ２）は、カルシウム結合性ドメインではないが、やはり３つのジスルフィド架橋を形成する。ＦＶＩＩにおける他のドメインと同様に、ＥＧＦ２ドメインはＴＦと相互作用する。それはまた、プロテアーゼドメインと共にジスルフィド結合しており、プロテアーゼドメインと共に大きな接触界面を共有する。
最後に、ＦＶＩＩのセリンプロテアーゼドメインは、ＦＶＩＩａのタンパク分解性活性に関与するドメインである。その触媒ドメインにおけるＦＶＩＩのアミノ酸の配列は、トリプシン及びキモトリプシンなどの他のセリンプロテアーゼと高い配列同一性及び三次構造類似性を示す（Ｊｉｎら、（２００１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、３０７：１５０３〜１５１７）。例えば、これらのセリンプロテアーゼは、キモトリプシン番号付けに基づいて、共通の触媒三連構造Ｈ５７、Ｄ１０２、Ｓ１９５を共有する。しかしながら、他のセリンプロテアーゼと違って、酵素原の完全活性酵素への変換を完了するのに、ＦＶＩＩａの切断では十分ではない。その代わりに、下記で論じるように、ＦＶＩＩａは、それを酵素原様不活性状態から触媒活性酵素へ切り換えるＦＶＩＩａプロテアーゼドメインにおける高次構造変化を引き起こす、細胞表面受容体ＴＦへの結合によって、その触媒機能においてアロステリックに活性化される。ＦＶＩＩａの補因子結合部位と活性部位の間のヘリックスループ領域（即ち、キモトリプシン番号付けに基づく残基１６３〜１７０位に対応する、アミノ酸残基３０５〜３２１位）は、ＦＶＩＩａのアロステリック効果及び酵素原性にとって重要である（Ｐｅｒｓｓｏｎら、（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．、３７９：４９７〜５０３）。この領域は、後にループが続く、短いαヘリックス（アミノ酸残基３０７〜３１２位）で構成される。ヘリックスのＮ末端部分は、プロテアーゼドメインとＴＦの間の界面の一部を形成し、タンパク分解性機能及びＴＦへの最適な結合にとって重要であるいくつかの残基を含有する。ＦＶＩＩａ単独と、ＴＦと複合体を形成したＦＶＩＩａとの結晶構造の比較により、ＦＶＩＩａがＴＦを結合するとき、αヘリックスが有意な高次構造変化を起こすことが示される。ＦＶＩＩａ単独のαヘリックスは、歪み、短縮され、且つ異なって配向されているように思われる。これは、隣接するループ構造に影響を及ぼし、それらを活性部位から遠ざける。対照的に、ＴＦと複合体を形成したときのＦＶＩＩａのαヘリックスは安定化され、隣接するループは活性部位のより近くに位置している。この安定化は、少なくともＦＶＩＩのアミノ酸位置３０６のメチオニン（キモトリプシン番号付けによるアミノ酸残基Ｍｅｔ１６４）が関与する機構を通してもたらされる（Ｐｉｋｅら、（１９９９）ＰＮＡＳ ８９２５〜８９３０）。
２．翻訳後修飾
ＦＶＩＩ前駆ポリペプチド（第ＶＩＩ因子遺伝子のアイソフォームのいずれでも）は、小胞体（ＥＲ）へ挿入して膜を横切っての転位を惹起する疎水性シグナルペプチドによって細胞分泌経路へ標的化される。そのタンパク質がＥＲ膜を通って転位する間、２０個のアミノ酸シグナルペプチドは、ＥＲ内腔内のシグナルペプチダーゼによって切り離され、その後、そのポリペプチドは、Ｎ−グリコシル化及びＯ−グリコシル化、Ｎ−末端グルタミン酸のγ−カルボキシグルタミン酸へのビタミンＫ依存性カルボキシル化、並びにアスパラギン酸のβ−ヒドロキシアスパラギン酸へのヒドロキシル化を含めた、さらなる翻訳後修飾を受ける。
プロペプチドは、ＦＶＩＩプロペプチドにおける１０残基の両親媒性α−ヘリックスを認識するビタミンＫ依存性カルボキシラーゼの結合部位を提供する。結合後、カルボキシラーゼは、ＦＶＩＩポリペプチドのＧｌａドメイン内の１０個のグルタミン酸残基をγ−カルボキシル化し、配列番号２に示すＦＶＩＩ前駆アミノ酸配列に関して位置Ｅ６６、Ｅ６７、Ｅ７４、Ｅ７６、Ｅ７９、Ｅ８０、Ｅ８５、Ｅ８６、Ｅ８９、及びＥ９５にγ−カルボキシグルタミル残基を生じる。これらの位置は、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドの位置Ｅ６、Ｅ７、Ｅ１４、Ｅ１９、Ｅ２０、Ｅ２５、Ｅ２６、Ｅ２９、及びＥ３５に対応する。最適な活性のために、ＦＶＩＩ分子は、カルシウムを必要とし、カルシウムがそのポリペプチドに結合して、ＦＶＩＩａのＴＦ及び脂質との結合に必要とされる高次構造変化を容易にする。γ−カルボキシル化Ｇｌａドメインは７個のＣａ２＋イオンを可変親和性で結合し、ＧｌａドメインがＴＦのＣ末端ドメイン、及び血小板膜上のホスファチジルセリン又は他の負荷電リン脂質とも相互作用するのを可能にする高次構造変化を引き起こす。
Ｎ−結合型グリコシル化は、成熟タンパク質（配列番号３）のアミノ酸残基１４５位及び２６２位に対応する位置のＦＶＩＩポリペプチドにおける２個のアスパラギン残基へのＧｌｃ３Ｍａｎ９（ＧｌｃＮＡｃ）の転移によって行われる。Ｏ−結合型グリコシル化は、成熟ポリペプチドのアミノ酸残基５２位及び６０位で起こり、β−ヒドロキシアスパラギン酸へのヒドロキシル化は、６３位のアスパラギン酸残基で起こる。これらのＯ−グリコシル化セリン残基及びβ−ヒドロキシル化アスパラギン酸残基は、ＦＶＩＩのＥＧＦ−１ドメイン内にある。これらの修飾は、ポリペプチドのその成熟型への最終プロセシングの前にＥＲ及びゴルジ複合体において実行される。
３．ＦＶＩＩプロセシング
修飾されたプロＦＶＩＩポリペプチドは、ゴルジ内腔を通って、トランスゴルジコンパートメントへと輸送され、そこで、そのプロペプチドは、そのタンパク質の細胞からの分泌直前にプロペプチダーゼによって切断される。ＰＡＣＥ／フューリン（ＰＡＣＥは対塩基性アミノ酸切断酵素（Ｐａｉｒｅｄ ｂａｓｉｃ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ）の頭字語である）は、多くのタンパク質を配列モチーフＡｒｇ−［任意の残基］−（Ｌｙｓ又はＡｒｇ）−Ａｒｇのカルボキシ末端側で切断するゴルジ膜に局在しているエンドペプチダーゼである。このプロペプチダーゼは、プロ第ＩＸ因子及びプロｖＷＦポリペプチドなどのビタミンＫ依存性糖タンパク質を切断し（Ｈｉｍｍｅｌｓｐａｃｈら、（２０００）Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９７；５１〜６７）、成熟タンパク質からプロペプチドを放出する。適切なＰＡＣＥ／フューリン認識部位を組換え第ＶＩＩ因子前駆体へ包含させることによって、組換えポリペプチドの正しいプロセシング及び分泌が容易になる（Ｍａｒｇａｒｉｔａｓら、（２００４）Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１３（７）：１０２５〜１０３１）。ＰＡＣＥ／フューリン又は別のサブチリシン様プロペプチダーゼ酵素は、プロＦＶＩＩのＦＶＩＩへのタンパク分解性プロセシングに関与する可能性が高い。それは、配列番号１に示す配列のアミノ酸位置３５〜３８及び配列番号２に示す配列のアミノ酸位置５７〜６０における−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−共通モチーフを認識且つ結合し、プロペプチドを切断して、成熟タンパク質を分泌として放出することができる。
４．ＦＶＩＩ活性化
血液中の大多数のＦＶＩＩは、不活性化一本鎖酵素原の形をとっているが、少量は二本鎖活性化型で存在する。ＦＶＩＩの活性化は、Ａｒｇ１５２−Ｉｌｅ１５３結合（配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドに関しての位置）のタンパク分解性切断で起こり、ジスルフィド架橋によって２５４個のアミノ酸重鎖（約３０ｋＤａ）に連結した１５２個のアミノ酸軽鎖（約２０ｋＤａ）を含有する二本鎖ポリペプチドを生じる。ＦＶＩＩａの軽鎖は、Ｇｌａドメイン及びＥＧＦ様ドメインを含有し、一方、重鎖は、その分子の触媒性又はセリンプロテアーゼ部分を含有する。一本鎖ＦＶＩＩの二本鎖ＦＶＩＩａへの変換は、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩＩａ、トロンビンによる切断により、又は内在性ＦＶＩＩａによる自己触媒性様式で媒介される（Ｂｕｔｅｎａｓら、（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３５：１９０４〜１９１０；Ｎａｋａｇａｋｉら、（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３０：１０８１９〜１０８２４）。循環中に存在する痕跡量のＦＶＩＩａは、ＦＸａ及びＦＩＸａの作用から生じる可能性が高い。
上記で論じるように、ＦＶＩＩのその酵素原型からＦＶＩＩａへの切断は、完全活性にとって十分ではない。ＦＶＩＩａは、完全活性のためにＴＦとの会合を必要とする（Ｈｉｇａｓｈｉら、（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：２６５６９〜２６５７４）。この必要性を理由に、単独のＦＶＩＩａは、酵素原のフォールディング及び形状を表し、比較的低い活性を示す酵素原様特徴を示すとされている。それのＴＦとの会合の不在下におけるＦＶＩＩａのこの酵素原様特性により、一般的に酵素原型よりむしろセリンプロテアーゼの活性型に主として作用するアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）及び他のセルピンに対して相対的に抵抗性となっている。さらに、ＴＦ／ＦＶＩＩａ活性の主要阻害剤であるＴＦＰＩもまた、ＦＶＩＩａの「不活性」の非複合体化型に効率的に結合しない。
ＴＦとの複合体形成によって、ＦＶＩＩａは、その分子の完全活性を可能にする高次構造変化を起こす。ＦＶＩＩドメインの全部がＴＦとの相互作用に関与するが、生じる高次構造変化は、ＦＶＩＩａのプロテアーゼドメインに局在している。例えば、ＦＶＩＩａとＴＦのアロステリック相互作用によって生じる高次構造変化は、拡張された高分子基質結合エキソサイトの生成を含む。この拡張された結合部位は、第Ｘ因子のＦＶＩＩ媒介性タンパク分解性活性化を大いに増強する。
ＦＶＩＩａの相互作用が、細胞表面発現型ＴＦに対してである場合、ＦＶＩＩａの活性はさらに増大する（即ち、１千倍）。これは、ホスファチジルセリンなどの負荷電リン脂質を含有するリン脂質膜が、Ｇｌａドメインを介して結合するＦＩＸ及びＦＸなどの他のビタミンＫ依存性凝固因子の相互作用の部位であるためである。したがって、これらのビタミンＫ依存性タンパク質の局所濃度は、細胞表面で高く、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体とのそれらの相互作用を促進する。
５．ＦＶＩＩ機能
ＦＶＩＩａは、ＴＦによるアロステリック活性化後、活性の増大を示すが、ＦＶＩＩａ単独で凝固を開始することができる機構が存在するという証拠がある。したがって、ＦＶＩＩは、ＴＦ依存性様式及びＴＦ非依存性様式で機能することができる。この後者の経路は、通常の止血においては、よりはるかに小さい役割を果たすことができるにすぎないが、出血性障害及びその治療との関連において考えられる場合、それは重要であり得る。
ａ．組織因子依存性ＦＶＩＩａ活性
循環ＦＶＩＩは、上記のように、細胞表面ＴＦを結合し、ＦＩＸａ、ＦＸａ、トロンビンによって、又は内在性ＦＶＩＩａによる自己触媒的様式で、活性化される。或いは、極少量の循環ＦＶＩＩａが直接、ＴＦを結合することができる。その後、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体は、ほんのわずかの血漿ＦＸを結合し、ＦＶＩＩａ触媒ドメインがＦＸを切断して、ＦＸａを生じる。したがって、トロンビンは、ＴＦ含有細胞の表面上で外因性経路を介して形成され、そのとき、ＦＸａがＦＶａと複合体を形成して、プロトロンビンをトロンビンに活性化する（図３）。ＦＩＸもまた、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体によって活性化され、活性化血小板の表面上で作動する内因性経路へのリンクを提供する。上記の凝固カスケードにおけるポジティブフィードバック系は、大量のトロンビンが生成され、それがフィブリノゲンをフィブリンへと切断して血塊を形成する手段を提供する。
ｂ．組織因子非依存性ＦＶＩＩａ活性
ＦＸのＦＸａへの活性化についてのＴＦ依存性機構に加えて、ＦＶＩＩａがまたＴＦの不在下でＦＸを活性化できるという証拠がある。活性化血小板は、ホスファチジルセリン及び他の負荷電リン脂質を外側の血漿配向性表面に転位させる（Ｈｅｍｋｅｒら、（１９８３）Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ ９：３０３〜３１７）。これは、ＦＶＩＩａのＴＦへの結合親和性の１０００分の１である相対的に低い親和性ではあるが、ＦＶＩＩａが結合することができる代替の「受容体」を提供する（Ｍｏｎｒｏｅら、（１９９７）Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ ９９：５４２〜７）。この相互作用は、Ｇｌａドメインにおける残基を通して媒介される（Ｈａｒｖｅｙら、（２００３）２７８：８３６３〜８３６９）。その後、ＦＶＩＩａは、活性化血小板表面上で、ＦＸをＦＸａへ、及びＦＩＸをＦＩＸａへ変換することができる（Ｈｏｆｆｍａｎら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ９：Ｓ６１〜Ｓ６５）。ＦＸａは血小板表面と会合したままであり、そこで、それはＦＶａに結合して、プロトロンビンから十分なトロンビンを生成することができ、同時に、新しく形成されたＦＩＸａは、ＦＶＩＩＩａと集合して、より多くのＦＸのＦＸａへの活性化を触媒する（図３）。その後、ＴＦの不在下における止血は、上記のポジティブフィードバック及び伝播機構によって達成することができる。しかしながら、ＦＶＩＩＩａが活性化血小板上で凝固過程に寄与することができるが、その存在は、ＴＦ非依存性機構においてトロンビン生成に必要とされないことは注目に値する（図３）。したがって、血友病患者においてのようなＦＶＩＩＩの不在下において、ＦＶＩＩａが、この二次機構を通してトロンビン生成を開始及び／又は増幅し、血塊形成をもたらすことができるという証拠がある。
６．生物製剤としてのＦＶＩＩ
ＦＶＩＩは血液凝固を開始するように機能する。組換えＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）；ｒＦＶＩＩａ）は、第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子の阻害因子を有する血友病Ａ又はＢに罹患する患者、及び先天性第ＶＩＩ因子欠乏症に罹患する患者における出血症状の治療、又は外科手術若しくは侵襲的方法での出血予防として認められている。Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ（登録商標）は、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞を用いて哺乳動物発現系で産生される第ＶＩＩａ因子の遺伝子組換え型調製物である。その作用物質は、その構造及び機能において血漿由来第ＶＩＩａ因子とほぼ同一である（Ｒａｔｋｏら、（２００４）、Ｐ＆Ｔ、２９：７１２〜７２０）。
組換えＦＶＩＩａ（ｒＦＶＩＩａ）の投与は、血友病を患っている患者において血液凝固を促進することが示されており、ＦＶＩＩａの投薬での治療は、ヒト対象において安全且つ耐容性がよいことが見出されている。典型的には、ｒＦＶＩＩａの使用は、第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子の阻害因子（即ち、同種抗体）を発生している患者においてである。血液凝固薬としてのｒＦＶＩＩａの使用は、他の出血性障害、例えば、グランツマン血小板無力症；それだけに限らないが、肝臓移植、前立腺手術、及び出血性外傷を含めた、外傷又は手術の結果などの広範な出血に関連した他の事象；新生児凝血障害、重症肝疾患；骨髄移植、血小板減少症、及び血小板機能障害；経口抗凝血の緊急逆転；第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子、及び第ＸＩ因子の先天性欠乏症；並びに、フォンウィルブランド因子の阻害因子を有するフォンウィルブランド病の治療に拡大適用されている。
治療効果を得るのに、高用量のｒＦＶＩＩが必要とされる。ｒＦＶＩＩ投与に必要とされる用量及び投薬レジメは、臨床的適応によって変わる。例えば、同種抗体を有する血友病Ａ又は血友病Ｂを罹患する患者における出血性症状発現についてのｒＦＶＩＩの典型的投薬量は、静脈（ＩＶ）注射によって投与される９０μｇ／ｋｇである。ｒＦＶＩＩは半減期が２時間であるため、反復投薬が必要とされる。追加の投薬は、止血に達するまで、２時間おきに与えることができる。用量範囲は、状態の重症度に依存して変わり得る。例えば、３５〜１２０μｇ／ｋｇの範囲の用量が効果的であった。また、用量及び投薬レジメは、他の適応によって変わり得る。例えば、手術を受ける血友病Ａ又は血友病Ｂ患者については、手術直前に９０μｇ／ｋｇの初回量を投与し、手術中及び手術後、２時間おきに反復投薬を与えることができる。手術及び出血症状の重症度に依存して、ボーラスＩＶ注入が、治癒に達するまで２〜６時間おきに継続することができる。先天性ＦＶＩＩ欠乏患者において、ｒＦＶＩＩは、典型的には、手術又は他の侵襲的方法において出血を予防するために、止血に達するまで４〜６時間おきに１５〜３０μｇ／ｋｇで投与される。
止血を開始するｒＦＶＩＩａの作用機構は、高用量の必要性を明らかにする。血友病患者は、ＴＦ含有細胞の部位でＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体がＦＸをＦＸａへと活性化し、トロンビン産生へと導くという凝固の正常な開始相を有する。しかしながら、その後、血友病患者はＦＶＩＩＩ（血友病Ａ）又はＦＩＸ（血友病Ｂ）を欠くため、凝固過程は破綻し、したがって、正常には前記の増幅及び伝播相で大量のＦＸをＦＸａへ活性化する働きをする、ＦＶＩＩＩａ／ＦＩＸａ複合体を活性化血小板表面上で形成することができない。ＴＦＰＩ及びＡＴ−ＩＩＩなどの阻害因子の存在のために、ＴＦ／ＦＶＩＩａによる切断後にＴＦ含有細胞上で生成されるＦＸａが、細胞表面間で容易には拡散することができない。結果として、活性化血小板表面上の大量トロンビン生成は起こらず、血塊は形成されない。
高用量のｒＦＶＩＩａの止血効果は、活性化血小板上でｒＦＶＩＩａによるＦＸａのＴＦ依存性及び／又はＴＦ非依存性生成を用いて達成することができるという証拠がある（図３）。ＴＦ依存性トロンビン生成は、内在性ＦＶＩＩａ及びｒＦＶＩＩａでのＴＦ分子の飽和によって非常に迅速に最大にすることができる。場合によっては、高用量ｒＦＶＩＩａは活性化血小板を結合し、ＦＸをＦＸａへ変換することができる。表面会合型ＦＸａはＦＶａを活性化して、止血に十分なトロンビンを生成する。ｒＦＶＩＩは血小板表面に低親和性で結合するため、より高用量のｒＦＶＩＩがトロンビン生成に必要とされ得る。活性化血小板上のＦＸａの活性化は、ｒＦＶＩＩａ媒介性止血が傷害部位に局在していることを保証する。
ｒＦＶＩＩの用量の低減を達成する手段は、薬物としてのその有用性及び効率を向上させることができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドが本明細書で提供されている。これらの中には、ＴＦＰＩに対する抵抗性の増大、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大、半減期の増大などの薬物動態学的性質の向上、ＴＦの存在下及び／若しくは不在下における触媒活性の増大、並びに／又は活性化血小板への結合の増大を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドがある。これらのＦＶＩＩポリペプチドは、凝固活性の増大を示すことができる。本明細書で提供されるＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＸａが生じて、トロンビンが生成されるようなＴＦ依存性及び／又はＴＦ非依存性機構で止血を開始する治療に用いることができる。
Ｄ．改変ＦＶＩＩポリペプチド
改変ＦＶＩＩポリペプチドが本明細書で提供されている。ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、１つ又は複数の活性又は性質の変化を示す。改変の結果として変化することができる活性又は性質には、それだけに限らないが、凝固若しくは凝固活性；凝固促進活性；第Ｘ因子（ＦＸ）活性化若しくは第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性化をもたらすなどのタンパク分解性活性若しくは触媒活性；抗原性（抗ＦＶＩＩ抗体への結合に関してポリペプチドに結合する、又はポリペプチドと競合する能力）；組織因子、第Ｘ因子、若しくは第ＩＸ因子を結合する能力；活性化血小板の細胞表面に結合する能力；リン脂質に結合する能力；半減期；三次元構造；ｐＩ；及び／又は高次構造が挙げられる。典型的には、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、凝固促進活性を示す。一本鎖酵素原型からの活性化で凝固活性の増大を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドが本明細書で提供されている。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、血友病又は傷害などの出血性障害又は事象の治療に用いることができ、ＦＶＩＩポリペプチドは血液凝固を促進するように機能することができる。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドの中には、組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）及びアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）などの阻害因子に対する抵抗性が増大しているもの、ＴＦの存在下及び／又は不在下で触媒活性が増大しているもの、半減期の増大などの薬物動態学的性質が向上しているもの、並びに血小板表面への結合及び／又は親和性が増大しているものが含まれる。特に、そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、凝固活性を供給しながらも、同時にＦＶＩＩＩａ及びＦＩＸａの必要性を迂回するように、疾患又は状態に用いることができる。一例では、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩＩａ及びＦＩＸａに対する自己抗体を有する血友病患者に用いることができる。したがって、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、止血のために血清中十分な濃度の活性ＦＶＩＩを維持するために必要とされるＦＶＩＩ投与量の低下を含めた利点を与える。これは、例えば、匹敵する生物学的効果を達成するのに必要なより少ない用量及び／又は投薬頻度、治療効果のより速い発現、急性出血症状のより速い改善、対象によるより高い快適性及び許容性、並びに二次的な非有益的効果の減弱をもたらすことができる。
ＦＶＩＩポリペプチドにおける改変は、対立遺伝子変異体及び種変異体、スプライス変異体、当技術分野において知られた変異体、又はハイブリッド若しくはキメラＦＶＩＩ分子を含めたいかなる型のＦＶＩＩポリペプチドにも行うことができる。例えば、本明細書で提供される改変は、配列番号１若しくは２に示す前駆ＦＶＩＩポリペプチド、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチド、又は配列番号１〜３に示すＦＶＩＩポリペプチドのいずれかと４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％配列同一性を有する、その任意の種変異体、対立遺伝子変異体、若しくは修飾変異体、及び活性断片において行うことができる。ＦＶＩＩの対立遺伝子変異体には、それだけに限らないが、配列番号１８〜７４のいずれかに示すアミノ酸の配列を有するそれらの前駆ポリペプチドのいずれかが挙げられる。本明細書における改変のための例示的な種変異体には、それだけに限らないが、ヒトポリペプチド、並びにウシ、マウス、ピグミーチンパンジー、チンパンジー、ウサギ、ラット、アカゲザル、ブタ、イヌ、ゼブラフィッシュ、フグ、ニワトリ、オランウータン、及びゴリラＦＶＩＩポリペプチド由来のＦＶＩＩポリペプチドを含めた非ヒトポリペプチドが挙げられ、それらの配列は、それぞれ、配列番号４〜１７に示されている。ＦＶＩＩポリペプチドにおける改変は、ポリペプチドの一次配列の改変及び一次配列に存在しない改変を含めた、当技術分野で記載されたものなどの他の改変も含有するＦＶＩＩポリペプチドに行うことができる。
ＦＶＩＩポリペプチドの改変にはまた、異なるＦＶＩＩポリペプチドのハイブリッドであるポリペプチドの改変、及び既知のポリペプチドの配列に基づいて、組換えで調製された、又は当技術分野において知られた他の方法によって合成若しくは構築された合成ＦＶＩＩポリペプチドの改変も挙げられる。例えば、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）又は第Ｘ因子（ＦＸ）などの他の凝固因子ファミリーメンバーとのＦＶＩＩのアラインメントに基づいて、ファミリーメンバー間の相同ドメインは容易に同定される。対応するファミリーメンバーのアミノ酸配列を用いてＦＶＩＩアミノ酸配列において１個若しくは複数のアミノ酸又はドメイン全体が交換されているＦＶＩＩポリペプチドのキメラ変異体を、構築することができる。さらに、キメラＦＶＩＩポリペプチドには、異なる種のアミノ酸配列を用いてヒトＦＶＩＩアミノ酸配列において１個若しくは複数のアミノ酸又はドメイン全体が交換されているものが挙げられる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、（２００５）Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ３：１２５０〜６参照）。そのようなキメラタンパク質は、本明細書における出発の非改変ＦＶＩＩポリペプチドとして用いることができる。
出発の非改変参照ポリペプチドの本明細書で提供される改変には、アミノ酸交換若しくは置換、アミノ酸の付加若しくは欠失、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドには、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、３０個、４０個、５０個、又はそれ以上の改変位置を有するものが挙げられる。出発の参照ＦＶＩＩポリペプチドと比較して２個以上の改変を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドもまた本明細書で提供される。改変ＦＶＩＩポリペプチドには、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、３０個、４０個、５０個、又はそれ以上の改変位置を有するものが挙げられる。本明細書で提供される任意の改変は、結果として生じた改変ＦＶＩＩポリペプチドが、それの二本鎖型又は活性化型であるとき凝固活性の増大を示す限り、当業者に知られた任意の他の改変と組み合わせることができる。典型的には、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、凝固活性の増大を示す。改変の結果として変化し得る活性又は性質には、それだけに限らないが、凝固若しくは凝固活性；凝固促進活性；第Ｘ因子（ＦＸ）活性化若しくは第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性化をもたらし得るなどのタンパク分解活性若しくは触媒活性；抗原性（抗ＦＶＩＩ抗体への結合に関してポリペプチドに結合する、又はポリペプチドと競合する能力）；組織因子、組織因子阻害因子（ＴＦＰＩ）、アンチトロンビンＩＩＩ、第Ｘ因子、若しくは第ＩＸ因子を結合する能力；活性化血小板の表面への能力；リン脂質に結合する能力；血中半減期；三次元構造；ｐＩ；及び／又は高次構造が挙げられる。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドの中には、組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）に対する抵抗性が増大しているもの、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）に対する抵抗性が増大しているもの、ＴＦの存在下及び／又は不在下において触媒活性が増大しているもの、血中半減期の増大など薬物動態学的性質が向上しているもの、固有活性が増大しているもの、並びに／又は活性化血小板への親和性及び／若しくは結合が増大しているものが含まれる。
いくつかの例では、改変は、ＦＶＩＩポリペプチドの２つ以上の性質又は活性に影響を及ぼすことができる。例えば、改変は、結果として、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、改変ＦＶＩＩポリペプチドのＴＦＰＩ抵抗性の増大及び触媒活性の増大を生じることができる。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、各性質及び活性についてアッセイして、改変の効果の範囲を同定することができる。そのようなアッセイは当技術分野において知られており、下記に記載されている。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドにはまた、細胞機構によってさらに改変されているＦＶＩＩポリペプチドも挙げられ、例えば、グリコシル化ポリペプチド、γ−カルボキシル化ポリペプチド、及びβ−ヒドロキシル化ポリペプチドが挙げられる。
ＦＶＩＩポリペプチドへの本明細書で提供される改変は、ＴＦＰＩ抵抗性を増大させ、ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性を増大させ、血中半減期を増大させるなどの薬物動態学的性質を向上させ、ＴＦの存在下及び／若しくは不在下において触媒活性を増大させ、並びに／又は活性化血小板への親和性及び／若しくは結合を増大させるために行われる。例えば、ＦＶＩＩポリペプチドは、ＴＦＰＩ抵抗性及び血小板への結合の１つ又は両方を増大させる改変（複数可）を含むことができる。他の例では、本明細書で提供される任意の改変は、その結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドが、それの二本鎖型であるとき凝固活性の増大を示す限り、当業者に知られた任意の他の改変と組み合わせることができる。典型的には、そのような凝固活性の増大は、ＴＦＰＩに対する抵抗性の増大、血中半減期の増大などの薬物動態学的性質の向上、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大、グリコシル化の変化、触媒活性の増大、並びに／又はリン脂質への結合及び／若しくは親和性の増大による。いくつかの例では、特定の活性又は性質を変化させるためにＦＶＩＩポリペプチドへ導入される改変はまた、又はそれよりむしろ、別の活性又は性質に影響を及ぼすことができる。したがって、本明細書で提供される改変は、それらが影響を及ぼすように設計されている性質又は活性、及び１つ又は複数の他の性質又は活性に影響を及ぼすことができる。例えば、ＴＦＰＩ抵抗性を増大させるためにＦＶＩＩポリペプチドに行われた改変はまた、血中半減期などの薬物動態学的性質を向上させることができる。いくつかの例では、単一アミノ酸置換などの単一改変は、ＦＶＩＩポリペプチドの２つ、３つ、４つ、又はそれ以上の性質又は活性を変化させる。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、各性質及び活性についてアッセイして、改変の効果の範囲を同定することができる。そのようなアッセイは当技術分野において知られており、下記に記載されている。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドにはまた、細胞機構によってさらに改変されているＦＶＩＩポリペプチドも挙げられ、例えば、グリコシル化ポリペプチド、γ−カルボキシル化ポリペプチド、及びβ−ヒドロキシル化ポリペプチドが挙げられる。
本明細書で提供される改変は、当業者にとって日常的であるような標準的な組換えＤＮＡ技術によって行うことができる。標的タンパク質において任意の１つ又は複数のアミノ酸の突然変異をもたらすための当技術分野において知られた任意の方法を用いることができる。方法には、（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅなどのキットのような、キットを用いる）コードする核酸分子の標準的な部位特異的突然変異誘発法、又は固相ポリペプチド合成方法によることが挙げられる。加えて、本明細書で提供される改変キメラタンパク質（即ち、Ｇｌａドメインのスワップ）は、日常的な組換えＤＮＡ技術により作製することができる。例えば、キメラポリペプチドは、所望のキメラポリペプチド構成要素の日常的なサブクローニングについての制限酵素及びクローニング方法を用いて作製することができる。
ポリペプチドの一次配列に存在する、又は存在しない他の改変もまた、改変ＦＶＩＩポリペプチド又はそのコンジュゲートに含めることができ、それらには、それだけに限らないが、糖部分の付加、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分の付加、Ｆｃドメインの付加などが挙げられる。例えば、そのような追加の改変は、タンパク質の安定性又は半減期を増大させるために行うことができる。
その結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドには、一本鎖酵素原若しくは活性ポリペプチドであるもの、又は一本鎖若しくは二本鎖酵素原様ポリペプチドであるものが挙げられる。例えば、一本鎖酵素原ポリペプチドである、本明細書で提供される任意の改変ポリペプチドは、自己活性化し、又は他の凝固因子によって活性化されて、二本鎖型である改変ＦＶＩＩ（即ち、ＦＶＩＩａ）を生じることができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性は、典型的には、それの二本鎖型において示される。
本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＴＦＰＩ抵抗性の増大、ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性の増大、ＴＦの存在下及び／若しくは不在下における触媒活性の増大、血中半減期の増大などの薬物動態学的性質の向上、並びに／又はリン脂質への結合及び／若しくは親和性の増大を示すことができる。典型的には、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドのそのような性質及び／又は活性は、それだけに限らないが、ＴＦへの結合並びに／又はＦＸの結合及び活性化などの他のＦＶＩＩ活性又は性質を保持しながら、生じる。したがって、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩポリペプチドの野生型又は出発型と比較して、ＴＦ結合並びに／又はＦＸ結合及び活性化を保持する。典型的には、そのような活性は、野生型又は出発タンパク質と比較して実質的に変化していない（１％、５％、１０％、２０％、又は３０％未満変化している）。他の例では、改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性は、野生型又は出発ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、増大又は低下している。活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏで評価することができ、例えば、成熟の野生型天然ＦＶＩＩポリペプチド（配列番号３）、野生型前駆ＦＶＩＩポリペプチド（配列番号１又は２）、又は出発物質として用いられる当業者に知られた任意の他のＦＶＩＩペプチドなどの非改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性と比較することができる。
したがって、本明細書で提供される改変によって、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＴＦ依存性及び／又はＴＦ非依存性様式で凝固活性の増大を示すことができる。典型的には、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性の増大は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで適切なアッセイにおいて、又はヒト若しくは非ヒト対象などの対象への投与後などｉｎ ｖｉｖｏで観察することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性の増大は、出発又は非改変ＦＶＩＩａポリペプチドの活性と比較して、少なくとも又は約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、又はそれ以上増強することができる。
１．阻害因子に対する抵抗性の増大
ほとんどの生命システムと同様に、凝固カスケードは、ポジティブ及びネガティブ機構によって制御される。これらの機構はしばしば、直接的か又は間接的かのいずれかで、カスケードに関与する１つ又は複数の因子の活性を阻害又は増強することによって作用する。したがって、それらの活性をネガティブに制御する阻害機構に対して抵抗性である治療的凝固因子を対象とする。特に、通常ＦＶＩＩ活性を阻害する阻害分子に対して抵抗性である改変ＦＶＩＩポリペプチドを対象とする。ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体の主要な制御因子は組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）である。また、ＦＶＩＩａ活性に対して阻害性であるのは、より少ない程度ではあるが、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）である。
ａ．ＴＦＰＩ
組織因子経路阻害因子は、染色体２ｑ３１〜ｑ３２．１に位置する９個のエクソンによってコードされる一本鎖ポリペプチドである。ＴＦＰＩ（ＴＦＰＩ−１とも呼ばれる）は、主として内皮細胞によって合成されるクニッツ型阻害因子であり、負荷電アミノ末端領域、３つの直列クニッツ型阻害因子ドメイン、及び高塩基性カルボキシル末端部を含有する（Ｗｕｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６００１（１９８８））。選択的ｍＲＮＡスプライシングによって、以下の２つの異なる型のＴＦＰＩが生じる：ＴＦＰＩα及びＴＦＰＩβ。ＴＦＰＩαは、およそ４６ｋＤａの分子量を有する分泌タンパク質である。前駆ポリペプチドは、長さが３０４個のアミノ酸であり（配列番号１０１）、２８個のアミノ酸のシグナルペプチドの切断によってプロセシングされ、２７６個のアミノ酸の成熟糖タンパク質（配列番号１０２）の分泌を生じる。成熟タンパク質は、１８個のシステイン残基を含有し、正しく折り畳まれる場合、９つのジスルフィド架橋を形成する。一次配列はまた、３つのＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ Ｎ−結合型グリコシル化共通部位を含有し、アスパラギン残基は位置１４５、１９５、及び２５６に位置する。クニッツ−１及びクニッツ−２ドメインは、それぞれ、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体及びＦＸａの結合及び阻害に関与する（例えば、図４参照）。プロテイナーゼ阻害活性を欠く、ＴＦＰＩαのクニッツ−３ドメイン、及びＴＦＰＩαのＣ末端は、その細胞表面局在性に関与することが示されている（Ｐｉｒｏら、（２００４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１０：３５６７〜３５７２）。
ＴＦＰＩβは、ＴＦＰＩαのクニッツ−３ドメイン及びＣ末端領域が、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの付着を方向付ける無関係のＣ末端領域と交換されている、ＴＦＰＩの選択的スプライス型である。前駆ポリペプチド（配列番号１０３）は、２２３個のアミノ酸である成熟タンパク質（配列番号１０４）へプロセシングされる。タンパク質質量に基づいて、ＴＦＰＩβ（２８ｋＤａ）は、ＴＦＰＩα（３６ｋＤａ）よりかなり小さい。どちらもドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上を同じ見かけの分子量（４６ｋＤａ）で移動し、翻訳後修飾の相違を示唆する。ＴＦＰＩα及びβは、ＧＰＩ依存性様式で細胞表面に結合している。ＴＦＰＩβは、そのＣ末端にＧＰＩアンカーを含有するが、ＴＦＰＩαは、まだ同定されていないＧＰＩ結合型タンパク質（複数可）に明らかに結合している。ＴＦＰＩβは総表面−ＴＦＰＩの２０％に相当するだけだが、それは、抗ＴＦ／ＦＶＩＩａ活性の大部分を占め、ＦＸａの結合及びクリアランスなどの細胞表面ＴＦＰＩαの潜在的な代替的役割を示唆する（Ｐｉｒｏら、（２００５）Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ３：２６７７〜２６８３）。
ＴＦＰＩは、ＦＸａの活性部位に結合することによる方法、及びＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体を不活性化することによる方法の少なくとも２つの方法で、凝固カスケードを阻害する（例えば、図４参照）。第１のクニッツドメインはＦＶＩＩａを結合し、第２ドメインはＦＸａを結合する（Ｇｉｒａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３８：５１８〜５２０）。遊離ＴＦＰＩは、それのＦＸａの結合と比較して非常にゆっくりＦＶＩＩａを結合する。しかしながら、一旦ＦＸａに結合したならば、ＴＦＰＩ／ＦＸａ複合体は、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体への強い親和性を示す。それらの相互作用は、結果として、内皮細胞表面でのヘテロテトラマーの複合体の形成を生じ、その複合体中でＦＶＩＩａは触媒的に不活性である（図４）。したがって、この四次構造はＴＦ／ＦＶＩＩａの凝固カスケード開始を妨げる。
ＴＦＰＩの少なくとも１つの他の相同体、ＴＦＰＩ−２は、ヒトに存在し、胎盤タンパク質５（ＰＰ５）及びマトリックス会合型セリンプロテアーゼ阻害因子（ＭＳＰＩ）とも呼ばれている。ＴＦＰＩ−２は、トリプシン、プラスミン、キモトリプシン、カテプシンＧ、血漿カリクレイン、及び第ＶＩＩａ因子−組織因子複合体を含めた広範囲のプロテイナーゼに対して阻害活性を示す、３２ｋＤａマトリックス会合型クニッツ型セリンプロテイナーゼ阻害因子である。２１３個のアミノ酸の成熟ＴＦＰＩ−２タンパク質（配列番号１０５）は、ＴＦＰＩクニッツ型ドメイン１、ドメイン２、及びドメイン３と、それぞれ、４３％、３５％、及び５３％一次配列同一性を示す３つのクニッツ型ドメインを含有する。ヒトＴＦＰＩ−２の第１のクニッツ型ドメインは、セリンプロテアーゼの阻害のためのすべての構造要素を含有するが、動態研究及び分子研究により、ＴＦＰＩ−２は、ＴＦ／ＦＶＩＩａを含めたいくつかの他のセリンプロテイナーゼよりプラスミンのより有効な阻害因子であることが示されている（Ｃｈａｎｄら、（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：１７５００〜１７５０７）。それは、細胞外マトリックス消化及びリモデリングの制御に重要な役割を果たすと考えられている。この関連において、ＴＦＰＩ−２の合成の低減は、炎症、血管新生、アテローム性動脈硬化、網膜変性症、及び腫瘍増殖／転移などの多数の病態生理学的過程に関連している（Ｃｈａｎｄら、（２００５）Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ９４：１１２２〜３０）。したがって、ＴＦＰＩと相同ではあるが、ＴＦＰＩ−２は、凝固経路における重要な因子であるとは考えられない。ＴＦＰＩ−１及びＴＦＰＩ−２のクニッツ−１ドメイン配列の配列アラインメントは、図６ｂに示されている。
ウサギモデルにおけるＴＦＰＩの免疫除去は凝固を増強し（Ｗａｒｎ−Ｃｒａｍｅｒら、（１９９３）Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ Ｔｈｒｏｍｂ １３：１５５１〜１５５７、Ｒａｇｎｉら、（２０００）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２：１１３〜１１７）、ＴＦ／ＦＶＩＩａ−ＴＦＰＩ／ＦＸａ四量体複合体の形成の崩壊が、ＴＦ／ＦＶＩＩａの凝固開始のネガティブ制御を阻害できることを示した。さらに、ＦＶＩＩａのＴＦＰＩとの相互作用の崩壊は、ＦＶＩＩａのクリアランスを低下させることができる。クリアランスの低下は、半減期の増大として現れ得る。また、細胞表面ＴＦに結合したＦＶＩＩａは、内部に取り入れられ、細胞表面上のそのＴＦを枯渇させることなく分解され得る。この内部移行及び分解の型は、細胞表面ＴＦ／ＦＶＩＩａと四量体複合体を形成するＴＦＰＩ／ＦＸａの存在下で有意に増大する。結合に続く内部移行及び分解は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）依存性被覆ピット経路を通して媒介される（Ｉａｋｈｉａｅｖら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４：３６９９５〜３７００３）。ＴＦＰＩはまた、肝臓又は腎臓クリアランス機構などの他の機構を通してＦＶＩＩａクリアランスを媒介するのを助けることができる。
ＴＦＰＩに対する抵抗性の増大をもたらすための改変
ＴＦＰＩに対する抵抗性の増大を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドが本明細書で提供される。そのようなＴＦＰＩに対する抵抗性は、例えば、ＴＦＰＩとの相互作用及び結合に関与するＦＶＩＩにおける１つ又は複数の残基を突然変異させて、そのような結合を低減又は阻止し、それにより、改変ＦＶＩＩポリペプチドを、凝固開始に関するＴＦＰＩの自然の阻害効果に対して抵抗性にすることにより達成することができる。適切なｉｎ ｖｉｔｒｏのアッセイにおいて、又は凝固促進治療薬としての対象への投与後などのｉｎ ｖｉｖｏで評価される場合、改変ＴＦＰＩ抵抗性ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して凝固活性の増大を示すことができる。ＴＦＰＩ抵抗性の増大を示すＦＶＩＩａ突然変異体の中には、半減期が増大している突然変異体がある。例えば、実施例９に記載された突然変異体は、半減期の増大を示す。
ＦＶＩＩ／ＴＦＰＩ接触残基又は、その相互作用界面に極めて近くの残基において１つ又は複数の突然変異を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが本明細書で提供される。そのような接触残基には、位置１９６のアスパラギン酸残基（Ｄ１９６、Ａｓｐ１９６）、位置１９７のリシン残基（Ｋ１９７、Ｌｙｓ１９７）、位置１９９のリシン残基（Ｋ１９９、Ｌｙｓ１９９）、位置２３９のスレオニン残基（Ｔ２３９、Ｔｈｒ２３９）、位置２９０のアルギニン残基（Ｒ２９０、Ａｒｇ２９０）、及び位置３４１のリシン残基（Ｋ３４１、Ｌｙｓ３４１）が挙げられ、これらは、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置に関する番号付けによる。キモトリプシン番号付けを用いて同定される場合、これらの残基は、Ｄ６０、Ｋ６０ａ、Ｋ６０ｃ、Ｔ９９、Ｒ１４７、及びＫ１９２に対応する（図７）。ＦＶＩＩ／ＴＦＰＩ界面の極めて近くにあり、且つ立体障害を引き起こすように改変することができる残基は、成熟ＦＶＩＩ番号付けによる位置２３７のグリシン残基（Ｇ２３７、Ｇｌｙ２３７）であり、キモトリプシン番号付けによるＧ９７（Ｇｌｙ９７）に対応する。
同定された残基は、アミノ酸交換、欠失、又は置換などによって改変することができる。或いは、アミノ酸挿入を用いて、標的アミノ酸残基の高次構造又は標的アミノ酸残基の近くのタンパク質構造を変化させることができる。例えば、ＦＶＩＩとＴＦＰＩの間の相互作用を乱して、その２つのタンパク質の効率的な結合を阻害するために、同定された残基を別のアミノ酸と交換又は置換し、それによってＴＦＰＩ抵抗性改変ＦＶＩＩポリペプチドを生成することができる。例えば、ＦＶＩＩとＴＦＰＩの相互作用を立体的に邪魔するアミノ酸の置換が企図される（即ち、Ｇｌｙ２３７（Ｇｌｙ９７）の別のより大きいアミノ酸での置換）。他の実施形態では、電荷反転又は電荷中和が同定された位置で達成されるように接触残基を代替のアミノ酸と交換することにより、ＴＦＰＩ抵抗性改変ＦＶＩＩポリペプチドを生成することができる。これらの突然変異の型は、置換されたＦＶＩＩアミノ酸の静電気的寄与に有意に影響を及ぼし、対応するＴＦＰＩ接触残基（複数可）との接触残基の正常な相互作用を乱すことができる。例えば、通常、ＴＦＰＩにおける正荷電アルギニン残基と有利に相互作用するＦＶＩＩにおける負荷電アスパラギン酸残基を、正荷電リシンと交換して、本来の有利な静電気的相互作用を排除するだけでなく、その残基間に反発力を生じ、且つそのタンパク質の効率的結合に干渉することができる。したがって、この突然変異は、そのタンパク質の効率的結合に干渉する。したがって、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）又はグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）などの負荷電アミノ酸（即ち、酸性アミノ酸）は、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）などの正荷電アミノ酸（即ち、塩基性アミノ酸）と置換することができる。逆に、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、又はヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）などの塩基性アミノ酸は、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）又はグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）などの酸性アミノ酸と置換することができる。また、任意の接触残基は、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、又はロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、又はグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、及びシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）などの中性アミノ酸と置換することができる。例示的な中性アミノ酸は、疎水性アミノ酸であり、それらには、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、及びチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、成熟ＦＶＩＩ番号付けによる位置２３７のグリシンは、新しいアミノ酸が立体障害を引き起こして、ＦＶＩＩとＴＦＰＩの間の相互作用を阻害するように交換されている。グリシンは、その側鎖にたった１個の水素原子を含有する、アミノ酸の中で最も小さく、且つ最も単純なものである。その小さなサイズのおかげで、グリシンは、狭い空間に収まることができ、他のアミノ酸ができない特別の高次構造をとることができる。位置２３７のグリシンの、より大きな側鎖を有するアミノ酸での置換は、ＦＶＩＩタンパク質における他のアミノ酸との立体障害を引き起こし、それにより、ＴＦＰＩ結合界面の高次構造を変化させることができ、及び／又はＴＦＰＩタンパク質におけるアミノ酸との立体障害を引き起こすことができる。どちらの状況も、結果として、ＦＶＩＩとＴＦＰＩの相互作用及び結合の障害を生じ、それにより、改変ＦＶＩＩポリペプチドのＴＦＰＩの阻害効果に対する抵抗性を増大させ得る。１９個の天然アミノ酸のいずれもグリシンより大きい側鎖を含有し、ＦＶＩＩポリペプチドを改変するために用いることができる。これらの例示的なものは、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、及びスレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）である。
他の例では、アミノ酸挿入が、ＴＦＰＩとＦＶＩＩの間の相互作用に干渉するために同定された残基の近くのＦＶＩＩポリペプチドへ組み入れられる。ＦＶＩＩポリペプチドにおける１つ又は複数の位置に１つ又は複数のアミノ酸残基を挿入することができる。例えば、チロシン残基を、Ｄ１９６とＫ１９７（キモトリプシン番号付けにより、それぞれ、Ｄ６０及びＫ６０ａに対応する）の間に挿入することができる。この改変は、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＹである（即ち、Ｄ１９６及びＫ１９７は、それらの間にチロシンが挿入されている（ｉｎｓＹ）位置である）。別の例では、２個のアミノ酸残基が、ＴＦＰＩとの相互作用に重要であると同定された位置に挿入されている。例えば、アラニン及びセリンを、Ｇ２３７とＴ２３８（キモトリプシン番号付けにより、それぞれ、Ｇ９７とＴ９８に対応する）の間に挿入することができ、結果として、改変Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡＳを生じる。そのような挿入突然変異は、結果として、ＦＶＩＩとＴＦＰＩの相互作用及び結合の障害を生じ、それにより、改変ＦＶＩＩポリペプチドのＴＦＰＩの阻害効果に対する抵抗性を増大させ得る。
表５は、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置に対応する、同定された残基における例示的なアミノ酸交換の非限定的な例を提供する。述べたように、そのようなＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩ／ＴＦＰＩ結合を阻害することによりＴＦＰＩに対する抵抗性を増大させるように設計されており、したがって、凝固活性が増大している。そのような突然変異に関して、１番目のアミノ酸（一文字略名）は、交換されるアミノ酸に対応し、その数値は、配列番号３に準拠した成熟ＦＶＩＩポリペプチド配列における位置に対応し、２番目のアミノ酸（一文字略名）は、その位置における１番目のアミノ酸に取って代わる、選択されたアミノ酸に対応する。突然変異についてのアミノ酸位置はまた、キモトリプシン番号付けスキームによっても参照される。下の表５において、改変ＦＶＩＩポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が示されている配列識別名（配列番号）、及び任意のポリペプチド識別番号も特定されている。
Figure 2014042523
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さらなる実施形態では、組合せ突然変異体を作製することができる。そのような組合せ突然変異体の中には、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩの番号付けに基づいて、残基Ｄ１９６、Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｇ２３７、Ｔ２３９、Ｒ２９０、又はＫ３４１（キモトリプシン番号付けに基づいて、それぞれ、Ｄ６０、Ｋ６０ａ、Ｋ６０ｃ、Ｇ９７、Ｔ９９、Ｒ１４７、及びＫ１９２に対応する）の２つ以上の突然変異を有するものが含まれる。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、同定された位置のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つにおいてアミノ酸置換を有することができる。上記に述べたように、もう１つの位置において、ＦＶＩＩａとＴＦＰＩの間の有利な相互作用が排除され、且つ不利な相互作用が導入され、又は立体障害が導入されるように、残基が交換されている。したがって、改変ポリペプチドは、立体障害、電荷反転、電荷中和、若しくは他の不利な相互作用、又はそれらの組合せのうちの１つ又は複数を提供する１個、２個、３個、４個、５個、６個、又は７個の突然変異を示すことができる。例えば、２個以上の突然変異を行うことができ、それによって、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）又はグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）などの負荷電アミノ酸を、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、若しくはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）などの正荷電アミノ酸で置換することができ、又は逆も同様であり、又は任意のアミノ酸の、例えば、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、若しくはロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、バリン、（Ｖａｌ、Ｖ）フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、若しくはグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｕ、Ｑ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、及びシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、若しくはそれらの任意の組合せとの交換による中性置換を行うことができる。例示的な中性アミノ酸は、疎水性アミノ酸であり、それらには、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、及びチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）が挙げられる。別の例では、２つ以上の突然変異を行うことができ、少なくとも１つは電荷反転又は電荷中和であり、もう１つが、グリシンをトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、及びスレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）などのより大きい側鎖を含有するアミノ酸と交換する置換である。他の例では、挿入突然変異を、他の挿入突然変異と、又はＦＶＩＩとＴＦＰＩの間に不利な相互作用若しくは立体障害を導入するアミノ酸置換などの１つ若しくは複数のアミノ酸置換と共に、改変ＦＶＩＩポリペプチドに含むことができる。組合せの任意の順列を、上の表５に示す改変を用いて改変ＦＶＩＩポリペプチドに含むことができる。例えば、本明細書で提供されるＦＶＩＩポリペプチドは、Ｄ１９６Ｋ、並びに、アミノ酸位置Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｇ２３７、Ｔ２３９、Ｒ２９０、及び／又はＫ３４１における１つ又は複数の追加の交換改変、並びに／又はＤ１９６、Ｋ１９７、及び／又はＧ２３７の後への挿入を含有することができる。当業者は、表５に示す改変を用いてすべての可能な組合せを容易に作製することができる。
例えば、ＦＶＩＩ変異体には、それらの突然変異の１つとして、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩの番号付けに基づいて、位置１９７におけるアミノ酸置換を含むものが挙げられる。非改変ＦＶＩＩポリペプチドにおいて位置１９７を占めるリシン残基に対して任意のアミノ酸残基が置換することができる。いくつかの実施形態では、リシンが、チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン酸（Ｄ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）、又はトリプトファン（Ｗ）残基に交換される。例えば、例示的な改変ＦＶＩＩポリペプチドは、置換Ｋ１９７Ｌ又はＫ１９７Ｅを含有するものである。別の例では、位置１９７に改変（交換、欠失、又は付加など）を含有するＦＶＩＩポリペプチドはまた、別の位置に別の改変を含むことができる。一般的に、そのような他の改変は、有利な相互作用を除去すること、不利な相互作用を生じさせること、立体障害を導入すること、又はそれらの組合せなどによりＦＶＩＩのＴＦＰＩとの相互作用を調節することが企図される位置にある。そのような追加の改変の中には、上記のようなＤ１９６、Ｋ１９９、Ｇ２３７、Ｔ２３９、Ｒ２９０、又はＫ３４１に対応するアミノ酸位置における改変が含まれる。下記のような当技術分野において知られた他の追加の改変もまた企図される。したがって、位置１９７における改変に加えて、ＦＶＩＩポリペプチドは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上のアミノ酸改変を含有することができる。例えば、少なくとも位置１９７における改変を有する例示的なＦＶＩＩ変異体には、Ｄ１９６Ｆ及びＫ１９７Ｅなどの２つの置換を含有するもの、Ｄ１９６Ｒ、Ｋ１９７Ｍ、及びＫ１９９Ｅにおけるものなどの３つの置換を含有するもの、Ｄ１９６Ｒ、Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９９Ｅ、及びＲ２９０Ｅなどの４つの置換を含有するもの、Ｋ１９７Ｌ、Ｋ１９９Ｄ、Ｇ２３７Ｔ、Ｒ２９０Ｄ、及びＫ３４１Ｑなどの５つの置換を含有するもの、Ｄ１９６Ｆ、Ｋ１９７Ｌ、Ｋ１９９Ｅ、Ｇ２３７Ｖ、Ｔ２３９Ａ、及びＲ２９０Ｄなどの６つの置換を含有するもの、並びにＤ１９６Ｙ、Ｋ１９７Ｌ、Ｋ１９９Ａ、Ｇ２３７Ｔ、Ｔ２３９Ａ、Ｒ２９０Ｄ、及びＫ３４１Ｒなどの７つの置換を含有するものが挙げられる。それらの突然変異の１つとして、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩの番号付けに基づいて、位置１９７におけるアミノ酸置換を含む例示的なＦＶＩＩ組合せ突然変異体は、表６に挙げられている。
配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置に対応するＤ１９６、Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｇ２３７、Ｔ２３９、Ｒ２９０、又はＫ３４１のうちの１個又は複数のアミノ酸残基において２つ以上のアミノ酸交換を含有する例示的なＦＶＩＩポリペプチドは、表６に提供されているものである。その表において、突然変異についてのアミノ酸位置はまた、キモトリプシン番号付けスキームによっても呼ばれている。そのような改変は、ＦＶＩＩのＴＦＰＩへの結合を阻害することによりＴＦＰＩに対する抵抗性を増大させ、したがって、凝固活性を増大させるように設計される。
Figure 2014042523
上記で同定された残基において１つ又は複数のアミノ酸置換を含有するＦＶＩＩポリペプチドはまた、国際公開第２００４／０８３３６１号パンフレット、Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒら、（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：８７０１〜８７０７、Ｃｈａｎｇら、（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１０９４０〜１０９４８、及びＩａｋｈｉａｅｖら、（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８５：４５８〜４６３に記載されたものなどの追加の突然変異を含有することができる。したがって、一実施形態では、本明細書で提供されるＦＶＩＩポリペプチドは、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置に対応するＱ１７６、Ｄ１９６、Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｇ２３７、Ｔ２３９、Ｒ２９０、Ｅ２９６、Ｋ３４１、及びＱ３６６のうちの１つ又は複数のアミノ酸残基において１つ又は複数のアミノ酸置換を含有することができる。例えば、１つ又は複数の追加の突然変異は、それだけに限らないが、Ｑ１７６Ａ、Ｄ１９６Ｎ、Ｇ２３７Ｌ、Ｅ２９６Ａ、Ｋ３４１Ｎ、Ｋ３４１Ｑ、Ｋ３４１Ｅ、Ｑ３６６Ａ、Ｑ３６６Ｅ、及びＱ３６６Ｇのうちの任意の１つ又は複数を含むことができる。
ｂ．アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）
アンチトロンビンＩＩＩ（アンチトロンビン又はＡＴ−ＩＩＩとしても知られている）は重要な抗凝固セルピン（セリンプロテアーゼ阻害因子）である。ＡＴ−ＩＩＩは、４６４個のアミノ酸残基を含有する前駆タンパク質（配列番号１２２）として合成される。分泌の過程において、３２残基のシグナルペプチドが切断されて、４３２個のアミノ酸の成熟ヒトアンチトロンビン（配列番号１２３）を生じる。５８ｋＤａ ＡＴ−ＩＩＩ糖タンパク質は、血液中を循環し、セリンプロテアーゼ阻害因子（セルピン）として、凝固系の多数のセリンプロテアーゼを阻害するように機能する。ＡＴ−ＩＩＩの主要な標的は、トロンビン及び第Ｘａ因子であるが、ＡＴ−ＩＩＩはまた、ＦＩＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、及びより少ない程度で、ＦＶＩＩａの活性を阻害することが示されている。ＡＴ−ＩＩＩの作用は、天然に存在するヘパラン硫酸、又は臨床診療で抗凝固薬として広く用いられている様々な組織由来ヘパリンなどのグリコサミノグリカンによって大いに増強される。ＡＴ−ＩＩＩは、反応中心ループに高次構造変化を引き起こす、ヘパリンにおける独特の五糖配列に非常に特異的な様式で、結合する。そのような高次構造において、ＡＴ−ＩＩＩの反応中心ループは、セリンプロテアーゼの反応部位とより効率的に相互作用し、阻害をもたらすことができる。
ＡＴ−ＩＩＩは、ヘパリンの存在下でも、遊離血漿ＦＶＩＩａに対して通常には阻害性ではなく、それは、ＡＴ−ＩＩＩとの効率的な相互作用を妨げるＦＶＩＩａの酵素原様高次構造のためである可能性が高い。しかしながら、一旦ＦＶＩＩａがＴＦと複合体を形成すれば、ＡＴ−ＩＩＩの阻害効果は増大する。ＡＴ−ＩＩＩのＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体への結合は、ＦＶＩＩａをＴＦから遊離させ、それをＡＴ−ＩＩＩとの不活性複合体として維持することができる。ＦＶＩＩａ単独と比較してのＴＦ結合型ＦＶＩＩａへのＡＴ−ＩＩＩの親和性の増大は、おそらく、ＴＦと複合体を形成したときのＦＶＩＩａの活性部位の成熟を反映しており、したがって、それによりＡＴ−ＩＩＩ結合が受け入れられている（Ｒａｏら、（１９９３）Ｂｌｏｏｄ ８１：２６００〜２６０７）。したがって、ＡＴ−ＩＩＩのＦＶＩＩａへの影響は、ＦＶＩＩａ分子自体の固有活性に比例する。ＦＶＩＩａはそれの酵素原様高次構造を保持する間、ＡＴ−ＩＩＩはほとんど効果を及ぼさない。しかしながら、ＦＶＩＩａが、ＴＦを結合すること、又は特定のｉｎ ｖｉｔｒｏ改変などによって、高次構造をより活性型へと変化させた場合には、ＡＴ−ＩＩＩ阻害は有意に増大する。固有活性が増大するように改変されているＦＶＩＩａポリペプチドは、しばしば、ＡＴ−ＩＩＩ阻害に対する感受性の同時的増大を示す。例えば、Ｋ３３７Ａ、Ｌ３０５Ｖ、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ、及びＥ２９６Ｖ置換（配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩ配列に関して）に対応するアミノ酸交換などによるＦＶＩＩａの活性化ポケットにおける１個又は複数のアミノ酸の改変は、結果として、ＡＴ−ＩＩＩに対するＦＶＩＩａポリペプチドの感受性の増大を生じ、それにより、ＦＶＩＩａ活性を最高９０％まで阻害する（Ｐｅｒｓｓｏｎら、（２００１）ＰＮＡＳ ９８：１３５８３〜１３５８８）。別の例では、ＦＶＩＩａのα−ヘリックスに関与するアミノ酸の改変によるより高い酵素原様の高次構造の導入もまた、改変ＦＶＩＩａタンパク質の活性を増加させると同時に、ＡＴ−ＩＩＩに対するその感受性を増大させる（Ｐｅｒｓｓｏｎら、（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３７９：４９７〜５０３）。
ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大をもたらすための改変
ＡＴ−ＩＩＩによる阻害に対する抵抗性を増大させる改変を、ＦＶＩＩポリペプチドに行うことができる。一般的に、そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を保持する。典型的には、そのような改変は、ＦＶＩＩａ（又はＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体）のＡＴ−ＩＩＩとの相互作用に直接関与するＦＶＩＩポリペプチドの任意の位置において、又はＦＶＩＩａ（又はＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体）とＡＴ−ＩＩＩの間の相互作用に直接関与する残基の位置又は高次構造に影響を及ぼす他の残基において、１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性が増大している改変ＦＶＩＩポリペプチドは、特定の条件下でのＡＴ−ＩＩＩによる阻害の程度において、又はＡＴ−ＩＩＩによる阻害についての二次速度定数において、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、非改変又は野生型ＦＶＩＩポリペプチドの阻害の程度、又は阻害についての二次速度定数と比較して少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、又はそれ以上、低減を示すことができる。したがって、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、凝固開始に関するＡＴ−ＩＩＩの自然の阻害効果に対して抵抗性である。適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｅｘ ｖｉｖｏのアッセイにおいて、又は凝固促進治療薬としての対象への投与後などのｉｎ ｖｉｖｏで評価される場合、改変ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して凝固活性の増大を示す。
本明細書の下で記載されているように、当業者は、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドを経験的に、又は合理的に設計することができる。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、当業者に知られたアッセイで試験して、そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドがＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大を示すかどうかを決定することができる。例えば、ＡＴ−ＩＩＩによる阻害の二次速度定数を、そのような改変ＦＶＩＩａポリペプチドについて測定することができる。一般的に、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性が増大している改変ＦＶＩＩポリペプチドは、特定の条件下（例えば、一定量のタンパク質の患者への注入後）での結合の低下、及び／又はＡＴ−ＩＩＩによる阻害の低下を示すであろう。典型的には、そのようなアッセイは、活性化型のＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）などの二本鎖型のＦＶＩＩで行われる。さらに、ＡＴ−ＩＩＩの効果を決定するアッセイは、一般的に、ヘパリンの存在及び組織因子の存在下で行われるが、そのようなアッセイは一方又は両方の補因子の不在下で行うこともできる。
ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性が増大している改変ＦＶＩＩポリペプチドは、特定の条件下でのＡＴ−ＩＩＩによる阻害の程度において、又はＡＴ−ＩＩＩによる阻害についての二次速度定数において、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、非改変又は野生型ＦＶＩＩポリペプチドの阻害の程度、又は阻害についての二次速度定数と比較して少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、又はそれ以上、低減を示すことができる。ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性が増大している、そのような得られた改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＡＴ−ＩＩＩへの結合及び／又は親和性において、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、非改変又は野生型ＦＶＩＩポリペプチドの結合及び／又は親和性と比較して少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、又はそれ以上、低減を示すことができる。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドによるＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大はまた、ＡＴ−ＩＩＩの存在下での凝固活性の増大として現れることができる。ＡＴ−ＩＩＩ−改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、非改変又は野生型ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性と比較して少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、又はそれ以上、増大することができる。
２．活性化血小板への結合
ＴＦ依存性及び／又はＴＦ非依存性凝固開始中の凝固活性を増大させる改変もまたＦＶＩＩポリペプチドに行うことができる。この提唱された、ＴＦ非依存性凝固開始の機構は、ＦＶＩＩａ（ＴＦとの複合体中ではない）によるＦＸ及びＦＩＸの直接的活性化に関わり、それは活性化血小板の表面上で実行される。ＦＶＩＩａは、ＦＶＩＩａポリペプチドのＧｌａドメインにおける残基と、血小板表面上に発現したホスファチジルセリン及び他の負荷電リン脂質との間の相互作用を通して活性化血小板を結合する。この相互作用は比較的弱く、凝固中に通常、観察される初期の大量のトロンビン生成には重要な役割を果たしていない可能性が高く、それはＴＦ依存性活性の結果である可能性が非常に高い。上記で論じるように、ＴＦ非依存性凝固開始及びＦＶＩＩａの血小板表面との比較的弱い相互作用が、臨床において効力を得るための高用量のｒＦＶＩＩａの投与の必要性の理由となり得る。例えば、血漿中１０ｎＭ ＦＶＩＩのたった約１％がＴＦ／ＦＶＩＩａとして存在するだけであるが、ｒＦＶＩＩａの治療量は、このレベルよりはるかに上の、９０μｇ／ｋｇ又は血漿中約５０ｎＭである。したがって、高用量のｒＦＶＩＩａが、活性化血小板へのｒＦＶＩＩａの低親和性結合を代償し、治療中、その治療薬の十分な凝固活性を生じる。したがって、凝固開始をもたらすのに十分な、活性化血小板への結合及び／又は親和性の増大によってより低用量で投与することができる改変ＦＶＩＩポリペプチドを治療の対象とする。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、Ｇｌａドメインの改変を通して活性化血小板への結合及び／又は親和性の増大を示すように設計されている。
ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、プロトロンビン、プロテインＣ、及びプロテインＳなどのビタミンＫ依存性血漿タンパク質のγ−カルボキシル化Ｇｌａドメインにおける残基と、膜表面上の負荷電リン脂質との相互作用は、止血にとって重要である。ビタミンＫ依存性血漿タンパク質のＧｌａドメインは、典型的には、約４５個のアミノ酸を含有し、そのうちの９〜１２個のグルタミン酸残基は、ビタミンＫ依存性カルボキシル化によって翻訳後修飾されて、γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）を形成する。Ｇｌａドメインを形成するアミノ酸は、そのタンパク質のシグナルペプチド及びプロペプチドを形成するもののすぐ後に位置し、したがって、前駆ポリペプチドの成熟タンパク質へのプロセシング及び切断後、Ｎ末端に位置する。例えば、ＦＶＩＩにおいてＧｌａドメインを形成するアミノ酸は、配列番号１に示す前駆ポリペプチドの位置３９〜８３、配列番号２に示す前駆ポリペプチドの位置６１〜１０５、及び配列番号３に示す成熟ポリペプチドの位置１〜４５にある。これらのうち、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドの位置Ｅ６、Ｅ７、Ｅ１４、Ｅ１９、Ｅ２０、Ｅ２５、Ｅ２６、Ｅ２９、及びＥ３５の１０個のグルタミン酸残基は、カルボキシル化によって修飾されて、γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）残基を生じる。
グルタミン酸はほんの弱いＣａ２＋キレート剤であり、γ−カルボキシグルタミン酸はよりずっと強いキレート剤であるため、ビタミンＫカルボキシラーゼによるこの修飾段階は、タンパク質のＧｌａドメインのＣａ２＋結合親和性を有意に増大させる。カルシウムはまた、ＦＶＩＩａのプロテアーゼドメインを結合し、そこで、それは、最適な活性に必要とされる高次構造変化を容易にする。ＦＶＩＩａのＧｌａドメイン及びプロテアーゼドメインの両方における部位への結合を通して、カルシウムは、ＴＦ及びリン脂質への結合、加えて、ＦＸの活性化のための触媒効力を増強する。γ−カルボキシル化Ｇｌａドメインは、７個のＣａ２＋イオンを可変親和性で結合し、ＧｌａドメインがＴＦのＣ末端ドメインと相互作用するのを可能にする高次構造変化を引き起こす。Ｃａ２＋結合はまた、ＦＶＩＩａの血小板膜上の負荷電リン脂質（その大部分はホスファチジルセリンである）との相互作用を促進する。ホスファチジルセリン（ＰＳ）は、血液凝固を支持する負荷電膜における重要な成分である。ほとんどの細胞において、ＰＳは、細胞膜の内層中に存在し、したがって、血漿に曝されない。血小板の活性化などの特定の細胞過程は、ＰＳの外側の血漿配向性表面への転位を生じ、ビタミンＫ依存性タンパク質のＧｌａドメインへの結合部位を提示する（Ｈｅｍｋｅｒら、（１９８３）Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ ９：３０３〜３１７）。
ＦＶＩＩａのＴＦ及び活性化血小板との相互作用におけるそれの関与に加えて、ＦＶＩＩａのＧｌａドメインはまた、ＦＸの結合及び活性化に結びつけられる。これは、間接的機構を通してであり得、それにおいて、ＦＶＩＩａ Ｇｌａドメインは、ＦＸのＦＸａへの活性化における重要な段階である、ＴＦのＬｙｓ１６５及びＬｙｓ１６６をＦＸのＧｌａドメインと整列させるのを助ける。或いは、ＦＶＩＩａのＧｌａドメインは、ＦＸのＧｌａドメインと直接相互作用して、活性化前にその酵素及び基質を正しく整列させる（Ｎｅｕｅｎｓｃｈｗａｎｄｅｒら、（１９９４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：８００７〜８０１３、Ｈｕａｎｇら、（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：２１７５２〜２１７５７）。ＦＶＩＩａの位置３６のアルギニンは、リン脂質の不在下においてＦＸ Ｇｌａドメインの有効なドッキングにとって重要であることが示されており、ＦＶＩＩａのＧｌａドメインがＦＸとのタンパク質−タンパク質相互作用に関与することを実証する（Ｒｕｆら、（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８：１９５７〜１９６６）。
異なるビタミンＫ依存性血漿タンパク質のＧｌａドメインは有意な相同性を示すが、それらは、負荷電リン脂質膜を非常に異なる親和性で結合し、解離定数（Ｋｄ）は１０００倍を超えるほど異なる。ヒトＦＶＩＩは、これらのタンパク質の中でリン脂質膜への最も低い親和性の１つを示す（ＭｃＤｏｎａｌｄら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：５１２０〜５１２７）。ＧｌａドメインのＰＳへの結合を担う正確な相互作用は完全には理解されていないが、このドメイン内の個々のアミノ酸残基が、観察される異なる親和性に寄与する可能性が高いように思われる。以前の研究は、位置１０、３２、及び３３（成熟ＦＶＩＩポリペプチドに関して）のアミノ酸と全体の膜親和性との間に相関があることを示した（ＭｃＤｏｎａｌｄら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：５１２０〜５１２７）。その後の突然変異分析もまた、特定の残基が結合親和性に寄与することを明らかにしている。例えば、成熟型プロテインＣの位置１０におけるヒスチジンのプロリンとの交換が結果として、膜親和性の３分の１への低下を生じた（Ｓｈｅｎら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１６０２５〜１６０３１）。逆に、ビタミンＫ依存性血漿タンパク質のＧｌａドメインにおける特定の残基の突然変異は、より高い膜親和性及び機能の増強を有するタンパク質を生じることができる。しかしながら、Ｇｌａドメイン内の特定の位置での突然変異の効果は、異なるタンパク質間で必ずしも保存されているわけではない。例えば、ウシプロテインＣのＱ３２Ｅ及びＮ３３Ｄの置換による突然変異は膜結合の大きな増大を媒介したが、ヒトプロテインＣにおいての対応する突然変異は、結合のわずかな変化を示した。ヒトＦＶＩＩの類似の突然変異（Ｋ３２Ｅ）は、野生型ＦＶＩＩタンパク質と比較して、結合親和性において１３倍の増大を生じた（Ｈａｒｖｅｙら、（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：８３６３〜８３６９）。
ａ．異種Ｇｌａドメインの導入による改変
改変ＦＶＩＩとリン脂質膜の間の相互作用を増強し、それにより凝固活性を増大させることを目的とする場合、活性化血小板へのそれの比較的低い結合親和性を理由に、ＦＶＩＩのＧｌａドメインが改変の標的となる。改変は、この相互作用に関与する特定のアミノ酸の置換によって実行することができる（例えば、Ｓｈａｈら、ＰＮＡＳ ９５：４４２９〜４２３４、Ｈａｒｖｅｙら、（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：８３６３〜８３６９参照）。或いは、改変は、Ｇｌａドメイン全体の別のビタミンＫ依存性タンパク質のＧｌａドメインでの置換、即ち、Ｇｌａドメインスワップによって実行することができる。この型の改変は、プロテインＣのＧｌａドメインがＦＶＩＩのＧｌａドメインと交換されたときに生じたものなどのキメラタンパク質を生じる（Ｇｅｎｇら、（１９９７）Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ７７：９２６〜９３３）。
典型的には、そのような改変には、キメラ改変ＦＶＩＩポリペプチドを生じるための、異種Ｇｌａドメイン、又はリン脂質結合をもたらすのに十分なその部分の付加又は置換などによるＦＶＩＩポリペプチドの領域への導入が挙げられる。一般的に、そのようなキメラＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩの少なくとも１つの活性を保持する。活性化血小板へのＧｌａ改変ＦＶＩＩポリペプチドの結合及び／又は親和性は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、非改変又は野生型ＦＶＩＩポリペプチドの結合及び／又は親和性と比較して少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、又はそれ以上、増大することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドによる活性化血小板への結合及び／又は親和性はまた、凝固活性の増大として現れることができる。Ｇｌａ改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性は、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、非改変又は野生型ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性と比較して少なくとも又は約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、又はそれ以上、増大することができる。
ＦＶＩＩポリペプチドの領域の導入又は交換のための異種Ｇｌａドメインの供給源として、任意のポリペプチド内に含有されるＧｌａドメイン又は十分なその部分を用いることができる。典型的には、そのような異種Ｇｌａドメインは、リン脂質、例えば、活性化血小板の表面上に存在するリン脂質に対して結合親和性を示す。一般的に、異種Ｇｌａドメインの選択は、ＦＶＩＩのＧｌａドメインの親和性と比較してリン脂質に対してより高い親和性を示すものである。ＦＶＩＩポリペプチドの改変のための異種ドメインとして用いられる正確なＧｌａドメイン又は十分なその部分は、合理的又は経験的に決定することができる。例示的な他のＧｌａ含有ポリペプチドには、それだけに限らないが、ＦＩＸ、ＦＸ、プロトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質、増殖停止特異的タンパク質６（Ｇａｓ６）、及びプロテインＺが挙げられる。これらの例示的なタンパク質のＧｌａドメインは、配列番号１１０〜１１８、１２０、及び１２１のいずれかに示されている。例えば、異種Ｇｌａドメインの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、２０個、３０個、４０個、若しくはそれ以上の連続したアミノ酸、又はＧｌａドメイン全体をＦＶＩＩポリペプチドへ導入することができる。さらに、ＧｌａドメインのＦＶＩＩポリペプチドへの導入はまた、追加のアミノ酸が、導入されたＧｌａドメインのリン脂質結合能力を有意に弱めない限り、異種ポリペプチドのＧｌａドメインの一部ではない追加のアミノ酸を含むことができる。
いくつかの例では、改変ＦＶＩＩポリペプチドがＦＶＩＩの少なくとも１つの活性を保持する限り、異種ＧｌａドメインがＦＶＩＩポリペプチドの内在性Ｇｌａドメインへ、又は別の領域若しくはドメインへ挿入されるように、ＧｌａドメインのＦＶＩＩポリペプチドへの付加により導入が行われる。そのような例では、ＦＶＩＩポリペプチドの天然Ｇｌａドメインは、ポリペプチド内に保持されるが、場合によっては、天然Ｇｌａドメインを構成するアミノ酸配列が中断される。他の例では、異種Ｇｌａドメイン又は十分なその部分は、天然Ｇｌａドメインが中断されないように、天然ＧｌａドメインのＮ末端又はＣ末端のいずれかで、隣接して挿入される。追加の例では、異種Ｇｌａドメイン又は十分なその部分は、ＦＶＩＩポリペプチドの別のドメインへ挿入される。
改変ＦＶＩＩポリペプチドがＦＶＩＩの少なくとも１つの活性を保持する限り、ＦＶＩＩの内在性Ｇｌａドメインの全部又は連続した部分が除去され、異種Ｇｌａドメイン又はリン脂質結合をもたらすのに十分なその部分と交換されている、改変ＧｌａドメインＦＶＩＩポリペプチドもまた本明細書で提供されている。そのような改変はまた、Ｇｌａドメインスワップと呼ばれる。例えば、配列番号３に示すアミノ酸配列のアミノ酸位置１〜４５に対応する配列番号１１９に示すものなどのＦＶＩＩのＧｌａドメインの全部又は部分を、ＦＶＩＩポリペプチドから除去し、異種Ｇｌａドメイン又は十分なその部分と交換することができる。異種部分は、リン脂質に結合する、当業者に知られた任意のＧｌａドメインを含み、それらには、それだけに限らないが、配列番号１１０〜１１８、１２０、及び１２１のいずれかに示すアミノ酸配列を有するＧｌａドメインが挙げられる。場合によっては、リン脂質結合をもたらすのに十分な、配列番号１１０〜１１８、１２０、及び１２１のいずれかの部分などのＧｌａドメインの十分な部分が、ＦＶＩＩの内在性Ｇｌａドメイン又は内在性Ｇｌａドメインの部分に取って代わることができる。例えば、ＦＶＩＩのＧｌａドメインは、配列番号１１３に示すプロテインＣのＧｌａドメインとスワップすることができる。その結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドは、プロテインＣ由来のＧｌａドメイン、続いて、それ自体のＥＧＦ−１、ＥＧＦ−２、及びセリンプロテアーゼドメインを含有する。
いくつかの例では、異種Ｇｌａドメインは、リン脂質結合の増大による、活性化血小板への結合の増大をさらにもたらす突然変異を含有する。例えば、プロテインＣ Ｇｌａドメインを導入して、改変ＦＶＩＩポリペプチドを作製した場合には、プロテインＣ Ｇｌａドメインは、リン脂質結合の増大を与えるアミノ酸突然変異を含有することができる。
他の例では、異種Ｇｌａドメインは、ＧｌａドメインにＦＶＩＩ様機能を与えるさらなる突然変異を含有することができる。例えば、上記に述べたように、配列番号１１９に示すＦＶＩＩ ＧｌａドメインのＲ３６は、ＦＸとの相互作用に関与することができる。したがって、異種Ｇｌａドメインは、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドの位置３６のアルギニンを維持するのに必要とされる任意の改変、又は改変ＦＶＩＩａポリペプチドのＦＸ活性化部分を維持するのに必要とされる任意の他の改変などのさらなる改変を含有することができる（Ｒｕｆら、（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３８：１９５７〜１９６６）。したがって、いくつかの例では、対応するＲ３６への突然変異を異種Ｇｌａドメインに行うことができる。対応する位置は、アミノ酸配列のアラインメントなどにより、当業者によって決定することができる。
本明細書の下で記載されているように、当業者は、結果として生じるＦＶＩＩポリペプチドが少なくとも１つのＦＶＩＩ活性を保持するように異種Ｇｌａドメインを含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドを経験的又は合理的に設計することができる。典型的には、そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＸを結合且つ活性化するそれらの能力を保持する。いくつかの例では、そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、ＦＩＸを結合且つ活性化するそれらの能力も保持する。結果として生じるＧｌａ改変ＦＶＩＩポリペプチドとしては、ＴＦに結合するそれらの能力を保持するものが挙げられる。Ｇｌａスワップされた改変ＦＶＩＩポリペプチドとしてはまた、ＴＦの不在下において固有活性が増加しているものも挙げられる。したがって、結果として生じるＧｌａ改変ＦＶＩＩポリペプチドには、野生型ＦＶＩＩａと比較して、ＴＦを結合しない、又はＴＦを弱く結合するものが挙げられる。典型的には、そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、リン脂質結合の増大を示す。特に、そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ホスファチジルセリンへの結合の増大を示す。リン脂質への結合の増大は、単離されたリン脂質上、又は活性化血小板の表面上でアッセイすることができる。そのようなアッセイは、典型的には、ＦＶＩＩの活性化型（ＦＶＩＩａ）などの二本鎖型のＦＶＩＩで行うことができる。
異種Ｇｌａドメインを含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが本明細書で提供されている。例示的なそのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、内在性Ｇｌａドメインが、ＦＩＸ（配列番号１１０）、ＦＸ（配列番号１１１）、トロンビン（配列番号１１２）、プロテインＣ（配列番号１１３）、又はプロテインＳ（配列番号１１４）のいずれか１つのＧｌａドメインの全部又は部分と交換されているものである。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化血小板への結合の増大を示し、その結果として、凝固活性の増大を生じることができる。表７は、内在性ＧｌａドメインをＦＩＸ、ＦＸ、プロテインＣ、プロテインＳ、又はトロンビンのドメインと交換するようにＦＶＩＩポリペプチドに行うことができる例示的な改変を示す。表は、改変の名前（例えば、ＧｌａスワップＦＸ）、並びに内在性ＧｌａドメインがＦＶＩＩポリペプチドに挿入されているアミノ酸位置、及び外来性Ｇｌａドメインの配列を含めた改変の詳細を提供する。改変ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が示されている配列識別名（配列番号）、及びまた任意のポリペプチド識別番号も提供されている。例えば、「ＧｌａスワップＦＩＸ」改変（Ａ１Ｙ４４ｄｅｌｉｎｓＹＮＳＧＫＬＥＥＦＶＱＧＮＬＥＲＥＣＭＥＥＫＣＳＦＥＥＡＲＥＶＦＥＮＴＥＲＴＴＥＦＷＫＱＹ）は、アミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）を除去することによる内在性ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインの欠失、及び配列番号１１０に示すＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸残基Ｙ１〜Ｙ４５に対応する４５個のアミノ酸残基の挿入を伴う。同様に、ＧｌａスワップＦＸ改変は、アミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）の欠失、及び配列番号１１１に示すＦＸ ＧｌａドメインのＡ１〜Ｙ４４に対応する４４個のアミノ酸残基の挿入を伴う。Ｇｌａスワップトロンビン改変は、アミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）の欠失、及び配列番号１１２に示すトロンビン Ｇｌａドメインのアミノ酸残基Ｙ１〜Ｙ４４に対応する４４個のアミノ酸残基の挿入を伴う。ＧｌａスワッププロテインＣ改変は、アミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）の欠失、及び配列番号１１３に示すプロテインＣ Ｇｌａドメインのアミノ酸残基Ａ１〜Ｈ４４に対応する４４個のアミノ酸残基の挿入を伴う。ＧｌａスワッププロテインＳ改変は、アミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）の欠失、及び配列番号１１４に示すプロテインＳ Ｇｌａドメインのアミノ酸残基Ｙ１〜Ｙ４４に対応する４４個のアミノ酸残基の挿入を伴う。
Figure 2014042523
異種Ｇｌａドメインを含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化血小板に対する結合及び／又は親和性の増大による、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）などの野生型ＦＶＩＩ分子と比較して、より低用量で凝固活性の増大を示すことができる。Ｇｌａ改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで、非改変又は野生型ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性と比較して少なくとも又は約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、又はそれ以上、増大することができる。
３．組合せ及び追加の改変
ＴＦＰＩ抵抗性の増大、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大、ＴＦ依存性及び／若しくはＴＦ非依存性触媒活性の増大、半減期増大などの薬物動態学的性質の向上、並びに／又はリン脂質膜に対する結合及び／若しくは親和性の増大を示すためのＦＶＩＩポリペプチドの改変に加えて、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドには、上記性質のうちの１つより多くを示すものも挙げられる。例えば、ＦＶＩＩポリペプチドは、結果として生じるポリペプチドがリン脂質に対する結合及び／又は親和性の増大を示し、且つまたＴＦＰＩに対する抵抗性の増大も示すように改変することができる。したがって、ＦＶＩＩポリペプチドは、別のビタミンＫ依存性血漿タンパク質由来の異種Ｇｌａドメインの導入、及び配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドに関して位置１９６、１９７、１９９、２３７、２３９、２９０、又は３４１のアミノ酸の任意の１つ又は複数の置換によって改変することができる。
さらに、本明細書で提供される任意の改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、当技術分野において記載された１つ又は複数の他の改変を含有することができる。典型的には、そのような追加の改変は、それら自体、改変ポリペプチドの凝固活性の増大及び／又はポリペプチドの安定性の増大を生じるものである。したがって、結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドは、凝固活性の増大を示す。追加の改変としては、例えば、当技術分野において知られた任意のアミノ酸置換、欠失、又は挿入、典型的には、ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性及び／又は安定性を増大させる任意の改変を挙げることができる。本明細書で提供される任意の改変ＦＶＩＩポリペプチドは、結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドが野生型又は非改変ポリペプチドのＦＶＩＩ活性を保持する限り、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、又はそれ以上の追加のアミノ酸改変を含有することができる。
一例では、他の因子、分子、及びタンパク質とのその相互作用が変化しているようにＦＶＩＩポリペプチド配列に追加の改変を行うことができる。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドの組織因子（ＴＦ）に対する親和性が増大しているように、ＴＦとの相互作用に関与するアミノ酸残基を交換することができる。他の改変としては、それだけに限らないが、第Ｘ因子、第ＩＸ因子、ＴＦＰＩ、及びＡＴ−ＩＩＩとの相互作用に関与するアミノ酸の改変が挙げられる。
ポリペプチドの高次構造又はフォールディングを変化させる追加の改変もまた、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドに行うことができる。これらには、例えば、新しいジスルフィド結合が形成されるための１つ又は複数のアミノ酸のシステインとの交換、又はα−ヘリックス高次構造を安定化させる改変が挙げられ、それによって、改変ＦＶＩＩポリペプチドに活性の増大を分け与える。
追加の改変はまた、翻訳後修飾をもたらすように改変ＦＶＩＩポリペプチドに行うことができる。例えば、結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドが、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較してグリコシル化が増加しているように、追加のグリコシル化部位を含むようにポリペプチドを改変することができる。改変はまた、改変ＦＶＩＩポリペプチドの安定性を増大させるように作用するものなど、後で化学的部分に連結することができるアミノ酸残基を導入するように行うことができる。ＦＶＩＩポリペプチドはまた、内在性プロテアーゼについての潜在的切断部位（複数可）を修飾することにより変化させることができ、それによって、ＦＶＩＩａ変異体の分解を低下させ、且つ改変ＦＶＩＩポリペプチドの安定性を増大させる。
さらに、改変ＦＶＩＩポリペプチドがリン脂質膜に対する結合及び／又は親和性の増大を示すように、内在性又は異種Ｇｌａドメインにアミノ酸置換、欠失、又は挿入を行うことができる。他の例では、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、内在性Ｇｌａドメインにおける欠失、又は通常、γ−カルボキシル化されている位置における置換を示すことができる（米国特許出願公開第２００７／００３７７４６号明細書）。
以下のセクションは、ＦＶＩＩポリペプチドの安定性及び／又は凝固活性の増大をもたらすための、当技術分野において記載された例示的な改変の非限定的な例を記載する。上記で論じるように、そのような改変もまた、本明細書で提供される任意の改変ＦＶＩＩポリペプチドに追加として含まれることができる。下記で参照されるアミノ酸位置は、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する。対応する突然変異は、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドの対立遺伝子変異体、種変異体、又はスプライス変異体などの他のＦＶＩＩポリペプチドにおいて行うことができる。
ａ．固有活性を増大させる改変
一例では、結果として第Ｘ因子及び／又は第ＩＸ因子への触媒活性の増大を生じる追加の改変を、本明細書で提供される改変第ＶＩＩ因子ポリペプチドに行うことができる。例えば、結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドが、ＴＦに対する親和性が増大し、それによりＦＸ及び／又はＦＩＸへの活性の増大を示すように、それの補因子、ＴＦとの相互作用に関与するアミノ酸に改変を行うことができる。ＦＸ及び／又はＦＩＸへの改変ＦＶＩＩポリペプチドの固有活性が非改変ポリペプチドの活性と比較して増大しているように、ＦＶＩＩポリペプチドの活性化ポケットにも改変を行うことができる。結果として活性の増大を生じる別の改変ストラテジーは、タンパク質のフォールディング及び高次構造がより高活性の型へ変化している、又は高活性高次構造と不活性（又はより低活性）高次構造との間の平衡が、高活性高次構造（複数可）の方を選んでシフトしているようなＦＶＩＩポリペプチドの改変を伴う。より高活性のポリペプチドはまた、ＦＶＩＩポリペプチドのβストランドに関与するアミノ酸の改変によって達成することができる。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドをより高活性の型へと「ロックする」ように機能することができる新しいジスルフィド結合を形成することができる新しいシステイン対を導入するアミノ酸置換を行うことができる。
改変ＦＶＩＩポリペプチドの固有活性を増大させるための、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドに含むことができる追加の改変の例には、それだけに限らないが、Ｐｅｒｓｓｏｎら、（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３７９：４９７〜５０３、Ｍａｕｎら、（２００５）Ｐｒｏｔ Ｓｃｉ １４：１１７１〜１１８０、Ｐｅｒｓｓｏｎら、（２００１）ＰＮＡＳ ９８：１３５８３〜１３５８８、Ｐｅｒｓｓｏｎら、（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６９：５９５０〜５９５５、Ｓｏｅｊｉｍａら、（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：１７２２９〜１７２３５、Ｓｏｅｊｉｍａら、（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：４９０２７〜４９０３５、国際公開第２００１／８３７２５号パンフレット、国際公開第２００２／０２２７７６号パンフレット、国際公開第２００２／０３８１６２号パンフレット、国際公開第２００３／０２７１４７号パンフレット、国際公開第２００３／３８１６２号パンフレット、国際公開第２００４／０２９０９０号パンフレット、国際公開第２００４／０２９０９１号パンフレット、国際公開第２００４／１０８７６３号パンフレット、及び国際公開第２００４／１１１２４２号パンフレットに記載されたものが挙げられる。結果として改変ＦＶＩＩポリペプチドの固有活性の増大を生じることができる当技術分野において記載された例示的なアミノ酸改変の非限定的な例には、Ｓ２７８Ｃ／Ｖ３０２Ｃ、Ｌ２７９Ｃ／Ｎ３０１Ｃ、Ｖ２８０Ｃ／Ｖ３０１Ｃ、Ｓ２８１Ｃ／Ｖ２９９Ｃ、Ｓ３１４Ｅ、Ｌ３９Ｅ、Ｌ３９Ｑ、Ｌ３９Ｈ、Ｉ４２Ｒ、Ｓ４３Ｑ、Ｓ５３Ｎ、Ｋ６２Ｅ、Ｋ６２Ｒ、Ｋ６２Ｄ、Ｋ６２Ｎ、Ｋ６２Ｑ、Ｋ６２Ｔ、Ｌ６５Ｑ、Ｌ６５Ｓ、Ｆ７１Ｄ、Ｆ７１Ｙ、Ｆ７１Ｅ、Ｆ７１Ｑ、Ｆ７１Ｎ、Ｐ７４Ｓ、Ｐ７４Ａ、Ａ７５Ｅ、Ａ７５Ｄ、Ｅ７７Ａ、Ｅ８２Ｑ、Ｅ８２Ｎ、Ｔ８３Ｋ、Ｅ１１６Ｄ、Ｋ１５７Ｖ、Ｋ１５７Ｌ、Ｋ１５７Ｉ、Ｋ１５７Ｍ、Ｋ１５７Ｆ、Ｋ１５７Ｗ、Ｋ１５７Ｐ、Ｋ１５７Ｇ、Ｋ１５７Ｓ、Ｋ１５７Ｔ、Ｋ１５７Ｃ、Ｋ１５７Ｙ、Ｋ１５７Ｎ、Ｋ１５７Ｅ、Ｋ１５７Ｒ、Ｋ１５７Ｈ、Ｋ１５７Ｄ、Ｋ１５７Ｑ、Ｖ１５８Ｌ、Ｖ１５８Ｉ、Ｖ１５８Ｍ、Ｖ１５８Ｆ、Ｖ１５８Ｗ、Ｖ１５８Ｐ、Ｖ１５８Ｇ、Ｖ１５８Ｓ、Ｖ１５８Ｔ、Ｖ１５８Ｃ、Ｖ１５８Ｙ、Ｖ１５８Ｎ、Ｖ１５８Ｅ、Ｖ１５８Ｒ、Ｖ１５８Ｋ、Ｖ１５８Ｈ、Ｖ１５８Ｄ、Ｖ１５８Ｑ、Ａ２７４Ｍ、Ａ２７４Ｌ、Ａ２７４Ｋ、Ａ２７４Ｒ、Ａ２７４Ｄ、Ａ２７４Ｖ、Ａ２７４Ｉ、Ａ２７４Ｆ、Ａ２７４Ｗ、Ａ２７４Ｐ、Ａ２７４Ｇ、Ａ２７４Ｔ、Ａ２７４Ｃ、Ａ２７４Ｙ、Ａ２７４Ｎ、Ａ２７４Ｅ、Ａ２７４Ｈ、Ａ２７４Ｓ、Ａ２７４Ｑ、Ｆ２７５Ｈ、Ｅ２９６Ｖ、Ｅ２９６Ｌ、Ｅ２９６Ｉ、Ｅ２９６Ｍ、Ｅ２９６Ｆ、Ｅ２９６Ｗ、Ｅ２９６Ｐ、Ｅ２９６Ｇ、Ｅ２９６Ｓ、Ｅ２９６Ｔ、Ｅ２９６Ｃ、Ｅ２９６Ｙ、Ｅ２９６Ｎ、Ｅ２９６Ｋ、Ｅ２９６Ｒ、Ｅ２９６Ｈ、Ｅ２９６Ｄ、Ｅ２９６Ｑ、Ｍ２９８Ｑ、Ｍ２９８Ｖ、Ｍ２９８Ｌ、Ｍ２９８Ｉ、Ｍ２９８Ｆ、Ｍ２９８Ｗ、Ｍ２９８Ｐ、Ｍ２９８Ｇ、Ｍ２９８Ｓ、Ｍ２９８Ｔ、Ｍ２９８Ｃ、Ｍ２９８Ｙ、Ｍ２９８Ｎ、Ｍ２９８Ｋ、Ｍ２９８Ｒ、Ｍ２９８Ｈ、Ｍ２９８Ｅ、Ｍ２９８Ｄ、Ｒ３０４Ｙ、Ｒ３０４Ｆ、Ｒ３０４Ｌ、Ｒ３０４Ｍ、Ｌ３０５Ｖ、Ｌ３０５Ｙ、Ｌ３０５Ｉ、Ｌ３０５Ｆ、Ｌ３０５Ａ、Ｌ３０５Ｍ、Ｌ３０５Ｗ、Ｌ３０５Ｐ、Ｌ３０５Ｇ、Ｌ３０５Ｓ、Ｌ３０５Ｔ、Ｌ３０５Ｃ、Ｌ３０５Ｎ、Ｌ３０５Ｅ、Ｌ３０５Ｋ、Ｌ３０５Ｒ、Ｌ３０５Ｈ、Ｌ３０５Ｄ、Ｌ３０５Ｑ、Ｍ３０６Ｄ、Ｍ３０６Ｎ、Ｄ３０９Ｓ、Ｄ３０９Ｔ、Ｓ３１４Ａ、Ｓ３１４Ｖ、Ｓ３１４Ｉ、Ｓ３１４Ｍ、Ｓ３１４Ｆ、Ｓ３１４Ｗ、Ｓ３１４Ｐ、Ｓ３１４Ｇ、Ｓ３１４Ｌ、Ｓ３１４Ｔ、Ｓ３１４Ｃ、Ｓ３１４Ｙ、Ｓ３１４Ｎ、Ｓ３１４Ｅ、Ｓ３１４Ｋ、Ｓ３１４Ｒ、Ｓ３１４Ｈ、Ｓ３１４Ｄ、Ｓ３１４Ｑ、Ｄ３３４Ｇ、Ｄ３３４Ｅ、Ｄ３３４Ａ、Ｄ３３４Ｖ、Ｄ３３４Ｉ、Ｄ３３４Ｍ、Ｄ３３４Ｆ、Ｄ３３４Ｗ、Ｄ３３４Ｐ、Ｄ３３４Ｌ、Ｄ３３４Ｔ、Ｄ３３４Ｃ、Ｄ３３４Ｙ、Ｄ３３４Ｎ、Ｄ３３４Ｋ、Ｄ３３４Ｒ、Ｄ３３４Ｈ、Ｄ３３４Ｓ、Ｄ３３４Ｑ、Ｓ３３６Ｇ、Ｓ３３６Ｅ、Ｓ３３６Ａ、Ｓ３３６Ｖ、Ｓ３３６Ｉ、Ｓ３３６Ｍ、Ｓ３３６Ｆ、Ｓ３３６Ｗ、Ｓ３３６Ｐ、Ｓ３３６Ｌ、Ｓ３３６Ｔ、Ｓ３３６Ｃ、Ｓ３３６Ｙ、Ｓ３３６Ｎ、Ｓ３３６Ｋ、Ｓ３３６Ｒ、Ｓ３３６Ｈ、Ｓ３３６Ｄ、Ｓ３３６Ｑ、Ｋ３３７Ｌ、Ｋ３３７Ｖ、Ｋ３３７Ｉ、Ｋ３３７Ｍ、Ｋ３３７Ｆ、Ｋ３３７Ｗ、Ｋ３３７Ｐ、Ｋ３３７Ｇ、Ｋ３３７Ｓ、Ｋ３３７Ｔ、Ｋ３３７Ｃ、Ｋ３３７Ｙ、Ｋ３３７Ｎ、Ｋ３３７Ｅ、Ｋ３３７Ｒ、Ｋ３３７Ｈ、Ｋ３３７Ｄ、Ｋ３３７Ｑ、Ｆ３７４Ｐ、Ｆ３７４Ａ、Ｆ３７４Ｖ、Ｆ３７４Ｉ、Ｆ３７４Ｌ、Ｆ３７４Ｍ、Ｆ３７４Ｗ、Ｆ３７４Ｇ、Ｆ３７４Ｓ、Ｆ３７４Ｔ、Ｆ３７４Ｃ、Ｆ３７４Ｙ、Ｆ３７４Ｎ、Ｆ３７４Ｅ、Ｆ３７４Ｋ、Ｆ３７４Ｒ、Ｆ３７４Ｈ、Ｆ３７４Ｄ、Ｆ３７４Ｑのいずれか１つ又は複数、及び位置３００〜３２２、３０５〜３２２、３００〜３１２、又は３０５〜３１２の、トリプシン、トロンビン、又はＦＸ由来の対応するアミノ酸との置換、及び位置３１０〜３２９、３１１〜３２２、又は２３３〜３２９の、トリプシン由来の対応するアミノ酸との置換が挙げられる。
ｂ．プロテアーゼに対する抵抗性を増大させる改変
本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、結果としてポリペプチドのプロテアーゼに対する抵抗性の増大を生じる追加の改変を含有することができる。例えば、１つ又は複数の潜在的タンパク分解性切断部位を除去するアミノ酸置換を行うことができる。したがって、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、プロテアーゼに対する抵抗性がより高められ、それにより、改変ポリペプチドの安定性及び半減期を増大することができる。
プロテアーゼに対する抵抗性を増大させるために本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドに含むことができる追加の改変の例には、それだけに限らないが、米国特許第５５８０５６０号明細書、又は国際公開第１９８８／０１０２９５号及び第２００２／０３８１６２号のパンフレットに記載されたものが挙げられる。結果として改変ＦＶＩＩポリペプチドの阻害因子及び／又はプロテアーゼに対する抵抗性の増大を生じることができる当技術分野において記載された例示的な改変の非限定的な例には、Ｋ３２Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｋ３２Ｇ、Ｋ３２Ｈ、Ｋ３２Ｔ、Ｋ３２Ａ、Ｋ３２Ｓ、Ｋ３８Ｔ、Ｋ３８Ｄ、Ｋ３８Ｌ、Ｋ３８Ｇ、Ｋ３８Ａ、Ｋ３８Ｓ、Ｋ３８Ｎ、Ｋ３８Ｈ、Ｉ４２Ｎ、Ｉ４２Ｓ、Ｉ４２Ａ、Ｉ４２Ｑ、Ｙ４４Ｎ、Ｙ４４Ｓ、Ｙ４４Ａ、Ｙ４４Ｑ、Ｆ２７８Ｓ、Ｆ２７８Ａ、Ｆ２７８Ｎ、Ｆ２７８Ｑ、Ｆ２７８Ｇ、Ｒ２９０Ｇ、Ｒ２９０Ａ、Ｒ２９０Ｓ、Ｒ２９０Ｔ、Ｒ２９０Ｋ、Ｒ３０４Ｇ、Ｒ３０４Ｔ、Ｒ３０４Ａ、Ｒ３０４Ｓ、Ｒ３０４Ｎ、Ｒ３１５Ｇ、Ｒ３１５Ａ、Ｒ３１５Ｓ、Ｒ３１５Ｔ、Ｒ３１５Ｑ、Ｙ３３２Ｓ、Ｙ３３２Ａ、Ｙ３３２Ｎ、Ｙ３３２Ｑ、Ｙ３３２Ｇ、Ｋ３４１Ｅ、Ｋ３４１Ｑ、Ｋ３４１Ｇ、Ｋ３４１Ｔ、Ｋ３４１Ａ及びＫ３４１Ｓのいずれか１つ又は複数が挙げられる。
ｃ．リン脂質に対する親和性を増大させる改変
ＦＶＩＩの凝固活性は、活性化血小板の表面上に発現するものなどのリン脂質に対するポリペプチドの結合及び／又は親和性を増大させることにより増強することができる。例えば、結果としてホスファチジルセリン及び他の負荷電リン脂質を結合する能力の増大を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドを生じる追加のアミノ酸置換は、ＦＶＩＩポリペプチドの内在性Ｇｌａドメインにおける特定の位置に行うことができる。したがって、そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドが内在性Ｇｌａドメインを有する、即ち、内在性Ｇｌａドメインと別のビタミンＫ依存性タンパク質のそれとの置換を生じる改変をまだ受けていないとの条件で、そのような改変はまた、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドに含むことができる。
リン脂質結合及び／又は親和性を増大させるための、且つ内在性ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインを含有する本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドに行うことができる追加の改変の例には、それだけに限らないが、Ｈａｒｖｅｙら、（２００３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：８３６３〜８３６９、米国特許出願公開第２００３／０１００５０６号明細書、米国特許出願公開第２００４／０２２０１０６号明細書、米国特許出願公開第２００６／０２４０５２６号明細書、米国特許第６０１７８８２号明細書、米国特許第６６９３０７５号明細書、米国特許第６７６２２８６号明細書、国際公開第２００３／９３４６５号パンフレット、及び国際公開第２００４／１１１２４２号パンフレットに記載されたものが挙げられる。例示的なそのような改変には、以下のうちのいずれか１つ又は複数が挙げられる；位置４におけるチロシンの挿入、又はＰ１０Ｑ、Ｐ１０Ｅ、Ｐ１０Ｄ、Ｐ１０Ｎ、Ｒ２８Ｆ、Ｒ２８Ｅ、Ｋ３２Ｅ、Ｋ３２Ｄ、Ｄ３３Ｆ、Ｄ３３Ｅ、Ｄ３３Ｋ Ａ３４Ｅ、Ａ３４Ｄ、Ａ３４Ｉ、Ａ３４Ｌ、Ａ３４Ｍ、Ａ３４Ｖ、Ａ３４Ｆ、Ａ３４Ｗ、Ａ３４Ｙ、Ｒ３６Ｄ、Ｒ３６Ｅ、Ｋ３８Ｅ及びＫ３８Ｄのいずれか１つ若しくは複数の改変。
ｄ．グリコシル化を変化させる改変
タンパク質のグリコシル化レベルの変化は、免疫原性を低減し、安定性を増大させ、投与頻度を低減し、及び／又は炎症などの有害な副作用を低減するための手段として当技術分野において記載されている。通常、これは、グリコシル化レベルを増大させることによってもたらされる。グリコシル化部位（複数可）は、ポリペプチドがグリコシル化の能力がある真核細胞で産生される場合、それがグリコシル化されるように、ポリペプチド上に糖部分付着のための部位を提供する。
ＦＶＩＩには、以下の４つの天然に存在するグリコシル化部位がある；配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドにおけるアミノ酸位置に対応する、Ｎ１４５及びＮ３２２における２つのＮ−グリコシル化部位、並びにＳ５２及びＳ６０における２つのＯ−グリコシル化部位。一実施形態では、上記部位におけるグリコシル化が乱されるように追加の改変が、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドに行うことができる。これは、結果として、凝固活性の増大を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドを生じることができる（例えば、国際公開第２００５／１２３９１６号パンフレット参照）。結果として、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して改変ＦＶＩＩポリペプチドのグリコシル化の低下及び活性の増大を生じることができる、当技術分野において記載される例示的な改変の非限定的な例には、それだけに限らないが、Ｎ１４５Ｙ、Ｎ１４５Ｇ、Ｎ１４５Ｆ、Ｎ１４５Ｍ、Ｎ１４５Ｓ、Ｎ１４５Ｉ、Ｎ１４５Ｌ、Ｎ１４５Ｔ、Ｎ１４５Ｖ、Ｎ１４５Ｐ、Ｎ１４５Ｋ、Ｎ１４５Ｈ、Ｎ１４５Ｑ、Ｎ１４５Ｅ、Ｎ１４５Ｒ、Ｎ１４５Ｗ、Ｎ１４５Ｄ、Ｎ１４５Ｃ、Ｎ３２２Ｙ、Ｎ３２２Ｇ、Ｎ３２２Ｆ、Ｎ３２２Ｍ、Ｎ３２２Ｓ、Ｎ３２２Ｉ、Ｎ３２２Ｌ、Ｎ３２２Ｔ、Ｎ３２２Ｖ、Ｎ３２２Ｐ、Ｎ３２２Ｋ、Ｎ３２２Ｈ、Ｎ３２２Ｑ、Ｎ３２２Ｅ、Ｎ３２２Ｒ、Ｎ３２２Ｗ及びＮ３２２Ｃが挙げられる。
別の実施形態では、追加のグリコシル化部位が導入され、それにしたがって、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して改変ＦＶＩＩポリペプチドのグリコシル化のレベルを増大させるようにさらなる改変が、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸配列に行うことができる。グリコシル化部位は、Ｎ−結合型又はＯ−結合型グリコシル化部位であり得る。１つ又は複数の新しいグリコシル化部位を導入する、ＦＶＩＩポリペプチドに行うことができる改変の例には、それだけに限らないが、米国特許第６８０６０６３号明細書及び国際公開第２００３／９３４６５号パンフレットに記載されているものが挙げられる。結果として、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して改変ＦＶＩＩポリペプチドのグリコシル化の増大を生じることができる、当技術分野において記載される例示的な改変の非限定的な例には、それだけに限らないが、Ｆ４Ｓ、Ｆ４Ｔ、Ｐ１０Ｎ、Ｑ２１Ｎ、Ｗ４１Ｎ、Ｓ４３Ｎ、Ａ５１Ｎ、Ｇ５８Ｎ、Ｌ６５Ｎ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｅ８２Ｓ、Ｅ８２Ｔ、Ｎ９５Ｓ、Ｎ９５Ｔ、Ｇ９７Ｓ、Ｇ９７Ｔ、Ｙ１０１Ｎ、Ｄ１０４Ｎ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１０９Ｎ、Ｇ１１７Ｎ、Ｇ１２４Ｎ、Ｓ１２６Ｎ、Ｔ１２８Ｎ、Ａ１７５Ｓ、Ａ１７５Ｔ、Ｇ１７９Ｎ、Ｉ１８６Ｓ、Ｉ１８６Ｔ、Ｖ１８８Ｎ、Ｒ２０２Ｓ、Ｒ２０２Ｔ、Ｉ２０５Ｓ、Ｉ２０５Ｔ、Ｄ２１２Ｎ、Ｅ２２０Ｎ、Ｉ２３０Ｎ、Ｐ２３１Ｎ、Ｐ２３６Ｎ、Ｇ２３７Ｎ、Ｖ２５３Ｎ、Ｅ２６５Ｎ、Ｔ２６７Ｎ、Ｅ２７０Ｎ、Ｒ２７７Ｎ、Ｌ２８０Ｎ、Ｇ２９１Ｎ、Ｐ３０３Ｓ、Ｐ３０３ＳＴ、Ｌ３０５Ｎ、Ｑ３１２Ｎ、Ｇ３１８Ｎ、Ｇ３３１Ｎ、Ｄ３３４Ｎ、Ｋ３３７Ｎ、Ｇ３４２Ｎ、Ｈ３４８Ｎ、Ｒ３５３Ｎ、Ｙ３５７Ｎ、Ｉ３６１Ｎ、Ｖ３７６Ｎ、Ｒ３７９Ｎ、Ｍ３９１Ｎ、Ｋ３２Ｎ／Ａ３４Ｓ、Ｋ３２Ｎ／Ａ３４Ｔ、Ｆ３１Ｎ／Ｄ３３Ｓ、Ｆ３１Ｎ／Ｄ３３Ｔ、Ｉ３０Ｎ／Ｋ３２Ｓ、Ｉ３０Ｎ／Ｋ３２Ｔ、Ａ３４Ｎ／Ｒ３６Ｓ、Ａ３４Ｎ／Ｒ３６Ｔ、Ｋ３８Ｎ／Ｆ４０Ｓ、Ｋ３８Ｎ／Ｆ４０Ｔ、Ｔ３７Ｎ／Ｌ３９Ｓ、Ｔ３７Ｎ／Ｌ３９Ｔ、Ｒ３６Ｎ／Ｋ３８Ｓ、Ｒ３６Ｎ／Ｋ３８Ｔ、Ｌ３９Ｎ／Ｗ４１Ｓ、Ｌ３９Ｎ／Ｗ４１Ｔ、Ｆ４０Ｎ／Ｉ４２Ｓ、Ｆ４０Ｎ／Ｉ４２Ｔ、Ｉ４２Ｎ／Ｙ４４Ｓ、Ｉ４２Ｎ／Ｙ４４Ｔ、Ｙ４４Ｎ／Ｄ４６Ｓ、Ｙ４４Ｎ／Ｄ４６Ｔ、Ｄ４６Ｎ／Ｄ４８Ｓ、Ｄ４６Ｎ／Ｄ４８Ｔ、Ｇ４７Ｎ／Ｑ４９Ｓ、Ｇ４７Ｎ／Ｑ４９Ｔ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｓ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ、Ｅ１４２Ｎ／Ｒ１４４Ｓ、Ｅ１４２Ｎ／Ｒ１４４Ｔ、Ｌ１４１Ｎ／Ｋ１４３Ｓ、Ｌ１４１Ｎ／Ｋ１４３Ｔ、Ｉ１４０Ｎ／Ｅ１４２Ｓ／、Ｉ１４０Ｎ／Ｅ１４２Ｔ、Ｒ１４４Ｎ／Ａ１４６Ｓ、Ｒ１４４Ｎ／Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｎ／Ｋ１４８Ｓ、Ａ１４６Ｎ／Ｋ１４８Ｔ、Ｓ１４７Ｎ／Ｐ１４９Ｓ／、Ｓ１４７Ｎ／Ｐ１４９Ｔ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｓ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ、Ｄ２８９Ｎ／Ｇ２９１Ｓ、Ｄ２８９Ｎ／Ｇ２９１Ｔ、Ｌ２８８Ｎ／Ｒ２９０Ｓ、Ｌ２８８Ｎ／Ｒ２９０Ｔ、Ｌ２８７Ｎ／Ｄ２８９Ｓ、Ｌ２８７Ｎ／Ｄ２８９、Ａ２９２Ｎ／Ａ２９４Ｓ、Ａ２９２Ｎ／Ａ２９４Ｔ、Ｔ２９３Ｎ／Ｌ２９５Ｓ、Ｔ２９３Ｎ／Ｌ２９５Ｔ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｓ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ、Ｓ３１４Ｎ／Ｋ３１６Ｓ、Ｓ３１４Ｎ／Ｋ３１６Ｔ、Ｑ３１３Ｎ／Ｒ３１５Ｓ、Ｑ３１３Ｎ／Ｒ３１５Ｔ、Ｋ３１６Ｎ／Ｇ３１８Ｓ、Ｋ３１６Ｎ／Ｇ３１８Ｔ、Ｖ３１７Ｎ／Ｄ３１９Ｓ、Ｖ３１７Ｎ／Ｄ３１９Ｔ、Ｋ３４１Ｎ／Ｄ３４３Ｓ、Ｋ３４１Ｎ／Ｄ３４３Ｔ、Ｓ３３９Ｎ／Ｋ３４１Ｓ、Ｓ３３９Ｎ／Ｋ３４１Ｔ、Ｄ３４３Ｎ／Ｇ３４５Ｓ、Ｄ３４３Ｎ／Ｇ３４５Ｔ、Ｒ３９２Ｎ／Ｅ３９４Ｓ、Ｒ３９２Ｎ／Ｅ３９４Ｔ、Ｌ３９０Ｎ／Ｒ３９２Ｓ、Ｌ３９０Ｎ／Ｒ３９２Ｔ、Ｋ３８９Ｎ／Ｍ３９１Ｓ、Ｋ３８９Ｎ／Ｍ３９１Ｔ、Ｓ３９３Ｎ／Ｐ３９５Ｓ、Ｓ３９３Ｎ／Ｐ３９５Ｔ、Ｅ３９４Ｎ／Ｒ３９６Ｓ、Ｅ３９４Ｎ／Ｒ３９６Ｔ、Ｐ３９５Ｎ／Ｐ３９７Ｓ、Ｐ３９５Ｎ／Ｐ３９７Ｔ、Ｒ３９６Ｎ／Ｇ３９８Ｓ、Ｒ３９６Ｎ／Ｇ３９８Ｔ、Ｐ３９７Ｎ／Ｖ３９９Ｓ、Ｐ３９７Ｎ／Ｖ３９９Ｔ、Ｇ３９８Ｎ／Ｌ４００Ｓ、Ｇ３９８Ｎ／Ｌ４００Ｔ、Ｖ３９９Ｎ／Ｌ４０１Ｓ、Ｖ３９９Ｎ／Ｌ４０１Ｔ、Ｌ４００Ｎ／Ｒ４０２Ｓ、Ｌ４００Ｎ／Ｒ４０２Ｔ、Ｌ４０１Ｎ／Ａ４０３Ｓ、Ｌ４０１Ｎ／Ａ４０３Ｔ、Ｒ４０２Ｎ／Ｐ４０４Ｓ、Ｒ４０２Ｎ／Ｐ４０４Ｔ、Ａ４０３Ｎ／Ｆ４０５Ｓ、Ａ４０３Ｎ／Ｆ４０５Ｔ、Ｐ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓ及びＰ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｔが挙げられる。
ｅ．化学基連結を容易にするための改変
本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドの追加の改変はまた、後の化学基の連結を容易にするために行うことができる。化学基が、置換されたアミノ酸を介して改変ＦＶＩＩポリペプチドに連結することができるように、１つ又は複数のアミノ酸置換又は挿入を行うことができる。例えば、システインを改変ＦＶＩＩポリペプチドに導入することができ、それにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を連結させて、安定性及び血中半減期の増大を与えることができる。他の付着残基には、リシン残基、アスパラギン酸残基、及びグルタミン酸残基が挙げられる。いくつかの実施形態では、潜在的連結位置の数を低減するためにアミノ酸残基を交換する。例えば、リシンの数を低減することができる。後の化学基との連結を容易にすることができるＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸配列に行うことができる改変の例には、それだけに限らないが、米国特許出願公開第２００３／００９６３３８号明細書、米国特許出願公開第２００６／００１９３３６号明細書、米国特許第６８０６０６３号明細書、国際公開第２００１／５８９３５号パンフレット、及び国際公開第２００２／０７７２１８号パンフレットに記載されているものが挙げられる。後の化学基との連結を容易にすることができる、ＦＶＩＩポリペプチドの例示的な改変の非限定的な例には、それだけに限らないが、Ｑ２５０Ｃ、Ｒ３９６Ｃ、Ｐ４０６Ｃ、Ｉ４２Ｋ、Ｙ４４Ｋ、Ｌ２８８Ｋ、Ｄ２８９Ｋ、Ｒ２９０Ｋ、Ｇ２９１Ｋ、Ａ２９２Ｋ、Ｔ２９３Ｋ、Ｑ３１３Ｋ、Ｓ３１４Ｋ、Ｒ３１５Ｋ、Ｖ３１７Ｋ、Ｌ３９０Ｋ、Ｍ３９１Ｋ、Ｒ３９２Ｋ、Ｓ３９３Ｋ、Ｅ３９４Ｋ、Ｐ３９５Ｋ、Ｒ３９６Ｋ、Ｐ３９７Ｋ、Ｇ３９８Ｋ、Ｖ３９９Ｋ、Ｌ４００Ｋ、Ｌ４０１Ｋ、Ｒ４０２Ｋ、Ａ４０３Ｋ、Ｐ４０４Ｋ、Ｆ４０５Ｋ、Ｉ３０Ｃ、Ｋ３２Ｃ、Ｄ３３Ｃ、Ａ３４Ｃ、Ｔ３７Ｃ、Ｋ３８Ｃ、Ｗ４１Ｃ、Ｙ４４Ｃ、Ｓ４５Ｃ、Ｄ４６Ｃ、Ｌ１４１Ｃ、Ｅ１４２Ｃ、Ｋ１４３Ｃ、Ｒ１４４Ｃ、Ｌ２８８Ｃ、Ｄ２８９Ｃ、Ｒ２９０Ｃ、Ｇ２９１Ｃ、Ａ２９２Ｃ、Ｓ３１４Ｃ、Ｒ３１５Ｃ、Ｋ３１６Ｃ、Ｖ３１７Ｃ、Ｌ３９０Ｃ、Ｍ３９１Ｃ、Ｒ３９２Ｃ、Ｓ３９３Ｃ、Ｅ３９４Ｃ、Ｐ３９５Ｃ、Ｒ３９６Ｃ、Ｐ３９７Ｃ、Ｇ３９８Ｃ、Ｖ３９９Ｃ、Ｌ４０１Ｃ、Ｒ４０２Ｃ、Ａ４０３Ｃ、Ｐ４０４Ｃ、Ｉ３０Ｄ、Ｋ３２Ｄ、Ａ３４Ｄ、Ｔ３７Ｄ、Ｋ３８Ｄ、Ｗ４１Ｄ、Ｙ４４Ｄ、Ｓ４５Ｄ、Ｄ４６Ｃ、Ｌ１４１Ｄ、Ｅ１４２Ｄ、Ｋ１４３Ｄ、Ｒ１４４Ｄ、Ｌ２８８Ｄ、Ｒ２９０Ｄ、Ｇ２９１Ｄ、Ａ２９２Ｄ、Ｑ３１３Ｄ、Ｓ３１４Ｄ、Ｒ３１５Ｄ、Ｋ３１６Ｄ、Ｖ３１７Ｄ、Ｌ３９０Ｄ、Ｍ３９１Ｄ、Ｒ３９２Ｄ、Ｓ３９３Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｒ３９６Ｄ、Ｐ３９７Ｄ、Ｇ３９８Ｄ、Ｖ３９９Ｄ、Ｌ４０１Ｄ、Ｒ４０２Ｄ、Ａ４０３Ｄ、Ｐ４０４Ｄ、Ｉ３０Ｅ、Ｋ３２Ｅ、Ａ３４Ｅ、Ｔ３７Ｅ、Ｋ３８Ｅ、Ｗ４１Ｅ、Ｙ４４Ｅ、Ｓ４５Ｅ、Ｄ４６Ｃ、Ｌ１４１Ｅ、Ｅ１４２Ｅ、Ｋ１４３Ｅ、Ｒ１４４Ｅ、Ｌ２８８Ｅ、Ｒ２９０Ｅ、Ｇ２９１Ｅ、Ａ２９２Ｅ、Ｑ３１３Ｅ、Ｓ３１４Ｅ、Ｒ３１５Ｅ、Ｋ３１６Ｅ、Ｖ３１７Ｅ、Ｌ３９０Ｅ、Ｍ３９１Ｅ、Ｒ３９２Ｅ、Ｓ３９３Ｅ、Ｐ３９５Ｅ、Ｒ３９６Ｅ、Ｐ３９７Ｅ、Ｇ３９８Ｅ、Ｖ３９９Ｅ、Ｌ４０１Ｅ、Ｒ４０２Ｅ、Ａ４０３Ｅ、Ｐ４０４Ｅ、Ｋ１８Ｒ、Ｋ３２Ｒ、Ｋ３８Ｒ、Ｋ６２Ｒ、Ｋ８５Ｒ、Ｋ１０９Ｒ、Ｋ１３７Ｒ、Ｋ１４３Ｒ、Ｋ１４８Ｒ、Ｋ１５７Ｒ、Ｋ１６１Ｒ、Ｋ１９７Ｒ、Ｋ１９９Ｒ、Ｋ３１６Ｒ、Ｋ３３７Ｒ、Ｋ３４１Ｒ、Ｋ３８９Ｒ、Ｋ１８Ｑ、Ｋ３２Ｑ、Ｋ３８Ｑ、Ｋ６２Ｑ、Ｋ８５Ｑ、Ｋ１０９Ｑ、Ｋ１３７Ｑ、Ｋ１４３Ｑ、Ｋ１４８Ｑ、Ｋ１５７Ｑ、Ｋ１６１Ｑ、Ｋ１９７Ｑ、Ｋ１９９Ｑ、Ｋ３１６Ｑ、Ｋ３３７Ｑ、Ｋ３４１Ｑ、Ｋ３８９Ｑ、Ｋ１８Ｎ、Ｋ３２Ｎ、Ｋ３８Ｎ、Ｋ６２Ｎ、Ｋ８５Ｎ、Ｋ１０９Ｎ、Ｋ１３７Ｎ、Ｋ１４３Ｎ、Ｋ１４８Ｎ、Ｋ１５７Ｎ、Ｋ１６１Ｎ、Ｋ１９７Ｎ、Ｋ１９９Ｎ、Ｋ３１６Ｎ、Ｋ３３７Ｎ、Ｋ３４１Ｎ、Ｋ３８９Ｎ、Ｋ１８Ｈ、Ｋ３２Ｈ、Ｋ３８Ｈ、Ｋ６２Ｈ、Ｋ８５Ｈ、Ｋ１０９Ｈ、Ｋ１３７Ｈ、Ｋ１４３Ｈ、Ｋ１４８Ｈ、Ｋ１５７Ｈ、Ｋ１６１Ｈ、Ｋ１９７Ｈ、Ｋ１９９Ｈ、Ｋ３１６Ｈ、Ｋ３３７Ｈ、Ｋ３４１Ｈ及びＫ３８９Ｈが挙げられる。
ｆ．例示的な組合せ改変
非改変ＦＶＩＩポリペプチドの１つ又は複数の性質又は活性に影響を及ぼすように設計された２つ以上の改変を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが本明細書で提供される。いくつかの例では、２つ以上の改変が、ＦＶＩＩポリペプチドの２つ以上の性質又は活性を変化させる。ＴＦＰＩに対する抵抗性、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性、固有活性、アミド分解活性、触媒活性（ＴＦの存在下又は不在下）、リン脂質結合及び／又は親和性、グリコシル化、プロテアーゼに対する抵抗性、半減期、並びに、ＦＸ及びＦＩＸなどの他の因子又は分子との相互作用及び／又はそれらの活性化のうちの１つ又は複数が変化しているように、ＦＶＩＩポリペプチドに改変を行うことができる。典型的には、結果として生じる改変ＦＶＩＩポリペプチドが、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して、凝固活性が増大し、凝固活性の持続時間が増大し、及び／又は治療指数が増強しているように、２つ以上の改変が組み合わされる。改変ＦＶＩＩａポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、凝固活性のより速い開始を示してもよい。改変は、アミノ酸置換、挿入、又は欠失を含むことができる。２つ以上の改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性の増大、凝固活性の持続時間の増大、凝固活性の開始の増進、及び／又は治療指数の増強は、出発又は非改変ＦＶＩＩａポリペプチドの活性と比較して、少なくとも又は約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、又はそれ以上、増大することができる。
２つ以上の活性又は性質を変化させるために非改変ＦＶＩＩポリペプチドへ導入される２つ以上の改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドが本明細書で提供される。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上の改変を含有することができる。さらに、各改変は、１個又は複数のアミノ酸残基に関わることができる。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、それぞれが単一のアミノ酸置換である２つの改変を含有することができる。別の例では、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、２つの改変を含有することができ、そのうちの一方は、単一アミノ酸の置換であり、他方は、１個より多いアミノ酸残基の欠失及びその後の１個より多いアミノ酸残基の挿入を伴う。例えば、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、固有活性を増大させるためのアミノ酸置換Ｍ２９８Ｑ（配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）、並びに、アミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）を除去することによる内在性ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインの欠失、及び配列番号１１０に示すＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸残基Ｙ１〜Ｙ４５に対応する４５個のアミノ酸残基の挿入を伴うＧｌａスワップＦＩＸ改変を含有することができる。
本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、表５〜８に示すものだけから選択される２つ以上の改変を有することができる。他の例では、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、１つ又は複数の改変が表５〜８に示すものから選択され、且つ１つ又は複数の改変が、例えば当技術分野において記載された改変などの表５〜８に示されていない追加の改変である、２つ以上の改変を含有する。いくつかの例では、１つ又は複数の追加の改変は、上記のセクションＤ．３．ａ〜ｅに示すものから選択することができる。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＴＦＰＩに対する抵抗性を増大させることができる、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩの番号付けに基づいたアミノ酸残基Ｄ１９６、Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｇ２３７、Ｔ２３９、Ｒ２９０、又はＫ３４１（キモトリプシン番号付けに基づいて、それぞれ、Ｄ６０、Ｋ６０ａ、Ｋ６０ｃ、Ｇ９７、Ｔ９９、Ｒ１４７、及びＫ１９２に対応する）の１つ又は複数における改変、並びに、例えば、Ｖ１５８及びＭ２９８（キモトリプシン番号付けに基づいて、それぞれ、Ｖ２１及びＭ１５６）などの固有活性に影響を及ぼす１つ又は複数のアミノ酸残基における改変を含有することができる。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、Ｋ１９７Ｅ及びＧ２３７ＶなどのＴＦＰＩに対する抵抗性を増大させる２つのアミノ酸置換、並びにＭ２９８Ｑなどの固有活性を増大させる１つのアミノ酸置換を含有することができ、結果として、凝固活性の増大を示すＦＶＩＩポリペプチドを生じる。
非限定的な例示的組合せ改変は表９に提供されている。これらの例示的な組合せ改変には、それだけに限らないが、ＴＦＰＩに対する抵抗性、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性、固有活性、アミド分解活性、触媒活性（ＴＦの存在下及び／又は不在下）、リン脂質結合及び／又は親和性、グリコシル化、プロテアーゼに対する抵抗性、半減期、並びに、ＦＸ及びＦＩＸなどの他の因子又は分子との相互作用及び／又はそれらの活性化を含めた、ＦＶＩＩポリペプチドの２つ以上の活性又は性質を変化させるように設計される２つ以上の改変が挙げられる。そのような組合せ改変を含有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、凝固活性が増大し、凝固活性の持続時間が増大し、凝固活性の開始が増進し、及び／又は治療指数が増強することができる。下記の表８に示す改変は、上記の表５〜７に記載されたのと同じ命名法及び番号付けシステムを用いている。例えば、「ＧｌａスワップＦＩＸ」改変は、上記のように、アミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドに対応する残基）を除去することによる内在性ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインの欠失、及び配列番号１１０に示すＦＩＸ Ｇｌａドメインのアミノ酸残基Ｙ１〜Ｙ４５に対応する４５個のアミノ酸残基の挿入を伴う。アミノ酸位置は、配列番号３に示す成熟ＦＶＩＩポリペプチドのアミノ酸位置に対応し、キモトリプシン番号付けスキームによっても呼ばれる。下記の表９において、改変ＦＶＩＩポリペプチドの例示的なアミノ酸配列が示されている配列識別名（配列番号）、及びいずれのポリペプチド識別番号もまた、特定されている。
Figure 2014042523
Ｅ．ＦＶＩＩの改変の設計及び方法
本明細書において、改変ＦＶＩＩポリペプチドが提供される。ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して１つ又は複数の活性又は特性において変化を示し得るように改変される。改変の結果、変化し得る活性及び特性には、それだけに限らないが、凝固若しくは凝固活性、凝固促進活性、第Ｘ因子（ＦＸ）の活性化若しくは第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の活性化をもたらす活性などのタンパク質分解活性若しくは触媒活性、ポリペプチドに結合する能力若しくは抗ＦＶＩＩ抗体への結合についてポリペプチドと競合する能力により評価されるような抗原性、組織因子、第Ｘ因子若しくは第ＩＸ因子に結合する能力、リン脂質に結合する能力、半減期、三次元構造、ｐＩ、及び／又は高次構造が含まれる。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドの中には、凝固活性が増大したものが存在する。これらの中には、凝固活性の増大が、ＴＦＰＩに対する改変ＦＶＩＩの抵抗性の増大、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大、半減期の増大などの薬物動態特性の向上、触媒活性の増大、及び／又は活性化血小板への結合の増大の結果であるもの、或いは凝固活性の増大がこれらを伴うものが存在する。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドを同定する例示的な方法及び改変ポリペプチドが、本明細書で提供される。例えば、ＴＦＰＩに対する抵抗性の増大、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大、及び／又は活性化血小板への結合の増大を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドは、（ａ）そのような特性に関与すると考えられる部位を論理的に標的化すること、或いは（ｂ）ＴＦＰＩに対する抵抗性、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性、半減期の増大などの薬物動態特性の向上、及び／又はリン脂質若しくは活性化血小板への結合の増大について、改変ＦＶＩＩポリペプチドを機能アッセイにおいて実証的に試験することによって、論理的に又は実証的に生成することができる。多くの場合では、改変ＦＶＩＩポリペプチドを生成するために、論理的及び実証的な設計アプローチの組合せを用いることができる。
論理的又は実証的なアプローチを用いて、改変についてドメイン、領域、又はアミノ酸が同定されれば、標的タンパク質において任意の１つ又は複数のアミノ酸の突然変異をもたらす、当技術分野において知られている任意の方法を用いることができる。方法は、コード核酸分子の標準的な部位特異的突然変異誘発（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅなどのキットなどのキットを用いる）を含むか、又は固相ポリペプチド合成法によるものである。さらに、本明細書で提供される改変キメラタンパク質（即ちＧｌａドメインのスワップ）は、通常の組換えＤＮＡ技術により生成することができる。例えば、キメラポリペプチドは、所望のキメラポリペプチド成分の通常のサブクローニングのための制限酵素及びクローニング法を用いて生成することができる。同定及び生成がされれば、改変ＦＶＩＩポリペプチドを次に、当技術分野において知られているか又は本明細書において以下に記載される様々なアッセイの任意の１つ又は複数を用いて、触媒活性又は凝固活性などの活性について評価することができる。
１．論理的
いくつかの例では、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、凝固活性が増大するように論理的な改変によって設計される。そのような方法において、ＦＶＩＩポリペプチドの活性に関与するドメイン、領域、又はアミノ酸は知られているか、又は論理的に決定することができる。例えば、公共の様々なデータベースは、野生型ＦＶＩＩに関する配列及びドメインの情報を提供している（例えば、ＥｘＰＡＳｙ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｓｅｒｖｅｒ ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇを参照されたい）。特定の相互作用又は活性に関与する、ＦＶＩＩポリペプチドにおけるアミノ酸、領域、及び／又はドメインを決定するために、公共の他の情報にアクセスすることができる。そのような情報源には、例えば、科学雑誌、配列及び機能のデータベース、又は特許データベースが含まれる。いくつかの場合では、直接的な証拠を用いて、所与の相互作用又は活性に対する１つ又は複数のアミノ酸の影響を決定することができる。他の例では、これは、例えば、類似の活性及び／又は相互作用を示す関連タンパク質に関する証拠又は情報から、間接的に推定することができる。そのような実施例では、関連タンパク質における活性又は相互作用に関与するアミノ酸を用いて、関連ポリペプチドとＦＶＩＩポリペプチドとを配列及び／又は構造の類似性に基づいて整列させることによって、どれが対応するアミノ酸であるかをＦＶＩＩポリペプチドにおいて決定することができる。このようにして、所与の活性又は相互作用に関与すると考えられるＦＶＩＩポリペプチドにおけるアミノ酸を決定することができる。さらに、ホモロジーモデリングを用いて、タンパク質／タンパク質相互作用の形成及び／又は安定化において重要な役割を有する残基を予想することができ、そして、この情報を用いて、特性が向上した変異体を設計することができる。
ＦＶＩＩポリペプチドの活性に関与するドメイン、領域、及び／又はアミノ酸が決定されれば、ポリペプチドの凝固活性を増大させると予想されるような改変を、それらに施すことができる。これは、標的化しようとする活性又は相互作用に応じたいくつかの方法で行うことができる。いくつかの例では、他のタンパク質又は分子に対する改変ＦＶＩＩの親和性を増大させる、１つ又は複数のアミノ酸の置換、挿入、又は欠失を行うことができる。
一例では、他のタンパク質に対する改変ＦＶＩＩの親和性又は相互作用が変化するように、即ち、改変しようとする標的の相互作用に応じて増大又は低下するように、任意のドメイン、領域、又はアミノ酸（複数可）に改変を行うことができる。そのような改変をもたらすために、そのような相互作用に関与するか又は関与すると考えられるドメイン、領域、及び／又はアミノ酸は知られているか、又は論理的に決定することができる。例えば、改変ＦＶＩＩを、ＴＦＰＩ又はＡＴ−ＩＩＩなどの阻害タンパク質との相互作用が低下するように論理的に設計して、改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性を増大させることができる。ＴＦＰＩとの相互作用が低下するようにＦＶＩＩポリペプチドを論理的に設計する方法を、実施例１に示す。ＦＶＩＩが相互作用又は結合することが知られている任意の他のポリペプチドとのＦＶＩＩの相互作用を増大又は低下させるために、類似のアプローチを実施することができる。
例えば、ＴＦＰＩに対する増大した抵抗性を示すように、ＦＶＩＩを改変した。ＦＸａと複合体を形成しているＴＦＰＩは、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体に結合して、ＦＶＩＩａの触媒活性が阻害されている四量体複合体を形成する。ＴＦＰＩ−１の第１のクニッツドメイン（ＴＦＰＩ−１ Ｋ１）は、ＦＶＩＩａとの相互作用及びＦＶＩＩａの阻害に関与するドメインである。この相互作用に関与するＦＶＩＩアミノ酸残基を同定することにより、ＴＦＰＩに対して抵抗性であるＦＶＩＩポリペプチドの設計が容易になり得る。ＦＶＩＩにおけるどのアミノ酸残基がこの相互作用に関与するかを決定するために、それだけに限らないが、突然変異誘発、スキャンアプローチ、及びコンピュータモデリングなどの論理的な設計を含めた、様々なアプローチを用いることができる。ＴＦＰＩと複合体を形成しているＦＶＩＩａの結晶構造を、接触残基を決定するための根拠として用いることができる。或いは、また実施例１に記載されるように、結晶構造が利用不可能な場合は、関連タンパク質の既知の構造及び配列並びにそれらの互いの相互作用から得られる、一連のアラインメント及び外挿法を介して、コンピュータモデルを生成することができる。
コンピュータモデリングの結果を用いて、例えばＴＦＰＩなどの所望の標的タンパク質との接触に直接関与する残基、及び／又は、例えば接触残基に非常に接近していることにより相互作用に間接的に関与している残基を同定することができる。例えば、実施例１に示すコンピュータモデリングの結果を用いて、ＴＦＰＩ−１及びＴＦＰＩ−２の第１のクニッツドメインのアラインメントを行い、ＴＦＰＩ−１において、どれが対応する「接触」残基であるかを決定した（図５ｂ）。ＦＶＩＩポリペプチドと標的タンパク質との相互作用を変化させるために、交換アミノ酸を同定することができる。交換アミノ酸は、最大で全１９個の他の天然に存在するアミノ酸、及び「非天然の」アミノ酸であり得る。或いは、そのような交換アミノ酸は、相互作用の論理的な推定に基づいたｉｎ ｓｉｌｉｃｏ突然変異誘発によって同定することができる。実施例１は、コンピュータモデルの分析によって第ＶＩＩ因子とＴＦＰＩ−１ Ｋ１との間の静電気的な相補性に関与する残基を明らかにするための、交換アミノ酸を同定するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのアプローチを示すものである。例えば、ＦＶＩＩの負に帯電したＤ６０（キモトリプシン番号付けによる）は、ＴＦＰＩ−１の正に帯電したＲ２０との静電気的な相互作用に関与すると考えられる。したがって、この残基は、ＴＦＰＩのＲ２０との静電気的な相補性が消え、それによりＴＦＰＩに対する抵抗性が増大した改変ＦＶＩＩポリペプチドが生じるような、突然変異誘発の候補である。これは、電荷反転置換又は電荷中和置換によって行うことができる。例えば、負に帯電したアスパラギン酸を正に帯電したリジンと交換するように、アミノ酸置換を行うことができる。そのような電荷反転置換は、この部位での電荷間の反発性の相互作用を確立し、ＴＦＰＩとＦＶＩＩａとの結合及び相互作用を妨げる。別の例では、ＦＶＩＩの負に帯電したＤ６０を塩基性アルギニンと交換して、ＴＦＰＩのＲ２０との正の静電的な補完性をなくし、好ましくない相互作用を導入することができる。そのような論理的に設計した改変を、ＴＦＰＩの残基との直接的又は間接的な接触及び相互作用に関与すると決定された１つ又は複数のＦＶＩＩ残基に施すことができる。
別の例では、ＦＶＩＩポリペプチドの論理的な改変は、ポリペプチドのドメイン又は領域の既知の機能に基づいて行うことができる。例えば、ＦＶＩＩのＧｌａドメインは、たとえ非常に弱いものであっても、活性化血小板上に存在するようなリン脂質へのＦＶＩＩａの結合に関与することが知られている。例えばＦＩＸ、ＦＸ、プロトロンビン、プロテインＣ、及びプロテインＳなどの、他のビタミンＫ依存性タンパク質もまた、負に帯電したリン脂質へのタンパク質の結合をもたらすＧｌａドメインを有し、多くの場合、ＦＶＩＩのＧｌａドメインよりも非常に大きな親和性を伴う。ＦＶＩＩポリペプチドへの異種Ｇｌａドメインの導入は、リン脂質に対するＦＶＩＩの親和性を増大させると考えられる。例えば、ＦＸ（及びＦＸａ）は、ＦＶＩＩ（及びＦＶＩＩａ）と比較して、リン脂質に対して比較的高い親和性を示す。したがって、一例では、ＦＸのＧｌａドメイン、又は、リン脂質への結合をもたらすために十分な、ＦＸのＧｌａドメインの部分を、ＦＶＩＩポリペプチドに導入し、キメラ改変ＦＶＩＩポリペプチドを生成することができる。
必要であれば、論理的及び実証的な方法の組合せを用いて、ＦＶＩＩポリペプチドを設計することができる。例えば、ポリペプチドを含むＧｌａドメインの結合を試験及びスクリーニングして、どのポリペプチドが、例えば血小板表面上のリン脂質に対して最も高い結合及び／又は親和性を示すかを同定することができる。その代わりに、又はそれに加えて、様々な異種Ｇｌａドメイン又はその十分な部分の導入を含有する一連のＦＶＩＩポリペプチドを試験して、どのキメラポリペプチドが、リン脂質に対して最も高い親和性及び／又は結合を示すかを決定することができる。
２．実証的（即ちスクリーニング）
改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、実証的に生成し、次に、試験又はスクリーニングを行って、目的の特定の活性又は特性を有するものを同定することができる。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、当技術分野において一般に知られている任意の方法を用いて、ＦＶＩＩポリペプチドの任意の１つ又は複数のアミノ酸残基を突然変異させることによって生成することができる（米国特許出願公開第２００４／０１４６９３８号明細書も参照されたい）。そのような改変ＦＶＩＩポリペプチドを、凝固の機能アッセイにおいて試験して、それらが凝固活性の増大についての「ヒット」であるかを決定することができる。ヒットは、それらがＴＦＰＩ又はＡＴ−ＩＩＩなどの阻害剤に対する抵抗性の増大を示すかどうか、及び／又はそれらがリン脂質への結合の増大若しくは半減期の増大などの薬物動態特性の向上を示すかどうかを決定するために、本明細書に記載されるか又は当業者に知られている任意のアッセイを用いて、さらに試験することができる。
ＦＶＩＩを突然変異させる方法の例には、配列全体にわたるランダム突然変異誘発をもたらす方法、又はＦＶＩＩ配列の選択された領域若しくはドメインの集中的な突然変異誘発をもたらす方法が含まれる。一例では、ポリペプチドに生じさせる突然変異の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０個、又はそれ以上である。
ａ．ランダム突然変異誘発
突然変異誘発に基づくタンパク質の指向的な変化のための、任意の様々な通常のアプローチを用いることができる。所望の特性を得るために、これらのいずれかを、単独で又は組み合わせて、ＦＶＩＩなどのポリペプチドの改変に用いることができる。そのような方法にはランダム突然変異誘発が含まれ、これは、開始タンパク質の配列におけるアミノ酸が、同一の分子上の異なるアミノ酸位置で同時に、単一又は複数の交換で２０個の天然アミノ酸のすべて（又は群）（及び非天然アミノ酸）によって交換されるものである。別の方法である制限ランダム突然変異誘発では、２０個の天然アミノ酸（及び非天然アミノ酸）のすべて若しくは一部又はＤＮＡ偏向残基が導入される。偏向は、ＤＮＡの配列に基づくものであり、「変化」している生物学的活性に関与することが予め知られているタンパク質の、それぞれ制限された領域又は所定の領域における確率的な又は半確率的なタンパク質の配列に基づくものではない。プロテアーゼを改変するための例示的な方法は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許仮出願第１０６７７９７７号明細書に記載されている。さらに、当技術分野で知られている任意の方法を、ＦＶＩＩプロテアーゼのポリペプチドなどのプロテアーゼのポリペプチド配列を改変又は変化させるために用いることができる。
ランダム突然変異誘発の方法には、例えば、大腸菌ＸＬ１ｒｅｄ、ＵＶ照射、脱アミノ、アルキル化、若しくは塩基が類似した突然変異原などによる化学的改変、又は、ＤＮＡシャッフリング、カセット突然変異誘発、部位特異的ランダム突然変異誘発、若しくはエラープローンＰＣＲなどのＰＣＲ法の使用が含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００６／０１１５８７４号明細書を参照されたい）。そのような例には、それだけに限らないが、ヒドロキシルアミンによる化学的改変（Ｒｕａｎ，Ｈ．ら（１９９７）Ｇｅｎｅ １８８：３５〜３９）、ｄＮＴＰ類似体の使用（Ｚａｃｃｏｌｏ，Ｍ．ら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：５８９〜６０３）、又は、例えばＧｅｎｅＭｏｒｐｈ ＰＣＲベースランダム突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）若しくはＤｉｖｅｒｓｉｆｙランダム突然変異誘発キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの市販されているランダム突然変異誘発キットの使用が含まれる。Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙランダム突然変異誘発キットでは、反応混合物中のマンガン（Ｍｎ２＋）又はｄＧＴＰの量を変化させることにより、所与のＤＮＡ配列についての所望の突然変異率（２〜８突然変異／１０００塩基対）を選択することが可能である。マンガンのレベルを上げると、まず突然変異率が増大し、さらに、ｄＧＴＰの濃度の増大によって突然変異率が増大する。ＰＣＲをさらに数回行うことで、さらに高い突然変異率を得ることができる。
ｂ．集中的な突然変異誘発
集中的な突然変異は、遺伝子配列の所定の領域、例えば、触媒活性に介在するプロテアーゼドメインの領域、リン脂質に結合するＧｌａドメインの領域、本明細書で提供されるような、ＴＦＰＩ、ＡＴ−ＩＩＩ、若しくはＺｎ２＋などの阻害剤若しくは分子を結合するＦＶＩＩポリペプチドの領域、又は、本明細書で提供されるような、ＦＶＩＩａのクリアランスに関与する因子又は受容体と相互作用するタンパク質の領域において、１つ又は複数の突然変異を生じさせることにより行うことができる。一例では、ポリペプチドの任意の１つ又は複数のアミノ酸を、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの、任意の標準的な単一の又は複数の部位特異的突然変異誘発キットを用いて突然変異させる。別の例では、プロテアーゼの任意の１つ又は複数のアミノ酸を、飽和突然変異誘発により突然変異させる（Ｚｈｅｎｇら（２００４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、３２：１１５）。例示的な一実施形態では、領域又はドメインの残基（複数可）を２０個の可能な天然アミノ酸（及び非天然アミノ酸）のそれぞれに突然変異させる飽和突然変異誘発技術が用いられる（例えば、Ｋｕｎｋｌｅ ｍｅｔｈｏｄ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｄｉａ Ｐａ．を参照されたい）。そのような技術において、選択されたアミノ酸（複数可）をコードする所望のコドン（複数可）でのヌクレオチドのランダム化を含有する縮重突然変異誘発オリゴヌクレオチドプライマーを合成することができる。例示的なランダム化方法には、Ｎが任意のヌクレオチドを示し、Ｓがグアニン又はシトシンを示し、Ｋがグアニン又はチミンを示す、ＮＮＳランダム化又はＮＮＫランダム化が含まれる。縮重突然変異誘発プライマーを一本鎖ＤＮＡ鋳型にアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼを加えて、鋳型の相補鎖を合成する。ライゲーションの後、二本鎖ＤＮＡ鋳型を、増幅のために、大腸菌内に形質転換する。
別の例では、集中的な突然変異誘発を、スクリーニングの最初の実施においてホットスポットとして同定されたアミノ酸に制限することができる。例えば、ラムダム突然変異誘発されたコンビナトリアルライブラリーから得られた改変ＦＶＩＩポリペプチドを選択すると、特定の位置又は領域で、不均衡な数の突然変異が観察され得る。これらは「ホットスポット」と呼ばれ、突然変異誘発及びスクリーニングの２回以上の実施を通して観察することができる。次に、改変ＦＶＩＩポリペプチドに機能アッセイを行って、ホットスポットでの突然変異が１つ又は複数の所望の特性又は活性と相関しているかを決定することができる。ホットスポットと所望の活性又は特性との間の相関が確認された場合は、次に、集中的な突然変異誘発を用いて、さらなる突然変異誘発のためにこれらのホットスポットを特異的に標的化することができる。この戦略では、ポリペプチド配列のランダム突然変異誘発によって生じる、より浅い突然変異誘発とは対照的に、特定の具体的な位置での、より多様で深い突然変異誘発が可能である。例えば、飽和突然変異誘発を用いて、これらの位置でＮＮｔ／ｇ又はＮＮｔ／ｃを含有するオリゴを用いるなどによって「ホットスポット」を突然変異させることができる。
ｃ．スクリーニング
改変ポリペプチドは、スクリーニングアッセイにおいて個々に試験することができるか、又はライブラリーなどにおけるコレクションとして試験することができる。一例では、ＦＶＩＩ変異体のポリペプチドは突然変異誘発によってランダムに生成し、個々にクローニングされる。次に、タンパク質の発現及び適当な活性の測定に従って、個々の各タンパク質突然変異体分子に対して活性の評価を個々に行う。いくつかの例では、個々のクローンが互いに物理的に分離され、個々の各ポリペプチドがアレイにおけるその位置に基づいて分かるように、アドレス可能なアレイにおいて個々のクローンをアッセイすることができる。例えば、それぞれの１つが、独立した突然変異誘発反応の単一の生成物である場合、特定の突然変異を、配列決定する必要なく容易に決定することができる。或いは、得られた改変ポリペプチドを配列決定し、活性をもたらす突然変異を決定することができる。
別の例では、改変ＦＶＩＩポリペプチドを、コレクションとして、又はライブラリーにおいてスクリーニングすることができる。例えば、ＦＶＩＩポリペプチドのライブラリーは、それだけに限らないが、ポリペプチド部分を提示することができる、ファージ、ウイルス、又は細菌などの、任意の複製可能なベクターを含めた、スクリーニングのための遺伝子パッケージ上にディスプレイすることができる。複数の提示されたポリペプチドは、ポリペプチドが標的ポリペプチドと結合及び／又は相互作用できるように、遺伝子パッケージによってディスプレイされる。例示的な遺伝子パッケージには、それだけに限らないが、バクテリオファージ（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｍａｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８；Ｇｌａｓｅｒら（１９９２）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ Ｃｏｎｄｏｎ−Ｂａｓｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ａ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｐｈａｇｅ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９：３９０３〜３９１３；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｍｕｌｔｉ−Ｓｕｂｕｎｉｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ Ｐｈａｇｅ：Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｆａｔｅ）Ｈｅａｖｙ ａｎｄ ３０ Ｌｉｇｈｔ Ｃｈａｉｎｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：４１３３〜４１３７０を参照されたい）、バキュロウイルス（例えば、Ｂｏｕｂｌｉｋら（１９９５）Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｊｏｒ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ（ＡＣＮＰＶ）ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｕｒｆａｃｅ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：１０７９〜１０８４を参照されたい）、細菌、及び、例えばファージが提示するプロテアーゼなどのタンパク質の提示に適した他のベクターが含まれる。例えば、目的のバクテリオファージには、それだけに限らないが、Ｔ４ファージ、Ｍ１３ファージ、及びＨＩファージが含まれる。遺伝子パッケージは、任意選択で、細菌宿主などにおいて増幅させる。
ファージディスプレイは当業者に知られており、例えば、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５２２３４０９号明細書、Ｒｏｄｉら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：９２〜９６、Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５〜１３１７、国際公開第９２／１８６１９号パンフレット、国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、国際公開第９２／２０７９１号パンフレット、国際公開第９２／１５６７９号パンフレット、国際公開第９３／０１２８８号パンフレット、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、国際公開第９２／０９６９０号パンフレット、国際公開第９０／０２８０９号パンフレット、ｄｅ Ｈａａｒｄら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７４：１８２１８〜３０、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１〜２０、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ２：３７１〜８、Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０〜１３７２、Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１〜８５、Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５〜７３４、Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６：８８９〜８９６、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８、Ｇｒａｍら（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：３５７６〜３５８０、Ｇａｒｒａｒｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３〜１３７７、Ｒｅｂａｒら（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：１２９〜４９、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：４１３３〜４１３７、及びＢａｒｂａｓら（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：７９７８〜７９８２に記載されている。例えばファージベクターなどのファージディスプレイに適した核酸は、当技術分野で知られている（例えば、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆら（２０００）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２８：１５９〜８１；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｋａｙら編、３５〜５３ページ；Ｃｏｒｅｙら（１９９３）Ｇｅｎｅ １２８（１）：１２９〜３４；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７（１６）：６３７８〜８２；Ｆｏｗｌｋｅｓら（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３（３）：４２２〜８、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９（１５）：４１３３〜７；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８（６３０１）：５５２〜４；ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら（１９９４）Ｇｅｎｅ １５１（１〜２）：１１５〜８；Ｓｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９（４９６７）：３８６〜９０を参照されたい）。
スクリーニングのための変異ＦＶＩＩポリペプチドのライブラリーもまた、例えば原核細胞又は真核細胞である細胞の表面上に発現させることができる。細胞表面での発現のための例示的な細胞には、それだけに限らないが、細菌、酵母、昆虫細胞、鳥細胞、植物細胞、及び哺乳動物細胞が含まれる（Ｃｈｅｎ及びＧｅｏｒｇｉｏｕ（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ７９：４９６〜５０３）。一例では、発現のための細菌細胞は大腸菌である。
変異ポリペプチドを、膜タンパク質又は細胞表面関連タンパク質などの細胞の表面上に発現するタンパク質との融合タンパク質として発現させることができる。例えば、変異プロテアーゼは、主要な大腸菌リポタンパク質（Ｌｐｐ）と外膜タンパク質ＯｍｐＡ又は細胞表面関連タンパク質（例えば、線毛及び鞭毛のサブユニット）との遺伝子操作されたハイブリッド分子である、大腸菌の外膜タンパク質（例えばＯｍｐＡ）との融合タンパク質として、大腸菌内に発現し得る。通常、細菌の外膜タンパク質が異種ペプチド又は異種タンパク質の提示に用いられる場合、それは、キャリアータンパク質の許容部位内への遺伝子の挿入を介して行われる。異種ペプチド又は異種タンパク質の発現は、挿入されたタンパク質ドメインの構造的特性に依存するが、それは、そのペプチド又はタンパク質が、許容部位に挿入された場合、タンパク質のＮ末端又はＣ末端での融合と比較して、より制約されるからである。柔軟なペプチドリンカー若しくはスペーサー配列の挿入、又は細菌タンパク質の改変（例えば、アミノ酸配列における突然変異、挿入、若しくは欠失による）などの、融合タンパク質に対する改変を行って、融合タンパク質の発現を向上させることができる。β−ラクタマーゼ及びＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｉｍｉのＣｅｘエキソグルカナーゼなどの酵素は、大腸菌の表面上にＬｐｐ−ＯｍｐＡ融合タンパク質として発現させることに成功している（Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｊ．Ａ．及びＧｅｏｒｇｉｏｕ Ｇ．Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．７４５：３７２〜３８２（１９９４）、並びにＧｅｏｒｇｉｏｕ Ｇ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９：２３９〜２４７（１９９６））。１５〜５１４個のアミノ酸からなる他のペプチドが、ＯｍｐＡの表面上の第２、第３、及び第４の外部ループ内に提示されている（Ｓａｍｕｅｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９６：１２９〜１５４（２００２））。したがって、外膜タンパク質は、細菌の外表面上に異種遺伝子産物を担持及び提示し得る。
変異ポリペプチドのライブラリーをスクリーニングするために他の提示形式を用いることも可能である。例示的な他の提示形式には、核酸−タンパク質融合、リボザイムディスプレイ（例えば、Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１３：４９３７〜４９４２を参照されたい）、ビーズディスプレイ（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５４、８２〜８４；Ｋ．Ｓ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５４、８２〜８４；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ、３５４、８４〜８６；Ｆｕｒｋａ，Ａ．ら（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３７、４８７〜４９３；Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．、９７、４１１〜４４８、米国特許出願公開第２００４／０２３５０５４号明細書）、並びにタンパク質アレイ（例えば、Ｃａｈｉｌｌ（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５０：８１〜９１；国際公開第０１／４０８０３号パンフレット、国際公開第９９／５１７７３号パンフレット、及び米国特許出願公開第２００２／０１９２６７３号明細書を参照されたい）が含まれる。
特定の他の場合では、むしろ変異ポリペプチド又はファージライブラリー又は変異ポリペプチドを発現する細胞を固体担体に付着させることが有利であり得る。例えば、いくつかの例では、変異ＦＶＩＩポリペプチドを発現する細胞を、ビーズ群がビーズ当たり１個の細胞を含有するように、ビーズに自然に吸着させることができる（Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００４）８６：１９６〜２００）。ガラス担体へ固定させた後、微小コロニーを成長させ、それを発色基質又は蛍光基質でスクリーニングすることができる。別の例では、変異ＦＶＩＩポリペプチド又はファージライブラリー又は変異プロテアーゼを発現する細胞を滴定プレート内にアレイし、固定することができる。
凝固活性の増大を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドを同定するために、改変ＦＶＩＩポリペプチドを個々に又はライブラリー内でスクリーニングし、ＴＦＰＩ及びＡＴ−ＩＩＩなどの阻害剤に対する抵抗性の増大、活性化血小板へのリン脂質の結合の増大、半減期の増大を示すもの、並びに／又は触媒活性の増大を示すものを同定するために、機能アッセイにおいて試験する。そのようなアッセイは本明細書に記載されているか、又は当業者に知られている。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、タンパク質分解活性について試験される。ＦＶＩＩポリペプチドを単独で、又はＴＦの存在下で、ペプチジル基質Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｂｕｔ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．ＡｃＯＨ）などの様々な濃度の発色基質とインキュベートする。基質の切断を吸光度によってモニターし、基質の加水分解の速度を、入手が容易なソフトウェアを用いた線形回帰によって決定する。さらなる実施例では、ＴＦＰＩ又はＡＴ−ＩＩＩに対する改変ＦＶＩＩポリペプチドの抵抗性を、阻害剤と、場合によってはＴＦとプレインキュベートされているＦＶＩＩポリペプチドとをインキュベートすることにより評価する。次に、ＦＶＩＩの活性を、当技術分野において知られている任意の１つ若しくは複数の活性アッセイ又は凝固アッセイを用いて測定し、ＴＦＰＩ又はＡＴ−ＩＩＩによる阻害を、阻害剤とインキュベートしたＦＶＩＩポリペプチドの活性と、阻害剤とインキュベートしていないＦＶＩＩポリペプチドの活性とを比較することにより評価する。
候補ポリペプチドの特定の突然変異は、配列決定などの通常の組換えＤＮＡ技術を用いて決定することができる。一例では、改変ＦＶＩＩポリペプチドの特性及び／又は凝固活性をさらに増大させるために、「ヒット」の組合せを作成することができる。
３．ＦＶＩＩ変異体の選択
任意の１つ又は複数の上記のアプローチによって設計及び同定されたＦＶＩＩポリペプチド変異体を、所望の特性又は活性を示す候補ＦＶＩＩポリペプチドを同定するために選択することができる。変異ＦＶＩＩポリペプチドの選択は、１）まず、改変する特定の活性又は特性（即ち、ＴＦＰＩに対する抵抗性、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性、Ｚｎ２＋結合、触媒活性、半減期、リン脂質に対する結合及び／又は親和性）について変異ポリペプチドを試験し、２）第２に、止血及び凝固に必要なＦＶＩＩ活性の保持について変異ポリペプチドを試験することに基づく。凝固に必要なＦＶＩＩ活性には、例えば、第Ｘ因子（ＦＸ）の活性化又は第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の活性化をもたらすためなどの、酵素活性、タンパク質分解活性、又は触媒活性が含まれる。評価し得る他のＦＶＩＩ活性には、それだけに限らないが、抗原性、組織因子、第Ｘ因子又は第ＩＸ因子を結合する能力、及びリン脂質に結合する能力が含まれる。したがって、本明細書で提供されるか、又は本明細書で提供される方法において同定される任意のもののような、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、増大又は低下したある程度のレベルの、凝固活性に必要なＦＶＩＩ活性を保持していなくてはならない。上記の２つの評価のそれぞれを行うために、当技術分野において知られているか又は本明細書において以下に記載される標準的なアッセイをｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。例えば、ＦＶＩＩのタンパク質分解活性又は触媒活性を、合成基質の切断の測定又は第Ｘ因子の活性化の測定を含めた様々な方法を用いて評価することができ（例えば、以下の実施例４、５、及び１１を参照されたい）、ＴＦＰＩ又はＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性を、それぞれＴＦＰＩ又はＡＴ−ＩＩＩによる阻害についてアッセイすることにより評価することができる（例えば、実施例７、１２、及び１６を参照されたい）。さらに、例えば実施例８及び１４に記載されているような、凝固促進活性についてのｉｎ ｖｉｖｏでのアッセイも用いることができる。
任意の候補ＦＶＩＩポリペプチド変異体の全体的な効果は、凝固促進活性を示すことである。例えば、変異ポリペプチドは、ＴＦＰＩに対する抵抗性、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性、半減期、並びに／又は、リン脂質に対する結合及び／若しくは親和性が増大し得るが、同時に、触媒活性の増大も示す。そのようなＦＶＩＩポリペプチドが、凝固活性を増大させるための候補ＦＶＩＩ変異体として選択される。
しかし、いくつかの場合では、ＴＦＰＩに対する抵抗性の増大、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大、半減期の増大、又はリン脂質に対する結合及び／若しくは親和性の増大の任意の１つ又は複数により凝固活性が増大するように改変されたＦＶＩＩポリペプチドは、特定の改変の結果、触媒活性、又は凝固に必要な他の活性の低下も示すことがある。これらの効果は、例えば、別の分子への結合に干渉する改変ＦＶＩＩポリペプチドにおける高次構造の変化、活性部位の改変をもたらす高次構造の変化、又は、別の分子との相互作用に関与する１つ若しくは複数のアミノ酸残基を直接的に伴うアミノ酸置換によるものであり得る。
したがって、別の例では、ＴＦＰＩに対する抵抗性、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性、半減期、及び／又はリン脂質に対する親和性が増大した変異ポリペプチドは、触媒活性の同時的な低下を示し得る。凝固活性の向上を確実にするために許容される、触媒活性などのＦＶＩＩ活性の低下レベルは、向上のために改変される特性の同時的な増大（即ち、ＴＦＰＩに対する抵抗性の増大）に依存し、実証的に決定することができる。したがって、特性の向上を示し、同時に、凝固をもたらすために少なくとも十分なＦＶＩＩ活性即ち触媒活性を保持する、変異ポリペプチドを同定するために、上記のそのような評価の結果を釣り合わせることができる。典型的には、改変しようとする特性の増大が大きいほど（即ち、ＴＦＰＩに対する抵抗性の増大が大きいほど）、タンパク質分解活性又は触媒活性の許容される低減が大きい。
例えば、ＴＦＰＩ又はＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性が１００倍増大したＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性と比較して、ちょうど又は約１．５倍、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０倍、又はそれ以上低下した、タンパク質分解活性又は触媒活性の低下を示し得、依然として、凝固活性を増大させるための有望な候補であり得る。逆に、ＴＦＰＩ又はＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性が１０倍増大すれば、全体的な凝固促進活性を維持するための触媒活性の低下レベルは、典型的には、非改変ポリペプチドの触媒活性と比較して、ちょうど又は約１．５倍、２、３、４、５、６、７、８、９倍、又はそれ以上の低下である。当業者であれば、ＴＦＰＩ抵抗性、ＡＴ−ＩＩＩ抵抗性、活性化血小板の結合、半減期、及びタンパク質分解活性若しくは触媒活性、又は任意の他の活性若しくは特性における同時的な変化を評価して、改変ＦＶＩＩポリペプチドが、例えば血友病患者における出血症状を治療するためなどの凝固促進治療剤として有用であるかを決定することができる。
Ｆ．ＦＶＩＩポリペプチドの生成
改変ＦＶＩＩポリペプチドを含めたＦＶＩＩポリペプチド、又はＦＶＩＩ若しくは他のビタミンＫポリペプチドにおけるそのドメインは、タンパク質精製及び組換えタンパク質発現のための、当技術分野で周知の方法によって得ることができる。所望の遺伝子をコードする核酸を同定するための、当業者に知られている任意の方法を用いることができる。当技術分野で利用可能な任意の方法を用いて、例えば肝臓などの細胞源又は組織源などから、ＦＶＩＩポリペプチド又は他のビタミンＫポリペプチドをコードする完全長の（即ち、全コード領域を含む）ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡのクローンを得ることができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、部位特異的突然変異誘発などによって、本明細書に記載されるように操作することができる。
ＦＶＩＩは、核酸分子をクローニング及び単離するための、当技術分野において知られている任意の利用可能な方法を用いてクローニング又は単離することができる。そのような方法には、核酸のＰＣＲ増幅、並びに、核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体に基づいたスクリーニング、及び活性に基づいたスクリーニングを含む、ライブラリーのスクリーニングが含まれる。
例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を含む、核酸の増幅方法を用いて、ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸分子を単離することができる。材料を含有する核酸を開始材料として用いることができ、そこからＦＶＩＩをコードする核酸分子を単離することができる。例えば、ＤＮＡ及びｍＲＮＡの調製物、細胞抽出物、組織抽出物（例えば肝臓から）、流体試料（例えば、血液、血清、唾液）、健康な及び／又は疾患を有する対象から得た試料を、増幅法に用いることができる。核酸ライブラリーも開始材料の由来源として用いることができる。ＦＶＩＩをコードする分子を増幅するために、プライマーを設計することができる。例えば、プライマーは、ＦＶＩＩを生じさせる、発現した配列に基づいて設計することができる。プライマーは、ＦＶＩＩアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計することができる。増幅により生成した核酸分子を配列決定し、ＦＶＩＩポリペプチドをコードすることを確認することができる。
さらなるヌクレオチド配列を、合成遺伝子をベクター内にクローニングするための制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列を含む、ＦＶＩＩをコードする核酸分子に結合させることができ、このベクターは例えば、タンパク質発現ベクター、又は核タンパク質をコードするＤＮＡ配列の増幅のために設計されたベクターである。さらに、機能的なＤＮＡエレメントを特定するさらなるヌクレオチド配列を、ＦＶＩＩをコードする核酸分子に作動的に連結することができる。そのような配列の例には、それだけに限らないが、細胞内タンパク質の発現を容易にするように設計されたプロモーター配列、及びタンパク質の分泌を容易にするように設計された分泌配列が含まれる。タンパク質結合領域を特定する配列などのさらなるヌクレオチド配列も、ＦＶＩＩをコードする核酸分子に連結させることができる。そのような領域には、それだけに限らないが、特定の標的細胞内へのＦＶＩＩの取り込みを容易にするための配列、或いは合成遺伝子の薬物動態を増強するための配列が含まれる。
次に、同定及び単離された核酸を、適切なクローニングベクター内に挿入することができる。当技術分野で知られている多くのベクター−宿主系を用いることができる。可能なベクターには、それだけに限らないが、プラスミド又は改変ウイルスが含まれるが、ベクター系は、用いる宿主細胞に適合するものでなくてはならない。そのようなベクターには、それだけに限らないが、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、又はｐＢＲ３２２若しくはｐＵＣプラスミド誘導体などのプラスミド、又はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）が含まれる。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的な粘着末端を有するクローニングベクター内にＤＮＡ断片をライゲーションすることによって行うことができる。挿入は、ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて行うことができる。ＤＮＡを断片化するために用いる相補的制限部位がクローニングベクター内に存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端を酵素により改変することができる。或いは、ＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカー）をライゲーションすることにより、任意の所望の部位を生じさせることができる。これらのライゲーションされたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする、特異的な化学合成されたオリゴヌクレオチドを含有し得る。別の方法では、切断されたベクター及びＦＶＩＩタンパク質遺伝子を、ホモポリマーテーリングによって改変することができる。組換え分子を、例えば、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション、及びソノポレーションを介して、宿主細胞に導入し、遺伝子配列の多くのコピーを生成することができる。
具体的な実施形態では、単離されたＦＶＩＩタンパク質の遺伝子、ｃＤＮＡ、又は合成ＤＮＡ配列を組み込む組換えＤＮＡ分子での宿主細胞の形質転換により、遺伝子の複数のコピーの生成が可能になる。したがって、形質転換体の成長、形質転換体からの組換えＤＮＡ分子の単離、及び必要であれば、単離された組換えＤＮＡからの挿入遺伝子の回収によって、遺伝子を大量に得ることができる。
１．ベクター及び細胞
１つ又は複数のＦＶＩＩタンパク質の組換え発現のために、ＦＶＩＩタンパク質をコードするヌクレオチド配列のすべて又は一部を含有する核酸を、適切な発現ベクター、即ち、挿入されたタンパク質コード配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含有するベクター内に挿入することができる。例示的なそのようなベクターは、例えばｐＣＭＶなどの、任意の哺乳動物発現ベクターである。ＦＶＩＩ遺伝子の天然プロモーター及び／又はそれらのフランキング領域により、必要な転写シグナル及び翻訳シグナルも供給され得る。
ＦＶＩＩ又は改変ＦＶＩＩをコードする核酸を含有するベクターも提供される。ベクターを含有する細胞も提供される。細胞は真核細胞及び原核細胞を含み、ベクターは、それらにおける使用に適した任意のものである。
ベクターを含有する、内皮細胞を含む原核細胞及び真核細胞が提供される。そのような細胞には、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞、及び動物細胞が含まれる。細胞を用いて、コードされるＦＶＩＩタンパク質を細胞が発現する条件下で上記の細胞を成長させ、発現したＦＶＩＩタンパク質を回収することにより、ＦＶＩＩポリペプチド又はその改変ＦＶＩＩポリペプチドを生成する。本明細書における目的のために、ＦＶＩＩを培地内に分泌させることができる。
一実施形態では、ＦＶＩＩ活性を有しＦＶＩＩポリペプチドのすべて若しくは一部又はその複数のコピーを含有するポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含有するベクターが提供される。ベクターは、細胞におけるＦＶＩＩポリペプチド又はその改変ＦＶＩＩポリペプチドの発現について選択することができるか、又は、ＦＶＩＩタンパク質が分泌タンパク質として発現するように選択することができる。ＦＶＩＩが発現すると、核酸は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα接合因子シグナル配列若しくはその一部などの分泌シグナル又は天然のシグナル配列をコードする核酸に連結する。
様々な宿主−ベクター系を、タンパク質をコードする配列の発現に用いることができる。これらには、それだけに限らないが、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、及び他のウイルス）に感染した哺乳動物細胞系、ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系、酵母ベクターを含有する酵母などの微生物、又は、バクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、若しくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が含まれる。ベクターの発現エレメントは、強度及び特異性において様々である。用いる宿主−ベクター系に応じて、多くの適切な転写エレメント及び翻訳エレメントの任意の１つを用いることができる。
ベクター内へのＤＮＡ断片の挿入のための、当業者に知られている任意の方法を用いて、適切な転写／翻訳調節シグナル及びタンパク質をコードする配列を含有するキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組換えＤＮＡ及び合成技術、並びにｉｎ ｖｉｖｏでの組換え体（遺伝子組換え）が含まれ得る。ＦＶＩＩポリペプチド又は改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸配列、又は、そのドメイン、誘導体、断片、若しくは類似体の発現を、第２の核酸配列によって制御して、遺伝子又はその断片を、組換えＤＮＡ分子（複数可）で形質転換された宿主において発現させることができる。例えば、タンパク質の発現は、当技術分野において知られている任意のプロモーター／エンハンサーによって調節することができる。具体的な実施形態では、プロモーターはＦＶＩＩタンパク質の遺伝子に由来するものではない。用いることができるプロモーターには、それだけに限らないが、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ及びＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４〜３１０（１９８１））；ラウス肉腫ウイルスの長い３’末端反復に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ ２２：７８７〜７９７（１９８０））；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４１〜１４４５（１９８１））；メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９〜４２（１９８２））；βラクタマーゼプロモーターなどの原核細胞発現ベクター（Ｊａｙら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：５５４３）；又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１〜２５（１９８３））；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：７９〜９４（１９８０）の「Ｕｓｅｆｕｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ」も参照されたい）；ノパリン合成酵素プロモーターを含有する植物発現ベクター（Ｈｅｒｒａｒ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ ３０３：２０９〜２１３（１９８４））又はカリフラワーモザイクウイルス３５ＳのＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９：２８７１（１９８１））；及び光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１１５〜１２０（１９８４））；Ｇａｌ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリフォスファターゼプロモーターなどの酵母及び他の真菌から得られるプロモーターエレメント；並びに、組織特異性を示しトランスジェニック動物において用いられている動物転写調節領域である、膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔら、Ｃｅｌｌ ３８：６３９〜６４６（１９８４）；Ｏｒｎｉｔｚら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９〜４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５〜５１５（１９８７））、膵臓ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５〜１２２（１９８５））、リンパ細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、Ｃｅｌｌ ３８：６４７〜６５８（１９８４）；Ａｄａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３〜５３８（１９８５）、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：１４３６〜１４４４（１９８７））、精巣細胞、乳腺細胞、リンパ細胞、及び肥満細胞において活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒら、Ｃｅｌｌ ４５：４８５〜４９５（１９８６））、肝臓において活性なアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｃｋｅｒｔら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８〜２７６（１９８７））、肝臓において活性なアルファ−フェトプロテイン遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９〜１６４８（１９８５）；Ｈａｍｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３〜５８ １９８７））、肝臓において活性なα−１抗トリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１〜１７１（１９８７））、骨髄細胞において活性なベータグロビン遺伝子調節領域（Ｍｏｇｒａｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８〜３４０（１９８５）；Ｋｏｌｌｉａｓら、Ｃｅｌｌ ４６：８９〜９４（１９８６））、脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、Ｃｅｌｌ ４８：７０３〜７１２（１９８７））、骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Ｓａｎｉ、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３〜２８６（１９８５））、及び視床下部の性腺刺激ホルモン分泌細胞において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２〜１３７８（１９８６））が含まれる。
具体的な実施形態では、ＦＶＩＩポリペプチド若しくは改変ＦＶＩＩポリペプチド、又はそのドメイン、断片、誘導体、若しくは類似体をコードする核酸に作動的に連結したプロモーターと、１つ又は複数の複製起点と、任意選択で１つ又は複数の選択可能なマーカー（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子）とを含有するベクターが用いられる。ＦＶＩＩポリペプチドの発現のためのベクター及び系には、周知のピチアベクター（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）、とりわけ、コードされたタンパク質の分泌のために設計されたピチアベクターが含まれる。哺乳動物細胞における発現のための例示的なプラスミドベクターには、例えばｐＣＭＶが含まれる。大腸菌細胞の形質転換のための例示的なプラスミドベクターには、例えばｐＱＥ発現ベクター（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡから入手可能；また、Ｑｉａｇｅｎから発行された、この系を記載している文献も参照されたい）が含まれる。ｐＱＥベクターは、ファージＴ５プロモーター（大腸菌ＲＮＡポリメラーゼにより認識される）、及び大腸菌における組換えタンパク質の非常に良く制御された高レベルの発現を得るためのダブルｌａｃオペレーター抑制モジュール、効率的な翻訳のための合成リボソーム結合部位（ＲＢＳ ＩＩ）、６ＸＨｉｓタグをコードする配列、ｔ０及びＴ１転写ターミネーター、ＣｏｌＥ１複製起点、並びにアンピシリン抵抗性をもたらすβ−ラクタマーゼ遺伝子を有する。ｐＱＥベクターは、組換えタンパク質のＮ末端又はＣ末端に６ｘＨｉｓタグを位置させることが可能である。そのようなプラスミドには、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ３０、及びｐＱＥ３１が含まれ、これらは、すべての３つのリーディングフレームについて複数のクローニング部位を提供し、Ｎ末端での６ｘＨｉｓタグ化タンパク質の発現をもたらすものである。大腸菌細胞の形質転換のための他の例示的なプラスミドベクターには、例えば、ｐＥＴ発現ベクター（米国特許第４９５２４９６号明細書を参照；ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから入手可能；また、Ｎｏｖａｇｅｎから発行された、この系を記載している文献も参照されたい）が含まれる。そのようなプラスミドには、Ｔ７ｌａｃプロモーター、Ｔ７ターミネーター、誘導性大腸菌ｌａｃオペレーター、及びｌａｃリプレッサーの遺伝子を含有するｐＥＴ１１ａ；Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、及び大腸菌ｏｍｐＴ分泌シグナルを含有するｐＥＴ１２ａ〜ｃ；並びに、Ｈｉｓカラムでの精製において用いるためのヒスタグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）（商標）リーダー配列及びカラム上での精製の後の切断を可能にするトロンビン切断部位、Ｔ７−ｌａｃプロモーター領域及びＴ７ターミネーターを含有する、ｐＥＴ１５ｂ及びｐＥＴ１９ｂ（ＮＯＶＡＧＥＮ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）が含まれる。
２．発現系
ＦＶＩＩポリペプチド（改変型及び非改変型）は、例えば、宿主細胞、宿主動物へのＦＶＩＩをコードする核酸分子の導入、及びＦＶＩＩをコードする核酸分子からのｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現などの、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの方法を含むタンパク質の生成のための、当技術分野において知られている任意の方法によって生成することができる。ＦＶＩＩポリペプチド及び改変ＦＶＩＩポリペプチドは、投与及び治療に必要な所望の量及び形態のＦＶＩＩポリペプチドの生成に適している、任意の生物において発現させることができる。発現宿主には、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞株を含む哺乳動物細胞、及びトランスジェニック動物などの、原核生物及び真核生物が含まれる。発現宿主は、タンパク質生成レベル、及び発現したタンパク質上に存在する翻訳後修飾のタイプにおいて異なり得る。発現宿主の選択は、これらの要素と、制御上及び安全上の検討事項、生成コスト、並びに精製の必要性及び方法などの他の要素とに基づいて行うことができる。
真核宿主における発現には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉａなどの酵母、ショウジョウバエ細胞及び鱗翅目細胞などの昆虫細胞、並びにタバコ、トウモロコシ、コメ、藻類、及びアオウキクサなどの植物及び植物細胞における発現が含まれ得る。発現のための真核細胞にはまた、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞又はベビーハムスターの腎臓（ＢＨＫ）細胞などの哺乳動物細胞株が含まれる。真核発現宿主にはまた、例えば血清、乳、及び卵における生成を含む、トランスジェニック動物における生成が含まれる。野生型ＦＶＩＩポリペプチドの生成のためのトランスジェニック動物は、当技術分野において知られており（米国特許出願公開第２００２／０１６６１３０号明細書及び米国特許出願公開第２００４／０１３３９３０号明細書）、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドの生成に適合させることができる。
ＦＶＩＩの発現のために、多くの発現ベクターが利用可能であり、当業者に知られている。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択に影響される。このような選択は当業者の技術レベルに十分に含まれるものである。通常、発現ベクターは転写プロモーターを含み得、任意選択でエンハンサー、翻訳シグナル、並びに転写終結シグナル及び翻訳終結シグナルを含み得る。安定な形質転換に用いられる発現ベクターは、典型的には、形質転換細胞の選択及び維持を可能にする選択可能なマーカーを有する。いくつかの場合では、複製起点を用いて細胞におけるベクターのコピー数を増幅することができる。
ＦＶＩＩポリペプチド又は改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、タンパク質融合体として用いるか又は発現させることができる。例えば、融合体を生成して、ポリペプチドにさらなる機能性を加えることができる。融合タンパク質の例には、それだけに限らないが、シグナル配列と、例えばｈｉｓ６タグ若しくはｍｙｃタグなどの位置決定などのためのタグ又は例えばＧＳＴ融合体などの精製のためのタグと、タンパク質分泌及び／又は膜結合を導くための配列との融合体が含まれる。
一実施形態では、ＦＶＩＩポリペプチド又は改変ＦＶＩＩポリペプチドは活性形態で発現し得、それにより、分泌後に、ポリペプチドの自己活性化によって活性化が得られる。別の実施形態では、プロテアーゼは不活性な酵素原形態で発現する。
ＦＶＩＩポリペプチドの生成方法には、ＦＶＩＩポリペプチドの生成に有用であり得る１つ又は複数のさらなる異種ポリペプチドの共発現が含まれ得る。例えば、そのようなポリペプチドは、ＦＶＩＩポリペプチドの翻訳後のプロセシングに寄与し得る。例示的なポリペプチドには、例えば、それだけに限らないが、プロペプチド配列などのＦＶＩＩ前駆体配列の切断を促進するペプチダーゼ、及び、グリコシル化、ヒドロキシル化、カルボキシル化、又はリン酸化などによるＦＶＩＩポリペプチドの改変に関与する酵素が含まれる。ＦＶＩＩと共発現し得る例示的なペプチダーゼは、ＦＶＩＩプロペプチド配列の切断に有用であるＰＡＣＥ／ｆｕｒｉｎ（又はＰＡＣＥ−ＳＯＬ）である。ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシル化に有用である例示的なタンパク質は、ビタミンＫ依存性のγ−カルボキシラーゼによって補因子として用いられる還元型ビタミンＫを生成する、ワルファリン感受性の酵素であるビタミンＫ２，３−エポキシド還元酵素（ＶＫＯＲ）である（Ｗａｊｉｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（３６）３１６０３〜３１６０７）。この酵素のサブユニットであるＶＫＯＲＣ１は、改変ＦＶＩＩポリペプチドと共発現して、γ−カルボキシル化を増大させ得る。１つ又は複数のさらなるポリペプチドを、ＦＶＩＩポリペプチドと同一の発現ベクター又は異なるベクターから発現させることができる。
ａ．原核性の発現
原核生物、とりわけ大腸菌は、大量のＦＶＩＩを生成するための系を提供するものである（例えば、Ｐｌａｔｉｓら（２００３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３１（２）：２２２〜３０、及びＫｈａｌｉｚｚａｄｅｈら（２００４）Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（２）：６３〜６９を参照されたい）。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の単純で迅速な技術である。大腸菌のための発現ベクターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するため及び宿主細胞に対するいくらかの毒性を示すタンパク質を発現させるために有用な誘導性プロモーターを含有し得る。誘導性プロモーターの例には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７及びＳＰ６ ＲＮＡプロモーター、並びに温度制御されたλＰＬプロモーターが含まれる。
ＦＶＩＩは大腸菌の細胞質環境において発現し得る。細胞質は還元性の環境であり、いくつかの分子では、これにより不溶性の封入体が形成され得る。ジチオトレイトール及びβ−メルカプトエタノールなどの還元剤並びに変性剤（例えば、グアニジン−ＨＣｌ及び尿素など）を用いて、タンパク質を再可溶化することができる。別のアプローチは、可溶性タンパク質の生成をもたらす酸化環境並びにシャペロニン様イソメラーゼ及びジスルフィドイソメラーゼをもたらす、細菌のペリプラズム空間におけるＦＶＩＩの発現である。典型的には、発現させようとするタンパク質に、タンパク質をペリプラズムに向かわせるリーダー配列を融合する。次に、ペリプラズム内部で、シグナルペプチダーゼによってリーダーを除去する。ぺリプラズムを標的化するリーダー配列の例には、ペクチン酸リアーゼ遺伝子のｐｅｌＢリーダー及びアルカリホスファターゼ遺伝子に由来するリーダーが含まれる。いくつかの場合では、ペリプラズムでの発現により、培地内への発現したタンパク質の漏出が可能となる。タンパク質の分泌により、培養上清からの迅速で単純な精製が可能となる。分泌されないタンパク質は、浸透圧溶解によりペリプラズムから得ることができる。細胞質での発現と類似して、いくつかの場合では、タンパク質は不溶性となり得、変性剤及び還元剤を用いて可溶化及びリフォールディングを容易にすることができる。誘導及び成長の温度もまた、発現レベル及び溶解度に影響を及ぼし得る。典型的には、２５℃〜３７℃の温度が用いられる。発現したタンパク質の溶解度を増大させるために突然変異も用いることができる。典型的には、細菌はアグリコシル化タンパク質を生成する。したがって、タンパク質の機能にグリコシル化が必要である場合、グリコシル化を、宿主細胞からの精製の後にｉｎ ｖｉｔｒｏで加えることができる。
ｂ．酵母
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、及びＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓなどの酵母は、ＦＶＩＩの有用な発現宿主である（例えば、Ｓｋｏｋｏら（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８（Ｐｔ３）：２５７〜６５を参照されたい）。酵母は、エピソーム複製ベクターを用いて、又は相同組換えによる安定な染色体組み込みによって、形質転換することができる。典型的には、誘導性プロモーターを用いて遺伝子発現を制御する。そのようなプロモーターの例には、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、及びＧＡＬ５、並びにＣＵＰ１などのメタロチオネインプロモーターが含まれる。発現ベクターには、形質転換ＤＮＡの選択及び維持のために、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３、及びＵＲＡ３などの選択可能なマーカーが含まれることが多い。酵母内で発現したタンパク質は可溶性であることが多く、Ｂｉｐなどのシャペロニン及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの共発現により、発現レベル及び溶解度が向上し得る。さらに、酵母内で発現したタンパク質は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから得た酵母接合型α因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合体、及び、Ａｇａ２ｐ接合接着受容体又はＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓのグルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合体を用いて、分泌に指向され得る。ポリペプチドが分泌経路を出るようにポリペプチドから融合配列を除去するために、プロテアーゼ切断部位（例えば、Ｋｅｘ−２プロテアーゼ）を操作することができる。酵母はまた、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフでのグリコシル化も可能である。
ｃ．昆虫及び昆虫細胞
とりわけバキュロウイルス発現系を用いた、昆虫及び昆虫細胞は、ＦＶＩＩ又はその改変形態などのポリペプチドの発現に有用である（例えば、Ｍｕｎｅｔａら（２００３）Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．６５（２）：２１９〜２３を参照されたい）。血リンパにおける発現を含む昆虫細胞及び昆虫の幼虫は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物により用いられる翻訳後修飾のほとんどが可能である。バキュロウイルスは、安全性を向上させ真核性発現の制御上の懸念を低減させる、制限的な宿主範囲を有する。典型的には、発現ベクターは、高レベルの発現のために、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを用いる。一般に用いられるバキュロウイルス系には、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）、及びカイコガ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）、並びに、ヨウトガ、Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ（Ａ７Ｓ）、及びオオカバマダラ（ＤｐＮ１）に由来するＳｆ９などの昆虫細胞系などのバキュロウイルスが含まれる。高レベルの発現のためには、発現させようとする分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリンの開始コドンの下流に直接に融合する。哺乳動物の分泌シグナルは昆虫細胞内で正確にプロセシングされ、培地内への発現したタンパク質の分泌に用いることができる。さらに、細胞株Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ（Ａ７Ｓ）及びオオカバマダラ（ＤｐＮ１）は、哺乳動物細胞系に類似したグリコシル化パターンを有するタンパク質を生成する。
昆虫細胞における別の発現系は、安定に形質転換された細胞の使用である。Ｓｃｈｎｉｅｄｅｒ ２（Ｓ２）などの細胞株並びにＫｃ細胞（キイロショウジョウバエ）及びＣ７細胞（ヒトスジシマカ）を発現に用いることができる。ショウジョウバエのメタロチオネインプロモーターを用いて、カドミウム又は銅での重金属誘発の存在下で高レベルの発現を誘発することができる。発現ベクターは、典型的には、ネオマイシン及びハイグロマイシンなどの選択可能なマーカーを用いて維持される。
ｄ．哺乳動物細胞
哺乳動物発現系をＦＶＩＩポリペプチドの発現に用いることができる。アデノウイルスなどのウイルス感染によって、又はリポソーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどの直接的なＤＮＡの導入によって、並びにエレクトロポレーション及びマイクロインジェクションなどの物理的手段によって、発現構築物を哺乳動物細胞に移すことができる。哺乳動物細胞のための発現ベクターには、典型的には、ｍＲＮＡのキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）、及びポリアデニル化エレメントが含まれる。このようなベクターには、例えばＳＶ４０プロモーター−エンハンサーなどの高レベルな発現のための転写プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復が含まれることが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは多くの細胞型において活性である。組織型及び細胞型のプロモーター及びエンハンサーの領域も発現に用いることができる。例示的なプロモーター／エンハンサー領域には、それだけに限らないが、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳腺腫瘍ウイルス、アルブミン、α−フェトプロテイン、α１−抗トリプシン、β−グロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖−２、及び性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節などの遺伝子から得られたものが含まれる。選択可能なマーカーを用いて、発現構築物を有する細胞を選択及び維持することができる。選択可能なマーカーの遺伝子の例には、それだけに限らないが、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素、及びチミジンキナーゼが含まれる。ＴＣＲ−ζ及びＦｃεＲＩ−γなどの細胞表面シグナル伝達分子との融合は、細胞表面上での活性な状態でのタンパク質の発現を導き得る。
マウス、ラット、ヒト、サル、及びニワトリ、及びハムスターの細胞を含む多くの細胞株が、哺乳動物発現に利用可能である。例示的な細胞株には、それだけに限らないが、ＢＨＫ（即ちＢＨＫ−２１細胞）、２９３−Ｆ、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌性）及び他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマ細胞株及びヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２９３Ｔ、２Ｂ８、並びにＨＫＢ細胞が含まれる。細胞培地からの分泌タンパク質の精製を容易にする無血清培地に適合する細胞株も利用可能である。１つのそのような例は無血清ＥＢＮＡ−１細胞株である（Ｐｈａｍら（２００３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：３３２〜４２）。血漿由来のＦＶＩＩと類似の構造及び翻訳後修飾を示す組換えＦＶＩＩポリペプチドの発現は、当技術分野において知られている（例えば、Ｊｕｒｌａｎｄｅｒら（２００３）Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍ Ｈｅｍｏｓｔを参照されたい）。ビタミンＫ依存性のタンパク質発現を最適化する方法は知られている。例えば、培地におけるビタミンＫの補充又はビタミンＫ依存性のγ−カルボキシラーゼの共発現（Ｗａｊｉｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０（３６）３１６０３〜３１６０７）は、ＦＶＩＩポリペプチドなどのビタミンＫ依存性タンパク質の翻訳後修飾に有用であり得る。
ｅ．植物
トランスジェニック植物細胞及びトランスジェニック植物を、ＦＶＩＩの発現に用いることができる。発現構築物は、典型的には、微粒子銃及びプロトプラストへのＰＥＧ媒介性導入などの直接的なＤＮＡ導入を用いて、並びにアグロバクテリウム媒介性形質転換を用いて、植物に移される。発現ベクターは、プロモーター配列及びエンハンサー配列、転写終結エレメント、並びに翻訳調節エレメントを含み得る。発現ベクター及び形質転換技術は、通常、アラビドプシス及びタバコなどの双子葉植物宿主と、トウモロコシ及びコメなどの単子葉植物宿主との間で分けられる。発現に用いられる植物プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、リボースビスリン酸カルボキシラーゼプロモーター、並びにユビキチン及びＵＢＱ３プロモーターが含まれる。ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼ、及びネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択可能なマーカーが、形質転換細胞の選択及び維持を容易にするために用いられることが多い。形質転換された植物細胞は、細胞、凝集体（カルス組織）として培養において維持するか、又は、植物全体に再生することができる。植物は哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するため、これはこれらの宿主においてＦＶＩＩを生成するという選択に影響を及ぼし得る。トランスジェニック植物細胞にはまた、タンパク質を生成するように操作された藻類も含まれ得る（例えば、Ｍａｙｆｉｅｌｄら（２００３）ＰＮＡＳ １００：４３８〜４４２を参照されたい）。植物は哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するため、これはこれらの宿主においてＦＶＩＩを生成するという選択に影響を及ぼし得る。
２．精製
宿主細胞からＦＶＩＩポリペプチドを精製するための方法は、選択された宿主細胞及び発現系に依存する。分泌された分子では、タンパク質は通常、細胞を除去した後に培地から精製される。細胞内発現では、細胞を溶解し、タンパク質を抽出物から精製することができる。トランスジェニック植物及びトランスジェニック動物などのトランスジェニック生物を発現に用いる場合、組織又は器官を、溶解細胞抽出物を得るための開始材料として用いることができる。さらに、トランスジェニック動物の生成には、回収し得る乳又は卵におけるポリペプチドの生成が含まれ得、必要であればさらに、当技術分野において標準的な方法を用いて、タンパク質を抽出し、さらに精製することができる。
ＦＶＩＩは、それだけに限らないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ分画クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、キレートクロマトグラフィー、並びにイオン交換クロマトグラフィーを含む、当技術分野において知られている標準的なタンパク質精製技術を用いて精製することができる。例えば、ＦＶＩＩポリペプチドは、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製することができる。ＦＶＩＩポリペプチドを精製するための例示的な方法は、その後にカルシウムの存在下での溶出が行われる、機能的なＧｌａドメインを有する任意のポリペプチドの結合を可能にするイオン交換カラムによるものである（例えば実施例３を参照されたい）。調製物の効率及び純度を向上させるために、アフィニティー精製技術も用いることができる。例えば、抗体、受容体、及びＦＶＩＩを結合する他の分子をアフィニティー精製において用いることができる。別の例では、精製はまた、可溶性ＴＦ（ｓＴＦ）アフィニティーカラムを用いて増強することができる（Ｍａｕｎら（２００５）Ｐｒｏｔ Ｓｃｉ １４：１１７１〜１１８０）。発現構築物はまた、ｍｙｃエピトープ、ＧＳＴ融合体、又はＨｉｓ６などのアフィニティータグを付加するように操作し、それぞれｍｙｃ抗体、グルタチオン樹脂、及びＮｉ樹脂を用いて、タンパク質にアフィニティー精製することができる。純度は、ゲル電気泳動及び染色及び分光光度技術を含む、当技術分野において知られている任意の方法によって評価することができる。
ＦＶＩＩプロテアーゼは、不活性形態（酵素原形態）となるように発現及び精製することができるか、或いは、発現したプロテアーゼを、自己触媒などによって活性形態に精製することができる。例えば、Ａｒｇ１５２〜Ｉｌｅ１５３のタンパク質分解性の切断を介して活性化されたＦＶＩＩポリペプチドをｉｎ ｖｉｔｒｏで調製することができる（即ち、ＦＶＩＩａ、二本鎖形態）。ＦＶＩＩポリペプチドはまず、それだけに限らないが、哺乳動物細胞における生成及びその後の精製を含む、本明細書に記載される任意の生成方法によって調製することができる。活性なプロテアーゼ形態であるＦＶＩＩａへのＦＶＩＩポリペプチドの切断は、いくつかの手段によって行うことができる。例えば、カルシウムの存在下でのリン脂質小胞とのインキュベーションの際の自己活性化は４５分間で行うことができる（Ｎｅｌｓｅｓｔｕｅｎら（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：３９８２５〜３１）。ＦＶＩＩポリペプチドはまた、カルシウムの存在下で、且つリン脂質の存在下又は不在下で、第Ｘａ因子、第ＸＩＩａ因子、又はＴＦとインキュベーションすることによって、完全に活性化することができる（例えば、実施例３、及び、Ｂｒｏｚｅら（１９８０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５５：１２４２〜１２４７；Ｈｉｇａｓｈｉら（１９９６）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：２６５６９〜２６５７４；Ｈａｒｖｅｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：８３６３〜８３６９を参照されたい）。
３．融合タンパク質
改変ＦＶＩＩポリペプチド及び１つ又は複数の他のポリペプチドを含有する融合タンパク質も提供される。適切な経路によって投与するために製剤された、そのような融合タンパク質を含有する医薬組成物が提供される。融合タンパク質は、改変ＦＶＩＩポリペプチドと、抗体又はその断片、成長因子、受容体、リガンド、及び他のそのような作用物質などの作用物質とを任意の順序で連結することにより形成され、この作用物質は、ＦＶＩＩポリペプチドの精製を容易にすること、例えば標的細胞若しくは標的組織へのポリペプチドの指向などの指向によりＦＶＩＩポリペプチドの薬力学的特性を変化させること、並びに／又はＦＶＩＩポリペプチドの発現若しくは分泌を増大させることを目的としたものである。典型的には、任意のＦＶＩＩ融合タンパク質は、非融合ポリペプチドと比較して９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の凝固活性を含む、非融合ＦＶＩＩポリペプチドと比較して少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％の凝固活性を保持する。
別のポリペプチドとのＦＶＩＩポリペプチドの連結は、リンカーを介して直接的又は間接的に行うことができる。一例では、連結は、ヘテロ二官能性作用物質を介するものなどの化学的連結、又はチオール連結若しくは他のそのような連結によるものであり得る。融合はまた、組換え手段によっても行うことができる。別のポリペプチドへのＦＶＩＩポリペプチドの融合は、ＦＶＩＩポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に対するものであり得る。本明細書で提供されるＦＶＩＩポリペプチドとの融合タンパク質に用いることができるポリペプチドの非限定的な例には、例えば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）ポリペプチド、免疫グロブリンＧのＦｃドメイン、又は異種シグナル配列が含まれる。融合タンパク質は、細胞によるタンパク質の取り込みに有用な、大腸菌のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などのさらなる構成要素を含有し得る（ＰＣＴ出願の国際公開第０１／３２７１１号パンフレットを参照されたい）。
融合タンパク質は、標準的な組換え技術によって生成することができる。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片を、従来の技術に従って、例えば、ライゲーションのための平滑末端又は付着末端、適切な末端を得るための制限酵素消化、粘着末端の適切な穴埋め、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、及び酵素ライゲーションを用いることにより、インフレームで共にライゲートすることができる。別の実施形態では、融合遺伝子を、自動ＤＮＡ合成装置を含めた従来の技術によって合成することができる。或いは、２つの連続した遺伝子断片の間に相補的な突出を生じさせるアンカープライマーを用いて遺伝子断片のＰＣＲ増幅を実施することができ、次にこの遺伝子断片にアニーリング及び再増幅を行ってキメラ遺伝子配列を生じさせることができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９２を参照されたい）。さらに、融合部分を既にコードしている多くの発現ベクターが市販されている（例えば、ＧＳＴポリペプチド）。融合部分がプロテアーゼタンパク質にインフレームで連結するように、ＦＶＩＩをコードしている核酸をそのような発現ベクター内にクローニングさせることができる。
４．ポリペプチドの修飾
改変ＦＶＩＩポリペプチドは、裸のポリペプチド鎖又は複合体として調製することができる。いくつかの適用では、改変ＦＶＩＩを、翻訳後修飾又は他の化学的修飾を行わずに「裸の」形態で調製することが望ましい場合がある。裸のポリペプチド鎖は、ＦＶＩＩの翻訳後修飾を行わない適切な宿主において調製することができる。そのようなポリペプチドはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系において、及び化学的ポリペプチド合成を用いて調製することができる。他の適用では、ペグ化、アルブミン化、グリコシル化、カルボキシル化、ヒロドキシル化、リン酸化、又は他の既知の修飾を含めた、特定の修飾が望ましい場合がある。修飾は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができるか、又は、例えば、このような修飾をもたらす適切な宿主において改変ＦＶＩＩを生成することにより実施することができる。
５．ヌクレオチド配列
本明細書において、ＦＶＩＩポリペプチド又は改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。核酸分子には、任意のコードされたＦＶＩＩポリペプチドの対立遺伝子変異体又はスプライス変異体が含まれる。本明細書で提供される例示的な核酸分子は、配列番号１８〜４３、１２５〜１５０、又は２０６〜２５０のいずれかに示すポリペプチドをコードする任意の分子などの、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする任意の分子である。一実施形態では、本明細書で提供される核酸分子は、少なくとも５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は、本明細書で提供されるＦＶＩＩポリペプチドをコードする任意の核酸の全長の少なくとも７０％と、中ストリンジェンシー若しくは高ストリンジェンシーの条件下においてハイブリダイズする。別の実施形態では、核酸分子には、本明細書で提供される任意のＦＶＩＩポリペプチドをコードする縮重コドン配列を有するものが含まれ得る。
Ｇ．改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性の評価
ＦＶＩＩポリペプチドの活性及び特性をｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。そのような評価のためのアッセイは当業者に知られており、試験した活性及び結果を治療活性及びｉｎ ｖｉｖｏでの活性に関連付けるために知られているものである。一例では、非改変ＦＶＩＩ及び／又は野生型ＦＶＩＩと比較して、ＦＶＩＩ変異体を評価することができる。別の例では、改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでＴＦＰＩ又はＡＴ−ＩＩＩに曝露した後に評価し、ＴＦＰＩ又はＡＴ−ＩＩＩに曝露していない改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性と比較することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイには、例えば、凝固アッセイ、結合アッセイ、タンパク質アッセイ、及び分子生物学的アッセイを含む、細胞に基づいたアッセイなどの、当業者に知られている任意の実験用アッセイが含まれる。ｉｎ ｖｉｖｏでのアッセイには、動物モデルにおけるＦＶＩＩアッセイ、及びヒトへの投与が含まれる。いくつかの場合では、ｉｎ ｖｉｖｏでのＦＶＩＩの活性を、血液、血清、又はアッセイの決定要因のための他の体液を評価することにより決定することができる。ＦＶＩＩ変異体はまた、治療効果などの活性又は特性を評価するためにｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。
典型的には、本明細書において記載されるアッセイは、二本鎖の活性化形態のＦＶＩＩ、即ちＦＶＩＩａに関するものである。そのようなアッセイはまた、一本鎖形態が典型的に、ＦＶＩＩの凝固活性に必要なタンパク質分解活性又は触媒活性を含有しないため、陰性対照を提供するなどのために一本鎖形態でも実施することができる。さらに、そのようなアッセイはまた、場合によってはＦＶＩＩの活性を高める、ＴＦなどの補因子の存在下で実施することができる。
１．ｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイ
例示的なｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイには、ポリペプチドの改変及び活性を評価するためのアッセイが含まれる。改変は、当技術分野において知られている、γ−カルボキシル化及び他の翻訳後修飾を評価するｉｎ ｖｉｔｒｏでのアッセイ、タンパク質アッセイ、並びに高次構造アッセイを用いて評価することができる。活性のアッセイには、それだけに限らないが、ＴＦ、第Ｘ因子、及び第ＩＸ因子などの他の凝固因子とのＦＶＩＩの相互作用の測定、ＦＶＩＩポリペプチドのタンパク質分解活性を決定するためのタンパク質分解アッセイ、ホスファチジルセリン及び他のリン脂質に対するＦＶＩＩポリペプチドの結合及び／又は親和性を決定するためのアッセイ、並びに凝固に対するＦＶＩＩポリペプチドの効果を決定するための細胞に基づいたアッセイが含まれる。
改変ＦＶＩＩポリペプチドの濃度は、それだけに限らないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；ブラッドフォード法、ローリー法、ＢＣＡ法；ＵＶ吸光度、並びに、それだけに限らないが、免疫学的方法、放射線法、及び蛍光法、及び関連する方法などの、他の定量的なタンパク質標識方法を含む、当技術分野において周知の方法によって評価することができる。
ＦＶＩＩポリペプチドの切断を含むタンパク質分解反応の切断生成物又はＦＶＩＩプロテアーゼ活性により生成された生成物の評価は、それだけに限らないが、発色基質切断、ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学、免疫沈降、ＮＨ２末端の配列決定、及びタンパク質標識を含む方法を用いて行うことができる。
改変ＦＶＩＩポリペプチドの構造特性も評価することができる。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドのＸ線結晶学、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、及び低温電子顕微鏡観察（ｃｒｙｏ−ＥＭ）を実施して、ＦＶＩＩポリペプチドの三次元構造、及び／又はＣａ２＋若しくは補因子の結合などのＦＶＩＩポリペプチドの他の特性を評価することができる。
さらに、ＦＶＩＩ分解の存在及び程度を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び電気泳動したＦＶＩＩ含有試料のウェスタンブロッティングなどの標準的な技術によって測定することができる。プロテアーゼに曝露したＦＶＩＩポリペプチドはまた、Ｎ末端の配列決定を行って、改変ＦＶＩＩポリペプチドの切断部位の位置又は変化を決定することができる。
ａ．翻訳後修飾
ＦＶＩＩポリペプチドはまた、翻訳後修飾の存在について評価することができる。そのようなアッセイは当技術分野において知られており、グリコシル化、ヒドロキシル化、及びカルボキシル化を測定するためのアッセイが含まれる。グリコシル化についての例示的なアッセイにおいて、例えば、ヒドラジン分解又はエンドグリコシダーゼ処理にさらされたＦＶＩＩポリペプチドのＳＤＳ ｐａｇｅ分析を用いて、炭水化物の分析を行うことができる。ヒドラジン分解では、無水ヒドラジンとのインキュベーションによって糖タンパク質からＮ結合型グリカン及びＯ結合型グリカンが放出され、一方、エンドグリコシダーゼの放出には、糖タンパク質からほとんどのＮ−グリカンを放出させるＰＮＧａｓｅ Ｆが関与する。ＦＶＩＩポリペプチドのヒドラジン分解又はエンドグリコシダーゼ処理では、フルオロフォア標識又はクロモフォア標識をタグ付けし得る還元末端が生じる。標識されたＦＶＩＩポリペプチドは、フルオロフォアを用いた炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）によって分析することができる。ＨＰＬＣによる、複雑なグリコシル化パターンの単糖分析、プロファイリング、又はフィンガープリンティングのために、グリカンに対する蛍光タグも用いることができる。例示的なＨＰＬＣ法には、親水性相互作用クロマトグラフィー、電子的相互作用、イオン交換、疎水性相互作用、及びサイズ排除クロマトグラフィーが含まれる。例示的なグリカンプローブには、それだけに限らないが、３−（アセチルアミノ）−６−アミノアクリジン（ＡＡ−Ａｃ）及び２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ）が含まれる。炭水化物部分も、グリコシル化したＦＶＩＩポリペプチドを認識する特異的抗体を用いて検出することができる。β−ヒドロキシル化を測定するための例示的なアッセイは、アルカリ加水分解を行ったＦＶＩＩポリペプチドの逆相ＨＰＬＣ分析を含有する（Ｐｒｚｙｓｉｅｃｋｉら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：７８５６〜７８６０）。ＦＶＩＩポリペプチドのカルボキシル化及びγ−カルボキシル化は、技術文献に記載されているように、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）分析での質量分析を用いて評価することができる（例えば、Ｈａｒｖｅｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：８３６３〜８３６９；Ｍａｕｍら、Ｐｒｏｔ Ｓｃｉ １４：１１７１〜１１８０を参照されたい）。翻訳後のγ−カルボン酸塩の修飾に関与するカルボキシラーゼとの、プロペプチドを含有するＦＶＩＩポリペプチド（ｐｒｏ−ＦＶＩＩ）の相互作用も評価することができる。カルボキシラーゼを、フルオレセイン標識したプロＦＶＩＩポリペプチドとインキュベートした後の解離定数（Ｋｄ）を、結合したカルボキシラーゼの量を異方性によって決定することにより、測定することができる（Ｌｉｎら（２００４）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：６５６０〜６５６６）。
ｂ．タンパク質分解活性
改変ＦＶＩＩポリペプチドをタンパク質分解活性について試験することができる。ＦＶＩＩのタンパク質分解活性は、Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ ｔ−ＰＡ（ＭｅＳＯ２−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）、Ｓ−２２８８（Ｈ−Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）、Ｓ−２２６６（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）、Ｓ−２７６５（Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）、Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＸａ及びＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｂｕｔ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）などの発色基質を用いて測定することができる。ＦＶＩＩポリペプチドを単独で、又はＴＦの存在下で、様々な濃度の発色基質とインキュベートする。基質の切断は吸光度によりモニターすることができ、基質の加水分解の速度は、容易に入手可能なソフトウェアを用いた線形回帰によって決定する。
ＦＶＩＩポリペプチドによる、ＦＸなどの凝固因子基質の活性化も評価することができる。ＴＦとのプレインキュベーションを行ったか又は行っていないＦＶＩＩポリペプチドを、精製ＦＸ（市販されている）とインキュベートすることができる。ＦＶＩＩポリペプチドとのインキュベーションの結果生成される活性ＦＸａの量を、Ｓ−２２２２又はＳｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ ＦＸａ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ．ＡｃＯＨ）などの発色基質に対するＦＸａの活性として測定し、それを、吸光度の変化を通してモニターする（Ｈａｒｖｅｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：８３６３〜８３６９；また、以下の実施例５も参照されたい）。リン脂質源もまた、ＦＶＩＩとＦＸとのインキュベーションに含まれ得る（Ｎｅｌｓｅｓｔｕｅｎら（２００１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：３９８２５〜３１）。
ｃ．凝固活性
ＦＶＩＩポリペプチドは、当技術分野において周知のアッセイを用いることにより、凝固活性について試験することができる。例えば、アッセイのいくつかには、それだけに限らないが、２段階の凝固アッセイ（Ｌｅｉｂｍａｎら（１９８５）ＰＮＡＳ ８２：３８７９〜３８８３）、プロトロンビン時間アッセイ（ＰＴ、外因性経路におけるＦＶＩＩａのＴＦ依存性活性を測定し得る）、ＰＴ試験の改変型であるアッセイ、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ、ＦＶＩＩａのＴＦ非依存性活性を測定し得る）、活性化凝固時間（ＡＣＴ）、再石灰化活性化凝固時間、Ｌｅｅ−Ｗｈｉｔｅ凝固時間、又はトロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）（Ｐｕｓａｔｅｒｉら（２００５）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃａｒｅ ９：Ｓ１５〜Ｓ２４）が含まれる。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性は、ＦＶＩＩをＦＶＩＩ欠乏性血漿に希釈し、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇからイノビン（Ｉｎｎｏｖｉｎ）（商標）として入手可能なものなどのプロトロンビン時間試薬（リン脂質とカルシウムとを有する組換えＴＦ）と混合する、ＰＴに基づいたアッセイによって決定することができる。凝固物の形成を任意選択で検出し、凝固までの時間を決定して、ＦＶＩＩ欠乏性血漿単独と比較する。
ｄ．他のタンパク質への結合及び／又は他のタンパク質による阻害
阻害アッセイを用いて、例えばＴＦＰＩ及びＡＴ−ＩＩＩなどのＦＶＩＩ阻害剤又はＺｎ２＋などの分子に対する改変ＦＶＩＩポリペプチドの抵抗性を測定することができる。他の阻害剤に対する阻害の評価も試験することができ、それだけに限らないが、他のセリンプロテアーゼ阻害剤及びＦＶＩＩ特異的抗体が含まれる。阻害は、例えばＴＦＰＩ、ＡＴ−ＩＩＩ、又はＺｎ２＋と、ＴＦとプレインキュベートしたＦＶＩＩポリペプチドとをインキュベートすることにより評価することができる。次に、ＦＶＩＩの活性を、上述した任意の１つ又は複数の活性アッセイ又は凝固アッセイを用いて測定することができ、ＴＦＰＩ、ＡＴ−ＩＩＩ、又はＺｎ２＋による阻害を、阻害剤とインキュベートしたＦＶＩＩポリペプチドの活性と、阻害剤とインキュベートしていないＦＶＩＩポリペプチドの活性とを比較することにより評価することができる。
ＦＶＩＩポリペプチドは、他の凝固因子及び阻害剤に対する結合について試験することができる。例えば、ＴＦなどの補因子、ＦＸ及びＦＩＸなどの基質、並びにＴＦＰＩ、抗トロンビンＩＩＩ、及びヘパリンなどの阻害剤との、ＦＶＩＩの直接又は間接の相互作用を、それだけに限らないが、免疫沈降、カラム精製、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）（登録商標）アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、円二色性（ＣＤ）、タンパク質断片相補性アッセイ（ＰＣＡ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析、光散乱、沈降平衡、小領域ゲル濾過クロマトグラフィー、ゲル遅延、ファーウェスタンブロッティング、蛍光偏光、ヒドロキシル−ラジカルタンパク質フットプリンティング、ファージディスプレイ、及び様々なツーハイブリッド系を含む、当技術分野において知られている任意の結合アッセイを用いて評価することができる。一例では、平衡分析を用いてＺｎ２＋の結合を評価する（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：８５９〜８６６）。
ｅ．リン脂質の親和性
ホスホチジルセリン（ＰＳ）及び他のリン脂質に対する改変ＦＶＩＩポリペプチドの結合及び／又は親和性を、当技術分野において周知のアッセイを用いて決定することができる。有機溶媒中の純度の高いリン脂質（例えば、Ｓｉｇｍａなどから市販されている、既知の濃度のウシＰＳ及び卵ホスファチジルコリン（ＰＣ））を用いて、小さな単層リン脂質ベシクルを調製することができる。これらのＰＳ／ＰＣベシクルに結合しているＦＶＩＩポリペプチドを、入射光に対して９０度での相対的な光散乱によって決定することができる。ＰＣ／ＰＳ単独での及びＰＣ／ＰＳ／ＦＶＩＩでの光散乱の強さを測定して、解離定数を決定する（Ｈａｒｖｅｙら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７８：８３６３〜８３６９）。ビアコアバイオセンサー装置などでの表面プラズマ共鳴も、リン脂質膜に対するＦＶＩＩポリペプチドの親和性を測定するために用いることができる（Ｓｕｎら、Ｂｌｏｏｄ １０１：２２７７〜２２８４）。
２．ヒト以外の動物モデル
ヒト以外の動物モデルを用いて、改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性、有効性、及び安全性を評価することができる。例えば、ヒト以外の動物を、疾患又は状態のモデルとして用いることができる。ヒト以外の動物に、配列番号１８〜４３、１２５〜１５０、又は２０６〜２５０のいずれかに示す任意のＦＶＩＩ変異体などのＦＶＩＩ変異体を投与する前に、疾患誘発性及び／又は表現型導性の物質を注射して、疾患の進行に対する効果をモニターすることができる。遺伝モデルも有用である。１つ又は複数の遺伝子の過剰発現、過小発現、又はノックアウトにより疾患又は状態を模倣する、マウスなどの動物、例えば血友病Ａを示す第ＶＩＩＩ因子ノックアウトマウスなどを生成することができる（Ｂｉら（１９９５）Ｎａｔ Ｇｅｎ １０：１１９〜１２１）。そのような動物は、当技術分野において周知のトランスジェニック動物生成技術により、又は天然に存在するか若しくは誘導された突然変異系を用いて生成することができる。ＦＶＩＩに関与する疾患の有用なヒト以外の動物モデルの例には、それだけに限らないが、出血性障害、とりわけ血友病又は血栓症のモデルが含まれる。ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性などの活性を評価するために、損傷についてのヒト以外の動物モデルも用いることができる。これらのヒト以外の動物モデルを用いて、ＦＶＩＩ変異体の活性を野生型ＦＶＩＩポリペプチドと比較してモニターすることができる。
動物モデルはまた、改変ＦＶＩＩポリペプチドの安定性、半減期、及びクリアランスをモニターするために用いることができる。そのようなアッセイは、改変ＦＶＩＩポリペプチドの比較、並びにヒト以外の動物及びヒトでのさらなる試験のための用量及び用量レジメンの計算に有用である。例えば、例えば配列番号１８〜４３、１２５〜１５０、又は２０６〜２５０のいずれかに示すものを含む、本明細書で提供される任意のＦＶＩＩ変異体などの改変ＦＶＩＩポリペプチドを、マウスの尾静脈に注射することができる。次に、注射後の各時点で血液試料を採取し（注射後の分、時間、及び日など）、次に、それだけに限らないが血清又は血漿を含む、身体試料における改変ＦＶＩＩポリペプチドのレベルを、例えばＥＬＩＳＡ又はラジオイムノアッセイによって特定の時点でモニターすることができる。ＦＶＩＩポリペプチドの注射後の様々な時点で得た血液試料をまた、実施例９及び１４に記載されるものなどの様々な方法を用いて、凝固活性について試験する。これらのタイプの薬物動態研究により、凝固促進剤として投与するための適切な用量の決定に役立ち得る、ＦＶＩＩポリペプチドの半減期、クリアランス、及び安定性に関する情報を得ることができる。
配列番号１８〜４３、１２５〜１５０、又は２０６〜２５０のいずれかに示すような改変ＦＶＩＩポリペプチドを、血友病の動物モデルを用いて、治療効果について試験することができる。非限定的な一例では、マウスなどの動物モデルを用いることができる。血友病のマウスモデルは、当技術分野において利用可能であり、改変ＦＶＩＩポリペプチドを試験するために用い得る。例えば、抗ＦＶＩＩＩ抗体の注射により生成される血友病Ａのマウスモデルを用いて、ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性を評価することができる（例えば、実施例８及び１４、並びにＴｒａｎｈｏｌｍら、Ｂｌｏｏｄ（２００３）１０２：３６１５〜３６２０を参照されたい）。血友病Ｂのマウスモデルも、ＦＶＩＩポリペプチドを試験するために用いることができる（Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓら（２００４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１３：１０２５〜１０３１）。出血性障害のマウス以外のモデルも存在する。ＦＶＩＩポリペプチドの活性は、ワルファリン誘発性の出血又はメラガトラン誘発性の出血を有するラット（Ｄｉｎｅｓｓら（１９９２）Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ ６７：２３３〜２４１、Ｅｌｇら（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ １０１：１４５〜１５７）、及びヘパリン誘発性の出血を有するウサギ（Ｃｈａｎら（２００３）Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １：７６０〜７６５）において評価することができる。重度の出血を示す、生まれつき血友病Ａ、血友病Ｂ、及びフォンウィルブランド病を有するイヌも、ＦＶＩＩポリペプチドを用いたヒト以外の動物の研究に用いることができる（Ｂｒｉｎｋｈｏｕｓら（１９８９）ＰＮＡＳ ８６：１３８２〜１３８６）。ＦＶＩＩポリペプチドの活性はまた、γ線照射と血小板抗体の使用との組合せによって血小板減少症を誘発する、出血のウサギモデルにおいて評価することができる（Ｔｒａｎｈｏｌｍら（２００３）Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ １０９：２１７〜２２３）。
全身性の出血性障害を有する動物に加え、損傷及び外傷のモデルもまた、ＦＶＩＩポリペプチドの活性、並びに凝固治療剤としてのそれらの安全性及び有効性を評価するために用いることができる。そのようなモデルの非限定的な例には、ウサギ冠動脈狭窄症モデル（Ｆａｔｏｒｕｔｔｏら（２００４）Ｃａｎ Ｊ Ａｎａｅｓｔｈ ５１：６７２〜６７９）、ブタのグレードＶの肝臓損傷モデル（Ｌｙｎｎら（２００２）Ｊ Ｔｒａｕｍａ ５２：７０３〜７０７）、ブタのグレードＶの肝臓損傷モデル（Ｍａｒｔｉｎｏｗｉｔｚら（２００１）Ｊ Ｔｒａｕｍａ ５０：７２１〜７２９）、及びブタ大動脈切開モデル（Ｓｏｎｄｅｅｍら（２００４）Ｓｈｏｃｋ ２２：１６３〜１６８）が含まれる。
３．臨床アッセイ
多くのアッセイが、臨床的使用のためのＦＶＩＩの活性の評価に利用可能である。そのようなアッセイには、ｉｎ ｖｉｖｏでの凝固、タンパク質安定性、及び半減期の評価、並びに表現型アッセイが含まれ得る。表現型アッセイ及びＦＶＩＩ治療の治療効果を評価するためのアッセイには、ＦＶＩＩの血中レベルの評価（例えば、ボディーマスインデックス（ＢＭＩ）について補正した、投与前の、並びに、最初の投与の後、最後の投与の直後、及び最中の各時点を含む、投与後の各時点での、血清ＦＶＩＩの測定）、ＦＶＩＩでの治療後の、上述の方法を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの血液凝固の評価（例えばＰＴアッセイ）、並びに、非改変ＦＶＩＩ及び／若しくは野生型ＦＶＩＩ又はプラセボで治療した対象と比較した、経時的な症状の改善を含む、ＦＶＩＩ治療に対する表現型の応答が含まれる。ＦＶＩＩポリペプチドで治療した患者は、血液の損失、輸血の必要性、及びヘモグロビンについてモニターすることができる。患者は、通常の投与若しくは反復投与のための期間にわたり定期的にモニターすることができるか、又は、出血、外傷、若しくは外科的処置などの急性事象に応じた投与の後にモニターすることができる。
Ｈ．製剤及び投与
出血性障害の治療に用いるための組成物が本明細書で提供される。そのような組成物は、治療上有効な量の、本明細書に記載される第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する。有効な濃度のＦＶＩＩポリペプチド又はその薬学的に許容される誘導体を、全身投与、局所投与、又は局部投与のために、適切な薬学的担体又は媒体と混合する。化合物は、選択された障害を治療するために有効な量で含まれる。組成物における活性化合物の濃度は、吸光度、不活性化、活性化合物の排出速度、投与スケジュール、及び投与量、並びに当業者に知られている他の要素に依存する。
本明細書で提供される化合物の投与に適した薬学的担体又は媒体には、特定の様式の投与に適していると当業者に知られている、任意の担体が含まれる。本明細書において記載される、治療上有効な量のＦＶＩＩポリペプチドを含む医薬組成物はまた、投与の直前に滅菌水などで再構成した凍結乾燥粉末として提供され得る。
１．製剤
改変ＦＶＩＩを含有する医薬組成物は、選択された量のポリペプチドと１つ又は複数の生理学的に許容される担体又は賦形剤とを混合することによる、任意の従来の方法で製剤することができる。担体又は賦形剤の選択は、投与の専門の技術の範囲内であり、パラメータの数に依存し得る。これらには、例えば、投与の様式（即ち、全身、経口、経鼻、経肺、局部、局所、又は任意の他の様式）及び治療する障害が含まれる。本明細書で提供される医薬組成物は、単一用量（直接的な）投与のため、又は希釈若しくは他の改変のために製剤することができる。製剤における化合物の濃度は、投与の際の、目的の治療に有効な量の送達に有効なものである。典型的には、組成物は単一用量投与のために製剤される。組成物を製剤するために、化合物の重量分率又はその混合物を、選択された媒体内に、治療する状態が軽減若しくは改善するような有効な濃度で溶解し、懸濁し、分散し、又はその他の形で混合する。
本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、二本鎖ＦＶＩＩａタンパク質として対象に投与するために製剤することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、製剤の前に、当技術分野において知られている任意の方法によって活性化することができる。例えば、ＦＶＩＩは、イオン交換クロマトグラフィーによる精製の間に自己活性化させることができる（Ｊｕｒｌａｎｄｅｒら（２００１）Ｓｅｍｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈｅｍｏｓｔ ２７：３７３〜３８４）。改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、ビーズに固定したＦＸａとのインキュベーション（Ｋｅｍｂａｌｌ−Ｃｏｏｋら（１９９８）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３：８５１６〜８５２１）、又は当技術分野において知られている任意の他の方法によって活性化することができる（以下の実施例３も参照されたい）。これらのプロセスにカルシウムを含めることにより、改変ＦＶＩＩａタンパク質の完全な活性化及び正確なフォールディングが確実となる。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、一本鎖タンパク質として投与するために製剤することができる。一本鎖ＦＶＩＩポリペプチドは、切断を防ぐように精製することができる（例えば、米国特許第６６７７４４０号明細書を参照されたい）。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、自己活性化をなくすか又は調節するための媒質を適切に選択することによって一本鎖及び二本鎖の形態が任意の比率で医薬組成物に含有されるように、製剤することができる。
化合物は、微粉状の形態若しくは他の適切な形態に懸濁するか、又はより可溶性の活性生成物を生成するように誘導体化することができる。得られた混合物の形態は、目的の投与態様及び選択された担体又は媒体における化合物の溶解度を含む、要素の数に依存する。得られた混合物は、溶液、懸濁液、乳濁液、及び他のそのような混合物であり、非水性又は水性の混合物、クリーム、ゲル、軟膏、乳濁液、溶液、エリキシル、ローション、懸濁液、チンキ、ペースト、フォーム、エアロゾル、洗浄水、スプレー、坐薬、包帯、又は全身投与、局所投与、若しくは局部投与に適した任意の他の製剤として製剤することができる。筋肉内投与、非経口投与、又は関節内投与などの局部的な内部投与のために、ポリペプチドは、等張緩衝生理食塩水などの水性ベースの媒質内での溶液懸濁液として製剤することができるか、又は、内部投与を目的とした生体適合性の支持体若しくは生体接着剤と組み合わせることができる。有効な濃度は、標的の状態を改善するために十分なものであり、実証的に決定することができる。組成物を製剤するために、化合物の重量分率を、選択された媒体内に、標的の状態が軽減若しくは改善するような有効な濃度で溶解し、懸濁し、分散し、また或いは、混合する。
通常は、薬学的に許容される組成物は、動物及びヒトにおける使用のために、管理機関の認可を考慮して調製するか、又は一般的に承認されている薬局方に従って調製される。医薬組成物は、アイソフォームと共に投与するための希釈剤、アジュバント、添加剤、又は媒体などの担体を含み得る。そのような薬学的担体は、水、並びに、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、及びゴマ油などの、石油、動物、植物、又は合成に由来する油を含む油などの、滅菌液体であり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合の典型的な担体である。生理食塩水並びに水性デキストロース及びグリセロールの溶液もまた、とりわけ注射用溶液のための、液体担体として用いることができる。組成物は、活性成分と共に、ラクトース、ショ糖、第二リン酸カルシウム、又はカルボキシメチルセルロースなどの希釈剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、及びタルクなどの潤滑剤、並びに、デンプン、ガムアカシアゼラチンなどの天然ゴム、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロース及びその誘導体、ポビドン、クロスポビドン、及び当業者に知られている他のそのような結合剤などの結合剤を含有し得る。適切な薬学的添加剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、及びエタノールが含まれる。必要であれば、組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ調整剤、例えば酢酸塩、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリル酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン、及び他のそのような調整剤も含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、及び持続放出製剤の形態を取り得る。例えば吸入器又は吸気器において用いるためのゼラチンの、カプセル及び薬包は、治療化合物とラクトース又はデンプンなどの適切な粉末ベースとの粉末混合物を含有させて製剤することができる。組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤及び担体と共に、坐薬として製剤することができる。経口製剤には、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、カルボン酸マグネシウム、及び他のそのような作用物質などの、標準的な担体が含まれ得る。経口投与のための調製物はまた、ボウマンバーク阻害剤、コンジュゲート型ボウマンバーク阻害剤、アプロチニン、及びカモスタットなどのプロテアーゼ阻害剤と共に、適切に製剤することができる。適切な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。そのような組成物は、通常は精製された形態の治療上有効な量の化合物を、対象又は患者への適切な投与のための形態を得るための適切な量の担体と共に含有する。
製剤は投与形態に適合すべきである。例えば、改変ＦＶＩＩは、注射（例えば、ボーラス注射又は持続注入）による非経口投与のために製剤することができる。注射可能な組成物は、油性媒体又は水性媒体中の懸濁液、溶液、又は乳濁液などの形態を取り得る。注射可能な滅菌調製物はまた、例えば１−４，ブタンジオール中の溶液のような、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の注射可能な滅菌溶液又は懸濁液であり得る。無菌の固定油は、溶媒又は懸濁媒質として従来から用いられている。この目的のために、それだけに限らないが、合成モノグリセリド若しくはジグリセリド、脂肪酸（オレイン酸を含む）、ゴマ油、ココナッツ油、ピーナッツ油、綿実油、及び他の油のような天然に存在する植物油、又は、オレイン酸エチルのような合成脂肪媒体を含む、任意の無刺激性の固定油を用いることができる。緩衝液、保存料、抗酸化剤、及び適切な成分を所望により組み込むことができるか、或いは、それらで製剤を構成することができる。
ポリペプチドは、組成物における唯一の薬学的に活性な成分として製剤することができるか、又は、他の活性成分と組み合わせることができる。ポリペプチドは、抗体などの標的化作用物質へのコンジュゲートなどによる送達のために標的化され得る。組織標的リポソームを含むリポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容される担体として適切であり得る。これらは、当業者に知られている方法に従って調製することができる。例えば、リポソーム製剤は、米国特許第４５２２８１１号明細書に記載されているように調製することができる。リポソームの送達はまた、コラーゲンゲル及びフィブロネクチンで改変されたリポソームなどの薬学的マトリックスを含む遅延放出製剤も含み得る（例えば、Ｗｅｉｎｅｒら（１９８５）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．７４（９）：９２２〜５を参照されたい）。本明細書で提供される組成物はさらに、それだけに限らないが、不活性担体又はコロイド分散系などの、送達を容易にする１つ又は複数のアジュバントを含有し得る。そのような不活性担体の代表的な及び非限定的な例は、水、イソプロピルアルコール、気体状のフッ化炭素、エチルアルコール、ポリビニルピロリドン、プロピレングリコール、ゲル生成材料、ステアリルアルコール、ステアリン酸、鯨ろう、ソルビタンモノオレエート、メチルセルロース、及びその２つ以上の適切な組合せから選択することができる。活性化合物は、治療する対象への望ましくない副作用を伴うことなく治療上有用な効果を示すのに十分な量で、薬学的に許容される担体中に含まれる。治療上有効な濃度は、本明細書で提供されるアッセイなどの既知のｉｎ ｖｉｔｒｏ系及びｉｎ ｖｉｖｏ系において化合物を試験することにより、実証的に決定することができる。
ａ．用量
投与される治療物質の正確な量又は用量は、特定のＦＶＩＩポリペプチド、投与経路、並びに、疾患の重篤度や対象の体重及び全身状態などの他の検討事項に依存する。治療物質の局部投与は、典型的には、全身投与の任意の態様よりも必要な用量は少ないが、局部投与の後の治療物質の局部の濃度は、いくつかの場合では、全身投与で安全に得られるものよりも高くなり得る。必要であれば、特定の用量及び時間及び治療プロトコルは、実証的に決定又は推定することができる。例えば、組換えＦＶＩＩポリペプチド及び天然ＦＶＩＩポリペプチドの例示的な用量を、適切な用量を決定するための開始点として用いることができる。例えば、ｒＦＶＩＩａであるノボセブン（Ｎｏｖｏｓｅｖｅｎ）（登録商標）に活性化された組換えＦＶＩＩ（ｒＦＶＩＩａ）ポリペプチドを、出血症状を有している、血友病Ａ又は血友病Ｂを有する患者に、２〜５分にわたるボーラス注入によって９０μｇ／ｋｇの用量で投与して、少なくとも２μｇ／ｍｌの有効な循環レベルを達成している。投与は、止血が得られるまで２時間毎に繰り返す。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、そのような組換えＦＶＩＩと比較して、少ない投与量及び／又は頻度で有効であり得る。例えば、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、８０μｇ／ｋｇ、７０μｇ／ｋｇ、６０μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、又はそれ未満の用量で投与することができる。いくつかの実施形態では、用量は、１００μｇ／ｋｇ、１１０μｇ／ｋｇ、１２０μｇ／ｋｇ、又はそれ以上のように、より高くてもよい。治療期間及び注射間隔は、出血の重篤度及び治療に対する患者の応答で変化し、適宜調節することができる。非改変ＦＶＩＩと比較した、改変ＦＶＩＩの活性レベル及び半減期などの要素を、用量を決定する際に考慮することができる。特定の用量及びレジメンは実証的に決定することができる。
別の例では、ｒＦＶＩＩａであるノボセブン（登録商標）に活性化された組換えＦＶＩＩ（ｒＦＶＩＩａ）ポリペプチドを、出血症状を有している、先天性ＦＶＩＩ欠乏症を有する患者に、２〜５分にわたるボーラス注入によって１５〜３０μｇ／ｋｇの用量で投与している。投与は、止血が得られるまで４〜６時間毎に繰り返す。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、そのような組換えＦＶＩＩと比較して、少ない投与量及び／又は頻度で有効であり得る。例えば、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、２０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、又はそれ未満の用量で投与することができる。いくつかの例では、用量は、３５μｇ／ｋｇ、４０μｇ／ｋｇ、４５μｇ／ｋｇ、又はそれ以上のように、より高くてもよい。治療期間及び注射間隔は、出血の重篤度及び治療に対する患者の応答で変化し、適宜調節することができる。非改変ＦＶＩＩと比較した、改変ＦＶＩＩの活性レベル及び半減期などの要素を、用量の決定に用いることができる。例えば、非改変ＦＶＩＩポリペプチドよりも長い半減期を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドよりも少ない用量及び／又は少ない頻度で投与することができる。同様に、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して増大した凝固活性を示す改変ＦＶＩＩポリペプチドを用いての治療効果に必要な用量は、頻度及び量において低減し得る。特定の用量及びレジメンは、当業者によって実証的に決定され得る。
ｂ．投与形態
薬学的な治療活性を有する化合物及びその誘導体は、典型的には、単位投与形態又は複数投与形態で製剤及び投与される。製剤は、それだけに限らないが、錠剤、カプセル、ピル、粉末、粒子、無菌の非経口溶液又は懸濁液、経口溶液又は懸濁液、及び、適切な量の化合物又はその薬学的に許容される誘導体を含有する油水乳濁液を含む投与形態でヒト及び動物に投与するために提供され得る。それぞれの単位用量は、所望の治療効果を得るために十分な所定の量の治療上活性な化合物を、所望の薬学的担体、媒体、又は希釈剤と組み合わせて含有する。単位投与形態の例には、アンプル及びシリンジ及び個々に包装された錠剤又はカプセルが含まれる。いくつかの例では、単位用量は、投与の前に戻される凍結乾燥粉末として提供される。例えば、ＦＶＩＩポリペプチドは、注射のための単一用量溶液を得るために適切な溶液で再構成される凍結乾燥粉末として提供され得る。いくつかの実施形態では、凍結乾燥粉末は、ＦＶＩＩポリペプチド、及び塩などのさらなる構成要素を含有し得、それによって、滅菌蒸留水で再構成することにより、緩衝溶液又は食塩水中のＦＶＩＩポリペプチドが得られる。単位投与形態は、画分又は多画分で投与することができる。複数投与形態は、分離された単位投与形態で投与される単一容器に包装された、複数の同一の単位投与形態である。複数投与形態の例には、バイアル、錠剤若しくはカプセルのボトル、又はパイント若しくはガロンのボトルが含まれる。したがって、複数投与形態は、包装に分離されていない複数の単位用量である。
２．改変ＦＶＩＩポリペプチドの投与
本明細書で提供されるＦＶＩＩポリペプチド（即ち活性化合物）は、体液又は他の組織試料などの混合物とＦＶＩＩポリペプチドとを接触させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。例えば、化合物をｅｘ ｖｉｖｏで投与する場合、対象から得た体液又は組織試料を、例えばバイパス機器のチューブ又はフィルターなどのチューブ又はフィルター上に被覆されているＦＶＩＩポリペプチドに接触させることができる。ｉｎ ｖｉｖｏで投与する場合、活性化合物は、例えば経口、経鼻、経肺、非経口、静脈内、皮内、皮下、関節内、脳槽内、眼内、脳室内、髄腔内、筋肉内、腹腔内、気管内、又は局所の任意の適切な経路により、及びその任意の２つ以上の任意の組合せにより、液体、半液体、又は固体の形態で投与され得、また、それぞれの投与経路に適した様式で製剤される。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、１回、又は２回、３回、４回、若しくは治療効果を得るために必要な任意の回数などの複数回、投与することができる。複数投与は、任意の経路又は経路の組合せを介して行うことができ、１時間毎、２時間毎、３時間毎、４時間毎、又はそれ以上で投与することができる。
投与に最も適した経路は、例えば出血障害の位置などの、治療しようとする疾患の状態に応じて変化する。通常、ＦＶＩＩポリペプチドは、約２〜５分間の投与（注入）時間で、静脈内ボーラス注射によって投与される。他の例では、血漿レベルによって確認しながら活性物質を持続注入することにより、ＦＶＩＩの好ましい血中レベルを維持することができる。担当医が、毒性、又は骨髄、肝臓、若しくは腎臓の機能障害のために、いかにして及びいつ治療を終了し、中断し、又は低用量に治療を調節するかを知っているはずであることに注意されたい。逆に、担当医はまた、臨床応答が適切でない場合に、いかにして及びいつ治療を高レベルに調節するか（毒性副作用を避けながら）も知っているであろう。他の例では、出血障害の位置は、ＦＶＩＩ製剤が別の経路を経て投与されることを示し得る。例えば、脳への投与（例えば脳室内投与）を含む局部投与は、患者がこの領域に出血を有している場合に行うことができる。同様に、関節における出血の治療では、関節への治療物質の注射による局部投与（即ち、関節内、静脈内、又は皮下手段）を用いることができる。他の例では、例えばクリーム、ゲル、若しくは軟膏として製剤された治療物質の皮膚への局所投与、又は、吸入若しくは気管内投与による肺への投与が、出血がこれらの領域に位置している場合には適切であり得る。
改変ＦＶＩＩポリペプチドがデポー調製物として製剤される場合、長時間作用型製剤を移植（例えば、皮下若しくは筋肉内）又は筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、治療化合物は、適切なポリマー材料若しくは疎水性材料（例えば許容される油中の乳濁液など）、又はイオン交換樹脂を用いて、或いは、例えば難溶性の塩などの難溶性誘導体として、製剤することができる。
必要であれば、組成物を、活性成分を含有する１つ又は複数の単位投与形態を含有し得る、包装、キット、又はディスペンサー装置内に入れることができる。包装は、例えば、ブリスター包装などのように、金属又はプラスチックの箔を含有する。包装又はディスペンサー装置は、投与のための説明書を伴い得る。活性物質を含有する組成物は、包装材料、本明細書で提供される作用物質、及び作用物質の提供対象である障害を説明するラベルを含有する製品として包装することができる。
３．改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸の投与（遺伝子治療）
遺伝子治療に適している、改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸分子の組成物及びそれをコードする発現ベクターも提供される。タンパク質を運搬するよりもむしろ、核酸は、全身投与若しくは他の経路などでｉｎ ｖｉｖｏで投与することができるか、又は、リンパ球を含む細胞の除去、そこへの核の導入、及び宿主若しくは適合レシピエントへの再導入などにより、ｅｘ ｖｉｖｏで投与することができる。
改変ＦＶＩＩポリペプチドは、核酸分子の発現によって細胞及び組織に送達することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ｅｘ ｖｉｖｏでの技術及び直接的なｉｎ ｖｉｖｏでの発現を含む、改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸分子として投与することができる。核酸は、当業者に知られている任意の方法によって細胞及び組織に送達することができる。単離された核酸配列は、さらなる操作のためにベクター内に組み込むことができる。本明細書において、ベクター（又はプラスミド）とは、細胞の発現又は複製のために異種ＤＮＡを細胞内に導入するために用いる、個々のエレメントをいう。このような媒体の選択及び使用は、十分に、当業者の技術の範囲内である。
コード核酸分子の発現により改変ＦＶＩＩポリペプチドを投与するための方法には、組換えベクターの投与が含まれる。ベクターは、複製起点を含めることなどによってエピソーム性であり続けるように設計することができるか、又は、細胞の染色体内に導入するように設計することができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、非ウイルスベクターを用いたｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子発現治療に用いることができる。例えば、細胞は、改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸をゲノム位置内に組み込むことなどにより、改変ＦＶＩＩポリペプチドを発現するように操作することができ、その際、このポリペプチドは、制御配列に作動的に連結しているか、又はゲノム位置の制御配列に作動的に連結するように位置する。そのような細胞は、次に、治療を必要としている患者などの対象に局部的又は全身的に投与することができる。
ウイルスベクターには、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスが含まれ、また、遺伝子治療のために設計された他のウイルスを用いることができる。ベクターはエピソーム性であり続けることができるか、又は、治療する対象の染色体内に組み込むことができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、治療を必要とする対象に投与されたウイルスによって発現され得る。遺伝子治療に適したウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、及び上記の他のウイルスが含まれる。例えば、アデノウイルス発現の技術は当技術分野において周知であり、アデノウイルスの生成方法及び投与方法もまた周知である。アデノウイルスの血清型は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手可能である。アデノウイルスはｅｘ ｖｉｖｏで使用可能であり、例えば、細胞は治療を必要とする患者から単離され、改変ＦＶＩＩポリペプチドを発現するアデノウイルスベクターを用いて形質導入される。適切な培養期間の後、形質導入細胞を、局部的及び／又は全身的に対象に投与する。或いは、改変ＦＶＩＩポリペプチドを発現するアデノウイルス粒子を単離し、対象の疾患又は状態を防ぎ、治療し、又は改善するために治療上有効な量を送達するための、薬学的に許容される担体内に製剤する。典型的には、アデノウイルス粒子は、対象の体重１ｋｇ当たり１〜１０１４個粒子の範囲、通常は対象の体重１ｋｇ当たり１０６又は１０８〜１０１２個粒子の用量で送達される。いくつかの状況では、核酸源に、細胞表面膜タンパク質若しくは標的細胞に特異的な抗体又は標的細胞上の受容体のリガンドなどの、細胞を標的化する作用物質を付与することが望ましい。ＦＶＩＩはまた、特異的な細胞型への送達のために標的化され得る。例えば、ＦＶＩＩポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターは、肝細胞などの非分裂細胞における安定な発現に用いることができる（Ｍａｒｇａｒｉｔｉｓら（２００４）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１３：１０２５〜１０３１）。別の例では、ＦＶＩＩポリペプチドをコードするウイルスベクター又は非ウイルスベクターを、その後の送達のために、単離した細胞内に形質導入することができる。ＦＶＩＩの発現及び送達のためのさらなる細胞型には、それだけに限らないが、線維芽細胞及び内皮細胞が含まれ得る。
核酸分子は、人工染色体及び他の非ウイルスベクター内に導入することができる。ＡＣＥＳ（Ｌｉｎｄｅｎｂａｕｍら（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（２１）：ｅ１７２を参照されたい）などの人工染色体を、アイソフォームをコード及び発現するように操作することができる。簡潔に述べると、哺乳動物の人工染色体（ＭＡＣ）により、大量の遺伝情報を、自己複製している細胞内に非組み込み形式で導入するための手段が得られる。ＭＡＣの間で唯一、哺乳動物のサテライトＤＮＡに基づいた人工染色体の発現（ＡＣＥ）を、異なる種の細胞株において再生可能にｄｅ ｎｏｖｏで生成し、宿主細胞の染色体から容易に精製することができる。精製された哺乳動物ＡＣＥは、次に、様々なレシピエント細胞株に再導入することができ、この細胞系において、ＡＣＥは、ＡＣＥ系を用いて、選択可能な圧力の不在下で長期間にわたり安定に維持されている。このアプローチを用いて、１つ又は２つの遺伝子標的の特異的なロードがＬＭＴＫ（−）細胞及びＣＨＯ細胞において行われている。
改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸を導入するための別の方法は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）においてクローニングされた完全なアデノウイルスゲノム（Ａｄ２、Ｋｅｔｎｅｒら（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：６１８６〜６１９０）、並びに、ＹＡＣクローンにおける特定の領域を標的化するためのアデノウイルス配列を含有するプラスミド、目的の遺伝子のための発現カセット、及び陽性や陰性の選択可能マーカーを用いて開始される、酵母における２段階の遺伝子交換技術である。ＹＡＣは、大きな遺伝子の組み込みを可能にするため、特に興味深いものである。このアプローチは、哺乳動物細胞又は動物全体に遺伝子を導入するための、記載された任意の改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸を有するアデノウイルスに基づいたベクターを構築するために用いることができる。
核酸は、リポソームなどの媒体に封入することができるか、又は細菌細胞、とりわけ弱毒化細菌などの細胞に導入することができるか、又はウイルスベクター内に導入することができる。例えば、リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、標的化のために、並びに／又は、例えば特定の細胞型に指向性であるカプシドタンパク質若しくはその断片、循環に内在化されるタンパク質に対する抗体、及び細胞内局在化を標的化し細胞内の半減期を増大させるタンパク質の取り込みを容易にするために用いることができる。
ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの方法のために、改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸分子を、適切なドナー又は治療しようとする対象から得た細胞内に導入する。治療を目的として核酸を導入することができる細胞には、例えば、任意の所望の、治療しようとする疾患又は状態に適した利用可能な細胞型が含まれ、それには、それだけに限らないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；様々な幹細胞又は前駆細胞、とりわけ、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓、及び他のその由来源から得た幹細胞などの、造血幹細胞又は造血前駆細胞が含まれる。
ｅｘ ｖｉｖｏでの治療のために、治療しようとする対象に適合するドナーから得た細胞、又は治療しようとする対象の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞内に導入し、改変細胞を対象に投与する。治療には、例えば多孔質膜内に封入し、それを患者に移植するなどの、直接的な投与が含まれる（例えば、参照することにより全体がそれぞれ本明細書に組み込まれる、米国特許第４８９２５３８号明細書及び米国特許第５２８３１８７号明細書を参照されたい）。哺乳動物細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏでの核酸の導入に適した技術には、リポソーム及び陽イオン性脂質（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、及びＤＣ−Ｃｈｏｌ）のエレクトロポレーションの使用、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、並びにリン酸カルシウム沈殿法が含まれる。ＤＮＡ送達の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏで改変ＦＶＩＩポリペプチドを発現させるために用いることができる。そのような方法には、エレクトロポレーション、超音波、及びリン酸カルシウム送達などを用いた局部的及び全身的な送達を含む、核酸のリポソーム送達及び裸のＤＮＡの送達が含まれる。他の技術には、マイクロインジェクション、細胞融合、染色体媒介性の遺伝子導入、ミクロ細胞媒介性の遺伝子導入、及びスフェロプラスト融合が含まれる。
改変ＦＶＩＩポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの発現は、さらなる分子の発現に結びつけることができる。例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドの発現を、操作したウイルスなどにおける、又は細胞毒性ウイルス内で発現した、細胞毒性生成物の発現と結びつけることができる。そのようなウイルスは、治療効果の標的である特定の細胞型に標的化することができる。発現した改変ＦＶＩＩポリペプチドを用いて、ウイルスの細胞毒性を増強させることができる。
改変ＦＶＩＩポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの発現には、改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸分子を、細胞特異的プロモーター又は組織特異的プロモーターなどの特定の制御配列に作動的に連結することが含まれ得る。改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、標的細胞型及び／又は標的組織に特異的に感染し、及び／又はそれにおいて複製するベクターから発現させることができる。誘導可能なプロモーターを用いて、改変ＦＶＩＩポリペプチドの発現を選択的に制御することができる。例示的な制御可能な発現系は、組換えＦＶＩＩの発現を制御するために用いられているドキシサイクリン誘導性遺伝子発現系である（Ｓｒｏｕｒら（２００３）Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．９０（３）：３９８〜４０５）。
裸の核酸などの核酸分子又はベクター内の核酸分子、人工染色体、リポソーム、及び他の媒体を、全身投与、局所投与、局部投与、及び他の経路の投与によって対象に投与することができる。全身的及びｉｎ ｖｉｖｏでの場合、核酸分子又は核酸分子を含有する媒体を細胞に標的化することができる。
投与はまた、細胞又は組織を典型的に標的化するベクター又は細胞の投与によるものなど、直接的なものであり得る。例えば、腫瘍細胞及び増殖細胞を、改変ＦＶＩＩポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの発現についての標的細胞とすることができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの発現に用いる細胞にはまた、患者にとって自己の細胞も含まれる。そのような細胞を患者から取り出し、改変ＦＶＩＩポリペプチドの発現についての核酸を導入し、そして、注射又は移植などにより患者に投与することができる。
Ｉ．治療的使用
本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、組換えＦＶＩＩが用いられる任意の状態の治療に用いることができる。典型的には、そのような治療には、止血応答の増大などの凝固の増大が望まれるものが含まれる。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、単独で、又は他の作用物質と組み合わせて、治療活性を有する。本明細書で提供される改変ポリペプチドは、治療活性を保持するが、改変された特性、とりわけＴＦＰＩに対する抵抗性の増大、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大、触媒活性の増大、半減期の増大、並びに／又は活性化血小板に対する結合及び／若しくは親和性の増大を示すように設計される。そのような改変された特性により、例えば、改変ＦＶＩＩポリペプチドの凝固活性の向上のために、ポリペプチドの治療有効性が向上し得る。この節は、例示的な使用及び投与の方法を提供する。これらの記載された治療は例示的なものであり、改変ＦＶＩＩポリペプチドの適用を限定するものではない。
本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩが用いられる様々な治療方法及び診断方法において用いることができる。そのような方法には、それだけに限らないが、以下に記載及び列挙する生理的状態及び医学的状態の治療方法が含まれる。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、野生型ＦＶＩＩと比較して、同一の効果を得るための用量の減少、並びに、投与頻度の減少及び／又は低下、副作用の低下、及び治療効果の増大などの、投与及び治療における他の向上を含む、ｉｎ ｖｉｖｏでの活性及び治療効果の向上を示し得る。改変ＦＶＩＩポリペプチドをＦＶＩＩ酵素原（即ち一本鎖形態）として投与し得ることは知られているが、典型的には、本明細書において提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、例えば、精製の間などの自己活性化又は他の凝固因子による活性化の後に、活性化した二本鎖形態で投与される。
とりわけ、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＦＶＩＩが治療に用いられてきた治療方法において用いることを目的としたものである。そのような方法には、それだけに限らないが、血液凝固障害、血液障害、出血障害、血友病Ａ、血友病Ｂ、及び第ＶＩＩ因子欠乏症などの血友病、並びに肝臓疾患により生じる後天性第ＶＩＩ因子欠乏症などの後天性血液障害などの、疾患及び障害の治療方法が含まれる。改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、それだけに限らないが、血小板減少症（例えば、化学療法レジメによるものなど）、フォンウィルブランド病、遺伝性血小板障害（例えば、チェディアック東症候群及びヘルマンスキーパドラック症候群、トロンボキサンＡ２機能障害、グランツマン血小板無力症、及びベルナールスーリエ症候群などの貯蔵プール疾患）、溶血性尿毒症症候群、Ｒｅｎｄｕ−Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｅｒ症候群としても知られている遺伝性出血性末梢血管拡張症、アレルギー性紫斑病（ヘノッホシェーンライン紫斑病）、並びに播種性静脈内凝固などの、さらなる出血疾患及び出血障害の治療に用いることもできる。
いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩポリペプチドによって治療しようとする出血は、脳、内耳領域、目、肝臓、肺、腫瘍組織、消化管などの器官において生じる。他の実施形態では、出血は、出血性胃炎及び大量の子宮出血におけるものなど、びまん性である。例えば血友病Ａ及びＢなどの出血障害を有する患者は、外科手術又は外傷の際の出血性合併症のリスクにさらされることが多い。そのような出血は、急性関節血症（関節における出血）、慢性血友病性関節症、血腫（例えば、筋肉、後腹膜、舌下、及び咽頭後）、血尿（腎管からの出血）、中枢神経系の出血、消化管の出血（例えば、ＵＧＩ出血）、並びに脳出血として現れ得、これらは、改変ＦＶＩＩポリペプチドによっても治療することができる。さらに、外科手術（例えば、肝切除）又は抜歯に関連する任意の出血を、改変ＦＶＩＩポリペプチドで治療することができる。一実施形態では、改変ＦＶＩＩポリペプチドを、対象において、外傷若しくは外科手術による出血症状を治療するため、又は血小板の数若しくは活性を低下させるために用いることができる。外科手術を受けている患者に対する例示的な方法には、出血を防ぐための治療、及び、それだけに限らないが、心臓手術、血管形成術、肺手術、腹部手術、脊椎手術、脳手術、血管手術、歯科手術、又は、骨髄、心臓、肺、膵臓、若しくは肝臓の移植を含む臓器移植手術などの、外科手術の前、最中、又は後の治療が含まれる。
改変ＦＶＩＩポリペプチドを用いた疾患及び状態の治療は、それだけに限らないが、注射、経肺投与、経口投与、及び経皮投与を含む、本明細書に記載されている適切な製剤を用いた任意の適切な投与経路によって行うことができる。治療は典型的には、静脈内ボーラス投与によって行われる。
必要であれば、特定の用量及び期間及び治療プロトコルを実証的に決定又は推定することができる。例えば、組換えＦＶＩＩポリペプチド及び天然ＦＶＩＩポリペプチドの例示的な用量を、適切な用量を決定するための開始点として用いることができる。例えば、ｒＦＶＩＩａであるノボセブン（登録商標）に活性化された組換えＦＶＩＩ（ｒＦＶＩＩａ）ポリペプチドを、出血症状を有している、血友病Ａ又は血友病Ｂを有する患者に、２〜５分間にわたるボーラス注入によって９０μｇ／ｋｇの用量で投与して、平均半減期が２．７時間の、少なくとも２μｇ／ｍｌの効果的な循環レベルを達成している。投与は、止血が得られるまで２時間毎に繰り返す。ＴＦＰＩに対する抵抗性の増大、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大、触媒活性の増大、半減期の増大、並びに／又は、活性化血小板に対する結合及び／若しくは親和性の増大による、凝固活性の増大を有する改変ＦＶＩＩポリペプチドは、このような組換えＦＶＩＩと比較して、低減した投与量及び／又は頻度で効果的であり得る。野生型ＦＶＩＩポリペプチド又は非改変ＦＶＩＩポリペプチドの用量を、改変ＦＶＩＩポリペプチドの用量を決定するための指標として用いることができる。非改変ＦＶＩＩと比較した、改変ＦＶＩＩの活性レベル及び半減期などの因子を、そのような決定を行うために用いることができる。特定の用量及びレジメンは、実証的に決定することができる。
用量レベル及びレジメンは、既知の用量及びレジメンに基づいて決定することができ、必要であれば、改変ポリペプチドの特性における変化に基づいて推定することができ、及び／又は様々な因子に基づいて実証的に決定することができる。そのような因子には、個体の体重、全身的な健康状態、年齢、用いる特定の化合物の活性、性別、食生活、投与の時間、排泄速度、薬物の組合せ、疾患の重篤度及び経過、並びに、疾患に対する患者の意向及び治療する医者の判断が含まれる。活性成分であるポリペプチドは、典型的には、薬学的に有効な担体と組み合わされる。単一投与形態又は複数投与形態を生成するための、担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、治療する宿主及び特定の投与形態に応じて変化し得る。
血液の凝固時間に対するＦＶＩＩポリペプチドの効果は、それだけに限らないが、全血のプロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）、活性化凝固時間（ＡＣＴ）、再石灰化活性化凝固時間、又はＬｅｅ−Ｗｈｉｔｅ凝固時間を含む、当技術分野において知られている任意の凝固試験を用いてモニターすることができる。
患者の状態を向上させる際に、必要であれば、維持用量の化合物又は組成物を投与することができ、用量、投与形態、若しくは投与頻度、又はその組合せを変えることができる。いくつかの場合では、対象は、疾患症状の任意の再発に対する長期にわたる、又は計画的な投与に基づく、断続的な治療を必要とする場合がある。他の場合では、出血、外傷、又は外科的処置などの急性の事象に応じて、さらなる投与が必要となり得る。
以下は、ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａとして投与される）が単独で、又は他の作用物質と組み合わせて治療物質として用いられている、いくつかの例示的な症状である。
１．先天性出血障害
ａ．血友病
先天性血友病は、血漿中の凝固因子のレベルが低下し、それにより凝固カスケードの破壊及びブロット凝固時間の増大が生じる、劣性の血液障害である。血友病の全症例の約８５％を占める血友病Ａは、Ｘ染色体上の第ＶＩＩＩ因子遺伝子における突然変異（複数可）の結果生じるものであり、ＦＶＩＩＩタンパク質の欠乏又は機能障害をもたらす。血友病Ｂは、凝固因子ＦＩＸの欠乏又は機能障害により生じ、通常は、Ｘ染色体上のＦＩＸ遺伝子における点突然変異又は欠失の結果によるものである。血友病Ａの世界的な発生率は５０００人の男性につき約１例であり、血友病Ｂでは、２５０００人の男性につき１例である。血友病Ａ及びＢはさらに、軽度、中度、又は重度に分類される。５％〜２５％の正常に機能する第ＶＩＩＩ因子又はＩＸの血漿レベルは軽度と分類され、１％〜５％は中度、１％未満は重度と分類される。ＦＸＩ欠乏症といわれることが多い血友病Ｃは、比較的軽度で稀な疾患であり、常染色体劣性の様式で１０万人に約１人が罹患する。
血友病Ａ及びＢは、多くの方法で臨床的に現れる。わずかな切り傷及び擦り傷では大量の出血にはならないが、外傷及び外科手術では大量の出血が生じる。患者はまた、多くの関節出血及び筋肉出血を有し、あざができやすい。関節血症又は関節内への出血は、血友病における主な合併症の１つであり、自然に、又は外傷に応じて生じ得る。膝、肘、及び足首などの蝶番関節が最も頻繁に影響を受けやすい。球関節はその周りにより多くの筋肉組織を有しており、損傷からより保護されるため、臀部及び肩はそれほど頻繁には影響を受けない。出血は、重度の急性の疼痛、動きの制限の原因となり得、滑膜の肥大を含む二次性合併症をもたらす。さらに、関節における再発性の出血は、関節の損傷、滑膜、軟骨、及び骨の破壊を生じさせ得る、慢性滑膜炎の原因となり得る。頭蓋内出血及び中枢神経系における出血などの、生命に関わる出血もまた、血友病を有する対象を苦しめるものである。頭蓋内の出血は、重度の血友病を有する患者の約１０％において生じ、３０％の死亡率となる。逆に、血友病Ｃはより軽度である。自然な出血が見られるのは稀であり、関節、軟組織、及び筋肉内への出血もあまり見られない。出血は通常、新鮮な凍結血漿（ＦＦＰ）の輸血、ＦＸＩ補充療法で治療されるか、又は、外部創傷若しくは抜歯の治療などの局所治療ではフィブリン接着剤で治療される。
血友病Ａ又はＢの最も一般的な治療は、ＦＶＩＩＩ又はＦＩＸを患者に投与する補充療法である。製剤は、これまでに治療されなかった患者において現在選択されている治療である組換えタンパク質を有する、血漿由来の生成物又は組換え産物として市販されている。これらの治療は非常に有効であり得るが、新たに投与された第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子に対する阻害剤を患者が発現した場合、合併症が生じる。阻害剤は、ほとんどの場合ＩｇＧ４サブクラスのＩｇＧ抗体であり、これは、ＦＶＩＩＩ又はＦＩＸと反応し、凝固促進機能に干渉するものである。阻害剤は重度の血友病Ａを有する患者の５人のうち約１人に作用する。ほとんどの対象は、第ＶＩＩＩ因子の最初の注入を投与した直後にこれらの阻害剤を発現し、これは幼児期においてよくあるが、対象は後年にそれらを発現する。阻害剤はまた、軽度又は中度の血友病Ａを有する１５人のうち約１人に作用する。これらの阻害剤は通常、成人期の間に発現し、投与された外因性ＦＶＩＩＩを破壊するだけでなく、内因性ＦＶＩＩＩも破壊する。その結果、軽度及び中度の血友病は重度になる。臨床的には、阻害剤を有する血友病Ａの患者は、彼らが再びＦＶＩＩＩにさらされた時に彼らが有する既往反応の強さに従って、高度及び低度の応答者に分類される。阻害剤は、血友病Ｂを有する患者の１００人のうち約１人に作用する。ほとんどの場合では、阻害剤は、治療第ＩＸ因子の最初の注入の後に発現し、アレルギー反応を伴い得る。
本明細書において示される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、血友病を有する患者、とりわけ阻害剤を有する血友病患者の治療に用いることができる。組換えＦＶＩＩａ生成物（ノボセブン、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、ＦＶＩＩＩ又はＦＩＸに対する阻害剤を有する血友病Ａ又はＢの患者における出血症状の治療、並びにＦＶＩＩＩ又はＦＩＸに対する阻害剤を有する血友病Ａ又はＢの患者における外科的介入又は侵襲的処置における出血の予防について、認可及び許諾されている。ｒＦＶＩＩａを用いた治療は、トロンビンの生成を増強する一方で、ＦＶＩＩＩａ及び／又はＦＩＸａの必要性を回避するものである。凝固は、ｒＦＶＩＩａとＴＦとの相互作用により損傷の部位で開始し、それにより、最初のＦＸ活性化、トロンビンの生成、及び血小板の活性化が生じる。ｒＦＶＩＩａによる完全な凝固は、ＴＦ依存性及びＴＦ非依存性のメカニズムにより行われ得、このメカニズムにおいて、生じたトロンビンのいくらかは、ｒＦＶＩＩａ単独による、活性化血小板に対するＦＸの直接的な活性化の結果生じ得、ｒＦＶＩＩａ自体は、リン脂質膜との低い親和性の相互作用を介して活性化血小板に結合する。
本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、出血症状の治療、及び外科的介入若しくは侵襲的処置における出血の予防を含む、血友病の治療において用いることができる。本明細書における改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体阻害剤であるＴＦＰＩに対する抵抗性の増大、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大、触媒活性の増大、半減期の増大、並びに／又は、活性化血小板に対する結合及び／若しくは親和性の増大をもたらす。したがって、ＦＶＩＩポリペプチドは、ＴＦ依存性の様式（ＴＦＰＩに対する抵抗性の増大を介するものなど）及び／又はＴＦ非依存性の様式（活性化血小板に対する結合／又は親和性の増大を介するものなど）で、より高い凝固活性を示し得る。したがって、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、血友病に対する、より活性な治療を提供するために用いることができる。改変ＦＶＩＩポリペプチドを用いた治療の向上の例には、例えば、それだけに限らないが、用量の減少、投与頻度の減少及び／又は低下、副作用の低下、並びに治療効果の増大が含まれる。
改変ＦＶＩＩポリペプチドは、典型的には、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、例えば動物モデルを用いて、治療有効性について試験することができる。例えば、抗体誘発性の血友病マウス、又は血友病についての他の既知の疾患モデルを、改変ＦＶＩＩポリペプチドで治療することができる。疾患の症状の進行及び表現型をモニターして、改変ＦＶＩＩポリペプチドの効果を評価する。改変ＦＶＩＩポリペプチドはまた、プラセボ対照及び／又は非改変ＦＶＩＩを用いた対照と比較してｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を評価するための臨床試験などにおいて、対象に投与することができる。
ｂ．ＦＶＩＩ欠乏症
第ＶＩＩ因子欠乏症は、５０万人に約１人が罹患する常染色体劣性の出血障害である。ＦＶＩＩ欠乏症は、臨床的に軽度、中度、又は重度であり得、軽度から中度の欠乏症は、外科手術及び外傷後の出血の増大に特徴を有する。重度のＦＶＩＩ欠乏症（１％未満のＦＶＩＩ活性）を有する患者は、血友病と類似の症状を有する。例えば、ＦＶＩＩ欠乏症の対象は、関節出血、自然発生的な鼻血、消化管の出血、腎管の出血を起こしやすい。脳内出血及び筋肉出血もまた報告されており、一方、女性は重度の月経過多（重い月経出血）を有し得る。治療は、補充療法によって行うことができる。組換えＦＶＩＩａ製品（ノボセブン（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、先天性ＦＶＩＩ欠乏症を有する患者における出血症状の治療、及び先天性ＦＶＩＩ欠乏症を有する患者における外科的介入又は侵襲的処置における出血の予防について、認可及び許諾されている。したがって、本明細書における改変ＦＶＩＩポリペプチドを同様に用いることができる。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、出血症状の治療、及びＦＶＩＩ欠乏症患者における外科的介入又は侵襲的処置における出血の予防に用いることができる。例えば、頭蓋内出血を伴う重度のＦＶＩＩ欠乏症を有する新生児の患者に、静脈内ボーラスによって改変ＦＶＩＩポリペプチドを投与することで、凝固をもたらし、止血を維持することができる。通常、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。
ｃ．その他
他の出血障害は、本明細書で提供される、凝固を促進するためのＦＶＩＩポリペプチドを用いて治療することができる。第Ｖ及びＸ因子の先天性欠乏症もまた、血液凝固時間の増大を示し、治療用量のＦＶＩＩを投与することで治療できる可能性がある。例えば、第Ｘ因子欠乏症を有する患者にｒＦＶＩＩａを投与して、脾臓摘出に関連する出血を調節することができる（Ｂｏｇｇｉｏら（２００１）Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １１２：１０７４〜１０７５）。フォンウィルブランド病（ｖＷＤ）に関連する、自然発生的な及び外科的に関連している出血症状もまた、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドを用いて治療することができる。ＶＷＤは、血液凝固タンパク質であるフォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）の欠陥及び欠乏により生じる出血障害であり、人口の１％〜２％に生じると推定されている。ｖＷＤを有する対象はあざができやすく、再発性の鼻血、抜歯、扁桃摘出又は他の外科手術の後の出血を有し、女性の患者は生理出血が増大し得る。改変ＦＶＩＩポリペプチドは、ｖＷＤ患者における、自然発生的な及び外科的に関連している出血を改善するために用いることができる（ｖｏｎ Ｄｅｐｋａら（２００６）Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌ Ｆｉｂｒｉｎ １７：３１１〜３１６）。例えばグランツマン血小板無力症及びヘルマンスキーパドラック症候群などの、他の血小板関連出血障害もまた、内因性の凝固活性の低減に関連するものである。血小板関連出血障害を有する患者における、過剰な、自然発生的な又は外科的に関連する出血もまた、治療用量の改変ＦＶＩＩポリペプチドによって調節することができる。例えば、外科手術を受けているグランツマン血小板無力症の患者は、大量の血液の損失を防ぐために、外科手術の前、最中、及び／又は後に、改変ＦＶＩＩポリペプチドで治療することができる（ｖａｎ Ｂｕｕｒｅｎら（２００２）Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ ４７：２１３４〜２１３６）。通常、改変ＦＶＩＩポリペプチドは活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。
２．後天性出血障害
ａ．化学療法による後天性の血小板減少症
出血障害はまた、先天性よりもむしろ後天性のものであり得る。例えば、白血病及び他の癌などの化学療法治療により、血小板減少症が生じ得る。これは、化学療法を受けた患者の骨髄における血小板の生成の低下によるものと考えられ、典型的には、薬物投与の６〜１０日後に生じる。後天性血小板減少症の治療は、通常、血小板の欠乏から生じ得る任意の異常な自然発生的な出血の予防に役立つ、血小板、赤血球、又は血漿の輸血により行われる。化学療法誘発性の血小板減少症又は任意の他の後天性若しくは先天性の血小板減少症を有する患者における出血もまた、治療用量の、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドを投与することにより調節することができる。例えば、消化管などにおける調節されていない出血を有する血小板減少症の患者に、治療用量のＦＶＩＩポリペプチドを静脈内ボーラス注入で投与して、出血を止めることができる（Ｇｅｒｏｔｚｉａｆａｓら（２００２）Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ６９：２１９〜２２２）。通常、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。
ｂ．他の凝固障害
他の後天性凝固障害を、本明細書において示される改変ＦＶＩＩポリペプチドを用いて治療することができる。凝固障害は、それだけに限らないが、劇症肝不全（ＦＨＦ、肝毒性薬、毒素、代謝性疾患、感染性疾患、及び虚血により生じるものなど）、肝硬変及びウィルソン病に関連する疾患を含む他の肝臓疾患、ビタミンＫ欠乏症（抗生物質治療又はダイエットにより生じるものなど）、溶血性尿毒症症候群、血栓性血小板減少症（ＴＴＣ）、並びに播種性血管内凝固障害（ＤＩＣ）を含む状態の結果生じ得る。従来の治療は、通常、血漿、赤血球（ＲＢＣ）、又は血小板の輸血によるものであるが、成功しない場合がある。一実施形態では、改変ＦＶＩＩポリペプチドを、侵襲的処置を受けているＦＨＦを有する患者に投与して、出血を防ぐことができる。新鮮な冷凍血漿（ＦＦＰ）を用いる従来の治療は成功しないことが多く、大量の血漿を必要として容量負荷及び全身浮腫（皮下結合組織への浮腫液の全身性浸潤）をもたらす場合がある。例えば肝臓生検又は肝臓移植などの侵襲的外科手術の最中、前、及び／又は後に静脈内ボーラスを行うことによる、治療用量の改変ＦＶＩＩポリペプチドを用いた治療は、ＦＨＦ患者において、出血を防ぎ、止血を確立することができる。患者を、血液のＰＴによりモニターして、治療の効力を決定することができる（Ｓｈａｍｉら（２００３）Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌ ９：１３８〜１４３）。別の実施形態では、従来の輸血注入に応答しない、凝固障害に関連する重度の出血、例えば、肝機能障害及びＤＩＣに関連する帝王切開後の重度の腹腔内出血などを有する患者に、ＦＶＩＩを投与することができる（Ｍｏｓｃａｒｄｏら（２００１）Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ １１３：１７４〜１７６）。さらに、改変ＦＶＩＩポリペプチドを用いて、新生児及び小児の患者における凝固障害を治療することができる。特定の実施形態では、新生児及び小児の患者は、ＲＢＣ及び血小板の注入などの従来の治療に対して応答しない。例えば、ＲＢＣ及び血小板の輸血に応答しない、ＰＴの増大に関連する重度の肺出血を有する新生児に、改変ＦＶＩＩポリペプチドを投与することで、ＰＴを低下させ、止血を確立することができる（Ｏｌｏｍｕら（２００２）Ｊ Ｐｅｒｉｎａｔｏｌ ２２：６７２〜６７４）。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して増強した凝固活性を示し、したがって、例えば低い用量、少ない頻度、及び少ない有害反応で投与することができる。通常、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。
ｃ．移植による後天性の出血
骨髄移植（ＢＭＴ）及び幹細胞移植（ＳＣＴ）の後の重度の出血は、血小板の低減に起因する、これらの処置に関連する比較的一般的な、及び生命に関わる合併症である。例えば、びまん性肺胞出血（ＤＡＨ）は、推定上の発生率が移植人口の１〜２１％であり、死亡率が６０〜１００％である、ＢＭＴの肺における合併症である。そのような出血症状の従来の治療には、コルチコステロイド治療、並びに血漿、血小板、及び／又はＲＢＣの輸血が含まれるが、これらは多くの場合成功せず、全体的な死亡率は約５０％である（Ｈｉｃｋｓら（２００２）Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌ ３０：９７５〜９７８）。コルチコステロイド及び／又は血小板の注入との同時の治療を伴って又は伴わずに、静脈内ボーラスによりＦＶＩＩを投与して、ＤＡＨを治療し、止血を確立することができる（Ｈｉｃｋｓら（２００２）Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌ ３０：９７５〜９７８）。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して増強した凝固活性を示し、したがって、例えば低い用量、少ない頻度、短い治療期間、及び少ない有害反応で投与して、同じ生物学的活性及び効力を得ることができる。通常、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。
ｄ．抗凝固療法誘発性の出血
血栓塞栓症などの状態の治療のために抗凝固療法を受けている患者は、ワルファリン、ヘパリン、及びフォンダパリヌクスなどの抗凝固物質を急性投与すると出血症状を示し得るか、又は、そのような療法を長期にわたり用いた結果、出血障害を発現し得る。出血症状の治療には、典型的には、ビタミンＫ、血漿、外因性ＦＩＸ、及びヘパリンを中和するためのプロタミンなどの凝固促進剤の投与が含まれる。外因性ＦＶＩＩの投与もまた、抗凝固物質の効果を中和するため、ＰＴ、ａＰＴＴ、及び／又は他の凝固マーカーを増大させるため、並びに止血を確立するために行うことができる（Ｄｅｖｅｒａｓら（２００２）Ａｎｎ Ｉｎｔｅｎ Ｍｅｄ １３７：８８４〜８８８）。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドを治療に用いて、抗凝固治療に起因する後天性の出血障害を有する患者における出血症状を調節することができる。通常、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。
ｅ．後天性血友病
第ＶＩＩＩ因子阻害剤は、他の点では健康な個体において自然発生的に発現し、「後天性血友病」として知られている状態をもたらす。後天性血友病は、毎年１００万人の人口当たり０．２〜１．０で発生する稀な状態である。自己抗体は主にＩｇＧ４抗体であり、これは、ＦＶＩＩＩに結合すると、トロンビン切断、フォンウィルブランド因子の相互作用、及び／又はリン脂質の結合に干渉することにより、ＦＶＩＩＩ活性を阻害する。これにより、罹患した患者の約８７％に、生命に関わる出血が生じる。出血の一般的な部位は、遺伝性血友病の患者が主に関節及び筋肉において出血するのに対し、皮膚、粘膜、筋肉、及び後腹膜である。後天性血友病は、活性化プロトロンビン複合体濃縮物又は組換え活性化第ＶＩＩ因子（ノボセブン（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）を用いて治療し、出血症状を調節することができる。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して増強した凝固活性を示し、したがって、例えば低い用量、少ない頻度、短い治療期間、及び少ない有害反応で投与して、同じ生物学的活性及び効力を得ることができる。通常、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。
３．外傷及び外科手術での出血
ＦＶＩＩポリペプチドを、正常な凝固系を有する対象における、周術期及び外傷での血液損失に関連する出血を治療するための療法として用いることができる。例えば、ＦＶＩＩポリペプチドを患者に投与して、凝固を促進し、外科手術に関連する血液損失を低減させ、さらに、輸血の必要性を低減させることができる。一実施形態では、ＦＶＩＩポリペプチドを、恥骨後前立腺摘除術を受けている対象に投与することができる。恥骨後前立腺摘除術は、大量の血液損失及びその後の輸血の必要性に関連することが多い。そのような又は類似の外科手術を受けている対象に、手術の初期に治療用量のＦＶＩＩを静脈内ボーラスして、外科手術部位での凝固を増強することによって周術期の血液損失を低減させることができる。血液損失を低減させることにより、これらの患者における輸血の必要性がなくなる（Ｆｒｉｅｄｅｒｉｃｈら（２００３）Ｌａｎｃｅｔ ３６１：２０１〜２０５）。ＦＶＩＩポリペプチドを、他のタイプの外科手術を受けている正常な凝固を示す患者に投与して、迅速な止血を得、血液損失を防ぐことができる。典型的には活性形態（即ちＦＶＩＩａ）で投与されるＦＶＩＩを、周術期の出血を低減させるための療法に用いることができる、外科的処置の非限定的な例には、それだけに限らないが、心臓弁手術（Ａｌ Ｄｏｕｒｉら（２０００）Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇ Ｆｉｂｒｉｎｏｌ １１：Ｓ１２１〜Ｓ１２７）、大動脈弁交換（Ｋａｓｔｒｕｐら（２００２）Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ ７４：９１０〜９１２）、再発性血管周囲細胞腫の切除（Ｇｅｒｌａｃｈら（２００２）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ９６：９４６〜９４８）、癌手術（Ｓａｊｄａｋら（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｇｙｎａｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２３：３２５〜３２６）、及び十二指腸潰瘍の手術（Ｖｌｏｔら（２０００）Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ １０８：４２１〜４２３）が含まれる。ＦＶＩＩを用いた治療は、外科手術の部位での止血を促進し、血液損失を低減又は予防し、それにより、輸血の必要性を低減させるか又はなくす。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して増強した凝固活性を示すように設計され、したがって、例えば低い用量、少ない頻度、及び少ない有害反応で投与することができる。通常、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。
第ＶＩＩ因子ポリペプチドはまた、外傷性の損傷を有する対象において凝固を促進し、血液損失を防ぐために用いることができる。外傷は、外因性の作用物質による生組織への損傷と定義され、アメリカ合衆国における４番目に多い死因である。外傷は、鈍的外傷（内部の圧迫、器官の損傷、及び内部の出血をもたらす）又は浸潤性外傷（身体を通過し、組織、血管、及び器官を破壊して、それにより外部の出血をもたらす作用物質の結果生じる）に分類される。外傷は、それだけに限らないが、車両事故（鈍的及び／又は浸潤性外傷をもたらす）、射撃による創傷（浸潤性外傷をもたらす）、刺し傷（浸潤性外傷をもたらす）、機械事故（浸潤性及び／又は鈍的外傷をもたらす）、並びに相当な高さからの落下（浸潤性及び／又は鈍的外傷をもたらす）を含む、いくつかの事象により生じ得る。外傷の結果生じる調節されていない出血は、ほとんどの関連する死亡の原因である。びまん性凝固障害は、外傷の患者に関連する比較的一般的な合併症であり、対象の２５〜３６％ほど多くで生じる。凝固障害は、損傷後の早期に発現し得、凝固因子及び血小板の希釈及び消費、線維素溶解、アシドーシス、並びに低体温などの様々なファクターから生じ得る。従来の管理は、新鮮な冷凍血漿（ＦＦＰ）、血小板、ＲＢＣ、及び／又は寒冷沈降物の輸血による補充療法、アシドーシスの修正、並びに低体温の治療を伴うものである。これらのステップは、出血の停止及び死亡の予防には不十分であることが多い。治療量のＦＶＩＩを投与することによる治療は、外傷患者における凝固を促進し、血液損失を低減させ得る。例えば、大量の出血を伴う、射撃による損傷を有する患者に、外科的介入に加え、凝固障害性の出血を調節するためにＦＶＩＩを投与する（Ｋｅｎｅｔら（１９９９）Ｌａｎｃｅｔ ３５４：１８７９）。ＦＶＩＩを用いた凝固療法は、鈍的及び浸潤性外傷を有する患者における血液損失及び出血を効果的に低減し得る（Ｒｉｚｏｌｉら（２００６）Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ １０：Ｒ１７８）。本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドは、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して増強した凝固活性を示すように設計され、したがって、例えば低い用量、少ない頻度、及び少ない有害反応で投与することができる。通常、改変ＦＶＩＩポリペプチドは、活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）ポリペプチドとして投与される。
Ｊ．組合せ療法
本明細書に記載される任意の改変ＦＶＩＩポリペプチドは、それだけに限らないが、他の生物学的製剤、小分子化合物、及び外科手術を含む他の治療物質又は治療処置と組み合わせて、その前に、その合間に、又はそれに続けて、投与することができる。ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ及びｒＦＶＩＩａを含む）が指定されるか又は用いられており、且つ他の作用物質及び治療が利用可能な、上記に例示したすべてのものを含む任意の疾患又は状態に対して、ＦＶＩＩをそれらと組み合わせて用いることができる。したがって、本明細書で提供される改変ＦＶＩＩポリペプチドも同様に用いることができる。治療しようとする疾患又は状態に応じて、例示的な組合せには、それだけに限らないが、他の血漿精製凝固因子又は組換え凝固因子、ビタミンＫ、ビタミンＫ誘導体、及びプロテインＣ阻害剤などの凝固促進剤、血漿、血小板、赤血球、並びにコルチコステロイドとの組合せが含まれる。
Ｋ．製品及びキット
改変ＦＶＩＩポリペプチド、若しくは改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードする核酸、又はその誘導体若しくは生物学的に活性な部分の医薬化合物を、包装材料、止血疾患又は止血障害の治療に有効な医薬組成物、及び改変ＦＶＩＩポリペプチド又は核酸分子が止血疾患又は止血障害の治療に用いられていることを示すラベルを含有する製品として包装することができる。
本明細書で提供される製品は、包装材料を含有する。医薬製品の包装に用いる包装材料は当業者に周知である。例えば、それぞれその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５３２３９０７号明細書、米国特許第５０５２５５８号明細書、及び米国特許第５０３３３５２号明細書を参照されたい。薬学的包装材料の例には、それだけに限らないが、ブリスター包装、ボトル、管、吸入器、ポンプ、袋、バイアル、容器、シリンジ、ボトル、並びに、選択された製剤と投与及び治療の意図された態様とに適したあらゆる包装材料が含まれる。本発明において提供される化合物及び組成物の広範な製剤が、あらゆる止血疾患又は止血障害の様々な治療として企図される。
改変ＦＶＩＩポリペプチド及び核酸分子はまた、キットとして提供され得る。キットは、本明細書に記載される医薬組成物及び投与のための品目を含み得る。例えば、改変ＦＶＩＩは、シリンジ、吸入器、計量カップ、点滴器、又は塗布器などの、投与のための装置を用いて供給し得る。キットは、任意選択で、用量、投与レジメン、及び投与態様の説明を含む、適用のための説明書を含み得る。キットはまた、本明細書に記載される医薬組成物及び診断のための品目も含み得る。例えば、そのようなキットは、対象のＦＶＩＩ又はＦＶＩＩ制御系の濃度、量、又は活性を測定するための品目を含み得る。
以下の実施例は、例示の目的のみのために含まれるものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
実施例１
ＴＦＰＩに対する増大した抵抗性を有する第ＶＩＩ因子変異体のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ生成
Ａ．第ＶＩＩ因子とＴＦＰＩの間の相互作用のモデリング
第ＶＩＩ因子とその天然阻害剤、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰ１）−１における第１のクニッツドメイン（Ｋ１）（ＴＦＰＩ−１のＫ１）の間の相互作用のコンピュータモデリングを実施して、相互作用部位の界面における接触アミノ酸残基を決定した。蛋白質構造データバンク（ｒｅｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）から公に入手可能な情報を使用して、相同性モデルを作製した。ＴＦＰＩ−１のＫ１単独、又はＴＦ／ＦＶＩＩａ／ＴＦＰＩ−１／ＦＸａ間の四量体複合体に関する結晶構造のいずれも解明されていない。代わりに、トリプシン／ＴＦＰＩ−２複合体の結晶構造に関する情報に従い（図６）、このプロセス用の出発モデルとしてＴＦ、ＦＶＩＩ及びウシ膵臓トリプシン阻害剤の５Ｌ１５変異体（ＢＰＴＩ５ＬＩ５；ＰＤＢコード１ＦＡＫ＿１）の間の三重複合体の２．１Å結晶構造を使用して、コンピュータモデリングを実施した。ＢＰＴＩ５ＬＩ５はクニッツドメイン型セリンプロテアーゼであり、且つＴＦＰＩ−１及びＴＦＰＩ−２に対して相同性を示す。ＢＰＴＩ５ＬＩ５（配列番号１０６）の第１のクニッツドメイン（Ｋ１）は、その第１のクニッツドメイン（Ｋ１）中で４５％の一次配列同一性を示す（図５）。ＴＦＰＩ−２のＫ１の結晶構造の座標は、トリプシン／ＴＦＰＩ−２複合体の結晶構造を示す、蛋白質構造データバンクのプログラムデータベース（ｐｄｂ）ファイル１ＴＦＸから抽出した。ＴＦＰＩ−２のＫ１の座標は、ＰｙＭｏｌソフトウェアスイート（ｐｙｍｏｌ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／）における剛体ｃ−α骨格のアラインメントプログラムを使用して、ＴＦ／ＦＶＩＩＡ／ＢＰＴＩ５ＬＩ５（ｐｄｂファイル１ＦＡＫ１）の結晶構造のＢＰＴＩ５ＬＩ５三次元座標に合わせた。重複の測定によるモデルへのＴＦＰＩ−２のＫ１の適合性の分析は、１Å未満の標準偏差（ＲＭＳＤ）をもたらした。これは２構造間の正確なアラインメント、及びＦＶＩＩとＴＦＰＩ−２のＫ１の複合体の信頼できるモデルの生成を示した。
このモデルによってＦＶＩＩの表面と非常に接していたことが示されたＴＦＰＩ−２のＫ１上の側鎖を同定し、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで突然変異誘発して、ＴＦＰＩ−１のＫ１中に存在する側鎖に対応させた。この分析の結果によって、活性部位に直接隣接した数個の残基（即ち、第２の球面残基）における第ＶＩＩ因子とＴＦＰＩ−１のＫ１の間の静電的相補性が明らかになった。前述の相同性分析に基づいてＴＦＰＩ−１のＫ１との相互作用と関係があるＦＶＩＩ中の残基は、キモトリプシン番号付けによってＤ６０、Ｋ６０ａ、Ｋ６０ｃ、Ｔ９９、Ｒ１４７及びＫ１９２であり、これらは成熟ＦＶＩＩ番号付けによってそれぞれＤ１９６、Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｔ２３９、Ｒ２９０及びＫ３４１に対応する（図７）。モデル化した相互作用の実験は、成熟ＦＶＩＩ番号付けによるＧ２３７に対応する、キモトリプシン番号付けによる位置９７におけるグリシン残基（Ｇ９７）は、接触残基と非常に接近していることを示した。この位置における修飾は、ＦＶＩＩとＴＦＰＩの相互作用を妨害し得る立体障害をもたらす可能性がある。
Ｂ．ＴＦＰＩ−１のＫ１に対する増大した抵抗性を与えるための第ＶＩＩ因子のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ突然変異
ＦＶＩＩ／ＴＦＰＩ−１のＫ１の相互作用の界面又はその近辺に位置するアミノ酸残基を、前に記載したのと同様に同定した。ａ）ＦＶＩＩとＴＦＰＩ−１の間の相補的静電性接触部位を反発電荷−電荷接触部位と交換した、及び／又はｂ）中性残基とＦＶＩＩ上の帯電残基を交換することによって正の静電性接触部位を無効にする、及び／又はｃ）大きな側鎖を含有する複数の残基と小さな側鎖を含む１残基の交換によって立体障害を引き起こすいずれかの、複数のアミノ酸の変化があるＦＶＩＩの変異体を設計した。例示的な変異体は表９中に列挙する。
Figure 2014042523
Figure 2014042523
実施例２
ＦＶＩＩのクローニング及び発現
Ａ．ＦＶＩＩのクローニング
４６６のアミノ酸ヒトＦＶＩＩアイソフォーム前駆体ポリペプチド（Ｐ０８７０９；配列番号１に示す）をコードするヌクレオチドを、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含有する、哺乳動物発現ベクター、ｐＣＭＶ Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；配列番号１５１）にクローニングした。簡単にいうと、ＣＢＯ−１２５（配列番号１５２）及びＣＢＯ−１２６（配列番号１５３）オリゴヌクレオチドを、それぞれ順方向プライマー及び逆方向プライマーとして使用して、鋳型としてヒトＦＶＩＩのｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するＰＣＲによりＦＶＩＩ配列を増幅した。ＣＢＯ−１２５プライマーは、ＢａｍＨＩ制限部位（太線）、Ｋｏｚａｋ配列（二本下線）、次にＡＴＧ開始コドンを含むＦＶＩＩのｃＤＮＡ配列の５’末端と相同性を有する１８ヌクレオチド（一本下線）を含有していた。ＣＢＯ−１２６プライマーは、ＥｃｏＲＩ制限部位（太線）、停止コドン（二本下線）、及びＦＶＩＩのｃＤＮＡ配列の３’末端と相同性を有する２１ヌクレオチド（一本下線）を含有していた。
ＣＢＯ−１２５順方向プライマー
５’ ｇｃａｔｃａｔｇａｃｇｔｇａｃｇｇａｔｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇｔｃｔｃｃｃａｇｇｃｃｃｔｃ ３’
ＣＢＯ−１２６逆方向プライマー
５’ ｇａｔｃｇｔａｃｇａｔａｃｇｔｇａａｔｔｃｃｔａｇｇｇａａａｔｇｇｇｇｃｔｃｇｃａｇｇａｇ ３’
標準的ＰＣＲ反応及び熱循環条件を、製造者によって推奨されたように、ＫｏＤ ＨｉＦｉ ＰＣＲキット（ＥＭＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と併せて使用した。ＰＣＲ産物はＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、標準的分子技法を使用してｐＣＭＶ ＳｃｒｉｐｔベクターのＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位に連結させた。次いでベクターを大腸菌に形質転換した。選択したコロニーを増殖させ、通常の分子生物学の技法を使用してプラスミドの精製用に細菌細胞を採取した。
Ｂ．ＦＶＩＩ変異体の生成
新たに合成されたＤＮＡに特定の突然変異を取り込むプライマーとして働く特異的に設計されたオリゴヌクレオチドを用いて、製造者の説明書に従いＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、ＦＶＩＩ変異体を生成した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅの方法は、ＰｆｕＵｌｔｒａ高忠実度ＤＮＡポリメラーゼによる鋳型ＤＮＡの直線的増幅を含む。望ましい突然変異を含む相補的プライマーは、鋳型としてクローニングＦＶＩＩｃＤＮＡ配列を含有する、精製した、二本鎖スーパーコイル状ｐＣＭＶ Ｓｃｒｉｐｔベクターを使用してサイクル中に伸長した。プライマーの伸長は新たに合成された鎖への対象の突然変異の取り込みをもたらし、互い違いのニックを有する突然変異プラスミドをもたらした。増幅後、大腸菌由来ｐＣＭＶ Ｓｃｒｉｐｔベクターのｄａｍメチル化親鎖を消化するＤｐｎＩで、核酸を処理した。これは、メチル化されなかった、新たに合成された突然変異プラスミドの「淘汰」をもたらした。（１つ又は複数の）望ましい突然変異を含有するベクターＤＮＡをＸＬ１０−Ｇｏｌｄウルトラコンピテント大腸菌細胞に形質転換し、この場合細菌リガーゼがニックを修復し、正常な複製が起こるのを可能にした。
単一アミノ酸置換を有するＦＶＩＩ変異体は、位置Ｄ１９６、Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｇ２３７、Ｔ２３９、Ｒ２９０及びＫ３４１の標的化、成熟ＦＶＩＩ番号付け（キモトリプシン番号付けによるＤ６０、Ｋ６０ａ、Ｋ６０ｃ、Ｇ９７、Ｔ９９、Ｒ１４７及びＫ１９２に対応する）によって作製した。位置Ｄ１９６、Ｋ１９７及びＫ１９９に多数の突然変異、又は位置Ｄ１９６及びＫ１９７に複数の突然変異を有するＦＶＩＩ変異体も生成した。ＦＶＩＩ変異体を生成するために使用したそれぞれの相補的プライマー対由来の、オリゴヌクレオチドの１つのヌクレオチド配列を表１０中に与える。対応する野生型配列も比較用に示す。置換アミノ酸をコードする３塩基対配列は太字で示す。例えば、置換Ｄ１９６Ｋ（キモトリプシン番号付けによりＤ６０Ｋ；ＣＢ５５４、配列番号１８）を含有するＦＶＩＩ変異体を生成するために、ＣＢＯ−１５７Ｄ６０Ｋオリゴヌクレオチド、及びＣＢＯ−１５７Ｄ６０Ｋと相補的であるオリゴヌクレオチドをＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ部位特異的突然変異誘発キットと共に使用して、３塩基対「ｇａｃ」野生型配列を３塩基対「ａａｇ」配列と交換した。Ｄ１９６Ｋ置換を含有するＦＶＩＩ変異体ポリペプチドをコードする突然変異ベクターを、次いでＸＬ１０−Ｇｏｌｄウルトラコンピテント大腸菌細胞に形質転換した。
Figure 2014042523
Figure 2014042523
Ｃ．ＦＶＩＩポリペプチドの発現
ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロットによる初期発現の分析用に、ＦＶＩＩポリペプチドをＢＨＫ−２１細胞中で発現させた。以下に記載したアッセイなどの生化学的アッセイ用に、ＦＶＩＩポリペプチドをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で発現させた。
野生型第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ＣＢ５５３−０２、配列番号３）及び変異体ＦＶＩＩポリペプチドを、仔ハムスター腎細胞株ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６３２）中で初期に発現させた。ＢＨＫ−２１細胞は、３７℃及び５％ＣＯ２で１００ｍｍ培養皿において、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。約９０％の集密状態まで増殖させた後、製造者によって指示されたようにリポフェクタミン２０００キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２４μｇのＦＶＩＩプラスミドＤＮＡで細胞をトランスフェクトした。１μｇ／ｍｌのビタミンＫ１（Ｓｉｇｍａ）を含有する血清を含まないＥＭＥＭを用いたトランスフェクション後６時間で培地を交換し、細胞をさらに７２時間インキュベートした。細胞培養培地中でのＦＶＩＩの発現は、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットによってアッセイした。
生化学的アッセイを使用する後の分析用に、野生型第ＶＩＩ因子ポリペプチド（ＣＢ５５３−０２、配列番号３）及び変異体ＦＶＩＩポリペプチドを、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で発現させた。３７℃及び８％ＣＯ２で通気口キャップを有する三角フラスコにおいて、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で細胞を培養した。細胞は製造者の提案するプロトコルを使用してトランスフェクトした。簡単にいうと、細胞１×１０６個／ｍｌに増殖した後、細胞を遠心分離にかけ、培地を交換した。次いで、細胞を、２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２４０ｍｌの細胞毎に２４０μｇのＦＶＩＩプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。さらに、エタノール中にビタミンＫ１（Ｓｉｇｍａ）を溶かした１ｍｇ／ｍｌストック５０μｌを、２４０ｍｌの細胞毎に加えた。細胞は５日間増殖させ、次いで培養上清を採取した。細胞培養培地中でのＦＶＩＩの発現は、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。
１．ＥＬＩＳＡ
イムノアッセイを使用して、試料中のヒトＦＶＩＩ及びＦＶＩＩａの量を定量化した。ヒトＦＶＩＩに対するポリクローナル抗体を使用して、溶液中のプロテアーゼを捕捉及び検出した。イムノアッセイを使用して、馴化培地又は精製ストックのタンパク質濃度を決定することができ、或いは他の試料、例えばヒト又はマウス血漿試料中のＦＶＩＩの濃度を決定することができる。ヒト血液中のＦＶＩＩのベースライン濃度は約５０ｎＭであり、且つ酵素活性型、ＦＶＩＩａは約１ｎＭである。
試料中のヒトＦＶＩＩ又はＦＶＩＩａタンパク質の量を決定するために、サンドウィッチＥＬＩＳＡを実施した。９６ウェルの平底Ｍａｘｉｓｏｒｐイムノプレート（Ｎｕｎｃ）を、１００μｌ／ウェルの５ｎｇ／μｌアビジン（ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）でコーティングした。プレートをカバーし、室温（ＲＴ）で１時間振とうしながらインキュベートし、次に０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０入りＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で４回洗浄した。２００μｌ／ウェルでそれぞれのウェルに加えたＰＢＳ中１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｗ／ｖ）とのインキュベーションによって、振とうしながら室温で少なくとも１時間、プレートをブロッキングした。ブロッキングしたプレートは、次いで使用するまで（最大２週間）４℃において保存した。
使用前に、プレートはＰＢＳＴ中で４回洗浄してＢＳＡを除去し、且つ１００μｌ／ウェルのビオチン化抗第ＶＩＩ因子抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の１ｎｇ／μｌ溶液をそれぞれのウェルに加え、振とうしながら４５分間室温でプレートをインキュベートし、コーティングアビジンとの複合体形成を可能にした。過剰な非結合抗体は、ＰＢＳＴでプレートを（４回）洗浄することによって除去した。
５０ｎｇ／μｌ〜０．８ｎｇ／μｌの範囲の、ＦＶＩＩ標準の連続２倍希釈液（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ；ＰＢＳＴに希釈）を、１００μｌ／ウェルでプレートに加えた。いかなるＦＶＩＩも含まないＰＢＳＴを含有するウェルも、バッファーのみの対照として含めた。ＦＶＩＩ又はＦＶＩＩａの精製試料をアッセイするために（活性化の前及び後、実施例３参照）、試料は最初にＰＢＳＴ中に１：２５に希釈し、次いで連続２倍希釈液を作製して、２５倍、５０倍、１００倍及び２００倍希釈液を試験した。希釈した試料は、１００μｌ／ウェルで二連でウェルに加えた。ＦＶＩＩ又はＦＶＩＩａを含有する血漿試料をアッセイするために、血漿試料はＰＢＳＴ中に１：１００及び１：４００に希釈し、１００μｌ／ウェルで二連でウェルに加えた。ＦＶＩＩ又はＦＶＩＩａを含まない血漿試料も含めて、バックグラウンドレベルを決定した。次いでプレートを、振とうしながら室温で３０分間インキュベートして、試料中の任意のＦＶＩＩ又はＦＶＩＩａが抗ＦＶＩＩ抗体と複合体形成するのを可能にした。
試料とのインキュベーション後、プレートはＰＢＳＴで４回洗浄した。二次抗体、ウマ抗ヒトＦＶＩＩ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）はＰＢＳＴ中に１：５０００に希釈し、１００μｌの体積でそれぞれのウェルに加えた。プレートを振とうしながら室温で３０分間インキュベートして、加えた抗体がプレート上でＦＶＩＩ又はＦＶＩＩ複合体と結合するのを可能にした。過剰な二次抗体を除去するために、プレートをＰＢＳＴで（４回）洗浄した。結合した二次抗体を検出するために、ＰＢＳＴ中に１：５０００希釈した１００μｌのヤギ抗ウマＨＲＰコンジュゲートを、それぞれのウェルに加えた。振とうしながら室温で３０分間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＴＭＢ基質と過酸化水素溶液（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）の１：１混合物を含有する１００μｌ／ウェルの溶液を加えた。プレートは、１００μｌ／ウェルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させる前に、室温で約１分間振とうした。４５０ｎｍでの光学濃度をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｍ５プレートリーダーを使用して測定し、（ＰＢＳＴのみで測定した）プレートに関するバックグラウンド値を、それぞれのウェルからの測定値から差し引いた。吸光度に対してＦＶＩＩ標準の濃度をプロットすることによって、標準曲線を作製した。約０．２〜５０ｎｇ／ｍｌの標準曲線範囲を、前述のＥＬＩＳＡ条件下で典型的に作製した。次いでそれぞれの試料の濃度を標準曲線を使用して決定し、希釈係数を掛けて、平均及び標準偏差を報告した。
２．ウェスタンブロット
細胞培養培地中でのＦＶＩＩの発現は、ウェスタンブロットによってもアッセイした。ＦＶＩＩトランスフェクトＢＨＫ−２１細胞由来の細胞培養培地の非希釈試料、又はＰＢＳに希釈した２つの連続２倍希釈液を含有する複数のアリコートを、濃度１（非希釈）、濃度２（２倍希釈）及び濃度３（４倍希釈）で標識した。試料はＳＤＳページゲル上で１０、２５、及び５０ナノグラムの対照血漿精製ｒＦＶＩＩ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、ＣＢ５５３−０１）の隣に添加した。ＢＨＫ−２１細胞によって生成されたＦＶＩＩタンパク質は、一次ポリクローナルウマ抗ＦＶＩＩ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ；製造者の提案する濃度で使用した）及びＨＲＰコンジュゲート抗ウマＩｇＧ二次抗体（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの１ｍｇ／ｍｌ溶液の１：２０００希釈液）を使用してウェスタンブロットによって検出した。発現レベルの比較は対照血漿精製ｒＦＶＩＩと行った。これらの結果は、約２０ｎｇ〜５０ｎｇを超える範囲の濃度のＦＶＩＩが、細胞培養物のアリコート中に存在したことを示す。
実施例３
ＦＶＩＩポリペプチドの精製及び活性化
ＦＶＩＩポリペプチドは、機能的Ｇｌａドメインを有するＦＶＩＩポリペプチドがそこに吸着するＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＸＫ１６）カラム、次にカルシウム溶出ステップを使用して精製した。トランスフェクトしたＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞由来の２４０ｍｌ体積の培養物上清を、２０ｍＭのトリスｐＨ８．０及び０．０１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する溶液で２倍希釈し、次いで１．５ｍｌの５００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０を希釈試料に加えた。試料を濾過した後、８ｍｌ／分で最初にバッファーＢ（２０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０）、次いでバッファーＡ（２０ｍＭのトリスｐＨ８．０、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０）で予め平衡状態にしたＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＸＫ１６）カラムに添加した。添加した後、２８０ｎｍでの流入液の吸光度がベースラインに達するまで、バッファーＡでカラムを洗浄した。バッファーＡをバッファーＣ（２０ｍＭのトリスｐＨ８．０、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０、５ｍＭのＣａＣｌ２）と交換し、ポンプによる洗浄を実施して系中のバッファーを完全に交換した。ポンプによる洗浄の終了時に、バッファーＣを８ｍｌ／分でカラムに施して、ＦＶＩＩポリペプチドを溶出させ、６０分間で５ｍｌの複数の分画に回収した。溶出後、（培養培地由来の）ピンク色の色素がカラムから洗浄除去されるまで、分画をさらに回収しながらカラムをバッファーＢで洗浄した。次いでカラムをバッファーＡで洗浄して、それを次の試料由来のＦＶＩＩの精製用に調製した。
溶出した分画は、２ｍｌ／分で最初にバッファーＢ、及び次いでバッファーＡを用いて予め平衡状態にした（１ｍｌの樹脂を含有する）ＭｏｎｏＱ５／５カラムを使用してさらに精製した。前述のバッファーＣを用いて回収した第５〜第８の５ｍｌ分画をプールし、１．６ｍｌの５００ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を加える前にバッファーＡで２倍希釈した。少量のアリコート（１００μｌ）を、ＥＬＩＳＡなどによる分析用に、この時点において任意選択で採取した。組合せた試料を２ｍｌ／分でＭｏｎｏ Ｑカラムに添加し、次いでバッファーＡで洗浄した。結合したＦＶＩＩポリペプチドを溶出するために、バッファーＢの０％〜３０％の勾配を、１ｍｌ／分で２０分の間カラムに施し、０．５ｍｌの分画を回収した。次いでカラムをバッファーＢ、次の試料由来のＦＶＩＩの精製用の調製において次いでバッファーＡで洗浄した。
精製したＦＶＩＩポリペプチドは、制限プロテアーゼ第Ｘａ因子切断及び除去キット（Ｒｏｃｈｅ）からビオチン化第Ｘａ因子を使用してＦＶＩＩａに活性化した。典型的には、Ｍｏｎｏ Ｑ精製からの７個の分画を１５ｍｌの円錐管中にプールし、３８８μｌの５００ｍＭのＣａＣｌ２、３８．９μｌの蒸留水に溶かした１０％ＢＳＡ、及び３．２μｇのビオチン化第Ｘａ因子を加えた。３７℃で１４〜１６時間のインキュベーション後、２５０μｌの固定化アビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、試料は３０分間４℃で混合した。生成した溶液は次いでＥｃｏｎｏ−ｐａｋカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を介して濾過し、濾液はさらに３０分間他の２５０μｌの固定化アビジンと混合した。溶液は再度濾過し、濾液はＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４ １０ｋＤａ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して約３００〜５００μｌに濃縮した。次いでＦＶＩＩａ濃度をＥＬＩＳＡによって分析し（実施例２．Ｃ．１中に記載したのと同様に）、第ＶＩＩ因子活性化のレベルをウェスタンブロットによってモニターした。ウェスタンブロッティングは実施例２．Ｃ．２中に記載したのと本質的に同様に実施したが、但し代わりに一次抗体として１時間１：２０００でウサギ抗ヒト第ＶＩＩａ因子抗体（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）、次に３０分間１：５０００でＨＲＰヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
実施例４
小分子基質におけるＦＶＩＩａのアミド分解活性のミカエリスメンテン反応速度定数の決定
ＦＶＩＩ変異体のアミド分解活性を、ペプチジル基質Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｂｕｔ−Ａｒｇ−ｐＮＡ．ＡｃＯＨ）に対するＦＶＩＩａポリペプチドのミカエリスメンテン反応速度定数を測定することによって評価した。脂質化ヒト精製組織因子（Ｉｎｎｏｖｉｎ、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ、ＶＷＲカタログ番号６８１００−３９０）をアッセイ中に含めて、ＦＶＩＩａの最適活性を与えた。ＴＦ−ＦＶＩＩａ複合体が非常に特異的な発色性基質であるＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａを切断すると、パラニトロアニリン−発色団（ｐＮＡ）が放出し、これは４０５ｎｍでの吸収を測定することによってモニターすることができる。酵素活性は、時間の関数として生成した遊離ｐＮＡの４０５ｎｍでの吸光度をモニターすることによって決定する。
これらの反応は３つの異なる酵素濃度で実施した。反応用に、ＦＶＩＩａ変異体は最初に、１．７ｍＬチューブ（ＩＳＣ Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓからの低粘着性マイクロヒュージチューブ）において、１×直接的アッセイ用バッファー（１００ｍＭのトリスｐＨ８．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％のＢＳＡ）中に４０ｎＭに希釈した。以下のように：７２０μｌ５×直接的バッファー（５００ｍＭのトリスｐＨ８．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％のＢＳＡ）、１８０μｌの４０ｎＭのＦＶＩＩａ、及び２７００μｌ２×ＴＦ（１０ｍＬの水で再構成した６ｎＭストック溶液）で１２ウェルのポリプロピレン製容器（Ａｘｙｇｅｎ）中において２ｎＭに希釈することによって、ＴＦ（Ｉｎｎｏｖｉｎ、Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）の存在下でＦＶＩＩａをさらに希釈した。希釈したプロテアーゼは室温で５分間インキュベートした。ＦＶＩＩａの２ｎＭストックはさらに複数の２倍連続希釈液に希釈して、これもＴＦの存在下で、それぞれ１ｎＭ及び０．５ｎＭのプロテアーゼのストックを与えた。連続希釈反応は以下の通りであった：最初に、１８００μｌの上記のＦＶＩＩａ／ＴＦの２ｎＭストックを、３６０μｌ５×直接的バッファー、９００μｌ２×ＴＦ、及び５４０μｌの水に希釈した。この希釈ストックは再度、直接的バッファー中の１８００μｌ１×ＴＦに１：１に希釈した。
基質Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）の希釈プレートを作製した。Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａのストック溶液は蒸留水中の５０μモルバイアルを１０ｍＭに再構成することによって作製し、４℃で保存した。８０μｌ（１０ｍＭのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａ）及び１０ｍＭのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａの６０μｌ＋２０μｌの水（７．５ｍＭのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａ）を、９６ウェルのポリプロピレン製アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ）の２つの隣接列中のウェルに加えた。それぞれの列の８ウェルのそれぞれまで２つのウェルを２倍に連続希釈して、第１列のウェルは１０ｍＭ〜７８μＭ基質まで、第２列のウェルは７．５ｍＭ〜５８．６μＭ基質までの範囲の一連の１０×基質濃度を作製した。
５μｌのそれぞれのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａ基質希釈液を、９６ウェルのクリアな半領域アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に加えた。３つのＦＶＩＩａ／ＴＦ希釈液のそれぞれの４５μｌを、基質系希釈液の列の３群に加えた。このステップ中、アッセイのウェルへの気泡の導入を避けるように注意を払った。気泡が導入した場合、それらはそれぞれのアッセイの開始前に清潔な針で刺すことによって除去した。プレートは振とうによって混合した。アッセイの開始前に、アッセイウェルの経路長を、終点読み取り値を得ることによりＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｍ５プレートリーダー分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、及びＳｏｆｔＭａｘ ＰｒｏソフトウェアのＰａｔｈｃｈｅｃｋフィーチャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して測定した。４０５ｎｍでの吸光度の増大は、３７℃において１時間の間３０秒毎に測定した。
ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用して、経路長及び４０５ｎｍでのｐＮＡ離脱基の吸光係数、９６００Ｍ−１ｃｍ−１を使用することによって、吸光率（ミリ単位／秒）を放出されたｐＮＡ濃度（μＭ／秒）に変換した。変換式は以下の通りである：率×（１／６０×１０００）×（１／９６００×経路長）×１０００００。プロテアーゼのそれぞれの濃度に関する結果は、Ｘ軸に基質濃度及びＹ軸に決定したμＭ／秒率を用いて、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してグラフ化した。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ４ソフトウェアを使用して、Ｋｍ及びＹｍａｘを、以下のようにミカエリスメンテンの等式にデータを適合させることによって決定した：
Ｙ＝（（ｋｃａｔＫｍ／１００００００）×Ｘ×［Ｅ］）／（１＋（Ｘ＋Ｋｍ）
上式で；Ｘは基質濃度であり（μＭ）
Ｙは酵素活性であり（μＭ／秒）
ｋｃａｔＫｍは特異性定数であり（Ｍ−１秒−１）
Ｋｍはミカエリスの定数であり（μＭ）
Ｅは酵素濃度であり（μＭ）
Ｅ＝１、Ｋｍ＝０．５×ＹｍａｘでのＸ及びｋｃａｔＫｍ＝１０００の初期値を設定した。
ＦＶＩＩａ変異体、野生型ＦＶＩＩａ（ＣＢ５５３−０２）のそれぞれの比活性度（ｍ単位／分／ｎＭ）を、４２０μＭのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａを使用して前に記載したアッセイを用いて決定した（表１１）。ＦＶＩＩａ変異体の活性は、典型的には野生型ＦＶＩＩａの活性より大きかった（２．７ｍ単位／分／ｎＭで測定）。ＦＶＩＩ変異体の活性は文献中に記載された変異体（ＣＢ５９１〜ＣＢ５９４）と比較し、且つ大部分のＦＶＩＩ変異体は、文献中に以前に記載された変異体の活性に匹敵する活性又はそれを超える活性を有することが分かった。
Figure 2014042523
実施例５
基質第Ｘ因子に対するＦＶＩＩａの触媒活性の決定
基質第Ｘ因子（ＦＸ）に対するＦＶＩＩａ変異体の触媒活性を、合成基質Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ ＦＸａにおいてＦＶＩＩａによる活性化によって生成したＦＸａの活性をアッセイすることによって、蛍光アッセイ中で間接的に評価した。脂質化型の精製組織因子（ＴＦ）をアッセイ中に含めて、ＦＶＩＩａの最適活性を与えた。Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ ＦＸａ（ＣＨ３ＳＯ２−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ．ＡｃＯＨ）に対するＦＸａの酵素活性は、時間の関数として、生成した遊離フルオロフォア、ＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）の吸光度の増大を測定することによって決定した。
簡単にいうと、ＦＶＩＩａ変異体は、最初に１×直接的アッセイ用バッファー（１００ｍＭのトリスｐＨ８．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、及び０．０１％のＢＳＡ）中に０．５μＭに希釈し、次いで直接的アッセイ用バッファー中に０．１ｎＭにさらに希釈した。脂質化完全長ＴＦ（Ｉｎｎｏｖｉｎ；Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）は２０ｍＬ水で再構成して３ｎＭ溶液を作製し、１×直接的アッセイ用バッファー中に０．２ｎＭに希釈した。４００μｌの０．１ｎＭのＦＶＩＩａを４００μｌの０．２ｎＭのＴＦと混合し、室温で５分間インキュベートした。溶液は２回の２倍希釈によって０．２ｎＭのＴＦを含有する１×直接的アッセイ用バッファー中にさらに希釈して、それぞれ０．２ｎＭのＴＦを含有する０．０５ｎＭ、０．０２５ｎＭ、又は０．０１２５ｎＭのＦＶＩＩａの合計３個のＦＶＩＩａ希釈液（ＦＶＩＩａ／ＴＦ溶液）を得た。
基質第Ｘ因子（ＦＸ；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ；８０μｇ）を１３５．６μｌの蒸留水で再構成し１０μＭのストックを得て、−８０℃においてアリコートで保存した。それらのアリコートは２回以上凍結解凍しなかった。ＦＸストックは直接的アッセイ用バッファー中に８００ｎＭに希釈し、次いで２倍に連続希釈して８００ｎＭ〜５０ｎＭの範囲のＦＸ溶液を得た。
Ｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ Ｘａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ；１０μモル）は蒸留水で５ｍＭに再構成し、４℃において保存した。９６ウェルの黒色半領域アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に、５μｌのＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ Ｘａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）をそれぞれのウェルに加えた。次いで、２５μｌのＦＸ溶液をそれぞれのウェルに加えた。プレートのウェルの最終行に、ＦＸを加えなかった陰性対照もアッセイ中に含めた。２連で、３個の濃度のＴＦ／ＦＶＩＩａ溶液を、２０μｌでプレートのそれぞれの列のウェルに加えて、それぞれのＴＦ／ＦＶＩＩａ希釈液を、一組の列が加えたＴＦ／ＦＶＩＩａを含有しない（即ち、ＦＸのみの）それぞれのＦＸ希釈液に対してアッセイした。振とうによってプレートを混合した。蛍光は３７℃で１時間の間３０秒毎に読み取るように設定した蛍光光度計を用いて経時的に測定し（Ｅｘ：３８０ｎｍ、ＥＭ：４５０ｎｍ、カットオフ：４３５ｎｍ）、その時間は時間二乗単位で報告した。アッセイ後、同じプレートリーダー中のＡＭＣ蛍光の標準曲線を作製して、蛍光単位をアッセイ中に放出された基質ｕＭに変換した。１ｍＭのＡＭＣ、ＤＭＳＯ中（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は１×直接的アッセイ用バッファー中に０．０２ｍＭに希釈した。６個の、ＡＭＣの２倍連続希釈液を、１×直接的アッセイ用バッファー中に２０ｎＭ〜０．６２５ｎＭの範囲で作製した。ＡＭＣの蛍光は前に記載したのと同じアッセイ条件を使用して測定し、ＡＭＣの蛍光対濃度のグラフをプロットした。直線の傾きを計算し、それは後の計算中でμＭへのＲＦＵの変換係数として役立てた。
ＦＸのＦＶＩＩａ活性化に関する反応速度定数は、基質濃度の逆数対基質切断速度の逆数（秒２の単位）に対して線形回帰分析を実施することによって計算し、Ｖｍａｘ，ＦＶＩＩａはｙ切片の逆数として計算し、Ｋｍ，ＦＶＩＩａはｙ切片における勾配として計算し、且つＶｍａｘ／Ｋｍ，ＦＶＩＩａは勾配の逆数として計算した。次いでｋｃａｔ値を以下の等式を使用して算出した；
ｋｃａｔ／Ｋｍ，ＦＶＩＩａ＝Ｖｍａｘ／Ｋｍ，ＦＶＩＩａ×１／（０．５×ｋ２×［ＦＶＩＩａ、μＭ単位］×（ＲＦＵ／μＭ変換係数））
上式で；ｋ２＝（［Ｓ］×ｋｃａｔ，ＦＸａ）／（Ｋｍ，ＦＸａ＋［Ｓ］）、前式でｋｃａｔ，ＦＸａ及びＫｍ，ＦＸａは、ｋｃａｔ，ＦＸａ＝１１７秒−１、及びＫｍ，ＦＸａ＝１６４μＭとして、ＦＸａ標準を使用して実験により決定した、ＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒＸａのＦＸａ切断に関する定数である。
前述のアッセイ条件を使用して、反応速度定数ｋ２は８８．１秒−１であったと決定した。
ＦＶＩＩａ変異体のそれぞれに関するＫｍ及びｋｃａｔを決定して、その基質、ＦＸに対するそれぞれの触媒活性、ｋｃａｔ／Ｋｍ（Ｍ−１秒−１）を評価した（表１２）。野生型ＦＶＩＩａプロテアーゼ（ＣＢ５５３−０２）も評価し、１．８×１０７Ｍ−１秒−１の活性を示すことが分かった。Ｋｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙら、（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３：８ ４３７８〜８６ページ）によって測定された第Ｘ因子の第ＶＩＩａ因子活性化は、２．９×１０７Ｍ−１秒−１である。変異体の多くは、非改変プロテアーゼの活性に匹敵する活性を示した。いくつかの場合、ＦＶＩＩａ変異体は、非改変プロテアーゼと比較して高い触媒活性を示した。例えば、ＣＢ５５８、ＣＢ５６１及びＣＢ５６３は、５．２×１０７、４．３×１０７及び５．９×１０７Ｍ−１秒−１の触媒活性を示した。
Figure 2014042523
実施例６
溶液中の触媒として存続可能なプロテアーゼの濃度の決定
ストック溶液中の触媒として存続可能なＦＶＩＩａの濃度を、ＦＶＩＩａの不可逆性ペプチド阻害剤、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−クロロメチルケトン（ＦＦＲ−ＣＭＫ）で因子ＦＶＩＩａと可溶性組織因子（ｓＴＦ）の複合体を滴定することによって決定した。この阻害剤はＦＶＩＩａとは結合するが、ＦＶＩＩとは結合しない。高濃度のＦＶＩＩａ（５０ｎＭ）での長時間のインキュベーションは、プロテアーゼの完全な滴定を確実にする。ＦＦＲ−ＣＭＫとのインキュベーション後のＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体の残留活性を測定して、元のストック溶液中の触媒として存続可能なＦＶＩＩａの濃度を決定した。
Ａ．９６ウェルのアッセイプレート形式
９６ウェルのクリアな半領域アッセイプレート（Ｎｕｎｃ）を、１５０μｌ／ウェルの１×プレートバッファー（１００ｍＭのトリスｐＨ８．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＢＳＡ、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）をそれぞれのウェルに加えること、及び少なくとも１時間３７℃でプレートをインキュベートすることによって前処理した。ペーパータオルで吸い取ること、及びプレートを逆さまの状態で遠心分離にかけて残留バッファーを除去することによって、バッファーを完全に除去し、プレートは１時間空気乾燥させ、室温（ＲＴ）においてカバーした状態で保存した。
ＦＶＩＩａ／ｓＴＦ／ＦＦＲ−ＣＭＫ反応混合物を調製するために、ＦＶＩＩａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ；５０％グリセロールに５μＭに希釈し（ｖ／ｖ）−２０℃においてアリコートで低温保存）又はＦＶＩＩａ変異体のストックを、１×直接的アッセイ用バッファー（１００ｍＭのトリスｐＨ８．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％のＢＳＡ）中に、５００ｎＭに最初に希釈した。次いでＦＶＩＩａ／ｓＴＦ混合物を、９０μｌの蒸留水と３６μｌの５×直接的アッセイ用バッファー、１８μｌの５００ｎＭのＦＶＩＩａ、及び１８μｌの５μＭのｓＴＦ（組換え型ヒト凝固第ＩＩＩ因子／可溶性組織因子；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；使用したストック溶液は１９．６μＭ、５０％グリセロール中であり、１×直接的アッセイ用バッファーに５μＭに希釈し、４℃で２週間まで保存した）を混合することによって作製した。次いでこれらの要素を室温で５分間複合体形成させた。
（−２０℃において保存した）ＤＭＳＯに溶かした１０ｍＭのＦＦＲ−ＣＭＫ（Ｂａｃｈｅｍ）のストック溶液を、水に３．５μＭに希釈した。ポリプロピレン製の不透明保存用プレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３３６３）の一行を使用して、水に希釈したＦＦＲ−ＣＭＫの連続２倍希釈液を、その行の最後のウェルが対照として水のみを含有する９６ウェルの不透明プレートの１１ウェル中に作製した。これが１０×ＦＦＲ−ＣＭＫ阻害剤系溶液である。前処理した９６ウェルのクリアな半領域アッセイプレートの行のそれぞれのウェルに、１０．８μｌのＦＶＩＩａ／ｓＴＦ混合物、次に１．２μｌの１０×ＦＦＲ−ＣＭＫ阻害剤系を加えた。溶液は十分に混合し、プレートを５分間＜３０００ｒｐｍで遠心分離にかけて、ウェル中の滴を除去した。プレートをカバーし、３７℃で８時間インキュベートした。
ＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体の残留活性をアッセイするために、基質Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、＃２１７Ｌ；５ｍＬ蒸留水で１０ｍＭに再構成した５０μモルバイアルのストック、４℃で保存）と、５×直接的バッファー（５００ｍＭのトリスｐＨ８．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、及び０．０５％のＢＳＡ）の混合物を、３６０μｌの５×直接的アッセイ用バッファーと、１８０μｌのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ ＦＶＩＩａの１０ｍＭ溶液及び１０８０μｌの水を混合することによって最初に調製した。アッセイプレートのそれぞれのウェルに、１０８μｌの調製した基質溶液を加えた。ウェルは混合し、プレートは３７℃でインキュベートした。４０５ｎｍでの吸光度の増大は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓからのＳｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｍ５プレートリーダーで、３７℃において１時間の間３０秒毎に測定した。
ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、吸光率を測定し、阻害剤とインキュベートしたプロテアーゼの分画活性は、測定した率を非阻害プロテアーゼの率で割ることによって決定した。分画活性はＦＦＲ−ＣＭＫの濃度に対してグラフ化し、＞９０％又は＜１０％の非阻害活性であった地点は廃棄した。次いで残りの地点に線を引いて、溶液中の活性プロテアーゼの濃度を表すｘ切片を決定した。多数のアッセイから値を測定し平均し、且つ標準偏差を決定した。
Ｂ．３８４ウェルのアッセイ形式
滴定の精度及びスループットを高めるために、以前のアッセイを３８４ウェルプレートベースの形式に改変した。高いプロテアーゼ濃度（２５０ｎＭ）及び４００ｎＭ〜５３ｎＭの範囲に及ぶ一連のＦＦＲ−ＣＭＫ濃度で、インキュベーションを７時間実施した。ＦＶＩＩａ基質（Ｍｅｓｙｌ−ｄＦＰＲ−ＡＣＣ）を加えること、及び経時的に蛍光シグナルの変化を測定することによって、残留活性を測定した。
簡単にいうと、３８４ウェルの黒色アッセイプレート（Ｎｕｎｃ）を実施例６中と同様に前処理した。次いで、ＦＶＩＩａ／ｓＴＦ溶液を、３２．５μｌの１μＭのＦＶＩＩａ＋１９．５μｌの５μＭのｓＴＦ＋６．５μｌの５×ＡＳＴバッファー（１００ｍＭのＮａ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、７５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、０．５％のＢＳＡ、０．５％のＰＥＧ８０００）と６．５μｌのｄＨ２Ｏを混合することによって調製した。この反応混合物は５分間室温でインキュベートした。３８４ウェルプレートの半分が、３連で測定した５プロテアーゼ、及び１つのアッセイ対照試料を含む。ＦＶＩＩａ／ｓＴＦのインキュベーション中に、２０ｍＭのＦＦＲ−ＣＭＫを、９６ウェルプレート中の１ｍＭのＨＣｌ、次に９連続の１．２５倍希釈液に８μＭに希釈した。その行の残りの２つのウェルは１ｍＭのＨＣｌのみで放置した。次いでこの行を１×ＡＳＴバッファーに１０倍希釈し、混合して８００ｎＭ〜１０７ｎＭの一連のＦＦＲ−ＣＭＫ濃度を生成した。３８４ウェルプレートのそれぞれの行に、４μｌのＦＦＲ−ＣＭＫ希釈系をピペッティングした。次いで、４μｌのＦＶＩＩａ／ｓＴＦ溶液をプレートの１１列中の阻害剤系と混合した。最終列に４μｌの１×ＡＳＴバッファーを添加してプレートブランクとして作用させた。プレートは遠心分離にかけ、密封し、振とうしながら７時間室温でインキュベートした。アッセイは１×ＡＳＴバッファーに希釈した７２μｌの１１０μＭのＭｅｓｙｌ−ｄＦＰＲ−ＡＣＣで開始した。蛍光の増大は２０分間Ｅｘ：３８０ｎｍ及びＥｍ：４６０ｎｍでモニターし、３７℃において４５秒毎に読み取った。データは、以下の改良で、実施例６と同じ方法で分析した。第１に、残留活性をプロテアーゼ単独活性の２０％と８０％の間の活性に限定した。第２に、直線適合値のｙ切片を０．９と１．１の間の範囲に制約した。第３に、ｘ切片を１２５ｎＭと３７５ｎＭの間の切片に制約した。それぞれのプロテアーゼの３連のｘ切片を平均し、その値及び標準偏差を報告した。
実施例７
ＦＶＩＩａ／ＴＦのＴＦＰＩ阻害に関するＩＣ５０の決定
ＴＦＰＩとＦＶＩＩａ／ＴＦ複合体の間の相互作用の有効性を、基質、Ｓｐｅｃｔｒａｚｙｍｅ ＶＩＩａに対するＦＶＩＩａ／ＴＦの触媒活性における様々な濃度のＴＦＰＩの阻害のレベルを測定することによって評価した。５０％の阻害に必要とされたＴＦＰＩの濃度（ＩＣ５０）は、それぞれのＦＶＩＩ変異体、及びＦＶＩＩａ標準に関して計算した。
９６ウェルのクリアな半領域アッセイプレート（Ｎｕｎｃ）を、１５０μｌ／ウェルの１×プレートバッファー（１００ｍＭのトリスｐＨ８．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＢＳＡ、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）をそれぞれのウェルに加えること、及び少なくとも１時間３７℃でプレートをインキュベートすることによって前処理した。プレートを振とう及びブロッティングすること、及びプレートを逆さまの状態で遠心分離にかけて残留バッファーを除去することによって、バッファーを完全に除去した。プレートは１時間空気乾燥させ、室温（ＲＴ）において保存した。
１．７ｍＬのマイクロヒュージチューブ（ＩＳＣ Ｂｉｏｅｘｐｒｅｓｓからの低粘着性マイクロヒュージチューブ）中で、ＦＶＩＩａ／ＴＦの混合物を、９μｌの２５０ｎＭのＦＶＩＩａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、ＣＢ５５３−０２又は試験したそれぞれの変異体）と、３３７．５μｌの２×ＴＦ（Ｉｎｎｏｖｉｎ；Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ；凍結乾燥品を１０ｍＬの蒸留水に再懸濁して２×ＴＦを生成し、これは７ｎＭの脂質化ＴＦにほぼ等しい）、９０μｌの５×アッセイ用バッファー（５００ｍＭのトリスｐＨ８．４、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％のＢＳＡ）、及び１３．５μｌの水を混合することによって、４５０μｌの合計体積に調製し、５ｎＭのＦＶＩＩａ及び５．２ｎＭのＴＦを含有する溶液を生成した。混合物は室温で５分間インキュベートし、これらの要素を複合体形成させた。前処理した９６ウェルのクリアな半領域アッセイプレート中の２列のそれぞれのウェルに、２５μｌのそれぞれのＦＶＩｌａ／ｓＴＦ混合物を加え、プレートはカバーして蒸発を防いだ。
ヒト組換え型ＴＦＰＩ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、３３μｌの５０％グリセロール（ｖ／ｖ）に最初に溶かして、−２０℃での保存用に１０μＭストックを作製した。このＴＦＰＩストックを、以下のようにポリプロピレン製の保存用プレートにおいて、最終１×直接的バッファー（１００ｍＭのトリスｐＨ８．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％のＢＳＡ）中に、１．５μＭにさらに希釈した：試験したそれぞれのプロテアーゼ用に、８７．５μｌの１．５μＭのＴＦＰＩ溶液を、１３．１μｌの１０μＭのＴＦＰＩと１７．５μｌの５×アッセイ用バッファー及び５６．９μｌの蒸留水を混合することによって作製した。ＴＦＰＩ溶液の連続３倍希釈液を、７５０ｎＭ、２５０ｎＭ、８３．３ｎＭ、２７．８ｎＭ、９．２６ｎＭ、３．１ｎＭ、及び１．０３ｎＭのＴＦＰＩを含有する複数の溶液が得られるように、２７．５μｌのＴＦＰＩを５５μｌの１×アッセイ用バッファーに混合することによって、１×アッセイ用バッファー中に作製した。系の最終ウェルは対照として１×直接的バッファーのみを含有した。
プロテアーゼ混合物をそれぞれのＴＦＰＩ希釈液を用いて２連でアッセイするように、２５μｌのＴＦＰＩのそれぞれの希釈液を、ＦＶＩＩａ／ＴＦ混合物を含有する９６ウェルのクリアな半領域アッセイプレートの２列の２ウェルに（即ち、２連で）加えた。ＴＦＰＩを含まない１×アッセイ用バッファーの溶液も、陰性対照としてＦＶＩＩａ／ＴＦ混合物を含有する２ウェルに加えた。プレートは軽く攪拌し、次いで３７℃で１．５時間のインキュベーション前に５分間３０００ｒｐｍで遠心分離にかけた。
Ｓｐｅｃｔｒａｚｙｍｅ ＶＩＩａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）のストック溶液を、５ｍｌの蒸留水中の５０μモルを１０ｍＭに再構成することによって調製し、使用するまで４℃で保存した。使用する直前に、この溶液を蒸留水中に６００μＭに希釈した。上記のアッセイプレートのインキュベーション後、１０μｌの希釈したＳｐｅｃｔｒａｚｙｍｅ ＶＩＩａを、アッセイプレートのそれぞれのウェルに加えた。反応混合物を混合し、プレートは３７℃でインキュベートした。４０５ｎｍでの吸光度の増大は、３７℃において１時間の間３０秒毎に測定し、吸光率はＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して計算した。
ＴＦＰＩによる阻害の程度を決定するために、ＴＦＰＩを含有するプロテアーゼ反応混合物の吸光率を、ＴＦＰＩを含有しない反応混合物（対照試料）の吸光率で最初に割り分画活性を得て、それぞれのＴＦＰＩ濃度のｌｏｇ１０を決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、ｌｏｇ１０［ＴＦＰＩ］をそれぞれのプロテアーゼに関する分画活性に対してプロットし、活性データの最大値及び最小値がそれぞれ１及び０に固定されると仮定して、曲線適合値を有する用量応答曲線を作製した。このソフトウェアを使用して、それぞれのプロテアーゼに関するｌｏｇＩＣ５０（ｐＩＣ５０）値、及び絶対的ＩＣ５０（ＴＦＰＩ阻害、ｎＭ単位）の両方としてＴＦＰＩ阻害を決定し、その平均及び標準偏差を決定した。
ｓＴＦと複合体形成したＦＶＩＩａ変異体のそれぞれのＴＦＰＩ阻害のレベルを決定し、ＩＣ５０又はｐＩＣ５０として表した（表１３）。ｓＴＦと複合体形成した非修飾ＦＶＩＩａ（ＣＢ５５３−０２）の活性をＴＦＰＩが阻害した程度も決定し、ＩＣ５０が８８ｎＭであったことが分かった。生成したＦＶＩＩａ変異体の９個が、増大したＩＣ５０値を表す、ＴＦＰＩとのそれらの相互作用の低下した有効性を示した。
Figure 2014042523
実施例８
ｉｎ ｖｉｖｏでの野生型ＦＶＩＩａの凝固促進活性の評価
血友病Ａのマウスモデルを確立して、ＦＶＩＩａポリペプチドの凝固促進活性を評価した。抗ＦＶＩＩＩ抗体の投与、次に尾の先端を外科手術により除去して出血を開始させることによって、ＣＤ−１マウスにおいて血友病Ａを誘導した。次いでマウスをＦＶＩＩａポリペプチドで治療して、出血を止めるのに要した時間、及びこの時間中に失われた血液の量を測定して、ＦＶＩＩａポリペプチドの凝固促進活性を決定した。
雄ＣＤ−１マウスに、１００ｍｇ／ｋｇでチオバルビタールナトリウムと、１００ｍｇ／ｋｇでケタミンの両方の腹腔内投与によって麻酔をかけた。リドカインは頚部腹側への皮下注射により投与して感度を低減させた。頚部のわずかな皮膚切開によって気管及び頚動脈にカニューレを挿入して、無制限の呼吸及び抗第ＶＩＩＩ因子抗体、組換え型ヒト第ＶＩＩａ因子（ｒｈＦＶＩＩａ）及び／又は改変ＦＶＩＩポリペプチドの投与を容易にした。
カニューレを挿入したマウスに、３．７６ｍｇのヒツジ抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ロットＩＧ１２９Ｒ４、６１２マウスＢＵ／ｍｌ）を４０μＬで投与した。この用量は、抗体を用いた、０．３７６、０．９４、１．８８及び３．７６ｍｇの抗ヒトＦＶＩＩＩを使用した初期用量応答実験を実施すること、及び血液消失及び出血時間を評価することによって決定した。２０分後、１０分の間３９℃のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含有する１５ｍＬチューブ中に、マウスの尾を置いた。３０分で、尾をＰＢＳ溶液から一時的に除去し、尾の最後の５ｍｍを切断して出血を開始させた。出血が始まった時間を記した。次いで尾を３９℃のＰＢＳを含有するチューブに戻し、５分間出血させて（事前出血）、マウスが抗ＦＶＩＩＩ抗体に応答することを確実にした。事前出血の後、マウスにＦＶＩＩａポリペプチド又は媒体を投与し、その中でＦＶＩＩａタンパク質を調製し送達した。ＦＶＩＩａポリペプチドは、ＰＢＳ又は５２ｍＭの塩化ナトリウム、１０．２ｍＭの無水塩化カルシウム、９．８４ｍＭのグリシルグリシン、０．０１％のポリソルベート８０及び１６５ｍＭのマンニトールから構成されるバッファーのいずれかに希釈した。ＦＶＩＩａ調製物は頚動脈カニューレを介して１、３又は１０ｍｇ／ｋｇのいずれか、３ｍＬ／ｋｇに等しい体積で投与し、尾は３９℃のＰＢＳを含有する新たなチューブ中に置いた。出血は２０分の間モニターし、出血が止まった時間を記した。合計出血時間は、事前出血中の出血期間、及びＦＶＩＩａポリペプチド、又はＰＢＳ若しくはバッファーの投与後の出血期間の合計として計算した。
出血症状中に消失した血液の量を決定するために、１５ｍＬチューブの中身をヘモグロビン含量に関してアッセイした。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は滅菌水中に１対４に希釈し、１００μＬを１ｍＬの試料に加えて溶血を引き起こした。次いで試料の吸光度を５４６ｎｍの波長で測定した。消失した血液の量を計算するために、ＰＢＳに希釈しＴｒｉｔｏｎＸ１００で前と同様に溶血した既知の体積のネズミ血液の、５４６ｎｍでの吸光度を測定することによって作製した標準曲線に対して吸光度を読み取った。
前に記載したように生成したｒｈＦＶＩＩａ（ＣＢ５３３）と市販の組換え型ヒトＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）を比較することによって実験を実施し、血液の消失は３ｍｇ／ｋｇ用量のそれぞれのタンパク質の投与後に評価した。媒体群（バッファー、ｎ＝１５）中の血液の消失は２０分の間中６７１．９±５７．８９μｌであった。これはＣａｔａｌｙｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓにより生成されたｒｈＦＶＩＩａによって２６４．１±５６．５９μｌに、及びＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）によって２７３．７±５３．９３μｌに低減した（ｎ＝１４）。この実験は、この２つのタンパク質間の同等性を実証した。
実施例９
ＦＶＩＩａポリペプチドの薬物動態分析
ＦＶＩＩａポリペプチドの薬物動態性を、マウス血漿中のヒト第ＶＩＩａ因子の量を測定することによって評価した。２つのアッセイを使用して血漿中のＦＶＩＩａを定量化した。ＥＬＩＳＡを使用してマウス血漿中の全ＦＶＩＩａタンパク質を定量化し、ＦＶＩＩａ依存性凝血アッセイ（ＦＶＩＩ：Ｃ）を使用して血漿中のＦＶＩＩａポリペプチドの凝固活性を定量化した。
Ａ．マウスへのＦＶＩＩａポリペプチドの投与
改変ＦＶＩＩａポリペプチド及び非改変組換え型ヒトＦＶＩＩａ（ｒｈＦＶＩＩａ）タンパク質（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）を、薬物動態試験において評価した。それぞれの試験用に、１８匹の雄ＣＤ−１マウスにｒＦＶＩＩａを静脈内ボーラス投与で注射した（試験に応じて０．１〜３．０ｍｇ／ｋｇ）。注射後５、１５、３０、６０、１２０、及び２４０分で、それぞれの注射プロトコルからの３匹のマウスをＣＯ２窒息を使用して安楽死させ、経皮的心穿刺によって約１．０ｍＬの血液を１．０ｍＬのシリンジに取り出した。それぞれのシリンジに十分なクエン酸ナトリウムを予め充填して、１ｍＬの血液中に３．２％の最終濃度を得た。次いでこれらの血液試料を、４℃において８分間９０００ｒｐｍで遠心分離にかけた。血漿を標識した個々の１．５ｍｌチューブ（エッペンドルフ）に除去し、液体窒素中で瞬間凍結させ、−８０℃で保存した。さらに、実験当たり１匹のマウスに媒体のみを注射し（擬似）、このマウス由来の血漿はバックグラウンドのＦＶＩＩａ活性の決定に使用した。
Ｂ．ＥＬＩＳＡアッセイ
市販のキット、ＩＭＵＢＩＮＤ（登録商標）第ＶＩＩ因子ＥＬＩＳＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）を使用して、ＥＬＩＳＡによって血清中のＦＶＩＩタンパク質を検出した。このキットは、タンパク質を捕捉するために抗ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ抗体で予めコーティングしたプレート、及びストレプトアビジン標識ホースラディッシュペルオキシダーゼを介した検出用のビオチン化抗ＦＶＩＩ抗体を利用する。このキットは以下の例外以外は製造者の指示に従って使用した：第１に、標準曲線を限定して、全濃度範囲にわたって直線的な範囲となり、０．８８ｎｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度に及ぶことを確実にした；第２に、抗体親和性の違いのために、キットに与えられたＦＶＩＩ標準ではなく、精製ＦＶＩＩａ変異体自体を標準曲線に使用した。複数の実験が、ＦＶＩＩａと抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）の複合体、ＦＶＩＩａの考えられる血漿阻害剤が遊離プロテアーゼのレベルの７５％で検出されることを示し、このアッセイは、活性型と不活性型の両方で血漿試料中の全ＦＶＩＩａを検出することができることを確実にした。
簡単にいうと、血漿試料を室温で解凍し、試料バッファー（ＰＢＳ＋０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００＋１．０％のＢＳＡ）中に１０倍希釈し、次いで４つの希釈液に５．５倍に連続希釈した。この４つの希釈試料は、２０、１１０、６０５及び３３２７．５倍の最終試料希釈液に、ＥＬＩＳＡプレートにおいて２倍希釈した。マウス血漿のこれら４つの希釈液は、３３，０００ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌのプロテアーゼ濃度の範囲に及んだ。それぞれの試料は２つの別個のアッセイプレートで測定し、標準曲線の範囲内の測定値を使用して、血漿試料中のＦＶＩＩａ変異体の濃度を計算した。
Ｃ．凝血アッセイ
市販のキット（ＳＴＡＣＬＯＴ ＦＶＩＩａ−ｒＴＦ、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）を、凝血アッセイ用として使用した。活性ＦＶＩＩａポリペプチドの凝固活性を決定するために、ＦＶＩＩａ依存性凝血アッセイ（ＦＶＩＩ：Ｃ）を使用して血漿試料をアッセイした。アッセイは市販のキット中に与えられた試薬及び説明書を使用して実施し、凝血時間は電気機械的凝血検出装置（ＳＴＡｒｔ４、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）を使用して測定した。このキットは以下の例外以外は製造者の指示に従って使用した：第１に、キットに与えられたｒｈＦＶＩＩａ標準ではなく、精製ＦＶＩＩａ変異体自体を標準曲線に使用した；第２に、以下の多量の市販の試薬を通常の薬物動態スクリーニング試験に使用して、キットの試薬に匹敵する結果を得た：可溶性組織因子（ＣａｌＢｉｏＣｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）及び合成リン脂質混合物（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）、ＴＢＳＡバッファー（Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌ、ｐＨ７．５及び１％のＢＳＡ；ＤｉａＰｈａｒｍａ、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、Ｏｈｉｏ）、及び２５μＭの塩化カルシウム溶液（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ Ｓｔａｇｏ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）。
凝血アッセイは以下のように実施した。凍結血漿試料を約４５分間室温で解凍し、次いでバッファー中に１：５０００に希釈した。５０μｌの希釈血漿を５０μＬの第ＶＩＩ因子欠損ヒト血漿及び５０μＬの再脂質化組織因子と組合せ、１８０秒間プレインキュベートした。プレインキュベーション後、５０μＬの塩化カルシウム溶液（２５μＭ）を加えて凝血を開始させた。凝血時間は電気機械的凝血検出を使用して決定した。それぞれの血漿試料は２連でアッセイした。既知量のアッセイした特異的ＦＶＩＩａ変異体を含有するバッファーの連続希釈液の凝血時間を使用して、標準曲線を構築することによって、この系を調整した。マウス血漿試料中のＦＶＩＩａ濃度は、ｌｏｇＦＶＩＩａ対Ｌｏｇ凝血時間の標準曲線の直線部分から計算した。第ＶＩＩ因子欠損血漿における凝血を誘導する血漿試料の能力は、擬似治療マウス由来の血漿中の内因性野生型ＦＶＩＩａのバックグラウンド除去後の、マウス血漿のｎｇＦＶＩＩａ／ｍＬとして報告した。
直線に活性の自然対数を従来通り適合させること、及びＦＶＩＩａタンパク質の活性が半分に低減するのに要した時間を測定することによって、それぞれのＦＶＩＩタンパク質の半減期を通常通り決定した。多重指数関数的減衰があるＦＶＩＩタンパク質に関して、半減期はｌｏｇ血漿対時間のプロファイルの末端部分から決定した。追加的な薬物動態パラメータは、市販のソフトウェア（ＷｉｎＮｏｎＬｉｎ ｖ５．１、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用して計算した。
Ｄ．ＣＢ７２８、ＣＢ７３５及びＣＢ９４５の薬物動態性
前述のプロトコルを使用して、野生型ＦＶＩＩａ及び２個のＦＶＩＩａ変異体：ＣＢ７２８、ＣＢ７３５及びＣＢ９４５の薬物動態性を評価した。これらの結果は表１４中に示す。ＣＢ７３５及びＣＢ９４５は、野生型ＦＶＩＩａと比較して改善された薬物動態パラメータを示した。
Figure 2014042523
Ｅ．ＣＢ５５８の薬物動態性
ＴＦＰＩ（ＣＢ−５５８；Ｋ１９７Ｅ突然変異を含有する）に対する抵抗性の増大を示した改変ＦＶＩＩａポリペプチドの半減期を測定し、幾分改変した前に記載したのと同様の薬物動態試験において、非改変組換え型ヒトＦＶＩＩａ（ｒｈＦＶＩＩａ）タンパク質（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）の半減期と比較した。１５匹の雄ＣＤ−１マウスにＣＢ−５５８を０．５ｍｇ／ｋｇ静脈内ボーラス投与で注射し、１５匹のマウスにはｒｈＦＶＩＩａを０．５ｍｇ／ｋｇで静脈内ボーラス投与した。注射後５、１５、３０、６０、及び１２０分で、それぞれの注射プロトコルからの３匹のマウスをＣＯ２窒息を使用して安楽死させ、経皮的心穿刺によって約１．０ｍＬの血液を１．０ｍＬのシリンジに取り出した。それぞれのシリンジに十分なクエン酸ナトリウムを予め充填して、１ｍＬの血液中に３．２％の最終濃度を得た。次いでこれらの血液試料を、４℃において８分間９０００ｒｐｍで遠心分離にかけた。血漿を標識した個々の１．５ｍｌチューブ（エッペンドルフ）に移し、液体窒素に瞬間凍結させ、−８０℃で保存した。
活性ＦＶＩＩａポリペプチドの凝固活性及び半減期を決定するために、血漿試料はＦＶＩＩａ依存性凝血アッセイ（ＦＶＩＩ：Ｃ）及び自動止血装置（ＡＭＡＸ １９０ｐｌｕｓ、Ｔｒｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用してＭａｃｈａｏｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．（Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ）で評価した。簡単にいうと、凍結血漿試料を５分間３７℃の水浴中で解凍し、次いでＶｅｒｏｎａｌバッファー中に１：４０に希釈した。６μｌの希釈血漿をキュベット中の５４μｌのＶｅｒｏｎａｌバッファーに加え、金属製ビーズと混合した。次いで等量（６０μｌ）の第ＶＩＩ因子欠損ヒト血漿（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）をキュベットに加え、それを絶えず混合しながら６０秒間３７℃でインキュベートした。
反応の開始時に着手するために、１２０μＬのトロンボプラスチン（ウサギ脳供給源、トロンボプラスチン−ＤＳ；Ｐａｃｉｆｉｃ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）をキュベットに加え、その中で絶えず混合し続けた。凝血反応を４０５ｎｍで写真−光学的にモニターしてフィブリンの形成を検出した。公開されたＦＶＩＩレベル（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）で参照血漿の連続希釈液の凝固時間を分析すること、及び次いで正常な対照血漿（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）及び異常な対照血漿（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ）の凝固時間を分析することによって、この系を調整した。
第ＶＩＩ因子欠損血漿における凝血を誘導する血漿試料の能力は、正常なヒト血漿において観察した凝固時間の割合として報告した。ＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）治療マウスとＣＢ−５５８治療マウスの両方由来の血漿の凝固活性は、経時的に低下した。直線に活性の自然対数を従来通り適合させること、及びＦＶＩＩａタンパク質の活性が半分に低減するのに要した時間を測定することによって、それぞれのＦＶＩＩタンパク質の半減期を決定した。ＣＢ−５５８の半減期は、ＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標））の半減期の約２倍、６７分と比較して１５６分であったと観察した。
実施例１０
追加的なＦＶＩＩ変異体の生成
一連の追加的なＦＶＩＩ突然変異体を生成してＦＶＩＩの１つ又は複数の性質及び／又は活性を変化させた。ＴＦＰＩ抵抗性を増大させるための改変以外に、ＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性を増大させるため、触媒活性を増大させるため、半減期を増大させるため、及び／又は活性化血小板上のリン脂質などのリン脂質との親和性及び／又は結合を増大させるための改変を設計した。これらの改変には、アミノ酸交換、挿入及び欠失がある。２つ以上の改変を含有するＦＶＩＩ変異体も生成した。表２３は、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞において生成し発現させたＦＶＩＩ変異体を示す。複数のアミノ酸交換を、適切なオリゴヌクレオチドを用いて、前述の実施例２．Ｂ中に記載した方法を使用してＦＶＩＩポリペプチドに組み込んだ。
以下の表１５は、生成した追加的なＦＶＩＩ変異体を示す。野生型ＦＶＩＩタンパク質のＮ末端におけるアミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４（成熟ＦＶＩＩ番号付けによる）を、ＦＩＸ、ＦＸ、プロテインＣ、プロテインＳ又はトロンビンのＧｌａドメインに対応するアミノ酸残基と交換した、ＧｌａスワップＦＶＩＩ変異体を生成した。「ＧｌａスワップＦＩＸ」ＦＶＩＩ変異体（即ち、内因性ＧｌａドメインがＦＩＸ由来のＧｌａドメインと交換されたＦＶＩＩポリペプチド）は、Ｎ末端に配列番号１１０のアミノ酸残基Ａ２〜Ｙ４５を含有し、「ＧｌａスワップＦＸ」ＦＶＩＩ変異体は、Ｎ末端に配列番号１１１のアミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４を含有し、「ＧｌａスワッププロテインＣ」ＦＶＩＩ変異体は、Ｎ末端に配列番号１１３のアミノ酸残基Ａ１〜Ｈ４４を含有し、「ＧｌａスワッププロテインＳ」ＦＶＩＩ変異体は、Ｎ末端に配列番号１１４のアミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４を含有し、且つ「Ｇｌａスワップトロンビン」ＦＶＩＩ変異体は、Ｎ末端に配列番号１１５のアミノ酸残基Ａ１〜Ｙ４４を含有する。
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実施例１１
基質第Ｘ因子に対するＦＶＩＩａ変異体の触媒活性の分析
基質第Ｘ因子（ＦＸ）に対するＦＶＩＩａ変異体の触媒活性を、合成基質Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ ＦＸａにおいてＦＶＩＩａによる活性化によって生成したＦＸａの活性をアッセイすることによって、２つのタイプの発色アッセイで間接的に評価した。この２つのアッセイは脂質化組織因子の存在下又は不在下のいずれかで実施して、ＴＦ依存性活性とＴＦ非依存性活性の両方を評価した。実施例２及び３中に前に記載したように、ＦＶＩＩ変異体を発現させ、精製しＦＶＩＩａに活性化した。大部分のＦＶＩＩ変異体はＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞中でのみで発現したが、いくつかのＦＶＩＩ変異体はＢＨＫ−２１細胞中でも発現した。
脂質化組織因子の間接的アッセイ
組織因子の存在下でＦＶＩＩａ変異体の触媒活性を、わずかな改変で前述の実施例５中に記載したアッセイを使用して評価した。１つのこのような改変は、ＥＲＧ−ＣＭＫ及びＦＦＲ−ＣＭＫで処理してバックグラウンド活性を低減させた第Ｘ因子基質プロテアーゼの使用であった（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）。２つの別個のアッセイ；直線範囲の分析アッセイ及び双曲線範囲の分析アッセイを使用して、２つのタイプのデータ分析を実施した。直線範囲の分析アッセイは０ｎＭと１５０ｎＭの間の範囲の第Ｘ因子濃度を使用して、用量曲線の直線範囲中の反応速度定数の正確な測定を確実にした。対照的に、双曲線範囲の分析アッセイは０μＭと１．４４μＭの間の範囲の第Ｘ因子濃度を使用して、飽和（双曲線）用量曲線を用いた反応速度定数の正確な測定を確実にした。
直線範囲のデータ分析を用いた脂質化組織因子の間接的アッセイは、以下の改変で前述の実施例５中に記載したのと本質的に同様に実施した。ＦＶＩＩａ変異体／ＴＦ溶液を０．１ｎＭのＦＶＩＩａ／０．４ｎＭのＴＦ溶液として調製し、３０分間インキュベートした後、０．４ｎＭのＴＦで１．５６２５ｐＭのＦＶＩＩａ／０．４ｎＭのＴＦを含有する溶液に２倍希釈した。２５μＬのＦＶＩＩａ／ＴＦ溶液を、１．０ｍＭのＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ ＦＸａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）及び３００ｎＭ、２００ｍＭ、１３３．３ｎＭ、８８．９ｎＭ、５９．３、３９．５ｎＭ、３６．３ｎＭ又は０ｎＭの第Ｘ因子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）の１つを含有していた２５μＬの基質溶液と混合した。したがって、アッセイに関する最終濃度は、０．８ｐＭのＦＶＩＩａ、０．２ｎＭのＴＦ、０．５ｍＭのＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ ＦＸａ及び１５０ｎＭ、１００ｍＭ、６６．７ｎＭ、４４．４ｎＭ、２９．６ｎＭ、１９．８ｎＭ、１３．２ｎＭ又は０ｎＭの第Ｘ因子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）、５０μＬ／ウェル中であった。後の計算においてμＭへのＲＦＵに関する変換係数として働いたＡＭＣ標準曲線を延長して、０μＭ〜１００μＭのＡＭＣに及ぶ用量範囲を含めた。
双曲線範囲のデータ分析を用いた脂質化組織因子の間接的アッセイは、以下の改変で前述の実施例５中に記載したのと本質的に同様に実施した。ＦＶＩＩａ変異体／ＴＦ溶液を０．１ｎＭのＦＶＩＩａ／０．４ｎＭのＴＦ溶液として調製し、３０分間インキュベートした後、０．４ｎＭのＴＦで１．５６２５ｐＭ（又は高活性を有すると予想されるプロテアーゼに関して０．７８ｐＭ）のＦＶＩＩａ／０．４ｎＭのＴＦを含有する溶液に２倍希釈した。２５μＬのＦＶＩＩａ／ＴＦ溶液を、１．０ｍＭのＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ ＦＸａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）及び１４４０ｎＭ、７２０ｍＭ、３６０ｎＭ、１８０ｎＭ、９０ｎＭ、４５ｎＭ、２２．５ｎＭ又は０ｎＭの第Ｘ因子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）の１つを含有していた２５μＬの基質溶液と混合した。したがって、アッセイに関する最終濃度は、０．８（又は０．３９）ｐＭのＦＶＩＩａ、０．２ｎＭのＴＦ、０．５ｍＭのＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ ＦＸａ及び７ｎＭ、７２０ｍＭ、３６０ｎＭ、１８０ｎＭ、９０ｎＭ、４５ｎＭ、２２．５ｎＭ、１１．２５ｎＭ又は０ｎＭの第Ｘ因子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）、５０μＬ／ウェル中であった。ｋｃａｔ及びＫｍパラメータを、（Ｖｍａｘ／（１＋（Ｋｍ／ｘ）））の形のミカエリスメンテンの双曲線的等式を使用して計算した。後の計算においてμＭへのＲＦＵに関する変換係数として働いたＡＭＣ標準曲線を延長して、０μＭ〜１００μＭのＡＭＣに及ぶ用量範囲を含めた。
ＦＸのＦＶＩＩａ又はＦＶＩＩａ変異体活性化に関する反応速度率定数を決定するために、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏアプリケーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で回収した生データを、ＸＭＬファイルとしてエクスポートした。さらなるデータの線形及び非線形解析は、マイクロソフトエクセルのスプレッドシートの環境内（ＩＤＢＳソフトウェア）で、ＸＬｆｉｔ４、自動式曲線適合及び統計解析用のソフトウェアパッケージを用いて実施した。
直線範囲のアッセイを使用して回収したデータに関して、ｋｃａｔ／Ｋｍ（Ｍ−１秒−１）反応速度定数を、ＦＸ濃度対蛍光基質切断の速度（μＭ／秒２単位）の線形回帰分析の勾配から直接計算し、前式でｋｃａｔ／Ｋｍ＝勾配／［ＦＶＩＩａ］×０．５×ｋ２である。補正係数ｋ２は実施例５中に記載した方法を使用して４５であったと決定し、ｋｃａｔ，ＦＸａ＝５６秒−１及びＫｍ，ＦＸａ＝１２６ｎＭのＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ ＦＸａのＦＸａ切断に関する反応速度定数を、ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンで滴定して以前は活性部位であった活性化ＦＸ（ＦＸａ）を用いて実験により決定した。０．９８未満のＲ２値をもたらしたデータ地点の除外によって、適合ルーチンで使用したデータセットの直線性を確実にした。
双曲線範囲のアッセイを使用して回収したデータの分析値は、ＦＸ濃度対蛍光基質切断の速度（μＭ／秒２単位）の非線形回帰分析から計算した。個々のｋｃａｔ及びＫｍパラメータは、ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［ＦＶＩＩａ］×０．５×ｋ２である（Ｖｍａｘ／（１＋（Ｋｍ／ｘ）））の形のミカエリスメンテンの双曲線的等式を使用して適合パラメータとして計算する。反応速度定数、ｋｃａｔ／ＫＭは個々のｋｃａｔ及びＫｍ適合パラメータから計算した。
組織因子の非依存性間接的アッセイ
組織因子の存在下でＦＶＩＩａ変異体の触媒活性を、組織因子をアッセイ中に含めなかったこと以外、前に記載したアッセイと同様の間接的アッセイにおいて評価した。したがって、ＴＦ非依存性活性を評価するためのアッセイを、以下の改変で前に記載したのと本質的に同様に実施した。ＦＶＩＩａ変異体の溶液は５０ｎＭに希釈した。２５μＬのそれぞれのＦＶＩＩａ溶液を、１．０ｍＭのＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ ＦＸａ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）及び１０５０ｎＭ、７００ｍＭ、４６６．７ｎＭ、３１１．１ｎＭ、２０７．４ｎＭ、１３８．３ｎＭ、９２．２ｎＭ又は０ｎＭの第Ｘ因子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）の１つを含有していた２５μＬの基質溶液と混合した。したがって、アッセイに関する最終濃度は、２５ｎＭのＦＶＩＩａ、０．５ｍＭのＳｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒ ＦＸａ及び５２５ｍＭ、３５０ｎＭ、２３３．３ｎＭ、１５５．６ｎＭ、１０３．７ｎＭ、６９．１ｎＭ、４６．１ｎＭ又は０ｎＭの第Ｘ因子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）、５０μＬ／ウェル中であった。データ分析は、改変なしで前の直線範囲のアッセイに関して記載したのと同様に実施した。
表１６〜１８は、ＦＶＩＩａ変異体の触媒活性を測定するために実施したアッセイの結果を与える。表１５及び１６は、それぞれ２９３−Ｆ細胞及びＢＨＫ−２１細胞から発現されたＦＶＩＩａポリペプチドを使用して、ＴＦ依存性間接的アッセイにおいて測定した触媒活性を与え、且つ表１７は、２９３−Ｆ細胞及び／又はＢＨＫ−２１細胞から発現されたＦＶＩＩａポリペプチドを使用して、ＴＦ非依存性間接的アッセイにおいて測定した触媒活性を与える。これらの結果は触媒活性、ｋｃａｔ／Ｋｍ（Ｍ−１秒−１）に関する反応速度定数として示し、且つ野生型ＦＶＩＩａの活性の割合としても表し、この活性はその基質、ＦＸに対するそれぞれのＦＶＩＩａ変異体の触媒活性、ｋｃａｔ／Ｋｍ（Ｍ−１秒−１）である。表中に示した値に対する、直線又は双曲線範囲のデータ分析の使用も示す。すべてのＦＶＩＩａ変異体をそれぞれのアッセイ中でアッセイした訳ではなかった。前述の実施例５中でアッセイしたいくつかのＦＶＩＩ変異体は、実施例５中に記載したアッセイと比較して、このアッセイセット中ではわずかに低減又は増大したＦＸに対する触媒活性を示した。実施例５中で見られた活性との活性の違いは、おそらくＡｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａから得たＦＸ基質における残留ＦＸａの様々なバックグラウンド活性によるものである。いくつかのＦＶＩＩａ変異体は、野生型ＦＶＩＩａ分子と比較して触媒活性の増大を示した。例えば、Ｑ３６６Ｖ突然変異を含有するＣＢ７６０は、野生型ＦＶＩＩａの触媒活性の１．５倍と５倍の間の触媒活性を有する。
Figure 2014042523
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実施例１２
ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンによるＦＶＩＩａ／ＴＦ又はＦＶＩＩａの阻害の決定
可溶性組織因子（ｓＴＦ）の存在下又は不在下、即ちＴＦ依存性又はＴＦ非依存性のＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン複合体とＦＶＩＩａの間の相互作用の有効性を、基質、Ｍｅｓｙｌ−ＦＰＲ−ＡＣＣに対するＦＶＩＩａ／ｓＴＦの触媒活性における様々な濃度のＡＴ−ＩＩＩの阻害のレベルを測定することによって評価した。試験したそれぞれのＦＶＩＩａ変異体に関して、室温（〜２５°）における３０分のアッセイ中にＦＶＩＩａ変異体の５０％阻害に必要とされたＡＴ−ＩＩＩのモル濃度（ＩＣ５０）に相当する、Ｋ０．５の値を決定した。
２つの別個のアッセイ、ＴＦを含む１つのアッセイとＴＦを含まない１つのアッセイを調製した。ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンの２μＭ溶液（最終５ｍＭヘパリン）を、２６．４μＬの１５１．７μＭのＡＴ−ＩＩＩ（血漿精製ヒトＡＴ−ＩＩＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）と５０μＬの０．２ｍＭのＬＭＷヘパリン（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）、４００μＬの５×アッセイ用バッファー（１００ｍＭのＨｅｐｅｓ、７５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％のＢＳＡ、０．５％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．４）及び１．５２３ｍＬの試薬用水を混合することによって調製した。この溶液は、ＴＦ依存性アッセイ中で最高濃度として使用した。５２．８μＬの１５１．７μＭのＡＴ−ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）と５０μＬの０．２ｍＭのＬＭＷヘパリン（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）、４００μＬの５×アッセイ用バッファー及び１．４９７ｍＬの試薬用水を混合することによって、４μＭのＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンを含有する溶液（最終５ｍＭヘパリン）を、ＴＦ非依存性アッセイ中で使用するために調製した。ＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン溶液を室温で５〜１０分間インキュベートし、次いで５μＭのヘパリンを含有する１ｍＬの最終体積で９６深ウェルのポリプロピレン製プレートに２倍希釈し、２０００、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５及び０ｎＭ、又は４０００、２０００、１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、及び０ｎＭの希釈液を生成した。ＦＶＩＩａ変異体及び野生型ＦＶＩＩａを、１×アッセイ用バッファー（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％のＢＳＡ、０．１％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．４）に２５０ｎＭに希釈した。ＴＦ依存性アッセイ用に、５ｎＭのＦＶＩＩａ／５０ｎＭのｓＴＦの複合体を、２０μＬのＦＶＩＩａと１０μＬの５μＭのｓＴＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓヒト凝固第ＩＩＩ因子：＃２３３９−ＰＡ）、２００μＬの５×アッセイ用バッファー及び７７０μＬの試薬用水を混合すること、及びその溶液を室温で１０〜１５分間インキュベートすることによって形成した。ＴＦ非依存性アッセイ用に、１００μＬのＦＶＩＩａを２００μＬの５×アッセイ用バッファー及び７００μＬの試薬用水と混合して、ＦＶＩＩａの２５ｎＭ溶液を生成した。アッセイを開始するために、２５μＬのＦＶＩＩａ／ＴＦ又はＦＶＩＩａ単独溶液を、９６ウェルの黒色半領域アッセイプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル中でＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンの２５μＬのそれぞれの希釈液と別々に混合した。ＴＦ依存性アッセイに関する最終アッセイ条件は、２．５ｎＭのＦＶＩＩａ／２５ｎＭのｓＴＦ及び１０００ｎＭ〜０ｎＭの範囲のＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン濃度であった。ＴＦ非依存性アッセイ用に、ＦＶＩＩａ濃度は１２．５ｎＭのＦＶＩＩａであり、且つＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリン濃度は２０００ｎＭ〜０ｎＭの範囲であった。プレートは室温（約２５℃）で振とうしながら３０分間インキュベートした。
ＦＶＩＩａ基質（Ｍｅｓｙｌ−ＦＰＲ−ＡＣＣ）のストック溶液は、その基質をＤＭＳＯに溶かして２０ｍＭにすること、次いで１×アッセイ用バッファー中に０．５ｍＭの希釈標準溶液を調製することによって調製した。上述のアッセイプレートのインキュベーション後、５０μｌのＦＶＩＩａ基質をアッセイプレートのそれぞれのウェルに加えた。反応物を混合し、ＦＶＩＩａの残留活性は、３０℃に設定した蛍光リーダー中で１５分間基質切断の初期速度を追跡することによって評価した。
ＦＶＩＩａ又はＦＶＩＩａ変異体に関するＡＴ−ＩＩＩ／ヘパリンによる阻害の程度を決定するために、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏアプリケーション（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で回収した生データを、ＸＭＬファイルとしてエクスポートした。さらなる非線形データ解析は、マイクロソフトエクセルのスプレッドシートの環境内（ＩＤＢＳソフトウェア）で、ＸＬｆｉｔ４、自動式曲線適合及び統計解析用のソフトウェアパッケージを用いて実施した。スプレッドシートテンプレートを使用して、それぞれの実験ＡＴ−ＩＩＩ濃度でのそれぞれのＦＶＩＩａ複製に関する、ＡＴ−ＩＩＩ希釈系、ＡＴ−ＩＩＩとＦＶＩＩａの比、及びＶｉ／Ｖｏ比を計算した。残留ＦＶＩＩａ活性（Ｖｉ／Ｖｏとして表した）対ＡＴ−ＩＩＩ濃度の非線形回帰分析を、ＸＬｆｉｔ４及び（（Ｃ＋（Ａｍｐ＊（１−（Ｘ／（Ｋ０．５＋Ｘ）））））の形の双曲線的阻害等式；前式でＣ＝補正値（アッセイの過程中に１００％阻害に達しないデータセットの外挿を可能にするために０に固定）、Ａｍｐ＝適合値と、アッセイ条件下で半最大阻害に必要とされたＡＴ−ＩＩＩの濃度に対応するＫ０．５の振幅値を使用して処理した。いくつかのＦＶＩＩａ変異体に関して、ＡＴ−ＩＩＩは試験した最高濃度のＡＴ−ＩＩＩにおいて全プロテアーゼ活性の２０〜２５％未満を阻害し、アッセイに関する検出の上限を表した。したがって２０〜２５％未満の最大阻害であった変異体には、下限Ｋ０．５値（ＴＦ依存性に関して５μＭ及びＴＦ非依存性に関して１０μＭ）を割り当て、且つ大抵の場合、報告された値を超えるＡＴ−ＩＩＩ抵抗性を有すると予想される。
表１９及び２０は、それぞれＴＦの存在下又は不在下においてＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞及び／又はＢＨＫ−２１細胞中で発現された、ＦＶＩＩａ変異体を使用して実施したアッセイの結果を与える。これらの結果は、それらの適合Ｋ０．５値の比（Ｋ０．５変異体／Ｋ０．５野生型）として表した、野生型ＦＶＩＩａと比較したそれぞれの変異体に関する適合Ｋ０．５パラメータとＡＴ−ＩＩＩ抵抗性の程度の表示の両方として表す。いくつかのＦＶＩＩａ変異体は、野生型ＦＶＩＩａと比較してＡＴ−ＩＩＩに対する抵抗性の増大を示した。
Figure 2014042523
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実施例１３
ＦＶＩＩａ変異体のＴＦＰＩに対する抵抗性の決定
ＴＦＰＩに対する様々なＦＶＩＩａ変異体の抵抗性を、前述の実施例７中に記載したアッセイを使用して評価した。表２１は、これらのアッセイの結果を与える。これらの結果は、野生型ＦＶＩＩａと比較したＴＦＰＩに対するそれぞれのＦＶＩＩａ変異体の抵抗性倍数として表す。
Figure 2014042523
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実施例１４
ｉｎ ｖｉｖｏでのＦＶＩＩａポリペプチドの凝固促進活性の評価
血友病Ａのマウスモデルを確立して、ＦＶＩＩａポリペプチドの凝固促進活性を評価した。（実施例８中で前に記載したのと同様に）抗ＦＶＩＩＩ抗体の投与、次に尾の先端を外科手術により除去して出血を開始させることによって、ＣＤ−１マウスにおいて血友病Ａを誘導した。ＦＶＩＩＩが欠損したマウス（ＦＶＩＩＩ−／−マウス）も使用したが、抗ＦＶＩＩＩ抗体で治療しなかった。次いでマウスをＦＶＩＩａポリペプチドで治療して、２０分中に失われた血液の量を測定して、ＦＶＩＩａポリペプチドの凝固促進活性を決定した。
Ａ．誘導型血友病Ａを有するＣＤ−１マウスにおけるＦＶＩＩａの凝固活性の分析
初期実験を実施して、ＣＤ−１マウスにおいて血友病を誘導するために腹腔内経路によって与えたときの、必要とされた用量並びに抗ヒトＦＶＩＩＩ抗体の影響の時間及び期間を決定した。抗ＦＶＩＩＩの第１ロット（ロット１；Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ロットＩＧ１２９Ｒ４）に関して、これは最初は、実施例８中で前に記載したカニューレ挿入実験に使用した用量に基づいた。血友病状態（２０分のアッセイ時間中の制御不能な出血）を引き起こすと決定した用量は、７．５４ｍｇ／マウス（８０μｌの９４．２５ｍｇ／ｍｌストック溶液）であった。このロットは、６１２マウスＢＵ／ｍｌの中和活性を有していた。抗ヒトＦＶＩＩＩの第２ロット（ロット２；Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ロットＩＧ１５７７Ｒ２、４７４マウスＢＵ／ｍｌの中和活性）に関して、使用した用量は１１．９８ｍｇ／マウス（１２０μｌの９９．８ｍｇ／ｍｌストック溶液）であり、尾部切断６時間前に投与した。
血友病を誘導するために、雄ＣＤ−１マウス（２５〜３５ｇ）に、実験前にロット１又はロット２の抗ＦＶＩＩＩを腹腔内投与した。雄ＣＤ−１及びＦＶＩＩＩ−／−マウスにケタミン／キシラジンカクテル（１００ｍｇ／ｍＬ溶液）の腹腔内投与によって麻酔をかけ、加熱したプラットホーム（３９℃）上に置き、体温の低下がないことを確実にした。実験室は８２°Ｆの温度に保った。尾部切断１０分前に、尾部を１０ｍｌの予め温めたＰＢＳ（１５ｍ１遠心分離チューブ；３９℃）中に浸した。８〜１０匹のマウスに、１回の注射で尾静脈を介して、５２ｍＭの塩化ナトリウム、１０．２ｍＭの無水塩化カルシウム、９．８４ｍＭのグリシルグリシン、０．０１％のポリソルベート８０及び１６５ｍＭのマンニトールから構成されるバッファーに希釈した、組換え型ヒトＦＶＩＩａ（ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）又は改変ＦＶＩＩポリペプチドを注射した。媒体のみも対照としてマウスの群に注射した。注射を失敗した場合、その動物は試験から除外した。試験作用物質又は媒体の注射は尾部切断５分前に行った。尾部切断は尾の末端から５ｍｍでカミソリ刃を使用して行い、血液は２０分の間ＰＢＳに回収した。回収時間の最後に、全体の血液消失を評価した。回収チューブを混合し、それぞれの試料の１ｍｌのアリコートを得て、ヘモグロビン含量に関してアッセイした。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は滅菌水中に１対４に希釈し、１００μＬを１ｍＬの試料に加えて溶血を引き起こした。次いで試料の吸光度を５４６ｎｍの波長で測定した。消失した血液の量を計算するために、ＰＢＳに希釈しＴｒｉｔｏｎＸ１００で前と同様に溶血した既知の体積のネズミ血液の、５４６ｎｍでの吸光度を測定することによって作製した標準曲線に対して吸光度を読み取った。
０．３、１又は３ｍｇ／ｋｇのＣＢ５５３（野生型ＦＶＩＩａ）を評価した用量応答試験も実施した。媒体を与えたマウスは２０分のアッセイ中に１００２．３±６０．７１μＬを失った。これは３ｍｇ／ｋｇのＣＢ５５３を投与したマウス中で、４１５．５±９０．８５μＬに有意に低減した（クラスカル−ワリス次にダンの事後検定を使用してｐ＜０．０５）。１ｍｇ／ｋｇに用量を低減することによって６７９．５７±８３．９５μＬの血液消失をもたらし、且つ０．３ｍｇ／ｋｇの低用量は８５２．４２±９４．４６μＬの血液消失をもたらした。
別の試験では、ＣＢ７３５（Ｋ３４１Ｄ）及びＣＢ９４５（Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３４１Ｄ）を３ｍｇ／ｋｇの用量で評価した。媒体のみの注射は対照として使用した。媒体のみを与えたマウスの群は、２０分のアッセイ中に８０３±９２．１８μＬと８１３．１±８２．６６μＬの間の血液を失った。これは、それぞれ７４６±１１０．５μＬと８７０．９±７８．３８μＬの血液消失をもたらしたＣＢ７３５又はＣＢ９４５での治療と同様であった。
Ｂ．ＦＶＩＩＩ−／−マウスにおけるＦＶＩＩａの凝固活性の分析
ＦＶＩＩＩが欠損したマウス（ＦＶＩＩＩ−／−マウス）を使用する血友病Ａのマウスモデルも使用して、マウスを抗ＦＶＩＩＩ抗体で治療しなかったこと以外は前に記載したのと同じプロトコルを使用して、ＦＶＩＩａポリペプチドの凝固活性を評価した。
１．野生型ＦＶＩＩａの凝固活性を評価する用量応答試験
０．３、１、３及び６ｍｇ／ｋｇでのＦＶＩＩＩ−／−マウスにおけるＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）及びＣＢ５５３の凝固活性を評価するための用量応答試験を実施した。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の実験では、媒体群中の血液消失は９１２．７９±３８．３２μＬであり、これは６及び３ｍｇ／ｋｇでのＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）治療によって有意に低減した（３６１．７４±５５．２８μＬ及び５８６．９８±６０．５６μＬに；クラスカル−ワリス次にダンの事後検定を使用してｐ＜０．０５）。１ｍｇ／ｋｇに用量を低減することによって６７４．８４±４６．８８μＬの血液消失をもたらし、且つ試験した最小用量ではその値は８０１．０８±４１．３９μＬであった。ＣＢ５５３の実験では、媒体対照群は９０４．０８±１５．３８μＬの血液消失をもたらした。これはＣＢ５５３によって６ｍｇ／ｋｇで４５１．０４±７４．１７μＬに有意に低減した（クラスカル−ワリス次にダンの事後検定を使用してｐ＜０．０５）。３ｍｇ／ｋｇに用量を低減することによって６９５．７５±６０．５０μＬの血液消失値をもたらし、一方１及び０．３ｍｇ／ｋｇにさらに用量を低下させることによって、媒体対照レベル及びその近辺の血液消失値をもたらした（それぞれ８４６．０８±３４．１７μＬ及び９３６．４３±３１．３９μＬ）。
実施例１５
可溶性組織因子との第ＶＩＩａ因子結合の決定
ＨＥＫ２９３又はＢＨＫ細胞から発現したＦＶＩＩａ変異体の可溶性組織因子（ｓＴＦ）と結合する能力を、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴を使用して評価した。ＦＶＩＩａ変異体は、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５チップと結合した２つの異なるレベルのｓＴＦを使用して、２つの二連実験における３つのプロテアーゼ濃度での結合プロファイルの測定によって評価する。
新たなＳｅｒｉｅｓ Ｓ ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＢＲ１００６−６８）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置を使用して、ウシ血清アルブミン及び可溶性組織因子とカップリングさせた。カップリングは、Ｂｉａｃｏｒｅカップリングバッファー（３０ｍＭのＮａ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１３５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）及びアミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＢＲ−１０００−５０）及びＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ソフトウェアのプロトコルウィザードを使用して実施した。固定用に、チップの全４個のセルを使用した。セル１及び３は酢酸バッファー、ｐＨ４．０に希釈した５００反応単位（ＲＵ）ウシ血清アルブミン参照タンパク質とカップリングさせ、セル２及び４は酢酸バッファー、ｐＨ４．５に希釈した５００及び２５０ＲＵのｓＴＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）とカップリングさせた。
それぞれのＦＶＩＩａ変異体、及び野生型ＦＶＩＩａプロテアーゼを、３つの濃度及び二連で試験した。プロテアーゼは、９６ウェルのアッセイプレートにおいて、１００μＬのＢｉａｃｏｒｅアッセイ用バッファー（２００ｍＭのＮａ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＰＥＧ８０００、０．１％のＢＳＡ、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）中に６０ｎＭ、３０ｎＭ及び１５ｎＭに希釈した。アッセイ用のそれぞれの試料は、１０μＬ／分の流速において、１２０秒の接触時間、次に１８０秒の解離時間を使用してＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置でアッセイした。バッファーブランクもアッセイした。チップは６０秒間、次いで３０秒間、５０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０で再生した。野生型ＦＶＩＩａとｓＴＦの結合を測定するためのアッセイは、約８ｎＭのＫｄを与える３組の曲線をもたらすはずである。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアを使用してデータを分析した。具体的には、Ｌａｎｇｍｕｉｒ型等温線にデータを適合させる反応速度／親和性１：１結合分析を利用し、データは２つの反応単位のカップリングで二連のそれぞれの変異体に個々に適合させた。４つの適合Ｋｄ値を平均した、これらを表２２中に示す。Ｍ１５６Ｑ突然変異を含有するＦＶＩＩａポリペプチドは低いＫｄ結果を有する傾向があり、したがってｓＴＦとより強く結合する傾向があった。
Figure 2014042523
実施例１６
ＴＦＰＩに対する抵抗性に関するＦＶＩＩａ変異体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング
ヒト組換え可溶性ＴＦＰＩによる阻害に対する様々なＦＶＩＩａ変異体の相対的抵抗性を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置を用いてハイスループット表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して評価した。ＴＦＰＩによる阻害に対するＦＶＩＩａ変異体の相対的抵抗性は、注入時間及びプロテアーゼ濃度の標準化の後に、結合した野生型ＦＶＩＩａの量と比較した、Ｂｉａｃｏｒｅ ＣＭ５センサーチップに固定された可溶性ＴＦＰＩと結合したＦＶＩＩａ変異体の相対量の測定によって評価した。
それぞれの実験用に、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ−１００コントロールソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）内で利用可能なアミンカップリングプロトコル及びアミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共に与えられた試薬を使用して、可溶性ＴＦＰＩ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、新たな４フローセルのＢｉａｃｏｒｅ ＣＭ５ Ｓｅｒｉｅｓ Ｓセンサーチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定した。全４個の利用可能なフローセルを、２個の異なる濃度のＴＦＰＩ、及び参照セルにおいてブロッキング剤として働いたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の固定用に使用した。ＢＳＡは酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中に５μｇ／ｍＬに希釈し、それぞれ１０００及び２０００反応単位（ＲＵ）でフローセル１及び３中に固定した。ＴＦＰＩ固定用に、凍結乾燥した可溶性ＴＦＰＩ（１０μｇ）は、１００μＬの１×カップリングバッファー（３０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１３５ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）中に０．１ｍｇ／ｍＬの濃度まで再懸濁した。合計２０μＬの０．１ｍｇ／ｍＬのＴＦＰＩを、それぞれ１０００及び２０００ＲＵでフローセル２及び４に固定するために、酢酸ナトリウムｐＨ４．０中に１０μｇ／ｍＬに希釈した。カップリングバッファーは固定ステップ中ランニングバッファーとして使用した。
ＦＶＩＩａのそれぞれの試料は、６２０ｎＭのｓＴＦ（ヒト凝固第ＩＩＩ因子；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する１×ランニングバッファー（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＰＥＧ８０００、０．１％のＢＳＡ、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）中に３２０ｎＭの最終濃度に調製した。一般に、３２０ｎＭの最終希釈前に、それぞれのＦＶＩＩａ変異体を１×ランニングバッファー中に１０倍希釈した。ＦＶＩＩａ／ｓＴＦ複合体は二連で１２０μＬの最終体積に調製し、４８個までの特有のＦＶＩＩａ変異体を９６ウェルの保存プレートに添加するのを可能にし、１回の実験において二連の注入で評価した。第１回目の試料注入の開始前に、ＦＶＩＩａ／ｓＴＦ複合体を室温で１０〜１５分間インキュベートした。
標準的な結合分析法をＢｉａｃｏｒｅコントロールソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）内で作製し、その中でそれぞれのＦＶＩＩａ複製を、１０μＬ／分の流速において、１８０秒の会合時間、次に短い６０秒の解離時間で注入する。解離期の後に、１０ｍＭのグリシン、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．０によって３０秒間センサーチップの再生を行い、次いで１×ランニングバッファーによる６０秒の安定期を同じ１０μＬ／分の流速で続けた。２つのアッセイ参照地点をそれぞれの実験及びその後のデータ分析に関して記録し、１回は会合期（結合）の終了５秒前に、及び第２は解離期（解離）の終了５秒前に報告した。完全なアッセイを開始する前に、それぞれフローセル２（１０００ＲＵ）及び４（２００ＲＵ）との結合に関して約４００〜４５０ＲＵ及び７５０〜８５０ＲＵの応答性を与えるはずである１８０秒間３２０ｎＭの野生型ＦＶＩＩａ／ｓＴＦの１回注入で、センサーチップを試験した。
参照セルとの結合が最小の、基線変動及び対照ブランク注入（ランニングバッファー）の結合であることを検証することを含むデータ分析を、最初にＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて実施して、アッセイ検証パラメータを調べた。結合報告地点と解離報告地点の両方で結合したＦＶＩＩａ変異体の量（ＲＵ単位）を示したこのアプリケーション内で、データ表を作製した。これらのデータ表は、マイクロソフトエクセルのスプレッドシートの環境内で、さらなる分析用に次いでエクスポートした。生データ地点（ＲＵ結合）をセンサーチップとの対照結合に補正し、次いで結合した野生型ＦＶＩＩａの量（ＲＵ単位）と結合したＦＶＩＩａ変異体の量（ＲＵ単位）の比をそれぞれのパラメータに関して得て、結合（野生型／変異体）と解離（野生型／変異体）として報告した。ＴＦＰＩ阻害に対する抵抗性は、評価したパラメータの一方又は両方に関する比の増大として表される。例えば、特定のＦＶＩＩａ変異体に関する２０の結合（野生型／変異体）又は解離（野生型／変異体）値は、その変異体が野生型ＦＶＩＩａよりＴＦＰＩ阻害に対して２０倍を超えて抵抗性があることを示す。いくつかの変異体は、ＴＦＰＩ阻害に対する抵抗性の増大を示した。例えば、ＣＢ６０９、ＣＢ６３７、ＣＢ６９１、ＣＢ８５６及びＣＢ８５７は２０〜６０倍の抵抗性を示した群中に存在し、且つＣＢ７３５などの（キモトリプシン番号付けに対応する）成熟ＦＶＩＩ番号付けによるＫ３４１Ｄを含有する変異体は、（５０〜１５０倍を超える）ＴＦＰＩに対する有意な抵抗性を示す比を有し、Ｋ１９２Ｄ突然変異９ＣＢ９４５）を含有する変異体は、（４０〜１５０倍を超える）ＴＦＰＩに対する有意な抵抗性を示す比を有する。いくつかの場合、解離速度は会合速度より影響を受けた。このプロファイルを示した変異体のいくつかの例は、ＣＢ７３５、ＣＢ８５４、ＣＢ８５５、ＣＢ８５６及びＣＢ８５７である。
Figure 2014042523
Figure 2014042523
実施例１７
活性部位滴定剤４−メチルウンベリフェリルｐ’−グアニジノ安息香酸（ＭＵＧＢ）を使用した触媒活性プロテアーゼの濃度の決定
ストック溶液中の触媒活性ＦＶＩＩａの濃度を、４−メチルウンベリフェリルｐ’−グアニジノ安息香酸（ＭＵＧＢ）、トリプシン様セリンプロテアーゼの活性部位として発色する蛍光エステル基質で、複合体ＦＶＩＩａ及び可溶性組織因子（ｓＴＦ）を滴定することによって決定した。このアッセイは、数個のわずかな改変でＰａｙｎｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）３５：７１００〜７１０６ページ）によって記載されたのと本質的に同様に実施した。ＭＵＧＢはＦＶＩＩ又は不活性プロテアーゼではなくＦＶＩＩａと容易に反応して、ＭＵＧＢの濃度が飽和状態であり脱アシル化が非常に遅く触媒作用が律速である条件下で、効率よく安定状態になるアシル−酵素中間体を形成する。これらの条件下では、ＦＶＩＩａプロテアーゼは１回の触媒代謝回転を経て、４−メチルウンベリフェロンフルオロフォア（４−ＭＵ）を放出する。初期の蛍光発生を４−ＭＵ蛍光の外部濃度標準曲線に調整すると、活性部位の濃度を計算することができる。
複数のアッセイを、連続攪拌下において１ｃｍ×１ｃｍ石英キュベット中で２ｍＬの反応体積で実施した。それぞれの反応混合物は、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、及び０．１％のＰＥＧ８０００、ＰＨ７．６を含有するアッセイ用バッファー中に０．５μＭのｓＴＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｈｕｍａｎ）を含有していた。４−ＭＵ標準溶液をＤＭＳＯ中に０．５Ｍのストック濃度で新たに調製し、１９，０００Ｍ−１ｃｍ−１、５０ｍＭトリスバッファー、ｐＨ９．０中の吸光係数を使用して３６０ｎｍでの吸光分光法によって濃度を確認した。ＭＵＧＢは乾燥重量に基づいてＤＭＳＯ中に０．０４Ｍのストック濃度で調製した。４μＬの４ｍＭのＭＵＧＢ（８μＭ最終濃度）を１×アッセイ用バッファー中に０．５μＭのｓＴＦ（２０．２μＬの４９．４μＭのｓＴＦ）の溶液に加えること、及び初期ＥＬＩＳＡ（実施例２Ｃ．１）又はＦＦＲ−ＣＭＫを用いた活性部位滴定（実施例６）に基づいて約１００〜２００ｎＭの最終濃度までＦＶＩＩａ又はＦＶＩＩａ変異体を加える前に、約１５０〜２００秒間ＭＵＧＢのバックグラウンド加水分解を最初に測定することによって、複数のアッセイを開始した。反応の発生期中の４−ＭＵの蛍光の放出を、さらに１０００〜１２００秒間追跡した。遊離４−ＭＵの標準曲線を、２５０ｎＭの最終濃度までの２０ｎＭステップ中の０．５μＭのｓＴＦを含有する１×アッセイ用バッファー中での吸光度調整した４−ＭＵの滴定によって調製した。
データ分析用に、反応痕跡をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージにインポートし、バックグラウンド加水分解の寄与を、初期測定した自発的ＭＵＧＢ加水分解の割合の外挿によって曲線から差し引き、それは典型的には全蛍光発生の５％未満であった。補正曲線は、Ａｍｐ＝前述の飽和アッセイ条件概略下での発生期の振幅であり、ｋがアシル−酵素形成に関して観察した一次速度定数であり、ＢがＭＵＧＢの完全な代謝回転と関係がある全体の速度定数である、Δ蛍光＝Ａｍｐ（１−ｅ−ｋｌ）＋Ｂｔの形の、（脱アシル化の遅い速度を考慮した）１つの指数関数式及び線形要素に適合させた。活性ＦＶＩＩａプロテアーゼの濃度は、振幅に関する適合パラメータと４−ＭＵ標準曲線の比較によって計算する。多数のアッセイからの値を測定し、平均し標準偏差を決定した。
複数の変更形態が当業者には明らかであるはずなので、本発明は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるものとする。

Claims (118)

  1. 第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチド中の改変を含む改変ＦＶＩＩポリペプチドであって、
    改変が、配列番号３に示すアミノ酸の配列を有するＦＶＩＩポリペプチド中の位置Ｄ１９６、Ｋ１９７若しくはＫ１９９、又はＦＶＩＩポリペプチド中の対応する残基における前記位置と対応する位置にあり、
    改変が、疎水性又は酸性アミノ酸による交換であり、
    疎水性又は酸性アミノ酸が、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ａｓｐ（Ｄ）及びＧｌｕ（Ｅ）の中から選択される、
    改変ＦＶＩＩポリペプチド、その対立遺伝子及び種変異体又はその活性断片。
  2. ＦＶＩＩポリペプチド中の改変が、Ｄ１９６Ｆ、Ｄ１９６Ｗ、Ｄ１９６Ｌ、Ｄ１９６Ｉ、Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｄ、Ｋ１９７Ｌ、Ｋ１９７Ｍ、Ｋ１９７Ｉ、Ｋ１９７Ｖ、Ｋ１９７Ｆ、Ｋ１９７Ｗ、Ｋ１９９Ｄ、及びＫ１９９Ｅの中から選択される、請求項１に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  3. ＦＶＩＩポリペプチド中の改変がＤ１９６Ｙ又はＫ１９７Ｙである、請求項１に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  4. ＦＶＩＩポリペプチド中の別の位置におけるさらなる改変をさらに含む、請求項１又は２に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  5. さらなる改変がアミノ酸の交換、挿入又は欠失である、請求項４に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  6. さらなる改変が、Ｄ１９６、Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｇ２３７、Ｔ２３９、Ｒ２９０及びＫ３４１の中から選択される位置と対応する位置におけるアミノ酸の交換又は挿入であり、第１の改変及び第２の改変が異なるアミノ酸にある、請求項４又は５に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  7. さらなるアミノ酸改変が、Ｄ１９６Ｋ、Ｄ１９６Ｒ、Ｄ１９６Ａ、Ｄ１９６Ｙ、Ｄ１９６Ｆ、Ｄ１９６Ｗ、Ｄ１９６Ｌ、Ｄ１９６Ｉ、Ｋ１９７Ｙ、Ｋ１９７Ａ、Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｄ、Ｋ１９７Ｌ、Ｋ１９７Ｍ、Ｋ１９７Ｉ、Ｋ１９７Ｖ、Ｋ１９７Ｆ、Ｋ１９７Ｗ、Ｋ１９９Ａ、Ｋ１９９Ｄ、Ｋ１９９Ｅ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｔ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｖ、Ｔ２３９Ａ、Ｒ２９０Ａ、Ｒ２９０Ｅ、Ｒ２９０Ｄ、Ｒ２９０Ｎ、Ｒ２９０Ｑ、Ｒ２９０Ｋ、Ｋ３４１Ｅ、Ｋ３４１Ｒ、Ｋ３４１Ｎ、Ｋ３４１Ｍ、Ｋ３４１Ｄ及びＫ３４１Ｑの中から選択される、請求項４又は５に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  8. さらなる改変が、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＶ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＫ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＲ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＹ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＷ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＭ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＥ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＹ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＡ及びＫ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＳの中から選択されるアミノ酸の挿入である、請求項５に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  9. Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｆ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｌ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｍ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｗ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｆ／Ｋ１９７Ｅ、Ｄ１９６Ｗ／Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９６Ｖ／Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｌ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ、Ｋ１９９Ｅ／Ｋ３４１Ｑ及びＫ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｋ３４１Ｑの中から選択される改変を含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  10. 配列番号３に示すアミノ酸の配列を有する第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチド中のＤ１９６Ｒ、Ｄ１９６Ｙ、Ｄ１９６Ｆ、Ｄ１９６Ｗ、Ｄ１９６Ｌ、Ｄ１９６Ｉ、Ｋ１９７Ｙ、Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｄ、Ｋ１９７Ｌ、Ｋ１９７Ｍ、Ｋ１９７Ｍ、Ｋ１９７Ｉ、Ｋ１９７Ｖ、Ｋ１９７Ｆ、Ｋ１９７Ｗ、Ｋ１９９Ｄ、Ｋ１９９Ｅ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｖ、Ｒ２９０Ｍ、Ｒ２９０Ｖ、Ｋ３４１Ｍ、Ｋ３４１Ｄ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＶ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＫ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＲ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＹ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＷ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＭ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＥ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＹ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＡ又はＫ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＳ、又はＦＶＩＩポリペプチド中の対応する残基における前記改変と対応するアミノ酸改変の中から選択される、ＦＶＩＩポリペプチド中の改変を含む改変ＦＶＩＩポリペプチド、その対立遺伝子若しくは種変異体又はその活性断片。
  11. ＦＶＩＩポリペプチド中の別の位置におけるさらなる改変をさらに含む、請求項１０に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  12. さらなる改変がアミノ酸の交換、挿入又は欠失である、請求項１１に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  13. さらなる改変が、位置Ｄ１９６、Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｇ２３７、Ｔ２３９、Ｒ２９０及びＫ３４１の中から選択される位置と対応する位置における１つ又は複数のアミノ酸の交換であり、さらなる改変が、第１の改変と異なる位置にある、請求項１１又は１２に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  14. さらなるアミノ酸改変が、Ｄ１９６Ｋ、Ｄ１９６Ｒ、Ｄ１９６Ａ、Ｄ１９６Ｙ、Ｄ１９６Ｆ、Ｄ１９６Ｍ、Ｄ１９６Ｗ、Ｄ１９６Ｌ、Ｄ１９６Ｉ、Ｋ１９７Ｙ、Ｋ１９７Ａ、Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｄ、Ｋ１９７Ｌ、Ｋ１９７Ｍ、Ｋ１９７Ｉ、Ｋ１９７Ｖ、Ｋ１９７Ｆ、Ｋ１９７Ｗ、Ｋ１９９Ａ、Ｋ１９９Ｄ、Ｋ１９９Ｅ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｔ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｖ、Ｔ２３９Ａ、Ｒ２９０Ａ、Ｒ２９０Ｅ、Ｒ２９０Ｄ、Ｒ２９０Ｎ、Ｒ２９０Ｑ、Ｒ２９０Ｋ、Ｋ３４１Ｅ、Ｋ３４１Ｒ、Ｋ３４１Ｎ、Ｋ３４１Ｍ、Ｋ３４１Ｄ、及びＫ３４１Ｑの中から選択される、請求項１２に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  15. Ｄ１９６Ｒ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｒ２９０Ｄ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｆ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｌ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｍ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｗ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｆ／Ｋ１９７Ｅ、Ｄ１９６Ｗ／Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｌ／Ｋ３４１Ｑ、Ｇ２３７Ｖ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ、Ｋ１９９Ｅ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｋ３４１Ｑ及びＫ１９６Ｖ／Ｋ１９７Ｅの中から選択される改変を含む、請求項１３に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  16. 第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチド中の２つ以上の改変を含む改変ＦＶＩＩポリペプチドであって、
    ２つ以上のアミノ酸改変が、配列番号３に示すアミノ酸の配列を有するＦＶＩＩポリペプチド中のＤ１９６Ｋ、Ｄ１９６Ｒ、Ｄ１９６Ａ、Ｄ１９６Ｙ、Ｄ１９６Ｆ、Ｄ１９６Ｍ、Ｄ１９６Ｗ、Ｄ１９６Ｌ、Ｄ１９６Ｉ、Ｋ１９７Ｙ、Ｋ１９７Ａ、Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｄ、Ｋ１９７Ｌ、Ｋ１９７Ｍ、Ｋ１９７Ｉ、Ｋ１９７Ｖ、Ｋ１９７Ｆ、Ｋ１９７Ｗ、Ｋ１９９Ａ、Ｋ１９９Ｄ、Ｋ１９９Ｅ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｔ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｖ、Ｔ２３９Ａ、Ｒ２９０Ａ、Ｒ２９０Ｅ、Ｒ２９０Ｄ、Ｒ２９０Ｎ、Ｒ２９０Ｑ、Ｒ２９０Ｋ、Ｋ３４１Ｅ、Ｋ３４１Ｒ、Ｋ３４１Ｎ、Ｋ３４１Ｍ、Ｋ３４１Ｄ、Ｋ３４１Ｑ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＶ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＫ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＲ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＹ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＷ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＭ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＥ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＹ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＡ又はＫ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＳ、又はＦＶＩＩポリペプチド中の対応する残基における前記改変に対応するアミノ酸改変の中から選択される、
    改変ＦＶＩＩポリペプチド、その対立遺伝子及び種変異体又はその活性断片。
  17. ２、３、４、５、６又は７つの改変を含有する、請求項１５に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  18. Ｄ１９６Ｒ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｒ２９０Ｄ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｆ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｌ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｍ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｗ／Ｋ１９７Ｌ、Ｄ１９６Ｆ／Ｋ１９７Ｅ、Ｄ１９６Ｗ／Ｋ１９７Ｅ、Ｄ１９６Ｖ／Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｌ／Ｋ３４１Ｑ、Ｇ２３７Ｖ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ、Ｋ１９９Ｅ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｋ３４１Ｑ及びＫ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ／Ｍ２９８Ｑの中から選択される改変を含む、請求項１５又は１６に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  19. 非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）に対する抵抗性の増大を示す、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  20. ＴＦＰＩに対して（少なくとも約）１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上の抵抗性がある、請求項１９に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  21. 異種Ｇｌａドメイン、又はリン脂質結合を行うのに十分なその部分をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  22. 異種Ｇｌａドメイン、又はリン脂質結合を行うのに十分なその部分を含む改変第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）ポリペプチド。
  23. 十分な部分が、異種Ｇｌａドメインの３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上を含む、請求項２１又は２２に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  24. 異種Ｇｌａドメインが、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第Ｘ因子（ＦＸ）、プロトロンビン、プロテインＣ、プロテインＳ、オステオカルシン、マトリックスＧｌａタンパク質、増殖停止特異的タンパク質６（Ｇａｓ６）又はプロテインＺ中のＧｌａドメインの中から選択される、請求項２１又は２２に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  25. 異種Ｇｌａドメインが、配列番号１１０〜１１８、１２０及び１２１のいずれかに示すアミノ酸の配列、又はリン脂質結合を行うのに十分なその部分を有する、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  26. 天然ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインの全部又は連続した部分が除去され、異種Ｇｌａドメイン、又はリン脂質結合を行うのに十分なその部分と交換されている、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  27. 天然ＦＶＩＩ Ｇｌａドメインが、配列番号３に示すアミノ酸の配列を有するＦＶＩＩポリペプチド中のアミノ酸１〜４５、又はＦＶＩＩポリペプチド中の対応する残基における前記アミノ酸を含む、請求項２６に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  28. ＧｌａスワップＦＩＸ、ＧｌａスワップＦＸ、ＧｌａスワップＰｒｏｔＣ、ＧｌａスワップＰｒｏｔＳ、Ｇｌａスワップトロンビンの中から選択される改変を含む、請求項２６又は２７に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  29. 非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較してリン脂質の親和性又は結合の増大を示す、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  30. （少なくとも約）１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上のリン脂質の親和性又は結合の増大を示す、請求項２９に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  31. 非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）に対する抵抗性の増大を示すさらなる改変を含有する、請求項２１〜３２のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  32. さらなる改変が、配列番号３に示すアミノ酸の配列を有するＦＶＩＩポリペプチド中のＤ１９６、Ｋ１９７、Ｋ１９９、Ｇ２３７、Ｔ２３９、Ｒ２９０、及びＫ３４１、又はＦＶＩＩポリペプチド中の対応する残基における前記位置の中から選択される位置における１つ又は複数のアミノ酸改変（複数可）である、請求項３１に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  33. １つ又は複数のアミノ酸改変（複数可）が、Ｄ１９６Ｋ、Ｄ１９６Ｒ、Ｄ１９６Ａ、Ｄ１９６Ｙ、Ｄ１９６Ｆ、Ｄ１９６Ｍ、Ｄ１９６Ｗ、Ｄ１９６Ｌ、Ｄ１９６Ｉ、Ｋ１９７Ｙ、Ｋ１９７Ａ、Ｋ１９７Ｅ、Ｋ１９７Ｄ、Ｋ１９７Ｌ、Ｋ１９７Ｍ、Ｋ１９７Ｉ、Ｋ１９７Ｖ、Ｋ１９７Ｆ、Ｋ１９７Ｗ、Ｋ１９９Ａ、Ｋ１９９Ｄ、Ｋ１９９Ｅ、Ｇ２３７Ｗ、Ｇ２３７Ｔ、Ｇ２３７Ｉ、Ｇ２３７Ｖ、Ｔ２３９Ａ、Ｒ２９０Ａ、Ｒ２９０Ｅ、Ｒ２９０Ｄ、Ｒ２９０Ｎ、Ｒ２９０Ｑ、Ｒ２９０Ｋ、Ｋ３４１Ｅ、Ｋ３４１Ｒ、Ｋ３４１Ｎ、Ｋ３４１Ｍ、Ｋ３４１Ｄ、Ｋ３４１Ｑ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＶ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＡＳ、Ｇ２３７Ｔ２３８ｉｎｓＳＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＫ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＲ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＹ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＷ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＡ、Ｄ１９６Ｋ１９７ｉｎｓＭ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＥ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＹ、Ｋ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＡ及びＫ１９７Ｉ１９８ｉｎｓＳの中から選択される、請求項３２に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  34. １つ又は複数のアミノ酸改変（複数可）が、Ｄ１９６Ｒ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｒ２９０Ｄ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｋ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅ、Ｄ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ、及びＤ１９６Ｒ／Ｋ１９７Ｍ／Ｋ１９９Ｅ／Ｒ２９０Ｅの中から選択される、請求項３３に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  35. 配列番号３に示すアミノ酸の配列を有するＦＶＩＩポリペプチド中の位置Ｑ１７６、Ｍ２９８若しくはＥ２９６、又はＦＶＩＩポリペプチド中の対応する残基における前記位置にある１つ又は複数のさらなるアミノ酸改変（複数可）を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  36. アミノ酸改変が、Ｑ１７６Ａ、Ｍ２９８Ｑ、Ｅ２９６Ｖ及びＥ２９６Ａの中から選択される、請求項３３に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  37. Ｖ１５８Ｄ／Ｇ２３７Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｇ２３７Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３４１Ｑ、Ｋ１９７Ｅ／Ｋ１９９Ｅ／Ｇ２３７Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３４１Ｑ、Ｇ２３７Ｖ／Ｍ２９８Ｑ、Ｇ２３７Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３４１Ｑ、Ｍ２９８Ｑ／Ｇｌａ Ｓｗａｐ ＦＩＸ、Ｋ１９７Ｅ／Ｍ２９８Ｑ及びＭ２９８Ｑ／Ｋ３４１Ｄの中から選択されるアミノ酸改変を含む、請求項３６に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  38. アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）に対する抵抗性の増大、リン脂質との結合及び／若しくは親和性の増大、組織因子（ＴＦ）に対する親和性の増大、固有活性の増大、ＴＦ依存性触媒若しくは凝固活性の増大、凝固活性の増大、酵素原性を変化させるポリペプチドの高次構造の変化、高度に活性なＦＶＩＩａ高次構造と活性でないＦＶＩＩａ高次構造との平衡を高度に活性な高次構造に有利に移動させることによる触媒若しくは凝固活性の増大、プロテアーゼに対する抵抗性の増大、グリコシル化の低下、グリコシル化の増大、免疫原性の低減、安定性の増大、並びに／又は化学基連結の容易化を起こす１つ又は複数のさらなるアミノ酸改変（複数可）を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  39. 酵素原性の変化が、より酵素原様の形状又はより酵素原様でない形状をもたらす、請求項３８に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  40. Ｓ２７８Ｃ／Ｖ３０２Ｃ、Ｌ２７９Ｃ／Ｎ３０１Ｃ、Ｖ２８０Ｃ／Ｖ３０１Ｃ、Ｓ２８１Ｃ／Ｖ２９９Ｃ、位置４でのチロシンの挿入、Ｆ４Ｓ、Ｆ４Ｔ、Ｐ１０Ｑ、Ｐ１０Ｅ、Ｐ１０Ｄ、Ｐ１０Ｎ、Ｑ２１Ｎ、Ｒ２８Ｆ、Ｒ２８Ｅ、Ｉ３０Ｃ、１３０Ｄ、Ｉ３０Ｅ、Ｋ３２Ｄ、Ｋ３２Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｋ３２Ｇ、Ｋ３２Ｈ、Ｋ３２Ｔ、Ｋ３２Ｃ、Ｋ３２Ａ、Ｋ３２Ｓ、Ｄ３３Ｃ、Ｄ３３Ｆ、Ｄ３３Ｅ、Ｄ３３Ｋ、Ａ３４Ｃ、Ａ３４Ｅ、Ａ３４Ｄ、Ａ３４Ｉ、Ａ３４Ｌ、Ａ３４Ｍ、Ａ３４Ｖ、Ａ３４Ｆ、Ａ３４Ｗ、Ａ３４Ｙ、Ｒ３６Ｄ、Ｒ３６Ｅ、Ｔ３７Ｃ、Ｔ３７Ｄ、Ｔ３７Ｅ、Ｋ３８Ｃ、Ｋ３８Ｅ、Ｋ３８Ｔ、Ｋ３８Ｄ、Ｋ３８Ｌ、Ｋ３８Ｇ、Ｋ３８Ａ、Ｋ３８Ｓ、Ｋ３８Ｎ、Ｋ３８Ｈ、Ｌ３９Ｅ、Ｌ３９Ｑ、Ｌ３９Ｈ、Ｗ４１Ｎ、Ｗ４１Ｃ、Ｗ４１Ｅ、Ｗ４１Ｄ、Ｉ４２Ｒ、Ｉ４２Ｎ、Ｉ４２Ｓ、Ｉ４２Ａ、Ｉ４２Ｑ、Ｉ４２Ｎ、Ｉ４２Ｓ、Ｉ４２Ａ、Ｉ４２Ｑ、Ｉ４２Ｋ、Ｓ４３Ｑ、Ｓ４３Ｎ、Ｙ４４Ｋ、Ｙ４４Ｃ、Ｙ４４Ｄ、Ｙ４４Ｅ、Ｓ４５Ｃ、Ｓ４５Ｄ、Ｓ４５Ｅ、Ｄ４６Ｃ、Ａ５１Ｎ、Ｓ５３Ｎ、Ｇ５８Ｎ、Ｇ５９Ｓ、Ｇ５９Ｔ、Ｋ６２Ｅ、Ｋ６２Ｒ、Ｋ６２Ｄ、Ｋ６２Ｎ、Ｋ６２Ｑ、Ｋ６２Ｔ、Ｌ６５Ｑ、Ｌ６５Ｓ、Ｌ６５Ｎ、Ｆ７１Ｄ、Ｆ７１Ｙ、Ｆ７１Ｅ、Ｆ７１Ｑ、Ｆ７１Ｎ、Ｐ７４Ｓ、Ｐ７４Ａ、Ａ７５Ｅ、Ａ７５Ｄ、Ｅ７７Ａ、Ｅ８２Ｑ、Ｅ８２Ｎ、Ｅ８２Ｓ、Ｅ８２Ｔ Ｔ８３Ｋ、Ｎ９５Ｓ、Ｎ９５Ｔ、Ｇ９７Ｓ、Ｇ９７Ｔ、Ｙ１０１Ｎ、Ｄ１０４Ｎ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１０９Ｎ、Ｅ１１６Ｄ、Ｇ１１７Ｎ、Ｇ１２４Ｎ、Ｓ１２６Ｎ、Ｔ１２８Ｎ、Ｌ１４１Ｃ、Ｌ１４１Ｄ、Ｌ１４１Ｅ、Ｅ１４２Ｄ、Ｅ１４２Ｃ、Ｋ１４３Ｃ、Ｋ１４３Ｄ、Ｋ１４３Ｅ、Ｒ１４４Ｅ、Ｒ１４４Ｃ、Ｒ１４４Ｄ、Ｎ１４５Ｙ、Ｎ１４５Ｇ、Ｎ１４５Ｆ、Ｎ１４５Ｍ、Ｎ１４５Ｓ、Ｎ１４５Ｉ、Ｎ１４５Ｌ、Ｎ１４５Ｔ、Ｎ１４５Ｖ、Ｎ１４５Ｐ、Ｎ１４５Ｋ、Ｎ１４５Ｈ、Ｎ１４５Ｑ、Ｎ１４５Ｅ、Ｎ１４５Ｒ、Ｎ１４５Ｗ、Ｎ１４５Ｄ、Ｎ１４５Ｃ、Ｋ１５７Ｖ、Ｋ１５７Ｌ、Ｋ１５７Ｉ、Ｋ１５７Ｍ、Ｋ１５７Ｆ、Ｋ１５７Ｗ、Ｋ１５７Ｐ、Ｋ１５７Ｇ、Ｋ１５７Ｓ、Ｋ１５７Ｔ、Ｋ１５７Ｃ、Ｋ１５７Ｙ、Ｋ１５７Ｎ、Ｋ１５７Ｅ、Ｋ１５７Ｒ、Ｋ１５７Ｈ、Ｋ１５７Ｄ、Ｋ１５７Ｑ、Ｖ１５８Ｌ、Ｖ１５８Ｉ、Ｖ１５８Ｍ、Ｖ１５８Ｆ、Ｖ１５８Ｗ、Ｖ１５８Ｐ、Ｖ１５８Ｇ、Ｖ１５８Ｓ、Ｖ１５８Ｔ、Ｖ１５８Ｃ、Ｖ１５８Ｙ、Ｖ１５８Ｎ、Ｖ１５８Ｅ、Ｖ１５８Ｒ、Ｖ１５８Ｋ、Ｖ１５８Ｈ、Ｖ１５８Ｄ、Ｖ１５８Ｑ、Ａ１７５Ｓ、Ａ１７５Ｔ、Ｇ１７９Ｎ、Ｉ１８６Ｓ、Ｉ１８６Ｔ、Ｖ１８８Ｎ、Ｒ２０２Ｓ、Ｒ２０２Ｔ、Ｉ２０５Ｓ、Ｉ２０５Ｔ、Ｄ２１２Ｎ、Ｅ２２０Ｎ、Ｉ２３０Ｎ、Ｐ２３１Ｎ、Ｐ２３６Ｎ、Ｇ２３７Ｎ、Ｑ２５０Ｃ、Ｖ２５３Ｎ、Ｅ２６５Ｎ、Ｔ２６７Ｎ、Ｅ２７０Ｎ、Ａ２７４Ｍ、Ａ２７４Ｌ、Ａ２７４Ｋ、Ａ２７４Ｒ、Ａ２７４Ｄ、Ａ２７４Ｖ、Ａ２７４Ｉ、Ａ２７４Ｆ、Ａ２７４Ｗ、Ａ２７４Ｐ、Ａ２７４Ｇ、Ａ２７４Ｔ、Ａ２７４Ｃ、Ａ２７４Ｙ、Ａ２７４Ｎ、Ａ２７４Ｅ、Ａ２７４Ｈ、Ａ２７４Ｓ、Ａ２７４Ｑ、Ｆ２７５Ｈ、Ｒ２７７Ｎ、Ｆ２７８Ｓ、Ｆ２７８Ａ．Ｆ２７８Ｎ、Ｆ２７８Ｑ、Ｆ２７８Ｇ、Ｌ２８０Ｎ、Ｌ２８８Ｋ、Ｌ２８８Ｃ、Ｌ２８８Ｄ、Ｄ２８９Ｃ、Ｄ２８９Ｋ、Ｌ２８８Ｅ、Ｒ２９０Ｃ、Ｒ２９０Ｇ、Ｒ２９０Ａ、Ｒ２９０Ｓ、Ｒ２９０Ｔ、Ｒ２９０Ｋ、Ｒ２９０Ｄ、Ｒ２９０Ｅ、Ｇ２９１Ｅ、Ｇ２９１Ｄ、Ｇ２９１Ｃ、Ｇ２９１Ｎ、Ｇ２９１Ｋ、Ａ２９２Ｃ、Ａ２９２Ｋ、Ａ２９２Ｄ、Ａ２９２Ｅ、Ｔ２９３Ｋ、Ｅ２９６Ｖ、Ｅ２９６Ｌ、Ｅ２９６Ｉ、Ｅ２９６Ｍ、Ｅ２９６Ｆ、Ｅ２９６Ｗ、Ｅ２９６Ｐ、Ｅ２９６Ｇ、Ｅ２９６Ｓ、Ｅ２９６Ｔ、Ｅ２９６Ｃ、Ｅ２９６Ｙ、Ｅ２９６Ｎ、Ｅ２９６Ｋ、Ｅ２９６Ｒ、Ｅ２９６Ｈ、Ｅ２９６Ｄ、Ｅ２９６Ｑ、Ｍ２９８Ｑ、Ｍ２９８Ｖ、Ｍ２９８Ｌ、Ｍ２９８Ｉ、Ｍ２９８Ｆ、Ｍ２９８Ｗ、Ｍ２９８Ｐ、Ｍ２９８Ｇ、Ｍ２９８Ｓ、Ｍ２９８Ｔ、Ｍ２９８Ｃ、Ｍ２９８Ｙ、Ｍ２９８Ｎ、Ｍ２９８Ｋ、Ｍ２９８Ｒ、Ｍ２９８Ｈ、Ｍ２９８Ｅ、Ｍ２９８Ｄ、Ｐ３０３Ｓ、Ｐ３０３ＳＴ、Ｒ３０４Ｙ、Ｒ３０４Ｆ、Ｒ３０４Ｌ、Ｒ３０４Ｍ、Ｒ３０４Ｇ、Ｒ３０４Ｔ、Ｒ３０４Ａ、Ｒ３０４Ｓ、Ｒ３０４Ｎ、Ｌ３０５Ｖ、Ｌ３０５Ｙ、Ｌ３０５Ｉ、Ｌ３０５Ｆ、Ｌ３０５Ａ、Ｌ３０５Ｍ、Ｌ３０５Ｗ、Ｌ３０５Ｐ、Ｌ３０５Ｇ、Ｌ３０５Ｓ、Ｌ３０５Ｔ、Ｌ３０５Ｃ、Ｌ３０５Ｎ、Ｌ３０５Ｅ、Ｌ３０５Ｋ、Ｌ３０５Ｒ、Ｌ３０５Ｈ、Ｌ３０５Ｄ、Ｌ３０５Ｑ、Ｍ３０６Ｄ、Ｍ３０６Ｎ、Ｄ３０９Ｓ、Ｄ３０９Ｔ、Ｑ３１２Ｎ、Ｑ３１３Ｋ、Ｑ３１３Ｄ、Ｑ３１３Ｅ、Ｓ３１４Ａ、Ｓ３１４Ｖ、Ｓ３１４Ｉ、Ｓ３１４Ｍ、Ｓ３１４Ｆ、Ｓ３１４Ｗ、Ｓ３１４Ｐ、Ｓ３１４Ｇ、Ｓ３１４Ｌ、Ｓ３１４Ｔ、Ｓ３１４Ｃ、Ｓ３１４Ｙ、Ｓ３１４Ｎ、Ｓ３１４Ｅ、Ｓ３１４Ｋ、Ｓ３１４Ｒ、Ｓ３１４Ｈ、Ｓ３１４Ｄ、Ｓ３１４Ｑ、Ｒ３１５Ｋ、Ｒ３１５Ｇ、Ｒ３１５Ａ、Ｒ３１５Ｓ、Ｒ３１５Ｔ、Ｒ３１５Ｑ、Ｒ３１５Ｃ、Ｒ３１５Ｄ、Ｒ３１５Ｅ、Ｋ３１６Ｄ、Ｋ３１６Ｃ、Ｋ３１６Ｅ、Ｖ３１７Ｃ、Ｖ３１７Ｋ、Ｖ３１７Ｄ、Ｖ３１７Ｅ、Ｇ３１８Ｎ、Ｎ３２２Ｙ、Ｎ３２２Ｇ、Ｎ３２２Ｆ、Ｎ３２２Ｍ、Ｎ３２２Ｓ、Ｎ３２２Ｉ、Ｎ３２２Ｌ、Ｎ３２２Ｔ、Ｎ３２２Ｖ、Ｎ３２２Ｐ、Ｎ３２２Ｋ、Ｎ３２２Ｈ、Ｎ３２２Ｑ、Ｎ３２２Ｅ、Ｎ３２２Ｒ、Ｎ３２２Ｗ、Ｎ３２２Ｃ、Ｇ３３１Ｎ、Ｙ３３２Ｓ、Ｙ３３２Ａ、Ｙ３３２Ｎ、Ｙ３３２Ｑ、Ｙ３３２Ｇ、Ｄ３３４Ｇ、Ｄ３３４Ｅ、Ｄ３３４Ａ、Ｄ３３４Ｖ、Ｄ３３４Ｉ、Ｄ３３４Ｍ、Ｄ３３４Ｆ、Ｄ３３４Ｗ、Ｄ３３４Ｐ、Ｄ３３４Ｌ、Ｄ３３４Ｔ、Ｄ３３４Ｃ、Ｄ３３４Ｙ、Ｄ３３４Ｎ、Ｄ３３４Ｋ、Ｄ３３４Ｒ、Ｄ３３４Ｈ、Ｄ３３４Ｓ、Ｄ３３４Ｑ、Ｓ３３６Ｇ、Ｓ３３６Ｅ、Ｓ３３６Ａ、Ｓ３３６Ｖ、Ｓ３３６Ｉ、Ｓ３３６Ｍ、Ｓ３３６Ｆ、Ｓ３３６Ｗ、Ｓ３３６Ｐ、Ｓ３３６Ｌ、Ｓ３３６Ｔ、Ｓ３３６Ｃ、Ｓ３３６Ｙ、Ｓ３３６Ｎ、Ｓ３３６Ｋ、Ｓ３３６Ｒ、Ｓ３３６Ｈ、Ｓ３３６Ｄ、Ｓ３３６Ｑ、Ｋ３３７Ｌ、Ｋ３３７Ｖ、Ｋ３３７Ｉ、Ｋ３３７Ｍ、Ｋ３３７Ｆ、Ｋ３３７Ｗ、Ｋ３３７Ｐ、Ｋ３３７Ｇ、Ｋ３３７Ｓ、Ｋ３３７Ｔ、Ｋ３３７Ｃ、Ｋ３３７Ｙ、Ｋ３３７Ｎ、Ｋ３３７Ｅ、Ｋ３３７Ｒ、Ｋ３３７Ｈ、Ｋ３３７Ｄ、Ｋ３３７Ｑ、Ｋ３４１Ｅ、Ｋ３４１Ｑ、Ｋ３４１Ｇ、Ｋ３４１Ｔ、Ｋ３４１Ａ、Ｋ３４１Ｓ、Ｇ３４２Ｎ、Ｈ３４８Ｎ、Ｒ３５３Ｎ、Ｙ３５７Ｎ、Ｉ３６１Ｎ、Ｆ３７４Ｐ、Ｆ３７４Ａ、Ｆ３７４Ｖ、Ｆ３７４Ｉ、Ｆ３７４Ｌ、Ｆ３７４Ｍ、Ｆ３７４Ｗ、Ｆ３７４Ｇ、Ｆ３７４Ｓ、Ｆ３７４Ｔ、Ｆ３７４Ｃ、Ｆ３７４Ｙ、Ｆ３７４Ｎ、Ｆ３７４Ｅ、Ｆ３７４Ｋ、Ｆ３７４Ｒ、Ｆ３７４Ｈ、Ｆ３７４Ｄ、Ｆ３７４Ｑ、Ｖ３７６Ｎ、Ｒ３７９Ｎ、Ｌ３９０Ｃ、Ｌ３９０Ｋ、Ｌ３９０Ｄ、Ｌ３９０Ｅ、Ｍ３９１Ｄ、Ｍ３９１Ｃ、Ｍ３９１Ｋ、Ｍ３９１Ｎ、Ｍ３９１Ｅ、Ｒ３９２Ｃ、Ｒ３９２Ｄ、Ｒ３９２Ｅ、Ｓ３９３Ｄ、Ｓ３９３Ｃ、Ｓ３９３Ｋ、Ｓ３９３Ｅ、Ｅ３９４Ｋ、Ｐ３９５Ｋ、Ｅ３９４Ｃ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９５Ｃ、Ｐ３９５Ｅ、Ｒ３９６Ｋ、Ｒ３９６Ｃ、Ｒ３９６Ｄ、Ｒ３９６Ｅ、Ｐ３９７Ｄ、Ｐ３９７Ｋ、Ｐ３９７Ｃ、Ｐ３９７Ｅ、Ｇ３９８Ｋ、Ｇ３９８Ｃ、Ｇ３９８Ｄ、Ｇ３９８Ｅ、Ｖ３９９Ｃ、Ｖ３９９Ｄ、Ｖ３９９Ｋ、Ｖ３９９Ｅ、Ｌ４００Ｋ、Ｌ４０１Ｋ、Ｌ４０１Ｃ、Ｌ４０１Ｄ、Ｌ４０１Ｅ、Ｒ４０２Ｄ、Ｒ４０２Ｃ、Ｒ４０２Ｋ、Ｒ４０２Ｅ、Ａ４０３Ｋ、Ａ４０３Ｃ、Ａ４０３Ｄ、Ａ４０３Ｅ、Ｐ４０４Ｅ、Ｐ４０４Ｄ、Ｐ４０４Ｃ、Ｐ４０４Ｋ、Ｆ４０５Ｋ、Ｐ４０６Ｃ、Ｋ３２Ｎ／Ａ３４Ｓ、Ｋ３２Ｎ／Ａ３４Ｔ、Ｆ３１Ｎ／Ｄ３３Ｓ、Ｆ３１Ｎ／Ｄ３３Ｔ、Ｉ３０Ｎ／Ｋ３２Ｓ、Ｉ３０Ｎ／Ｋ３２Ｔ、Ａ３４Ｎ／Ｒ３６Ｓ、Ａ３４Ｎ／Ｒ３６Ｔ、Ｋ３８Ｎ／Ｆ４０Ｓ、Ｋ３８Ｎ／Ｆ４０Ｔ、Ｔ３７Ｎ／Ｌ３９Ｓ、Ｔ３７Ｎ／Ｌ３９Ｔ、Ｒ３６Ｎ／Ｋ３８Ｓ、Ｒ３６Ｎ／Ｋ３８Ｔ、Ｌ３９Ｎ／Ｗ４１Ｓ、Ｌ３９Ｎ／Ｗ４１Ｔ、Ｆ４０Ｎ／Ｉ４２Ｓ、Ｆ４０Ｎ／Ｉ４２Ｔ、Ｉ４２Ｎ／Ｙ４４Ｓ、Ｉ４２Ｎ／Ｙ４４Ｔ、Ｙ４４Ｎ／Ｄ４６Ｓ、Ｙ４４Ｎ／Ｄ４６Ｔ、Ｄ４６Ｎ／Ｄ４８Ｓ、Ｄ４６Ｎ／Ｄ４８Ｔ、Ｇ４７Ｎ／Ｑ４９Ｓ、Ｇ４７Ｎ／Ｑ４９Ｔ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｓ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ、Ｅ１４２Ｎ／Ｒ１４４Ｓ、Ｅ１４２Ｎ／Ｒ１４４Ｔ、Ｌ１４１Ｎ／Ｋ１４３Ｓ、Ｌ１４１Ｎ／Ｋ１４３Ｔ、Ｉ１４０Ｎ／Ｅ１４２Ｓ／、Ｉ１４０Ｎ／Ｅ１４２Ｔ、Ｒ１４４Ｎ／Ａ１４６Ｓ、Ｒ１４４Ｎ／Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｎ／Ｋ１４８Ｓ、Ａ１４６Ｎ／Ｋ１４８Ｔ、Ｓ１４７Ｎ／Ｐ１４９Ｓ／、Ｓ１４７Ｎ／Ｐ１４９Ｔ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｓ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ、Ｄ２８９Ｎ／Ｇ２９１Ｓ、Ｄ２８９Ｎ／Ｇ２９１Ｔ、Ｌ２８８Ｎ／Ｒ２９０Ｓ、Ｌ２８８Ｎ／Ｒ２９０Ｔ、Ｌ２８７Ｎ／Ｄ２８９Ｓ、Ｌ２８７Ｎ／Ｄ２８９、Ａ２９２Ｎ／Ａ２９４Ｓ、Ａ２９２Ｎ／Ａ２９４Ｔ、Ｔ２９３Ｎ／Ｌ２９５Ｓ、Ｔ２９３Ｎ／Ｌ２９５Ｔ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｓ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ、Ｓ３１４Ｎ／Ｋ３１６Ｓ、Ｓ３１４Ｎ／Ｋ３１６Ｔ、Ｑ３１３Ｎ／Ｒ３１５Ｓ、Ｑ３１３Ｎ／Ｒ３１５Ｔ、Ｋ３１６Ｎ／Ｇ３１８Ｓ、Ｋ３１６Ｎ／Ｇ３１８Ｔ、Ｖ３１７Ｎ／Ｄ３１９Ｓ、Ｖ３１７Ｎ／Ｄ３１９Ｔ、Ｋ３４１Ｎ／Ｄ３４３Ｓ、Ｋ３４１Ｎ／Ｄ３４３Ｔ、Ｓ３３９Ｎ／Ｋ３４１Ｓ、Ｓ３３９Ｎ／Ｋ３４１Ｔ、Ｄ３４３Ｎ／Ｇ３４５Ｓ、Ｄ３４３Ｎ／Ｇ３４５Ｔ、Ｒ３９２Ｎ／Ｅ３９４Ｓ、Ｒ３９２Ｎ／Ｅ３９４Ｔ、Ｌ３９０Ｎ／Ｒ３９２Ｓ、Ｌ３９０Ｎ／Ｒ３９２Ｔ、Ｋ３８９Ｎ／Ｍ３９１Ｓ、Ｋ３８９Ｎ／Ｍ３９１Ｔ、Ｓ３９３Ｎ／Ｐ３９５Ｓ、Ｓ３９３Ｎ／Ｐ３９５Ｔ、Ｅ３９４Ｎ／Ｒ３９６Ｓ、Ｅ３９４Ｎ／Ｒ３９６Ｔ、Ｐ３９５Ｎ／Ｐ３９７Ｓ、Ｐ３９５Ｎ／Ｐ３９７Ｔ、Ｒ３９６Ｎ／Ｇ３９８Ｓ、Ｒ３９６Ｎ／Ｇ３９８Ｔ、Ｐ３９７Ｎ／Ｖ３９９Ｓ、Ｐ３９７Ｎ／Ｖ３９９Ｔ、Ｇ３９８Ｎ／Ｌ４００Ｓ、Ｇ３９８Ｎ／Ｌ４００Ｔ、Ｖ３９９Ｎ／Ｌ４０１Ｓ、Ｖ３９９Ｎ／Ｌ４０１Ｔ、Ｌ４００Ｎ／Ｒ４０２Ｓ、Ｌ４００Ｎ／Ｒ４０２Ｔ、Ｌ４０１Ｎ／Ａ４０３Ｓ、Ｌ４０１Ｎ／Ａ４０３Ｔ、Ｒ４０２Ｎ／Ｐ４０４Ｓ、Ｒ４０２Ｎ／Ｐ４０４Ｔ、Ａ４０３Ｎ／Ｆ４０５Ｓ、Ａ４０３Ｎ／Ｆ４０５Ｔ、Ｐ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｓ及びＰ４０４Ｎ／Ｐ４０６Ｔの中から選択される１つ又は複数のさらなるアミノ酸改変（複数可）を含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  41. 位置３００〜３２２、３０５〜３２２、３００〜３１２、若しくは３０５〜３１２と、トリプシン、トロンビン若しくはＦＸの対応するアミノ酸の置換、又は位置３１０〜３２９、３１１〜３２２若しくは２３３〜３２９と、トリプシンの対応するアミノ酸の置換を含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  42. 非改変ＦＶＩＩポリペプチドが、配列番号３に示すアミノ酸の配列を有する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  43. 配列番号１８〜４３、１２５〜１４６及び２０６〜２５０のいずれかに示すアミノ酸の配列を有する、請求項４０に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  44. 非改変ＦＶＩＩポリペプチドが、配列番号３に示すポリペプチドの対立遺伝子又は種変異体である、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  45. 対立遺伝子又は種変異体が、アミノ酸改変（複数可）を除外して、配列番号３に示すポリペプチドと４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する、請求項４４に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  46. ヒトポリペプチドである、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  47. 非ヒトポリペプチドである、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  48. 活性又は成熟ポリペプチドである、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  49. 一次配列だけが改変されている、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  50. 化学修飾又は翻訳後修飾をさらに含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  51. ＦＶＩＩポリペプチドが、グリコシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、硫酸化、リン酸化、アルブミン化され、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分とコンジュゲートしている、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  52. 単一鎖ポリペプチドである、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  53. 二本鎖ポリペプチドである、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  54. 活性であり、又は活性化されている、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  55. 活性化が、自己活性化によるタンパク質分解性切断、第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）による切断、第Ｘ因子（ＦＸａ）による切断、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩａ）による切断、又はトロンビンによる切断によって行われる、請求項５４に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  56. 非改変ＦＶＩＩポリペプチドの１つ又は複数の活性を保持する、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  57. 非改変ＦＶＩＩポリペプチドの少なくとも１つのＦＶＩＩ活性を保持する限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０又は６０個のアミノ酸の位置における改変を含む、請求項１〜５５のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  58. 非改変ＦＶＩＩポリペプチドの活性の（少なくとも約）１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上を保持する、請求項５６又は５７に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  59. １つ又は複数の活性が、組織因子（ＴＦ）結合、第Ｘ因子（ＦＸ）活性化、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）活性化、リン脂質結合、及び凝固活性の中から選択される、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  60. 保持されている活性が、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して増大している、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  61. 保持されている活性が、非改変ＦＶＩＩポリペプチドと比較して低下している、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  62. 凝固活性が増大している、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
  63. 活性が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで測定される、請求項５６〜６２のいずれか一項に記載の改変ポリペプチド。
  64. 請求項１〜６３のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含む核酸分子。
  65. 請求項６４に記載の核酸分子を含むベクター。
  66. 原核生物ベクター、ウイルスベクター、又は真核生物ベクターである、請求項６５に記載のベクター。
  67. 哺乳動物ベクターである、請求項６５又は６６に記載のベクター。
  68. ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、及びサイトメガロウイルスの中から選択される、請求項６６に記載のベクター。
  69. 請求項６５〜６８のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
  70. 真核細胞である、請求項６９に記載の細胞。
  71. 真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項７０に記載の細胞。
  72. 哺乳動物細胞が、仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１）又は２９３細胞又はＣＨＯ細胞の中から選択される、請求項７１に記載の細胞。
  73. 改変ＦＶＩＩポリペプチドを発現する、請求項６９〜７２のいずれか一項に記載の細胞。
  74. 酵母細胞である、請求項６９に記載の細胞。
  75. ピキア属種細胞である、請求項７４に記載の細胞。
  76. ピキア・パストリス細胞である、請求項７５に記載の細胞。
  77. 請求項７１〜７６のいずれか一項に記載の細胞によって産生された改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  78. 薬学的に許容される媒体中に、治療に有効な濃度又は量の請求項１〜６３及び７７のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド、又は請求項６４に記載の核酸分子又は請求項６５〜６８のいずれか一項に記載のベクター又は請求項６９〜７６のいずれか一項に記載の細胞を含む医薬組成物。
  79. 局部、全身、又は局所投与用に製剤される、請求項７８に記載の医薬組成物。
  80. 経口、経鼻、肺、口腔、経皮、皮下、十二指腸内、経腸、非経口、静脈内、又は筋内投与用に製剤される、請求項７８又は７９に記載の医薬組成物。
  81. 制御放出用に製剤される、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  82. 単回投与用に製剤される、請求項７８〜８１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  83. 請求項７８〜８２のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することにより対象を治療することを含む方法であって、対象が、ＦＶＩＩ又は凝固促進物質の投与により治療される疾患又は状態を有する方法。
  84. 疾患又は状態が、酵素原又は活性型のＦＶＩＩの投与によって治療される、請求項８３に記載の方法。
  85. 医薬組成物での治療が、疾患又は状態に伴う症状を改善又は緩和する、請求項８３又は８４に記載の方法。
  86. ＦＶＩＩの投与又は他の凝固促進療法により治療される疾患又は状態に伴う症状の変化について対象をモニターすることをさらに含む、請求項８３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 治療する疾患又は状態が、血液凝固障害、血液系障害、出血性障害、血友病、第ＶＩＩ因子欠損、出血障害、手術による出血、又は外傷から生じる出血の中から選択される、請求項８３〜８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 血友病が、血友病Ａ又は血友病Ｂ又は血友病Ｃである、請求項８７に記載の方法。
  89. 血友病が先天性である、請求項８８に記載の方法。
  90. 血友病が後天性である、請求項８８に記載の方法。
  91. 疾患又は状態が、手術又は外傷による出血性合併症に起因する、請求項８３〜８７のいずれか一項に記載の方法。
  92. 出血が、急性関節血症、慢性血友病性関節症、血腫、血尿、中枢神経系出血、胃腸出血、又は脳溢血として現れる、請求項９１に記載の方法。
  93. 出血が抜歯に起因する、請求項９１に記載の方法。
  94. 手術が、心臓手術、血管形成術、肺手術、腹部手術、脊髄手術、脳手術、血管手術、歯科手術、又は臓器移植手術である、請求項９１に記載の方法。
  95. 移植手術が、骨髄、心臓、肺、膵臓、及び肝臓の移植の中から選択される、請求項９４に記載の方法。
  96. 対象が、第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子に対する自己抗体を有する、請求項８３〜９５のいずれか一項に記載の方法。
  97. １つ又は複数のさらなる凝固因子を投与することをさらに含む、請求項８３〜９６のいずれか一項に記載の方法。
  98. １つ又は複数のさらなる凝固因子が、血漿精製又は組換え凝固因子、ビタミンＫ、ビタミンＫ誘導体やプロテインＣ阻害因子などの凝固促進物質、血漿、血小板、赤血球及びコルチコステロイドの中から選択される、請求項９７に記載の方法。
  99. ＦＶＩＩ又は凝固促進物質の投与により治療される疾患又は状態を治療する際に使用する、請求項１〜６３及び７７のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド。
  100. ＦＶＩＩ又は凝固促進物質の投与により治療される疾患又は状態を治療するための医薬品の調製における、請求項７８〜８２のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
  101. 疾患又は状態が、酵素原又は活性型のＦＶＩＩの投与によって治療される、請求項９９に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド又は請求項１００に記載の使用。
  102. 医薬組成物での治療が、疾患又は状態に伴う症状を改善又は緩和する、請求項９９若しくは１０１に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド又は請求項１００若しくは１０１に記載の使用。
  103. ＦＶＩＩの投与又は他の凝固促進療法により治療される疾患又は状態に伴う症状の変化について対象をモニターすることをさらに含む、請求項９９、１０１若しくは１０２のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド又は請求項１００〜１０２のいずれか一項に記載の使用。
  104. 治療する疾患又は状態が、血液凝固障害、血液系障害、出血性障害、血友病、第ＶＩＩ因子欠損、出血障害、手術による出血、又は外傷から生じる出血の中から選択される、請求項９９及び１０１〜１０３のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド又は請求項１００〜１０３のいずれか一項に記載の使用。
  105. 血友病が、血友病Ａ又は血友病Ｂ又は血友病Ｃである、請求項１０４に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド又は使用。
  106. 血友病が先天性である、請求項１０５に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド又は使用。
  107. 血友病が後天性である、請求項１０５に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド又は使用。
  108. 疾患又は状態が、手術又は外傷による出血性合併症に起因する、請求項１０４に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド又は使用。
  109. 出血が、急性関節血症、慢性血友病性関節症、血腫、血尿、中枢神経系出血、胃腸出血、又は脳溢血として現れる、請求項１０４に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド又は使用。
  110. 出血が抜歯に起因する、請求項１０８に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド又は使用。
  111. 手術が、心臓手術、血管形成術、肺手術、腹部手術、脊髄手術、脳手術、血管手術、歯科手術、又は臓器移植手術である、請求項１０８に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド又は使用。
  112. 移植手術が、骨髄、心臓、肺、膵臓、及び肝臓の移植の中から選択される、請求項１１１に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド又は使用。
  113. 対象が、第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子に対する自己抗体を有する、請求項９９及び１０１〜１１２のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド又は請求項１００〜１１２のいずれか一項に記載の使用。
  114. １つ又は複数のさらなる凝固因子を投与することをさらに含む、請求項９９及び１０１〜１１２のいずれか一項に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド又は請求項１００〜１１３のいずれか一項に記載の使用。
  115. １つ又は複数のさらなる凝固因子が、血漿精製又は組換え凝固因子、ビタミンＫ、ビタミンＫ誘導体やプロテインＣ阻害因子などの凝固促進物質、血漿、血小板、赤血球及びコルチコステロイドの中から選択される、請求項１１４に記載の改変ＦＶＩＩポリペプチド又は使用。
  116. パッケージング材料及びパッケージング材料に入った請求項７８〜８２のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む製品。
  117. 改変ＦＶＩＩポリペプチドが、ＦＶＩＩが媒介する疾患又は状態の治療に有効であり、パッケージング材料が、ＦＶＩＩが媒介する疾患又は状態の治療に改変ＦＶＩＩポリペプチドが使用されることを示すラベルを含む、
    請求項１１６に記載の製品。
  118. 請求項７８〜８２のいずれか一項に記載の医薬組成物、組成物を投与するためのデバイス、及び任意選択で投与についての説明書を含むキット。
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