ES2597436T3 - Antídotos para inhibidores del factor Xa y procedimientos de uso de los mismos - Google Patents
Antídotos para inhibidores del factor Xa y procedimientos de uso de los mismos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2597436T3 ES2597436T3 ES08834136.7T ES08834136T ES2597436T3 ES 2597436 T3 ES2597436 T3 ES 2597436T3 ES 08834136 T ES08834136 T ES 08834136T ES 2597436 T3 ES2597436 T3 ES 2597436T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- fxa
- antidote
- factor
- inhibitor
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 134
- 229940123583 Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 title claims description 35
- 239000000729 antidote Substances 0.000 title description 182
- 229940075522 antidotes Drugs 0.000 title description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 161
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 128
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 102
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 40
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 116
- 229950011103 betrixaban Drugs 0.000 claims description 86
- XHOLNRLADUSQLD-UHFFFAOYSA-N betrixaban Chemical compound C=1C=C(Cl)C=NC=1NC(=O)C1=CC(OC)=CC=C1NC(=O)C1=CC=C(C(=N)N(C)C)C=C1 XHOLNRLADUSQLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 86
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 86
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 86
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 86
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 64
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 60
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 claims description 37
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 34
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 33
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims description 31
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 30
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 29
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 26
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- QNZCBYKSOIHPEH-UHFFFAOYSA-N Apixaban Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1N1C(C(=O)N(CC2)C=3C=CC(=CC=3)N3C(CCCC3)=O)=C2C(C(N)=O)=N1 QNZCBYKSOIHPEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 229960003886 apixaban Drugs 0.000 claims description 22
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 claims description 21
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 claims description 21
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 20
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 19
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 claims description 19
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 claims description 19
- 229960001148 rivaroxaban Drugs 0.000 claims description 19
- KGFYHTZWPPHNLQ-AWEZNQCLSA-N rivaroxaban Chemical compound S1C(Cl)=CC=C1C(=O)NC[C@@H]1OC(=O)N(C=2C=CC(=CC=2)N2C(COCC2)=O)C1 KGFYHTZWPPHNLQ-AWEZNQCLSA-N 0.000 claims description 19
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 17
- 229960000610 enoxaparin Drugs 0.000 claims description 16
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 9
- KANJSNBRCNMZMV-ABRZTLGGSA-N fondaparinux Chemical group O[C@@H]1[C@@H](NS(O)(=O)=O)[C@@H](OC)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@H]1O[C@H]1[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O4)NS(O)(=O)=O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O2)NS(O)(=O)=O)[C@H](C(O)=O)O1 KANJSNBRCNMZMV-ABRZTLGGSA-N 0.000 claims description 7
- MVPQUSQUURLQKF-MCPDASDXSA-E nonasodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[(2r,3s,4s,5r,6r)-2-carboxylato-4,5-dimethoxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-6-methoxy-4,5-disulfonatooxy-2-(sulfonatooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-disulfonatooxy-2-(sulfonatooxymethyl)oxan-3-yl]oxy-4,5-di Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)O[C@@H]1[C@@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H](OC)O[C@H](COS([O-])(=O)=O)[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](OS([O-])(=O)=O)[C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COS([O-])(=O)=O)O4)OC)[C@H](O3)C([O-])=O)OC)[C@@H](COS([O-])(=O)=O)O2)OS([O-])(=O)=O)[C@H](C([O-])=O)O1 MVPQUSQUURLQKF-MCPDASDXSA-E 0.000 claims description 7
- 229960001318 fondaparinux Drugs 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 229940087051 fragmin Drugs 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- NPBKHEMDWREFJJ-UHFFFAOYSA-N 2-[(7-carbamimidoylnaphthalen-2-yl)methyl-[4-(1-ethanimidoylpiperidin-4-yl)oxyphenyl]sulfamoyl]acetic acid Chemical compound C1CN(C(=N)C)CCC1OC1=CC=C(N(CC=2C=C3C=C(C=CC3=CC=2)C(N)=N)S(=O)(=O)CC(O)=O)C=C1 NPBKHEMDWREFJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HGVDHZBSSITLCT-JLJPHGGASA-N Edoxaban Chemical compound N([C@H]1CC[C@@H](C[C@H]1NC(=O)C=1SC=2CN(C)CCC=2N=1)C(=O)N(C)C)C(=O)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C=N1 HGVDHZBSSITLCT-JLJPHGGASA-N 0.000 claims description 3
- 101001024703 Homo sapiens Nck-associated protein 5 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100036946 Nck-associated protein 5 Human genes 0.000 claims description 3
- IJNIQYINMSGIPS-UHFFFAOYSA-N darexaban Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC(O)=C1NC(=O)C1=CC=C(N2CCN(C)CCC2)C=C1 IJNIQYINMSGIPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000622 edoxaban Drugs 0.000 claims description 3
- QQBKAVAGLMGMHI-WIYYLYMNSA-N eribaxaban Chemical compound N1([C@H](C[C@H](C1)OC)C(=O)NC=1C(=CC(=CC=1)N1C(C=CC=C1)=O)F)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C=C1 QQBKAVAGLMGMHI-WIYYLYMNSA-N 0.000 claims description 3
- VYNKVNDKAOGAAQ-RUZDIDTESA-N n-[(1r)-2-[4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperazin-1-yl]-2-oxo-1-phenylethyl]-1h-indole-6-carboxamide Chemical compound C1CN(C)CCC1N1CCN(C(=O)[C@H](NC(=O)C=2C=C3NC=CC3=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 VYNKVNDKAOGAAQ-RUZDIDTESA-N 0.000 claims description 3
- PFGVNLZDWRZPJW-OPAMFIHVSA-N otamixaban Chemical compound C([C@@H](C(=O)OC)[C@@H](C)NC(=O)C=1C=CC(=CC=1)C=1C=C[N+]([O-])=CC=1)C1=CC=CC(C(N)=N)=C1 PFGVNLZDWRZPJW-OPAMFIHVSA-N 0.000 claims description 3
- 229950009478 otamixaban Drugs 0.000 claims description 3
- LJCBAPRMNYSDOP-LVCYMWGESA-N (2s)-3-(7-carbamimidoylnaphthalen-2-yl)-2-[4-[(3s)-1-ethanimidoylpyrrolidin-3-yl]oxyphenyl]propanoic acid;hydron;chloride;pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.Cl.C1N(C(=N)C)CC[C@@H]1OC1=CC=C([C@H](CC=2C=C3C=C(C=CC3=CC=2)C(N)=N)C(O)=O)C=C1 LJCBAPRMNYSDOP-LVCYMWGESA-N 0.000 claims description 2
- 229940123688 Direct Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 229940122093 Indirect Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 125
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 106
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 105
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 91
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 83
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 77
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 77
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 75
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 75
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 70
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 68
- 108010018682 PRT064445 Proteins 0.000 description 55
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 44
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 43
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 37
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 37
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 36
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 36
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 34
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 34
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 34
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 34
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 31
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 31
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 30
- -1 fenprocoumon Chemical compound 0.000 description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 30
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 29
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 29
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 29
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 29
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 28
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 28
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 28
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 26
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 26
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 25
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 25
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 22
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 22
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 22
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 21
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 21
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 21
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 20
- 108010013773 recombinant FVIIa Proteins 0.000 description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 19
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 18
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 18
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 17
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 17
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 17
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 16
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 16
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 15
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 15
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 15
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 15
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 14
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 14
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 14
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 14
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 13
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 13
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 13
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 13
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 12
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 12
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 11
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 11
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 108010014806 prothrombinase complex Proteins 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 description 10
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 10
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 10
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 10
- 102100037642 Elongation factor G, mitochondrial Human genes 0.000 description 9
- 101000880344 Homo sapiens Elongation factor G, mitochondrial Proteins 0.000 description 9
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 9
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 9
- 229960003856 argatroban Drugs 0.000 description 9
- KXNPVXPOPUZYGB-XYVMCAHJSA-N argatroban Chemical compound OC(=O)[C@H]1C[C@H](C)CCN1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NS(=O)(=O)C1=CC=CC2=C1NC[C@H](C)C2 KXNPVXPOPUZYGB-XYVMCAHJSA-N 0.000 description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 9
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 9
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 8
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 7
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 7
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 7
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 7
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 101100226845 Strongylocentrotus purpuratus EGF2 gene Proteins 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 7
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 7
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 7
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 6
- UQBOJOOOTLPNST-UHFFFAOYSA-N Dehydroalanine Chemical group NC(=C)C(O)=O UQBOJOOOTLPNST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000393496 Electra Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 6
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 6
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 6
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 6
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 6
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- 101710117290 Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 102100024952 Protein CBFA2T1 Human genes 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 5
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 5
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 5
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 5
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 5
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 4
- MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N (6S)-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid Chemical compound C([C@H]1CNC=2N=C(NC(=O)C=2N1)N)NC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 MSTNYGQPCMXVAQ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 4
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 4
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 4
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 4
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010090444 Innovin Proteins 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 4
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 4
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 4
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N pyrene Chemical compound C1=CC=C2C=CC3=CC=CC4=CC=C1C2=C43 BBEAQIROQSPTKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000012032 thrombin generation assay Methods 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 4
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 4
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PMHUSCHKTSTQEP-UHFFFAOYSA-N (4-carbamimidoylphenyl)methanesulfonyl fluoride Chemical compound NC(=N)C1=CC=C(CS(F)(=O)=O)C=C1 PMHUSCHKTSTQEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycerol-3-phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC PORPENFLTBBHSG-MGBGTMOVSA-N 0.000 description 3
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 3
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 3
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 3
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 3
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 3
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 3
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 3
- 102000003827 Plasma Kallikrein Human genes 0.000 description 3
- 108090000113 Plasma Kallikrein Proteins 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 3
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 3
- 101001045455 Proteus vulgaris Antitoxin HigA Proteins 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 3
- 102100030951 Tissue factor pathway inhibitor Human genes 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 229940127090 anticoagulant agent Drugs 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCN)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MWRBNPKJOOWZPW-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 3
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 3
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 3
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004023 fresh frozen plasma Substances 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 108010013555 lipoprotein-associated coagulation inhibitor Proteins 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 3
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 3
- 150000003905 phosphatidylinositols Chemical class 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 3
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 239000002821 viper venom Substances 0.000 description 3
- 229940019333 vitamin k antagonists Drugs 0.000 description 3
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCC(C=C1)=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O PMJWDPGOWBRILU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC KILNVBDSWZSGLL-KXQOOQHDSA-N 0.000 description 2
- SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC SNKAWJBJQDLSFF-NVKMUCNASA-N 0.000 description 2
- LVNGJLRDBYCPGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-distearoylphosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP([O-])(=O)OCC[NH3+])OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC LVNGJLRDBYCPGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BIABMEZBCHDPBV-MPQUPPDSSA-N 1,2-palmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-sn-glycerol) Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@@H](O)CO)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC BIABMEZBCHDPBV-MPQUPPDSSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- WUAPFZMCVAUBPE-NJFSPNSNSA-N 188Re Chemical compound [188Re] WUAPFZMCVAUBPE-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-1-piperidin-4-ylpyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CC(O)CN1C1CCNCC1 HIQIXEFWDLTDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 2
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 2
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 2
- 102100022977 Antithrombin-III Human genes 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N Butyric acid Chemical compound CCCC(O)=O FERIUCNNQQJTOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 108010061932 Factor VIIIa Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 2
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N N-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)N[C@H](C(=O)CCl)CC1=CC=CC=C1 MQUQNUAYKLCRME-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 2
- 241000272144 Naja atra Species 0.000 description 2
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- LUZWXMGSPXIQHB-UHFFFAOYSA-N OC(=O)CC(C1=CC=C(C=C1)[N+]([O-])=O)C1=C(O)C2=C(OC1=O)C=CC=C2 Chemical compound OC(=O)CC(C1=CC=C(C=C1)[N+]([O-])=O)C1=C(O)C2=C(OC1=O)C=CC=C2 LUZWXMGSPXIQHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241001504519 Papio ursinus Species 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N Pyridoxal Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N Stilbene Natural products C=1C=CC=CC=1/C=C/C1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-VAWYXSNFSA-N 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 101000712605 Theromyzon tessulatum Theromin Proteins 0.000 description 2
- RDFCSSHDJSZMTQ-ZDUSSCGKSA-N Tos-Lys-CH2Cl Chemical compound CC1=CC=C(S(=O)(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)CCl)C=C1 RDFCSSHDJSZMTQ-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VWQVUPCCIRVNHF-OUBTZVSYSA-N Yttrium-90 Chemical compound [90Y] VWQVUPCCIRVNHF-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 229960002054 acenocoumarol Drugs 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 150000001350 alkyl halides Chemical class 0.000 description 2
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 2
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 2
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 2
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001502 aryl halides Chemical class 0.000 description 2
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N benzo-alpha-pyrone Natural products C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YXLGWNWVIGXGME-NRFANRHFSA-N benzyl n-[2-[[2-[[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-2-[(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)amino]pentanoyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-2-oxoethyl]carbamate Chemical compound O=C([C@H](CCCN=C(N)N)NC1=CC=2OC(=O)C=C(C=2C=C1)C)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)OCC1=CC=CC=C1 YXLGWNWVIGXGME-NRFANRHFSA-N 0.000 description 2
- JCXGWMGPZLAOME-AKLPVKDBSA-N bismuth-212 Chemical compound [212Bi] JCXGWMGPZLAOME-AKLPVKDBSA-N 0.000 description 2
- 108010055460 bivalirudin Proteins 0.000 description 2
- OIRCOABEOLEUMC-GEJPAHFPSA-N bivalirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 OIRCOABEOLEUMC-GEJPAHFPSA-N 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 108090001015 cancer procoagulant Proteins 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 2
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001780 epistaxis Diseases 0.000 description 2
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 2
- IINNWAYUJNWZRM-UHFFFAOYSA-L erythrosin B Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(I)C(=O)C(I)=C2OC2=C(I)C([O-])=C(I)C=C21 IINNWAYUJNWZRM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940011411 erythrosine Drugs 0.000 description 2
- 239000004174 erythrosine Substances 0.000 description 2
- 235000012732 erythrosine Nutrition 0.000 description 2
- GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N fluoranthrene Natural products C1=CC(C2=CC=CC=C22)=C3C2=CC=CC3=C1 GVEPBJHOBDJJJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 2
- BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 2
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N iron(II,III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]O[Fe]=O SZVJSHCCFOBDDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N isoquinoline Chemical compound C1=NC=CC2=CC=CC=C21 AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- FIBJDTSHOUXTKV-BRHMIFOHSA-N lepirudin Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@@H]2NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC2=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc2ccc(O)cc2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O FIBJDTSHOUXTKV-BRHMIFOHSA-N 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L lucifer yellow dye Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC(C(N(C(=O)NN)C2=O)=O)=C3C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC3=C1N DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M malachite green Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(C=1C=CC=CC=1)=C1C=CC(=[N+](C)C)C=C1 FDZZZRQASAIRJF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229940107698 malachite green Drugs 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 2
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- SSZBUIDZHHWXNJ-UHFFFAOYSA-N palmityl stearate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCCCCCCCCCCCCCCC SSZBUIDZHHWXNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- IEQIEDJGQAUEQZ-UHFFFAOYSA-N phthalocyanine Chemical compound N1C(N=C2C3=CC=CC=C3C(N=C3C4=CC=CC=C4C(=N4)N3)=N2)=C(C=CC=C2)C2=C1N=C1C2=CC=CC=C2C4=N1 IEQIEDJGQAUEQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 2
- 108010012557 prothrombin complex concentrates Proteins 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- WUAPFZMCVAUBPE-IGMARMGPSA-N rhenium-186 Chemical compound [186Re] WUAPFZMCVAUBPE-IGMARMGPSA-N 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 229940124547 specific antidotes Drugs 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N stilbene Chemical compound C=1C=CC=CC=1C=CC1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021286 stilbenes Nutrition 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 239000005460 tetrahydrofolate Substances 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100001274 therapeutic index Toxicity 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 239000002691 unilamellar liposome Substances 0.000 description 2
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 2
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- XSWBNALIBMCQED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-phenyl-2-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)C(C=1C=CC=CC=1)(C)SSC1=CC=CC=N1 XSWBNALIBMCQED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoate Chemical compound C=1C=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O LLXVXPPXELIDGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[(2-iodoacetyl)amino]benzoate Chemical compound C1=CC(NC(=O)CI)=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[1-(pyridin-2-yldisulfanyl)ethyl]benzoate Chemical compound C=1C=C(C(=O)ON2C(CCC2=O)=O)C=CC=1C(C)SSC1=CC=CC=N1 GKSPIZSKQWTXQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N (3-hexadecanoyloxy-2-hydroxypropyl) 2-(trimethylazaniumyl)ethyl phosphate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C ASWBNKHCZGQVJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWKMGYQJPOAASG-UHFFFAOYSA-M 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylate Chemical compound C1=CC=C2CNC(C(=O)[O-])CC2=C1 BWKMGYQJPOAASG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=C(F)C=C1F VILFTWLXLYIEMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJLUATLTXUNBOT-UHFFFAOYSA-N 1-Hexadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCN FJLUATLTXUNBOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AASYSXRGODIQGY-UHFFFAOYSA-N 1-[1-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)hexyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C(CCCCC)N1C(=O)C=CC1=O AASYSXRGODIQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPBMJFQAGBVIDC-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2C(O)NC(C(O)=O)CC2=C1 MPBMJFQAGBVIDC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 10043-66-0 Chemical compound [131I][131I] PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 0.000 description 1
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCO)OCCCCCCCCCCCCCC WALUVDCNGPQPOD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 2,4-Hexadienoic acid, potassium salt (1:1), (2E,4E)- Chemical compound [K+].CC=CC=CC([O-])=O CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O UFBJCMHMOXMLKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(oxiran-2-ylmethoxy)butoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COCCCCOCC1CO1 SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JPHGTWWUDOEBRJ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,4,4a,5-tetrahydro-1h-naphthalene-2-carboxylic acid Chemical compound C1C=CC=C2CC(N)(C(O)=O)CCC21 JPHGTWWUDOEBRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFWRDBDJAOHXSH-SECBINFHSA-N 2-azaniumylethyl [(2r)-2,3-diacetyloxypropyl] phosphate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](OC(C)=O)COP(O)(=O)OCCN CFWRDBDJAOHXSH-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- FDAYLTPAFBGXAB-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-n,n-bis(2-chloroethyl)ethanamine Chemical compound ClCCN(CCCl)CCCl FDAYLTPAFBGXAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NUIURNJTPRWVAP-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dimethylbenzidine Chemical compound C1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=CC=2)=C1 NUIURNJTPRWVAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMRMMAOBSFSXLN-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]butanehydrazide Chemical compound C1=CC(CCCC(=O)NN)=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O ZMRMMAOBSFSXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BMUXFZXYGDXKJY-UHFFFAOYSA-N 4-azido-2-hydroxybenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1O BMUXFZXYGDXKJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004217 4-methoxybenzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1OC([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- ZBPYOEMMLMVVQT-UHFFFAOYSA-N 5-chloropyridine-2-carboxamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=C(Cl)C=N1 ZBPYOEMMLMVVQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LIFHMKCDDVTICL-UHFFFAOYSA-N 6-(chloromethyl)phenanthridine Chemical compound C1=CC=C2C(CCl)=NC3=CC=CC=C3C2=C1 LIFHMKCDDVTICL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 description 1
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMHJEEQLYBKSAN-UHFFFAOYSA-N Adipaldehyde Chemical compound O=CCCCCC=O UMHJEEQLYBKSAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000228254 Aspergillus restrictus Species 0.000 description 1
- 101000669426 Aspergillus restrictus Ribonuclease mitogillin Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 102100026031 Beta-glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010028614 BnSO(2)-D-Arg-Gly-Arg-ketothiazole Proteins 0.000 description 1
- UJKPHYRXOLRVJJ-MLSVHJFASA-N CC(O)C1=C(C)/C2=C/C3=N/C(=C\C4=C(CCC(O)=O)C(C)=C(N4)/C=C4\N=C(\C=C\1/N\2)C(C)=C4C(C)O)/C(CCC(O)=O)=C3C Chemical compound CC(O)C1=C(C)/C2=C/C3=N/C(=C\C4=C(CCC(O)=O)C(C)=C(N4)/C=C4\N=C(\C=C\1/N\2)C(C)=C4C(C)O)/C(CCC(O)=O)=C3C UJKPHYRXOLRVJJ-MLSVHJFASA-N 0.000 description 1
- 102000019025 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010026870 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100033620 Calponin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 108020004998 Chloroplast DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005133 Chloroplast RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 101710112752 Cytotoxin Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 description 1
- 241000271032 Daboia russelii Species 0.000 description 1
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKUKTXOBAWVSHC-UHFFFAOYSA-N Dimethylphosphate Chemical compound COP(O)(=O)OC KKUKTXOBAWVSHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JYGLAHSAISAEAL-UHFFFAOYSA-N Diphenadione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C1C(=O)C(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JYGLAHSAISAEAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 1
- 229940123900 Direct thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010074105 Factor Va Proteins 0.000 description 1
- 108010071241 Factor XIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700004714 Gelonium multiflorum GEL Proteins 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010054964 H-hexahydrotyrosyl-alanyl-arginine-4-nitroanilide Proteins 0.000 description 1
- 206010019027 Haemothorax Diseases 0.000 description 1
- 101710153310 Hemoglobin subunit beta-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100038617 Hemoglobin subunit gamma-2 Human genes 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 101000690301 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 1
- 101000933465 Homo sapiens Beta-glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101001116548 Homo sapiens Protein CBFA2T1 Proteins 0.000 description 1
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 244000207740 Lemna minor Species 0.000 description 1
- 235000006439 Lemna minor Nutrition 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical class ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 101710204212 Neocarzinostatin Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N Octadecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN REYJJPSVUYRZGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- CWRVKFFCRWGWCS-UHFFFAOYSA-N Pentrazole Chemical compound C1CCCCC2=NN=NN21 CWRVKFFCRWGWCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000742 Plant toxin Toxicity 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 235000001855 Portulaca oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 1
- 108700033844 Pseudomonas aeruginosa toxA Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101100409194 Rattus norvegicus Ppargc1b gene Proteins 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 1
- 240000003946 Saponaria officinalis Species 0.000 description 1
- 108010084592 Saporins Proteins 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- 241000710961 Semliki Forest virus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 102100035088 Sodium/calcium exchanger 1 Human genes 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 241000194026 Streptococcus gordonii Species 0.000 description 1
- PCSMJKASWLYICJ-UHFFFAOYSA-N Succinic aldehyde Chemical compound O=CCCC=O PCSMJKASWLYICJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 101150052863 THY1 gene Proteins 0.000 description 1
- GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N Technetium-99 Chemical compound [99Tc] GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000235013 Yarrowia Species 0.000 description 1
- DSNRWDQKZIEDDB-GCMPNPAFSA-N [(2r)-3-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-2-[(z)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC DSNRWDQKZIEDDB-GCMPNPAFSA-N 0.000 description 1
- CWRILEGKIAOYKP-SSDOTTSWSA-M [(2r)-3-acetyloxy-2-hydroxypropyl] 2-aminoethyl phosphate Chemical compound CC(=O)OC[C@@H](O)COP([O-])(=O)OCCN CWRILEGKIAOYKP-SSDOTTSWSA-M 0.000 description 1
- HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N [(3s,8s,9s,10r,13r,14s,17r)-10,13-dimethyl-17-[(2r)-6-methylheptan-2-yl]-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-3-yl] n-[2-(dimethylamino)ethyl]carbamate Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OC(=O)NCCN(C)C)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HIHOWBSBBDRPDW-PTHRTHQKSA-N 0.000 description 1
- VUBTYKDZOQNADH-UHFFFAOYSA-N acetyl hexadecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC(C)=O VUBTYKDZOQNADH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 239000002776 alpha toxin Substances 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K aluminium tristearate Chemical compound [Al+3].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- REDXJYDRNCIFBQ-UHFFFAOYSA-N aluminium(3+) Chemical compound [Al+3] REDXJYDRNCIFBQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940063655 aluminum stearate Drugs 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940003354 angiomax Drugs 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 229940104697 arixtra Drugs 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019606 astringent taste Nutrition 0.000 description 1
- VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N azanide;cyclobutane-1,1-dicarboxylic acid;platinum(2+) Chemical compound [NH2-].[NH2-].[Pt+2].OC(=O)C1(C(O)=O)CCC1 VSRXQHXAPYXROS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N benzidine Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C=C1 HFACYLZERDEVSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004993 binary fission Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 108700021042 biotin binding protein Proteins 0.000 description 1
- 102000043871 biotin binding protein Human genes 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- NXVYSVARUKNFNF-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2,3-dihydroxybutanedioate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)C(O)C(O)C(=O)ON1C(=O)CCC1=O NXVYSVARUKNFNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001500 bivalirudin Drugs 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003130 blood coagulation factor inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000001273 butane Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- XEVRDFDBXJMZFG-UHFFFAOYSA-N carbonyl dihydrazine Chemical compound NNC(=O)NN XEVRDFDBXJMZFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 229960004562 carboplatin Drugs 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 229930183167 cerebroside Natural products 0.000 description 1
- 150000001784 cerebrosides Chemical class 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N chloroacetone Chemical compound CC(=O)CCl BULLHNJGPPOUOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 229960001307 clorindione Drugs 0.000 description 1
- NJDUWAXIURWWLN-UHFFFAOYSA-N clorindione Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O NJDUWAXIURWWLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 1
- 239000008119 colloidal silica Substances 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 229940072645 coumadin Drugs 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000002178 crystalline material Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000002574 cystoscopy Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 229960004969 dalteparin Drugs 0.000 description 1
- 229960003828 danaparoid Drugs 0.000 description 1
- 229960000975 daunorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-O diazynium Chemical class [NH+]#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 229960001912 dicoumarol Drugs 0.000 description 1
- DOBMPNYZJYQDGZ-UHFFFAOYSA-N dicoumarol Chemical compound C1=CC=CC2=C1OC(=O)C(CC=1C(OC3=CC=CC=C3C=1O)=O)=C2O DOBMPNYZJYQDGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HIZKPJUTKKJDGA-UHFFFAOYSA-N dicumarol Natural products O=C1OC2=CC=CC=C2C(=O)C1CC1C(=O)C2=CC=CC=C2OC1=O HIZKPJUTKKJDGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMGXUWVIJIQANV-UHFFFAOYSA-M didecyl(dimethyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCCCCCCCC UMGXUWVIJIQANV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N dihydromaleimide Natural products O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- GXGAKHNRMVGRPK-UHFFFAOYSA-N dimagnesium;dioxido-bis[[oxido(oxo)silyl]oxy]silane Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-][Si](=O)O[Si]([O-])([O-])O[Si]([O-])=O GXGAKHNRMVGRPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N dimethyl hexanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCC(=N)OC ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FRTGEIHSCHXMTI-UHFFFAOYSA-N dimethyl octanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCCCC(=N)OC FRTGEIHSCHXMTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRPQMNYCTSPGCX-UHFFFAOYSA-N dimethyl pimelimidate Chemical compound COC(=N)CCCCCC(=N)OC LRPQMNYCTSPGCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002147 dimethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 229960000267 diphenadione Drugs 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L disodium [3-[2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propoxy-oxidophosphoryl]oxy-2-hydroxypropyl] 2,3-di(octadeca-9,12-dienoyloxy)propyl phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COP([O-])(=O)OCC(O)COP([O-])(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCC=CCCCCC ZGSPNIOCEDOHGS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N disuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JRBPAEWTRLWTQC-UHFFFAOYSA-N dodecylamine Chemical compound CCCCCCCCCCCCN JRBPAEWTRLWTQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000000203 droplet dispensing Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000009297 electrocoagulation Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000002297 emergency surgery Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 229960002822 ethyl biscoumacetate Drugs 0.000 description 1
- JCLHQFUTFHUXNN-UHFFFAOYSA-N ethyl biscoumacetate Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C(C(C=3C(OC4=CC=CC=C4C=3O)=O)C(=O)OCC)=C(O)C2=C1 JCLHQFUTFHUXNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006624 extrinsic pathway Effects 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 125000005179 haloacetyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960003569 hematoporphyrin Drugs 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 238000012188 high-throughput screening assay Methods 0.000 description 1
- 102000054751 human RUNX1T1 Human genes 0.000 description 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 229940102213 injectable suspension Drugs 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000007919 intrasynovial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 230000006623 intrinsic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N isothiocyanate group Chemical group [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 108010002230 lepirudin Proteins 0.000 description 1
- 229960004408 lepirudin Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 229940118179 lovenox Drugs 0.000 description 1
- 238000007422 luminescence assay Methods 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000000391 magnesium silicate Substances 0.000 description 1
- 229940099273 magnesium trisilicate Drugs 0.000 description 1
- 229910000386 magnesium trisilicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019793 magnesium trisilicate Nutrition 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229940118019 malondialdehyde Drugs 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 108091064355 mitochondrial RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000009149 molecular binding Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N n-butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N n-pentane Natural products CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N neocarzinostatin chromophore Chemical compound O1[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC)[C@H]1O[C@@H]1C/2=C/C#C[C@H]3O[C@@]3([C@@H]3OC(=O)OC3)C#CC\2=C[C@H]1OC(=O)C1=C(O)C=CC2=C(C)C=C(OC)C=C12 QZGIWPZCWHMVQL-UIYAJPBUSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000007935 oral tablet Substances 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- URLKBWYHVLBVBO-UHFFFAOYSA-N p-dimethylbenzene Natural products CC1=CC=C(C)C=C1 URLKBWYHVLBVBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- WCVRQHFDJLLWFE-UHFFFAOYSA-N pentane-1,2-diol Chemical compound CCCC(O)CO WCVRQHFDJLLWFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000280 phenindione Drugs 0.000 description 1
- NFBAXHOPROOJAW-UHFFFAOYSA-N phenindione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C1C1=CC=CC=C1 NFBAXHOPROOJAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002428 photodynamic therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000003123 plant toxin Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 235000010241 potassium sorbate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 description 1
- 229940069338 potassium sorbate Drugs 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 150000003834 purine nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229960003581 pyridoxal Drugs 0.000 description 1
- 235000008164 pyridoxal Nutrition 0.000 description 1
- 239000011674 pyridoxal Substances 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 229940068953 recombinant fviia Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 229940030915 refludan Drugs 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- WBHHMMIMDMUBKC-QJWNTBNXSA-M ricinoleate Chemical compound CCCCCC[C@@H](O)C\C=C/CCCCCCCC([O-])=O WBHHMMIMDMUBKC-QJWNTBNXSA-M 0.000 description 1
- 229940066675 ricinoleate Drugs 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 108010067207 sodium-calcium exchanger 1 Proteins 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 229960002317 succinimide Drugs 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 150000003461 sulfonyl halides Chemical class 0.000 description 1
- 231100000617 superantigen Toxicity 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 230000001839 systemic circulation Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940056501 technetium 99m Drugs 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 229940121358 tyrosine kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000005483 tyrosine kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000004865 vascular response Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
- 229950009268 zinostatin Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4826—Trypsin (3.4.21.4) Chymotrypsin (3.4.21.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4833—Thrombin (3.4.21.5)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4853—Kallikrein (3.4.21.34 or 3.4.21.35)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/02—Antidotes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21006—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Un derivado de fXa que es un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 12.
Description
DESCRIPCIÓN
Antídotos para inhibidores del factor Xa y procedimientos de uso de los mismos.
CAMPO DE LA INVENCIÓN 5
La presente invención se refiere al uso de derivados del factor Xa (fXa) que tienen actividad procoagulante intrínseca reducida o carecen de ella pero también son capaces de unirse a y/o neutralizar inhibidores de fXa actuando de este modo como antídotos para anticoagulantes dirigidos a fXa.
10
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los anticoagulantes atienden una necesidad en el mercado en el tratamiento o la prevención de trombosis no deseada en pacientes con una tendencia a formar coágulos de sangre, tales como, por ejemplo, aquellos pacientes que tienen trastornos de coagulación, confinados a periodos de inmovilidad o que se están sometiendo a cirugías 15 médicas. Una de las principales limitaciones de la terapia anticoagulante, sin embargo, es el riesgo de hemorragia asociado con los tratamientos, y limitaciones en la capacidad de invertir rápidamente la actividad anticoagulante en caso de sobredosis o si se requiere un procedimiento quirúrgico urgente. Por lo tanto, antídotos específicos y eficaces para todas las formas de terapia anticoagulante son altamente deseables. Por consideraciones de seguridad, también es ventajoso tener un par anticoagulante-antídoto en el desarrollo de nuevos fármacos 20 anticoagulantes.
Los pares anticoagulante-antídoto disponibles actualmente para sobreanticoagulación son heparina - protamina y warfarina - vitamina K. Plasma fresco congelado y factor VIIa recombinante (rfVIIa) también se han usado como antídotos inespecíficos en pacientes en tratamiento con heparina de bajo peso molecular, que padecen traumatismo 25 grave o hemorragia grave. (Lauritzen, B. y col., Blood, 2005, 607A-608A). También se describen fragmentos de protamina (patente de Estados Unidos N.º 6.624.141) y pequeños péptidos sintéticos (patente de Estados Unidos N.º 6.200.955) como heparina o antídotos de heparina de bajo peso molecular; y muteínas de trombina (patente de Estados Unidos N.º 6.060.300) como antídotos para inhibidor de trombina. Intermedios y derivados de protrombina se han descrito como antídotos para hirudina y trombina sintética (patentes de Estados Unidos N.º 5.817.309 y 30 6.086.871).
Una forma prometedora de terapia anticoagulante se dirige al factor Xa (fXa), y de hecho, varios inhibidores de fXa directos están actualmente en diferentes fases de desarrollo clínico para uso en terapia anticoagulante. Muchos de estos son moléculas pequeñas. Aunque estos nuevos inhibidores de fXa se muestran prometedores para el 35 tratamiento, aún se necesitan antídotos específicos y eficaces. En el caso de sobreanticoagulación o requisito de cirugía en pacientes tratados con estos inhibidores de fXa, puede requerirse un agente para neutralizar sustancialmente el inhibidor o inhibidores de fXa administrados y restaurar la hemostasia normal.
Los agentes disponibles actualmente, tales como el factor VIIa recombinante (rfVIIa), están mecánicamente limitados 40 y son inespecíficos para la inversión de inhibidores de fXa y, por lo tanto, opciones mejoradas para el facultativo son altamente deseables. En estudios en ser humano, rfVIIa se ha usado para invertir el efecto de inhibidores de fXa dependientes de antitrombina III indirectos, tales como fondaparinux e idraparinux (Bijsterveld, NR y col., Circulation, 2002, 106: 2550-2554; Bijsterveld, NR y col., British J. of Haematology, 2004(124): 653-658). El mecanismo de acción del factor VIIa (fVIIa) es actuar con el factor tisular para convertir el factor X (fX) presente en la circulación 45 sanguínea en fXa para restaurar la hemostasia normal el pacientes. Este modo de acción dicta necesariamente que la concentración potencial más elevada de fXa que podría alcanzarse para neutralizar inhibidores de fXa dirigidos al sitio activo está limitada por la concentración plasmática circulante de fX. Por lo tanto, el potencial de usar rfVIIa para invertir el efecto de inhibidores de fXa directos está mecánicamente limitado. Dado que la concentración plasmática circulante de fX es 150 nanomolar (“nM”), la cantidad máxima de fXa producida por este modelo sería de 150 nM. 50 Por lo tanto, el potencial de uso de rfVIIa para invertir el efecto de inhibidores de fXa directos está mecánicamente limitado. Las concentraciones terapéuticas descritas de inhibidores de fXa de molécula pequeña tales como rivaroxaban han sido mayores (aproximadamente 600 nM, Kubitza D, y col., Eur. J. Clin. Pharmacol., 2005, 61: 873-880) que la cantidad potencial de fXa generada por rfVIIa. El uso de rfVIIa para la inversión de niveles terapéuticos o supraterapéuticos de anticoagulación mediante inhibidor de fXa proporcionaría, por lo tanto, niveles inadecuados de 55 eficacia. Tal como se muestra en la figura 4, el uso de rfVIIa tiene un efecto limitado en la neutralización de la actividad anticoagulante de un inhibidor del factor Xa betrixaban (descrito a continuación). El fVIIa recombinante mostraba una actividad de antídoto sensible a la dosis de 50 nM a 100 nM, pero el efecto se estabilizaba entre 100 nM y 200 nM, indicando que su efecto de antídoto está limitado por factores diferentes de su concentración. En todas las concentraciones de rfVIIa ensayadas, betrixaban seguía mostrando una inhibición en respuesta a la dosis de fXa, hasta aproximadamente el 75% de inhibición a una concentración de 250 nM. Esta observación es coherente con el mecanismo de acción propuesto de fVIIa. Esto también está apoyado por estudios que muestran que rfVIIa no invertía completamente el efecto inhibidor of fondaparinux sobre los parámetros de generación de trombina y activación de protrombina. (Gerotiafas, GT, y col., Thrombosis & Haemostasis 2204(91): 531-537). 5
El fXa activo exógeno no puede administrarse directamente a un sujeto de una manera similar a rfVIIa. A diferencia de rfVIIa, que tiene una muy baja actividad procoagulante en ausencia de su cofactor, el factor tisular, el fXa nativo es una potente enzima y tiene un riesgo potencial de causar trombosis. Por lo tanto, el uso de rfVIIa o fXa activo como antídoto para una terapia anticoagulante de fXa presenta desventajas. 10
Por lo tanto, existe una necesidad de agentes antídoto mejorados que no causen trombosis no deseada y que sean eficaces en neutralizar sustancialmente la actividad anticoagulante de un inhibidor de fXa en caso de una sobredosis del inhibidor de fXa o en caso de que sea necesario restaurar la hemostasia normal para prevenir o detener una hemorragia. 15
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Se ha descubierto ahora que la administración de derivados modificados de proteínas de fXa son útiles como antídotos para anticoagulantes dirigidos a fXa. Los derivados modificados de proteínas de fXa no compiten con fXa 20 para ensamblarse en el complejo de protrombinasa, sino que en su lugar se unen a y/o neutralizan sustancialmente los anticoagulantes, tales como inhibidores de fXa. Los derivados útiles como antídotos se modifican para reducir o eliminar actividades procoagulante y anticoagulante intrínsecas, mientras conservan la capacidad de unirse a los inhibidores. Se contempla que los derivados de la divulgación pueden incluir modificar el sitio activo, o cambiar o eliminar todo el dominio Gla de fXa, o diversas combinaciones de los mismos. Se contempla, además, que la 25 modificación del dominio Gla reduce o elimina el efecto anticoagulante del derivado de fXa sobre la hemostasia normal, debido a que se sabe que un fXa de longitud completa modificado en el sitio activo es un anticoagulante.
Se contempla, además, que modificar el dominio EGF (delecionando o sustituyendo el dominio EGF1, EGF2, o ambos EGF1 y EGF2) del fXa proporciona un derivado útil para los procedimientos de esta divulgación. La 30 modificación del dominio EGF puede realizarse en solitario o además de la modificación del dominio Gla.
El derivado conserva las características estructurales necesarias para unirse al anticoagulante (o inhibidor de fXa) dirigido a fXa. Mediante la unión del derivado, directa o indirectamente, al inhibidor, el inhibidor es sustancialmente neutralizado. 35
En un aspecto, la invención proporciona (i) un derivado de fXa que es un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 12, (ii) un derivado de fXa que es un polipéptido bicatenario aislado que tiene un fragmento de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 14 y un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 15, o (ii) un polipéptido 40 bicatenario aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 13. El derivado tiene las siguientes propiedades: actividad procoagulante reducida o ninguna; un dominio Gla eliminado; y un sitio activo modificado. El derivado de la invención se une selectivamente a, e inhibe, un inhibidor del factor Xa administrado de forma exógena neutralizando sustancialmente de este modo la actividad anticoagulante de un inhibidor de fXa. Diversas modificaciones adicionales a la proteína del factor Xa contempladas por la invención se encuentran en toda 45 la descripción detallada.
Debe entenderse que los derivados contemplados por esta invención no son factor VIIa derivado de plasma, factor VIIa recombinante, plasma fresco congelado, concentrados del complejo de protrombina, o sangre completa.
50
Un aspecto de la presente invención son derivados del factor Xa y composiciones que los contienen para uso en el tratamiento de pacientes que han recibido o están recibiendo terapia de sobreanticoagulación con un inhibidor del factor Xa o pacientes a los que se había administrado previamente un inhibidor del factor Xa y que necesitan entonces hemostasia, tal como la requerida por cirugía opcional o de urgencia. En un aspecto, las proteínas de fXa modificadas se distinguen de fXa de origen natural en que tienen actividad procoagulante intrínseca reducida o 55 eliminada y no interferirán en la función fisiológica de fXa en la hemostasia, mientras siguen siendo capaces de unirse a y sustancialmente neutralizar inhibidores de fXa.
En otro aspecto, la proteína del factor Xa modificada se coadministra con un agente capaz de prolongar la semivida en plasma (o semivida en circulación) del derivado del factor Xa. En otro aspecto más, el antídoto está conjugado con un resto para prolongar su semivida en plasma.
También se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen el derivado del factor Xa que se une a (y/o sustancialmente neutraliza) el inhibidor del factor Xa pero no se ensambla en el complejo de protrombinasa. La 5 composición farmacéutica comprende opcionalmente un transportador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, esta divulgación proporciona un kit que comprende un inhibidor de fXa para uso anticoagulante y un antídoto para el inhibidor de fXa (o derivado del factor Xa) para uso cuando se necesita neutralización sustancial de la actividad anticoagulante del inhibidor de fXa. 10
Una realización de la invención se dirige a un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 12. Otra realización se refiere a un polipéptido bicatenario aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 13. Otra realización más se refiere a un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 15. 15
También se proporciona una composición farmacéutica que comprende un transportador y un polipéptido que se acaba de describir.
También se proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que se acaba de describir. 20
En el presente documento se proporciona, además, un conjugado peptídico que comprende un transportador enlazado covalente o no covalentemente a un polipéptido que se acaba de describir. El transportador puede ser un liposoma, una micela, un polímero farmacéuticamente aceptable, o un transportador farmacéuticamente aceptable.
25
Esta divulgación también se refiere a un anticuerpo que se une a un polipéptido que se acaba de describir. El anticuerpo es un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. También está proporcionado por la divulgación un fragmento biológicamente activo del anticuerpo. El anticuerpo puede estar etiquetado de forma detectable. El anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) también es proporcionado por la divulgación como parte de una composición que comprende además un transportador. 30
En una realización de la divulgación, se proporciona un complejo anticuerpo-péptido que comprende el anticuerpo de la invención y un polipéptido que se une específicamente al anticuerpo. El polipéptido es el polipéptido contra el que se genera el anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. 35
En otra realización, se proporciona un procedimiento para preparar un polipéptido de la invención que comprende expresar un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 16 en una célula huésped procariota o eucariota. La invención también proporciona un polipéptido bicatenario obtenible mediante el procedimiento. En una realización, la célula huésped es una célula eucariota y en particular es una célula de ovario 40 de hámster chino. En una realización, la cadena pesada (SEQ ID NO. 15) se expresa en una célula procariota, tal como E. coli. En otra realización, el polipéptido está aislado.
En otra realización más de la divulgación, se proporciona una célula huésped procariota o eucariota aislada que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención. En una realización, la célula huésped está 45 en una composición que comprende además un transportador.
En aún otra realización más, se proporciona una composición que comprende un derivado de fXa de la invención para uso en un procedimiento de prevención o reducción de hemorragia en un sujeto sometido a terapia anticoagulante con un inhibidor del factor Xa que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una 50 composición que comprende un polipéptido de la invención y un transportador. Se proporciona, además, una composición que comprende un derivado de fXa de la invención para uso en un procedimiento de unión selectivamente e inhibición de un inhibidor del factor Xa administrado de forma exógena en un sujeto sometido a terapia anticoagulante que comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva de una composición recién descrita. 55
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra esquemáticamente la estructura del dominio del factor X humano (SEQ ID NO. 1) mostrada en la tabla 1 tal como se describe en Leytus y col., Biochem., 1986, 25, 5098-5102. La SEQ ID NO. 1 es la secuencia de aminoácidos de fX humano codificada por la secuencia de nucleótidos de fX humano (SEQ ID NO. 2) tal como se muestra en la tabla 2 conocida en la técnica anterior. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos traducida se describe en Leytus y col., Biochem., 1986, 25, 5098-5102 y puede encontrarse en el GenBank, “NM_000504” en <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=89142731>. La numeración de aminoácidos en esta 5 secuencia se basa en la secuencia de fX. El precursor de fX humano (SEQ ID NO. 1) contiene una secuencia prepro-líder (aminoácidos 1 a 40 de la SEQ ID NO. 1) seguida por secuencias correspondientes a la cadena ligera de fX (LC) (aminoácidos 41 a 179 de la SEQ ID NO. 1), el triplete RKR (aminoácidos 180 a 182 de la SEQ ID NO. 1) que se elimina durante la secreción de fX, y la cadena pesada de fX (aminoácidos 183 a 488 de la SEQ ID NO. 1) que contiene el péptido de activación (AP) (aminoácidos 183 a 234 de la SEQ ID NO. 1) y el dominio catalítico 10 (aminoácidos 235 a 488 de la SEQ ID NO. 1).
La figura 2 (SEQ ID NO. 3) muestra la secuencia de aminoácidos de factor X humano maduro. La numeración de aminoácidos en esta figura se basa en la secuencia fX madura comenzando desde el extremo N de la cadena ligera de fX. El factor X circula en el plasma como una molécula bicaternaria enlazada por un puente disulfuro. La cadena 15 ligera (LC) tiene 139 residuos de aminoácidos (aminoácidos 41 a 179 de la SEQ ID NO. 1) y contiene el dominio rico en ácido γ-carboxiglutámico (Gla) (aminoácidos 1-45 de la SEQ ID NO. 3), incluyendo un corto apilamiento aromático (AS) (aminoácidos 40-45 de la SEQ ID NO. 3), seguido por dos dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF) (EGF1: aminoácidos 46-84, EGF2: aminoácidos 85-128 de la SEQ ID NO. 3). La cadena pesada (HC) tiene 306 aminoácidos y contiene un péptido de activación de 52 aminoácidos (AP: aminoácidos 143-194 de la 20 SEQ ID NO. 3) seguido por el dominio catalítico (aminoácidos 195-448 de la SEQ ID NO. 3). Los equivalentes de tríada catalítica a H57-D102-S195 en numeración de quimotripsina están ubicados en His236, Asp282 y Ser379 en la secuencia fX y están subrayados (aminoácidos 236, 282 y 379 de la SEQ ID NO. 3).
La figura 3 muestra esquemáticamente la estructura del dominio de factor X humano maduro mostrada en la figura 2. 25 La numeración de aminoácidos en esta figura se basa en la secuencia de fX maduro. Los sitios de escisión para digestión con quimotripsina para eliminar el fragmento que contiene el dominio Gla (aminoácidos 1-44 de la SEQ ID NO. 3) y activación de fX para eliminar el péptido de activación están resaltados. La digestión con quimotripsina de fXa da como resultado un fXa sin dominio Gla que carece de los residuos de aminoácidos 1-44 (SEQ ID NO. 4).
30
La figura 4 muestra el efecto de concentraciones variables de rfVIIa en presencia de factor tisular sobre la actividad anticoagulante de un inhibidor de fXa betrixaban (descrito a continuación) en un ensayo de generación de trombina (expresada como unidades de fluorescencia relativa (RFU) (tal como se describe en el ejemplo 2)). Los datos muestran que una combinación de rfVIIa y factor tisular fue incapaz de neutralizar completamente la actividad anticoagulante de un inhibidor de fXa, betrixaban, en concentraciones hasta 200 nM. 35
La figura 5 muestra que anhidro-fXa con su dominio Gla intacto invierte la inhibición de fXa por betrixaban en un sistema purificado que comprende fXa activo y betrixaban (círculo abierto), mientras que anhidro-fXa en solitario tiene actividad procoagulante despreciable (triángulo abierto) en comparación con fXa activo. La actividad cromógena de FXa se normalizó respecto a fXa activa en ausencia de cualquier inhibidor (cuadrado abierto). Esto se 40 describe más exhaustivamente en el ejemplo 2. Los datos muestran que anhidro-fXa es inactivo hacia sustrato fXa aunque conserva la afinidad de unión al inhibidor de fXa.
La figura 6 muestra que el anhidro-fXa con dominio Gla intacto en la figura 5 es un potente inhibidor en ensayo de generación de trombina en plasma (expresada como unidades de fluorescencia relativa (RFU)) (tal como se describe 45 en el ejemplo 2). Éste inhibía casi completamente la generación de trombina a aproximadamente 115 nM. Los datos muestran que anhidro-fXa sin modificación del dominio Gla no es adecuado para uso como un antídoto para el inhibidor de fXa.
La figura 7 muestra la comparación de la actividad de coagulación de fXa activo en un formato de placa de 96 50 pocillos antes de la digestión con quimotripsina, y después de 15 minutos y 30 minutos de digestión con quimotripsina. Tal como se muestra en esta figura, el tiempo de coagulación (cambio de DO405) se retrasó significativamente después de que el fXa fuera digerido por quimotripsina durante 15 minutos y no se observó coagulación durante hasta 20 minutos cuando el fXa se digirió durante 30 minutos. Este resultado se usó también para establecer condiciones para digestión con quimotripsina de anhidro-fXa dado que no tienen ninguna actividad 55 que pueda ser monitorizada durante la digestión. Esto se describe más exhaustivamente en el ejemplo 3.
La figura 8 muestra la afinidad de unión de des-Gla anhidro-fXa por un inhibidor del factor Xa betrixaban tal como se describe en el ejemplo 4. Los datos muestran que des-Gla anhidro-fXa, preparado mediante digestión quimotríptica de anhidro-fXa para eliminar el fragmento que contiene el dominio Gla (residuos 1-44), es capaz de unirse a betrixaban con afinidad similar a fXa nativo (fXa: Ki=0,12 nM, des-Gla anhidro-fXa: Kd=0,32 nM).
La figura 9 muestra la inversión de la actividad anticoagulante de concentraciones variables de betrixaban mediante la adición de un concentrado de 680 nM del antídoto (des-Gla anhidro-fXa) en un ensayo de generación de trombina 5 del ejemplo 2. A la concentración de 680 nM, des-Gla anhidro-fXa fue capaz de producir restauración sustancialmente completa de actividad de fXa.
La figura 10 muestra la inversión de la actividad anticoagulante de 250 nM de betrixaban mediante concentraciones variables del antídoto (des-Gla anhidro-fXa) en ensayos de prolongación de la coagulación usando reactivo de aPTT 10 en un formato de placa de 96 pocillos (tal como se describe en el ejemplo 3). Los datos muestran que el tiempo de coagulación era comparable al del plasma pobre en plaquetas de control cuando se usaron aproximadamente 608 nM del antídoto para neutralizar 250 nM del inhibidor de fXa betrixaban.
La figura 11 muestra el efecto sobre la actividad anticoagulante de enoxaparina (0,3125 - 1,25 U/ml) mediante 563 15 nM del antídoto (des-Gla anhidro-fXa) en ensayos de prolongación de la coagulación usando un reactivo de aPTT en un formato de placa de 96 pocillos, expresado como cambios en veces después de la normalización. El protocolo de ensayo se describe en el ejemplo 3. Los datos muestran que la adición de 563 nM del antídoto neutralizaba significativamente la actividad de una heparina de bajo peso molecular, enoxaparina.
20
La figura 12 muestra el efecto del antídoto, des-Gla anhidro-fXa, sobre la actividad de trombina (5 nM) y su inhibición por 50 nM de argatroban, un inhibidor de trombina específico, en un ensayo cromógeno. Como se esperaba, el antídoto del inhibidor de fXa no afecta de forma detectable a la actividad trombina o su inhibición por el inhibidor específico argatroban a concentraciones hasta 538 nM. Esto se describe más exhaustivamente en el ejemplo 14.
25
La figura 13 muestra el efecto sobre la actividad anticoagulante de betrixaban 400 nM mediante concentraciones variables del antídoto, des-Gla anhidro-fXa, en un ensayo aPTT usando un temporizador de coagulación estándar. El protocolo de ensayo se describe en el ejemplo 3. Los datos muestran que el antídoto del inhibidor de fXa sustancialmente invierte la inhibición de fXa por 400 nM de betrixaban. Se estimó que la CE50 del antídoto era de aproximadamente 656 nM con betrixaban 400 nM. 30
La figura 14 muestra el mapa de la construcción de ADN para la expresión del mutante triple de fXa (SEQ ID NO. 12) en células CHO. ADN plasmídico se linealizó y se transfectó en células CHO dhfr(-). Las células se seleccionaron usando medios deficientes en tetrahidrofolato (HT) más metotrexato (MTX). Se cribaron clones estables para expresión de proteínas elevada mediante ELISA. El mutante triple de fXa se produjo en medio libre de suero y se 35 purificó mediante combinación de columnas de intercambio iónico y afinidad. La numeración en el mapa se basaba en la secuencia de polinucleótidos que codifica fX humano, SEQ ID NO.1. Por ejemplo, una mutación de alanina en el sitio activo S419 (SEQ ID NO.1) es equivalente a la mutación en S379 (SEQ ID NO.3) de fX humano maduro descrita en toda la solicitud y más particularmente, en el ejemplo 7.
40
La figura 15 muestra una transferencia de Western de r-Antídoto purificado usando anticuerpos monoclonales que reconocen la cadena pesada y la cadena ligera de fX, respectivamente. Tras la reducción del puente disulfuro que conecta las cadenas ligera y pesada, la cadena pesada de r-antídoto migra a un peso molecular esperado similar al del fXa derivado de plasma. La deleción de 6-39 aa en el dominio Gla de fXa mutante da como resultado una banda de peso molecular más bajo de la cadena ligera de r-antídoto en comparación con FXa normal. 45
La figura 16 muestra el nivel en plasma de betrixaban en ratones (n=7-10 por grupo) después de administración oral de betrixaban en solitario (15 mg/kg), o betrixaban (15 mg/kg) seguido por inyección intravenosa (300 µg, IV) de antídoto derivado de plasma (pd-antídoto) preparado de acuerdo con el ejemplo 1. El pd-antídoto se administró 5 minutos antes del punto temporal de 1,5 h, y muestras de sangre de ratón (0,5 ml) se extrajeron a 1,5, 2,0 y 4,0 h 50 después de administración oral de betrixaban. Los niveles en plasma de INR en sangre completa, betrixaban y antídoto se analizaron. El nivel de betrixaban (Media±SEM) en plasma de ratón se representó gráficamente en función del tiempo para ratones después de 15 mg/kg (cuadrado abierto) y 15 mg/kg seguido por inyección del antídoto (círculo abierto). La correlación PK-PD del grupo tratado con antídoto en el punto temporal de 1,5 h (5 min después de la inyección del antídoto) se resumió en la tabla 13. Una única inyección del antídoto dio como resultado 55 una reducción >50% de betrixaban funcional basándose en mediciones de INR. Esto se describe más exhaustivamente en el ejemplo 8.
La figura 17 muestra los resultados de un experimento en ratón con r-antídoto purificado (n=4-10 por grupo). El nivel de betrixaban en plasma de ratón (figura 17A) e INR en sangre completa (figura 17B) se compararon después de administración oral de betrixaban en solitario (15 mg/kg) o betrixaban (15 mg/kg) seguido por inyección intravenosa (300 µg) de r-antídoto. Se indicaron valores medios para cada grupo tratado. Tal como se resume en la tabla 14, una única inyección IV del r-antídoto dio como resultado >50% de corrección de IRN en sangre completa ex vivo, justificando la neutralización eficaz de inhibidores de fXa por el antídoto mediante múltiples inyecciones u otros 5 regímenes. Estos resultados demuestran que las variantes de fXa de esta invención tienen potencial de actuar como antídotos universales para invertir el efecto anticoagulante de inhibidores de fXa en pacientes con hemorragia u otras urgencias médicas. Esto se describe más exhaustivamente en el ejemplo 8.
La figura 18 muestra la inversión con r-antídoto del efecto inhibidor de enoxaparina en un ensayo de coagulación por 10 cambio de turbidez de 96 pocillos. Los resultados son esencialmente similares a pd-antídoto (figura 11) lo que indica que ambos derivados de fXa tienen actividad de antídoto funcional comparable. r-antídoto 50 nM sustancialmente corregía (>75%) el efecto inhibidor de 1,25 U/ml de enoxaparina. El protocolo de ensayo se presenta en el ejemplo 11.
15
La figura 19 muestra la inversión con r-antídoto del efecto inhibidor de heparina de bajo peso molecular (LMWH) como se ensaya en un ensayo de coagulación en plasma humano. Ambas figuras 18 y 19 se describen en el ejemplo 11.
La figura 20 muestra la inversión con r-antídoto del efecto anticoagulación de rivaroxaban. Esto se describe más 20 exhaustivamente en el ejemplo 12.
La figura 21 muestra el alineamiento de la secuencia de polinucleótidos y la secuencia de polipéptidos traducida de r-antídoto.
25
La figura 22 muestra los resultados de un experimento en ratón con una única inyección IV (1 inyección) o dos inyecciones (2 inyecciones) del r-antídoto (n=5 por grupo, 312 µg/200 µl de r-antídoto). El nivel de betrixaban en plasma (figura 22A) se comparó después de la administración oral de betrixaban (15 mg/kg) seguida por inyección intravenosa de vehículo o r-antídoto (véase el ejemplo 8 para detalles). Tal como se muestra en la figura 22A, una única inyección IV de r-antídoto incrementaba el nivel de betrixaban en plasma en más de 8 veces en comparación 30 con control con vehículo (control_1), indicando la capacidad del antídoto para capturar eficazmente betrixaban in vivo. Una segunda inyección del antídoto incrementaba adicionalmente el nivel de betrixaban en menos de 2 veces en comparación con la única inyección, indicando cantidad limitante de betrixaban en sangre de ratón y posible inversión de su efecto anticoagulante por el antídoto. La figura 22B demuestra que la INR medida disminuye a medida que la relación de antídoto/betrixaban se incrementa en plasma de ratón después de inyecciones 35 individuales y dobles del antídoto.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
I.Definiciones 40
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de cultivo tisular, inmunología, biología molecular, microbiología, biología celular y ADN recombinante, que están dentro del alcance de la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edición; la serie Ausubel y col. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; la serie Methods in 45 Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson y col. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson y col. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5ª edición; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; patente de Estados Unidos N.º 4.683.195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) 50 Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, Londres); Herzenberg y col. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3ª edición 55 (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)).
Todas las designaciones numéricas, por ejemplo, pH, temperatura, tiempo, concentración y peso molecular, incluyendo intervalos, son aproximaciones que se modifican (+) o (-) en incrementos de 0,1. Debe entenderse, aunque no se afirme siempre explícitamente, que todas las designaciones numéricas vienen precedidas por el término “aproximadamente”. Debe entenderse también, aunque no siempre se afirme explícitamente, que los reactivos descritos en el presente documento son meramente ejemplares y que los equivalentes de estos se conocen en la técnica.
5
Tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, la forma singular “un”, “uno” y “el/la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión “un transportador farmacéuticamente aceptable” incluye una pluralidad de transportadores farmacéuticamente aceptables, incluyendo mezclas de los mismos.
10
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “que comprende” pretende significar que las composiciones y procedimientos incluyen los elementos citados, pero no excluyen otros. “Que consiste/n esencialmente en” cuando se usa para definir composiciones y procedimientos, significará que excluye otros elementos de cualquier importancia esencial para la combinación para el uso pretendido. Por lo tanto, una composición que consiste esencialmente en los elementos tal como se definen en el presente documento no excluiría contaminantes traza 15 procedentes del procedimiento de aislamiento and purificación y transportadores farmacéuticamente aceptables, tales como solución salina tamponada con fosfato, conservantes, y similares. “Que consiste/n en” significará que excluye más de un elemento traza de otros ingredientes y etapas del procedimiento sustanciales para administrar las composiciones de esta invención. Realizaciones definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de esta invención. 20
Un “sujeto” de diagnóstico o tratamiento es una célula o un mamífero, incluyendo un ser humano. Los sujetos animales no humanos para diagnóstico o tratamiento incluyen, por ejemplo, murinos, tales como ratas, ratones, caninos, tales como perros, lepóridos, tales como conejos, ganado, animales para la práctica deportiva, y mascotas.
25
El término “proteína” y “polipéptido” se usan de forma indistinta y en su sentido más amplio para referirse a un compuesto de dos o más subunidades de aminoácido, análogos de aminoácidos o peptidomiméticos. Las subunidades pueden estar enlazadas mediante enlaces peptídicos. En otra realización, la subunidad puede estar enlazada mediante otros enlaces, por ejemplo, éster, éter, etc. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos y no se establece ninguna limitación sobre el número máximo de aminoácidos que puede comprender 30 una secuencia de proteína o péptido. Tal como se usa en el presente documento, el término “aminoácido” se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, que incluyen glicina y los isómeros ópticos tanto D como L, análogos de aminoácidos y peptidomiméticos. Abreviaturas de una letra y de tres letras de los aminoácidos de origen natural se enumeran a continuación. Un péptido de tres o más aminoácidos se denomina habitualmente un oligopéptido si la cadena peptídica es corta. Si la cadena peptídica es larga, el péptido se denomina habitualmente 35 un polipéptido o una proteína.
- 1-letra
- 3-letras Aminoácido
- Y
- Tyr L-tirosina
- G
- Gly L-glicina
- F
- Phe L-fenilalanina
- M
- Met L-metionina
- A
- Ala L-alanina
- S
- Ser L-serina
- I
- Ile L-isoleucina
- L
- Leu L-leucina
- T
- Thr L-treonina
- V
- Val L-valina
- P
- Pro L-prolina
- K
- Lys L-lisina
- H
- His L-histidina
- Q
- Gln L-glutamina
- E
- Glu Ácido L-glutámico
- W
- Trp L-triptófano
- R
- Arg L-arginina
- D
- Asp Ácido L-aspártico
- N
- Asn L-asparagina
- C
- Cys L-cisteína
“Factor Xa” o “fXa” o “proteína fXa” se refiere a una serina proteasa en la ruta de coagulación sanguínea, que es producida a partir del factor X inactivo (fX). El factor Xa es activado por el factor IXa con su cofactor, el factor VIIIa, en un complejo conocido como Xasa intrínseca, o factor VIIa con su cofactor, el factor tisular, en un complejo conocido como Xasa extrínseca. fXa forma un complejo protrombinasa unido a la membrana con el factor Va y es el 5 componente activo en el complejo de protrombinasa que cataliza la conversión de protrombina en trombina. La trombina es la enzima que cataliza la conversión de fibrinógeno en fibrina, que, en última instancia, causa la formación del coágulo sanguíneo. Por lo tanto, la actividad biológica de fXa se denomina algunas veces “actividad procoagulante” en el presente documento.
10
La secuencia de nucleótidos que codifica el factor X humano (“fX”) puede encontrarse en el GenBank, “NM_000504” en <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=89142731>, y se enumera en la figura 1b y la SEQ ID NO. 2. La secuencia de aminoácidos y la estructura del dominio correspondientes de fX se describen en Leytus y col., Biochemistry, 1986, 25: 5098-5102. La estructura del dominio de fX maduro también se describe en Venkateswarlu, D. y col., Biophysical Journal, 2002, 82: 1190-1206. Tras la escisión catalítica de los primeros 52 15 residuos (aminoácidos 143 a 194 de la SEQ ID NO. 3) de la cadena pesada, fX es activado a fXa (SEQ ID NO. 6). FXa contiene una cadena ligera (SEQ ID NO. 8) y una cadena pesada (SEQ ID NO. 9). Los primeros 45 residuos de aminoácido (residuos 1-45 de la SEQ ID NO. 6) de la cadena ligera se denomina el dominio Gla porque contiene 11 residuos de ácido γ-carboxiglutámico modificados de forma posttraduccional (Gla). También contiene una corta secuencia de apilamiento aromático (6 residuos de aminoácido) (residuos 40-45 de la SEQ ID NO. 6). La digestión 20 con quimotripsina elimina selectivamente los 1-44 residuos dando como resultado fXa sin dominio Gla (SEQ ID NO. 4). El dominio catalítico de serina proteasa de fXa se ubica en la cadena pesada C-terminal. La cadena pesada de fXa es altamente homóloga con otras serina proteasas tales como trombina, tripsina, y proteína C activada.
La estructura del dominio de factor X maduro puede encontrarse en Venkateswarlu D. y col., Biophysical J., 2002, 25 82, 1190-1206. La numeración de aminoácidos en esta figura es la misma que en la figura 3. El tripéptido de Arg140-Lys141-Arg142 (el triplete RKR tal como se muestra en la figura 1) que conecta la cadena ligera con el péptido de activación no se muestra, dado que la forma que carece del tripéptido es predominante en el plasma sanguíneo en circulación. Dominios individuales se muestran en cuadros. Esto incluye los aminoácidos 1-45 en la figura 2 (SEQ ID NO. 3). Residuos catalíticos funcionalmente importantes están rodeados por un círculo, y “γ” representa el residuo 30 Gla (ácido γ-carboxiglutámico).
“fXa nativo" o “fXa de tipo silvestre” se refiere al fXa presente de forma natural en plasma o que está aislado en su forma original, sin modificar, que procesa la actividad biológica de activar protrombina promoviendo, por lo tanto, la formación del coágulo sanguíneo. La expresión incluye polipéptidos de origen natural aislados a partir de muestras 35 de tejido, así como fXa producido de forma recombinante. “fXa activo” se refiere a fXa que tiene la actividad biológica de activar protrombina. “fXa activo” puede ser fXa nativo o fXa modificado que conserva actividad procoagulante.
“Derivados de fXa” o “fXa modificado” o “derivados de una proteína de factor Xa” se refiere a proteínas de fXa que han sido modificadas de modo que se unan, directa o indirectamente, a un inhibidor del factor Xa y no se ensamblen 40 en el complejo de protrombinasa. Estructuralmente, los derivados se modifican para proporcionar ninguna actividad procoagulante o actividad procoagulante reducida. “Actividad procoagulante” se denomina en el presente documento como la capacidad de un agente para causar coagulación sanguínea o formación de coágulos. Actividad procoagulante reducida significa que la actividad procoagulante se ha reducido en al menos aproximadamente el 50%, o más de aproximadamente el 90%, o más de aproximadamente el 95% en comparación con fXa de tipo 45 silvestre. Por ejemplo, fX-S395A recombinante esencialmente no tiene ninguna actividad procoagulante, según lo medido mediante ensayos in vitro, tales como ensayos de actividad de fXa.
Los derivados de la divulgación tienen sitios activos modificados o dominios Gla modificados o ambos. Modificaciones adicionales también son contempladas por la divulgación. Se contempla que dichas modificaciones 50 pueden realizarse de una o más de las siguientes maneras: deleción de uno o más de los aminoácidos de la secuencia, sustitución de uno o más residuos de aminoácidos con uno o más residuos de aminoácidos diferentes, y/o manipulación de una o más cadenas laterales de aminoácido o sus extremos “C” o “N”.
La expresión “sitio activo” se refiere a la parte de una enzima o anticuerpo donde se produce una reacción química. 55 Un “sitio activo modificado” es un sitio activo que ha sido modificado estructuralmente para proporcionar al sitio activo reactividad o especificidad química incrementada o reducida. Ejemplos de sitios activos incluyen, aunque sin limitarse a, el dominio catalítico de factor X humano que comprende los 235-488 residuos de aminoácido (figura 1), y el dominio catalítico de factor Xa humano que comprende los 195-448 residuos de aminoácido (figuras 2 y 3). Ejemplos de sitio activo modificado incluyen, aunque sin limitarse a, el dominio catalítico de factor Xa humano que comprende 195-448 residuos de aminoácido en la SEQ ID NO. 10, 11, 12, 13 o 15 con al menos una sustitución de aminoácidos en la posición Arg306, Glu310, Arg347, Lys351, Lys414 o Arg424.
Tal como se ha indicado anteriormente, los derivados de la divulgación pueden tener dominios Gla modificados o 5 tienen todo el dominio Gla eliminado. Los ejemplos de derivados de fXa adecuados como antídotos en los procedimientos de esta divulgación son FXa sin dominio Gla (SEQ ID NO. 4 o 5), FXa deficiente en Gla (SEQ ID NO. 7 con modificaciones descritas en el presente documento), fXa con modificaciones en el sitio catalítico (SEQ ID NO. 10 o 11), y fXa con modificaciones en los sitios que se sabe que son importantes para la interacción fV/fVa o la interacción fVIII/fVIIIa (SEQ ID NO. 4, 5, 7, 10, o 11 con al menos una sustitución de aminoácidos en la posición 10 Arg306, Glu310, Arg347, Lys351, Lys414 o Arg424), tal como se describe en detalle en el presente documento. Ejemplos adicionales de los derivados de fXa contemplados por esta divulgación se proporcionan a continuación.
“FXa sin dominio Gla” o “des-Gla fXa” se refiere a fXa que no tiene un dominio Gla y abarca derivados de fXa que portan otras modificaciones además de la eliminación del dominio Gla. Los ejemplos de FXa sin dominio Gla en esta 15 invención incluyen, aunque sin limitarse a, derivado de fXa que carece de los 1-39 residuos de aminoácido de la SEQ ID NO. 3; derivado de fXa que carece de los 6-39 residuos de aminoácido de la SEQ ID NO. 3, correspondientes a un mutante de fXa expresado en células CHO descrito con más detalle a continuación (SEQ ID NO. 12, tabla 12); derivado de fXa que carece de los 1-44 residuos de aminoácido de la SEQ ID NO. 3, correspondientes a des-Gla fXa después de digestión quimotríptica de fXa humano (SEQ ID NO. 4, figura 3); y 20 derivado de fXa que carece de todos los residuos 1-45 del dominio Gla de la SEQ ID NO. 3 tal como se describe en Padmanabhan y col., Journal Mol. Biol., 1993, 232: 947-966 (SEQ ID NO 5). Otros ejemplos incluyen des-Gla anhidro fXa (SEQ ID NO. 10, tabla 10) y des-Gla fXa-S379A (SEQ ID NO. 11, tabla 11).
En algunas realizaciones de la divulgación, el des-Gla fXa comprende al menos los residuos de aminoácido 40 a 448 25 de la SEQ ID NO. 3 o un equivalente de la misma. En alguna realización de la divulgación, el des-Gla fXa comprende al menos los residuos de aminoácido 45 a 488 (SEQ ID NO. 4) o 46 a 488 (SEQ ID NO. 5) de la SEQ ID NO. 3 o equivalentes de la misma.
En alguna realización de la divulgación, el des-Gla fXa comprende al menos los residuos de aminoácido 40 a 139 y 30 195 a 448 de la SEQ ID NO. 3 o equivalentes de la misma. En alguna realización de la divulgación, el des-Gla fXa comprende al menos los residuos de aminoácido 45 a 139 y 195 a 448 de la SEQ ID NO. 3 o equivalentes de la misma. En otra realización de la divulgación, el des-Gla fXa comprende al menos residuos de aminoácido 46 a 139 y 195 a 448 de la SEQ ID NO. 3 o equivalentes de la misma.
35
“FXa deficiente en Gla” se refiere a fXa con número reducido de grupos γ-carboxilo de cadena lateral libre en su dominio Gla. Como FXa sin dominio Gla, FXa deficiente en Gla también puede portar otras modificaciones. FXa deficiente en Gla incluye fXa no carboxilado, subcarboxilado y descarboxilado. “fXa no carboxilado” o “fXa descarboxilado” se refiere a derivados de fXa que no tienen los grupos γ-carboxilo de los residuos de ácido γ-carboxiglutámico del dominio Gla, tal como fXa que tiene todos su ácido γ-carboxiglutámico del dominio Gla 40 sustituido por diferentes aminoácidos, o fXa que tiene todo su γ-carboxilo de cadena lateral eliminado o enmascarado por medios tales como aminación, esterificación, etc. Para proteína expresada de forma recombinante, fXa no carboxilado se denomina, algunas veces, fXa sin carboxilar. “fXa subcarboxilado” se refiere a derivados de fXa que tienen un número reducido de grupo γ-carboxilo en el dominio Gla en comparación con fXa de tipo silvestre, tal como fXa que tiene uno o más pero no todos de sus ácidos γ-carboxiglutámicos del dominio Gla sustituidos por 45 uno o más aminoácidos diferentes, o fXa que tiene al menos uno pero no todos de sus γ-carboxilos de cadena lateral eliminados o enmascarados mediante medios tales como aminación y esterificación, etc.
La estructura del dominio de factor Xa sin dominio Gla humano puede encontrarse en Padmanabhan y col., J. Mol. Biol., 1993, 232, 947-966. La numeración de los aminoácidos se basa en equivalencias topológicas con 50 quimotripsina, donde, por ejemplo, Ser195 corresponde a Ser379 en la figura 2 cuando se usa la numeración de fX maduro humano. Las inserciones se indican con letras, y las deleciones se indican mediante 2 numeraciones sucesivas. Se añade 300 a la numeración de cadena ligera para diferenciarla de la numeración de cadena pesada. β363 es β-hidroxi aspartato. Las barras diagonales indican escisiones proteolíticas observadas en material cristalino. La secuencia de FXa sin dominio Gla que carece del fX maduro basado en 1-45 residuos de aminoácido (SEQ ID 55 NO. 3) se enumera en la SEQ ID NO. 5.
En una realización de la divulgación, el derivado de fXa puede carecer de una cadena ligera de fXa pero aún contiene un dominio catalítico de serina proteasa presente en la cadena pesada. Además, pueden usarse quimeras con otro dominio catalítico de serina proteasa para realizar sustituciones en la cadena pesada.
“pd-antídoto” o “antídoto derivado de plasma” se refiere al derivado de des-Gla anhidro fXa y tiene los residuos de aminoácido de la SEQ ID NO. 10. 5
“r-antídoto” o “antídoto recombinante” se refiere a un derivado de fXa que carece de los 6-39 residuos de aminoácido de la SEQ ID NO. 3, correspondientes a un mutante de fXa expresado en células CHO descritas con más detalle a continuación (SEQ ID NO. 12, tabla 12).
10
“Agentes anticoagulantes” o “anticoagulantes” son agentes que inhiben la formación de coágulos sanguíneos. Los ejemplos de agentes anticoagulantes incluyen, aunque sin limitarse a, inhibidores específicos de trombina, factor IXa, factor Xa, factor XIa, factor XIIa o factor VIIa, heparina y derivados, antagonistas de vitamina K, y anticuerpos anti-factor tisular. Los ejemplos de inhibidores específicos de trombina incluyen hirudina, bivalirudina (Angiomax®), argatroban y lepirudina (Refludan®). Los ejemplos de heparina y derivados incluyen heparina no fraccionada (UFH), 15 heparina de bajo peso molecular (LMWH), tal como enoxaparina (Lovenox®), dalteparina (Fragmin®), y danaparoid (Orgaran®); y pentasacárido sintético, tales como fondaparinux (Arixtra®). Los ejemplos de antagonistas de vitamina K incluyen warfarina (Coumadin®), fenocumarol, acenocumarol (Sintrom®), clorindiona, dicumarol, difenadiona, biscoumacetato de etilo, fenprocoumon, fenindiona y tioclomarol. En una realización, el anticoagulante es un inhibidor del factor Xa. En una realización, el anticoagulante es betrixaban. 20
“Terapia anticoagulante” se refiere a un régimen terapéutico que se administra a un paciente para prevenir coágulos sanguíneos o trombosis no deseados. Una terapia anticoagulante comprende administrar uno o una combinación de dos o más agentes anticoagulantes u otros agentes a una dosificación y calendario adecuados para tratar o prevenir los coágulos sanguíneos o trombosis no deseados en el paciente. 25
La expresión “inhibidores del factor Xa” o “inhibidores de factor Xa” se refieren a compuestos que pueden inhibir, directa o indirectamente, la actividad del factor de coagulación Xa de catalizar la conversión de protrombina en trombina in vitro y/o in vivo. Los ejemplos de inhibidores de fXa conocidos incluyen, sin limitación, fondaparinux, idraparinux, idraparinux biotinilado, enoxaparina, fragmina, NAP-5, rNAPc2, inhibidor de la ruta del factor tisular, DX-30 9065a (tal como se describe en, por ejemplo, Herbert, J.M., y col., J Pharmacol Exp Ther. 1996 276(3): 1030-8), YM-60828 (tal como se describe en, por ejemplo, Taniuchi, Y., y col., Thromb Haemost. 1998 79(3): 543-8), YM-150 (tal como se describe en, por ejemplo, Eriksson, B.I. et. al, Blood 2005; 106(11), Resumen 1865), apixaban, rivaroxaban, PD-348292 (tal como se describe en, por ejemplo, Pipeline Insight: Antithrombotics - Reaching the Untreated Prophylaxis Market, 2007), otamixaban, razaxaban (DPC906), BAY 59-7939 (tal como se describe en, por ejemplo, 35 Turpie, A.G., y col., J. Thromb. Haemost. 2005, 3(11): 2479-86), DU-176b (tal como se describe en, por ejemplo, Hylek EM, Curr Opin Invest Drugs 2007 8(9): 778-783), LY517717 (tal como se describe en, por ejemplo, Agnelli, G., y col., J. Thromb. Haemost. 2007 5(4): 746-53), GSK913893, betrixaban (tal como se describe a continuación) y derivados de los mismos. La heparina de bajo peso molecular (“LMWH”) también se considera un inhibidor del factor Xa. 40
En una realización, el inhibidor del factor Xa se selecciona de entre betrixaban, rivaroxaban, LMWH, y combinaciones de los mismos.
El término “betrixaban” se refiere al compuesto “[2-({4-[(dimetilamino)iminometil]fenil}carbonilamino)-5-metoxifenil]-N-45 (5-cloro(2-piridil))carboxamida” o sales farmacéuticamente aceptables del mismo. “[2-({4-[(dimetilamino)iminometil]fenil}carbonilamino)-5-metoxifenil]-N-(5-cloro(2-piridil))carboxamida” se refiere al compuesto que tiene la siguiente estructura:
50
o un tautómero o sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
El betrixaban se describe en las patentes de Estados Unidos N.º 6.376.515 y 6.835.739 y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.º 2007/0112039, presentada el 7 de noviembre de 2006. Se sabe que el betrixaban es un inhibidor específico del factor Xa. 5
Tal como se usa en el presente documento, el término “antídoto” o la expresión “antídoto para un inhibidor del factor Xa” se refiere a moléculas, tales como derivados de fXa, que pueden neutralizar o invertir sustancialmente la actividad inhibidora de la coagulación de un inhibidor de fXa compitiendo con fXa activo para unirse con inhibidores de fXa disponibles. Los ejemplos de los antídotos de esta divulgación son derivados de fXa con unión a la 10 membrana fosfolipídica reducida, tal como des-Gla fXa o FXa deficiente en Gla, y derivados de fXa con actividad catalítica reducida, tal como derivados de fXa con el sitio activo modificado, y derivados con interacción reducida con fV/Va, o fVIII/fVIIIa. Los ejemplos de antídotos de la divulgación con unión a membrana reducida y actividad catalítica reducida incluyen, aunque sin limitarse a, des-Gla anhidro-fXa mediante digestión quimotríptica de anhidro-fXa (tal como se describe en el ejemplo 1); des-Gla fXa-S379A (S 195A en numeración de quimotripsina) mediante 15 mutagénesis (tal como se describe en el ejemplo 6).
Otros ejemplos de antídotos de la divulgación incluyen proteínas o polipéptidos que contienen dominios catalíticos de serina proteasa que poseen suficiente similitud estructural con el dominio catalítico de fXa y son, por lo tanto, capaces de unirse a inhibidores de fXa molécula pequeña. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitarse a, trombina 20 que se une al inhibidor de fXa GSK913893 (Young R., y col., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007, 17(10): 2927-2930); calicreína plasmática que se une al inhibidor de fXa apixaban (Luettgen J., y col., Blood, 2006, 108(11) resumen 4130); y tripsina (o su homólogo bacteriano subtilisina) que se une al inhibidor de fXa C921-78 con afinidad subnanomolar (Kd = 500 pM) (Betz A, y col., Biochem., 1999, 38(44): 14582-14591).
25
El derivado de la invención se une, directa o indirectamente a un inhibidor del factor Xa. Los términos “unión”, “se une” “reconocimiento” o “reconocer”, tal como se usan en el presente documento, pretenden incluir interacciones entre moléculas que pueden detectarse usando, por ejemplo, un ensayo de hibridación. Los términos también pretenden incluir interacciones “de unión” entre moléculas. Las interacciones pueden ser, por ejemplo, proteína-proteína, proteína-ácido nucleico, proteína-molécula pequeña o molécula pequeña-ácido nucleico en la naturaleza. 30 La unión puede ser “directa” o “indirecta”. Unión “directa” comprende contacto físico directo entre moléculas. Unión “indirecta” entre molécula comprende las moléculas que tienen contacto físico directo con una o más moléculas intermedias simultáneamente. Por ejemplo, se contempla que derivados de la invención se unen indirectamente y neutralizan sustancialmente heparina de bajo peso molecular y otros inhibidores de factor Xa indirectos. Esta unión puede dar como resultado la formación de un “complejo” que comprende las moléculas de interacción. Un “complejo” 35 se refiere a la unión de dos o más moléculas mantenidas juntas mediante enlaces, interacciones o fuerzas covalentes o no covalentes.
“Neutralizar” “invertir” o “contrarrestar” la actividad de un inhibidor de fXa o frases similares se refieren a inhibir o bloquear la función inhibidora del factor Xa o anticoagulante de un inhibidor de fXa. Dichas frases se refieren a 40 inhibición o bloqueo parcial de la función, así como a inhibir o bloquear la mayoría o todo de la actividad inhibidora de fXa, in vitro y/o in vivo.
En ciertas realizaciones, el inhibidor del factor Xa es neutralizado sustancialmente, lo que significa que su capacidad de inhibir el factor Xa, directa o indirectamente, se reduce en al menos aproximadamente el 5%, 10%, 15%, 20%, 45 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100%.
La expresión “unión a la membrana fosfolipídica” se refiere a la capacidad un fXa activo de unirse a la membrana fosfolipídica cargada negativamente u otra membrana celular, tal como plaquetas, en presencia de iones Ca2+. Esta unión está medida por los residuos de ácido γ-carboxiglutámico en el dominio Gla de fXa. 50
La expresión “interacción reducida” se refiere a la capacidad disminuida del derivado de fXa de unirse o formar un complejo con iones u otros cofactores que normalmente se unen a o complejan con fXa silvestre. Los ejemplos de dicha interacción incluyen, aunque sin limitarse a, unión de fXa con iones de Ca2+ y membrana fosfolipídica, interacción con fV/fVa, o fVIII/f/VIIIa, etc. Se prefiere que la interacción de un derivado de fXa con los iones u otros 55 cofactores se reduzca al 50% de la de un fXa silvestre. Más preferentemente, la interacción se reduce al 10%, 1%, y 0,1% de la de un fXa de tipo silvestre. Esto se refiere a la capacidad de los derivados de “ensamblarse en el complejo de protrombinasa”.
“Actividad de unión al inhibidor de fXa” se refiere a la capacidad de una molécula de unirse a un inhibidor de fXa. Un antídoto de la presente invención posee actividad de unión al inhibidor de fXa, ya sea directa o indirectamente.
La expresión “semivida en circulación” o “semivida en plasma” se refiere al tiempo requerido para que la concentración plasmática de un antídoto que circula en el plasma se reduzca a la mitad de su concentración inicial 5 después de una única administración.
La expresión “resto conjugado” se refiere a un resto que puede añadirse a un derivado de fXa formando un enlace covalente con un residuo del derivado de fXa. El resto puede unirse directamente a un residuo del derivado de fXa o puede formar un enlace covalente con un enlazador que, a su vez, forma un enlace covalente con un residuo del 10 derivado de fXa.
Tal como se usa en el presente documento, un “anticuerpo” incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión al antígeno o una cadena sencilla del mismo. Por lo tanto, el término “anticuerpo” incluye cualquier molécula que contiene proteína o péptido que comprende al menos una parte de una molécula de inmunoglobulina. Los 15 ejemplos de estos incluyen, aunque sin limitarse a una región determinante de la complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una parte de unión a ligando del mismo, una región variable de cadena pesada o cadena ligera, una región constante de cadena pesada o cadena ligera, una región marco (FR), o cualquier parte de las mismas, o al menos una parte de una proteína de unión.
20
Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales y pueden estar aislados de cualquier fuente biológica adecuada, por ejemplo, murina, de rata, oveja y canina.
Una “composición” pretende significar una combinación de agente activo y otro compuesto o composición, inerte (por ejemplo, un agente o etiqueta detectable) o activo, tal como un adyuvante. 25
Una “composición farmacéutica” pretende incluir la combinación de un agente activo con un transportador, inerte o activo, que hace a la composición adecuada para uso de diagnóstico o terapéutico in vitro, in vivo o ex vivo.
“Una cantidad efectiva” se refiere a la cantidad de derivado suficiente para inducir un resultado biológico y/o 30 terapéutico deseado. Ese resultado puede ser alivio de los signos, síntomas, o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. En la presente invención, el resultado implicará normalmente uno o más de los siguientes: neutralización de un inhibidor de fXa que ha sido administrado a un paciente, inversión de la actividad anticoagulante del inhibidor de fXa, eliminación del inhibidor de fXa del plasma, restauración de la hemostasia, y reducción o cese de hemorragia. La cantidad efectiva variará dependiendo del 35 agente antídoto específico usado, el inhibidor de fXa específico que ha sido administrado al sujeto, el régimen de dosificación del inhibidor de fXa, la temporización de administración del antídoto, el estado del sujeto y la enfermedad que están siendo tratados, el peso y la edad del sujeto, la gravedad de la patología, la vía de administración y similares, todos los cuales pueden ser determinados fácilmente por un experto en la materia.
40
Tal como se usan en el presente documento, los términos “tratar” “tratamiento” y similares se usan en el presente documento para significar obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente un trastorno o signo o síntoma del mismo, y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para un trastorno y/o efecto adverso atribuible al trastorno.
45
“Tratar” también cubre cualquier tratamiento de un trastorno en un mamífero, e incluye: (a) prevenir que se produzca un trastorno en un sujeto que puede estar predispuesto a un trastorno, pero al que aún puede no habérsele diagnosticado que lo tiene, por ejemplo, prevenir la hemorragia en un paciente con sobredosis de anticoagulante; (b) inhibir un trastorno, es decir, detener su desarrollo, por ejemplo, inhibir la hemorragia; o (c) aliviar o mejorar el trastorno, por ejemplo, reducir la hemorragia. 50
Tal como se usa en el presente documento, “tratar” incluye además mejora sistémica de los síntomas asociados con la patología y/o un retardo de la aparición de los síntomas. Las evidencias clínicas y subclínicas de “tratamiento” variarán con la patología, el individuo y el tratamiento.
55
La “administración” puede efectuarse en una dosis, de forma continua o de forma intermitente durante todo el tratamiento. Procedimientos de determinación de los medios y dosificación de administración más eficaces son conocidos por los expertos en la materia y variarán con la composición usada para terapia, el propósito de la terapia, la célula diana que está siendo tratada, y el sujeto que está siendo tratado. Administraciones individuales o múltiples pueden llevarse a cabo con el nivel de dosis y el patrón que es seleccionado por el facultativo encargado del tratamiento. En la técnica se conocen formulaciones de dosificación y procedimientos de administración de los agentes.
Los agentes y composiciones de la presente invención pueden usarse en la fabricación de medicamentos y para el 5 tratamiento de seres humanos y otros animales mediante administración de acuerdo con procedimientos convencionales, tal como un ingrediente activo en composiciones farmacéuticas.
Un agente de la presente invención puede administrarse para terapia mediante cualquier vía adecuada, específicamente mediante administración parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e 10 intradérmica). También se apreciará que la vía preferida variará con el estado y la edad del receptor, y la enfermedad que está siendo tratada.
Se puede determinar si se consigue el procedimiento, es decir, la inhibición o inversión de un inhibidor del factor Xa, mediante un número de ensayos in vitro, tales como ensayo de generación de trombina, y ensayos de coagulación 15 clínica tales como aPTT, PT y ACT.
El término “aislado/a”, tal como se usa en el presente documento, con respecto a ácidos nucleicos, tales como ADN o ARN, se refiere a moléculas separadas de otros ADN o ARN, respectivamente que están presentes en la fuente natural de la macromolécula. La expresión “ácido nucleico aislado” pretende incluir fragmentos de ácido nucleico que 20 no son de origen natural como fragmentos y no se encontrarían en el estado natural. El término “aislado/a” también se usa en el presente documento para referirse a polipéptidos y proteínas que están aisladas de otras proteínas celulares y pretende abarcar polipéptidos tanto purificados como recombinantes. En otras realizaciones, el término “asilado/a” significa separado de constituyentes, celulares y otros, en los que la célula, tejido, polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o un fragmento o fragmentos de los mismos, que están normalmente asociados en 25 la naturaleza. Por ejemplo, una célula aislada es una célula que está separada de tejido o células de fenotipo o genotipo distinto. Tal como es evidente para los expertos en la materia, un polinucleótido, péptido, polipéptido, proteína, anticuerpo o fragmento o fragmentos de los mismos no de origen natural, no requiere “aislamiento” para distinguirlo de su contrapartida de origen natural.
30
Tal como se usa en el presente documento, la expresión “equivalente del mismo/de la misma” cuando se refiere a una proteína, polipéptido o ácido nucleico de referencia, pretende incluir aquellos que tienen homología mínima mientras siguen manteniendo la funcionalidad deseada. Está contemplado por la divulgación que cualquier proteína modificada mencionada en el presente documento también incluya equivalentes de la misma. Por ejemplo, la homología puede ser, al menos el 75% de homología y como alternativa, al menos el 80%, o como alternativa al 35 menos el 85%, o como alternativa al menos el 90%, o como alternativa al menos el 95%, o como alternativa el 98% de porcentaje de homología y muestran actividad biológica sustancialmente equivalente al polipéptido o proteína de referencia. Que un polinucleótido o región de polinucleótido (o un polipéptido o región de polipéptido) tiene cierto porcentaje (por ejemplo, 80%, 85%, 90% o 95%) de “identidad de secuencia” con otra secuencia significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de bases (o aminoácidos) son los mismos al comparar las dos secuencias. Debe 40 observarse que, cuando solamente se usa la cadena pesada de fXa (o una serina proteasa relacionada), la homología global podría ser inferior al 75%, tal como, por ejemplo, 65% o 50% sin embargo, la funcionalidad deseada permanece. Este alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia pueden determinarse usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo los descritos en CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel y col., eds., 1987) Suplemento 30, sección 7.7.18, Tabla 7.7.1. 45 Preferentemente, se usan parámetros por defecto para el alineamiento. Un programa de alineamiento preferido es BLAST, usando parámetros por defecto. En particular, programas preferidos son BLASTN y BLASTP, usando los siguientes parámetros por defecto: Código genético = estándar; filtro = ninguno; cadena = ambas; límite = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificadas por = PUNTUACIÓN ELEVADA; Bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + 50 SPupdate + PIR. Detalles de estos programas pueden encontrarse en la siguiente dirección de Internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
Los términos “polinucléotido” y “oligonucleótido” se usan indistintamente y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos. Los 55 polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen (por ejemplo, una sonda, cebador, marca EST o SAGE), exones, intrones, ARN mensajero (mARN), ARN transferente, ARN ribosómico, ribozimas, cADN, plinucleótidos recombinantes, plinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas y cebadores de ácido nucleico. Un plinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si están presentes, modificaciones a la estructura de nucleótidos pueden impartirse antes o después del ensamblaje del plinucleótido. La secuencia de nucleótidos puede interrumpirse por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación 5 con un componente de etiquetado. El término también se refiere a moléculas tanto bi- como monocatenarias. A menos que se especifique o requiera lo contrario, cualquier realización de esta invención que es un polinucleótido abarca tanto la forma bicatenaria como cada una de dos formas monocatenarias complementarias que se sabe o se ha predicho que componen la forma bicatenaria.
10
Un polinucleótido está compuesto por una secuencia específica de cuatro bases de nucleótido: adenina (A); citosina (C); guanina (G); timina (T); y uracilo (U) para timina cuando el polinucleótido es ARN. Por lo tanto, la expresión “secuencia de polinucleótido” es la representación alfabética de una molécula de polinucleótido. Esta representación alfabética puede introducirse en bases de datos en un ordenador que tiene una unidad central de procesamiento y usarse para aplicaciones bioinformáticas tales como genómica funcional y búsqueda de homología. 15
“Homología” o “identidad” o “similitud” se refiere a similitud de secuencia entre dos péptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. La homología puede determinarse comparando una posición en cada secuencia que pueden ser alineadas para fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base o aminoácido, entonces las moléculas son homólogas en esa posición. Un grado de homología entre 20 secuencias está en función del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las secuencias. Una secuencia “no relacionada” o “no homóloga” comparte menos del 40% de identidad, o como alternativa menos del 25% de identidad, con una de las de la presente invención.
Que un polinucleótido o región de polinucleótido (o un polipéptido o región de polipéptido) tiene cierto porcentaje (por 25 ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%) de “identidad de secuencia” con otra secuencia significa que, cuando están alineadas, ese porcentaje de bases (o aminoácidos) son los mismos al comparar las dos secuencias. Este alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia pueden determinarse usando programas software conocidos en la técnica, por ejemplo los descritos en Ausubel y col. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology. Preferentemente, se usan parámetros por defecto pata el alineamiento. Un programa 30 de alineamiento es BLAST, usando parámetros por defecto. En particular, son programas BLASTN y BLASTP, usando los siguientes parámetros por defecto: Código genético = estándar; filtro = ninguno; cadena = ambas; límite = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; clasificadas por = PUNTUACIÓN ELEVADA; Bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR. Detalles de estos programas pueden encontrarse en la siguiente dirección de 35 Internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi, último acceso el 26 de noviembre de 2007. Polinucleótidos biológicamente equivalentes son aquellos que tienen el porcentaje de homología especificado y que codifican un polipéptido que tiene la misma o similar actividad biológica.
La expresión “un homólogo de un ácido nucleico” se refiere a un ácido nucleico que tiene una secuencia de 40 nucleótidos que tiene cierto grado de homología con la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico o complemento del mismo. Un homólogo de un ácido nucleico bicatenario pretende incluir ácidos nucleicos que tienen una secuencia de nucleótidos que tiene cierto grado de homología con él o con el complemento del mismo. En un aspecto de la divulgación, homólogos de ácidos nucleicos son capaces de hibridar con el ácido nucleico o complemento del mismo. 45
Un “gen” se refiere a un polinucleótido que contiene al menos un marco abierto de lectura (ORF) que es capaz de codificar un polipéptido o proteína particular después de haber sido transcrito y traducido. Cualquiera de las secuencias de polinucleótidos o polipéptidos descritas en el presente documento puede usarse para identificar fragmentos más grandes o secuencias codificantes de longitud completa del gen con el que están asociados. 50 Procedimientos de aislamiento de secuencias de fragmentos más grandes son conocidos por los expertos en la materia.
El término “expresar” se refiere a la producción de un producto génico.
55
Tal como se usa en el presente documento, “expresión” se refiere al proceso mediante cual polinucleótidos se transcriben a mARN y/o el proceso mediante el cual el mARN transcrito está siendo posteriormente traducido en péptidos, polipéptidos, o proteínas. Si el polinucleótido se deriva de ADN genómico, la expresión puede incluir splicing del mARN en una célula eucariota.
El término “codificar”, tal como se aplica a polinucleótidos, se refiere a un polinucleótido que se dice que “codifica” un polipéptido si, en su estado nativo o cuando se manipula mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia, puede transcribirse y/o traducirse para producir el mARN para el polipéptido y/o un fragmento del mismo. La cadena antisentido es el complemento de dicho ácido nucleico, y la secuencia codificante puede 5 deducirse a partir de ella.
Un “conjugado peptídico” se refiere a la asociación mediante unión por enlace covalente o no covalente de uno o más polipéptidos y otro compuesto químico o biológico. En un ejemplo no limitante, la “conjugación” de un polipéptido con un compuesto químico da como resultado estabilidad o eficacia mejoradas del polipéptido para su 10 propósito pretendido. En una realización, un péptido está conjugado a un transportador, donde el transportador es un liposoma, una micela, o un polímero farmacéuticamente aceptable.
Los “liposomas” son vesículas microscópicas que consisten en bicapas lipídicas concéntricas. Estructuralmente, los liposomas varían en tamaño y forma desde largos tubos a esferas, con dimensiones desde unos pocos cientos de 15 Angstroms a fracciones de un milímetro. Los lípidos formadores de vesículas se seleccionan para conseguir un grado especificado de fluidez o rigidez del complejo final que proporciona la composición lipídica de la capa externa. Estos son neutros (colesterol) o bipolares e incluyen fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI), y esfingomielina (SM) y otros tipos de lípidos bipolares, incluyendo aunque sin limitarse a dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), con una longitud de cadena de hidrocarburo en el 20 intervalo de 14 a 22, y saturados o con uno o más enlaces dobles C = C. Los ejemplos de lípidos capaces de producir un liposoma estable, en solitario, o en combinación con otros componentes lipídicos son fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), lecitina, fosfatidiletanolamina, lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, cefalina, cardiolipina, ácido fosfatídico, cerebrósidos, distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina 25 (DPPC), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE) y dioleoilfosfatidiletanolamina 4-(N-maleimido-metil)ciclohexano-1 carboxilato (DOPE-mal). Lípidos que no contienen fósforo adicionales que pueden ser incorporados en liposomas incluyen estearilamina, dodecilamina, hexadecilamina, miristato de isopropilo, lauril sulfato de trietanolamina, sulfato de alquilo-arilo, palmitato de acetilo, ricinoleato de glicerol, estearato de hexadecilo, polímeros acrílicos anfóteros, amidas de ácidos grasos 30 polietoxilados, y los lípidos catiónicos mencionados anteriormente (DDAB, DODAC, DMRIE, DMTAP, DOGS, DOTAP (DOTMA), DOSPA, DPTAP, DSTAP, DC-Chol). Los lípidos cargados negativamente incluyen ácido fosfatídico (PA), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidilglicerol y (DOPG), dicetilfosfato que son capaces de formar vesículas. Normalmente, los liposomas pueden dividirse en tres categorías basadas en su tamaño global y la naturaleza de la estructura laminar. Las tres clasificaciones, según lo desarrollado por la New York Academy 35 Sciences Meeting, “Liposomes and Their Use in Biology and Medicine”, diciembre de 1977, son vesículas multilaminares (MLV), pequeñas vesículas unilaminares (SUV) y granes vesículas unilaminares (LUV).
Una “micela” es un agregado de moléculas de tensioactivo dispersadas en un coloide líquido. Una micela típica en solución acuosa forma un agregado con las regiones de “cabeza” hidrófilas en contacto con disolvente circundante, 40 secuestrando las regiones de cola hidrófobas en el centro de la micela. Este tipo de micela es conocido como una micela en fase normal (micela de aceite en agua). Las micelas inversas tienen los grupos de cabeza en el centro de las colas con las colas extendiéndose fuera (micela de agua en aceite). Las micelas pueden usarse para unir un polinucleótido, polipéptido, anticuerpo o composición descrita en el presente documento para facilitar el suministro eficiente de la célula o tejido diana. 45
La frase “polímero farmacéuticamente aceptable” se refiere al grupo de compuestos que pueden conjugarse con uno o más polipéptidos descritos en el presente documento. Se contempla que la conjugación de un polímero con el polipéptido es capaz de prolongar la semivida del polipéptido in vivo e in vitro. Los ejemplos no limitantes incluyen polietilenglicoles, polivinilpirrolidonas, alcoholes polivinílicos, derivados de celulosa, poliacrilatos, polimetacrilatos, 50 azúcares, polioles y mezclas de los mismos.
Un “vehículo de suministro de genes” se define como cualquier molécula que puede transportar polinucleótidos insertados a una célula huésped. Los ejemplos de vehículos de suministro de genes son liposomas, micelas polímeros biocompatibles, incluyendo polímeros naturales y polímeros sintéticos; lipoproteínas; polipéptidos; 55 polisacáridos; lipopolisacáridos; envueltas virales artificiales; partículas de metal; y bacterias, o virus, tales como baculovirus, adenovirus y retrovirus, bacteriófago, cósmido, plásmido, vectores fúngicos y otros vehículos recombinantes usados normalmente en la técnica que se han descrito para expresión en diversos huéspedes eucariotas y procariotas, y pueden usarse para terapia génica así como para simple expresión de proteínas.
Un polinucleótido de esta invención puede suministrarse a una célula o tejido usando un vehículo de suministro de genes. “Suministro de genes”, “transferencia de genes”, “transducción”, y similares tal como se usan en el presente documento, son expresiones que se refieren a la introducción de un polinucleótido exógeno (algunas veces denominado como “transgén”) en una célula huésped, independientemente del procedimiento usado para la 5 introducción. Dichos procedimientos incluyen diversas técnicas bien conocidas tales como transferencia de genes mediada por vectores (mediante, por ejemplo, infección vírica/transfección, o diversos otros complejos de suministro de genes basados en proteínas o basados en lípidos) así como técnicas que facilitan el suministro de polinucleótidos “desnudos” (tales como electroporación, suministro con “pistola génica” y diversas otras técnicas usadas para la introducción de polinucleótidos). El polinucleótido introducido puede mantenerse de forma estable o transitoria en la 10 célula huésped. El mantenimiento estable normalmente requiere que el polinucleótido introducido contenga un origen de replicación compatible con la célula huésped o se integre en un replicón de la célula huésped, tal como un replicón extracromosómico (por ejemplo, un plásmido) o un cromosoma nuclear o mitocondrial. Se conocen una serie de vectores que son capaces de mediar la transferencia de genes a células de mamífero, tal como se conoce en la técnica y se describe en el presente documento. 15
Un “vector viral” se define como un virus o partícula viral producida de forma recombinante que comprende un polinucleótido a suministrar a una célula huésped, in vivo, ex vivo o in vitro. Los ejemplos de vectores virales incluyen vectores retrovirales, vectores de adenovirus, vectores de virus adenoasociados, vectores de alfavirus y similares. Los vectores de alfavirus, tales como vectores basados en el virus Semliki Forest y vectores basados en el 20 virus Sindbis, también se han desarrollados para uso en terapia génica e inmunoterapia. Véase, Schlesinger y Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5: 434-439 y Ying, y col. (1999) Nat. Med. 5(7): 823-827. En aspectos donde la transferencia de genes está mediada por un vector retroviral, una construcción de vector se refiere al polinucleótido que comprende el genoma retroviral o parte del mismo, y un gen terapéutico. Tal como se usa en el presente documento, “transferencia de genes mediada retroviral” o “transducción retroviral” lleva el mismo 25 significado y se refiere al proceso mediante el cual un gen o secuencias de ácido nucleico son transferidas de forma estable en la célula huésped en virtud del virus que entra en la célula y que integra su genoma en el genoma de la célula huésped. El virus puede entrar en la célula huésped mediante su mecanismo de infección normal o modificarse de modo que se una a un receptor o ligando de la superficie de la célula huésped diferente para entrar en la célula. Tal como se usa en el presente documento, vector retroviral se refiere a una partícula viral capaz de 30 introducir ácido nucleico exógeno en una célula a través de un mecanismo de entrada viral o de tipo viral.
Los retrovirus portan sui información genética en forma de ARN; sin embargo, una vez que el virus infecta una célula, el ARN es transcrito de forma inversa en forma de ADN que se integra en el ADN genómico de la célula infectada. La forma de ADN integrado se denomina provirus. 35
En aspectos donde la transferencia de genes es mediada por un vector viral de ADN, tal como un adenovirus (Ad) o virus adenoasociado (AAV), una construcción de vector se refiere al polinucleótido que comprende el genoma viral o parte del mismo, y un transgén. Los adenovirus (Ad) son un grupo de virus homogéneo, relativamente bien caracterizado, que incluye más de 50 serotipos. Véase, por ejemplo, la solicitud PCT internacional N.º WO 95/27071. 40 Los Ad no requieren integración en el genoma de la célula huésped. Vectores derivados de Ad recombinante, particularmente aquellos que reducen el potencial de recombinación y generación de virus de tipo silvestre, también han sido construidos. Véase, las solicitudes PCT internacional N.º WO 95/00655 y WO 95/11984. El AAV de tipo silvestre tiene alta infectividad y especificidad integrándose en el genoma de la célula huésped. Véase, Hermonat and Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 81: 6466-6470 y Lebkowski y col. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 45 3988-3996.
Los vectores que contienen tanto un promotor como un sitio de clonación en el que un polinucleótido puede enlazarse de forma operativa se conocen bien en la técnica. Dichos vectores son capaces de transcribir ARN in vitro o in vivo, y están disponibles en el mercado de fuentes tales como Stratagene (La Jolla, CA) y Promega Biotech 50 (Madison, WI). Para optimizar la expresión y/o la transcripción in vitro, puede ser necesario eliminar, añadir o alterar partes no traducidas 5' y/o 3' de los clones para eliminar codones de iniciación extra, de potencial traducción alternativa inapropiada u otras secuencias que pueden interferir en o reducir la expresión, a nivel de la transcripción o la traducción. Como alternativa, sitios de unión al ribosoma consenso pueden insertarse inmediatamente 5' del codón de inicio para mejorar la expresión. 55
Los vehículos de suministro de genes también incluyen complejos de ADN/liposoma, micelas y complejos proteína-ADN dirigidos. Los liposomas que también comprenden un anticuerpo de dirección o fragmento del mismo pueden usarse en los procedimientos de esta invención. Para mejorar el suministro a una célula, el ácido nucleico o las proteínas de esta invención pueden conjugarse a anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que se unen a antígenos de la superficie celular, por ejemplo, un marcador de la superficie celular descubierto en células madre o cardiomiocitos. Además del suministro de polinucleótidos a una célula o población de células, la introducción directa de las proteínas descritas en el presente documento en la célula o población de células puede realizarse mediante la técnica no limitante de transfección de proteínas, como alternativa condiciones de cultivo que pueden mejorar la 5 expresión y/o promover la actividad de las proteínas de esta invención son otras técnicas no limitantes.
La frase “soporte sólido” se refiere a superficies no acuosas tales como “placas de cultivo” “chips génicos” o “micromatrices” (microarrays). Dichos chips génicos o micromatrices pueden usarse para fines de diagnóstico y terapéuticos mediante una serie de técnicas conocidas por un experto en la materia. En una técnica, los 10 oligonucleótidos se distribuyen sobre un chip génico para determinar la secuencia de ADN mediante la estrategia de hibridación, tal como la perfilada en las patentes de Estados Unidos N.º 6.025.136 y 6.018.041. Los polinucleótidos de esta invención pueden modificarse a sondas, que, a su vez, pueden usarse para la detección de una secuencia genética. Dichas técnicas han sido descritas, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.º 5.968.740 y 5.858.659. Una sonda también puede fijarse a la superficie de un electrodo para la detección electroquímica de 15 secuencias de ácido nucleico tales como las descritas por Kayem y col., patente de Estados Unidos N.º 5.952.172 y por Kelley y col. (1999) Nucleic Acids Res. 27: 4830-4837.
Diversos “chips génicos” o “micromatrices” y tecnologías similares son conocidas en la técnica. Los ejemplos de éstas incluyen, aunque sin limitarse a, LabCard (ACLARA Bio Sciences Inc.); GeneChip (Affymetric, Inc); LabChip 20 (Caliper Technologies Corp); una matriz de baja densidad con detección electroquímica (Clinical Micro Sensors); LabCD System (Gamera Bioscience Corp.); Omni Grid (Gene Machines); Q Array (Genetix Ltd.); un sistema de espectrometría de masas automatizado de alto rendimiento con tecnología de expresión en fase líquida (Gene Trace Systems, Inc.); un sistema de dispensado de gotas por chorro térmico (Hewlett Packard Company); Hyseq HyChip (Hyseq, Inc.); BeadArray (Illumina, Inc.); GEM (Incyte Microarray Systems); un sistema de formación de 25 micromatrices de alto rendimiento que puede dispensar de 12 a 64 gotas sobre múltiples portaobjetos de vidrio (Intelligent Bio-Instruments); Molecular Biology Workstation y NanoChip (Nanogen, Inc.); un chip de vidrio microfluídico (Orchid biosciences, Inc.); BioChip Arrayer con cuatro puntas piezoeléctricas de goteo a voluntad PiezoTip (Packard Instruments, Inc.); FlexJet (Rosetta Inpharmatic, Inc.); espectrómetro de masas MALDI-TOF (Sequnome); ChipMaker 2 y ChipMaker 3 (TeleChem International, Inc.); y GenoSensor (Vysis, Inc.) tal como se 30 identifican y describen en Heller (2002) Annu. Rev. Biomed. Eng. 4:129-153. Los ejemplos de “chips génicos” o una “micromatriz” también se describen en las publicaciones de patente de Estados Unidos N.º: 2007-0111322, 2007-0099198, 2007-0084997, 2007-0059769 y 2007-0059765 y las patentes de Estados Unidos N.º: 7.138.506, 7.070.740 y 6.989.267.
35
En un aspecto, se preparan “chips génicos” o “micromatrices” que contienen sondas o cebadores homólogos a un polinucleótido, polipéptido o anticuerpo descrito en el presente documento. Se obtiene una muestra adecuada del paciente, se lleva a cabo extracción de ADN, ARN genómico, proteína o cualquier combinación de los mismos y se amplifica en caso necesario. La muestra se pone en contacto con el chip génico o panel de micromatriz en condiciones adecuadas para hibridación de los genes o productos génicos de interés con las sondas o cebadores 40 contenidos en el chip génico o micromatriz. Las sondas o cebadores pueden estar etiquetadas de forma detectable identificando de este modo el uno o más genes de interés. Como alternativa, puede usarse una reacción química o biológica para identificar las sondas o cebadores que hibridaron con el ADN o ARN del uno o más genes) de interés. Los genotipos o el fenotipo del paciente se determinan a continuación con ayuda del aparato y los procedimientos mencionados anteriormente. 45
Otros ejemplos no limitantes de un soporte en fase sólida incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita. La naturaleza del transportador puede ser soluble en cierta medida o insoluble. El material de soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible, siempre que la molécula acoplada sea capaz de unirse a un 50 polinucleótido, polipéptido o anticuerpo. Por lo tanto, la configuración del soporte puede ser esférica, como en una perla, o cilíndrica, como en la superficie interna de un tubo de ensayo, o la superficie externa de una varilla. Como alternativa, la superficie puede ser plana tal como una lámina, tira reactiva, etc., o, como alternativa, perlas de poliestireno. Los expertos en la materia conocerán muchos otros transportadores adecuados para unirse al anticuerpo o antígeno, o serán capaces de determinar los mismos mediante el uso de experimentación rutinaria. 55
Las “células eucariotas" comprenden todos los reinos de la vida, excepto monera. Se pueden distinguir fácilmente a través de un núcleo rodeado por una membrana. Animales, plantas, hongos y protistas son eucariotas u organismos cuyas células están organizadas en estructuras complejas por las membranas internas y un citoesqueleto. La estructura rodeada por una membrana más característica es el núcleo. Un huésped eucariota, incluyendo, por ejemplo, levadura, plantas superiores, insectos y células de mamíferos, o como alternativa a partir de una célula procariota tal como se ha descrito anteriormente. Los ejemplos no limitantes incluyen simio, bovino, porcino, murino, ratas, aviar, reptiliano y humano.
5
Las “células procariotas" que habitualmente carecen de un núcleo o cualesquiera otros orgánulos rodeados por una membrana y se dividen en dos dominios, bacterias y archaea. Además, en lugar de tener el ADN cromosómico, la información genética de estas células está en un bucle circular llamado un plásmido. Las células bacterianas son muy pequeñas, aproximadamente del tamaño de una mitocondria animal (aproximadamente 1-2 µm de diámetro y 10 µm de largo). Las células procariotas presentan tres formas principales: en forma de barra, esférica y en espiral. 10 En vez de someterse a procesos de replicación elaborados como las eucariotas, las células bacterianas se dividen por fisión binaria. Los ejemplos incluyen aunque sin limitarse a bacterias bacillus, bacterias E. coli bacterias Salmonella.
La expresión “anticuerpo humano”, tal como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que 15 tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la divulgación pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, la expresión “anticuerpo humano”, tal como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que secuencias CDR derivadas de la línea 20 germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, han sido injertadas en secuencias marco humanas. Por lo tanto, tal como se usa en el presente documento, la expresión “anticuerpo humano” se refiere a un anticuerpo en el que sustancialmente todas las partes de la proteína (por ejemplo, CDR, marco, dominios CL, CH (por ejemplo, CH1, CH2, Cm), bisagra, (VL, VH)) son sustancialmente no inmunógenas en seres humanos, con solamente cambios o variaciones de poca importancia en la secuencia. Del mismo modo, los anticuerpos designados de primate (mono, 25 babuino, chimpancé, etc.), roedores (ratón, rata, conejo, cobaya, hámster, y similares) y otros mamíferos designan dichos anticuerpos específico de especie, subgénero, género, subfamilia, familia. Además, los anticuerpos quiméricos incluyen cualquier combinación de los anteriores. Dichos cambios o variaciones opcional y preferentemente retienen o reducen la inmunogenicidad en los seres humanos u otras especies con respecto a los anticuerpos no modificados. Por lo tanto, un anticuerpo humano es distinto de un anticuerpo quimérico o 30 humanizado. Se señala que un anticuerpo humano puede ser producido por una célula animal no humana o procariota o eucariota que es capaz de expresar los genes de inmunoglobulina humana funcionalmente reordenados (por ejemplo, la cadena pesada y/o ligera). Además, cuando un anticuerpo humano es un anticuerpo monocatenario, puede comprender un péptido enlazador que no se encuentra en los anticuerpos humanos nativos. Por ejemplo, un Fv que puede comprender un péptido enlazador, tal como de dos a aproximadamente ocho residuos de glicina u 35 otros aminoácidos, que une la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera. Se considera que dichos péptidos enlazadores son de origen humano.
Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo humano se “deriva de” una secuencia de línea germinal particular, si se obtiene el anticuerpo a partir de un sistema que usa secuencias de inmunoglobulina humana, por 40 ejemplo, mediante la inmunización de un ratón transgénico que porta genes de inmunoglobulina humana o cribando una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana. Un anticuerpo humano que se “deriva de” una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana puede ser identificado como tal mediante la comparación de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con la secuencia de aminoácidos de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Un anticuerpo humano seleccionado normalmente es al menos 90% idéntico en la secuencia de 45 aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de la línea germinal de inmunoglobulina humana y contiene residuos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano como de ser humano, cuando se comparan con las secuencias de aminoácidos inmunoglobulina de línea germinal de otras especies (por ejemplo, secuencias de la línea germinal murina). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos el 95%, o incluso al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntica en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos 50 codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Normalmente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia de línea germinal humana particular presentará no más de 10 diferencias de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede presentar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2, o 1 diferencias de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de la línea germinal de inmunoglobulina. 55
Un “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a anticuerpos que presentan una sola especificidad de unión que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. La expresión también pretende incluir anticuerpos humanos recombinantes. Procedimientos para fabricar estos anticuerpos se describen en el presente documento.
La expresión “anticuerpo humano recombinante”, tal como se usa en el presente documento, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan mediante medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de 5 inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos, anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, a partir de un transfectoma, anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatoria, recombinante y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implica splicing de secuencias génicas de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y 10 constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertas realizaciones de la descripción, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sometidos a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas de y relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir de 15 forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo. Procedimientos para fabricar estos anticuerpos se describen en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, “isotipo” se refiere a la clase de anticuerpos (por ejemplo, IgM o IgG1) que está codificada por genes de la región constante de cadena pesada. 20
Las expresiones “anticuerpo policlonal” o “composición de anticuerpo policlonal”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a una preparación de anticuerpos que se derivan de diferentes líneas de células B. Son una mezcla de moléculas de inmunoglobulina secretadas contra un antígeno específico, que reconoce, cada una, un epítopo diferente. 25
Las expresiones “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpo monoclonal”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular sencilla. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta una única especificidad y afinidad de unión para un epítopo particular. 30
Tal como se usa en el presente documento, el término “etiqueta” pretende un compuesto o composición directa o indirectamente detectable que está conjugado directa o indirectamente a la composición a detectar, por ejemplo, polinucleótido o proteína tal como un anticuerpo para generar una composición “etiquetada”. El término también incluye secuencias conjugadas al polinucleótido que proporcionarán una señal en el momento de la expresión de las 35 secuencias insertadas, tal como proteína verde fluorescente (GFP) y similares. La etiqueta puede ser detectable por sí misma (por ejemplo etiquetas de radioisótopo o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable. Las etiquetas pueden ser adecuadas para detección a pequeña escala o más adecuadas para cribado de alto rendimiento. Por lo tanto, las etiquetas adecuadas incluyen, aunque sin limitarse a, radioisótopos, fluorócromos, compuestos 40 quimioluminiscentes, tintes y proteínas, incluyendo enzimas. La etiqueta puede detectarse simplemente o puede cuantificarse. Una respuesta que es simplemente detectada en general comprende una respuesta cuya existencia meramente es confirmada, mientras que una respuesta que se cuantifica generalmente comprende una respuesta que tiene un valor cuantificable (por ejemplo, numéricamente notificable) tal como una intensidad, polarización, y/u otra propiedad. En ensayos de luminiscencia o fluorescencia, la respuesta detectable puede ser generada 45 directamente a través de un luminóforo o fluoróforo asociado a un componente del ensayo implicado realmente en la unión, o indirectamente usando un luminóforo o fluoróforo asociado con otro componente (por ejemplo, informador o indicador).
Los ejemplos de etiquetas luminiscentes que producen señales incluyen, aunque sin limitarse a, bioluminiscencia y 50 quimioluminiscencia. Una respuesta de luminiscencia detectable comprende generalmente un cambio en, o una aparición de, una señal de luminiscencia. Los procedimientos y luminóforos adecuados para los componentes de ensayo de etiquetado de forma luminiscente son conocidos en la técnica y se describen por ejemplo, en Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6ª ed.). Los ejemplos de sondas luminiscentes incluyen, aunque sin limitarse a, aecuorina y luciferasas. 55
Los ejemplos de etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen, aunque sin limitarse a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde malaquita, estilbeno, Lucifer Yellow, Cascade Blue ™, y Rojo Texas. Otros colorantes ópticos adecuados se describen en Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6ª ed.).
En otro aspecto, la etiqueta fluorescente se funcionaliza para facilitar unión covalente a un componente celular presente en o sobre la superficie de la célula o tejido tal como un marcador de la superficie celular. Grupos adecuados funcionales, incluyendo, aunque sin limitarse a, grupos isotiocianato, grupos amino, grupos haloacetilo, 5 maleimidas, ésteres de succinimidilo, y haluros de sulfonilo, todos los cuales pueden ser utilizados para unir la etiqueta fluorescente a una segunda molécula. La elección del grupo funcional de la etiqueta fluorescente dependerá del sitio de unión ya sea a un enlazador, el agente, el marcador o el segundo agente de etiquetado.
II. Usos de la invención 10
Un aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende un derivado de fXa de la invención para uso en un procedimiento de prevenir o reducir una hemorragia en un sujeto sometido a terapia anticoagulante administrando al sujeto una cantidad efectiva de un derivado proteico de factor Xa. El derivado tiene un sitio activo modificado y un dominio Gla modificado, teniendo de este modo actividad procoagulante reducida o 15 ninguna. El derivado actúa como antídoto y sustancialmente neutraliza la actividad anticoagulante del inhibidor. El derivado es deficiente en Gla. El sujeto puede ser un mamífero o, más particularmente, un ser humano.
En otra realización, la invención se refiere a un derivado de fXa de la invención para uso en un procedimiento para unirse a e inhibir selectivamente un inhibidor del factor Xa administrado de forma exógena en un sujeto. El 20 procedimiento comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de un derivado de un derivado de factor Xa tal como se ha descrito anteriormente. El sujeto puede ser una célula o un mamífero, tal como un ser humano.
Los pacientes adecuados para esta terapia se han sometido a terapia anticoagulante anterior, por ejemplo, se les ha administrado uno o más de un anticoagulante, tal como un inhibidor de factor Xa. Los ejemplos de anticoagulantes 25 que son inhibidores del factor Xa, incluyen aunque sin limitarse a, fondaparinux, idraparinux, idraparinux biotinilado, enoxaparina, fragmina, NAP-5, rNAPc2, inhibidor de la ruta del factor tisular, DX-9065a, YM-60828, YM-150, apixaban, rivaroxaban, PD-348292, otamixaban, DU-176b, LY517717, GSK913893, heparina de bajo peso molecular y betrixaban, o cualquier combinación de los mismos. La fuente de diversos anticoagulantes se encuentra en toda la descripción. 30
El derivado tiene un sitio activo modificado y un dominio Gla eliminado. En un aspecto de la divulgación, el derivado del factor Xa no tiene o muestra ninguna actividad procoagulante. Es este aspecto de la divulgación, el derivado comprende al menos los residuos de aminoácido 40 a 448, 45 a 448, o 46 a 448 de la SEQ ID NO. 3 o equivalentes de la misma. En otro aspecto de la divulgación, el derivado comprende al menos los residuos de aminoácido 45 a 35 139 y 195 a 448 o 46 a 139 y 195-448 de la SEQ ID NO. 3 o equivalentes de la misma.
El derivado de fXa conserva la estructura tridimensional del sitio activo de la proteína fXa. Información respecto a la estructura tridimensional del des-Gla fXa puede encontrarse en Brandstetter, H y col. J. Bio. Chem., 1996, 271: 29988-29992. 40
En otro aspecto de la divulgación, los derivados de fXa pueden carecer del dominio Gla así como uno cualquiera de los dos dominios EGF. En otro aspecto de la divulgación, los derivados de fXa carecen completamente de cadena ligera. Otras modificaciones de la cadena pesada pueden comprender el dominio catalítico de serina proteasas relacionadas que son capaces de unirse a inhibidores. Las serina proteasas relacionadas tienen dominios catalíticos 45 que poseen suficiente similitud estructural con el dominio catalítico fXa y son, por lo tanto, capaces de unirse a inhibidores de fXa de molécula pequeña. Los ejemplos de serina proteasas relacionadas incluyen, aunque sin limitarse a, proteasas de mamífero tales como calicreína plasmática, trombina y tripsina o la proteasa bacteriana subtilisina. Estos derivados incluyen además modificaciones en los residuos de aminoácidos equivalentes a residuos serina (SER379) o ácido aspártico (ASP282) del sitio activo, descritos en el presente documento. 50
La proteína del factor Xa con actividad procoagulante reducida comprende una cadena ligera modificada, donde la modificación es deleción del dominio Gla para reducir la unión a la membrana fosfolipídica de fXa. En algunas realizaciones de la divulgación, la secuencia de aminoácidos principal de fXa no ha cambiado, pero la cadena lateral de ciertos aminoácidos se ha cambiado. Los ejemplos del dominio Gla modificado que reduce la unión a la 55 membrana fosfolipídica de fXa comprenden polipéptidos o proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos primaria de la SEQ ID NO. 3 o un equivalente de la misma, con al menos una sustitución, adición o deleción de aminoácidos en comparación con el dominio Gla de una proteína de factor Xa humano de tipo silvestre. En algunas realizaciones de la divulgación, al menos un aminoácido que es sustituido o delecionado es un ácido γ-carboxiglutámico (Gla). Los residuos de Gla se muestran en la SEQ ID NO. 3 en las posiciones de aminoácidos 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 32 y 39. En algunas realizaciones de la divulgación, la secuencia de aminoácidos primaria del antídoto es idéntica a la SEQ ID NO. 3 o equivalente de la misma, pero es una proteína de factor Xa no carboxilada, subcarboxilada o descarboxilada. En algunas realizaciones de la divulgación, el antídoto es un des-Gla anhidro-fXa o des-Gla fX-S379A. En algunas realizaciones de la divulgación, la proteína del factor Xa con unión a la 5 membrana fosfolipídica reducida comprende, además, modificación o deleción de los EGF1 y/o EGF2 (mostrados en la figura 3 como los aminoácidos 46 a 84 y 85 a 128, respectivamente) o una parte, es decir fragmento de los dominios EGF1 y/o EGF2. En algunas realizaciones de la divulgación, toda la cadena ligera o sustancialmente toda la cadena ligera se modifica o elimina. Por ejemplo, la proteína de fXa modificada con unión a la membrana fosfolipídica reducida puede contener solamente la cadena pesada o el fXa modificado puede contener la cadena 10 pesada y un fragmento de la cadena ligera que contiene Cys132, el residuo de aminoácido que forma el único puente disulfuro con Cys302 de la cadena pesada en la SEQ ID NO. 3. En algunas realizaciones, el derivado comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 12. En algunas realizaciones, el derivado es el polipéptido bicatenario que comprende la SEQ ID NO. 13. En otras realizaciones de la divulgación, el derivado es el polipéptido de la SEQ ID NO. 15. 15
El derivado de la proteína del factor Xa comprende una cadena pesada modificada que contiene el dominio catalítico de dicha proteína del factor Xa. En algunas realizaciones de la divulgación, al menos una sustitución de aminoácidos está presente en una o más posiciones de aminoácido de fXa seleccionadas de entre el grupo que consiste en Glu216, Glu218, Arg332, Arg347, Lys351 y Ser379 en la SEQ ID NO. 3 y 7 (Glu37, Glu39, Arg150, Arg165, Lys169 y 20 Ser195 en numeración de quimotripsina, respectivamente). El antídoto es una proteína del factor Xa con residuo serina (Ser379 en la SEQ ID NO. 3 y 7, Ser195 en numeración de quimotripsina) en el sitio activo modificado a alanina. Dichas modificaciones pueden realizarse a proteína fXa de tipo silvestre o a cualquiera de las proteínas de fXa modificadas o fragmentos descritos anteriormente. Por ejemplo, el des-Gla anhidro-fXa con residuos serina en el sitio activo sustituidos por deshidroalanina descrito en el ejemplo 1 ha mostrado actividad de antídoto. 25
En otras realizaciones de la divulgación, el derivado tiene interacción reducida con ATIII, cofactores fV/fVa y fVIII/fVIIIa en comparación con factor Xa de tipo silvestre o de origen natural. En algunas realizaciones de la divulgación, al menos una sustitución de aminoácidos está presente en la posición de aminoácido Arg306, Glu310, Arg347, Lys351, Lys414 o Arg424 en la SEQ ID NO. 3 y 7 (Arg125, Glu129, Arg165, Lys169, Lys230 o Arg240 en 30 numeración de quimotripsina, respectivamente). Dichas modificaciones pueden realizarse a proteína fXa de tipo silvestre o a cualquiera de las proteínas de fXa modificadas o fragmentos descritos anteriormente.
En otras realizaciones de la divulgación, el antídoto es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de un dominio catalítico de serina proteasa que puede imitar la capacidad de unión al inhibidor de la cadena pesada de 35 fXa. Dichas proteínas pueden incluir proteasas de mamífero tales como calicreína plasmática, trombina, tripsina (o su homólogo bacteriano subtilisina) que han sido modificadas de forma recombinante para carecer de actividad serina proteasa capaz de escindir sustratos de proteína pero aún posee las características estructurales del sitio activo escindido.
40
También son proporcionadas por esta invención composiciones farmacéuticas que contienen uno o más de los derivados del factor Xa modificados y un transportador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones se administran a un sujeto que lo necesita en una cantidad que proporcionará el beneficio deseado, una reducción o detención de hemorragia. Las composiciones pueden coadministrarse con cualquier agente o terapia adecuada que complemente o mejore la actividad del derivado del factor Xa. Un ejemplo de estos es un segundo agente capaz de 45 prolongar la semivida en plasma del antídoto. Los ejemplos de segundos agentes adecuados incluyen, aunque sin limitarse a, un anticuerpo anti-fXa que reconoce en exositio de la cadena pesada de fXa o un derivado de fXa unido alfa-2-macroglobulina. La formación del complejo entre el derivado de fXa y un segundo agente (anticuerpo de exositio o alfa-2-macroglobulina) bloquearía interacciones macromoleculares pero conserva la capacidad de active uniones al inhibidor dependientes del sitio. Los ejemplos de anticuerpos anti-fXa adecuados para coadministración 50 incluyen, aunque sin limitarse a, los descritos en Yang Y.H., y col., J. Immunol. 2006, 1; 177(11): 8219-25, Wilkens, M y Krishnaswamy, S., J. Bio. Chem., 2002, 277 (11), 9366-9374, y Church WR, y col., Blood, 1988, 72(6), 1911-1921.
En algunas realizaciones, una proteína de factor Xa se modifica mediante medios químicos, enzimáticos o 55 recombinantes. Por ejemplo, el sitio activo Ser379 puede modificarse químicamente a deshidroalanina, y el dominio Gla puede eliminarse enzimáticamente mediante digestión con quimotripsina tal como se describe en el ejemplo 1. Un fXa modificado descrito en el presente documento también puede producirse mediante medios recombinantes modificando la secuencia del cADN que codifica fX de tipo silvestre (SEQ ID NO. 2) descrita con más detalles en el ejemplo 7 para expresión directa de antídoto recombinante (r-antídoto) o como alternativa, una proteína fX con la modificación deseada puede producirse mediante medios recombinantes seguida por activación del fXa modificado por un activador, tal como un veneno de serpiente, por ejemplo veneno de víbora de Russell, y complejos de fVIIa/factor tisular o fIXa/fVIIIa.
5
Los sujetos que se beneficiarán de la administración de las composiciones descritas en el presente documento y los procedimientos adjuntos incluyen aquellos que están experimentando, o predispuestos a un evento de hemorragia clínica grave o un evento de hemorragia no grave clínicamente significativa. Los ejemplos de eventos de hemorragia clínica grave se seleccionan de entre el grupo que consiste en hemorragia, hemorragia en órganos vitales, hemorragia que requiere reintervención o un nuevo procedimiento terapéutico, y un índice de hemorragia de ≥ 2,0 10 con una hemorragia manifiesta asociada. (Turpie AGG, y col., NEJM, 2001, 344: 619-625.) Adicionalmente, el sujeto puede estar experimentando o predispuesto a un evento de hemorragia no grave seleccionado de entre el grupo que consiste en epistaxis que es persistente o recurrente y en cantidad sustancial o no se detendrá sin intervención, hemorragia rectal o del tracto urinario que no se alzan hasta un nivel que requiere un procedimiento terapéutico, hematomas sustanciales en sitios de inyección o en cualquier otro lugar que son espontáneos o se producen con 15 traumatismo trivial, pérdida de sangre sustancial más de habitualmente asociada con un procedimiento quirúrgico que no requiere drenaje, y hemorragia que requiere transfusión no planificada.
En algunas realizaciones, el antídoto se administra después de la administración de una sobredosis de un inhibidor de fXa o antes de una cirugía, que puede exponer a los sujetos al riesgo de hemorragia. 20
En cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, debe entenderse, incluso aunque no siempre se afirme explícitamente, que una cantidad efectiva del derivado se administra al sujeto. La cantidad puede ser determinada empíricamente por el facultativo encargado del tratamiento y variará con la edad, el género, el peso y la salud del sujeto. Factores adicionales a considerar por el facultativo encargado del tratamiento incluyen, aunque 25 sin limitarse a, la identidad y/o cantidad de inhibidor del factor Xa, que puede haber sido administrado, la vía o el modo en que el antídoto será administrado al sujeto, la formulación del antídoto, y el criterio de valoración terapéutico para el paciente. Con estas variables en mente, un experto en la materia administrará una cantidad terapéuticamente efectiva al sujeto a tratar. Se contempla que una cantidad terapéuticamente efectiva de los antídotos descritos en el presente documento suficiente para contrarrestar, o sustancialmente neutralizar, un 30 anticoagulante en un sujeto puede contener de aproximadamente 0,01 miligramos de antídoto por kilogramo de peso corporal de un sujeto a 1 gramo de antídoto por kilogramo de peso corporal de un sujeto de antídoto. Se contempla, además, que el antídoto puede proporcionarse al sujeto en un intervalo de concentración de aproximadamente 10 nanomolar a aproximadamente 100 micromolar, o de aproximadamente 10 nanomolar a aproximadamente 5 micromolar, o de aproximadamente 100 nanomolar a aproximadamente 2,5 micromolar. 35
Las composiciones pueden administrarse en cantidades que son eficaces para que el antídoto reconozca selectivamente y se una, directa o indirectamente, al inhibidor del factor Xa en el sujeto. También pueden administrarse en cantidades para inhibir sustancialmente o sustancialmente neutralizar los inhibidores del factor Xa administrados de forma exógena en un sujeto. 40
En otro aspecto más, la invención se refiere a una composición farmacéutica para invertir o neutralizar la actividad anticoagulante de un inhibidor del factor Xa administrado a un sujeto, que comprende administrar una cantidad efectiva de un antídoto al inhibidor del factor Xa y un transportador farmacéuticamente aceptable, a condición de que el antídoto no sea factor VIIa derivado de plasma, factor VIIa recombinante, plasma fresco congelado, concentrados 45 del complejo de protrombina y sangre completa.
En algunas realizaciones, el antídoto es uno cualquiera de los antídotos de la invención. En algunas realizaciones, el antídoto está conjugado con un resto capaz de prolongar la semivida en circulación del antídoto. En algunas realizaciones, el resto se selecciona de entre el grupo que consiste en polietilenglicol, un grupo acilo, un liposoma, 50 una proteína transportadora, una membrana fosfolipídica artificial, y una nanopartícula. Por ejemplo, un residuo lisina o cisteína no en el sitio activo de un derivado de fXa descrito en el presente documento puede modificarse químicamente para unirse a una molécula de polietilenglicol. Otros procedimientos proporcionados en Werle, M. & Bernkop-Schnürch, A. Strategies to Improve Plasma Half Life Time of Peptide and Protein Drugs, Amino Acids 2006, 30(4): 351-367 pueden usarse para prolongar la semivida en plasma de los antídotos de esta invención. 55
En otras realizaciones de la invención, la semivida del derivado de fXa mejora acoplando el antídoto a dominios transportadores de Fc. En una realización, el antídoto está acoplado a un fragmento Fc, tal como una parte peptídica de inmunoglobulina o un fragmento de IgG1. En una realización, se contempla una proteína quimérica que comprende el derivado de fXa y la parte peptídica de inmunoglobulina. En otra realización más, el derivado de fXa y el péptido de inmunoglobulina se acoplan mediante una reacción química, tal como un puente disulfuro, con la cadena pesada de IgG humana y regiones constantes de cadena ligera kappa.
En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además un agente capaz de prolongar la 5 semivida plasmática del antídoto. En otro aspecto, la composición farmacéutica ha sido coformulada con un agente capaz de prolongar la semivida plasmática del antídoto. En algunas realizaciones, el agente coadministrado o coformulado es un anticuerpo anti-fXa que reconoce el exositio de fXa o un derivado de fXa unido a alfa-2-macroglobulina.
10
III. Antídotos
Derivados de factor Xa
Un aspecto de la presente invención es el uso de derivados de fXa como antídotos seguros y eficaces para 15 neutralizar sustancialmente la actividad de un inhibidor de la coagulación fXa para prevenir o detener una hemorragia. Se contempla que los antídotos de la presente invención serán útiles para invertir el efecto anticoagulante de un inhibidor de fXa, especialmente un inhibidor de molécula pequeña dirigido al sitio activo.
Un antídoto para un inhibidor de fXa tiene actividad procoagulante reducida o ninguna pero es capaz de unirse con 20 un inhibidor de fXa. Se contempla que dicha actividad limitada permita dosificar del antídoto a un nivel mayor que el fXa de tipo silvestre circulante. Ciertos derivados de fXa, tales como des-Gla fXa y FXa deficiente en Gla, son antídotos adecuados de esta divulgación. Además de tener actividad procoagulante reducida o disminuida, los antídotos de la presente invención deben ser también sustancialmente no inmunógenos para el sujeto. Un antídoto de la divulgación puede contener una combinación de dos o más de las anteriores mutaciones y/o modificaciones. 25 Además, cualquiera de los anteriores derivados de fXa puede administrarse en solitario o en combinación con otro.
El factor Xa es una serina proteasa en la ruta de coagulación sanguínea responsable de convertir protrombina en trombina. Se produce a partir del factor X inactivo tras la activación por la Xasa intrínseca (complejo formado por el factor IXa con su cofactor, factor VIIIa) o la Xasa extrínseca (complejo formado por el factor VIIa con su cofactor, 30 factor tisular). El fX activado (fXa) puede someterse a escisión autocatalítica adicional en el extremo C de su cadena pesada, que convierte fXaα en la subforma fXaβ (Jesty, J y col. J. Biol. Chem. 1975, 250(12): 4497-4504). Tanto fXaα como fXa□ son materiales adecuados para la presente invención. El propio fXa convierte la protrombina a una velocidad lenta que no es suficiente para apoyar la coagulación. Solamente cuando forma un complejo protrombinasa con cofactores Ca2+, fosfolípido, y factor Va, fXa puede activar la protrombina a una velocidad 35 suficientemente rápida para apoyar la coagulación (Skogen, W.F., y col., J. Biol. Chem. 1984, 259(4): 2306-10). El complejo requiere unión entre el fosfolípido cargado negativamente y residuos de ácido γ-carboxiglutámico en el dominio Gla de fXa mediante establecimiento de puentes con Ca2+.
Por lo tanto, aunque el dominio Gla no contiene el sitio activo de fXa, permite a fXa formar el complejo de 40 protrombinasa a través de los residuos de ácido γ-carboxiglutámico. Esto se demuestra mediante eliminación selectiva del dominio Gla de fXa mediante digestión con quimotripsina (véase la figura 7 y el ejemplo 1). Se realizaron ensayos de coagulación en fXa durante la evolución temporal de escisión del dominio Gla mediante digestión con quimotripsina. Se ha descrito (Skogen y col., J. Biol. Chem. 1984, 259(4): 2306-10) que un complejo protrombinasa reconstituido que comprende fXa sin dominio Gla, fVa, fosfolípidos e iones calcio produce trombina a 45 una velocidad significativamente reducida (0,5% de producto generado en comparación con el complejo de control que contiene fXa nativo). Tal como se muestra en la figura 7, la actividad de fXa en la formación de coágulos se redujo parcialmente después de que fXa fue digerido mediante quimotripsina durante 15 minutos y la actividad se perdió completamente después de 30 minutos de digestión. Se ha descubierto, por lo tanto, que fXa no carboxilado o descarboxilado, que carecen de los residuos de ácido gamma-carboxiglutámico apropiados requeridos para unión a 50 la membrana dependiente de calcio, son incapaces de ensamblaje del complejo de coagulación dependiente de membrana y no apoyan la coagulación sanguínea (Mann, KG y col., Blood, 1990, 76: 1-16).
Se ha establecido también que fXa deficiente en dominio Gla es capaz de unirse a inhibidores de fXa dirigidos al sitio activo. (Brandstetter, H y col., J. Bio. Chem., 1996, 271: 29988-29992). Ha habido informes de cristalografía de 55 inhibidor de fXa de molécula pequeña unido a des-Gla fXa humano, que proporcionaron descripción estructural del sitio activo escindido (Brandstetter, J. Bio. Chem., 1996, 271: 29988-29992 y Roehrig, J. Med. Chem. 2005, 48(19): 5900-8). La figura 8 muestra que un des-Gla anhidro-fXa mostraba una afinidad de unión de 0,319 nM con un inhibidor de fXa betrixaban, comparable a la de un fXa nativo.
Se ha descubierto ahora que des-Gla fXa, y otros derivados de fXa que tienen actividad procoagulante reducida pero son capaces de unión al inhibidor de fXa, pueden usarse como un antídoto para un inhibidor de fXa. Tal como se muestra en la figura 9, el des-Gla anhidro-fXa mostraba inversión completa de actividad anticoagulante de betrixaban a una concentración de 680 nM. Tal como se detalla en el ejemplo 2, la generación de trombina se inició 5 añadiendo reactivo que contenía TF (Innovin) y, por lo tanto, indicativa de función de factores de coagulación en la ruta de coagulación extrínseca. También se ha demostrado en los ejemplos 9-13, que el antídoto recombinante es útil para invertir una amplia variedad de anticoagulantes.
Ensayos de prolongación de la coagulación con el reactivo de tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) 10 (Actina FS) que determinan la función del factor de coagulación en la ruta de coagulación intrínseca también indican que el des-Gla anhidro-fXa posee actividad de antídoto. La figura 10 muestra el efecto de antídoto dependiente de la dosis de des-Gla anhidro-fXa contra 250 nM de betrixaban, con inversión completa a 600 nM. La figura 11 muestra que des-Gla anhidro-fXa también fue capaz de invertir la actividad anticoagulante de otro inhibidor de fXa, enoxaparina. La figura 12 muestra que des-Gla anhidro-fXa no mostraba actividad de antídoto significativa contra un 15 inhibidor de trombina directo, argatroban. Por lo tanto, el des-Gla anhidro-fXa es un antídoto selectivo para inhibidor de fXa y es capaz de restaurar la actividad procoagulante de fXa iniciada por la ruta extrínseca o la intrínseca.
Además, la actividad de antídoto de des-Gla anhidro-fXa se demostró mediante los ensayos de prolongación del aPTT medido con un temporizador de coagulación tradicional. Tal como se muestra en la figura 13, el propio des-Gla 20 anhidro-fXa no tiene ningún efecto sobre el aPTT de plasma de control a las concentraciones más altas ensayadas (2576 nM). 400 nM de betrixaban prolongaban el aPTT más de dos veces. Este efecto anticoagulante de betrixaban es invertido por des-Gla anhidro-fXa de manera sensible a la dosis, con retorno de aPTT a un nivel cercano al normal de plasma de control a concentraciones de antídoto mayores de 1610 nM.
25
Se contempla que truncamientos adicionales en la cadena ligera de fXa, por ejemplo, deleción adicional del dominio EGF1, los dominios EGF1 más EGF2, o fragmentos de los mismos, y fXa inactivo con solamente la cadena pesada pueden ser antídotos útiles de esta divulgación.
FXa deficiente en dominio Gla no apoya coagulación normal por debajo de la concentración fisiológicamente 30 relevante. Sin embargo, la proteína tiene la capacidad de escindir muchos sustratos y causar coagulación a concentraciones más elevadas. Por ejemplo, Skogen y col., (Skogen, W.F., y col., J. Biol. Chem. 1984, 259(4): 2306-10) mostraron que des-Gla fXa bovino tiene aproximadamente un 0,5-1,0% de actividad del complejo de protrombinasa con respecto al fXa de tipo silvestre. Por lo tanto, modificaciones que reducen adicionalmente o eliminan completamente la actividad procoagulante de un derivado de fXa están contempladas por procedimientos 35 de la invención. Dicha modificación puede ser, por ejemplo, en un dominio catalítico de fXa.
Varias maneras de modificar el dominio catalítico en la cadena pesada de fXa para reducir su actividad procoagulante están contempladas por la divulgación. El residuo del sitio activo S379 de fXa (tal como se muestra en la SEQ ID No. 7), por ejemplo, puede sustituirse selectivamente por deshidroalanina (véase el ejemplo 1) o alanina 40 (véase el ejemplo 6) para reducir o eliminar la actividad procoagulante. También se conoce que la formación de un complejo entre fXa y un reactivo dirigido al exositio de fXa puede bloquear la afinidad de unión macromolecular de fXa, reduciendo de este modo su actividad procoagulante mientras conserva afinidad de unión a molécula pequeña en el sitio activo. Este reactivo dirigido al exositio incluye, sin limitación, anticuerpos monoclonales dirigidos a una región eliminada del sitio activo (Wilkens, M y Krishnaswamy, S, J. Bio. Chem., 2002, 277 (11), 9366-9374), o α-2-45 macroglobulina. Se ha conocido que el complejo α-2-macroglobulina-serina proteasa, tal como con tripsina, trombina o fXa, es capaz de unirse a sustrato de molécula pequeña (Kurolwa, K. y col., Clin. Chem. 1989, 35(11), 2169-2172).
También se conoce que un fXa inactivo con modificaciones únicamente en la cadena pesada, mientras mantiene su cadena ligera sin cambios, actuaría como un inhibidor de protrombinasa (Hollenbach, S. y col., Thromb. Haemost., 50 1994, 71(3), 357-62) dado que interfiere en la actividad procoagulante de fXa normal, tal como se muestra en la figura 6. Por lo tanto, el derivado de fXa presenta modificaciones tanto en la cadena ligera como en la cadena pesada. Se ha descubierto que estas modificaciones reducen o eliminan las actividades tanto procoagulante como anticoagulante, mientras conservan la capacidad de unión a inhibidores del derivado de fXa.
55
Pueden usarse varios procedimientos para producir derivados de fXa deficiente en dominio Gla u otros derivados de fXa descritos en el presente documento. Por ejemplo, el dominio Gla puede eliminarse completamente mediante escisión quimotríptica, produciendo fXa sin dominio Gla. Como alternativa, un fX sin dominio Gla puede producirse mediante escisión quimotríptica de fX nativo. El fX sin dominio Gla puede convertirse entonces en fXa sin dominio Gla mediante un activador de fX. fX puede aislarse de plasma de la misma o una especie diferente que el sujeto a tratar. fX bovino, por ejemplo, ha demostrado ser funcional en ensayos en plasma humano. Los ejemplos de un activador de fX incluyen, sin limitación, un veneno de serpiente, tal como veneno de víbora de Russell, y complejos de fVIIa/factor tisular o fIXa/fVIIIa. Dicho medio es conocido para un experto en la materia. Por ejemplo, Rudolph A.E. y col., describieron un fXa recombinante producido a partir de un factor X (fX) recombinante con una única 5 sustitución de Arg347 por Glutamina (fXR347N) (Biochem. 2000, 39 (11): 2861 -2867). En una realización, los derivados de fXa producidos a partir de fuentes no humanas son no inmunógenos o sustancialmente no inmunógenos. El ejemplo 7 también proporciona un procedimiento de producción de un antídoto recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 12.
10
Los derivados de fXa también pueden purificarse a partir de plasma humano, o pueden producirse mediante un procedimiento de ADN recombinante donde un gen apropiado para el derivado de fXa se expresa en un organismo huésped adecuado. La expresión y purificación de fXa recombinante ha sido descrita por varios grupos, véase, por ejemplo, Larson, P.J., y col., Biochem., 1998, 37: 5029-5038, y Camire, R.M., y col., Biochem., 2000, 39, 14322-14329 para producir fX recombinante; Wolf, D.L. y col., J. Bio. Chem., 1991, 266(21): 13726-13730 para producir fXa 15 recombinante. fXa modificado puede prepararse de acuerdo con estos procedimientos usando un cADN modificado genéricamente que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica el fXa mutante deseado. El ejemplo 6 da más detalles para expresión directa de un FXa sin dominio Gla-S379 mutante con actividad funcional como antídoto.
Está contemplado por la divulgación que fXa mutado o modificado en el sitio activo con dominio Gla deficiente, tal 20 como fXa subcarboxilado, también pueda ser útil como antídoto de inhibidor de fXa. El fXa subcarboxilado puede prepararse mediante medios recombinantes reteniendo derivados de vitamina K durante la expresión de proteínas (los derivados de vitamina K son necesarios para modificación postraduccional para formar los residuos de Gla) o añadiendo antagonistas de vitamina K tales como warfarina durante el cultivo tisular. FXa descarboxilado puede prepararse calentando (Bajaj P., J. Biol. Chem., 1982, 257(7): 3726-3731) o mediante digestión proteolítica mediante 25 quimotripsina (Morita T., y col., J. Biol. Chem., 1986, 261(9): 4015-4023). El antídoto también puede generarse en sistemas procariotas seguido por replegamiento o constitución in vitro del sitio de unión del inhibidor de fXa.
Los residuos de Gla también pueden modificarse químicamente para eliminar el grupo carboxilo responsable de unión a la membrana dependiente de iones calcio. Por ejemplo, los grupos carboxilo en los residuos de Gla pueden 30 eliminarse selectivamente en condiciones de descarboxilación o pueden estar cubiertos, por ejemplo, mediante esterificación o aminación. Es deseable que dicha esterificación o aminación sea resistente a hidrólisis in vivo de modo que el fXa modificado no se convierta fácilmente en fXa activo, lo que puede causar trombosis.
Otros mutantes o derivados de fXa también pueden ser antídotos útiles de esta divulgación. En una realización, esta 35 invención abarca el uso de mutantes descritos en Peter J. Larson y col., Biochem., 1998, 37: 5029-5038 como antídotos de inhibidores de fXa.
En otra realización, esta divulgación abarca el uso de mutantes de fXa catalíticamente inactivos para preparar antídotos de inhibidores de fXa. Por ejemplo, mutantes descritos en Sinha, U., y col., Protein Expression and Purif. 40 1992, 3: 518-524 rXai, mutantes con modificaciones químicas, tales como deshidroalanina (anhidro fXa), tal como se describe en Nogami, y col., J. Biol. Chem. 1999, 274(43): 31000-7. FXa con serina en el sitio activo (Ser379 en numeración de fX tal como se muestra en la SEQ ID NO. 7, y Ser195 en numeración de quimotripsina) sustituida por alanina (fXa-S379A en numeración de fX, o fXa-S195A en numeración de quimotripsina), donde la actividad procoagulante se eliminó, también pueden usarse como antídotos de inhibidores de fXa. La divulgación también 45 prevé derivados de fXa con el residuo serina del sitio activo acilado de forma irreversible que aún es capaz de unirse a inhibidores de molécula pequeña. FXa con la serina del sitio activo acilada de forma reversible ha sido descrita por Wolf, y col., Blood, 1995, 86(11): 4153-7. Dicha acilación reversible, sin embargo, es capaz de producción dependiente del tiempo de fXa activo y pude conducir a un exceso de fXa activo durante un periodo de tiempo. La velocidad de desacilación puede reducirse mediante estrategias similares a las descritas en Lin P.H. y col., 50 Thrombosis Res., 1997, 88(4), 365-372. Por ejemplo, moléculas de fXa con Ser379 (Ser195 en numeración de quimotripsina) acilada mediante grupos 4-metoxibencilo y 3-bromo-4-metoxibencilo recuperan menos del 50% de su actividad original cuando se incuban en un tampón que tiene pH 7,5 a 37°C durante 4 horas.
Una realización de la divulgación se refiere al uso de derivados de fXa con mutaciones en residuos de fXa que se 55 sabe que son importantes para interacción de fXa con el cofactor fV/fVa. Dichos residuos incluyen, sin limitación, Arg306, Glu310, Arg347, Lys351 o Lys414 (SEQ ID NO. 3 y 7, estos aminoácidos corresponden a Arg125, Glu129, Arg165, Lys169, Lys230 en la numeración de quimotripsina). Los ejemplos de dichos mutantes se describen en Rudolph, A.E. y col., J. Bio. Chem., 2001, 276: 5123-5128. Además, mutaciones en residuos de fXa que se sabe que son importante para la interacción fVIII/fVIIIa, tales como Arg424 en la SEQ ID NO. 3 y 7 (Arg240 en numeración de quimotripsina), también pueden usarse como antídotos de inhibidores de fXa. Los ejemplos de dichos mutantes se describen en Nogami, K. y col., J. Biol. Chem., 2004, 279(32): 33104-33113.
Otra modificación de residuos del sitio activo de fXa o residuos que se sabe que son importantes para interacciones 5 con serina proteasa también pueden conducir a antídotos útiles de esta divulgación, por ejemplo, sustitución de Glu216, Glu218, y Arg332 en la SEQ ID NO. 3 y 7 (Glu37, Glu39 y Arg150 en numeración de quimotripsina, respectivamente) con otros residuos de aminoácido.
En una realización, la actividad procoagulante residual de un antídoto, según lo evaluado mediante ensayo de 10 escisión de sustrato amidolítico, es < 1%, preferentemente < 0,1%, más preferentemente < 0,05 % de fXa nativo derivado de plasma humano. Por ejemplo, no hay ninguna actividad procoagulante medible para fXa-S379A recombinante cuando el sitio activo Ser379 (S195 en numeración de quimotripsina) es sustituido por un residuo de alanina según lo medido mediante ensayos de coagulación.
15
La invención se refiere además a secuencias de ácido nucleico, en particular secuencias de ADN, que codifican los derivados de fXa descritos anteriormente. Éstas pueden determinarse fácilmente traduciendo la secuencia polipeptídica de vuelta a la secuencia de ADN correspondiente de acuerdo con el código genético. Los codones usados preferentemente son aquellos que causan la expresión correcta en el organismo huésped requerido. Las secuencias de ácido nucleico pueden prepararse mediante mutagénesis específica de sitio comenzando a partir de 20 la secuencia génica de fXa natural o incluso mediante síntesis de ADN completo.
Polipéptidos de la invención
La invención se refiere a un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 12, 25 13 o 15. También están abarcados por esta divulgación polipéptidos que tienen al menos el 80% de homología con la SEQ ID NO. 12, 13 o 15.
Los polipéptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos de la invención pueden prepararse expresando polinucleótidos que codifican las secuencias polipeptídicas de esta invención en una célula huésped apropiada. Esto 30 puede conseguirse mediante procedimientos de tecnología de ADN recombinante conocidos por los expertos en la materia. Por consiguiente, esta invención también proporciona procedimientos para producir de forma recombinante los polipéptidos de esta invención en una célula huésped eucariota o procariota. Las proteínas y polipéptidos de esta invención también pueden obtenerse mediante síntesis química usando un sintetizador de péptidos automatizado disponible en el mercado tal como los fabricados por Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc., Modelo 430A o 431A, 35 Foster City, CA, EE. UU. La proteína o polipéptido sintetizado pueden precipitarse y purificarse adicionalmente, por ejemplo mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Por consiguiente, esta divulgación también proporciona un proceso para sintetizar químicamente las proteínas de esta invención proporcionando la secuencia de la proteína y reactivos, tales como aminoácidos y enzimas y uniendo entre sí los aminoácidos en la orientación y la secuencia lineal apropiadas. 40
Es conocido para los expertos en la materia que pueden realizarse modificaciones a cualquier péptido para proporcionarle propiedades alteradas. Los polipéptidos de la invención pueden modificarse para incluir aminoácidos no naturales. Por lo tanto, los péptidos pueden comprender D-aminoácidos, una combinación de D- y L-aminoácidos, y diversos aminoácidos “de diseño” (por ejemplo, β-metil aminoácidos, C-α-metil aminoácidos, y N-α-metil 45 aminoácidos, etc.) para llevar propiedades especiales a péptidos. Adicionalmente, asignando aminoácidos específicos en etapas de acoplamiento específicas, pueden generarse péptidos con hélices α, giros β, láminas β, giros α, y péptidos cíclicos. Generalmente, se cree que se prefiere estructura secundaria α-helicoidal o estructura secundaria aleatoria.
50
En una realización adicional de la divulgación, se seleccionarán subunidades de polipéptidos que otorgan propiedades químicas y estructurales útiles. Por ejemplo, péptidos que comprenden D-aminoácidos pueden ser resistentes a proteasas específicas de L-aminoácidos in vivo. Compuestos modificados con D-aminoácidos pueden sintetizarse con los aminoácidos alineados en orden inverso para producir los péptidos de la invención como péptidos retro-inversos. Además, la presente divulgación prevé preparar péptidos que tienen propiedades 55 estructurales mejor definidas, y el uso de peptidomiméticos, y enlaces peptidomiméticos, tales como enlaces éster, para preparar péptidos con propiedades novedosas. En otra realización, puede generarse un péptido que incorpore un enlace peptídico reducido, es decir, R1-CH2NH-R2, donde R1, y R2 son residuos o secuencias de aminoácido. Un enlace peptídico reducido puede introducirse como una subunidad dipéptido. Dicha molécula sería resistente a hidrólisis de enlaces peptídicos, por ejemplo, actividad proteasa. Dichas moléculas proporcionarían ligandos con función y actividad únicas, tales como semividas prolongadas in vivo debido a resistencia a descomposición metabólica, o actividad proteasa. Además, es bien conocido que, en ciertos sistemas, péptidos constreñidos muestran actividad funcional mejorada (Hruby (1982) Life Sciences 31: 189-199 y Hruby y col., (1990) Biochem J. 268: 249-262); la presente divulgación proporciona un procedimiento para producir un péptido constreñido que 5 incorpora secuencias aleatorias en todas las demás posiciones.
Los siguientes aminoácidos no convencionales pueden incorporarse en los péptidos de la invención para introducir motivos conformacionales particulares: 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato (Kazrnierski y col., (1991) J. Am. Chem. Soc. 113: 2275-2283. ); (2S, 3S)-metil-fenilalanina, (2S, 3R)-metil-fenilalanina, (2R, 3S)-metil-fenilalanina y 10 (2R, 3R)-metil-fenilalanina (Kazmierski y Hruby (1991) Tetrahedron Lett 32 (41): 5769-5772); ácido 2-aminotetrahidronaftaleno-2-carboxílico (Landis (1989) Tesis Doctoral, Universidad de Arizona); hidroxi-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilato (Miyake y col., (1989) J. Takeda Res Labs. 43:53-76) ácido carboxílico de histidina e isoquinolina (Zechel y col., (1991) Int. J. Pep Protein Res 38 (2): 131-138); e HIC (histidina urea cíclica), (Dharanipragada y col., (1993) Int. J. Pep. Protein Res 42 (1): 68-77)) y (Dharanipragada y col., (1992) Acta. 15 Crystallogr. C. 48: 1239-1241).
Los siguientes análogos de aminoácido y peptidomiméticos pueden incorporarse en un péptido para inducir o favorecer estructuras secundarias específicas: LL-Acp (ácido LL-3-amino-2-propenidona-6-carboxílico), un análogo de dipéptido que induce giros β (Kemp y col., (1985) J. Org. Chem. 50: 5834-5838); análogos que inducen lámina β 20 (Kemp y col., (1988) Tetrahedron Lett. 29: 5081-5082); análogos que inducen giro β (Kemp y col., (1988) Tetrahedron Lett. 29: 5057-5060); análogos que inducen hélice α (Kemp y col., (1988) Tetrahedron Lett. 29: 4935-4938); análogos que inducen giro α (Kemp y col., (1989) J. Org. Chem. 54: 109:115); análogos proporcionados por las siguientes referencias: Nagai y Sato (1985) Tetrahedron Lett. 26: 647-650; y DiMaio y col., (1989) J. Chem. Soc. Perkin Trans. p. 1687; un análogo de giro Gly-Ala (Kahn y col., (1989) Tetrahedron Lett. 30: 2317); isóstero de 25 enlace amida (Clones y col., (1988) Tetrahedron Lett. 29: 3853-3856); tetrazol (Zabrocki y col., (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 5875-5880); DTC (Samanen y col., (1990) Int. J. Protein Pep. Res. 35: 501:509); y análogos enseñados en Olson y col., (1990) J. Am. Chem. Sci. 112: 323-333 y Garvey y col., (1990) J. Org. Chem. 56: 436. Miméticos restringidos conformacionalmente de giros beta y protuberancias beta, y péptidos que los contienen, se describen en la patente de Estados Unidos N.º 5.440.013, expedida el 8 de agosto de 1995 a Kahn. 30
Es conocido por los expertos en la materia que pueden realizarse modificaciones a cualquier péptido sustituyendo uno o más aminoácidos con uno o más aminoácidos funcionalmente equivalentes que no alteran la función biológica del péptido. En un aspecto de la divulgación, el aminoácido que es sustituido por un aminoácido que posee propiedades intrínsecas similares incluyendo, aunque sin limitación, hidrofobicidad, tamaño o carga. Procedimientos 35 usados para determinar el aminoácido apropiado a sustituir y por qué aminoácido, son conocidos para un experto en la materia. Los ejemplos no limitantes incluyen modelos de sustitución empíricos tal como se describe por Dahoff y col., (1978) en Atlas of Protein Sequence and Structure Vol. 5 supl. 2 (ed. M.O. Dayhoff), págs. 345-352. National Biomedical Research Foundation, Washington DC; Matrices PAM incluyendo matrices de Dayhoff (Dahoff y col., (1978), supra, o matrices JTT tal como se describe por Jones y col., (1992) Comput. Appl. Biosci. 8: 275-282 y 40 Gonnet y col., (1992) Science 256: 1443-1145; el modelo empírico descrito por Adach y Hasegawa (1996) J. Mol. Evol. 42: 459-468; las matrices de sustitución de bloques (BLOSUM) según lo descrito por Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 89:109; modelos de Poisson según lo descrito por Nei (1987) Molecular Evolutionary Genetics. Columbia University Press, New York.; y el procedimiento de la Máxima Probabilidad (ML) según lo descrito por Muller y col., (2002) Mol. Biol. Evol. 19: 8-13. 45
Conjugados polipeptídicos
Los polipéptidos y complejos polipeptídicos de la divulgación pueden usarse en diversas formulaciones, que pueden variar dependiendo del uso pretendido. Por ejemplo, uno o más pueden estar enlazados (complejados) de forma 50 covalente o no covalente a diversas otras moléculas, cuya naturaleza puede variar dependiendo del fin particular. Por ejemplo, un péptido de la invención puede complejarse de forma covalente o no covalente con un transportador macromolecular, incluyendo, aunque sin limitación, polímeros, proteínas, polisacáridos, polipéptidos (aminoácidos), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, y lípidos naturales y sintéticos. Un péptido puede estar conjugado a un ácido graso, para introducción en un liposoma, véase la patente de Estados Unidos N.º 5.837.249. Un péptido de la 55 invención puede complejarse de forma covalente o no covalente con un soporte sólido, de los cuales se conoce una variedad en la técnica y se describen en el presente documento. Un epítopo de péptido antigénico de la invención puede estar asociado con una matriz de presentación de antígenos tal como un complejo MHC con o sin moléculas coestimuladoras.
Los ejemplos de transportadores de proteína incluyen, aunque sin limitarse a, superantígenos, albúmina de suero, toxoide tetánico, ovoalbúmina, tiroglobulina, mioglobulina e inmunoglobulina.
Polímeros transportadores de péptido-proteína pueden formarse usando agentes de reticulación convencionales 5 tales como carbodiimidas. Son ejemplos de carbodiimidas 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil) carbodiimida (CMC), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y 1-etil-3-(4-azonia-44-dimetilpentil) carbodiimida.
Son ejemplos de otros agentes de reticulación adecuados bromuro de cianógeno, glutaraldehído y anhídrido succínico. En general, cualquiera de una serie de agentes homobifuncionales incluyendo un aldehído 10 homobifuncional, un epóxido homobifuncional, un imido-éster homobifuncional, un éster de N-hidroxisuccinimida homobifuncional, una maleimida homobifuncional, un haluro de alquilo homobifuncional, un disulfuro de piridilo homobifuncional, un haluro de arilo homobifuncional, una hidrazida homobifuncional, un derivado de diazonio homobifuncional y un compuesto fotorreactivo homobifuncional pueden utilizarse. También se incluyen compuestos heterobifuncionales, por ejemplo, compuestos que tienen un amina-reactivo y un grupo sulfhidrilo-reactivo, 15 compuestos con un amina-reactivo y un grupo fotorreactivo y compuestos con un carbonilo-reactivo y un grupo sulfhidrilo-reactivo.
Ejemplos específicos de dichos agentes de reticulación homobifuncionales incluyen los ditiobis N-hidroxisuccinimida ésteres (succinimidilpropionato) bifuncionales, suberato de disuccinimidilo, y tartrato de disuccinimidilo; los imido-20 ésteres de adipimidato de dimetilo bifuncionales, pimelimidato de dimetilo, y suberimidato de dimetilo; los agentes de reticulación sulfhidrilo-reactivo bifuncionales 1,4-di-[3'-(2'-piridilditio)propionamido]butano, bismaleimidohexano, y bis-N-maleimido-1,8-octano; los haluros de arilo bifuncionales 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno y 4,4'-difluoro-3,3'-dinitrofenulsulfona; agentes fotorreactivos bifuncionales tales como bis-[b-(4-azidosalicilamido)etil]disulfuro; los aldehídos bifuncionales formaldehído, malondialdehído, succinaldehído, glutaraldehído y adipaldehído; un epóxido 25 bifuncional tal como 1,4-butanodiol diglicidil éter; la hidrazidas bifuncionales dihidrazida de ácido adípico, carbohidrazida y dihidrazida de ácido succínico; los diazonios bifuncionales o-tolidina, diazotan y bencidina bis-diazotan; los haluros de alquilo bifuncionales N1N'-etilen-bis(yodoacetamida), N1N'-hexametilen-bis (yodoacetamida), N1N'-undecametilen-bis(yodoacetamida), así como haluros de bencilo y halomostazas, como ácido ala'-diyodo-p-xileno sulfónico y tri(2-cloroetil)amina, respectivamente. 30
Los ejemplos de agentes de reticulación heterobifuncionales comunes que pueden usarse para efectuar la conjugación de proteínas a péptidos incluyen, aunque sin limitarse a, SMCC (succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), MBS (m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster), SIAB (N-succinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato), SMPB (succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato), GMBS (N-(γ-35 maleimidobutiriloxi)succinimida éster), MPBH hidrazida de ácido (4-(4-N-maleimidofenil) butírico), M2C2H (4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilo-hidrazida), SMPT (succinimidiloxicarbonil-α-metil-α-(2-piridilditio)tolueno), y SPDP (3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo).
La reticulación puede conseguirse acoplando un grupo carbonilo a un grupo amino o un grupo hidrazida mediante 40 aminación reductora.
Los péptidos de la invención también se pueden formular como unión no covalente de monómeros a través de interacciones iónicas, de adsorción o bioespecíficas. Los complejos de péptidos con moléculas altamente cargadas positiva o negativamente se pueden realizar a través de la formación de puentes de sal en ambientes de fuerza 45 iónica baja, tales como en agua desionizada. Pueden crearse complejos grandes usando polímeros cargados tales como ácido poli-(L-glutámico) o poli-(L-lisina) que contienen numerosas cargas negativas y positivas, respectivamente. La adsorción de péptidos se puede realizar a superficies tales como perlas de látex de micropartículas o a otros polímeros hidrófobos, formando complejos de péptido-superantígeno asociados no covalentemente que imitan de manera efectiva la proteína reticulada o polimerizada químicamente. Finalmente, los 50 péptidos pueden estar enlazados no covalentemente a través del uso de interacciones bioespecíficas entre otras moléculas. Por ejemplo, la utilización de la fuerte afinidad de la biotina por proteínas tales como avidina o estreptavidina o sus derivados se podría utilizar para formar complejos peptídicos. Estas proteínas de unión a biotina contienen cuatro sitios de unión que pueden interactuar con biotina en solución o unirse covalentemente a otra molécula. (Véase Wilchek (1988) Anal Biochem 171: 1-32). Los péptidos pueden ser modificados para poseer 55 grupos biotina usando reactivos de biotinilación comunes tales como el éster de N-hidroxisuccinimidilo de D-biotina (NHS-biotina) que reacciona con los grupos amino disponibles de la proteína. Péptidos biotinilados pueden ser incubados a continuación con avidina o estreptavidina para crear complejos grandes. La masa molecular de dichos polímeros puede ser regulada a través de un control cuidadoso de la relación molar del péptido biotinilado con respecto a la avidina o estreptavidina.
También se proporcionan mediante esta solicitud los péptidos y polipéptidos descritos en el presente documento conjugados a una etiqueta, por ejemplo, una etiqueta fluorescente o bioluminiscente, para uso en los procedimientos de diagnóstico. Por ejemplo, péptidos y polipéptidos etiquetados de forma detectable pueden estar unidos a una 5 columna y usarse para la detección y purificación de anticuerpos. Las etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen, aunque sin limitarse a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde Malaquita, estilbeno, Lucifer Yellow, Cascade Blue ™, y Rojo Texas. Otros colorantes ópticos adecuados se describen en Haugland, Richard P. (1996) Molecular Probes Handbook.
10
Los polipéptidos de esta invención también pueden combinarse con diversos transportadores en fase líquida, tales como soluciones estériles o acuosas, transportadores farmacéuticamente aceptables, suspensiones y emulsiones. Los ejemplos de disolventes no acuosos incluyen propiletilenglicol, polietilenglicol y aceites vegetales. Cuando se usan para preparar anticuerpos, los transportadores también pueden incluir un adyuvante que es útil para aumentar inespecíficamente una respuesta inmunitaria específica. Un experto en la materia puede determinar fácilmente si se 15 requiere un adyuvante y seleccionar uno. Sin embargo, para fin de ilustración solamente, los adyuvantes adecuados incluyen, aunque sin limitarse a, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund y sales minerales.
Células huésped
20
También son proporcionadas por la divulgación células huésped que comprenden uno o más de los polipéptidos de esta invención. En un aspecto, los polipéptidos se expresan y presentan en la superficie celular (de forma extracelular). Células adecuadas que contienen los polipéptidos de la invención incluyen células procariotas y eucariotas, que incluyen, aunque sin limitarse a, células bacterianas, células de levadura, células de insecto, células animales, células de mamífero, células murinas, células de rata, células de oveja, células de simio y células 25 humanas. Los ejemplos de células bacterianas incluyen Escherichia coli, Salmonella enterica y Streptococcus gordonii. Las células pueden adquirirse de un proveedor comercial tales como la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville Maryland, EE. UU.) o cultivarse a partir de un aislado usando procedimientos conocidos en la técnica. Los ejemplos de células eucariotas adecuadas incluyen, aunque sin limitarse a, células 293T HEK, así como la línea celular de hámster CHO, BHK-21; las líneas celulares murinas designadas NIH3T3, NS0, C127, las líneas 30 celulares de simio COS, Vero; y las líneas celulares humanas HeLa, PER.C6 (disponible en el mercado de Crucell) U-937 y Hep G2. Un ejemplo no limitante de células de insecto incluyen Spodoptera frugiperda. Los ejemplos de levaduras útiles para la expresión incluyen, aunque sin limitarse a Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Torulopsis, Yarrowia o Pichia. Véase por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.º 4.812.405; 4.818.700; 4.929.555; 5.736.383; 5.955.349; 5.888.768 y 6.258.559. 35
Además de especificidad de especie, las células pueden ser de cualquier tipo de tejido particular tal como neuronal o como alternativa una célula madre somática o embrionaria tal como una célula madre que puede o no puede diferenciarse en una célula neuronal, por ejemplo, célula madre embrionaria, célula madre adiposa, célula madre neuronal y célula madre hematopoyética. La célula madre puede ser de origen humano o animal, tal como de 40 mamífero.
Polinucleótidos aislados y composiciones
Esta divulgación también proporciona los polinucleótidos complementarios a las secuencias identificadas 45 anteriormente o sus complementos. La complementariedad puede determinarse usando hibridación tradicional en condiciones de astringencia moderada o alta. Tal como se usa en el presente documento, el término polinucleótido pretende ADN y ARN así como nucleótidos modificados. Por ejemplo, esta invención también proporciona la cadena de polinucleótido antisentido, por ejemplo ARN antisentido a estas secuencias o sus complementos.
50
También son proporcionados por la divulgación polinucleótidos que codifican polipéptidos sustancialmente homólogos y biológicamente equivalentes a los polipéptidos y complejos polipeptídicos de la invención. Sustancialmente homólogos y biológicamente equivalentes pretende incluir aquellos que tienen grados de homología variables, tales como al menos el 65%, o como alternativa, al menos el 70%, o como alternativa, al menos el 75%, o como alternativa al menos el 80%, o como alternativa, al menos el 85%, o como alternativa al menos el 90%, o como 55 alternativa, al menos el 95%, o como alternativa al menos el 97% homólogos, tal como se ha definido anteriormente, y que codifican polipéptidos que tienen la actividad biológica para unirse a inhibidores del factor Xa y no se ensamblan en el complejo de protrombinasa, tal como se describe en el presente documento. Debe entenderse, aunque no siempre se afirme explícitamente, que realizaciones para polipéptidos y polinucleótidos sustancialmente homólogos están destinadas para cada aspecto de esta invención, por ejemplo, polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos.
Los polinucleótidos de esta invención pueden replicarse usando técnicas recombinantes convencionales. Como alternativa, los polinucleótidos pueden replicarse usando tecnología de PCR. La PCR es el asunto de las patentes de 5 Estados Unidos N.º 4.683.195; 4.800.159; 4.754.065; y 4.683.202 y se describe en PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis y col., eds, Birkhauser Press, Boston (1994)) y referencias citadas en ese documento. Es más, un experto en la materia puede usar las secuencias proporcionadas en el presente documento y un sintetizador de ADN comercial para replicar el ADN. Por consiguiente, esta divulgación también proporciona un proceso para obtener los polinucleótidos de esta invención proporcionando la secuencia lineal del polinucleótido, moléculas de cebador 10 apropiadas, productos químicos tales como enzimas e instrucciones para su replicación y replicar o enlazar químicamente los nucleótidos en la orientación apropiada para obtener los polinucleótidos. En una realización diferente de la divulgación, estos polinucleótidos se aíslas adicionalmente. Es más, un experto en la materia puede enlazar de forma operativa los polinucleótidos a secuencias reguladoras para su expresión en una célula huésped. Los polinucleótidos y las secuencias reguladoras se insertan en la célula huésped (procariota o eucariota) para 15 replicación y amplificación. El ADN amplificado de este modo puede aislarse de la célula mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Un proceso para obtener polinucleótidos mediante este procedimiento se proporciona adicionalmente en el presente documento así como los polinucleótidos obtenidos de este modo.
Puede obtenerse ARN insertando en primer lugar un polinucleótido de ADN en una célula huésped procariota o 20 eucariota adecuada. El ADN puede insertarse mediante cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, mediante el uso de un vehículo de suministro de genes apropiado (por ejemplo, liposoma, plásmido o vector) o mediante electroporación. Cuando la célula se replica y el ADN es transcrito a ARN; el ARN puede aislarse a continuación usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, tal como se describe en Sambrook y Russell (2001) sura. Por ejemplo, puede aislarse mARN usando diversas enzimas líticas o soluciones 25 químicas de acuerdo con los procedimientos descritos en Sambrook y Russell (2001) supra o extraerse mediante resinas de unión a ácido nucleico siguiendo las instrucciones adjuntas proporcionadas por los fabricantes.
En un aspecto de la divulgación, el ARN es ARN interferente pequeño, también conocido como siARN. Los procedimientos para preparar y cribar ARN interferente y seleccionarlo por la capacidad de bloquear la expresión de 30 polinucleótidos se conocen en la técnica y ejemplos no limitantes de los mismos se muestran a continuación Estos ARN interferentes son proporcionados por esta divulgación.
Las secuencias de siARN pueden diseñarse obteniendo la secuencia de mARN diana y determinando una secuencia complementaria de siARN apropiada. Los siARN de la divulgación están diseñados para interactuar con una 35 secuencia diana, lo que significa que complementan una secuencia diana suficientemente para hibridar con esa secuencia. Un siARN puede ser el 100% idéntico a la secuencia diana. Sin embargo, la homología de la secuencia de siARN con la secuencia diana puede ser menor del 100% siempre que el siARN pueda hibridar con la secuencia diana. Por lo tanto, por ejemplo, la molécula de siARN puede ser al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica a la secuencia diana o el complemento de la secuencia diana. Por lo tanto, 40 también pueden usarse moléculas de siARN con inserciones, deleciones o mutaciones puntuales individuales con respecto a una diana. La generación de varias secuencias de siARN diferentes por mARN diana se recomienda para permitir el cribado para la secuencia diana óptima. Una búsqueda de homología, tal como una búsqueda BLAST, debe realizarse para garantizar que la secuencia de siARN no contiene homología a ningún gen de mamífero conocido. 45
En general, es preferible que la secuencia diana esté ubicada a al menos 100-200 nucleótidos del codón de inicio AUG y al menos a 50-100 nucleótidos del codón de terminación del mARN diana (Duxbury (2004) J. Surgical Res. 117: 339-344).
50
Los investigadores han determinado que ciertas características son comunes en moléculas de siARN que silencian eficazmente su gen diana (Duxbury (2004) J. Surgical Res. 117: 339-344; Ui-Tei y col., (2004) Nucl. Acids Res. 32: 936-48). Como guía general, siARN que incluyen una o más de las siguientes condiciones son particularmente útiles en silenciación de genes en células de mamífero: proporción GC de entre 45-55%, sin series de más de 9 residuos G/C, G/C en el extremo 5' de la cadena sentido; A/U en el extremo 5' de la cadena antisentido; y al menos 5 residuos 55 A/U en las primeras 7 bases del extremo 5' de la cadena antisentido.
Los siARN son, en general, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, el siARN puede ser de 10-30 nucleótidos de largo, 12-28 nucleótidos de largo, 15-25 nucleótidos de largo, 19-23 nucleótidos de largo o 21-23 nucleótidos de largo. Cuando un siARN contiene dos cadenas de diferentes longitudes, la más larga de las cadenas designa la longitud del siARN. En esta situación, los nucleótidos no emparejados de la cadena más larga formarían un saliente.
El término siARN incluye ARN de horquilla corto (shARN). Los shARN comprenden una única cadena de ARN que 5 forma una estructura tallo-bucle, donde el tallo consiste en las cadenas sentido y antisentido complementarias que comprenden un siARN bicatenario, y el bucle es un enlazador de tamaño variable. La estructura del tallo de los shARN generalmente es de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleótidos de largo. Por ejemplo, el tallo puede ser de 10-30 nucleótidos de largo, 12-28 nucleótidos de largo, 15-25 nucleótidos de largo, 19-23 nucleótidos de largo o 21-23 nucleótidos de largo. 10
Herramientas para ayudar al diseño de siARN están fácilmente disponibles para el público. Por ejemplo, una herramienta de diseño de siARN basado en ordenador está disponible en internet en www.dharmacon.com, último acceso el 26 de noviembre de 2007.
15
Síntesis de dsARN y siARN
dsARN y siARN pueden sintetizarse química o enzimáticamente in vitro tal como se describe en Micura (2002) Agnes Chem. Int. Ed. Emgl. 41: 2265-2269; Betz (2003) Promega Notes 85: 15-18; y Paddison y Hannon (2002) Cancer Cell. 2: 17-23. La síntesis química puede realizarse mediante procedimientos manuales o automatizados, 20 ambos de los cuales se conocen bien en la técnica, tal como se describe en Micura (2002), supra. El siARN también puede expresarse de forma endógena dentro de las células en forma de shARN tal como se describe en Yu y col., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 99: 6047-6052; y McManus y col., (2002) RNA 8: 842-850. La expresión endógena se ha conseguido usando sistemas de expresión basados en plásmido usando pequeños promotores de ARN nuclear, tales como ARN polimerasa III U6 o H1, o ARN polimerasa II U1 tal como se describe en 25 Brummelkamp y col., (2002) Science 296: 550-553 (2002); y Novarino y col., (2004) J. Neurosci. 24: 5322-5330.
La síntesis enzimática in vitro de dsARN y siARN puede realizarse usando un proceso mediado por ARN polimerasa para producir cadenas sentido y antisentido individuales que se hibridan in vitro antes del suministro al interior de las células elegidas, tal como se describe en Fire y col., (1998) Nature 391: 806-811; Donze y Picard (2002) Nucl. Acids 30 Res. 30(10): e46; Yu y col., (2002); y Shim y col., (2002) J. Biol. Chem. 277: 30413-30416. Varios fabricantes (Promega, Ambion, New England Biolabs, y Stragene) producen kits de transcripción útiles para realizar la síntesis in vitro.
La síntesis in vitro de siARN puede conseguirse, por ejemplo, usando un par de oligonucleótidos dobles cortos que 35 contienen promotores de T7 ARN polimerasa cadena arriba de las secuencias de ARN sentido y antisentido como plantilla de ADN. Cada oligonucleótido del dúplex es una plantilla diferente para la síntesis de una cadena del siARN. Las cadenas de ARN cortas diferentes que se sintetizan se hibridan a continuación para formar siARN tal como se describe en Protocols and Applications, Chapter 2: RNA interference, Promega Corporation, (2005).
40
La síntesis in vitro de dsARN puede conseguirse, por ejemplo, usando un promotor de T7 ARN polimerasa en los extremos 5' de ambas cadenas de la secuencia diana de ADN. Esto se consigue usando plantillas de ADN diferentes, que contienen, cada una, la secuencia diana en una orientación diferente con respecto al promotor T7, transcritas en dos reacciones diferentes. Los transcritos resultantes se mezclan e hibridan de forma posttranscripcional. Plantillas de ADN usadas en esta reacción pueden crearse mediante PCR o usando dos 45 plantillas de plásmido linealizadas, que contienen, cada una, el promotor de T7 polimerasa en un extremo diferente de la secuencia diana. Protocols and Applications, Chapter 2: RNA interference, Promega Corporation, (2005).
Para expresar las proteínas descritas en el presente documento, el suministro de secuencias de ácido nucleico que codifican el gen de interés pueden suministrarse mediante varias técnicas. Ejemplos de los cuales incluyen 50 tecnologías virales (por ejemplo vectores retrovirales, vectores de adenovirus, vectores de virus adenoasociados, vectores de alfavirus y similares) y tecnologías no virales (por ejemplo complejos ADN/liposoma, micelas y complejos de proteína-ADN viral dirigidos) tal como se describe en el presente documento. Una vez dentro de la célula de interés, la expresión del transgén puede estar bajo el control de promotores ubicuos (por ejemplo EF-1α) o promotores específicos de tejido (por ejemplo el promotor de calcio calmodulina quinasa 2 (CaMKI), promotor NSE y 55 promotor Thy-1 humano). Como alternativa, los niveles de expresión pueden controlarse mediante el uso de un sistema promotor inducible (por ejemplo promotor Tet on/off) tal como se describe en Wiznerowicz y col., (2005) Stem Cells 77: 8957-8961.
Los ejemplos no limitantes de promotores incluyen, aunque sin limitarse a, el promotor de citomegalovirus (CMV) (Kaplitt y col., (1994) Nat. Genet. 8: 148-154), promotor CMV/humano β3-globina (Mandel y col., (1998) J. Neurosci. 18: 4271-4284), promotor NCX1, promotor αMHC, promotor MLC2v, promotor GFAP (Xu y col., (2001) Gene Ther., 8: 1323-1332), el promotor de enolasa específica de neuronas de 1,8-kb (NSE) (Klein y col., (1998) Exp. Neurol. 150: 183-194), el promotor de beta actina de pollo (CBA) (Miyazaki (1989) Gene 79: 269-277) y el promotor de β-5 glucuronidasa (GUSB) (Shipley y col., (1991) Genetics 10: 1009-1018), el promotor de albúmina de suero humano, el promotor de alfa-1-antitripsina. Para mejorar la expresión, otros elementos reguladores pueden unirse adicionalmente de forma operativa al transgén, tales como, por ejemplo, el elemento post-regulador del virtus e la Hepatitis de marmota (WPRE) (Donello y col., (1998) J. Virol. 72: 5085-5092) o el sitio de poliadenilación de hormona del crecimiento bovina (BGH). 10
También se proporciona por la divulgación una sonda o cebador de polinucleótidos que comprende al menos 10, o como alternativa, al menos17 o como alternativa al menos 20, o como alternativa, al menos 50, o como alternativa, al menos 75 polinucleótidos, o como alternativa al menos 100 polinucleótidos que codifican las SEQ ID NO: 12 a 15 o sus complementos. Sondas y cebadores adecuados se han descrito supra. En la técnica se conoce que una sonda 15 “perfectamente emparejada” no es necesaria para una hibridación específica. Cambios secundarios en la secuencia de la sonda conseguidos mediante sustitución, deleción o inserción de un pequeño número de bases no afectan a la especificidad de hibridación. En general, puede tolerarse hasta el 20% de emparejamiento erróneo de pares de bases (cuando están alineadas de forma óptima). Una sonda útil para detectar el mARN mencionado anteriormente es al menos aproximadamente el 80% idéntica a la región homóloga de tamaño comparable contenida en las 20 secuencias identificadas previamente (identificadas anteriormente) que corresponden a polinucleótidos caracterizados previamente de esta invención. Como alternativa, la sonda es el 85% idéntica a la secuencia génica correspondiente después del alineamiento de la segundo homóloga; y es más, muestra un 90% de identidad, o aún más, al menos el 95% idéntica.
25
Estas sondas pueden usarse en radioensayos (por ejemplo análisis por transferencia de Southern y Northern) para detectar o monitorizar la expresión de los polinucleótidos o polipéptidos de esta invención. Las sondas también pueden unirse a un soporte sólido o una matriz tal como un chip para uso en ensayos de cribado de alto rendimiento para la detección de la expresión del gen correspondiente a uno o más polinucleótidos de esta invención.
30
Los polinucleótidos y fragmentos de los polinucleótidos de la presente divulgación también pueden servir como cebadores para la detección de genes o transcritos de genes que se expresan en células neuronales, por ejemplo, para confirmar la transducción de los polinucleótidos en células huésped. En este contexto, amplificación significa cualquier procedimiento que emplea una polimerasa dependiente de cebador capaz de replicar una secuencia diana con fidelidad razonable. La amplificación puede llevarse a cabo mediante ADN polimerasas naturales o 35 recombinantes tales como T7 ADN polimerasa, fragmento de Klenow de ADN polimerasa de E. coli, y transcriptasa inversa. La longitud del cebador es la misma que la identificada para sondas, anteriormente.
La divulgación proporciona además los polinucleótidos aislados enlazados de forma operativa a un promotor de la transcripción de ARN, así como otras secuencias reguladoras para replicación y/o expresión transitoria o estable del 40 ADN o ARN. Tal como se usa en el presente documento, la expresión “enlazado de forma operativa” significa posicionado de tal manera que el promotor dirigirá la transcripción de ARN de la molécula de ADN. Los ejemplos de dichos promotores son SP6, T4 y T7. En ciertas realizaciones, se usan promotores específicos de células para expresión específica de células del polinucleótido insertado. Vectores que contienen un promotor o un promotor/potenciador, con codones de terminación y secuencias marcadoras seleccionables, así como un sitio de 45 clonación en el que un trozo insertado de ADN puede estar enlazado de forma operativa a ese promotor, se conocen bien en la técnica y están disponibles en el mercado. Para estrategias de metodología y clonación generales, véase Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press, Inc. (1991)) y referencias citadas en ese documento y Vectors: Essential Data Series (Gacesa and Ramji, eds., John Wiley & Sons, N.Y. (1994)), que contiene mapas, propiedades funcionales, proveedores comerciales y una referencia a los números de entrada de GenEMBL para 50 diversos vectores adecuados. Preferentemente, estos vectores son capaces de transcribir ARN in vitro o in vivo.
Los vectores de expresión que contienen estos ácidos nucleicos son útiles para obtener sistemas de vectores huésped para producir proteínas y polipéptidos. Se da a entender que estos vectores de expresión deben ser replicables en los organismos huésped ya sea como episomas o como una parte integrante del ADN cromosómico. 55 Los vectores de expresión adecuados incluyen plásmidos, vectores virales, incluyendo adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, cósmidos, etc. Los vectores adenovirales son particularmente útiles para introducir genes en los tejidos in vivo debido a sus altos niveles de expresión y la transformación eficiente de células tanto in vitro como in vivo. Cuando se inserta un ácido nucleico en una célula huésped adecuada, por ejemplo, una célula procariota o una eucariota y la célula huésped se replica, la proteína puede producirse de forma recombinante. Las células huésped adecuadas dependerán del vector y pueden incluir células de mamífero, células animales, células humanas, células de simio, células de insecto, células de levadura y células bacterianas, tal como se ha descrito anteriormente y construirse usando procedimientos bien conocidos. Véase Sambrook y Russell (2001), supra. Además del uso de un vector viral para la inserción de un ácido nucleico exógeno en las células, el ácido nucleico se 5 puede insertar en la célula huésped mediante procedimientos bien conocidos en la técnica tales como la transformación de células bacterianas; transfección usando precipitación con fosfato cálcico para células de mamífero; DEAE-dextrano; electroporación; o microinyección. Véase Sambrook y Russell (2001), supra para esta metodología.
10
La presente divulgación también proporciona vehículos de suministro adecuados para el suministro de un polinucleótido de la invención al interior de células (ya sea in vivo, ex vivo o in vitro). Un polinucleótido de la invención puede estar contenido dentro de un vehículo de suministro de genes, un vector de clonación o un vector de expresión. Estos vectores (especialmente vectores de expresión) pueden ser manipulados, a su vez, para asumir cualquiera de una serie de formas que pueden, por ejemplo, facilitar el suministro a y/o la entrada en una célula. 15
Estas células huésped aisladas que contienen los polinucleótidos de esta divulgación son útiles para la replicación recombinante de los polinucleótidos y para la producción recombinante de péptidos y para cribado de alto rendimiento.
20
Los polinucleótidos de esta divulgación pueden conjugarse a una etiqueta detectable o combinarse con un transportador tal como un soporte sólido o transportador farmacéuticamente aceptable. Los soportes sólidos adecuados se han descrito anteriormente al igual que las etiquetas adecuadas. Procedimientos para unir una etiqueta a un polinucleótido son conocidos por los expertos en la materia. Véase Sambrook y Russell (2001), supra.
25
Composiciones de anticuerpos terapéuticas
Esta divulgación también proporciona un anticuerpo capaz de formar específicamente un complejo con una proteína o polipéptido de esta invención, que son útiles en los procedimientos terapéuticos. El término “anticuerpo” incluye anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, así como derivados de los mismos 30 (descritos anteriormente). Los anticuerpos incluyen, aunque no se limitan a, anticuerpos de ratón, rata, y conejo o humanos. Los anticuerpos pueden ser producidos en cultivo celular, en un fago, o en diversos animales, incluyendo aunque sin limitarse a, vacas, conejos, cabras, ratones, ratas, hámsteres, cobayas, ovejas, perros, gatos, monos, chimpancés, simios, etc. los anticuerpos también son útiles para identificar y purificar polipéptidos terapéuticos.
35
Esta divulgación también proporciona un complejo anticuerpo-péptido que comprende los anticuerpos descritos anteriormente y un polipéptido que se une específicamente al anticuerpo. En un aspecto de la divulgación, el polipéptido es el polipéptido contra el cual se generó el anticuerpo. En un aspecto de la divulgación, el complejo anticuerpo-péptido es un complejo aislado. En un aspecto adicional de la divulgación, el anticuerpo del complejo es, aunque sin limitarse a, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado o un derivado 40 de anticuerpo descritos en el presente documento. Cualquiera o ambos del anticuerpo o el péptido del complejo anticuerpo-péptido puede ser etiquetado de forma detectable. En un aspecto, el complejo anticuerpo-péptido de la divulgación se puede usar como una muestra de control o de referencia en los ensayos de diagnóstico o cribado.
Los anticuerpos policlonales de la divulgación se pueden generar usando técnicas convencionales conocidas en la 45 técnica y que están bien descritas en la literatura. Existen varias metodologías para la producción de anticuerpos policlonales. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales se producen normalmente mediante inmunización de un mamífero adecuado, tal como, aunque sin limitarse a, pollos, cabras, cobayas, hámsteres, caballos, ratones, ratas y conejos. Un antígeno se inyecta en el mamífero, que induce a los linfocitos B a producir inmunoglobulinas IgG específicas para el antígeno. Esta IgG se purifica a partir del suero de mamíferos. Las variaciones de esta 50 metodología incluyen la modificación de adyuvantes, vías y punto de administración, los volúmenes de inyección por sitio y el número de sitios por animal para la producción óptima y el trato humano de los animales. Por ejemplo, los adyuvantes normalmente se usan para mejorar o potenciar una respuesta inmunitaria a los antígenos. La mayoría de los adyuvantes posibilitan un depósito de antígeno en el sitio de inyección, lo que permite una liberación lenta del antígeno en ganglios linfáticos de drenaje. Otros adyuvantes incluyen tensioactivos que promueven la concentración 55 de moléculas de antígeno de proteína sobre una gran área superficial y moléculas inmunoestimulantes. Los ejemplos no limitantes de adyuvantes para la generación de anticuerpos policlonales incluyen adyuvantes de Freund, sistema adyuvante de Ribi, y Titermax. Los anticuerpos policlonales se pueden generar utilizando procedimientos descritos en las patentes de Estados Unidos N.º 7.279.559; 7.119.179; 7.060.800; 6.709.659; 6.656.746; 6.322.788; 5.686.073; y 5.670.153.
Los anticuerpos monoclonales de la divulgación pueden generarse usando técnicas de hibridoma convencionales conocidas en la técnica y bien descritas en la literatura. Por ejemplo, un hibridoma se produce fusionando una línea celular inmortal adecuada (por ejemplo, una línea celular de mieloma tal como, aunque sin limitación, Sp2/0, Sp2/0-5 AG14, NSO, NS1, NS2, AE-1, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SS1, Sp2 SA5, U397, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, CHO, PerC.6, YB2/O) o similar, o heteromielomas, productos de fusión de los mismos, o cualquier célula o célula de fusión derivada de ellos, o cualquier otra línea celular adecuada tal como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, www.atcc.org, www.lifetech.com., último acceso el 26 de noviembre de 2007, y similares), con células 10 productoras de anticuerpos, tales como, aunque sin limitarse a, células de bazo aisladas o clonadas, sangre periférica, linfa, amígdala, u otras células inmunitarias o que contienen células B, o cualquier otro tipo de células que expresan secuencias constante o variable o marco o CDR de cadena pesada o ligera, ya sea como ácido nucleico endógeno o heterólogo, como recombinante o endógeno, viral, bacteriano, de algas, procariota, anfibio, insecto, reptil, pez, de mamífero, roedor, equina, ovina, cabra, oveja, ADN de primate, eucariota, genómico, cADN, rADN, 15 ADN o ARN mitocondrial, ADN o ARN de cloroplasto, hnARN, mARN, tARN, de cadena sencilla, doble o triple, hibridada, y similares, o cualquier combinación de los mismos. Células productoras de anticuerpos también pueden obtenerse a partir de sangre periférica o, preferentemente del bazo o los ganglios linfáticos, de seres humanos u otros animales adecuados que han sido inmunizados con el antígeno de interés. Cualquier otra célula huésped adecuada también puede usarse para expresar el ácido nucleico heterólogo o endógeno que codifica un anticuerpo, 20 fragmento especificado o variante del mismo, de la presente divulgación. Las células fusionadas (hibridomas) o células recombinantes se pueden aislar usando condiciones de cultivo selectivas u otros procedimientos conocidos adecuados, y se clonaron por dilución limitante o la clasificación de células, u otros procedimientos conocidos.
En una realización de la divulgación, los anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser generados 25 utilizando un sistema de péptido antigénico múltiple (MAP). El sistema de MAP utiliza un núcleo de peptidilo de tres o siete residuos de lisina ramificados radialmente, sobre el que los péptidos antigénicos de interés pueden construirse usando química en fase sólida estándar. El núcleo de lisina produce el MAP que porta alrededor de 4 a 8 copias del epítopo peptídico dependiendo del núcleo interno que generalmente representa menos de 10% del peso molecular total. El sistema MAP no requiere una proteína portadora para conjugación. Se ha demostrado que la alta relación 30 molar y denso empaquetamiento de múltiples copias del epítopo antigénico en un MAP producen una fuerte respuesta inmunógena. Este procedimiento se describe en la patente de Estados Unidos N.º 5.229.490.
Pueden usarse otros procedimientos adecuados de producción o aislamiento de anticuerpos de la especificidad requerida, incluyendo, aunque sin limitación, procedimientos que seleccionan un anticuerpo recombinante a partir de 35 una biblioteca de péptidos o proteínas (por ejemplo, aunque sin limitación, un bacteriófago, ribosoma, oligonucleótido, ARN, cADN, so similares, biblioteca de presentación; por ejemplo, como están disponibles de diversos proveedores comerciales tales como Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, RU), MorphoSys (Martinsreid/Planegg, Del.), Biovation (Aberdeen, Scotland, RU) BioInvent (Lund, Suecia), usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase las patentes de Estados Unidos N.º 4.704.692; 5.723.323; 5.763.192; 5.814.476; 40 5.817.483; 5.824.514; 5.976.862. Procedimientos alternativos dependen de la inmunización de animales transgénicos (por ejemplo, ratones SCID, Nguyen y col., (1977) Microbiol. Immunol. 41: 901-907 (1997); Sandhu y col., (1996) Crit. Rev. Biotechnol. 16: 95-118; Eren y col., (1998) Immunol. 93: 154-161 que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos, tal como se conoce en la técnica y/o tal como se describe en el presente documento. Dichas técnicas, incluyen, aunque sin limitarse a, presentación en ribosomas (Hanes y col., (1997) Proc. 45 Natl. Acad. Sci. EE. UU., 94: 4937-4942; Hanes y col., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU., 95: 14130-14135); tecnologías que producen anticuerpos de una sola célula (por ejemplo, el procedimiento de anticuerpo de linfocito seleccionado (“SLAM”) (patente de Estados Unidos N.º 5.627.052, Wen y col., (1987) J. Immunol. 17: 887-892; Babcook y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. (1996) 93: 7843-7848); microgota de gel y citometría de flujo (Powell y col., (1990) Biotechnol.; One Cell Systems, (Cambridge, Mass); Gray y col., (1995) J. Imm. Meth. 182: 155-163; y 50 Kenny y col., (1995) Bio. Technol. 13: 787-790); selección de células B (Steenbakkers y col., (1994) Molec. Biol. Reports 19: 125-134.
Derivados de anticuerpos de la presente divulgación también pueden prepararse suministrando un polinucleótido que codifica un anticuerpo de esta invención a un huésped adecuado para proporcionar animales transgénicos o 55 mamíferos, tales como cabras, vacas, caballos, ovejas, y similares, que producen dichos anticuerpos en su leche. Estos procedimientos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.º 5.827.690; 5.849.992; 4.873.316; 5.849.992; 5.994.616; 5.565.362; y 5.304.489.
La expresión “derivado de anticuerpo” incluye modificación posttraduccional a la secuencia polipeptídica lineal del anticuerpo o fragmento. Por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.º 6.602.684 B1 describe un procedimiento para la generación de formas modificadas con glicol de anticuerpos, incluyendo moléculas de anticuerpo completas, fragmentos de anticuerpo, o proteínas de fusión que incluyen una región equivalente a la región Fc de una inmunoglobulina, que tiene toxicidad celular mediada por Fc mejorada, y glucoproteínas generadas de este modo. 5
También pueden prepararse derivados de anticuerpos mediante suministrando un polinucleótido de esta invención para proporcionar plantas transgénicas y células vegetales cultivadas (por ejemplo, aunque sin limitarse a tabaco, maíz, y lenteja de agua) que producen dichos anticuerpos, partes o variantes especificadas en las partes de la planta o en células cultivadas de las mismas. Por ejemplo, Cramer y col., (1999) Curr. Top. Microbol. Immunol. 240: 95-118 10 y las referencias citadas en ese documento, describen la producción de hojas de tabaco transgénico que expresan grandes cantidades de proteínas recombinantes, por ejemplo, usando un promotor inducible. El maíz transgénico se han usado para expresar proteínas de mamífero a niveles de producción comercial, con actividades biológicas equivalentes a las producidas en otros sistemas recombinantes o purificadas de fuentes naturales. Véase, por ejemplo, Hood y col., (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147 y las referencias citadas en ese documento. 15 Derivados de anticuerpos también se han producido en grandes cantidades a partir de semillas de plantas transgénicas, incluyendo fragmentos de anticuerpos, tales como anticuerpos monocatenarios (scFv), incluyendo de semillas de tabaco y tubérculos de patata. Véase, por ejemplo, Conrad y col., (1998) Plant Mol. Biol. 38: 101-109 y referencia citadas en este documento. Por lo tanto, los anticuerpos de la presente divulgación también se pueden producir usando plantas transgénicas, de acuerdo con procedimientos conocidos. 20
Los derivados de anticuerpos también pueden producirse, por ejemplo, añadiendo secuencias exógenas para modificar la inmunogenicidad o reducir, mejorar o modificar la unión, afinidad, tasa de asociación, tasa de disociación, avidez, especificidad, semivida, o cualquier otra característica adecuada. Generalmente parte o la totalidad de las secuencias de CDR no humanas o humanas se mantienen, mientras que las secuencias no 25 humanas de las regiones variables y constantes se sustituyen con aminoácidos humanos o de otro tipo.
En general, los residuos de CDR están directamente y de la manera sustancial implicados en influir en la unión al antígeno. La humanización o genomanipulación de anticuerpos de la presente invención puede realizarse usando cualquier procedimiento conocido tal como, aunque sin limitación, los descritos en las patentes de Estados Unidos 30 N.º 5.723.323; 5.976.862; 5.824.514; 5.817.483; 5.814.476; 5.763.192; 5.723.323; 5.766.886; 5.714.352; 6.204.023; 6.180.370; 5.693.762; 5.530.101; 5.585.089; 5.225.539; y 4.816.567.
Las técnicas para fabricar anticuerpos de parcial a completamente humanos son conocidas en la técnica y puede usarse cualquiera de dichas técnicas. De acuerdo con una realización de la divulgación, las secuencias de 35 anticuerpos humanos completos se fabrican en un ratón transgénico que ha sido diseñado para expresar genes de anticuerpo de cadena pesada y ligera humanos. Se han preparado múltiples estirpes de dichos ratones transgénicos que puede producir diferentes clases de anticuerpos. Células B de ratones transgénicos que producen un anticuerpo deseable se pueden fusionar para preparar líneas celulares de hibridoma para la producción continua del anticuerpo deseado. (Véase por ejemplo, Russel y col., (2000) Infection and Immunity abril de 2000: 1820-1826; Gallo y col., 40 (2000) European J. of Immun. 30: 534-540; Green (1999) J. of Immun. Methods 231: 11-23; Yang y col., (1999A) J. of Leukocyte Biology 66: 401-410; Yang (1999B) Cancer Research 59(6): 1236-1243; Jakobovits. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 31: 33-42; Green y Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188(3): 483-495; Jakobovits (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614; Tsuda y col., (1997) Genomics 42: 413-421; Sherman-Gold (1997) Genetic Engineering News 17(14); Mendez y col., (1997) Nature Genetics 15: 146-156; Jakobovits (1996) Weir's Handbook 45 of Experimental Immunology, The Integrated Immune System Vol. IV, 194. 1-194.7; Jakobovits (1995) Current Opinion in Biotechnology 6: 561-566; Mendez y col., (1995) Genomics 26: 294-307; Jakobovits (1994) Current Biology 4(8): 761-763; Arbones y col., (1994) Immunity 1(4): 247-260; Jakobovits (1993) Nature 362(6417): 255-258; Jakobovits; y la patente de Estados Unidos N.º 6.075.181.)
50
Los anticuerpos de esta divulgación también pueden modificarse para crear anticuerpos quiméricos. Los anticuerpos quiméricos son aquellos en los que los diversos dominios de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos están codificados por el ADN de más de una especie. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N.º 4.816.567.
Como alternativa, los anticuerpos de esta divulgación también se pueden modificar para crear anticuerpos 55 remodelados en superficie. Los anticuerpos remodelados en superficie son aquellos en los que los residuos de aminoácidos exteriores del anticuerpo de una especie se sustituyen juiciosamente o “remodelan” con los de una segunda especie de manera que los anticuerpos de la primera especie no serán inmunógenos en la segunda especie reduciendo de ese modo la inmunogenicidad del anticuerpo. Dado que la antigenicidad de una proteína depende principalmente de la naturaleza de su superficie, la inmunogenicidad de un anticuerpo podría reducirse mediante la sustitución de los residuos expuestos que difieren de las que normalmente se encuentran en otros anticuerpos de especies de mamíferos. Esta sustitución juiciosa de residuos exteriores debe tener poco o ningún efecto sobre los dominios interiores, o sobre los contactos entre dominios. Por lo tanto, las propiedades de unión a ligando no deben modificarse como consecuencia de alteraciones que se limitan a los residuos marco de región 5 variable. El proceso se conoce como “remodelación en superficie”, ya que se altera sólo la superficie exterior o “piel” del anticuerpo, los residuos de soporte permanecen inalterados.
El procedimiento de “remodelación en superficie” hace uso de los datos de secuencia disponibles para dominios variables de anticuerpos humanos compilados por Kabat y col., (1987) Sequences of Proteins of Immunological 10 Interest, 4ª ed., Bethesda, Md., National Institutes of Health, actualizaciones de esta base de datos, y otras bases de datos accesibles estadounidenses y extranjeras (tanto de ácidos nucleicos y proteínas). Los ejemplos de los procedimientos utilizados para generar anticuerpos remodelados en superficie incluyen EP 519596; patente de Estados Unidos N.º 6.797.492; y se describen en Padlan y col., (1991) Mol. Immunol. 28(4-5): 489-498.
15
La expresión “derivado de anticuerpo” también incluye “diacuerpos”, que son pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión al antígeno, donde los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica. (Véase por ejemplo, EP 404.097; WO 93/11161; y Hollinger y col., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90: 6444-6448). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, 20 los dominios son forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. (Véase también, la patente de Estados Unidos N.º 6.632.926 de Chen y col., que describe variantes de anticuerpo que tienen uno o más aminoácidos insertados en una región hipervariable del anticuerpo parental y una afinidad de unión para un antígeno diana que es al menos aproximadamente dos veces más potente que la afinidad de unión del anticuerpo parental por el antígeno). 25
La expresión “derivado de anticuerpo” incluye, además, “anticuerpos lineales”. El procedimiento para la fabricación de anticuerpos lineales se conoce en la técnica y se describe en Zapata y col., (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062. En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que forman un par de regiones de unión al antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos. 30
Los anticuerpos de esta divulgación se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante procedimientos conocidos que incluyen, aunque sin limitarse a, purificación de la proteína A, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de 35 hidroxiapatita y cromatografía de lectina. También puede usarse cromatografía líquida de alta resolución (“HPLC”) para la purificación.
Los anticuerpos de la presente divulgación productos purificados, productos de procedimientos sintéticos químicos, y productos producidos mediante técnicas recombinantes a partir de un huésped eucariota, incluyendo, por ejemplo, 40 levaduras, plantas superiores, células de insecto y de mamífero, o como alternativa a partir de una célula procariota tal como se ha descrito anteriormente.
Si un anticuerpo monoclonal que está siendo ensayado se une a una proteína o polipéptido, entonces el anticuerpo que está siendo ensayado y los anticuerpos proporcionados por los hibridomas de esta divulgación son equivalentes. 45 También es posible determinar sin experimentación excesiva, si un anticuerpo tiene la misma especificidad que el anticuerpo monoclonal de esta divulgación determinando si el anticuerpo que está siendo ensayado impide que un anticuerpo monoclonal de esta divulgación se una a la proteína o polipéptido con el que el anticuerpo monoclonal es reactivo normalmente. Si el anticuerpo que está siendo ensayado compite con el anticuerpo monoclonal de la divulgación, tal como se muestra mediante una disminución de la unión por el anticuerpo monoclonal de esta 50 divulgación, entonces es probable que los dos anticuerpos se unan al mismo epítopo o a uno estrechamente relacionado. Como alternativa, se puede preincubar el anticuerpo monoclonal de esta divulgación con una proteína con la que es reactivo normalmente, y determinar si el anticuerpo monoclonal que está siendo ensayado es inhibido en su capacidad de unirse al antígeno. Si el anticuerpo monoclonal que está siendo ensayado es inhibido entonces, con toda probabilidad, tiene la misma, o una relacionada estrechamente, especificidad epitópica que el anticuerpo 55 monoclonal de esta divulgación.
El término “anticuerpo” también pretende incluir anticuerpos de todos los isotipos. Isotipos particulares de un anticuerpo monoclonal se pueden preparar ya sea directamente mediante la selección de la fusión inicial, o se pueden preparar de forma secundaria, a partir de un hibridoma parental que secreta un anticuerpo monoclonal de diferente isotipo utilizando la técnica de selección sib para aislar variantes de cambio de clase usando el procedimiento descrito en Steplewski, y col., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 82: 8653 o Spira, y col., (1984) J. Immunol. Methods 74: 307.
5
El aislamiento de otros hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales con la especificidad de los anticuerpos monoclonales de la divulgación también se puede conseguir por un experto en la materia mediante la producción de anticuerpos antiidiotípicos. Herlyn, y col., (1986) Science 232: 100. Un anticuerpo antiidiotípico es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos presentes en el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma de interés.
10
La identidad idiotípica entre los anticuerpos monoclonales de dos hibridomas demuestra que los dos anticuerpos monoclonales son iguales con respecto a su reconocimiento del mismo determinante epitópico. Por lo tanto, usando anticuerpos para los determinantes epitópicos en un anticuerpo monoclonal, es posible identificar otros hibridomas que expresan anticuerpos monoclonales de la misma especificidad epitópica.
15
También es posible usar tecnología de anti-idiotipo para producir anticuerpos monoclonales que imitan un epítopo. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal antiidiotípico preparado para un primer anticuerpo monoclonal tendrá un dominio de unión en la región hipervariable que es la imagen especular del epítopo al que se une el primer anticuerpo monoclonal. De este modo, en este ejemplo, el anticuerpo monoclonal antiidiotípico podría usarse para inmunización para la producción de estos anticuerpos. 20
En algunos aspectos de esta divulgación, será útil etiquetar de forma detectable o terapéutica el anticuerpo. Las etiquetas adecuadas se han descrito supra. Los procedimientos para conjugar anticuerpos a estos agentes son conocidos en la técnica. Para propósito de ilustración solamente, los anticuerpos se pueden etiquetar con un resto detectable tal como un átomo radioactivo, un cromóforo, un fluoróforo, o similares. Dichos anticuerpos etiquetados 25 se pueden usar para técnicas de diagnóstico, ya sea in vivo, o en una muestra de ensayo aislada.
El acoplamiento de anticuerpos a haptenos de bajo peso molecular puede aumentar la sensibilidad del anticuerpo en un ensayo. Los haptenos pueden detectarse a continuación específicamente por medio de una segunda reacción. Por ejemplo, es habitual usar haptenos tales como biotina, que reacciona con avidina, o dinitrofenol, piridoxal y 30 fluoresceína, que pueden reaccionar con anticuerpos antihapteno específicos. Véase, Harlow y Lane (1988) supra.
Los anticuerpos pueden etiquetarse con un resto detectable tal como un átomo radioactivo, un cromóforo, un fluoróforo, o similares. Dichos anticuerpos etiquetados pueden usarse para técnicas de diagnóstico, ya sea in vivo, o en una muestra de ensayo aislada. Los anticuerpos también pueden conjugarse, por ejemplo, a un agente 35 farmacéutico, tal como fármaco quimioterapéutico o una toxina. Estos se pueden enlazar a una citoquina, a un ligando, a otro anticuerpo. Los agentes adecuados para el acoplamiento a anticuerpos para conseguir un efecto anti-tumoral incluyen citoquinas, tales como interleuquina 2 (IL-2) y factor de necrosis tumoral (TNF); fotosensibilizadores, para uso en terapia fotodinámica, incluyendo ftalocianina tetrasulfonato de aluminio (III), hematoporfirina, y ftalocianina; radionucleidos, tales como yodo-131 (131I), itrio-90 (90Y), bismuto-212 (212Bi), bismuto-40 213 (213Bi), tecnecio-99m (99mTc), renio-186 (186Re), y renio-188 (188Re); antibióticos, tales como doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, metotrexato, daunomicina, neocarzinostatina, y carboplatino; toxinas bacterianas, vegetales, y otras, tales como toxina de la difteria, exotoxina de pseudomonas A, enterotoxina A estafilocócica, toxina abrina-A, ricina A (ricina A desglicosilada y ricina natural A), toxina TGF-alfa, citotoxina de cobra China (naja naja atra), y gelonina (una toxina vegetal); proteínas inactivadoras del ribosoma de plantas, bacterias y hongos, tales 45 como restrictocina (una proteína inactivadora del ribosoma producida por Aspergillus restrictus), saporina (una proteínas inactivadora del ribosoma de Saponaria officinalis), y RNasa; inhibidores de la tirosina quinasa; ly207702 (un nucleósido de purina difluorado); liposomas que contienen agentes anti-quísticos (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, plásmidos que codifican toxinas, metotrexato,. etc.); y otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, tales como F(ab). 50
Los anticuerpos de la divulgación también se pueden unir a muchos transportadores diferentes. Por lo tanto, esta divulgación también proporciona composiciones que contienen los anticuerpos y otra sustancia, activa o inerte. Los ejemplos de transportadores bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del transportador 55 puede ser soluble o insoluble para los fines de la invención. Los expertos en la materia conocerán otros transportadores adecuados para la unión de anticuerpos monoclonales, o serán capaces de determinarlos, usando experimentación rutinaria.
IV. Terapias
La presente invención se refiere a una composición que comprende un derivado de fXa de la invención para uso en un procedimiento terapéutico de prevención o reducción de hemorragias en un sujeto sometido a terapia anticoagulante. Se contempla que los antídotos o derivados de la presente invención pueden ser fármacos de corta 5 duración para usarlos en situaciones de elección o de emergencia que pueden neutralizar de forma segura y específica propiedades anticoagulantes convencionales de un inhibidor de fXa sin causar efectos secundarios o hemodinámicos perjudiciales o exacerbación de la respuesta vascular proliferativa a la lesión.
En una realización, la cantidad terapéuticamente efectiva de un antídoto muestra un índice terapéutico elevado. El 10 índice terapéutico es la relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos que pueden expresarse como la relación entre DL50 y DE50. La DL50 es la dosis letal para el 50% de la población y la DE50 es la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población. La DL50 y la DE50 se determinan mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares animales o animales experimentales. Los antídotos o derivados de esta invención pueden administrarse una o varias veces cuando se necesitan para neutralizar el efecto de un inhibidor de 15 fXa presente en el plasma de un sujeto. Preferentemente, los antídotos de esta invención son suficientes cuando se administran en una única dosis.
Se contempla que una dosis típica de los antídotos de la invención dependerá del entorno clínico real y de la concentración del inhibidor en el plasma. En ensayos in vitro, tales como generación de trombina, ensayos clínicos 20 de coagulación tales como aPTT, PT y ACT, se espera que una cantidad terapéuticamente efectiva de un antídoto produzca produce una corrección de la actividad de coagulación ex vivo del 10% o más. Los ensayos in vitro indican que una relación de antídoto/inhibidor > 1,0 debe mostrar un efecto de inversión. Se espera que la concentración plasmática máxima para antídoto esté en el intervalo micromolar, probablemente entre 10 micromolar o por debajo.
25
En un entorno clínico, uno de los criterios en la determinación de la eficacia de un antídoto es que produzca cualquier cambio de las medidas reales de hemorragia. En los ensayos clínicos, las categorías de hemorragias graves son la hemorragia fatal, las hemorragias en órganos vitales (intracraneal, intraocular, retroperitoneal, medular, pericárdica), cualquier hemorragia que requiere reintervención o un nuevo procedimiento terapéutico (por ejemplo, aspiración de una rodilla operada, inserción de un tubo de toracotomía para hemotórax, electrocoagulación 30 endoscópica, etc.) o un índice de hemorragia de ≥ 2,0 si se asocia con una hemorragia manifiesta. El índice de hemorragia se define como el número de unidades de glóbulos rojos empaquetados o sangre completa transfundida, además de los valores de hemoglobina antes del episodio de hemorragia menos los valores de hemoglobina después de que la hemorragia se ha estabilizado (en gramos por decilitro).
35
Otro criterio para la eficacia de antídoto en un entorno clínico es que reduzca hemorragia no grave clínicamente significativa. Esta categoría de hemorragias incluyen hemorragia que no es importante, pero es mayor de lo habitual y justifica la atención clínica, incluyendo epistaxis que es persistente o recurrente y en cantidad sustancial o no se detendrá sin la intervención; hemorragia rectal o del tracto urinario que no llega a un nivel que requiere un procedimiento terapéutico (por ejemplo, la nueva inserción de un catéter Foley o inspección cistoscopia), hematomas 40 sustancial en los sitios de inyección o en otros lugares que son espontáneos o se producen con traumatismo trivial; pérdida considerable de sangre; hemorragia que requiere transfusión no planificada. Tal como se usa en el presente documento, “pérdida de sangre sustancial” se refiere a la cantidad de pérdida de sangre que es mayor de esa cantidad por lo general asociada con el procedimiento quirúrgico. Pérdida de sangre sustancial conduce a la hinchazón que se gestiona de forma conservadora, ya que se queda corta para requerir drenaje. 45
En una realización, los derivados de esta invención tienen suficiente semivida en plasma circulante para neutralizar sustancialmente el inhibidor de fXa presente en el plasma. El fXa activado esencialmente no tiene semivida en circulación en seres humanos, ya que es inhibido eficazmente por ATIII, TFPI y otros inhibidores de plasma (Fuchs, H.E. y Pizzo, S.V., J. Clin. Invest., 1983, 72: 2041-2049). Se ha demostrado que el fXa inactivo tiene una semivida 50 en circulación de 2-3 horas en seres humanos. En un modelo de babuino, la semivida de un fXa bloqueado en el sitio activo por DEGR ([5-(dimetilamino)1-naftalenosulfonilo]-glutamilglicilarginil clorometil cetona) fue de aproximadamente 10 horas o 2 horas, tal como se determina mediante ensayos isotópicos o inmunoadsorbentes ligados a enzima, respectivamente (Taylor, F.B. y col., Blood, 1991, 78(2): 364-368).
55
Puede ser deseable prolongar la semivida de un derivado de antídoto fXa a 24-48 horas. Se contempla que la conjugación o adición de uno o más d los siguientes restos incrementará la semivida en plasma de un antídoto:
a) polietilenglicol;
b) un grupo acilo;
c) liposomas y agentes de encapsulación;
d) proteínas transportadoras;
e) membrana fosfolipídica artificial;
f) inmunoglobulina; y 5
g) nanopartícula.
El sitio de conjugación puede no estar limitado a la cadena o residuo especial, siempre que la conjugación no enmascare el sitio o sitios de unión al del antídoto. Los antídotos descritos en el presente documento se pueden administrar en combinación con uno cualquiera o más de uno de los compuestos descritos anteriormente. 10
En general, los anticuerpos administrados tienen una semivida mucho más larga que las proteínas circulantes de coagulación sanguínea. Es posible usar un complejo que consiste en fXa deficiente en dominio Gla y un anticuerpo unido al exositio de fXa como antídoto de semivida en circulación prolongada. La formación de un complejo entre fXa y el anticuerpo dirigido el exositio puede reducir la interacción de un fXa deficiente en dominio Gla con sustratos e 15 inhibidores macromoleculares, tales como protrombina y la antitrombina III, mientras que deja el sitio activo escindido inalterado, de modo que el complejo puede actuar como un antídoto para unirse al inhibidor de molécula pequeña dirigido al sitio activo. La formación de complejo de α-2-macroglobulina-fXa también puede ser de utilidad como antídoto para los inhibidores de molécula pequeña de fXa.
20
La eficacia de los antídotos en la inversión de la actividad anticoagulante de los inhibidores de fXa, así como su actividad procoagulante puede determinarse mediante ensayos in vitro y modelos animales por los expertos en la materia. Son ejemplos de ensayos in vitro la generación de trombina, los ensayos clínicos de coagulación tales como aPTT, PT y ACT. Se contempla que un antídoto de esta invención sea capaz de producir el 10% o más de corrección de la actividad de coagulación ex vivo. Varios modelos animales in vivo de tiempo de hemorragia y/o 25 pérdida de sangre en, por ejemplo, roedores, tales como ratones, perros y primates, tales como monos, se pueden usar para medir la eficacia.
V. Composiciones farmacéuticas
30
La presente invención proporciona, además, composiciones que comprenden un derivado de fXa y un transportador farmacéuticamente aceptable.
“Transportadores farmacéuticamente aceptables” se refiere a cualesquiera diluyentes, excipientes o transportadores que pueden usarse en las composiciones de la invención. Los transportadores farmacéuticamente aceptables 35 incluyen intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas del suero, tales como albúmina de suero humano, sustancias tamponantes, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disódico, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa 40 sódica, poliacrilatos, ceras, copolímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana. Los transportadores farmacéuticos adecuados se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, un texto de referencia estándar en este campo. Se seleccionan preferentemente con respecto a la forma pretendida de administración, es decir, comprimidos orales, cápsulas, elixires, jarabes y similares, y consecuentes con las prácticas farmacéuticas convencionales. 45
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden fabricarse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica tales como procesos de granulación convencional, mezcla, disolución, encapsulación, liofilización, emulsión, entre otros. Las composiciones pueden producirse de diversas formas, incluyendo gránulos, precipitados o partículas, polvos, incluyendo secado por congelación, secado rotatorio o polvos secados por pulverización, polvos 50 amorfos, inyecciones, emulsiones, elixires, suspensiones o soluciones. Las formulaciones pueden contener opcionalmente estabilizantes, modificadores de pH, tensioactivos, modificadores de la biodisponibilidad y combinaciones de éstos.
Las formulaciones farmacéuticas pueden prepararse como suspensiones o soluciones líquidas usando un líquido 55 estéril, tal como aceite, agua, alcohol, y combinaciones de los mismos. Tensioactivos, agentes de suspensión o agentes emulsionantes farmacéuticamente adecuados, se pueden añadir para administración oral o parenteral. Las suspensiones pueden incluir aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de sésamo, aceite de semilla de algodón, aceite de maíz y aceite de oliva. La preparación en suspensión también puede contener ésteres de ácidos grasos, tales como oleato de etilo, miristato de isopropilo, glicéridos de ácidos grasos y glicéridos de ácidos grasos acetilados. Las formulaciones en suspensión pueden incluir alcoholes, tales como etanol, alcohol isopropílico, alcohol hexadecílico, glicerol y propilenglicol. Éteres, tales como poli(etilenglicol), hidrocarburos de petróleo, tales como aceite mineral y vaselina, y agua también se pueden usar en formulaciones en suspensión.
5
Las composiciones de esta invención están formadas para administración farmacéutica a un mamífero, preferentemente un ser humano. Dichas composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse de diversas maneras, preferentemente por vía parenteral.
Se contempla que para invertir rápidamente la actividad anticoagulante de un inhibidor de fXa presente en el plasma 10 de un paciente en una situación de emergencia, el antídoto de esta invención puede o pueda ser administrado a la circulación sistémica mediante administración parenteral. El término “parenteral”, tal como se usa en el presente documento, incluye técnicas de inyección o infusión subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal. Sin embargo, en casos en que el inhibidor de fXa que está siendo neutralizado tiene una larga semivida en plasma, una infusión continua o una 15 formulación de liberación sostenida puede ser necesaria para unirse al inhibidor de fXa y de este modo liberar el fXa activo antes de la eliminación del inhibidor de fXa del cuerpo.
Las formas inyectables estériles de las composiciones de esta invención pueden ser suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones pueden formularse de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica usando 20 agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril puede ser también una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo como una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como medio disolvente o de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier 25 aceite fijo suave incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como ácido oleico y sus derivados glicéridos son útiles en la preparación de inyectables, como lo son los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas soluciones o suspensiones en aceite también pueden contener un diluyente o dispersante alcohólico de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se usan 30 comúnmente en la formulación de formas de dosificación farmacéuticamente aceptables incluyendo emulsiones y suspensiones. Otros tensioactivos usados comúnmente, tales como Tweens, Spans y otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad que se usan comúnmente en la fabricación de formas de dosificación sólidas, líquida, u farmacéuticamente aceptables también pueden usarse para fines de formulación. Los compuestos pueden formularse para administración parenteral por inyección tal como por inyección en embolada o infusión continua. Una 35 forma de dosificación unitaria para inyección puede ser en ampollas o en recipientes de múltiples dosis.
Además de las formas de dosificación descritas anteriormente, excipientes y transportadores y formas de dosificación farmacéuticamente aceptables son conocidos generalmente por los expertos en la materia y están incluidos en la invención. Debe entenderse que un régimen de dosificación y tratamiento específico para cualquier 40 paciente particular dependerá de diversos factores, incluyendo la actividad del antídoto específico empleado, la edad, peso corporal, estado de salud general, sexo y dieta, la función renal y hepática del paciente, y el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos, criterio del facultativo o el veterinario a cargo del tratamiento y la gravedad de la enfermedad particular que está siendo tratada.
45
VI. Kits
La invención proporciona además kits o paquetes. En algunas realizaciones, el kit de la presente invención comprende: (a) un primer recipiente que contiene un inhibidor de fXa para la administración regular para el tratamiento de la trombosis, y (b) un segundo recipiente que contiene un antídoto de esta invención para usarlo en 50 los casos en hay una sobredosis del inhibidor de fXa en (a) o cuando la hemostasia normal necesita ser restaurada para detener o prevenir la hemorragia. En otras realizaciones, el kit comprende además una etiqueta que explica cuándo deben usarse estos dos agentes en (a) y (b).
El primer y segundo recipiente puede ser un frasco, tarro, vial, matraz, jeringa, tubo, bolsa, o cualquier otro recipiente 55 usado en la fabricación, el almacenamiento o la distribución de un producto farmacéutico. El prospecto puede ser una etiqueta, marca, marcador, o similares, que recita información relativa a la composición farmacéutica del kit. La información recitada por lo general es determinada por la agencia reguladora que regula la zona en la que se va a comercializar la composición farmacéutica, tal como la Food and Drug Administration. Preferiblemente, en el prospecto recita específicamente las indicaciones para las que la composición farmacéutica se ha aprobado. El prospecto puede estar hecho de cualquier material sobre el que una persona pueda leer la información contenida en el mismo o sobre el mismo. Preferiblemente, el prospecto es un material imprimible, tal como papel, cartón con reverso adhesivo, papel de aluminio, o plástico, y similares, en el que se ha impreso o aplicado la información deseada. 5
EJEMPLOS
La invención se entenderá adicionalmente mediante referencia a los siguientes ejemplos, que pretenden ser puramente ejemplares de la invención. La presente invención no está limitada en alcance por las realizaciones 10 ejemplificadas, que pretenden ser ilustraciones de aspectos individuales de la invención solamente. Cualesquiera procedimiento que son funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Diversas modificaciones de la invención además de las descritas en el presente documento serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y las figuras adjuntas. Dichas modificaciones están dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. 15
A menos que se indique otra cosa, todas las temperaturas están en grados Celsius. Además, en estos ejemplos y en cualquier otra parte, las abreviaturas tienen los siguientes significados:
aa = aminoácido 20
ab = anticuerpo
ACT = Tiempo de coagulación activado
aPTT= tiempo de tromboplastina parcial activada
célula CHO = célula de ovario de hámster chino
células CHO dhfr (-)= células CHO que carecen de gen dhfr 25
hr= hora
INR= Relación normalizada internacional
IV = intravenosa
kg = kilogramo
M = molar 30
mg = miligramo
mg / kg = Miligramo/kilogramo
mg/ml= Miligramo/mililitro
min = minuto
ml = mililitro 35
mM = milimolar
nm = nanómetros
nM = nanomolar
PO= oral
PRP= Plasma rico en plaquetas 40
PT = Tiempo de protrombina
RFU = Unidad de fluorescencia relativa
s = segundo
TF = Factor tisular
U/ml= Unidades/mililitrol 45
µl o Ul= microlitro
µM= micromol
µg= microgramo
Ejemplo 1. Preparación de des-Gla anhidro-fXa mediante digestión con quimotripsina 50
Se preparó des-Gla anhidro-fXa de acuerdo con el procedimiento de Morita, T. y col., J. Bio. Chem., 1986, 261(9): 4015-4023 mediante la incubación de anhidro-fXa, en el que deshidroalanina sustituye a la serina del sitio activo, con quimotripsina en Tris-HCl 0,05 M, NaCl 0,1 M, a pH 7,5 y 22°C durante 60 minutos. En un entorno de experimento típico, 0,5 miligramos/mililitro (mg/ml) de anhidro-fXa se incubaron con perlas de 5 unidades/mililitro (U/ml) de α-55 quimotripsina-agarosa con agitación suave. Al final de la reacción, las perlas de α-quimotripsina-agarosa se eliminaron por centrifugación o filtración. A esto le siguió incubación con cantidad en exceso de inhibidores fluoruro de 4-amidino-fenil-metanosulfonilo (APMSF), tosil-L-lisina clorometil cetona (TLCK), y tosil-L-fenilalanina clorometil cetona (TPCK) para inactivar la actividad fXa residual o cualquier actividad de la quimotripsina posiblemente lixiviada a partir de las perlas. El fragmento de dominio Gla y los inhibidores se eliminaron del producto final, des-Gla anhidro-fXa, por un dispositivo de filtro Amicon Ultra Centrifugal (membrana YM10) o mediante diálisis convencional. La concentración o el intercambio de tampón, en caso necesario, también se logró al mismo tiempo. El anhidro-fXa que contiene dominio Gla se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito por Nogami, y col., J. Biol. Chem. 1999, 274 (43): 31000-7. La perla de α-quimotripsina-agarosa se adquirió de Sigma y la actividad específica (U/ml) se 5 basaba en los datos del fabricante para el número de lote específico usado.
La digestión con quimotripsina de fXa activo puede llevarse a cabo de acuerdo con el procedimiento anterior sin usar APMSF. La actividad de coagulación de fXa activo se determinó antes de la digestión con quimotripsina, y después de 15, 30 y 60 minutos de la digestión con quimotripsina de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 3 a 10 continuación. La figura 7muestra una pérdida completa de la actividad de coagulación después de 30 minutos de digestión con quimotripsina. El tiempo de incubación se prolongó a 60 minutos para asegurar la eliminación completa del dominio Gla.
Ejemplo 2. Ensayo de generación de trombina en plasma pobre en plaquetas (PPP) o plasma rico en 15 plaquetas (PRP)
En este ejemplo, las muestras de plasma rico en plaquetas o pobre en plaquetas humanas se prepararon a partir de sangre de donantes sanos extraída en el 0,32% de citrato. PRP y PPP se prepararon centrifugando la sangre anticoagulada a ~100 gravedades o 1000 gravedades durante 20 minutos, respectivamente, a temperatura 20 ambiente. 75-100 microlitros de plasma (µl) se mezclaron con CaCl 2 y Z-Gly-Gly-Arg-aminometilcumarina (Z-GGR-AMC, un sustrato fluorógeno de trombina). Se añadió el factor tisular (Innovin, Dade Behring) para iniciar la generación de trombina. Para un experimento típico, la mezcla de reacción contenía Ca2+ 15 milimolar (mM), Z-GGR-AMC 100 micromolar (µM), y el factor tisular (TF) (Innovin) 0,1 nanomolar (nM). La formación de trombina se monitorizó de forma continua a 37°C mediante un lector de placas fluorométrico (Molecular Devices) midiendo las 25 unidades de fluorescencia relativa (RFU). Inhibidor y antídoto, cuando están presentes, se preincubaron con plasma durante 20 minutos a temperatura ambiente antes del inicio de la generación de trombina.
Los resultados de diversos experimentos usando este ensayo pueden encontrarse en las figuras 4, 6 y 9.
30
Ejemplo 3. Ensayos de prolongación de la coagulación
Se usaron dos formatos de ensayo de coagulación para poner a prueba los efectos de los inhibidores del factor Xa y el antídoto sobre la prolongación de la coagulación. En el primer formato, se usó una placa de 96 pocillos para medir varias muestras al mismo tiempo. En el segundo formato de ensayo, se midió aPTT con un instrumento de 35 coagulación convencional (temporizador de coagulación automático MLA Electra 800).
En el procedimiento de formato de placa de 96 pocillos, plasma pobre en plaquetas o plasma rico en plaquetas humano se preparó de manera similar a los procedimientos en el ejemplo 2. De 75 a 100 µl de plasma se recalcificaron con CaCl2, se incubaron a 37°C durante 3 minutos y la formación de coágulos se inició añadiendo 40 factor tisular (Innovin, Dade Behring) o un reactivo de aPTT (Actin FS, Dade Behring). El cambio de DO405 se monitorizó continuamente mediante un lector de placas (Molecular Devices). El tiempo de coagulación se definió como el tiempo (segundos) cuando se alcanzó la mitad del valor máximo de cambio de absorbancia (DO405nm). El inhibidor del Factor Xa y el antídoto, cuando estaban presentes, se preincubaron con plasma a temperatura ambiente durante 20 minutos antes del inicio de la reacción. 45
Cuando un fXa activo se ensayó para su actividad de coagulación tal como se muestra en la figura 7, 75-100 µl de plasma deficiente en fX (George King Bio-Medical, Inc.) se recalcificaron con CaCl2, se incubaron a 37°C durante 3 minutos y productos de fXa después de la digestión con quimotripsina se añadieron al plasma para iniciar la formación de coágulos. El cambio de DO405 se monitorizó continuamente mediante un lector de placas, tal como se 50 ha descrito anteriormente.
En la figura 13, el efecto de betrixaban 400 nM sobre la prolongación del aPTT de plasma humano normal y la inversión del efecto inhibidor de betrixaban por antídoto des-Gla anhidro-fXa se midió con un temporizador de coagulación automático MLA Electra 800. 100 µl de plasma humano combinado se mezclaron con betrixaban 400 55 nM y diferentes concentraciones de antídoto. Se añadieron reactivo de aPTT (Actin FS, Dade Behring) y CaCl2 según las instrucciones del fabricante para la medición de los tiempos de coagulación.
Los resultados de experimentos adicionales usando este ensayo pueden encontrarse en la figuras 10 y 11.
Ejemplo 4. Inversión de la inhibición de fXa por betrixaban mediante des-Gla anhidro-fXa
Para medir la inhibición de la actividad fXa por betrixaban y la inversión de su efecto inhibidor, se purificó fXa activo, diferentes concentraciones de betrixaban y antídoto des-Gla anhidro-fXa se añadieron a Tris 20 mM, NaCl 150 mM, 5 Ca2+ 5 mM, y albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1%. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos, se añadieron 100 µM de Spectrozyme FXa (un sustrato cromógeno del factor Xa, Chromogenix) a la mezcla y la velocidad de escisión de sustrato se monitorizó continuamente durante 5 minutos a 405 nanómetros (nm) mediante un lector de placas. En la figura 5, la actividad cromógena se normalizó respecto a fXa activo en ausencia de cualquier inhibidor. La velocidad inicial de formación de producto en función de la concentración de 10 inhibidor y antídoto se analizó por regresión no lineal para estimar la afinidad de betrixaban por el antídoto (figura 8).
El efecto del antídoto des-Gla anhidro-fXa sobre la actividad de trombina hacia un sustrato cromógeno S2288 (200 mM) se midió de manera similar como anteriormente, con o sin Argatroban, un inhibidor de IIa de molécula pequeña específico. Como se esperaba, el antídoto (538 nM) no afecta a la actividad amidolítica de IIa (5 nM) o su inhibición 15 por Argatroban 50 nM.
Ejemplo 5. Preparación de fXa con residuos de ácido γ-carboxiglutámico descarboxilados
Un derivado de fXa con residuos de ácido γ-carboxiglutámico descarboxilados puede prepararse tratando proteína 20 fXa, por ejemplo, basándose en el procedimiento descrito por Bajaj, y col., J. Biol. Chem., 1982, 257(7): 3726-3731. De 2 a 5 mg de fXa purificado o recombinante en 2 ml de bicarbonato de amonio 0,1 molar a pH 8,0 se liofilizan. El polvo resultante se selló a un vacío de menos de 20 µM y se calentó a 110°C durante diversos períodos de tiempo para obtener fXa descarboxilado.
25
Ejemplo 6. Preparación de des-Gla fXa-S379A recombinante
Los derivados de fXa pueden producirse mediante procedimiento de ADN recombinante con uno de los siguientes procedimientos basados en cADN de fX (SEQ ID NO. 2) para expresar fX (SEQ ID NO. 1, 3) o derivados de fXa (SEQ ID NO. 4, 5, 9 y 11) en un organismo huésped adecuado de acuerdo con procedimientos generales de 30 mutagénesis y biología molecular.
fX recombinante y derivados de fX pueden expresarse en, por ejemplo, células de riñón embrionario humano HEK293 basándose en procedimientos descritos en Larson, P.J., y col., Biochem., 1998, 37: 5029-5038, y Camire, R.M., y col., Biochem., 2000, 39, 14322-14329. fX recombinante puede activarse a rfXa mediante el activador del 35 factor X veneno de víbora de Russell (RVV). rfXa puede procesarse adicionalmente a des-Gla anhidro-fXa basándose en procedimientos descritos en el ejemplo 1.
fX-S379A recombinante (S195A en numeración de quimotripsina) con el residuo serina del sitio activo siendo sustituido por alanina, y preferentemente el mutante de fXa activado, rfXa-S379A, puede expresarse, por ejemplo, en 40 células de ovario de hámster chino (CHO) basándose en procedimiento descritos por Sinha y col., Protein Expression and Purif. 1992, 3: 518-524; Wolf, D.L. y col., J. Biol. Chem., 1991, 266(21): 13726-13730.
Des-Gla fXa-S379A puede prepararse mediante digestión con quimotripsina de fXa-S379A de acuerdo con procedimiento descritos en el ejemplo 1. 45
Más preferentemente, Des-Gla fXa-S379A puede expresarse directamente de acuerdo con procedimiento previos con deleción del fragmento del dominio Gla mediante procedimientos de mutagénesis. Por ejemplo, puede usarse expresión de proteínas recombinantes para expresar: des-Gla(1-39)-fXa-S379A, después de la eliminación del fragmento de dominio Gla 1-39 de la SEQ ID NO. 3; des-Gla(1-44)-fXa-S379A, equivalente a la SEQ ID NO. 10 con 50 deshidroalanina siendo sustituida por alanina; y des-Gla(1-45)-fXa-S379A con todo el dominio Gla siendo eliminado (SEQ ID NO. 11).
También pueden realizarse truncamientos adicionales en el dominio EGF1 o EGF1 más EGF2 (figura 2) para expresar derivados des(1-84)-fXa-S379A o des(1-128)-fXa-S379A. 55
Ejemplo 7. Expresión de mutante de fXa recombinante en células CHO
Este ejemplo describe la construcción de expresión de proteína recombinante y la línea celular para la expresión directa de una variante de fXa-S379A sin dominio Gla (S195A en la numeración de quimotripsina). El antídoto recombinante no requiere las etapas de activación o modificación química necesarias para producir el pd-antídoto y tiene una afinidad comparable a la proteína derivada de plasma en los ensayos in vitro descritos en el presente documento.
5
En este ejemplo, un mutante de fXa (SEQ ID NO. 13, tabla 12a) se expresó directamente en una célula CHO (véase la figura 14 para vector de expresión) y la proteína funcional se purificó a partir de medio acondicionado como se describe a continuación. La actividad funcional del antídoto recombinante (r-antídoto) se ensayó in vitro y en un modelo animal (ejemplo 8).
10
Se usó PCR para mutar la secuencia de cADN de fX (SEQ ID NO. 2) en tres regiones. La primera mutación fue la deleción de 6 a 39 aa en el dominio Gla de FX (SEQ ID NO. 3, figura 3). La segunda mutación fue sustituir la secuencia del péptido de activación de 143-194 aa con -RKR-. Esto produjo un enlazador -RKRRKR- que conecta la cadena ligera y la cadena pesada. Tras la secreción, este enlazador se elimina en CHO dando como resultado una molécula de fXa bicatenaria. La tercera mutación es la mutación del residuo del sitio activo S379 a un residuo de Ala. 15
El polipéptido producido mediante el cADN (SEQ ID NO. 16) que se acaba de describir, se describe en la tabla 12 (SEQ ID NO. 12). El alineamiento del cADN con el polipéptido se muestra en la tabla 20. La molécula de fXa bicatenaria producida después de la secreción es un fragmento de cadena ligera descrito en la tabla 12b (SEQ ID NO. 14) y un fragmento de cadena pesada descrito en la tabla 12c (SEQ ID NO. 15). 20
Los primeros 1-5 aa en la secuencia de fX se reservaron y se usaron para conectar el polipéptido de mutante de fXa con el prepropéptido de fX (SEQ ID NO. 1, figura 1), garantizando el apropiado procesamiento del prepropéptido en el mutante de fXa.
25
La secuencia de ADN que codifica el polipéptido de mutante de fXa descrito anteriormente se secuenció y se insertó en el vector de expresión mostrado en la Figura 14. El polinucleótido del vector de expresión se muestra en la SEQ ID NO. 18. El ADN del plásmido se linealizó y se transfectó a células CHO dhfr(-). Las células se seleccionaron usando medios deficientes en tetrahidrofolato (HT) más metotrexato (MTX). Se cribaron clones estables para expresión elevada de proteínas usando un kit de ELISA de fX (Enzyme Research Laboratories, número de catálogo 30 FX-EIA). La proteína mutante de fXa se expresó en medio libre de suero y el medio acondicionado se recogió y se procesó para purificación.
La proteína diana en el medio se puede aislar mediante cromatografía de intercambio iónico y purificarse posteriormente mediante cromatografía de afinidad de etapa única (tal como un anticuerpo anti-fXa acoplado a una 35 matriz) o mediante una combinación de varias etapas de cromatografía, tales como matrices hidrófobas. Las purificaciones por afinidad pueden incluir material cromatográfico que se une selectivamente al sitio activo escindido de fXa, tal como benzamidina-sefarosa o inhibidor de tripsina de soja-agarosa (STI-agarosa).
La figura 15 muestra las transferencias de Western de mutante de fXa purificado por afinidad (STI-Agarosa, nº de 40 catálogo de Sigma T0637) usando anticuerpos monoclonales (Enzyme Research Laboratories, FX-EIA) que reconoce la cadena pesada y ligera de fX, respectivamente. Tras la reducción del puente disulfuro que conecta la cadena ligera y pesada, el r-Antídoto muestra la banda de cadena pesada esperada similar a fXa derivado de plasma en la transferencia de Western. La deleción de 6-39 aa en el dominio Gla del mutante de fXa da como resultado una banda de peso molecular más bajo para la cadena ligera de r-Antídoto en comparación con fXa 45 derivado del plasma. Las marcas de peso molecular también pueden verse en la transferencia.
Ejemplo 8. Modelo en ratón in vivo
Se ensayaron el perfil farmacocinético y farmacodinámico (PK-PD) de betrixaban en ratones macho C57B1/6 con o 50 sin la administración de antídoto. La administración oral única de betrixaban se dosificó a 0, 15, 25 y 75 mg/kg para los grupos de control. Se usaron 15 mg/kg para el grupo tratado con antídoto. Una única inyección intravenosa (IV) de antídoto (300 µg/200 µl) o vehículo (solución salina normal, 200 µl) se administró 5 minutos antes del punto temporal de 1,5 h.
55
A las 1,5, 2,0, y 4,0 horas después de la administración oral de betrixaban, los ratones fueron anestesiados con un cóctel de ketamina (SC) y se desangraron por punción cardiaca. Se obtuvieron muestras de sangre (0,5 ml) en 50 µl de citrato trisódico. La INR de sangre total se midió usando cartuchos de HEMOCHRON Jr. (International Technidyne Corporation) según las instrucciones del fabricante. Se preparó plasma pobre en plaquetas de ratón por centrifugación para determinaciones de la concentración plasmática de betrixaban y antídoto (ELISA).
Para experimento con antídoto recombinante (r-antídoto), a los ratones se les administró por vía oral betrixaban a 0, 15, 25 y 75 mg/kg para grupos de control. Se usaron 15 mg/kg para el grupo tratado con antídoto (300 µg/200 µl). Se tomaron muestras a 1,5 h después de la administración oral de betrixaban (5 min. después de la inyección de 5 antídoto).
Tal como se muestra en la figuras 16 y 17 y las tablas 13 y 14, una única inyección (300 µg, IV) de antídoto derivado de plasma (pd-antídoto) o mutante de fXa recombinante (r-antídoto) a ratones después de la administración de betrixaban (15 mg/kg, PO) capturaba eficazmente el inhibitor in vivo. La correlación PK-PD de INR de sangre 10 completa y la concentración plasmática de antídoto (tablas 13-14) indicaba una reducción >50% de betrixaban funcional basándose en mediciones de INR, y justificaron la neutralización eficaz de inhibidores de fXa mediante el antídoto mediante múltiples inyecciones u otros regímenes. Se contempla que estos resultados demuestran que los derivados de fXa de esta invención tienen potencial para actuar como antídotos universales para invertir el efecto anticoagulante de inhibidores de fXa en pacientes con hemorragia u otras urgencias médicas. 15
La figura 22 muestra un experimento en ratón con una sola inyección IV (1 inyección) o dos inyecciones (2 inyecciones) del r-antídoto (n = 5 por grupo, 312 µg/200 µl de r-antídoto) después de la administración oral de betrixaban (15 mg/kg). Para el grupo de inyección única, se tomaron muestras de sangre de ratón a 1 h después de la administración oral de betrixaban. Vehículo (control_1) o r-Antídoto (1 inyección) se administró 5 min antes del 20 punto temporal de 1 h. Para el grupo de doble inyección, se inyectó vehículo o r-antídoto a los 55 min y se repitieron al 115 min después de la administración oral de betrixaban. Se tomaron muestras de sangre de ratón a las 2 h para los ratones tratados con vehículo (control_2) y r-antídoto (2 inyecciones). La INR se midió en función de la relación de antídoto/betrixaban en plasma de ratón después de las inyecciones individuales o dobles del antídoto, tal como se muestra en la figura 22B. 25
Ejemplo 9. Inversión in vitro de rivaroxaban y apixaban mediante antídoto
Como se esperaba, los antídotos contemplados por esta invención también fueron capaces de unirse a y neutralizar otros inhibidores de fXa dirigidos al sitio activo. Las tablas 15 y 16 muestran corrección in vitro de la inhibición por 30 betrixaban, rivaroxaban y apixaban mediante pd-antídoto y r-antídoto. FXa purificado (3,0 nM), inhibidor (7,5 nM), y diferentes concentraciones de antídoto se incubaron durante 10 min a 22°C en un tampón con Tris 20 mM, NaCl 150 mM, BSA al 0,1%, pH 7,4. La actividad de fXa se ensayó similar al ejemplo 4.
Tal como se muestra en la tabla 15, pd-antídoto 204 nM produce al menos el 60% de corrección de los efectos 35 inhibidores de inhibidores de la prueba, mientras que, en la tabla 16se consigue >95% de corrección de inhibición mediante el r-antídoto (186 nM) para betrixaban y rivaroxaban y > 70% inversión de apixaban.
Ejemplo 10. Inversión in vitro de betrixaban mediante r-antídoto
40
En la tabla 17, se ensayó el efecto de la proteína antídoto recombinante sobre la inversión de la anticoagulación por betrixaban en un ensayo de coagulación en plasma humano. El efecto de betrixaban 300 nM y 400 nM sobre una prolongación del aPTT de plasma y la inversión del efecto inhibidor se midió mediante un temporizador de coagulación automático MLA Electra 800. 100 µl de plasma humano anticoagulado combinado se mezclaron con betrixaban 300 nM o 400 nM y diferentes concentraciones de antídoto. Se añadieron reactivo de aPTT (Actin FS, 45 Dade Behring) y CaCl2 según las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 11. Inversión in vitro de heparina de bajo peso molecular (“LMWH”) mediante r-antídoto
En la figura 18, se ensayó el efecto de r-antídoto para invertir el efecto inhibidor de la LMWH enoxaparina (Sanofi-50 Aventis) mediante cambios de turbidez en plasma humano. Se incubó enoxaparina (0-1,25 U/ml) a 22°C durante 20 min con o sin r-antídoto 508 nM. Se midieron cambios de turbidez de acuerdo con procedimiento descritos en el ejemplo 3. El r-antídoto 508 nM sustancialmente corregía (>75%) el efecto inhibidor de 0,3125-1,25 U/ml de enoxaparina.
55
En la figura 19, se ensayó el efecto de r-antídoto sobre la inversión de anticoagulación mediante una heparina de bajo peso molecular (LMWH enoxaparina, Sanofi-Aventis) en un ensayo de coagulación en plasma humano. El efecto de 1 unidad de antiXa/ml de LMWH sobre una prolongación del aPTT de plasma y la inversión del efecto inhibidor se midió mediante un temporizador de coagulación automático MLA Electra 800. 100 µl de plasma humano anticoagulado con citrato combinado se mezclaron con enoxaparina y diferentes concentraciones de antídoto. Antes de la medición del tiempo de coagulación, se añadieron reactivo de aPTT (Actin FS, Dade Behring) y CaClanticoagulado con citrato combinado se mezclaron con enoxaparina y diferentes concentraciones de antídoto. Antes de la medición del tiempo de coagulación, se añadieron reactivo de aPTT (Actin FS, Dade Behring) y CaClanticoagulado con citrato combinado se mezclaron con enoxaparina y diferentes concentraciones de antídoto. Antes de la medición del tiempo de coagulación, se añadieron reactivo de aPTT (Actin FS, Dade Behring) y CaCl
5
Ejemplo 12. Inversión in vitro de rivaroxaban mediante r-antídoto
En la figura 20, se ensayó el efecto de proteína de antídoto recombinante sobre la inversión de anticoagulación mediante un inhibidor del factor Xa de molécula pequeña (rivaroxaban, Bay 59-7939) en un ensayo de coagulación en plasma humano. Según lo descrito por Perzborn y col., J. Thromb. Haemost. 3: 514-521, 2005; las mediciones del 10 tiempo de protrombina son un procedimiento preciso para evaluar el efecto anticoagulante de rivaroxaban. El efecto de rivaroxaban 1 µM sobre la prolongación del tiempo de protrombina (PT) de plasma humano combinado y la inversión del efecto inhibidor se midió mediante un temporizador de coagulación automático MLA Electra 800. 100 µl de plasma humano anticoagulado con citrato combinado se mezclaron con rivaroxaban y diferentes concentraciones de antídoto. Antes de la medición del tiempo de coagulación, se añadió reactivo Thromboplastin C Plus de cerebro 15 de conejo (Dade Behring) a muestras de plasma según las instrucciones del fabricante. La adición de anticuerpo recombinante 1,9 µM produjo una corrección del 100% de la anticoagulación producida por rivaroxaban 1 µM.
Ejemplo 13. Inversión in vitro de apixaban mediante r-antídoto
20
En la tabla 18, se ensayó el efecto de proteína de antídoto recombinante sobre la inversión de anticoagulación mediante apixaban en un ensayo de coagulación en plasma humano. Según lo descrito por Pinto y col., J. Med. Chem. 55(22): 5339-5356, 2007; las mediciones del tiempo protrombina (PT) son un procedimiento preciso de evaluar los efectos anticoagulantes ex vivo de apixaban. El efecto de apixaban 1 µM y 1,5 µM sobre la prolongación del tiempo de protrombina (PT) de plasma humano combinado y la inversión del efecto inhibidor se midió mediante 25 un temporizador de coagulación automático MLA Electra 800. 100 µl de plasma humano anticoagulado con citrato combinado se mezclaron con apixaban y diferentes concentraciones de antídoto. Antes de la medición del tiempo de coagulación, se añadió reactivo Thromboplastin C Plus de cerebro de conejo (Dade Behring) a muestras de plasma según las instrucciones del fabricante. La adición de antídoto recombinante 1,9 µM produjo una corrección del 97% de la anticoagulación producida por apixaban 1,5 µM. 30
Ejemplo 14. Inhibición in vitro de argatroban mediante des-Gla anhidro-fXa
Para medir la inhibición de la actividad de trombina mediante argatroban y la inversión de su efecto inhibidor, se añadieron trombina humana purificada (5 nM), argatroban (50 nM) y diferentes concentraciones de antídoto des-Gla 35 anhidro fXa a un tampón que contenía Tris 20 mM, NaCl 0,15 M, cloruro cálcico 5 mM, albúmina de suero bovino al 0,1%, pH 7,4. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 20 min, se añadió un sustrato amidolítico S2288 (200 µM) a la mezcla y la velocidad de escisión de sustrato de p-nitroanilida se monitorizó mediante absorbancia a 405 nm. Los resultados se presentan en la figura 12.
40
Debe entenderse que, aunque la invención se ha descrito junto con las realizaciones anteriores, la descripción y los ejemplos anteriores pretenden ilustrar y no limitar el alcance de la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del alcance de la invención serán evidentes para los expertos en la materia a la que pertenece la invención.
45
Tabla 13 correlación PK-PD en ratones tratados con pd-antídoto a 1,5 h después de la administración oral de 15 mg/kg de Betrixaban (5 min después de la inyección del antídoto)
- Animal tratado con pd-Antídoto
- 1 2 3 4 5 6 7 media
- Betrixaban (ng/ml)
- 673 793 1170 415 217 664 879 687
- INR esperada
- 4,2 4,5 5,2 3,3 2,3 4,1 4,7 4,0
- INR medida
- 2,3 2,3 3,3 0,8 0,8 1,5 2,0 1,9
- % de corrección
- 63,9 66,6 52,3 100 100 83,1 74,4 77,2
Tabla 14-correlación PK-PD en ratones tratados con r-Antídoto a 1,5 h después de la administración oral de 15 mg/kg de Betrixaban (5 min después de la inyección del antídoto)
- Animal tratado con r-Antídoto
- 1 2 3 4 Media
- Betrixaban (ng/ml)
- 434 262 335 494 381
- INR esperada
- 3,2 2,5 2,8 3,5 3,0
- INR medida
- 2,0 0,9 1,2 0,9 1,3
- % de corrección
- 50,0 94,1 80,0 93,6 77,3
Tabla 15-% de corrección de inhibición mediante inhibidores de fXa
- pd-Antídoto (nM)
- Betrixaban Rivaroxaban Apixaban
- 0
- 0
- 0
- 0
- 10,2
- 13,1 10,6 6,5
- 20,4
- 34,8 37,4 11,4
- 40,7
- 47,1 46,8 15,0
- 61,1
- 68,4 55,7 40,3
- 101,8
- 67,5 69,4 52,3
- 162,9
- 80,5 74,0 56,0
- 203,7
- 82,6 72,6 60,2
5
Tabla 16-% de corrección de inhibición mediante inhibidores de fXa
- r-Antídoto (nM)
- Betrixaban Rivaroxaban Apixaban
- 0
- 0
- 0
- 0
- 9,3
- 21,5 23,2 13,3
- 18,6
- 52,7 54,2 33,5
- 37,2
- 75,5 72,6 49,9
- 55,8
- 86,5 79,9 59,2
- 93,1
- 94,9 89,1 64,4
- 148,9
- 99,3 96,7 74,8
- 186,1
- 99,5 94,8 72,6
Tabla 17 inversión con r-antídoto de la actividad anticoagulante de betrixaban
- aPTT (s) Veces de cambio % de corrección de anticoagulación
- Plasma humano de control
- 35,2 1,00 -
- Betrixaban 300 nM
- 61,8 1,76 -
- Betrixaban 300 nM + r-antídoto 570 nM
- 38,3 1,09 88
- Betrixaban 300 nM + r-antídoto 760 nM
- 38,2 1,09 88
- Betrixaban 300 nM + r-antídoto 1140 nM
- 38,1 1,08 90
- Betrixaban 400 nM
- 66,3 1,88 -
- Betrixaban 400 nM + r-antídoto 380 nM
- 47,1 1,34 61
- Betrixaban 400 nM + r-antídoto 570 nM
- 39,9 1,13 85
- Betrixaban 400 nM + r-antídoto 760 nM
- 39,9 1,13 85
- Betrixaban 400 nM + r-antídoto 1140 nM
- 37,8 1,07 92
- Betrixaban 400 nM + r-antídoto 1520 nM
- 39,4 1,12 86
- r-antídoto 1140 nM
- 38,9 1,11 -
- r-antídoto 1520 nM
- 38,8 1,10 -
10
Tabla 18-inversión con r-antídoto de la actividad anticoagulante de Apixaban
- PT (s) Veces de cambio
- Plasma humano de control
- 14,1 -
- 1 µM de apixaban
- 16,4 1,16
- 1 µM de apixaban + r-antídoto 380 nM
- 15,3 1,09
- 1 µM de apixaban + r-antídoto 760 nM
- 14,9 1,06
- 1 µM de apixaban + 1,14 µM de r-antídoto
- 14,2 1,01
- 1 µM de apixaban + 1,52 µM de r-antídoto
- 14,2 1,01
- 1,5 µM de apixaban
- 18,4 1,31
Claims (12)
- REIVINDICACIONES1. Un derivado de fXa que es un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 12.5
- 2. Un derivado de fXa que es un polipéptido bicatenario aislado que tiene un fragmento de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 14 y un fragmento de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 15.
- 3. Un derivado de fXa que es un polipéptido bicatenario aislado que comprende la secuencia de 10 aminoácidos de la SEQ ID NO. 13.
- 4. Un procedimiento para preparar un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende expresar un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO. 16 en una célula huésped procariota o eucariota. 15
- 5. Un polipéptido bicatenario obtenible mediante el procedimiento de la reivindicación 4.
- 6. Una composición farmacéutica que comprende un transportador y un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o 5. 20
- 7. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
- 8. La composición de la reivindicación 6, para uso en un procedimiento de prevención o reducción de 25 hemorragia en un sujeto sometido a terapia anticoagulante con un inhibidor del factor Xa.
- 9. La composición de la reivindicación 6, para uso en un procedimiento de unión de forma selectiva e inhibición del factor Xa administrado de forma exógena para el tratamiento de sobreanticoagulación.30
- 10. La composición para el uso de la reivindicación 8 o 9, donde el inhibidor del factor Xa es un inhibidor del factor Xa directo.
- 11. La composición para el uso de la reivindicación 8 o 9, donde el inhibidor del factor Xa es un inhibidor del factor Xa indirecto. 35
- 12. La composición para el uso de la reivindicación 10 o 11, donde el inhibidor del factor Xa se selecciona de entre el grupo que consiste en fondaparinux, idraparinux, idraparinux biotinilado, enoxaparina, fragmina, NAP-5, rNAPc2, inhibidor de la ruta del factor tisular, DX-9065a, YM-60828, YM-150, apixaban, rivaroxaban, PD-348292, otamixaban, DU-176b, LY517717, GSK913893, razaxaban, heparina de bajo peso molecular, betrixaban o una sal 40 farmacéuticamente aceptable del mismo, y combinaciones de los mismos.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US97634307P | 2007-09-28 | 2007-09-28 | |
US976343P | 2007-09-28 | ||
US9057408P | 2008-08-20 | 2008-08-20 | |
US90574P | 2008-08-20 | ||
PCT/US2008/078014 WO2009042962A2 (en) | 2007-09-28 | 2008-09-26 | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2597436T3 true ES2597436T3 (es) | 2017-01-18 |
Family
ID=40481812
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES08834136.7T Active ES2597436T3 (es) | 2007-09-28 | 2008-09-26 | Antídotos para inhibidores del factor Xa y procedimientos de uso de los mismos |
ES16167534T Active ES2796623T3 (es) | 2007-09-28 | 2008-09-26 | Antídotos para inhibidores del factor Xa y procedimientos de uso de los mismos |
ES14197779T Active ES2849426T3 (es) | 2007-09-28 | 2008-09-26 | Antídotos para inhibidores del factor Xa y procedimientos de uso de los mismos |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES16167534T Active ES2796623T3 (es) | 2007-09-28 | 2008-09-26 | Antídotos para inhibidores del factor Xa y procedimientos de uso de los mismos |
ES14197779T Active ES2849426T3 (es) | 2007-09-28 | 2008-09-26 | Antídotos para inhibidores del factor Xa y procedimientos de uso de los mismos |
Country Status (27)
Country | Link |
---|---|
US (8) | US8153590B2 (es) |
EP (4) | EP2915564B1 (es) |
JP (6) | JP5637561B2 (es) |
KR (4) | KR102271404B1 (es) |
CN (4) | CN101802188B (es) |
AU (6) | AU2008304192B9 (es) |
BR (2) | BRPI0816837B1 (es) |
CA (1) | CA2697583C (es) |
CY (2) | CY1118482T1 (es) |
DK (3) | DK2915564T3 (es) |
ES (3) | ES2597436T3 (es) |
FR (1) | FR20C1045I2 (es) |
HK (1) | HK1210443A1 (es) |
HR (2) | HRP20161255T1 (es) |
HU (4) | HUE050063T2 (es) |
IL (4) | IL203993A (es) |
LT (3) | LT2193196T (es) |
MX (1) | MX2010003095A (es) |
NL (1) | NL301063I2 (es) |
NO (2) | NO2019040I1 (es) |
NZ (1) | NZ583944A (es) |
PL (3) | PL3078743T3 (es) |
PT (3) | PT2915564T (es) |
SG (1) | SG185263A1 (es) |
SI (3) | SI2193196T1 (es) |
WO (1) | WO2009042962A2 (es) |
ZA (2) | ZA201002039B (es) |
Families Citing this family (58)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7696352B2 (en) * | 2004-06-18 | 2010-04-13 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Factor Xa inhibitors |
TW200813017A (en) | 2006-05-05 | 2008-03-16 | Millennium Pharm Inc | Factor XA inhibitors |
PT2915564T (pt) | 2007-09-28 | 2021-02-09 | Alexion Pharma Inc | Antídotos para inibidores do fator xa e métodos de utilização dos mesmos |
US8455439B2 (en) | 2008-11-14 | 2013-06-04 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor Xa inhibitors and methods of using the same in combination with blood coagulating agents |
JP5739816B2 (ja) | 2008-12-19 | 2015-06-24 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドBaxter International Incorp0Rated | Tfpiインヒビターおよび使用法 |
ES2607935T3 (es) | 2009-03-30 | 2017-04-04 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antídotos para inhibidores del factor Xa y procedimientos de uso de los mismos |
WO2011008885A1 (en) | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Unit dose formulation of antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
GB0916576D0 (en) * | 2009-09-22 | 2009-10-28 | Malmsten Nils M | Polypeptides and uses thereof |
EP2316931B1 (de) | 2009-10-30 | 2016-12-28 | Senova Gesellschaft für Biowissenschaft und Technik mbH | Polymergekoppelte Peptidasen |
US8742120B2 (en) | 2009-12-17 | 2014-06-03 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods of preparing factor xa inhibitors and salts thereof |
EP2513094B1 (en) * | 2009-12-17 | 2015-12-16 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Crystalline salts of a factor xa inhibitor |
AR079944A1 (es) * | 2010-01-20 | 2012-02-29 | Boehringer Ingelheim Int | Anticuerpo neutralizante de la actividad de un anticoagulante |
WO2011115712A2 (en) | 2010-03-19 | 2011-09-22 | Baxter International Inc | Tfpi inhibitors and methods of use |
TW201221128A (en) | 2010-09-01 | 2012-06-01 | Portola Pharm Inc | Crystalline forms of a factor Xa inhibitor |
TW201240664A (en) * | 2010-09-01 | 2012-10-16 | Portola Pharm Inc | Methods and formulations of treating thrombosis with betrixaban and a P-glycoprotein inhibitor |
CA2824885A1 (en) * | 2011-01-19 | 2012-07-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Binding proteins to inhibitors of coagulation factors |
FR2972114B1 (fr) * | 2011-03-01 | 2013-03-15 | Univ Grenoble 1 | Un nouveau leurre moleculaire procoagulant pour le traitement des hemophiles a ou b avec ou sans inhibiteur |
EP2691156A1 (en) | 2011-03-30 | 2014-02-05 | Boehringer Ingelheim International GmbH | Anticoagulant antidotes |
US9371522B2 (en) | 2011-09-30 | 2016-06-21 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for modulating hemostasis |
KR101892330B1 (ko) * | 2011-11-29 | 2018-08-27 | 페로스피어 파마슈티컬스 인코포레이티드 | 항응혈 역전 물질들 |
CN104254603A (zh) | 2012-02-14 | 2014-12-31 | 博尔托拉制药公司 | 用于制备xa因子抑制剂的重组解毒剂的方法 |
US20160015793A1 (en) * | 2012-02-16 | 2016-01-21 | Portola Pharmacueticals, Inc. | Modulation of factor xa inhibitor mediated blood loss by partial and transient administration of antidote |
WO2013141965A1 (en) | 2012-03-21 | 2013-09-26 | Baxter International Inc. | Tfpi inhibitors and methods of use |
US20150239929A1 (en) * | 2012-06-14 | 2015-08-27 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Method for purification of recombinant factor xa derivatives |
IN2015DN01404A (es) | 2012-07-25 | 2015-07-03 | Catalyst Biosciences Inc | |
US9200268B2 (en) | 2012-12-27 | 2015-12-01 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for purification of serine proteases |
FR3000895B1 (fr) * | 2013-01-11 | 2017-02-24 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Sa | Utilisation d'antidotes d'inhibiteurs de la coagulation indiques dans la prevention ou le traitement de pathologies thromboemboliques |
EP2948168B1 (en) * | 2013-01-24 | 2018-07-18 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Inhibition of tissue factor pathway inhibitor with factor xa derivatives |
ES2761730T3 (es) | 2013-01-31 | 2020-05-20 | Pfizer | Composiciones y procedimientos para contrarrestar la inhibición del factor Xa |
FR3007410B1 (fr) * | 2013-06-21 | 2016-05-27 | Lab Francais Du Fractionnement | Facteur x depourvu de domaine gla |
CN105579468A (zh) | 2013-09-24 | 2016-05-11 | 辉瑞大药厂 | 包含重组人凝血因子Xa蛋白的异质性群体的组合物 |
JP6629744B2 (ja) * | 2013-11-01 | 2020-01-15 | ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアThe Children’S Hospital Of Philadelphia | 第Xa因子の半減期を延ばす組成物および方法 |
SI3149163T1 (sl) * | 2014-05-26 | 2020-10-30 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Prohemostatski proteini za zdravljenje krvavitve |
ES2907190T3 (es) * | 2014-07-31 | 2022-04-22 | Haemonetics Corp | Detección de la reversión de un anticoagulante mediante pruebas de coagulación por ecarina y factor Xa |
US10676731B2 (en) | 2014-08-19 | 2020-06-09 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for modulating factor IX function |
CA2961739C (en) | 2014-08-20 | 2024-04-30 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Lyophilized formulations for factor xa antidote |
CN105030703B (zh) * | 2015-06-23 | 2018-03-23 | 上海旭东海普药业有限公司 | 一种防治疗栓塞性疾病的利伐沙班片及其制备方法 |
US9849125B1 (en) | 2015-11-03 | 2017-12-26 | Banner Lifie Sciences LLC | Anti-overingestion dosage forms |
CN108883160B (zh) * | 2016-02-24 | 2022-06-28 | 博尔托拉制药公司 | 因子xa解毒剂的冻干制剂 |
US10640822B2 (en) | 2016-02-29 | 2020-05-05 | Iridia, Inc. | Systems and methods for writing, reading, and controlling data stored in a polymer |
US10438662B2 (en) | 2016-02-29 | 2019-10-08 | Iridia, Inc. | Methods, compositions, and devices for information storage |
JP2019512480A (ja) * | 2016-02-29 | 2019-05-16 | イリディア・インコーポレイテッドIridia, Inc. | 情報保存のための方法、組成物およびデバイス |
US10859562B2 (en) | 2016-02-29 | 2020-12-08 | Iridia, Inc. | Methods, compositions, and devices for information storage |
TW201802121A (zh) | 2016-05-25 | 2018-01-16 | 諾華公司 | 抗因子XI/XIa抗體之逆轉結合劑及其用途 |
EP3472314B1 (en) | 2016-06-17 | 2021-05-05 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Preparation of factor xa derivatives |
WO2018115235A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antidotes to anti-coagulant drugs allowing diagnosis and treatment |
US11168147B2 (en) | 2016-12-23 | 2021-11-09 | Novartis Ag | Factor XI antibodies and methods of use |
US10335375B2 (en) | 2017-05-30 | 2019-07-02 | Patheon Softgels, Inc. | Anti-overingestion abuse deterrent compositions |
CN111246821A (zh) * | 2017-08-21 | 2020-06-05 | 美国绿阳生物技术及医药公司 | 光吸收组合物和使用方法 |
EP3710486A1 (en) | 2017-11-15 | 2020-09-23 | Novo Nordisk A/S | Factor x binders enhancing fx activation |
WO2019246094A1 (en) * | 2018-06-19 | 2019-12-26 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes to factor xa inhibitors |
KR20210044245A (ko) * | 2018-08-14 | 2021-04-22 | 지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드 | 주사가능 약학 조성물 및 이의 제조 방법 |
US11655465B1 (en) | 2019-05-02 | 2023-05-23 | Iridia, Inc. | Enzymes and systems for synthesizing DNA |
WO2021026254A2 (en) * | 2019-08-08 | 2021-02-11 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for preparing factor xa and derivatives |
US11837302B1 (en) | 2020-08-07 | 2023-12-05 | Iridia, Inc. | Systems and methods for writing and reading data stored in a polymer using nano-channels |
CN113484386B (zh) * | 2021-05-21 | 2024-02-13 | 郑州轻工业大学 | 一种金属聚酞菁纳米材料的制备方法及其应用,适配体传感器及其制备方法 |
CN114681597A (zh) * | 2022-03-11 | 2022-07-01 | 兆科药业(合肥)有限公司 | 蝰蛇蛇毒血凝酶在制备用于逆转凝血因子Xa抑制剂的抗凝作用的药物中的应用 |
CN116327627B (zh) * | 2023-03-10 | 2024-06-07 | 四川大学 | 一种四面体框架核酸-光甘草定复合物及其在皮肤美白方面的用途 |
Family Cites Families (96)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CH596313A5 (es) * | 1975-05-30 | 1978-03-15 | Battelle Memorial Institute | |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4754065A (en) | 1984-12-18 | 1988-06-28 | Cetus Corporation | Precursor to nucleic acid probe |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
EP1186660A3 (fr) | 1985-03-30 | 2002-03-20 | KAUFFMAN, Stuart A. | Procédé d'obtension d'ADN, ARN, peptides, polypeptides ou protéines, par une technique de recombination d'ADN |
US5837249A (en) | 1985-04-19 | 1998-11-17 | The Wistar Institute | Method for generating an immunogenic T cell response protective against a virus |
US4818700A (en) | 1985-10-25 | 1989-04-04 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof |
US5618920A (en) | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
US4812405A (en) | 1986-02-18 | 1989-03-14 | Phillips Petroleum Company | Double auxotrophic mutants of Pichia pastoris and methods for preparation |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
US4704692A (en) | 1986-09-02 | 1987-11-03 | Ladner Robert C | Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides |
US5763192A (en) | 1986-11-20 | 1998-06-09 | Ixsys, Incorporated | Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique |
EP0279582A3 (en) | 1987-02-17 | 1989-10-18 | Pharming B.V. | Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion |
US6270961B1 (en) | 1987-04-01 | 2001-08-07 | Hyseq, Inc. | Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification |
US5202231A (en) | 1987-04-01 | 1993-04-13 | Drmanac Radoje T | Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes |
US5229490A (en) | 1987-05-06 | 1993-07-20 | The Rockefeller University | Multiple antigen peptide system |
US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
US4929555A (en) | 1987-10-19 | 1990-05-29 | Phillips Petroleum Company | Pichia transformation |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5120537A (en) * | 1989-06-14 | 1992-06-09 | Oklahoma Medical Research Foundation | Factor xa based anticoagulant compositions |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
US6075181A (en) | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5686073A (en) | 1990-05-23 | 1997-11-11 | The University Of Iowa Research Foundation | Polyclonal and monoclonal antibodies against a 43 KDA dystrophin associated protein |
EP0542810A1 (en) | 1990-08-02 | 1993-05-26 | B.R. Centre Limited | Methods for the production of proteins with a desired function |
US5597799A (en) * | 1990-09-04 | 1997-01-28 | Cor Therapeutics, Inc. | Recombinant agents affecting thrombosis |
US5583107A (en) * | 1990-09-04 | 1996-12-10 | Cor Therapeutics, Inc. | Agents affecting thrombosis and hemostasis |
US5278144A (en) * | 1990-09-04 | 1994-01-11 | Cor Therapeutics, Inc. | Antithrombosis agents |
WO1992013878A2 (en) | 1991-02-07 | 1992-08-20 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Conformationally restricted mimetics of beta turns and beta bulges and peptides containing the same |
US6797492B2 (en) | 1991-05-17 | 2004-09-28 | Merck & Co., Inc. | Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains |
EP0519596B1 (en) | 1991-05-17 | 2005-02-23 | Merck & Co. Inc. | A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains |
RU2212899C2 (ru) | 1991-09-13 | 2003-09-27 | Чирон Корпорейшн | Hcv иммунореактивные полипептидные композиции |
WO1993009804A1 (en) | 1991-11-18 | 1993-05-27 | The Scripps Research Institute | Serine protease derived-polypeptides and anti-peptide antibodies, systems and therapeutic methods for inhibiting coagulation |
DK1136556T3 (da) | 1991-11-25 | 2005-10-03 | Enzon Inc | Fremgangsmåde til fremstilling af multivalente antigen-bindende proteiner |
US5766886A (en) | 1991-12-13 | 1998-06-16 | Xoma Corporation | Modified antibody variable domains |
DE4203965A1 (de) | 1992-02-11 | 1993-08-12 | Max Planck Gesellschaft | Antidot fuer hirudin und synthetische thrombininhibitoren |
AU681074B2 (en) | 1992-03-20 | 1997-08-21 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Glycosylation-mediated inhibition of factor X |
JP3532566B2 (ja) | 1993-06-24 | 2004-05-31 | エル. グラハム,フランク | 遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター |
US5858659A (en) | 1995-11-29 | 1999-01-12 | Affymetrix, Inc. | Polymorphism detection |
DE69434594T2 (de) | 1993-10-25 | 2006-09-21 | Canji, Inc., San Diego | Rekombinante adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung |
US5455338A (en) | 1993-11-05 | 1995-10-03 | Zymogenetics, Inc. | DNA encoding novel human kunitz-type inhibitors and methods relating thereto |
US5952172A (en) | 1993-12-10 | 1999-09-14 | California Institute Of Technology | Nucleic acid mediated electron transfer |
US5827690A (en) | 1993-12-20 | 1998-10-27 | Genzyme Transgenics Corporatiion | Transgenic production of antibodies in milk |
US7252989B1 (en) | 1994-04-04 | 2007-08-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Adenovirus supervector system |
DE4430205A1 (de) * | 1994-08-26 | 1996-02-29 | Behringwerke Ag | Zusammensetzungen, die als Gegenmittel für Blut-Antikoagulanzien geeignet sind und deren Verwendung |
US5589571A (en) * | 1994-10-28 | 1996-12-31 | Cor Therapeutics, Inc. | Process for production of inhibited forms of activated blood factors |
AT404357B (de) | 1995-06-13 | 1998-11-25 | Immuno Ag | Prothrombin-derivate |
US5968740A (en) | 1995-07-24 | 1999-10-19 | Affymetrix, Inc. | Method of Identifying a Base in a Nucleic Acid |
US5955349A (en) | 1996-08-26 | 1999-09-21 | Zymogenetics, Inc. | Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica |
DE19605126A1 (de) | 1996-02-12 | 1997-08-14 | Basf Ag | Thrombinmuteine als Antidot für Thrombininhibitoren |
US5714352A (en) | 1996-03-20 | 1998-02-03 | Xenotech Incorporated | Directed switch-mediated DNA recombination |
US6200955B1 (en) | 1996-06-11 | 2001-03-13 | Commonwealth Biotechnologies, Inc. | Heparin binding peptides |
US5736383A (en) | 1996-08-26 | 1998-04-07 | Zymogenetics, Inc. | Preparation of Pichia methanolica auxotrophic mutants |
US6709659B1 (en) | 1996-08-02 | 2004-03-23 | Zymogenetics, Inc. | Antibodies that bind testis-specific insulin homolog polypeptides |
SE9604744D0 (sv) | 1996-12-20 | 1996-12-20 | Pharmacia & Upjohn Ab | A modified coagulation agent |
AT405516B (de) | 1997-02-27 | 1999-09-27 | Immuno Ag | Faktor x-analoge mit modifizierter proteasespaltstelle |
AT405517B (de) | 1997-02-27 | 1999-09-27 | Immuno Ag | Faktor x-deletionsmutanten und analoge davon |
AU6673898A (en) * | 1997-03-07 | 1998-09-22 | Washington University | Factor x variant |
JPH1149800A (ja) | 1997-06-05 | 1999-02-23 | Fujimori Kogyo Kk | アンヒドロトロンビンの合成方法 |
PT1071700E (pt) | 1998-04-20 | 2010-04-23 | Glycart Biotechnology Ag | Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos |
US6322788B1 (en) | 1998-08-20 | 2001-11-27 | Stanley Arthur Kim | Anti-bacterial antibodies and methods of use |
PT1135498E (pt) | 1998-11-18 | 2008-04-30 | Genentech Inc | Variantes de anticorpos com maior afinidade de ligação em comparação com os anticorpos parentais |
WO2000054787A1 (en) | 1999-03-16 | 2000-09-21 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Enhanced gamma-carboxylation of recombinant vitamin k-dependent clotting factors |
US6624141B1 (en) | 1999-03-17 | 2003-09-23 | The Regents Of The University Of Michigan | Protamine fragment compositions and methods of use |
US6258559B1 (en) | 1999-03-22 | 2001-07-10 | Zymogenetics, Inc. | Method for producing proteins in transformed Pichia |
US6939545B2 (en) | 1999-04-28 | 2005-09-06 | Genetics Institute, Llc | Composition and method for treating inflammatory disorders |
US6858599B2 (en) | 1999-06-30 | 2005-02-22 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Tricyclic compound having spiro union |
AT411997B (de) * | 1999-09-14 | 2004-08-26 | Baxter Ag | Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper und antikörper-derivate |
EP1095933A1 (en) | 1999-10-30 | 2001-05-02 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Novel N-guanidinoalkylamides, their preparation, their use, and pharmaceutical preparations comprising them |
EP1259485B1 (en) | 2000-02-29 | 2005-11-30 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | BENZAMIDES AND RELATED INHIBITORS OF FACTOR Xa |
WO2001068605A1 (en) | 2000-03-13 | 2001-09-20 | Pharmacia Corporation | Polycyclic aryl and heteroaryl substituted benzenes useful for selective inhibition of the coagulation cascade |
MXPA03002049A (es) | 2000-09-08 | 2003-07-24 | Schering Corp | Genes de mamiferos: reactivos y metodos relacionados. |
US7070740B1 (en) | 2000-09-28 | 2006-07-04 | Beckman Coulter, Inc. | Method and apparatus for processing biomolecule arrays |
US20030064414A1 (en) | 2001-03-30 | 2003-04-03 | Benecky Michael J. | Rapid assessment of coagulation activity in whole blood |
WO2002090599A1 (en) | 2001-05-09 | 2002-11-14 | Genetic Id, Inc. | Universal microarray system |
US6989267B2 (en) | 2001-07-02 | 2006-01-24 | Agilent Technologies, Inc. | Methods of making microarrays with substrate surfaces having covalently bound polyelectrolyte films |
DE10155075A1 (de) * | 2001-11-09 | 2003-05-22 | Merck Patent Gmbh | Cyclische Sulfonamide |
US6861236B2 (en) | 2002-05-24 | 2005-03-01 | Applied Nanosystems B.V. | Export and modification of (poly)peptides in the lantibiotic way |
CN1480466A (zh) * | 2002-09-03 | 2004-03-10 | �й������ž�����ҽѧ��ѧԺ����ҽ | 一类溶栓抗凝双功能融合蛋白及应用 |
US20040198660A1 (en) | 2002-11-06 | 2004-10-07 | Petersen Lars Christian | Tissue factor antagonist and protein C polypeptide compositions |
US7247654B2 (en) | 2003-06-04 | 2007-07-24 | Bristol-Myers Squibb Company | 3,4-disubstituted benzamidines and benzylamines, and analogues thereof, useful as serine protease inhibitors |
WO2005088310A2 (en) | 2004-03-05 | 2005-09-22 | The Scripps Research Institute | High throughput glycan microarrays |
JP4441336B2 (ja) | 2004-06-11 | 2010-03-31 | 日本碍子株式会社 | マイクロアレイの製造方法 |
US9223929B2 (en) | 2005-03-14 | 2015-12-29 | The California Institute Of Technology | Method and apparatus for detection, identification and quantification of single-and multi-analytes in affinity-based sensor arrays |
US7119179B1 (en) | 2005-03-21 | 2006-10-10 | Los Alamos National Security, Llc | Preparation of high nitrogen compound and materials therefrom |
WO2006102687A1 (en) | 2005-03-22 | 2006-09-28 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | A liposome-based microarray and methods of use thereof |
JP5227178B2 (ja) | 2005-11-08 | 2013-07-03 | ミレニアム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | N−(5−クロロ−2−ピリジニル)−2−[[4−[(ジメチルアミノ)イミノメチル]ベンゾイル]アミノ]−5−メトキシ−ベンズアミド、第Xa因子阻害剤の薬学的な塩および多形体 |
US20070111322A1 (en) | 2005-11-15 | 2007-05-17 | Lin-Cheng Yang | Novel method of using inject printing for creating microarrays |
MX2008006313A (es) | 2005-11-15 | 2008-11-06 | Philadelphia Children Hospital | Metodos y composiciones para modular la hemostasia. |
EP1820508A1 (en) | 2006-02-21 | 2007-08-22 | CSL Behring GmbH | Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties |
PT2915564T (pt) * | 2007-09-28 | 2021-02-09 | Alexion Pharma Inc | Antídotos para inibidores do fator xa e métodos de utilização dos mesmos |
US8455439B2 (en) * | 2008-11-14 | 2013-06-04 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor Xa inhibitors and methods of using the same in combination with blood coagulating agents |
JP5833448B2 (ja) | 2008-12-19 | 2015-12-16 | アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル | セリンプロテアーゼ誘導体および血液凝固疾患の予防または処置における使用 |
ES2607935T3 (es) * | 2009-03-30 | 2017-04-04 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antídotos para inhibidores del factor Xa y procedimientos de uso de los mismos |
WO2011008885A1 (en) | 2009-07-15 | 2011-01-20 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Unit dose formulation of antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
-
2008
- 2008-09-26 PT PT141977793T patent/PT2915564T/pt unknown
- 2008-09-26 DK DK14197779.3T patent/DK2915564T3/da active
- 2008-09-26 KR KR1020207001549A patent/KR102271404B1/ko active IP Right Grant
- 2008-09-26 BR BRPI0816837-7A patent/BRPI0816837B1/pt active IP Right Grant
- 2008-09-26 DK DK08834136.7T patent/DK2193196T3/en active
- 2008-09-26 PT PT88341367T patent/PT2193196T/pt unknown
- 2008-09-26 KR KR1020177023761A patent/KR20170100071A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-09-26 CN CN2008801079738A patent/CN101802188B/zh active Active
- 2008-09-26 KR KR1020167003860A patent/KR102069498B1/ko active IP Right Grant
- 2008-09-26 LT LTEP08834136.7T patent/LT2193196T/lt unknown
- 2008-09-26 HU HUE16167534A patent/HUE050063T2/hu unknown
- 2008-09-26 CN CN2011104472050A patent/CN102533702A/zh active Pending
- 2008-09-26 HU HUE08834136A patent/HUE031647T2/en unknown
- 2008-09-26 LT LTEP16167534.3T patent/LT3078743T/lt unknown
- 2008-09-26 PL PL16167534T patent/PL3078743T3/pl unknown
- 2008-09-26 SG SG2012072716A patent/SG185263A1/en unknown
- 2008-09-26 AU AU2008304192A patent/AU2008304192B9/en active Active
- 2008-09-26 EP EP14197779.3A patent/EP2915564B1/en active Active
- 2008-09-26 JP JP2010527220A patent/JP5637561B2/ja active Active
- 2008-09-26 PL PL14197779T patent/PL2915564T3/pl unknown
- 2008-09-26 PL PL08834136T patent/PL2193196T3/pl unknown
- 2008-09-26 PT PT161675343T patent/PT3078743T/pt unknown
- 2008-09-26 CN CN201310301566.3A patent/CN103446579B/zh active Active
- 2008-09-26 BR BR122022001846-7A patent/BR122022001846B1/pt active IP Right Grant
- 2008-09-26 SI SI200831678A patent/SI2193196T1/sl unknown
- 2008-09-26 SI SI200832130T patent/SI3078743T1/sl unknown
- 2008-09-26 KR KR1020107008718A patent/KR101698214B1/ko active IP Right Grant
- 2008-09-26 DK DK16167534.3T patent/DK3078743T3/da active
- 2008-09-26 EP EP20198287.3A patent/EP3824902A1/en active Pending
- 2008-09-26 CA CA2697583A patent/CA2697583C/en active Active
- 2008-09-26 ES ES08834136.7T patent/ES2597436T3/es active Active
- 2008-09-26 WO PCT/US2008/078014 patent/WO2009042962A2/en active Application Filing
- 2008-09-26 EP EP08834136.7A patent/EP2193196B1/en active Active
- 2008-09-26 NZ NZ583944A patent/NZ583944A/en unknown
- 2008-09-26 HU HUE14197779A patent/HUE052423T2/hu unknown
- 2008-09-26 SI SI200832153T patent/SI2915564T1/sl unknown
- 2008-09-26 ES ES16167534T patent/ES2796623T3/es active Active
- 2008-09-26 US US12/239,651 patent/US8153590B2/en active Active
- 2008-09-26 ES ES14197779T patent/ES2849426T3/es active Active
- 2008-09-26 MX MX2010003095A patent/MX2010003095A/es active IP Right Grant
- 2008-09-26 EP EP16167534.3A patent/EP3078743B1/en active Active
- 2008-09-26 CN CN201110447251.0A patent/CN102559644B/zh active Active
-
2010
- 2010-02-16 IL IL203993A patent/IL203993A/en active IP Right Grant
- 2010-03-23 ZA ZA2010/02039A patent/ZA201002039B/en unknown
-
2012
- 2012-03-07 US US13/414,499 patent/US8455441B2/en active Active
-
2013
- 2013-04-11 AU AU2013205326A patent/AU2013205326A1/en not_active Abandoned
- 2013-05-07 US US13/889,014 patent/US9062298B2/en active Active
- 2013-06-11 US US13/915,525 patent/US8889129B2/en active Active
-
2014
- 2014-07-21 US US14/337,074 patent/US9388401B2/en active Active
- 2014-08-07 AU AU2014210620A patent/AU2014210620B2/en active Active
- 2014-08-19 JP JP2014166333A patent/JP6047127B2/ja active Active
- 2014-09-04 ZA ZA2014/06514A patent/ZA201406514B/en unknown
-
2015
- 2015-11-13 HK HK15111214.0A patent/HK1210443A1/xx unknown
-
2016
- 2016-06-08 US US15/176,461 patent/US10675335B2/en active Active
- 2016-10-03 HR HRP20161255TT patent/HRP20161255T1/hr unknown
- 2016-10-12 CY CY20161101020T patent/CY1118482T1/el unknown
- 2016-11-18 JP JP2016225290A patent/JP6300885B2/ja active Active
-
2017
- 2017-01-12 AU AU2017200212A patent/AU2017200212A1/en not_active Abandoned
- 2017-11-02 IL IL255397A patent/IL255397B/en active IP Right Grant
-
2018
- 2018-02-27 JP JP2018033229A patent/JP2018100290A/ja active Pending
-
2019
- 2019-02-18 IL IL264886A patent/IL264886B/en active IP Right Grant
- 2019-06-13 AU AU2019204123A patent/AU2019204123A1/en not_active Abandoned
- 2019-11-08 NO NO2019040C patent/NO2019040I1/no unknown
-
2020
- 2020-02-26 IL IL272926A patent/IL272926A/en unknown
- 2020-03-12 JP JP2020042919A patent/JP2020109113A/ja active Pending
- 2020-05-07 US US16/869,117 patent/US11839646B2/en active Active
- 2020-07-08 HR HRP20201071TT patent/HRP20201071T1/hr unknown
- 2020-08-04 CY CY20201100715T patent/CY1123504T1/el unknown
- 2020-09-09 NL NL301063C patent/NL301063I2/nl unknown
- 2020-09-23 NO NO2020033C patent/NO2020033I1/no unknown
- 2020-09-23 FR FR20C1045C patent/FR20C1045I2/fr active Active
- 2020-12-22 HU HUS2000057C patent/HUS2000057I1/hu unknown
- 2020-12-22 LT LTPA2020540C patent/LTC3078743I2/lt unknown
-
2021
- 2021-08-17 AU AU2021218033A patent/AU2021218033A1/en active Pending
-
2022
- 2022-07-29 JP JP2022121451A patent/JP2022153574A/ja active Pending
-
2023
- 2023-11-02 US US18/500,675 patent/US20240082367A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2597436T3 (es) | Antídotos para inhibidores del factor Xa y procedimientos de uso de los mismos | |
ES2607935T3 (es) | Antídotos para inhibidores del factor Xa y procedimientos de uso de los mismos | |
ES2605801T3 (es) | Formulación de dosis unitaria de antídoto para inhibidores del factor Xa para su uso en la prevención de la hemorragia |