EA028865B1

EA028865B1 - Модифицированные полипептиды фактора х и их применение

Info

Publication number: EA028865B1
Application number: EA201500172A
Authority: EA
Inventors: Эдвин Л. Мэдисон; Кристофер Тсанос
Original assignee: Каталист Биосайенсиз, Инк.
Priority date: 2012-07-25
Filing date: 2013-03-15
Publication date: 2018-01-31
Also published as: NZ703148A; IL236449B; EA201500172A1; AU2013293573B2; CA2879785C; HK1210790A1; CN104755492A; US9856467B2; IN2015DN01404A; US9145552B2; ES2704083T3; US20140030247A1; AU2013293573A1; JP6363600B2; SG11201500579SA; EP2877487A1; KR20160073937A; WO2014018120A1; MX2015001083A; KR102049900B1

Abstract

Предусмотрены модифицированные терапевтические белки. В частности, предусмотрены модифицированные полипептиды фактора X, которые включают зимоген фактора X, фактор Ха и другие формы фактора X, и их применение.

Description

Область техники

Предшествующий уровень техники

Гемостаз представляет собой сложный физиологический процесс, который приводит к прекращению кровотечения. Тромбоциты, белки плазмы и кровеносные сосуды, а также эндотелиальные клетки являются тремя составляющими этого процесса, каждое из них играет важную роль в событиях, которые непосредственно следуют за повреждением тканей и при нормальных обстоятельствах приводят к быстрому образованию сгустка. Центральное место занимает каскад свертывания, ряд протеолитических реакций, в которых определенные белки плазмы (или факторы свертывания крови) последовательно активируются в "каскаде" другими ранее активированными факторами свертывания крови, что приводит к быстрому образованию тромбина. Большие количества образованного в этом каскаде тромбина далее расщепляют фибриноген до фибриновых пептидов, необходимых для образования сгустка. Фактор X (ΡX) был предложен в качестве терапевтического агента для лечения нарушений свертываемости крови и имеет преимущества по сравнению с другими терапевтическими факторами свертывания крови, поскольку играет центральную роль в каскаде свертывания. Современные способы лечения с помощью ΡX основаны на терапевтическом применении неактивированного зимогена, потому что, как полагают, такой подход является более безопасным. Существует потребность в улучшенных или альтернативных лекарственных средствах ΡX.

Сущность изобретения

В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды или варианты полипептидов фактора X (ΡX), которые имеют измененные свойства или активность по сравнению с немодифицированным полипептидом ΡX, такие как увеличенная зависимость от кофактора (РУа), увеличенный период полужизни, увеличенная устойчивость к ингибиторам (например, к антитромбину III) и/или измененное гликозилирование. Предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РX могут обладать некоторыми или всеми из указанных выше свойств или активностей. Модифицированные полипептиды РX могут представлять собой их зрелые, зимогенные, активные или активированные или каталитически активные формы.

Например, в настоящем документе предусмотрен модифицированный полипептид РX, который содержит аминокислотную замену в немодифицированном полипептиде РX, например активная форма РX (РXа) модифицированного полипептида РX обладает увеличенной по меньшей мере в 2 раза, в 10 раз, в 20 раз, в 30 раз, в 40 раз и обычно по меньшей мере в 50 раз зависимостью от кофактора РУа по сравнению с полипептидом РXа, который является таким же, как модифицированный полипептид РX, но не содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены). Немодифицированный полипептид РX имеет последовательность аминокислот, приведенную в 8ЕЦ ГО N0: 134, или представляет собой ее зимогенную, активную или каталитически активную форму, или имеет последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 75% идентичность последовательности с 8ЕЦ ГО N0: 134 или ее зимогенной, активной или каталитически активной формой. В одном из примеров немодифицированный полипептид РX может представлять собой полипептид зимоген РX, который имеет легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139 в 8ЕЦ ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 143-448 в 8ЕЦ ГО N0: 134, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с полипептидом зимогена РX, который имеет легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139 в 8ЕЦ ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 143-448 в 8ЕЦ ГО N0: 134. В другом примере немодифицированный полипептид РX представляет собой активный полипептид РX (РXа), который имеет легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139 в 8ЕЦ ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как ос- 1 028865

татки 195-448 в 8ЕО ГО N0: 134, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с РХа, который имеет легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139 в 8Е0 ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 195-448 в 8Е0 ГО N0: 134. В другом примере немодифицированный полипептид РХа представляет собой каталитически активную форму активного РХа, описанного выше. Любой немодифицированный полипептид РХ может иметь, по меньшей мере 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94%, 95, 96, 97, 98, 99% или большую идентичность последовательности с 8Е0 ГО N0: 134 или ее зимогенной, активной или каталитически активной формой.

В конкретных примерах модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных выше и в настоящем документе, зрелая или зимогенная форма модифицированного полипептида РХ не содержит гетерологичный активационный пептид из другой сериновой протеазы. В других примерах в настоящем документе зрелая или зимогенная форма модифицированного полипептида РХ не содержит модифицированный активационный пептид. В дополнительных примерах в настоящем документе форма РХа модифицированного полипептида РХ, или ее каталитически активная часть, не получены из полипептида зимогена РХ, содержащего гетерологичный активационный пептид из другой сериновой протеазы или модифицированный активационный пептид. Модифицированные полипептиды РХ могут быть выделены или, по существу, очищены или очищены.

Также предусмотрены в настоящем документе модифицированные активные полипептиды фактора Х (РХа), содержащие аминокислотную замену в немодифицированном полипептиде РХ, где активная форма РХ (РХа) модифицированного полипептида РХ обладает увеличенной зависимостью от кофактора, например увеличенной по меньшей мере в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 30 раз, в 40 раз и обычно по меньшей мере в 50 раз зависимостью от кофактора РУа по сравнению с полипептидом РХа, который является таким же, как модифицированный полипептид РХ, но не содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены). Модифицированный РХа обычно не содержит активационный пептид. Немодифицированный полипептид РХ может представлять собой активный полипептид РХ (РХа), содержащий последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с РХа, который имеет легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139 в 8Е0 ГО N0: 134, и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 195-448 в 8Е0 ГО N0: 134, или представляет собой его каталитически активную форму.

В любом из примеров модифицированных полипептидов РХ или выделенных модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе, которые обладают увеличенной зависимостью от кофактора, зависимость от кофактора может быть увеличена по меньшей мере в 75 раз, в 100 раз, в 125 раз, в 150 раз, в 200 раз, в 250 раз, в 300 раз, в 350 раз, в 400 раз, в 450 раз, в 500 раз, в 600 раз, в 700 раз, в 800 раз, в 900 раз, в 1000 раз, в 2000 раз или больше по сравнению с немодифицированным полипептидом.

Такие модифицированные полипептиды РХ или выделенные модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, включают полипептиды, в которых нативный аминокислотный остаток в положении 196 со ссылкой на положения аминокислот, указанные в 8ЕО ГО N0:134, или остаток, который соответствует аминокислотному остатку 196 в немодифицированном полипептиде РХ, заменен на остаток нейтральной полярной аминокислоты. Например, нейтральная полярная аминокислота выбрана из аспарагина (И), глутамина (О), серина (8), треонина (Т), триптофана (А), цистеина (С) и тирозина (Υ) и обычно представляет собой серин (8) или треонин (Т). Соответствующие аминокислотные остатки (т.е. аминокислотные остатки, которые соответствуют положению 196 в полипептиде РХ, отличном от того, который приведен в 8ЕО ГО N0: 4) идентифицируют путем выравнивания немодифицированного полипептида РХ с полипептидом 8ЕО ГО N0: 134. Это проиллюстрировано на фиг. 3. Например, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, которые содержат аминокислотную замену на 8 в положении, соответствующем положению 196, или аминокислотную замену на Т в положении, соответствующем положению 196, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в 8ЕО ГО N0: 134, или такую же аминокислотную замену соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ, который не включает 8 или Т в положении, соответствующем положению 196. В конкретных примерах модифицированный полипептид РХ содержит аминокислотную замену на 8 в положении, соответствующем положению 196, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в 8Е0 ГО N0: 134, или такую же замену соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ, который не включает 8 в положении, соответствующем 196.

В любом из примеров модифицированных полипептидов РХ или выделенных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе или описанных выше, полипептид может содержать дополнительную аминокислотную замену (аминокислотные замены) в легкой цепи или в протеазном домене тяжелой цепи. В других примерах, аминокислотная замена, описанная выше, в положении 196 является единственной модификацией в полипептиде. Таким образом, предусмотренные в настоящем документе модифицированный полипептид РХ или выделенный модифицированный полипептид РХ может содержать только одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать,

- 2 028865

тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать или двадцать аминокислотных замен по сравнению с немодифицированным полипептидом той же самой формы, например немодифицированным полипептидом, который имеет последовательность аминокислот, приведенную в 5>ЕО ГО N0: 134, или его зимогенной, активной или каталитически активной формой.

В любом из примеров в настоящем документе дополнительная аминокислотная замена (аминокислотные замены) не соответстуют замене на изолейцин (I), аланин (А), валин (V), серин (δ) или треонин (Т) в положении, соответствующем положению 195 или 197, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в 5>Е0 ГО N0: 134, или такой же замене соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ. Дополнительная аминокислотная замена (аминокислотные замены) может приводить к изменению гликозилирования, увеличению устойчивости к ингибитору и/или увеличению каталитической активности, или обеспечивать изменение гликозилирования, увеличение устойчивости к ингибитору и/или увеличение каталитической активности, или вызывать изменение гликозилирования, увеличение устойчивости к ингибитору и/или увеличение каталитической активности.

Например, увеличенная устойчивость к ингибитору может представлять собой увеличенную устойчивость к антитромбину III (ΑΤΙΙΙ).

В конкретных примерах в настоящем документе любой из модифицированных полипептидов РХ или выделенных модифицированных полипептидов РХ, описанных в настоящем документе или выше, может иметь аминокислотную замену (аминокислотные замены) в аминокислотном положении, соответствующем положению, выбранному из 211, 214, 216, 218, 219, 273, 276, 306, 326, 332, 338, 420 и 424, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в 5>Е0 ГО N0: 134, где соответствующие аминокислотные положения идентифицируют путем выравнивания немодифицированного полипептида РХ с полипептидом, приведенным в 5>Е0 ГО N0: 134. Например, аминокислотная замена (аминокислотные замены) может представлять собой аминокислотную замену (аминокислотные замены) на δ в положении, соответствующем положению 211; Ό в положении, соответствующем положению 214; А в положении, соответствующем положению 214; δ в положении, соответствующем положению 214; К в положении, соответствующем положению 216; К в положении, соответствующем положению 216; А в положении, соответствующем положению 216; δ в положении, соответствующем положению 216; К в положении, соответствующем положению 218; К в положении, соответствующем положению 218; А в положении, соответствующем положению 218; Н в положении, соответствующем положению 219; А в положении, соответствующем положению 273; Е в положении, соответствующем положению 273; А в положении, соответствующем положению 276; Е в положении, соответствующем положению 276; Е в положении, соответствующем положению 306; δ в положении, соответствующем положению 326; Τ в положении, соответствующем положению 326; V в положении, соответствующем положению 326; О в положении, соответствующем положению 326; N в положении, соответствующем положению 326; М в положении, соответствующем положению 326; К в положении, соответствующем положению 326; Υ в положении, соответствующем положению 326; Е в положении, соответствующем положению 326; Ό в положении, соответствующем положению 326; А в положении, соответствующем положению 332; Ό в положении, соответствующем положению 332; Е в положении, соответствующем положению 332; δ в положении, соответствующем положению 332; С в положении, соответствующем положению 332; А в положении, соответствующем положению 338; δ в положении, соответствующем положению 338; N в положении, соответствующем положению 338; К в положении, соответствующем положению 338; V в положении, соответствующем положению 338; Υ в положении, соответствующем положению 338; М в положении, соответствующем положению 338; А в положении, соответствующем положению 420; Е в положении, соответствующем положению 420; А в положении, соответствующем положению 424; или Е в положении, соответствующем положению 424, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δΡρ ГО N0: 134, или такую же аминокислотную замену (аминокислотные замены) соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ.

Например, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ или выделенные модифицированные полипептиды РХ, в том числе любые модифицированные полипептиды РХ или выделенные модифицированные полипептиды РХ, описанные выше, включают полипептиды РХ, содержащие аминокислотную замену (аминокислотные замены) на δ в положении, соответствующем положению 196, δ в положении, соответствующем положению 211, и Н в положении, соответствующем

положению 219; δ в положении, соответствующем положению 196, и Ό в положении, соответствующем

положению 214; δ в положении, соответствующем положению 196, и А в положении, соответствующем

положению 214; δ в положении, соответствующем положению 196, и δ в положении, соответствующем

положению 214; δ в положении, соответствующем положению 196, и К в положении, соответствующем

положению 216; δ в положении, соответствующем положению 196, и К в положении, соответствующем

положению 216; δ в положении, соответствующем положению 196, и А в положении, соответствующем

положению 216; δ в положении, соответствующем положению 196, и δ в положении, соответствующем

положению 218; δ в положении, соответствующем положению 196, и К в положении, соответствующем

положению 218; δ в положении, соответствующем положению 196, и А в положении, соответствующем

3 028865

положению 218; δ в положении, соответствующем положению 196, и Е в положении, соответствующем

положению 273; δ в положении, соответствующем положению 196, и А в положении, соответствующем

положению 276; δ в положении, соответствующем положению 196, и Е в положении, соответствующем

положению 306; δ в положении, соответствующем положению 196, и Е в положении, соответствующем

положению 326; δ в положении, соответствующем положению 196, и Ό в положении, соответствующем

положению 326; δ в положении, соответствующем положению 196, и М в положении, соответствующем

положению 326; δ в положении, соответствующем положению 196, и N в положении, соответствующем

положению 326; δ в положении, соответствующем положению 196, и Р в положении, соответствующем

положению 326; δ в положении, соответствующем положению 196, и А в положении, соответствующем

положению 332; δ в положении, соответствующем положению 196, и Ό в положении, соответствующем

положению 332; δ в положении, соответствующем положению 196, и Е в положении, соответствующем

положению 332; δ в положении, соответствующем положению 196, и δ в положении, соответствующем

положению 332; δ в положении, соответствующем положению 196, и С в положении, соответствующем

положению 332; δ в положении, соответствующем положению 196, и А в положении, соответствующем

положению 338; δ в положении, соответствующем положению 196, и δ в положении, соответствующем

положению 338; δ в положении, соответствующем положению 196, и А в положении, соответствующем

положению 420; δ в положении, соответствующем положению 196, и Е в положении, соответствующем

положению 420; δ в положении, соответствующем положению 196, и А в положении, соответствующем

положению 424; δ в положении, соответствующем положению 196, и Е в положении, соответствующем

положению 424; или δ в положении, соответствующем положению 196, Е в положении, соответствующем положению 420, и Е в положении, соответствующем положению 424, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δερ ГО N0: 134, или такую же аминокислотную замену соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ, или такую же аминокислотную замену (такие же аминокислотные замены) соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ.

В любых предусмотренных в настоящем документе модифицированных полипептидах РХ или выделенных модифицированных полипептидах РХ, в том числе в любых модифицированных полипептидах РХ или выделенных модифицированных полипептидах РХ, описанных выше, модифицированный полипептид РХ может содержать аминокислотную замену (аминокислотные замены), которая изменяет гликозилирование за счет введения не нативного сайта гликозилирования. Например, не нативный сайт гликозилирования может быть введен за счет аминокислотной замены (аминокислотных замен) на N в положении, соответствующем положению 51; N в положении, соответствующем положению 56, и δ в положении, соответствующем положению 58; N в положении, соответствующем положению 62, и δ в положении, соответствующем положению 64; N в положении, соответствующем положению 65, и δ в положении, соответствующем положению 67; N в положении, соответствующем положению 67; N в положении, соответствующем положению 73, и δ в положении, соответствующем положению 75; N в положении, соответствующем положению 75, и δ в положении, соответствующем положению 77; N в положении, соответствующем положению 77, и δ в положении, соответствующем положению 79; N в положении, соответствующем положению 78, и δ в положении, соответствующем положению 80; δ в положении, соответствующем положению 82; N в положении, соответствующем положению 83; N в положении, соответствующем положению 82, и δ в положении, соответствующем положению 84; N в положении, соответствующем положению 85, и δ в положении, соответствующем положению 87; N в положении, соответствующем положению 86, и δ в положении, соответствующем положению 88; N в положении, соответствующем положению 95, и δ в положении, соответствующем положению 97; N в положении, соответствующем положению 114; N в положении, соответствующем положению 119, и δ в положении, соответствующем положению 121; δ в положении, соответствующем положению 122; N в положении, соответствующем положению 215, и δ в положении, соответствующем положению 217; N в положении, соответствующем положению 243, и δ в положении, соответствующем положению 245; N в положении, соответствующем положению 264, и δ в положении, соответствующем положению 266; N в положении, соответствующем положению 293, и δ в положении, соответствующем положению 295; N в положении, соответствующем положению 388; N в положении, соответствующем положению 389, и δ в положении, соответствующем положению 391; N в положении, соответствующем положению 428, и δ в положении, соответствующем положению 430; или N в положении, соответствующем положению 429, и δ в положении, соответствующем положению 431, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δερ ГО N0: 134, или такой же аминокислотной замены (аминокислотных замен) соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ.

Например, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ или выделенные модифицированные полипептиды РХ, в том числе любые модифицированные полипептиды РХ или выделенные модифицированные полипептиды РХ, описанные выше, включают модифицированные полипептиды РХ, содержащие аминокислотную замену (аминокислотные замены) на δ в положении,

- 4 028865

соответствующем положению 196, и N в положении, соответствующем положению 51; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 56, и δ в положении, соответствующем положению 58; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 58, и δ в положении, соответствующем положению 60; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 62, и δ в положении, соответствующем положению 64; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 65, и δ в положении, соответствующем положению 67; δ в положении, соответствующем положению 196, и N в положении, соответствующем положению 67; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 73, и δ в положении, соответствующем положению 75; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 75, и δ в положении, соответствующем положению 77; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 77, и δ в положении, соответствующем положению 79; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 78, и δ в положении, соответствующем положению 80; δ в положении, соответствующем положению 196, и δ в положении, соответствующем положению 82; δ в положении, соответствующем положению 196, и N в положении, соответствующем положению 83; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 82, и δ в положении, соответствующем положению 84; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 85, и δ в положении, соответствующем положению 87; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 86, и δ в положении, соответствующем положению 88; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 95, и δ в положении, соответствующем положению 97; δ в положении, соответствующем положению 196, и N в положении, соответствующем положению 114; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 114, δ в положении, соответствующем положению 211, и Н в положении, соответствующем положению 219; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 119, и δ в положении, соответствующем положению 121; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 114, N в положении, соответствующем положению 119, и δ в положении, соответствующем положению 121; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 114, N в положении, соответствующем положению 119, δ в положении, соответствующем положению 121, δ в положении, соответствующем положению 211, и Н в положении, соответствующем положению 219; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 119, δ в положении, соответствующем положению 121, δ в положении, соответствующем положению 211, и Н в положении, соответствующем положению 219; δ в положении, соответствующем положению 196, и δ в положении, соответствующем положению 122; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 215, и δ в положении, соответствующем положению 217; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 243, и δ в положении, соответствующем положению 245; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 264, и δ в положении, соответствующем положению 266; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 119, δ в положении, соответствующем положению 121, N в положении, соответствующем положению 264, и δ в положении, соответствующем положению 266; δ в положении, соответствующем положению 196, δ в положении, соответствующем положению 211, Н в положении, соответствующем положению 219, N в положении, соответствующем положению 264, и δ в положении, соответствующем положению 266; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 119, δ в положении, соответствующем положению 121, δ в положении, соответствующем положению 211, Н в положении, соответствующем положению 219, N в положении, соответствующем положению 264, и δ в положении, соответствующем положению 266; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 114, N в положении, соответствующем положению 264, и δ в положении, соответствующем положению 266; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 114, δ в положении, соответствующем положению 211, Н в положении, соответствующем положению 219, N в положении, соответствующем положению 264, и δ в положении, соответствующем положению 266; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 264, δ в положении, соответствующем положению 266, и N в положении, соответствующем положению 388; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 293, и δ в положении, соответствующем положению 295; δ в положении, соответствующем положению 196, и N в положении, соответствующем положению 388; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 119, δ в положении, соответствующем положению 121, и N в положении, соответствующем положению 388; δ в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 114, δ в положении, соответствующем положению 211, Н в положении, соответствующем положению 219, и N в положении, соответствующем положению 388; δ в положении,

- 5 028865

соответствующем положению 196, 8 в положении, соответствующем положению 211, Н в положении,

соответствующем положению 219, N в положении, соответствующем положению 264, 8 в положении,

соответствующем положению 266, и N в положении, соответствующем положению 388; 8 в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 119, 8 в положении,

соответствующем положению 121, 8 в положении, соответствующем положению 211, Н в положении,

соответствующем положению 219, и N в положении, соответствующем положению 388; 8 в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 389, и 8 в положении, соответствующем положению 391; 8 в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 428, и 8 в положении, соответствующем положению 430; или 8 в положении, соответствующем положению 196, N в положении, соответствующем положению 429, и 8 в положении, соответствующем положению 431, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в 8ЕО ГО N0: 134, или такую же аминокислотную замену (аминокислотные замены) соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ.

В одном из примеров в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ или выделенные модифицированные полипептиды РХ, которые содержат последовательность аминокислот, приведенную в любой из 8Е0 ГО N08: 137-157, 169, 205-208, 214-243 и 246-265, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с любой из последовательностей аминокислот, приведенных в любой из 8Е0 ГО N08: 137-157, 169, 205-208, 214243 и 246-265, и которые содержат аминокислотную замену (аминокислотные замены). В другом примере в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ или выделенные модифицированные полипептиды РХ, которые содержат последовательность аминокислот, содержащую легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139, и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 143-448 в любой из 8Е0 ГО N08: 137-157, 169, 205-208, 214-243 и 246-265, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с любой из последовательностей аминокислот, содержащей легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139, и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 143-448 в любой из 8Е0 ГО N08: 137-157, 169, 205-208, 214-243 и 246-265, и которая содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены). В другом примере в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ или выделенные модифицированные полипептиды РХ, которые содержат последовательность аминокислот, содержащую легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139, и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 195-448 в любой из 8Е0 ГО N08: 137-157, 169, 205-208, 214-243 и 246-265, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с любой из последовательностей аминокислот, содержащей легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139, и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 195-448 в любой из 8Е0 ГО N08: 137-157, 169, 205-208, 214-243 и 246265, и которая содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены). В дополнительном примере, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ или выделенные модифицированные полипептиды РХ или выделенные модифицированные полипептиды РХ, которые содержат каталитически активную форму любой из указанных выше форм, которая включает модификацию (модификации) и обладает каталитической активностью.

В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды фактора Х (РХ), содержащие аминокислотную замену нативного аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ, который представляет собой остаток 198, 202, 211, 214, 217, 219, 327 и/или 338 со ссылкой на положения аминокислот, указанные в 8Е0 ГО N0: 134, или остатка, который соответствует аминокислотному остатку 198, 202, 211, 214, 217, 219, 327 и/или 338, где модифицированный полипептид РХ обладает РУа-зависимой каталитической активностью. В таких примерах соответствующие аминокислотные остатки идентифицируют путем выравнивания немодифицированного полипептида РХ с полипептидом 8Е0 ГО N0: 134, например, как проиллюстрировано на фиг. 3. Немодифицированный полипептид РХ имеет последовательность аминокислот, приведенную в 8Е0 ГО N0: 134, или представляет собой его зимогенную, активную или каталитически активную форму, или имеет последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 75% идентичность последовательности с 8Е0 ГО N0: 134 или его зимогенной, активной или каталитически активной формой. В одном из примеров немодифицированный полипептид РХ может представлять собой полипептид зимоген РХ, который имеет легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139 из 8Е0 ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 143-448 из 8Е0 ГО N0: 134, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с полипептидом зимогеном РХ, который имеет легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139 из 8Е0 ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 143-448 в 8Е0 ГО N0: 134. В другом примере немодифицированный полипептид РХ представляет собой активный полипептид РХ (РХа), ко- 6 028865

торый имеет легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1139 из δΕΟ ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 195-448 из δΕΟ ГО N0: 134, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с РХа, который имеет легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139 из δΕΟ ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 195-448 из δΕΟ ГО N0: 134. В другом примере немодифицированный полипептид РХа представляет собой каталитически активную форму активного РХа, описанного выше. Любой немодифицированный полипептид РХ может иметь по меньшей мере 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую идентичность последовательности с 8Е0 ГО N0: 134 или ее зимогенной, активной или каталитически активной формой. Такие модифицированные полипептиды РХ могут быть выделены или, по существу, очищены. Например, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ содержат аминокислотную замену (аминокислотные замены) на δ в положении, соответствующем положению 202; δ в положении, соответствующем положению 211; Ό в положении, соответствующем положению 214; А в

положении, соответствующем положению 214; δ в положении, соответствующем положению 214; δ в

положении, соответствующем положению 217; Н в положении, соответствующем положению 219; А в

положении, соответствующем положению 327; Ь в положении, соответствующем положению 327; А в

положении, соответствующем положению 338; δ в положении, соответствующем положению 338; N в

положении, соответствующем положению 338; К в положении, соответствующем положению 338; V в

положении, соответствующем положению 338; Υ в положении, соответствующем положению 338 и М в положении, соответствующем положению 338, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δΕΟ ГО N0: 134, или такую же аминокислотную замену (аминокислотные замены) соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ.

В конкретных примерах модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе, модифицированный полипептид РХ содержит аминокислотные замены на δ в положении, соответствующем положению 211, и на Н в положении, соответствующем положению 219, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δΕΟ ГО N0:134, или такие же замены соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ. Например, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ включают такие модифицированные полипептиды РХ, которые содержат аминокислотную замену (аминокислотные замены) на: δ в положении, соответствующем положению 196, δ в положении, соответствующем положению 211, и Н в положении, соответствующем положению 219; А в положении, соответствующем положению 197, δ в положении, соответствующем положению 214, и Н в положении, соответствующем положению 219; или на Ь в положении, соответствующем положению 195, δ в положении, соответствующем положению 211, и Н в положении, соответствующем положению 219, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δΕΟ ГО N0: 134, или такие же замены соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ.

В других примерах модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе, модифицированный полипептид РХ содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены) на А в положении, соответствующем положению 327, и на А в положении, соответствующем положению 338; или аминокислотную замену (аминокислотные замены) на Ь в положении, соответствующем положению 327, и на М в положении, соответствующем положению 338, где каждая замена приведена со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δΕΟ ГО N0: 134, или такие же замены соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ. Например, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, содержащие аминокислотную замену (аминокислотные замены) на V в положении, соответствующем положению 200, Ь в положении, соответствующем положению 327, и М в положении, соответствующем положению 338; или аминокислотную замену (аминокислотные замены) на V в положении, соответствующем положению 200, Ь в положении, соответствующем положению 327, А в положении, соответствующем положению 334, и М в положении, соответствующем положению 338.

В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды фактора Х (РХ), содержащие аминокислотную замену в немодифицированном полипептиде РХ, которая представляет собой замену на δ в положении, соответствующем положению 197; А в положении, соответствующем положению 200; V в положении, соответствующем положению 200; δ в положении, соответствующем положению 326; Т в положении, соответствующем положению 326; V в положении, соответствующем положению 326; N в положении, соответствующем положению 326, М в положении, соответствующем положению 326; К в положении, соответствующем положению 326; Υ в положении, соответствующем положению 326; А в положении, соответствующем положению 327; Ь в положении, соответствующем положению 327; А в положении, соответствующем положению 334; Т в положении, соответствующем положению 334; N в положении, соответствующем положению 334; Ε в положении, соответствующем положению 336; А в положении, соответствующем положению 338; δ в положении, соответствующем положению 338; N в положении, соответствующем положению 338; К в положении, соответствующем положе- 7 028865

нию 338; V в положении, соответствующем положению 338; Υ в положении, соответствующем положению 338; и/или М в положении, соответствующем положению 338, где каждая замена приведена со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δΕΟ ГО N0: 134, или такие же замены соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ, где модифицированный полипептид РХ обладает Ρνα-зависимой каталитической активностью. В таких примерах соответствующие остатки идентифицируют путем выравнивания немодифицированного полипептида РХ с полипептидом из 8Е0 ГО N0: 134, например, как проиллюстрировано на фиг. 3. Немодифицированный полипептид РХ имеет последовательность аминокислот, приведенную в δΕΟ ГО N0: 134, или представляет собой его зимогенную, активную, каталитически активную форму, или имеет последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 75% идентичность последовательности с δΕΟ ГО N0: 134 или ее зимогенной, активной, каталитически активной формой. В одном из примеров немодифицированный полипептид РХ может представлять собой полипептид зимоген РХ, который имеет легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139 из δΕΟ ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 143-448 из δΕΟ ГО N0: 134, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с полипептидом зимогеном РХ, который имеет легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139 из δΕΟ ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 143-448 из δΕΟ ГО N0: 134. В другом примере немодифицированный полипептид РХ представляет собой активный полипептид РХ (РХа), который имеет легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139 из 8Е0 ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 195-448 из 8Е0 ГО N0: 134, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с РХа, который имеет легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139 из δΕΟ ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 195-448 из δΕΟ ГО N0: 134. В другом примере немодифицированный полипептид РХа представляет собой каталитически активную форму активного РХа, описанного выше. Любой немодифицированный полипептид РХ может иметь по меньшей мере 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую идентичность последовательности с 8Е0 ГО N0: 134 или ее зимогенной, активной, каталитически активной формой. Такие модифицированные полипептиды РХ могут быть выделены или, по существу, очищены.

В таких примерах модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе, модифицированный полипептид РХ также может содержать аминокислотную замену (аминокислотные замены) на δ в положении, соответствующем положению 196,1 в положении, соответствующем положению 196; Ь в положении, соответствующем положению 196; Т в положении, соответствующем положению 196; А в положении, соответствующем положению 326, и/или О в положении, соответствующем положению 326.

Предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ, в том числе любые модифицированные полипептиды РХ, которые обладают РVа-зависимой каталитической активностью, могут содержать аминокислотную замену (аминокислотные замены), которые изменяют гликозилирование за счет введения не нативного сайта гликозилирования. Например, не нативный сайт гликозилирования может быть введен за счет аминокислотной замены (аминокислотных замен) на N в положении, соответствующем положению 51; N в положении, соответствующем положению 56, и δ в положении, соответствующем положению 58; N в положении, соответствующем положению 62, и δ в положении, соответствующем положению 64; N в положении, соответствующем положению 65, и δ в положении, соответствующем положению 67; N в положении, соответствующем положению 67; N в положении, соответствующем положению 73, и δ в положении, соответствующем положению 75; N в положении, соответствующем положению 75, и δ в положении, соответствующем положению 77; N в положении, соответствующем положению 77, и δ в положении, соответствующем положению 79; N в положении, соответствующем положению 78, и δ в положении, соответствующем положению 80; δ в положении, соответствующем положению 82; N в положении, соответствующем положению 83; N в положении, соответствующем положению 82, и δ в положении, соответствующем положению 84; N в положении, соответствующем положению 85, и δ в положении, соответствующем положению 87; N в положении, соответствующем положению 86, и δ в положении, соответствующем положению 88; N в положении, соответствующем положению 95, и δ в положении, соответствующем положению 97; N в положении, соответствующем положению 114; N в положении, соответствующем положению 119, и δ в положении, соответствующем положению 121; δ в положении, соответствующем положению 122; N в положении, соответствующем положению 215, и δ в положении, соответствующем положению 217; N в положении, соответствующем положению 243, и δ в положении, соответствующем положению 245; N в положении, соответствующем положению 264, и δ в положении, соответствующем положению 266; N в положении, соответствующем положению 293, и δ в положении, соответствующем положению 295; N в положении, соответствующем положению 388; N в положении, соответствующем положению 389, и δ в положении, соответствующем положению 391; N в положении, соответствующем положению 428, и δ в положении,

- 8 028865

соответствующем положению 430; или N в положении, соответствующем положению 429, и δ в положении, соответствующем положению 431, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δΕφ ГО N0: 134, или за счет такой же аминокислотной замены (аминокислотных замен) соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ.

Например, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, содержащие аминокислотную замену (аминокислотные замены) на N в положении, соответствующем положению 119, δ в положении, соответствующем положению 121, δ в положении, соответствующем положению 196, δ в положении, соответствующем положению 211, и Н в положении, соответствующем положению 219; N в положении, соответствующем положению 114, δ в положении, соответствующем положению 196, δ в положении, соответствующем положению 211, и Н в положении, соответствующем положению 219; N в положении, соответствующем положению 114, N в положении, соответствующем положению 119, δ в положении, соответствующем положению 121, δ в положении, соответствующем положению 196, δ в положении, соответствующем положению 211, и Н в положении, соответствующем положению 219; δ в положении, соответствующем положению 196, δ в положении, соответствующем

положению 211, Н в положении, соответствующем положению 219, N в положении, соответствующем

положению 264, и δ в положении, соответствующем положению 266; N в положении, соответствующем положению 119, δ в положении, соответствующем положению 121, δ в положении, соответствующем

положению 196, δ в положении, соответствующем положению 211, Н в положении, соответствующем

положению 219, N в положении, соответствующем положению 264, и δ в положении, соответствующем положению 266; N в положении, соответствующем положению 114, δ в положении, соответствующем

положению 219, N в положении, соответствующем положению 264, и δ в положении, соответствующем положению 266; N в положении, соответствующем положению 119, δ в положении, соответствующем

положению 121, δ в положении, соответствующем положению 196, δ в положении, соответствующем

положению 211, Н в положении, соответствующем положению 219, и N в положении, соответствующем положению 388; N в положении, соответствующем положению 114, δ в положении, соответствующем

положению 219, и N в положении, соответствующем положению 388; или δ в положении, соответствующем положению 196, δ в положении, соответствующем положению 211, Н в положении, соответствующем положению 219, N в положении, соответствующем положению 264, δ в положении, соответствующем положению 266, и N в положении, соответствующем положению 388.

В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, содержащие аминокислотную замену (аминокислотные замены), которая изменяет гликозилирование за счет введения не нативного сайта гликозилирования, при сохранении или проявлении РУа-зависимой каталитической активности. Например, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, содержащие не нативный сайт гликозилирования, который введен за счет аминокислотной замены (аминокислотных замен) на N в положении, соответствующем положению 51; N в положении, соответствующем положению 56, и δ в положении, соответствующем положению 58; N в положении, соответствующем положению 62, и δ в положении, соответствующем положению 64; N в положении, соответствующем положению 65, и δ в положении, соответствующем положению 67; N в положении, соответствующем положению 67; N в положении, соответствующем положению 73, и δ в положении, соответствующем положению 75; N в положении, соответствующем положению 75, и δ в положении, соответствующем положению 77; N в положении, соответствующем положению 77, и δ в положении, соответствующем положению 79; N в положении, соответствующем положению 78, и δ в положении, соответствующем положению 80; δ в положении, соответствующем положению 82; N в положении, соответствующем положению 83; N в положении, соответствующем положению 82, и δ в положении, соответствующем

положению 84; N в положении, соответствующем положению 85, и δ в положении, соответствующем

положению 87; N в положении, соответствующем положению 86, и δ в положении, соответствующем

положению 88; N в положении, соответствующем положению 95, и δ в положении, соответствующем

положению 97; N в положении, соответствующем положению 114; N в положении, соответствующем положению 119, и δ в положении, соответствующем положению 121; δ в положении, соответствующем положению 122; N в положении, соответствующем положению 215, и δ в положении, соответствующем

положению 217; N в положении, соответствующем положению 243, и δ в положении, соответствующем

положению 245; N в положении, соответствующем положению 264, и δ в положении, соответствующем

положению 266; N в положении, соответствующем положению 293, и δ в положении, соответствующем

положению 295; N в положении, соответствующем положению 388; N в положении, соответствующем положению 389, и δ в положении, соответствующем положению 391; N в положении, соответствующем положению 428, и δ в положении, соответствующем положению 430; или N в положении, соответствующем положению 429, и δ в положении, соответствующем положению 431, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δΕφ ГО N0: 134, или за счет такой же замены (замен) соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ.

Модифицированные полипептиды РХ, в том числе любые выделенные или, по существу, очищен- 9 028865

ные формы, предусмотренные в настоящем документе, включают модифицированные полипептиды РХ, которые содержат только одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать или двадцать аминокислотных замен. В одном из примеров в настоящем документе предусмотрен модифицированный полипептид РХ, который имеет последовательность аминокислот, приведенную в любой из 3ЕО ГО N03: 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 и 263265, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с любой из последовательностей аминокислот, приведенных в любой из 3ЕО ГО N03: 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 и 263-265, и который содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены). В другом примере в настоящем документе предусмотрен модифицированный полипептид РХ, который имеет последовательность аминокислот, содержащую легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 143-448 в любой из 3ЕО ГО N03: 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 и 263-265, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с любой из последовательностей аминокислот, содержащих легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139, и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 143-448 в любой из 3Е0 ГО N03: 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 и 263-265, и которая содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены). В другом примере в настоящем документе предусмотрен модифицированный полипептид РХ, который имеет последовательность аминокислот, содержащую легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139, и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 195-448 в любой из 3Е0 ГО N03: 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 и 263-265, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательность с любой из последовательностей аминокислот, содержащей легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139, и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 195-448 в любой из 3ЕО ГО N03: 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 и 263-265, и которая содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены). В дополнительном примере в настоящем документе предусмотрен модифицированный полипептид РХ, который представляет собой каталитически активную форму любого из указанных выше полипептидов и включает аминокислотную замену (аминокислотные замены) и обладает каталитической активностью.

В любом из примеров, предусмотренных в настоящем документе, модифицированные полипептиды РХ включают такие модифицированные полипептиды РХ, которые в форме РХа или в виде его каталитически активного фрагмента обладают увеличенной зависимостью от кофактора РУа по сравнению с таким же полипептидом РХа, но не содержащим аминокислотную замену (аминокислотные замены). Например, зависимость от кофактора увеличена по меньшей мере в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 6 раз, в 7 раз, в 8 раз, в 9 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 30 раз, в 40 раз, в 50 раз, в 100 раз, в 200 раз, в 300 раз, в 400 раз, в 500 раз, в 600 раз, в 700 раз, в 800 раз, в 900 раз, в 1000 раз, в 1200 раз или в 1500 раз.

В любом из примеров, предусмотренных в настоящем документе, модифицированные полипептиды РХ включают такие модифицированные полипептиды РХ, которые в форме активного РХ (РХа) или в виде его каталитически активного фрагмента обладают увеличенной устойчивостью к ингибитору, такому как антитромбин III (ΑΤ-ΙΙΙ) или ТРР1, по сравнению с таким же полипептидом РХа, но не содержащим аминокислотную замену (аминокислотные замены). Устойчивость к ингибитору увеличена по меньшей мере в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 6 раз, в 7 раз, в 8 раз, в 9 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 30 раз, в 40 раз, в 50 раз, в 60 раз, в 70 раз, в 80 раз, в 90 раз, в 100 раз, в 200 раз, в 300 раз, в 400 раз, в 500 раз, в 600 раз, в 700 раз, в 800 раз, в 900 раз, в 1000 раз, в 1500 раз, в 2000 раз, в 2500 раз, в 3000 раз, в 3500 раз, в 4000 раз, в 4500 раз, в 5000 раз, в 5500 раз или в 6000 раз.

В любом из примеров, предусмотренных в настоящем документе, модифицированные полипептиды РХ включают такие модифицированные полипептиды РХ, которые в форме активного РХ (РХа) или в виде его каталитически активного фрагмента обладают по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190% или большей каталитической активностью по сравнению с таким же РХа, но не содержащим аминокислотную замену (аминокислотные замены). В одном из примеров каталитическая активность представляет собой каталитическую активность в присутствии РУа. В другом примере каталитическая активность представляет собой каталитическую активность в отсутствие РУа.

В любом из примеров модифицированных полипептидов РХ или выделенных модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе, модифицированный полипептид РХ может дополнительно содержать аминокислотную замену на лейцин (Ь) в положении, соответствующем положению 195 со ссылкой на положения аминокислот, указанные в 3ЕО ГО N0: 134, или такую же замену (замены) соответствующего аминокислотного остатка в немодифицированном полипептиде РХ.

В любом из примеров модифицированных полипептидов РХ или выделенных модифицированных

- 10 028865

полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе, модифицированный полипептид может представлять собой человеческий полипептид или может представлять собой не человеческий полипептид. В некоторых примерах модифицированный полипептид РХ представляет собой полипептид зимоген. В других примерах модифицированный полипептид РХ является активным или активированным, например представляет собой модифицированный полипептид РХ, у которого отсутствует активационный пептид в тяжелой цепи или который не содержит активационный пептид в тяжелой цепи. В таких примерах активация может осуществляться за счет протеолитического расщепления комплексом теназы ТР/РУПа или комплексом теназы РУ111а/Р1Ха или активатором РХ из яда гадюки Рассела. В некоторых примерах модифицированный полипептид РХ представляет собой двухцепочечный полипептид. В других примерах модифицированный полипептид РХ представляет собой одноцепочечный полипептид.

В примерах модифицированых полипептидов РХ или выделенных модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе, модифицирована только первичная последовательность. В других примерах любых модифицированых полипептидов РХ или выделенных модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе, полипептид может дополнительно содержать химическую модификацию или посттрансляционную модификацию. Например, модифицированный полипептид РХ гликозилирован, карбоксилирован, гидроксилирован, сульфатирован, фосфорилирован, модифицирован присоединением альбумина (а1Ъитта1:ей) или конъюгирован с фрагментом полиэтиленгликоля (РЕС). В дополнительных примерах модифицированых полипептидов РХ или выделенных модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе, полипептид представляет собой химерный белок или белок слияния.

В настоящем документе предусмотрены молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат последовательность нуклеотидов, кодирующую любые из модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе, в том числе любые описанные выше или в другом месте в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ. Также в настоящем документе предусмотрены векторы, содержащие такие молекулы нуклеиновых кислот. Вектор может представлять собой прокариотический вектор, вирусный вектор или эукариотический вектор. Вектор может представлять собой вектор млекопитающих. В примерах, в которых вектором является вирусный вектор, он может представлять собой вектор на основе аденовируса, аденоассоциированного вируса, ретровируса, вируса герпеса, лентивируса, поксвируса или цитомегаловируса.

Также в настоящем документе предусмотрены выделенные клетки, содержащие любые из указанных выше молекул нуклеиновых кислот или векторов. Клетка может представлять собой эукариотическую клетку, например клетку млекопитающих. Клетка млекопитающих может представлять собой клетки почки детеныша хомяка (ВНК-21) или клетки 293, или клетки СНО. Клетка может экспрессировать модифицированный полипептид РХ. Таким образом, также в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, которые продуцируются клетками, предусмотренными в настоящем документе.

В настоящем документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие любые модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, нуклеиновые кислоты, предусмотренные в настоящем документе, или векторы, предусмотренные в настоящем документе, в фармацевтически приемлемой среде. Фармацевтическая композиция может быть составлена для локального, системного или местного введения. Например, лекарственная форма составлена для перорального, назального, легочного, буккального, трансдермального, подкожного, интрадуоденального, энтерального, парентерального, внутривенного или внутримышечного введения. В некоторых примерах, фармацевтическая композиция может представлять собой композицию, составленную для контролируемого высвобождения. В других примерах, фармацевтические композиции составлены для однократного введения дозы. Предусмотренные в настоящем документе композиции включают любые композиции, в которых модифицированный полипептид РХ, содержащий аминокислотную замену (аминокислотные замены), представляет собой активный РХа и не включает активационный полипептид. Композиции могут представлять собой фармацевтическую композицию.

В настоящем документе предусмотрены способы получения модифицированного активного полипептида фактора Х (РХа) путем а) обеспечения композиции, содержащей модифицированный зимоген РХ, который содержит легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот 1-139, приведенную в 8ЕО ГО N0:134, или последовательность аминокислот, которая обладает, по меньшей мере, 75% идентичностью последовательности с последовательностью аминокислот 1-139 из любой из 8Е0 ГО N08:134, и которая содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены), и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот 143-448 из любой из 8Е0 ГО N08:136-265, или последовательность аминокислот, которая обладает, по меньшей мере, 75% идентичностью последовательности с последовательностью аминокислот 143-448 в любой из 8Е0 ГО N08:136-265, и которая содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены) по сравнению с немодифицированным полипептидом РХ; и Ъ) удаления активационного пептида из полипептида за счет активационного расщепления зимогена, в результате чего образуется модифицированный полипептид РХа. Зимоген РХ, используемый в способах, включает модифицированные зимогены РХ, которые получают экспрессией нуклеиновой кислоты, кодирующей

- 11 028865

полипептид, приведенный в любой из 5ЕО ГО N05: 4-133 или 136-265 и 417-546, или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 75% идентичность последовательности с любой из 5Е0 ГО N05: 4-133 или 136-265 и 417-546, и который содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены) по сравнению с немодифицированным полипептидом РХ. В предусмотренных в настоящем документе способах активационное расщепление путем удаления активационного пептида может быть осуществлено ίη νίνο или ίη νίΐτο. Например, активационное расщепление может быть осуществлено с помощью активатора, выбранного из комплекса теназы ТР/РУ11а или комплекса теназы РУШа/ИХа, или активатора из яда гадюки Рассела. Предусмотренные в настоящем документе способы могут включать стадии удаления активатора из композиции. Способы в настоящем документе также могут включать стадии удаления активационного пептида из композиции.

В настоящем документе предусмотрены способы лечения заболевания или состояния, которое представляет собой нарушение свертываемости крови, путем введения субъекту любых модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе, или любых фармацевтических композиций, предусмотренных в настоящем документе. Используемый в способе модифицированный полипептид РХ может представлять собой зимоген, РХа или его каталитически активную часть, которые содержат аминокислотную замену (аминокислотные замены). В способах, предусмотренных в настоящем документе, лечение полипептидом или фармацевтической композицией облегчает или смягчает симптомы, связанные с заболеванием или состоянием. Предусмотренные в настоящем документе способы также включают мониторинг у субъекта изменений в симптомах, связанных с нарушением свертываемости крови.

В любых предусмотренных в настоящем документе способах лечения нарушения свертываемости крови нарушение свертываемости крови представляет собой врожденное нарушение свертываемости крови или приобретенное нарушение свертываемости крови. Например, нарушение свертываемости крови может представлять собой расстройство, связанное с дефицитом фактора свертывания крови, расстройство, связанное с присутствием приобретенных ингибиторов фактора свертывания крови, гематологическое расстройство, геморрагическое расстройство, болезнь фон Виллебранда, расстройство, которое возникает в результате антикоагулянтной терапии антагонистом витамина К, наследственные нарушения функций тромбоцитов, дефицит витамин К эпоксид-редуктазы С1, дефицит гамма-карбоксилазы, кровотечение, связанное с травмой, повреждением, тромбоз, тромбоцитопению, инсульт, коагулопатию, диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС), синдром Бернара-Сулье, тромбастению Гланцманна или дефицит пула накопления. В примерах, в которых нарушение свертываемости крови связано с дефицитом фактора свертывания крови или с присутствием приобретенных ингибиторов фактора свертывания крови, фактор свертывания крови представляет собой фактор VII, фактор IX, фактор X, фактор XI, фактор V, фактор XII, фактор II или фактор фон Виллебранда. В примерах, в которых нарушение свертываемости крови связано с дефицитом фактора свертывания крови, фактор свертывания крови может представлять собой фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор XI. Например, нарушение свертываемости крови представляет собой гемофилию А, гемофилию В или гемофилию С.

В примерах способов, предусмотренных в настоящем документе, нарушение свертываемости крови, связанное с дефицитом фактора свертывания крови, представляет собой семейный множественный дефицит факторов свертывания крови (ΡΜΡΌ). В примерах в настоящем документе, в которых нарушение свертываемости крови связано с присутствием приобретенных ингибиторов фактора свертывания крови, фактор свертывания крови представляет собой фактор VII, фактор VIII, фактор IX, фактор X, фактор XI и фактор XII. В таких примерах приобретенные ингибиторы представляют собой аутоантитела. Например, нарушение свертываемости крови представляет собой приобретенную гемофилию. В примерах способов в настоящем документе, в которых нарушение свертываемости крови представляет собой наследственное нарушение функций тромбоцитов, оно может представлять собой синдром Чедиака-Хигаши, синдромы Германски-Пудлака, дисфункцию тромбоксана А2, тромбастению Гланцманна и синдром Бернара-Сулье. В других примерах в настоящем документе, в которых расстройство возникает в результате антикоагулянтной терапии антагонистом витамина К, антагонист витамина К может представлять собой гепарин, пентасахарид, варфарин, низкомолекулярные антитромботические агенты и ингибиторы РXа.

В других примерах способов в настоящем документе расстройство представляет собой тромбоз, тромбоцитопению, инсульт и коагулопатию. В следующих примерах способов в настоящем документе нарушение свертываемости крови возникает в результате травмы, хирургического вмешательства или раны. В таких примерах, например, кровотечение проявляется в виде острых гемартрозов, хронической гемофилической артропатии, гематомы, гематурии, кровотечений в центральной нервной системе, желудочно-кишечных кровотечений или внутримозгового кровоизлияния. В других примерах кровотечение связано с удалением зуба. В других примерах в настоящем документе, в которых нарушение свертываемости крови связано с хирургическим вмешательством, хирургическое вмешательство представляет собой хирургическое вмешательство на сердце, ангиопластику, хирургическое вмешательство на легких, органах брюшной полости, хирургическое вмешательство на позвоночнике, хирургическое вмешательство на головном мозге, сосудистую хирургию, стоматологическую хирургию или хирургическое вмеша- 12 028865

тельство по трансплантации органов. Например, хирургическое вмешательство представляет собой трансплантационную хирургию, например трансплантацию костного мозга, сердца, легких, поджелудочной железы или печени.

В настоящем документе в любом из примеров способов лечения нарушения свертываемости крови модифицированный полипептид РX может обладать увеличенным периодом полужизни по сравнению с немодифицированным полипептидом РX. Например, увеличенный период полужизни достигается за счет увеличенной устойчивости к ЛТ-Ш или за счет гипергликозилирования в результате гликозилирования введенных не нативных сайтов гликозилирования.

В настоящем документе в любом из примеров способов лечения нарушения свертываемости крови способ может включать введение одного или нескольких дополнительных факторов свертывания крови. Например, один или несколько дополнительных факторов свертывания крови могут представлять собой очищенные из плазмы или рекомбинантные факторы свертывания крови, прокоагулянты, такие как витамин К, производное витамина К и ингибиторы белка С, плазму, тромбоциты, эритроциты или кортикостероиды.

Также в настоящем документе предусмотрены медицинские применения любых модифицированных полипептидов РX, предусмотренных в настоящем документе. В одном из примеров в настоящем документе предусмотрены любые модифицированные полипептиды РX, предусмотренные в настоящем документе, для применения в лечении нарушения свертываемости крови. В другом примере в настоящем документе предусмотрены применения фармацевтической композиции, содержащей любые модифицированные полипептиды РX, предусмотренные в настоящем документе, для получения лекарственного средства для лечения нарушения свертываемости крови. В медицинских применениях, предусмотренных в настоящем документе, модифицированный полипептид РX представляет собой зимоген, РXа или его каталитически активную форму, которые содержат аминокислотную замену (аминокислотные замены).

В любых применениях или полипептидах для применения, предусмотренных в настоящем документе для лечения нарушения свертываемости крови, нарушение свертываемости крови представляет собой врожденное нарушение свертываемости крови или приобретенное нарушение свертываемости крови. Например, нарушение свертываемости крови может представлять собой расстройство, связанное с дефицитом фактора свертывания крови, расстройство, связанное с присутствием приобретенных ингибиторов фактора свертывания крови, гематологическое расстройство, геморрагическое расстройство, болезнь фон Виллебранда, расстройство, которое возникает в результате антикоагулянтной терапии антагонистом витамина К, наследственные нарушение функций тромбоцитов, дефицит витамин К эпоксид-редуктазы С1, дефицит γ-карбоксилазы, кровотечение, связанное с травмой, повреждением, тромбоз, тромбоцитопению, инсульт, коагулопатию, диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС), синдром Бернара-Сулье, тромбастению Гланцманна или дефицит пула накопления. В примерах, в которых нарушение свертываемости крови связано с дефицитом фактора свертывания крови или с присутствием приобретенных ингибиторов фактора свертывания крови, фактор свертывания крови представляет собой фактор У11, фактор IX, фактор X, фактор XI, фактор У, фактор XII, фактор II или фактор фон Виллебранда. В примерах, в которых нарушение свертываемости крови связано с дефицитом фактора свертывания крови, фактор свертывания крови может представлять собой фактор VII, фактор УШ, фактор IX, фактор XI. Например, нарушение свертываемости крови представляет собой гемофилию А, гемофилию В или гемофилию С.

В некоторых примерах применений или полипептидов для применения, предусмотренных в настоящем документе для лечения нарушения свертываемости крови, если нарушение свертываемости крови связано с дефицитом фактора свертывания крови, то расстройство может представлять собой семейный множественный дефицит факторов свертывания крови (ΡΜΡΌ). В примерах в настоящем документе, в которых нарушение свертываемости крови связано с присутствием приобретенных ингибиторов фактора свертывания крови, фактор свертывания крови представляет собой фактор УП, фактор УШ, фактор IX, фактор X, фактор XI и фактор XII. В таких примерах приобретенные ингибиторы представляют собой аутоантитела. Например, нарушение свертываемости крови представляет собой приобретенную гемофилию. В примерах применений или полипептидов для применения, предусмотренных в настоящем документе, в которых нарушение свертываемости крови представляет собой наследственное нарушение функций тромбоцитов, оно может представлять собой синдром Чедиака-Хигаши, синдромы ГерманскиПудлака, дисфункцию тромбоксана А2, тромбастению Гланцманна и синдром Бернара-Сулье. В других примерах в настоящем документе, в которых расстройство возникает в результате антикоагулянтной терапии антагонистом витамина К, антагонист витамина К может представлять собой гепарин, пентасахарид, варфарин, низкомолекулярные антитромботические агенты и ингибиторы РXа.

В других примерах применений или полипептидов для применений, предусмотренных в настоящем документе для лечения нарушения свертываемости крови, расстройство представляет собой тромбоз, тромбоцитопению, инсульт и коагулопатию. В других примерах нарушение свертываемости крови возникает в результате травмы, хирургического вмешательства или раны. В таких примерах, например, кровотечение проявляется в виде острых гемартрозов, хронической гемофилической артропатии, гематомы, гематурии, кровотечений в центральной нервной системе, желудочно-кишечных кровотечений или внут- 13 028865

римозгового кровоизлияния. В других примерах кровотечение связано с удалением зуба. В других примерах в настоящем документе, в которых нарушение свертываемости крови связано с хирургическим вмешательством, хирургическое вмешательство представляет собой хирургическое вмешательство на сердце, ангиопластику, хирургическое вмешательство на легких, органах брюшной полости, хирургическое вмешательство на позвоночнике, хирургическое вмешательство на головном мозге, сосудистую хирургию, стоматологическую хирургию или хирургическое вмешательство по трансплантации органов. Например, хирургическое вмешательство представляет собой трансплантационную хирургию, например трансплантацию костного мозга, сердца, легких, поджелудочной железы или печени.

В настоящем документе в любом из примеров применений или полипептидов для применений, предусмотренных в настоящем документе для лечения нарушения свертываемости крови, модифицированный полипептид РХ может обладать увеличенным периодом полужизни по сравнению с немодифицированным полипептидом РХ. Например, увеличенный период полужизни достигается за счет увеличенной устойчивости к АТ-ΙΙΙ или за счет гипергликозилирования в результате гликозилирования введенных не нативных сайтов гликозилирования.

В настоящем документе предусмотрено изделие, содержащее упаковочный материал и любую фармацевтическую композицию, содержащую любые модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, содержащуюся в упаковочном материале. В примерах изделий, предусмотренных в настоящем документе, модифицированный полипептид РХ является эффективным для лечения нарушения свертываемости крови, и упаковочный материал включает этикетку, в которой указано, что модифицированный полипептид РХ используется для лечения нарушения свертываемости крови. Также в настоящем документе предусмотрен набор, содержащий любые фармацевтические композиции согласно настоящему документу, устройство для введения композиции и, необязательно, инструкции по введению.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 представляет собой структурное изображение зимогенной формы фактора X, содержащей легкую цепь и тяжелую цепь, связанные дисульфидной связью (адаптировано из Уепка1ек\уаг1и с1 а1., Βίорйу81са1 1оита1 82:1190-1206 (2002)). Аминокислотные остатки, являющиеся мишениями для мутагенеза, выделены серым цветом.

В случае зрелого человеческого зимогена, приведенного в 8Еф ГО N0: 134, легкая цепь состоит из 130 аминокислот (соответствующих остаткам 1-139 из 8Еф ГО N0: 134), и тяжелая цепь состоит из 306 аминокислот (соответствующих остаткам 143-448 из 8Еф ГО N0: 134). Легкая цепь содержит домен, богатый γ-карбоксиглутаминовой кислотой (СЬА) (соответствующий остаткам 1-39 из 8Еф ГО N0: 134), за которым следует короткий гидрофобный участок (соответствующий остаткам 40-45 из 8Еф ГО N0: 134) и два домена, подобных эпидермальному фактору роста (ЕСР): ЕСР1 (соответствующий аминокислотам 46-84 из 8Еф ГО N0: 134) и ЕСР2 (соответствующий аминокислотам 85-128 из 8Еф ГО N0: 134). Тяжелая цепь содержит 52 активационных аминокислотных остатка на аминоконце тяжелой цепи. Тяжелая цепь также содержит каталитический домен, начинающийся с остатка, соответствующего 11е195 из 8Еф ГО N0: 134. Легкая и тяжелая цепи РХ остаются связанными дисульфидной связью между Сук 132 (легкой цепи) и Сук 302 (тяжелой цепи), где нумерация приведена со ссылкой на аминокислотные остатки, приведенные в 8Еф ГО N0: 134.

Активная форма фактора Х (РХа) обладает структурными особенностями зимогенной формы фактора Х, за исключением того, что в тяжелой цепи отсутствует активационный пептид и, таким образом, она содержит только каталитический домен (также называемый химотрипсиноподобным доменом сериновой протеазы; соответствующий остаткам 195-448 из 8Еф ГО N0: 134), начинающийся с нового N конца, соответствующего гидрофобным остаткам Не195-С198 в зрелом факторе Х, приведенном в 8Еф ГО N0: 134. Конформация РХа также отличается от зимогена РХ вследствие образования солевого мостика в пределах каталитического домена между а-ХН₂ группой 11е195 и Акр378, соответствующих остаткам, приведенным в 8Еф ГО N0:134. Образование солевого мостика связано с многочисленными изменениями в структуре каталитического домена, в том числе, с перегруппировками активационных доменов, образованием полости оксианиона, необходимой для катализа, и образованием сайта связывания субстрата (81-84). Также экспонируются остатки из областей экзосайта, которые вносят вклад в расширение субстратной специфичности. Каталитические остатки Шк236, Акр282 и 8ег379 составляют каталитическую триаду активного центра активной протеазы. Конформационное изменение, которое перегруппировывает остатки, также приводит к экспонированию гепаринсвязывающих остатков, которые связываются с гепарином и облегчают узнавание ингибитором АТ-ΙΙΙ.

На фиг. 2 изображен каскад свертывания крови. На фиг. 2А показаны внутренний и внешний пути свертывания крови, приводящие к независимому образованию РХа, и схождение этих путей в общий путь, приводящий к образованию тромбина и фибрина для образования сгустка. Эти пути взаимосвязаны. Фигура изображает порядок молекул, участвующих в активации каскада, в котором зимоген превращается в активированную протеазу путем расщепления одной или нескольких пептидных связей. Активированная протеаза далее служит активирующей протеазой для следующей молекулы зимогена в каска- 14 028865

де, что, в конечном счете, приводит к образованию сгустка. На фигуре показано, что активность РХа регулируется присутствием РУа, необходимого для образования, в конечном счете, тромбина и фибрина (РУа-зависимая активность). РХа сам по себе также может на низком уровне активировать тромбин (РУа-независимая активность). На фиг. 2 А также изображены другие активности РХа, вне каскада свертывания, которые могут осуществляться независимо от РУа. На фиг. 2В изображен тот же путь, но дополнительно изображены регуляторы пути, в том числе антитромбин (АТ-ΙΙΙ), который может ингибировать коагуляцию.

На фиг. 3 изображены примеры выравниваний зрелого человеческого РХ, приведенного в 8ЕО ГО N0: 134, с другими полипептидами РХ. "*" означает, что выравненные остатки являются идентичными, означает, что выравненные остатки не являются идентичными, но являются аналогичными, и полипептиды содержат консервативные аминокислотные остатки в выравненном положении, и "." означает, что выравненные остатки являются аналогичными, и полипептиды содержат полуконсервативные аминокислотные остатки в выравненном положении. Не имеющие ограничительного характера примеры соответствующих положений для аминокислотных замен выделены цветом. Например, на фиг. 3А изображено выравнивание зрелого РХ, приведенного в 8Е0 ГО N0: 134, с РХ белощекого гиббона, приведенным в 8Е0 ГО N0:404. На фиг. 3В изображено выравнивание зрелого РХ, приведенного в 8Е0 ГО N0: 134, с РХ бабуина, приведенным в 8Е0 ГО N0: 405. На фиг. 3С изображено выравнивание зрелого РХ, приведенного в 8Е0 ГО N0:134, с РХ макака-резус, приведенным в 8Е0 ГО N0: 406. На фиг. 3Ό изображено выравнивание зрелого РХ, приведенного в 8Е0 ГО N0:134, с РХ обезьяны прыгун-молох, приведенным в 8Е0 ГО N0:407. На фиг. 3Е изображено выравнивание зрелого РХ, приведенного в 8Е0 ГО N0:134, с РХ слона, приведенным в 8Е0 ГО N0:408. На фиг. 3Р изображено выравнивание зрелого РХ, приведенного в 8Е0 ГО N0:134, с РХ мыши, приведенным в 8Е0 ГО N0:409. На фиг. 30 изображено выравнивание зрелого РХ, приведенного в 8Е0 ГО N0:134, с РХ кролика, приведенным в 8Е0 ГО N0: 410. На фиг. 3Н изображено выравнивание зрелого РХ, приведенного в 8Е0 ГО N0:134, с РХ крысы, приведенным в 8Е0 ГО N0:411. На фиг. 3Ι изображено выравнивание зрелого РХ, приведенного в 8Е0 ГО N0: 134, с РХ собаки, приведенным в 8Е0 ГО N0:412. На фиг. 31 изображено выравнивание зрелого РХ, приведенного в 8Е0 ГО N0:134, с вариантом РХ 1195Б, приведенным в 8Е0 ГО N0:135. На фиг. 3К изображено выравнивание зрелого РХ, приведенного в 8Е0 ГО N0: 134, с вариантом РХ, имеющим активационный пептид (Ар) 152Т, приведенным в виде аминокислотных остатков 41-488 в 8Е0 ГО N0: 549. Подробное описание

Содержание.

A. Определения.

B. Гемостаз и функция фактора Х.

1. Каскад свертывания.

a) Путь свертывания тканевого фактора (внешний).

b) Внутренний путь свертывания.

c) Общий путь.

2. Независимая от фактора У активность.

a) Активация тромбина.

b) Воспаление и пролиферация клеток.

ί) Протеазный рецептор эффекторных клеток-1 (ЕРК-1). ίί) Активируемые протеазами рецепторы (РАК).

3. Ингибиторы фактора Х.

C. Структура и активация фактора Х.

1. Процессинг и структура.

2. Активация.

3. Факторы Х и Ха как биофармацевтические агенты.

Ό. Модифицированные полипептиды фактора Х.

Е. Получение полипептидов фактора Х.

1. Векторы и клетки.

2. Экспрессирующие системы.

a) Прокариотическая экспрессия.

b) Дрожжи.

c) Насекомые и клетки насекомых.

Ф) Клетки млекопитающих.

е) Растения.

2. Очистка.

3. Белки слияния.

4. Модификации полипептидов.

5. Нуклеотидные последовательности.

Р. Оценка активности модифицированного фактора Х.

1. Анализы ίη νίΐτο.

- 15 028865

2. Модели на животных, не относящихся к человеку.

3. Клинические анализы.

О. Лекарственные формы и введение.

1. Лекарственные формы.

a) Дозирование.

b) Дозированные формы.

2. Введение модифицированных полипептидов РХ.

3. Введение нуклеиновых кислот, кодирующих модифицированные полипептиды РХ (генная терапия).

H. Терапевтические применения.

I. Комбинированная терапия.

I. Изделия и наборы.

К. Примеры.

А. Определения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют тот же смысл, как это обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится изобретение. Если не указано иное, все патенты, заявки, опубликованные заявки и публикации, последовательности ОепЬапк, базы данных, веб-сайты и другие опубликованные материалы, упомянутые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме. Если для упоминаемого в настоящем документе термина существует множество определений, предпочтительно приведенное в этом разделе определение. В случае приведения ссылки на ИКЕ или другого подобного идентификатора или адреса понимается, что идентификатор может изменяться и информация в сети Интернет может появляться и исчезать, но аналогичную информацию можно найти в сети Интернет. Подобная ссылка свидетельствует о доступности и широком распространении такой информации.

В настоящем документе термины "путь свертывания" или "каскад свертывания" относятся к серии актов активации, которые приводят к образованию нерастворимого сгустка фибрина. В каскаде или пути свертывания неактивные сериновые протеазы (также называемые зимогенами) превращаются в активные протеазы путем расщепления одной или нескольких пептидных связей, где указанные протеазы затем служат в качестве активирующих протеаз для следующей молекулы зимогена в каскаде. На конечном этапе протеолитического каскада фибриноген протеолитически расщепляется тромбином с образованием фибрина, который затем сшивается в месте повреждения и формирует сгусток.

В настоящем документе термин "гемостаз" относится к остановке кровотечения или притока крови в орган или часть тела. Термин гемостаз может охватывать весь процесс свертывания крови для предотвращения потери крови после повреждения кровеносного сосуда до последующего растворения сгустка после восстановления тканей.

В настоящем документе термины "коагуляция" или "свертывание" относятся к образованию нерастворимых сгустков фибрина или к процессу, посредством которого факторы свертывания крови взаимодействуют в каскаде свертывания, что, в конечном счете, приводит к образованию нерастворимых сгустков фибрина.

В настоящем документе "протеаза" представляет собой фермент, который катализирует гидролиз ковалентной пептидной связи. Этот термин включает зимогенную форму и активированные одноцепочечную, двухцепочечную форму и состоящую из множества цепей форму протеаз. Упоминание протеазы относится ко всем формам. В зависимости от каталитической активности их активного центра и механизма расщепления пептидных связей в целевом субстрате протеазы включают, например, сериновые протеазы, цистеиновые протеазы, аспарагиновые протеазы, треониновые протеазы и металлопротеазы.

В настоящем документе сериновые протеазы или сериновые эндопептидазы относятся к классу пептидаз, которые характеризуются наличием остатка серина в активном центре фермента. Сериновые протеазы участвуют в широком спектре функций в организме, в том числе в свертывании крови и воспалении, а также функционируют в качестве пищеварительных ферментов у прокариот и эукариот. Механизм расщепления связей сериновыми протеазами основан на нуклеофильной атаке целевой пептидной связи серином. Цистеин, треонин или молекула воды, связанная с аспартатом или металлом, также могут играть эту роль. Выровненные боковые цепи серина, гистидина и аспартата формируют каталитическую триаду, общую для большинства сериновых протеаз. Активный центр сериновых протеаз представляет собой расщелину, где связывается полипептидный субстрат.

В настоящем документе фактор Х (РХ) или полипептид РХ относится к полипептиду сериновой протеазы, который в активной форме обладает каталитической активностью по отшению к протромбину (т.е. протромбогенной активностью). РХ представляет собой сериновую протеазу, являющуюся частью каскада свертывания, и, в частности, первой сериновой протеазой в общем пути свертывания крови. РХ процессируется в клетках из полипептида предшественника (например, из приведенного в 8Е0 ГО N0: 2) с образованием полипептида, содержащего пропептидную область, которая, в конечном счете, расщепляется с образованием зрелого полипептида без сигнальной последовательности и пропептида (например, приведен в 8Е0 ГО N0: 134). Секретируемый полипептид РХ представляет собой двухцепочечный

- 16 028865

полипептид. Полипептиды РХ включают неактивные зимоены или активный фактор Х (РХа). У активного РХа отсутствует активационный пептид. РХа представляет собой форму РХ, обладающую каталитической активностью, которая значительно увеличивается при связывании активного РХ (РХа) с его кофактором фактором Уа. Активность РХа также усиливается за счет включения Са и фосфолипида. Как предусмотренно в настоящем документе, могут быть введены мутации, что приводит к конформационным изменениям формы РХа в зимогенподобную форму, которая в виде полностью активной формы в присутствии кофактора РУа обладает каталитической активностью против протромбина. Таким образом, ссылка на РХ или полипептиды РХ в настоящем документе включает все формы, которые в свою очередь включают форму предшественника, его одноцепочечные и двухцепочечные формы, в том числе зрелые формы, зимогенные формы, формы РХа, в том числе зимогенподобные формы или его каталитически активные части.

Ссылка на РХ включает человеческие полипептиды РХ, в том числе полипептид предшественник, приведенный в δερ ΙΌ N0: 2, и его одноцепочечные и двухцепочечные формы, в том числе зрелые формы, зимогенные формы, формы РХа, в том числе зимогенподобные формы или его каталитически активные формы. Например, зрелый РХ, у которого отсутствует сигнальная последовательность и пропептидная область, приведен в δ Ер ГО N0: 134. Его зимогенная форма представляет собой двухцепочечную форму, содержащую легкую цепь из 130 аминокислот (соответствующих остаткам 1-139 из δΞρ ГО N0: 134) и тяжелую цепь из 306 аминокислот (соответствующих остаткам 143-448 из δΞρ ГО N0: 134). Его РХа форма представляет собой двухцепочечную форму, содержащую легкую цепь из 130 аминокислот (соответствующих остаткам 1-139 из δΞρ ГО N0: 134) и тяжелую цепь из 306 аминокислот (соответствующих остаткам 194-448 из δΞρ ГО N0: 134) или их каталитически активные формы. Как указано, РХ также включает его модифицированные формы, в том числе РХа, которая является зимогенподобной в отсутствии кофактора РУа.

Ссылка на РХ также включает его варианты, такие как аллельные варианты и видовые варианты, варианты, кодируемые вариантами сплайсинга, и другие варианты, в том числе полипептиды, которые имеют по меньшей мере 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% или большую идентичность последовательности с полипептидом-предшественником, приведенным в δ Ер ГО N0: 2 или его зрелой формой, зимогенной формой или его РХа формой. Такие варианты включают любые варианты, в которых форма РХа или ее каталитически активная часть обладает одной или несколькими активностями РХ, включая, но на ограничиваясь этим, связывание с РУа, каталитическую активность, связывание с протромбином, протромбиназную активность и/или коагулянтную активность. Активность может быть снижена или увеличена по сравнению с активностью нативного фактора Х или фактора Х дикого типа. Например, полипептиды РХ включают полипептиды, у которых форма РХа или ее каталитически активная часть обладает по меньшей мере 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200% или большей активностью по сравнению с нативным полипептидом РХа или нативным полипептидом дикого типа. Примеры вариантов включают видовые варианты, включая, но не ограничиваясь этим, полипептид человека (препропептид-предшественник приведен в δЕ^ ГО N0: 2 и кодируется δЕ^ ГО N0: 1; и зрелая форма приведена в δЕ^ ГО N0: 134), северного белощекого гиббона (препропептид-предшественник приведен в δЕ^ ГО N0δ: 393, и зрелая форма приведена в δЕ^ ГО N0: 404), оливкового бабуина (препропептид-предшественник приведен в δЕ^ ГО N0: 394, и зрелая форма приведена в δЕ^ ГО N0: 405), макака-резус (препропептид-предшественник приведен в δЕ^ ГО N0: 395, и зрелая форма приведена в δЕ^ ГО N0: 406), обезьяны прыгун-молох (препропептид-предшественник приведен в δЕ^ ГО N0: 396, и зрелая форма приведена в δЕ^ ГО N0: 407), африканского слона (препропептид предшественник приведен в δЕ^ ГО N0: 397, и зрелая форма приведена в δЕ^ ГО N0: 408), мыши (препропептид предшественник приведен в δЕ^ ГО N0: 398, и зрелая форма приведена в δЕ^ ГО N0: 409), кролика (препропептид предшественник приведен в δЕ^ ГО N0: 399, и зрелая форма приведена в δЕ^ ГО N0: 410), крысы (препропептид предшественник приведен в δЕ^ ГО N0: 400, и зрелая форма приведена в δЕ^ ГО N0: 411), собаки (препропептид предшественник приведен в δЕ^ ГО N0: 401, и зрелая форма приведена в δЕ^ ГО N0: 412), свиньи (препропептид предшественник приведен в δЕ^ ГО N0: 402, и зрелая форма приведена в δЕ^ ГО N0: 413) и быка (препропептид предшественник приведен в δЕ^ ГО N0: 403, и зрелая форма приведена в δЕ^ ГО N0: 414). Примеры вариантов также включают аллельные варианты человеческого РХ, включая, но не ограничиваясь этим, варианты, приведенные в δЕ^ ГО N0δ: 547552 (СагдШ е1 а1. (1999) Ыа1. Сеп., 22:231-238).

В настоящем документе предшественник полипептида РХ относится к несекретируемой форме полипептида РХ, содержащей й-концевой сигнальный пептид, который направляет белок для секреции, и пропептид. Сигнальный пептид отщепляется в эндоплазматическом ретикулуме. Примером предшественника полипептида РХ является полипептид, приведенный в δЕ^ ГО N0: 2, или его аллельный или видовой вариант, или другие варианты, такие как любые варианты, приведенные в δЕ^ ГО N0δ: 393-403 или 547-552.

Используемые в настоящем документе термины "прообласть", "пропептид" или "пропоследовательность" относятся к области или сегменту, который расщепляется с образованием зрелого белка. Прообласть представляет собой последовательность аминокислот, расположенную на аминоконце зрелого

- 17 028865

биологически активного полипептида, и может состоять всего из нескольких аминокислот или может представлять собой мультидоменную структуру. Для полипептидов РХ пропептидная область состоит обычно из примерно 9 аминокислот, но может варьировать (например, быть длинне или короче) в зависимости от видовой принадлежности. В случае РХ пропептидная последовательность вовлечена в посттрансляционную модификацию белка и расщепляется до секреции белка из клетки. Например, пропептид представляет собой распознаваемый элемент для γ-карбоксилирования с помощью витамина Кзависимой карбоксилазы в эндоплазматическом ретикулуме. Реакция осуществляется путем превращения остатков глутаминовой кислоты в О1а домене в остатки γ-карбоксиглутаминовой кислоты (01а). Эта модификация необходима для оптимальной Са²+-опосредованной активации зимогена в крови. Например, остатки §1а делают возможным связывание фактора Х/Ха с фосфолипидом (т.е. поверхностью клетки) зависимым от кальция образом, что является необходимым условием для сборки протромбиназного комплекса. Приведенные в качестве примера пропептид или прообласть соответствуют аминокислотам 32-40 из 81Т) ГО N0: 2.

В настоящем документе пропептидная форма РХ представляет собой белок без сигнального пептида, но который сохраняет пропептид. Например, на примере человеческого РХ, приведенного в 8Е0 ГО N0: 2, пропептид представляет собой 9-аминокислотный пропептид, соответствующий остаткам 32-40 в 8Е0 ГО N0: 2. Таким образом, примером пропептидной формы РХ является человеческий РХ, приведенный в виде аминокислот 32-488 в 8Е0 ГО N0: 2, или его варианты, в том числе аллельные и видовые варианты.

В настоящем документе "зрелый полипептид РХ" относится к полипептиду РХ без сигнальной последовательности и пропептидной последовательности. Пропептид удаляется путем протеолитического расщепления в транс-Гольджи аппарате перед секрецией полипептида. Примером зрелого полипептида РХ является полипептид, приведенный в 8Е0 ГО N0: 134, и также включает его варианты, такие как видовые или аллельные вариаты. Например, примерами таких вариантов являются любые варианты, приведенные в любой из 8Е0 ГО N08: 404-414. Зрелый полипептид РХ обычно относится к одноцепочечной форме РХ до внутрицепочечного протеолиза, приводящего к образованию двухцепочечного полипептида.

Используемый в настоящем документе термин "зимоген" относится к двухцепочечной интактной форме полипептида РХ, которая в норме присутствует в плазме. Двухцепочечная форма образуется путем внутрицепочечного расщепления с удалением остатков Άτ§140-Άτ§142 (соответствующих остаткам, приведенным в 8Е0 ГО N0: 134) между тяжелой и легкой цепями, так что легкая цепь отщепляется от тяжелой цепи. Это происходит в процессе или после секреции в кровоток. Зимоген больше активной формы вследствие присутствия активационного пептида на Оконце тяжелой цепи. В случае РХ зимоген содержит легкую цепь, содержащую домен, богатый γ-карбоксиглутаминовой кислотой (0ЬЛ), и два домена, подобных эпидермальному фактору роста (Е0Р). Тяжелая цепь связана с легкой цепью дисульфидной связью между аминокислотами (например, Сув132 и Сув302 в 8Е0 ГО N0: 134). Тяжелая цепь содержит активационный пептид из 52 аминокислотных остатков на Оконце (например, аминокислотные остатки с 8ег143 по Агд194 в 8Е0 ГО N0: 134). Тяжелая цепь также содержит домен сериновой протеазы (например, остатки с 11е195 по Ьув448 в 8Е0 ГО N0: 134), имеющий каталитическую триаду (например, Ηΐδ²³⁶, Авр²⁸² и Зет³⁷⁹ в 8Е0 ГО N0: 134, и соответствующие Ηΐδ⁵⁷, Авр¹⁰² и 8ег¹⁹⁵ согласно нумерации химотрипсина). Зимогенная форма обычно является неактивной и может быть превращена в активный полипептид путем каталитического расщепления с удалением сегмента активационного пептида. Зимоген, таким образом, представляет собой ферментативно неактивный белок, который превращается в протеолитический фермент в результате действия активатора.

Используемый в настоящем документе термин "активационный пептид" относится к сегменту, присутствующему на Оконце тяжелой цепи РХ, который функционирует, чтобы супрессировать протеолитическую активность, маскируя каталитический механизм и, таким образом, предотвращая образование каталитического интермедиата (т.е. конформационно закрывая сайт связывания субстрата). Примером активационного пептида РХ является активационный пептид из 52 аминокислотных остатков на Оконце тяжелой цепи зрелого полипептида РХ, соответствующий аминокислотным остаткам с 8ег143 по Ат§194 в 81Т) ГО N0: 134.

Используемый в настоящем документе модифицированный активационный пептид относится к активационному пептиду, который не является нативным для полипептида РХ, например, из-за присутствия одного или нескольких отличий в аминокислотной последовательности по сравнению с активационным пептидом немодифицированного полипептида фактора Х или нативным полипептидом фактора Х. Одно или несколько отличий в аминокислотной последовательности представляют собой мутации, такие как одна или несколько аминокислотных замен, вставок или делеций, или могут представлять собой вставки или делеции и любые их комбинации. Например, модифицированный активационный пептид представляет собой такой пептид, который может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 или больше отличий в аминокислотной последовательности по сравнению с активационным пептидом немодифицированного или нативного полипептида РХ (например, по сравнению с

- 18 028865

последовательностью аминокислотных остатков с δοιΊ43 по Аг§194 в δΕρ ГО N0: 134). Примерами аминокислотных модификаций являются модификации, которые приводят к образованию сайта процессинга протеазы, который отсутствует в немодифицированном или нативном полипептиде РХ (например, РХ дикого типа). Например, модификации включают замены активационного пептида в нативном полипептиде РХ или полипептиде РХ дикого типа на гетерологичный активационный пептид из другой протеазы.

Используемая в настоящем документе ссылка на модифицированный полипептид РХ, который не содержит модифицированный активационный пептид, означает, что активационный пептид полипептида не отличается от активационного пептида немодифицированного полипептида фактора Х или нативного полипептида фактора Х. Например, в вариантах воплощения, в которых модифицированный полипептид РХ включает активационный пептид, он содержит нативный активационный пептид или активационный пептид дикого типа. Таким образом, в настоящем документе ссылка на модифицированный полипептид РХ, который не содержит модифицированный активационный пептид, означает, что модификации (например, аминокислотные замены) в нем осуществлены только в легкой цепи или в протеазном домене тяжелой цепи и, как правило, только в протеазном домене тяжелой цепи.

Используемый в настоящем документе термин активный РХ (РХа) или активированный РХ относится к двухцепочечной форме полипептида РХ, в которой тяжелая цепь не содержит ^концевого активационного пептида. РХа активируется в результате расщепления тяжелой цепи с удалением активационного пептида. Таким образом, РХа представляет собой гетеродимер, который состоит из 2 цепей, соединенных дисульфидной связью. Для человеческого РХ легкая цепь имеет молекулярную массу примерно 16000 Да и состоит из последовательности аминокислот 1-139 из δΕρ ГО N0: 134, и тяжелая цепь имеет молекулярную массу примерно 38000 Да и состоит из аминокислотных остатков с Пе95 по Ьук448 из δΕρ ГО N0: 134, которые составляют домен сериновой протеазы. Активация РХ происходит путем расщепления связи Агд194-Пе195, что приводит к высвобождению активационного пептида. Активация осуществляется с помощью внешнего комплекса фактора Х-азы (комплекс фактора УПа/ТФ) или внутреннего комплекса фактора Х-азы (комплекс РРХа/РУШа). Для активации, обычно, необходимо присутствие фосфолипида и ионов кальция. Активация также может быть осуществлена с помощью яда гадюки Рассела (КУУ-Х). РХа обладает каталитической активностью, связывается с РУа, связывается с гепарином, связывается с протромбином, обладает протромбиназной активностью и/или коагулянтной активностью. Для целей настоящего документа ссылка на РХа относится к любой двухцепочечной форме РХ без активационного пептида, которая может проявлять активности РХа, такие как каталитическая активность, связывание с РУа, связывание с гепарином, связывание с протромбином, протромбиназная активность и/или коагулянтная активность. Таким образом, ссылка на РХа включает зимогенподобные полипептиды РХа, которые в присутствии насыщающих концентраций РУа обладают активностями РХа.

Используемый в настоящем документе термин "каталитически активная часть" полипептида РХа относится к активному полипептиду РХа, который содержит непрерывную часть аминокислот тяжелой цепи, включающую остатки каталитической триады (например, остатки Ηίδ²³⁶, Акр²⁸² и δе^³⁷⁹ в δΕρ ГО N0: 134, соответствующие остаткам Ηίδ⁵⁷, Акр¹⁰² и δе^¹⁹⁵ согласно нумерации химотрипсина), но не включает полную последовательность тяжелой цепи, соответствующую аминокислотным остаткам с Пе195 по Ьук448 из δΕρ ГО N0: 134. Каталитически активная часть также может содержать всю легкую цепь РХа или часть легкой цепи РХа. Каталитически активная часть полипептида РХа обладает по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90% или большей активностью, например по меньшей мере 120, 130, 140, 150, 200, 300, 400, 500% или большей активностью по сравнению с полноразмерным РХа. Следует понимать, что в настоящем документе ссылка на модифицированный РХа или его каталитически активную часть означает, что каталитически активная часть содержит модификацию (модификации) (например, аминокислотную замену (аминокислотные замены)).

В настоящем документе яд гадюки Рассела (КУУ-Х) относится к металлопротеиназе яда Урега гиккеШ (гадюка Рассела), которая специфически активирует фактор Х (Такеуа е1 а1. (1992) ί. ΒίοΙ. СЬет., 267:14109-14117). КУУ-Х имеет молекулярную массу примерно 79000 Да и содержит тяжелую и легкую цепи, связанные дисульфидными связями. КУУ-Х не требуются фосфолипиды для активации фактора Х, но требуется экзогенный Са²' и присутствие аминоконцевого С1а домена для усиления активации. Активность КУУ-Х ингибируется в присутствии ЭДТА. Очищенные препараты протеазы змеиного яда известны и доступны (см., например, номер по каталогу КУУХ-2010, Наета!о1одю ТесЬпо1од1ек, Ью.; номер по каталогу аЬ62233; АЬсат, СатЬпЬде. МА), известна их последовательность (см., например, Такеуа е! а1. (1992) I. Βίο1. СЬет., 267:14109-14117 и номера доступа в итрго! Ρ7ΕΖ61, Р4РКЭ1 и Ρ4ΡΡΌ2).

В настоящем документе "зимогеноподобный" белок или полипептид относится к белку, который был активирован протеолитическим расщеплением, но в отсутствии кофактора еще обладает свойствами, которые ассоциированы с зимогеном, такими как, например, низкая или нулевая активность, или конформация, или итоговая активность, которая напоминает конформацию или итоговую активность зимогенной формы белка. Например, для модифицированных полипептидов РХа, предусмотренных в настоящем документе, при отсутствии связи с кофактором РУа двухцепочечная активированная форма РХа является зимогеноподобным белком, она обладает очень низкой активностью. При связывании с РУа

- 19 028865

двухцепочечная активированная форма РХа претерпевает конформационные изменения или сдвиг конформационного равновесия и приобретает свою полную активность фактора свертывания.

Используемый в настоящем документе термин "дикий тип" или "нативный" со ссылкой на РХ относится к полипептиду РХ, кодируемому нативным геном РХ или геном РХ, встречающимся в природе, включая аллельные варианты, который присутствует в организме, в том числе у человека и других животных, в природе. Когда упоминается полипептид РХа дикого типа или нативный полипептид РХа, следует понимать, что это упоминание относится к активной или каталитически активной части полипептида РХа. Ссылка на фактор Х дикого типа без указания видовой принадлежности включает факторы Х дикого типа любых видов. Полипептиды РХ дикого типа включают кодируемый полипептидпредшественник, его фрагменты и его процессированные формы, такие как зрелая форма без сигнального пептида и пропептида, а также любые его претрансляционно или посттрансляционно процессированные или модифицированные формы. Также нативные полипептиды РХ включают те полипептиды, которые являются посттрансляцонно модифицированными, включая, но не ограничиваясь полипептидами, модифицированными путем гликозилирования, карбоксилирования и гидроксилирования. Нативные полипептиды РХ также включают двухцепочечные секретируемые формы, в том числе зимогенные и активные формы, а также любые его процессированные формы или изоформы. Например, люди экспрессируют нативный РХ. Аминокислотная последовательность человеческого РХ дикого типа приведена в 8ЕО ГО N08: 2 и включает его зрелую, зимогенную, активную и каталитически активные формы, как описано в настоящем документе, и аллельные варианты, приведенные в 8Е0 ГО N08: 547-552, и их зрелые, зимогенные, активные и каталитически активные формы. Аминокислотные последовательности РХ других видов: северный белощекий гиббон (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N08: 393, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 404), оливковый бабуин (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 394, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 405), макак-резус (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 395, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 406), обезьяна прыгун-молох (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 396, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 407), африканский слон (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 397, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 408), мышь (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 398, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 409), кролик (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 399, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 410), крыса (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 400, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 411), собака (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 401, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 412), свинья (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 402, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 413) и бык (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 403 и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 414).

В настоящем документе видовые варианты относятся к полипептидам разных видов, в том числе разных видов млекопитающих, таких как мышь и человек.

В настоящем документе аллельные варианты относятся к вариациям в белках среди представителей одного и того же вида.

В настоящем документе вариант сплайсинга относится к варианту, полученному в результате альтернативного процессинга первичного транскрипта геномной ДНК, который приводит к образованию более чем одного типа мРНК.

В настоящем документе соответствующие остатки относятся к остаткам, которые встречаются в выравненных локусах. Родственные полипептиды или варианты полипептидов выравнивают любым способом, известным специалистам в данной области техники. Такие способы, как правило, максимизируют совпадения, и включают такие способы выравнивания как ручное выравнивание и выравнивание с использованием многочисленных доступных программ для выравнивания (например, ВЬА8ТР) и другие способы выравнивания, известные специалистам в данной области техники. С помощью выравнивания последовательностей полипептидов РХ специалист в данной области техники может идентифицировать соответствующие остатки, используя консервативные и идентичные аминокислотные остатки в качестве ориентиров. Обычно фраза, что аминокислоты полипептида соответствуют аминокислотам в раскрытой последовательности, относится к аминокислотам, идентифицированным при выравнивании полипептида с раскрытой последовательностью для максимизации идентичности или гомологии (где выравниваются консервативные аминокислоты) с использованием стандартного алгоритма для выравнивания, такого как алгоритм ОАР. Например, в соответствии с выравниваниями, приведенными на фиг. 3, аминокислотный остаток Ηίδ8 в легкой цепи зрелого человеческого РХ, приведенного в 8Е0 ГО N0: 134, соответствует А§и8 в РХ белощекого бабуина, приведенном в 8Е0 ГО N0: 404. В другом примере А§р164 в тяжелой цепи зрелого человеческого РХ, приведенного в 8Е0 ГО N0: 134, соответствует А§р161 в РХ крысы, приведенном в 8Е0 ГО N0: 411.

В настоящем документе термин "домен" (как правило, представляет собой последовательность из трех или более, как правило, 5 или 7 или более аминокислот) относится к части молекулы, такой как белок или кодирующая нуклеиновая кислота, которая структурно и/или функционально отличается от других частей молекулы и является идентифицируемой. Например, домены включают те участки полипептидной цепи, которые способны формировать независимо фолдируемую структуру в белке, состоящую

- 20 028865

из одного или нескольких структурных мотивов и/или распознаваемую по функциональной активности, такой как протеолитическая активность. Белок может иметь один или несколько различных доменов. Например, домен может быть идентифицирован, определен или различен по гомологии последовательности с близкими членами семейства, такой как гомология с мотивами, которые определяют протеазный домен или О1а домен. В другом примере домен можно отличить по его функции, например по протеолитической активности или способности взаимодействовать с биомолекулами, например по связыванию ДНК, связыванию лиганда и димеризации. Домен самостоятельно может проявлять биологическую функцию или активность, так что домен самостоятельно или при слиянии с другой молекулой может проявлять активность, такую как, например, протеолитическая активность или способность связывать лиганд. Домен может представлять собой линейную последовательность аминокислот или не линейную последовательность аминокислот. Многие полипептиды содержат множество доменов. Такие домены известны и могут быть идентифицированы специалистами в данной области. Для иллюстративных целей в настоящем документе приводятся определения, но подразумевается, что специалист в данной области может распознать конкретный домен по названию. Если необходимо, для выявления доменов может быть использовано соответствующее программное обеспечение.

Используемый в настоящем документе термин протеазный домен или его каталитически активный домен обозначает домен, который обуславливает каталитическую активность. Ссылка на протеазный домен протеазы включает одноцепочечные, двухцепочечные и мультицепочечные формы любых этих белков. Протеазный домен протеазы обладает всеми нужными свойствами данного белка, необходимыми для его протеолитической активности, такими как, например, каталитический центр. В случае РХ протеазный домен имеет гомологию и сходные структурные особенности с протеазными доменами семейства химотрипсин/трипсин, в том числе каталитическую триаду. Например, в полипептиде РХ, приведенном в δΕφ ГО N0: 134, протеазный домен соответствует аминокислотным положениям с 11е195 по Ьу8448 в δΕφ ΙΌ N0: 134 и включает остатки каталитической триады (например, Ηίδ , Лер и δе^ в δΕφ ΙΌ N0: 134, соответствующие Ηίδ⁵⁷, Αδρ¹⁰² и δе^¹⁹⁵ согласно нумерации химотрипсина).

Используемый в настоящем документе термин домен, богатый γ-карбоксиглутаминовой кислотой (01а), относится к части белка, например витамин К-зависимого белка, который содержит посттрансляционные модификации остатков глутамата, обычно большинства, но не всех остатков глутамата, осуществляемые путем витамин К-зависимого карбоксилирования с образованием 01а. Домен 01а отвечает за высокоаффинное связывание ионов кальция и связывание с отрицательно заряженными фосфолипидами. Как правило, домен 01а начинается на й-конце зрелой формы витамин К-зависимых белков и заканчивается консервативным ароматическим остатком. При расщеплении до двухцепочечной формы домен 01а находится в легкой цепи. В зрелом РХ домен 01а соответствует аминокислотным положениям 1-39 полипептида, приведенного в качестве примера в δΕφ ГО N0: 134. Домены 01а хорошо известны и их расположение может быть идентифицировано в конкретных полипептидах. Домены 01а различных витамин К-зависимых белков имеют гомологию последовательности, структурную и функциональную гомологию, в том числе кластеризацию ^концевых гидрофобных остатков в гидрофобный участок, который опосредует взаимодействие с отрицательно заряженными фосфолипидами на наружной клеточной мембране. Примеры других 01а-содержащих полипептидов включают, но не ограничиваются ими, Р1Х, РУН. протромбин, белок С, белок δ, остеокальцин, матриксный 01а белок, специфический белок задержки пролиферации/блокировки роста (0го№1й-ап^1^рес1Йс рто1еш 6, 0аδ6) и белок Ζ.

В настоящем документе домен, подобный эпидермальному фактору роста (Е0Р) (Е0Р-1 или Е0Р2), относится к части белка, которая имеет гомологию последовательности с определенной частью последовательности эпидермального фактора роста (Е0Р) из 30-40 аминокислот. Домен Е0Р включает шесть остатков цистеина, которые, как было показано (в Е0Р), участвуют в образовании дисульфидных связей. Основная структура домена Е0Р представляет собой двухцепочечный β-лист, за которым следует петля к С-концевому короткому двухцепочечному листу. РХ содержит два домена Е0Р: Е0Р-1 и Е0Р-2. Эти домены соответствуют аминокислотным положениям 46-84 и 85-128, соответственно, зрелого полипептида РХ, приведенного в δΕφ ГО N0: 134. При расщеплении до двухцепочечной формы домены Е0Р находятся в легкой цепи.

Используемый в настоящем документе термин "немодифицированный полипептид" или "немодифицированный РХ" и их грамматические варианты относятся к исходному полипептиду, который выбран для модификации, как предусмотренно в настоящем документе. Исходный полипептид может представлять собой дикую форму полипептида, встречающуюся в природе. Примером немодифицированного полипептида РХ является человеческий РХ, приведенный в δΕφ ГО N0: 134, и его зимогенная или двухцепочечная форма РХа. Кроме того, исходный полипептид может быть измененным или мутированным, таким образом, что он отличается от нативной изоформы дикого типа, но, тем не менее, является в настоящем документе исходным немодифицированным полипептидом для последующих модифицированных полипептидов, полученных из него. Таким образом, существующие белки, известные в данной области техники и которые были модифицированы для желаемого увеличения или уменьшения конкретной активности или свойства по сравнению с немодифицированным белком сравнения, могут быть выбраны

- 21 028865

и использованы в качестве исходного немодифицированного полипептида. Например, белок, который был получен модификацией его нативной формы с помощью одного или нескольких единичных аминокислотных изменений, и обладающий либо увеличенным, либо уменьшенным желаемым свойством, например изменением аминокислотного остатка или аминокислотных остатков для изменения гликозилирования, может являться целевым белком, называемым в настоящем документе немодифицированным, для дальнейшей модификации либо того же самого, либо другого свойства.

Используемые в настоящем документе термины "модифицированные полипептиды фактора X" и "модифицированный фактор X" относятся к полипептидам РХ, в том числе к любым их формам, таким как зимоген РХ или РХа, которые имеют одно или несколько отличий аминокислотной последовательности по сравнению с немодифицированным полипептидом фактора X. Одно или несколько отличий аминокислотной последовательности могут представлять собой аминокислотные мутации, такие как одна или несколько аминокислотных замен, вставок или делеций, или могут представлять собой вставки или делеций целых доменов, или любые их комбинации. Как правило, модифицированный полипептид РХ имеет одну или несколько модификаций в первичной последовательности по сравнению с немодифицированным полипептидом РХ. Например, предусмотренный в настоящем документе модифицированный полипептид РХ может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 или больше отличий аминокислотной последовательности по сравнению с немодифицированным полипептидом РХ. Предусмотрены любые модификации при условии, что полученный полипептид обладает по меньшей мере одной активностью РХ, связанной с нативным полипептидом РХ, такой как, например, каталитическая активность, протеолитическая активность, протромботическая активность или коагулянтная активность.

Используемый в настоящем документе термин "свойство" полипептида РХ относится к физическому или структурному свойству, такому как пространственная структура, р1, период полужизни, конформация и другие такие физические характеристики.

Используемый в настоящем документе термин "активность" полипептида РХ, или "активность РХ", или "активность РХа" относится у любой активности, которой обладает активная форма полипептида фактора Ха. Такие активности могут быть протестированы ίη νίΐτο и/или ίη νίνο, и они включают коагулянтную активность, прокоагулянтную активность, протеолитическую или каталитическую активность, такую как осуществление активации протромбина; антигенность (способность связываться или конкурировать с полипептидом за связывание с анти-РХ антителом); способность связываться с РУа, протромбином, гепарином и/или способность связываться с фосфолипидами, но не ограничиваются этим. Активность можно оценить ίη νίΐτο или ίη νίνο, используя общепринятые анализы, например измеряя коагуляцию ίη νίΐτο или ίη νίνο. Результаты таких анализов свидетельствуют о том, что полипептид обладает активностью, которая может коррелировать с активностью полипептида ίη νίνο, где активность ίη νίνο может обозначать биологическую активностью. Анализы для оценки функциональности или активности модифицированных форм РХ известны специалистам в данной области техники. Примеры таких анализов для оценки активности полипептида РХ включают анализ протромбопластинового времени (РТ), или анализ активированного частичного тромбопластинового времени (аРТТ) для оценки коагулянтной активности, или хромогенные анализы с использованием синтетических субстратов, такие как анализы, описанные в примерах ниже, для оценки каталитической или протеолитической активности.

Используемое в настоящем документе выражение "обладает по меньшей мере одной активностью" или "сохраняет по меньшей мере одну активность" относится к активности РХ, которой обладает модифицированный полилептид РХ, если сравнивать его с немодифицированным полипептидом РХ той же формы и в тех же условиях. Обычно, активность представляет собой активность формы РХа полипептида или ее каталитически активной части. Например, активность модифицированного полипептида РХа в двухцепочечной форме сравнивают с немодифицированным полипептидом РХа в двухцепочечной форме, в тех же экспериментальных условиях, где единственным различием между двумя полипептидами является исследуемая модификация. Как правило, модифицированный полипептид РХ, который сохраняет по меньшей мере одну активность немодифицированного полипептида РХ той же формы или обладает по меньшей мере одной активностью немодифицированного полипептида РХ той же формы, сохраняет достаточную активность, так что при введении ίη νίνο модифицированный полипептид РХ является терапевтически эффективным в качестве прокоагулянтного лекарственного средства. Модифицированный полипептид РХ может обладать увеличенной или уменьшенной активностью по сравнению с немодифицированным полипептидом РХ в той же форме. Обычно, модифицированный полипептид РХ обладает активностью, если он обладает от 0,5 до 500% от активности немодифицированного полипептида РХ, например по меньшей мере или примерно по меньшей мере или 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% активности или больше по сравнению с активностью немодифицированного полипептида РХ той же формы, который является терапевтически эффективным в качестве прокоагулянта. Значение активности, необходимое для поддержания терапевтической эффективности в качестве прокоагулянта, можно, при необходимости, определить опытным путем. Как правило, сохранение от 0,5 до 20%, от 0,5 до 10%, от 0,5 до 5% активности достаточно для сохранения терапевтической эффективности в качестве прокоагулянта ίη νίνο. Конкрет- 22 028865

ный уровень, который должен быть сохранен, является функцией предполагаемого применения полипептида и может быть определен опытным путем. Активность может быть измерена, например, с использованием анализов ίη νίίτο или ίη νίνο, таких как те анализы, которые описаны в настоящем документе или в примерах ниже.

Используемый в настоящем документе термин "каталитическая активность" или "протеолитическая активность" касательно РХ относится к способности формы РХа или ее каталитически активной части катализировать протеолитическое расщепление субстрата. Анализы для оценки таких активностей известны в данной области техники. Анализы включают такие анализы, в которых контролируется или оценивается образование стабильных интермедиатов ацил-фермент с субстратом, анализы, в которых оценивается связывание с ингибиторами РХа, которое коррелирует с каталитической активностью, и анализы, в которых напрямую оценивается расщепление субстрата РХа (например, протромбина) или синтетического субстрата. Например, протеолитическую активность РХ можно измерить, используя хромогенные или флуорогенные субстраты, такие как флуоресцеин-моно-п'-гуанидинобензоат (РМОВ) или 5>рсс1го/утс РХа (метоксикарбонил-Э-циклогексилглицил-глицил-аргинин-паранитроанилида ацетат), используя прочно связывающийся обратимо действующий ингибитор, такой как экотин, или используя субстрат РХа протромбин. Оценить каталитическую активность можно напрямую или косвенно. Например, каталитическую активность можно оценить, измеряя активность расщепленного субстрата РХа, как проиллюстрировано в примере 4 в настоящем документе, где измеряют активность активированного тромбина по отношению к его синтетическому субстрату РеГаГкюг ТН (Н-О-СНА-А1а-Аг§АМС). Примеры анализов приведены в примерах. Анализы для оценки каталитической активности могут быть осуществлены в присутствии или в отсутствие РУа и также в присутствии или в отсутствие фосфолипидов или Са²'. Каталитическая активность может быть представлена в виде каталитической эффективности или кса1/кт. которая представляет собой показатель эффективности, с которой протеаза расщепляет субстрат, и измеряется в стационарном состоянии, как хорошо известно специалистам в данной области техники.

Используемый в настоящем документе термин "коагулянтная активность" или "прокоагулянтная активность" относится к способности полипептида осуществлять свертывание крови. Анализы для оценки коагулянтной активности известны специалистам в данной области техники и включают анализ протромбопластинового времени (РТ) или анализ активированного частичного тромбопластинового времени (аРТТ).

Используемый в настоящем документе термин "протромбиназная активность" относится к специфической каталитической активности по отношению к субстрату протромбину и представляет собой активность, которая превращает протромбин (фактор II) в тромбин (фактор 11а). Активность можно оценить напрямую, например, с помощью белкового анализа продуктов реакций расщепления, разрешенных при помощи δΌδ-РАОЕ. Активность также можно оценить с использованием синтетических субстратов, где при расщеплении отслеживают высвобождение хромогенных или флуорогенных фрагментов. Активность также можно оценить косвенно, оценивая активность тромбина по отношению к его субстрату или синтетическому субстрату (например, РеГайиог ТН (Н-О-СНА-А1а-Агд-АМС). Анализы для оценки протромбиназной активности можно осуществить в присутствии или в отсутствие РУа и также в присутствии или в отсутствие фосфолипидов или Са²'.

Используемые в настоящем документе термины "ингибиторы коагуляции (ингибиторы свертывания крови)" относятся к белкам или молекулам, которые ингибируют или предотвращают свертывание крови или образование сгустка. Ингибирование или предотвращение свертывания крови можно наблюдать ίη νίνο или ίη νίίτο и можно оценить с использованием любого способа, известного в данной области техники, включая анализ протромбопластинового времени (РТ) или анализ активированного частичного тромбопластинового времени (аРТТ), но не ограничиваясь этим.

В настоящем документе антитромбин III (АТ или АТ-ΙΙΙ) представляет собой ингибитор сериновой протеазы (серпин). АТ-Ш синтезируется в виде белка-предшественника, содержащего 464 аминокислотных остатка (5>ЕО ГО N0: 553), который расщепляется в процессе секреции с высвобождением 432аминокислотного зрелого антитромбина (5>Е0 ГО N0: 554).

Используемый в настоящем документе термин "ингибирующий эффект АТ-Ш" или "ингибирование АТ-Ш" относится к способности антитромбина III (АТ или АТ-Ш) ингибировать каталитическую или коагулянтную активность формы РХа полипептида РХ или его каталитически активной или зимогенподобной формы. Ингибирование АТ-Ш можно оценить, оценивая связывание полипептида РХ или модифицированного полипептида РХ с ингибитором. Анализы для определения связывания полипептида с ингибитором известны в данной области техники. Кроме того, поверхностный плазмонный резонанс, например, измеряемый с помощью биосенсора В^тоте, также может использоваться для измерения связывания полипептидов РХ с АТ-Ш или другими ингибиторами. Тем не менее, для ковалентных ингибиторов, таких как АТ-Ш, с использованием В^тоте может быть измерена только скорость прямой реакции. Ингибирующую активность также можно оценить, оценивая каталитическую активность или коагулянтную активность РХа в присутствии АТ-Ш. Для ковалентных ингибиторов, таких как, например, АТГО, также измеряют константу скорости ингибирования второго порядка. Например, ингибирование ин- 23 028865

гибитором ΑΤ-ΙΙΙ также можно оценить, определяя константу скорости ингибирования РХа второго порядка (к_арр). Реакции ингибирования обычно осуществляют в присутствии гепарина, который необходим для полной активности ΑΤ-ΙΙΙ. Например, обычно ΑΤ-ΙΙΙ оказывает ингибирующий эффект, если его К₀,₅(т.е. молярная концентрация ΑΤ-ΙΙΙ, необходимая для 50% ингибирования каталитической активности РХа) составляет меньше чем 80 нМ и обычно меньше чем 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 нМ или меньше. Например, ΑΤ-ΙΙΙ обладает К₀,₅, равной примерно 2 нМ для РХа плазмы и для РХа дикого типа. В другом примере АТ-ΙΙΙ оказывает ингибирующий эффект, если к_арр (М^-1с^-1) составляет более чем 1,0х10⁶ и обычно более чем 2,0х10⁶, 3,0х10⁶, 4,0х10⁶, 5,0х10⁶, 6,0х10⁶, 7,0х10⁶, 8,0х10⁶, 9,0х10⁶, 1,0х10⁷, 2,0х10⁷ или больше. Например, ΑΤ-ΙΙΙ обладает к_арр, равной примерно 1,4х10⁷ и 9,7х10⁶ для РХа плазмы и РХа дикого типа соответственно.

В настоящем документе увеличенная устойчивость к ингибиторам, например "увеличенная устойчивость к ΑΤ-ΙΙΙ" или "увеличенная устойчивость к ΤΤΡΙ", относится к любому уменьшению чувствительности полипептида к ингибирующим эффектам ингибитора, такого как ΑΤ-ΙΙΙ, ΤРΡI или другой ингибитор, по сравнению с полипептидом, таким как немодифицированный полипептид РХ. Анализы для определения ингибирующего эффекта ингибитора, например ΑΤ-ΙΙΙ или ΊΤΡΙ, по отношению к модифицированному полипептиду РХ могут быть осуществлены в присутствии ингибитора (например, ΑΤ-ΙΙΙ или ΤРΡI), и может быть определена ингибирующая активность по сравнению с ингибирующем эффектом того же ингибитора (например, ΑΤ-ΙΙΙ или ΤРΡI) по отношению к полипептиду сравнения или немодифицированному полипептиду РХ. Например, может быть измерена способность модифицированного полипептида РХ расщеплять его субстрат протромбин в присутствии или в отсутствие ΑΤ-ΙΙΙ, и может быть определена степень, до которой ΑΤ-ΙΙΙ ингибирует реакцию. Это можно сравнить со способностью немодифицированного полипептида РХ расщеплять протромбин в присутствии или отсутствии ΑΤ-ΙΙΙ. Аналогичные анализы могут быть проведены с ΤΕΡΙ. Модифицированный полипептид, который обладает увеличенной устойчивостью к ингибитору, например обладает устойчивостью к эффектам ингибитора, которая увеличена на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с немодифицированным полипептидом. Устойчивость к ингибитору можно определить как отношение ингибирующей активности по отношению к модифицированному РХ к ингибирующей активности по отношению к немодифицированному полипептиду РХ. Например, можно определить К_0,5, и степень устойчивости к ингибитору (например, устойчивость к ΑΤ-ΙΙΙ или устойчивость к ΤРΡI) модифицированного полипептида РХ по сравнению с РХа дикого типа выражается в виде отношения значений их К₀,₅ (К₀,₅ варианта/К₀,₅ дикого типа). Отношение больше 1,0 означает, что модифицированный полипептид РХ обладает увеличенной устойчивостью к ингибитору (например, ΑΤ-ΙΙΙ или ΤРΡI). В другом примере можно определить к_арр, и степень устойчивости к ингибитору (например, устойчивость к ΑΤ-ΙΙΙ или устойчивость к ΤРΡI) модифицированного полипептида РХ по сравнению с РХа дикого типа выражается в виде отношения значений их карр (карр дикого типа/карр варианта). Отношение больше 1,0 означает, что модифицированный полипептид РХ обладает увеличенной устойчивостью к ингибитору, такому как ΑΤ-ΙΙΙ и/или ΤРΡI.

В настоящем документе кофакторы относятся к белкам или молекулам, которые связываются с другими специфическими белками или молекулами с образованием активного комплекса. В некоторых примерах связывание с кофактором необходимо для оптимальной протеолитической активности. Например, фактор Уа (РУа) является кофактором РХа. Связывание РХа или зимогенподобной формы РХа с РУа индуцирует конформационные изменения, которые приводят к увеличению протеолитической активности РХа в отношении его субстратов.

В настоящем документе фактор Уа (РУа) относится к неферментативно активному фактору свертывания крови, который функционирует как кофактор для РХа. Фактор У представляет собой одноцепочечный полипептид, активируемый тромбином на поверхности активированных тромбоцитов с образованием РУа, который представляет собой двухцепочечный полипептид, цепи которого нековалентно связаны друг с другом с помощью кальция. РУа связывается с РХа с образованием протромбиназного комплекса, который в присутствии фосфолипидов и Са²+ превращает протромбин в тромбин. Ιη νίνο это обычно происходит на поверхности клеток. РУа является кофактором РХа, потому что активность РХа по активации тромбина значительно увеличивается в присутствии РУа.

В настоящем документе "РУа-независимая активность" относится к ативности РХа в отсутствие

РУа.

В настоящем документе "РУа-зависимая активность" относится к ативности РХа в присутствии

РУа.

Используемый в настоящем документе термин "зависимость от кофактора" или "относительная зависимость от кофактора" относится к большей активности РХа в присутствии РУа по сравнению с его отсутствием, и может быть отражена в виде отношения РУа-зависимой активности к РУа-независимой активности. Обычно РХа обладает значительно большей активностью в присутствии кофактора, чем в его отсуствии, так что его полная активность зависит от присутствия кофактора. Например, связывание активного РХа с его активированным кофактором, РУа, приводит к увеличению активности более чем в

- 24 028865

2000 раз (например, каталитической активности) по сравнению с отсутствием кофактора.

В настоящем документе увеличенная зависимость от кофактора относится к любому увеличению зависимости от кофактора модифицированного полипептида РХ по сравнению с полипептидом сравнения, таким как немодифицированный полипептид РХ. Модифицированный полипептид, который обладает увеличенной зависимостью от кофактора, обладает, например, зависимостью от кофактора, которая увеличена на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 200, 300, 400, 500% или более по сравнению с немодифицированным полипептидом. Увеличенную зависимость от кофактора можно определить как отношение зависимости от кофактора (РVа-зависимая активность/Р№а-независимая активность) модифицированного полипептида РХ к зависимости от кофактора полипептида сравнения или немодифицированного полипептида РХ, не содержащего модификацию (модификации). Например, модифицированный полипептид РХ обладает увеличенной зависимостью от кофактора, если он обладает зависимостью от кофактора, которая увеличена по меньшей мере в 1,5 раза, в 2, в 3, в 4, в 5, в 10, в 20, в 30, в 40, в 50, в 60, в 70, в 80, в 90, в 100, в 200, в 300, в 400, в 500, в 600, в 700, в 800, в 900, в 1000 раз или больше по сравнению с немодифицированным полипептидом РХ.

В настоящем документе сайт гликозилирования относится к аминокислотному положению в полипептиде, по которому присоединяется углеводный фрагмент. Как правило, гликозилированный белок содержит один или несколько аминокислотных остатков, таких как аспарагин или серин, для присоединения углеводных фрагментов.

В настоящем документе природный сайт гликозилирования относится к аминокислотному положению в полипептиде дикого типа, по которому присоединяется углеводный фрагмент. Существует четыре природных сайта гликозилирования в РХ: два 0-связанных и два ^связанных сайта гликозилирования, соответствующих остаткам Тйг159, Тйг171, Άδη181 и Άδη191 в соответствии с δΕΟ ΙΌ N0: 134.

В настоящем документе не нативный сайт гликозилирования относится к аминокислотному положению, которое отсутствует в полипептиде дикого типа, по которому присоединяется углеводный фрагмент в модифицированном полипептиде. Не нативные сайты гликозилирования могут быть введены в полипептид РХ с помощью аминокислотной замены. 0-сайты гликозилирования могут быть созданы, например, путем аминокислотной замены нативного остатка на серин или треонин. Н-сайты гликозилирования могут быть созданы, например, путем создания фрагмента Акп-Хаа^ег/Тйг/Сук, где Хаа не является пролином. Создание такой консенсусной последовательности с помощью аминокислотных модификаций может включать, например, единичную аминокислотную замену нативного аминокислотного остатка на аспарагин, единичную аминокислотную замену нативного аминокислотного остатка на серин, треонин или цистеин, или двойную аминокислотную замену, включающую первую аминокислотную замену нативного остатка на аспарагин и вторую аминокислотную замену нативного остатка на серин, треонин или цистеин.

Используемый в настоящем документе термин "уровень гликозилирования" относится к числу сайтов гликозилирования, которые могут быть заняты гликаном, например, при экспрессии в клеткехозяине, которая может осуществлять гликозилирование.

В настоящем документе увеличение со ссылкой на уровень гликозилирования означает, что существует большее число сайтов гликозилирования, которые могут быть заняты гликаном, относительно немодифицированного полипептида РХ или полипептида РХ дикого типа. Модифицированный полипептид, который имеет увеличенный уровень гликозилирования, может быть гипергликозилированным, если существует большее число сайтов гликозилирования, занятых гликаном, по сравнению с немодифицированным полипептидом РХ или дикого типа.

Используемый здесь термин "биологическая активность" относится к активности соединения ίη νίνο или к физиологическому ответу, который проявляется при введении соединения, композиции или другой смеси ίη νίνο. Биологическая активность, таким образом, охватывает терапевтический эффект и фармацевтическую активность таких соединений, композиций и смесей. Биологическую активность можно наблюдать в системах ίη νίίτο, предназначенных для исследования или использования такой активности. Таким образом, в настоящем документе биологическая активность полипептида РХа охватывает коагулянтную активность.

Используемый здесь термин "оценка" и его грамматические варианты относятся к качественному и количественному определению абсолютного значения активности полипептида, а также к получению индекса, коэффициента, процента, визуального показателя или другого показателя уровня активности. Оценка может быть прямой или косвенной. Например, обнаружение расщепления субстрата полипептида может осуществляться прямым измерением продукта или косвенным путем через определение активности расщепленного субстрата.

В настоящем документе "нумерация зрелой формы полипептида" или "стандартная нумерация" относится к нумерации остатков в порядке, основанном на зрелом полипептиде РХ. Для целей, предусмотренных в настоящем документе, нумерация зрелой формы полипептида основана на нумерации остатков зрелого РХ, приведенного в δΕΟ ΙΌ N0: 134.

В настоящем документе "нумерация химотрипсина" относится к нумерации аминокислотных остатков, основанной на нумерации зрелого полипептида химотрипсина, приведенного в δΕΟ ΙΌ N0: 556.

- 25 028865

Выравнивание химотрипсина с протеазным доменом другой сериновой протеазы, такого как, например, протеазный домен фактора X, осуществляют, основываясь на совпадающих паттернах последовательностях, которые получены с помощью трехмерного моделирования и взаимного наложения структур обычных сериновых протеаз (см., например, Сгеег, 1., Рго1етз 81гисй Рипсй Сепей 7 (1990) 317-334). В таком случае аминокислоты фактора X, которые соответствуют аминокислотам химотрипсина, получают нумерацию аминокислот химотрипсина. Соответствующие номера аминокислотных положений с 195 по 448 по химотрипсину, соответствующие протеазному домену тяжелой цепи полипептида РX, приведенного в 8Ер ГО N0: 134, приведены в табл. 1. Аминокислотные положения, относящиеся к последовательности, приведенной в 8ЕР ГО N0: 134, имеют обычный шрифт, аминокислотные остатки в этих положения выделены жирным шрифтом, и соответствующие номера по химотрипсину выделены курсивом. Например, при выравнивании зрелого фактора РX (8Е0 ГО N0: 134) со зрелым химотрипсином (8ЕР ГО N0: 556), изолейцин (I) в аминокислотном положении 195 в факторе X получает номер 116 по химотрипсину. Последующие аминокислоты нумеруются соответственно. Если остаток существует в протеазе, но отсутствует в химотрипсине, аминокислотный остаток получает буквенное обозначение (например, остаток 330 согласно нумерации зрелой формы полипептида представляет собой остаток 146А согласно нумерации химотрипсина).

Таблица 1

Нумерация фактора X по химотрипсину

195	196	197	198	199	200	201	202	203	204	205	206	207	208	209
I	V	С	С	0	Е	С	К	Ц	С	Е	С	Р	νν	а
16	17	18	19	20	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30

210	211	212	213	214	215	216	217	218	219	220	221	222	223	224
А	й	й	I	N	Е	Е	N	Е	С	Р	С	С	С	Т
31	32	33	34	35	36	37	38	39	40	41	42	43	44	45

- 26 028865

225	226	227	228	229	230	231	232	233	234	235	236	237	238	239
1	Ь	δ	Е	Р	Υ	I	ί	Τ	Α	Α	Η	С	ί	Υ
46	47	48	49	50	51	52	53	54	55	56	57	58	59	60

240	241	242	243	244	245	246	247	248	249	250	251	252	253	254
α	А	К	К	Р	К	V	Ρ	V	6	ϋ	Ρ	Ν	Τ	Ε
61	61А	62	63	64	65	66	67	68	69	70	71	72	73	73Α

255	256	257	258	259	260	261	262	263	264	265	266	267	268	269
0	Е	Е	С	С	Ε	Α	V	Η	Ε	V	Ε	V	V	1
74	75	77	78	79	80	81	82	83	84	85	86	87	88	89

270	271	272	273	274	275	276	277	278	279	280	281	282	283	284
К	Н	N	К	Р	Τ	К	Ε	Τ	Υ	ϋ	Ρ	ϋ	I	Α
90	91	92	93	94	95	96	97	98	99	700	707	702	703	704

285	286	287	288	289	290	291	292	293	294	295	296	297	298	299
V	ί	Р	ί	К	Τ	Ρ	I	Τ	Ρ	Ρ	Μ	Ν	V	Α
105	706	107	108	709	770	777	772	773	774	775	776	777	778	779

300	301	302	303	304	305	306	307	308	309	310	311	312	313	314
Ρ	А	С	ь	Р	Ε	Ρ	ϋ	νν	Α	Ε	δ	Τ	Ь	Μ
120	727	722	723	724	724Α	725	726	727	728	729	729Α	730	737	732

315	316	317	318	319	320	321	322	323	324	325	326	327	328	329
τ	0	К	Т	О	I	V	δ	0	Ρ	0	Ρ	Τ	Η	Ε
733	ЮЗА	734	735	736	737	138	739	740	747	742	743	744	745	746

330	331	332	333	334	335	336	337	338	339	340	341	342	343	344
К	С	К	0	δ	Τ	Ρ	ί	К	Μ	ί	Ε	V	Ρ	Υ
146Α	749	150	757	752	753	754	155	756	157	158	759	160	767	762

345	346	347	348	349	350	351	352	353	354	355	356	357	358	359
V	Ц	Р	N	δ	С	К	1.	δ	δ	δ	Ρ	I	1	Τ
763	764	765	766	767	768	769	770	172	773	774	775	776	777	778

360	361	362	363	364	365	366	367	368	369	370	371	372	373	374
0	N	М	Р	С	Α	С	Υ	ϋ	Τ	К	0	Ε	0	Α
178Α	779	180	787	782	783	784	785	785Α	185Β	786	187	788	789	790

375	376	377	378	379	380	381	382	383	384	385	386	387	388	389
С	0	О	Ц	δ	0	0	Ρ	Η	V	Τ	Ρ	Ρ	К	0
797	792	793	794	795	796	797	798	799	200	207	202	203	204	205

390	391	392	393	394	395	396	397	398	399	400	401	402	403	404
Τ	Υ	Р	V	Τ	С	I	V	δ	νν	С	Ε	С	С	Α
206	207	208	209	270	277	272	273	274	275	276	277	278	220	227

- 27 028865

405	406	407	408	409	410	411	412	413	414	415	416	417	418	419
К	К	О	К	Υ	С	I	Υ	Т	К	V	Т	А	Р	ί
222	223	223А	224	225	226	227	228	229	230	231	232	233	234	235

420	421	422	423	424	425	426	427	428	429	430	431	432	433	434
К	νν	I	ϋ	К	δ	М	К	Т	К	С	ί	Р	К	А
236	237	238	239	240	241	242	243	244	245	246	247	248	249	250

435	436	437	438	439	440	441	442	443	444	445	446	447	448
К	δ	Н	А	Р	Е	V	1	Т	δ	δ	Р	Ь	К
251	252	253	254	255	256	257	258	259	260	261	262	263	264

В настоящем документе "нуклеиновые кислоты" включают ДНК, РНК и их аналоги, в том числе пептидные нуклеиновые кислоты (РУА) и их смеси. Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Когда речь идет о зондах или праймерах, которые по желанию являются мечеными, например, обнаруживаемой меткой, например флуоресцентной или радиоактивной меткой, подразумеваются одноцепочечные молекулы. Такие молекулы, как правило, обладают такой длиной, что их мишени при исследовании библиотеки с использованием таких молекул в качестве зондов или праймеров являются статистически уникальными или встречаются в виде низкого числа копий (обычно менее 5, как правило, менее 3). Обычно зонд или праймер содержит последовательность по меньшей мере из 14, 16 или 30 непрерывно расположенных нуклеотидов, комплементарных или идентичных интересующему гену. Зонды и праймеры могут включать 10, 20, 30, 50, 100 или более нуклеотидов в длину.

В настоящем документе "пептид" относится к полипептиду, который включает от 2 до 40 аминокислот в длину.

В настоящем документе аминокислоты, входящие в различные аминокислотные последовательности, предусмотренные здесь, обозначаются в соответствии с известными трехбуквенными или однобуквенными аббревиатурами (табл. 2). Нуклеотиды, входящие в различные фрагменты нуклеиновых кислот, называют стандартными однобуквенными обозначениями, обычно используемыми в уровне техники.

В настоящем документе "аминокислота" представляет собой органическое соединение, содержащее аминогруппу и карбоксильную группу. Полипептид содержит две или более аминокислот. В настоящем

документе аминокислоты включают двадцать природных аминокислот, неприродные аминокислоты и аналоги аминокислот (т.е. аминокислоты, у которых α-атом углерода имеет боковую цепь).

Аббревиатуры для аминокислотных остатков в соответствии со стандартной номенклатурой полипептидов, описанной в 1. Βΐοΐ. СЬет., 243:3552-3559 (1969) и принятой 37 С.Р.К, §§ 1.821-1.822, приведены в табл. 2.

Таблица 2

Таблица соответствия

Обозначение	Аминокислота
однобуквенное	трехбуквенное
Υ	Туг	Тирозин
О	О1у	Глицин
Р	РЬе	Фенилаланин
М	Ме1	Метионин
А	А1а	Аланин
8	8ег	Серин
I	Не	Изолейцин
Ь	Беи	Лейцин
Т	ТЬг	Треонин
V	Уа1	Валин
Р	Рго	Пролин
к	Ьуз	Лизин
н	Из	Гистидин
Ω	О1п	Глутамин
Е	О1и	Глутаминовая кислота
Ζ	О1х	О1и и/или О1п
νν	Тгр	Триптофан
к	Агд	Аргинин
ϋ	Азр	Аспарагиновая кислота
N	Азп	Аспарагин
В	Азх	Азр и/или Азп
с	Суз	цистеин
X	Хаа	Неизвестная или другая

Следует отметить, что все последовательности аминокислотных остатков, представленные в на- 28 028865

стоящем документе в виде формулы, ориентированы слева направо в обычном направлении от аминоконца к карбоксильному концу. Кроме того, термин "аминокислотный остаток" в настоящем документе используется в широком смысле и включает аминокислоты, перечисленные в таблице соответствия (табл. 2), модифицированные и необычные аминокислоты, такие как упомянутые в 37 С.Р.К. §§ 1.8211.822 и включенные в настоящий документ посредством ссылки. Кроме того, следует отметить, что тире в начале или в конце аминокислотной последовательности указывает на пептидную связь с дальнейшей последовательностью из одного или более аминокислотных остатков, с аминоконцевой группой, такой как NН2, или с карбоксильной группой, такой как СООН.

В настоящем документе термин "гидрофобные аминокислоты" включает любую из аминокислот, для которой с использованием непрерывной шкалы гидрофобности Айзенберга установлено, что она является гидрофобной. Примерами являются природные гидрофобные аминокислоты, такие как изолейцин, фенилаланин, валин, лейцин, триптофан, метионин, аланин, глицин, цистеин и тирозин (ЕАепЪегу и др., (1982) Рагайау 8утр. СЬет. 8ос.17:109-120). Неприродные гидрофобные аминокислоты также включены в этот термин.

В настоящем документе "кислые аминокислоты" включают природные аминокислоты аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Неприродные кислые аминокислоты также включены в этот термин.

В настоящем документе "полярная аминокислота" относится к аминокислоте, которая является гидрофильной, так что боковые цепи предпочтительно находятся в водном окружении (т.е. в воде). Такие аминокислоты обычно расположены на поверхности белка. Такие аминокислоты обычно классифицируют как аминокислоты с полярными боковыми цепями, имеющими функциональную группу, такую как кислота, амид, спирт или амин, которая содержит кислород или азот, который может участвовать в образовании водородной связи с водой. Примерами таких аминокислот являются Агд (К), Αδη Αδρ (1)), С1и (Е), С1п (Ό), Ηίδ (Н), Ι.νδ (К), 8ег (8), ТЬг (Т) и Туг (Υ). Суδ (С) и Тгр (XV) также считаются слабо полярными.

В настоящем документе полярная и нейтральная аминокислота представляет собой полярную аминокислоту, которая содержит нейтральную боковую цепь. Примерами таких аминокислотных остатков для замены являются Αδη Щ), С1п (Р), 8ег (8), ТЬг (Т), Суδ (С) или Туг (Υ).

Используемый здесь термин "природные аминокислоты" относится к 20 1 .-аминокислотам, которые встречаются в полипептидах.

Используемый здесь термин "неприродные аминокислоты" относится к органическим соединениям, содержащим аминогруппу и карбоксильную группу, которые не являются природными аминокислотами, перечисленными в табл. 2. Неприродные аминокислоты, таким образом, включают, например, аминокислоты или аналоги аминокислот за исключением 20 природных аминокислот и включают, но не ограничиваются, Ώ-изостереомерами аминокислот. Примеры неприродных аминокислот известны специалистам в данной области и могут быть включены в модифицированные полипептиды фактора РХ.

В настоящем документе подходящие консервативные замены аминокислот известны специалистам в данной области техники и могут быть обычно осуществлены без изменения биологической активности полученной молекулы. Специалистам в данной области техники известно, что, в общем, единичные аминокислотные замены в неважных областях полипептида практически не изменяют биологическую активность (см., например, А'аЦоп е! а1., Мо1еси1аг Вю1о§у о£ !Ье Сепе, 4ΐ1ι Εάΐίΐοη, 1987, ТЬе Веп|атт/Ситтт^ РиЪ. со., р. 224). Такие замены могут быть осуществлены в соответствии с заменами, которые приведены в табл. 3 ниже.

Таблица 3

- 29 028865

Другие замены также допустимы и могут быть определены опытным путем или в соответствии с известными консервативными заменами.

В настоящем документе "конструкция ДНК" представляет собой одноцепочечную или двухцепочечную линейную или кольцевую молекулу ДНК, которая содержит сегменты ДНК, комбинированные и составленные в порядке, не встречающемся в природе. Конструкция ДНК существует как результат человеческой деятельности и включает клоны и другие копии подвергнутых манипуляции молекул.

В настоящем документе "сегмент ДНК" представляет собой часть большей молекулы ДНК с указанными свойствами. Например, сегмент ДНК, кодирующий указанный полипептид, представляет собой часть большей молекулы ДНК, например плазмиды или фрагмента плазмиды, который при его прочтении от 5'-конца к 3'-концу кодирует последовательность аминокислот указанного полипептида.

Используемый здесь термин "полинуклеотид" означает одноцепочечный или двухцепочечный полимер дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, читаемый от 5'- к 3'-концу. Полинуклеотиды включают РНК и ДНК и могут быть выделены из природных источников, синтезированы ίη νίίΓο или получены из комбинации природных и синтетических молекул. В настоящем документе длина полинуклеотидной молекулы дается в нуклеотидах (сокращенно "нт") или парах оснований (сокращенно "Ър"). Термин "нуклеотиды" используется для одноцепочечных и двухцепочечных молекул, где позволяет контекст. Когда термин применяется к двухцепочечной молекуле, он используется для обозначения общей длины и является синонимом термина пара оснований. Для специалиста в данной области техники очевидно, что две цепи двухцепочечного полинуклеотида могут незначительно отличаться по длине, и концы их могут быть расположены уступом, поэтому не все нуклеотиды в двухцепочечной молекуле полинуклеотида могут образовывать пары. Такие неспаренные концы, обычно, не превышают 20 нуклеотидов в длину.

В настоящем документе "первичная последовательность" относится к последовательности аминокислотных остатков в полипептиде.

Используемый здесь термин "сходство" для двух белков или нуклеиновых кислот относится к близости аминокислотных последовательностей белков или нуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот. Сходство может быть основано на степени идентичности и/или гомологии последовательностей остатков и содержащихся в них остатков. Способы оценки степени сходства белков или нуклеиновых кислот известны специалистам в данной области. Например, в одном способе оценки сходства последовательностей две аминокислотные или нуклеотидные последовательности выравнивают таким образом, чтобы достичь максимального уровня идентичности между последовательностями. Идентичность относится к степени, в которой аминокислотные или нуклеотидные последовательности инвариантны. При выравнивании аминокислотных последовательностей и, в некоторой степени, последовательностей нуклеотидов, также можно принять во внимание консервативные различия и/или частые замены аминокислот (или нуклеотидов). Консервативными различиями являются те, при которых сохраняются физикохимические свойства участвующих остатков. Выравнивание может быть глобальным (выравнивание сравниваемых последовательностей по всей длине последовательностей и по всем остаткам) или локальным (выравнивание частей последовательностей, которые включают только наиболее близкую область или области).

Используемые здесь термины "гомология" и "идентичность" употребляются как взаимозаменяемые, но гомология по отношению к белкам может включать консервативные замены аминокислот. В общем, для определения соответствующих положений последовательности аминокислот выравнивают для достижения наибольшего совпадения (см., например, СотрШаБопа1 Мо1еси1аг Вю1о§у, Ьекк, Α.Μ., ей., 0хГогй ИпщегеБу Рге88, №ν Уогк, 1988; ВюсотриБпд: 1пГогтаПс5 апй Оепоте РгсдеСз, 3114111, Ό.Α., ей., Асайетю Рге88, №ν Уогк, 1993; СотрШег Лпа1у818 оГ 3ециепсе ^аίа, Раг1 I, ОпГГш, Α.Μ., апй ОгЖп, Н.О., ей8., Нитапа Рге88, №ν 1ег8еу, 1994; 3ециепсе Лпа1у818 ш Мо1еси1аг Вю1о§у, νοη Нещ)е, О., Асайетю Рге88, 1987; апй 3ециепсе Лпа1у818 Рптег, ОпЪ8ко\\ М. апй ^еνе^еиx, ί., ей8., М 31оскЮп Рге88, Уогк, 1991; Сап11о е1 а1. (1988) 3IΑΜ ί АррБей ΜаίЬ 48:1073).

В настоящем документе термин "идентичность последовательности" относится к числу идентичных аминокислот (или нуклеотидных оснований) при сравнении исследуемого и контрольного полипептида или полинуклеотида. Гомологичные полипептиды обладают заранее определенным числом идентичных или гомологичных аминокислотных остатков. Гомология подразумевает консервативные аминокислотные замены и идентичные остатки. Идентичность последовательности может быть определена по стандартному алгоритму выравнивания, использующему выбранные по умолчанию штрафы за разрыв в последовательности, установленные разработчиком. Гомологичные молекулы нуклеиновой кислоты обладают заранее определенным числом идентичных или гомологичных нуклеотидов. Гомология подразумевает замены, которые не изменяют закодированные аминокислоты (то есть "молчащие замены") и идентичные остатки. По существу, гомологичные молекулы нуклеиновых кислот обычно гибридизуются в умеренных условиях или в жестких условиях по всей длине нуклеиновой кислоты или по меньшей мере примерно на 70, 80 или 90% от полной длины интересующей молекулы нуклеиновой кислоты. Также предусмотрены молекулы нуклеиновых кислот, которые содержат вырожденные кодоны вместо кодона в гибридизуемой молекуле нуклеиновой кислоты. (Для определения гомологии белков могут быть выров- 30 028865

нены не только идентичные аминокислоты, но и консервативные аминокислоты, в этом случае процент идентичности и процент гомологии отличаются). Обладают ли любые две молекулы нуклеиновой кислоты нуклеотидными последовательностями (или обладают ли любые два полипептида аминокислотными последовательностями), которые по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% "идентичны", может быть определено с помощью известных алгоритмов, таких как программа РΑδТΑ, с использованием, например, параметров по умолчанию, как описано Реагкоп и др., Ргос. №ι11. Асаб. δοί. υδΑ 85: 2444 (1988) (другие программы включают пакет программ ОСО (Оеуегеих, 1.. и др., №.1с1ею Аабк Кекеагсб 12(1): 387 (1984)), ΒΕΑδΤΡ, ΒΕΑδΊΉ, РΑδТΑ (А1ксби1, 8.Р., и др., 1. Мо1ес. ΒίοΙ. 215:403 (1990); Ошбе Ю НидеСошрШегк, Магйп 1. Βίκ6ορ, изд., Асабешю Ргекк, δаη Э1едо (1994), и СагШо и др. δΙΑΜ 1. Аррбеб Ма1б 48: 1073 (1988)). Например, функция Β6ΛδΤ базы данных Национального центра биотехнологической информации может быть использована для определения идентичности. Другие коммерчески доступные или общедоступные программы включают программу "МедАбдп" от ^NΑδίа^ (Маб1коп, Висконсин) и программу "Оар" генетической компьютерной группы университета Висконсина итуегкбу о£ ХУбсопкиг Оепебск СошрШег Огоир (и^О) (Маб1коп, Висконсин). Процент гомологии или идентичность молекул белков и/или нуклеиновых кислот могут быть определены, например, путем сравнения информации о последовательностях с использованием программы ОАР (см., например, №еб1ешаи и др., 1. Мо1. ΒΦ1. 48: 443 (1970), с изменениями, внесенными διηίΐΐι и \Уа1егтап (Абу. Арр1. МаШ. 2: 482 (1981)). Кратко, программа ОАР определяет сходство как число выровненных символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот), которые являются одинаковыми, деленное на общее число символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы ОАР могут включать: (1) унарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для совпадения и 0 для не совпадения) и взвешенную матрицу сравнения ОпЬккоу и др., №с1. Аабк Кек. 14: 6745 (1986), как описано δ^ιχνηΠχ и Оаубо££, Абак о£ Рго1еш δе^иеηсе апб δΙη-ΐανοΌ, №Фопа1 Β^οтеб^са1 Кекеагсб Роипбабоп, сс. 353-358 (1979); (2) штраф в размере 3,0 для каждого разрыва в последовательности, дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом разрыве и (3) штраф не применяется для разрывов в концах последовательности.

Таким образом, используемый здесь термин "идентичность" относится к сравнению исследуемого и контрольного полипептида или полинуклеотида. Например, фраза "по меньшей мере на 90% идентичны" относится к идентичности от 90 до 100% по отношению к контрольному полипептиду. Принимая для иллюстративных целей длину исследуемого и контрольного полипептидов за 100 аминокислот, идентичность на уровне 90% и более свидетельствует о том, что не более чем 10% (т.е. 10 из 100) аминокислот в исследуемом полипептиде отличается от контрольного полипептида. Подобные сравнения можно провести между исследуемым и контрольным полинуклеотидами. Такие различия могут быть представлены в виде точечных мутаций, случайно распределенных по всей длине аминокислотной последовательности, или различия могут быть сосредоточены в одном или нескольких местах различной длины вплоть до максимально допустимой, например 10/100 различающихся аминокислот (около 90% идентичности). Различия определяются как замены, вставки и удаления нуклеиновых оснований и аминокислот. При уровне гомологии или идентичности выше примерно 85-90% результат не должен зависеть от программы и параметров штрафа за разрыв, такие высокие уровни идентичности могут быть легко оценены, часто без использования программного обеспечения.

В настоящем документе термины "по существу, идентичные" или "сходные" варьируют в зависимости от контекста, как это понимает специалист в данной области техники, но специалист в данной области техники может оценить их.

В настоящем документе "выровненная последовательность" относится к использованию гомологии (сходства и/или идентичности) для выравнивания соответствующих положений в последовательности нуклеотидов или аминокислот. Как правило, две или более последовательности, которые обладают 50% и более идентичности, выравниваются. Выровненное множество последовательностей относится к 2 или более последовательностям, которые являются выровненными в соответствующих положениях, и может включать выравнивание последовательностей, полученных из РНК, таких как ΕδΤ и другие кДНК, с последовательностью геномной ДНК.

В настоящем документе термин "специфически гибридизуется" относится к отжигу через комплементарное спаривание оснований молекулы нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотида) с целевой молекулой нуклеиновой кислоты. Специалистам в данной области известны параметры ш νίΙΐΌ и ш У1уо, которые влияют на специфическую гибридизацию, такие как длина и состав конкретной молекулы. Особенно важные для ш νί6Ό гибридизации параметры дополнительно включают температуру отжига и отмывания, состав буфера и концентрацию соли. Примеры условий отмывания для удаления неспецифически связанных молекул нуклеиновой кислоты включают 0,1xδδΡЕ, 0,1% δΌδ, 65°С при высокой жесткости и 0,2xδδΡЕ, 0,1% δΌδ, 50°С при умеренной жесткости. Эквивалентные условия известны в уровне техники. Специалист в данной области может легко изменить условия для конкретной задачи для достижения специфической гибридизации молекул нуклеиновой кислоты с целевыми молекулами нуклеиновой кислоты.

В настоящем документе "выделенный" или "очищенный" белок или его каталитически активная

- 31 028865

часть, по существу, не содержит клеточного материала или других загрязняющих белков из клеток или тканей, из которых происходит белок, или является, по существу, свободным от химических веществпредшественников и других химических веществ при химическом синтезе. Препараты могут быть определены как, по существу, чистые, если они являются свободными от легкообнаруживаемых примесей, определяемых с помощью стандартных способов анализа, таких как тонкослойная хроматография (ТСХ), гель-электрофорез и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), используемых специалистами в области техники для оценки чистоты, или препараты могут быть определены как, по существу, чистые, если дальнейшая очистка не изменяет физические и химические свойства вещества, такие как протеолитическая и биологическая активность. Способы очистки белков для получения, по существу, химически чистых полипептидов известны специалистам в данной области.

Термин "по существу свободный от клеточного материала" относится к препаратам белков, где белок отделен от клеточных компонентов клеток, из которых он выделен или получен рекомбинантно. В одном варианте термин "по существу, свободный от клеточного материала" относится к препарату белка протеазы, имеющему примерно менее 30% (на сухой вес) белков, не являющихся протезой (также называемых здесь загрязняющими белками), как правило, менее 20% белков, не являющихся протезой, или 10% белков, не являющихся протезой, или примерно менее 5% белков, не являющихся протезой. Если протеаза или ее активная часть являются рекомбинантными, то они являются, по существу, свободными от культуральной среды, т.е. культуральная среда составляет менее чем примерно или точно 20, 10 или 5% от объема препарата протеазы.

Используемый здесь термин "по существу, не содержат химических веществ-предшественников и других химических веществ" относится к препарату белка протеазы, в котором белок отделен от химических веществ-предшественников и других химических веществ, которые использовали в синтезе белка. Этот термин включает препараты белка протеазы, имеющие менее 30% (на сухой вес), 20, 10, 5% или менее химических веществ-предшественников или химических веществ или компонентов, не являющихся протеазой.

В настоящем документе получение рекомбинантными методами с помощью методов рекомбинантной ДНК относится к использованию хорошо известных способов молекулярной биологии для экспрессии белков, кодируемых клонированной ДНК.

В настоящем документе "вектор" (или плазмида) относится к дискретному элементу, который используется для введения гетерологичных нуклеиновых кислот в клетки для их экспрессии или репликации. Векторы обычно остаются в эписомном состоянии, но могут быть разработаны для осуществления интеграции гена или его части в хромосому генома. Также предусмотрены векторы, которые представляют собой искусственные хромосомы, такие как бактериальные искусственные хромосомы, искусственные хромосомы дрожжей и искусственные хромосомы млекопитающих.

Выбор и использование таких векторов хорошо известны специалистам в данной области.

В настоящем документе "экспрессия" означает процесс, посредством которого нуклеиновая кислота транскрибируется в мРНК и транслируется в пептид, полипептид или белок. Если нуклеиновая кислота происходит от геномной ДНК, то при наличии соответствующей выбранной эукариотической клеткихозяина или организма экспрессия может включать процессинг, такой как сплайсинг РНК.

В настоящем документе "вектор экспрессии" включает векторы, способные экспрессировать ДНК, функционально связанную с регуляторными последовательностями, такими как промоторные области, которые способны вызывать экспрессию таких фрагментов ДНК. Такие дополнительные сегменты могут включать промоторные и терминаторные последовательности и, при необходимости, могут включать одну или несколько точек начала репликации, один или более маркеров для селекции, энхансер, сигнал полиаденилирования и тому подобное. Векторы экспрессии обычно получают из плазмидной или вирусной ДНК, или вектор может содержать элементы того и другого. Таким образом, вектор экспрессии относится к рекомбинантным конструкциям ДНК или РНК, например плазмидам, фагам, рекомбинантным вирусам или другим векторам, которые после введения в соответствующую клетку-хозяин приводят к экспрессии клонированной ДНК. Соответствующие векторы экспрессии хорошо известны специалистам в данной области и включают векторы, которые реплицируются в эукариотических клетках и/или прокариотических клетках, векторы, которые остаются в эписомном состоянии, или векторы, которые интегрируются в геном клетки-хозяин.

В настоящем документе вектор также включает "вирусный вектор" или "вирусные векторы". Вирусные векторы представляют собой сконструированные вирусы, функционально связанные с экзогенным геном для передачи (как носитель или челнок) экзогенного гена в клетки.

В настоящем документе "аденовирус" относится к любому вирусу из группы ДНК-содержащих вирусов, которые вызывают конъюнктивит и инфекции верхних дыхательных путей у человека.

В настоящем документе "голая" ДНК относится к свободной от гистонов ДНК, которая может быть использована для получения вакцин и генной терапии. Голая ДНК представляет собой генетический материал, который передается от клетки к клетке во время переноса генов, называемого трансформацией или трансфекцией. При трансформации или трансфекции очищенная или голая ДНК, поглощенная клеткой-реципиентом, дает клетке-реципиенту новую характеристику или фенотип.

- 32 028865

В настоящем документе термины "функционально" или "функционально связанный" по отношению к сегментам ДНК означают, что сегменты расположены так, что они функционируют в соответствии с их назначением, например транскрипция инициируется на промоторе и проходит через кодирующий сегмент до терминатора.

В настоящем документе агент, который модулирует активность белка или экспрессию гена или нуклеиновой кислоты, уменьшает или увеличивает или иным образом изменяет активность белка, или каким-либо образом положительно или отрицательно регулирует или иным образом изменяет экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке.

В настоящем документе "химерный белок" или "белок слияния" относится к полипептиду, функционально связанному с другим полипептидом. Химерные белки или белки слияния, предусмотренные в настоящем документе, могут включать один или несколько полипептидов РХ или их частей и один или несколько других полипептидов с любым одним или несколькими элементами, выбранными из сигналов управления транскрипции/трансляции, сигнальных последовательностей, метки для локализации, метки для очистки, части домена иммуноглобулина С и/или нацеливающего агента. Химерные полипептиды РХ также включают полипептиды, в которых эндогенные домены или области заменены на домены или области из другого полипептида. Эти белки или белки слияния включают белки, полученные с помощью рекомбинантной технологии как гибридные белки, а также белки, полученные химическими методами, например белки, полученные путем химического соединения, например соединения сульфгидрильных групп, и белки, полученные с использованием любого другого способа, с помощью которого по меньшей мере один полипептид (т.е. РХ) или его часть могут быть связаны напрямую или не напрямую через линкер (линкеры) с другим полипептидом.

В настоящем документе понятие "функционально связанные" по отношению к белку слияния относится к полипептидам протеазы и не протеазы, которые слиты в одной рамке считывания друг с другом. Полипептид, не являющийся протеазой, может быть слит с Ν-концом или С-концом полипептида протеазы.

В настоящем документе "нацеливающий агент" представляет собой любой фрагмент, такой как белок или его активная часть, который обеспечивает специфическое связывание с молекулой клеточной поверхности, такой как рецептор клеточной поверхности, которая в некоторых случаях может интернализовать связанный конъюгат или его часть. Нацеливающий агент также может представлять собой агент, который способствует или облегчает, например, аффинное выделение или очистку конъюгата, прикрепление конъюгата к поверхности или выявление конъюгата или комплекса, содержащего конъюгат.

В настоящем документе "производное" или "аналог" молекулы относится к части молекулы или модифицированной молекуле.

Используемый здесь термин "заболевание или расстройство" относится к патологическим состояниям организма, возникшим в результате факторов или состояний, включающих, но не ограничивающихся, инфекцией, приобретенными состояниями, генетическими состояниями, и характеризующимся идентифицируемыми симптомами. Заболевания и расстройства по настоящему документу включают заболевания и расстройства, затрагивающие коагуляцию, включая заболевания и расстройства, опосредованные участвующими в коагуляции белками, и заболевания и расстройства, в которых участвующие в коагуляции белки играют важную роль в этиологии и патологии. Заболевания и расстройства также включают вызванные отсутствием белков заболевания и расстройства, такие как гемофилии, при которых коагуляция не происходит из-за дефицита или дефекта белков, такие заболевания и расстройства представляют особый интерес в настоящем документе.

В настоящем документе термин "прокоагулянт" относится к любому веществу, которое способствует свертыванию крови.

В настоящем документе термин "антикоагулянт" относится к любому веществу, которое препятствует свертыванию крови.

В настоящем документе "гемофилия" относится к нарушению свертываемости крови, обусловленному дефицитом в крови факторов свертывания. Гемофилия может быть результатом, например, отсутствия, уменьшения экспрессии или снижения функционирования фактора свертывания крови. Наиболее распространенным типом гемофилии является гемофилия А, являющаяся результатом дефицита фактора VIII. Второй по распространенности тип гемофилии представляет собой гемофилию В, являющуюся результатом дефицита фактора IX. Гемофилия С, которую также называют дефицитом РХ1, является более мягкой и менее распространенной формой гемофилии.

Используемый здесь термин "врожденная гемофилия" относится к типам гемофилии, которые наследуются. Врожденная гемофилия является результатом мутации, удаления, вставки или другой модификации гена фактора свертывания крови, при которых фактор свертывания не образуется, образуется в меньшем количестве или не функционирует. Например, наследственные мутации в генах факторов свертывания крови, таких как фактор VIII и фактор IX, приводят к врожденным гемофилиям, гемофилии А и В соответственно.

В настоящем документе термин "приобретенная гемофилия" относится к типу гемофилии, который

- 33 028865

развивается в зрелом возрасте в результате образования аутоантител, которые инактивируют РУШ.

Используемый здесь термин "нарушение свертываемости крови" относится к состоянию, при котором у субъекта снижена способность останавливать кровотечения из-за ослабленного свертывания крови. Нарушения свертываемости крови могут быть наследственными или приобретенными и могут возникнуть, например, в результате дефекта или недостаточности пути коагуляции, дефекта или недостаточности активности тромбоцитов или дефектов сосудов.

В настоящем документе "приобретенное нарушение свертываемости крови" относится к нарушению свертываемости крови, вызванному недостаточностью свертывания вследствие заболевания печени, дефицита витамина К или применения Кумадина (варфарина) или другой антикоагулянтной терапии.

В настоящем документе "лечение" субъекта, страдающего заболеванием или состоянием, означает, что полипептид, композицию или другой продукт, предусмотренный в этом документе, вводят субъекту.

В настоящем документе "терапевтический агент", "схема лечения", "радиопротектор" или "химиотерапевтический агент" означают обычные лекарства и лекарственную терапию, включая вакцины, которые известны специалистам в данной области. Радиотерапевтические агенты хорошо известны в уровне техники.

В настоящем документе "лечение" представляет собой любой способ уменьшения или иного благотворного изменения симптомов состояния, расстройства или заболевания. Поэтому лечение включает профилактику, терапию и/или излечение. Лечение также включает любое фармацевтическое применение композиции по настоящему документу. Лечение также включает любое фармацевтическое применение модифицированного РХ и композиций, предусмотренных в настоящем документе.

В настоящем документе "улучшение симптомов заболевания или расстройства" посредством лечения, например введением фармацевтической композиции или другого лекарственного средства, относится к любому уменьшению, постоянному или временному, устойчивому или кратковременному, симптомов, связанному с введением или приписываемому введению композиции или лекарственного средства.

В настоящем документе "профилактика" или "предотвращение" относится к способам уменьшения риска развития заболевания или состояния. Профилактика включает уменьшение риска развития заболевания или состояния, и/или предотвращение ухудшения симптомов или развития заболевания, или уменьшение риска ухудшения симптомов или развития заболевания.

В настоящем документе "эффективное количество соединения или композиции" для лечения конкретного заболевания представляет собой количество, которое является достаточным для улучшения или любого уменьшения симптомов, связанных с заболеванием. Такое количество может быть введено одной дозой или согласно режиму введения, при котором введение эффективно. Указанное количество может привести к выздоровлению, но обычно приводит к улучшению симптомов заболевания. Обычно для достижения желаемого улучшения симптомов требуются повторные введения.

В настоящем документе "терапевтически эффективное количество" или "терапевтически эффективная доза" относится к количеству или дозе агента, соединения, материала или композиции, содержащей соединение, которые являются, по меньшей мере, достаточными для получения терапевтического эффекта. Эффективное количество представляет собой количество терапевтического агента, которое необходимо для предотвращения, излечения, улучшения, устранения или частичного устранения симптома заболевания или расстройства.

В настоящем документе "пациент" или "субъект", подвергающийся лечению, включает человека и животных, не являющихся человеком, в том числе млекопитающих. Млекопитающие включают приматов, таких как люди, шимпанзе, гориллы и низшие приматы; домашних животных, таких как собаки, лошади, кошки, свиньи, козы, коровы; и грызунов, таких как мыши, крысы, хомяки и песчанки.

В настоящем документе "комбинация" относится к любой ассоциации двух или более элементов. Комбинация может быть пространственной или относится к использованию двух или более элементов для одной цели.

В настоящем документе "композиция" относится к любой смеси двух или более продуктов или соединений (например, агентов, модуляторов, регуляторов, и т.д.). Композиция может представлять собой раствор, суспензию, жидкость, порошок, пасту, водную или неводную лекарственную форму или их комбинации.

В настоящем документе "изделие" представляет собой продукт, который изготавливается и продается. В настоящем документе термин включает полипептиды модифицированных протеаз и нуклеиновые кислоты, содержащиеся в упаковке.

В настоящем документе "жидкая композиция" относится к любой композиции, которая может течь. Таким образом, жидкие композиции включают композиции в полужидкой форме, пасты, растворы, водные смеси, гели, лосьоны, кремы и другие подобные композиции.

В настоящем документе "набор" относится к комбинации, помещенной в упаковку, по желанию содержащей реагенты и другие продукты и/или компоненты для осуществления способов с помощью элементов комбинации. Например, в настоящем документе предусмотрены наборы, содержащие модифицированные протеазы или молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению и еще один элемент, предназначенный, например, для введения, диагностики или оценки биологической активности или свойства. По

- 34 028865

желанию, наборы включают инструкции по использованию.

В настоящем документе "животные" включают любых животных, включая, но не ограничиваясь приматами, такими как человек, горилла и низшие приматы; грызунами, такими как мыши и крысы; птицами, такими как куры; жвачными животными, такими как козы, коровы, олени, овцы, мелким домашним скотом, таким как свиньи; и другими животными. В понятии "животные, не являющиеся человеком" люди исключены из числа предусмотренных животных. Предусмотренные здесь протеазы могут происходить из любого источника, включая животных, растения, прокариотов и грибы.

В настоящем документе "генная терапия" включает перенос гетерологичных нуклеиновых кислот, таких как ДНК, в определенные клетки, клетки-мишени млекопитающих, особенно человека, страдающего расстройством или состоянием, для которого предназначена такая терапия. В настоящем документе генная терапия включает перенос нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный полипептид РХ, предусмотренный в настоящем документе. Нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, вводят в выбранные клетки-мишени непосредственно, либо в векторе или другом средстве доставки таким образом, что гетерологичные нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, экспрессируются и производят таким образом закодированный терапевтический продукт. Альтернативно, гетерологичные нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, могут каким-либо образом опосредовать экспрессию ДНК, которая кодирует терапевтический продукт, или могут кодировать продукт, такой как пептид или РНК, который каким-либо образом опосредует, прямо или косвенно, экспрессию терапевтического продукта. Генная терапия также может быть использована для доставки нуклеиновой кислоты, кодирующей генетический продукт, который заменяет дефектный ген или дополняет генетический продукт, продуцируемый млекопитающим или клеткой, в которые введена нуклеиновая кислота. Введенная нуклеиновая кислота может кодировать терапевтическое соединение, такое как протеаза или модифицированная протеаза, которые в норме не производятся млекопитающим-хозяином или не производятся в терапевтически эффективных количествах или в терапевтически полезное время. Гетерологичные нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, кодирующие терапевтический продукт, могут быть модифицированы до введения в клетки хозяина для усиления или иного изменения продукта или его экспрессии. Генная терапия также может включать доставку ингибитора, репрессора или другого модулятора экспрессии генов.

В настоящем документе "терапевтически эффективный продукт" в генной терапии представляет собой продукт, который кодируется гетерологичной нуклеиновой кислотой, как правило, ДНК, который при введении нуклеиновой кислоты в хозяина экспрессируется и улучшает или устраняет симптомы и проявления наследственного или приобретенного заболевания, или который вылечивает заболевание. Терапевтически эффективный продукт также подразумевает биологически активные молекулы нуклеиновых кислот, такие как интерферирующие и антисмысловые РНК.

В настоящем документе утверждение, что полипептид "состоит, по существу" из указанной последовательности аминокислот означает, что присутствует только указанная часть полноразмерного полипептида или ее фрагмент. Полипептид, по желанию, как правило, включает дополнительные аминокислоты из другого источника или может быть вставлен в другой полипептид.

В настоящем документе упоминание понятий в единственном числе также включает множественное число, если контекст с очевидностью не указывает на иное. Таким образом, например, упоминание соединения, включающего "внеклеточный домен" относится к соединениям с одним или несколькими внеклеточными доменами.

В настоящем документе диапазоны и количества могут быть обозначены, как конкретные значения или диапазоны с добавлением термина "примерно". Термин примерно также включает в себя точное значение. Следовательно, "примерно 5 оснований" означает "примерно 5 оснований", а также "5 оснований".

В настоящем документе термины "по желанию" или "необязательно" означают, что описанные явления или обстоятельства могут иметь место или нет, и что описание включает случаи, когда указанное явление или обстоятельство происходит, и случаи, когда это не так. Например, необязательно замещенная группа означает, что группа не является замещенной или является замещенной.

В настоящем документе аббревиатуры для любых защитных групп, аминокислот и других соединений, если не указано иное, употребляются в соответствии с их обычным использованием и являются признанными аббревиатурами, или употребляются в соответствии с Комиссией по биохимической номенклатуре ЮТАС-ШВ (см. (1972) ВюсЬет. И: 1726).

В. Гемостаз и фактор Х

В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды фактора Х (РХ), в том числе модифицированные активированные полипептиды фактора Х (РХа) и их каталитически активные фрагменты. Являясь первым ферментом в общем пути образования тромба, РХ занимает уникальное и важное положение в каскаде свертывания крови. Дефициты факторов свертывания крови РХ или УШ, до РХ, приводят к нарушенной продукции РХа. Последствием такой нарушенной продукции РХа является снижение уровней тромбина и фибрина, образующего сгусток, что приводит к гемофилии (КоЪейк е1 а1. (2006). НеторЬШа А аиб ЬеторЬШа В. Ιη МА ЫсЙтаи е1 а1., ебк., ^ЬЬатк Нета!о1оду, 7^4Ь еб., рр. 18671886. №\ν Уогк: МсСга\\-НП1). Таким образом, РХ является привлекательным терапевтическим агентом, чтобы обойти дефициты факторов свертывания крови, расположенных выше в каскаде свертывания, и

- 35 028865

также может использоваться для других, не связанных с гемофилией медицинских применений, например для того, чтобы способствовать свертыванию крови в процессе хирургических процедур или после них.

Несмотря на то, что РХа потенциально может служить в качестве терапевтического прокоагулянта, с помощью которого можно обойти дефициты других факторов свертывания крови в каскаде, применение полностью функционального РХ в качестве терапевтического агента оказалось непрактичным из-за чрезмерной активации системного свертывания. Тогда как связывание активного РХа с его активированным кофактором, РУа, с образованием протромбиназного комплекса приводит к увеличению активации тромбина более чем в 100000 раз, РХа как таковой может на низком уровне активировать тромбин (№зЬеип е! а1. (1979) 1. ΒίοΙ. СЬет., 254:10952-10962). Таким образом, инфузия РХа может привести к нежелательному процессу индукции коагуляции. Действительно, введение РХа вызывает образование тромбина ίη νίνο и используется для индукции диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС) в моделях на животных (КгиЬЬоГ е! а1. (1997) ТЬотЬо818 апб НаетозЕМз 77(2):308-311; СЬез е! а1. (1984) 1. СЬп. Ькей. 74(6):2219-2225). Поэтому применение РХа в качестве терапевтического агента ограничено из-за опасений, что такие фармацевтические препараты являются тромбогенными и могут вызвать диссеминированную внутрисосудистую коагуляцию. Соответственно, исследование по применению РХ в качестве терапевтического агента было сосредоточено на применении неактивного зимогена РХ (см., например, патент США № 4501731). С помощью модифицированных полипептидов РХ, в том числе модифицированных полипептидов РХа, предусмотренных в настоящем документе, можно преодолеть эти проблемы.

Другим ограничением применения РХа в качестве терапевтического агента является короткий период полужизни циркулирующего РХа вследствие его быстрой инактивации ингибиторами протеаз крови, такими как антитромбин (АТ) III и белок С (СЬе1 е! а1. (1984) 1. ΒίοΙ. СЬет. 259(11):6890-6895; СЬез е! а1. (1988) Вг. 1. Наета!о1. 69(4):491-497).

Нежелательные активности РХа не ограничиваются только теми, которые связаны с каскадом свертывания. РХа также играет хорошо подтвержденную роль в активации иммунного и воспалительных путей и митогенеза в ответ на повреждение (АШеп (1993) В1ооб 81:569-579; А1Ьеп (1995) РАδЕΒ ί. 9:860-865; Стпо е! а1. (1997) 1. СЬп. Ιη\Ό5ΐ. 99(10):2446-2451; Ьеаб1еу е! а1. (2001) Сшт. 0ρίη. РЬагтасо1. 1(2):169-175). РХа-опосредованная активация иммунитета, воспаления и митогенеза может привести к нежелательным эффектам, таким как эдема (Стпо е! а1. (1997) ί. СЬп. 1тез!. 99(10):2446-2451). Эти активности РХа проявляет независимо от фактора У, и они обсуждаются ниже более подробно.

Важно отметить, что фактор Х в зимогенной конформации (обсуждается ниже) не может активировать вышеупомянутые пути (АтЬгозш е! а1. (1997) 1. Вю1. СЬет. 272(13):8340-8345). Поэтому, чтобы преодолеть описанные выше недостатки применения РХа в качестве терапевтического агента, предусмотренные в настоящем документе полипептиды РХа являются модифицированными, чтобы изменить структурные характеристики полипептида таким образом, чтобы полипептиды имитировали зимогенную конформацию и обладали низкой активностью или не обладали ею в отстутствии РУа. В присутствии насыщающих уровней РУа, тем не менее, активность мутантов РХа полностью восстанавливается после сборки в протромбиназный комплекс. Как показано в настоящем документе, формы РХа модифицированных РХ, предусмотренные в настоящем документе, включают такие формы, которые обладают относительной зависимостью от кофактора в виде отношения каталитической активности в присутствии РУа по сравнению с каталитической активностью в его отсутствии, превышающей или равной 150000 или более и, обычно, превышающей или равной 300000 или более, что больше приблизительно в 50-100 раз больше, чем наблюдается для РХа дикого типа.

Существующие в данной области техники мутанты РХа, которые, как утверждается, обладают зимогенподобной активностью, такие как мутант 1195Ь (соответствующий 116Ь согласно нумерации химотрипсина, см. йапсш е! а1. (2011) №!иге Вю!есЬпо1оду, 29:1028-1033 апб Випсе е! а1. (2011) В1ооб, 117:290-8), по-прежнему сохраняют значительную активность в отсутствии РУа. Это может ограничить терапевтические применения некоторых зимогенподобных мутантов РХа. В настоящем документе было обнаружено, что модифицированные зимогенподобные полипептиды РХа, которые обладают значительно увеличенной зависимостью от кофактора, имеют терапевтические преимущества, поскольку облегчают коагуляцию, не демонстрируя токсичность, связанную с тромбозом и воспалением. Таким образом, в настоящем документе предусмотрены такие модифицированные полипептиды РХа. Кроме того, предусмотренные в настоящем документе полипептиды РХа также включают те полипептиды, которые устойчивы к инактивации ингибиторами протеаз плазмы, такими как ΑΤΙΙΙ, или по другой причине обладают увеличенным или улучшенным периодом полужизни в крови.

Последующие разделы и подразделы описывают каскад свертывания, структуру, процессинг и регуляцию форм РХ (например, зимогенной формы и формы РХа), и функцию РХ в каскаде свертывания. Структура, функция и регуляция РУ-зависимой и РУ-независимой активности также описаны ниже.

1. Каскад свертывания.

Коагуляция представляет собой сложный процесс, в результате которого кровь образует сгусток (тромб). Это важная часть гемостаза, заключающаяся в прекращении кровотечения из поврежденного

- 36 028865

сосуда, при этом поврежденные стенки кровеносных сосудов покрываются сгустком, содержащим тромбоциты и фибрин для остановки кровотечения и начала восстановления поврежденного сосуда. Расстройства коагуляции могут привести к увеличению риска кровотечения (кровоизлияния) или обструктивного свертывания (тромбоз). Каскад свертывания высоко консервативен и включает клеточные (тромбоциты) и белковые (факторы свертывания крови) компоненты. В первичную фазу коагуляции тромбоциты активируются с образованием гемостатической пробки в месте повреждения. Далее следует вторая фаза гемостаза с участием факторов свертывания крови плазмы, которые действуют в протеолитическом каскаде, приводящем к образованию нитей фибрина, которые укрепляют тромб.

Протеолитический каскад, ведущий к укреплению тромбоцитарной пробки, осуществляется в виде серии реакций, в которых циркулирующий зимоген (неактивный предшественник фермента) сериновой протеазы и его гликопротеиновый кофактор активируются, превращаясь в активные компоненты, которые далее катализируют следующие реакции в каскаде, в конечном счете, приводящие к образованию поперечно-сшитого фибрина. Факторы свертывания крови обычно нумеруются римскими цифрами (например, фактор X). Строчная "а", добавляемая к римской цифре, указывает на активную форму (например, фактор Ха).

Каскад свертывания классически делят на три пути: внешний путь (или путь тканевого фактора), внутренний путь (или контактная активация) и общий путь (см. фиг. 2). Внутренний и внешний пути осуществляются параллельно и сходятся в факторе X, с которого начинается общий путь, приводящий к образованию фибринового сгустка (Мапп ей а1. (1990) Βίοοά, 76(1): 1-16).

a) Путь свертывания тканевого фактора (внешний). Коагуляция инициируется почти сразу же после повреждения эндотелия, выстилающего кровеносный сосуд. Первичным путем для инициации свертывания крови является путь тканевого фактора. Тканевый фактор (ТФ) представляет собой трансмембранный белок, экспрессируемый на поверхности клеток и в норме не попадающий в кровоток. После попадания в кровь ТФ связывается с циркулирующей сериновой протеазой фактором УП (РУН), что приводит к активации фактора УП (РУПа) на поверхности мембраны. Комплекс ТФ/РУПа (также называемый теназой) далее катализирует превращение неактивного, циркулирующего фактора X (РX) в активную сериновую протеазу (РXа) на поверхности клетки, несущей ТФ.

b) Внутренний путь свертывания.

Внутренний путь коагуляции включает ферменты, которые в норме присутствуют в плазме, и начинается с образования белкового комплекса, включающего фактор XII (РXΠ), на экспонированном коллагене после нарушения целостности кровеносного сосуда. Среди других событий, чтобы инициировать протеазный каскад, РXΠ активируется до РXΠа. РXΠа превращает РXI (фактор XI) в РXIа. Фактор XIа активирует фактор IX (РIX) до РКа. РКа далее образует комплекс теназы с гликопротеиновым кофактором, РУШа, который активирует РX до РXа на поверхности активированных тромбоцитов.

c) Общий путь.

Внешний и внутренний пути сходятся на расщеплении зимогенной формы РX теназными комплексами ТФ/РУПа и РУШа/РКа и, таким образом, на активации РX с образованием активной формы РX (РXа) (фиг. 2). Взаимодействие РXа с его активированным кофактором, фактором У (РУа), в стехиометрическом отношении 1:1 в присутствии Са²' приводит к образованию мембраносвязанного протромбиназного комплекса. Протромбиназный комплекс образуется на поверхности мембраны за счет связывания РXа с его кофактором РУа, субстратом протромбином и с фосфолипидами поверхности. Протромбиназа действует, расщепляя протромбин (также называемый РП) по Аг§323-Пе324, с последующим расщеплением по Аг§274-Тйг275 с образованием активной сериновой протеазы, тромбина (также называемого РПа) (КПзйпаз^ату ей а1. (1986) I. ΒίοΙ. Сйет., 261:8977-8984; КПзйпазтату ей а1. (1987) I. ΒίοΙ. Сйет., 262:3291-3299). Тромбин далее превращает фибриноген в фибрин, что приводит к образованию сгустка в месте повреждения с последующим поперечным сшиванием белков фибринов активированной трансглутаминазой фактором XIII.

В дополнение к превращению фибриногена в фибрин РXа-активированный тромбин участвует в усилении и распространении процесса свертывания за счет механизма обратной связи для дальнейшей активации внутреннего пути коагуляции путем непосредственного расщепления, и, таким образом, активации, нескольких компонентов внутреннего пути коагуляции (например, превращение фактора XI в фактор XIа и превращение фактора УШ в фактор УШа). Тромбин также распространяет процессы свертывания и образования тромба, активируя фактор У в общем пути и активируя тромбоциты.

В дополнение к своей роли в протромбиназном комплексе РXа способен проявлять активность обратной связи, активируя, в дополнение к тромбину, факторы свертывания крови, в том числе РУ, РУШ и РУП, и может играть роль в активации активируемых протеазами рецепторов (РАК) (Розйег ей а1. (1983) 1. ΒίοΙ. Сйет., 258(22):13970-13977; ЕаЮп ей а1. (1986) Вюсйет15йу, 25(2):505-512; Ви1епа« апб Мапп (1996) Вюсйет15йу, 35(6):1904-1910).

2. Независимая от фактора У активность.

В отсутствии фактора У/Уа РXа может на низком уровне активировать тромбин и также функционировать в не связанных с гемостазом клеточных процессах, в том числе, опосредуя воспалительный ответ, экспрессию генов и пролиферацию клеток (Сатегег ей а1. (1999) 1. ΒίοΙ. Сйет. 274:32225-32233;

- 37 028865

Сшпо е! а1. (1997) 1. С1ш. Ιηνβδΐ. 99(10):2446-2451; Оа.)би8ек е! а1. (1986) 1. Се11 Вю1. 103:419-428; Оаяс е! а1. (1992) Ргос. ЫаИ. Асаб. 8ск И8А. 89:2317-2320; НегЬей е! а1. (1998) 1. С1ш. 1ше8!. 101:993-1000; Ко е! а1. (1996) 1. С1ш. Ιηνβδΐ. 98:1493-1501; Рараре!горои1о8 е! а1. (1998) Ргос. №ιΐ1. Асаб. 8ск И8А 95:47384742; 8епбеп е! а1. (1998) 1. 1ттипо1 161:4318-4324). Эти РУ/РУа-независимые активности описаны более подробно ниже.

а) Активация тромбина.

В отсутствии своего кофактора, фактора Уа, РХа сохраняет некоторую каталитическую активность, приводящую к активации протромбина, хотя эта активность и является значительно сниженной (№8Йе1т е! а1. (1979) 1. Вю1. СЬет., 254:10952-10962). Пути активации протромбина различны в зависимости от того, находится ли РХа в растворе или включен в протромбиназный комплекс с РУа на поверхности фосфолипидов. В растворе активация протромбина протекает путем первоначального расщепления протромбина по Агд274, в результате чего образуется претромбин и фрагмент 1.2, с последующим вторичным расщеплением фрагмента претромбина по Агд323 с образованием А и В цепей α-тромбина, связанных дисульфидными связями (Мапп е! а1. (1981) Ме!Ьоб8 Еп/уто1.. 80:286-302).

В противоположность этому, когда мембраносвязанный протромбин активируется мембраносвязанной протромбиназой, активация протромбина протекает путем расщепления сначала по Агд323, с образованием цепей мейзотромбина, связанных дисульфидными связями, в качестве промежуточного продукта, с последующим расщеплением мейзотромбина по Агд 274 с образованием а-тромбина и фрагмента активационного пептида 1.2 (1<п8Ьпа8\уату е! а1. (1986) 1. Вю1. СЬет. 261(19)8977-8984).

Интермедиат мейзотромбин сам по себе является функциональной сериновой протеазой, которая служит в качестве мощного вазоконстриктора (ТЬотр8оп е! а1. (1987) В1ооб, 70:410а. (АЬ8!гас! 1494); ТЬотр8оп е! а1. (1990) 1. Уа8с. Меб. Вю1, 1:348; Эоу1е апб Мапп (1990) 1. Вю1. СЬет., 265(18):1069310701) и может действовать как регулирующий элемент в свертывании крови, активируя антикоагулянт белок С (обсуждается ниже) при связывании с тромбомодулином (Мапп е! а1. (1990) В1ооб, 76(1):1-16).

Ь. Воспаление и пролиферация клеток.

В дополнение к своей роли в каскаде свертывания РХа вносит вклад в другие физиологические механизмы, включая воспаление и митогенез (Ъеаб1еу е! а1. (2001) Сигг. 0рш. РЬагтасо1. 1(2):169-175). РХа инициирует эти сигнальные пути в различных клетках, прежде всего, путем связывания с протеазным рецептором эффекторных клеток (Ейес!ог Се11 Рго!еа8е Кесер!ог, ЕРК-1) или путем протеолитической активации активируемых протеазами рецепторов (РАК).

ί. Протеазный рецептор эффекторных клеток (Ейес!ог Се11 Рго!еа8е Кесер!ог-1, ЕРК-1).

Протеазный рецептор эффекторных клеток (ЕРК-1) был идентифицирован как рецептор для РХа на поверхности моноцитов, лейкоцитов, сосудистых эндотелиальных клеток и гладкомышечных клеток (А1Пеп (1995) РА8ЕВ 1 9:860-865; №сЬокоп е! а1. (1996) 1. Вю1. СЬет. 271:28407-28413; Вопо е! а1. (1997) 1. Се11. РЬу8ю1. 172:36-43). Связывание РХа с ЕРК-1 приводит к активации лейкоцитов (А1йеп (1995) 1. Ьеикосу!е Вю1. 58:120-127), образованию тромбина (ВоисЬагб е! а1. (1997) 1. Вю1. СЬет. 272:9244-9251; АтЬго8Ш1 апб АШеп (1996) 1. Вю1. СЬет. 271:1243-1248) и пролиферации клеток (№сЬойоп е! а1. (1996) 1. Вю1. СЬет. 271:28407-28413). Активация лейкоцитов сопровождается синтезом цитокинов и экспрессией молекул адгезии, что приводит к расширению сосудов и воспалению как части иммунного ответа.

Последовательность ЬРТККЬ (8ЕО ГО N0: 555) РХа, расположенная в положениях 83-88 зрелой последовательности РХ, представляет собой сайт распознавания для ЕРК-1 (АтЬго81ш е! а1. (1997) 1. Вю1. СЬет. 272 (13): 8340-8345; Стпо е! а1. (1997) 1. С1т. Ιπ\Ό8ΐ. 99(10):2446-2451). Ферментативная активность РХа не необходима для связывания ЕРК-1 (НегЬей е! а1. (1998) 1. С1ш. Ιπ\Ό8ΐ. 101:993-1000; АтЬго8Ш1 е! а1. (1997) 1. Вю1. СЬет. 272 (13): 8340-8345). Тем не менее, активация РХ необходима для связывания ЕРК-1, поскольку зимогенная конформация фактора Х закрывает доступ к связывающему ЕРК-1 фрагменту. Конформационный переход в легкой цепи РХа демаскирует домен взаимодействия, делая возможным связывание ЕРК-1 с последующей передачей сигнала.

ц) Активируемые протеазами рецепторы (РАК).

РХа также может инициировать клеточную сигнализацию посредством протеолитической активации активируемых протеазами рецепторов (РАК). РАК представляют собой рецепторы, связанные с Обелком, высокоэкспрессируемые в тромбоцитах, эндотелиальных клетках, миоцитах и нейронах (МасГаг1апе е! а1. (2001) РЬагтасо1. Кет. 53(2):245-282). В частности, РХа расщепляет активируемый протеазами рецептор-1 (РАК-1) и активируемый протеазами рецептор-2 (РАК-2) с высвобождением Мконцевого пептида, который, в свою очередь, действует как привязанный лиганд, приводя к активации (МсЬеап е! а1. (2001) ТЬотЬо818 Ке8еагсЬ 103:281-297). Активация РАК-1 и РАК-2 приводит к увеличенной пролиферации клеток, опосредованной сигналингом, связанным с О-белком (МасГабапе е! а1. (2001) РЬагтасо1. Ке\'. 53(2):245-282), увеличенной продукции провоспалительных цитокинов и молекул адгезии (МсЬеап е! а1. (2001) ТЬотЬо818 Ке8еагсЬ 103:281-297; 8епбеп е! а1. (1998) 1. 1ттипо1 161:4318-4324; Рарарейорои1о8 е! а1. (1998) Ргос. №-Н1. Асаб. 8сг И8А 95:4738-4742) и увеличенной продукции протромботического тканевого фактора (ТФ) (МсЬеап е! а1. (2001) ТЬотЬо818 Ке8еагсЬ 103:281-297). Ферментативная активность РХа необходима для активации сигналинга через РАК (МсЬеап е! а1. (2001) ТЬотЬо818 Ке8еагсЬ 103:281-297).

- 38 028865

3. Ингибиторы фактора Х.

Активность фактора Х ингибируется тремя основными антикоагулянтными белковыми системами в крови: антитромбин III (АТ-111)/гепарин, белок С/белок 8 и ингибитор пути тканевого фактора (ТРР1). Эти три системы играют различные взаимодополняющие роли в ингибировании активности фактора Х, тем самым ингибируя каскад свертывания.

Антитромбин (АТ-ΙΙΙ) ингибирует активность фактора Ха как сериновой протеазы, блокируя фермент на промежуточной стадии протеолитического процесса, когда фактор Х инициирует атаку на реакционноспособную связь в реакционноспособном сайте петли в АТ-ΙΙΙ. Гепарин способствует ингибированию фактора Ха путем индукции конформационных изменений в петле активного центра АТ-ΙΙΙ, что облегчает ее вхождение в активный центр фактора Ха, и путем непосредственного взаимодействия с основными остатками на поверхности фактора Ха, что облегчает образование стабильного неактивного тройного комплекса (Ре/а1е. АК, (2000) I. Βίο1. СЬет., 275(5):3320-3327; Бапдйо^п е! а1. (2004) I. Βίο1. СЬет., 279 (45): 47288-7297).

В пути белка С другой зимоген витамин К-зависимой сериновой протеазы, белок С, который циркулирует в плазме, превращается в активированный белок С (АРС) в результате ограниченного протеолиза с помощью комплекса тромбин-тромбомодулин-эндотелиальный рецептор белка С на поверхности эндотелия после образования тромбина как результата каскада свертывания (Евтоп апй 0\уеп (1981) Ргос. №11. Асай. 8сЕ И8А, 78:2249-2252). Активный белок С (АРС) далее ингибирует активность фактора Ха, инактивируя фактор Уа (РУа) путем протеолитического расщепления. Расщепление РУа активированным белком С (АРС) облегчается белком 8, который катализирует расщепление РУа белком С и связывает РХа для ингибирования инактивации белка С (Мовтег апй Опйт ΙΗ (2006) РгопР Вюксц 11: 23812399).

Ингибитор пути тканевого фактора (ТРРГ) ингибирует фактор Ха путем непосредственного связывания с фактором Ха, но не с зимогеном фактора Х, в активном центре или вблизи него (Вго/е е! а1. (1988) В1оой, 71 (2): 335-343; Вго/е е! а1. (1990) ВюсЬет18йу, 7539-7546). Как и в случае АТ-ΙΙΙ, описанного выше, ингибирование РХа ингибитором ТРРI ускоряется в присутствии гепарина. Комплекс РХаΊΤΡΙ далее ингибирует путь коагуляции тканевого фактора (и дополнительную активацию РХ), связываясь с комплексом теназы РУПа-тканевой фактор и ингибируя его.

С. Структура фактора Х и его активация

Фактор Х, как и другие ферменты коагуляции, циркулирует в крови в виде неактивного предшественника, называемого зимогеном, для активации которого необходимо его протеолитическое расщепление. Зимогены обладают примерно в 10000 раз меньшей протеолитической активностью по сравнению с сериновой протеазой, которая получается после активации. Инициация коагуляции в месте повреждения сосуда, как обсуждалось выше, приводит к серии реакций, в которых зимоген превращается в активную протеазу в результате специфического протеолитического расщепления с образованием активного фермента для последующей реакции. РХа образуется при протеолитическом расщеплении зимогена РХ комплексами теназ ТФ/РУПа и РУШа/РКа (смотрите фиг. 2). Это приводит к активации клеток крови и превращению растворимого фибриногена в нерастворимый фибрин и, таким образом, формированию сгустка. Избыток протеаз удаляется реакцией с циркулирующими ингибиторами протеаз, которые действуют как «субстраты-самоубийцы», или с ингибиторами протеаз, которые распознают активные ферменты. Таким образом, протеолитическая активация зимогенов свертывания является ключевым регулирующим свойством системы свертывания крови.

кДНК фактора Х была клонирована из множества видов млекопитающих. Примеры полипептидов РХ включают, но не ограничиваются ими, человеческий полипептид (полипептид предшественник приведен в 8ЕО ГО N0: 2 и кодируется 8ЕО ГО N0: 1; и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 134), полипептид северного белощекого гиббона (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N08: 393, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 404), оливкового бабуина (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 394, и зрелая форма 8Е0 ГО N0: 405), макака-резус (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0:395, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0:406), обезьяны прыгуна-молох (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 396, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 407), африканского слона (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 397, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 408), мыши (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 398, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 409), кролика (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 399, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 410), крысы (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 400, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 411), собаки (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 401, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 412), свиньи (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0: 402, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0: 413) и бычий полипептид (полипептид предшественник приведен в 8Е0 ГО N0:403, и зрелая форма приведена в 8Е0 ГО N0:414). Также были идентифицированы несколько аллельных вариантов человеческого РХ (СагдЫ е! а1. (1999) №1. 0еп., 22:231-238; 8Е0 ГО N08:547-552).

Процессы и структурные особенности, которые регулируют процессинг неактивного зимогенапредшественника РХ при секреции в кровоток, приводящий к образованию функционального активного

- 39 028865

фермента РХа, описаны ниже на примере человеческих зрелых зимогенных полипептидов РХ и полипептидов РХа. На основе такого описания специалист в данной области техники знает и может определить соответствующие зрелые, зимогенные формы, формы РХа и каталитически активные формы для других полипептидов РХ, в том числе для их аллельных или видовых вариантов. Например, понятно, что зимогенная форма включает двухцепочечную форму любой из указанных выше одноцепочечных зрелых форм, в которой аминокислотные остатки вырезаются за счет внутрицепочечного протеолиза одноцепочечного РХ, так что полипептид содержит легкую цепь и тяжелую цепь, связанные дисульфидной связью. Кроме того, РХа различных видов, а также аллельные варианты и другие варианты обычно существуют в виде двухцепочечной формы, у которой отсутствует активационный пептид. Исходя из описания в настоящем документе на примере человеческого РХ и знаний в данной области технике о его видовых и аллельных вариантах, специалист в данной области техники знает и может определить остатки, соответствующие таким формам в приведенных в качестве примера аллельных и видовых вариантах и других вариантах, известных в данной области технике.

1. Процессинг РХ, посттрансляционная модификация и секреция зимогена.

Фактор Х является сериновой эндопротеиназой и представителем семейства протеаз пептидазы δ1, которые имеют химотрипсинподобную укладку. Человеческий ген, кодирующий фактор Х, расположен в длинном плече хромосомы 13 (13д34). Он состоит из 8 экзонов и имеет в длину приблизительно 33 тысячи оснований, и экспрессируется преимущественно в печени. Транскрипт человеческого РХ имеет в длину 1560 нуклеотидов, которые включают короткую 5' нетранслируемую область и открытую рамку считывания (включая стоп-кодон) из 1467 нуклеотидов, и 3' нетранслируемую область. Открытая рамка считывания из 1467 нуклеотидов (или мРНК РХ; δΕρ ГО N0: 1) кодирует препропептид из 488 аминокислот (номер доступа δ^ίδδ-ΡΓοΐ Ρ00742; δΕρ ГО N0: 2).

Фактор Х синтезируется в печени в виде одноцепочечного белка-предшественника, который называется препропептид. Препропептид РХ процессируется, когда он проходит секреторный путь в клетке печени. На примере человеческого РХ препропептид содержит ^концевой сигнальный пептид из 31 аминокислоты (аминокислоты 1-31 в δΕρ ГО N0: 2), который направляет полипептид фактора Х по секреторному пути в гепатоците путем транслокации в эндоплазматический ретикулум (ЭР). Сигнальный пептид далее расщепляется сигнальной пептидазой, так что остается пропептид из 9 аминокислот (аминокислоты 32-40 из δΕρ ГО N0: 2) на новом аминоконце, в результате чего образуется пропептидная форма РХ. Когда полипептид укладывается в свою третичную структуру в просвете ЭР, образуется 12 дисульфидных связей. Касательно человеческого РХ эти связи образуются между остатками цистеина в положениях 17 и 22, 50 и 61, 55 и 70, 72 и 81, 89 и 100, 96 и 109, 111 и 124, 132 и 302, 201 и 206, 221 и 237, 350 и 364, 375 и 403, в соответствии с остатками, приведенными в δΕρ ГО N0:134 (см. фиг. 1).

Полученный полипептид далее посттрансляционно модифицируется в просвете ЭР. ^концевой пропептид служит в качестве распознаваемого элемента, что приводит к превращению нескольких остатков глутаминовой кислоты (соответствующих аминокислотам 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 32 и 39 полипептида РХ, приведенного в δΕρ ГО N0: 134)) в γ-карбоксиглутаминовую кислоту (С1а) с помощью витамин К-зависимой карбоксилазы (Риле апй Рипе (1988) Се11, 53:505-518). Эта стадия γкарбоксилирования играет важную роль в транспорте предшественника РХ между ЭР и аппаратом Гольджи (δΐηηΐοη апй ^аШп (1992) ВюсЬет. I, 284:25-31) и вовлечена в оптимальную Са²+-опосредованную активацию циркулирующего зрелого зимогена РХ. Полипептид РХ далее посттрансляционно модифицируется в транс-Гольджи компартменте путем β-гидроксилирования и гликозилирования. Исследования показали, что гликозилирование этих остатков является важным для распознавания зимогена фактора Х его физиологическими активаторами (Υηπβ е! а1. (2009) 1. ТЬготЬ. Ηаетοδΐ., 7(10): 1696-1702). Например, что касается человеческого РХ, гидроксилирование происходит по остатку аспарагиновой кислоты, который соответствует положению 63 полипептида РХ, приведенного в δΕρ ГО N0:134 (МсМи11еп е! а1. (1983) ВюсЬет181гу, 22:2875-2884), и гликозилирование происходит по остаткам треонина в положениях, соответствующих остаткам 159 и 171, и по остаткам аспарагина в положениях, соответствующих остаткам 181 и 191, полипептида РХ, приведенного в δΕρ ГО N0: 134 (Июне апй Мο^^ίа (1993) Еиг. 1. ВюсЬет, 218:153-163).

Пропептид удаляется путем протеолитического расщепления в транс-Гольджи аппарате с образованием зрелой формы, в которой отсутствует пропептид (приведена в δΕρ ГО N0: 134), что происходит до секреции зимогена в кровоток. Кроме того, внутрицепочечный протеолиз одноцепочечного зрелого РХ, который может предшествовать расщеплению пропептида или следовать за расщеплением пропептида, также происходит в транс-Гольджи компартменте (81ап1»п апй ^аШп (1992) ВюсЬет. 1. 284:25-31). Это приводит к удалению аминокислот 140-142, соответствующих остаткам, приведенным в δΕρ ГО N0: 134, и образованию двухцепочечного полипептида. Таким образом, полученный секретируемый зимоген РХ существует в виде легкой цепи и тяжелой цепи, связанных дисульфидной связью. Например, со ссылкой на зрелую одноцепочечную форму, приведенную в δΕρ ГО N0: 134, легкая цепь включает 130 аминокислот (соответствует остаткам 1-139 в δΕρ ГО N0: 134) и тяжелая цепь включает 306 аминокислот (соответствует остаткам 143-448 в δΕρ ГО N0: 134). Секретируемый зимоген существует в виде двухцепо- 40 028865

чечной формы, поскольку вырезаются аминокислоты 140-142 из δΕφ ΙΌ N0: 134, при этом легкая и тяжелая цепи РХ остаются связанными дисульфидной связью между Суδ 132 (легкой цепи) и Суδ 302 (тяжелой цепи), со ссылкой на аминокислотные остатки, приведенные в δΕφ ΙΌ N0: 134 (Όί δαρίο е1 а1. (1977) Β^οсЬет^δΐ^у, 16:698-706).

Секретируемая двухцепочечная зимогенная неактивная форма, содержащая легкую цепь и тяжелую цепь, содержит активационный пептид на Оконце тяжелой цепи, который должен быть удален для активации фермента (см. фиг. 2). В отношении человеческого РХ, приведенного в δΕφ ΙΌ N0: 134, зимоген РХа дикого типа имеет легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотам 1-139 из δΕφ ΙΌ N0: 134, и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотам 143-448, где активационный пептид состоит из 52 аминокислотных остатков на аминоконце тяжелой цепи. Активный РХ (РХа) образуется путем протеолитического расщепления для удаления активационного пептида, как обсуждается ниже. Легкая и тяжелая цепи РХа остаются связанными дисульфидной связью между Суδ 132 (легкой цепи) и Суδ 302 (тяжелой цепи), со ссылкой на аминокислотные остатки, приведенные в δΕφ ΙΌ N0: 134.

До отщепления активационного пептида (обсуждается ниже) циркулирующая зимогенная форма фактора Х существует в структурной конформации, которая структурно отличается от РХа в отношении четырех основных сегментов. Эти сегменты, совместно называемые "активационный домен", представляют собой вконец тяжелой цепи (активационный пептид плюс остатки 195-198 из δΕφ ΙΌ N0: 134) и остатки 325-334, 365-377 и 400-406 (соответствующие остаткам, приведенным в δΕφ ΙΌ N0: 134). Активационный пептид на Оконце тяжелой цепи конформационно блокирует сегменты активационного домена РХ. В неактивном зимогене активационный домен закрывает часть субстрат-связывающего кармана (сайт δ1), тем самым ограничивая доступ субстрата и лишь в незначительной степени допуская каталитическую активность.

2. Активация и образование активированного фактора Х (РХа).

Активационное расщепление зимогенной формы и, обычно, высвобождение активационного пептида необходимы для образования активной сериновой протеазы. Обычно, в случае сериновых протеаз, для превращения зимогена в активную протеазу требуется расщепление после Агд¹⁵ (как правило, связи между Агд¹⁵ и Не¹⁶) согласно нумерации химотрипсина. Это может привести к удалению активационного пептида и экспонированию нового Оконца в каталитическом домене, начиная с Не¹⁶. Например, что касается РХ, активированный РХ (РХа) образуется из зимогена РХ путем удаления активационного пептида, которое происходит после протеолитического расщепления между аминокислотами 194-195, соответствующими остаткам, приведенным в δΕφ ΙΌ N0: 134. Для РХ протеолитическое расщепление инициируется ίη νίνο активированными ранее (выше в каскаде свертывания) сериновыми протеазами каскада свертывания, а именно комплексами теназ ТФ/РУПа и РУШа/ИХа. Активация путем протеолитического расщепления также может быть индуцирована ίη νίίΓο, например, с помощью активатора РХ из яда гадюки Рассела, как описано в примерах в настоящем документе.

Протеолитический процессинг, приводящий к удалению активационного пептида, демаскирует новый вконец тяжелой цепи, соответствующий гидрофобным остаткам Пе195-01у198 в зрелом РХ, приведенном в δΕφ ΙΌ N0: 134. Полученный РХа содержит каталитически активную тяжелую цепь, связанную с легкой цепью дисульфидной связью. Что касается последовательности аминокислот, приведенной в δΕφ ΙΌ N0: 134, РХа дикого типа имеет легкую цепь, имеющую последовательность аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотам 1-139 из δΕφ ΙΌ N0: 134, и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотным остаткам 195-448 из δΕφ ΙΌ N0: 134. Легкая и тяжелая цепи РХа остаются связанными дисульфидной связью между Суδ 132 (легкой цепи) и Суδ 302 (тяжелой цепи), со ссылкой на аминокислотные остатки, приведенные в δΕφ ΙΌ N0: 134.

Экспонированная новая ^концевая последовательность тяжелой цепи укладывается в каталитический домен и вставляется в углубление, связывающее вконец, специфичным к последовательности образом. ^концевая вставка приводит к образованию солевого мостика между а-ИН₂ группой Пе16 и Αρδ194 внутри каталитического домена согласно нумерации химотрипсина (соответствуют Пе195 и Αδρ378 по нумерации зрелого РХ, приведенного в δΕφ ΙΌ N0: 134). Образование солевого мостика связано с многочисленными изменениями в структуре каталитического домена, включая перегруппировки активационных доменов, образование полости оксианиона, необходимой для катализа, и образование сайта связывания. Эти изменения приводят к созреванию активной сериновой протеазы. Например, перегруппировка третичной структуры вседствие образования углубленного солевого мостика между вновь экспонированным ^концом и Αδρ378 в гидрофобном ядре приводит к конформационным изменениям в активационном домене, которые упорядочивают субсайт δ1 и приводят к активной протеазе.

Остатки тяжелой цепи 195-448 из δΕφ ΙΌ N0: 134 представляют собой домен химотрипсиноподобной сериновой протеазы. Как и другие представители семейства химотрипсинподобных сериновых протеаз, протеазный домен РХ содержит два субдомена в виде β-бочонка со структурой греческого ключа, которые сходятся в каталитическом активном сайте. Остатки Ηίδ236, Αδρ282 и δе^379 составляют каталитическую триаду активного центра активной протеазы. Дополнительный автопротеолиз РХа после

- 41 028865

Агд429 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 134 превращает α-форму РХа в β-форму (Мег1ен8 аий ВсПта. ВюсНст. 1. (1980) 185:647-658). Тем не менее, эти две формы РХа функционально неразличимы (Ргу/й1а1 аий Ке881ег, 1. Βίο1. СЬет. (1996) 271:16621-16626).

Активный центр протеазного домена состоит из четырех (4) субкарманов, нумеруемых 81-84. Карман 81 находится рядом с каталитической триадой в трехмерной структуре и является основным детерминантом субстратной специфичности и связывания. Карман 81 образуется петлями, состоящими из остатков 398-403 и 373-379 из 8ЕЦ ГО N0: 134, которые связаны дисульфидной связью Су8403-Су8375, и остатков 409-412 из 8ЕЦ ГО N0: 134. В кармане 81 остатки А8р373, С1у400 и С1у410 являются ключевыми остатками, обуславливающими селективность связывания субстрата. Сайт 82 представляет собой небольшой неглубокий карман, образованный петлей, соответствующей остаткам 270-279 из 8ЕЦ ГО N0: 134 (Ка е! а1., Сигг. Мей. СЬет. (2001) 8(2):101-1 19). Туг, соответствующий Туг279 из 8ЕЦ ГО N0: 134, является важным для специфичности фермента остатком в субсайте 82 (Ке/а1е, 1. Βίο1. СЬет. (1996) 271(39):23807-23814). Область 83 РХа расположена на краю кармана 81, экспонирована растворителю и в незначительной степени обеспечивает специфичность связывания. Субсайт 84 образован между петлей, содержащей аминокислоты 270-279 и 350-359 из 8ЕЦ ГО N0: 134, и содержит 3 лигандсвязывающих домена: "гидрофобный бокс" (образованный остатками Туг279, РЬе356 и Туг399 из 8ЕЦ ГО N0: 134), "катионную полость" (образована боковой цепью С1и277 и основной цепью К276 из 8ЕЦ ГО N0: 134) и сайт связывания воды (теа1ег 811е) (образован остатками ТЬг278, 11е357 и ТЬг359 из 8ЕЦ ГО N0: 134) (Ка е! а1., Сигг. Мей. СЬет. (2001) 8(2):101-119).

Легкая цепь РХа и зимогенной формы имеет три характерных структурных домена, каждый из которых обладает различными функциональными свойствами (Ьеу1и8 е! а1., ВюсЬет18Ьу. (1986) 25:50985102; РайтаηаЬЬаη е! а1., 1. Μο1. Βίο1. (1993) 232:947-966). Домен, богатый γ-карбоксиглутаминовой кислотой (СЬА) (остатки 1-39 из 8ЕЦ ГО N0: 134), содержит 11 остатков СЬА, указанных выше, и имеет важное значение для Са²+-зависимой ассоциации РХ с клеточными мембранами: он требуется для сборки протромбиназного комплекса (ΜοπΕι аий ,^Εδοη, 1. Βίο1. СЬет. (1986) 261(9):4015-4023). За доменом СЬА следует короткий гидрофобный участок (соответствующий остаткам 40-45 из 8ЕЦ ГО N0: 134) и два домена, подобных эпидермальному фактору роста (ЕСР): ЕСР1 (соответствующий остаткам 46-84 из 8ЕС ГО N0:134) и ЕСР2 (соответствующий остаткам 85-128 из 8ЕЦ ГО N0:134), которые участвуют в белок-белковых взаимодействиях и, в случае ЕСР1, в связывании Са²+ с участием остатков С1у47, С1у64, С1п49, А8р/Нуа63 и А8р46 (^Ειι^Γ-8ιιηι·κι1κ·ι^η е! а1., 1. Βίο1. СЬет. (1992) 267(27): 19642-19649).

Несмотря на то, что РХа обладает полностью функциональным активным сайтом и содержит каталитический механизм для расщепления протромбина в тромбин, он является плохим катализатором этой реакции, хотя обладает некоторой активностью. Эта независимая от кофактора активность обусловливает некоторые вредные побочные эффекты, связанные с инфузией РХа, как обсуждалось выше. Обычно для полной активности в виде эффективного расщепления биологических субстратов необходим фактор Уа (РУа) в качестве кофактора. РУа, присутствующий на мембранах тромбоцитов, связывается с РХа, что приводит к увеличению аффинности РХа к фосфолипидам и увеличению каталитической активности (см., например, 8едег8 е! а1. (2007) ТЬготЬ. Наетο8ΐ., 98:530-542). Например, как показано в примерах, РХа дикого типа обычно обладает увеличенной больше чем в 3000 раз каталитической активностью по отношению к своему субстрату в присутствии РУа, чем в его отсутствии. Коровым эпитопом связывания кофактора в РХа являются остатки Аг§347, Ьу8351 и Ьу8414, соответствующие остаткам, приведенным в 8ЕС ГО N0: 134 (см., например, Кийс1рЬ е! а1. (2001) 1. Βίο1. СЬет., 276:5123-5128).

Ό. Модифицированные полипептиды фактора Х

В настоящем документе предусмотрены варианты или модифицированные полипептиды фактора Х (РХ), в том числе зимоген протеазы РХ и активные полипептиды протеазы РХ (РХа), которые обладают измененной или улучшенной активностью или свойствами по сравнению с соответствующей формой полипептида РХ, не содержащей модификацию (модификации). В частности, такие измененные или улучшенные активности или свойства очевидны, когда полипептид РХ активирован или когда он существует в виде модифицированного полипептида РХа. Активности и свойства, которые изменены в модифицированных полипептидах РХ, предусмотренных в настоящем документе, включают увеличенную зависимость от кофактора РУа, увеличенную устойчивость к ингибиторам, увеличенный уровень гликозилирования или степень гликозилирования, увеличенный период полужизни и/или увеличенную каталитическую активность. Например, увеличенная устойчивость к ингибиторам может проявляться как увеличенная устойчивость к одному или обоим ингибиторам, выбранным из ингибитора пути тканевого фактора (ТРР1) или антитромбина III (АТ-ΙΙΙ). Активные формы модифицированных полипептидов РХ, предусмотренные в настоящем документе, обладают каталитической активностью, в том числе в присутствии РУа, и, таким образом, прокоагулянтной активностью. Такие модифицированные полипептиды РХ могут быть использованы в лечении заболеваний или состояний, чтобы обеспечить коагулянтную активность, но при этом не нуждаться в ферментах, действующих ранее в каскаде свертывания крови, таких как РУШа и Р1Ха.

В частности, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ, в том

- 42 028865

числе зимоген фактора Х и полипептиды РХа, когда они присутствуют в их активной форме РХа, сохраняют улучшенную локальную активность в месте раны или обладают улучшенной локальной активностью в месте раны, но обладают небольшой системной активностью, либо не обладают системной активностью в отсутствии кофактора. Этот результат обусловлен модификацией (модификациями), предусмотренными в настоящем документе, которые приводят к существенному увеличению зависимости от кофактора по сравнению с РХа дикого типа или любым существующим в данной области техники вариантом РХа. Таким образом, модифицированные протеазы, предусмотренные в настоящем документе, в виде активных полипептидов РХа обладают намного большей активностью, чем РХа дикого типа, но являются более безопасным, поскольку циркулирующая свободная форма может обладать высокой (т. е. сравнимой с РХа дикого типа) активностью, только будучи связанной с кофактором РVа в месте раны. Модифицированные полипептиды РХ, в том числе зимогенные формы РХ и РХа, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы в терапевтических применениях для лечения субъектов, имеющих гемофилию (гемофилия А или В), а также в других применениях для контроля гемостаза, например, при хирургическом вмешательстве или другой травме.

Также предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, в том числе формы зимогена фактора Х и РХа, которые обладают увеличенным периодом полужизни. Проблемой применения зимогена/протеазы фактора Х/фактора Ха в качестве лекарственного средства для лечения гемофилии является короткий период полужизни. Например, фактор Х имеет период полужизни от 24 до 40 ч. Для продолжительного лечения пациентов с гемофилией, у которых наблюдается дефект или дефицит в каскаде свертывания, более длительный период полужизни является выгодным, чтобы избежать повторного дозирования с частотой, которая является неудобной и нежелательной. Модифицированные зимогены/протеазы фактора Х/фактора Ха, предусмотренные в настоящем документе, обладают измененным периодом полужизни из-за измененного уровня и/или типа гликозилирования. Гликозилирование может увеличить период полужизни полипептидов в сыворотке за счет увеличения стабильности, растворимости и снижения иммуногенности белка. Модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, в том числе формы зимогена фактора Х и РХа, также обладают увеличенным периодом полужизни в активной форме из-за увеличенная устойчивости к ингибиторам, таким как АТ111 и другие ингибиторы.

Модификация (модификации) в полипептиде РХ могут быть введены в любую форму полипептида РХ, при условии, что форма, когда она экспрессирована, очищена и процессирована (ίη νίίτο или ίη νίνο), представляет собой РХа, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь без активационного пептида. Для целей, предусмотренных в настоящем документе, ссылка на аминокислотную замену (аминокислотные замены) в полипептиде РХ в настоящем документе приводится в отношении остатков в зрелой форме, приведенной в δΕΟ ΙΌ N0: 134, которая содержит легкую цепь (соответствует аминокислотным остаткам 1-139) и тяжелую цепь (соответствует аминокислотным остаткам 140-448), где тяжелая цепь содержит аминокислотные остатки 140-142 и 52-аминокислотный активационный пептид, который в норме не присутствует в форме РХа. Таким образом, в настоящем документе предусмотрены модифицированные зрелые формы полипептида РХ. Аминокислотные замены могут быть сделаны в соответствующих остатках любой формы РХ или любого варианта РХ, известного в данной области техники, путем выравнивания со зрелым полипептидом, приведенным в δΕΟ ΙΌ N0: 134 (см., например, фиг. 1). Таким образом, также в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, которые представляют собой двухцепочечные зимогенные формы без аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотным остаткам 140-142 из δΕΟ ΙΌ N0: 134, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, связанные дисульфидной связью, и которые содержат аминокислотную замену (аминокислотные замены) со ссылкой на нумерацию, приведенную в δΕΟ ΙΌ N0:134. Также в настоящем документе предусмотрены модифицированные формы РХа, которые представляют собой двухцепочечные формы δΕΟ ΙΌ N0:134 без аминокислотных остатков, соответствующих аминокислотным остаткам 140-142, без активационного пептида в тяжелой цепи, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, связанные дисульфидной связью, и которые содержат аминокислотную замену (аминокислотные замены) со ссылкой на нумерацию, приведенную в δΕΟ ΙΌ N0:134. Соответствующие остатки в других формах РХ или в других полипептидах РХ, отличных от δΕΟ ΙΌ N0:134, могут быть идентифицированы путем выравнивания с δΕΟ ΙΌ N0:134.

Везде в заявке также дается ссылка согласно нумерации химотрипсина, которая является общепринятой схемой нумерации, используемой для нумерации аминокислотных остатков в любой сериновой протеазе (Сгеет (1990) РгоЮйъ: δΙπκΙιιΐΌ. ΕιιηοΙίοη апб СемеНсь 7:317-334). Соответствующая схема нумерации для нумерации РХ, основанная на зрелой последовательности, приведенной в δΕΟ ΙΌ N0:134, и основанная на химотрипсине, предусмотрена в настоящем документе в табл. 1. Таким образом, специалист в данной области техники может осуществить аминокислотную замену (аминокислотные замены), предусмотренную в настоящем документе, в любом варианте РХ, известном в данной области техники, со ссылкой на нумерацию химотрипсина.

Таким образом, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, содержащие модификации в зрелом РХ, приведенном в δΕΟ ΙΌ N0: 134, или в его зимогенной, активной, каталитически активной форме, которые включают модификацию (модификации), или в его варианте,

- 43 028865

который обладает по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с 5ЕО ГО N0: 134, или в его зимогенной, активной, каталитически активной форме, которые включают модификацию (модификации). Например, модификации могут быть осуществлены со ссылкой на любой аллельный или видовой вариант, известный в данной области техники, такой как любой вариант, приведенный в любой из 5Е0 ГО N05: 393-414 или 547-552, или другой, вариант, известный в данной области техники (см., например, раздел Ό.5), или введены в его зимогенные, активные или каталитически активные формы.

Полученный модифицированный полипептид РX может представлять собой одноцепочечную форму или может содержать две или больше цепей. Как правило, модифицированный полипептид РX представляет собой двухцепочечный зимоген или представляет собой двухцепочечный активный РXа. Понятно, что любой модифицированный полипептид, предусмотренный в настоящем документе в виде одноцепочечного полипептида, может быть автоактивирован или активирован с образованием двухцепочечной формы. Также любой модифицированный полипептид, предусмотренный в настоящем документе в зимогенной форме, содержащей активационный пептид, может быть активирован с помощью любых известных активаторов (например, другие комплексы факторов свертывания крови или с образованием модифицированной двухцепочечной формы РXа. Стадию активации можно осуществить ίη νίίτο, или она может быть осуществлена при введении ίη νίνο, например введении зимогенной формы ίη νίνο. Например, когда активацию осуществляют ίη νίίτο, конечная форма РXа может быть очищена от активационного пептида или других расщепляемых пептидных последовательностей, как это известно в данной области техники и описано в других разделах в настоящем документе, в том числе в примерах. Модифицированный полипептид РX, как правило, обладает активностью в своей двухцепочечной активной форме РXа.

Например, модифицированные полипептиды РX, предусмотренные в настоящем документе, включают двухцепочечные формы, имеющие легкую цепь и тяжелую цепь, связанные по меньшей мере одной дисульфидной связью. В частности, модификации в полипептиде РX введены в зимогенную двухцепочечную форму, имеющую легкую цепь, которая имеет последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотам 1-139 из 5Е0 ГО N0: 134, и тяжелую цепь, которая имеет последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотам 143-448, или в ее вариант, который представляет собой зимоген и который обладает по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с РX, имеющим легкую цепь, которая имеет последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотам 1-139 из 5Е0 ГО N0: 134, и тяжелую цепь, которая имеет последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотам 143-448. В других примерах модификация (модификации) в полипептиде РX введена (введены) в двухцепочечную форму РXа без активационного пептида. Например, модификация (модификации) в полипептиде РX введена (введены) в РXа, имеющий легкую цепь, которая имеет последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотным остаткам 1-139 из 5Е0 ГО N0: 134, и тяжелую цепь, которая имеет последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотам 195-448 в 5Е0 ГО N0: 134, или в его вариант, который обладает каталитической активностью и который обладает по меньшей мере 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с РXа, имеющим легкую цепь, которая имеет последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотным остаткам 1-139 из 5Е0 ГО N0: 134, и тяжелую цепь, которая имеет последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотам 195-448 из 5Е0 ГО N0: 134, или в его каталитически активную часть.

Предусмотренные в настоящем документе модификации начального, немодифицированного полипептида сравнения включают аминокислотные замены, добавления или делеции аминокислот или любые их комбинации. Например, модифицированные полипептиды РX включают 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 или больше модифицированных положений. Также в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РX с двумя или большим числом модификаций по сравнению с начальным полипептидом РX сравнения. Модифицированные полипептиды РX включают 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 или больше модифицированных положений.

Модификация (модификации), предусмотренная (предусмотренные) в настоящем документе, может (могут) включать любую одну или несколько модификаций, которые изменяют активность или свойство формы РXа полипептида РX, например увеличивают зависимость от кофактора, увеличивают устойчивость к ингибиторам, изменяют гликозилирование и/или увеличивают период полужизни по сравнению с формой РXа, не содержащей модификацию (модификации). Например, модифицированные полипептиды РX, предусмотренные в настоящем документе, могут включать модификацию (модификации), которые увеличивают зависимость от кофактора. В таких примерах зависимость от кофактора может быть увеличена путм снижения каталитической активности в отсутствии РVа (РVа-независимой каталитической активности) и/или снижения аффинности к субстрату (субстратной аффинности) (например, для протромбина) в отсутствии кофактора РVа. В другом примере модифицированные полипептиды РX, предусмотренные в настоящем документе, могут включать модификацию (модификации), которые увеличивают период полужизни. В таких примерах период полужизни можно увеличить путем одной или не- 44 028865

скольких модификаций, которые увеличивают устойчивость к ингибиторам, таким как ΤРΡI или ΑΤ-ΙΙΙ. В других примерах период полужизни можно увеличить путем одной или нескольких модификаций, которые приводят к добавлению новых сайтов гликозилирования, так что модифицированный полипептид РХ является гликозилированным или гипергликозилированным. В конкретных примерах в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, могут включать модификацию (модификации), которые увеличивают зависимость от кофактора и увеличивают период полужизни по сравнению с РХ, не содержащим модификацию (модификации). В некоторых примерах, единичная модификация, такая как единичная аминокислотная замена, изменяет 2, 3, 4 или больше свойств или активностей полипептида РХ. Можно оценить каждое свойство и активность модифицированных полипептидов РХ и обычно их форм РХа, предусмотренных в настоящем документе, для идентификации диапазона эффектов модификации. Такие анализы известны в данной области техники и описаны ниже.

Полученные модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, когда они находятся в активной двухцепочечной форме в виде модифицированного РХа, обладают РУазависимой коагулянтной активностью. В активной форме РУа-зависимая активность сохраняется, т. е. поддерживается или увеличивается по сравнению с РХа, не содержащим модификацию (модификации). Например, активность составляет по меньшей мере 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190% или больше от РУа-зависимой активности РХа, не содержащего модификацию (модификации).

Любая модификация, предусмотренная в настоящем документе, может быть комбинирована с любой другой модификацией, известной специалисту в данной области техники (например, любой модификацией, приведенной в разделе Ό.5), при условии, что полученный модифицированный полипептид РХ обладает увеличенной зависимостью от кофактора, увеличенной устойчивостью к ингибиторам, измененным гликозилированием (например, гипергликозилирование) и/или увеличенным периодом полужизни и сохраняет РУа-зависимую коагулянтную активность по сравнению с полипептидом РХ, не содержащим модификацию (модификации), где каждый полипептид находится в его активной двухцепочечной форме.

Другие модификации в первичной последовательности полипептида или не в первичной последовательности полипептида также могут быть включены в модифицированный полипептид РХ, включая, но не ограничиваясь этим, добавление углеводного фрагмента, добавление фрагмента полиэтиленгликоля (РЕО), добавление домена Рс и т.п. Например, такие дополнительные модификации могут быть введены для увеличения стабильности или периода полужизни белка. Модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, также включают полипептиды РХ, которые дополнительно модифицированы клеточным аппаратом, и включают, например, гликозилированные, γкарбоксилированные и β-гидроксилированные полипептиды.

Также в настоящем документе предусмотрены молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любые модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе. В конкретных примерах, последовательность нуклеиновой кислоты может быть оптимизированной с точки зрения встречаемости кодонов, например, для увеличения уровня экспрессии кодируемой последовательности. Конкретная частота использования кодона зависит от организма-хозяина, в котором экспрессируется модифицированный полипептид. Специалисту в данной области техники известны оптимальные кодоны для экспрессии в клетках млекопитающих или человека, бактерий или дрожжей, в том числе, например, в Е. сой или 8ассЬаготусез сеге\аз1ае. Например, информация о частоте использования кодона доступна из Сойоп Изаде ОаЮЬазе. доступной на сайте ка/иза.ог.|р.соЬоп (см., например, КюЬтопй (2000) Оепоте Вю1оду, 1:241 для описания базы данных). См. также Рогзйигд (2004) Уеаз1, 10:1045-1047; Вго\т е1 а1. (1991) №с1ею ЛсЛз КезеагсЬ, 19:4298; 8Ьагр е1 а1. (1988) №с1ею ЛсЛз Кез., 12:8207-8211; 8Ьагр е1 а1. (1991) Уеазг 657-78).

В некоторых примерах кодирующие молекулы нуклеиновых кислот также могут быть модифицированы, чтобы содержать гетерологичную последовательность, которая изменяет процессинг полипептида. Например, нуклеиновая кислота может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичную сигнальную последовательность, препропептид (содержащий сигнальную последовательность и пропептид) или пропептид, чтобы увеличить секрецию или продукцию полипептида или иным образом улучшить функциональную продукцию белка. В конкретных примерах нуклеиновая кислота может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую препропептид или пропептид витамин К-зависимого белка, который обладает измененной (например, пониженной) аффинностью к γ-карбоксилазе по сравнению в пропептидом фактора Х. γ-Карбоксилаза представляет собой фермент, который катализирует модификацию глутамата (О1и) до γ-карбоксилглутаминовой кислоты (О1а), которая необходима для активности фактора Х. Пропептид фактора Х имеет самую высокую аффивность к γ-карбоксилазе среди других витамин К-зависимых полипептидов, таких как фактор УП, белок 8, фактор ГХ, белок С и протромбин (Сапиге е1 а1. (2000) ВюсЬет1зЬу, 39:14322-9). Модификация кодирующей нуклеиновой кислоты таким образом, чтобы она содержала препропептид или пропептид из другого витамин К-зависимого полипеп- 45 028865

тида, обладающий пониженной аффинностью к γ-карбоксилазе, увеличивает γ-карбоксилирование за счет большего оборота субстрата, что, в свою очередь, увеличивает продукцию белка, которая приводит к увеличению процента белка, являющегося γ-карбоксилированным. Например, в настоящем документе предусмотрены нуклеиновые кислоты, кодирующие модифицированный полипептид РХ, который содержит гетерологичную последовательность пропептида протромбина (приведена в виде аминокислотных остатков 1-43 в любой из 8ЕО ГО N0: 415-546). Как описано в других разделах в настоящем документе, кодирующие нуклеиновые кислоты также могут быть получены в клетках, трансфицированных витамин К-эпоксидредуктазой (УК0К), чтобы дополнительно увеличить фракцию карбоксилированного фактора Х (см., например, 8ип е1 а1. (2005) Βίοοά, 106:3811-3815).

Модифицированные полипептиды и кодирующие молекулы нуклеиновых кислот, предусмотренные в настоящем документе, могут быть получены стандартными методами рекомбинантных ДНК, известными специалисту в данной области техники. Для осуществления мутации в одной или нескольких аминокислотах в белке-мишени может быть использован любой способ, известный в данной области техники. Способы включают стандартный сайт-направленный или случайный мутагенез кодирующих молекул нуклеиновых кислот или способы твердофазного синтеза полипептидов. В частности, могут быть использованы способы полного химического синтеза, в том числе синтеза пептидов с последующим лигированием пептида. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид РХ, могут быть подвергнуты мутагенезу, такому как случайный мутагенез кодирующей нуклеиновой кислоты, ПЦР с внесением ошибок, сайт-направленный мутагенез (например, с использованием набора, такого как, например, РшкСЬаиде, доступный от 81га1адепе), ПЦР с перекрыванием фрагментов, генной перетасовке или другим рекомбинантным способам. Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, могут быть введены в клетку-хозяин для гетерологичной экспрессии. В некоторых примерах модифицированные полипептиды РХ получают синтетическим путем, например используя полный химический синтез, например, твердофазный пептидный синтез и пептидный синтез в растворе.

В подразделах, приведенных ниже, описаны примеры модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе, обладающих измененными свойствами и активностями, в том числе модифицированные формы зимогена РХ или РХа и кодирующие их молекулы нуклеиновых кислот. Описание ниже организовано на основе одного или нескольких свойств или активностей, выбранных из следующих свойств или активностей: увеличенная зависимость от кофактора, увеличенная устойчивость к ингибиторам (например, АТ-ΙΙΙ) и измененное гликозилирование. Понятно, что эти свойства и активности не являются взаимоисключающими, так что один или несколько модифицированных полипептидов, предусмотренных в настоящем документе, могут обладать одним, двумя или всеми идентифицированными выше свойствами или активностями.

Также ниже в настоящем документе в некоторых примерах модифицированных полипептидов РХ, которые содержат модификацию в положении 195 на Уа1, А1а, 8ег или ТЬг и/или модификацию в положении 196 на 11е, А1а, 8ег или ТЬг со ссылкой на положения, приведенные в 8Е0 ГО N0: 134 (соответствуют остаткам 16 и 17 согласно нумерации химотрипсина), модифицированный полипептид РХ не содержит гетерологичный активационный пептид из другой сериновой протеазы, который дает сайт процессирования протеазы, не встречающийся в факторе Х дикого типа. В одном из примеров модифицированный полипептид фактора Х, предусмотренный в настоящем документе, в виде предшественника, зрелой или зимогенной формы, который содержит аминокислотную замену в положении 195 и/или 196 (например, замену на 11е, Уа1, А1а, 8ег или ТЬг), содержит Аг§194 (Аг§15 согласно нумерации химотрипсина) как часть сайта расщепления протеазы. В конкретных примерах предшественник, зрелая или зимогенная форма полипептида фактора Х, предусмотренные в настоящем документе, содержат активационный пептид РХ, соответствующий аминокислотным остаткам 143-194 последовательности аминокислот, приведенной в 8Е0 ГО N0: 134. В примерах в настоящем документе, модифицированные полипептиды РХа, предусмотренные в настоящем документе в активной форме, содержащие модификацию в положении 195 и/или 196 (например, модификацию на 11е, Уа1, А1а, 8ег или ТЬг), становятся активными путем активационного расщепления и процессинга модифицированного зимогена РХ, содержащего активационный пептид, соответствующий аминокислотным остаткам 143-194 в последовательности аминокислот, приведенной в 8Е0 ГО N0: 134.

1. Измененное гликозилирование.

В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, в том числе модифицированный зимоген РХ и модифицированные полипептиды РХа, которые содержат одну или несколько модификаций в полипептиде РХ, такую как измененное гликозилирование полипептида. Модификации могут представлять собой вставки, делеции или замены аминокислот. В частности, модификации представляют собой аминокислотные замены. Сайты гликозилирования обеспечивают сайты для прикрепления моносахаридов и олигосахаридов к полипептиду посредством гликозидной связи, так что когда полипептид продуцируется в эукариотической клетке, способной к гликозилированию, он является гликозилированным. Двумя основными типами гликозилирования является ^связанное гликозилирование, где сахаридные единицы присоединяются через амидный азот остатка аспарагина, и 0-связанное

- 46 028865

гликозилирование, где сахаридные единицы присоединяются через гидроксильную группу остатков серина, треонина, гидроксилизина или гидроксипролина. Другие более минорные формы гликозидных связей включают δ-связь с цистеином и С-связь с триптофаном. Ν-связанное гликозилирование происходит по аспарагинам в консенсусной последовательности -Лкп-Хаа-Бег/ТЬг/Сук, где Хаа не является пролином. Для О-гликозилирования нет известных мотивов, хотя О-гликозилирование является более вероятным в последовательностях с высокой долей остатков серина, треонина и пролина. Наличие потенциального сайта гликозилирования, тем не менее, не означает, что сайт обязательно будет гликозилирован в процессе посттрансляционного процессинга в ЭР. Более того, уровень гликозилирования в данном сайте может варьировать, и один сайт может иметь много разных гликановых структур.

РХ обычно представляет собой гликозилированный белок с двумя О-связанными и двумя Νсвязанными сайтами гликозилирования, присутствующими в части активационного пептида полипептида (соответствуют остаткам ТЬг159, ТЬг171, Л§п181 и Л§п191 со ссылкой на БЕЦ ГО N0:134). Эти остатки, подвергающиеся гликозилированию, необходимы для активации зимогена с помощью физиологических активаторов (см., например, Уапд е! а1. (2009) 1. ТЬготЬ. НаетоЛ.. 7:1696-1702).

В настоящем документе установлено, что в РХ могут быть введены дополнительные сайты гликозилирования, которые могут изменить функционирование и активность полипептида. Обычно, функционирование и активность полипептида улучшены или увеличены за счет добавления дополнительных сайтов гликозилирования, что тем самым обеспечивает преимущества при терапевтическом применении. Например, гликозилирование может увеличить период полужизни полупептидов в сыворотке за счет увеличения стабильности, растворимости и снижения иммуногенности белка. Гликозилирование может увеличить устойчивость белков за счет уменьшения протеолиза белка и может защитить белок от термической деградации, воздействия денатурирующих агентов, повреждения свободными радикалами кислорода и изменения рН. Гликозилирование также обеспечивает возможность белку-мишени уклониться от механизмов клиренса, которые могут включать связывание с другими белками, в том числе рецепторами поверхности клеток. Углеводные фрагменты, которые содержат сиаловую кислоту, могут влиять на растворимость белка. Фрагменты сиаловой кислоты являются сильно гидрофильными и могут защитить гидрофобные остатки белка-мишени. Это уменьшает агрегацию и преципитацию целевого белка. Снижение агрегации также помогает в предотвращении иммунной реакции против белка-мишени. Углеводы, кроме того, могут заслонять иммуногенные последовательности от иммунной системы. Объем пространства, занимаемого углеводными фрагментами, может уменьшить площадь поверхности, доступную для иммунной системы. Эти свойства приводят к снижению иммуногенности белка-мишени.

Таким образом, предусмотренные в настоящем документе полипептиды РХ, которые обладают измененным гликозилированием, могут обладать улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами, в том числе увеличенным периодом полужизни в крови. Предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ, которые обладают измененным гликозилированием, также могут обладать измененными активностями и свойствами, такими как увеличенная каталитическая активность и/или увеличенная устойчивость к ингибиторам. В частности, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ включают полипептиды, которые обладают измененным гликозилированием, и одним или обоими из свойств, выбранных из увеличенной зависимости от кофактора (см., например, раздел Ό.2) или увеличенной устойчивости к ингибиторам, таким как ТРИ или ЛТ-Ш (см., например, раздел Ό.3).

Предусмотренные в настоящем документе полипептиды РХ включают полипептиды, которые были модифицированы путем изменения уровня и/или типа гликозилирования по сравнению с немодифицированным полипептидом РХ. Гликозилирование может быть увеличено или уменьшено по сравнению с немодифицированным полипептидом РХ. В некоторых случаях уровень или степень гликозилирования увеличены, что приводит к гипергликозилированию полипептида РХ. Это может быть достигнуто, например, путем включения по меньшей мере одного не нативного сайта гликозилирования, не присутствующего в немодифицированном полипептида РХ, с которым связан углевод. Гипергликозилированные полипептиды РХ также могут быть получены путем связывания углеводного фрагмента по меньшей мере с одним природным сайтом гликозилирования, который присутствует в немодифицированном полипептиде РХ, но не подвергается гликозилированию.

У предусмотренных в настоящем документе модифицированных полипептидов РХ может быть изменено О-связанное гликозилирование, Ν-связанное гликозилирование или О-связанное и Ν-связанное гликозилирование, например, может быть добавлено новое О-связанное гликозилирование, Ν-связанное гликозилирование или О-связанное и Ν-связанное гликозилирование. В некоторых примерах модифицированный полипептид РХ включает 1, 2, 3, 4, 5 или больше углеводных фрагментов, где каждый углеводный фрагмент связан со своим сайтом гликозилирования. Сайт гликозилирования (сайты гликозилирования) может представлять собой природный сайт гликозилирования (сайты гликозилирования) и/или не нативный сайт гликозилирования (сайты гликозилирования). В некоторых примерах модифицированный полипептид РХ является гликозилированным больше чем в одном не нативном сайте гликозилирования. Например, модифицированный полипептид РХ может быть модифицирован, так что в него введены 1, 2, 3, 4, 5 или больше не нативных сайтов гликозилирования.

- 47 028865

Не нативные сайты гликозилирования могут быть введены путем аминокислотной замены. Сайты 0-гликозилирования могут быть созданы, например, путем аминокислотной замены природного остатка на серин или треонин. Сайты Ν-гликозилирования могут быть созданы путем создания мотива Ази-Хаа8ег/ТЬг/Су§, где Хаа не является пролином. Создание этой консенсусной последовательности путем аминокислотной модификации может включать замену природного аминокислотного остатка на аспарагин, замену природного аминокислотного остатка на серин, треонин или цистеин или замену природного аминокислотного остатка на аспарагин и аминокислотную замену природного остатка на серин, треонин или цистеин. Не нативные сайты гликозилирования могут быть созданы в любой области в полипептиде РХ. Например, один или несколько сайтов гликозилирования могут быть введены в легкую цепь и/или тяжелую цепь. В некоторых примерах один или несколько сайтов гликозилирования введены в домен ЕОР1 легкой цепи. В других примерах не нативные сайты гликозилирования введены в область протеазного домена тяжелой цепи. Уровень гликозилирования (например, число введенных не нативных сайтов гликозилирования) может быть увеличен по меньшей мере примерно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или больше по сравнению с уровнем гликозилирования немодифицированного полипептида РХ или полипептида РХ дикого типа.

Примеры модификаций, предусмотренных в настоящем документе, включают введение не нативного гликозилирования путем модификации с помощью одной или нескольких аминокислотных замен, которые включают, без ограничения, аминокислотную замену (аминокислотные замены) в немодифицированном полипептиде РХ на N в положении, соответствующем положению 51; N в положении, соответствующем положению 56, и δ в положении, соответствующем положению 58; N в положении, соответствующем положению 62, и δ в положении, соответствующем положению 64; N в положении, соответствующем положению 65, и δ в положении, соответствующем положению 67; N в положении, соответствующем положению 67; N в положении, соответствующем положению 73, и δ в положении, соответствующем положению 75; N в положении, соответствующем положению 75, и δ в положении, соответствующем положению 77; N в положении, соответствующем положению 77, и δ в положении, соответствующем положению 79; N в положении, соответствующем положению 78, и δ в положении, соответствующем положению 80; δ в положении, соответствующем положению 82; N в положении, соответствующем положению 83; N в положении, соответствующем положению 82, и δ в положении, соответствующем положению 84; N в положении, соответствующем положению 85, и δ в положении, соответствующем положению 87; N в положении, соответствующем положению 86, и δ в положении, соответствующем положению 88; N в положении, соответствующем положению 95, и δ в положении, соответствующем положению 97; N в положении, соответствующем положению 114; N в положении, соответствующем положению 119, и δ в положении, соответствующем положению 121; δ в положении, соответствующем положению 122; N в положении, соответствующем положению 215, и δ в положении, соответствующем положению 217; N в положении, соответствующем положению 243, и δ в положении, соответствующем положению 245; N в положении, соответствующем положению 264, и δ в положении, соответствующем положению 266; N в положении, соответствующем положению 293, и δ в положении, соответствующем положению 295; N в положении, соответствующем положению 388; N в положении, соответствующем положению 389, и δ в положении, соответствующем положению 391; N в положении, соответствующем положению 428, и δ в положении, соответствующем положению 430, и/или N в положении, соответствующем положению 429, и δ в положении, соответствующем положению 431, где каждая замена приведена со ссылкой на положения аминокислот, приведенные в δΚΟ II) N0: 134. Со ссылкой на аминокислотные остатки, приведенные в δΕΟ II) N0: 134, не имеющие ограничительного характера, примеры такой аминокислотной замены (аминокислотных замен) в предусмотренном в настоящем документе модифицированном полипептиде РХ приведены в табл. 4.

Таблица 4

Ε51Ν	Ο56Ν/(258δ	Κ62Ν/Ο64δ	Ε65Ν/Ε678
Ε67Ν	Ε73Ν/Ο758	Ο75Ν/Ε778	Ε77Ν/Κ798
Ο78Ν/Ν808	Е828	Σ83Ν	Ε82Ν/Ρ848
Τ85Ν/Κ878	Κ.86Ν/Ε888	ϋ95Ν/ϋ97δ	Ο114Ν
ϋ119Ν/Ο121δ	К1228	Κ243Ν/Κ2458	Ε264Ν/Ε266δ
Τ293Ν/Κ2958	Κ388Ν	ϋ389Ν/Υ391δ	Τ428Ν/Ο430δ
Κ429Ν/Έ4318	Ε215Ν/Ν2178

Как правило, предусмотренные в настоящем документе модифицированные' полипептиды РХ, которые имеют измененное гликозилирование, сохраняют по меньшей мере одну активность РХ. В некоторых случаях, измененные уровни гликозилрования или изменения в типе гликозилирования, присутствующие в модифицированном полипептиде РХ, по сравнению с немодифицированным полипептидом РХ могут проявляться в виде увеличенной каталитической активности и/или увеличенной устойчивости к ингибиторам, таким как АТ-Ш. Увеличение активности может происходить за счет добавления гликозилирования или может происходить за счет вторичной аминокислотной модификации (аминокислотных модификаций), которые действуют независимо или совместно с измененным гликозилированием для изменения активности. В разделе О.2 и разделе О.3 описаны примеры модификаций, которые могут быть

- 48 028865

комбинированы с любой модификацией (модификациями), предусмотренной (предусмотренными) в настоящем документе для изменения гликозилирования.

Например, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ, которые имеют измененное гликозилирование, обладают в активной форме увеличенным периодом полужизни, увеличенной каталитической активностью и/или увеличенной коагулянтной активностью по сравнению с немодифицированным РХ. Период полужизни модифицированных полипептидов РХ с измененным гликозилированием может быть увеличен по меньшей мере или примерно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или больше по сравнению с периодом полужизни немодифицированного полипептида РХ или полипептида РХ дикого типа. Период полужизни можно определить, используя анализы, известные в данной области техники, например, проводя фармакокинетические (РК) исследования или исследования клиренса, как описано в настоящем документе (например, пример 7). Каталитическая активность модифицированных полипептидов РХ с измененным гликозилированием может быть увеличена по меньшей мере или примерно на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500% или больше по сравнению с каталитической активностью немодифицированного полипептида РХ или полипептида РХ дикого типа, по данным анализа ίη У1уо или ίη νίΙΐΌ. Увеличенная каталитическая активность может быть РУа-зависимой и/или РУа-независимой каталитической активностью. Как правило, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ, которые имеют измененное гликозилирование, сохраняют РУа-зависмую каталитическую активность или обладают увеличенной РУа-зависимой каталитической активностью, так что модифицированные полипептиды обладают увеличенной зависимостью от кофактора. Примеры таких модифицированных полипептидов РХ приведены в разделе Ό.2.

В других примерах предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ, которые имеют измененное гликозилирование, обладают в активной форме увеличенной устойчивостью к ингибиторам, например увеличенной устойчивостью к АТ-ΙΙΙ по сравнению с немодифицированным РХ. Устойчивость модифицированных полипептидов РХ с измененным гликозилированием к ингибиторам, таким как АТ-ΙΙΙ, может быть увеличена по меньшей мере в 2, в 3, в 4, в 5, в 6, в 7, в 8, в 9, в 10, в 20, в 30, в 40, в 50, в 60, в 70, в 80, в 90, в 100, в 200, в 300, в 400, в 500, в 600, в 700, в 800, в 900, в 1000, в 1500, в 2000, в 2500, в 3000, в 3500, в 4000, в 4500, в 5000, в 5500, в 6000 раз или больше. Таким образом, при оценке в соответствующем анализе ίη νίΙΐΌ. ιη У1уо или ех угуо модифицированные полипептиды РХ, имеющие измененное гликозилирование, могут обладать увеличенной устойчивостью к АТ-ΙΙΙ по сравнению с не модифицированными полипептидами РХ. Примеры таких модифицированных полипептидов РХ приведены в разделе Ό.3.

2. Увеличенная зависимость от кофактора.

В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, в том числе модифицированный зимоген РХ и модифицированные полипептиды РХа, которые содержат одну или несколько модификаций в полипептиде РХ и которые в активной форме РХа обладают большей каталитической активностью в присутствии кофактора РУа (РУа-зависимая активность) по сравнению с отсутствием РУа (РУа-независимая активность). Модификации могут представлять собой вставки, делеции или замены аминокислот. В частности, модификации представляют собой аминокислотные замены. Предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ в активной форме обладают увеличенной зависимостью от кофактора, выраженной в виде отношения каталитической активности в присутствии РУа к каталитической активности в отсутствии РУа, по сравнению с РХа, не содержащим модификацию (модификации).

Хотя РУа значительно повышает активность РХа, РХа дикого типа проявляет некоторую активность даже в отсутствии РУа. Например, как показано в примерах в настоящем документе, зависимость от кофактора для РХа дикого типа (например, РХа, полученный из плазмы или рекомбинантным путем) составляет приблизительно 3000. Как обсуждалось выше, РУа-независимая активность может приводить к нежелательной активности, что ограничивает применение РХа в качестве терапевтического агента. В настоящем документе установлено, что ограничение или снижение РУа-независимой активности может быть достигнуто при сохранении РУа-зависимой активности. Изменения в каталитической активности в присутствии РУа могут проявляться в виде увеличенной РУа-зависимой коагулянтной активности. Таким образом, нежелательная активность может быть снижена, минимизирована или устранена при сохранении протромбиназной активности на поверхности мембраны для осуществления образования сгустка, необходимой для терапевтических применений. Предусмотренные в настоящем документе модифицированные протеазы в виде активных полипептидов РХа обладают значительно большей активностью, чем РХа дикого типа, но могут быть намного безопаснее, поскольку циркулирующая свободная форма обладает активностью, только когда она связана с кофактором РУа в месте раны.

Увеличенная зависимость от кофактора достигается путем модификации одного или нескольких аминокислотных остатков в тяжелой цепи РХ, которые связаны с конформационным переключением из формы зимогена РХ в форму РХа. В норме РХ существует в равновесии конформационных форм зимогена и активной протеазы, так что зимогенная форма является предпочтительной перед активацией, и форма РХа является предпочтительной после активации. В зимогенной форме первичный карман, опо- 49 028865

средующий специфичность (например, сайт связывания §1), и полость оксианиона не находятся в их "активной конформации" или не стабилизированы в их "активных конформациях", что делает зимогенную форму неактивной. Кроме того, дополнительные сайты субстратной специфичности (экзосайты) и сайты связывания с РУа также правильно не сформированы или не стабилизированы в "активных конформациях". Переход в измененное активное состояние может быть вызван расщеплением связи между Агд 19411е195 (Агд15-11е16 согласно нумерации химотрипсина), которое приводит к созданию нового Оконца, участвующего в образовании солевого мостика с Акр378 (Акр194 согласно нумерации химотрипсина). Переход в состояние протеазы также может происходить без расщепления связи благодаря наличию стабилизирующих взаимодействий с формой РХа. Например, кофактор РУа обеспечивает сильное стабилизирующее воздействие на РХа и сдвигает равновесие в сторону формы РХа.

При расщеплении связи этот переход зимогена в активный фермент также связан с другими конформационными изменениями протеазы для получения активного фермента. Например, конформационные изменения в активационном домене, который соответствует остаткам 195-198, 325-334, 366-377 и 400-406 согласно нумерации зрелой формы полипептида со ссылкой на §ЕО ГО N0: 134 (соответствующие остаткам 16-19, 142-152, 184-193 и 216-223 согласно нумерации химотрипсина), реорганизуют и стабилизируют первичный карман, опосредующий специфичность, или сайт связывания субстрата и полость оксианиона (Токо е1 а1. (2008) 1. Βίο1. СЬет., 283:18627-18635). Более того, экзосайт 1, образованный петлями, содержащими остатки 213-219 и 249-259 (соответствующие остаткам 34-40 и 70-80 согласно нумерации химотрипсина), который участвует в связывании протромбина и катализе, существует в состоянии проэкзосайта и появляется в активной конфигурации только при конформационных изменениях, сопровождающих переход (Воск е1 а1. (2007) 1. ТЬготЬ. Наеток1., 5:81-94). Конформационное изменение зимогена в активный фермент также приводит к появлению сайта связывания РУа, который включает Аг§347, Ьу8351 и Ьу8414 в экзосайте 2, который образует коровый эпитоп связывания кофактора (см. также В1апсЫш (2004) 1. Βίο1. СЬет., 279:3671-3679). Конформация активного фермента также стабилизируется при связывании субстрата.

Конформационное равновесие белков РХ может быть сдвинуто за счет модификации аминокислотных остатков, которые связаны с переходом зимогена в активный фермент. Модификация в этих остатках может сдвинуть равновесие в сторону зимогенподобного состояния. Остатки, связанные с переходом зимогена в активный фермент, включают остатки на новом Оконце, такие как аминокислотные остатки 195-198 (соответствующие остаткам 16-19 согласно нумерации химотрипсина). Другие остатки, связанные с переходом зимогена, включают остатки в активационном домене и экзосайтах (приведены выше), которые играют непосредственную роль в конформационном изменении или иным образом энергетически связаны с ним. Мутация остатков в этих областях может привести к структурным пертурбациям активационного домена и/или экзосайтов активированного фермента в процессе перехода, тем самым изменяя связывание субстрата и/или катализ, приводя к зимогенподобной активности. Например, часть активационного домена представляет собой петлю автолиза (соответствующая остаткам 142-152 согласно нумерации химотрипсина), структурное изменение которой может привести к снижению протеолиза субстрата. Таким образом, мутации в этих областях могут также дестабилизировать форму РХа, приводя к сдвигу равновесия в сторону предпочтительной зимогенподобной структуры. В настоящем документе установлено, что модификация остатков, связанных с указанными выше доменами или находящихся в непосредственной близости с указанными выше доменами, может влиять на РУ-независимую активность, что приводит к протеазам, которые обладают значительно увеличенной зависимостью от кофактора. Остатки каталитической триады не являются мишенью для мутагенеза (например, Ηίδ236. Акр282 и §ег379 со ссылкой на §ЕО ГО N0: 134), поскольку они необходимы для каталитической активности.

В частности, модификации подвергаются остатки в ^концевом пептидном сегменте, которые инициируют переход в РХа после расщепления связи, чтобы нарушить образование межмолекулярного солевого мостика или дестабилизировать межмолекулярный солевой мостик или нарушить другие описанные выше "связанные" конформационные изменения, которые происходят в процессе перехода зимогена в активный фермент. Например, 11е195 и также в некоторой степени Уа1196 в РХа углублены в белковом фрагменте, при этом α-аммониевая группа 11е195 и карбоксилатная группа боковой цепи Акр378 образуют внутренний солевой мостик. Этот солевой мостик стабилизирует активный фермент. Обнаружено, что нарушение солевого мостика в результате модификации аминокислотных остатков в положениях 195, 196 и/или 378 приводит к трансформации структуры активного фермента в зимогенподобную структуру. Соседние остатки 197 и 198 также являются мишенью для модификаций для придания фермента зимогенподобной структуры.

Кроме того, предусмотренные в настоящем документе модификации включают модификации в остатках триады зимогена, про которые известно, что они стабилизируют зимогенное состояние в некоторых сериновых протеазах. Например, в зимогенной структуре химотрипсиногена и трипсиногена боковая цепь, соответствующая Акр378 (Акр194 согласно нумерации химотрипсина), стабилизирована ионной парой с углубленным гистидином в положении 211 (Ηίδ40 согласно нумерации химотрипсина), который также образует водородную связь с серином в положении 219 (§ег32 согласно нумерации химотрипсина) (МаФкоп е1 а1. (1993) §с1епсе, 262:419-421). Эта триада зимогена (А8р194-Н1840-§ег32 согласно нумера- 50 028865

ции химотрипсина) стабилизирует зимогенную форму. Соответствующая триада зимогена отсутствует в РХ, поскольку в положении 211 (соответствующем положению 32 согласно нумерации химотрипсина) присутствует лейцин (Ь) и в положении 219 (соответствующем положению 40 согласно нумерации химотрипсина) присутствует глицин (С). Таким образом, модификации в настоящем документе включают такие модификации, в которых соответствующая триада зимогена (Λ5ρ194-Ηί540-δθΓ32 согласно нумерации химотрипсина) образована в РХ.

Как и зимогенная форма РХ полипептид РХа в зимогенподобном конформационном состоянии обладает небольшой каталитической активностью. Как обсуждалось выше, активность может регулироваться с помощью кофактора РУа. Зимогенные формы РХ и зимогенподобные формы РХа обычно обладают сниженной аффинностью к РУа, поскольку предположительно для экспонирования сайта связывания РУа необходима конформационная активация протеазного домена. Тем не менее, поскольку РУа является таким сильным стабилизатором, равновесие может быть смещено с зимогенподобного конформационного состояния в РХа в присутствии сильного стабилизирующего избытка кофактора РУа. Таким образом, в примерах, предусмотренных в настоящем документе, зимогенподобные варианты обладают небольшой активностью в отсутствие РУа, но могут обладать значительной активностью в присутствии РУа. Полученные полипептиды РХ в активной форме обладают отношением каталитической активности в присутствии РУа по сравнению с каталитической активностью в отсутствии РУа (также называемой относительной зависимостью от кофактора), которое увеличено по сравнению с РХа, не содержащим модификацию (модификации). Увеличенная зависимость от кофактора может быть обусловлено уменьшенной каталитической активностью в отсутствии РУа и/или увеличенной каталитической активностью в присутствии РУа.

Например, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ в активной форме РХа обладают относительной зависимостью от кофактора, составляющей более чем 5000, например, более чем 10000; 20000; 30000; 40000; 50000; 100000; 200000; 300000; 400000; 500000; 600000; 700000; 800000; 900000; 1000000; 2000000; 3000000; 4000000; 5000000; 6000000; 7000000; 8000000; 9000000; 10000000 15000000; 20000000; 25000000; 30000000; 35000000; 40000000; 45000000; 50000000 или больше. По сравнению с РХа, не содержащим модификацию (модификации), относительная зависимость от кофактора увеличена, по меньшей мере, в 2 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 6 раз, в 7 раз, в 8 раз, в 9 раз, в 10 раз, в 20 раз, в 30 раз, в 40 раз, в 50 раз, в 60 раз, в 70 раз, в 80 раз, в 90 раз, в 100 раз, в 200 раз, в 300 раз, в 400 раз, в 500 раз, в 600 раз, в 700 раз, в 800 раз, в 900 раз, в 1000 раз, в 1500 раз, в 2000 раз, в 2500 раз, в 3000 раз, в 3500 раз, в 4000 раз, в 4500 раз, в 5000 раз, в 6000 раз, в 7000 раз, в 8000 раз, в 9000 раз, в 10000 раз, в 15000 раз, в 20000 раз или больше. Таким образом, при оценке в соответствующем анализе ίη νίίΓΟ, ίη νίνο или ех νίνο модифицированные полипептиды РХ могут проявлять увеличенную зависимость от кофактора по сравнению с немодифицированными полипептидами РХ.

Такие модифицированные полипептиды РХ включают полипептиды, которые содержат модификацию (модификации) в аминокислотном положении (аминокислотных положениях) 195, 196, 197, 198, 200, 202, 211, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 273, 276, 306, 326, 327, 332, 334, 336, 338, 378, 420 и/или 424 в тяжелой цепи РХ, соответствующем (соответствующем) положениям, приведенньм в δΕΟ ΙΌ N0: 134. Например, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ включают полипептиды, которые содержат модификацию (модификации) в аминокислотном положении (аминокислотных положениях) 198, 202, 211, 214, 217, 219, 327 и/или 338. Обычно, модификация представляет собой аминокислотную замену. Аминокислотная замена может представлять собой замену на любую из других 19 аминокислот в этом положении, при условии что полученный модифицированный полипептид РХ в активной форме обладает увеличенной зависимостью от кофактора по сравнению с РХа, не содержащим аминокислотную замену (аминокислотные замены), и сохраняет РУа-зависимую каталитическую активность.

В одном из примеров модифицированные полипептиды РХ содержат по меньшей мере одну аминокислотную замену, например по меньшей мере одну аминокислотыую замену в положении, соответствующем положению 195, 196, 197 или 198, например по меньшей мере в положении 196, как приведено в δΕΟ ΙΌ N0: 134 (положения 16-19 согласно нумерации химотрипсина). Эти аминокислотные остатки соответствуют гидрофобным остаткам в новом Оконце, который экспонируются при активационном расщеплении зимогена РХ. Как обсуждалось в других разделах в настоящем документе, гидрофобные остатки на Оконце образуют солевой мостик с остатком Αδρ378 (Αδρ194 согласно нумерации химотрипсина), который необходим для перехода из неактивного состояния в активное состояние. Например, остаток Уа1, который присутствует в положении 196 в соответствии с нумерацией полипептида РХ, приведенного в качестве примера в δΕΟ ΙΌ N0: 134, является гидрофобным и подходит для этого взаимдействия. В настоящем документе установлено, что модификация ^концевых аминокислотных остатков 195, 196, 197 и/или 198 (соответствуют остаткам 16-19 согласно нумерации химотрипсина) на гидрофильный нейтральный аминокислотный остаток, который содержит полярную группу К, в частности, разрушает или дестабилизирует образование солевого мостика. Примерами таких аминокислотных остатков для замен являются Άδη (М), С1п (О), δе^ (δ), ТЬг (Τ), Τ’νδ (С) или Туг (Υ).

Примеры предусмотренных в настоящем документе модификаций включают, но не ограничиваются

- 51 028865

ими, аминокислотную замену в немодифицированном полипептиде РХ на Ι в положении, соответствующем положению 196; 8 в положении, соответствующем положению 196; Ь в положении, соответствующем положению 196; Т в положении, соответствующем положению 196; 8 в положении, соответствующем положению 197; 8 в положении, соответствующем положению 197; А в положении, соответствующем положению 197; А в положении, соответствующем положению 200; V в положении, соответствующем положению 200; 8 в положении, соответствующем положению 202; 8 в положении, соответствующем положению 211; Ό в положении, соответствующем положению 214; А в положении, соответствующем положению 214; 8 в положении, соответствующем положению 214; N в положении, соответствующем положению 215; К в положении, соответствующем положению 216; К в положении, соответствующем положению 216; А в положении, соответствующем положению 216; 8 в положении, соответствующем положению 216; 8 в положении, соответствующем положению 217; К в положении, соответствующем положению 218; К в положении, соответствующем положению 218; А в положении, соответствующем положению 218; Н в положении, соответствующем положению 219; А в положении, соответствующем положению 273; Е в положении, соответствующем положению 273; А в положении, соответствующем положению 276; Е в положении, соответствующем положению 276; Е в положении, соответствующем положению 306; 8 в положении, соответствующем положению 326; Т в положении, соответствующем положению 326; V в положении, соответствующем положению 326; 0 в положении, соответствующем положению 326; N в положении, соответствующем положению 326; М в положении, соответствующем положению 326; К в положении, соответствующем положению 326; Υ в положении, соответствующем положению 326; Е в положении, соответствующем положению 326; Ό в положении, соответствующем положению 326; А в положении, соответствующем положению 327; Ь в положении, соответствующем положению 327; А в положении, соответствующем положению 332; Ό в положении, соответствующем положению 332; Е в положении, соответствующем положению 332; 8 в положении, соответствующем положению 332; О в положении, соответствующем положению 332; А в положении, соответствующем положению 334; Т в положении, соответствующем положению 334; N в положении, соответствующем положению 334; Е в положении, соответствующем положению 336; А в положении, соответствующем положению 338; 8 в положении, соответствующем положению 338; N в положении, соответствующем положению 338; К в положении, соответствующем положению 338; V в положении, соответствующем положению 338; Υ в положении, соответствующем положению 338; М в положении, соответствующем положению 338; А в положении, соответствующем положению 420; Е в положении, соответствующем положению 420; А в положении, соответствующем положению 424; и/или Е в положении, соответствующем положению 424, где каждая замена приведена со ссылкой на положения аминокислот, указанные в 8ЕР ГО N0: 134. Модифицированный полипептид РХ может содержать две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или больше любых указанных выше аминокислотных замен, где каждая замена введена в другое положение, при условии, что полученный модифицированный полипептид РХ в активной форме обладает, по меньшей мере, увеличенной зависимостью от кофактора и сохраняет РУа-зависимую каталитическую активность. Такие модифицированные полипептиды РХ включают полипептиды, которые в активной форме обладают зависимостью от кофактора, которая увеличена по меньшей мере в 2 раза по сравнению с немодифицированным полипептидом РХа, не содержащим модификацию (модификации). Со ссылкой на аминокислотные остатки, приведенные в 8ЕР ГО N0: 134, не имеющие ограничительного характера примеры такой аминокислотной замены (аминокислотных замен) в предусмотренном в настоящем документе модифицированном полипептиде РХ приведены в табл. 5 и 6.

_ _ Таблица 5

VI961	νΐ968	У196Ь	νΐ96Τ	01978	Ο197Α	Ε200Α
Е200У	К2028	Ь2118/О219Н	Ν214ϋ	Ν214Α	N2148	Ε215Ν
Е216К	Е216К	Ε216Α	Ε2168	N2178	Ε218Κ	Ε218Κ
Е218А	Т327А/ К338А	Κ273Α	Κ273Ε	Κ276Α	Κ276Ε	Κ306Ε
К3268	К326Т	К326У	К326Ц	Κ326Ν	Κ326Μ	Κ326Κ
Κ326Υ	К326Е	Κ326ϋ	Τ327Α	Т327Ь	Κ332Α	Κ332Ώ
К.332О	3334А	3334Τ	3334Ν	Κ336Ε	Κ338Α	Κ3388
Κ338Ν	К.338К	К338У	Κ338Υ	Κ.338Μ	Κ420Α	Κ420Ε
К424А	К424Е	Е200У/Т327Ь/ Κ338Μ	Е220У/Т32717 3334Α/Κ338Μ	У1968/Ь2118/ Ο219Η	О197А/Ь2118/ 0219η	1195Ь/Ь2118/0219Η
VI963/ Е216К	VI968/ Е216А	νΐ96δ/Ε216δ	νΐ96δ/Ε218Κ	νΐ968/Ε218Κ	У1968/Е218А	νΐ968/Κ332Α
VI968/ Κ332Ώ	VI968/ К332Е	νΐ96δ/Κ3328	νΐ96δ/Κ332Ο	νΐ96δ/Κ326ϋ	νΐ96δ/Κ326Μ	νΐ968/Κ326Ν
νΐ968/ КЗ 260	VI968/ К273Е	νΐ96δ/Κ273Α	νΐ968/Κ424Ε	νΐ963/Κ420Α	νΐ96δ/Κ420Ε	νΐ96δ/Κ306Ε
νΐ968/ Ν214ϋ	VI968/ Ν214Α	νΐ968/Ν2148	νΐ968/Ε216Κ	Υ1968/Κ276Α	νΐ968/Κ276Ε	νΐ963/Κ420Ε/ Κ424Ε
VI968/ К338А	VI968/ К3388	Τ327Α/Κ338Α

В модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, также может быть введена дополнительная аминокислотная замена (аминокислотные замены), и она может представ- 52 028865

лять собой любую другую аминокислотную замену, описанную в настоящем документе или известную в данной области техники, при условии, что полученные модифицированные полипептиды РХ в активной форме обладают зависимостью от кофактора, которая увеличена по меньшей мере в 2 раза по сравнению с немодифицированным полипептидом РХа, не содержащим модификацию (модификации), и сохраняют РУа-зависимую каталитическую активность. Например, дополнительные модификации включают любую дополнительную модификацию (модификации), описанную в настоящем документе, которая увеличивает устойчивость к ингибиторам, таким как АТ-Ш (см., например, раздел Ό.3) и/или для изменения гликозилирования (см., например, раздел Ό.1). Примеры аминокислотной замены (аминокислотных замен) для введения не нативного сайта гликозилирования включают, но не ограничиваются этим, аминокислотную замену (аминокислотные замены) в немодифицированном полипептиде РХ на N в положении, соответствующем положению 51; N в положении, соответствующем положению 56, и 3 в положении, соответствующем положению 58; N в положении, соответствующем положению 62, и 3 в положении, соответствующем положению 64; N в положении, соответствующем положению 65, и 3 в положении, соответствующем положению 67; N в положении, соответствующем положению 67; N в положении, соответствующем положению 73, и 3 в положении, соответствующем положению 75; N в положении, соответствующем положению 75, и 3 в положении, соответствующем положению 77; N в положении, соответствующем положению 77, и 3 в положении, соответствующем положению 79; N в положении, соответствующем положению 78, и 3 в положении, соответствующем положению 80; 3 в положении, соответствующем положению 82; N в положении, соответствующем положению 83; N в положении, соответствующем положению 82, и 3 в положении, соответствующем положению 84; N в положении, соответствующем положению 85, и 3 в положении, соответствующем положению 87; N в положении, соответствующем положению 86, и 3 в положении, соответствующем положению 88; N в положении, соответствующем положению 95, и 3 в положении, соответствующем положению 97; N в положении, соответствующем положению 114; N в положении, соответствующем положению 119, и 3 в положении, соответствующем положению 121; 3 в положении, соответствующем положению 122; N в положении, соответствующем положению 215, и 3 в положении, соответствующем положению 217; N в положении, соответствующем положению 243, и 3 в положении, соответствующем положению 245; N в положении, соответствующем положению 264, и 3 в положении, соответствующем положению 266; N в положении, соответствующем положению 293, и 3 в положении, соответствующем положению 295; N в положении, соответствующем положению 388; N в положении, соответствующем положению 389, и 3 в положении, соответствующем положению 391; N в положении, соответствующем положению 428, и 3 в положении, соответствующем положению 430, и/или N в положении, соответствующем положению 429, и 3 в положении, соответствующем положению 431, где каждая замена приведена со ссылкой на положения аминокислот, приведенные в 3ЕЭ ГО N0: 134. Со ссылкой на аминокислотные остатки, приведенные в 3ЕЭ ГО N0:134, не имеющие ограничительного характера примеры такой аминокислотной замены (аминокислотных замен) в предусмотренном в настоящем документе модифицированном полипептиде РХ приведены в табл. 6.

Таблица 6

Ε73Ν/Ο75δ/νΐ96δ	Ο75Ν/Ε778/ VI968	Κ86Ν/Ε888/ VI968	Ο114ΝΛΊ968	ϋ95Ν/Ε>978/ νΐ96δ	Ε82δ/νΐ96δ
Ο78Ν/Ν80δ/νΐ96δ	Ε77Ν/Κ.798/ VI968	Ш 19Ν/Ο1218/ VI968	Ε83Ν/νΐ96δ	Κ122δ/νΐ96δ	Ε51Ν/νΐ96δ
Ο114Ν/ϋ119Ν/ Ο121δ/νΐ96δ	ϋ119Ν/Ο121δ/ νΐ96δ/Ε211δ/ Π7 1 ΠΕΙ /1Ζ Ώ Ο 0X1 ΌΕ1 711/ 1ХЛ ΟΟ1Ν	Τ85Ν/Κ878/ VI968	φ56Ν/φ58δ/ VI968	Κ62Ν/Ο648/ VI968	ϋΐ 19Ν/Ο1218/ У1968/Ь2118/ гл ι ηυ VI 1711
Ο114Ν/Ο119Ν/ Ο121δ/νΐ96δ/ Ь2118/Ο219Η	Ε65Ν/Ε678 VI968	Ε67Ν/νΐ96δ	νΐ96δ/Ε215Ν/ N2178	νΐ96δ/Ε264Ν/ Ε2668	0114Ν/νΐ96δ/ Ь2118 Ο219Η/Κ388Ν
ϋΐ 19Ν/Ο1218/ νΐ96δ/Ε264Ν/ Ε2668	Ο114Ν/νΐ96δ/ Ε264Ν/Ε2668	νΐ96δ/Κ429Ν/Ε431δ	νΐ96δ/Κ243Ν/ Κ2458	νΐ96δ/Τ293Ν/ Κ.2958	νΐ96δ/Ε)389Ν/ Υ3918
Ш 19Ν/Ο1218/ νΐ96δ/Κ388Ν	νΐ96δ/Τ428Ν/ 04308	νΐ96δ/Ε211δ/ Ο219Η/Ε264Ν/ Ε2668	ϋ119Ν/Ο121δ/ νΐ96δ/Ε211δ/ Ο219Η/Ε264Ν/Ε 2668	ΟΙ 14Ν/νΐ96δ/Ε 2118/0219Н/ Ε264Ν/Ε2668	νΐ968/Ε264Ν/ Ε2668/Κ388Ν
Ε82Ν/Ε848/ VI968	Ο58Ν/Κ608/ VI968	Ο114Ν/νΐ96δ/ Ь2118/О219Н	νΐ96δ/Ε211δ/ 0219Η/Ε264Ν/Ε 2668/Κ388Ν	Υ196δ/Κ388Ν

В конкретных примерах модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, включают по меньшей мере одну модификацию, которая представляет собой, без ограничения, аминокислотную замену в немодифицированном полипептиде РХ на 3 в положении, соответствующем положению 196; Τ в положении, соответствующем положению 196; 3 в положении, соответствующем

положению 197; 3 в положении, соответствующем положению 197; А в положении, соответствующем

положению 197; А в положении, соответствующем положению 200; У в положении, соответствующем

положению 200; 3 в положении, соответствующем положению 202; 3 в положении, соответствующем

положению 211; Ό в положении, соответствующем положению 214; А в положении, соответствующем

- 53 028865

положению 214; δ в положении, соответствующем положению 214; N в положении, соответствующем положению 215; К в положении, соответствующем положению 216; А в положении, соответствующем положению 216; δ в положении, соответствующем положению 216; δ в положении, соответствующем положению 217; К в положении, соответствующем положению 218; А в положении, соответствующем положению 218; Н в положении, соответствующем положению 219; Ε в положении, соответствующем положению 273; Ε в положении, соответствующем положению 276; Ε в положении, соответствующем положению 306; δ в положении, соответствующем положению 326; Т в положении, соответствующем положению 326; V в положении, соответствующем положению 326; N в положении, соответствующем положению 326; М в положении, соответствующем положению 326; К в положении, соответствующем положению 326; Υ в положении, соответствующем положению 326; Ε в положении, соответствующем положению 326; Ό в положении, соответствующем положению 326; А в положении, соответствующем положению 327; Ь в положении, соответствующем положению 327; Ό в положении, соответствующем положению 332; Ε в положении, соответствующем положению 332; δ в положении, соответствующем положению 332; С в положении, соответствующем положению 332; А в положении, соответствующем положению 334; Т в положении, соответствующем положению 334; N в положении, соответствующем положению 334; Ε в положении, соответствующем положению 336; А в положении, соответствующем положению 338; δ в положении, соответствующем положению 338; N в положении, соответствующем положению 338; К в положении, соответствующем положению 338; V в положении, соответствующем положению 338; Υ в положении, соответствующем положению 338; М в положении, соответствующем положению 338; Ε в положении, соответствующем положению 420; и/или Ε в положении, соответствующем положению 424, где каждая замена приведена со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δΕΟ ΙΌ N0: 134.

В примерах, предусмотренных в настоящем документе, модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, в том числе модифицированный зимоген РХ или РХа, имеют по меньшей мере одну аминокислотную замену в немодифицированном полипептиде РХ, которая представляет собой замену на δ в положении, соответствующем положению 211, или замену на Н в положении, соответствующем положению 219, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δΕΟ ΙΌ N0: 134. Модифицированный полипептид РХ может содержать две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или больше аминокислотных замен, где каждая замена введена в другое положение, при условии, что полученный модифицированный полипептид РХ в активной форме обладает увеличенной зависимостью от кофактора и сохраняет РVа-зависимую каталитическую активность. Например, модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, в том числе модифицированный зимоген РХ или РХа, имеют по меньшей мере две аминокислотные замены в немодифицированном полипептиде РХ, которые представляют собой замену на δ в положении, соответствующем положению 211, и замену на Н в положении, соответствующем положению 219, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δΕΟ ΙΌ N0: 134. Дополнительная аминокислотная замена (аминокислотные замены) может представлять собой любую другую аминокислотную замену, описанную в настоящем документе или известную в данной области техники. В конкретном примере дополнительная аминокислотная замена представляет собой аминокислотную замену в положении 195, 196, 197 или 198. Примеры такой дополнительной аминокислотной замены (аминокислотных замен) включают, но не ограничиваются заменой на Ь в положении, соответствующем положению 195; заменой на V в положении, соответствующем положению 195; заменой на δ в положении, соответствующем положению 195; заменой на Т в положении, соответствующем положению 195; заменой на Ι в положении, соответствующем положению 195; заменой на А в положении, соответствующем положению 195; заменой на Р в положении, соответствующем положению 195; заменой на Ό в положении, соответствующем положению 195; заменой на С в положении, соответствующем положению 195; заменой на Ι в положении, соответствующем положению 196; заменой на А в положении, соответствующем положению 196; заменой на δ в положении, соответствующем положению 196; заменой на Ь в положении, соответствующем положению 196; заменой на Р в положении, соответствующем положению 196; заменой на Ι в положении, соответствующем положению 196; заменой на Т в положении, соответствующем положению 196; заменой на С в положении, соответствующем положению 196; δ в положении, соответствующем положению 197; А в положении, соответствующем положению 197; А в положении, соответствующем положению 197; N в положении, соответствующем положению 197; Н в положении, соответствующем положению 197; и К в положении, соответствующем положению 197. В других примерах, дополнительные модификации включают любую дополнительную модификацию (модификации), описанную в настоящем документе выше, предназначенную для увеличения устойчивости к ингибиторам, таким как АТ-ΙΙΙ (раздел Ό.3), и/или для изменения гликозилирования (раздел Ό.1). Такие модифицированные полипептиды РХ включают полипептиды, которые в активной форме обладают зависимостью от кофактора, которая увеличена по меньшей мере в 2 раза по сравнению с немодифицированным полипептидом РХа, не содержащим модификацию (модификации). Со ссылкой на аминокислотные остатки, приведенные в δΕΟ ΙΌ N0: 134, не имеющие ограничительного характера примеры такой аминокислотной замены (аминокислотных замен) в предусмотренном в настоящем документе модифицированном полипептиде РХ приведены в табл. 7.

- 54 028865

Таблица 7

Ь2118/О219Н	У196Ь/Ь2118/0219Н	0197 А/Ь2118/0219Н	1195Ь/Ь2118/О219Н
Ω119Ν/Ο1218/ У1963/Ь2115/ О219Н	Ο114Ν/νΐ968/ Ь2118/О219Н	Ο114Ν/Ω119Ν/ О1218/У1968/ Ь2118/О219Н	Ο114Ν/νΐ96δ/ Ь2118 Ο219Η/Κ388Ν
У1968/Ь2115/ Ο219Η/Ε264Ν/ Ε2665/Κ388Ν	У1968/Ь2118/ Ο219Η/Ε264Ν/ Е2663	Ω119Ν/Ο1218/ У1968/Е2113/ Ο219Η/Ε264Ν/Ε2663	0114Ν/ν 1963/Ь2118/ 0219Η/Ε264Ν/Ε2668
Ώ119Ν/Ο1218/ У1968/Ь2118/ Ο219Η/Κ388Ν

В конкретных примерах, предусмотренных в настоящем документе, модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, в том числе модифицированный зимоген РХ или РХа, имеют по меньшей мере одну аминокислотную замену в немодифицированном полипептиде РХ, которая представляет собой замену на δ в положении, соответствующем положению 196; Ь в положении, соответствующем положению 196; Т в положении, соответствующем положению 196; δ в положении,

соответствующем положению 197; А в положении, соответствующем положению 197; А в положении,

соответствующем положению 200; У в положении, соответствующем положению 200; δ в положении,

соответствующем положению 202; А в положении, соответствующем положению 338; δ в положении,

соответствующем положению 338; или У в положении, соответствующем положению 338, где каждая замена приведена со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δЕ^ ГО N0: 134. Модифицированный полипептид РХ может содержать две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или больше аминокислотных замен, где каждая замена введена в другое положение, при условии, что полученный модифицированный полипептид РХ в активной форме обладает увеличенной зависимостью от кофактора и сохраняет РУа-зависимую каталитическую активность. Дополнительная аминокислотная замена (аминокислотные замены) может представлять собой любую другую аминокислотную замену, описанную в настоящем документе или известную в данной области техники. Например, дополнительные модификации включают любую дополнительную модификацию (модификации), описанную в настоящем документе выше, которая увеличивает зависимость от кофактора, любую дополнительную модификацию, которая увеличивает устойчивость к ингибиторам, таким как ΑΤ-ΙΙΙ (раздел Ό.3), и/или любую дополнительную модификацию для изменения гликозилирования (раздел Ό.1). Такие модифицированные полипептиды РХ включают полипептиды, которые в активной форме обладают зависимостью от кофактора, которая увеличена по меньшей мере в 10 раз по сравнению с немодифицированным полипептидом РХа, не содержащим модификацию (модификации). Со ссылкой на аминокислотные остатки, приведенные в δЕ^ ГО N0: 134, не имеющие ограничительного характера примеры такой аминокислотной замены (аминокислотных замен) в предусмотренном в настоящем документе модифицированном полипептиде РХ приведены в табл. 8 и 9.

_ _ _ Таблица 8

VI968	У196Т	У196Ь	У196Т	01978
К2028	К.338А	К3388	К338У	Т327А/К338А
Е200У/Т327Ь/3334А/К338М	О197А/Ь211/О219Н

В конкретных примерах, модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, в том числе модифицированный зимоген РХ или РХа, которые обладают увеличенной зависимостью от кофактора в их активной форме, имеют по меньшей мере одну аминокислотную замену в немодифицированном полипептиде РХ в аминокислотном положении 196 на неполярный, нейтральный или гидрофильный аминокислотный остаток. Таким образом, модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, содержат по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, например по меньшей мере одну аминокислотную замену, которая представляет собой замену на N О, δ, Т, А, С или Υ в положении, соответствующем положению 196 со ссылкой на последовательностью аминокислот, приведенную в δЕ^ ГО N0: 134. Такие модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, включают полипептиды, которые в активной форме обладают зависимостью от кофактора, которая увеличена по меньшей мере в 2, в 5, в 10, в 20, в 30, в 40 и обычно по меньшей мере в 50 раз, например по меньшей мере в 100 раз или больше по сравнению с немодифицированным полипептидом РХа, не содержащим модификацию (модификации). Примером такого предусмотренного в настоящем документе модифицированного полипептида РХ является полипептид РХ, в том числе модифицированный зимоген РХ или РХа, который содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, которая представляет собой замену на δ в положении, соответствующем положению 196. Модифицированный полипептид РХ может содержать две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или больше аминокислотных замен, где каждая замена введена в другое положение, при условии, что полученный модифицированный полипептид РХ в активной форме обладает зависимостью от кофактора, которая увеличена по меньшей мере в 2, в 5, в 10, в 20, в 30, в 40 и обычно по меньшей мере в 50 раз, например по меньшей мере в 100 раз, и сохраняет РУа-зависимую каталитическую активность.

- 55 028865

Дополнительная аминокислотная замена (аминокислотные замены) может представлять собой любую другую аминокислотную замену, описанную в настоящем документе или известную в данной области техники. Например, дополнительные модификации включают любую дополнительную модификацию (модификации), описанную в настоящем документе выше, которая увеличивает зависимость от кофактора, любую модификацию, которая увеличивает устойчивость к ингибиторам, таким как АТ-Ш (раздел Ό.3) и/или любую модификацию для изменения гликозилирования (раздел Ό.1). Со ссылкой на аминокислотные остатки, приведенные в 8ЕЭ ГО N0: 134, не имеющие ограничительного характера, примеры такой аминокислотной замены (аминокислотных замен) в предусмотренном в настоящем документе модифицированном полипептиде РX приведены в табл. 9.

_ _ Таблица 9

У1963	У1968/Ь2113/О219Н	νΐ968/Ν214Ό	νΐ968/Ν214Α	νΐ968/Ν2148
У1968/Е216К	У1963/Е216К	У1968/Е216А	У1968/Е2168	νΐ96δ/Ε216δ
У1968/Е218К	У1963/Е218К	У1963/Е218А	νΐ968/Κ332Α	νΐ96δ/Κ332Ό
У1968/К332Е	У1963/К.3323	У1963/К332О	νΐ968/Κ.326Ό	У1968/К326М
νΐ96δ/Κ326Ν	νΐ96δ/Κ326Ο	νΐ96δ/Κ273Ε	У1968/К273А	У1968/К424А
У1968/К424Е	У1963/К420А	νΐ963/Κ420Ε	У1963/К.306Е	У1968/К276А
У1963/К276Е	У1963/К338А	У1963/К3383	Е823/У1963	Ε82Ν/Ρ848/ VI968
Ε73Ν/Ο758/ У1968	Ο75Ν/Ε773/ У1963	Κ86Ν/Ε888/ У1968	Ο114Ν/νΐ96δ	Ό95Ν/Ό978/ VI968
Ο78Ν/Ν803/ VI968	Ε77Ν/Κ798/ VI968	Ό119Ν/Ο1218/ У1963	Ε83Ν/νΐ968	К1228/У1968
Ε51Ν/νΐ96δ	(358Ν/Κ608/ У1963	Ο114Ν/Ο119Ν/ О1213/У1963	Ό119Ν/Ο1218/ VI 963/1.2118/ Ο219Η/Κ388Ν	Τ85Ν/Κ873/ νΐ96δ
Ο56Ν/Ο588/ VI968	Κ62Ν/Ο643/ VI968	Ό119Ν/Ο1218/ У1968/Ь2118/ Ο219Η	Ο114Ν/νΐ96δ/ 1.2113/0219Η	Ο114Ν/Ό119Ν/ Ο1218/νΐ968/ 1.2118/0219Η
Ε65Ν/Ε673 VI968	Ε67Ν/νΐ96δ	νΐ96δ/Ε215Ν/ N2178	νΐ96δ/Ε264Ν/ Ε2668	Ο114Ν/νΐ968/ 1.2118 Ο219Η/Κ388Ν
У1968/Ь2118/ 0219Η/Ε264Ν/ Ε2663/Κ388Ν	Ш19Ν/Ο1218/ νΐ96δ/Ε264Ν/ Ε2663	Ο114Ν/νΐ96δ/ Ε264Ν/Ε2663	νΐ96δ/Κ429Ν/ 1.4318	νΐ96δ/Κ243Ν/ Κ.2458
νΐ96δ/Τ293Ν/Κ295δ	νΐ96δ/Ό389Ν/ Υ3918	νΐ96δ/Κ388Ν	Ό119Ν/Ο1218/ νΐ96δ/Κ388Ν	νΐ96δ/Τ428Ν/ 04308
У1963/Ь2118/ Ο219Η/Ε264Ν/ Ε2663	ϋΐ19Ν/Ο1218/ V 1963/1.2118/ Ο219Η/Ε264Ν/ Ε2668	Ο114Ν/νΐ96δ/ Ь2118/О219Н/ Ε264Ν/Ε2663	νΐ968/Ε264Ν/ Ε2663/Κ388Ν	Υ1963/Κ420Ε/Κ424Ε
νΐ96δ/Ε215Ν/Ν2178

3. Увеличенная устойчивость к ингибиторам.

В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РX, в том числе модифицированный зимоген РX и модифицированные полипептиды РXа, которые содержат одну или несколько модификаций в полипептиде РX и которые в активной форме РXа обладают увеличенной устойчивостью к ингибированию ингибитором РX. Ингибиторы РX включают, например, ингибитор пути тканевого фактора (ТРИ) и антитромбин III (АТ-Ш). Модификации могут представлять собой вставки, делеции или замены аминокислот. В частности, модификации представляют собой аминокислотные замены.

ТРИ представляет собой ингибитор типа Кунитца. ТРИ в виде предшественника имеет последовательность аминокислот, приведенную в 8ЕЭ ГО N0: 557, и имеет зрелую последовательность, соответствующую остаткам, приведенным как остатки 29-304 из 8ЕЭ ГО N0: 557. ТРИ является трехвалентным и содержит три домена типа Кунитца. ТРИ непосредственно ингибирует РXа посредством его второго домена Кунитца (соответствует остаткам 125-175 в последовательности, приведенной в 8ЕЭ ГО N0: 557). ТРИ также может ингибировать комплекс фактор VIIа/тканевой фактор (ТФ) после связывания РXа посредством его первого домена Кунитца (соответствует остаткам 54-104 в последовательности, приведи ной в 8ЕЭ ГО N0: 557). Ингибирование за счет ТРИ увеличивается в присутствии фосфолипидов и РVа. Как и в случае АТШ, обсуждаемого ниже, активность ТРИ опосредована взаимодействиями по связыванию активного центра РXа. Предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РX, такие как модифицированные полипептиды РX, представляющие собой зимогенподобные полипептиды, включают полипептиды, которые обладают увеличенной устойчивостью к ТРИ, поскольку взаимодействия по связыванию изменены и/или не доступны для ингибирования под действием ТРИ.

АТ-Ш представляет собой антикоагулянтный серпин (ингибитор сериновой протеазы). АТ-Ш синтезируется в виде белка-предшественника, содержащего 464 аминокислотных остатка (см. 8ЕЭ ГО N0: 553). В ходе секреции сигнальный пептид из 32 остатков расщепляется с образованием зрелого человеческого антитромбина из 432 аминокислот (8ЕР ГО N0: 554). Гликопротеин АТ-Ш, имеющий молекулярную массу 58 кДа, циркулирует в крови и функционирует как ингибитор сериновой протеазы (серпин),

- 56 028865

ингибируя большое количество сериновых протеаз системы свертывания крови. Основными мишенями АТ-ΙΙΙ являются тромбин и фактор Ха, хотя было показано, что АТ-ΙΙΙ также ингибирует активности Р1Ха, РХЫ, РХПа и, в меньшей степени, РVIIа (см., например, фиг. 2).

Действие АТ-ΙΙΙ значительно усиливается гликозаминогликанами, такими как встречающиеся в природе гепаран сульфат или различные гепарины тканевого происхождения, которые широко используются в качестве антикоагулянтов в клинической практике. АТ-ΙΙΙ связывается с высокой специфичностью с уникальной пентасахаридной последовательностью в гепарине, что индуцирует конформационное изменение в петле реакционного центра (КСЬ). В такой конформации петля реакционного центра АТ-ΙΙΙ может более эффективно взаимодействовать с реакционным центром сериновой протеазы и осуществлять ингибирование. Эта "активация" КСЬ АТШ может быть индуцирована специфичным пентасахаридом как таковым, а также другими "низкомолекулярными" формами гепарина и высокомолекулярными формами гепарина. Длинноцепочечный гепарин (или "высокомолекулярный" гепарин), который имеет сайты связывания как на АТ-ΙΙΙ, так и на РХа, также выступает в качестве матрицы для АТ-ΙΙΙ и РХа, тем самым приводя их в непосредственную близость и дальше облегчая ингибирующее взаимодействие. В отсутствии гепарина АТ-ΙΙΙ является относительно неэффективным ингибитором РХа Юшпкеу е1 а1. (2002) 1. Β^Ι Сбеш., 277:15971-15978).

АТ-ΙΙΙ специфически взаимодействует с РХа, но не с зимогенной формой РХ. Конформационное переключение, которое происходит при расщеплении связи Агд194-Пе195 (Агд15-Пе16 согласно нумерации химотрипсина), структурно экспонирует экзосайты, необходимые для взаимодействий с АТ-ΙΙΙ и гепарином. Взаимодействие АТ-ΙΙΙ с РХа опосредовано или усиливается остатками дополнительных сайтов связывания субстрата в экзосайте 1, и, в особенности, остатками глутаминовой кислоты 215, 216 и 219 согласно нумерации зрелой формы полипептида (соответствующих остаткам 36, 37 и 39 согласно нумерации химотрипсина) (см., например, Ошпкеу е1 а1. (2002) апб Βίίίικίιίπί е1 а1. (2004) 1. Бю1. Сбеш., 279:3671-3679). Экзосайт связывания гепарина РХа топологически расположен на противоположной стороне экзосайта 1 и включает остатки Агд273, бук 276, Агд306, Агд347, Ьук351, Ьук420 и Агд424 согласно нумерации зрелой формы полипептида, приведенной в δΕΟ ΙΌ N0: 134 (соответствующие Агд93, Ьук96, Агд125, Агд165, Ьук169, Ьук236 и Агд240 согласно нумерации химотрипсина) (см., например, Ке/;йе (2000) 1. Бю1. Сбеш., 275:3320-7). Кроме того, основные остатки петли автолиза 326-336 (соответствующие остаткам 143-154 согласно нумерации химотрипсина) также играют роль в распознавании полипептидом РХа активированной гепарином конформации АТ-ΙΙΙ (Ке/;не е1 а1. (2005) 1. Бю1. Сбеш., 280:32722-32728; ИнтсНпи е1 а1. (2004)).

Увеличенная устойчивость к ингибиторам, включая ΤРΡI или АТ-ΙΙΙ, может быть достигнута путем модификации одного или нескольких остатков в полипептиде РХ, связанных с взаимодействием с ингибитором (например, АТ-ΙΙΙ или ТРРЦ. Увеличенная устойчивость также может быть достигнута путем модификации одного или нескольких остатков, участвующих во взаимодействиях с гепарином. Например, могут быть модифицированы один или несколько остатков в экзосайте 1, петле автолиза или в гепарин-связывающем экзосайте. Кроме того, модификация (модификации), которая делает полипептид РХа более зимогеноподобным, тем самым конформационно нарушая доступ к указанным выше сайтам связывания, также может обеспечить увеличенную устойчивость к ингибиторам. Таким образом, модификация (модификации) для увеличения устойчивости к ингибиторам (например, АТШ или ТРРЦ также могут представлять собой модификации одного или нескольких остатков активационного домена, соответствующих остаткам 195-198, 325-334, 366-377 и 400-406 согласно нумерации зрелой формы полипептида со ссылкой на δΕΟ ΙΌ N0: 134 (соответствующих остаткам 16-19, 142-152, 184-193 и 216-223 согласно нумерации химотрипсина) и/или остатков 211, 219 или 378, которые образуют триаду зимогена (см., например, раздел Ό.2 выше).

Например, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ в активной форме РХа обладают устойчивостью к ингибиторам (например, АТ-ΙΙΙ или ТРРЦ, которая увеличена в 2 раза, например по меньшей мере в 3, в 4, в 5, в 6, в 7, в 8, в 9, в 10, в 20, в 30, в 40, в 50, в 60, в 70, в 80, в 90, в 100, в 200, в 300, в 400, в 500, в 600, в 700, в 800, в 900, в 1000, в 1500, в 2000, в 2500 в 3000, в 3500, в 4000, в 4500, в 5000, в 5500, в 6000 раз или больше по сравнению с немодифицированным РХа, не содержащим модификацию (модификации). Таким образом, при оценке в соответствующем анализе ш νίϋΌ, ш νί\Ό или ех νί\Ό модифицированные полипептиды РХ могут проявлять увеличенную устойчивость к ингибиторам (например, АТ-ΙΙΙ или ΊΤΉ) по сравнению с немодифицированными полипептидами РХ.

Такие модифицированные полипептиды РХ включают полипептиды, которые содержат модификацию (модификации) в аминокислотном положении (аминокислотных положениях) 196, 197, 200, 202, 211, 214, 216, 218, 219, 273, 276, 306, 326, 327, 332, 334, 336, 338, 420 и/или 424 в тяжелой цепи РХ, соответствующем остаткам, приведенным в δΕΟ ΙΌ N0: 134. Обычно модификация представляет собой аминокислотную замену. Аминокислотная замена может представлять собой замену на любую из 19 других аминокислот в этом положении при условии, что полученный модифицированный полипептид РХ в активной форме обладает увеличенной устойчивостью к ингибиторам (например, АТ-ΙΙΙ или ТРРЦ по сравнению с РХа, не содержащим аминокислотную замену (аминокислотные замены), и сохраняет РVа- 57 028865

зависимую каталитическую активность.

В конкретных примерах модификация (модификации) для осуществления устойчивости к ингибиторам может представлять собой модификацию, которая делает полипептид РХа более зимогенподобным, тем самым снижая скорость связывания с ингибитором (например, связывания с АТ-Ш или связывания с ЮТ). Например, модифицированные полипептиды РХ, которые обладают увеличенной устойчивостью к ингибиторам (например, АТ-Ш или ТРИ), могут содержать по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, например по меньшей мере одну аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 195, 196, 197 или 198 со ссылкой на положения, приведенные в δΕρ ГО N0: 134 (положения 16-19 согласно нумерации химотрипсина). Эти аминокислотные остатки соответствуют гидрофобным остаткам на новом Оконце, который создается при активационном расщеплении зимогена РХ. Как обсуждалось в других разделах в настоящем документе, после "активационного расщепления" гидрофобные остатки на Оконце попадают в активационный карман, и новая а-аммониевая группа Пе195 образует солевой мостик с остатком Акр378 (соответствующим Акр 194 согласно нумерации химотрипсина), который необходим для перехода из неактивного состояния в активное состояние. Например, остаток Уа1, который присутствует в полипептиде РХ, приведенном в качестве примера в δΕρ ГО N0: 134, является гидрофобным и подходит для оптимального взаимодействия в активационном кармане. В конкретных примерах модификация путем аминокислотной замены (аминокислотных замен) N концевых аминокислотных остатков 195, 196, 197 и/или 198 (соответствующих остаткам 16-19 согласно нумерации химотрипсина) на гидрофильные нейтральные аминокислотные остатки, которые содержат полярную группу К, нарушает или дестабилизирует образование этого а-солевого мостика или другие "связанные" конформационные изменения, описанные выше, хотя при этом сохраняется активность. Примерами таких аминокислотных остатков являются Акп (М), С1п (Р), δе^ (δ), ТЬг (Т), Сук (С) или Туг (Υ).

В примерах, предусмотренных в настоящем документе, предусмотренные в настоящем документе модификации, которые обеспечивают увеличенную устойчивость к ингибиторам (например, АТ-Ш или ТРИ), включают, но не ограничиваются ими, аминокислотную замену в немодифицированном полипептиде РХ на I в положении, соответствующем положению 196; δ в положении, соответствующем положению 196; Ь в положении, соответствующем положению 196; Т в положении, соответствующем положению 196; δ в положении, соответствующем положению 197; А в положении, соответствующем положению 197; А в положении, соответствующем положению 200; У в положении, соответствующем положению 200; δ в положении, соответствующем положению 200; δ в положении, соответствующем положению 202; δ в положении, соответствующем положению 211; Ό в положении, соответствующем положению 214; А в положении, соответствующем положению 214; δ в положении, соответствующем положению 214; К в положении, соответствующем положению 216; К в положении, соответствующем положению 216; А в положении, соответствующем положению 216; δ в положении, соответствующем положению 216; К в положении, соответствующем положению 218; К в положении, соответствующем положению 218; А в положении, соответствующем положению 218; Н в положении, соответствующем положению 219; А в положении, соответствующем положению 273; Ε в положении, соответствующем положению 273; А в положении, соответствующем положению 276; Е в положении, соответствующем положению 276; Ε в положении, соответствующем положению 306; А в положении, соответствующем положению 326; δ в положении, соответствующем положению 326; Т в положении, соответствующем положению 326; У в положении, соответствующем положению 326; р в положении, соответствующем положению 326; N в положении, соответствующем положению 326; М в положении, соответствующем положению 326; К в положении, соответствующем положению 326; Υ в положении, соответствующем положению 326; Е в положении, соответствующем положению 326; Ό в положении, соответствующем положению 326; А в положении, соответствующем положению 327; Ь в положении, соответствующем положению 327; А в положении, соответствующем положению 332; Ό в положении, соответствующем положению 332; Е в положении, соответствующем положению 332; δ в положении, соответствующем положению 332; С в положении, соответствующем положению 332; А в положении, соответствующем положению 334; Т в положении, соответствующем положению 334; N в положении, соответствующем положению 334; Е в положении, соответствующем положению 336; А в положении, соответствующем положению 338; δ в положении, соответствующем положению 338; N в положении, соответствующем положению 338; К в положении, соответствующем положению 338; У в положении, соответствующем положению 338; Υ в положении, соответствующем положению 338; М в положении, соответствующем положению 338; А в положении, соответствующем положению 420; Е в положении, соответствующем положению 420; А в положении, соответствующем положению 424; и/или Ε в положении, соответствующем положению 424, где каждая замена приведена со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δΕρ ГО N0: 134. Модифицированный полипептид РХ может содержать одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или больше из любых указанных выше аминокислотных замен, где каждая замена введена в другое положение при условии, что полученный модифицированный полипептид РХ в активной форме обладает увеличенной устойчивостью к ингибитору (например, устойчивостью к АТ-Ш

- 58 028865

и/или устойчивостью к ТРР!) и сохраняет РУа-зависимую каталитическую активность. Такие модифицированные полипептиды РК включают полипептиды, которые в активной форме обладают устойчивостью к ингибиторам (например, устойчивостью к АТ-Ш и/или устойчивостью к ТТЛ), которая увеличена по меньшей мере в 2 раза по сравнению с немодифицированным полипептидом Р%а, не содержащим модификацию (модификации). Со ссылкой на аминокислотные остатки, приведенные в 8РС) II) N0: 134, не имеющие ограничительного характера примеры такой аминокислотной замены (аминокислотных замен) в предусмотренном в настоящем документе модифицированном полипептиде Ι'Υ приведены в табл. 1013.

Таблица 10

VI961	VI968	νΐ96Ε	νΐ96Τ	01978	Ε200Α	Ε200ν
К2028	Е2118/О219Н	Κ.326Υ	Κ.326Α	Κ.326Τ	Κ326ν	Κ326<3
Κ.326Ν	К.326М	Κ.326Κ	Τ327Α	Т327Б	8334Α	8334Τ
8334Ν	К.336Е	Κ338Α	Κ.3388	Κ338Ν	Κ338Κ	Κ338ν
Κ338Υ	К.338М	Т327А/ Κ338Α	Т327Б/ Κ338Μ	Ε200ν/Τ327Ε/ Κ338Μ	Ε220ν/Τ327Ε/ 8334Α/Κ338Μ	νΐ96δ/Ε2118/ Ο219Η
О197А/ Ь2115/О219Н	1195171,2118/ О219Н	VI968/ Ν214ϋ	VI968/ Ν214Α	VI968/ N2148	νΐ968/Ε216Κ
VI968/ Е216К	νΐ968/Ε216Α	VI968/ Ε2168	VI968/ Ε218Κ	νΐ968/Ε218Κ	νΐ96δ/Ε218Α	νΐ968/Κ332Α
У1968/ Κ332ϋ	νΐ96δ/Κ332Ε	VI968/ Κ3328	VI968/ Κ.332Ο	νΐ96δ/Κ326ϋ	νΐ96δ/Κ326Μ	νΐ968/Κ326Ν
νΐ96δ/ Κ326ς	νΐ968/Κ273Ε	VI968/ Κ273Α	νΐ96δ/ Κ.424Ε	νΐ96δ/Κ420Α	νΐ96δ/Κ420Ε	Υ1968/Κ306Ε
VI968/ К424А	Υ1968/Κ338Α	VI968/ Κ3388	VI968/ Κ276Α	Υ1968/Κ276Ε	νΐ96δ/Κ420Ε/ Κ.424Ε

В предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РУ также может быть включена дополнительная аминокислотная замена (аминокислотные замены), которая может представлять собой любую другую аминокислотную замену, описанную в настоящем документе или известную в данной области техники, при условии, что полученные модифицированные полипептиды РА в активной форме обладают устойчивостью к ингибиторам (например, устойчивостью к АТ-Ш и/или устойчивостью к ТРР!), которая увеличена по меньшей мере в 2 раза по сравнению с немодифицированным полипептидом Р%а, не содержащим модификацию (модификации), и сохраняют РУа-зависимую каталитическую активность. Например, дополнительные модификации включают любую дополнительную модификацию (модификации), описанные в настоящем документе, которые увеличивают зависимость от кофактора (см., например, раздел Ώ.2) и/или изменяют гликозилирование (см., например, раздел Р).Р). Примеры аминокислотной замены (аминокислотных замен) для введения не нативного сайта гликозилирования включают, но не ограничиваются ими, аминокислотную замену (аминокислотные замены) в немодифицированном полипептиде Р-Υ на N в положении, соответствующем положению 51; N в положении, соответствующем положению 56, и 8 в положении, соответствующем положению 58; N в положении, соответствующем положению 62, и 8 в положении, соответствующем положению 64; N в положении, соответствующем положению 65, и 8 в положении, соответствующем положению 67; N в положении, соответствующем положению 67; N в положении, соответствующем положению 73, и 8 в положении, соответствующем положению 75; N в положении, соответствующем положению 75, и 8 в положении, соответствующем положению 77; N в положении, соответствующем положению 77, и 8 в положении, соответствующем положению 79; N в положении, соответствующем положению 78, и 8 в положении, соответствующем положению 80; 8 в положении, соответствующем положению 82; N в положении, соответствующем положению 83; N в положении, соответствующем положению 82, и 8 в положении, соответствующем положению 84; N в положении, соответствующем положению 85, и 8 в положении, соответствующем положению 87; N в положении, соответствующем положению 86, и 8 в положении, соответствующем положению 88; N в положении, соответствующем положению 95, и 8 в положении, соответствующем положению 97; N в положении, соответствующем положению 114; N в положении, соответствующем положению 119, и 8 в положении, соответствующем положению 121; 8 в положении, соответствующем положению 122; N в положении, соответствующем положению 215, и 8 в положении, соответствующем положению 217; N в положении, соответствующем положению 243, и 8 в положении, соответствующем положению 245; N в положении, соответствующем положению 264, и 8 в положении, соответствующем положению 266; N в положении, соответствующем положению 293, и 8 в положении, соответствующем положению 295; N в положении, соответствующем положению 388; N в положении, соответствующем положению 389, и 8 в положении, соответствующем положению 391; N в положении, соответствующем положению 428, и 8 в положении, соответствующем положению 430 и/или N в положении, соответствующем положению 429, и 8 в положении, соответствующем положению 431, где каждая замена приведена со ссылкой на положения аминокислот, приведенные в 8РС) Ю N0: 134. Со ссылкой на аминокислотные остатки, приведенные в 81(0 II) N0: 134, не имеющие ограничительного характера примеры такой аминокислотной замены (аминокислотных замен) в предусмотренном в настоящем документе модифицированном полипептиде Р% приведены в табл. 11.

- 59 028865

Таблица 11

Τ85Ν/Κ873/ VI968	Φ56Ν/Ό588/ νΐ968	Κ62Ν/Ο648/ VI968	1.65Ν/Ε673/ VI968	Ε67Ν/νΐ96δ	1/73Ν/Ο755/ νΐ963
Ο75Ν/Ε778/ VI968	Κ86Ν/Ε888/ VI968	Ο114Ν/νΐ968	ϋ95Ν/Ε)973/ VI968	Ε82δ/νΐ968	Ε82Ν/Ρ848/ VI968
Ο78Ν/Ν803/ VI968	Ε77Ν/Κ798/ VI968	Ш19Ν/Ο1218/ νΐ968	Ε83Ν/νΐ968	Κ1223/νΐ968	Ε51Ν/νΐ968
φ58Ν/Κ60δ/νΐ 968	Ο114Ν/Ο119Ν/ Ο121δ/νΐ968	Ш19Ν/Ο1218/ V 1968/1.2113/ Ο219Η	Ο114Ν/νΐ968/ Ε2118/Ο219Η	0114Ν/ 0119Ν/01218/ν1968/Ь 2113/Ο219Η	νΐ968/Ε215Ν/ N2178
νΐ96δ/Ε264Ν/ Е2663	Ш19Ν/Ο1218/ νΐ968/Ε264Ν/ Ε2663	Ο114Ν/νΐ963/ Ε264Ν/Ε2668	νΐ96δ/Κ429Ν/ 1.4313	νΐ96δ/Κ243Ν/Κ2458	νΐ965/Τ239Ν/Κ.2958
νΐ96δ/ϋ389Ν/ Υ3913	νΐ968/Κ388Ν	ϋΐ 19Ν/Ο1213/ νΐ96δ/Κ388Ν	νΐ96δ/Τ428Ν/ 04308	VI963/1.2118/ Ο219Η/Ε264Ν/Ε2668	ϋΐ 19Ν/Ο1218/ VI 965/1.2118/ 0219Η/Ε264Ν/Ε2665
0114Ν/νΐ963/ Ь2118/0219Н/ Ε264Ν/Ε2663	νΐ96δ/Ε264Ν/ Ε2668/Κ388Ν	ϋΐ 19Ν/Ο1213/ νΐ96δ/Ε2118/ Ο219Η/Κ388Ν	0114Ν/νΐ968/ Ь2118/0219Η/Κ 388Ν	νΐ963/Ε2118/ Ο219Η/Ε264Ν/Ε2668/ Κ.388Ν

В конкретных примерах, предусмотренные в настоящем документе модификации включают, без ограничения, аминокислотную замену в немодифицированном полипептиде РХ на δ в положении, соответствующем положению 196; Т в положении, соответствующем положению 196; δ в положении, соответствующем положению 197; А в положении, соответствующем положению 197; А в положении, соответствующем положению 200; У в положении, соответствующем положению 200; δ в положении, соответствующем положению 200; δ в положении, соответствующем положению 202; δ в положении, соответствующем положению 211; Ό в положении, соответствующем положению 214; А в положении, соответствующем положению 214; δ в положении, соответствующем положению 214; К в положении, соответствующем положению 216; К в положении, соответствующем положению 216; А в положении, соответствующем положению 216; δ в положении, соответствующем положению 216; К в положении, соответствующем положению 218; А в положении, соответствующем положению 218; Н в положении, соответствующем положению 219; Ε в положении, соответствующем положению 273; Ε в положении, соответствующем положению 276; Ε в положении, соответствующем положению 306; δ в положении, соответствующем положению 326; Т в положении, соответствующем положению 326; У в положении, соответствующем положению 326; N в положении, соответствующем положению 326; М в положении, соответствующем положению 326; К в положении, соответствующем положению 326; Υ в положении, соответствующем положению 326; Ε в положении, соответствующем положению 326; Ό в положении, соответствующем положению 326; А в положении, соответствующем положению 327; Ь в положении, соответствующем положению 327; Ό в положении, соответствующем положению 332; Ε в положении, соответствующем положению 332; δ в положении, соответствующем положению 332; 0 в положении, соответствующем положению 332; А в положении, соответствующем положению 334; Т в положении, соответствующем положению 334; N в положении, соответствующем положению 334; Ε в положении, соответствующем положению 336; А в положении, соответствующем положению 338; δ в положении, соответствующем положению 338; N в положении, соответствующем положению 338; К в положении, соответствующем положению 338; У в положении, соответствующем положению 338; Υ в положении, соответствующем положению 338; М в положении, соответствующем положению 338; Ε в положении, соответствующем положению 420; и/или Ε в положении, соответствующем положению 424, где каждая замена приведена со ссылкой на положения аминокислот, приведенные в δΕΡ ΙΌ N0: 134.

В примерах, предусмотренных в настоящем документе, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ, в том числе модифицированный зимоген РХ или РХа, имеют по меньшей мере одну аминокислотную замену в немодифицированном полипептиде РХ, которая представляет собой замену на δ в положении, соответствующем положению 211, или замену на Н в положении, соответствующем положению 219, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δΕΡ ΙΌ N0: 134. Модифицированный полипептид РХ может содержать одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или больше аминокислотных замен, где каждая замена введена в другое положение при условии, что полученный модифицированный полипептид РХ в активной форме обладает увеличенной устойчивостью к ингибиторам (например, ΑΤ-ΙΙΙ или ТРИ) и сохраняет РУа-зависимую каталитическую активность. Например, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ, в том числе модифицированный зимоген РХ или РХа, имеют по меньшей мере две аминокислотные замены в немодифицированном полипептиде РХ, которые представляют собой замену на δ в положении, соответствующем положению 211, и замену на Н в положении, соответствующем положению 219, со ссылкой на положения аминокислот, указанные в δΕΡ ΙΌ N0: 134. Дополнительная аминокислотная замена (аминокислотные замены) может представлять собой любую другую аминокислотную замену, описанную в настоящем документе или известную в данной области техники. В конкретном примере дополнительная аминокислотная замена представляет собой аминокислотную замену в положении 195, 196, 197 или 198. Примеры такой дополнительной аминокислотной замены (аминокислотных замен) включают, но не ограничиваются заменой на Ь в положении, соответствующем положению 195; заменой на У в по- 60 028865

ложении, соответствующем положению 195; заменой на 8 в положении, соответствующем положению 195; заменой на Т в положении, соответствующем положению 195; заменой на Ι в положении, соответствующем положению 195; заменой на А в положении, соответствующем положению 195; заменой на Р в положении, соответствующем положению 195; заменой на Ό в положении, соответствующем положению 195; заменой на С в положении, соответствующем положению 195; заменой на Ι в положении, соответствующем положению 196; заменой на А в положении, соответствующем положению 196; заменой на 8 в положении, соответствующем положению 196; заменой на Ь в положении, соответствующем положению 196; заменой на Р в положении, соответствующем положению 196; заменой на Ι в положении, соответствующем положению 196; заменой на Т в положении, соответствующем положению 196; заменой на С в положении, соответствующем положению 196; 8 в положении, соответствующем положению 197; А в положении, соответствующем положению 197; А в положении, соответствующем положению 197; N в положении, соответствующем положению 197; Н в положении, соответствующем положению 197; и/или К в положении, соответствующем положению 197. В других примерах, дополнительные модификации включают любую дополнительную модификацию (модификации), описанную в настоящем документе, которая увеличивает зависимость от кофактора (см., например, раздел Ό.2) и/или изменяет гликозилирование (см., например, раздел Ό.1). Такие модифицированные полипептиды РХ включают полипептиды, которые в активной форме обладают устойчивостью к ингибиторам и/или зависимостью от кофактора, которая увеличена по меньшей мере в 2 раза или больше по сравнению с немодифицированным полипептидом РХа, не содержащим модификацию (модификации). Со ссылкой на аминокислотные остатки, приведенные в 8ЕЭ ГО N0: 134, не имеющие ограничительного характера примеры такой аминокислотной замены (аминокислотных замен) в предусмотренном в настоящем документе модифицированном полипептиде РХ приведены в табл. 12.

_ _ _Таблица 12

νΐ96δ/Έ2118/ О219Н	Ο197ΑΥ2118/ О219Н	11951712118/ Ο219Η	ϋΐ 19Ν/Ο1218/ У1968/Ь2118/ С219Н	0114Ν/νΐ968/ 12118/Ο219Η	0114Ν/ ΟΙ 19Ν/Ο1218/Υ1968/Ε 2118/Ο219Η
VI965/12118/ Ο219Η/Ε264Ν /Е2668	ϋΐ 19Ν/Ο1213/ У1968/Ь2118/ Ο219Η/Ε264Ν/ Ε2663	Ο114Ν/νΐ96δ/ 12118/О219Н/ Ε264Ν/Ε2663	ϋΐ 19Ν/Ο1218/ У1968/Ь211δ/ Ο219Η/Κ388Ν	Ο114Ν/νΐ96δ/ Ь2118/О219Н/ Κ.388Ν	νΐ963/Ι/2113/ Ο219Η/Ε264Ν/Ε2668/ Κ388Ν

В конкретных примерах, предусмотренных в настоящем документе, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ, в том числе модифицированный зимоген РХ или РХа, которые обладают увеличенной устойчивостью к ингибиторам (например, устойчивостью к АТ-ΙΙΙ и/или устойчивостью к ΣΤΡΙ) в их активной форме, имеют по меньшей мере одну аминокислотную замену в немодифицированном полипептиде РХ, которая представляет собой замену на 8 в положении, соответствующем положению 196; замену на Ь в положении, соответствующем положению 196; замену на Т в положении, соответствующем положению 196; замену на 8 в положении, соответствующем положению 197; замену на N в положении, соответствующем положению 326; замену на А в положении, соответствующем положению 334; замену на Т в положении, соответствующем положению 334; замену на А в положении, соответствующем положению 338; замену на 8 в положении, соответствующем положению 338; или замену на У в положении, соответствующем положению 338, где каждая замена приведена со ссылкой на положения аминокислот, указанные в 8ЕЭ ГО N0: 134. Модифицированный полипептид РХ может содержать одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или больше аминокислотных замен, где каждая замена введена в другое положение, при условии, что полученный модифицированный полипептид РХ в активной форме обладает увеличенной устойчивостью к ингибиторам (например, устойчивостью к АТ-ΙΙΙ и/или устойчивостью к ΊΊΤΙ) и сохраняет РУа-зависимую каталитическую активность. Дополнительная аминокислотная замена (аминокислотные замены) может представлять собой любую другую аминокислотную замену, описанную в настоящем документе или известную в данной области техники. Например, дополнительные модификации включают любую дополнительную модификацию (модификации), описанную в настоящем документе выше, которая увеличивает зависимость от кофактора (раздел Ό.2) и/или любую дополнительную модификацию, которая изменяет гликозилирование (раздел Ό.1). Такие модифицированные полипептиды РХ включают полипептиды, которые в активной форме обладают зависимостью от кофактора, которая увеличена по меньшей мере в 5 раз, например зависимостью от кофактора, которая увеличена по меньшей мере в 10, в 20, в 30, в 40, в 50, в 60, в 70, в 80, в 90, в 100 раз или больше по сравнению с немодифицированным полипептидом РХа, не содержащим модификацию (модификации).

В конкретных примерах предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ, в том числе модифицированный зимоген РХ или РХа, которые обладают увеличенной устойчивостью к ингибиторам (например, устойчивостью к АТ-ΙΙΙ и/или устойчивостью к ТРЛ) в их активной форме, имеют по меньшей мере две аминокислотные замены в немодифицированном полипептиде РХ, где одна замена представляет собой замену в аминокислотном положении 195, 196, 197 или 198, и другая замена представляет собой замену в положении, соответствующем одному или нескольким положениям, выбранным из положений 273, 276, 306, 326, 332, 338, 420 и/или 424. Замена может представлять собой

- 61 028865

замену на любую из других 19 аминокислот в этом положении. Не имеющий ограничительного характера пример замены в аминокислотном положении 195, 196, 197 или 198 представляет собой замену на неполярный, нейтральный или гидрофильный аминокислотный остаток, такую как замена в положении 195 или 196 на Акп (И), О1п (О), 8ег (8), ТЬг (Т), Сук (С) или Туг (Υ), например замена на 8 или Т. Не имеющий ограничительного характера пример замены в положении, соответствующем одному или нескольким положениям, выбранным из положений 273, 276, 306, 326, 332, 338, 420 и/или 424, представляет собой замену на кислый или нейтральный аминокислотный остаток, например на Акр (Ό), О1и (Е), А1а (А), О1у (О), 8ег (8), Сук (С), Акп (М), О1п (0), 11е (I), Ьеи (Ь), Ме! (М), РЬе (Р), Рго (Р), ТЬг (Т), Тгр (А), Туг (Υ) или Уа1 (У), например, замену на А или Е. Такие модифицированные полипептиды РХ, содержащие по меньшей мере две замены в положениях 195, 196, 197 и/или 198 и в одном или нескольких положениях, выбранных из 273, 276, 306, 326, 332, 338, 420 и/или 424, включают полипептиды, которые в активной форме обладают устойчивостью к ингибиторам (например, устойчивостью к АТ-ΙΙΙ и/или устойчивостью к ТЕРЦ которая увеличена по меньшей мере в 2, в 4, в 10, в 50, в 100, в 200, в 300, в 400 и, в частности, по меньшей мере в 500 раз по сравнению с немодифицированным полипептидом РХа, не содержащим модификацию (модификации).

В конкретных примерах предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ, в том числе модифицированный зимоген РХ или РХа, имеют, по меньшей мере, две аминокислотные замены в немодифицированном полипептиде РХ, где

1) по меньшей мере одна аминокислотная замена представляет замену, соответствующую замене на Ь в положении, соответствующем положению 195; замене на У в положении, соответствующем положению 195; замене на 8 в положении, соответствующем положению 195; замене на Т в положении, соответствующем положению 195; замене на Ι в положении, соответствующем положению 195; замене на А в положении, соответствующем положению 195; замене на Р в положении, соответствующем положению 195; замене на Ό в положении, соответствующем положению 195; замене на О в положении, соответствующем положению 195; замене на Ι в положении, соответствующем положению 196; замене на А в положении, соответствующем положению 196; замене на 8 в положении, соответствующем положению 196; замене на Ь в положении, соответствующем положению 196; замене на Р в положении, соответствующем положению 196; замене на Ι в положении, соответствующем положению 196; замене на Т в положении, соответствующем положению 196; замене на О в положении, соответствующем положению 196; 8 в положении, соответствующем положению 197; А в положении, соответствующем положению 197; А в положении, соответствующем положению 197; N в положении, соответствующем положению 197; Н в положении, соответствующем положению 197; и/или К в положении, соответствующем положению 197; и

2) по меньшей мере одна аминокислотная замена представляет замену, соответствующую замене на

А в положении, соответствующем положению 273; Е в положении, соответствующем положению 273; А в положении, соответствующем положению 276; Е в положении, соответствующем положению 276; Е в положении, соответствующем положению 306; А в положении, соответствующем положению 326; 8 в

положении, соответствующем положению 326; Т в положении, соответствующем положению 326; У в

положении, соответствующем положению 326; О в положении, соответствующем положению 326; N в

положении, соответствующем положению 326; М в положении, соответствующем положению 326; К в

положении, соответствующем положению 326; Υ в положении, соответствующем положению 326; Е в

положении, соответствующем положению 326; Ό в положении, соответствующем положению 326; А в

положении, соответствующем положению 332; Ό в положении, соответствующем положению 332; Е в

положении, соответствующем положению 332; 8 в положении, соответствующем положению 332; О в

положении, соответствующем положению 332; А в положении, соответствующем положению 338; 8 в

положении, соответствующем положению 338; N в положении, соответствующем положению 338; К в

положении, соответствующем положению 338; У в положении, соответствующем положению 338; Υ в

положении, соответствующем положению 338; М в положении, соответствующем положению 338; А в

положении, соответствующем положению 420; Е в положении, соответствующем положению 420; А в

положении, соответствующем положению 424; и/или Е в положении, соответствующем положению 424, где каждая замена приведена со ссылкой на положения аминокислот, приведенные в 8ЕО ГО N0: 134. Со ссылкой на аминокислотные остатки, приведенные в 8ЕО ГО N0: 134, не имеющие ограничительного характера примеры такой аминокислотной замены (аминокислотных замен) в предусмотренном в настоящем документе модифицированном полипептиде РХ приведены в табл. 13.

- 62 028865

Таблица 13

νΐ96δ/Κ332Ό	νΐ96δ/Κ332Ε	νΐ96δ/Κ332δ	νΐ96δ/Κ332Ο	νΐ96δ/Κ326Ό	νΐ96δ/Κ326Μ
νΐ96δ/Κ326Ο	νΐ96δ/Κ273Ε	νΐ96δ/Κ273Α	νΐ96δ/Κ424Ε	νΐ96δ/Κ420Α	νΐ96δ/Κ420Ε
νΐ96δ/Κ.424Α	νΐ96δ/Κ338Α	νΐ96δ/Κ338δ	Υ196δ/Κ276Α	Υ196δ/Κ276Ε	Υ196δ/Κ420Ε/Κ424Ε
Υ196δ/Κ326Ν	Υ196δ/Κ306Ε	Υ196δ/Κ.332Α

4. Примеры модифицированых полипептидов РХ.

В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, содержащие аминокислотную замену (аминокислотные замены) в полипептиде предшественнике РХ, приведенном в 8Н(9 ГО ΝΘ: 2, или в его варианте, который обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ним. Например, модифицированный полипептид РХ содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены) в полипептиде РХ, который обладает по меньшей мере 80, 85, 86, 87, 88, 89%, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с 8ЕР ГО ΝΘ: 2. Примерами таких модифицированных полипептидов РХ являются полипептиды РХ, имеющие последовательность аминокислот, приведенную в любой из 8ЕР ГО ΝΘ8: 4-133, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с любой из 8Н(9 ГО ΝΘ8: 4-133. В конкретных примерах модифицированные полипептиды РХ представляют собой полипептиды РХ, имеющие последовательность аминокислот, приведенную в любой из 8ЕР ГО ΝΘ8: 5-25, 32, 37, 41, 42, 44, 45, 47-49, 51-58, 60-71, 73-77, 81111 и 114-133, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с любой из 8Е(А ГО ΝΘ8: 5-25, 32, 37, 41, 42, 44, 45, 47-49, 51-58, 60-71, 73-77, 81-111 и 114-133.

В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, содержащие аминокислотную замену (аминокислотные замены) в полипептиде предщественнике РХ, содержащем гетерологичную сигнальную последовательность. Например, гетерологичная сигнальная последовательность представляет собой гетерологичную сигнальную последовательность из тромбина (например, соответствующую аминокислотам 1-43 из 8Н(9 II) ΝΘ: 415). Например, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, содержащие аминокислотную замену (аминокислотные замены) в полипептиде РХ, приведенном в 8ЕР ГО ΝΘ: 415, или в его варианте, который обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ним. Например, модифицированный полипептид РХ содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены) в полипептиде РХ, который обладает по меньшей мере 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с 8Н(9 ГО ΝΘ: 415. Примерами таких модифицированных полипептидов РХ являются полипептиды РХ, имеющие последовательность аминокислот, приведенную в любой из 81%) ГО ΝΘ8: 417546, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с любой из 8ЕР ГО ΝΘ8: 417-546. В конкретных примерах модифицированные полипептиды РХ представляют собой полипептиды РХ, имеющие последовательность аминокислот, приведенную в любой из 8ЕР ГО ΝΘ8: 418438, 445, 450, 454, 455, 457, 458, 460-462, 464-471, 473-484, 486-490, 494-524 и 527-546, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с любой из 8Н(9 ГО ΝΘ8: 418-438, 445, 450, 454, 455, 457, 458, 460-462, 464-471, 473-484, 486-490, 494-524 и 527-546.

В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, содержащие аминокислотную замену (аминокислотные замены) в зрелом полипептиде РХ, приведенном в 81%) ГО ΝΘ: 134, или в его варианте, который обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с ним. Например, модифицированный полипептид РХ содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены) в полипептиде РХ, который обладает по меньшей мере 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90%, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с 8Н(9 ГО ΝΘ: 134. Примерами таких модифицированных полипептидов РХ являются полипептиды РХ, имеющие последовательность аминокислот, приведенную в любой из 8ЕР ГО ΝΘ8: 136-265, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с любой из 8ЕР ГО ΝΘ8: 136-265. В конкретных примерах модифицированные полипептиды РХ представляют собой полипептиды РХ, имеющие последовательность аминокислот, приведенную в любой из 8ЕР ГО ΝΘ8: 137-157, 164, 169, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213-243 и 246-265, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с любой из 8Ер ГО ΝΘ8: 137-157, 164, 169, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213-243 и 246-265.

Также в настоящем документе предусмотрены зимогенная, активная или каталитически активная формы любой из 8ЕР ГО ΝΘ8: 136-265, или последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью

- 63 028865

последовательности с любой из 8ЕО ГО N08: 136-265. В конкретных примерах предусмотрены зимогенная, активная или каталитически активные формы любой из 8Е0 ГО N08: 137-157, 164, 169, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213-243 и 246-265. Примерами таких форм являются двухцепочечные формы, имеющие тяжелую и легкую цепи, связанные дисульфидной связью. Аминокислотная замена (аминокислотные замены) представляют собой аминокислотную замену (аминокислотные замены) в тяжелой цепи.

Например, в настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, которые представляют собой зимогенные формы РХ, содержащие аминокислотную замену (аминокислотные замены) в полипептиде зимогене РХ, содержащем легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот 1-139 из 8Е0 ГО N0: 134, и тяжедую цепь, имеющую последовательность аминокислот 143-448 из 8Е0 ГО N0: 134, или в его варианте, содержащем тяжелую цепь, обладающую по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с легкой цепью и тяжелой цепью соответственно. Например, модифицированный полипептид РХ представляет собой модифицированный зимоген РХ, который содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены) в полипептиде зимогене РХ, содержащем легкую цепь, которая обладает по меньшей мере 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с легкой цепью полипептида зимогена РХ, имеющей последовательность аминокислот 1-139 из 8Е0 ГО N0: 134, и/или тяжелую цепь, которая обладает по меньшей мере 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с тяжелой цепью полипептида зимогена РХ, имеющей последовательность аминокислот 143-448 из 8Е0 ГО N0: 134. Примерами таких модифицированных полипептидов зимогенов РХ являются полипептиды РХ, содержащие легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот 1-139, приведенную в 8Е0 ГО N0: 134 (т.е. соответствующую аминокислотам 1-139 в любой из 8Е0 ГО N08: 136-265), или легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с аминокислотами 1-139, приведенными в любой из 8Е0 ГО N08: 134; и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот 143-448 из любой из 8Е0 ГО N08: 136-265, или полипептид, содержащий тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с аминокислотами 143-448, приведенными в любой из 8Е0 ГО N08: 136-265. В конкретных примерах модифицированные полипептиды зимогены РХ представляют собой полипептиды РХ, содержащие легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот 1-139, приведенную в 8Е0 ГО N0: 134 (т.е. соответствующую аминокислотам 1-139 в любой из 8Е0 ГО N08: 136-265), или легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с аминокислотами 1139, приведенными в любой из 8Е0 ГО N08: 134; и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот 143-448 из любой из 8ЕО ГО N08: 137-157, 164, 169, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192203, 205-209, 213-243 и 246-265, или полипептид, содержащий тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с аминокислотами 143-448, приведенными в любой из 8ЕО ГО N08: 137-157, 164, 169, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213243 и 246-265.

В настоящем документе предусмотрены модифицированные полипептиды РХ, которые представляют собой формы РХа, содержащие аминокислотную замену (аминокислотные замены) в полипептиде РХа, содержащем легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот 1-139 из 8Е0 ГО N0: 134, и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот 195-448 из 8Е0 ГО N0: 134, или в его варианте, который обладает по меньшей мере 75% идентичностью последовательности с легкой цепью или тяжелой цепью. Например, модифицированный полипептид РХ представляет собой модифицированный РХа, который содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены) в полипептиде РХа, который содержит легкую цепь, которая обладает по меньшей мере 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с легкой цепью полипептида РХа, имеющей последовательность аминокислот 1-139 из 8Е0 ГО N0: 134, и/или тяжелую цепь, которая обладает по меньшей мере 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с тяжелой цепью полипептида РХа, имеющей последовательность аминокислот 195448 из 8Е0 ГО N0: 134. Примерами таких модифицированных полипептидов РХа являются полипептиды РХ, содержащие легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот 1-139, приведенную в 8Е0 ГО N0: 134 (т.е. соответствующую аминокислотам 1-139 в любой из 8Е0 ГО N08: 136-265), или легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с аминокислотами 1-139, приведенными в любой из 8Е0 ГО N08: 134; и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот 195-448 из любой из 8Е0 ГО N08: 136-265, или полипептид, содержащий тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с ами- 64 028865

нокислотами 195-448, приведенными в любой из 8Е0 ГО N08: 136-265. В конкретных примерах модифицированные полипептиды РХа представляют собой полипептиды РХ, содержащие легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот 1-139, приведенную в 8Е0 ГО N0: 134 (т.е. соответствующую аминокислотам 1-139 в любой из 8Е0 ГО N08: 136-265), или легкую цепь, имеющую последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с аминокислотами 1-139, приведенными в любой из 8Е0 ГО N08: 134; и тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот 195-448 из любой из 8Е0 ГО N08: 137-157, 164, 169, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213-243 и 246-265, или полипептид, содержащий тяжелую цепь, имеющую последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с аминокислотами 195-448, приведенными в любой из 8Е0 ГО N08: 137157, 164, 169, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213-243 и 246-265.

В табл. 14 суммированы примеры модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе.

Таблица 14

Пептид	Препропептид РХ 5ЕЦ ГО N0.	Белок слияния Тромбин-РХ 8Εζ)ΙΟΝΟ.	Зрелый РХ 8Εζ) ГО N0.	Зимоген РХ ЕС: аа 1-139; НС: аа 143-448 в ЗЕф ГО ΝΟ.	Активированный РХ (РХа) ЬС: аа 1-139; НС: аа 195-448 в ЗЕф ГО N0.
VI961	4	417	136	136	136
VI968	5	418	137	137	137
Τ85Ν/Κ87δ/νΐ96δ	6	419	138	138	138
956Ν/()58δ/νΐ96δ	7	420	139	139	139
Κ62Ν/Ο64δ/Υ196δ	8	421	140	140	140

- 65 028865

Ε65Ν/Ε67δ/νΐ96δ	9	422	141	141	141
Ε67Ν/νΐ96δ	10	423	142	142	142
Ε73Ν/Ο75δ/νΐ96δ	11	424	143	143	143
Ο75Ν/Ε77δ/νΐ96δ	12	425	144	144	144
Κ86Ν/Έ88δ/νΐ96δ	13	426	145	145	145
Ο114Ν/νΐ96δ	14	427	146	146	146
ϋ95Ν/Ο97δ/νΐ96δ	15	428	147	147	147
Ε828/νΐ96δ	16	429	148	148	148
Ε82Ν/Ρ848/νΐ968	17	430	149	149	149
Ο78Ν/Ν80δ/νΐ96δ	18	431	150	150	150
Ε77Ν/Κ79δ/νΐ968	19	432	151	151	151
ϋ119Ν/Ο121δ/νΐ96δ	20	433	152	152	152
Ι.83Ν/νΐ96δ	21	434	153	153	153
Κ122δ/νΐ96δ	22	435	154	154	154
Ε51Ν/νΐ96δ	23	436	155	155	155
(358Ν/Κ60δ/νΐ96δ	24	437	156	156	156
Ο114Ν/ϋ119Ν/Ο121δ /νΐ96δ	25	438	157	157	157
Ο198Α	26	439	158	158	158
О198У	27	440	159	159	159
С198К	28	441	160	160	160
Ο198Κ	29	442	161	161	161
Ο198Ρ	30	443	162	162	162
Ο198Η	31	444	163	163	163
Ε2115/С219Н	32	445	164	164	164
Ο197Ρ	33	446	165	165	165
Ώ378Ν	34	447	166	166	166
ϋ378δ	35	448	167	167	167
νΐ96ί	36	449	168	168	168
У196Т	37	450	169	169	169
У196Р	38	451	170	170	170
О197У	39	452	171	171	171
Ο197Τ	40	453	172	172	172
0197δ	41	454	173	173	173
Ε200Α	42	455	174	174	174
Ε200δ	43	456	175	175	175
Е200У	44	457	176	176	176
Κ202δ	45	458	177	177	177
Κ.326Α	46	459	178	178	178
Κ.3268	47	460	179	179	179
Κ326Τ	48	461	180	180	180
К326У	49	462	181	181	181
Κ326Ο	50	463	182	182	182
	С 1	/1/С/1	1 ΟΟ	1 ΟΟ	1 00
1ХЭ ί. VI Ν	υ 1		1 03	1 Ο-ί	1 ОЭ
Κ.326Μ	52	465	184	184	184
Κ.326Κ	53	466	185	185	185
Κ326Υ	54	467	186	186	186
Τ327Α	55	468	187	187	187
Т327Ь	56	469	188	188	188
δ334Α	57	470	189	189	189
δ334Τ	58	471	190	190	190
8334Ν	59	472	191	191	191

- 66 028865

К.336Е	60	473	192	192	192
К338А	61	474	193	193	193
Κ338δ	62	475	194	194	194
Κ338Ν	63	476	195	195	195
К338К	64	477	196	196	196
К338У	65	478	197	197	197
Κ338Υ	66	479	198	198	198
К338М	67	480	199	199	199
Т327А/К338А	68	481	200	200	200
Т3271Ж338М	69	482	201	201	201
Е200У/Т327Ь/К338М	70	483	202	202	202
Ε200ν/Τ327Ι7δ334Α/ К338М	71	484	203	203	203
V196δ/0197А	72	485	204	204	204
У1968/Ь2118/0219Н	73	486	205	205	205
ΟΙ 19Ν/01218/У1968/ Ь2118/О219Н	74	487	206	206	206

υΐ 1414/ ν ινοο/ι^ζι 1О/ С219Н	/ Э	ЧОО	ζυ /	ζυ /	ζυ /
0114Ν/Ό119Ν/Ο121δ /У1965/Ь2118/Ο219Η	76	489	208	208	208
0197 А/Ь2118/0219Η	77	490	209	209	209
V1968/0197А/Ь2118/ О219Н	78	491	210	210	210
1195Ь/У1968	79	492	211	211	211
1195170197 А	80	493	212	212	212
1195Ь/Ь2118/О219Н	81	494	213	213	213
νΐ96δ/Ν214Ό	82	495	214	214	214
νΐ96δ/Ν214Α	83	496	215	215	215
νΐ96δ/Ν214δ	84	497	216	216	216
У1968/Е216К.	85	498	217	217	217
У1968/Е216К	86	499	218	218	218
У1968/Е216А	87	500	219	219	219
νΐ96δ/Ε216δ	88	501	220	220	220
У1968/Е218К	89	502	221	221	221
У1968/Е218К	90	503	222	222	222
У1968/Е218А	91	504	223	223	223
У1968/К332А	92	505	224	224	224
νΐ96δ/Κ332Ό	93	506	225	225	225
У1968/К.332Е	94	507	226	226	226
νΐ96δ/Κ332δ	95	508	227	227	227
У1968/К332О	96	509	228	228	228
У1968/К326Е	97	510	229	229	229
νιοής/τπ?6Γ>	98	511	230	230	230

У1968/К326М	99	512	231	231	231
νΐ96δ/Κ326Ν	100	513	232	232	232
У1968/К326О	101	514	233	233	233
У1968/К273Е	102	515	234	234	234
У1968/К273А	103	516	235	235	235
νΐ96δ/Κ424Α	104	517	236	236	236
У1968/К424Е	105	518	237	237	237
У1968/К420А	106	519	238	238	238

- 67 028865

У1968/К420Е	107	520	239	239	239
У1968/К306Е	108	521	240	240	240
У1963/К276А	109	522	241	241	241
У1968/К276Е	110	523	242	242	242
У1963/К420Е/К424Е	111	524	243	243	243
У1963/К273Е/К420Е/ Κ424Ε	112	525	244	244	244
У1968/К273Е/К306Е/ Κ420Ε/Κ424Ε	113	526	245	245	245
У1963/К338А	114	527	246	246	246
У1963/К3383	115	528	247	247	247
νΐ96δ/Ε215Ν/Ν217δ	116	529	248	248	248
νΐ96δ/Ε264Ν/Ε266δ	117	530	249	249	249
Ό119Ν/Ο121δ/νΐ968/ Ε264Ν/Ε2663	118	531	250	250	250
ΟΙ 14Ν/νΐ96δ/Ε264Ν/ Ε2663	119	532	251	251	251
У1968/К42914/Ь4318	120	533	252	252	252
νΐ968/Κ243Ν/Κ2458	121	534	253	253	253
\/ι олстотхт/тзоосе	1 οο				ОСИ

νΐ96δ/Ό389Ν/Υ391δ	123	536	255	255	255
νΐ968/Κ388Ν	124	537	256	256	256
Ό119Ν/Ο121δ/νΐ96δ/ Κ388Ν	125	538	257	257	257
νΐ96δ/Τ428Ν/Ο430δ	126	539	258	258	258
V1963/17118/0219Н/ Ε264Ν/Ε2663	127	540	259	259	259
Ώ119Ν/Ο121δ/νΐ968/ Ь2118/0219Η/Ε264Ν/ Ε2668	128	541	260	260	260
ΟΙ 14Ν/νΐ968/Ρ2118/ Ο219Η/Ε264Ν/Ε2663	129	542	261	261	261
νΐ96δ/Ε264Ν/Ε266δ/ Κ388Ν	130	543	262	262	262
Ώ119Ν/Ο121δ/νΐ96δ/ 17113/0219Η/Κ388Ν	131	544	263	263	263
ΟΙ 14Ν/νΐ96δ/Ρ2118/ Ο219Η/Κ388Ν	132	545	264	264	264
VI963/17118/0219Н/ Ε264Ν/Ε2663/Κ388Ν	133	546	265	265	265

5. Дополнительные модификации

В любые предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ могут быть введены дополнительные модификации. Дополнительная модификация (модификации) может представлять собой аминокислотную вставку, делецию, замену, химические модификации и/или посттрансляционные модификации. Например, дополнительная аминокислотная замена (аминокислотные замены) может быть введена в модифицированный полипептид РХ, чтобы обеспечить сайт для присоединения химического фрагмента (например, полимерного фрагмента), чтобы ввести один или несколько дополнительных не нативных сайтов гликозилирования и/или чтобы улучшить активность или другие свойства полипептида. Примеры свойств или активностей, которые могут быть изменены, включают, но не ограничиваются ими, растворимость, стабильность, каталитическую активность (например, протромбиназную активность), связывание с кофакторами (например, РУа), субстратную специфичность, субстратную селективность и/или связывание с ингибиторами (например, АТШ).

Такие модификации (модификация) хорошо известны специалисту в данной области техники (см., например, патенты США №№ 5990079; 6017882; 6573071; 6562598; 6660492; 6670147; 6958322, 7078508; 7220569; 7645602; 8048990; опубликованные заявки США №№ ϋ8 20030207402; ϋ8 20060148038; ϋ8 20090053185; ϋ8 20090175828; ϋ8 20090175931; ϋ8 20100125052; ϋ8 20100255000; ϋ8 20100285568; 20110015128; 20110293597; международные опубликованные заявки РСТ №№ У0 1998039456 и У0 2005023308; и ирпсЬагй аий Реггу, Β1οοй Кеу 16: 97-110 (2002); Уеика!е8^аг1и е! а1., Β^οрЬу8 I 82(3):11901206 (2002); Ушие^ е! а1., ТЬготЬ. Ке8. 107:51-54 (2002); Утие^ е! а1. ТЬготЬ. Ке8. 104:257-264 (2001); Ухаие^ е! а1., Β1οοй ^адиЕ ΓΛπηο^8ί8 14:401-405 (2003); \Уа11тагк е! а1., Β1οοй 78(8ирр1е1): 60 (1991); ХУаПтагк е! а1., ТЬготЬ Наетο8ΐ. 65:1263 (1991); Уаид е! а1., НаетοрЬ^1^а. 11(1):31-37 (2005); Уаид е! а1., НаетаФЬдюа. 90(12):1659-1664 (2005); Уа1/ке е! а1., I. Βιο1 СЬет. 265:11982-11989 (1990); Уа1/ке е! а1.,

I. СЬи 1иуе81. 88(5):1685-1689 (1991); Уа1/ке е! а1., ТЬготЬ Наетο8! 69:1452 (1993); УЬтиа е! а1., I. ТЬготЬ Наетο8! 2(7):1127-1134; Уаид е! а1., Β^οсЬет^8!^у 47(22):5976-5985 (2008); и /ата е! а1., Βγ. 1. Наетаю! 106:809-811 (1999), Например, модифицированный полипептид РХ может быть модифицрован, чтобы сделать возможной конъюгацию полипептида с полимером. Примеры полимеров включают, на- 68 028865

пример, сополимеры полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон или полипролин (ЛЬис1ю\\ък1 ек а1. (1981); №\\лпагк ек а1. (1982); и Какге ек а1. (1987)). Предусмотренный в настоящем документе модифицированный полипептид РХ может быть модифицирован одним или несколькими фрагментами полиэтиленгликоля (пегилирован). Активированные производные РЕС могут быть использованы для непосредственного взаимодействия с полипептидами РХ, и они включают активные сложные эфиры карбоновой кислоты или карбонатные производные, в частности те, в которых уходящие группы представляют собой N-гидроксисукцинимид, п-нитрофенол, имидазол или 1-гидрокси-2-нитробензол-4-сульфонат. Производные РЕС, содержащие малеимидогруппу или галоацетильную группу, могут быть использованы для модификации сульфгидрильных групп, и РЕС реагенты, содержащие группы гидразина или гидразида, могут быть использованы для модификации альдегидов, образуемых путем периодатного окисления углеводных групп.

Также предусмотрены последовательности модифицированных полипептидов РХ, которые имеют фосфорилированные аминокислотные остатки, такие как фосфотирозин, фосфосерин или фосфотреонин. Дополнительные модификации полипептидов, предусмотренные в настоящем документе, включают химическую дериватизацию полипептидов, включая, но не ограничиваясь этим, ацетилирование и карбоксилирование. Например, были получены ацилированные неактивные варианты РХ, которые медленно деацилируются после инъекции в плазме крови, таким образом, в течение долгого времени производя активированный фактор Х (Χνο1Γ ек а1. (1995) Β1οοά. 86, рр. 4153-4157).

Другие подходящие дополнительные модификации модифицированного полипептида РХ, предусмотренные в настоящем документе, представляют собой модификации полипептидов с использованием стандартных химических способов и/или способов с использованием рекомбинантных нуклеиновых кислот, предназначенные для увеличения их устойчивости к протеолитической деградации, для оптимизации свойств растворимости и/или для того, чтобы сделать их более подходящими терапевтическими агентами. Например, остов пептида может быть циклизован для увеличения стабильности (см., например, РйеЛег ек а1. (2000) 1. Βίο1. СНет. 275:23783-23789). Могут быть использованы аналоги, которые включают остатки, отличные от встречающихся в природе Ь-аминокислот, такие как Ό-аминокислоты или не встречающиеся в природе синтетические аминокислоты.

Дополнительные модификации включают модификации, которые изменяют, увеличивают или улучшают процессинг полипептида в клетке и/или посттрансляционные модификации полипептида. Например, дополнительные модификации включают модификации в области сайта расщепления полипептида (например, ТНг39), предназначенные для увеличения эффективности процессинга пропептида в клеточной культуре (Ριιύο1ρ1ι ек а1. (1997) Ргок. Ε.χρίΌδδ апй Рш±, 10: 373-378). В других примерах, как описано в других разделах в настоящем документе, более высокая степень γ-карбоксилирования может быть достигнута путем замены препропептида фактора Х на препропептид из тромбина (см., например, Сапиге ек а1. (2000) ВюсНепщкгу. 39 рр. 14322-14329).

Другие примеры дополнительных модификаций включают аминокислотную замену (аминокислотные замены) для изменения одного или нескольких свойств или активностей полипептидов. Например, модификации включают модификации, которые изменяют зависимость от витамина К, необходимого для их синтеза, например, путем модификации остатков в домене С1а, включая, но не ограничиваясь этим, аминокислотную замену в положениях 10, 11, 12, 28, 29, 32, 33, 34 или 35, соответствующих остаткам, приведенным в δΕΟ ΙΌ N0: 134 (см., например, патенты США №№ 6017882 и 8048990). Модификации также могут быть сделаны для увеличения способности РХ быть активированным, например, путем аминокислотной замены (аминокислотных замен) остатков в активационном пептиде на гетерологичные остатки другой сериновой протеазы или другого пептида или белка (см., например, патенты США №№ 6958322 и 6573071; международные опубликованные заявки РСТ №№ \У0 98/38317, \У0 03/035861, \У0 2004/005347; опубликованную заявку США № 2006/0148038; НшппеЕрасН ек а1. ТНготЪ. Ρ^δ., 97, 51-67 (2000); ΧΧ'οΠ' ек а1. (1991) ,1ВС. 266, ηο. 21. рр. 13726-13730; Уο1ке1 ек а1. (2005), Μο1. В^есНтоЕ, 29 (1):1930). Дополнительные модификации включают модификации для удаления активационного пептида, так что полипептид РХ автоактивируется независимым от кофактора способом (Ки^рН ек а1., (2002) ТНготЪ Наетοδк., 88:756-62). Дополнительные модификации включают модификации, которые изменяют или модифицируют сайт активационного расщепления, так что другие протеазы, которые в природе не активируют РХ, могут расщеплять и активировать РХ (см., например, XV0 98/38317; XV0 98/38318; XV0 01/10896).

Могут быть получены химерные белки модифицированных РХ, предусмотренных в настоящем документе. Например, часть легкой цепи (например, домен С1а и/или домен (домены) ΕСР) может быть заменена на соответствующую часть из другой протеазы системы свертывания крови, такой как Р1Х, чтобы получить химеры, которые продуктивно взаимодействуют с комплексами факторов свертывания крови в каскаде, такими как комплексы ТФ/РУ11а (ТЫес ек а1. (2003) 1ВС, 12: 10393-10399).

Ε. Получение полипептидов £х.

Полипептиды РХ, в том числе модифицированные полипептиды РХ, могут быть получены хорошо известными в уровне техники способами очистки белков и экспрессии рекомбинантных белков. Могут быть использованы любые известные специалистам в данной области способы выявления нуклеиновых

- 69 028865

кислот, которые кодируют желаемые гены. Для получения полноразмерного (т.е. охватывающего всю кодирующую область) клона кДНК или геномной ДНК, кодирующего полипептид РХ, например, из клеток или ткани, например ткани печени, может быть использован любой способ, доступный в уровне техники. кДНК также может быть получена из коммерческих источников (например, от 06^1+2, КюскуШе, МО) или получена синтетическими способами. Модифицированные полипептиды РХ могут быть сконструированы, как описано в настоящем документе, например, с помощью сайт-направленного мутагенеза.

РХ можно клонировать или выделить с помощью любых доступных известных в уровне техники способов клонирования и выделения молекул нуклеиновых кислот. Такие способы включают ПЦРамплификацию нуклеиновых кислот и скрининг библиотек, в том числе скрининг гибридизацией нуклеиновых кислот, скрининг антителами и скрининг по активности.

Для выделения молекул нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид РХ, могут быть использованы различные способы амплификации нуклеиновых кислот, включая, например, полимеразную цепную реакцию (ПЦР). В качестве исходного материала, из которого могут быть выделены кодирующие РХ молекулы нуклеиновой кислоты, может быть использован содержащий нуклеиновые кислоты материал. Например, в способах амплификации могут быть использованы препараты ДНК и РНК, клеточные экстракты, экстракты ткани (например, печени), образцы жидкости (например, образцы крови, сыворотки, слюны), образцы, взятые у здоровых и/или больных субъектов. Библиотеки нуклеиновых кислот также могут быть использованы как источник исходного материала. Для амплификации кодирующих РХ молекул могут быть разработаны праймеры. Например, праймеры могут быть сконструированы на основе экспрессируемых последовательностей, из которых образуется РХ. Праймеры могут быть сконструированы с помощью обратной трансляции аминокислотной последовательности РХ. Молекулы нуклеиновых кислот, полученные в результате амплификации, могут быть секвенированы, чтобы подтвердить, что указанные молекулы кодируют полипептид РХ.

С кодирующей РХ молекулой нуклеиновой кислоты могут быть соединены дополнительные нуклеотидные последовательности, в том числе линкерные последовательности, содержащие сайты рестрикции для клонирования синтетического гена в вектор, например вектор экспрессии или вектор, предназначенный для амплификации коровой кодирующей белок последовательности ДНК. Кроме того, с кодирующей РХ молекулой нуклеиновой кислоты могут быть функционально связаны дополнительные нуклеотидные последовательности, представляющие собой функциональные элементы ДНК. Примеры таких последовательностей включают, но не ограничиваются промоторными последовательностями, предназначенными для обеспечения внутриклеточной экспрессии белка, и сигнальными последовательностями, предназначенными для обеспечения секреции белка. С кодирующей РХ молекулой нуклеиновой кислоты также могут быть связаны дополнительные нуклеотидные последовательности, такие как последовательности, представляющие собой области, с которыми связываются белки. Такие области включают, но не ограничиваются последовательностями, содействующими поглощению РХ конкретными клетками-мишенями или другим способом улучшающими фармакокинетику синтетического гена.

Идентифицированные и выделенные нуклеиновые кислоты могут быть вставлены в соответствующий вектор клонирования. Может быть использовано большое количество известных в уровне техники систем вектор-хозяин. Возможные векторы включают, но не ограничиваются плазмидами или модифицированными вирусами, но векторная система должна быть совместима с используемой клеткойхозяином. Такие векторы включают, но не ограничиваются бактериофагами, такими как производные бактериофага лямбда, или плазмидами, такими как производные плазмид рВК322, рИС или вектора В1ие8спр1: ^бааде^, Ьа ίοΐΐη, Калифорния). Вставки в вектор клонирования могут быть введены, например, путем лигирования фрагмента ДНК в вектор клонирования, который имеет комплементарные липкие концы. Вставка может быть введена с использованием векторов клонирования ТОРО Ρηνί^'ο^η, СаткЪаб, Калифорния). Если для фрагментации ДНК были использованы комплементарные сайты рестрикции, которых нет в векторе клонирования, концы молекулы ДНК могут быть ферментативно модифицированы. Кроме того, любой желаемый сайт может быть получен путем лигирования нуклеотидных последовательностей (линкеров) на концах ДНК, лигированые линкеры могут содержать специфичные химически синтезированные олигонуклеотиды, кодирующие последовательности, распознаваемые эндонуклеазами рестрикции. В альтернативном способе, расщепленный вектор и ген белка РХ могут быть модифицированы присоединением гомополимерного концевого фрагмента. Рекомбинантные молекулы могут быть введены в клетку-хозяин, например, с помощью трансформации, трансфекции, инфекции, электропорации и сонопорации, в результате чего образуется множество копий последовательности гена.

Для получения мутаций любой одной или более аминокислот в целевом белке может быть применен любой способ, известный в уровне техники. Такие способы включают стандартный сайтнаправленный мутагенез или случайный мутагенез кодирующих молекул нуклеиновых кислот или твердофазный синтез полипептидов. Например, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептид РХ, могут быть подвергнуты мутагенезу, такому как случайный мутагенез кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты, ПЦР с ошибками, сайт-направленный мутагенез (с использованием, например, набора, такого как набор ОшкОитде от δύΟΗ^^), ПЦР с перекрыванием фрагментов, перетасовке фрагментов генов или другим рекомбинантным методикам. Кодирующие полипептиды молекулы нуклеиновой

- 70 028865

кислоты затем могут быть введены в клетки-хозяева для гетерологичной экспрессии. В некоторых вариантах модифицированные полипептиды РХ получают синтетически, например, с помощью твердофазного синтеза полипептидов или синтеза полипептидов в растворе.

В конкретных вариантах трансформация клетки-хозяин рекомбинантными молекулами ДНК, которые включают выделенный ген белка РХ, кДНК РХ или синтезированную последовательность ДНК РХ, позволяет получить множество копий гена. Таким образом, ген может быть получен в больших количествах с помощью выращивания трансформантов, выделения рекомбинантных молекул ДНК из трансформантов и, при необходимости, получения вставленного гена из выделенной рекомбинантной ДНК.

1. Векторы и клетки.

Для рекомбинантной экспрессии одного или нескольких белков РХ нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую белок РХ или ее часть, могут быть вставлены в соответствующий вектор экспрессии, т.е. вектор, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции вставленной кодирующей белок последовательности. Примером такого вектора может быть любой вектор экспрессии млекопитающих, такой как, например, рСМУ. Необходимые сигналы транскрипции и трансляции также могут содержаться в нативном промоторе гена РХ и/или его фланкирующих районах.

Кроме того, в настоящем документе предусмотрены векторы, которые содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие РХ или модифицированный РХ. Также предусмотрены клетки, содержащие вектор. Клетки включают эукариотические и прокариотические клетки, а векторы представляют собой любые векторы, подходящие для использования в таких клетках.

Предусмотрены прокариотические и эукариотические клетки, в том числе эндотелиальные клетки, содержащие векторы. Такие клетки включают бактериальные клетки, клетки дрожжей, клетки грибов, археи, растительные клетки, клетки насекомых и клетки животных. Для получения полипептида РХ или модифицированных полипептидов РХ клетки выращивают в соответствующих условиях, при которых закодированные белки РХ экспрессируются в клетках, после чего извлекают экспрессированный белок РХ. Для целей настоящего изобретения РХ может быть секретирован в среду.

В одном варианте предусмотрен вектор, содержащий последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид, обладающий активностью РХ и включающий полипептид РХ или его часть, или несколько копий указанной последовательности. Могут быть выбраны векторы для экспрессии полипептида РХ или модифицированных полипептидов РХ в клетке или для секреции экспрессированного белка РХ. В случае секреции РХ нуклеиновая кислота может быть связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей сигнал секреции, такой как сигнальная последовательности α-фактора спаривания 8ассЬаготусек сегеуыае или ее часть, или нативная сигнальная последовательность.

Для экспрессии кодирующей последовательности белка могут быть использованы различные системы хозяин-вектор. Они включают, но не ограничиваются системами клеток млекопитающих, инфицированных вирусом (например, вирусом осповакцины, аденовирусом и другими вирусами); системами клеток насекомых, инфицированных вирусом (например, бакуловирусом); микроорганизмами, такими как дрожжи, содержащие дрожжевые векторы, или бактерии, трансформированные бактериофагом, ДНК, плазмидной ДНК или космидной ДНК. Экспрессионные элементы векторов варьируют по силе и специфичности. В зависимости от используемой системы хозяин-вектор может быть использован любой подходящий транскрипционный и трансляционный элемент.

Для конструирования векторов экспрессии, содержащих химерный ген, включающий соответствующие сигналы контроля транскрипции/трансляции и кодирующие белок последовательности, могут быть использованы любые способы вставки фрагментов ДНК в вектор, известные специалистам в данной области. Эти способы могут включать рекомбинацию и синтез ДНК ш νίΐΓο или рекомбинацию ш νίνο (генетическую рекомбинацию). Экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид РХ, модифицированный полипептид РХ или его домены, производные, фрагменты или гомологи, можно регулировать с использованием второй последовательности нуклеиновой кислоты, так что гены или их фрагменты экспрессируются в трансформированном молекулой (молекулами) рекомбинантной ДНК хозяине. Например, экспрессией белков можно управлять с помощью любого промотора/энхансера, известного в уровне техники. В одном варианте промотор не является нативным для генов белка РХ. Промоторы, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются ранним промотором 8У40 (Вешак! и СЬатЬοη, Ка1иге 290: 304-310 (1981)), промотором, содержащимся в 3'длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (Υататοΐο и др., Се11 22:781-791 (1980)), промотором тимидинкиназы герпеса (Аадпег и др., Ргос. КаИ. Асай. 8с1 И8А 75:1441-1445 (1981)), регуляторными последовательностями гена металлотионеина (Вг1пк1ег и др., №йиге 296:39-42 (1982)); промоторами прокариотических векторов экспрессии, включающими промотор β-лактамазы (1ау и др., (1981). Ргос. N01. Асай. 8с1 И8А 75: 5543) или ТАС промотор (^еΒοе^ и др., Ргос. №11. Асай. 8с1 И8А 80:21-25 (1983)), см. также "ике£и1 Рго!ешк Ггот КесοтЬ^ηаηΐ Вас1епа" в журнале 8с1епййс Атепсап 242:79-94 (1980); векторы экспрессии растений включают промотор нопалин-синтетазы (Неггаг-Ек!ге11а и др., Чакие 305:209-213 (1984)), промотор 358 РНК вируса мозаики цветной капусты (Оагйег и др., ШсШс АсШк Кек. 9:2871

- 71 028865

(1981)) и промотор фермента фотосинтеза рибулозобисфосфаткарбоксилазы (Неггега-Ек!ге11а и др., №йиге 310: 115-120 (1984)); промоторные элементы дрожжей и других грибов включают промотор Са14, промотор алкогольдегидрогеназы, промотор фосфоглицераткиназы, промотор щелочной фосфатазы, в трансгенных животных были использованы следующие участки контроля транскрипции животных, которые проявляют тканевую специфичность: регуляторный участок гена эластазы I, который активен в ацинарных клетках поджелудочной железы (δ^ίί! е! а1., Се11 38:639-646 (1984); 0гпП/ е! а1., СЫй δр^^ид На^г δутр. Риап!. Βίο1. 50:399-409 (1986); Мас^οηа1й, НераЮ^ду 7:425-515 (1987)); регуляторный участок гена инсулина, который активен в β-клетках поджелудочной железы (НапаЬап е! а1., №йиге 315:115-122 (1985)), регуляторный участок гена иммуноглобулина, который активен в лимфоидных клетках (СгокксЬей1 е! а1., Се11 38:647-658 (1984); Айатк е! а1., №!иге 318:533-538 (1985); А1ехапйег е! а1., Мο1. Се11 Βίο1. 7:1436-1444 (1987)), регуляторный участок вируса опухоли молочной железы мыши, который активен в яичке, молочной железе, лимфоидных и тучных клетках (Ъейег е! а1., Се11 45:485-495 (1986)), регуляторный участок гена альбумина, который активен в печени (ЬткеП е! а1., Сепек апй Эеуе1. 1:268-276 (1987)), регуляторный участок гена а-фетопротеина, который активен в печени (КгитЕшГ е! а1., Мο1. Се11. Βίο1. 5:1639-1648 (1985); Наттег е! а1., δ^ι^ 235:53-58 1987)), регуляторный участок гена а-1 антитрипсина, который активен в печени (Ке1кеу е! а1., Сепек апй Эеуе1. 1:161-171 (1987)), регуляторный участок гена β-глобина, который активен в миелоидных клетках (Мадгат е! а1., №йиге 315:338-340 (1985); КтоШак е! а1., Се11 46:89-94 (1986)), регуляторный участок гена основного белка миелина, который активен в олигодендроцитах мозга (КеайЬеай е! а1., Се11 48:703-712 (1987)), регуляторный участок гена лёгких цепей миозина 2, который активен в скелетных мышцах (δίκ-ιτιί, №йиге 314:283-286 (1985)) и регуляторный участок гена рилизинг-фактора гонадотропного гормона, который активен в гонадотропных клетках гипоталамуса (Матоп е! а1., δ^ΐ'^ 234:1372-1378(1986)).

В конкретном варианте используют вектор, который содержит промотор, функционально связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид РХ или модифицированный полипептид РХ, или его домен, фрагмент, производное или гомолог, вектор также содержит одну или несколько точек начала репликации и, по желанию, один или более селективных маркеров (например, ген устойчивости к антибиотику). Векторы и системы экспрессии полипептидов РХ включают известные векторы ΡΠιίη (доступные, например, от Iиν^!^οдеи, δаи ^^едο, Калифорния), в частности, векторы, предназначенные для секреции закодированных белков. Примеры плазмидных векторов для экспрессии в клетках млекопитающих включают, например, рСМУ, рРЦЬЕ (Iиν^νοСеи) и множество других векторов, которые хорошо известны специалистам в данной области. Примеры плазмидных векторов для трансформации клеток Е.тоЬ включают, например, векторы экспрессия рРЕ (доступные от Р1адеп, Уа1епс1а, Калифорния, см. также литературу, опубликованную Р1адеп для описания системы). Вектор рРЕ включает промотор фага Т5 (распознается РНК полимеразой Е. ток), двойной участок репрессии в Ьас-операторе для жестко регулируемой высокой экспрессии рекомбинантных белков в Е. тоИ, синтетический сайт связывания рибосом (ΡΒδ II) для эффективной трансляции, последовательность, кодирующую 6хШк метку, терминаторы транскрипции !₀ и Т1, точку начала репликации <3οΓΕ1 и ген бета-лактамазы для устойчивости к ампициллину. Вектор рРЕ позволяет присоединять 6хШк метку на Шконце или С-конце рекомбинантного белка. Такие плазмиды включают рРЕ 32, рРЕ 30 и рРЕ 31, которые включают сайты множественного клонирования для всех трех рамок считывания и обеспечивают экспрессию белков с Шконцевой 6хШк меткой. Другие примеры плазмидных векторов для трансформации клеток Е. тоП включают, например, векторы экспрессии рЕТ (см., патент США 4952496; вектор доступен от ^уадеп, МаФтоп, Висконсин, см., также опубликованную Шуадеп литературу с описанием системы). Такие плазмиды включают рЕТ11а, которая содержит промотор Т71ас, терминатор Т7, индуцируемый 1ас-оператор Е. тоИ, и ген 1асрепрессора; рЕТ12а-с содержит промотор Т7, терминатор Т7 и сигнал секреции οтрΤ из Е.тоЬ; рЕТ15Ь и рЕТ19Ь (^уадеп, МаФтоп, Висконсин) содержат лидерную последовательность Шк-Тад™ для очистки на Шк колонке и сайт расщепления тромбином, который позволяет осуществить расщепление после очистки на колонке, Т7-1ас промоторный район и терминатор Т7.

2. Системы экспрессии.

Полипептиды РХ (модифицированные и не модифицированные) могут быть получены любыми известными в уровне техники способами получения белка, включая способы ш уПго и ш νίνο, такие как, например, введение молекул нуклеиновых кислот, кодирующих РХ, в клетку-хозяина, животное-хозяина, и экспрессию молекул нуклеиновых кислот, кодирующих РХ, ш νί!Γο. РХ и модифицированные полипептиды РХ могут быть экспресссированы в любом организме, подходящем для получения необходимого количества полипептида РХ и необходимой формы РХ, требуемых для введения и лечения. Хозяева в системах экспрессии включают прокариотические и эукариотические организмы, такие как Е. ток, дрожжи, растения, клетки насекомых, клетки млекопитающих, включая клеточные линии человека, и трансгенные животные. Хозяева систем экспрессии могут отличаться уровнями экспрессии белка, а также типом пост-трансляционных модификаций, которые присутствуют на экспрессированных белках. Выбор хозяина системы экспрессии может быть сделан на основе перечисленных и других факторов, таких как нормативные ограничения и соображения безопасности, издержки производства и необходи- 72 028865

мость очистки, и способы очистки.

Экспрессия в эукариотических хозяевах может включать экспрессию в дрожжах, таких как 8ассЬаготусе8 сеге\381ае и РюЫа ра8!опа, клетках насекомых, таких как клетки дрозофилы и клетки чешуекрылых, экспрессию в растениях и растительных клетках, таких как табак, кукуруза, рис, водоросли и ряска. Эукариотические клетки для экспрессии также включают линии клеток млекопитающих, такие как клетки яичников китайского хомячка (СН0) или клетки почки детеныша хомяка (ВНК). Эукариотические хозяева экспрессии также включают трансгенных животных, например, включая получение трансгена в сыворотке крови, молоке и яйцах.

Для экспрессии РХ специалистам в данной области доступно и известно множество векторов экспрессии. Выбор вектора экспрессии зависит от выбора хозяина системы экспрессии. Такой выбор находится в сфере компетенции специалиста. В общем, вектор экспрессии может включать транскрипционный промотор и, необязательно, энхансер, сигналы трансляции и сигналы терминации транскрипции и трансляции. Векторы экспрессии, которые используются для стабильной трансформации, обычно обладают селективным маркером, который позволяет отобрать и поддерживать трансформированные клетки. В некоторых случаях для амплификации копий вектора в клетках может быть использована точка начала репликации.

Полипептиды РХ или модифицированные полипептиды РХ также могут быть использованы или экспрессированы в виде белков слияния. Например, белок слияния может быть получен для добавления полипептиду дополнительной функции. Примеры белков слияния включают белки слияния с сигнальной последовательностью, такой как метка для локализации, например, Ηΐ86 метка или тус метка, или такой как метка для очистки, например, слитая последовательность О8Т, примеры также включают белки, слитые с последовательностью для направления секреции белков и/или ассоциации с мембраной, но не ограничиваются указанными примерами.

В одном варианте протеазы экспрессируют в неактивной, зимогенной форме. В другом варианте полипептид РХ или модифицированные полипептиды РХ могут быть получены в активной форме, где активация достигается за счет реакции с активатором РХ из яда гадюки Рассела (Наета!о1одю ТесЬпо1од1е8) после экспрессии, секреции и очистки зимогенной формы РХ полипептида. В таком примере активатор может быть удален из полученного очищенного препарата с помощью диализа или с использованием аффинной очистки на колонке, совместимой с активатором (например, биотин-стрептавидин).

В некоторых случаях неактивированную форму полипептида РХ отделяют от активированной формы РХа в препарате. Например, так как РХа отличается по конформации, он способен связывать гепарин. Таким образом, РХа может быть очищен из препаратов, содержащих также зимогенную форму полипептида, с помощью хроматографии с использованием колонки с гепарином. Данная методика проиллюстрирована в примере 2 в настоящем документе. Как правило, в примерах, приведенных в настоящем документе, полипептид РХа имеет чистоту по меньшей мере 70%, и, как правило, по меньшей мере 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более. Как правило, препараты РХа являются, по существу, свободными от других загрязняющих белков, включая зимогенные формы РХ.

а) Экспрессия в прокариотах.

Прокариоты, особенно Е. сой, представляют собой системы для получения большого количества РХ (см., например, Р1аЙ8 е! а1. (2003) Рго!еш Ехр. РиггГ. 31(2): 222-30; и КйайкабеЬ е! а1. (2004) 1. 1пб. МюгоЬю1. Вю!есйпо1. 31(2): 63-69). Трансформация Е. сой представляет собой простой и быстрый метод, хорошо известный специалистам в данной области. Векторы экспрессии Е. сой могут содержать индуцибельный промотор, полезный для индукции высоких уровней экспрессии белка и для экспрессии белков, которые проявляют токсичность для клеток-хозяев. Примеры индуцибельных промоторов включают 1аспромотор, промотор 1гр, гибридный промотор !ас, промоторы Т7 и 8Р6 РНК и термочувствительный промотор АР,,.

РХ может быть экспрессирован в цитоплазматической среде Е. сой. Цитоплазма представляет собой восстановительную среду, и для некоторых молекул это может привести к образованию нерастворимых телец включения. Для ресолюбилизации белков могут быть использованы восстанавливающие агенты, такие как дитиотреитол и β-меркаптоэтанол и денатурирующие агенты (например, гуанидин-НС1 и мочевина). Альтернативный подход состоит в экспрессии РХ в периплазматическом пространстве бактерий, которое предоставляет окислительную среду, шаперонинподобные белки и дисульфидизомеразы, что приводит к образованию растворимого белка. Как правило, с экспрессируемым белком сливают лидерную последовательность, которая направляет белок в периплазму. Затем лидерная последовательность удаляется сигнальной пептидазой внутри периплазмы. Примеры лидерных последовательностей, направляющих белки в периплазму, включают лидерную последовательность гена пектатлиазы ре1В и лидерную последовательность гена щелочной фосфатазы. В некоторых случаях периплазматическая экспрессия приводит к утечке экспрессированного белка в культуральную среду. Секреция белков позволяет быстро и просто очистить белки от культурального супернатанта. Не секретируемые белки могут быть получены из периплазмы с помощью осмотического лизиса. Как и при цитоплазматической экспрессии, в некоторых случаях белки могут стать нерастворимыми, и для облегчения растворения и рефолдинга

- 73 028865

белков могут быть использованы денатурирующие агенты и восстановители. Температуры индукции и культивирования также могут влиять на уровень экспрессии и растворимость белков. Как правило, используются температуры между 25 и 37°С. Для увеличения растворимости экспрессированного белка также могут быть использованы мутации. Как правило, бактерии производят не гликозилированные белки. Таким образом, если для функционирования белки требуют гликозилирования, то гликозилирование может быть осуществлено ίη νίίΐΌ после очистки из клетки-хозяина.

b) Клетки дрожжей.

Дрожжи, такие как 8ассЬаготусез сегеу!зае, 8сЫ/озассНаготусез ротЬе, Уагго\\аа Нро1уйса, К1иууеготусез 1асйз и РюЫа разЮпз, являются полезными хозяевами систем экспрессии для РХ (см., например, 8коко и др., (2003) Вю1ес1то1. Αрр1. ВюсЬет. 38 (Ρΐ3):257-65). Дрожжи можно трансформировать эписомными реплицирующимися векторами или путем стабильной интеграции в хромосомы методом гомологичной рекомбинации. Как правило, для регулирования экспрессии генов используют индуцируемые промоторы. Примеры таких промоторов включают ОЛЬ1, ОЛЬ7 и ОЛЬ5 и промоторы металлотионеина, такие как СИР1. Экспрессионные векторы часто включают маркер для селекции, такой как ЬЕШ, ΤΚΡ1, ΗΙ83 и υΚΑ3 для отбора и поддержания трансформированной ДНК. Белки, экспрессируемые в дрожжах, часто являются растворимыми, и совместная экспрессия с шаперонинами, такими как В1р, и протеин-дисульфидизомеразой, может улучшить уровни экспрессии и растворимость. Кроме того, белки, экспрессированные в дрожжах, могут быть направленно секретированы с помощью слияния с сигнальным секреторным пептидом, таким как секреторный сигнал дрожжевого фактора спаривания альфа 8ассЬаготусез сегеу!зае, и слияния с поверхностными белками клетки дрожжей, такими как рецептор адгезии спаривания Αда2р или глюкоамилаза Αγχι^-ι айепииуогапз. Чтобы затем удалить слитые последовательности от экспрессированных полипептидов, когда они выходят из секреторного пути, может быть добавлен сайт расщепления протеазой, например, протеазой Кех-2. Дрожжи также способны к гликозилированию по мотивам Αзη-X-8е^/ΤЬ^.

c) Клетки насекомых.

Клетки насекомых, в частности система бакуловирусной экспрессии, полезны для экспрессии полипептидов, таких как РХ или его модифицированные формы (см., например, Мипе1а и др., (2003) ί. УеБ Мей. 8с1. 65 (2):219-23). Клетки насекомых и личинки насекомых экспрессируют высокие уровни белка, в том числе экспрессируют в гемолимфе, и способны к большинству посттрансляционных модификаций, используемых высшими эукариотами. Бакуловирусы имеют ограниченный круг хозяев, что повышает безопасность и снижает нормативные требования к эукариотической экспрессии. Типичные векторы экспрессии используют промотор для экспрессии высокого уровня белка, такой как промотор полиэдрина бакуловируса. Обычно используемые бакуловирусные системы включают бакуловирусы, такие как вирус ядерного полиэдроза Αυ^ι^^ саПГописа (ΑсNΡУ) и вирус ядерного полиэдроза ВотЬух топ (ВтЫРУ), и клеточные линии насекомых, такие как 8Г9, полученная из 8ройор1ега Ггид1регйа, Рзеийа1еПа итрипс1а (Α78) и Эапаиз р1ех1рриз ГОрШ). Для высокого уровня экспрессии нуклеотидная последовательность экспрессируемой молекулы должна быть вставлена непосредственно после инициаторного кодона полиэдрина вируса. Сигналы секреции млекопитающих точно процессируются в клетках насекомых и могут быть использованы для секреции экспрессированного белка в культуральную среду. Кроме того, клеточные линии Рзеийа1ейа ишрипс!а (Α78) и Эапаиз р1ех1рриз (ОрЩ1) продуцируют белки с гликозилированием, аналогичным таковому в клеточных системах млекопитающих.

В качестве альтернативной системы экспрессии в клетках насекомых используются стабильно трансформированные клетки. Для экспрессии могут быть использованы клеточные линии, такие как 8сЬпе1Йег 2 (82), Кс (ЭгозорНПа те1аподаз1ег) и С7 ^ейез а1Ьорю1из). Промотор металлотионеина дрозофилы может быть использован, чтобы обеспечивать высокие уровни экспрессии при индукции тяжелыми металлами кадмием или медью. Векторы экспрессии обычно поддерживают с помощью маркеров для селекции, таких как неомицин и гигромицин.

й) Клетки млекопитающих.

Для экспрессии полипептидов РХ могут быть использованы системы экспрессии млекопитающих. Экспрессионные конструкции могут быть доставлены в клетки млекопитающих путём вирусной инфекции, такой как аденовирусная инфекция, или путем прямого переноса ДНК, например, с помощью липосом, фосфата кальция, ^ЕЛЕ-декстрана и физических способов, таких как электропорация и микроинъекция. Экспрессионные векторы для клеток млекопитающих, как правило, включают в себя сайт кэпирования мРНК, ТАТА-бокс, последовательность инициации трансляции (консенсусная последовательность Козака) и сигналы полиаденилирования. Такие векторы часто включают промоторы-энхансеры транскрипции для высокого уровня экспрессии, например промотор-энхансер 8У40, промотор цитомегаловируса человека (СМУ) и длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса (К8У). Эти промоторыэнхансеры активны во многих типах клеток. Тканеспецифичные и специфичные для определенных клеток промоторные и энхансерные участки также могут быть использованы для экспрессии. Примеры участков промотора/энхансера включают последовательности из генов, таких как гены эластазы Ι, инсулина, иммуноглобулина, вируса опухоли молочной железы мыши, альбумина, α-фетопротеина, а-1- 74 028865

антитрипсина, β-глобина, основного белка миелина, легкой цепи миозина 2 и гена рилизинг-фактора гонадотропного гормона, но не ограничиваются ими. Для отбора и поддержания клеток с экспрессионной конструкцией могут быть использованы маркеры для селекции. Примеры маркерных генов для селекции включают, но не ограничиваются ими, гены гигромицин-В-фосфотрансферазы, аденозиндезаминазы, ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы, аминогликозидфосфотрансферазы, дигидрофолатредуктазы (ОНРК) и тимидинкиназы. Слияние с сигнальными молекулами клеточной поверхности, такими как ТСК-ζ и РсеКЬу, может направить экспрессию белков в активном состоянии на поверхности клетки.

Для экспрессии в клетках млекопитающих подходят различные клеточные линии, в том числе клеточные линии мыши, крысы, человека, обезьяны, курицы и хомяка. Примеры клеточных линий включают, без ограничения, ВНК (т.е. клетки ВНК-21), 293-Р, СН0, Βа1Ь/3Τ3, НеЬа, МТ2, мышиные Ж0 (не секретирующие) и другие клеточные линии миеломы, гибридомные и гетерогибридомные клеточные линии, лимфоциты, фибробласты, клетки δΡ2/0, ΟΌδ, NIН3Τ3, НЕК293, 293δ, 293Т, 2В8 и НКБ. Также доступны адаптированные к бессывороточной среде клеточные линии, что облегчает очистку секретируемых белков из культуральной среды. Одним из таких примеров является бессывороточная линия клеток ΕΒNΑ-I (Рбаш и др., (2003) Β^οΐесбηο1 Β^^. 84:332-42).

е) Растения.

Трансгенные растительные клетки и растения могут быть использованы для экспрессии РХ. Экспрессионные конструкции, как правило, вводят в растения с применением прямого переноса ДНК, например, бомбардировкой микрочастицами и РЕО-опосредованной передачей в протопласты, и агробактериальной трансформацией. Экспрессионные векторы могут включать промотор и энхансер, элементы терминации транскрипции и элементы контроля трансляции. Экспрессионные векторы и способы трансформации, как правило, различаются для двудольных растений-хозяев, таких как АгаЫборык и табак, и для однодольных растений-хозяев, таких как кукуруза и рис. Примеры промоторов растений, используемых для экспрессии, включают промотор вируса мозаики цветной капусты, промотор нопалин-синтазы, промотор рибулозобисфосфаткарбоксилазы и промоторы убиквитина и υΒΟ3. Маркеры селекции, такие как гены гигромицина, фосфоманнозоизомеразы и неомицинфосфотрансферазы, часто используют для облегчения селекции и поддержания трансформированных клеток. Трансформированные растительные клетки можно поддерживать в культуре клеток, в виде агрегатов (каллусная ткань) или регенерировать в целые растения. Поскольку растения имеют типы гликозилирования, отличающиеся от таковых в клетках млекопитающих, это может повлиять на выбор получения РХ в этих организмах. Трансгенные клетки растений также могут включать генетически модифицированные водоросли, предназначенные для получения белков (см., например, Мауйе1б и др., (2003) ΡNΑδ 100:438-442). Поскольку растения имеют типы гликозилирования, отличающиеся от таковых в клетках млекопитающих, это может повлиять на выбор получения РХ в этих организмах.

2. Очистка.

Способы очистки полипептидов РХ из клетки-хозяина зависят от выбранной клетки-хозяина и системы экспрессии. В случае секреции белки, в общем, являются очищенными из культуральной среды после удаления клеток. В случае внутриклеточной экспрессии клетки могут быть лизированы, и белки очищают из экстракта. Если для экспрессии используют трансгенные организмы, такие как трансгенные растения и животные, в качестве исходного материала для получения экстракта лизированных клеток могут быть использованы ткани или органы. Кроме того, получение белков в трансгенных животных может включать получение полипептидов в молоке или яйцах, которые могут быть собраны, и затем при необходимости белки могут быть выделены и очищены с использованием стандартных способов, известных в уровне техники.

РХ может быть очищен с использованием стандартных способов очистки белков, известных в уровне техники, включая, но не ограничиваясь δΌδ-РАОЕ, эксклюзионной хроматографией и хроматографией по размеру, осаждением сульфатом аммония, хелатной хроматографией и ионообменной хроматографией. Например, полипептиды РХ могут быть очищены анионообменной хроматографией. Примером способа очистки полипептида РХ является использование ионообменной колонки, которая позволяет связать любой полипептид, который имеет функциональный домен О1а, с последующей элюцией в присутствии кальция. Для повышения выхода и чистоты препаратов также могут быть использованы методы аффинной очистки. Например, для аффинной очистки могут быть использованы антитела, рецепторы и другие молекулы, которые связывают РХ. В экспрессионных конструкциях к белку может быть добавлена аффинная метка, такая как шус эпитоп, слитая последовательность ОδΤ или НБ6, и аффинная очистка может быть проведена с помощью шус антител, смолы с глутатионом и №-смолы соответственно. Чистота может быть оценена любым способом, известным в уровне техники, включая гель-электрофорез, окрашивание и спектрофотометрические методы.

Как обсуждалось выше, протеаза РХ может быть экспрессирована и очищена в неактивной форме (зимогенной форме), либо, альтернативно, экспрессированная протеаза может быть очищена в активной форме. Полипептиды зимогена РХ могут быть получены с помощью любого из способов получения, описанного в настоящем документе, включая, без ограничения, получение в клетках млекопитающих с

- 75 028865

последующей очисткой. Полипептиды РХа, которые были активированы с помощью удаления активационного пептида, могут быть получены ш νίΙΐΌ (т.е. РХа; двухцепочечная форма). Расщепление полипептидов РХ с получением активной формы протеазы, РХа, может быть проведено с помощью реакции с активатором (например, активатором РХ из яда гадюки Рассела), удаления активатора и дополнительного удаления неактивной формы.

3. Белки слияния.

Также предусмотрены белки слияния, содержащие модифицированный полипептид РХ и один или нескольких других полипептидов. Предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие такие белки слияния, составленные для введения подходящим путем. Белки слияния получают соединением в любом порядке модифицированного полипептида РХ и агента, такого как антитело или его фрагмент, фактор роста, рецептор, лиганд и другие подобные агенты для облегчения очистки полипептида РХ, изменения фармакодинамических свойств полипептида РХ, например, за счет направления полипептида РХ в целевые клетки или ткани и/или для увеличения экспрессии или секреции полипептида РХ. Как правило, любой белок слияния РХ сохраняет по меньшей мере приблизительно 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% коагулянтной активности по сравнению с не слитым полипептидом РХ, в том числе 96, 97, 98, 99% или более коагулянтной активности по сравнению с не слитым полипептидом.

Связь полипептида РХ с другим полипептидом может быть осуществлена непосредственно или через линкер. В одном примере, связь может представлять собой химическую связь, например связь через гетеробифункциональный агент, тиоловую связь или другую такую связь. Белки слияния также могут быть получены с помощью рекомбинантной методики. Слитый с полипептидом РХ другой полипептид может быть присоединен на Оконце или С-конце полипептида РХ. Не ограничивающие примеры полипептидов, которые могут быть использованы для получения белков слияния с полипептидом РХ по настоящему изобретению, включают, например, полипептид 08Т (глутатион 8-трансферазу), Рс домен иммуноглобулина 0 или гетерологичную сигнальную последовательность (например, из тромбина). Белки слияния могут содержать дополнительные компоненты, такие как связывающий мальтозу белок Е. сой (МВР), которые способствуют поглощению белка клетками (см., международную заявку РСТ XV0 01/32711).

Белок слияния может быть получен стандартными рекомбинантными методами. Например, фрагменты ДНК, кодирующие различные последовательности полипептидов, могут быть лигированы друг с другом с совпадением рамки считывания в соответствии с обычными способами, например, с использованием тупых или липких концов для лигирования, расщепления эндонуклеазой рестрикции для обеспечения соответствующих концов, заполнения липких концов в соответствующих случаях, обработки щелочной фосфатазой для избежания нежелательного лигирования и ферментативного лигирования. В другом варианте гибридные гены могут быть синтезированы обычными способами, включая автоматизированный синтез ДНК. Кроме того, ПЦР-амплификация фрагментов генов может осуществляться с использованием перекрывающихся праймеров, которые приводят к комплементарным перекрывающимся участкам между двумя последовательными фрагментами гена, которые затем могут быть отожжены и реамплифицированы для создания последовательности химерного гена (см., например, АивиЬе1 и др., Сштеп! Рго1осо1в Ш Мо1еси1аг Вю1о§у, 1оЬп ΧνίΕν & 8опв, 1992). Кроме того, доступны многие векторы экспрессии, которые уже кодируют сливаемый фрагмент (например, полипептид 08Т). Кодирующая РХ нуклеиновая кислота может быть клонирована в такой вектор экспрессии, причем сливаемый фрагмент может быть связан с протеазой с совпадением рамки считывания.

4. Модификации полипептидов.

Модифицированные полипептиды РХ могут быть получены в виде голых полипептидных цепей или в виде комплекса. Для некоторых целей может быть предпочтительным получение модифицированного РХ в "голой" форме без пост-трансляционных или других химических модификаций. Голые полипептидные цепи могут быть получены в подходящих хозяевах, которые не осуществляют посттрансляционную модификацию РХ. Такие полипептиды также могут быть получены в системах ш νίΐΐΌ и с использованием химического синтеза полипептидов. Для других целей могут быть желательны специфические модификации, включая пегилирование, присоединение альбумина, гликозилирование, карбоксилирование, гидроксилирование, фосфорилирование или другие известные модификации. Модификации могут быть введены ш νίΙΐΌ или, например, при получении модифицированных РХ в подходящем хозяине, который производит такие модификации.

5. Нуклеотидные последовательности.

В настоящем документе предусмотрены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие РХ или модифицированные полипептиды РХ. Молекулы нуклеиновых кислот включают аллельные варианты или варианты сплайсинга любого закодированного полипептида РХ. Примеры предусмотренных здесь молекул нуклеиновых кислот включают любые молекулы, которые кодируют модифицированные полипептиды РХ по настоящему документу, такие как любые молекулы, кодирующие полипептиды, приведенные в любой из 8ЕО ГО N0: 4-133 или 417-546, или их зрелые, зимогенные активные или каталитически активные формы. В одном из вариантов молекулы нуклеиновой кислоты, предусмотренные в настоящем документе, по меньшей мере на 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 или 99% идентичны по по- 76 028865

следовательности любой нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид РХ, предусмотренный в настоящем документе, или гибридизуются в условиях средней или высокой жесткости, по меньшей мере, на протяжении 70% от их полной длины с любой нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид РХ, предусмотренный в настоящем документе. В другом варианте молекулы нуклеиновой кислоты могут включать молекулы с вырожденными кодонами, кодирующие любой из предусмотренных полипептидов РХ.

Р. Оценка активности модифицированных полипептидов РХ.

Активности и свойства полипептидов РХ можно оценить ίη νίίΓΟ и/или ίη νίνο. Анализы для такой оценки известны специалистам в данной области, а также известна корреляция измеренной активности и терапевтического результата и активности ίη νίνο. В одном примере, варианты РХ могут быть оценены по сравнению с не модифицированным РХ и/или РХ дикого типа. В другом примере активность модифицированного полипептида РХ может быть оценена после воздействия АТ-Ш ίη νίΐτο или ίη νίνο и сравнена с активностью модифицированного полипептида РХ, который не был подвержен воздействию АТ-Ш. Такие анализы могут быть выполнены в присутствии или в отсутствие РVа. Анализы ίη νίίτο включают любые лабораторные анализы, известные специалистам в данной области, такие как, например, анализы с использованием клеток, в том числе анализы свертывания, анализы на связывание, белковые анализы и молекулярно-биологические анализы. Анализы ίη νίνο включают тестирование РХ в моделях на животных, а также введение РХ человеку. В некоторых случаях активность РХ ίη νίνο может быть определена на основе оценки крови, сыворотки или других жидкостей организма. Варианты РХ также могут быть исследованы ίη νίνο для оценки их активности или свойств, таких как терапевтический эффект.

Как правило, анализы, описанные в настоящем документе, относятся к активированной форме РХ, т.е. РХа. Такие анализы также могут быть выполнены на неактивной, зимогенной форме в качестве отрицательного контроля, поскольку такая форма, как правило, не обладает протеолитической или каталитической активностью, необходимой для коагулянтной активности РХ. Кроме того, такие анализы также могут быть выполнены в присутствии кофакторов, таких как РVа, которые в некоторых случаях увеличивают активность РХ.

1. Анализы ίη νίίτο.

Примеры анализов ίη νίίτο включают анализы для оценки модификаций и активности полипептидов. Модификации могут быть оценены с помощью анализов ίη νίίτο для оценки γ-карбоксилирования и других пост-трансляционных модификаций, анализов белков и конформационных анализов, известных в уровне техники. Анализы для определения активности включают, но не ограничиваются оценкой взаимодействия РХа с другими факторами свертывания, такими как РVа и протромбин, протеолитическими анализами для определения протеолитической активности полипептидов РХа, анализами для определения связывания и/или аффинности полипептидов РХа к фосфатидилсерину и другим фосфолипидам и анализами с использованием клеток для определения влияния полипептидов РХа на свертывание.

Концентрации модифицированных полипептидов РХа могут быть оценены хорошо известными в уровне техники способами, включая, но не ограничиваясь иммуноферментным анализом (ЕЫ8А), δΌδРАСЕ, методами Брэдфорд, Лоури, с использованием бицинхониновой кислоты (ВСА); измерением УФпоглощения, а также другими методами количественного мечения белка, включая, но не ограничиваясь иммунологическими методами, связанными с радиоактивностью методами, флуоресцентными и сходными методами. Оценка продуктов расщепления протеолитических реакций, в том числе оценка расщепления полипептида протромбина или оценка количества продуктов протеолитической активности РХа может быть выполнена с использованием способов, включающих, но не ограничивающихся расщеплением хромогенного субстрата, ВЭЖХ, δΌδ-РАСЕ анализом, ЕЫ8А, Вестерн-блоттингом, иммуногистохимическим анализом, иммунопреципитацией, определением последовательности с ИН₂-конца и мечением белка.

Также могут быть оценены структурные свойства модифицированных полипептидов РХа. Например, для оценки трехмерной структуры полипептидов РХ и/или других свойств полипептидов РХ, таких как связывание субстрата, Са²' или кофактора, могут быть использованы рентгеновская кристаллография, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) модифицированных полипептидов РХ.

Кроме того, наличие и степень деградации РХа может быть измерена с помощью стандартных способов, таких как электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (δΌδРАСЕ) и Вестерн-блоттинг подвергнутых электрофорезу образцов, содержащих РХа. Полипептиды РХа, которые подверглись воздействию протеазы, могут также быть подвергнуты Ν-концевому секвенированию для определения местонахождения сайтов расщепления или изменения в сайтах расщепления в модифицированных полипептидах РХа.

а) Посттрансляционные модификации.

Полипептйды РХ/РХа также могут быть оценены на наличие посттрансляционных модификаций. Такие анализы известны в уровне техники и включают анализы для оценки гликозилирования, гидроксилирования и карбоксилирования. Например, для анализа гликозилирования может быть выполнен анализ

- 77 028865

углеводов, например, совместно с δΌδ-РАОЕ анализом полипептидов РХ/РХа, подвергнутых гидразинолизу или обработанных эндогликозидазой. Гидразинолиз при инкубации белка с безводным гидразином приводит к отщеплению N и 0-связанных гликанов от гликопротеина, а обработка эндогликозидазой ПНГазой Р приводит к отщеплению большей части ^гликанов от гликопротеина. Гидразинолиз или обработка эндогликозидазой полипептидов РХ/РХа приводит к образованию восстанавливающего конца, который может быть помечен флуорофорной или хромофорной меткой. Меченые полипептиды РХ/РХа могут быть проанализированы с помощью электрофореза углеводов с использованием флуорофора (РАСЕ). Флуоресцентное мечение гликанов также может быть использовано при анализе моносахаридов, профилировании или анализе особенностей структуры сложных паттернов гликозилирования с помощью ВЭЖХ. Примеры ВЭЖХ включают гидрофильную хроматографию, хроматографию электронного взаимодействия, ионообменную, гидрофобную хроматографию и гель-хроматографию. Примеры меток для гликанов включают, но не ограничиваются 3-(ацетиламино)-6-аминоакридином (АА-АС) и 2аминобензойной кислотой (2-АА). Углеводные фрагменты также могут быть обнаружены с использованием специфических антител, которые распознают гликозилированный полипептид РХ/РХа.

Пример анализа для оценки β-гидроксилирования включает обратнофазный ВЭЖХ анализ полипептидов РХ/РХа, которые были подвергнуты щелочному гидролизу (РегШилб, Р авб ί. δίеηГ1ο (1983) 1. ΒίοΙ. СЬет. 258(20): 12509-12). Карбоксилирование и γ-карбоксилирование полипептидов РХ/РХа может быть оценено с использованием щелочного гидролиза с последующей ВЭЖХ с использованием катионообменной колонки, и модифицированные остатки могут быть идентифицированы с помощью аминоконцевого секвенирования с использованием расщепления по Эдману (СатШе еί а1. (2000) ВюсЬетШгу. 39(46): 14322-14329). Также может быть оценено взаимодействие полипептидов РХ, содержащих пропептидную последовательность (про-РХ), с карбоксилазой, ответственной за посттрансляционное γкарбоксилирование. Например, относительные аффинности пептидов РХ к карбоксилазе можно сравнить с помощью определения констант ингибирования (К₁) по отношению к субстрату пропептиду фактора РХ/домену, содержащему γ-карбоксиглутаминовую кислоту ^ал1еу, Т.В. (1999) 1. ΒίοΙ. СЬет. 274:1694016944).

b) Протеолитическая активность (каталитическая активность).

Модифицированные полипептиды РХа могут быть протестированы на протеолитическую активность. Протеолитическая активность РХа может быть измерена с помощью хромогенных субстратов, таких как Р-3301 (СН₃,0С0-^-СНА-01у-А^д-рNА-Ас0Н; δίβΐηη А16псЬ), δ-2222 В/-Пе-О1и(д-0К)-О1уА^д-рNА·НС1; К=Н (50%) и К=СН₃ (50%); О1аРЬагта), δ-2337 (бензоил-Пе-О1и-С-пиперидил)-О1у-Аг§-пнитроаналин; КаЫ Оха^^я^а), СΒδ 39.31 (□1адгю5Ьс δΙη§ο Όίά.), и флуорогенных субстратов, таких как РеГаГЪюг РХа (СН^0₂-Э-СНА-О1у-Аг§-АМС-Ас0Н; РеШарЬагт). Полипептиды РХа в присутствии РУа или без РУа и необязательно в присутствии фосфолипидов инкубировали с различными концентрациями хромогенного субстрата. Расщепление субстрата можно контролировать по оптическому поглощению или флуоресценции, а скорость гидролиза субстрата можно определить линейной регрессией с использованием доступного программного обеспечения.

Протеолитическая активность фактора Ха также может быть оценена косвенно по активации субстратов РХа, таких как протромбин. Полипептиды РХа в присутствии фосфолипидов при предварительной инкубации с РУа или без нее можно инкубировать с очищенным протромбином (который является коммерчески доступным). Количество активного тромбина, который образовался вследствие протеолитического расщепления протромбина полипептидом РХа, затем определяют по активности тромбина по отношению к флуорогенному субстрату, такому как РеГаГЪюг ТН (Н-Э-СНА-А§а-Аг§-АМС-2Ас0Н; Сеа(егсРет), которую отслеживают по изменениям флуоресценции (υδ 2005/0142032, см. также пример 4 ниже), или по отношению к хромогенному субстрату, такому как Т3068 ф-А1а-О1у-Аг§ п-нитроанилид диацетат; δίβίικι А16псЬ), которую отслеживают по изменениям оптического поглощения. Активность полипептида фактора Ха затем определяют, исходя из измеренной активности тромбина.

c) Коагулянтная активность.

Коагулянтная активность полипептидов РХ/РХа может быть оценена с помощью известных в уровне техники анализов. Примеры анализов включают, но не ограничиваются двухэтапным анализом свертывания (δΐίο^η еί а1., (1983) 1. ΒίοΙ. СЬет. 259(4):2306-2310); анализом протромбинового времени (РТ); модификациями анализа РТ; активированным частичным тромбопластиновым временем (аРТТ); активированным временем свертывания (АСТ); активированным временем свертывания с разбавленным активированным фактором Х (ХАСТ) (Ехвег еί а1. (2000) Β1οοά СЛадЫ Р^Ъ^^ηο1у8^8. 14(8):773-779); рекальцифицированным активированным временем свертывания; временем свертывания Ли-Уайта или тромбоэластографией (ТЕО); или ротационной тромбоэластометрией (К0ТЕМ). Например, коагулянтная активность модифицированного полипептида РХ/РХа может быть определена с помощью анализа на основе РТ, в котором РХ/РХа разводят в РХ-дефицитной плазме и смешивают с реагентом для определения протромбинового времени (с фосфолипидами и кальцием), например, доступным под названием [ηηονίη™ от Эабе ВеЬгтд. Образование сгустка определяют оптически, находят требующееся для образования сгустка время и сравнивают его со временем, полученным для РХ-дефицитной плазмы без добавления

- 78 028865

РХ/РХа.

б) Связывание с другими белками и молекулами и/или ингибирование другими белками и молекулами.

Для оценки устойчивости модифицированных полипептидов РХа к ингибиторам РХа, таким как комплекс антитромбин III (АТ-111)/гепарин, могут быть использованы анализы ингибирования. Также может быть проведена оценка ингибирования для других ингибиторов, включая, но не ограничиваясь ими, другие ингибиторы сериновых протеаз, такие как белок Ζ-зависимый ингибитор протеазы (ΖΓΙ) и РХа-специфичные антитела. Ингибирование можно оценить, инкубируя коммерчески доступные АТ-ΙΙΙ и нефракционированный гепарин с полипептидами РХа. Активность РХа можно оценить, используя любой один или несколько анализов активности или анализ коагулянтной активности, описанные выше, и ингибирование с помощью АТ-ΙΙΙ или ΖРI можно оценить путем сравнения активности полипептидов РХа, которые инкубировали с ингибитором, с активностью полипептидов РХа, которые не инкубировали с ингибитором.

Можно протестировать связывание полипептидов РХа с другими факторами свертывания крови и ингибиторами. Например, прямые и косвенные взаимодействия РХа с кофакторами, такими как РУа, субстратами, такими как протромбин, и ингибиторами, такими как АТ-ΙΙΙ, ΖРI и гепарин, можно оценить, используя любые анализы связывания, известные в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, иммунопреципитацию; очистку на колонках; невосстанавливающий 8Э8-РЛОЕ; поверхностный плазмонный резонанс (8РК), в том числе анализы ВЮсоге®; резонансный перенос энергии флуоресценции (РКЕТ); поляризацию флуоресценции (РР); изотермическую титрационную калориметрию ^ТС); круговой дихроизм (СЭ); структурный анализ комплементации фрагментов белка (РСА); спектроскопию ядерного магнитного резонанса (ММК); рассеивание света; седиментационное равновесие; гельфильтрационную хроматографию с узкими зонами (8та11-/опе де1 П1!га!юп сЬгота!одгарЬу); задержку в геле; Раг-\уе81егп блоттинг; поляризацию флуоресценции; гидроксил-радикальный футпринтинг белка; фаговый дисплей и различные двухгибридные системы. В одном из примеров аффинность связывания РХа с фосфолипид-связанным РУа определяли, используя радиоактивно меченые РХа и РУа и центрифугирование через масло (Тгасу е! а1. (1981) 1. Вю1. СЬет. 256(2): 743-751).

е) Аффинность к фосфолипидам.

Связывание и/или аффинность модифицированных полипептидов РХ/РХа к фосфатидилсерину (ФС) и другим фосфолипидам могут быть определены с помощью хорошо известных в уровне техники анализов (см., например, Вит е! а1. (1987) ВюсЫтюа е! ВюрЬу8юа Ас!а. 923(2): 176-186). Высоко чистые фосфолипиды (например, бычий ФС и яичный фосфатидилхолин (ФХ) в известной концентрации), которые являются коммерчески доступными, например, от 81дта, и растворены в органическом растворителе, могут быть использованы для получения малых однослойных фосфолипидных везикул. Связывание полипептида РХ/РХа с этими ФС/ФХ везикулами может быть оценено по относительному рассеянию света под углом 90° к падающему свету. Для определения константы диссоциации измеряют интенсивности рассеяния света для ФС/ФХ и ФС/ФХ/РХ или ФС/ФХ/РХа (Вит е! а1. (1987) ВюсЫтюа е! ВюрЬу8юа Ас!а. 923(2): 176-186). Поверхностный плазмонный резонанс, например, измеренный на биосенсоре ВЮсоге, также может быть использован для измерения аффинности полипептидов РХ/РХа к фосфолипидным мембранам (ЕгЬ е! а1. (2002) Еиг. 1. ВюсЬет. 269(12):3041-3046).

2. Модели на животных, не включающих человека.

Модели на животных, не включающих человека, могут быть использованы для оценки активности, эффективности и безопасности модифицированных полипептидов РХ/РХа. Например, животные, не включающие человека, могут быть использованы для моделирования заболевания или состояния. Животным, не включающим человека, могут быть сделаны инъекции вещества, вызывающего заболевание и/или индуцирующего определенный фенотип, такие как инъекции, приводящие к передозировке антикоагулянтного лекарственного средства, затем животному может быть введен вариант РХ/РХа, такой как любой вариант РХ/РХа, приведенный в табл. 14, и, в частности, зимоген РХа или его каталитически активная форма, и может быть проведен мониторинг воздействия полипептида на гемостаз.

Генетические модели также являются полезными. Могут быть получены животные, такие как мыши, которые в результате гиперэкспрессии, недостаточной экспрессии или нокаута одного или нескольких генов имитируют заболевания или состояния, например, могут быть получены мыши с нокаутом фактора УШ, которые проявляют гемофилию А (В1 и др., (1995) №ц Оеп 10: 119-121). Для тестирования вариантов РХ/РХа также могут быть получены генетические модели с дефицитом других факторов свертывания, включая, но не ограничиваясь дефицитом фактора УП; дефицитом фактора РХ (например, модели гемофилии В); дефицитом фактора Х; дефицитом фактора XI (модели гемофилии С); дефицитом фактора ХП и семейным множественным дефицитом факторов свертывания крови (РМРЦ) типа Ι, ΙΙ, ГУ, У и У (см. КоЬей8, Н.К. апб М.Э. ВшдЬат, "0!Ьег Соади1а!юп Рас!ог ОеПс1епс1е8". ТЫотЬо818 апб НетоггЬаде, 2^пб еб. ВаШтоге, МО: Щййатз & ЩПкш8, 1998: 773-802). Такие животные могут быть получены согласно технологии получения трансгенных животных, хорошо известной в уровне техники, или с использованием природных или индуцированных мутантных линий. Примеры полезных моделей заболеваний, связанных с РХ/РХа, на животных, не включающих человека, включают, но не ограничиваются мо- 79 028865

делями нарушений свертываемости крови, в частности моделями гемофилии или тромбоза. Модели повреждения или травмы на животных, не включающих человека, а также модели посттравматической гемодилюционной коагулопатии или острой травматической коагулопатии на животных также могут быть использованы для оценки активности полипептидов РХ/РХа, такой как коагулянтная активность. Указанные модели на животных, не включающих человека, могут быть использованы для мониторинга активности вариантов РХ/РХа по сравнению с полипептидами РХ/РХа дикого типа.

Модели на животных также могут быть использованы для мониторинга стабильности, периода полужизни и клиренса модифицированных полипептидов РХ/РХа. Такие анализы полезны для сравнения модифицированных полипептидов РХ/РХа и для расчета доз и режима дозирования для дальнейших исследований на животных и человеке. Например, модифицированный полипептид РХ/РХа, такой как любой вариант РХ/РХа, предусмотренный в настоящем документе, в том числе, например, любой полипептид, приведенный в табл. 14, и, в частности, зимоген, РХа или их каталитически активные части, может быть введен в хвостовую вену мыши. Затем через определенные интервалы времени после инъекции могут быть отобраны образцы крови (например, через минуты, часы и дни после введения), и в образцах, включающих, но не ограничивающихся сывороткой или плазмой, через определенные интервалы времени после введения может быть определен уровень модифицированных полипептидов РХ/РХа, например, с помощью ИФА или радиоиммуноанализа. Образцы крови, отобранные через определенные интервалы времени после инъекции полипептидов РХ/РХа, также могут быть исследованы на коагулянтную активность с использованием различных способов, таких как способы, описанные в примере 8. Указанные фармакокинетические исследования могут предоставить информацию о периоде полужизни, клиренсе и стабильности полипептидов РХ/РХа, которая может помочь в определении подходящих доз для введения прокоагулянта.

Модифицированные полипептиды РХ/РХа, такие как любые полипептиды, приведенные в табл. 14, и, в частности, зимоген, РХа или их каталитически активные части, может быть проверен на терапевтическую эффективность в моделях гемофилии на животных. В одном не ограничивающем примере могут быть использованы модели на животных, таких как мыши. Модели гемофилии на мышах, известные в уровне техники, могут быть использованы для тестирования модифицированных полипептидов РХ/РХа. Например, модель гемофилии А на мышах, получаемая путем инъекции анти-РУШ антител, может быть использована для оценки коагулянтной активности полипептидов факторов свертывания (см. ТгапМт и др., В^й (2003) 102:3615-3620), в настоящем документе предусмотрено тестирование модифицированных полипептидов РХ/РХа на модели индуцированной гемофилии. Генетические модели гемофилии А на мышах (Βί е! а1. (1995) Оеп 10:119-121) или гемофилии В на мышах (МагдагШк е! а1. (2004) I. С1ш Iиνек! 113:1025-1031) также могут быть использованы для тестирования модифицированных полипептидов РХ/РХа.

Также существуют модели нарушений свертываемости крови, в которых модельные животные не являются мышами. Активность полипептида РХ/РХа может быть оценена на крысах с индуцированным варфарином кровотечением или индуцированным мелатраном кровотечением (Этекк и др., (1992) ТЬготЬ Кек 67:233-241, Е1д и др., (2001) ТЬготЬ Кек 101:145-157) и на кроликах с индуцированным гепарином кровотечением (СЬеп и др., (2003) I. ТЬготЬ Наетοк! 1:760 - 765). Для тестирования активности модифицированных полипептидов РХ/РХа также могут быть использованы модели передозировки антикоагулянтов на приматах (ОгиЬег е! а1. (2008) В^й 112: АЬкйас! 3825). Инбредные собаки с гемофилией А, гемофилией В и болезнью Виллебранда, у которых наблюдаются тяжелые кровотечения, также могут быть использованы в качестве моделей для исследования модифицированных полипептидов РХ/РХа (Βγ^^ο^ и др., (1989) 86:1382-1386 РNΑ8). Активность полипептидов РХ/РХа также может быть оценена в модели кровотечения на кроликах с тромбоцитопенией, индуцированной сочетанием гаммаоблучения и использования антител против тромбоцитов (ТгапМт и др., (2003) ТЬготЬ Кек 109: 217223).

В дополнение к животным с генерализованными нарушениями свертываемости крови для оценки активности модифицированных полипептидов РХ/РХа, а также их безопасности и эффективности в качестве терапевтических коагулянтов также могут быть использованы модели ранения и травмы. Не ограничивающие примеры таких моделей включают модель коронарного стеноза на кролике (ΕηΙοΓυΙΙο и др., (2004). Сап I. АпаекШ 51: 672-679), модель травмы печени У степени у свиней (^ре1тап е! а1. (2000) С^уοЬ^ο1ο§у; 40:210-217; Маг1ию\уП/ е! а1. (2001) I Тгаита; 50:721-729), модель аортотомии у свиней ^ийееи и др., (2004) 81юск 22: 163-168), модель острой травматической коагулопатии у свиней (Нагг е! а1. (2011) I. 8игд Кек; 170(2):319-324); и модель приобретенной травматической коагулопатии у свиней (Пюкпейе, О. апй Ι. Ргадк!, (2009) Βγ I. Апаек!Ь; 102(3):345-354).

3. Клинические анализы.

Для оценки активности РХ/РХа для клинического использования доступно множество анализов. Такие анализы могут включать оценку свертывания, стабильности белков и периоде полужизни ш νίνο, а также фенотипические анализы. Фенотипические анализы и тесты для оценки терапевтического эффекта лечения фактором РХ/РХа включают оценку уровня РХ/РХа в крови (например, измерение уровня РХ/РХа в сыворотке до введения и через определенные интервалы времени после введения, в том числе

- 80 028865

после первого введения, непосредственно после последнего введения и в определенные моменты времени между ними с поправкой на индекс массы тела (ИМТ)), оценку свертывания крови после лечения РХ/РХа ίη νίίτο с использованием способов, описанных выше (например, анализ РТ), и фенотипический ответ на лечение РХ/РХа, включая улучшение симптомов во времени по сравнению с субъектами, которым вводили не модифицированный РХ/РХа и/или РХ/РХа дикого типа, или плацебо. У пациентов, получавших модифицированный полипептид РХ/РХа, можно оценить потерю крови, потребность в переливании и уровень гемоглобина. Пациенты могут наблюдаться регулярно в течение определенного периода времени при регулярных или повторных введениях или после введения в ответ на острую необходимость, такую как кровотечение, травма или хирургическое вмешательство.

С. Лекарственные формы и введение.

В настоящем документе предусмотрены композиции модифицированных полипептидов РХ, включая модифицированные зимогены РХ и модифицированные полипептиды РХа для применения в лечении нарушений свертываемости крови. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество модифицированного зимогена РХ или полипептида РХа, как описано в настоящем документе. Эффективные концентрации полипептидов РХ или их фармацевтически приемлемым производных смешивают с подходящим фармацевтическим носителем или средой для системного, местного или локального введения. Количество соединения эффективно для лечения выбранного расстройства. Концентрация активного вещества в композиции зависит от поглощения, инактивации, экскреции активного соединения, графика дозирования и количества ведений, а также от других факторов, известных специалистам в данной области.

Фармацевтические носители или среды, пригодные для введения соединений, предусмотренных в настоящем документе, включают известные специалистам в данной области носители, подходящие для определенного способа введения. Фармацевтические композиции, которые включают терапевтически эффективное количество полипептида РХ, описанного в настоящем документе, также могут быть предусмотрены в виде лиофилизированного порошка, который может быть восстановлен, например, стерильной водой, непосредственно перед введением.

1. Лекарственные формы.

Фармацевтические композиции, содержащие модифицированный полипептид РХ, в том числе модифицированный зимоген РХ и модифицированные полипептиды РХа, могут быть составлены любым традиционным способом путем смешивания выбранного количества полипептида с одним или несколькими физиологически приемлемыми носителями или эксципиентами. Выбор носителя или эксципиента находится в пределах компетентности профессионала, осуществляющего введение, и выбор может зависеть от ряда параметров. Они включают, например, способ введения (т.е. системный, пероральный, назальный, легочный, локальный, местный или любой другой способ) и расстройство, подвергаемое лечению.

Соединение может быть суспендировано в микронизированной или другой подходящей форме или может быть дериватизировано для получения более растворимого активного продукта. Форма полученной смеси зависит от ряда факторов, в том числе предполагаемого способа введения и растворимости соединения в выбранном носителе или среде для лекарства. Полученные смеси представляют собой растворы, суспензии, эмульсии и другие такие смеси и могут быть составлены в виде неводной или водной смеси, кремов, гелей, мазей, эмульсий, растворов, эликсиров, лосьонов, суспензий, настоек, паст, пен, аэрозолей, состава для промывания (орошения), спрея, суппозиториев, бандажей или любой другой лекарственной формы, подходящей для системного, местного или локального введения. Для локального введения внутрь, такого как внутримышечное, парентеральное или внутрисуставное введение, полипептиды могут быть составлены в виде раствора, суспензии в среде на водной основе, такой как изотоничный буферный раствор, или комбинированы с биосовместимой или биоадгезивной подложкой, предназначенной для введения внутрь. Как правило, фармацевтически приемлемые композиции получают в соответствии с требованиями регулирующего органа или получают в соответствии с общепризнанной фармакопеей для использования на животных и для человека. Фармацевтические композиции могут включать вспомогательные вещества, такие как разбавитель, адъювант, наполнитель или носитель, с которыми вводят изоформу. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильную жидкость, такую как вода и масло, в том числе масло нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такое как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло и кунжутное масло. Вода является типичным носителем, если фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидкого носителя, особенно в качестве раствора для инъекций. Композиции наряду с активным ингредиентом могут содержать разбавитель, такой как лактоза, сахароза, дикальция фосфат или карбоксиметилцеллюлоза; смазку, такую как стеарат магния, стеарат кальция, тальк, и связующее, такое как крахмал, натуральные смолы, такие как камедь, гуммиарабик, желатин, глюкоза, патока, поливинилпирролидон, целлюлоза и ее производные, повидон, кроссповидоны и другие подобные связующие, известные специалистам в данной области. Подходящие фармацевтические наполнители включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рисовую муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицери- 81 028865

на, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен гликоль, воду и этанол. Композиция, по желанию, также может содержать небольшие количества смачивателя или эмульгатора, или буферных агентов, например ацетата, цитрата натрия, производных циклодекстрина, сорбитанмонолаурата, ацетата натрия, триэтаноламина, триэтаноламинолеата и других подобных агентов. Эти композиции могут быть в форме раствора, суспензии, эмульсии, таблетки, пилюли, капсулы, порошка и в виде лекарственной формы с замедленным высвобождением. Могут быть изготовлены капсулы и картриджи, например, из желатина для использования в ингаляторе или инсуффляторе, содержащие порошок, представляющий собой смесь терапевтического соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал. Композиция может быть составлена в виде свечей с обычными связующим и носителем, такими как триглицериды. Композиция для перорального приема может включать стандартные носители, такие как маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлозу, карбонат магния фармацевтической чистоты и другие подобные агенты. Препараты для перорального введения также могут содержать ингибиторы протеаз, такие как ингибитор Боумена-Бирка, конъюгированный ингибитор Боумена-Бирка, апротинин и камостат. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в "КепипдЮп'к Рбагшасеийса1 δс^епсек", Е.У. Магйп. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество соединения, обычно, в очищенном виде вместе с подходящим количеством носителя для обеспечения надлежащей формы для введения субъекту или пациенту.

Лекарственная форма должна соответствовать способу введения. Например, композиции, содержащие модифицированный РХ, включая модифицированные зимогены РХ и модифицированные полипептиды РХа, могут быть составлены для парентерального введения путем инъекции (например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии). Инъекционные композиции могут иметь форму суспензии, раствора или эмульсии в масляном или водном носителе. Стерильные инъекционные препараты также могут представлять собой стерильные инъекционные растворы или суспензии в нетоксичном парентерально-приемлемом разбавителе или растворителе, например могут представлять собой раствор в 1,4-бутандиоле. Стерильные нелетучие масла обычно применяют в качестве растворителя или среды для суспендирования. Для этой цели может быть использовано любое мягкое нелетучее масло, включая, но не ограничиваясь синтетическими моно- или диглицеридами, жирными кислотами (в том числе олеиновой кислотой), природными растительными маслами, например кунжутным маслом, кокосовым маслом, арахисовым маслом, хлопковым маслом и другими маслами, или синтетическими жирными носителями, такими как этилолеат. Буферы, консерванты, антиоксиданты и подходящие ингредиенты могут быть включены в композицию, если это необходимо, или, альтернативно, могут составлять композицию.

Полипептиды могут представлять собой единственный фармацевтически активный ингредиент в композиции или могут быть объединены с другими активными ингредиентами. Доставка полипептидов может быть направленной, например, при конъюгировании с нацеливающим агентом, таким как антитело. Суспензии липосом, в том числе суспензии нацеленных на определенную ткань липосом, также могут быть пригодны в качестве фармацевтически приемлемого носителя. Они могут быть получены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области. Например, липосомные лекарственные формы могут быть получены, как описано в патенте США № 4522811. Липосомная доставка также может включать лекарственные формы с медленным высвобождением, в том числе фармацевтические матрицы, такие как коллагеновые гели и липосомы, модифицированные фибронектином (см., например, ХУетег и др., (1985) 1. Рбагш δα 74 (9): 922-5). Композиции, предусмотренные в настоящем документе, дополнительно могут содержать один или несколько адъювантов, которые облегчают доставку, включая, но не ограничиваясь инертными носителями или коллоидными дисперсионными системами. Не ограничивающие примеры таких инертных носителей могут быть выбраны из воды, изопропилового спирта, газообразных фторуглеродов, этилового спирта, поливинилпирролидона, пропиленгликоля, образующих гель материалов, стеарилового спирта, стеариновой кислоты, спермацета, сорбитанмоноолеата, метилцеллюлозы, а также из подходящих комбинаций двух или более из них.

Активное соединение включено в фармацевтически приемлемый носитель в количестве, достаточном для оказания терапевтического эффекта при отсутствии нежелательных побочных эффектов у субъекта, подвергающегося лечению. Терапевтически эффективная концентрация может быть определена эмпирически путем тестирования соединений в известных системах ш ν Иго и ш уйо, таких как, например, системы, предусмотренные в настоящем документе.

а) Дозирование.

Фармацевтические композиции, содержащие модифицированный полипептид РХ, в том числе модифицированный зимоген РХ и модифицированные полипептиды РХа, предусмотренные в настоящем документе, могут быть составлены для однократного (прямого) введения дозы, многократного введения дозы или для разведения или другой модификации. Концентрации соединений в лекарственных формах являются эффективными для доставки количества при введении, которое является эффективным для предполагаемого лечения. Как правило, композиции составлены в виде лекарственных форм для однократного введения дозы. Для составления композиции взвешенную фракцию соединения или его смеси растворяют, суспендируют или иным образом смешивают в выбранном носителе в эффективной концентрации, такой, что подвергаемое лечению состояние облегчается или улучшается.

- 82 028865

Точное количество или доза вводимого терапевтического агента зависит от конкретного полипептида РХ (например, зимогена РХ или РХа и/или конкретной модификации), способа введения и других соображений, таких как тяжесть заболевания, а также вес и общее состояние субъекта. При локальном введении терапевтического агента, как правило, будет требоваться меньшая доза, чем при любом способе системного введения, хотя локальная концентрация терапевтического агента, в некоторых случаях, может быть выше после локального введения, чем концентрация, которая может быть безопасно достигнута при системном введении.

При необходимости, конкретная дозировка, продолжительность и протокол лечения могут быть определены опытным путем или экстраполированы. Например, в качестве отправной точки для определения соответствующих дозировок можно использовать примеры доз рекомбинантных и нативных полипептидов РХ. Обычно модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, могут быть эффективными при уменьшенных дозировках и/или частоте дозирования по сравнению с рекомбинантным полипептидом РХ дикого типа. Длительность лечения и интервал между инъекциями будет варьировать в зависимости от тяжести кровотечения и ответа пациента на лечение, и они могут быть соответственно скорректированы. При определении дозировок могут учитываться такие факторы как уровень активности и период полужизни модифицированного РХ по сравнению с немодифицированным РХ. Конкретные дозировки и режимы дозирования могут быть определены опытным путем. Например, модифицированный полипептид РХ, который обладает более длительным периодом полужизни, чем немодифицированный полипептид РХ, можно вводить в более низких дозах и/или реже, чем немодифицированный полипептид РХ. Аналогично, частота и размер доз, необходимых для достижения терапевтического эффекта с использованием модифицированного полипептида РХ, который обладает увеличенной коагулянтной активностью по сравнению с немодифицированным полипептидом РХ, могут быть снижены. Конкретные дозировки и режимы дозирования могут быть определены опытным путем специалистом в данной области техники.

Размер дозировки модифицированного полипептида РХ, в том числе зимогена РХ или РХа, может представлять собой количество, которое повышает уровни полипептида в крови примерно на 10-400%, от 50 до 100% или от 100 до 250% от нормального количества полипептида РХ. Контроль уровня вводимого полипептида РХ в плазме или в крови с целью мониторинга или корректировки уровня дозировки находится в пределах компетентности специалиста в данной области техники.

Полипептид РХ может быть введен в композицию в количестве, которое составляет от или примерно от 50 до 1000 единиц/мл, например от 50 до 500 единиц/мл, от 100 до 600 единиц/мл или от 400 до 1000 единиц/мл. Объем композиций может составлять от 0,5 до 100 мл, например от 0,5 до 5 мл, от 1 до 10 мл, от 5 до 50 мл или от 30 до 60 мл.

Например, модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, могут быть составлены для введения пациенту в дозировке от 0,01 до 1,000 мг, например от 0,05 до 500 мг, например от 1 до 500 мг. Эффективное количество лекарства обычно вводят в дозировке от 0,0002 до примерно 20 мг/кг веса тела в день, например от примерно 0,001 до 7 мг/кг веса тела в день, например от 0,01 до 1 мг/кг, от 0,05 до 0,5 мг/кг, от 0,01 до 0,250 мг/кг, от 0,01 до 0,075 мг/кг или по меньшей мере или примерно по меньшей мере 0,04 мг/кг. Обычно дозирование осуществляют по меньшей мере один раз в день, по меньшей мере, до тех пор, пока не наблюдается достаточное улучшение. Дозирование может быть осуществлено путем болюсной инфузии в течение нескольких минут (например, от 1 до 10 мин или от 2 до 5 мин). Альтернативно, пациент может получать болюсную инфузию каждые один-три часа, или, если наблюдается достаточное улучшение, инфузию полипептида можно осуществлять один раз ежедневно. Таким образом, в некоторых примерах доза может быть повторена один раз в час, один раз в день, один раз в неделю или один раз в месяц. Например, для лечения пациентов, у которых случается эпизод кровотечения, таких как пациенты, имеющие дефицит фактора свертывания крови или другую связанную травму, доза может быть повторена каждые 1-24 ч, например каждые 2-12 ч или каждые 4-6 ч до тех пор, пока не будет достигнут гемостаз.

Ь) Дозированные формы.

Фармацевтические терапевтически активные соединения и их производные, как правило, включают в лекарственные формы и вводят в виде единичных лекарственных форм или лекарственных форм для многократного введения. Могут быть предусмотрены лекарственные формы для введения людям и животным, которые включают, но не ограничиваются таблетками, капсулами, пилюлями, порошками, гранулами, стерильными парентеральными растворами или суспензиями, пероральными растворами или суспензиями и водно-масляными эмульсиями, содержащими приемлемые количества соединений или их фармацевтически приемлемых производных. Каждая единичная доза содержит определенное количество терапевтически активного соединения, достаточное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем, средой или растворителем. Примеры единичных лекарственных форм включают ампулы и шприцы, а также индивидуально упакованные таблетки или капсулы. В некоторых примерах единичные дозы предусмотрены в виде лиофилизированного порошка, который восстанавливают до введения. Например, полипептид РХ может быть предусмотрен в виде лиофилизированного порошка, который восстанавливают подходящим раствором и получают рас- 83 028865

твор для инъекции, содержащий единичную дозу полипептида РХ. В некоторых вариантах лиофилизированный порошок может содержать полипептид РХ и дополнительные компоненты, такие как соли, такие, что восстановление стерильной дистиллированной водой приводит к раствору полипептида РХ в буфере или солевом растворе. Единичные лекарственные формы могут быть введены частями, или может быть введено сразу несколько единичных лекарственных форм. Лекарственная форма для многократного введения представляет собой множество одинаковых единичных лекарственных форм, упакованных в один контейнер, которые вводят по отдельности в виде единичных лекарственных форм. Примеры лекарственных форм для многократного введения включают флаконы, бутылки с таблетками или капсулами или бутылки с пинтами или галлонами жидкости. Таким образом, лекарственная форма для многократного введения представляет собой множество единичных лекарственных форм, которые не отделены друг от друга в упаковке.

Модифицированные полипептиды РХ, в том числе зимоген РХ или полипептиды РХа, предусмотренные в настоящем документе (т.е. активные соединения), могут быть введены ίη νίίΐΌ, ех νί\Ό или ίη νί\Ό путем контактирования смеси, такой как образец биологической жидкости или ткани, с модифицированным полипептидом РХ. Например, при введении соединения ех νί\Ό образец биологической жидкости или ткани от субъекта может быть приведен в контакт с полипептидами РХ, которые покрывают трубку или фильтр, например трубку или фильтр в аппарате искусственного кровообращения. При введении ίη νί\Ό активные соединения могут быть введены любым подходящим способом, например перорально, назально, легочным путем, парентерально, внутривенно, внутрикожно, подкожно, внутрисуставно, интрацистернально, внутрь глаза, интравентрикулярно, интратекально, внутримышечно, внутрибрюшинно, интратрахеально или местно, а также с помощью любой комбинации любых двух или более из указанных способов, в жидкой, полужидкой или твердой форме, составленной подходящим для каждого способа введения образом. Модифицированные полипептиды РХ могут быть введены один раз или больше одного раза, например два раза, три раза, четыре раза или любое число раз, необходимое для достижения терапевтического эффекта. Многократные введения дозы могут быть осуществлены любым способом или комбинацией способов, и введения могут быть проведены, например, каждый час (например, каждые 2 ч, каждые 3 ч, каждые 4 ч или больше), ежедневно, еженедельно или ежемесячно.

Наиболее подходящий способ для введения будет варьировать в зависимости от состояния заболевания, подлежащего лечению, например, локализации нарушения свертываемости крови. Обычно полипептиды РХ будут введены путем внутривенной болюсной инъекции. Время введения (инфузии) может составлять нескольких минут, например приблизительно от 1 до 10 мин или от 2 до 5 мин. В других примерах желательные уровни РХ в крови могут поддерживаться непрерывной инфузией активного агента, которую осуществляют в зависимости от уровня в плазме. Следует отметить, что лечащий врач будет знать, как и когда закончить, прервать или скорректировать терапию, чтобы снизить дозировку из-за токсичности или нарушений функции костного мозга, печени или почек. И наоборот, лечащий врач будет знать, как и когда корректировать лечение до более высоких уровней, если клинический ответ не является адекватным (исключая токсические побочные эффекты).

В других примерах локализация нарушения свертываемости крови может указывать на то, что лекарственная форма РХ должна вводиться альтернативным путем. Например, может быть осуществлено локальное введение, в том числе введение в головной мозг (например, интравентрикулярно), если у пациента наблюдаются кровотечения в этой области. Аналогично, для лечения кровотечения в суставах может быть осуществлено локальное введение путем инъекции терапевтического агента в сустав (т.е. внутрисуставно, внутривенно или подкожным способом). В других примерах может применяться местное введение терапевтического агента, например, составленного в виде крема, геля или мази, в кожу или введение в легкие путем ингаляции или интратрахеального введения, когда кровотечение локализуется в этих областях.

В примерах, в которых модифицированные полипептиды РХ составлены в виде депо-препарата, лекарственные формы пролонгированного действия могут быть введены путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. Таким образом, например, терапевтические соединения могут быть составлены с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами, или в виде умеренно растворимых производных, например в виде умеренно растворимой соли.

Композиции, если желательно, могут быть предусмотрены в упаковке, в наборе или в дозирующем устройстве, которые могут содержать одну или несколько единичных дозированных форм, содержащих активный ингредиент. Упаковка, например, содержит металлическую фольгу или полимерную пленку, такую как блистерная упаковка. Упаковка или дозирующее устройство могут сопровождаться инструкциями для введения. Композиции, содержащие активные агенты, могут быть упакованы в виде изделий, содержащих упаковочный материал, агент, предусмотренный в настоящем документе, и этикетку, в которой указано расстройство, для которого предусмотрен агент.

- 84 028865

Также в настоящем документе предусмотрены композиции молекул нуклеиновых кислот, кодирующих модифицированные полипептиды РХ, и векторов экспрессии, кодирующих модифицированные полипептиды РХ, подходящие для генной терапии. Вместо введения белков могут быть введены нуклеиновые кислоты, причем введение может быть проведено ίη угуо, например, системно или другим путем, или ех У1уо, например, путем изъятия клеток, в том числе лимфоцитов, введения в них нуклеиновых кислот и реинтродукции клеток в хозяина или совместимого реципиента.

Модифицированные полипептиды РХ могут быть доставлены в клетки и ткани путем экспрессии молекул нуклеиновых кислот. Модифицированные полипептиды РХ могут быть введены как молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие модифицированные полипептиды РХ, включая методики ех угуо и прямую экспрессию ίη У1уо. Нуклеиновые кислоты могут быть доставлены в клетки и ткани любым способом, известным специалистам в данной области. Выделенные последовательности нуклеиновых кислот могут быть включены в векторы для дальнейших манипуляций. В настоящем документе вектор (или плазмида) относится к дискретному элементу, который используется для введения гетерологичной ДНК в клетки для ее экспрессии или репликации. Выбор и использование таких носителей находится в пределах компетенции специалистов в данной области.

Способы введения модифицированных полипептидов РХ за счет экспрессии кодирующих молекул нуклеиновой кислоты включают введение рекомбинантных векторов. Вектор может быть сконструирован для сохранения в эписомном состоянии, например, путем включения в него точки начала репликации, или может быть предназначен для интеграции в хромосому клетки. Модифицированные полипептиды РХ также могут быть использованы в терапии при экспрессии генов ех У1уо с использованием невирусных векторов. Например, могут быть созданы клетки, которые экспрессируют модифицированный полипептид РХ, например, путем интеграции кодирующей модифицированный полипептид РХ нуклеиновой кислоты в геном, причем кодирующая последовательность может быть функционально связана с регуляторной последовательностью или может быть помещена под контроль регуляторных последовательностей в геноме. Затем такие клетки могут быть введены локально или системно субъекту, например пациенту, нуждающемуся в лечении.

Для генной терапии могут быть использованы вирусные векторы, включающие, например, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (ААУ), поксвирусы, вирусы герпеса, ретровирусы и другие вирусы. Векторы могут оставаться эписомными или могут интегрироваться в хромосомы субъекта, подвергающегося лечению. Модифицированные полипептиды РХ могут быть экспрессированы с помощью вируса, который вводят субъекту, нуждающемуся в лечении. Подходящие для генной терапии вирусные векторы включают аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (ААУ), ретровирусы, лентивирусы, вирус осповакцины и другие вирусы, указанные выше. Например, технология экспрессии с помощью аденовируса известна в уровне техники, и получение аденовируса и способы его введения также хорошо известны. Серотипы аденовируса доступны, например, из Американской коллекции типовых культур (АТСС, КоскуШе, Мэриленд). Аденовирус может быть использован ех У1уо, например, при выделении клеток из пациентов, нуждающихся в лечении, и их трансдукции экспрессирующим модифицированный полипептид РХ аденовирусным вектором. После соответствующего периода культивирования трансдуцированные клетки вводят субъекту локально и/или системно. Альтернативно, экспрессирующие модифицированные полипептиды РХ аденовирусные частицы выделяют и смешивают с фармацевтически приемлемым носителем для доставки терапевтически эффективного количества для профилактики, лечения или улучшения симптомов заболевания или состояния у субъекта. Как правило, аденовирусные частицы вводят в дозе от 1 частицы до 10¹⁴ частиц на 1 кг веса субъекта, как правило, от 10⁶ или 10⁸ частиц до 10¹² частиц на 1 кг веса субъекта.

В некоторых ситуациях предпочтителен источник нуклеиновой кислоты с нацеливающим на определенные клетки агентом, таким как антитело, специфичное к поверхностному белку клеточной мембраны клетки-мишени, или таким как лиганд рецептора клетки-мишени. РХ также может быть нацелен на доставку в специфические типы клеток. Например, аденовирусные векторы, кодирующие полипептиды РХ, могут быть использованы для стабильной экспрессии в неделящихся клетках, таких как клетки печени (МатдатШк и др., (2004). 1. С1ш Шуек! 113:1025-1031). В другом примере, вирусный или невирусный вектор, кодирующий полипептиды РХ, может быть трансдуцирован в выделенные клетки для последующей доставки. Дополнительные типы клеток для экспрессии и доставки РХ включают, но не ограничиваются фибробластами и эндотелиальными клетками.

Молекулы нуклеиновых кислот могут быть введены в искусственные хромосомы и другие не вирусные векторы. Искусственные хромосомы, такие как АСЕ8 (см., ^^ηάеηЪаит и др., (2004) Шскю Ас1й Кек. 32 (21):е172) могут быть сконструированы для кодирования и экспрессии изоформы белка. Искусственные хромосомы млекопитающих (МАС) представляют собой средство введения большого количества полезной генетической информации в клетку при автономной репликации и отсутствии интеграции. В отличие от других МАС система экспрессии с помощью искусственных хромосом млекопитающих на основе сателлитной ДНК (АСЕ) может быть получена йе поуо в клеточных линиях различных видов, и

- 85 028865

искусственные хромосомы могут быть легко очищены от хромосом клеток хозяина. Очищенные АСЕ млекопитающих могут быть вновь введены в различные реципиентные клеточные линии, где они стабильно поддерживаются в течение длительного периода в отсутствие селективного давления. С использованием этого подхода в клетки ЬМТК(-) и СНО были введены один или два целевых гена.

Другой способ введения кодирующей модифицированные полипептиды РХ нуклеиновой кислоты представляет собой двухстадийную технологию замены генов в дрожжах, в которой используют полный геном аденовируса (АИ2; КеШег и др., (1994) РNА§ 91: 6186-6190), клонированный в искусственной хромосоме дрожжей (УАС), и плазмиду, содержащую аденовирусные последовательности, нацеленные на конкретной район в клоне УАС, экспрессионную кассету для интересующего гена и положительные и отрицательные селективные маркеры. УАС представляют особый интерес, поскольку они позволяют включать в себя большие гены. Этот подход может быть использован для конструирования аденовирусных векторов, несущих нуклеиновые кислоты, кодирующие любой из описанных модифицированных полипептидов РХ, предназначенных для переноса генов в клетки млекопитающих или в животных.

Нуклеиновые кислоты могут быть инкапсулированы в носитель, такой как липосому, или включены в клетки, такие как бактериальные клетки, особенно ослабленные бактерии, или введены в вирусный вектор. Например, при использовании липосом для нацеливания и/или для облегчения поглощения клетками могут быть использованы белки, которые связываются с белками клеточной мембраны, ассоциированными с эндоцитозом, например капсидные белки или их фрагменты, связывающиеся с определенным типом клеток, антитела к белкам, подвергающимся интернализации, и белки, которые определяют внутриклеточную локализацию и увеличивают период полужизни внутри клеток.

В способах ех νίνο и ίη νίνο молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие модифицированные полипептиды РХ, вводят в клетки, взятые от подходящего донора или от субъекта, подлежащего лечению. Клетки, в которые для терапевтических целей могут быть введены нуклеиновые кислоты, включают, например, любой доступный предпочтительный тип клеток, подходящий для подлежащего лечению заболевания или состояния, включая, но не ограничиваясь эпителиальными клетками, эндотелиальными клетками, кератиноцитами, фибробластами, мышечными клетками, гепатоцитами, клетками крови, такими как Т-лимфоциты, В-лимфоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, мегакариоциты, гранулоциты, различными стволовыми клетками или клетками-предшественниками, включая гемопоэтические стволовые клетки-предшественники или, например, стволовые клетки, полученные из костного мозга, пуповинной крови, периферической крови, печени плода, а также других их источников.

Для лечения ех νίνο выделяют клетки донора, совместимого с подлежащим лечению субъектом, или клетки самого подлежащего лечению субъекта, в указанные выделенные клетки вводят нуклеиновые кислоты и модифицированные клетки вводят субъекту. Лечение включает прямое введение клеток, например, инкапсулированных в пористые мембраны, которые имплантируют в организм пациента (см., например, патенты США №№ 4892538 и 5283187, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки в полном объеме). Способы, пригодные для переноса нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих ίη νίίΓο, включают использование липосом и катионных липидов (например, ЭОТМА, ПОРЕ и ОС-СМ), электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, использование ДЭАЭ-декстрана и осаждение с фосфатом кальция. Способы доставки ДНК могут быть использованы для экспрессии модифицированных полипептидов РХ ίη νίνο. Такие способы включают доставку нуклеиновых кислот в липосомах и доставку голой ДНК, в том числе местную и системную доставку, например, при использовании электропорации, ультразвука и кальций-фосфатной доставки. Другие способы включают микроинъекцию, слияние клеток, перенос генов в хромосомах, опосредованный микроклетками перенос генов и слияние сферопластов.

Экспрессия модифицированных полипептидов РХ ίη νίνο может быть связана с экспрессией дополнительных молекул. Например, экспрессия модифицированных полипептидов РХ может быть связана с экспрессией цитотоксического продукта, например, в составе сконструированного вируса, или полипептид может экспрессироваться в составе цитотоксического вируса. Такие вирусы могут быть нацелены на конкретный тип клеток, который является мишенью для терапевтического воздействия. Экспрессия модифицированных полипептидов РХ может быть использована для повышения цитотоксичности вируса.

Экспрессия модифицированных полипептидов РХ ίη νίνο может включать функциональное связывание кодирующей модифицированный полипептид РХ молекулы нуклеиновой кислоты со специфичной регуляторной последовательностью, такой как специфичный для определенных клеток промотор или тканеспецифичный промотор. Модифицированные полипептиды РХ также могут быть экспрессированы в векторах, которые специфически заражают целевые клетки и/или ткани и/или специфически реплицируются в целевых клетках и/или тканях. Для селективной регуляции экспрессии модифицированного полипептида РХ можно использовать индуцибельный промотор. Пример системы регулируемой экспрессии представляет собой доксициклин-индуцибельная система экспрессии генов, которая была использована для регулируемой экспрессии рекомбинантного РХ (8гоиг и др., (2003) ТЬготЬ Наетο8ί 90 (3):398-405).

Молекулы нуклеиновой кислоты, такие как голые нуклеиновые кислоты или векторы, искусственные хромосомы, липосомы и другие переносчики, могут быть введены субъекту путем системного вве- 86 028865

дения, локального, местного и других способов введения. При системном введении ш νί\Ό молекулы нуклеиновой кислоты или переносчик, содержащий молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть нацелены на определенные клетки.

Введение также может быть прямым, таким как введение вектора или клеток, которые обычно нацелены на клетки или ткани. Например, опухолевые клетки и пролиферирующие клетки могут представлять собой клетки-мишени для экспрессии модифицированных полипептидов РХ ш νί\Ό. Используемые для экспрессии модифицированных полипептидов РХ ш νί\Ό клетки также включают клетки, аутологичные для пациента. Такие клетки могут быть изъяты у пациента, в них могут быть введены нуклеиновые кислоты для экспрессии модифицированных полипептидов РХ, а затем клетки могут быть введены пациенту, например, путем инъекции или пересадки.

Н. Терапевтические применения.

Модифицированные полипептиды РХ/РХа, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы в различных терапевтических, а также диагностических способах, в которых используется зимоген РХ или РХа. Такие способы включают, но не ограничиваются этим, способы лечения физиологических и медицинских состояний, описанных и приведенных ниже. Как правило, такие способы лечения включают способы лечения, в которых желательна увеличенная коагуляция, например увеличенный гемостатический ответ. Например, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды могут быть использованы в лечении нарушения свертываемости крови, например, у пациентов с гемофилией. Полипептиды РХ/РХа особенно подходят для лечения пациентов с дефицитами факторов свертывания крови, включая гемофилию А (дефицит фактора УШ), гемофилию В (дефицит фактора ЕХ) или гемофилию С (дефицит фактора ХЦ, но не ограничиваясь ими, поскольку они играют центральную роль в каскаде свертывания, позволяя обойти необходимость в дефицитных факторах. Модифицированные полипептиды, предусмотренные в настоящем документе, также могут быть использованы в случае хирургического вмешательства или другой травмы.

В способах, предусмотренных в настоящем документе, зимоген РХ, или форма РХа, или его каталитически активный фрагмент любых модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе, могут быть введены субъекту. Модифицированные полипептиды, предусмотренные в настоящем документе, сконструированы таким образом, чтобы сохранять терапевтическую активность, но обладать модифицированными свойствами, в особенности, увеличенной зависимостью от кофактора, увеличенной каталитической активностью, увеличенной аффинностью к субстрату, измененным гликозилированием и/или увеличенной устойчивостью к АТ-ΙΙΙ. Такие модифицированные свойства, например, могут улучшить терапевтическую эффективность полипептидов благодаря увеличенной коагулянтной активности модифицированных полипептидов РХ/РХа, которая ограничена присутствием кофактора. Измененные свойства также могут приводить к увеличению периода полужизни. Модифицированные полипептиды РХ/РХа, предусмотренные в настоящем документе, могут обладать улучшенными активностями ш νί\Ό и терапевтическими эффектами по сравнению с РХ/РХа дикого типа, включая более низкую дозировку для достижения такого же эффекта и другие улучшения в контексте введения и лечения, такие как меньшая частота введения, уменьшенные побочные эффекты и увеличенные терапевтические эффекты.

Например, недостатки практического характера ограничили клиническое применение полипептидов РХа, в том числе немодифицированных полипептидов РХа, как обходной стратегии для лечения нарушений со строны крови. Например, циркулирующие немодифицированные РХа быстро инактивируются эндогенными циркулирующими ингибиторами протеаз, при этом снижается биологический период полужизни РХ с 20-40 ч (КоЬейз е! а1. (1965) ТЬготЬ Ωίηΐΐι НаетоггЬ. 13:305-313) до меньше чем 1-2 мин (Сйе1 е! а1. (1984) 1. Вю1. СЬет. 259:6890-6895). Кроме того, введение полипептидов РХа как таковых или в фармацевтических композициях может угрожать патологической активацией свертывания крови (Сйе1 е! а1. (1984) 1. Вю1. СЬет. 259:6890-6895; ЬесЬ1ег (1999) ТЬготЬ Кез. 95(8ирр1. 1):δ39-δ50). Это подтверждается тем фактом, что введение полипептидов РХа может быть использовано для создания моделей диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС) на животных (Кгш!Ьо£ е! а1. (1997) ТЬготЬоз13 апб Наетоз!аз13. 77(2):308-311; Сбез е! а1. (1984) 1. С1т Икез! 74:2219-2225).

Модифицированные полипептиды РХ, описанные в настоящем документе, были модифицированы, чтобы преодолеть ограничения клинического применения полипептидов РХа. Чтобы предотвратить чрезмерное свертывание при введении полипептида РХ, модифицированные полипептиды РХ, описанные в настоящем документе, модифицированы таким образом, что форма РХа обладает повышенной зависимостью от кофактора (пример 4) для ограничения активности модифицированного полипептида РХа, так что полипептиды РХа обладают минимальной активностью или не обладают активностью в отсутствии активированного кофактора РУа. Ограничение активности модифицированного полипептида РХа, основанное на доступности и связывании с РУа, снижает или устраняет риск тромбоза, связанный с лечением немодифицированным полипептидом РХа. Важно отметить, что в присутствии РУа модифицированные полипептиды РХа, описанные в настоящем документе, тем не менее, демонстрируют нормальную каталитическую активность и, в некоторых случаях, демонстрируют каталитическую активность, которая превышает нормальную. Модифицированные полипептиды РХ, в том числе модифицированные

- 87 028865

полипептиды РХа, предусмотренные в настоящем документе, могут обладать улучшенными фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами, такими как улучшенный период полужизни в сыворотке, увеличенная устойчивость к ингибиторам, увеличенная каталитическая активность и/или увеличенная коагулянтная активность по сравнению с немодифицированными полипептидами РХа, при этом увеличенная зависимость от кофактора модифицированных полипептидов РХа, описанных в настоящем документе, снижает или устраняет нежелательное свертывание.

В некоторых примерах способы лечения полипептидом РХ, в том числе зимогеном РХ или формой РХа, требуют более продолжительного действия, чтобы обеспечить продолжительный терапевтический эффект. Это особенно верно в лечении пациентов с гемофилией и другими врожденными или хроническими нарушениями свертываемости крови. Как обсуждалось в других разделах в настоящем документе, период полужизни РХа составляет меньше 40 ч, отчасти из-за ингибирования ингибиторами, такими как АТ-ΙΙΙ. Модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, которые обладают устойчивостью к АТ-ΙΙΙ и/или которые являются гипергликозилированными за счет введения не нативных сайтов гликозилирования, могут иметь увеличенный период полужизни. Таким образом, такие модифицированные полипептиды РХ, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для обеспечения более длительно действующих средств для терапии расстройств свёртывания крови.

В частности, модифицированные полипептиды РХ/РХа предусмотрены для применения в способах лечения, в которых для лечения могут быть использованы РХ/РХа. Как правило, предусмотренные в настоящем документе модифицированные полипептиды РХ представляют собой прокоагулянты и могут быть использованы для лечения нарушений свертываемости крови, в том числе врожденных нарушений свертываемости крови и приобретенных нарушений свертываемости крови. Примеры заболеваний и расстройств включают расстройства свертывания крови, гематологические расстройства, геморрагические расстройства, гемофилию, дефициты факторов свертывания крови и приобретенные расстройства крови, в том числе кровотечения, связанные с травмой и хирургическим вмешательством, но не ограничиваются этим. В некоторых примерах кровотечения, подлежащие лечению полипептидами РХ/РХа, происходят в органах, таких как головной мозг, область внутреннего уха, глаза, печень, легкое, опухолевая ткань, желудочно-кишечный тракт. В других вариантах воплощения кровотечение является диффузным, таким как геморрагический гастрит и профузное маточное кровотечение, например, в послеродовом периоде у женщины.

Пациенты с нарушениями свертываемости крови, такими как, например, гемофилия А и В, часто имеют риск геморрагических осложнений в процессе хирургического вмешательства или при травме. Такие кровотечения могут проявляться в виде острого гемартроза (кровотечения в суставах), хронической гемофилической артропатии, гематом (например, мышечных, забрюшинных, подъязычных и заглоточных), гематурии (кровотечение из мочеполовых путей), кровотечений в центральной нервной системе, желудочно-кишечных кровотечений (например, кровотечения в верхней части желудочно-кишечного тракта) и внутримозгового кровоизлияния, которые также можно лечить модифицированными полипептидами РХ/РХа. Дополнительно любые кровотечения, связанные с травмой, такой как хирургическое вмешательство (например, гепатэктомия) или удаление зубов, можно лечить модифицированными полипептидами РХ/РХа.

Лечение заболеваний и состояний модифицированными полипептидами РХ/РХа может быть осуществлено с использованием любого подходящего способа введения с использованием подходящих лекарственных форм, как описано в настоящем документе, включая, но не ограничиваясь этим, путем инъекции, легочного, перорального или трансдермального введения. Лечение, как правило, осуществляют путем внутривенного болюсного введения.

При необходимости, конкретная дозировка, продолжительность и протокол лечения могут быть определены опытным путем или экстраполированы. Дозировки для зимогена РХ или полипептидов РХа дикого типа или немодифицированных зимогена РХ или полипептидов РХа могут быть использованы в качестве ориентиров для определения дозировок для модифицированного зимогена РХ или полипептидов РХа. Дозировки модифицированного зимогена РХ или полипептидов РХа также могут быть определены или экстраполированы из релевантных исследований на животных. Такие факторы как уровень активности и период полужизни модифицированного РХ/РХа по сравнению с немодифицированным РХ/РХа могут быть использованы для такого определения. Конкретные дозировки и режимы дозирования могут быть определены опытным путем, основываясь на различных факторах. Такие факторы включают вес тела индивидуума, общее состояние здоровья, возраст, активность конкретного используемого соединения, пол, диету, время введения, скорость выведения, комбинацию лекарств, тяжесть и течение заболевания, предрасположенность пациента к заболеванию и мнение лечащего врача. Активный ингредиент, полипептид, как правило, комбинирован с фармацевтически эффективным носителем. Количество активного ингредиента, которое может быть комбинировано с материалом носителя для получения лекарственной формы для однократного введения дозы или для многократного введения дозы, может варьировать в зависимости от хозяина, подвергаемого лечению, и конкретного способа введения.

В некоторых примерах неактивная зимогенная форма модифицированных полипептидов РХ может быть введена для контроля патологического кровотечения. Например, полипептиды РХ могут быть вве- 88 028865

дены в дозировках примерно от 50 до 800 единиц/мл, где удельная активность зимогена РХ составляет примерно от 20 до 130 единиц/мг белка (υ8 4501731). В случаях, в которых вводится зимогенная форма модифицированных полипептидов РХ, эндогенные комплексы теназ расщепляют введенный зимоген РХ, создавая активированный РХ (РХа), который обладает терапевтической активностью.

В некоторых примерах для контроля патологического кровотечения модифицированные полипептиды РХ, описанные в настоящем документе, могут быть введены в форме активированного РХ (РХа). Например, очищенные полипептиды РХ могут быть активированы активатором РХ из яда гадюки Рассела (Наета1о1одю ΤесЬηο1οд^ез) или другими факторами свертывания крови ш уйго перед введением, например, в процессе очистки, как описано в примере 2В. Модифицированные полипептиды РХа, предусмотренные в настоящем документе, которые модифицированы таким образом, чтобы обладать зимогенподобной активностью, могут быть введены в дозировках между 10-1000 мкг/кг, например, примерно между 10-250 мкг/кг и обычно между 10 и 75 мкг/кг, например 40 мкг/кг (см., например, опубликованную заявку на патент США номер и8 20090175931).

В других примерах модифицированные полипептиды РХ, описанные в настоящем документе, могут быть введены, являясь частью терапевтической композиции, например композиции, которая может содержать или может не содержать активаторы, которые напрямую активируют РХ. Например, терапевтическая композиция может содержать другие факторы свертывания крови, которые не являются частью комплекса нетазы, такие как фактор ΙΙ и/или протромбин. В другом примере модифицированные полипептиды РХ могут быть предусмотрены в терапевтических композициях, которые необязательно содержат активирующие РХ ферменты в активной или зимогенной формах, такие как РУН или РУПа; РРХ или РРХа. Пациентам с гемофилией с ингибиторами (8ЫгаЬа1а е1 а1. (2012) НаеторЬШа 18:94-101) полипептиды РХ могут быть введены в комбинации с активированным фактором УП (РУПа), например, в соотношении 10:1. В другом примере терапевтический концентрат, содержащий 0,58 МЕд/мл РХ и 0,29 МЕд/мл РIX, может быть использован для лечения коагулопатии, вызванной передозировкой антикоагулянтными лекарствами (01езеп е1 а1. (2009) ί. ΤЬ^οтЬοз^з апй Наетоз1аз13 7(82)^31^1 №. РР-М0-386). В других примерах с использованием модифицированных полипептидов РХ и факторов свёртывания крови ΙΙ, УП и а также белка С и белка 8 может быть получен модифицированный концентрат протромбинового комплекса.

Влияние полипептидов РХ/РХа на время свертывания крови можно контролировать с помощью любого из анализов коагуляции, известных в уровне техники, включая, но не ограничиваясь протромбиновым временем цельной крови (ΡΤ), активированным частичным тромбопластиновым временем (аΡΤΤ), активированным временем свертывания (ΑСΤ), активированным временем свертывания рекальцифицированной плазмы или временем свертывания крови Ли-Уайта.

После улучшения состояния пациента, если это необходимо, может быть введена поддерживающая доза соединения или композиции; и доза, лекарственная форма или частота введения, или их сочетание могут быть изменены. В некоторых случаях субъекту может потребоваться длительное прерывистое лечение при повторении симптомов заболевания или на основе запланированных введений. В других случаях дополнительные введения могут быть необходимы в ответ на острую потребность, такую как кровотечение, травма или хирургическое вмешательство.

Модифицированные полипептиды РХ/РХа проявляют терапевтическую активность сами по себе или в комбинации с другими агентами. В этом разделе приведены примеры применений и способов введения. Эти описанные виды терапии являются примерами и не ограничивают применения модифицированных полипептидов РХ/РХа. Ниже приведены некоторые приведенные в качестве примера состояния, при которых РХ/РХа могут быть использованы в качестве агента для лечения сами по себе или в комбинации с другими агентами.

1. Врожденные нарушения свертываемости крови.

Модифицированные зимоген РХ и полипептиды РХа, такие как полипептиды, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения врожденного нарушения свертываемости крови. Например, полипептиды РХ и РХа могут быть использованы для того, чтобы обойти любой фактор свертывания крови во внутреннем или во внешнем пути коагуляции, и для лечения коагулопатии, связанной с дефицитом такого фактора. Нарушения свертываемости крови, возникшие из-за врожденного дефицита фактора свертывания крови, включают гемофилию А (дефицит фактора УШ); гемофилию В (дефицит фактора Ш); гемофилию С (дефицит фактора ХЦ дефицит фактора УП; дефицит фактор Х; дефицит фактора ХП и семейные множественные дефициты факторов свертывания крови Ι, ΙΙ, ΙΫ, У и У! типов (РМРЭ) (см. КоЬейз, НК апй МО ВшдЬат, "01Ьег Соади1аПоп РасЮг ПеПтепаез," ΤЬ^οтЬοз^з апй НетоггЬаде., 2^пй ей. ВаШтоге, МО: ХУППатз & ХУПЕтз, 1998: 773-802). Модифицированные полипептиды РХ/РХа также могут быть использованы в лечении других врожденных заболеваний и нарушений свертываемости крови, таких как, например, болезнь фон Виллебранда, наследственное нарушение функций тромбоцитов (например, заболевание пула накопления, такое как синдромы Чедиака-Хигаши и Германски-Пудлака, дисфункция тромбоксана А2, тромбастения Гланцманна и синдром Бернара-Сулье) и наследственная геморрагическая телеангиэктазия, также известная как синдром Рандю-Ослера-Вебера, но не ограничиваясь ими.

- 89 028865

а) Гемофилия.

Модифицированные зимоген РХ и полипептиды РХа, такие как полипептиды, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения врожденных нарушений свертываемости крови, таких как гемофилия. Гемофилия представляет собой нарушение свертываемости крови, которое вызвано дефицитом одного или нескольких факторов свертывания крови. Оно характеризуется уменьшением способности к образованию тромбов в местах повреждений тканей. Врожденные Х-сцепленные гемофилии включают гемофилию А и гемофилию В, которые могут возникнуть в результате мутации (мутаций), которые приводят к дефициту РУШ и ИХ соответственно. Гемофилия А возникает с частотой 1 на 10000 человек, в то время как гемофилия В встречается с частотой 1 на 50000 человек. Гемофилию А и В далее классифицируют на легкую, умеренную или тяжелую. Если уровень фактора УШ или £Х в плазме составляет 5-25% от уровня нормально функционирующих факторов УШ или К, гемофилию классифицируют как легкую, если уровень фактора УШ или К в плазме составляет 1-5% от уровня нормально функционирующих факторов УШ или К, гемофилию классифицируют как умеренную, и уровень менее 1% означает тяжелую гемофилию. Гемофилия С, часто называемая дефицитом РХк является относительно легким и редким аутосомно-рецессивным заболеванием с частотой встречаемости примерно 1 на 100000 человек.

Пациенты с гемофилией страдают от повторяющихся кровотечений в суставах и мышцах, которые могут быть спонтанными или могут возникать в ответ на травму. Кровотечение может вызывать тяжелую острую боль, ограничивать движение и приводить к вторичным осложнениям, в том числе к синовиальной гипертрофии. Кроме того, повторяющиеся кровотечения в суставах могут вызвать хронический синовит, который может вызвать повреждение суставов, разрушение синовиальной оболочки, хрящей и костей. Кровотечение обычно лечат переливанием свежезамороженной плазмы (СЗП), заместительной терапией РХк или, в случае местного лечения, для наружных ран или ран при удалении зубов применяют лечение фибриновым клеем. Наиболее распространенным лечением гемофилии А или В является заместигельная терапия, в которой пациенту вводят РУШ или РК. Коммерчески доступны лекарственные формы, составленные на основе продуктов, полученных из плазмы крови, или рекомбинантных продуктов, при этом для лечения пациентов, ранее не подвергаемых лечению, в настоящее время препаратом выбора являются рекомбинантные белки. Эти виды терапии могут быть очень успешными, но, если у пациента вырабатываются ингибиторы к вновь вводимым фактору УШ или фактору К, могут возникнуть осложнения.

Ингибиторы представляют собой антитела ΙβΟ. в основном, подкласса Ι§04, которые вступают в реакцию с РУШ или РК и мешают их прокоагулянтной функции. Ингибиторы встречаются примерно у 1 из 5 пациентов с тяжелой формой гемофилии А. У большинства субъектов эти ингибиторы вырабатываются вскоре после введения первых инфузий фактора УШ, которые часто проводят в раннем детстве, хотя у субъектов ингибиторы вырабатываются в более позднем возрасте. Ингибиторы встречаются примерно у 1 из 15 человек с легкой или умеренной формой гемофилии А. Эти ингибиторы обычно вырабатываются в зрелом возрасте и не только разрушают введенный экзогенный РУШ, но также разрушают эндогенный РУШ. В результате легкая и умеренная формы гемофилии становятся более тяжелыми. В соответствии с силой испытываемого пациентами анамнестического ответа, когда пациенты вновь подвергаются действию РУШ, пациентов с гемофилией А с ингибиторами клинически классифицируют на пациентов, у которых наблюдается высокий ответ, и пациентов, у которых наблюдается низкий ответ. Ингибиторы встречаются примерно у 1 из 100 пациентов с гемофилией В. В большинстве случаев ингибиторы вырабатываются после первых инфузий терапевтического фактора К, и это может сопровождаться аллергическими реакциями.

Предусмотренные в настоящем документе модифицированные зимоген РХ и полипептиды РХа, а также нуклеиновые кислоты, кодирующие модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы в качестве универсальной терапии для пациентов с гемофилией, в том числе для пациентов с гемофилией с ингибиторами, и могут быть использованы для лечения состояний, сопровождающихся повышенной кровоточивостью, связанных с гемофилией. Модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы, например, для контроля или предотвращения спонтанных эпизодов кровотечения или для контроля или предотвращения кровотечения в ответ на травму или хирургические вмешательства путем усиления образования тромбина в обход необходимости в РУШа и/или РКа.

Терапевтическая эффективность модифицированных полипептидов РХ может быть протестирована, например, с использованием моделей на животных. Например, мыши, дефицитные по РУШ или РК, мыши с гемофилией, индуцированной антителами, или любые другие известные модели гемофилии могут быть подвергнуты обработке модифицированными полипептидами РХ. Для оценки эффектов модифицированных полипептидов РХ можно оценивать прогрессирование симптомов и фенотипа заболевания. Для оценки эффективности ш νί\Ό модифицированные полипептиды РХ также могут быть исследованы в моделях на животных, а также введены субъектам, например, в клинических исследованиях, в сравнении с плацебо контролями и/или контролями с использованием немодифицированных полипептидов РХ.

- 90 028865

Ь) Дефициты других факторов свертывания крови.

Модифицированные зимоген РX и полипептиды РXа, такие как полипептиды, описанные в настоящем документе, также могут быть использованы для лечения пациентов с коагулопатией, вызванной дефицитами факторов свертывания крови, отличных от РУШ и РК. Например, полипептиды РX могут быть использованы для лечения пациентов с дефицитом фактора УП, дефицитом фактора X, дефицитом фактора XIII и семейными множественными дефицитами факторов свертывания крови типов II, ГУ, У и УГ (РМРЭ) (см. КлЬейк, НК апб ΜΌ Β^пдйат. "01йег Сοади1аί^οи РасЮг ОеПаепаех" Τй^οтЬο5^5 апб Неиюггйаде. 2^пб еб. Βа1й^тο^е, ΜΌ: \УПНат5 & ^ί1Κίπ5. 1998: 773-802).

ί) Дефицит фактора УП.

Модифицированные зимоген РX и полипептиды РXа, такие как полипептиды, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для субъектов или пациентов с дефицитом фактора УП. Дефицит фактора УП представляет собой аутосомное рецессивное нарушение свертываемости крови, которое встречается приблизительно у 1 из 500000 человек. Клинически дефицит РУП может быть легким, умеренным или тяжелым, при этом легкий и умеренный дефицит характеризуется повышенным кровотечением после хирургического вмешательства и травмы. У пациентов с тяжелым дефицитом РУП (меньше 1% активности РУП) наблюдаются симптомы, аналогичные симптомам гемофилии. Например, дефицитные по РУП субъекты имеют склонность к кровотечению в суставах, спонтанным кровотечениям из носа, желудочно-кишечным кровотечениям, кровотечениям из мочевыводящих путей. Также сообщалось о внутримозговых кровоизлияниях и мышечных кровотечениях, а у женщин могут быть тяжелые меноррагии (обильные менструальные кровотечения). Лечение может быть осуществлено с помощью заместительной терапии с использованием плазмы, КПК (концентрат протромбинового комплекса) и рекомбинантного РУПа (Небпег ей а1. (1993) Тгап5Ги5юп Меб Кеу, 7:78-83; И8 2009-0291890). Модифицированные полипептиды РX, описанные в настоящем документе, действуют после РУП в каскаде свертывания и, таким образом, могут быть использованы в лечении эпизодов кровотечения и для предотвращения кровотечения при хирургических вмешательствах или инвазивных процедурах у дефицитных по РУП пациентов. Модифицированные полипептиды РX могут быть введены в зимогенной форме или в виде активированных полипептидов РX (РXа).

ίί) Дефицит фактора X.

Модифицированные зимоген РX и полипептиды РXа, такие как полипептиды, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для субъектов или пациентов с дефицитом фактора X. Дефицит фактора X представляет собой аутосомное рецессивное нарушение свертываемости крови, которое встречается приблизительно у 1 из 1000000 человек. Дефицит фактора X проявляется в виде различных фенотипов, характеризующихся кровотечением, от клинически легкой формы (6-10 МЕд/дл) до тяжелой (<1 МЕд/дл или <1% от нормальной активности РX). У пациентов, у которых активность фактора X составляет 10-15% от нормальной, наблюдаются ограниченные спонтанные кровотечения, и кровоизлияния происходят только в связи с хирургическим вмешательством или травмой (Реууапб1 ей а1. (1998) Βγ. ί. НаетаЮ1. 102:626-628; ИрПсйагб, Г апб Ό.Ι Репу, (2002) Β1οο6 Ке\ае\\'5. 16:97-110; Κο^ή5, Н.К. апб Μ.Ό. Β^идйат, "01йег ^адиН^и РасЮг ПеГ1с1епс1е5," Τй^οтЬο5^5 апб ΚιηοηΚ^, 2^пб еб. Βа1й^тο^е, ΜΌ: \УПНат5 & Убкш5, 1998: 773-802). Типичными для дефицитных по РX пациентов являются кровотечения из носа, и у 50% женщин с дефицитом фактора X наблюдаются меноррагии. Также у пациентов с тяжелыми случаями сообщалось о гемартрозе, тяжелом послеоперационном кровоизлиянии и кровоизлиянии в центральной нервной системе.

В настоящее время заместительное лечение в случае дефицита фактора X ограничивается кровью (С1го1ат1 ей а1. (1970) Тйго1пЬ Э|а1й Наеиюггй 24(1):175-184), свежезамороженной плазмой (СЗП) (С1го1атг ей а1. (1970) Βγ. ί. Наетайο1 19(2): 179-192) и комбинированной терапией, например, концентратами протромбинового комплекса (КПК), которые содержат фактор X (Ьесй1ег, Е. (1999) ТйготЬ Ке5 95(8ирр1 1):839-850). Комбинированная терапия, включающая РX, также описана в разделе I. Введение полипептида РX в настоящее время недоступно. Модифицированные полипептиды РXа, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения эпизодов кровотечения и для предотвращения кровотечения при хирургических вмешательствах или инвазивных процедурах у дефицитных по РX пациентов.

ίίί) Семейные множественные дефициты факторов свертывания крови.

Модифицированные зимоген РX и полипептиды РXа, такие как полипептиды, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения пациентов с коагулопатией, вызванной наследственными дефицитами множества факторов свертывания крови, также называемой семейными множественными дефицитами факторов свертывания крови (НИРО). Существует шесть типов РΜР^, классификация которых основана на типе дефицитных факторов свертывания. ИНРО I типа возникает из-за дефицита факторов У и УШ; СПРЭ II типа возникает из-за дефицита факторов УШ и IX; у пациентов с СПРЭ III типа наблюдается дефицит витамин К-зависимых факторов свертывания крови (т.е. факторов II, УП, IX и X); СПРЭ ЙУ типа возникает из-за дефицита факторов УП и УШ; дефицит факторов УШ, IX и XI приводит к СПРЭ У типа; и дефицит факторов IX и XI классифицируют как СПРЭ У типа. СПРЭ II и и типов представляют собой дефициты факторов свертывания крови, которые функционируют до РX в

- 91 028865

каскаде свертывания, и, таким образом, лечение описанными в настоящем документе модифицированными полипептидами РХ как таковыми или в комбинации с другими способами лечения может принести пользу при этих расстройствах. Полипептиды РХ, описанные в настоящем документе, могут быть использованы для лечения других типов РМРО, обычно являясь частью комбинированной терапии. Только РМЕЭ I и III типов были широко охарактеризованы. Клинические проявления ΕΜΕΌ III типа варьируют от отсутствия симптомов до тяжелой геморрагии в зависимости от степени дефицита или дисфункции фактора. Дефекты гамма-глутамил- карбоксилазы и витамин К-эпоксид-редуктазного комплекса приводят к дефектам стадии карбоксилирования в процессе синтеза РП, РУН, РЕХ и РХ, что может приводить к комбинированным дефицитам этих четырех факторов (Вгеппег е1 а1. (1998) В1ооФ. 92:4554-4559; 01ФепЬигд е1 а1. (2000) ТЬготЬ Наеток1. 84:937-941). ΕΜΕΌ III типа наследуется по аутосомно-рецесивному типу. Для некоторых индивидуумов с ΕΜΕΌ III типа наблюдается ответ на большие дозы витамина К (ОоМктЪЬ е1 а1. (1982) 1 СИп ^екЕ 69:1253-1260). Тем не менее, лечение эпизодов кровотечения требует терапии для замещения дефицитных факторов (КоЬейк, Н.К. апФ Μ.Ό. ВшдЬат, "01Ьег Соади1аФоп Рас1ог Оейаепшек," ТЬготЬок15 апФ НетоггЬаде, 2^пФ еФ. ВаШтоге, ΜΌ: ^ФНатк & АНЕтк, 1998: 773-802). Таким образом, модифицированные полипептиды РХ, описанные в настоящем документе, могут быть использованы как часть схемы лечения некоторых типов ΕΜΕΌ.

с) Другие.

Другие врожденные нарушения свертываемости крови для обеспечения коагуляции можно лечить полипептидами РХ, в том числе зимогеном РХ или полипептидами РХа, предусмотренными в настоящем документе. Спонтанные и связанные с хирургическим вмешательством эпизоды кровотечения, связанные с болезнью фон Виллебранда (ννΌ), можно лечить, используя модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе. ν\νϋ представляет собой нарушение свертываемости крови, вызванное дефектом или дефицитом белка свертывания крови, фактора фон Виллебранда (ννΤ), и, по оценкам, встречается в 1-2% населения. Субъекты с ννΌ могут легко получать гематомы, имеют повторяющиеся кровотечения из носа, имеют кровотечение после удаления зуба, тонзиллэктомии или другого хирургического вмешательства, и у женщин-пациентов могут быть увеличенные менструальные кровотечения. Модифицированные полипептиды РХ могут быть использованы для облегчения спонтанного и связанного с хирургическим вмешательством кровотечения у пациентов с ννΌ.

Другие связанные с тромбоцитами нарушения свертываемости крови, такие как, например, тромбастения Гланцманна и синдром Германски-Пудлака, также связаны с пониженной эндогенной коагулянтной активностью. Избыточные спонтанные или связанные с хирургическим вмешательством кровотечения у пациентов со связанными с тромбоцитами нарушениями свертываемости крови, также можно контролировать терапевтическими дозами модифицированных полипептидов РХ. Например, пациента с тромбастенией Гланцманна, перенесшего хирургическое вмешательство, можно лечить модифицированными полипептидами РХ до хирургического вмешательства, в процессе хирургического вмешательства и/или после хирургического вмешательства для предотвращения большой потери крови. Модифицированные полипептиды РХ могут быть введены в виде неактивного зимогена или в виде активированных полипептидов РХ (РХа).

2. Приобретенные нарушения свертываемости крови.

Нарушения свертываемости крови также могут быть приобретенными, а не врожденными. Модифицированные зимоген РХ и полипептиды РХа, такие как полипептиды, описанные в настоящем документе, также могут быть использованы для лечения приобретенных нарушений свертываемости крови. Приобретенные нарушения свертываемости крови включают коагулопатию в результате хирургических процедур или обусловленную лекарствами коагулопатию, например тромбоцитопению из-за химиотерапии. В одном из примеров модифицированные полипептиды РХ могут быть использованы в виде антидота при передозировке антикоагулянтным терапевтическим агентом (И8 2011/0015128). Модифицированные полипептиды РХ также могут быть использованы для лечения приобретенных дефицитов факторов свертывания крови, таких как приобретенный дефицит фактора Х из-за заболевания печени, дефицита витамина К. Другие приобретенные нарушения свертываемости крови, для которых может быть полезно лечение модифицированным РХ, включают гемолитический уремический синдром, аллергическую пурпуру (пурпура Геноха-Шенлейна) и диссеминированное внутрисосудистое свертывание (ДВС).

В одном из примеров модифицированные полипептиды РХ/РХа могут быть использованы для лечения эпизодов кровотечения из-за травмы или хирургического вмешательства, или низкого количества или активности тромбоцитов у субъектов. Например, модифицированными полипептидами РХ/РХа можно лечить гемодилюционную коагулопатию, например, возникшую в результате переливания крови, или острую травматическую коагулопатию после травмы. Примеры способов лечения пациентов, подвергающихся хирургическому вмешательству, включают лечение для предотвращения кровоизлияния и включают лечение до хирургического вмешательства, в процессе хирургического вмешательства или после хирургического вмешательства, такого как, например, хирургическое вмешательство на сердце, ангиопластика, хирургическое вмешательство на легких, органах брюшной полости, хирургическое вмешательство на позвоночнике, хирургическое вмешательство на головном мозге, сосудистая хирургия, стоматологическая хирургия или хирургическое вмешательство по трансплантации органов, в том числе

- 92 028865

трансплантация костного мозга, сердца, легких, поджелудочной железы или печени.

a) Тромбоцитопения вследствие химиотерапии.

Химиотерапия, например, при лейкемии и других раковых заболеваниях может привести к тромбоцитопении. Тромбоцитопения, вероятно, развивается из-за прекращения образования тромбоцитов в костном мозге больных, получающих химиотерапию, и обычно наступает через 6-10 дней после лечения. Лечение приобретенной тромбоцитопении, как правило, состоит в переливании тромбоцитов, эритроцитов или плазмы, что служит для предотвращения любых ненормальных спонтанных кровотечений, которые могут быть результатом дефицита тромбоцитов.

Кровотечения у пациентов с вызванной химиотерапией тромбоцитопенией или у пациентов с любой другой приобретенной или врожденной тромбоцитопенией также можно лечить введением терапевтических количеств модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе. Например, пациенту с тромбоцитопенией при неконтролируемом кровотечении, например, в желудочнокишечном тракте для остановки кровотечения может быть введен внутривенный болюс терапевтического количества полипептида РХ. Модифицированные полипептиды РХ могут быть введены в форме неактивных зимогенов или в виде активированных полипептидов РХ (РХа).

b) Другие коагулопатии.

Другие приобретенные коагулопатии также можно лечить с помощью модифицированных полипептидов РХ, предусмотренных в настоящем документе. Коагулопатии могут быть следствием состояний, включающих, но не ограничивающихся молниеносной печеночной недостаточностью (РНР, например, вызванной гепатотоксичными лекарствами, токсинами, нарушениями метаболизма, инфекционными заболевания и ишемией), другими заболеваниями печени, включая цирроз и заболевания, связанные с болезнью Вильсона, дефицитом витамина К (например, вызванным лечением антибиотиками или диетой), гемолитическим уремическим синдромом, тромботической тромбоцитопенией (ТТЦ) и диссеминированным внутрисосудистым свертыванием (ДВС). Обычные способы лечения, как правило, включают переливание плазмы, красных кровяных телец (эритроцитов) или тромбоцитов, но могут быть неудачными.

В одном из примеров модифицированные полипептиды РХ для предотвращения кровотечения можно вводить пациенту с РНР, перенесшему инвазивную процедуру. Обычное лечение свежезамороженной плазмой (СЗП) часто не приносит эффекта и может потребовать большого количества плазмы, что приведет к перегрузке и анасарке (генерализованной инфильтрации подкожной соединительной ткани отечной жидкостью). Лечение терапевтическими количествами модифицированных полипептидов РХ внутривенным болюсом во время, до и/или после хирургического вмешательства, такого как, например, биопсия печени или трансплантация печени, может предотвратить кровотечение и установить гемостаз у больных с РНР. Для определения эффективности лечения у пациента может контролироваться ΡΤ крови.

В другом примере РХ могут быть введены пациенту с тяжелым кровотечением, связанным с коагулопатией, таким как, например, тяжелое внутрибрюшинное кровотечение после кесарева сечения, связанное с дисфункцией печени и ДВС, если пациент не отвечает на традиционные трансфузионные инфузии. Более того, модифицированные полипептиды РХ могут быть использованы для лечения коагулопатии у новорожденных и пациентов детского возраста. Модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, обладают повышенной зависимостью от РУа для увеличенной коагулянтной активности по сравнению с немодифицированными полипептидами РХ и увеличенным периодом полужизни, и поэтому они могут быть введены, например, в более низких дозах, реже и с меньшими нежелательными реакциями. Модифицированные полипептиды РХ могут быть введены в неактивной зимогенной форме для активации эндогенными ферментами или в виде активированных полипептидов РХ (РХа).

c) Кровотечения при трансплантации.

Тяжелые кровотечения после трансплантации костного мозга (ТКМ) и трансплантации стволовых клеток (ТСК) являются относительно распространенными и опасными для жизни осложнениями, связанными с этими процедурами, возникающими из-за уменьшения количества тромбоцитов. Например, диффузное альвеолярное кровотечение (ДАГ) является легочным осложнением ТКМ, затрагивающим 1-21% пациентов при трансплантации, при этом смертность достигает 60-100%. Обычное лечение таких кровотечений включает лечение кортикостероидами и переливание плазмы, тромбоцитов и/или эритроцитов, хотя такое лечение является в значительной степени неудачным с общей смертностью примерно 50% (Нюкк и др., (2002) Βοικ Магго\у Тгапкр1 30:975-978). Для лечения ДАГ и установления гемостаза может быть выполнено введение РХ внутривенным болюсом при одновременном лечении с помощью введения кортикостероидов и/или инфузии тромбоцитов или без них. Модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, проявляют повышенную зависимость от РУа для увеличенной коагулянтной активности по сравнению с не модифицированными полипептидами РХ и увеличенный период полужизни и поэтому могут быть введены, например, в более низких дозах, реже и с меньшим количеством побочных реакций. Модифицированные полипептиды РХ могут быть введены в форме неактивных зимогенов для активации эндогенными ферментами или в виде активированных полипептидов РХ (РХа).

- 93 028865

б) Кровотечения, вызванные антикоагулянтной терапией.

У пациентов, проходящих антикоагулянтную терапию для лечения таких состояний как тромбоэмболия, могут проявляться кровотечения при остром введении антикоагулянтов, таких как варфарин, гепарин, фондапаринукс и ривароксабан, или развиваться геморрагические нарушения в результате долгосрочного использования таких способов лечения. Лечение кровотечений обычно включает введение прокоагулянтов, таких как витамин К, плазма, экзогенный ИХ, и протаминов для нейтрализации гепарина. Для нейтрализации действия антикоагулянтов, повышения РТ, аРТТ и/или других маркеров коагуляции и установления гемостаза также может быть введен экзогенный РХ, отдельно или в виде фармацевтической лекарственной формы (ОгиЬег е1 а1., 2008 Б1ооб. 112:АЬк1гас1 3825). Модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, могут быть использованы в терапии для остановки кровотечений у пациентов с приобретенными в результате антикоагулянтой терапии нарушениями свертываемости крови. Модифицированные полипептиды РХ могут быть введены в форме неактивных зимогенов для активации эндогенными ферментами или в виде активированных полипептидов РХ (РХа). Для более быстрого лечения модифицированные полипептиды, как правило, вводят в виде активированных полипептидов РХ (РХа).

е) Приобретенная гемофилия.

Ингибиторы фактора νΙΙΙ могут спонтанно образоваться у здоровых субъектов, что приводит к состоянию, известному как "приобретенная гемофилия". Приобретенная гемофилия представляет собой редкое состояние с ежегодной встречаемостью 0,2-1,0 случаев на миллион населения. Аутоантитела в основном представляют собой рО4 антитела, которые при связывании с ΕνΙΙΙ ингибируют его активность, препятствуя расщеплению тромбина, взаимодействию с фактором Виллебранда и/или связыванию фосфолипидов. Это приводит к опасным для жизни кровоизлияниям у приблизительно 87% пациентов, страдающих этим состоянием. Обычные места кровотечения включают кожу, слизистые оболочки, мышцы и забрюшинное пространство в отличие от пациентов с наследственной гемофилией, у которых кровотечения локализованы преимущественно в суставах и мышцах. Для контроля кровотечений приобретенную гемофилию можно лечить с помощью концентрата активированного протромбинового комплекса или рекомбинантного активированного фактора νΙΙ (Nονοкеνеη®, "Ново Нордиск"). Модифицированные полипептиды РХ могут быть введены в форме неактивных зимогенов для активации эндогенными ферментами или в виде активированных полипептидов РХ (РХа). Для применений, требующих более быстрого действия, например, во время хирургического вмешательства, модифицированные полипептиды могут быть введены в виде активированных полипептидов РХ (РХа).

3. Кровотечения при травме и хирургическом вмешательстве.

Модифицированные полипептиды РХ могут быть использованы в качестве терапии для лечения кровотечения, связанного с периоперационной и травматической потерей крови у субъектов с нормальными системами свертывания крови. Например, модифицированные полипептиды РХ могут быть введены пациенту для обеспечения коагуляции и снижения потери крови, связанной с операцией, и также для снижения потребности в переливании крови.

В некоторых примерах модифицированные полипептиды РХ могут быть введены пациентам с нормальной коагуляцией, подвергающимся различным типам хирургических вмешательств, для осуществления быстрого гемостаза и предотвращения потери крови. Лечение модифицированными РХ может обеспечить гемостаз в месте хирургического вмешательства и снизить или предотвратить потерю крови, тем самым снижая или отменяя необходимость в переливании крови. Некоторые модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, обладают улучшенными свойствами, такими как увеличенный период полужизни, увеличенная устойчивость к циркулирующим ингибиторам протеаз и увеличенная каталитическая активность, и поэтому могут быть введены, например, в более низких дозах, реже и с меньшими нежелательными реакциями. Модифицированные полипептиды РХ могут быть введены в неактивной зимогенной форме для активации эндогенными ферментами или в виде активированных полипептидов РХ (РХа).

Модифицированные полипептиды фактора Х, такие как полипептиды, описанные в настоящем документе, также могут быть использованы для обеспечения коагуляции и предотвращения потери крови у субъектов с травматическим повреждением. Травма определяется как повреждение живой ткани внешним агентом и является четвертой по значимости причиной смерти в Соединенных Штатах. Травмы классифицируют либо как тупые травмы (приводящие к внутренней компрессии, повреждению органа и внутреннему кровоизлиянию), либо как проникающие травмы (в результате воздействия агента, проникающего в тело и разрушающего ткани, сосуды и органы, что приводит к внешнему кровоизлиянию). Травму могут вызвать несколько событий, включая, но не ограничиваются ими, транспортные происшествия (причиняют тупые и/или проникающие травмы), огнестрельные раны (причиняют проникающие травмы), колющие раны (причиняют проникающие травмы), происшествия с производственным оборудованием (причиняют проникающие и/или тупые травмы) и падение со значительной высоты (причиняют проникающие и/или тупые травмы). Неконтролируемое кровоизлияние в результате травмы является причиной большинства смертей, связанных с травмой.

Диффузная коагулопатия является относительно распространенным осложнением у пациентов с

- 94 028865

травмами, встречающимся примерно у 25-36% субъектов.

Коагулопатия может развиваться спустя короткое время после травмы в результате целого ряда факторов, таких как разбавление и потребление факторов свертывания крови и тромбоцитов, фибринолиз, ацидоз и гипотермия. Традиционная тактика ведения пациентов включает заместительную терапию путем переливания тромбоцитов, свежезамороженной плазмы (СЗП), эритроцитов и/или криопреципитата, корректировку ацидоза и лечение гипотермии. Эти шаги часто являются недостаточными, чтобы остановить кровотечение и предотвратить смерть. Лечение путем введения терапевтических количеств РХ как такового или в комбинации с другими терапевтическими агентами может способствовать коагуляции и снижать потерю крови у пациентов с травмой. Например, лечение, включающее полипептид РХ, увеличивает коагуляцию и прочность конечного сгустка в моделях дилюционной коагулопатии на свиньях (Оюкпейе е! а1. (2010) I. Тгаита 68(5):1151-1157; МШепесЬпег е! а1. (2011) I ΤЬ^οтЬοк^к апй Наетοкίак^к. 9(4):729-737). Модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, обладают повышенной зависимостью от РУа для увеличенной коагулянтной активности по сравнению с немодифицированными полипептидами РХ и увеличенным периодом полужизни, и поэтому могут быть введены, например, в более низких дозах, реже и с меньшими нежелательными реакциями. Модифицированные полипептиды РХ могут быть введены в неактивной зимогенной форме для активации эндогенными ферментами или в виде активированных полипептидов РХ (РХа).

Ι. Комбинированная терапия.

Любые модифицированные полипептиды РХ, описанные в настоящем документе, могут быть введены в комбинации с другими терапевтическими агентами или процедурами, до других терапевтических агентов или процедур, периодически или после других терапевтических агентов или процедур, включая, но не ограничиваясь этим, с другими биологическими агентами, низкомолекулярными соединениями и хирургическим вмешательством. Для любого заболевания или состояния, включая все заболевания или состояния, приведенные в качестве примера выше, для которых показан или применялся РХ (в том числе РХа и гРХа) и для которых доступны другие агенты и способы лечения, РХ в зимогенной или активированной форме может быть использован в комбинации с другими агентами и способами лечения. Таким образом, модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, в зимогенной или активированной форме могут быть использованы аналогичным образом. В зависимости от заболевания или состояния, подлежащего лечению, примеры комбинаций включают, но не ограничиваются этим, комбинацию с другими очищенными из плазмы или рекомбинантными факторами свертывания крови, прокоагулянтами, такими как витамин К, производное витамина К и ингибиторы белка С, плазмой, тромбоцитами, эритроцитами и кортикостероидами.

В некоторых примерах кровь и свежезамороженная плазма (СЗМ) являются источниками заместительной терапии фактором Х для минимального увеличения уровней фактора Х (О1го1аш1 е! а1. (1970) ТЬготЬ Οί;·ιΐΗ Наетο^^Ь 24(1): 175-184; О1го1ат1 е! а1. (1970) Βγ I НаетаГО1 19(2): 179-192). Тем не менее, лечение дефицита фактора Х, как правило, осуществляют лечением концентратами протромбиназного комплекса (КПК), которые содержат фактор Х наряду с РП, РУН и РЕХ (ЬесЬ1ег, Е. (1999) ТЬготЬ Кек 95(8ирр1 1):839-850). Такие концентраты являются коммерчески доступными, например, Κοτινι^ 80 (Си!!ег, И8А); РгоГПшпе НТ (А1рЬа, И8А); Ргор1е\ Т (Β;·ι\^γ Ну1апй, И8А; или ΒеЬи1^и УН ртти^, И8А). Также доступны активированные КПК, которые содержат активированный РХ (РХа), например АиГОр1ех (Βηχ^ι; Ну1апй, И8А) и РЕША ртти^, И8А). Как правило, гемостаз достигается, когда послеоперационные уровни РХ составляют 10-20 МЕд/дл (КтдЬ! е! а1. (1985) 25(1):78-80; Βο1!οи-Маддк,

Γ4Β. ТЬе гаге сοади1а!^οи Шюгйегк. Тгеа!теп! οΓ ЬетοрЬ^1^а. МапсЬек!ег: ΑοιΉ Рейега!юп οΓ НетοрЬ^1^а; 2006). Концентраты ПХ и РХ также использовались для лечения дефицита фактора Х. Тем не менее, с использованием КПК, активированных КПК и других концентратов, содержащих немодифицированные полипептиды РХ, связаны случаи тромбоэмболии (ЬесЬ1ег (1999) ТЬготЬ Кек. 95(8ирр1 1):839-850). Случаи тромбоэмболии, связанные с РХ-содержащими концентратами, могут быть уменьшены или устранены путем использования модифицированных полипептидов РХ, таких как полипептиды, описанные в настоящем документе.

Модифицированные полипептиды РХ, предусмотренные в настоящем документе, обладают увеличенной зависимостью от РУа для увеличенной коагулянтной активности по сравнению с немодифицированными полипептидами РХ и увеличенным периодом полужизни, поэтому могут быть введены, например, в более низких дозах, реже и с меньшими нежелательными реакциями. Модифицированные полипептиды РХ могут быть введены в неактивной зимогенной форме для активации эндогенными ферментами или в виде активированных полипептидов РХ (РХа).

I. Изделия и наборы.

Фармацевтические соединения модифицированных полипептидов РХ или нуклеиновые кислоты, кодирующие модифицированные полипептиды РХ, или их производные, или их биологически активные части, могут быть упакованы в виде изделий, содержащих упаковочный материал, фармацевтическую композицию, которая является эффективной для лечения гемостатического заболевания или расстройства, и этикетку, на которой указано, что модифицированный полипептид РХ или молекула нуклеиновой кислоты предназначены для лечения гемостатического заболевания или расстройства.

- 95 028865

Изделия, предусмотренные в настоящем документе, содержат упаковочные материалы. Упаковочные материалы для применения в упаковке фармацевтических продуктов хорошо известны специалистам в данной области техники. См., например, патенты США №№ 5323907 и 5052558, каждый из которых включен в настоящий документ во всей своей полноте. Примеры фармацевтических упаковочных материалов включают, но не ограничиваются этим, блистерные упаковки, бутылки, тюбики, ингаляторы, помпы, мягкие контейнеры, флаконы, контейнеры, шприцы, сосуды и любой упаковочный материал, подходящий для выбранной лекарственной формы и предполагаемого способа введения и лечения. Широкий спектр лекарственных форм соединений и композиций, предусмотренных в настоящем документе, предполагает множество вариантов лечения для любого гемостатического заболевания или расстройства.

Модифицированные полипептиды РХ и молекулы нуклеиновых кислот также могут быть предусмотрены в виде наборов. Наборы включают фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе, и средство для введения. Например, модифицированный РХ поставляться с устройством для введения, таким как шприц, ингалятор, стаканчик для дозирования лекарств, пипетка или аппликатор. Набор может необязательно включать инструкции по применению, включающие дозировки, режимы дозирования и инструкции по способам введения. Наборы также могут включать фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе, и средство для диагностики. Например, такие наборы могут включать средство для измерения концентрации, количества или активности РХ или регулируемой РХ системы у субъекта.

К. Примеры.

Следующие примеры включены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1. Клонирование и экспрессия полипептидов фактора Х.

A. Клонирование гена фактора Х в вектор рРи8Е.

Нуклеиновую кислоту, кодирующую 488-аминокислотный человеческий полипептид предшественник фактора Х (РХ) (Р00742; приведен в 8ЕС) ГО N0: 1), клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих рРи8Е-Ы§О1-Рс2 (сокращается в настоящем документе как рРи8Е) (Ίηνί\ΌθΐΛΐ; 8РС) ΙΟ N0: 266), который содержит составной промотор, ЬЕР1-НТЙУ, содержащий коровый промотор фактора элонгации-1а (ЕР-1а), а также сегмент К и часть последовательности ϋ5 (Κ-ϋ5') длинного концевого повтора вируса Т-клеточного лейкоза человека (ОТРУ) типа 1. Набор йт-Рикиот СР Огу-Ооуш РСК С Ротищ Κΐί (СРот1ес1т) использовали в соответствии с инструкцией производителя.

Для процесса клонирования методом Ш-Рикюи плазмиду рРи8Е без Рс части человеческого иммуноглобулина 1 (ЫдО1) линеаризовали с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) с прямым праймером рРи8Е-Асс-Р1: ОТОСТАОСТООССАОАСАТОАТААО (8ЕЦ ГО N0: 267) _{и обратнь1м}праймером рРи8Е-Асс-К3: САТСОТООСССТССТТСОССОСТСАТС (8Е<3 ГО N0: 268) и использовали в качестве акцепторной ДНК. Полноразмерную кодирующую последовательность РХ амплифицировали с помощью ПЦР с использованием кДНК человеческого РХ (0г1ЦСИс, КосксШе, МО) в качестве матрицы с прямым праймером РХ-уЛкр-йп'П'о-Р 1:

ССААССАСССССАССАТСОООСОСССАСТОСАССТС (8ЕЦ ГО N0: 269) _и обратным праймером

_РX-Iην^_Vο_-К1: ТСТСТССССАССТАССАСТСАСТТТААТООАОАСОАСО (8Е0 ГО N0: 270).

Для двух последовательностей донорных праймеров для амплификации РХ, приведенных выше, стартовый кодон 'АТО' РХ и комплементарная последовательность 'ТОА' стоп-кодона выделены подчеркиванием в последовательностях прямого и обратного праймеров соответственно. Области гомологии длиной 18 нт, не отжигаемый 5' хвост праймера для клонирования методом Ш-Рикюи выделены жирным.

Использовали стандартные условия реакции ПЦР и термоциклирования в для набора Рйикюи I 1щ1тРЧбеШу Мак1ег М1х Κΐί (\е\у РчщРитб Вю1аЪк), как рекомендовано производителем. Как акцепторный, так и донорный ПЦР продукт расщепляли далее рестрикционным ферментом ОрМ для удаления примесей бат-метилированной матрицы для ПЦР из Е. сой. Их смешивали друг с другом и далее проводили реакцию слияния Ш-Рикюи с использованием условий, указанных поставщиком.

Суперкомпетентные клетки Е. сой ХЙ1 В1ие трансформировали реакционной смесию (81га1адепе). Колонии отбирали на чашках с агаром 2хУТ, в который было добавлено 25 ррт зеоцина (Нп'П'оСтсп). Плазмидную ДНК выделяли из отобранных клонов и секвенировали для подтверждения правильности клонирования. Клон, содержащий правильную последовательность, использовали для дальнейших исследований.

B. Конструирование плазмиды РХ с сигнальной и пропептидной последовательностями протромбина.

Для замены нативных сигнальной и пропептидной последовательностей РХ на последовательности протромбина плазмиду, полученную в примере 1А выше, линеаризовали с помощью ПЦР с прямым праймером Р10-Рго-Асс-Р1: ОССААТТССТТТСТТОААОАОАТО (8ЕЦ ГО N0: 271) _и обратным праймером рРи8Е-Асс-К3: САТООТООСССТССТТСОССООТОАТС (8Е<? Ю N0: 272) и использовали в качестве акцепторной ДНК. Нуклеотидные последовательности сигнальной и пропептидной последовательностей протромбина (приведена в виде аминокислот 1-43 в 8ЕС) ГО N0: 415 и приведена в 8ЕС) ГО

- 96 028865

N0: 273) амплифицировали с помощью ПЦР с использованием кДНК человеческого протромбина (0γϊдепе) в качестве матрицы с прямым праймером РП-8Р+Рго-Р10Асс-Р1:

ССААССАСССССАССАТСОСОСАСОТССОАООСТТО (8ЕЦ ГО N0: 274) _и обратным праймером Р11_-8Р+_Рг_{о-Р10Асс-К1:} ТТСААСАААССААТТСССТСОССОСАСССОСТООАОСАО (8ЕЦ ГО ΝΟ: 275).

Для двух последовательностей донорных праймеров для амплификации протромбина, приведенных выше, области гомологии длиной 18 нуклеотидов, не отжигаемый 5' хвост праймера для клонирования методом Ы-Ризюп выделены жирным, стартовый кодон 'АТС' протромбина выделен подчеркиванием в последовательности прямого праймера. Стандартные ПЦР реакции и реакции Пйлжгои проводили, как описано выше, и один клон с правильной последовательностью был выбран для использования в качестве матрицы для получения вариантов РХ.

С. Получение вариантов РХ.

Варианты РХ были получены с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза С)шкСНануе' 1 πρίιΐηίηρ 811е-01гее1ей Миίадеηеδ^δ Κΐί (8Ца1адел1еу) в соответствии с инструкциями производителя с использованием специально сконструированных олигонуклеотидов, которые служили в качестве праймеров для включения запланированных мутаций во вновь синтезированную ДНК. Комплементарные праймеры, которые включают нужные мутации, удлиняли в процессе циклизации, используя в качестве матрицы очищенную, двухцепочечную суперскрученную плазмидную ДНК, полученную в примере 1В, содержащую клонированную последовательность кДНК РХ. Удлинение праймеров приводит к включению нужных мутаций во вновь синтезируемые цепи и приводит к получению мутантной плазмиды с одноцепочечными разрывами, расположенными уступом. После амплификации продукт мутагенеза расщепляли рестрикционым ферментом Ορη! для удаления йат-метилированных исходных цепей плазмидной ДНК из Е. сой. Суперкомпетентные клетки Е. сой ХР1 В1ие (8Ца1ауее1еу) далее трансформировали ДНК с последующим отбором на чашках с агаром 2χΥΓ, в который было добавлено 25 ррт зеоцина (ТпуггоОсп). Плазмидную ДНК выделяли из отобранных клонов и секвенировали, чтобы подтвердить включение мутации (мутаций) в нужное место (места) гена РХ.

Нуклеотидная последовательность одного из олигонуклеотидов из каждой пары комплементарных праймеров, использованной для получения вариантов РХ, приведена в табл. 15 ниже. Последовательности триплетов нуклеотидов, которые кодируют замещающую аминокислоту, показаны заглавными буквами. Например, для получения варианта РХ, содержащего замену И6Ь (Ι16Ρ согласно нумерации химотрипсина; 8ЕС) ГО N0: 416), праймер РХ-И6Р-РогАагб и праймер, являющийся комплементарным РХН6Р-1’о1'\уа1'с1, использовали для замещения последовательности 'АТС дикого типа длиной 3 Ър на мутантную последовательность 'СТС' длиной 3 Ър.

В табл. 15 ниже приведены олитонуклеотидные праймеры, использованные для мутагенеза РХ. Мутантные триплеты показаны заглавными буквами, и названия праймеров соответствуют мутациям согласно нумерации химотрипсина, полученным в результате мутагенеза с использованием этого праймера.

- 97 028865

Таблица 15

Олигонуклеотидные праймеры

Название праймера (Нумерация по химотрипсину)	Последовательность праймера (5' к 3')	8Е<2 ГО ΝΟ
РХ-116Р-Рог	§асаасаасс1сасса§§СТ0§г§§§а§§сса§§аа1§с	276
РХ-У17А-Рог	Саасаасс1сасса§§а1сОСС§да§§сса§§аа1§саа§	277
РХ-У 171-Рог	саасс1сасса§§а1сАТС§§а§§сса§§аа1§с	278
РХ-У17Р-Рог	саасс1сасса§§а1:сСТ0§§а£§сса££аа1§с	279
РХ-У17Т-Рог	саасс1сасса§£а1сАСС£§а££сса£§аа1§с	280
РХ-У 178-Рог	саасс1сасса§§а1:сА0С§§а££сса§§аа1:£с	281
РХ-У17Р-Рог	саасс1:сасса£§а1:сССС££а§§сса££аа1:§с	282
РХ-018 А-Рог	асса£§а1с§1:£0СС§£сса§£аа1:§саа§£ас	283
РХ-О18Р-РОГ	асса££а1с£1£ССС§£сса££аа1£саа££ас	284
РХ-0188-Рог	асса§§а1:с§1§А0С££Сса£§аа1:§саа££ас	285
РХ-С18У-Рог	асса§£а1с£4£ОТО££сса§£аа1§саа£§ас	286
РХ-С18Т-Рог	асса§§а!:с§1:§АСС§£сса£§аа1§саа§£ас	287
РХ-019 А-Рог	сасса§£а1:с§1£§£аОССса££аа1:£саа£§ас	288
РХ-С19У-Рог	сасса§£а1с§1£££аОТСса££аа1£саа§£ас	289
РХ-О19К-Рог	сасса§§а1с§1§§§аСООса§§аа1§саа§§ас	290
РХ-С19К-Рог	сасса££аГс§Г§§§аАА0са§§аа1§саа£§ас	291
РХ-С19Р-Рог	сасса££а1с§1£££аСССса££аа1£саа££ас	292
РХ-С19Н-РОГ	сасса§§а1;с§1§§§аСАСса§§аа1:£саа§§ас	293
ΡΧ-ϋ194Ν-ΡθΓ	§а1§сс1§сса§§££ААСа§с§§§§§ссс§сас	294
РХ-Ц 1948-Рог	§а1£сс1§сса§££§А0Са£с§§£ё£ССС£сас	295
РХ-Р328/С40Н-РОГ	§1£{ссс1:£§са§§ссАОСс1:са1саа1:§а§£аааас£а£САСйс1£1:§ £1_ёёаасс	296
РХ-Р21 А-Рог	£а1с£1ё££аё£Сса£0СС1£саа£§ас£ё££аё	297
РХ-Р218-Рог	ёа1с^ёё§а£ёсса£А0С1£сааё§асё£ёёаё	298
РХ-Р21У-Рог	£а1с£1ёё§а££сса£0Т01£саа££ас££££а£	299
РХ-К23 8-Рог	ё£а§£сса££аа1§сАСС£ас££§£а£1£1ссс	300
РХ-К143А-Рог	£1§а§с§£сйс§§§ОССасссас£а§аа§§§с	301
РХ-К 143 8-Рог	§1§а§с§§с«с§££А0Сасссас§а£аа£§ёс	302
РХ-К143Т-Рог	£1£а§с££сКс£§£АССасссас£а£аа£§£с	303
РХ-К143У-Рог	§1£а£С£ёсйс£££ОТОасссас£а£аа£££с	304
РХ-К143р-Рог	§1£а£С££сйс§ё£СА0асссас£а£аа£££с	305
ΡΧ-Κ143Ν-ΡΟΓ	§1£а£с§£сйс£££ААСасссас£а£аа£££с	306
РХ-К143М-Рог	£1£а£С££сйс£§£АТ0асссас£а£аа£££с	307
РХ-К143К-Рог	£1§а§с§дсКс§§§ААОасссас§а£аа§§§с	308
ΡΧ-Κ143Υ-ΡΟΓ	£1£а£с§£сйс£££ТАСасссас£а£аа£££с	309
ΡΧ-Κ143ϋ-ΡθΓ	£1§а£Сё£сйс£££ОАСасссас£а§аа£§£с	310
РХ-Т144А-Рог	£а§с£§сйС£££С£сОССсас§а§аа£§£сс££	311
РХ-Т144Р-Рог	£а£С§£СЙС§££С£ССТОсаС£а£аа£ё£СС£§	312
РХ-8152А-Рог	£аёаа£££сс£§са£0ССасса££с1саа£а1£	313
РХ-8152Т-Рог	£а£аа£§§сс§£са£АССасса££с1саа§а1£	314
ΡΧ-8152Ν-ΡΟΓ	§а§аа§£§сс£§са§ААСасса§£с1:саа§а1:§	315
РХ-К154Р-Рог	§§сс§§са§1ссассОАОс1:саа§а1£с1:§§аё	316
РХ-К156А-Рог	са£1ссасса§§с1сОССа1§с1§£а£§1£ссс	317
РХ-К 1568-Рог	са§1ссасса§£с1сАОСа1§с1££а££1£ссс	318
ΡΧ-Κ156Ν-ΡΟΓ	са£1ссасса£§с1сААСа1£с1££а£§1§ссс	319
ΡΧ-Κ156ϋ-ΡθΓ	са§1ссасса£цс1сОЛСа1£с1£§а§§1§ссс	320
РХ-К156К.-РОГ	са£1ссасса£§с1сАССа1£с1§£а§§1§ссс	321
РХ-К156У-Рог	са§1ссасса§§с1;сОТОа1:£с1:§£а§§1§ссс	322
ΡΧ-Κ156Υ-ΡΟΓ	са§1:ссасса££с1сТАСа1£с1££а££1£ссс	323
РХ-К156М-Рог	са§1ссасса§£с1сАТ0а1£с1ё£а££1£ссс	324
РХ-У 178/018 А-Рог	саас<Дсасса§§а1:сА0С0СС££Сса§£аа1;£саа£	325
РХ-ПбЬ/У 178-Рог	§асаасаасс1сасса£§СТОАОС££а££сса££аа1§саа§	326
ΡΧ-Ι16Ρ/018 А-Рог	§асаасаасс1:сасса££СТ0£1§0СС££сса£§аа1£саа§£ас	327
РХ-8152А/К156М-Рог	§а£аа£££сс§§са§ОССасса§§с1сАТОа1£с1££а£§1£ссс	328
ΡΧ-Ν35Ώ-ΡΟΓ	ссс1§£са§§ссс1:£с1:са1:сОАС£а££аааас£а§§£й1:с1:§1	329
ΡΧ-Ν35Α-ΡΟΓ	ссс1£§са££ссс1§с1са1сОСС§а£§аааас§а§£§й1с1§1	330
ΡΧ-Ν358-ΡΟΓ	ссс1§ёса££ССс1§с1са1сАОС£а££аааас£а£££Шс1§1	331
РХ-РЗ 7К-Рог	са§£ссс1§с1са1сааГ§а§С0Саас£а£££1йс1£{££1:§§а	332
РХ-РЗ 7К-Рог	са£§ссс1:£сГса1сааГ£а£ААОаас£а£££Шс1£1£§1£§а	333
РХ-РЗ 7 А-Рог	са§§ссс1§с1са1;саа1§а§0ССаас§а§£§й1с1£1:££1:§£а	334
РХ-РЗ 78-Рог	са££ССс1£с1са1саа1£а£А0Саас£а£££Й1с1£1££1§ёа	335
РХ-Р39К-Рог	с1§с1са1саа1§а§§аааасС0С§§Шс1;£1££1§§аасий	336
РХ-РЗ 9К-Рог	с1§сГса1сааГ£а§§аааасААО££1йс1:£1:£ё1:£§аас1ай	337
РХ-РЗ 9 А-Рог	с1£с1са{саа1£а§£аааасОСС££1йс1£1§§1:§§аа(Дай	338
РХ-К150А-Рог	§££С£сасссас§а§аа§££сОССса§1:ссасса£§с1саа§а1:§	339
РХ-К1500-Рог	§££С£сасссас§а§аа§£§сОАСса§1ссасса§§с1:саа§а1£	340
РХ-К150Р-Рог	£££С£сасссас§а£аа£££сОАОса£1ссасса££с1саа§а1£	341
РХ-К.1505-Рог	§££С£сасссас£а§аа§££сА0Сса£1ссасса££с1саа£а1£	342
РХ-К 1500-Рог	§££С£сасссас§а£аа£££сООСса£1ссасса£§с1саа§а1£	343
РХ-К143Р-Рог	§£§ай£1£а£С££сйс££§ОАОасссас£а£аа§§£сс££са£	344

- 98 028865

РХ-КНЗЦ-Рог	ё§§айёГ§аёс§§сйс§§§ОАСасссас§а§ааёё§сс§§са§	345
РХ-К.143М-РОГ	§§ёай§1§а§с§§сйс§§§АТ0асссасза§аа§§§сс§ёса§	346
ΡΧ-Κ.143Ν-ΡΟΓ	§§§ай§1§а£С§8Сйс§§§ААСасссас§а§аа§§§сс§§са£	347
РХ-К143(УРог	§§§ай§1§а§с§§сйс§§§САОасссас§а§аа§§§сс§§са§	348
РХ-К93Е-Рог	§а§§1§§1са1саа§сасаасОАОйсасаааё§а§ассШ§ас	349
РХ-К93А-Рог	ёа§§Г§ё1са1саа§сасаасОССйсасаааё§а§асс1а1§ас	350
РХ-К240А-Рог	§ссйсс1:сааёГ§ёа1с§асСССГсса1§аааасса§8ё§сй§	351
РХ-К240Е-Рог	§ссйсс1саа§Г§§а1с§асОАС1сса1§аааасса§§§§сй§	352
РХ-К236А-ЕОГ	ассаа§§1сассёссйсс1сОСС1§§а1с§аса§§4сса1§ааа	353
РХ-К236Е-РОГ	ассаа§ёГсасс§ссПсс1сОАС1§§аГс§асаё§1сса1§ааа	354
РХ-К125А-РОГ	§с§сс1§сс1§сс1сссс§а§ОСС§асГё§§сс§аёГссас§с1§	355
РХ-К125Е-РОГ	§с§сс1§сс1§сс1сссс§а§САС§асГ§§§сс§а§1ссас§с1§	356
РХ-К96А-РОГ	аГсаа§сасаасс§§йсасаССС§а§асс1а1§асйс§аса1с	357
РХ-К96Е-РОГ	а1саа§сасаасс£§йсасаОАО§а§асс1а1§асйс§аса1:с	358
РХ-К236Е/К240Е-РОГ	§1сасс§ссйсс1сСАС1§ёа1с§асСАС1сса1§аааасса§ё	359
РХ-К156А-РОГ	ёёсс§§са§1ссасса§§с1сОССа1§с1ёёа§§1§ссс1ас§Г§	360
РХ-К1568-Рог	§§сс§§са§1ссасса§§с1сАССа1§с1§§а§§Г§ссс1асёГ§	361
ΡΧ-Ε[51]Ν-Ρογ	§а1§§с§асса§1§1ААСасса§1:ссй§сса£	362
ΡΧ-Ρ[56]Ν/0[58]5-Ρογ	§а§асса§Гсс11§сААСаасА0СёёсаааГ§1ааа§ас	363
ΡΧ-9[58]Ν/Κ[60]8-Ρογ	са§1ссй£сса§аасААС§§сА0С1§1ааа§ас£§сс1:с	364
ΡΧ-Κ[62]Ν/Ο[64]8-Ρογ	§аасса§ё§сааа1ё1ААС§асА0Сс1сёёё§аа1асасс	365
ΡΧ-Ρ[65]Ν/Ε[67] 8-Рог	сааа1§1ааа§ас§§сААС§§§АСгС1асасс1:§сасс1§	366
ΡΧ-Ε[67]Ν-Ρογ	§1ааа§ас§§сс1с§8§ААС1асасс1§сасс1§й1а£	367
ΡΧ-Ρ[73]Ν/Ο[75]8-Ρογ	§аа1асасс1§сасс1§1ААСёааА0Сйс§аа§§сааааас	368
ΡΧ-Ο[75]Ν/Ε[77]8-Ρογ	с18сасс1§1йа§ааААСйсАСС8§сааааас1§1§аайайс	369
ΡΧ-Κ[86]Ν/Ρ[88]δ-ΡθΓ	с1§1§аайайсасаААСаа§А0С1§са§сс1:§§асаас	370
ΡΧ-Τ[85]Ν/Κ[87]8-Ρογ	сааааас1£1§аайайсААСс§§А0Сс1с1§са§сс1:§§ас	371
ΡΧ-Ρ[83]Ν-Ρογ	§£сааааас1§1§ааААСйсасас§£аа§с1с	372
ΡΧ-Ε[82]Ν/Ρ[84] 8-Рог	§ааёёсааааас1ё1ААСйаАССасас§ёаа§с1с1§с	373
РХ-Е[82]8-Рог	§аа§§сааааас1§1А0Сйайсасас£§аа§	374
ΡΧ-Ο[78]Ν/Ν[80] 8-Рог	§Ша§ааё§айс§ааААСаааАСС1ё1§аайайсасас	375
ΡΧ-Ε[77]Ν/Κ[79]8-Ρογ	с1§й1а§аа§§айсААС§§сАОСаас1§1:§аайайс	376
ΡΧ-ϋ[95]Ν/Ο[97]δ-ΡθΓ	са§сс1§ёасаас§ё§ААС1§1А0СсаёйсГ§ссас§аё	377
ΡΧ-0[1 14]Ν-Ρογ	§Гёс1сс1§с§сссёсААС1асасссГёёс1ёас	378
ΡΧ-Κ[ 122] 8-Рог	с1§§с1§асаас§§сА0С§сс1:§сайсссасаё	379
ΡΧ-ϋ[119]Ν/Ο[121]δ-ΡθΓ	ё§§1асассс1£ёс1ААСаасАСгСааё§сс1ёсайссс	380
ΡΧ-Κ23Ν/Ο258-Ρογ	§§а§§сса£§аа1§сААС§асАСгС§а§1§1ссс1§§са§	381
ΡΧ-Ε36Ν/Ν388-Ρογ	ёссс1ёс1са1саа1ААС§ааА0Сёаё§ёШс1§1ёёГё	382
ΡΧ-Κ63Ν/Κ65 8-Рог	сКйассаа§ссаа§ААСйсАОС§Г§а§§£1а£§§§ас	383
ΡΧ-Ε84Ν/Ε868-Ρογ	ё£1§а£§С£§1£сасААС£1§А0С§1§§1са1саа£сас	384
ΡΧ-Τ113Ν/Κ1158-Рог	с1саа§ассссса1сААСйсА0Са1§аас§1§§с§сс1§	385
ΡΧ-Κ134Ν/Ο1368-Ρογ	ас£с1§а1§ас§са§ААСас§А0Сай§1ёа§с§£сйс	386
ΡΧ-Κ202Ν/Κ2048-Ρογ	§§ссс§сас§ГсассААСйсАССёасасс1асйс§1§	387
ΡΧ-ϋ205Ν/Υ207δ-ΡθΓ	ё1сассс§сйсаа§ААСассА0Сйс§1§аса§ёса1с	388
ΡΧ-Κ204Ν-Ρογ	сас§1сассс§сйсААСёасасс1асйс§1ё	389
ΡΧ-Τ244Ν/Ο2468-Ρογ	§асаёё1сса1§аааААСаё§А0Сй§сссааёёссааё	390
ΡΧ-Κ245Ν/Ρ2478-Ρογ	а§£1сса1£аааассААС§§сА(ЗСсссаа§§ссаа§а§с	391
ΡΧ-0[114]Ν+ϋ[ί 19]Ν/Ο[12118Рог	§1£с1сс1£С£ссс£сААС1асассс1§§с1ААСаасАОСаа§£Сс1ё сайссс	392

В табл. 16 ниже приведены полученные варианты РХ с мутациями, указанными с использованием нумерации относительно зрелого полипептида РХ, приведенного в 8Ер П) N0: 134, и также с использованием нумерации химотрипсина. Приведенные 8Ер П) N08 относятся к кодируемому полипептиду предшественнику и зрелым последовательностям перечисленных мутантов.

- 99 028865

Таблица 16

Варианты РХ

Мутация (Нумерация зрелого РХ) 1195Ь	Мутация (Нумерация по химотрипсину) 116Ь	8Ε<2 ГО ΝΟ. (предшественник) 416	δΕΟ ΙΟ ΝΟ. (зрелый) 135
VI961	У171	417	136
VI968	У178	418	137
Τ85Ν/Κ87δ/νΐ96δ	Τ[85]Ν/Κ[87]δ/νΐ7δ	419	138
Ο56Ν/Ο58δ/νΐ96δ	Ο[56]Ν/Ο[58]8/νΐ7δ	420	139
Κ62Ν/Ο64δ/νΐ96δ	Κ[62]Ν/Ο[64]δ/νΐ7δ	421	140
Ε65Ν/Ε67δ/νΐ96δ	Ε(65]Ν/Ε[67]8/νΐ78	422	141
Ε67Ν/νΐ968	Ε[67]Ν/νΐ78	423	142
Ε73Ν/Ο75δ/νΐ96δ	Ε[73]Ν/Ο[75]δ/νΐ7δ	424	143
Ο75Ν/Ε77δ/νΐ96δ	Ο[75]Ν/Ε[77]8/νΐ7δ	425	144
Κ86Ν/Ε88δ/νΐ96δ	Κ[86]Ν/Ε[88]8/νΐ7δ	426	145
Ο114Ν/νΐ96δ	Ο[114]Ν/νΐ7δ	427	146
Ό95Ν/Ώ97δ/νΐ96δ	Ο[95]Ν/ϋ[97]8/νΐ7δ	428	147
Е828/У1968	Е[82]8/У178	429	148
Ε82Ν/Ρ84δ/νΐ96δ	Ε[82]Ν/Ρ[84]8/νΐ7δ	430	149
Ο78Ν/Ν80δ/νΐ96δ	Ο[78]Ν/Ν[80]δ/νΐ7δ	431	150
Ε77Ν/Κ798/νΐ96δ	Ε[77]Ν/Κ[79]8/νΐ78	432	151
Ό119Ν/Ο121δ/νΐ96δ	Ό[119]Ν/Ο[121]8/νΐ78	433	152
Ε83Ν/νΐ96δ	Ь[83]Ы/У178	434	153
К1228/У1968	К[122]8/У178	435	154
Ε51Ν/νΐ96δ	Ε[51]Ν/νΐ78	436	155
ς>58Ν/Κ608/νΐ96δ	<3[58]Ν/Κ[60]δ/νΐ78	437	156
0114Ν/Ό119Ν/Ο121δ/νΐ96δ	0[114]Ν/Ό[ 119]Ν/Ο[121 ]8/У 178	438	157
Ο198Α	019Α	439	158
О198У	О19У	440	159
Ο198Κ	019Κ	441	160
Ο198Κ	019Κ	442	161
Ο198Ρ	019Ρ	443	162
Ο198Η	019Η	444	163
Ь2118/Ο219Η	Ь328/С40Н	445	164
Ο197Ρ	018Ρ	446	165
Ό378Ν	Ό194Ν	447	166
Ό3788	Ό1948	448	167
У196Б	У17Ь	449	168
У196Т	У17Т	450	169
У196Р	У17Р	451	170
О197У	018У	452	171
Ο197Τ	018Τ	453	172
01978	0188	454	173
Ε200Α	Ε21Α	455	174
Ε2008	Ε218	456	175
Е200У	Е21У	457	176
Κ2028	Κ238	458	177
Κ.326Α	Κ143Α	459	178
Κ3268	Κ1438	460	179
Κ.326Τ	Κ143Τ	461	180
К326У	К.143У	462	181
К326С)	Κ143<3	463	182
Κ.326Ν	Κ.143Ν	464	183
Κ326Μ	Κ143Μ	465	184
Κ.326Κ	Κ143Κ	466	185
Κ326Υ	Κ143Υ	467	186
Τ327Α	Τ144Α	468	187
Т327Ь	Т144Ь	469	188
8334Α	8152Α	470	189
8334Τ	8152Τ	471	190
8334Ν	8152Ν	472	191
Κ.336Ε	Κ154Ε	473	192
Κ338Α	Κ156Α	474	193
КЗ 388	Κ1568	475	194
Κ338Ν	Κ156Ν	476	195
К338К	Κ156Κ	477	196
К338У	К156У	478	197
Κ338Υ	Κ156Υ	479	198
К338М	Κ156Μ	480	199
Т327А/К338А	Τ144Α/Κ156Α	481	200
Т327Б/К338М	Т1441УК156М	482	201
Е200У/Т327Ь/К338М	Е21У/Т1441УК156М	483	202
Е200У/Т327Ь/8334А/К338М	Ε21У/Т144178152 Α/Κ15 6Μ	484	203
VI968/0197А	У178/О18А	485	204
У1968/Ь21 Ιδ/0219Н	У178/Ь328/О40Н	486	205
Ό119Ν/01218/У1968/Ь2118/0219Н	ϋ[ 119]Ν/Ο[1211δ/νΐ7δ/Ε32δ/Ο40Η	487	206
0114Ν/ν 1968/Б2118/0219Н	0[114]Ν/νΐ78/Ε32δ/Ο40Η	488	207
0114Ν/Ό119Ν/01218/У 1968/Б2118/	0[114]Ν/Ό[119]Ν/Ο[121]8/νΐ78/Ε328/	489
0219Н	Ο40Η		208
0197 А/Б2118/0219Н	Ο18Α/Ε328/Ο40Η	490	209
V1968/0197А/Ь2118/0219Н	У178/О18А/Е328/О40Н	491	210
1195Ь/У1968	116Б/У178	492	211
1195Ь/О197А	Ι16Ε/Ο18Α	493	212
1195Е/Ь2118/О219Н	Ι16Ε/Ε328/Ο40Η	494	213
νΐ96δ/Ν214Ό	νΐ7δ/Ν35Ό	495	214
νΐ968/Ν214Α	νΐ78/Ν35Α	496	215
νΐ96δ/Ν214δ	νΐ7δ/Ν35δ	497	216
У1968/Е216К	У178/Е37К	498	217
У1968/Е216К	У178/Е37К	499	218
У1968/Е216А	У173/Е37А	500	219
У1968/Е2168	У173/Е373	501	220
У1968/Е218К	У173/Е39К	502	221
У1968/Е218К	У173/Е39К	503	222
У1968/Е218А	У173/Е39А	504	223
У1968/К332А	У173/К150А	505	224
νΐ968/Κ332Ό	νΐ7δ/Κ150Ό	506	225
У1968/К332Е	У173/К150Е	507	226
У1968/К3328	У173/К1503	508	227
У1968/К332О	У178/К150О	509	228
У1968/К326Е	У173/К143Е	510	229
νΐ96δ/Κ326Ό	νΐ78/Κ143Ό	511	230
У1968/К326М	У173/К143М	512	231
νΐ96δ/Κ326Ν	νΐ7δ/Κ143Ν	513	232
У1968/К326О	У178/К143О	514	233
У1968/К273Е	У173/К93Е	515	234
У1968/К273А	У178/К93А	516	235
У1968/К424А	У178/К240А	517	236
У1968/К.424Е	У173/К240Е	518	237

100 028865

У1963/К420А	У173/К236А	519	238
У1963/К420Е	У173/К236Е	520	239
νΐ96δ/Κ306Ε	У173/К125А	521	240
У1963/К276А	У173/К96А	522	241
У1963/К276Е	У173/К96Е	523	242
νΐ96δ/Κ420Ε/Κ424Ε	У178/К236Е/К240Е	524	243
V1968/Κ273 Ε/Κ420Ε/Κ424Ε	У178/К93Е/К236Е/К240Е	525	244
V1968/Κ273 Ε/Κ306Ε/Κ420Ε/Κ424Ε	У173/К93Е/К.125Е/К236Е/К240Е	526	245
У1963/К338А	У173/К.156А	527	246
νΐ96δ/Κ338δ	У173/К1563	528	247
νΐ96δ/Ε215Ν/Ν217δ	νΐ78/Ε36Ν/Ν388	529	248
νΐ96δ/Ε264Ν/Ε266δ	νΐ78/Ε84Ν/Ε86δ	530	249
ϋΐ 19Ν/Ο121δ/νΐ96δ/Ε264Ν/Ε266δ	ϋ[119]Ν/Ο[ 121 ]8/У173/Ε84Ν/Ε863	531	250
0114Ν/ν 1968/Ε264Ν/Ε2668	Ο[114]Ν/νΐ78/Ε84Ν/Ε86δ	532	251
νΐ963/Κ429Ν/Ι.4313	νΐ7δ/Κ245Ν/Ε2478	533	252
νΐ96δ/Κ243Ν/Κ245δ	νΐ7δ/Κ63Ν/Κ658	534	253
νΐ96δ/Τ293Ν/Κ295δ	У178/Т113Ν/Κ.1158	535	254
νΐ96δ/Ό389Ν/Υ3915	νΐ7δ/ϋ205Ν/Υ207δ	536	255
νΐ96δ/Κ388Ν	νΐ7δ/Κ204Ν	537	256
ϋ 119Ν/0121 δ/ν 1963/Κ3 88Ν	ϋ[119]Ν/Ο[121 ]8/У 178/Κ204Ν	538	257
νΐ96δ/Τ428Ν/Ο430δ	νΐ7δ/Τ244Ν/Ο246δ	539	258
V196δ/Έ211 8/0219Η/Ε264Ν/Ε2668	V173/1.323/Ο40Η/Ε84Ν/Ε863	540	259
ϋ 119Ν/Ο121 δ/ν 1963/1.2113/0219Н/ Ε264Ν/Ε2663	ϋ [ 119]Ν/Ο [ 121 ] δ/ν 17δ/ЬЗ 23/Ο40Η/Ε8 4Ν/Ε863	541	260
0114Ν/ν 1963/1.2113/0219Η/Ε264Ν/ Ε2663	Ο[ 114]Ν/ν 173Λ.323/Ο40Η/Ε84Ν/Ε868	542	261
V1963/Ε264Ν/Ε2663/Κ3 88Ν	νΐ73/Ε84Ν/Ε863/Κ204Ν	543	262
ϋ 119Ν/01213/ν 1963/1.2118/0219Н/ Κ388Ν	ϋ[ 119]Ν/Ο[ 121 ] δ/ν ] 73/Ι.323/Ο40Η/Κ2 04Ν	544	263
0114Ν/ν 1968/1.2113/0219Η/Κ3 88 Ν	Ο[114]Ν/νΐ7δ/Ε32δ/(340Η/Κ204Ν	545	264
V1968/1.2118/0219Η/Ε264Ν/Ε2663/Κ 388Ν	νΐ73/1.323/Ο40Η/Ε84Ν/Ε863/Κ.204Ν	546	265

Пример 2. Экспрессия, очистка и активация полипептидов РХ.

A. Экспрессия и очистка полипептидов РХ.

Полипептиды РХ дикого типа и варианты полипептидов РХ экспрессировали в клетках СНОЕхргезз (СНОХ) (Р.хсе'Пдете'). Клетки СНО Ехргезз (СНОХ) поддерживали в полной среде ΌΜ204Β (Σγуте БщеШйс) и использовали в качестве культуры для инокуляции продуцирующих культур. Трансфекции проводили в биореакторах ААУЕ (СЕ НеаЙНсаге). 20 л биореакторы А'АУР инокулировали приблизительно 400 мл посевной культуры с 4,6 л полной среды ΌΜ204Β до плотности 1,2х10⁶ жизнеспособных клеток/мл. Биореактор ААУЕ устанавливали на качалку с углом качания 6° и со скоростью качания 24 об/мин при 37,1°С, чтобы клетки через 3 дня достигали плотности 13-16х10⁶ жизнеспособных клеток/мл. 16 мг плазмидной ДНК РХ и 102,5 мг РЕ1 (полиэтиленимин) объединяли для получения трансфекционного комплекса, который был разбавлен 5,0 л Т1МАХ2 до добавления к культуре в биореакторе ААУЕ через 3 дня после начала посева. Трансфекционный комплекс со средой Т1МАХ добавляли в биореактор ААУЕ. Экспрессирующую культуру растили в течение 4 дней, а затем проводили сбор неочищенных лизатов РХ. Для сбора содержимое биоконтейнеров ААУЕ осаждали в течение 3 ч при 4°С. Культуральный супернатант далее собирали через пористый фильтр СυNО, а затем проводили очистку РХ.

Полипептиды РХ очищали с использованием колонки Р Ра^ Ι·Ίο\ν (СЕ НеаЙНсаге), на которую адсорбировались полипептиды РХ с функциональными доменами С1а, которые далее элюировали с применением ионов кальция. Как правило, культуральный супернатант трансфицированных клеток разбавляли в 2 раза раствором, содержащим 20 мМ Трис рН 8,0, и далее к разбавленному образцу добавляли 500 мМ ЭДТА с рН 8,0 до конечной концентрации ЭДТА 1,5 мМ. Перед нанесением на колонку Р Ра^ ΓΊονν, предварительно уравновешенную сначала буфером В (20 мМ Трис рН 8,0, 1 М №С1), затем буфером А (20 мМ Трис рН 8,0, 0,15 М ЖС1), образцы были профильтрованы. После нанесения образцов колонку промывали буфером А до тех пор, пока поглощение прошедшего через колонку раствора при 280 нм не достигло базового уровня. Буфер А заменяли буфером С (20 мМ Трис рН 8,0, 0,15 М №С1, 10 мМ СаС1₂) и проводили промывание насоса для полной замены буфера в линиях. После завершения промывания насоса буфер С наносили на колоку для элюции полипептидов РХ, которые собирали фракциями. После элюции колонку промывали буфером В, продолжая при этом собирать фракции, пока розовый пигмент (из культуральной среды) не был смыт с колонки. Колонку вновь уравновешивали путем промывки буфером А для повторного использования.

Элюированные фракции далее очищали с использованием колонки δοπίΌβ 15Р (СЕ НеаЙНсаге). Фракции, собранные с буфером С, как описано выше, которые содержали РХ, соединяли, и к ним добавляли ЭДТА до конечной концентрации 20 мМ. Объединенные фракции далее разбавляли в 2 раза 50 мМ Трис, рН 8,0 и наносили на колонку δουΌβ 15Р, которая была предварительно уравновешена буфером Ό (20 мМ Трис рН 8,0, 0,15 М ЖС1, 0,01% Туцет 20, 2,5 мМ СаС1₂). После промывки нагруженной колонки буфером Ό колонку промывали раствором с градиентом от 0,15 до 0,5М \'аС1 и собирали фракции. Фракции, содержащие РХ, объединяли и к ним добавляли СаС12 до концентрации 12,5 мМ.

B. Активация РХ и вариантов РХ.

Для получения активированного РХ (РХа) из зимогена РХ к объединенным фракциям, полученным в примере 2 А, добавляли активатор РХ из яда гадюки Рассела (Наета^Ьдю ТесН^Ь^е^), который был предварительно конъюгирован с биотином, из расчета 10,1 мкг активатора на 1 мл объединенных фракций. Реакцию активации проводили при 37°С в течение 1,5 ч, далее реакционную смесь разбавляли 1:5 20 мМ МЕ8, рН 6,0. Смесь далее наносили на колонку БцерТгар (СЕ НеаЙНсаге) для удаления активатора РХ из яда гадюки Рассела.

- 101 028865

В заключение, неактивированный РХ отделяли от активированного РХа с помощью хроматографии на колонке с гепарином ΗΡ. Раствор, прошедший колонку δ!^ерΤ^ар, наносили прямо на колонку с гепарином НЬ (СЕ Неа1!Ьсаге), которая была предварительно уравновешена буфером Е (20 мМ МΕδ, рН 6,0, 50 мМ №С1). Колонку промывали раствором с линейным градиентом от 0,1 до 0,7 М №С1 в 20 мМ МΕδ, рН 6,0 и собирали фракции. Фракции, содержащие активный РХа, объединяли и буфер заменяли на 5 мМ МΕδ, рН 6,0, 100 мМ №С1 путем диафильтрации.

Пример 3. Определение концентрации каталитически активной протеазы (РХа) в концентрированном растворе.

Определение концентрации каталитически активного фактора Ха (РХа) в концентрированном растворе РХа или варианта РХа проводили путем титрования концентрированного образца протеазы флуоресцеин-моно-п'-гуанидинобензоатом (РМСΒ), который является субстратом флуорогенным эфиром, разработанным в качестве титранта для активного центра трипсиноподобных сериновых протеаз. В некоторых случаях концентрацию активного РХа или варианта РХа также определяли путем титрования экотином, природным сильносвязывающим обратимым ингибитором РХа из ЕксЬепсЫа тоН, имеющим пикомолярную К₁ против РХа дикого типа (δеутοи^ е! а1. (1994) Β^^^^Γγ 33:3949-3958). Для набора вариантов РХа, для которых титрование РМСΒ было невозможным, проводили титрование экотином, как описано ниже.

А. Титрование активного центра РХа с использованием титранта активного центра флуоресцеинмоно-п'-гуанидинобензоата (РМСΒ).

Концентрацию каталитически активного фактора Х (РХа) в концентрированном растворе РХа определяли с помощью модифицированного варианта титриметрического анализа, описанного Βοск е! а1. (АгсЫуек οί Β^^^^Γν апй Β^^^^ (1989) 273:375-388), с использованием субстрата флуорогенного эфира флуоресцеин-моно-п'-гуанидинобензоата (РМСΒ). РМСΒ легко реагирует с РХа, но не с РХ или неактивной протеазой, и в условиях, в которых концентрация РМСΒ является насыщающей и деацилирование происходит особенно медленно и лимитирует скорость катализа, РМСΒ образует эффективно стабильный интермедиат ацил-фермент. В этих условиях протеаза РХа совершает один каталитический оборот с высвобождением флуорофора флуоресцеина. Когда первоначальную вспышку флуоресценции калибруют с внешней стандартной кривой зависимости флуоресценции флуоресцеина от концентрации, может быть вычислена концентрация активных центров.

Оригинальный анализ, описанный Βοск е! а1., был модифицирован следующим образом: 1) включали насыщающие количества кофактора к РХа, 2) добавляли фактор Уа (очищенный из плазмы РУа, НеатаЮ^дю ΤесЬиο1οд^ек) и высокие концентрации фосфолипидов (75% фосфатидилхолина (ФХ)/25% фосфатидилсерина (ФС); ФХ/ФС везикулы ~120 нм в диаметре; АуапЕ ΡοΕιγ Ыр1йк) и 3) использовали увеличенную концентрацию РМСΒ.

В отсутствии РУа и везикул ФХ/ФС варианты РХа с показанной увеличенной зависимостью от кофактора реагировали плохо или не реагировали с субстратом эфиром РМСΒ. Поэтому эти модификации были необходимы для поддержания полной каталитической активности вариантов РХа, созданных таким образом, что они обладали высокой степенью зависимости от кофактора (см. пример 4А).

Дальнейшие изменения были разработаны, чтобы модифицировать анализ для формата 96луночного планшета для минимизации реакционных объемов и увеличения производительности анализа (до 18 образцов на планшет). Анализы титрования активного центра проводили в конечном реакционном объеме 50 мкл в 96-луночном черном планшете с половинным объемом лунок (СгокЕи #3694). Способ был оптимизирован для титрования активного центра вариантов протеазы РХа в концентрированных растворах с диапазоном концентраций 10-100 мкМ. Для концентрированных растворов протеаз с рассчитанной концентрацией вне этого диапазона была необходима стадия концентрирования или предварительного разбавления. Конечные реакционные растворы содержали ~300-650 нМ каждого варианта РХа и 10, 50 или 75 мкМ РМСΒ в 1х буфере А (50 мМ Нерек-Иа0Н, 50 мМ ЫаС1, 5 мМ СаС1₂ и 0,1% ΒδΑ, рН 7,4), содержащем 1 мкМ РУа и 240 мкМ ФХ/ФС фосфолипидов. Рабочие растворы РМСΒ готовили в 2х концентрации в буфере А (20-50 мкМ) из концентрированного раствора 5 мМ РМСΒ в ДМФ в расчете на сухой вес и концентрацию полученных растворов подтверждали с помощью измерения поглощения при 452 нм, используя коэффициент экстинкции 19,498 М^-1 см^-1 в фосфатно-солевом буфере (ΡΒδ), рН 7,2.

Анализы титрования активного центра проводили следующим образом: варианты РХа разбавляли до 0,6-1,3 мкМ в 1х буфере А, содержащем 2х РУа и везикулы ФХ/ФС (2 и 480 мкМ соответственно) и объем 25 мкл разделяли на аликвоты в двух повторах в лунки 96-луночного черного аналитического планшета с половинным объемом лунок. Реакции инициировали путем добавления 25 мкл 2х рабочего раствора РМСΒ (20-150 мкМ) в 1х буфере А. Флуоресценцию при высвобождении флуоресцеина в фазе вспышки реакции измеряли каждые 30 с в течение 180 мин, используя сканер для микропланшетов Ειινίкюп (Тегкт Е1тег) с возбуждением 485 нм и эмиссией 535 нм.

Стехиометрическое количество флуоресцеина, высвобождаемого после катализа РМСΒ под действием активного РХа, определяли с помощью стандартной кривой, построенной с использованием свободного флуоресцеина в 1хбуфере А, содержащем 1 мкМ РУа и 240 мкМ фосфолипидов ФХ/ФС. Стан- 102 028865

дартный раствор флуоресцеина использовали свежеприготовленным из концентрированного раствора в ДМФ с концентрацией ~70-150 мМ и точную концентрацию РМОВ подтверждали с помощью измерения поглощения в стандартных условиях при 496 нм с использованием коэффициента экстинкции 89,125 М^-1см^-1 в 0,1н. №ЮН. Стандартную кривую свободного флуоресцеина далее строили путем серийных разведений стандарта в 1х буфере А, содержащем 1 мкМ РУа и 240 мкМ фосфолипидов ФХ/ФС, в диапазоне от 0 до 2,5 мкМ РМОВ.

Для анализа данных графики реакций экспортировали в виде файлов.ТХТ из программного пакета Епу18ЮП (Регкт Е1тег) и далее проводили нелинейный анализ данных с помощью N0014, программного пакета для автоматической аппроксимации кривой и статистического анализа в среде электронных таблиц МкгоюП Ехсе1 (программное обеспечение [ΌΕδ). Вклад фонового гидролиза РМОВ определяли и вычитали из экспериментального графика реакции, используя набор контрольных лунок, в которые не добавляли РХа. Как правило, фоновый гидролиз РМОВ был меньше 5% от общей наблюдаемой вспышки флуоресценции. Скорректированную кривую аппроксимировали одним экспоненциальным уравнением с линейным компонентом (для учета медленной скорости деацилирования), имеющим формулу

АФлуоресценции= Υ₀ + АтрхЦ-ехрОкл.ХХ-ХОЛ+наклонх^-ХЛ, где параметры Х и Х₀ = время завершения и время инициации реакции,

Υ0 = параметр, учитывающий фоновую флуоресценцию в системе анализа,

Атр = амплитуда фазы вспышки в условиях насыщения, обозначенных выше,

Еь представляет собой наблюдаемую константу скорости первого порядка для образования ацилфермента, и наклон представляет собой полную константу скорости, связанную с полным оборотом РМОВ протеазой.

Концентрацию активной протеазы РХа в реакции рассчитывали путем сравнения аппроксимированного параметра для амплитуды (Атр) со стандартной кривой флуоресцеина. Значения из повторных анализов усредняли и определяли стандартное отклонение. Концентрацию активного РХа в концентрированном препарате далее определяли из рассчитанной в анализе концентрации, учитывая поправку на степень разведения в этом анализе.

В. Титрование активного центра РХа с использованием сильносвязывающего ингибитора.

Если титрование РМОВ было невозможно, концентрацию каталитически активного фактора Ха или варианта РХа в концентрированном растворе определяли путем титрования известным количеством экотина, сильносвязывающего обратимого ингибитора РХа из ЕзсЬебсЫа той.

Концентрацию активного экотина в коммерчески доступном препарате (Мο1еси1а^ Iηηονаί^οη8, Ыс.) определяли путем титрования известной концентрации рекомбинантного человеческого трипсина (гЬТгурзт, Рο1утиη δ^ηίίίκ) коммерческим препаратом экотина из Е. тоП. Титрование проводили в 2,0 мл объеме 1х буфера В (20 мМ Нерез, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС1₂, 0,1% РЕО 8000), используя конечную концентрацию титрованного активного центра рекомбинантного человеческого трипсина 100 нМ и ступенчатую дозу экотина от 0 до 200 нМ. После 60 мин инкубации при комнатной температуре в 96-луночном полипропиленовом планшете с глубокими лунками 2,0 мл переносили в чистую кварцевую кювету (10 ммх10 мм). РМОВ добавляли до конечной концентрации 5 мкМ (1,9 мкл/2,0 мл из 5,3 мМ концентрированного раствора) и остаточный активный трипсин гЬ-Тгурзш определяли по вспышке РМОВ. Данные плато вспышки интегрировали в течение 50 с для каждой дозы экотина и измеренную величину преобразовывали в отношение АР^/АР^, где АР_тах представляет собой общую амплитуду вспышки трипсина гЬ-Тгурзш в отсутствие ингибитора и АР^ представляет собой амплитулу выспышки в присутствии ингибитора. Рабочую концентрацию активного ингибитора далее определяли из экстраполированного отрезка, отсекаемого на оси Х, при полном ингибировании и известного количества активного трипсина гЬТгурзт в реакции.

Реакции титрования активного центра экотином проводили, готовя серийные разведения экотина в 1,33 раз (150 мкл в 50 мкл) в 2х концентрации (400-0 нМ) в 1х буфере В, в который был добавлен 0,1% ΒδА. Образцы протеаз РХа или вариантов протеаз РХа разбавляли до 2х рабочих концентраций (400 нМ) и аликвоты 50 мкл полученного раствора добавляли в двух повторах в лунки 96-луночного полипропиленового аналитического планшета. Реакции инициировали путем добавления 50 мкл 2х раствора экотина (12 серийных разведений) до финальных концентраций экотина в диапазоне от 200 до 0 нМ в реакционных объемах 100 мкл (50 мкл + 50 мкл).

Реакции ингибирования инкубировали в течении 120 мин при комнатной температуре (~25°С), после чего считывали значения остаточной активности РХа или варианта РХа с помощью флуорогенного субстрата РеГаГЬюг Ха (СНзδ0₂-^-СНА-01у-А^д-АМС, СеШегсНет). РХа дикого типа и варианты РХа с высокой активностью по отношению к пептидному субстрату разбавляли в 10-100 раз в конечном объеме 75 мкл 1х буфера В, в который был добавлен 0,1% ΒδА, чтобы получить скорость реакции в приемлемом диапазоне. Варианты РХа с маленькой активностью по отношению к пептидному субстрату тестировали неразбавленными. 75 мкл разбавленных или неразбавленных образцов переносили в 96-луночный черный аналитический планшет, далее добавляли 25 мкл 0,4 мМ (конечная концентрация 0,1 мМ) РеГаГНюг Ха. Начальную скорость реакции далее измеряли при 25°С в течение 15-60 мин. Принималось, что любая

- 103 028865

диссоциация из-за изменения разбавления была незначительной в процессе измерения скорости; таким образом, концентрации при инкубации были конечными концентрациями, используемыми для ингибитора и протеазы в последующем анализе данных.

Отношение скорости реакции в присутствии ингибитора (V!) к скорости реакции в отсутствие ингибитора (ν0) определяли для каждой концентрации ингибитора (экотина) при фиксированной концентрации протеазы. Отношения ν/ν₀ откладывали на графике и полученные кривые титрования оценивали с помощью уравнения (1) в программном пакете Рпкш (Огарбраб δοΠ\γа^е). Анализы проводили, принимая стехиометрическое соотношение ингибитор/протеаза равным п=1.

Уравнение (1): ν/ν₀ = (отрезок, отсекаемый на оси Υ) + наклонх[экотин].

Аппроксимированное значение для отрезка, отсекаемого на оси Х, экстраполированное из уравнения (1), далее использовали для определения концентрации концентрированного раствора РХа при титровании активного центра (ΑδΤ) и значения "активной фракции", принимая, что общая концентрация протеазы была известной и экотин был активным при концентрации, использованной для построения кривой зависимости ответа от дозы с использованием уравнения (2). Оценивали только те значения, которые характеризовались линейной потерей активности (0-90%) при увеличивающихся концентрациях экотина.

^УраВ^{нение (2)}: ^{([отрезок, отсекаемый на оси Х]}аппроксимированное-значение^/[РХа]анализ^{)х [РХа]}общий белок ^[РХа]экотин^-А^^Т.

Пример 4. Определение каталитической активности РХа в отношении его субстрата, протромбина

(РП).

Каталитическую активность РХа и вариантов РХа в отношении их субстрата, протромбина (РП), оценивали как в присутствии очищенного из плазмы РVа и фосфолипидов (зависимая от кофактора активность), так и в отсутствие очищенного из плазмы РVа и фосфолипидов (не зависимая от кофактора активность). Соответствующую каталитическую активность оценивали косвенно, используя флуорогенный анализ, в котором флуоресценцию, возникающую результате опосредованного тромбином (РПа) расщепления синтетического субстрата РеГаЛног ТН (Н-Э-СНА-А1а-Агд-АМС; СеШегсбеш) использовали для оценки расщепления протромбина (РП) под действием РХа с образованием тромбина (РПа).

Для вычисления кинетических констант скоростей использовали диапазон концентраций протромбина, где для зависимого от кофактора анализа субстрат протеазы (протромбин) использовали по меньшей мере в 1000-кратном избытке по сравнению с концентрацией активирующей протеазы (РХа) и для независимого от кофактора анализа субстрат протеазы (протромбин) использовали по меньшей мере в 10-1000-кратном избытке по сравнению с концентрацией активирующей протеазы (РХа) в зависимости от активности варианта. Кратко, следующий анализ обеспечивает измерение кинетики активации протромбина, катализируемой протромбиназой, путем непосредственного наблюдения активности тромбина в отношении его субстрата, РеГаПиог ТН, где кинетический анализ проводили в течение 30-60 мин при комнатной температуре (25°С). Для определения кинетических констант функционирования РХа/протромбиназы (к_кат и к_М) эксперименты проводили с лимитирующим количеством фактора Ха в присутствии или отсутствие фиксированного насыщающего количества фактора Vа (20 нМ) и везикул, содержащих фосфолипиды ФХ/ФС (20 мкМ), при увеличивающихся концентрациях протромбина (между 0 и 8 мкМ). Высвобождение свободного флуорофора, АМС (7-амино-4-метилкумарина), после расщепления РеГаПиог ТН тромбином далее оценивали непрерывно в течение всей реакции и определяли кинетические константы скорости для вариантов РХа.

А. Протокол РVа-зависимого анализа.

Для анализов, оценивающих кинетическую скорость активации протромбина (РП) фактором РХа в присутствии РVа (очищенный из плазмы, Неаша1о1одю Тесбио1од1ек, Шс.) и фосфолипидов (75% фосфатидилхолина (ФХ)/25% фосфатидилсерина (ФС); везикулы ФХ/ФС ~120 нм в диаметре; АуапЦ Ро1аг Ыр1бк) варианты РХа экспрессировали, очищали, активировали и подвергали титрованию активного центра, как описано в примерах 1-3 выше. Далее делали серийные разведения вариантов РХа до 2х концентрации 0,2 пМ в объеме 2 мл 1х буфера А (20 мМ Нерек/150 мМ №С1/5 мМ СаС1₂/0,1% ΒδΑ/0,1% РЕО-8000, рН 7,4), содержащего 2х концентрации РVа (40 нМ) и везикул ФХ/ФС (40 мкМ).

Раствор 5 мкМ протромбина (РП), обработанного ОРР/РРК-сшк, готовили в 2,0 мл 1х буфера А, содержащего 0,1 мМ субстрата РеГаПиог ТН. Этот раствор представлял собой самую высокую концентрацию тестируемого протромбина и предусматривал объем, достаточный для 3 аналитических планшетов. Раствор протромбина/РеГаПиог ТН далее серийно разводили в 1,8 раза в 12-канальном полипропиленовом планшете с глубокими лунками с конечным объемом 700 мкл 1х буфера А, содержащего 0,1 мМ РеГаПиог ТН, в результате получали конечные разведения 5000 нМ, 2778 нМ, 1543 нМ, 857 нМ, 476 нМ, 265 нМ, 147 нМ, 82 нМ, 45 нМ, 25 нМ, 14 нМ и 0 нМ протромбина. Всего по 25 мкл каждого серийного разведения протромбина вносили в виде аликвот в три 96-луночных черных аналитических планшета с половинным объемом лунок. Реакции в рамках анализа, как правило, инициировали, используя станцию дозирования жидкостей БюМек РХ или 12-канальную микропипетку для распределения 25 мкл растворов протромбиназы (РХа/^рха/фосфолипиды/Са²+) в аналитические планшеты, содержащие 25 мкл се- 104 028865

рийных разведений протромбина в соответствии с заранее определенной схемой (4 варианта РХа/планшет).

Финальные концентрации реагентов в анализе были следующими: 0,1 пМ РХа, 20 нМ РУа, 20 мкМ везикул ФХ/ФС, 50 мкМ РеГайиог ТН и разведения протромбина (РН) от 0 до 2500 нМ. Реакции отслеживали с помощью флуоресцентного планшетного спектрофотометра δρес1^аМаx в течение 30 мин при 25°С. Стандартная кривая свободного АМС в диапазоне концентраций от 0 до 100 мкМ АМС служила для перерасчета КРИ в мкМ при анализе данных.

B. Протокол РУа-независимого анализа.

Для анализов, оценивающих кинетическую скорость активации протромбина (РН) фактором РХа в отсутствие РУа, но в присутствии фосфолипидов (75% фосфатидилхолина (ФХ)/25% фосфатидилсерина (ФС); везикулы ФХ/ФС ~120 нм в диаметре; АуапП Ро1аг 1ар|бз), варианты РХа экспрессировали, очищали, активировали и подвергали титрованию активного центра, как описано в примерах 1-3 выше. Далее делали серийные разведения вариантов РХа до 2х концентрации 0,2 пМ (для дикого типа) или концентрации 1-4 нМ (для каждого варианта РХа) в объеме 2 мл 1х буфера А, содержащего 2х концентрации везикул ФХ/ФС (40 мкМ). Раствор 8 мкМ протромбина (РН), обработанного ЭРР/РРК-сшк, готовили в 2,0 мл 1х буфера А, содержащего 0,1 мМ субстрата РеГайиог ТН. Этот раствор представлял собой самую высокую концентрацию тестируемого протромбина и предусматривал объем, достаточный для 3 аналитических планшетов. Раствор протромбина/РеГайиог ТН далее серийно разводили в 1,8 раза в 12канальном полипропиленовом планшете с глубокими лунками с конечным объемом 700 мкл 1х буфера А, содержащего 0,1 мМ РеГайиог ТН, в результате получали конечные разведения 8000 нМ, 4444 нМ, 2469 нМ, 1372 нМ, 762 нМ, 423 нМ, 235 нМ, 131 нМ, 73 нМ, 40 нМ, 22 нМ и 0 нМ протромбина. Всего по 25 мкл каждого серийного разведения протромбина вносили в виде аликвот в три 96-луночных черных аналитических планшета с половинным объемом лунок. Реакции в рамках анализа, как правило, инициировали, используя станцию дозирования жидкостей ВюМек РХ или 12-канальную микропипетку для распределения 25 мкл растворов РУа-независимой протромбиназы (РХа/фосфолипиды/Са²⁺) в три аналитических планшета, содержащих 25 мкл серийных разведений протромбина в соответствии с заранее определенной схемой (4 варианта РХа/планшет).

Финальные концентрации реагентов в анализе были следующими: 10 пМ варианта РХа или 0,5-2 нМ варианта РХа, 20 мкМ везикул ФХ/ФС, 50 мкМ РеГайиог ТН и разведения протромбина (РН) от 0 до 4000 нМ. Реакции отслеживали с помощью флуоресцентного планшетного спектрофотометра δρес1^аМаx в течение 30 мин при 25°С. Стандартная кривая свободного АМС в диапазоне концентраций от 0 до 100 мкМ АМС служила для перерасчета КРИ в мкМ при анализе данных.

C. Анализ данных.

Все уравнения, использованные для определения стационарной кинетики катализа протромбина (РН) фактором РХа, основаны на уравнениях, описанных в ссылке 'Уутодеп- АсйУ'аПоп Ктейсз: Моби1а1огу ейес1з о£ 1:^аηз-4-(аш^ηοшеίЬу1)сус1οЬеxаηе-1-са^Ьοxу1^с аыб апб ро1у-Э-1узте оп р1азтто§еп асПхайоп" в Ре1егзеп, е! а1. (1985) ВюсЬет. б. 225:149-158. Теория стационарной кинетики системы, описываемой схемой А ниже, описана уравнением (3), представляющим параболическое накопление продукта.

Схема А

РХаТ\^га/фосфолипиды/Са^>(протромбиназный комплекс)

Протромбин (РП)

Тромбин (РИа)

I

Субстрат РеШайиог ТН - Высвобождение продукта

Уравнение (3)

„₌„ I Фо] А

А + И к,+М г

В соответствии с механизмом схемы А, а0 представляет собой концентрацию активирующей протеазы (РХа), ζ₀ представляет собой концентрацию зимогена (РН), к_а и Κ_ζ представляют собой к_са! и К_Мдля катализируемого активатором превращения зимогена в активный фермент (РНа), где к_е и К_з преставляет собой к_са! и К_М для превращения субстрата в продукт фактором РНа в течение заданного времени 1.

Для анализа кривых процесса уравнение (3) преобразовали в форму уравнения (4), с помощью которого независимо определяли стационарную кинетику гидролиза флуорогенного субстрата протромбином и заменяли ее константой соединения к2.

Уравнение (4)

- 105 028865

Ρ = «с

Для активности тромбина (Рйа) в отношении Рекайиог ТН в 1х буфере А независимо определили К_М и значение к_са1, которые оказались равны 5,7 мкМ и 40,4 с^-1 соответственно. Подстановка этих значений в уравнение (5) дает поправочный коэффициент к₂ 36,3 с^-1.

Уравнение (5)

Для определения степени каталитической активности РХа сырые данные, собранные с применением 8ойМах Рго (Мо1еси1аг Оехчсев), экспортировали в виде .ТХТ файлов. Далее проводили нелинейный анализ данных прямо в программном пакете АсЖйуВазе с использованием модуля анализа данных ХЕ Киппег (программное обеспечение ГОВ8). Был создан шаблон электронной таблицы, чтобы автоматически аппроксимровать параболические скорости реакций (мкМ/с²) тестируемых вариантов РХа при каждой концентрации протромбина функцией стандартной равносторонней гиперболы (т.е. уравнение Михаэлиса-Ментен), заданной уравнением (6), чтобы получить аппроксимированные значения для У_тах и КМ.

Уравнение (6)

Г Г.5'. Ι

Скорость реакции (мкМ/сек²) = —

+ |5_;]

Значение к_са1 для тестируемого варианта РХа далее вычисляли из аппроксимированного значения для У_тах (мкМ/с²) с помощью уравнения (7).

Уравнение (7)

Константу специфичности к_са1/К_М вычисляли прямо из аппроксимированного значения К_М и рассчитанной к_са1, возникшей из оценки уравнения (7) выше.

Ό. Результаты.

В табл. 17-18 ниже приведены кинетические параметры, используемые для вычисления каталитической активности, приведенной в табл. 19, для каждого проанализированного варианта РХа в присутствии и отсутствие кофактора РХа (РУа). Аппроксимированные значения константы Михаэлиса-Ментен, КМ и рассчитанные каталитические константы скорости, к_са1 для каждого мутанта РХа, а также рекомбинантного РХа дикого типа (обозначенный как РХа νΓ) и очищенного из плазмы РХа (Наета!о1од1с ТесЬпо1од1ез, Шс) приведены в табл. 17 и 18, соответственно, ниже. В табл. 17 и 18 также приведены стандартное отклонение (8.Ό.), коэффициент вариации (выраженный в процентах; %СУ) и число проведенных анализов (п) для кинетических параметров К_М и к_са1. Каждый кинетический параметр определяли для мутантов РХа в присутствии и отсутствие кофактора РХа, РУа.

Рассчитанные значения к_са1 для полипептидов РХа, приведенные в табл. 18, делили на аппроксимированные значения КМ, приведенные в табл. 17, чтобы получить кинетическую константу для каталитической активности, к_са1/К_М (М'¹с'¹). Каталитическая активность мутантов РХа приведена в табл. 19 в виде константы каталитической активности и также выражена в проценте от активности РХа дикого типа. Также в табл. 19 представлена относительная зависимость от кофактора (последняя колонка), где зависимость от кофактора определяют как отношение каталитической активности (к_са1/К_М) в присутствии РУа (РУа-зависимая каталитическая активность) к каталитической активности (к_са1/К_М) в отсутствие РУа (РУа-независимая каталитическая активность).

Там, где активность варианта РХа сравнивали с активностью РХа дикого типа (% от к_са1/К_М ν^, сравнение проводили с активностью рекомбинантного полипептида РХа дикого типа (РХа ν^, который был экспрессирован и очищен в тех же условиях, что и варианты полипептидов РХа, чтобы любые различия в активности были результатом мутации (мутаций), а не результатом различий, например, в посттрансляционных модификациях, связанных с экспрессирующими системами. Таким образом, полипептид РХа дикого типа, использованный для сравнения, представлял собой рекомбинантный РХа дикого типа, полученный путем клонирования гена РХ, последовательность которого приведена в 8РО ГО N0: 1, и экспрессии в клетках СН0 в виде полипептида с аминокислотной последовательностью, приведенной в виде аминокислот 1-139 и 195-448 из 8ЕЦ ГО N0: 134, как описано в примере 2.

Наблюдаемые каталитические активности (к_са1/К_М в табл. 19) вариантов РХа представляли собой активности в диапазоне от отсутствия обнаруживаемой протромбиназной активности у небольшого числа вариантов (например, РХа-0197Р, РХа-0198А, РXа-^378N и РХа-П95Ь/У1968) до небольшого увеличения к_са1/К_М для активации протромбина (Рй) по сравнению с РХа дикого типа (например, РХаР65ЖЕ678/У1968, РХа-К236У, РХа-У1968 и РХа-Ь2118/0219Н). Некоторые варианты демонстрируют значительное увеличение зависимости от кофактора по сравнению с РХа дикого типа, в том числе РХа- 106 028865

У1968, РХа-К3388, РХа-И95Р, РХа-О1978 и их комбинации, такие как РХа-У1968/К3388, РХаУ1968/К326М, РХа-У1968/К326К, РХа-У1968/К276Е и РХа-У1968/К332О. Улучшение зависимости от кофактора наблюдалось, в основном, из-за уменьшения активности вариантов РХа в отсутствие РУа, тем не менее, некоторые варианты также демонстрировали более низкую аффинность к субстрату в отсутствии кофактора, что демонстрируют значения К_М, которые были 3-5 раз ниже в РУа-зависимых анализах (табл. 17).

Несколько вариантов РХа, в которые вносили мутации, чтобы создать один или множество дополнительных сайтов гликозилирования, демонстрировали активность, близкую к активности дикого типа (например, РХа-Р82К/Р848/У1968, РХа-О114К/У1968/Р264К/Р2668, РХа-У1968/Р264К/Р2668/К388К и РХа-О114К/У1968/Р2118/О219Н); тогда как другие варианты показывали сниженную каталитическую активность.

Значения аппроксимации К_М для мутантов РХа

Таблица 17

Мутация (нумерация зрелого РХ)	Мутация (нумерация по химотрипсину)	РУа π	рисутствует	Без РУа
Κ_Μ (нМ)	±δ.ϋ. (нМ)	%СУ	η	Км(нМ)	±8.1). (нМ)	%СУ	η
РХа плазмы	РХа плазмы	146,0	49,9	34%	120	145,5	44,4	31%	100
РХ дикого типа	РХ дикого типа	165,2	78,0	47%	38	127,9	22,0	17%	16
1195Ь	116Ь	101,8	41,5	41%	28	145,6	63,5	44%	10
VI961	У171	129,5	3,1	2%	2	136,7	11,0	8%	2
VI968	У178	78,2	22,0	28%	47	252,5	185,5	73%	25
Τ85Ν/Κ87δ/νΐ96δ	Τ[85]Ν/Κ[87]8/νΐ7δ	38,6	3,1	8%	3	499,5	334,2	67%	3
(256Ν/()58δ/νΐ96δ	ς[56]Ν/ρ[58]δ/νΐ78	76,9	29,9	39%	3	384,8	352,7	92%	3
Κ62Ν/Ο648/ν 1968	Κ[62]Ν/Ο[64]3/νΐ73	109,7	16,5	15%	2	461,8	360,4	78%	3
Ь65Р1/Е678/У1968	Ε[65]Ν/Ε[67]8/νΐ78	60,8	13,4	22%	2	977,7	766,2	78%	3
Ε67Ν/νΐ96δ	Ε[67]Ν/νΐ7δ	107,4	29,2	27%	3	713,2	34,2	5%	2
Ε73Ν/Ο75δ/νΐ96δ	Ε[73]Ν/Ο[75]δ/νΐ7δ	66,7	13,8	21%	3	645,7	502,7	78%	3
Ο75Ν/Ε77δ/νΐ968	Ο[75]Ν/Ε[77]δ/νΐ7δ	63,7	20,7	33%	2	305,5	209,9	69%	3
Κ86Ν/Ε88δ/νΐ96δ	Κ[86]Ν/Ε[88]8/νΐ7δ	98,7	22,2	22%	3	105,1	41,8	40%	3
Ο114Ν/νΐ96δ	Ο[114]Ν/νΐ7δ	113,4	39,1	34%	6	1310,5	976,3	75%	4
Ο95Ν/Ο97δ/νΐ96δ	ϋ[95]Ν/Ο[97]δ/νΐ78	53,6	18,7	35%	4	1422,5	534,3	38%	4
Е828/У1968	Ε[82]8/νΐ78	48,5	12,3	25%	9	194,1	110,0	57%	10
Ε82Ν/Ρ848/νΐ96δ	Ε[821Ν/Ρ(841δ/νΐ78	70,6	19,7	28%	2	593,9	198,7	33%	5
Ο78Ν/Ν808/νΐ96δ	Ο[78]Ν/Ν[80]5/νΐ78	53,7	17,2	32%	4	443,0	457,1	103%	5
Ε77Ν/Κ79δ/νΐ96δ	Ε[77]Ν/Κ[79]δ/νΐ78	88,9	33,1	37%	4	398,2	173,4	44%	4
ϋί 19Ν/Ο121δ/νΐ96δ	ϋ[119]Ν/Ο[121]δ/νΐ7δ	108,5	24,7	23%	4	748,9	526,4	70%	4
Ь83И/У1968	Ε[83]Ν/νΐ7δ	78,5	26,5	34%	4	266,2	74,8	28%	3
К1223/У1965	К[122]8/У178	134,1	32,4	24%	6	978,3	383,3	39%	5
Ε51Ν/νΐ96δ	Ε[51]Ν/νΐ78	118,6	18,9	16%	2	959,7	278,1	29%	2
Ο58Ν/Κ60δ/νΐ968	()[58]Ν/Κ[60]δ/νΐ78	97,9	10,9	11%	2	911,0	215,4	24%	2
Ο114Ν/Ο119Ν/Ο1218/νΐ96δ	Ο[114]Ν/Ο[119]Ν/Ο[121]δ/νΐ7δ	54,9	15,6	28%	4	92,0	25,0	27%	4
Ο198Α	Ο19Α	Нет активности	нд	НД	0	нд	нд	нд	0
С198У	О19У	Нет активности	нд	нд	0	НД	нд	нд	0
Ο198Κ	019Κ	Нет активности	нд	нд	0	НД	нд	нд	0
С198К	019Κ	Нет активности	НД	нд	0	нд	нд	нд	0
С198Р	019Ρ	Нет активности	НД	нд	0	нд	нд	НД	0
Ο198Η	019Η	Нет активности	нд	нд	0	нд	нд	нд	0
Ь2118/О219Н	Ь328/О40Н		11,7	18%	2	112,1	7,1	6%	2
Ο197Ρ	018Ρ	Нет активности	нд	НД	0	нд	НД	нд	0
ϋ378Ν	Ω194Ν	Нет активности	НД	НД	0	нд	НД	нд	0
ϋ3788	Э1945	Нет активности	НД	НД	0	нд	нд	нд	0
У196Ь	У17Ь	107,9	11,4	11%	2	137,1	42,9	31%	2
У196Т	У17Т	116,4	11,5	10%	2	138,8	13,8	10%	2
У196Р	У17Р	Нет активности	НД	НД	0	нд	НД	нд	0
О197У	018У	Нет активности	НД	НД	0	нд	НД	нд	0
Ο197Τ	018Τ	Нет активности	НД	НД	0	нд	нд	НД	0
01978	0188	103,4	4,0	4%	2	153,9	11,6	8%	2
Ε200Α	Ε21Α	116,8	5,6	5%	2	158,9	11,9	7%	2
Ε2008	\|Ε218	157,3	14,5	9%	2	124,1	46,1	37%	2
Е200У	Е21У	127,7	6,9	5%	2	158,8	22,7	14%	2
Κ2028	«23 8	105,5	1,4	1%	2	152,4	28,9	19%	2
Κ326Α	Κ443Α	119,8	25,5	21%	2	143,2	46,2	32%	2
Κ3268	Κ.1438	101,2	10,2	10%	2	136,9	82,7	60%	2
Κ326Τ	Κ.143Τ	81,3	1,4	2%	2	142,0	87,1	61%	2
К326У	К.143У	63,0	22,1	35%	2	193,5	38,8	20%	2
Κ326ς	Κ.143<5	69,4	9,1	13%	2	143,1	86,1	60%	2
Κ326Ν	Κ.143Ν	82,5	5,2	6%	2	136,2	82,6	61%	2
Η326Μ	Κ.143Μ	78,7	5,1	6%	2	174,3	41,2	24%	2
Κ326Κ	Κ.143Κ	114,2	19,6	17%	2	158,1	16,9	11%	2
Ρ326Υ	Κ143Υ	68,2	14,6	21%	2	144,8	29,8	21%	2
Τ327Α	Τ144Α	116,5	24,8	21%	2	169,3	60,7	36%	2
Т327Б	Т144Б	127,1	32,8	26%	3	198,1	91,9	46%	2
5334Α	8152Α	115,4	18,0	16%	2	150,0	67,1	45%	2
8334Τ	8152Τ	106,6	24,3	23%	2	160,4	52,0	32%	2
8334Ν	8152Ν	95,6	22,6	24%	2	160,7	58,3	36%	2
Κ336Ε	Κ.154Ε	105,7	20,2	19%	3	158,3	39,4	25%	2
Κ338Α	Κ.156Α	100,0	20,1	20%	5	168,5	34,3	20%	4

- 107 028865

К.3385	Κ1568	109,7	18,3	17%	5	167,1	20,6	12%	4
Κ338Ν	Κ156Ν	115,0	40,6	35%	3	159,6	60,8	38%	2
К338К	Κ156Κ.	112,2	4,0	4%	2	182,4	55,9	31%	2
К338У	К156У	90,1	24,4	27%	2	158,7	35,3	22%	2
Κ338Υ	Κ156Υ	151,8	0,5	0%	2	167,1	35,2	21%	2
К338М	Κ156Μ	180,3	26,3	15%	2	180,0	27,8	15%	2
Т327А/К338А	Τ144Α/Κ156Α	187,9	19,9	11%	2	255,8	47,3	18%	2
Т327Б/К338М	Τ1441/Κ156Μ	151,7	11,1	7%	2	174,8	27,1	16%	2
Ε200ν/Τ327Ι7Κ338Μ	Е21У/Т1441/К156М	125,8	9,5	8%	2	163,4	33,4	20%	2
Е200У/Т327Ь/8334А/К338М	Е21У/Т144Ь/8152А/К156М	70,0	7,3	10%	2	171,7	11,9	7%	2
V1968/0197Α	У175/О18А	Нет активности	НД	нд	0	нд	нд	нд	0
У1968/Ь2118/0219Η	У178/1325/О40Н	48,2	11,5	24%	11	116,1	12,3	11%	2
Б119Ν/01218/У1965/Б2118/0219Η	Β[119]Ν/Ο[121]8/νΐ78/1325/Ο40Η	41,3	23,0	56%	2	101,5	52,0	51%	2
0114Ν/ν 1968/Б2118/0219Н	0[ 114]Ν/νΐ7δ/Ε328/Ο40Η	37,3	17,1	46%	2	76,2	21,0	28%	2
0114Ν/Β119Ν/01218/У 1968/Ь2118/0219 Н	0[ 114]Ν/Β[ 119]Ν/0[ 121 ] 8/У 178/1328/0 40Η	41,4	18,2	44%	3	132,1	55,9	42%	4
О197А/Ь2118/0219Н	Ο18Α/1325/Ο40Η	96,1	28,9	30%	2	114,0	26,6	23%	3
V1968/0197А/Ь2118/0219Н	У178/О18А/1328/О40Н	Нет активности	нд	НД	0	нд	нд	нд	0
1195Ь/У1968	И61/У178	Нет активности	нд	нд	0	нд	нд	нд	0
1195Ь/О197А	И61/О18А	Нет активности	НД	нд	0	нд	нд	нд	0
1195Ь/Ь2115/О219Н	Ι161/1325/Ο40Η	111,0	44,4	40%	4	257,4	147,8	57%	5
νΐ96δ/Ν214Β	νΐ78/Ν35Β	63,4	6,4	10%	3	250,7	0,1	0%	2
νΐ96δ/Ν214Α	νΐ7δ/Ν35Α	82,9	16,1	19%	2	185,1	57,9	31%	2
νΐ968/Ν214δ	νΐ7δ/Ν35δ	79,5	9,4	12%	2	158,1	24,4	15%	2
У1968/Е216К.	У178/Е37К	59,1	7,9	13%	3	269,3	2,9	1%	2
У1968/Е216К	У178/Е37К	70,0	1,0	1%	2	258,3	132,8	51%	2
У1968/Е216А	У178/Е37А	66,6	4,7	7%	2	268,6	91,8	34%	2
У1968/Е2168	У178/Е378	79,5	19,0	24%	2	165,7	80,4	49%	2
У1968/Е218К.	У178/Е39К.	64,3	15,8	25%	3	231,9	7,1	3%	2
У1968/Е218К	У178/Е39К	76,6	9,4	12%	2	204,2	41,1	20%	2
У1968/Е218А	У178/Е39А	79,2	6,3	8%	2	217,1	5,3	2%	2
У1968/К332А	У178/К150А	67,8	19,5	29%	4	372,0	82,3	22%	3
У1968/К332В	У178/К150В	87,0	53,1	61%	5	149,2	53,1	36%	5
У1968/К332Е	У178/К150Е	55,1	14,2	26%	2	178,2	68,3	38%	2
У1968/К3328	У175/К.1508	70,6	32,2	46%	6	147,0	33,9	23%	5
У1968/К332О	У178/К150О	54,5	21,7	40%	5	192,8	74,8	39%	4
У1968/К326Е	У178/К143Е	нд	нд	нд	0	нд	нд	нд	0
У1968/К326В	У175/К143В	18,8	8,9	48%	5	2169,5	32,5	1%	2
У1968/К326М	У178/К143М	39,4	1,4	3%	2	265,9	72,4	27%	2
νΐ96δ/Κ326Ν	νΐ7δ/Κ143Ν	20,1	3,6	18%	3	338,3	100,5	30%	2
νΐ968/Κ326ς	νΐ78/Κ143ς	22,1	5,8	26%	12	892,1	577,8	65%	3
У1968/К273Е	У178/К93Е	58,7	4,9	8%	3	199,1	38,2	19%	2
У1968/К273А	У178/К93А	62,6	10,7	17%	2	152,0	34,4	23%	2
У1968/К424А	У178/К240А	65,0	15,9	25%	2	107,3	1,5	1%	2
У1968/К424Е	У178/К240Е	66,3	5,5	8%	7	173,2	70,8	41%	2
У1968/К420А	У178/К236А	54,7	20,3	37%	2	70,9	24,1	34%	2
У1965/К420Е	У178/К236Е	49,9	16,0	32%	2	102,2	13,1	13%	2
У1968/К306Е	У178/К.125А	66,6	3,8	6%	2	110,5	нд	нд	1
У1968/К276А	У178/К96А	58,3	11,6	20%	2	339,1	96,2	28%	2
У1968/К276Е	У173/К96Е	47,0	8,1	17%	2	436,6	5!,!	12%	2
У1968/К420Е/К424Е	У178/К236Е/К240Е	60,0	22,0	37%	3	167,5	111,4	67%	2
V1968/Κ273 Ε/Κ420Ε/Κ424Ε	V175/Κ93Ε/Κ236Ε/Κ240Ε	НД	нд	НД	0	нд	нд	нд	0
V1968/Κ273 Ε/Κ306Ε/Κ420Ε/Κ424Ε	V178/Κ93 Ε/Κ! 25Ё/К236Е/К240Е	Нет активности	НД	НД	0	нд	нд	нд	0
У1968/К338А	У178/К156А	17,5	2,8	16%	2	820,8	417,6	51%	2
У1968/К3388	У178/К1568	17,9	5,1	29%	10	2996,2	1390,0	46%	8
νΐ968/Ε215Ν/Ν2178	νΐ78/Ε36Ν/Ν38δ	151,7	32,4	21%	3	1078,5	634,6	59%	4
νΐ968/Ε264Ν/Ε2668	νΐ78/Ε84Ν/Ε86δ	97,4	16,0	16%	4	948,7	447,3	47%	4
Б119Ν/01218/У 1965/Ε264Ν/Ε2665	Β[119]Ν/Ο[121]δ/νΐ7δ/Ε84Ν/Ε86δ	101,1	69,8	69%	2	179,5	89,6	50%	2
0114Ν/ν 1965/Ε264Ν/Ε2665	0[114]Ν/νΐ7δ/Ε84Ν/Ε868	57,1	19,4	34%	2	88,0	51,4	58%	2
νΐ96δ/Κ429Ν/Ε4318	νΐ78/Κ245Ν/1247δ	110,7	4,7	4%	2	512,1	122,8	24%	2
νΐ96δ/Κ243Ν/Κ245δ	νΐ78/Κ63Ν/Κ658	33,2	4,2	13%	3	86,2	57,9	67%	2
νΐ968/Τ293Ν/Κ295δ	νΐ73/Τ113Ν/Κ1158	154,9	45,9	30%	2	944,4	379,5	40%	2
νΐ96δ/Β389Ν/Υ391δ	νΐ7δ/Β205Ν/Υ2075	119,8	98,2	82%	2	95,9	62,6	65%	3
νΐ96δ/Κ388Ν	νΐ78/Κ204Ν	134,0	54,7	41%	5	1522,3	969,2	64%	4
В119Ν/01218/У 1965/Κ3 88Ν	Β[ 119]Ν/0[ 121 ] 8/У 178/Κ204Ν	61,4	25,3	41%	2	63,7	13,9	22%	2
νΐ965/Τ428Ν/Ο4305	νΐ78/Τ244Ν/Ο246δ	88,5	23,9	27%	2	839,1	63,1	8%	2
V1968/Ь2118/0219Η/Ε264Ν/Ε2668	V178/1328/Ο40Η/Ε84Ν/Ε86δ	30,7	7,2	23%	3	166,0	44,8	27%	2
Β119Ν/0121δ/ν 1968/12118/0219Η/Ε264Ν	Β[119]Ν/Ο[121 ]8/У175/Ε323/Ο40Η/Ε84	40,5	8,1	20%		75,5	18,9	25%	2
/Е2665	Ν/Ε868	ζ
0114Ν/ν 1968/Ь2118/0219Η/Ε264Ν/Ε2665	0[ 114]Ν/νΐ73/Ε325/Ο40Η/Ε84Ν/Ε868	62,4	21,0	34%	4	77,5	17,9	23%	2
V1965/Ε264Ν/Ε2665/Κ3 88Ν	V178/Ε84Ν/Ε865/Κ204Ν	64,2	36,0	56%	2	66,8	15,3	23%	2
В119Ν/01218/У 1965/Б2118/0219Η/Κ3 88 Ν	Β[119]Ν/0[121]5/νΐ75/Ε325/040Η/Κ20 4Ν	57,2	24,5	43%	3	68,0	22,9	34%	2
0114Ν/νΐ96δ/Ε2118/0219Η/Κ388Ν	0[114]Ν/νΐ78/Ε328/Ο40Η/Κ204Ν	95,7	52,5	55%	4	71,4	23,3	33%	2
V1968/12118/0219Η/Ε264Ν/Ε2668/Κ3 88Ν	νΐ7δ/Ε325/Ο40Η/Ε84Ν/Ε865/Κ204Ν	74,6	1,0	1%	2	133,9	43,3	32%	2

- 108 028865

Рассчитанная к_сяХ Для мутантов РХа

Таблица 18

Мутация (нумерация зрелого РХ)	Мутация (нумерация по химотрипсину)	РУа присутствует	Без РУа
Лса1 (С¹)	±8.ϋ. (с¹)	%СУ	η	^са1 (^с )	±δ.ϋ. (с	%СУ	η
РХа плазмы	РХа плазмы	46,4	16,4	35%	120	1,6Е-02	6,ЗЕ-ОЗ	40%	100
РХ дикого типа	РХ дикого типа	37,8	14,7	39%	38	9,5Е-03	4ДЕ-03	44%	16
1195Ь	116Ь	31,2	8,6	27%	28	ЗДЕ-04	9,4Е-05	30%	10
VI961	У171	28,3	4,7	17%	2	3,0Е-03	8,6Е-05	3%	2
У1963	νΐ78	31,7	10,9	34%	47	3,8Е-05	8ДЕ-06	22%	25
Τ85Ν/Κ878/νΐ968	Τ[85]Ν/Κ[87]8/νΐ78	3,8	0,8	20%	3	5,8Е-05	4ДЕ-05	70%	3
956Ν/<2583/νΐ963	Ω[56]Ν/ρ[58]δ/νΐ7δ	21,1	6,4	30%	3	5,ЗЕ-О5	3,7Е-05	71%	3
Κ62Ν/Ο648/νΐ96δ	Κ[62]Ν/Ο[64]3/νΐ73	42,8	0,2	0%	2	8,5Е-05	6,2Е-05	72%	3
Ь65Ы/Е678/У1968	Ε[65]Ν/Ε[67]8/νΐ78	27,9	9,2	33%	2	1,ЗЕ-04	8,ЗЕ-05	65%	3
Ε67Ν/νΐ96δ	Ε[67]Ν/νΐ7δ	28,9	13,9	48%	3	7,2Е-05	1,8Е-06	3%	2
Ε73Ν/Ο758/νΐ968	Ε[73]Ν/Ο[75]δ/νΐ78	10,9	3,0	27%	3	6,6Е-05	4,6Е-05	70%	3
Ο75Ν/Ε77δ/νΐ96δ	Ο[75]Ν/Ε[77]δ/νΐ7δ	14,8	4,1	28%	2	5,5Е-05	2,9Е-05	52%	3
Κ86Ν/Ε888/νΐ968	Κ[86]Ν/Ε[88]8/νΐ78	30,0	16,0	53%	3	7,ЗЕ-05	2,8Е-05	39%	3
Ο114Ν/νΐ968	Ο[114]Ν/νΐ78	21,4	7,0	33%	6	1,4Е-04	8,2Е-05	60%	4
Ο95Ν/Ό978/νΐ96δ	Ο[95]Ν/ϋ[97]δ/νΐ78	13,5	3,1	23%	4	2,5Е-05	ДЗЕ-05	53%	4
Е823/У1963	Ε[82]δ/νΐ7δ	7,2	3,8	53%	9	1,7Е-05	5,4Е-06	32%	10
Ε82Ν/Ρ848/νΐ968	Ε[82]Ν/Ρ[84]δ/νΐ78	15,0	0,9	6%	2	2,6Е-05	7,6Е-06	29%	5
Ο78Ν/Ν808/νΐ96δ	Ο[78]Ν/Ν[80]8/νΐ78	6,5	2,2	34%	4	1,8Е-05	9,6Е-06	55%	5
Ε77Ν/Κ798/νΐ96δ	Ε[77]Ν/Κ[79]δ/νΐ7δ	11,3	2,4	22%	4	2,9Е-05	9,0Е-06	31%	4
Ό119Ν/Ο1218/νΐ968	Ό[119]Ν/Ο[121]8/νΐ78	22,0	4,9	22%	4	4,4Е-05	2,7Е-05	60%	4
Ε83Ν/νΐ968	Ε[83]Ν/νΐ78	11,2	0,8	7%	4	ЗДЕ-05	Ι,ΟΕ-05	33%	3
К1223/У1963	Κ[122]δ/νΐ7δ	19,5	6,5	33%	6	6,ЗЕ-05	ЗДЕ-05	49%	5
Ε51Ν/νΐ968	Ε[51]Ν/νΐ78	27,1	6,7	25%	2	1,2Е-04	2,ЗЕ-05	20%	2
Ρ58Ν/Κ608/νΐ96δ	Ρ[58]Ν/Κ[60]8/νΐ78	22,5	1,5	7%	2	9,ЗЕ-05	Д6Е-05	18%	2
0114Ν/Ό119Ν/01218/ν 1968	Ο[114]Ν/ϋ[119]Ν/Ο[121]8/ VI78	18,0	6,4	36%	4	8,7Е-06	2ДЕ-06	24%	4
Ο198Α	019Α	Нет активности	нд	нд	0	Нет активности	НД	нд	0
О198У	Ο19ν	Нет активности	нд	нд	0	Нет активности	НД	НД	0
Ο198Κ.	019Κ	Нет активности	нд	нд	0	Нет активности	НД	НД	0
Ο198Κ	019Κ	Нет активности	нд	нд	0	Нет активности	нд	НД	0
Ο198Ρ	019Ρ	Нет активности	НД	нд	0	Нет активности	нд	НД	0
Ο198Η	Ο19Η	Нет активности	НД	нд	0	Нет активности	нд	нд	0
Ь2118/О219Н	Ь328/О40Н	28,0	7,7	28%	2	7,0Е-03	7ДЕ-05	1%	2
С3197Р	Ο18Ρ	Нет активности	НД	нд	0	Нет активности	НД	нд	0
Ό378Ν	Ό194Ν	Нет активности	НД	нд	0	Нет активности	НД	НД	0
Ό3783	Ό1943	Нет активности	НД	нд	0	Нет активности	НД	НД	0
У196Ь	У17Ь	39,8	5,1	13%	2	1 ДЕ-ОЗ	1ДЕ-04	10%	2
νΐ96Τ	νΐ7Τ	39,4	8,0	20%	2	2,8Е-04	6,0Е-05	22%	2
У196Р	νΐ7Ρ	Нет активности	нд	нд	0	Нет активности	нд	нд	0
О197У	Ο18ν	Нет активности	нд	НД	0	Нет активности	нд	нд	0
Ο197Τ	Ο18Τ	Нет активности	НД	нд	0	Нет активности	нд	нд	0
01978	0188	20,7	1,7	8%	2	1,6Е-04	3,5Е-05	23%	2
Ε200Α	Ε21Α	29,6	6,8	23%	2	1,5Е-03	4,5Е-04	29%	2
Ε2003	Ε218	17,7	1,7	9%	2	2,8Е-03	7,8Е-04	27%	2
Ε200ν	Ε2ΐν	30,2	5,5	18%	2	2ДЕ-03	4,4Е-04	22%	2
Κ2023	Κ238	39,1	1,7	4%	2	1,6Е-03	2,5Е-05	2%	2
Κ.326Α	Κ143Α	19,4	2,6	13%	2	6ДЕ-03	1,6Е-03	27%	2
Κ.3268	Κ.1433	17,2	1,6	9%	2	2,6Е-03	Ι,ΟΕ-03	39%	2
Κ.326Τ	Κ.143Τ	16,8	0,5	3%	2	2,2Е-03	8ДЕ-04	36%	2
К326У	К.143У	27,0	1,7	6%	2	4,7Е-03	1,4Е-03	30%	2

- 109 028865

- 110 028865

ϋ 119Ν/Ο1218/ν 1968/Ε264Ν /Е2668	ϋ[119]Ν/Ο[121]δ/νΐ7δ/Ε84Ν /Е863	12,6	10,9	87%	2	3,0Ε-05	1,2Ε-05	42%	2
ΟΙ 14Ν/νΐ96δ/Ε264Ν/Ε266δ	Ο[114]Ν/νΐ78/Ε84Ν/Ε86δ	23,2	0,0	0%	2	2,0Ε-05	1,7Ε-06	9%	2
νΐ96δ/Κ429Ν/Ε431δ	νΐ7δ/Κ245Ν/Ε247δ	25,0	8,1	32%	2	4ДЕ-05	6,7Ε-06	16%	2
νΐ96δ/Κ243Ν/Κ245δ	νΐ7δ/Κ63Ν/Κ65δ	5,1	1,7	34%	3	6ДЕ-05	4,9Ε-05	81%	2
νΐ96δ/Τ293Ν/Κ295δ	νΐ7δ/Τ113Ν/Κ115δ	23,1	9,4	40%	2	7,7Ε-05	1,6Ε-05	20%	2
νΐ96δ/Ο389Ν/Υ391δ	VI78/0205Ν/Υ2073	8,5	2,8	34%	2	Ι,ΙΕ-04	5,3Ε-05	47%	3
νΐ96δ/Κ388Ν	νΐ78/Κ204Ν	24,3	6,9	28%	5	1,4Ε-04	9,8Ε-05	73%	4
ϋ119Ν/Ο121δ/νΐ96δ/Κ388Ν	ϋ[119]Ν/Ο[121]δ/νΐ7δ/ Κ204Ν	24,0	0,3	1%	2	1,7Ε-05	6,4Ε-06	38%	2
νΐ96δ/Τ428Ν/Ο430δ	νΐ7δ/Τ244Ν/Ο246δ	21,0	2,4	11%	2	8,2Ε-05	3,5Ε-06	4%	2
V1968/Έ211 δ/Ο219Η/Ε264Ν /Ε266δ	V178/Ε328/Ο40Η/Έ84Ν/Έ868	13,1	5,1	39%	3	1,9Ε-05	8,8Ε-06	46%	2
ϋ 119Ν/0121 δ/ν 1968/Ь2118/ Ο219Η/Ε264Ν/Ε2668	0[119]Ν/Ο[121 ]8/νΐ 78/Ь328/ Ο40Η/Ε84Ν/Ε863	13,8	2,7	20%	2	1,8Ε-05	1,4Ε-05	76%	2
0114Ν/ν 1965/Σ2118/0219Η /Ε264Ν/Ε2668	0[ 114]Ν/ν 178/Ь323/О40Н/ Ε84Ν/Ε863	15,4	6,8	44%	4	8,4Ε-06	3,9Ε-06	47%	2
V1968/Ε264Ν/Ε2663/Κ3 8 8Ν	νΐ7δ/Ε84Ν/Ε86δ/Κ204Ν	17,2	2,3	14%	2	1,0Ε-05	6,0Ε-06	59%	2
Ш19Ν/Ο121 δ/ν 1963/Ь2118/ Ο219Η/Κ388Ν	ϋ[119]Ν/Ο[121]δ/νΐ7δ/Ε32δ/ 040Η/Κ204Ν	7,7	2,1	27%	3	9,0Ε-06	5,2Ε-06	58%	2
0114Ν/ν 1963/Ь2113/0219Η /Κ388Ν	0[114]Ν/νΐ78/Ε32δ/Ο40Η/ Κ204Ν	24,3	19,3	79%	4	8,3Ε-06	5,9Ε-06	71%	2
V1963/Ь2113/0219Η/Ε264Ν /Ε2663/Κ388Ν	VI73/Ε323/Ο40Η/Ε84Ν/Ε863 /Κ204Ν	10,4	1,1	11%	2	1,9Ε-05	1,4Ε-05	70%	2

Таблица 19

Рассчитанная константа специфичности (к_са!/К_М) и

относительная зависимость от кофактора вариантов РХа

Мутация (нумерация зрелого ГХ)	Мутация (нумерация по химотрипсину)	Зависимая от РУа каталитическая активность (РУа присутствует)	Не зависимая от РУа каталитическая активность (Без РУа)	Относительная зависимость от кофактора
А_са1/А_м (М^с’¹)	±δ.ϋ. (М’с¹)	%СУ	% от ЛсЛ \ντ	»	Л_са1/А_м (М-’с¹)	±δ.ϋ. (М-'с'¹)	%СУ	% от АсЛ \ντ	η
РХа плазмы	РХа плазмы	ЗДЕ+08	1ДЕ+08	34%	129%	120	Ι,ΙΕ+05	4,5Е+04	40%	151%	100	2941
РХа дикого типа	РХа дикого типа	2,6Е+08	1ДЕ+08	42%	100%	38	7,5Е+04	3,0Е+04	40%	100%	16	3427
Ι195Ε	116Ь	3,2Е+08	8,ЗЕ+07	26%	126%	28	2,ЗЕ+ОЗ	9,6Е+02	41%	3%	10	138730
VI961	У171	2,2Е+08	ЗДЕ+07	14%	85%	2	2,2Е+04	1ДЕ+03	5%	29%	2	9857
У1968	νΐ7δ	4,2Е+08	1,5Е+08	36%	163%	47	2,2Е+02	1,2Е+02	56%	0,3%	25	1949704
Τ85Ν/Κ87δ/νΐ968	Τ[85]Ν/Κ[87]δ/νΐ7δ	9,7Е+07	1,2Е+07	12%	38%	3	1,2Е+02	5,0Е+01	41%	0,2%	3	796199
Ο56Ν/<358δ/νΐ96δ	Ο[56]Ν/Ο[58]δ/νΐ7δ	2,8Е+08	2,7Е+07	10%	109%	3	1,7Е+02	6,6Е+01	40%	0,2%	3	1689225
Κ62Ν/Ο64δ/νΐ968	Κ[62]Ν/Ο[64]δ/νΐ7δ	3,9Е+08	5,8Е+07	15%	153%	2	2,0Е+02	6ДЕ+01	30%	0,3%	3	1954206
Ε65Ν/Ε67δ/νΐ96δ	Ε[65]Ν/Ε[67]δ/νΐ7δ	4,5Е+08	5,2Е+07	11%	176%	2	1,6Е+02	6,ЗЕ+01	39%	0,2%	3	2783973
Ε67Ν/νΐ96δ	Ε[67]Ν/νΐ7δ	2,6Е+08	8,4Е+07	32%	101%	3	1,0Е+02	2,ЗЕ+00	2%	0,1%	2	2577649
Ε73Ν/Ο75δ/νΐ96δ	Ε[73]Ν/Ο[75]δ/νΐ7δ	1,7Е+08	7,6Е+07	44%	67%	3	Ι,ΙΕ+02	2,4Е+01	22%	0,1%	3	1622299
Ο75Ν/Ε77δ/νΐ96δ	Ο[75]Ν/Ε[77]δ/νΐ7δ	2,6Е+08	1,5Е+08	58%	99%	2	2,0Е+02	5ДЕ+01	25%	0,3%	3	1260991
Κ86Ν/Ε88δ/νΐ96δ	Κ[86]Ν/Ι[88]δ/νΐ7δ	2,9Е+08	1,ЗЕ+08	44%	113%	3	7,2Е+02	1,9Е+02	26%	1%	3	404779
Ο114Ν/νΐ96δ	Ο[114]Ν/νΐ7δ	2,0Е+08	6ДЕ+07	31%	77%	6	Ι,ΙΕ+02	3,2Е+01	28%	0,2%	4	1720332
Ό95Ν/Ό97δ/νΐ96δ	Ό[95]Ν/Ο[97]δ/νΐ7δ	2,7Е+08	1,ОЕ+08	38%	106%	4	1,7Е+01	5,5Е+00	32%	0,0%	4	15813111
Ε82δ/νΐ96δ	Ε[82]δ/νΐ7δ	1,5Е+08	9,5Е+07	61%	60%	9	Ι,ΙΕ+02	6ДЕ+01	56%	0,1%	10	1414270
Ε82Ν/Ρ84δ/νΐ96δ	Ε[82]Ν/Ρ[84]δ/νΐ7δ	2.2Е+08	7,5Е+07	34%	87%	2	4,8Е+01	1,6Е+01	33%	0,1%	5	4676971
Ο78Ν/Ν80δ/νΐ96δ	Ο[78]Ν/Ν[80]δ/νΐ7δ	1,ЗЕ+08	5,7Е+07	45%	49%	4	5,8Е+01	3,7Е+01	64%	0,1%	5	2180187
Ε77Ν/Κ79δ/νΐ96δ	Ε[77]Ν/Κ[79]δ/νΐ7δ	1,5Е+08	8ДЕ+07	57%	57%	4	7,7Е+01	1,9Е+01	25%	0,1%	4	1913457
Ό119Ν/Ο121δ/νΐ96δ	Ό[119]Ν/Ο[121]δ/ 'ν17δ	2ДЕ+08	5,2Е+07	25%	80%	4	6,2Е+01	1,4Е+01	23%	0,1%	4	3348627
Ь83Т4/У1968	ί[83]Ν/νΐ7δ	1,5Е+08	3,8Е+07	25%	59%	4	1,2Е+02	4,5Е+01	37%	0,2%	3	1261176
Κ122δ/νΐ96δ	Κ[122]δ/νΐ7δ	1,4Е+08	1,9Е+07	13%	55%	6	6,5Е+01	2,5Е+01	39%	0,1%	5	2200872
Ε51Ν/νΐ96δ	Ε[51]Ν/νΐ7δ	2,ЗЕ+08	2,ОЕ+07	9%	88%	2	1,2Е+02	1,2Е+01	10%	0,2%	2	1858168
Ο58Ν/Κ60δ/νΐ96δ	Ο[58]Ν/Κ[60]δ/νΐ7δ	2,ЗЕ+08	4ДЕ+07	18%	90%	2	1,0Е+02	6,ЗЕ+00	6%	0,1%	2	2265746
ΟΙ 14Ν/Ο119Ν/Ο121δ/ νΐ96δ	Ο[114]Ν/ϋ[119]Ν/ Ο[121]δ/νΐ7δ	3,2Е+08	4ДЕ+07	13%	125%	4	Ι,ΙΕ+02	5,4Е+01	51%	0,1%	4	3062135
Ο198Α	Ο19Α	Нет активности	нд	нд	0%	0	Нет активности	нд	НД	НД	0	нд
О198У	О19У	Нет активности	нд	нд	0%	0	Нет активности	нд	нд	НД	0	нд
Ο198Κ	Ο19Ρ	Нет активности	нд	нд	0%	0	Нет активности	нд	НД	НД	0	нд
Ο198Κ	Ο19Κ	Нет активности	нд	нд	0%	0	Нет активности	нд	НД	НД	0	НД
Ο198Ρ	Ο19Ρ	Нет активности	нд	нд	0%	0	Нет активности	нд	НД	НД	0	НД
Ο198Η	Ο19Η	Нет активности	нд	нд	0%	0	Нет активности	НД	НД	НД	0	НД
Ь2118/О219Н	ΙΟ2δ/Ο40Η	4,ЗЕ+08	4ДЕ+07	10%	168%	2	6,2Е+04	4,6Е+03	7%	83%	2	6920
Ο197Ρ	Ο18Ρ	Нет активности	НД	нд	0%	0	Нет активности	нд	НД	НД	0	НД
Ό378Ν	Ό194Ν	Нет активности	НД	нд	0%	0	Нет активности	нд	НД	НД	0	НД
Ό378δ	Ό194δ	Нет активности	НД	НД	0%	0	Нет активности	НД	НД	НД	0	НД
У196Б	У17Ь	3,7Е+08	8,6Е+07	23%	145%	2	8,4Е+03	1,8Е+03	22%	11%	2	44694
У196Т	У17Т	3,4Е+08	1,0Е+08	30%	134%	2	2,0Е+03	2,4Е+02	12%	3%	2	172484
У196Р	У17Р	Нет активности	НД	НД	0%	0	Нет активности	нд	НД	НД	0	нд
О197У	О18У	Нет активности	НД	НД	0%	0	Нет активности	нд	НД	НД	0	нд
Ο197Τ	Ο18Τ	Нет активности	НД	НД	0%	0	Нет активности	НД	НД	НД	0	НД
Ο197δ	Ο18δ	2,0Е+08	8,4Е+06	4%	78%	2	1,0Е+03	1,5Е+02	15%	1%	2	198192
Ε200Α	Ε21Α	2,5Е+08	4,6Е+07	18%	98%	2	9,5Е+03	2ДЕ+03	22%	13%	2	26489

- 111 028865

Е2003	Ε213	Ι,ΙΕ+08	2,7Е+05	0%	44%	2	2,ЗЕ+04	2,4Е+03	10%	31%	2	4796
Е200У	Е21У	2,4Ε+08	ЗДЕ+07	13%	92%	2	1,ЗЕ+04	9,5Е+02	7%	17%	2	18368
Κ2023	Κ233	3,7Ε+08	2ДЕ+07	6%	144%	2	Ι,ΙΕ+04	2,2Е+03	20%	14%	2	34688
Κ.326Α	Κ.143Α	1,6Ε+08	1,ЗЕ+07	8%	64%	2	4,ЗЕ+04	2,5Е+03	6%	57%	2	3817
Κ3263	Κ.1433	1,7Ε+08	1,ЗЕ+06	1%	66%	2	2ДЕ+04	5ДЕ+03	25%	28%	2	8216
Κ326Τ	Κ.143Τ	2,1Ε+08	2,6Е+06	1%	80%	2	1,7Е+04	5,0Е+03	29%	23%	2	11901
К326У Κ326ζ) Κ326Ν Κ326Μ Κ326Κ Κ326Υ Τ327Α Т327Ь 3334Α 3334Τ 3334Ν Κ336Ε Κ338Α Κ3383 Κ338Ν Κ338Κ. К338У Κ338Υ Κ338Μ Τ327Α/Κ338Α Т327Ь/К338М Ε200ν/Τ327Ε/Κ338Μ	К143У К.143Ц Κ143Ν Κ.143Μ Κ.143Κ Κ.143Υ Τ144Α Т144Б 3152Α 3152Τ 3152Ν Κ.154Ε Κ156Α Κ1563 Κ156Ν Κ156Κ К156У Κ156Υ Κ156Μ Τ144Α/Κ156Α Т1441УК156М Е21У/Т1441УК156М	4,5Ε+08 2,4Ε+08 2,3Ε+08 1,8Ε+08 1,3Ε+08 3,3Ε+08 2,9Ε+08 2,9Ε+08 2,3Ε+08 3,2Ε+08 3,2Ε+08 3,2Ε+08 3,6Ε+08 2,9Ε+08 2,9Ε+08 3,7Ε+08 3,9Ε+08 ЗДЕ+08 3,0Ε+08 2,4Ε+08 1,9Ε+08 3,0Ε+08	1,ЗЕ+08 3,ЗЕ+07 3,5Е+06 4,6Е+06 1,2Е+07 1,9Е+07 2,4Е+07 Ι,ΙΕ+08 5ДЕ+07 8,7Е+07 7,ЗЕ+07 8,4Е+07 4,2Е+07 4,5Е+07 5,5Е+07 7,9Е+06 6,7Е+07 5,4Е+07 2,4Е+07 5,ЗЕ+06 2,ЗЕ+06 Ι,ΙΕ+07	29% 14% 2% 3% 9% 6% 8% 37% 22% 27% 23% 26% 12% 15% 19% 2% 17% 17% 8% 2% 1% 4%	176% 93% 89% 70% 50% 128% 114% 114% 89% 125% 124% 126% 139% 114% 111% 143% 151% 122% 115% 93% 73% 117%	2 2 2 2 2 2 2 3 2 2 2 3 5 5 3 2 2 2 2 2 2 2	2,4Е+04 1,2Е+04 1,8Е+04 2,0Е+04 6,2Е+03 3,2Е+04 1,7Е+04 2,4Е+04 1,7Е+04 1,6Е+04 1,0Е+04 2,9Е+04 4,4Е+03 2,7Е+03 1,8Е+04 3,ЗЕ+04 6,ЗЕ+ОЗ 9,7Е+03 3,9Е+04 1,0Е+03 3,8Е+04 2,5Е+04	2,5Е+03 3,9Е+03 5,7Е+03 6,4Е+03 9,6Е+02 3,4Е+03 1,7Е+03 9,0Е+03 4,0Е+03 Ι,ΙΕ+04 1,8Е+03 1,0Е+03 1,8Е+03 Ι,ΙΕ+03 ЗДЕ+ОЗ 1,4Е+04 1,6Е+03 9ДЕ+02 1,2Е+04 1,9Е+02 2,9Е+03 3,ЗЕ+03	10% 33% 31% 32% 16% 11% 10% 37% 24% 65% 17% 3% 41% 41% 18% 42% 26% 9% 30% 18% 8% 13%	32% 16% 24% 26% 8% 43% 22% 32% 22% 22% 14% 39% 6% 4% 24% 45% 8% 13% 52% 1% 50% 34%	2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 4 2 2 2 2 2 2 2 2	18752 19958 12662 9107 20886 10164 17524 12215 13610 19693 31084 11104 80902 109860 16112 10973 61833 32379 7576 231251 4966 11872
Е200У/Т327Е/8334А/ Κ338Μ	Ε21У/Т144Ь/8152А/ Κ156Μ	2,9Ε+08	6,1Е+06	2%	114%	2	3,6Е+03	5,5Е+01	2%	5%	2	82667
V1968/0197Α	У173/О18А	Нет активности	нд	нд	0%	0	Нет активности	нд	НД	НД	0	нд
У1968/Ь2118/0219Η	У173/Ь323/О40Н	2,7Ε+08	7,0Е+07	26%	107%	И	1,5Е+02	9,9Е+00	7%	0,2%	2	1825614
ϋ119Ν/Ο121δ/νΐ96δ/ Ь2118/О219Н	ϋ[119]Ν/Ο[121]8/ У178/Ь328/О40Н	4,0Ε+08	1,8Е+08	44%	156%	2	1,7Е+02	1,2Е+02	73%	0,2%	2	2424835
Ο114Ν/νΐ96δ/Ε2118/ Ο219Η	0[114]К/У178/Ь328/ Ο40Η	3,7Ε+08	8,9Е+07	24%	143%	2	1,8Е+02	8,0Е+01	43%	0,2%	2	1991946
ΟΙ 14Ν/Ο119Ν/Ο1213/ У1963/Ь2118/0219Η	0[114]Ν/ϋ[119]Ν/ О[121]3/У173/Ь323/ Ο40Η	3,3Ε+08	2,4Е+07	7%	128%	3	8,ЗЕ+01	2,4Е+01	29%	0,1%	4	3937247
О197А/Б2113/Ο2Ι9Η	О18А/Ь328/О40Н	1,3Ε+08	1,8Е+07	13%	52%	2	1,9Е+03	7,0Е+02	37%	3%	3	69315
V1963/0197А/Ь2113/ Ο219Η	У178/О18А/Ь328/ Ο40Η	Нет активности	нд	нд	0%	0	Нет активности	НД	НД	НД	0	НД
И95Ь/У1968	116Ь/У173	Нет активности	нд	НД	0%	0	Нет активности	НД	нд	НД	0	НД
1195Ь/О197А	1161УО18А	Нет активности	нд	НД	0%	0	Нет активности	НД	НД	НД	0	нд
1195Ь/Ь2113/О219Н	116Ь/Е323/О40Н	2,9Е+08	2,7Е+07	10%	112%	4	7,0Е+02	1ДЕ+02	16%	0,9%	5	411146
νΐ968/Ν214ϋ	νΐ7δ/Ν35ϋ	2ДЕ+08	1,4Е+07	7%	82%	3	1,4Е+02	2,0Е+01	14%	0,2%	2	1467332
νΐ96δ/Ν214Α	νΐ78/Ν35Α	2ДЕ+08	3,8Е+07	18%	82%	2	2,2Е+02	4,7Е+01	22%	0,3%	2	982637
νΐ96δ/Ν214δ	νΐ7δ/Ν358	2,9Е+08	4ДЕ+07	14%	112%	2	3,5Е+02	1,7Е+01	5%	0,5%	2	818829
У1963/Е216К.	У173/Е37К.	2,ЗЕ+08	2,4Е+07	11%	88%	3	1,7Е+02	4ДЕ+01	24%	0,2%	2	1319111
У1968/Е216К	У173/Е37К	3,0Е+08	2ДЕ+07	7%	115%	2	1,8Е+02	7,7Е+01	42%	0,2%	2	1626388
У1963/Е216А	У178/Е37А	2,2Е+08	3,2Е+07	14%	87%	2	1,4Е+02	4,6Е+00	3%	0,2%	2	1615323
У1963/Е2168	У173/Е373	1,9Е+08	7,2Е+06	4%	75%	2	1,8Е+02	1,6Е+01	9%	0,2%	2	1039836
У1968/Е218К	У173/Е39К	1,9Е+08	1,ЗЕ+07	7%	74%	3	1,8Е+02	1,4Е+01	8%	0,2%	2	1028287
У1968/Е218К	У173/Е39К	1,9Е+08	3,4Е+07	18%	73%	2	1,6Е+02	2,ЗЕ+01	14%	0,2%	2	1176402

У1968/Е218А	У173/Е39А	2,5Ε+08	8,ЗЕ+07	34%	96%	2	1,8Е+02	4,7Е+01	26%	0,2%	2	1364144
У1968/К332А	У175/К150А	3,5Ε+08	3,0Е+07	9%	136%	4	2,2Е+02	3,9Е+01	18%	0,3%	3	1618345
У1963/К332О	νΐ78/Κ150ϋ	4,3Ε+08	1,2Е+08	28%	168%	5	1,8Е+02	6,7Е+01	37%	0,2%	5	2395228
У1963/К332Е	У178/К150Е	3,5Ε+08	3,8Е+06	1%	136%	2	3,4Е+02	2,2Е+02	63%	0,5%	2	1019834
У1968/К3328	У178/К1508	3,3Ε+08	3,9Е+07	12%	126%	6	1,5Е+02	3,5Е+01	24%	0,2%	5	2209279
У1968/К332О	У178/К.150О	3,8Ε+08	6ДЕ+07	16%	149%	5	9ДЕ+О1	3,4Е+01	37%	0,1%	4	4218821
У1968/К326Е	У178/К143Е	Нет активноет и	нд	нд	0%	0	Нет активно сти	нд	НД	нд	0	нд
У1968/К326О	νΐ78/Κ143ϋ	1,ЗЕ+08	2,7Е+07	21%	49%	5	3,2Е+00	8,ЗЕ-01	26%	0,0%	2	39452222
У1968/К326М	У178/К143М	2,ЗЕ+08	4ДЕ+06	2%	90%	2	2,2Е+01	1,8Е+00	8%	0,0%	2	10595674
νΐ96δ/Κ326Ν	νΐ7δ/Κ143Ν	ЗДЕ+08	3,4Е+07	11%	121%	3	1,4Е+01	6,5Е-01	5%	0,0%	2	22111090
У1968/К326()	νΐ7δ/Κ143<3	3,0Е+08	5,7Е+07	19%	118%	12	6,6Е+00	2,5Е+00	39%	0,0%	3	46198526
У1968/К273Е	У178/К93Е	3,ЗЕ+08	5,6Е+07	17%	128%	3	2,0Е+02	1.4Е+01	7%	0,3%	2	1681120
У1963/К273А	У178/К93А	2,7Е+08	4,2Е+07	16%	105%	2	1,9Е+02	6,9Е+01	37%	0,2%	2	1446828
У1968/К424А	У178/К240А	2,7Е+08	1,9Е+07	7%	106%	2	2,7Е+02	1,5Е+02	56%	0,4%	2	993583
У1965/К424Е	У178/К240Е	2,4Е+08	5ДЕ+07	21%	95%	7	1,5Е+02	2ДЕ+00	1%	0,2%	2	1663352
У1968/К420А	У178/К236А	2,8Е+08	5,4Е+06	2%	111%	2	4,0Е+02	1,5Е+02	38%	0,5%	2	712414
У1968/К420Е	У178/К236Е	2,2Е+08	5,0Е+07	23%	86%	2	2,4Е+02	9,2Е+01	39%	0,3%	2	927406
У1968/К306Е	У178/К125А	2,2Е+08	5,4Е+07	24%	87%	2	1,9Е+02	нд	нд	0,2%	1	1194201
У1963/К276А	У178/К96А	1,6Е+08	ЗДЕ+06	2%	60%	2	5,0Е+01	5,ЗЕ+00	11%	0,1%	2	3117288
У1963/К276Е	У173/К96Е	1,ЗЕ+08	1,5Е+07	12%	52%	2	2,ЗЕ+01	3,0Е+00	13%	0,0%	2	5713870
У1965/К420Е/К424Е	У178/К236Е/К240Е	7,9Е+07	2,ЗЕ+07	29%	31%	3	1,7Е+02	3,6Е+01	21%	0,2%	2	465277
У1968/К273Е/К420Е/ К424Е	У178/К93Е/К236Е/ Κ240Ε	Нет активности	нд	нд	0%	0	Нет активности	нд	нд	нд	0	нд
У1968/К273Е/К306Е/ К420Е/К424Е	У173/К93Е/К125Е/ Κ236Ε/Κ240Ε	Нет активности	нд	нд	0%	0	Нет активности	НД	нд	нд	0	НД
У1968/К338А	У173/К156А	Ι,ΙΕ+08	3,ЗЕ+07	30%	43%	2	3,9Е+00	9,6Е-01	24%	0,0%	2	28406569

112

028865

У1968/К3388	У178/К1568	1,4Ε+08	4,9Ε+07	34%	56%	10	3,0Ε+00	9,4Ε-01	31%	0,0%	8	47490591
V1965X215Ν/Ν2173	νΐ73Χ36Ν/Ν388	1,7Ε+08	4,9Ε+07	29%	66%	3	8,7Ε+01	5,2Ε+00	6%	0,1%	4	1971094
νΐ96δ/Ε264Ν/Ε266δ	νΐ78Χ84ΝΧ868	2,8Ε+08	6,6Ε+07	23%	111%	4	7,5Ε+01	6,ΟΕ+00	8%	0,1%	4	3815411
ϋ 119Ν/01218/У1963/ Ε264ΝΧ2668	ϋ[119]Ν/Ο[121]3/ νΐ78Χ84ΝΧ868	1,1Ε+08	2,9Ε+07	26%	44%	2	1,7Ε+02	1,5Ε+01	9%	0,2%	2	675381
ΟΙ 14Ν/νΐ96δ/Ε264Ν/ Ε2668	Ο[114]Ν/νΐ78Χ84Ν/ Ε868	4,3Ε+08	1,5Ε+08	34%	168%	2	2,8Ε+02	1,8Ε+02	66%	0,4%	2	1562440
νΐ968/Κ429ΝΧ4318	νΐ78/Κ245ΝΧ2478	2,3Ε+08	8,3Ε+07	36%	89%	2	8,2Ε+01	6,6Ε+00	8%	0,1%	2	2791109
νΐ96δ/Κ243Ν/Κ245δ	νΐ78/Κ63Ν/Κ658	1,5Ε+08	3,5Ε+07	23%	58%	3	6,6Ε+02	1,3Ε+02	19%	0,9%	2	226278
νΐ96δ/Τ293Ν/Κ295δ	νΐ78/Τ113Ν/Κ.1158	1,5Ε+08	1,7Ε+07	12%	57%	2	8,5Ε+01	1,8Ε+01	21%	0,1%	2	1733605
νΐ96δ/Ο389Ν/Υ391δ	νΐ78/Ο205Ν/Υ2078	9,2Ε+07	5ДЕ+07	56%	36%	2	1,3Ε+03	2,7Ε+02	21%	2%	3	70856
νΐ96δ/Κ388Ν	νΐ7δ/Κ204Ν	2,0Ε+08	7,1Ε+07	36%	77%	5	8,7Ε+01	1,0Ε+01	12%	0,1%	4	2288700
ϋ119Ν/01218/У1968/ Κ388Ν	ϋ[119]Ν/Ο[121]3/ νΐ78/Κ204Ν	4,3Ε+08	1,8Ε+08	42%	167%	2	2,6Ε+02	4,4Ε+01	17%	0,3%	2	1661646
νΐ96δ/Τ428Ν/Ο4303	νΐ73/Τ244Ν/Ο2468	2,5Ε+08	9,4Ε+07	38%	97%	2	9,8Ε+01	3,2Ε+00	3%	0,1%	2	2555985
VI963X2113/О219Н/ Ε264Ν/Ε2663	VI78X328/О40Н/ Ε84ΝΧ868	4,2Ε+08	6,7Ε+07	16%	163%	3	1,1Ε+02	2,2Ε+01	20%	0,2%	2	3707889
ϋ119Ν/Ο121δ/νΐ96δ/	ϋ[119]Ν/Ο[121]3/
Ь2113/0219Η/Ε264Ν/	У178Х325/О40Н/	3,4Ε+08	9,6Ε+05	0%	132%	2	2,3Ε+02	Ε3Ε+02	56%	0,3%	2	1486131
Ε2663	Ε84ΝΧ868
ΟΙ 14Ν/ν 1968X2118/ Ο219Η/Ε264ΝΧ2663	Ο[114]Ν/νΐ 78X328/ Ο40Η/Ε84ΝΧ863	2,5Ε+08	7,7Ε+07	30%	98%	4	1,2Ε+02	7,8Ε+01	66%	0,2%	2	2147579
νΐ96δ/Ε264Ν/Ε266δ/ Κ388Ν	νΐ73Χ84Ν/Ε868/ Κ204Ν	3,3Ε+08	2,2Ε+08	67%	128%	2	1,7Ε+02	1,3Ε+02	76%	0,2%	2	1969113
ϋ119Ν/Ο121δ/νΐ96δ/ Ь2113/0219Η/Κ388Ν	ϋ[119]Ν/Ο[121]8/ У178Х328/О40Н/ Κ204Ν	1,5Ε+08	9,1Ε+07	59%	60%	3	1,3Ε+02	3.4Ε+01	27%	0,2%	2	1218354
ΟΙ 14Ν/νΐ 968X2113/ Ο219Η/Κ388Ν	Ο[114]Ν/ν 178X323/ 040Η/Κ204Ν	2,4Ε+08	8,5Ε+07	35%	94%	4	Ι,ΙΕ+02	4,7Ε+01	44%	0,1%	2	2222421
V1968X2118/0219Н/ Ε264ΝΧ2668/Κ388Ν	У178Х323/О40Н/ Ε84ΝΧ868/Κ204Ν	1,4Ε+08	1,3Ε+07	9%	54%	2	1,7Ε+02	1,6Ε+02	92%	0,2%	2	823652

Пример 5. Определение ингибирования РХа комплексом антитромбин/гепарин.

Ингибирование РХа дикого типа или вариантов РХа комплексом антитромбин/гепарин (АТ/гепарин) оценивали путем измерения уровня ингибирования АТ/гепарином каталитической активности РХа в отношении низкомолекулярного субстрата, СН₃80₂-И-СНО-О1у-Аг§-АМС (РеГайиог РХа; Сеп1егсЬет). Значение К₀,₅ определяли для каждого тестируемого варианта РХа, которое соответствует молярной концентрации АТ, необходимой для 50% ингибирования (ГС₅₀) каталитической активности варианта РХа в заранее определенных условиях анализа. Реакции ингибирования проводили в присутствии полноразмерного нефракционированного гепарина (ИРН; Са1ЬюсЬет), который увеличивает скорость реакции ингибирования за счет эффекта "матрицы", создаваемого более длинными цепями гепарина (см., например, 01зоп е1 а1. (2004) ТЬготЬ Наетоз1 92(5), 929-939). Также напрямую оценивали кажущуюся константу скорости второго порядка (к_арр) для ингибирования РХа дикого типа или вариантов РХа комплексом АТ/ИРН, используя модифицированный протокол, в котором варьировало время инкубации с комплексом АТ/ИРН.

А. Ингибирование РХа комплексом антитромбин/ИРН.

Для реакций ингибирования в присутствии ИРН 2х растворы 2000 нМ, 1000 нМ, 200 нМ или 100 нМ АТ/ИРН (конечная концентрация ИРН 2 мкМ) готовили путем разведения 20 мкМ концентрированного раствора очищенного из плазмы человеческого АТ-Ш (Мо1еси1аг Iηηονа1^οηз) в растворе избытка ИРН (2 мкМ) в объеме 1,0 мл 1х буфера А (20 мМ Нерез, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС1₂, 0,01% Т'мееп-20, 0,1% РЕО 8000, рН 7,4). Растворы АТ/ИРН инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем получали серийные разведения в 2 раза в 96-луночном полипропиленовом планшете с круглыми лунками в объеме 500 мкл 1х буфера А, содержащего 2 мкМ ИРН. Финальные разведения АТ зависили от начальной концентрации АТ и были в диапазоне 2000-0 нМ, 1000-0 нМ, 200-0 нМ или 100-0 нМ (т.е. ряды А-Н). Те варианты, которые продемонстрировали увеличенную устойчивость к ингибированию АТ в стандартных условиях, далее тестировали, используя более высокие концентрации АТ. 35 мкл аликвоты каждого разведения АТ распределяли в соответствующие ряды 96-луночного планшета для хранения с лунками с У-образным дном для заполнения всех столбцов лунок (т.е. 1-12). Варианты РХа изначально разбавляли до 100 нМ в 1х буфере А. Далее 50 мкл каждого 100 нМ раствора варианта РХа были разбавлены дл концентрации 2,0 нМ в 2,5 мл 1х буфера А и далее 70 мкл этого раствора распределяли в 96луночный планшет для хранения с лунками с У-образным дном в соответствии с заранее определенной схемой (4 варианта РХа на планшет).

Реакции в рамках анализа инициировали, используя станцию дозирования жидкостей ВюМек РХ, запрограммированную на распределение 35 мкл растворов РХа в планшеты, содержащие 35 мкл каждого разведения АТ/ИРН в лунке, в общей сложности в двух повторных аналитических планшетах для каждого варианта РХа. Конечные условия анализа ингибирования были следующими: 1,0 нМ РХа и разведения АТ/ИРН в диапазоне от 35 до 0 нМ, от 50 до 0 нМ, от 100 до 0 нМ, от 500 до 0 нМ или от 1000 до 0 нМ АТ в 1 мкМ ИРН.

Реакционные смеси с инигибитором далее инкубировали в течение 30 с при комнатной температуре (~25°С), а затем 40 мкл аликвоту реакционной смеси перенесли с помощью станции дозирования жидкостей ВюМек РХ в 96-луночный черный планшет с половинным объемом лунок, содержащий 20 мкл 0,3 мМ раствора РеГайиог Ха в буфере А, в который добавлено 15 мг/мл полибрена. Для остановки реакции АТ/ИРН к реакционной смеси добавляли полибрен (гексадиметрин бромид) в конечной концентрации 5 мг/мл. Остаточную активность РХа оценивали, наблюдая за начальными скоростям расщепления суб- 113 028865

страта в течение 60 мин с помощью планшетного флуориметра при 25°С. Конечные условия анализа для определения остаточной активности были следующими: 2,0 нМ варианта РXа, 0,1 мМ ΡеГаГ1иο^ РX и 5 мг/мл полибрена в буфере А.

Для определения степени ингибирования РXа или вариантов РXа под действием АТ/ЦРН сырые данные, собранные с применением 8οйΜа\ Рго (Μο1еси1а^ Пеукез), экспортировали в виде .ΤXΤ файлов. Далее нелинейный анализ проводили прямо в программном пакете Асί^ν^ίуΒаδе, используя модуль анализа данных ХЕ Киппег (программное обеспечение I^Β8). Для расчета серийных разведений АТ, отношения АТ к РXа и отношений У;/У₀ для каждой повторности РXа при каждой экспериментальной концентрации АТ использовали шаблон. Нелинейный регрессионный анализ остаточной активности РXа (выраженной как У;/У₀) в сравнении с концентрацией АТ проводили, используя гиперболическое уравнение ингибирования, имеющее вид

[С+(Атрх(1-(Х/(Х0,5+Х))))];

где С = отклонение (фиксированное на уровне 0, чтобы сделать возможной экстраполяцию наборов данных, которые не достигли 100% ингибирования в процессе анализа),

Атр = амплитуда аппроксимированного значения и

К0,5 соответствует концентрации АТ, необходимой для полумаксимального ингибирования в условиях анализа.

Ингибирование нескольких вариантов РXа под действием АТ/иРН составляло меньше 10-15% от общей протеазной активности при самой высокой тестируемой концентрации АТ, что представляло верхний предел обнаружения для анализа в стандартных условиях скрининга. Поэтому вариантам с менее чем 10% от максимального ингибирования приписывали нижнее предельное значение К₀,₅, равное 10000 нМ, и в большинстве случаев, как ожидается, они имели гораздо большую устойчивость к АТ, чем приписываемое им значение.

В табл. 20 приведены результаты анализов, которые проводили с АТ/иРН. Результаты представлены в виде параметра аппроксимации К₀,₅ и в виде степени устойчивости к АТ-Ш для каждого варианта по сравнению с РXа дикого типа, выраженной как отношение их аппроксимированных значений К₀,₅ (К₀,₅варианта/К₀,₅ дикого типа). Полипептид РXа дикого типа, использованный для сравнения, представлял собой рекомбинантный РXа дикого типа, полученный в примерах 1-2.

Некоторые варианты РXа обладали увеличенной больше чем в 500 раз устойчивостью к АТ по сравнению с РXа дикого типа (РXа УТ). Например, группа вариантов, обладающих значительной устойчивостью к АТ-Ш, включает РXа-У1968/К276Р, РXа-У1968/Κ332С, РXа-У1968/Κ332^, РXаУ1968/К326И, РXа-У1968/К3388, РXа- У1968/К420А и РXа-У1968/Κ424Р.

Таблица 20

Ингибирование вариантов, РXа под действием АТ-Ш/ИРН

Мутация (нумерация зрелого РХ)	Мутация (нумерация по химотрипсину)	Ко,₅ (нМ)	±δ.ϋ. (нМ)	%СУ	#0.5-гпи( /#0.5«1	η
РХа плазмы	РХа плазмы	2	1	44%	1	23
РХа дикого типа	РХа дикого типа	2	1	59%	1	10
Ι195Φ	И6Ь	89	41	47%	49	17
VI961	У171	5	2	37%	3	3
VI968	VI78	132	25	19%	73	14
Ь2118/О219Н	Ь328/О40Н	8	2	30%	4	3
У196Ь	У17Ь	18	2	10%	10	3
У196Т	У17Т	48	3	7%	26	2
01978	0188	75	9	11%	41	2
Е200А	Е21А	5	1	24%	3	2
Е2008	Е218	2	0	6%	1	2
Е200У	Е21У	4	0	6%	2	2
К2028	К238	5	2	54%	3	2
К326А	К143А	3	1	19%	2	2
К.3263	К1438	3	0	6%	1	2
К326Т	К143Т	5	0	7%	3	2
К326У	К143У	10	2	24%	5	2
К326(}	К143ф	4	2	45%	2	2
Κ326Ν	Κ143Ν	10	7	69%	6	4
К326М	К143М	7	3	43%	4	4

- 114 028865

К326К	Κ.143Κ	6	1	14%	3	2
Κ.326Υ	Κ.143Υ	6	1	11%	3	2
Т327А	Τ144Α	5	1	13%	3	2
Т327Ь	ΤΙ 441.	5	2	33%	3	2
8334А	8152Α	12	8	69%	7	2
8334Т	3152Τ	19	9	45%	11	2
8334Ν	8152Ν	8	0	4%	4	2
К336Е	Κ.154Ε	5	0	6%	3	2
К338А	Κ156Α	23	3	13%	13	4
К3388	Κ1563	34	8	24%	19	4
Κ338Ν	Κ156Ν	8	1	19%	4	2
К338К.	Κ156Ε	6	1	24%	3	2
К338У	К156У	52	2	4%	29	2
Κ338Υ	Κ156Υ	7	0	6%	4	2
К338М	Κ156Μ	4	1	25%	2	2
Т327А/К338А	Τ144Α/Κ156Α	42	3	8%	23	2
Τ327Ι7Κ338Μ	Τ14417Κ156Μ	5	1	27%	3	2
Е200У/Т327Ь/К338 М	Е21У/Т144Ь/ Κ156Μ	8	2	27%	4	2
Е200У/Т327Ь/3334 А/К338М	Е21У/Т144178152 Α/Κ156Μ	40	13	31%	22	2
VI 963/1.2113/0219 Н	У178/Ь328/О40Н	194	35	18%	108	4
0197 А/Ь2118/0219 Н	Ο18Α/1.323/Ο40Η	128	43	34%	71	4
1195171.2118/О219Н	Ι16Ι7Ι.328/Ο40Η	180	29	16%	100	4
νΐ968/Ν214ϋ	νΐ78/Ν35ϋ	154	18	12%	86	2
νΐ968/Ν214Α	νΐ78/Ν35Α	185	107	58%	103	2
νΐ968/Ν2148	νΐ78/Ν358	186	7	4%	103	2
У1968/Е216К	У178/Е37К	236	57	24%	131	2
У1968/Е216К	У178/Е37К	400	99	25%	222	4
У1968/Е216А	У178/Е37А	279	111	40%	155	2
У1963/Е2163	У178/Е378	178	31	17%	99	2
У1968/Е218К	У173/Е39К	321	22	7%	178	2
У1968/Е218К	У178/Е39К	404	200	49%	224	2
У1968/Е218А	У173/Е39А	167	38	23%	93	2
У1968/К.332А	У178/К150А	3757	2834	75%	2085	4
νΐ968/Κ332ϋ	νΐ78/Κ150ϋ	7284	3841	53%	4042	2
У1968/Е332Е	У178/К150Е	3961	2026	51%	2198	4
У1963/К.3328	У178/К.1508	7247	3345	46%	4022	4
У1968/К332О	У178/К150О	8357	3285	39%	4638	4
νΐ96δ/Κ.326ϋ	νΐ78/Κ143ϋ	5455	3531	65%	3027	2
У1968/К.326М	У178/К143М	850	286	34%	472	4
νΐ968/Κ326Ν	νΐ7δ/Ε143Ν	1178	472	40%	654	4
У1968/К.326Ц	У178/К143Ц	642	148	23%	356	4
У1968/К273Е	У173/К93Е	1491	923	62%	828	2
У1968/К273А	У178/К93А	1144	552	48%	635	4
У1963/К424А	У178/К240А	1756	811	46%	975	4
У1968/Е424Е У1963/К420А У1968/К420Е У1968/К.306Е У1968/К276А У1968/К276Е	У178/Е240Е У178/К236А У178/К236Е У178/К.125А У178/К96А У178/К96Е	3969 10000 10000 10000 7450 10000	3725 0 0 0 3606 0	94% 0% 0% 0% 48% 0%	2203 5550 5550 5550 4135 5550	4 3 3 3 2 2
У1968/К420Е/К424 Ε	У173/К236Е/К24 ΟΕ	3019	1649	55%	1675	4
У1968/К338А	У178/К156А	1783	692	39%	990	4
Υ1963/Κ3383	Υ178/Κ1568	2260	975	43%	1254	4

* Значение К₀,₅, составляющее 10000 нМ, указывает на нижнее предельное значение для вариантов с ингибированием на уровне менее 10% в условиях анализа.

В. Определение константы скорости второго порядка (к_арр) для ингибирования РХа комплексом антитромбин/иРН.

Константу скорости второго порядка для ингибирования (к_арр) вариантов РХа под действием АТ/иРН определяли с использованием того же самого анализа, описанного выше в примере 5А, с небольшими модификациями. Использованный способ лучше подходит для оценки констант скорости вто- 115 028865

рого порядка для множества вариантов одновременно, чем конкурентные кинетические или способы с периодическим отбором проб из реакции (см., например, Ο1кοи е! а1. (2004) ТЬготЬ Ηаетοкί 92(5), 929939).

Для реакций ингибирования в присутствии иРН 1000 нМ раствор АТ/иРН готовили путем разбавления 20 мкМ концентрированного раствора очищенного из плазмы АТ (Мο1еси1а^ Iиηονаί^οик) раствором избытка иРН (2 мкМ) в 1,0 мл объеме 1х буфера А (20 мМ Нерек, 150 мМ №С1, 5 мМ СаС1₂, 0,01% Тмееп-20, 0,1% ΡΕС 8000, рН 7,4). Растворы АТ/иРН инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем получали их серийные разведения в 2,0 раза в столбце лунок 96-луночного полипропиленового планшета с глубокими лунками в конечном объеме 500 мкл 1х буфера А, содержащего 2 мкМ иРН. Конечные разведения АТ-Ш для модифицированного анализа к_арр находились в диапазоне 500-0 нМ (т.е. ряды А-Н). Всего по 35 мкл каждого разведения АТ-Ш вносили в виде аликвот в соответствующие ряды 96-луночного планшета для хранения с лунками с У-образным дном для заполнения всех столбцов лунок (т.е. 1-12). Варианты РХа вначале разбавляли до 100 нМ в 1х буфере А. Далее 50 мкл каждого 100 нМ раствора варианта РХа разбавляли до концентрации 2,0 нМ в 2,5 мл 1х буфера А и далее 70 мкл аликвоты этого раствора распределяли в 96-луночный планшет для хранения с лунками с Уобразным дном в соответствии с заранее определенной схемой, такой же, как описано выше (4 варианта РХа на планшет).

Реакции в рамках анализа инициировали, используя станцию дозирования жидкостей Β^οМек РХ, запрограммированную на распределение 35 мкл растворов РХа в планшеты, содержащие по 35 мкл каждого разведения АТ/иРН в лунке, в общей сложности использовали два дублирующих аналитических планшета для каждго варианта РХа. Конечные условия анализа ингибирования были следующими: 1,0 нМ РХа и разведения АТ в диапазоне от 500 до 0 нМ в 1 мкМ иРН, так что гепарин оставался в избытке. Реакции ингибирования далее инкубировали разное время при комнатной температуре (~25°С) в зависимости от ожидаемой константы скорости ингибирования, и время инкубации подбирали таким образом, что при самой высокой концентрации АТ в этом анализе (500 нМ) могло быть достигнуто >90% ингибирования. Типичное время инкубации определяли специально для каждого варианта или класса вариантов, но обычно следовали времени инкубации, указанному в табл. 21.

Таблица 21

Анализ времени инкубации на основе значений ожидаемой к_арр

Ожидаемая А_арр	Инкубация РХа/АТ III (с)
Ι,ΟΕ-07	10
1,0Е-06	30
1,0Е-05	120
1,0Е-04	600
Ι,ΟΕ-03	3600
Ι,ΟΕ-02	7200

После инкубации в течение заранее определенного времени 40 мкл аликвоту реакционного раствора переносили с помощью Β^οМек РХ в 96-луночный черный планшет с половинным объемом лунок, содержащий 20 мкл 0,3 мМ ΙΥΙΑΙΊιιοί' Ха в аналитическом буфере А, в который было добавлено 15 мг/мл полибрена. Полибрен (гексадиметрина бромид) в конечной концентрации 5 мг/мл добавили к буферу А, чтобы остановить реакцию АТ/иРН. Остаточную активность РХа оценивали, наблюдая за начальными скоростями расщепления субстрата в течение 60 мин с помощью флуориметра при 25°С. Конечные условия анализа для определения остаточной активности были следующими: 1,0 нМ варианта РХа, 0,1 мМ ΙΥΡι11ιιοΐ' Ха и 5 мг/мл полибрена в буфере А. Анализ данных для вычисления значения К₀,₅ проводили аналогичным образом, как описано выше для анализа ингибирования АТ/иРН в примере 5А, используя программный пакет Αсί^ν^ίуΒаке и модуль анализа данных ХЕ Киппег (программное обеспечение ΖΟΒδ). Используя настройки анализа, описанные в примере 5А, в условиях псевдо-1-го-порядка и тестируя разное время инкубации, было возможно вычислить кажущуюся константу второго порядка для ингибирования ингибитором АТ (карр) с помощью следующих уравнений:

Уравнение (8)

I 5.1.)

Уравнение (9)

„ _вд

Поскольку аппроксимированное значение для К₀,₅ = [АТ] при !_1/2 (определяется временем анализа), то доступны все необходимые значения для вычисления к,_Ьк и, таким образом, к_арр для ингибирования

- 116 028865

данного варианта РХа ингибитором АТ. Рассчитанное значение к_арр не учитывает любые потенциальные эффекты изменений в стехиометрии игибирования (δ.Ι.), которое было задано в виде постоянного значения 1,2 в настоящих расчетах, поскольку это значение отражает то значение, которое, как правило, встречается в литературе (см., например, 01коп е! а1. (2004) ТбгошЬ Наешок! 92(5), 929-939).

В табл. 22 приведены результаты анализов скорости второго порядка, которые проводили с использованием АТ/иРН. Результаты представлены в виде аппроксимированного параметра к_арр и в виде степени устойчивости к АТ для каждого варианта по сравнению с РХа дикого типа, выраженной как отношение их аппроксимированных значений к_арр (к_арр дикого типа/к_арр варианта). Полипептид РХа дикого типа, использованный для сравнения, представлял собой рекомбинантный РХа дикого типа, полученный путем клонирования гена РХ, приведенного в δΙΤ) ΙΌ N0: 1, и его экспрессии в клетках СН0 в виде полипептида с аминокислотной последовательностью, приведенной в виде аминокислот 1-139 и 195-448 в δΙΤ) ΙΌ N0: 134, как описано в примерах 1-3 (т.е. полипептид РХ УТ). Некоторые варианты РХа обладали увеличенной более чем в 300 раз устойчивостью к АТ по сравнению с РХа дикого типа. Например, эта группа включает РXа-V196δ/К332О, РXа-V196δ/К420Ε/К424Ε, РXа-V196δ/К332^, РXа-V196δ/К332δ и РXа-V196δ/К338δ, которые обладают значительной устойчивостью к АТ.

Таблица 22

Константа скорости второго порядка для ингибирования АТ/иРН

Мутация (нумерация зрелого РХ)	Мутация (нумерация по химотрипсину)	карр (μΎ¹)	±8.ϋ. (μΎ¹)	%СУ	^арр-«( Аарр.щиг	η
РХа плазмы	РХа плазмы	1,4Ε+07	7,2Ε+06	52%	1	3
РХа дикого типа	РХа дикого типа	9,7Ε+06	4,6Ε+06	47%	1	6
1195Ь	И6Ь	5,3Ε+05	9ДЕ+04	17%	18	4
У1968	У178	5,3Ε+05	1,7Ε+05	32%	18	11
Τ85Ν/Κ87δ/νΐ968	Τ[85]Ν/Κ[87]δ/νΐ7δ	1,8Ε+05	2ДЕ+03	1%	55	2
(256Ν/ρ58δ/νΐ96δ	(Д56]ЖД58]8/У178	3,2Ε+05	2ДЕ+04	7%	31	2
Κ62Ν/Ο64δ/νΐ96δ	Κ[62]Ν/Ο[64]δ/νΐ7δ	2,8Ε+05	4,3Ε+03	2%	35	2
Ρ65Ν/Ε67δ/νΐ96δ	Ε[65]Ν/Ε[67]δ/νΐ7δ	3,8Ε+05	Ρ7Ε+04	4%	25	2
Ε67Ν/νΐ96δ	Ε[67]Ν/νΐ7δ	4,4Ε+05	43Ε+02	0%	22	2
Ε73Ν/Ο75δ/νΐ96δ	ΙΤ73]Ν/Ο[75]δ/νΐ7δ	ЗДЕ+05	7,6Ε+03	2%	32	2
Ο75Ν/Ε77δ/νΐ96δ	Ο[75]Ν/Ε[77]δ/νΐ7δ	4,4Ε+05	5,2Ε+02	0%	22	2
Κ86Ν/Ε88δ/νΐ96δ	Κ[86]Ν/Ε[88]δ/νΐ7δ	4,9Ε+05	5,2Ε+03	1%	20	2
Ο114Ν/νΐ96δ	Ο[114]Ν/νΐ7δ	3,4Ε+05	8,0Ε+03	2%	28	4
ϋ95Ν/ϋ97δ/νΐ96δ	ϋ[95]Ν/ϋ[97]δ/νΐ7δ	4ДЕ+05	2ДЕ+05	49%	24	2
Е828/У1968	Ε[82]8/νΐ78	2,3Ε+05	2,2Ε+05	96%	42	8
Ε82Ν/Ρ84δ/νΐ96δ	Ε[82]Ν/Ρ[84]δ/νΐ7δ	4,2Ε+05	Ρ6Ε+05	39%	23	3
Ο78Ν/Ν80δ/νΐ96δ	Ο[78]Ν/Ν[80]δ/νΐ7δ	Ρ5Ε+05	5,0Ε+04	33%	64	4
Ε77Ν/Κ79δ/νΐ96δ	Ε[77]Ν/Κ[79]δ/νΐ7δ	2ДЕ+05	1,2Ε+05	57%	47	2
ϋ119Ν/Ο121δ/νΐ96δ	ϋ[119]Ν/Ο[121]δ/νΐ7δ	7,5Ε+05	Ρ7Ε+05	23%	13	2
Ρ83Ν/νΐ96δ	Ρ[83]Ν/νΐ7δ	6,0Ε+05	3,2Ε+04	5%	16	2
К1228/У1968	Κ[122]δ/νΐ7δ	9,3Ε+05	1,4Ε+05	15%	11	4
Ε51Ν/νΐ96δ	Ε[51]Ν/νΐ7δ	8,6Ε+05	2,9Ε+04	3%	11	2
Ο58Ν/Κ60δ/νΐ968	Ρ[58]Ν/Κ[60]8/νΤ78	6,4Ε+05	1,3Ε+04	2%	15	2
0114Ν/Ο119Ν/Ο1218/ У1968	Ο[114]Ν/ϋ[119]Ν/Ο[121 ]8/У178	Ρ4Ε+05	8ДЕ+04	59%	71	5
У196Т	У17Т	3,2Ε+06	8,3Ε+04	3%	3	2
01978	0188	1ДЕ+06	3,9Ε+05	28%	7	2
8334Τ	8152Τ	1,2Ε+07	ЗДЕ+06	25%	1	4
Κ338Α	Κ156Α	5,8Ε+06	1ДЕ+06	19%	2	2
Κ3388	Κ1568	3,2Ε+06	Ρ7Ε+05	5%	3	2
К338У	К156У	3,4Ε+06	2ДЕ+05	6%	3	2
Τ327Α/Κ338Α	Τ144Α/Κ156Α	1,5Ε+06	4,6Ε+05	32%	7	2
Т3271УК338М	Τ144Ι7Κ156Μ	5,4Ε+06	2,7Ε+06	50%	2	2
Е200У/Т327Ь/К338М	Е21У/Т14417К.156М	3,4Ε+06	Ρ2Ε+06	36%	3	2
Е200У/Т327178334А/ Κ338Μ	Ε21У/Т144178152А/ Κ156Μ	3,8Ε+06	6,9Ε+05	18%	3	2
VI968/172118/О219Н	У178/Ь328/О40Н	2,5Ε+05	3,9Ε+04	15%	39	4
ϋ119Ν/Ο121 δ/У 1968/ Ь2118/О219Н	ϋ[119]Ν/Ο[121]8/νΐ78/ 028/04014	9,5Ε+04	НД	НД	102	1
0114Ν/νΐ96δ/Ε211 δ/ Ο219Η	Ο[114]Ν/ν 178/1328/ Ο40Η	5,6Ε+04	НД	НД	173	1
0114Ν/ϋ119Ν/Ο1218/ VI968/172118/Ο219Η	Ο[114]Ν/ϋ[119]Ν/Ο[121 ]8/У178/028/040Н	6,5Ε+04	2,2Ε+04	34%	149	5
0197Α/Ι72118/0219Η	ΟΙ 8 Α/Ο28/04014	Ρ2Ε+06	5,2Ε+05	44%	8	2
119517172118/О219Н	11617028/04014	ЗДЕ+05	ЗДЕ+04	10%	31	4
νΐ96δ/Ν214ϋ	νΐ78/Ν35ϋ	7,6Ε+05	4ДЕ+05	53%	13	2
Υ1968/Ν214Α	Υ178/Ν35Α	1,4Ε+06	Ι,ΟΕ+05	7%	7	2

- 117 028865

νΐ96δ/Ν214δ	νΐ7δ/Ν35δ	9,0Ε+05	8,4Ε+04	9%	11	2
νΐ96δ/Ε216Κ	νΐ7δ/Ε37Κ.	4,5Ε+05	1,4Ε+05	31%	22	2
νΐ96δ/Ν216Κ	νΐ7δ/Ε37Κ	2,5Ε+05	2,7Ε+03	1%	39	2
νΐ96δ/Ν216Α	νΐ7δ/Ε37Α	3,3Ε+05	8,4Ε+03	3%	29	2
νΐ96δ/Ν216δ	νΐ7δ/Ε37δ	4,7Ε+05	4ДЕ+03	1%	21	2
νΐ96δ/Ε218Κ	νΐ7δ/Ε39Κ	4ДЕ+05	8,8Ε+04	22%	24	2
νΐ96δ/Ν218Κ	νΐ7δ/Ε39Κ	2ДЕ+05	2,3Ε+04	11%	48	2
νΐ96δ/Ν218Α	νΐ7δ/Ε39Α	5,4Ε+05	5,5Ε+04	10%	18	4
νΐ96δ/Κ332Α	νΐ7δ/Κ150Α	2,9Ε+04	6,7Ε+03	23%	339	3
νΐ96δ/Κ332ϋ	νΐ7δ/Κ150ϋ	5,6Ε+03	Ρ9Ε+03	35%	1,754	6
νΐ96δ/Κ.332Ε	νΐ7δ/Κ150Ε	2,3Ε+04	4,9Ε+03	21%	428	2
νΐ96δ/Κ332δ	νΐ7δ/Κ150δ	9ДЕ+03	7,9Ε+03	86%	1,070	5
νΐ96δ/Κ332Ο	νΐ7δ/Κ.150Ο	3,3Ε+03	Ρ4Ε+03	43%	2,926	6
νΐ96δ/Κ.326ϋ	νΐ7δ/Κ.143ϋ	6,3Ε+03	4,9Ε+03	78%	1,555	3
νΐ96δ/Κ326Μ	νΐ7δ/Κ.143Μ	3,5Ε+04	2,9Ε+03	8%	280	4
νΐ96δ/Κ326Ν	νΐ7δ/Κ143Ν	2,5Ε+04	3,0Ε+03	12%	396	4
νΐ96δ/Κ.326(3	νΐ7δ/Κ.143(3	5,2Ε+04	1ДЕ+04	21%	186	4
νΐ96δ/Κ273Ε	νΐ7δ/Κ93Ε	2,3Ε+04	4,2Ε+03	18%	415	2
νΐ96δ/Κ273Α	νΐ7δ/Κ93Α	7,8Ε+03	Ρ2Ε+03	15%	1,257	4
νΐ96δ/Κ424Α	νΐ7δ/Κ240Α	2,7Ε+04	Ρ4Ε+03	5%	364	2
νΐ96δ/Κ424Ε	νΐ7δ/Κ240Ε	8,3Ε+03	2,7Ε+03	33%	1,173	2
νΐ96δ/Κ420Α	νΐ7δ/Κ236Α	2,5Ε+04	3,9Ε+03	15%	389	4
νΐ96δ/Κ420Ε	νΐ7δ/Κ236Ε	1,4Ε+04	8,4Ε+03	58%	672	4
νΐ96δ/Κ306Ε	νΐ7δ/Κ125Α	3,5Ε+04	5,4Ε+03	16%	281	4
νΐ96δ/Κ276Α	νΐ7δ/Κ96Α	4,7Ε+05	Ι,όΕ+05	34%	21	4
νΐ96δ/Κ276Ε	νΐ7δ/Κ96Ε	3,2Ε+05	1,8Ε+05	57%	30	4
νΐ96δ/Κ420Ε/Κ424Ε	νΐ7δ/Κ236Ε/Κ240Ε	5ДЕ+03	2,8Ε+01	1%	1,929	2
νΐ96δ/Κ338Α	νΐ7δ/Κ156Α	4,5Ε+04	2,5Ε+04	55%	218	4
νΐ96δ/Κ338δ	Υ17δ/Κ156δ	2,3Ε+04	7,6Ε+03	33%	421	10
νΐ96δ/Ε215Ν/Ν217δ	νΐ7δ/Ε36Ν/Ν38δ	7,5Ε+05	6,4Ε+03	1%	13	2
V196δ/Ε264Ν/Ε266δ	νΐ7δ/Ε84Ν/Ε86δ	8,7Ε+05	6ДЕ+04	7%	11	2
Ш 19Ν/Ο121δ/νΐ96δ/ Ε264Ν/Ε266δ	ϋ[119]Ν/Ο[121]δ/νΐ7δ/ Ε84Ν/Ε86δ	4,0Ε+05	Ρ8Ε+04	4%	24	2
0114Ν/νΐ96δ/Ε264Ν/ Ε266δ	Ο[114]Ν/νΐ7δ/Ε84Ν/Ε8 6δ	2,0Ε+05	НД	НД	48	1
V196δ/Κ429Ν/Ε431 δ	νΐ7δ/Κ245Ν/Ε247δ	2,4Ε+05	5,6Ε+03	2%	40	2
νΐ96δ/Κ243Ν/Κ245δ	νΐ7δ/Κ.63Ν/Κ65δ	5,0Ε+05	Ρ2Ε+04	2%	19	2
νΐ96δ/Τ293Ν/Κ295δ	νΐ7δ/Τ113Ν/Κ115δ	6ДЕ+05	1,2Ε+02	0%	16	2
νΐ96δ/ϋ389Ν/Υ391δ	νΐ7δ/0205Ν/Υ207δ	7,6Ε+05	Ρ7Ε+04	2%	13	2
νΐ96δ/Κ388Ν	νΐ7δ/Κ204Ν	7ДЕ+05	3,0Ε+04	4%	14	4
ϋ119Ν/Ο121δ/νΐ96δ/ Κ388Ν	ϋ[119]Ν/Ο[121]δ/νΐ7δ/ Κ204Ν	1ДЕ+05	4,9Ε+03	4%	71	2
νΐ96δ/Τ428Ν/Ο430δ	νΐ7δ/Τ244Ν/Ο246δ	9,5Ε+05	Ρ6Ε+04	2%	10	2
У1968/Ь211δ/Ο219Η/ Ε264Ν/Ε266δ	νΐ7δ/Ε32δ/Ο40Η/Ε84Ν/ Ε86δ	2ДЕ+05	Ρ5Ε+04	7%	46	2
Ш 19Ν/Ο121δ/νΐ96δ/ Ь211δ/Ο219Η/Ε264Ν/ Ε266δ	ϋ[119]Ν/Ο[121]δ/νΐ7δ/ Ε32δ/Ο40Η/Ε84Ν/Ε86δ	1,4Ε+05	Ρ7Ε+04	12%	69	2
Ο114Ν/νΐ96δ/Ε211δ/ Ο219Η/Ε264Ν/Ε266δ	0[114]Ν/νΐ7δ/Ε32δ/ Ο40Η/Ε84Ν/Ε86δ	8,3Ε+04	1ДЕ+04	16%	118	3
νΐ96δ/Ε264Ν/Ε266δ/ Κ388Ν	νΐ7δ/Ε84Ν/Ε86δ/Κ204Ν	2,7Ε+05	1,8Ε+04	7%	37	2
Э119Ν/Ο121δΛΤ96δ/ Ь211δ/Ο219Η/Κ388Ν	ϋ[119]Ν/Ο[12Ι]δ/νΐ7δ/ Ε32δ/040Η/Κ204Ν	6,2Ε+04	7,3Ε+03	12%	157	4
Ο114ΝΛΠ96δ/Ε211δ/ Ο219Η/Κ388Ν	Ο[114]Ν/νΐ7δ/Ε32δ/ 040Η/Κ204Ν	3,7Ε+04	2ДЕ+03	6%	267	2
νΐ96δ/Ε211δ/Ο219Η/ Ε264Ν/Ε266δ/Κ388Ν	VI 7δ/Ε32δ/Ο40Η/Ε84Ν/ Ε86δ/Κ204Ν	2,2Ε+05	Ρ2Ε+04	6%	44	2

Пример 6. Определение функционального связывания кофактора (К_о-арр) полипептидом РХа для его кофактора, фактора Уа.

Функциональное связывание кофактора (К_о-арр) вариантов РХа с кофактором фактором Уа (РУа) в присутствии насыщающего количества субстрата, протромбина (РП), оценивали косвенно с помощью флуорогенного анализа, оценивая активность тромбина (РПа), образованного при активации РХа, по отношению к синтетическому субстрату РеГаПиси' ТН. Для расчета кажущейся кинетической константы скорости (К_о-арр) использовали диапазон концентраций РУа, где кофактор (РУа) был по меньшей мере в 1000-кратном в избытке по отношению к концентрации активирующей протеазы (РХа). Анализ был разработан таким образом, что представлял собой вариант анализа, описанного в примере 4 (определение каталитической активности РХа в отношении его субстрата, протромбина (РП)), где кофактор (РУа) в

- 118 028865

разных концентрациях предварительно инкубировали с РXа в присутствии фосфолипидных везикул с образованием протромбиназного комплекса до оценки каталитической активности с насыщенными уровнями субстрата, протромбина (РП). Кратко, для проведения анализа активированные варианты РXа с титрованным активным центром разбавляли в кальций-содержащем буфере с фосфолипидными везикулами, смешивали с разными концентрациями РVа, чтобы образовался протромбиназный комплекс, и далее смешивали с насыщающими концентрациями протромбина и флуоресцентного субстрата, ΡβίΐαίΊΗοΓ ТН (Н-Э-СНА-А1а-Аг§-АМС, СеЩегейет). Высвобождение свободного флуорофора, АМС (7-амино-4метилкумарин), после каталитического расщепления Ρеίаί1иο^ ТН образованным тромбином далее измеряли непрерывно в течение периода времени и определяли кинетические константы скорости для вариантов РXа.

A. Протокол анализа.

Для анализов, оценивающих кинетическую скорость активации протромбина фактором РXа в присутствии разных концентраций РVа (очищенный из плазмы РVа, НеатаЩБще Тесйпο1οβ^ез, Ее.) и фосфолипидов, варианты РXа экспрессировали, очищали, активировали и подвергали титрованию активного центра, как описано в примерах 1-3, выше. Варианты РXа далее серийно разводили до концентраций 0,48 пМ (4х) в объеме 0,25 мл 1х буфера А (20 мМ Нерез/150 мМ ХаС1/5 мМ СаС1₂/0,1% В8А/0,1% РЕО8000, рН 7,4). РVа далее разводили до разных максимальных концентраций в зависимости от тестируемых вариантов, но, как правило, в диапазоне 2-60 нМ (4х максимальная концентрация) в объеме 1,0 мл 1х буфера А, содержащего 80 мкМ свежересуспендированных фосфолипидов (75% фосфатидилхолина (ФХ)/25% фосфатидилсерина (ФС); везикулы ФХ/ФС ~120 нм в диаметре; Λνπηΐι Ρο^Γ ЫрИз). Растворы РVа серийно разводили в 1,8 раз в 12-канальном полипропиленовом планшете с глубокими лунками с конечным объемом 0,4 мл 1х буфера А, содержащего 80 мкМ везикул ФХ/ФС (4х). Серии разведений РVа последовательно смешивали 1:1с 4х разведением РXа (25 мкл каждый) в 96-луночном черном аналитическом планшете с круглым дном в соответствии с заранее определенной схемой (4 варианта РXа/планшет) и предварительно инкубировали 15 мин при 25°С, чтобы образовались уравновешенные протромбиназные комплексы с разными концентрациями РVа. Конечные 2х растворы (50 мкл) содержали компоненты в следующих концентарциях: 0,2-4 пМ варианта РXа, 60-0 нм РVа и 40 мкМ везикул ФХ/ФС.

Раствор 5000 нМ (2х) обработанного ЭРР/РРК-етк протромбина (РП) с титрованными активными центрами готовили в 30 мл 1х буфера А, содержащего 0,1 мМ субстрата РеГаИ^т ТН, чтобы получить объем, достаточный для 4 анализов. Он содержал 2х насыщающую концентрацию протромбина (РП), которая была по меньшей мере в 10-50 раз выше значений К_М, описанных в примере 4, табл. 17. Реакции в рамках анализов, как правило, инициировали, используя станцию дозирования жидкостей ВюМек РX, запрограммированную для распределения 50 мкл разведений РII/Ρеίаί1иο^ ТН в 4 аналитических планшета, содержащих 50 мкл каждого варианта РXа и разведений РVа (протромбиназные комплексы). Финальные концентрации реагентов в анализе были следующими: 0,1-2,0 пМ РXа, 20 мкМ везикул ФХ/ФС, 50 мкМ ΙΜπΠιιοί' ТН, 2,5 мкМ протромбина (РП) и 0-0,5 нМ, 0-1,0 нМ, 0-3,0 нМ или 0-10 нМ разведений РVа, хотя иногда использовались другие диапазоны разведения РVа. Реакции отслеживали с помощью планшетного флуориметра 8рее1гаМах в течение 30 мин при 25°С. Стандартная кривая свободного АМС с диапазоном концентраций от 0 до 100 мкМ АМС служила для перерасчета КРи в мкМ для дальнейшего расчета данных анализов.

B. Анализ данных.

Для определения функциональной аффинности вариантов РXа к РVа на основе их каталитической активности сырые данные, собранные с применением 8οίίΜаx Ριό (Μο^οη^ί ^еν^сез), экспортировали в виде файлов .ТХТ. Далее проводили нелинейный анализ данных непосредственно в программном пакете Ае1Ш11уВазе с использованием модуля анализа данных ХЕ Киппег (программное обеспечение ГОВ8). Данные анализировали, в основном, как описано в примере 4С с небольшими модификациями. Шаблон АЬазе был создан для автоматической аппроксимации параболических скоростей реакций (мкМ/с²) тестируемых вариантов РXа при каждой концентрации РVа функцией стандартной равносторонней гиперболы (т.е. уравнение Михаэлиса-Ментен), задаваемой уравнением (10), для получения аппроксимированных значений для V_таx и К_о-арр.

Уравнение (10)

. V ί 31

Скорость реакции (мкМ/сек²) = -1.+.1-..

В табл. 23 приведена функциональная активность (К^_-арр) для каждых анализируемых вариантов РXа. Также был проанализирован рекомбинантный РXа дикого типа (называемый РXа ШТ), очищенный из плазмы РXа (НаетаЩБще ТесЬпο1οβ^ез, Ее.). В табл. 23 представлены результаты, выраженные в виде кинетической константы для аффинности, Кп_-арр (нМ), и также в виде отношения функциональной активности РXа дикого типа по сравнению с вариантом РXа, где функциональная аффинность каждого варианта РXа определена значением К_о-арр (нМ) для активации субстрата, протромбина (РП). Там, где активность варианта РXа сравнивали с активностью РXа дикого типа, сравнение проводили с активно- 119 028865

стью рекомбинантного полипептида РХа дикого типа, который был экспрессирован и очищен в тех же условиях, что и варианты полипептидов РХа, чтобы любые различия в активности были результатом модификации (модификаций), а не результатом различий, например, в посттрансляционных модификациях, связанных с экспрессирующими системами. Таким образом, полипептид РХа дикого типа, используемый для сравнения, представлял собой рекомбинантный РХа дикого типа, полученный путем клонирования гена РХ, последовательность которого приведена в 8Ер ΙΌ N0: 1, и экспрессированный в клетках СН0 в виде полипептида с аминокислотной последовательностью, приведенной в виде аминокислот 1-139 и 195-448 в 8Ер ΙΌ N0: 134, как описано в примере 1-3 (т.е. полипептид РХа VТ). Стандартное отклонение (8.Ό.), коэффициент вариации (в виде процента; %СУ) и число проведенных анализов (п) также приведены в табл. 23.

В то время как несколько вариантов показали аффинность, аналогичную аффинности полипептида дикого типа, или показали номинальное увеличение в К_о-арр (например, РХа-К326У и РХа-Р2118/О219Н), некоторые варианты показали значительное снижение в функциональной аффинности с увеличением в К_о-арр более чем в 10-100 раз. Варианты со значительно увеличенной зависимостью от кофактора (пример 4) показали наибольшее снижение функциональной аффинности к кофактору. Например, эта группа включает РХа-У1968/К326р, РХа-У1968/К420Е/К424Е, РХа-У1968/К273Е и РХа-У1968/К3388.

Таблица 23

Функциональная аффинность вариантов РХа к кофактору (К_р-арр)

Мутация (нумерация зрелого РХ)	Мутация (нумерация по химотрипсину)	^Ъ-арр (нМ)	±δ.ϋ. (нМ)	%СУ	Χβ-\ντ/ Χϋ-ηιιιί	η
РХа плазмы	РХа плазмы	0,01	0,00	21%	1,64	5
РХ дикого типа	РХ дикого типа	0,02	0,01	47%	1,00	3
1195Ь	Ι16Ε	0,18	0,06	33%	0,09	10
VI968	У178	0,39	0,12	32%	0,04	14
Ρ56Ν/ρ588/νΐ968	Ο[56]Ν/()[58]8/νΐ7δ	0,49	0,18	37%	0,03	2
Κ62Ν/Ο64δ/νΐ 968	Κ[62]Ν/Ο[64]δ/νΐ78	0,72	0,25	34%	0,02	2
Ε67Ν/νΐ968	Ε[67]Ν/νΐ78	1,08	0,13	12%	0,01	2
Ь73Ж}758/У1968	Ε[73]Ν/Ο[75]δ/νΐ7δ	0,45	0,07	16%	0,04	2
Ο75Ν/Ε778/νΐ968	Ο[75]Ν/Ε[77]8/νΐ78	0,90	0,28	31%	0,02	2
Ο114Ν/νΐ968	Ο[114]Ν/νΐ78	0,73	0,24	32%	0,02	3
ϋ119Ν/Ο1218/νΐ968	ϋ[119]Ν/Ο[121]8/νΐ7 8	0,62	0,19	30%	0,03	3
К1228/У1968	К[122]8/У178	0,46	0,17	37%	0,03	3
Ε51Ν/νΐ968	Ε[51]Ν/νΐ78	0,38	0,05	14%	0,04	2
Ο58Ν/Κ608/νΐ968	<3[58]Ν/Κ[60]8/νΐ7δ	0,52	0,19	36%	0,03	3
Ь2118/О219Н	Ε328/Ο40Η	0,02	0,00	7%	0,67	3
У196Ь	У17Ь	0,06	0,01	21%	0,27	3
У196Т	У17Т	0,31	НД	НД	0,05	1
01978	0188	0,18	0,07	39%	0,09	3
Κ.326Α	Κ143Α	0,03	НД	НД	0,60	1
Κ.3268	Κ1438	0,03	НД	НД	0,55	1
Κ326Τ	Κ143Τ	0,04	НД	НД	0,42	1
К.326С)	Κ143<3	0,03	НД	НД	0,50	1
Κ326Ν	Κ143Ν	0,04	0,01	22%	0,44	2
Κ.326Μ	Κ143Μ	0,04	НД	НД	0,39	1
Κ.326Κ	Κ143Κ	0,03	НД	НД	0,60	1
Κ326Υ	Κ143Υ	0,02	0,00	2%	0,86	2
Κ338Α	Κ156Α	0,20	НД	НД	0,08	1
Κ3388	Κ1568	0,15	0,04	25%	0,11	3
Κ338Ν	Κ156Ν	0,06	НД	НД	0,25	1

- 120 028865

К338К	Κ156Κ	0,02	0,01	55%	0,73	2
К338У	К156У	0,15	0,05	35%	0,11	3
К338М	Κ156Μ	0,36	НД	НД	0,04	1
Τ327Α/Κ338Α	Τ144Α/Κ156Α	0,24	0,15	59%	0,06	2
Т3271УК338М	Т144Б/К156М	0,03	0,00	17%	0,61	2
Е200У/Т327Ь/8334А/ К338М	Е21У/Т144Е/8152А/ Κ156Μ	0,11	0,04	37%	0,14	3
У1968/Ь2118/0219Н	У173/Е323/О40Н	0,32	0,09	29%	0,05	2
1195Ь/Ь2118/О219Н	116Е/Ь328/О40Н	0,37	0,05	14%	0,04	3
νΐ968/Ν214Ώ	νΐ78/Ν35ϋ	0,32	0,07	23%	0,05	3
νΐ968/Ν214Α	νΐ78/Ν35Α	0,38	НД	НД	0,04	1
νΐ968/Ν2148	νΐ78/Ν35δ	0,33	НД	НД	0,05	1
У1968/Е216К	У178/Е37К	0,16	0,06	38%	0,10	3
νΐ96δ/Ν216Κ	У173/Е37К	0,25	0,06	23%	0,06	2
νΐ968/Ν216Α	У178/Е37А	0,29	0,12	41%	0,05	2
νΐ968/Ν2168	У173/Е373	0,40	0,13	31%	0,04	3
У1968/Е218К	У178/Е39К	0,34	0,12	34%	0,05	3
νΐ968/Ν218Κ	У173/Е39К	0,29	0,05	18%	0,05	2
νΐ968/Ν218Α	У178/Е39А	0,36	0,13	35%	0,04	3
У1968/К332А	У178/К.150А	0,54	НД	НД	0,03	1
У1968/К.332О	У178/К150Ц	1,70	0,60	35%	0,01	3
У1968/К.332Е	У178/К.150Е	0,49	0,04	7%	0,03	2
У1968/К.3328	У173/К.1508	0,56	0,11	19%	0,03	2
У1968/К332С	У178/Е150О	0,56	0,12	22%	0,03	3
νΐ968/Κ326ϋ	У178/К.143О	1,02	0,33	32%	0,02	3
У1968/К326М	У173/К143М	0,56	0,27	48%	0,03	4
νΐ968/Κ326Ν	νΐ78/Κ143Ν	2,21	0,15	7%	0,01	2
νΐ96δ/Κ326(2	νΐ7δ/Κ143(2	1,21	0,26	21%	0,01	3
У1968/К273Е	У178/К93Е	15,04	3,42	23%	0,001	3
У1968/К.273А	У173/К.93А	2,45	0,08	3%	0,01	3
У1968/К424А	У173/К240А	5,86	0,11	2%	0,003	2
У1968/К.424Е	У178/К240Е	6,31	1,00	16%	0,002	3
У1968/К420А	У173/К236А	0,37	НД	НД	0,04	1
У1963/К420Е	У178/К236Е	0,39	НД	НД	0,04	1
У1968/К306Е	У173/К125А	2,25	1,49	66%	0,01	5
У1968/К276А	У178/К96А	0,62	0,11	18%	0,03	3
У1963/К276Е	У178/К96Е	0,70	0,02	3%	0,02	3
У1963/К420Е/К.424Е	У178/К236Е/К240Е	20,86	13,15	63%	0,001	4
У1968/К338А	У173/К156А	0,93	0,24	26%	0,02	3
У1963/К3388	У178/К1568	0,91	0,19	21%	0,02	3
νΐ968/Ε215Ν/Ν217δ	νΐ78/Ε36Ν/Ν38δ	0,28	0,03	10%	0,06	2
νΐ968/Ε264Ν/Ε2668	νΐ78/Ε84Ν/Ε868	0,48	0,03	6%	0,03	2
VI968/Κ429Ν/Ε4318	νΐ78/Κ245Ν/Ε247δ	1,06	0,34	32%	0,01	2
νΐ968/Τ293Ν/Κ2958	У178/Т113Ν/Κ1158	0,64	0,15	23%	0,02	2
νΐ96δ/Κ388Ν	νΐ78/Κ204Ν	0,59	0,06	10%	0,03	2
νΐ968/Τ428Ν/Ο4308	νΐ78/Τ244Ν/Ο2463	0,73	0,10	14%	0,02	2

Пример 7. Фармакокинетический анализ полипептидов Рха.

Фармакокинетические (РК) свойства вариантов полипептидов РХа оценивали, измеряя количество варианта РХа в мышиной плазме в различные временные точки после внутриввенного введения. Чтобы оценить фармакокинетические свойства, для количественной оценки общего содержания белка РХа в мышиной плазме использовали анализ ЕЬ^А.

A. Животные.

Самцов мышей СБ-1 (30-40 г), полученных из СЬаг1ез Ккегз ЬаЬога!опез (НоШз!ег, СА), помещали в карантин по меньшей мере на 3 дня до эксперимента. Для серийных исследований РК самцам мышей СБ-1 (30-37 г) установили постоянную канюлю в яремную вену. Фильтрованная водопроводная вода и пища были доступны аб ИЫШт до проведения экспериментов Р1) или РК.

B. Дозирование и сбор крови.

Мышам (N=3 на временную точку) вводили полипептиды РХа внутривенно (0,5 мг/кг, объем дозы 2 мл/кг) через хвостовую вену. В соответствующее время (2-960 мин) после дозирования животных анестезировали и забирали кровь (0,5-1 мл) путем посмертной пункции сердца в шприцы, содержащие цитрат. Если для посмертных исследований РК не было доступно достаточное количество белка, использовали серийный сбор крови в общей сложности от 4-6 животных и ступенчатые временные точки; чтобы собрать образцы для всех временных точек без сбора избыточного объема крови, для каждого полного измерения использовали двух мышей. Для экспериментов с серийным сбором крови образцы собирали из обездвиженных животных, находящихся в сознании, сначала собирая небольшое количество крови в 0,1 мл шприц, содержащий 0,9% физиологический раствор. Далее прикрепляли шприц, содержащий 4,5 мкл 0,1 М цитрата натрия, 0,05 мл крови отбирали в шприц и переносили кровь в 1,5 мл пробирку. Затем снова присоединяли первый шприц и 0,07 мл физиологического раствора пропускали обратно через канюлю. Канюлю закрывали до следующей временной точки, когда процесс повторяли. Как для серийных, так и для посмертных исследований образцы крови центрифугировали в течение 15 мин после сбора (9000 грт, 8 мин, 4°С), плазму отбирали и немедленно быстро замораживали в жидком азоте и далее хранили замороженной (-70°С) до анализа.

- 121 028865

С. Оценка РК.

Содержащие цитрат образцы крови собирали в различные временные точки вплоть до 960 мин после дозирования (т.е. до дозирования и через 2, 5, 10, 15, 30, 60, 120, 240, 360 и 960 мин) путем пункции сердца для посмертных экспериментов или используя постоянный катетер для серийных экспериментов, как описано в примере 7В выше. Концентрации РХа в плазме определяли, используя анализ ЕЫ8А, специфичный к человеческому фактору Х/Ха. Использовали подобранную пару поликлонального детектирующего и захватывающего антител (^РХ-ЕГА-С, Айтйу Вю1о§1са1к, Аηсакίе^, СЖ). Анализ ЕЫ8А РХ/Ха использовали для определения фармакокинетических параметров исследуемого варианта.

Кратко, лунки планшета покрывали аффинно очищенным поликлональным антителом к РХ/Ха (1:500) в буфере для иммобилизации (15 мМ №_:С()₃, 35 мМ №11С0₃, рН 9,6) в течение 2 ч при комнатной температуре (КТ). Планшеты промывали промывочным буфером (РВ8Т) и наносили образцы плазмы, содержащие РХ/Ха, разбавленные раствором для разбавления образцов (100 мМ Нерек, 100 нМ ЫаС1, 10 мМ ЕЭТА, 1,0% В8А, 0,1% Тусси-20, рН 7,2). Все образцы и стандарты нормализовали до конечной концентрации 1:200 плазмой мышей линии СЭ-1, разбавленной раствором для разбавления образцов для поддержания консистенции. Образцы плазмы разбавляли 1:200 и 1:1000 в планшете с последующим последовательным разведением 1:4 с получением дополнительного набора разведений 1:1000 и 1:4000. После промывки планшета для удаления несвязавшегося материала в планшет добавляли конъюгированное с пероксидазой детектирующее антитело (1:1000) к РХ/Ха для связывания захваченного РХ/Ха. После промывки планшета для удаления несвязавшегося конъюгированного антитела активность пероксидазы измеряли путем инкубации с хемилюминесцентным субстратом ^ирегёхд^ РетГО, #37074, ТЬегто 8сй сиййс). Хемилюминесцентный сигнал измеряли, используя планшетный флуориметр 8ресйаМах. Стандартная кривая пероксидазной активности является характеристически линейной в диапазоне концентраций от 0,82 пг/мл до 25 нг/мл. Для устранения различий в аффинности антител к разным вариантам РХа для построения стандартной кривой использовали интересующий вариант РХа. Каждый образец измеряли на планшетах в двух отдельных анализах и эти измерения в линейном диапазоне стандартной кривой использовали для вычисления концентрации вариантов РХа в образцах плазмы.

Ό. Анализ данных РК.

Параметры РК (ЕЬ!8А) для исследований вариантов РХа на мышах рассчитывали, используя некомпартментный анализ с использованием программного обеспечения АпЖоп1дп (ν5.1, Ркагкщк! Согр., Мои^ат У1еу, СА). РК вариантов РХа характеризовалась кажущимся биэкспоненциальным распадом в плазме. Выбранные параметры для каждого протестированного варианта предусмотрены в табл. 25.

Параметры РК включают период полужизни (терминальный, мин), МКТ (МКТ_0-1акЬ мин), площадь под кривой (АиС)_04а4 (мин-мкг/мл)/доза (мг/кг); максимальную концентрацию (С_тах; (мкг/мл)/доза (мкг/кг), VI (мл/кг) и клиренс (С1, мл/мин/кг).

Таблица 24

Определения и формулы, используемые для вычисления фармакокинетических параметров

Т ермин/Формула	Определения
Период полужизни в плазме	период полужизни полипептида РХа в терминальной фазе профиля зависимости концентрации РХа в плазме от времени
БетаТ1_/2(Т,/₂в)	параметр вычислен как -1п2, деленный на отрицательный наклон в терминальной фазе линейно-логарифмического графика кривой зависимости концентрации РХа в плазме от времени
ΜΚ.Το-ΐ35ΐ	среднее время существования полипептида РХа в организме; вычисленное как АиМСо.^ /АиСо-щь ^гД^е АиМСо-1_а51 представляет собой общую площадь под кривой зависимости первого момента от времени, и АиС описана далее
АиСо-^ /Доза	параметр вычислен как значение [АиС(₀-1)1, где ί представляет собой последнюю временную точку с измеренной концентрацией полипептида РХа в плазме, деленное на IV дозу (мг/кг)
АиСо-трДоза	параметр вычислен как значение [АиС(о-о ⁺ С1/(1п2/ Ту₂ в)], где ί представляет собой последнюю временную точку с измеренной концентрацией полипептида РХа в плазме, деленное на IV дозу (мг/кг)
Сшах/Д^оза	(мкг/мл на мг/кг)
Стах	время после дозирования, соответствующее максимальной измеренной концентрации РХа в плазме
С1	системный клиренс, вычисленный как (Доза / АИС ₀-шг)
ν₅₅	объём распределения в стационарном состоянии; вычисленный как МКТ*С1
ν₂	объем распределения, основанный на константе терминальной элиминации (В); вычисленный как С1/(1п2/Т/₂ в)

- 122 028865

Таблица 25

Фармакокинетические свойства вариантов РХа, оцененные методом ЕЫ8А

Мутант (нумерация зрелого полипептида)	Мутант (нумерация по химотрипсину)	η	Ве1а Τι/2	т_тах	С / ^ν тах' Доза	/Доза	АиСо__ы /Доза	Уг	С1	МКТ (0-1а$1)	МКТ (0-ίηί)
1195Ь	116Ь	4	320	4	16	548	788	577	1,3	81	312
Е828/У1968	Е[82]8/У178	1	403	22	29	1719	3388	172	0,3	272	120
У1968	У178	4	523	3	30	1840	2757	306	0,44	241	743
С1978	0188	2	225	6	17	1584	2383	134	0,43	125	310
К.338А	К156А	2	462	2	21	1411	1844	350	0,56	267	577
КЗ 388	К1568	2	570	4	16	795	1770	402	0,71	106	715
У1968/Ь2118/	У178/Ь328/	2	405	4	23	1408	1723	336	0,58	248	483
О219Н	О40Н
1195Ь/Ь2118/ О219Н	116Ь/Ь328/ О40Н	2	337	4	23	1095	1708	284	0,59	111	377
У1968/К332А	У178/К150А	1	172	5	19	1205	1522	163	0,66	ПО	213
У1968/К.332О	У178/К150О	2	427	2	14	1250	1503	410	0,67	249	473
У1968/К.3328	У178/К1508	2	516	2	20	632	1471	382	1,07	67	626
У1968/К.332О	У178/КЛ50О	1	266	2	22	1029	1463	262	0,68	101	292
Ε67Ν/νΐ968	Ε[67]Ν/νΐ78	2	322	2	20	1113	1396	328	0,72	157	337
Κ.86Ν/Ε888/ У1968	К[86]М/Ь[88]8/ У178	2	249	2	21	747	1353	267	0,74	75	309
Ό95Ν/Ό97δ/ν 1968	Ό[95]Ν/Ό[97]8/ У178	2	162	10	16	938	1333	178	0,76	75	195
Ό119Ν/Ο1218 /VI968	Ό[119]Ν/ О[121]8/У178	2	473	2	21	755	1312	566	0,82	87	489
Ε83Ν/νΐ96δ	Ь[83]Т\Г/У178	2	213	4	23	981	1298	251	0,84	91	226
νΐ96δ/Ε264Ν /Е2668	νΐ7δ/Ε84Ν/ Ε868	2	400	2	23	987	1296	441	0,77	149	383
νΐ968/Κ243Ν /К2458	νΐ7δ/Κ63Ν/ Κ658	2	306	4	15	1150	1269	348	0,79	217	329
νΐ96δ/Ό389Ν Ύ3918	νΐ7δ/Ό205Ν/ Υ2078	2	267	2	23	1046	1250	308	0,87	166	306
νΐ968/Κ388Ν	νΐ7δ/Κ204Ν	1	514	2	18	639	1151	644	0,87	104	548
Ο114Ν/νΐ968	Ο[114]Ν/νΐ78	2	277	2	22	808	1132	342	0,91	93	285
Τ85Ν/Κ878/ У1968	Τ[85]Ν/Κ[87]δ/ У178	2	309	2	19	933	1131	370	0,99	175	341
Ο114Ν/νΐ96δ /Ь2118/0219	Ο[114]Ν/νΐ78/ Ь328/С40Н	2	326	2	22	928	1098	412	0,92	137	289
Ο78Ν/Ν808/ У1968	Ο[78]Ν/Ν[80]δ/ У178	1	195	2	14	631	768	373	1,31	93	194
Ό119Ν/Ο1218	Ό[119]Ν/
/У1968/Е264	С[121]8/У178/	1	384	2	12	611	741	689	1,39
Ν/Ε2668	Ε84Ν/Ε868									139	351
У1968/Ь2118/	У178/Ь328/
Ο219Η/Ε264Ν	Ο40Η/Ε84Ν/	1	249	2	12	522	658	540	1,55
/Е2668	Ε865									78	210
Όί 19Ν/Ο1218	Ό[119]Ν/
/У1968/Ь2118	Ο[121]δ/νΐ7δ/	1	332	6	11	530	614	786	1,63
/О219Н	Ь328/О40Н									112	239

Пример 8. Оценка прокоагулянтной активности полипептида РХа т νίνο.

Линия мышей с дефицитом РУ III (РУШ) была взята в качестве модели гемофилии А на мышах для оценки прокоагулянтной активности полипептидов РХа. Мышей обрабатывали полипептидом РХа и для определения прокоагулянтной активности полипептидов РХа оценивали количество потерянной за 20 мин крови.

А. Оценка прокоагулянтной активности полипептида РХа ш νίνο.

Самцов мышей РУШ^-- анестезировали путем внутрибрюшинного введения коктейля кетамина/ксилазина (45 мг/мл и 3,6 мг/мл в солевом растворе) и помещали на нагретую платформу (39°С), чтобы не допускать снижение температуры тела. В процедурной комнате поддерживали температуру 82°Р. За 10 мин до того, как был отрезан хвост, хвост погружали в 10 мл подогретого ΡΒδ (15 мл пробирка для центрифугирования; 39°С). Рекомбинантный человеческий РХа (разбавленный 5 мМ МΕδ, рН 5,5, 100 мМ №С1) или модифицированные полипептиды РХа (разбавленные 5 мМ МΕδ, рН 6, 100 мМ №С1) вводили одной инъекцией через хвостовую вену мышам в количестве до 15 особей. Мыши из группы отрицательного контроля получали только соответствующий буфер. В случаях, когда инъекция была пропущена, животное исключали из исследования.

Инъекцию полипептида РХа или буфера делали за 5 мин до того, как был отрезан хвост. Хвост от- 123 028865

резали, используя лезвие бритвы, на расстоянии 5 мм от конца хвоста, и кровь собирали в ΡΒ8 в течение периода 20 мин. В конце периода сбора крови оценивали общую потерю крови. Пробирки для сбора крови смешивали и 1 мл аликвоту каждого образца отбирали для оценки содержания гемоглобина. Х100 разбавляли 1:4 стерильной водой и 100 мкл раствора добавляли к 1 мл образцов, чтобы вызвать гемолиз. Поглощение образцов далее измеряли при длине волны 546 нм. Чтобы рассчитать объем потерянной крови, поглощение считывали по стандартной кривой, полученной путем измерения поглощения при 546 нм известных объемов мышиной крови, разбавленной в ΡΒ8 и гемолизованной Τ^^йοи Х-100, как указано выше. Значения были выражены в виде средней величины ±8ЕΜ.

1. Исследования влияния дозы на ответ для оценки коагулянтной активности РXа дикого типа.

В одном из исследований коагулянтную активность РXа дикого типа анализировали на мышах РУШ^-/-, как описано выше, используя дозы 0,1, 0,3 и 1 мг РXа/кг веса тела. Потеря крови в контрольной группе, получающей только буфер (5 мМ ΜР8, рН 5,5, 100 мМ №С1), составила 940,95±30,78 мкл (п = 9). Обработка РXа дикого типа в дозе 0,1 мг/кг не оказывала ингибирующего эффекта на потерю крови (958,76±31,91 мкл, п = 9), тогда как обработка в дозе 0,3 мг/кг и 1 мг/кг приводила к ингибированию потери крови до 870,36±53,92 мкл и 802,62±52,92 мкл соответственно (п = 10 при каждой дозе). Точное значение ЕО₅₀ не могло быть определено в этом исследовании из-за токсичности, наблюдаемой для высоких доз РXа дикого типа.

В последующем исследовании было определено, что максимальная переносимая доза (МПД) РXа дикого типа составляла 0,125 мг/кг. В последующем исследовании тестировали коагуляцию после однократной дозы 0,1 мг/кг. В этом эксперименте обработка РXа дикого типа не оказывала ингибирующего эффекта на потерю крови по сравнению с группой, получающей только буфер (890,14±23,97 мкл по сравнению с 914,03±23,48 мкл (группа, получающая только буфер, п = 15; экспериментальная группа, п = 10). Статистический анализ с использованием критерия Крускала-Уоллиса и последующего апостериорного теста Данна (эксперимент о влиянии дозы на ответ) и теста Манна-Уитни (эксперимент с однократной дозой), соответственно, продемонстрировал отсутствие значительного ингибирования потери крови при введении РXа дикого типа в дозе 0,1 мг/кг.

2. Исследования влияния дозы на ответ для оценки коагулянтной активности РXа-I195^ (П6Ь).

Влияние дозы на проагулянтный эффект мутанта РXа П95Ь (П6Ь в соответствии с нумерацией химотрипсина) тестировали на мышах РУШ^-/-, как описано выше. В первом анализе потеря крови в группе животных, получающих только буфер (5 мМ ΜР8, рН 6, 100 мМ №С1), составила 930,74±16,33 мкл (п = 9). Обработка РXа-I195^ (П6Ь) в дозах 0,2, 0,6 и 2 мг/кг приводила к значительному ингибированию потери крови: 717,34±41,34 мкл (п = 8), 704,93±46,45 мкл (п = 10) и 488±95,65 мкл (п = 11) соответственно (р < 0,05 с использованием критерия Крускала-Уоллиса и последующего апостериорного теста Данна).

Во втором тесте потеря крови в группе, получающей только буфер, составила 910,85±23,79 мкл (п = 12). Обработка РXа-I195^ (П6Ь) в дозе 0,46 мг/кг приводила к незначительному ингибированию потери крови (828,24±36,79 мкл; п = 8). Тем не менее, обработка РXа-I195^ (П6Ь) в увеличенных дозах 1,53 и 4,58 мг/кг приводила к значительному ингибированию потери крови: 690,99±41,88 мкл (п = 9) и 121,62±76,52 мкл (п = 7), соответственно, по сравнению с контрольной группой (р < 0,05 с использованием критерия Крускала-Уоллиса и последующего апостериорного теста Данна).

3. Исследования влияния дозы на ответ для оценки коагулянтной активности РXа-V1968 (У178).

Влияние дозы на проагулянтный эффект мутантов РXа-У1968 (У178 в соответствии с нумерацией

химотрипсина) оценивали на мышах РУШ^-/-, используя указанные выше способы. В первом тесте потеря крови в контрольной группе животных, получающих только буфер (5 мМ ΜЕ8, рН 6, 100 мМ №С1), составила 855,94±62,55 мкл (п = 9). Обработка РXа-У1968 (У178) в дозах 0,7 и 2,33 мг/кг приводила к незначительному ингибированию потери крови по сравнению с контрольной группой: 737,16±21,75 мкл (п = 8) и 614,38±75,13 мкл (п = 8) соответственно. Увеличенная доза РXа-У1968 (У178), составляющая 6,98 мг/кг, тем не менее, приводила к значительному ингибированию потери крови по сравнению с группой, получающей только буфер (151,51 ±32,43 мкл (п = 7); р < 0,05 с использованиемкритерия КрускалаУоллиса и последующего апостериорного теста Данна).

Во втором тесте потеря крови в группе, получающей только буфер, составляла 877,36±41,7 мкл (п =

8) . Обработка РXа-У1968 (У178) в дозе 0,7 мг/кг приводила к незначительному ингибированию потери крови (532,80±53,34 мкл; п = 9); тогда как обработка РXа-У1968 (У178) в дозах 2,33 и 6,98 мг/кг приводила к значительному ингибированию потери крови по сравнению с группой, получающей только буфер (189,66±40,14 мкл (п = 8) и 89,28±14,46 мкл (п = 7) соответственно; р < 0,05 с использованием критерия Крускала-Уоллиса и последующего апостериорного теста Данна).

В третьем тесте потеря крови в группе, получающей только буфер, составляла 1018,82±27,13 мкл (п =

9) . Обработка РXа-У1968 (У178) в дозе 0,7 мг/кг приводила к незначительному ингибированию потери крови (760,27±25,92 мкл, п = 9). Обработка РXа-У1968 (У178) в дозах 2,33 и 6,98 мг/кг приводила к значительному ингибированию потери крови по сравнению с группой, получающей только буфер (414,06±61,89 мкл (п = 9) и 187,24±25,08 мкл (п = 9) соответственно; р < 0,05 с использованием критерия

- 124 028865

Крускала-Уоллиса и последующего апостериорного теста Данна).

4. Исследования влияния дозы на ответ для оценки коагулянтной активности мутанта РXа при пониженной температуре.

Коагулянтную активность РXа-V1968 ^178) также оценивали при комнатной температуре 72-74°Р, тогда как предыдущие эксперименты (примеры 8А1-3) проводили при комнатной температуре 82°Р. В первой оценке потеря крови в группе, получающей только буфер, составляла 939,93± 19,12 мкл (η = 9). Обработка РXа-V1968 ^178) в дозе 0,7 мг/кг приводила к незначительному снижению потери крови (798,71±26,04 мкл; η = 9), тогда как обработка РXа-V1968 ^178) в дозах 2,33 и 6,98 мг/кг приводила к значительному снижению потери крови по сравнению с группой, получающей только буфер (502,48±93,31 мкл (η = 8) и 141,81±30,37 мкл (η = 9) соответственно; р < 0,05 с использованием критерия Крускала-Уоллиса и последующего апостериорного теста Данна).

Во второй оценке при комнатной температуре 72-74°Р потеря крови в группе, получающей только буфер, составляла 977,42±20,61 мкл (η = 9). Обработка РXа-V1968 ^178) в дозе 0,7 мг/кг приводила к незначительному снижению потери крови (690,52±79,41 мкл; η = 10). Обработка РXа-V178 как в дозе 2,33, так и в дозе 6,98 мг/кг приводила к значительному ингибированию потери крови по сравнению с группой, получающей только буфер (305,74±70 мкл (η = 10) и 152,42±37,44 мкл (η = 10) соответственно; р < 0,05 с использованием критерия Крускала-Уоллиса и последующего апостериорного теста Данна).

Коагулянтную активность других полипептидов РXа определяли, как описано выше, при комнатной температуре 72-74°Р. Рассчитанные с использованием нелинейной регрессии значения ЕО₅₀ для протестированных полипептидов РXа показаны в табл. 26 ниже.

Таблица 26

Значения ЕО₅₀ для зависимости ответа от дозы

Мутация (нумерация зрелого полипептида)	Мутация (нумерация по химотрипсину)	п/группа/ эксперимент	Ν (эксперимент)	Среднее Εϋ50 (мг/кг)
11951.	1161.	7- 12	2	2,5
VI968	νΐ7δ	7 - 10	5	2,0
Ο114Ν/νΐ96δ	Ο[114]Ν/νΐ7δ	8 - 10	2	1,4
Ό95Ν/Ο978/νΐ96δ	Ο[95]Ν/ϋ[97]δ/νΐ7δ	8 - 10	2	>3
Ε828/νΐ96δ	Ε[82]δ/νΐ7δ	8 - 10	2	>3
01978	0188	8 - 10 *	2	0,7
К338А	Κ156Α	7- 10	3	1,9
К3383	Κ1568	7- 10	2	1,6
V1968/Ь2118/0219Н	νΐ73Λ.323/Ο40Η	7-10	3	2,5
И95Ь/Ь2118/О219Н	116Ь/Ь328/О40Н	8-9	3	1,7
νΐ96δ/Κ332Α	νΐ7δ/Κ.150Α	8-10	2	0,2
νΐ96δ/Κ332Ώ	νΐ7δ/Κ150Ό	8-10	3	0,08
νΐ96δ/Κ3323	νΐ7δ/Κ.150δ	8-9	3	ο,ι
νΐ968/Κ332Ο	νΐ78/Κ150Ο	8 - 10	5	0,2
νΐ96δ/ Κ338Α	νΐ78/Κ156Α	8	1	7,9
У1968/ Κ3383	νΐ73/Κ1563	8-10	1	>5
νΐ96δ/Ε264Ν/Ε266δ	νΐ7δ/Ε84Ν/Ε86δ	8 - 10	2	2,7
νΐ963/Κ243Ν/Κ245δ	νΐ7δ/Κ63Ν/Κ65δ	8- 10	2	>3
V1963/1.2118/0219Η/Ε264Ν/ Ε2663	νΐ73/Ε323/Ο40Η/Ε84Ν/Ε863	9-10	2	2,1
Ό119Ν/0121 δ/ν 1968/Ь2118/ Ο219Η/Κ388Ν	Ό[ 119]Ν/Ο[121]3/νΐ 78/Ь328/ 040Η/Κ204Ν	8- 10	2	>3

* = В группе с самой высокой дозой в эксперименте 2 было только 3 животных, при этой дозе наблюдались случаи смерти.

Поскольку модификации будут очевидны специалистам в данной области техники, предполагается, что это изобретение ограничено только объемом прилагаемой формулы изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Выделенный модифицированный активный полипептид фактора X (РXа), содержащий аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 196 последовательности зрелого полипептида 8ЕР ГО N0: 134, в котором

соответствующие положения аминокислот идентифицируют выравниванием не модифицированного полипептида РX с полипептидом, последовательность которого приведена в 8ЕР ГО N0: 134;

замена представляет собой замену на нейтральный полярный аминокислотный остаток, который представляет собой серин (8) или треонин (Т);

не модифицированный РXа содержит последовательность аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 75% идентичность последовательности с РXа, содержащим легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот 1-139 8НС) ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот 195-448 8ЕР ГО N0: 134, или ее каталитически активную форму;

модифицированный РXа проявляет зависимость от кофактора РVа, которая увеличена по меньшей мере в 50 раз по сравнению с не модифицированным полипептидом РXа, не содержащим аминокислот- 125 028865

ную замену в положении, соответствующем положению 196; и

зависимость от кофактора представляет собой отношение каталитической активности модифицированного РXа в присутствии фактора Уа (РУа) по сравнению с отсутствием РУа.
2. Выделенный полипептид РXа по п.1, где модифицированный полипептид РX содержит аминокислотную замену на 8 в положении, соответствующем положению 196 8ЕЦ ГО N0: 134, или такую же замену соответствующего аминокислотного остатка в не модифицированном полипептиде РX, который не содержит 8 в положении, соответствующем 196.
3. Выделенный модифицированный полипептид РXа по п.1 или 2, включающий дополнительную аминокислотную замену (дополнительные аминокислотные замены) в легкой цепи или в протеазном домене тяжелой цепи, где

дополнительная аминокислотная замена (дополнительные аминокислотные замены) приводит к измененному гликозилированию, увеличенной устойчивости к ингибитору, увеличенной зависимости от кофактора, увеличению периода полужизни и/или увеличенной каталитической активности; и

дополнительная аминокислотная замена (дополнительные аминокислотные замены) присутствует в аминокислотном положении, соответствующем положению, выбранному из 211, 214, 216, 218, 219, 273, 276, 306, 326, 332, 338, 420 и 424 8ΙΡ) ГО N0: 134.
4. Выделенный полипептид РXа по п.3, где замена приводит к увеличенной устойчивости к ингибитору; и ингибитор представляет собой ингибитор пути тканевого фактора (ТРР^ или антитромбин III (АТШ).
5. Выделенный модифицированный полипептид РXа по п.4, где ингибитор представляет собой антитромбин III (АТШ).
6. Выделенный модифицированный полипептид РXа по любому из пп.1, 2, 4 и 5, включающий только одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать или двадцать замен аминокислот по сравнению с не модифицированным полипептидом РXа той же формы.
7. Выделенный модифицированный полипептид РXа по любому из пп.3-6, где дополнительная аминокислотная замена выбрана из аминокислотной замены (аминокислотных замен) на 8 в положении, соответствующем положению 211; Ό в положении, соответствующем положению 214; А в положении, соответствующем положению 214; 8 в положении, соответствующем положению 214; К в положении, соответствующем положению 216; К в положении, соответствующем положению 216; А в положении, соответствующем положению 216; 8 в положении, соответствующем положению 216; К в положении, соответствующем положению 218; К в положении, соответствующем положению 218; А в положении, соответствующем положению 218; Н в положении, соответствующем положению 219; А в положении, соответствующем положению 273; Е в положении, соответствующем положению 273; А в положении, соответствующем положению 276; Е в положении, соответствующем положению 276; Е в положении, соответствующем положению 306; 8 в положении, соответствующем положению 326; Т в положении, соответствующем положению 326; У в положении, соответствующем положению 326; О в положении, соответствующем положению 326; N в положении, соответствующем положению 326; Μ в положении, соответствующем положению 326; К в положении, соответствующем положению 326; Υ в положении, соответствующем положению 326; Е в положении, соответствующем положению 326; Ό в положении, соответствующем положению 326; А в положении, соответствующем положению 332; Ό в положении, соответствующем положению 332; Е в положении, соответствующем положению 332; 8 в положении, соответствующем положению 332; С в положении, соответствующем положению 332; А в положении, соответствующем положению 338; 8 в положении, соответствующем положению 338; N в положении, соответствующем положению 338; К в положении, соответствующем положению 338; У в положении, соответствующем положению 338; Υ в положении, соответствующем положению 338; Μ в положении, соответствующем положению 338; А в положении, соответствующем положению 420; Е в положении, соответствующем положению 420; А в положении, соответствующем положению 424; и Е в положении, соответствующем положению 424 8ЕЦ ГО N0: 134, или такую же замену (такие же замены) соответствующего аминокислотного остатка в не модифицированном полипептиде РX.
8. Выделенный модифицированный полипептид РXа по любому из пп.1-7, включающий аминокислотную замену (аминокислотные замены), выбранную из аминокислотной замены на А, Ό, Е, 8 или С в положении, соответствующем положению 332 в не модифицированном полипептиде РXа.
9. Выделенный модифицированный полипептид РXа по любому из пп.1-8, включающий аминокислотную замену (аминокислотные замены) на 8 в положении, соответствующем положению 196, и на А в положении, соответствующем положению 332, на основе нумерации зрелого полипептида 8ЕЦ ГО N0: 134, или такие же замены соответствующих аминокислотных остатков в не модифицированном полипептиде РXа.
10. Модифицированный полипептид РXа, включающий аминокислотные замены, соответствующие 1968 и 332А.
11. Выделенный модифицированный полипептид РXа по любому из пп.1-10, включающий дополнительную аминокислотную замену (дополнительные аминокислотные замены), которая вводит не на- 126 028865

тивный сайт гликозилирования.
12. Выделенный модифицированный полипептид РХа по любому из пп.1-11, где не модифицированный полипептид РХа выбран из:

a) активного полипептида РХ (РХа), содержащего легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот 1-139 8ЕЦ ГО NО: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот 195448 8ΙΤ) ГО Ш: 134; или

b) каталитически активной формы а).
13. Выделенный модифицированный полипептид РХа по любому из пп.1-12, где не модифицированный полипептид содержит тяжелую цепь и легкую цепь и состоит из последовательности аминокислот 1-139 8ЕЦ ГО NО: 134, и последовательности аминокислот 195-448 8ЕЦ ГО NО: 134.
14. Выделенный модифицированный полипептид РХа по любому из пп.1-11, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из:

а) последовательности аминокислот, содержащей легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот 1-139, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот 195-448 в любой из 8ΙΤ) ГО Ш: 137-157, 169, 205-208, 214-243 и 246-265; и

б) каталитически активной формы а), которая содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены) и проявляет каталитическую активность.
15. Модифицированный полипептид фактора Х (РХ), содержащий по меньшей мере две аминокислотные замены в не модифицированном полипептиде РХ, где

не модифицированный полипептид РХ имеет последовательность аминокислот, 8ЕЦ ГО NО: 134, или представляет собой ее зимогенную, активную или каталитически активную форму, или имеет последовательность аминокислот, которая обладает по меньшей мере 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью последовательности с 8ЕЦ ГО NО: 134 или ее зимогенной, активной или каталитически активной формой соответственно;

модифицированный полипептид РХ включает:

(ί) аминокислотную замену в положении, соответствующем положению 196 в не модифицированном полипептиде РХ 8ЕЦ ГО NО: 134, где аминокислотная замена представляет собой замену на нейтральную полярную аминокислоту, выбранную из серина (8) или треонина (Т); и

(ίί) дополнительную аминокислотную замену, которая придает полипептиду одно или несколько свойств, выбранных из увеличенной зависимости от кофактора, увеличенной устойчивости к ингибиторам, измененного гликозилирования, увеличенного периода полужизни или увеличенной каталитической активности, где

дополнительная аминокислотная замена не является заменой на изолейцин (I), аланин (А), серин (8) или треонин (Т) в положении, соответствующем положению 195 8ЕЦ ГО NО: 134, или такой же заменой соответствующего аминокислотного остатка в не модифицированном полипептиде РХ; и

активная форма РХ (РХа) модифицированного полипептида проявляет увеличенную зависимость от кофактора по сравнению с формой РХа полипептида РХ, не содержащего аминокислотную замену; и

зависимость от кофактора представляет собой отношение каталитической активности модифицированного РХа в присутствии фактора Уа (РУа) по сравнению с отсутствием РУа.
16. Модифицированный полипептид РХ по п.15, где модифицированный полипептид РХ содержит аминокислотную замену на 8 в положении, соответствующем положению 196 8ЕЦ ГО NО: 134, или такую же аминокислотную замену соответствующего аминокислотного остатка в не модифицированном полипептиде РХ.
17. Модифицированный полипептид РХ по п.15 или 16, где активная форма РХа модифицированного полипептида РХ проявляет увеличенную устойчивость к ингибитору, и ингибитор выбран из ингибитора пути тканевого фактора (ТРР1) или антитромбина III (АТ111).
18. Модифицированный полипептид РХ по п.17, где ингибитор представляет собой антитромбин III (АТ111).
19. Модифицированный полипептид РХ по любому из пп.15-18, включающий только одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать или двадцать замен аминокислот по сравнению с не модифицированным полипептидом той же формы.
20. Модифицированный полипептид РХ по любому из пп.15-19, включающий аминокислотную замену (аминокислотные замены) в аминокислотном положении, соответствующем положению, выбранному из 211, 214, 216, 218, 219, 273, 276, 306, 326, 332, 338, 420 и 424 8ΙΤ) ГО ΝΘ: 134, где соответствующие положения аминокислот идентифицируют выравниванием не модифицированного полипептида РХ с полипептидом, приведенным в 8ЕЦ ГО NО: 134.
21. Модифицированный полипептид РХ по п.20, включающий аминокислотную замену (аминокислотные замены), выбранную из аминокислотной замены (аминокислотных замен) на 8 в положении, соответствующем положению 211; Ό в положении, соответствующем положению 214; А в положении, соответствующем положению 214; 8 в положении, соответствующем положению 214; К в положении, соответствующем положению 216; К в положении, соответствующем положению 216; А в положении, со- 127 028865

ответствующем положению 216; 8 в положении, соответствующем положению 216; К в положении, соответствующем положению 218; К в положении, соответствующем положению 218; А в положении, соответствующем положению 218; Н в положении, соответствующем положению 219; А в положении, соответствующем положению 273; Е в положении, соответствующем положению 273; А в положении, соответствующем положению 276; Е в положении, соответствующем положению 276; Е в положении, соответствующем положению 306; 8 в положении, соответствующем положению 326; Т в положении, соответствующем положению 326; У в положении, соответствующем положению 326; О в положении, соответствующем положению 326; N в положении, соответствующем положению 326; Μ в положении, соответствующем положению 326; К в положении, соответствующем положению 326; Υ в положении, соответствующем положению 326; Е в положении, соответствующем положению 326; Ό в положении, соответствующем положению 326; А в положении, соответствующем положению 332; Ό в положении, соответствующем положению 332; Е в положении, соответствующем положению 332; 8 в положении, соответствующем положению 332; С в положении, соответствующем положению 332; А в положении, соответствующем положению 338; 8 в положении, соответствующем положению 338; N в положении, соответствующем положению 338; К в положении, соответствующем положению 338; У в положении, соответствующем положению 338; Υ в положении, соответствующем положению 338; Μ в положении, соответствующем положению 338; А в положении, соответствующем положению 420; Е в положении, соответствующем положению 420; А в положении, соответствующем положению 424; и Е в положении, соответствующем положению 424 8ЕЦ ГО N0: 134, или такую же замену (такие же замены) соответствующего аминокислотного остатка в не модифицированном полипептиде РX.
22. Модифицированный полипептид РX по любому из пп.15-21, включающий аминокислотную замену (аминокислотные замены), выбранную (выбранные) из аминокислотной замены (аминокислотных замен) на 8 в положении, соответствующем положению 196, и на А, Е, Ό, С или 8 в положении, соответствующем положению 332 8ЕЦ ГО N0: 134, или такую же аминокислотную замену соответствующего аминокислотного остатка в не модифицированном полипептиде РX, или такие же замены соответствующих аминокислотных остатков в не модифицированном полипептиде РX.
23. Модифицированный полипептид РX по любому из пп.1-22, включающий аминокислотные замены на 8 в положении, соответствующем положению 196, и на А в положении, соответствующем положению 332 8ЕЦ ГО N0: 134, или такую же аминокислотную замену соответствующего аминокислотного остатка в не модифицированном полипептиде РX, или такие же замены соответствующих аминокислотных остатков в не модифицированном полипептиде РX.
24. Модифицированный полипептид РX по любому из пп.15-23, включающий дополнительную аминокислотную замену (дополнительные аминокислотные замены), которая вводит не нативный сайт гликозилирования.
25. Модифицированный полипептид РX по любому из пп.15-24, где не модифицированный полипептид РX выбран из:

a) полипептида зимогена РX, содержащего легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот 1-139 8ЕЦ ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот 143-448 8ЕЦ ГО N0: 134, или последовательности аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 75% идентичность последовательности с полипептидом зимогена РX, содержащим легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот 1-139 8ЕЦ ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот 143-448 8ЕЦ ГО N0: 134;

b) активного полипептида РX (РXа), содержащего легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот 1-139 8ЕЦ ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 195-448 8ЕЦ ГО N0: 134, или последовательности аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 75% идентичность последовательности с РXа, содержащим легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 1-139 8ЕЦ ГО N0: 134, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот, приведенную как остатки 195-448 8ЕЦ ГО N0: 134; и

c) каталитически активной формы Ь).
26. Модифицированный полипептид РX по любому из пп.1-25, который содержит последовательность аминокислот полипептида из любой из 8ЕЦ ГО N0: 92-96 и 224-228.
27. Модифицированный полипептид РX по любому из пп.15-25, содержащий последовательность аминокислот, выбранную из:

a) последовательности аминокислот любой из 8ЕЦ ГО N0: 137-157, 169, 205-208, 214-243 и 246-265, или последовательности аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 75% идентичность последовательности с любой из последовательностей аминокислот 8ЕЦ ГО N0: 137-157, 169, 205-208, 214-243 и 246-265, и содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены);

b) последовательности аминокислот, содержащей легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот 1-139, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот 143-448 любой из 8ЕЦ ГО N0: 137-157, 169, 205-208, 214-243 и 246-265, или последовательности аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 75% идентичность последовательности с любой из последовательностей

- 128 028865

аминокислот, содержащих легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот 1-139, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот 143-448 любой из 8Еф ГО N0: 137-157, 169, 205208, 214-243 и 246-265, и которая содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены);

с) последовательности аминокислот, содержащей легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот 1-139, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот 195-448 любой из 8Еф ГО N0: 137-157, 169, 205-208, 214-243 и 246-265, или последовательности аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 75% идентичность последовательности с любой из последовательностей аминокислот, содержащих легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот 1-139, и тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот 195-448 любой из 8Еф ГО N0: 137-157, 169, 205208, 214-243 и 246-265, и которая содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены); и

б) каталитически активной формы с), которая включает модификацию (модификации) и проявляет каталитическую активность.
28. Модифицированный полипептид РХ по любому из пп.1-27, содержащий аминокислотную замену, выбранную из замены на Ь в положении, соответствующем положению 195 8Еф ГО N0: 134, или такую же замену (такие же замены) соответствующего аминокислотного остатка в не модифицированном полипептиде РХ.
29. Модифицированный полипептид РХ по любому из пп.1-28, где не модифицированный полипептид представляет собой человеческий полипептид.
30. Модифицированный полипептид РХ по любому из пп.1-28, где не модифицированный полипептид представляет собой не человеческий полипептид.
31. Модифицированный полипептид РХ по любому из пп.15-30, который выбран из полипептида зимогена, двухцепочечного полипептида и одноцепочечного полипептида.
32. Модифицированный полипептид РХ по любому из пп.15-31, который является активированным.
33. Модифицированный полипептид РХ по любому из пп.1-32, где модифицирована только первичная последовательность.
34. Модифицированный полипептид РХ по любому из пп.1-33, где модифицированный полипептид РХ гликозилирован, карбоксилирован, гидроксилирован, сульфатирован, фосфорилирован, модифицирован присоединением альбумина или конъюгирован с фрагментом полиэтиленгликоля (РЕО).
35. Модифицированный полипептид РХ по любому из пп.1-34, который представляет собой химерный белок или белок слияния.
36. Модифицированный полипептид РХ по п.35, содержащий последовательность аминокислотных остатков любой из 8Еф ГО N0: 505-509.
37. Молекула нуклеиновой кислоты, включающая последовательность нуклеотидов, кодирующую модифицированный полипептид РХ по любому из пп.1-36.
38. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.37.
39. Вектор по п.38, где вектор представляет собой прокариотический вектор, вирусный вектор или эукариотический вектор.
40. Вектор по п.38, который представляет собой вирусный вектор, выбранный из вектора на основе аденовируса, аденоассоциированного вируса, ретровируса, вируса герпеса, лентивируса, поксвируса и цитомегаловируса.
41. Клетка-хозяин, содержащая вектор по любому из пп.38-40.
42. Клетка по п.41, которая является эукариотической клеткой.
43. Клетка по п.42, где эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего.
44. Клетка по п.43, где клетка млекопитающего выбрана из клеток почки детеныша хомячка (ВНК21), или клеток 293, или клеток СН0.
45. Способ получения модифицированного полипептида РХ по любому из пп.1-36, включающий культивирование клетки по любому из пп.41-44 в условиях, в которых продуцируется модифицированный полипептид.
46. Способ по п.45, дополнительно включающий выделение модифицированного полипептида РХ.
47. Фармацевтическая композиция, содержащая модифицированный полипептид РХ по любому из пп.1-36 в фармацевтически приемлемом носителе.
48. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.37 в фармацевтически приемлемом носителе.
49. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор по любому из пп.38-40 в фармацевтически приемлемом носителе.
50. Фармацевтическая композиция по п.47-49, которая составлена для однократного введения дозы.
51. Способ получения модифицированного активного полипептида фактора Х (РХа), включающий:

a) обеспечение композиции, содержащей модифицированный зимоген РХ по п.31; и

b) удаление активационного пептида из полипептида за счет активационного расщепления зимогена, в результате чего образуется модифицированный полипептид РХа.
52. Способ получения модифицированного активного полипептида фактора Х (РХа), включающий: а) обеспечение композиции, содержащей модифицированный зимоген РХ, выбранный из зимогена,

- 129 028865

включающего:

легкую цепь, содержащую последовательность аминокислот 1-139 8ЕО ГО N0: 134, или последовательность аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 75% идентичность последовательности с последовательностью аминокислот 1-139 8Е0 ГО N0: 134 и содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены), выбранную (выбранные) из замен на 8 и Т в положении 196; и

тяжелую цепь, содержащую последовательность аминокислот 143-448, приведенную в любой из 8Е0 ГО N0: 136-265, или последовательность аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 75% идентичность последовательности с последовательностью аминокислот 143-448 из любой из 8Е0 ГО N0: 136-265, и которая содержит аминокислотную замену (аминокислотные замены) по сравнению с не модифицированным полипептидом РХ; и

Ь) удаление активационного пептида из полипептида за счет активационного расщепления зимогена, в результате чего образуется модифицированный полипептид РХа.
53. Способ по п.51 или 52, где активационное расщепление проводят ш νί\Ό или ш νίΙΐΌ.
54. Способ по любому из пп.51-53, дополнительно включающий удаление активационного пептида из композиции.
55. Способ по любому из пп.51-54, в котором зимоген РХ получают путем экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, приведенный в любой из 8Е0 ГО N0: 4-133 или 136-265 и 417-546, или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий последовательность аминокислот, которая имеет по меньшей мере 75% идентичность последовательности с любой из 8Е0 ГО N0: 4-133 или 136-265 и 417-546, и которая содержит аминокислотную замену (замены) по сравнению с не модифицированным полипептидом РХ.
56. Способ лечения заболевания или состояния, которое представляет собой нарушение свертываемости крови, включающий введение субъекту фармацевтической композиции по любому из пп.47-49, где модифицированный полипептид РХ представляет собой зимоген, РХа или его каталитически активную форму, которые содержат аминокислотную замену (аминокислотные замены); и

нарушение свертываемости крови выбрано из расстройства, обусловленного дефицитом фактора свертывания крови, расстройства, обусловленного присутствием приобретенных ингибиторов фактора свертывания крови, гематологического расстройства, геморрагического расстройства, болезни фон Виллебранда, расстройства, которое возникает в результате антикоагулянтной терапии антагонистом витамина К, наследственных нарушений функций тромбоцитов, дефицита витамин К эпоксид-редуктазы С1, дефицита γ-карбоксилазы, кровотечения, связанного с травмой, ранением, тромбоза, тромбоцитопении, инсульта, коагулопатии, диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС), синдрома Бернара-Сулье, тромбастении Гланцманна или дефицита пула накопления.
57. Способ по п.56, где нарушение свертываемости крови представляет собой гемофилию.
58. Применение модифицированного полипептида РХ по любому из пп.1-36 для лечения нарушения свертываемости крови, где

модифицированный полипептид РХ представляет собой зимоген, РХа или его каталитически активную форму, которые содержат аминокислотную замену (аминокислотные замены); и

нарушение свертываемости крови выбрано из расстройства, обусловленного дефицитом фактора свертывания крови, расстройства, обусловленного присутствием приобретенных ингибиторов фактора свертывания крови, гематологического расстройства, геморрагического расстройства, болезни фон Виллебранда, расстройства, которое возникает в результате антикоагулянтной терапии антагонистом витамина К, наследственных нарушений функций тромбоцитов, дефицита витамин К эпоксид-редуктазы С1, дефицита гамма-карбоксилазы, кровотечения, связанного с травмой, ранения, тромбоза, тромбоцитопении, инсульта, коагулопатии, диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС), синдрома Бернара-Сулье, тромбастении Гланцманна или дефицита пула накопления.
59. Применение модифицированного полипептида РХ по любому из пп.1-36 для получения лекарственного средства для лечения нарушения свертываемости крови, где

модифицированный полипептид РХ представляет собой зимоген, РХа или его каталитически активную форму, которые содержат аминокислотную замену (аминокислотные замены); и

нарушение свертываемости крови выбрано из расстройства, обусловленного дефицитом фактора свертывания крови, расстройства, обусловленного присутствием приобретенных ингибиторов фактора свертывания крови, гематологического расстройства, геморрагического расстройства, болезни фон Виллебранда, расстройства, которое возникает в результате антикоагулянтной терапии антагонистом витамина К, наследственных нарушений функций тромбоцитов, дефицита витамин К эпоксид-редуктазы С1, дефицита γ-карбоксилазы, кровотечения, связанного с травмой, ранением, тромбоза, тромбоцитопении, инсульта, коагулопатии, диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС), синдрома Бернара-Сулье, тромбастении Гланцманна или дефицита пула накопления.
60. Применение п.58 или 59, где нарушение свертываемости крови представляет собой гемофилию.

- 130 028865