BRPI0816837A2 - antídotos para inibidores do fator xa e métodos para sua utilização - Google Patents
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Abstract
ANTÍDOTOS PARA INIBIDORES DO FATOR XA E MÉTODOS PARA SUA UTILIZAÇÃO
A presente invenção está relacionada aos antídotos para anticoagulantes que visam o fator Xa. Os antídotos são derivados da proteína do fator Xa que se ligam aos inibidores do fator Xa e, dessa forma, os neutralizam substancialmente, mas não se agregam ao complexo de protrombinase. Os derivados aqui descritos são desprovidos ou possuem atividade coagulante intrínseca reduzida. São aqui revelados métodos de interrupção ou prevenção de sangramento em um paciente está sendo submetido á terapia anticoagulante com uma inibidor do fator Xa.
Description
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REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 5 119(e) do Pedido U.S. provisório n" de Séríe 60/976.343, depositado em 28 de setembro de 2007, e do Pedido U.S.
Provisório N° de Série 61/090.574, depositado em 20 de agosto de 2008, arnbos incorporados por referência em sua totalidade.
10 CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção está relacionada ao uso de derivados do fator Xa (fXa) que possuem atividade pró- coagulante intrínseca reduzida ou ausente, mas são capazes de se ligar e/ou neutralízar inibidores de fXa, atuando, b , 15 dessa forma, como antídotos para anticòagulantes dirigidos . ao fXa.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO . Os anticoagulantes servern a uma necessidade no mercado no tratamento ou prevenção de tronibose indesejada em 20 pacientes com uma tendência a formar coágulos sangüíneos como, por exemplo, aqueles pacientes que possuem distúrbios da coagulação, confinados aos períodos de imobilidade ou que passam por cirurgias médicas. Uma das principais limitações da terapia anticoagulante, no entanto, é o risco 25 de sangramento associado aos tratamentos, e limitações sobre a habilidade para reverter rapidamente a atividade anticoagulante no caso de overdose ou caso seja necessário urn procedimento cirúrgico urgente. Dessa forma, são altamente desejáveis antídotos específicos e eficazes para 30 todas as formas de terapia anticoagulante. Para considerações em relação à segurança, também é vantajoso ter um par de anticoagulante-antídoto no desenvolvímento de novos fármacos anticoagulantes.
OS pares de anticoagulante-antídoto atualmente 5 disponíveis para o excesso de anticoagulação são heparina - protamina e warfarina - vitamina K. O plasma fresco congelado e o fator VIla recombinante (rfvlla) também foram usados como antídotos não específicos em pacientes sob tratamento corri heparina de baíxo peso molecular, que sofrem de trauma importante ou hemorragia severa (Lauritzen, B. e col., Blood, 2005, 607A-608A). Também há relatos de fragrnentos de protamina (Patente U.S. N° 6.624.141) e pequenos peptídeos sintéticos (Patente U.S. N° 6.200.955) como antídotos para heparina ou heparina de baixo peso molecular; e muteínas de trombina (Patente U.S. N°
6.060.300) como antídotos para inibidor de trombina.
Intermediários e derivados protrombina foram relatados como antídotos para hirudina e inibidores sintéticos de trombina (Patentes U.S. N°": 5.817.309 e 6.086.871).
Uma forma de terapia anticoagulante promissora tem corrio alvo o fator Xa (fxa) e, na verdade, vários inibidores diretos de fXa estão atualmente em diferentes estãgios de desenvolvimento clínico para uso na terapia anticoagulante.
Muitos destes são pequenas moléculas. Embora esses novos inibidores de fXa exibam boas perspectivas para o tratamento, ainda são necessários antídotos específicos e eficazes. No caso de hiperanticoagulação ou necessidade de cirurgia em pacientes tratados com esses inibidores de fXa, pode ser necessário um agente para neutralízar substancialmente o inibidor ou inibidores de fxa administrados e restaurar a hemostasia normal.
Os agentes atualmente disponíveis, por exemplo, fator VIla recombinante (rfVlla), são mecanisticamente limitados e não específicos para a reversão dos inibidores de fxa e, 5 dessa forma, são altamente desejáveis melhores opções para o médico. Em estudos em humanos, rfVlla foi usado para reverter o efeito de inibidores indiretos de fxa antitrornbina Ill-dependentes como, por exemplo, fondaparínux e idraparinux (Bijsterveld, n.r. e col., 10 Circulation, 2002, 106: 2.550-2.554; Bijsterveld, n.r. e col., British j. of Haematology, 2004(124): 653-658). O mecanismo de ação do fator VIla (fvlla) é atuar com fator tecidual para converter o fator X (fx) presente na circulação sangüínea em fXa para restaurar a hemostasia - 15 normal em pacientes. Esse modo de ação necessariamente dita " que a maior concentração potencial de fxa que poderia ser . alcançada para neutralizar inibidores de fXa dirigidos ao sítio atívo é limitada pela concentração plasmática circulante de fX. Dessa forma, o potencial da utilização de 20 rfvlla para reverter o efeito de inibidores díretos de fXa é mecanisticamente limitado. Na medida em que a concentração plasmãtica circulante de fx é de 150 nanornolar ("nM"), a quantidade máxima de fXa produzida por esse modo seria de 150 nM. Dessa forma, o potencial da utilização de 25 rfVlla para reverter o efeito de inibidores diretos de fXa é mecanisticamente limitado. As concentrações terapêuticas relatadas de inibidores de fXa de pequena molécula como, por exemplo, rivaroxaban, erarn maiores (aproximadamente 600 riM, Kubitza D, e col., Eur. j. CIin. Pharmacol., 2005, 61: 30 873-880) do que a quantidade potencial de fXa gerada por rfvlla. O uso de rfVlla para a reversão de níveis terapêuticos ou supraterapêuticos da anticoagulação por ínibidor de fXa forneceria, portanto, níveis inadequados de eficácia. Como mostrado na Figura 4, o uso de rfVlla possui 5 um efeito limitado sobre a neutralização da atívidade anticoagulante de um inibidor do fator Xa betrixaban (descrito abaixo). fWla recombinante mostrou urna atividade de antídoto dose-responsiva de 50 nM a 1.00 nM, mas o efeito se nívelou entre 100 nM a 200 nM, indicando que seu efeito 10 de antídoto é limitado por outros fatores além de sua concentração. Ern todas as concentrações de rfvlla testadas, betrixaban ainda mostrou uma inibição dose-resposta de fXa, até cerca de 75% de inibição em uma concentração de 250 riM.
Essa observação ê consistente com o mecanísmo de ação de
P , 15 fVlla proposto. Isso também é apoiado por estudos que . mostram que rfVlla não revertia cornpletamente o efeito inibidor de fondaparinux sobre os parâmetros da geração de trombina e ativação de protrombina (Gerotiafas, G.T., e col., Thrombosis & Haemostasis 2204(91): 531-537).
20 O fXa ativo exógeno não pode ser administrado diretamente a um indivíduo de uuia forma similar ao rfVlla.
Díferentemente de rfVlla, que possui atividade pró- coagulante muito baixa na ausência de seu fator tecidual co-fator, o fXa nativo é uma potente enzima e possui um 25 risco potencial de causar trombose. Dessa forma, o uso de rfVlla ou fXa ativo como antídoto para uma terapia anticoagulante com fXa possui desvantagens.
Dessa forrna, há a necessidade de agentes antídotos aprimorados que não causem trombose indesejada e que sejam 30 eficazes para substancialmente neutralizar a atívidade anticoagulante de um inibidor de fxa no caso de uma overdose do inibidor de fXa ou caso a hemostasia normal precise ser restaurada para evitar ou interromper um sangramento.
5 Qualquer uma e todas as publicações, patentes, pedidos de patente aquí mencionados são aquí incorporados por referência em sua totalidade.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO Foi agora descoberto que a administração de derívados 10 modificados de proteínas de fxa é útil como antídoto para anticoagulantes dirigidos ao fXa. Os derivados modificados de proteínas de fXa não cornpetem com fxa na montagem no complexo de protrombinase, mas, erri vez disso, se ligam e/ou substancialmente neutralizam os anticoagulantes, por 15 exemplo, inibidores de fXa. Os derivados úteis como . . antídotos são modificados para reduzir ou remover as atividades pró-coagulantes e anticoagulantes intrínsecas, mantendo a habilidade para se Iigar aos inibidores.
Conternpla-se que os derivados da invenção podem incluir a 20 modificação do sítio ativo, ou alteração ou remoção de todo o domínio Gla de fXa, ou várias combinações destes. É ainda contemplado que a modificação do domínio Gla reduz ou remove o efeito anticoagulante do derivado de fXa sobre a hemostasia nornial, pois um fXa de comprimento total com 25 sítio ativo modificado sabidamente é um anticoagulante. É ainda contemplado que a modificação do domínio EGF (por eliminação ou substituição do domínio EGFI, EGF2, ou ambos os domínios, EGFI e EGF2) do fXa fornece urn derívado útil para os métodos desta invenção. A modificação do 30 domínio EGF pode ser feita isoladamente ou em adição à modificação do domínio Gla.
Em uma modalidade, o derivado rnantém as características estruturais necessárias à Iigação ao anticoagulante (ou inibidor de fXa) dirigido ao fXa. Pela 5 ligação do derivado, direta ou indiretamente, ao inibidor, o inibidor é substancialrnente neutralizado.
Em um aspecto, a invenção fornece um rnétodo de prevenção ou redução de sangramento em um indivíduo submetido à terapia anticoagulante com um inibidor do fator 10 Xa, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um derivado da proteína do fator xa que se liga ao inibidor do fator Xa, mas não se agrega ao complexo de protrombinase. Em uma modalidade, o derivado possui uma ou mais das seguintes propriedades: atividade , ? 15 pró-coagulante reduzida ou ausente; um domínío Gla - modificado ou removído; e um sítio ativo modificado. O derivado da invenção se liga seletivamente e inibe um inibidor do fator Xa administrado exogenamente, neutralizando substancialmente, dessa forma, a atividade 20 anticoagulante de um inibidor de fXa. Esse método contempla métodos in vitro e in vivo. Várias modificações adicionais à proteína do fator Xa contempladas pela invenção são encontradas ao longo da descrição detalhada.
Deve-se entender que os derívados contemplados por 25 esta invenção não são fator VIla derivado do pIasma, fator vIla recombinante, plasma fresco congelado, concentrados de complexo de protrombina ou sangue total.
Um aspecto da presente invenção consiste no uso dos derivados de fator Xa e composíções que o contêm para o 30 tratamento de pacientes que receberam ou que estão recebendo terapia de hiperanticoagulação com um inibidor do fator Xa, ou pacientes que receberam previamente a administração de um inibidor do fator Xa e depois precisam de hemostasia, por exemplo, como necessário para a 5 realízação de cirurgia eletiva ou de emergência. Em um aspecto, as proteínas de fxa modificadas se distinguem de fXa de ocorrência natural pelo fato de terem atividade pró- coagulante intrínseca reduzida ou removida e não interferirem com a função fisiolõgica do fXa na hemostasia, 10 embora ainda sendo capazes de se Iigar e neutralizar substancialmente os inibidores de fXa.
Em outro aspecto, a proteína do fator Xa modificada é co-adminístrada com um agente capaz de prolongar a meia- vida pIasmãtica (ou meia-vida circulante) do derivado de 15 fator Xa. Ainda em outro aspecto, o antídoto é conjugado a
. urna porção para prolongar sua meia-vida plasmática. Também são fornecidas composições farmacêuticas que contêm o derivado de fator Xa que se Iiga (e/ou substancialmente neutraliza) ao inibidor do fator Xa, mas 20 não se agrega ao complexo de protrombinase. A composição farmacêutica opcionalrnente compreende um veículo farmaceuticamente aceítável.
Em outro aspecto, esta invenção fornece um kit que compreende um inibidor de fXa para uso anticoagulante e um 25 antídoto para o inibidor de fXa (ou derivado de fator Xa) para uso quando for necessária a neutralização substancial da atividade anticoagulante do inibidor de fXa.
Uma modalidade da invenção se dirige a um polípeptídeo isolado que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE 30 SEQ. N°: 12 ou um polipeptídeo que possui pelo menos 80% de homología para o ID. DE SEQ. N°: 12. Outra modalidade se dirige a um polipeptídeo isolado de duas cadeias que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 13 ou um polipeptídeo que possui pelo menos 80% de hornologia 5 para o ID. DE SEQ. N°: 13. Ainda outra modalidade se dirige a um polipeptídeo isolado que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 15 ou um polipeptídeo que possui pelo menos 80% de homologia para o ID. DE SEQ. N°:
15.
10 Também ê fornecida uma composíção farmacêutica que compreende um veículo e um polipeptídeo descrito acima.
Também é fornecido um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo descrito acima.
É ainda aqui fornecido um conjugado peptídico que 15 compreende um veículo ligado covalente ou não
B , covalentemente a um polipeptídeo descrito acima. O veículo pode ser um lipossomo, uma micela, um polímero farmaceuticamente aceitável ou urn veículo farmaceuticamente aceitável.
20 Esta invenção também é dirigida a um anticorpo que se liga a um poIipeptídeo descrito acima. O anticorpo é um anticorpo poIíclonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado. Também é fornecido um fragmento biologicarnente ativo do anticorpo. O anticorpo 25 pode ser marcado de forma detectável. O anticorpo (ou fragmento de anticorpo) também é fornecido como parte de uma composição que aínda compreende um veículo.
Em uma modalidade, é fornecido um complexo anticorpo- peptídeo que compreende o anticorpo da invenção e um 30 polipeptídeo que se liga específicamente ao anticorpo. O polipeptídeo é o polipeptídeo contra o qual o antícorpo é desenvolvido. O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado.
5 Em outra modalidade, é fornecido um método para a preparação de um polipeptídeo da invenção que compreende a expressão de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica. Em uma modalidade, a célula hospedeira é urna célula 10 eucariótica e, ern particular, é uma célula de ovário de hamster chinês. Em uma modalidade, a cadeia pesada (ID. DE SEQ. N°: 15) é expressa em uma célula procariótica, por exemplo, E. coli. Em outra modalidade, o polipeptídeo está isolado. . 15 Ainda em outra modalidade, é fornecida uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica isolada que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo - da invenção. Em uma modalidade, a célula hospedeira está em uma composição que ainda compreende um veículo.
20 Ainda em outra modalidade, é fornecido um rnétodo de prevenção ou redução de sangramento ern um indivíduo submetido à terapia anticoagulante com um iníbidor do fator Xa que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende um 25 poIipeptídeo da invenção e um veículo. É ainda fornecido um método de se ligar e inibir seletivamente um inibidor do fator Xa administrado exogenamente em um indivíduo submetido à terapia anticoagulante, que couipreende a adrninistração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma 30 composição descrita acíma.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra esquematicamente a estrutura do domínio do fator X humano (ID. DE SEQ. N°: 1) mostrada na Tabela 1 como relatada em Leytus e col., Biochem., 1986, 5 25, 5.098-5.102. O ID. DE SEQ. N°: 1 é a seqüência de aminoácidos de fX humano codificada pela seqüência de nucleotídeos de fX hurnano (ID. DE SEQ. N°: 2) como mostrada na Tabela 2 conhecida na técnica estabelecida. Por exemplo, a seqüência de aminoácidos traduzida é relatada em Leytus e 10 col., Biochem., 1986, 25, 5.098-5.102 e pode ser encontrada em GenBank, "NM_O00504" em. <http://www.ncbi.nlm.nih gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=89142731>. A numeração de aminoácidos nessa seqüência é baseada na seqüência de fX. O precursor de fX humano (ID. DE SEQ. N°: 1) contém uma . 15 seqüência pré-pró-líder (aminoácidos 1 a 40 do ID. DE SEQ. r N°: 1), seguida por seqüências que correspondem à cadeia leve de fx (LC) (aminoácidos 41 a 179 do ID. DE SEQ. N°: 1), ao tripleto RKR (aminoácidos 180 a 182 do rD. DE SEQ.
N°: 1) que é removido durante a secreção de fX, e à cadeia 20 pesada de fX (aminoãcídos 183 à 488 do ID. DE SEQ. n°: 1) que contém o peptídeo de ativação (AP) (aminoácidos 183 a 234 do ID. DE SEQ. N°: 1) e o dornínio catalítico (aminoácidos 235 a 488 do ID. DE SEQ. N°: 1).
A Figura 2 (ID. DE SEQ. N°: 3) mostra a seqüência de 25 aminoácidos do fator X humano maduro- A numeração de arninoácidos nessa figura se baseia na seqüência de fx maduro que começa no termínal N da cadeia leve de fX. O fator X circula no plasma como uma molécula de duas cadeias ligada por uma ligação dissulfeto. A cadeia leve (LC) 30 possui 139 resíduos de aminoácidos (aminoácidos 41 a 179 do
ID. DE SEQ. N°: 1) e contém o domínio rico em ácido y- carboxiglutâmico (Gla) (aminoácidos 1-45 do ID. DE SEQ. N°: 3), incluindo um stack aromático curto (AS) (aminoácidos 40-45 do ID. DE SEQ. N°: 3), seguido por dois domínios 5 fator de crescimento epídérmico (EGF)-like (EGFI: arninoácidos 46-84, EGF2: aminoácidos 85-128 do ID. DE SEQ.
N°: 3). A cadeia pesada (HC) possui 306 aminoácidos e contêm um peptídeo de ativação de 52 aminoácídos (AP: aminoácidos 143-194 do ID. DE SEQ. N": 3), seguido pelo 10 dornínio catalítico (aminoácidos 195-448 do ID. DE SEQ. N°: 3). Os equivalentes à tríade catalítica para H57-D102-S195 na numeração de quimotripsina estão Iocalizados em His236, Asp282 e Ser379 na seqüência de fx e estão sublinhados (aminoácidos 236, 282 e 379 do id. DE SEQ. N°: 3).
V 15 A Figura 3 mostra esquematicamente a estrutura do . domínio do fator X humano maduro mostrado na Figura 2. A . numeração de arninoácidos nessa figura se baseia na . seqüência de fX maduro. Os sítios de clivagem para digestão por quimotrípsina para remover o fragmento que contém o 20 dornínio GIa (aminoãcido 1-44 do ID. DE SEQ. N°: 3) e ativação de fX para remover o peptídeo de ativação estão realçados. A digestão por quimotripsina de fXa resulta em urn fXa sem domínio Gla desprovido dos resíduos de aminoácido 1-44 (ID. DE SEQ. N°: 4).
25 A Figura 4 mostra o efeito de concentrações variáveis de rfvlla na presença de fator tecidual sobre a atividade anticoagulante de um inibidor de fXa betrixaban (descrito abaixo) na geração de trombina (expressa em um ensaío de unidades relativas de fluorescência (RFU) (como descrito no 30 Exemplo 2)). Os dados mostram que uma combinação de rfvlla e fator tecidual foi incapaz de neutralizar completamente a atividade anticoagulante de um inibidor de fXa, betrixaban, em concentrações de até 200 ríM.
A Figura 5 mostra que fXa anidro com seu domínio Gla 5 intacto reverte a inibição de fxa por betrixaban em um sistema purificado contendo fXa ativo e betrixaban (círculo aberto), enquanto fXa anidro isoladarnente possui atividade prõ-coagulante desprezível (triângulo aberto) comparado com fXa ativo. A atividade cromogênica de fxa foi normalizada 10 para o fXa ativo na ausência de qualquer inibidor (quadrado aberto). Isso é descrito com rrtais detalhes no Exemplo 2. Os dados mostram que fXa anidro é inativo contra o substrato de fXa, embora retenha a habi1i,dade de Iigação ao inibidor de fXa.
15 A Figura 6 mostra que o fXa anidro com domínio GIa è intacto na Figura 5 é um inibidor potente em um ensaio de geração de trombina plasmática (expressa como unidades relativas de fluorescência (RFU)) (como descrito no Exemplo 2). Ele ínibiu quase completamente a geração de trombina a 20 cerca de 115 nM. Os dados mostram que fXa anidro sem modificação do domínio Gla não é adequado para uso como um antídoto para o inibidor de fXa.
A Figura 7 mostra a comparação da atividade de coagulação de fxa ativo em formato de uma placa de 96 poços 25 antes da digestão por quimotripsina, e após 15 minutos e 30 minutos de digestão por quimotripsina. Como mostrado nessa figura, o ternpo de coagulação (alteração da OD405) foi significativamente retardado apõs o fXa ser digerido por quimotripsina por 15 minutos e não foi observada nenhuma 30 coagulação por até 20 minutos quando o fXa foí digerido por
30 minutos. Esse resultado também foi usado para estabelecer condições para a digestão por quimotripsina de fXa anidro, pois ele não possui atividade que possa ser monitorada durante a digestão. Isso é descrito com mais 5 detalhes no Exemplo 3.
A Figura 8 mostra a afinidade de Iigação de fXa anidro des-Gla a urn inibidor do fator Xa betrixaban, como descrito no Exemplo 4. Os dados mostram que fXa anidro des-Gla, preparado por digestão por quimotripsina de fXa anidro para 10 remover o fragrnento que contém o domínio Gla (resíduos 1- 44), é capaz de se Iigar ao betrixaban com afinidade similar que o fXa nativo (fXa: Ki = 0,12 nM, fXa anidro des-Gla: Kd = 0,32 nM).
A Figura 9 mostra a reversão da atividade 15 anticoagulante de concentrações variáveis de betrixaban por y . adição de um concentrado de 680 nM do antídoto (fXa anidro des-Gla) em um ensaio de geração de trombina do Exemplo 2.
Na concentração de 680 riM, fXa anidro des-Gla foi capaz de produzir restauração substancialmente completa da ativídade 20 de fXa.
A Figura 10 mostra a reversão da atividade anticoagulante de 250 riM àe betrixaban por concentrações variáveis do antídoto (fXa anidro des-Gla) em ensaios de prolongação da coagulação usando reagente aPTT em formato 25 de uma placa de 96 poços (como descrito no Exernplo 3). Os dados mostram que tempo de coagulação era comparável àquele de plasma de controle pobre em plaquetas quando cerca de 608 nM do antídoto eram usados para neutralizar 250 nM do inibidor de fXa betrixaban.
30 A Figura 11 mostra o efeito sobre a atividade anticoagulante de enoxaparina (0,3125 - 1,25 U/ml) por 563 nM do antídoto (fXa anidro des-Gla) em ensaios de prolongação da coagulação usando reagente aPTT em formato de uma pIaca de 96 poços, expressa como alterações ern 5 número de vezes após normalização. O protocolo do ensaio é descrito no Exemplo 3. Os dados mostram que a adição de 563 riM do antídoto neutralizou significativamente a atividade de uma heparina de baixo peso molecular enoxaparina.
A Figura 12 mostra o efeito do antídoto, fxa anidro lO des-Gla, sobre a atividade de trombina (5 nM) e sua inibição por 50 nM de argatroban, um inibidor específico de trombína, em um ensaio cromogênico. Como esperado, o antídoto do inibidor de fXa não afeta de forma detectável a atividade de trombina ou sua inibição por pelo inibidor 15 específico argatroban em concentrações de até 538 nM. Isso q . é descrito com mais detalhes no Exemplo 14. A Figu:ra 13 mostra o efeito sobre a atividade anticoagulante de 400 nM betrixaban por concentrações variáveis do antídoto, fXa anidro des-gla, em um ensaio de 20 aPTT usando um timer de coagulação padronizado. O protocolo do ensaio é descrito no Exemplo 3. Os dados mostrarn que o antídoto do íníbidor de fXa reverte substancialmente a inibição de fxa por 400 rm de betrixaban. A ÉC,q do antídoto foi estimada como sendo de cerca de 656 riM com 400 25 nM de betrixaban.
A Figura 14 mostra o mapa da construção de DNA para a expressão do mutante triplo de fXa (ID. DE SEQ. N°: 12) em células CHO. dna de plasmídeo foi linearízado e transfectado em células CHO dhfr(-). As cêlulas foram 30 selecionadas usando meio deficiente em tetrahidrofolato
(HT) mais metotrexato (MTX). Os clones estáveis foram avaliados quanto à expressão de proteína elevada por ELISA.
O mutante triplo de fXa foi produzido em meio sem soro e purificado por combinação de colunas de troca iônica e de 5 afinidade. A numeração no mapa foí baseada na seqüência de polinucleotídeos que codifica fX humano ID. DE SEQ. N°: 1.
Por exemplo, uma mutação de alanina no sítio ativo S419 (ID. DE SEQ. N°: 1) é equivalente à mutação em S379 (ID. DE SEQ. N°: 3) de fX maduro humano discutida ao longo do pedido e, mais particularmente, no Exemplo 7.
A Figura 15 mostra um Western blot de Antídoto-r purificado usando anticorpos monoclonais que reconhecem a cadeia pesada e cadeia Ieve de fX, respectívamente.
Mediante redução da ligação dissulfeto que conecta as cadeias leves e pesadas, a cadeia pesada do Antídoto-r migra em um peso molecular esperado similar àquele do derivado de fxa do plasma. A eliminação de 6-39 como no domínio Gla do fXa rnutante resulta em uma banda de peso molecular rrtenor da cadeia Ieve do Antídoto-r comparado com o fxa normal.
A Figura 16 mostra o nível plasmático de betrixaban em camundongos (n = 7-10 por grupo) apõs admínistração oral de betrixaban isoladamente (15 mg/'kg), ou betrixaban (IS mg/kg), seguida por injeção intravenosa (300 µg, IV) de antídoto derivado do plasma (Antídoto-pd) preparado de acordo com o Exemplo 1. O Antídoto-pd foi administrado 5 rriinutos antes do ponto do tempo de 1,5 hora, e amostras de sangue de camundongo (0,5 ml) foram coletadas a 1,5, 2,0 e 4,0 horas após a administração oral de betrixaban. Os níveis plasrrtáticos da INR ("International Normalized Ratio"
- sistema que a Organização Mundial de Saúde e o "International Committee on Throrríbosis and Hemostasis" estabelecerarn para o relato de resultados de testes da coagulação sangüínea) do sangue total, betrixaban e 5 antídoto foram analisados. O nível de betrixaban (média ± SEM) no plasma de camundongo foi tabulado em função do tempo para camundongos após 15 mg/kg (quadrado aberto) e 15 rng/kg seguidos por injeção ão antídoto (círculo aberto). A correlação PK-PD do grupo tratado com antídoto no ponto do 10 tempo de 1,5 hora (5 minutos após a injeção do antídoto) foi resumida na Tabela 13. Uma única injeção do antídoto resultou em uma redução >50% de betrixaban funcional com base nas medidas da INR. Isso é descrito com mais detalhes no Exemplo 8.
15 A Figura 17 mostra os resultados de um experimento em < carnundongo com Antídoto-r purificado (n = 4-10 por grupo).
O nível de betrixaban no plasma de camundongo (Figura 17A) e INR do sangue total (Figura 17B) foram comparados após administração oral de betrixaban isoladamente (15 mg/kg) ou 20 betrixaban (15 mg/kg) seguida por injeção intravenosa (300 µg) de Antídoto-r. Os valores médios para cada grupo tratado foram índicados. Corrio resumido na Tabela 14, urria única injeção iv do Antídoto-r resultou em correção >50% da INR do sangue total ex vivo, justificando a neutralização 25 eficaz de inibidores de fxa pelo antídoto por rneio de injeções múltiplas ou outros regimes. Esses resultados demonstram que as variantes de fXa desta invenção possuem potencial para atuar como antídotos universais para reverter o efeito anticoagulante de inibidores de fxa em 30 pacientes corn sangramento OLl outras emergências médicas.
Isso é descrito com mais detalhes no Exemplo 8.
A Figura 18 mostra reversão por Antídoto-r do efeito inibidor de enoxaparina em um ensaio de coagulação por mudança da turvação em 96 poços. Os resultados são 5 basicamente similares aos do Antídoto-pd (Figura 11), o que indica que ambos os derivados de fxa possuern atividade de antídoto funcional comparável. Cinqüenta m de Antídoto-r corrigiram substancialmente (>75%) o efeito inibidor de 1,25 U/rnl de enoxaparina. O protocolo do ensaio é apresentado no Exemplo 11.
A Figura 19 mostra a reversão por Antídoto-r do efeito inibidor de heparina de baixo peso molecular (LMWH) testado em um ensaio de coagúlação de plasma humano. As Figuras 18 e 19 sãcj discutidas no Exemplo 11.
A Figura 20 mostra a reversão por Antídoto-r do efeito
anticoag'ulação de rivaroxaban. Isso é discutido com mais detalhes no Exemplo 12.
A Figura 21 mostra o alinhamento da seqüência de polinucleotídeos e seqüência de polipeptídeos traduzida do Antídoto-r.
A Figura 22 rnostra os resultados de urn experimento em camundongo com uma única injeção iv (1 injeção) ou duas injeções (2 injeções) do Antídoto-r (n = 5 por grupo, 312 µg/200 µ1 Antídoto-r). O nível de betrixaban no plasma (Figura 22A) foi comparado após administração oral de betrixaban (15 mg/kg), seguida por injeção intravenosa de veículo ou Antídoto-r (veja o Exemplo 8 para detalhes).
Como mostrado na Figura 22A, urna única injeção iv de Antídoto-r aumentou o nível de betrixaban no plasma em mais de 8 vezes comparado com controle de veículo (controle 1),
indicando a habilidade do antídoto para capturar efi'cazmente betrixaban in vivo. Uma segunda injeção do antídoto aumentou ainda mais o nível de betrixaban em menos de 2 vezes, comparada com uma única injeção, indicando uma 5 quantidade limitante de betrixaban no sangue de camundongo e possível reversão de seu efeito anticoagulante pelo antídoto. A Figura 22B demonstra que a INR medida diminui à medida que a proporção de antídoto/betríxaban aumenta no plasma de camundongo após injeções únicas e duplas do 10 antídoto.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Definições A prática da presente invenção empregará, a menos que índicado de forma diferente, técnicas convencionais de
F 15 cultura de tecido, imunologia, biologia molecular, . microbiologia, biologia celular e DNA recombinante, que estão dentro do conhecimento da técnica. veja, por exemplo, Sambrook e Russell eds. (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3" Edição; a série Ausubel e col. eds.
20 (2007) "Current Protocols in Molecular Biology"; a série "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson e COI. (1991) "PCR 1: A Practical Approach" (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson e col. (1995) "PCR 2: A Practical Approach"; Harlow e Lane eds. (1999) 25 "Antibodies, A Laboratory Manual"; Freshney (2005) "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique", 5" Edição; Gait ed. (1984) "Oligonucleotide Synthesis"; Patente U.S.
N" 4.683.195; Hames e Higgins eds. (1984) "Nucleic Acid Hybridization"; Anderson (1999) "Nucleic Acid 30 Hybridization"; Hames e Higgins eds. (1984) "Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press (1986)); perbal (1984) "A practical Guide to Molecular Cloning"; Miller e Calos eds. (1987) "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Cold Spring Harbor Laboratory); 5 Makrides ed. (2003) "Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells"; Mayer e Walker eds. (1987) "Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology" (Academic Press, Londres); Herzenberg e col. eds (1996) "Weir's Handbook of Experimental Imrnunology; Manipulating 10 the Mouse Embryo: A Laboratory Manual", 3" Edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)).
Todas as designações numéricas, por exemplo, ph, temperatura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo faíxas, são aproximações que são variadas (+) ou 15 (-) por incrernentos de 0,1. No entanto, deve-se entender q - que nem sempre seja estabelecido explicitamente que todas as designações numéricas são precedidas pelo termo "cerca de". Deve-se entender também que nem sempre seja estabelecido explicitamente que os reagentes aqui descritos 20 são rneramente exemplares e que equivalentes destes são conhecidos na técnica.
Como usada na especifícação e nas reívindicações, as forrnas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem referências no plural, a rnenos que o contexto determine 25 claramente de forma diferente. Por exemplo, o termo "um veículo farmaceuticamente aceitável" inclui vârios veículos farmaceuticarnente aceitáveís, incluindo misturas destes.
Como aqui usado, o termo "que compreende" visa significar que as composições e rnétodos incluem os 30 elementos citados, mas não excluem outros. o termo "que consiste basicamente em", quando usado para definir composições e métodos, significa que exclui outros elementos de qualquer sígnificância essencial à combinação para o uso a que se destina. Dessa forma, uma composição 5 que consiste basicamente nos elementos aqui definidos não excluiria contaminantes residuaís do método de isolamento e purificação e veículos farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato, conservantes, e sernelhantes. O termo "que consíste em" 10 signifíca que exclui mais do que elementos residuais de outros ingredientes e etapas substancíais do mêtodo para administração das composições desta invenção.
As modalidades definidas por cada um desses termos de transição estão dentro do escopo desta invenção.
15 Um "objeto" de diagnõstico ou tratamento é uma célula " u · ou urn mamífero, incluindo um ser humano. Animais não " humanos submetidos ao diagnóstico ou tratamento incluem, por exemplo, murideos, por exemplo, ratos, camundongos, caninos, por exemplo, cães, leporídeos, por exemplo, 20 coelhos, animais de criação, animais de caça e animais de estimação.
O termo "proteína" e "polipeptídeo" são usados de forma intercambiãvel e em seu sentido mais amplo para se referir a um composto de duas ou mais subunidades de 25 aminoácidos, análogos de aminoácidos ou peptidomimêticos.
As subunidades podem estar Iigadas por ligações peptídícas.
Em outra modalidade, a subunidade pode estar ligada por outras ligações, por exemplo, éster, éter etc. Uma proteína ou um peptídeo deve conter pelo menos dois aminoácidos e 30 não há limitação sobre o número máximo de aminoácidos que podem compreender uma seqüência de proteínas ou peptídeos.
Como aqui usado, o termo "aminoácido" refere-se aos aminoácidos naturaís e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e tanto os isôrneros ópticos D quanto L, 5 análogos de aminoácído e peptidomiméticos. As abreviações de uma letra e de três letras dos aminoácidos de ocorrência natural estão listadas abaixo. Um peptídeo de três ou rnais aminoácidos é comumente denominado um oIigopeptídeo se a cadeia peptídica for curta. Se a cadeia peptídica é longa, o peptídeo é comumente denominado um polipeptídeo ou uma proteína.
1 letra 3 Ietras Âminoacido Y Tyr L-tirosina G Gly L-glicina F Phe L-fenilalanina M Met L-metionina A Ala L-alanina S Ser L-serina :r Ile L-isoleucina L Leu L-leucina T Thr L-treonina V Val L-valina P Pro L-prolina K Lys L-lisina H His L-histidina Q Gln L-glutamina E Glu Ácido L-g1utâmico W Trp L-triptofano R Arg L-arginina D Asp Ácido L-aspártico
N Asn L-asparagina C Cys L-cisteína "Fator Xa" ou "fXa" ou "proteína de fXa" refere-se a uma serina-protease na via da coagulação sangüínea, que é produzida a partir do fator X inativo (fx). O Fator Xa é ativado pelo fator IXa com seu co-fator, fator VIlla, em um 5 complexo conhecido como Xase intrínseca, ou fator VIla com seu co-fator, fator tecidual, em um complexo conhecido como Xase extrínseca.
fxa forma um complexo de protrordbinase ligado à membrana com fator Va e é o componente ativo no complexo de 10 protrombinase que catalisa a conversão de protrombina em trornbina. A trombina é a enzima que catalisa a conversão de fibrinogênio erri fibrina, que, por fim, leva à formação do
P coágulo sangüíneo. Dessa forrria, a atividade biológica de fxa algumas vezes é aqui denominada "atividade pró- " 15 coagulante".
A seqüêncía de nucleotídeos que codifica fator X humano ("fX") pode ser encontrada em GenBank, "NM 000504" em <http://www.ncbimlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore& 20 id=89142731>, e está Iistada na Figura Ib e no ID. DE SEQ N°: 2. A seqüência de aminoácidos correspondente e a estrutura do domínio de fX estão descritas em Leytus e col., Biochemistry, 1986, 25: 5.098-5.102. A estrutura do domínio de :EX rnaduro também está descrita em Venkateswarlu, 25 D. e col., Bíophysical journal, 2002, 82: 1.190-1.206.
Mediante a clivagem catalítica dos primeiros 52 resíduos (aminoácidos 143 a 194 do ID. DE SEQ. N°: 3) da cadeia pesada, fX é ativado em fXa (ID. de SEQ. N°: 6). fXa contém uma cadeia leve (ID. DE SEQ. N°: 8) e uma cadeia pesada (ID. DE SEQ. N°: 9). Os primeiros 45 resíduos de aminoácido (resíduos 1-45 do ID. DE SEQ. N°: 6) da cadeia leve são denominados domínio Gla pois contém 11 resíduos de ácido y- 5 carboxiglutâmico modificados pós-tradução (Gla). Ele também contém uma seqüência aromática stack curta (6 resíduos de aminoácido) (resíduos 40-45 do ID. DE SEQ. N°: 6). A digestão por quimotripsina remove seletivamente os resíduos 1-44 resultando em fXa sem domínio Gla (ID. DE SEQ. N°: 4)- 10 O domínio catalítico de serina-protease de fXa se Iocaliza na cadeia pesada do terminal C. A cadeia pesada de fXa é altamente homóloga às outras serina-proteases como, por exemplo, trombina, tripsina e proteína C ativada.
A estrutura do domínio de fator X maduro pode ser 15 encontrada em Venkateswarlu D. e col., Biophysical j., ¥ 2002, 82, 1.190-1.206, que é aqui incorporado por . referência em sua totalidade. A numeração de aminoácidos nessa figura é a mesma que na Figura 3. O tripeptídeo de Arg140-Lys141-Arg142 (o tripleto RKR, como rnostrado na 20 Figura 1) que conecta a cadeia leve ao peptídeo de ativação não é rnostrado, pois a forma que não possui o tripeptídeo é predominante no plasma sangüíneo da circulação. Os domínios individuais são mostrados em caixas. Esses incluerri aminoácidos 1-45 na Figura 2 (ID. DE SEQ. N°: 3). Resíduos 25 catalíticos funcionalmente importantes estão circulados, e "r representa o resíduo Gla (ácido Y-carboxiglutâmico).
O termo "fXa nativo" ou "fXa do tipo selvagem" refere- se ao fXa naturalmente presente no plasma ou que é isolado em sua forma original, não modificada, que processa a 30 atividade biológica de ativação de protrombina e, portanto,
promove a formação de coágulo sangüíneo. O termo inclui polipeptídeos de ocorrência natural isolados de amostras de tecido, além de fXa produzido recombinantemente. O termo "fxa ativo" refere-se ao fxa que possui a atividade 5 biológica de ativação de protrombina. "fXa ativo" pode ser um fXa natívo ou fxa modificado que retenha a atividade pró-coagulante.
"Derivados de fXa" ou "fXa modificado" ou "derivados de uma proteína do fator Xa" refere-se às proteínas de fXa 10 que foram modificadas de tal forma que se ligam, direta ou indiretamente, a um inibídor do fator Xa e não se agregam ao complexo de protrombinase. Estruturalmente, os derivados são modificados para não fornecer nenhuma atividade pró- coagulante ou atividade pró-coagulante reduzida. "Atividade 15 pró-coagulante" é aqui citada como a habilidade de um ¥ agente para causar coagulação sangüínea ou formação de . coágulo. Atividade pró-coagulante reduzida significa que a atividade pró-coagulante foi reduzida por pelo menos cerca de 50% ou mais do que cerca de 90% ou mais do que cerca de 20 95%, comparado cotti fxa do tipo selvagem. Por exemplo, fX- S395A recombinante basicamente não possui atividade pró- coagulante medida por ensaios in vitro, por exemplo, ensaios da atividade de fxa.
Os derivados possuem sítios ativos rnodificados ou 25 domínios Gla modificados ou ambos. Modificações adicionais tambérn são contempladas. Contempla-se que essas modificações podem ser feitas de uma ou rnais das seguintes formas: eliminação de um ou mais dos aminoácidos da seqüência, substituição de um ou mais resíduos de 30 aminoácido com urn ou rnais resíduos de aminoácidos diferentes, e/ou manipulação de uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos ou seus terminais "C" ou "N".
O termo "sítio ativo" refere-se à parte de uma enzima ou anticorpo onde ocorre uma reação química. Um "sítio 5 ativo modificado" é um sítio ativo que foi modificado estruturalmente para dar ao sítio ativo reatividade ou especificidade química aumentada ou diminuída. Exemplos de sít.ios ativos incluem, sem limitação, o domínio catalítico de fator X humano que compreende os 235-488 resíduos de 10 aminoácido (Figura 1), e o domínio catalítíco do fator Xa humano que compreende os 195-448 resíduos de aminoácido (Figuras 2 e 3). Exemplos de sítio ativo modificado incluem, sem limitação, o domínio catalítico do fator Xa humano que compreende 195-448 resíduos de aminoãcido nos ·P 15 IDS. DE SEQ. N°": 10, 11, 12, 13 ou 15 com pel-o menos uma substituição de aminoácido na posição Arg306, Glu310, Arg347, Lys351, Lys414 ou Arg424. . Como estabelecido acima, os derivados da invenção podem ter domínios GIa modificados ou ter todo o domínio 20 Gla removido. Exemplos de derivados de fXa adequados como antídotos nos métodos desta invenção são fXa sem dominio Gla (IDS. DE SEQ. N°": 4 ou 5), fXa deficiente em Gla (ID.
DE SEQ. N°: 7 com modificações aqui descritas), fXa com modificações no sítio catalítico (IDS. DE SEQ. N°": 10 ou 25 11) e fXa com modificações nos sítios sabidamente importantes para a interação fV/fVa ou para a interação fVIII/fVIIIa (IDS. DE SEQ. N°": 4, 5, 7, 10 ou 11 com pelo menos uma substituição de aminoácido na posição Arg306, Glu310, Arg347, Lys351, Lys414 ou Arg424), como aqui 30 descrito em detalhes. Exemplos adícionais dos derivados de fXa contemplados por esta invenção serão fornecidos abaíxo.
"fXa sem domínio Gla" ou "fXa des-Gla" refere-se ao fXa que não possui um domínio Gla e engloba derivados de fXa que abrigam outras modificações além da remoção do 5 domínio Gla. Exemplos de fXa sem domínio Gla nesta invenção incluem, sem limitação, derivado de fXa desprovido dos 1-39 resíduos de aminoãcido do ID. de SEQ. N°: 3; derivado de fXa desprovido dos 6-39 resíduos de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 3, que corresponde a um fXa mutante expresso em 10 células CHO descrito com mais detalhes abaixo (ID. DE SEQ.
n°: 12, Tabela 12); derivado de fXa desprovido dos 1-44 resíduos de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 3, que corresponde ao fXa des-Gla após digestão por quimotrípsina de fXa humano (ID. DE SEQ. N": 4, Figura 3); e derivado de . 15 fxa desprovido de todos os resíduos do 1-45 dornínio Gla do ID. DE SEQ. N°: 3 como descrito em Padmanabhan e coI., jburnal Mol. Biol., 1993, 232: 947-966 (ID. DE SEQ. N°: 5). . Outros exemplos incluem fxa des-Gla anidro (ID. DE SEQ. N°: 10, Tabela 10) e fXa des-Gla-S379A (ID. DE SEQ. n°: 11, 20 Tábela 11).
Em algumas modalidades, o fxa des-Gla compreende pelo menos os resíduos de arninoácido 40 a 448 do ID. DE SEQ. N°: 3 ou um equivalente deste. Em algumas modalidades, o fxa des-Gla compreende pelo menos os resíduos de aminoácido 45 25 a 488 (ID. DE SEQ- N°: 4) ou 46 a 488 (ID. DE SEQ. N°: 5) do ID. DE SEQ. N°: 3 ou equivalentes destes.
Em algumas modalidades, o fXa des-Gla compreende pelo menos os resíduos de aminoácido 40 a 139 e 1-95 a 448 do ID.
DE SEQ. N°: 3 ou equivalentes destes. Erri algumas 30 modalidades, o fxa des-Gla compreende pelo menos os residuos de aminoácido 45 a 139 e 195 a 448 do id. DE SEQ.
N°: 3 ou equivalentes destes. Em outra modalidade, o fXa des-Gla compreende pelo menos os resíduos de aminoácido 46 a 139 e 195 a 448 do ID. DE SEQ. N°: 3 ou equívalentes 5 destes.
"fXa deficiente em Gla" refere-se a fXa com um número reduzído de grupos Y-carboxil livres na cadeia Iateral em seu domínio Gla. Como q fxa sem domínio Gla, fXa deficiente em Gla também pode abrigar outras modificações. fxa 10 deficiente em GIa inclui fXa não carboxilado, subcarboxilado e desca-rboxilado. "fxa não carboxilado" ou "fXa descarboxilado" refere-se aos derivados de fxa que não possuem os grupos Y-carbõxi dos resíduos de ácido y- carboxiglutâmico do dominio Gla, por exemplo, fXa que 15 possui todo o seu ácido Y-carboxiglutâmico do domínio GIa substituído por aminoácidos díferentes, ou fXa que possui todo o seu Y-carboxil da cadeia lateral rernovido ou 0 mascarado por rneio, por exemplo, de aminação, esterificação etc. Para proteína expressa recombinanterriente, fXa sem 20 carboxilação também é denominado, algumas vezes, fxa não carboxilado. "fXa subcarboxilado" refere-se aos derivados de fxa que possuem um núrnero reduzido de grupos Y-carbóxi no domínio Gla quando cornparado com o fXa do tipo selvagem, por exemplo, fXa que possui um ou mais, mas nem todos, os 25 seus ácidos Y-carboxiglutâmicos do domínio Gla substituídos por um ou maís aminoácidos diferentes, ou fXa que possui pelo menos um, mas nem todos, seus grupos Y-carboxil da cadeia Iateral removido ou mascarado por meios como, por exemplo, aminação e esterificação etc.
30 A estrutura do domínio do fator Xa hurnano sem domínio
Gla pode ser encontrada em Padmanabhan e col., j. Mol.
Biol., 1993, 232, 947-966, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. A numeração do aminoácido se baseia em equivalências topológicas com quimotripsina, em 5 que, por exemplo, Ser195 corresponde a Ser379 na Figura 2 quando é utilizada a numeração do fX maduro humano.
Inserções são indicadas com letras, e eliminações são indicadas por 2 numerações sucessivas. "300" é adicionado à numeração da cadeia leve para diferenciar da numeração da cadeia pesada. É3363 é É3-hidróxi aspartato.
Barras inclinadas (/) indicam clivagens proteolíticas observadas em material cristalino. A seqüência de fxa sem domínio Gla desprovida de 1-45 resíduos de aminoácido com base no fX maduro (ID. DE SEQ. N°: 3) está listada no ID.
DE SEQ. N°: 5.
Em uma rnodalidade, o derivado de EXa pode não possuir uma cadeia leve de fXa, mas ainda contém um domínío catalítico de serina-protease presente na cadeia pesada.
Alérn disso, quimeras com outro domínio catalítico de serina-protease podem ser usadas para a realização de substituições na cadeia pesada.
"Antídoto-pd" ou "antídoto derívado do plasma" refere- se ao derivado de fXa des-Gla anidro e possui os resíduos de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 10.
"Antídoto-r" ou "antídoto recombinante" refere-se a um derivado de fxa desprovido dos 6-39 resíduos de aminoácido do ID. DE SEQ. N°: 3, que corresponde a um fXa mutante expresso em células CHO descrito corn mais detalhes abaixo (ID. DE SEQ. N°: 13, Tabela 12a).
"Agentes anticoagulantes" ou "anticoagulantes" são agentes que inibem a formação do coágulo sangüíneo. Exernplos de agentes anticoagulantes incluem, sem Iimitação, inibidores específicos de trombina, fator IXa, fator Xa, fator XIa, fator XIla ou fator VIla, heparina e derivados, 5 vitamina K antagonista, e anticorpos anti-fator tecidual.
Exemplos de inibidores específicos de trombina incluem hirudina, bivalirudina (Arlgiornax®), argatroban e lepirudina (Refludan®). Exemplos de heparina e derivados incluem heparina não fracionada (UFH), heparina de baixo peso molecular (LMWH) como, por exemplo, enoxaparina (Lovenox®), dalteparina (Fragmin®) e danaparóide (Orgaran®); e pentassacarídeo sintético, como, por exemplo, fondaparinux (Arixtra®). Exemplos de antagonistas da vitamina K incluem warfarina (Coumadin®), fenocumarol, acenocumarol (SintrornR), clorindiona, dicurnarol, difenadiona, biscumacetato de etila, fenprocumon, feníndiona e tioclomarol. Em uma modalidade, o anticoagulante é um inibidor do fator Xa. Em uma modalidade, o anticoagulante é betrixaban.
O terrno "terapia anticoagulante" refere-se a urn regirne terapêutico que é administrado a um paciente para evitar coágulos sangüíneos indesejados ou trombose. Uma terapia anticoagulante compreende a administração de um ou uma combinação de dois ou mais agentes anticoagulantes ou outros agentes em uma dosagerri e posología adequada ao tratamento ou à prevenção dos coágulos sangüíneos indesejados ou de trombose no paciente.
O termo "inibidores do fator Xa" ou "inibidores de fator Xa" refere-se aos compostos que podem inibír, direta ou indiretamente, a atividade do fator da coagulação Xa de catalisação da conversão de protrombina em trombina in vitro e/ou in vivo. Exemplos de inibídores de fXa conhecidos incluem, sem lirnitação, fondaparinux, idraparinux, idraparinux biotinilado, enoxaparina, 5 fragmína, NAP-5, rNAPc2, inibidor da via do fator tecidual, DX-9065a (como descrito, por exemplo, em Herbert, J.M., e col., j. Pharmacol. Exp. Ther. 1996 276(3): 10.308), YM- 60828 (como descrito, por exemplo, em Taniuchí, Y., e col., Thromb. Haemost. 1998 79(3): 5.438), YM-150 (como descrito, por exemplo, em Eriksson, B.I. e cols., Blood 2005; 106(11), Resumo 1865), apixaban, rivaroxaban, PD-348292 (como descrito, por exemplo, em "Pipeline Insight: Antithrombotics - Reaching the Untreated Prophylaxis Market", 2007), otamixaban, razaxaban (DPC906), BAY 59-7939 (como descrito, por exemplo, em Turpie, A.G., e col., lj.
Thromb. Haemost. 2005, 3(11): 2.479-86), DU-176b (como descrito, por exemplo, em Hylek EM, Curr. Opin. Invest.
Drugs 2007 8(9): 778-783), LY517717 (como descrito, por exemplo, em Agnelli, G., e col., j. Thromb. Haemost. 2007 5(4): 746-53), GSK913893, betrixaban (como descrito abaixo) e derivados destes. A heparina de baixo peso molecular ("LMWH") também é considerada urn inibidor do fator Xa.
Em uma modalidade, o inibidor do fator Xa é selecionado de betrixaban, rivaroxaban, LMWH, e combinações destes.
O termo "betrixaban" refere-se ao composto "12j{4- [(dimetilamino)iminometi1]feniI}carbonilamino)-5- metoxifenil]-N-(5-cloro(2-piridil))carboxarnida", ou sais farmaceuticamente aceitáveis destes. "[2-({4- [(dimetilamino)iminometil]fenil}carbonílamino)-5-
metoxifenil]-N-(5-cloro(2-piridi1))carboxamída" refere - se ao composto que possui a seguinte estrutura: H^^^ <Y"' 5 NH
NH H,c"n"ch3 , ou um tautômero ou sal farmaceuticamente aceitável 10 deste.
Betrixaban é descrito nas Patentes U.S. N°": 6.376.515 e 6.835.739 e Publicação de Pedido de Patente U.S. N°: 2007/0112039, depositado em 7 de novembro de 2006, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência. Betrixaban 15 sabidamente é urri ínibidor específico do fator Xa.
Como aqui usado, o termo "antídoto" ou "antídoto para um inibidor do fator Xa" refere-se às moléculas, por 4 exemplo, derivados de fXa, que podem substancialmente neutralizar ou reverter a atividade inibidora da coagulação 20 de um inibidor de fXa por competição com fXa ativo para se ligar aos inibidores de fXa disponíveis. Exemplos dos antídotos desta invenção são derivados de fXa com ligação reduzida à membrana de fosfolipídeo, por exemplo, fXa des- GIa ou fxa deficiente eín Gla, e derivados de fXa com 25 atividade catalítica reduzida, por exemplo, os derivados de fXa com sítio ativo rnodificado, e derivados com interação reduzida com fV/Va, ou fVIIIjfVIIIa. Exemplos de antídotos da invenção com ligação à membrana reduzida e atívidade catalítica reduzida incluem, sem limitação, fXa anidro des- 30 Gla por digestão por quimotripsina de fXa anidro (corno descrito no Exemplo 1); fxa des-G1a-S379A (S195A na numeração de quimotripsina) por mutagênese (como descrito no Exemplo 6).
Outros exemplos de antídotos da invenção incluem 5 proteínas ou polipeptídeos que contêm domínios catalíticos de serina-protease que possuem símilaridade estrutural suficiente com o dornínio catalítico de fxa e são, portanto, capazes de se ligar aos inibidores de fXa de pequena molécula. Exemplos incluem, sem Iimitação, trombina, que se lO Iiga ao inibidor de fXa GSK913893 (Young r., e col., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007, 17(10): 2.927-2.930); calicreína plasmática, que se Iiga ao inibidor de fXa apixaban (Luettgen j., e col., Blood, 2006, 108(11) Resurno 4130); e tripsina (ou seu homólogo bacteriano subtilisina), que se liga ao inibidor de fXa C921-78 com afinidade subnanomolar (Kd = 500 pM) (Betz A, e col., Biochein., 1999, 38(44): 14.582-14.591).
Em uma modalidade, o derívado da invenção se liga, direta ou indiretamente, a um inibidor do fator Xa. Os termos "ligação", "que se liga", "reconhecimento" ou "reconhece", como aqui usados, visam íncluir interações entre moléculas que podem ser detectadas usando, por exemplo, um ensaio de híbridização. Os termos também visam incluir a "ligação" de interações entre moléculas. As interações podern ser, por exemplo, de natureza proteína- proteína, proteína-ãcido nucléico, proteína-pequena molécula ou pequena molécula-ácido nucléico. A ligação pode ser "direta" ou "indireta". A ligação "direta" compreende o contato físico direto entre moléculas. A ligação "indireta" entre moléculas compreende o fato de que as moléculas têm contato físico direto com uma ou mais moléculas intermediárias simultaneamente. Por exemplo, é contemplado que os derivados da ínvenção se ligam indiretamente e substancialmente neutralizam heparina de baíxo peso 5 molecular e outros inibidores indiretos do fator Xa. Essa ligação pode resultar na formação de um "complexo" que compreende as rnolêculas que interagern. Um "complexo" refere-se à Iigação de duas ou rnais moléculas mantidas juntas por ligações covalentes ou não covalentes, interações ou forças.
"Neutralizar", "reverter" ou "atuar contra" a atividade de um inibidor de fXa ou frases similares se referem à inibição ou ao bloqueio da função inibidora ou anticoagulante do fator Xa de um inibidor de fXa. Essas frases referem-se à inibição ou ao bloqueio parcial da função, bem como à inibição ou ao bloqueio da maioria ou de toda a atividade inibidora de fXa, in vitro e/ou in vivo.
Em certas modalidades, o inibidor do fator Xa é neutralizado substancialmente, o que significa que sua habilidade para inibir o fator Xa, direta ou indiretamente, é reduzida em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90°â, 95% ou 100%- 0 termo "ligação à membrana de fosfolipídeo" refere-se à habilidade de um fXa ativo para se ligar à membrana de fosfolipídeo carregada negativamente ou a outra membrana celular, por exemplo, plaquetas, na presença de íons de Ca2+. Essa ligação é mediada pelos resíduos de ácido y- carboxiglutâmico no domínio Gla de fxa.
O termo "interação reduzida" refere-se à habilidade diminuída do derivado de fXa para se ligar ou formar um complexo ccm íons ou outros co-fatores que norrnalmente se Iiga ou forma complexos com IXa selvagem. Exemplos dessa . interação incluem, sem limitação, a ligação de IXa com íons 5 de Ca'" e à membrana de fosfolipídeo, interação com fV/fVa, ou fVIII/f/VTIIa etc. Prefere-se que a interação de um derivado de fXa com os íons ou outros co-fatores seja reduzida a 50% daquela de um fXa selvagem. Mais preferivelmente, a interação é reduzida a 10%, 1% e 0,1% 10 daquela de um fxa do tipo selvagem. Isso se refere à habilidade dos derivados para "se reunir no complexo de protrombinase".
O termo "atividade de ligação ao inibidor de fXa" refere-se à habilidade de uma molécula para se ligar a um 15 inibidor de IXa. Um antídoto da presente invenção possui atividade de ligação ao inibidor de fXa, seja ela direta ou indiretamente.
O termo "meia-vida circulante" ou "meia-vida plasmática" refere-se ao tempo necessário para que a 20 concentração plasrriática de um antídoto que circula no plasma se reduza à metade de sua concentração inicial após urna única administração.
O termo "porção conjugada" refere-se a uma porção que pode ser adicionada a um derivado de fxa por formação de 25 uma ligação covalente com a resíduo do derivado de fXa. A porção pode se ligar díretamente a um resíduo do derivado de fXa ou pode formar uma ligação covalente corn um vinculador que, pQr sua vez, forma uma ligação covalente com um resíduo do derivado de fXa.
30 Como aqui usado, um "anticorpo" inclui anticorpos inteiros e qualquer fragrnento de Iigação de antígeno ou uma cadeia única deste. Dessa forma, o termo "anticorpo" inclui qualquer proteína ou peptídeo que contenha uma molécula que compreenda pelo menos uma porção de uma molêcula de 5 irnunoglobulina. Exemplos deste incluem, sem limitação, a região determinante de complementaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou leve ou a porção de ligação de lígante desta, uma região variável da cadeia pesada ou cadeia leve, uma região constante da cadeia pesada ou cadeia leve, uma região framework (FR), ou qualquer porção desta, ou pelo menos uma porção de uma proteína de ligação.
Os anticorpos podem ser policlonais ou monoclonais, e podem ser isolados de qualquer fonte biológica adequada, por exemplo, de murídeos, rato, carneiro e caninos.
O termo "composição" visa significar uma combinação de agente ativo e outro composto ou composição, inerte (por exemplo, um agente ou marcador detectável) ou ativo, por exemplo, urn adjuvante.
O termo "composição farmacêutica" visa incluir a combinação de um agente ativo com um veículo, inerte ou ativo, que torna a composição adequada para uso diagnóstico ou terapêutico in vitro, in vivo ou ex vivo.
Urna "quantidade eficaz" refere-se à quantidade de derivado suficiente para induzir um resultado biológico e/ou terapêutico desejado. Aquele resultado pode ser o alívio dos sinais, sintomas ou causas de uma doença, ou qualquer outra alteração desejada de um sistema bio.lógico.
Na presente invenção, o resultado tipicamente envolverá um ou mais dos seguintes: neutralização de urn inibidor de fXa que foi administrado a um paciente, reversão da atividade anticoagulante do inibídor de fxa, remoção do inibidor de fxa do pIasma, restauração da hemostasia, e redução ou cessação de sangramento. A quantidade eficaz irá variar, . dependendo do agente do antídoto específico usado, do 5 inibidor específico de fxa que foi administrado ao indivíduo, do regime de dosagem do inibidor de fxa, do momento da administração do antídoto, do indivíduo e da condição de doença que está sendo tratada, do peso e da idade do indivíduo, da gravidade da condição de doença, da 10 forma de admínistração, e semelhantes, todos podendo ser determinados facilmente por aqueles habílitados na técnica.
Como aqui usado, os termos "que trata", "tratamento" e semelhantes são aquí usados para significar a obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. o efeito 15 pode ser profilático, em termos de evitar completa ou parcialmente um distúrbio ou sinal ou sintoma deste, e/ou pode ser terapêutico, em termos de urna cura parcial ou ¶ cornpleta para um distúrbio e/ou efeito adverso atribuível ao distúrbio.
20 "Tratamento" também cobre qualquer tratamento de um distúrbio em um mamífero, e inclüi: (a) prevenção da ocorrência de um distúrbio em um indivíduo que pode estar predisposto a um distúrbio, mas pode ainda não ter recebido o diagnóstico do distúrbio, por exemplo, evitar sangramento 25 em um paciente com overdose de anticoagulante; (b) inibíção de um distúrbio, ou seja, interromper seu desenvolvimento, por exemplo, inibição de sangramento; ou (C) alívío ou atenuação do distúrbio, por exemplo, redução do sangramento.
30 Como aquí usado, "tratar" ainda inclui melhora sistêmica dos sintomas associados à patologia e/ou urn retardo nQ surgimento de sintomas. As evidências clínicas e subclínicas do "tratamento" irão variar com a patologia, com o indivíduo e com o tratamento.
5 A "administração" pode ser efetuada ern urna dose, continuamente ou intermitentemente ao longo da evolução do tratamento. Métodos para determinação do meio e da dosagem de administração rnais eficazes são conhecidos por aqueles habilitados na técnica, e irão variar com a composição usada para terapia, com a finalidade da terapia, com a cêlula-alvo que está sendo tratada e com o indivíduo tratado. Administrações únicas ou múltiplas podem ser realízadas com c) nível e padrão de dose sendo selecionados pelo médico responsável pelo tratamento. Formulações de dosagem e métodos de administração dos agentes adequados são conhecidos na técnica.
Os agentes e as composições da presente invenção podem ser usados na fabrícação de medicamentos e para o tratamento de humanos e outros animais por administração de acordo com procedimentos convencionais, por exemplo, um ingrediente ativo ern composições farmacêuticas.
Um agente da presente invenção pode ser administrado para terapia por qualquer via adequada, especificamente por administração parental (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Também será observado que a via preferida irá variar com a condição e a idade do receptor, e com a doença tratada.
Pode-se determinar se o método, ou seja, inibição ou reversão de um inibidor do fator Xa, é obtido por diversos ensaios in vitro, por exemplo, ensaio de geração de trombina, e ensaios clínicos de coagulação corno, por exemplo, aPTT, PT e ACT.
O termo "isolado" como aqui usado em relação aos ácidos nucléicos, por exempj-o, DNA ou RNA, refere-se às 5 moléculas separadas de outros DNAS ou RNAS, respectivamente, que estão presentes na fonte natural da macromolécula. O termo "ácido nucléico isolado" visa incluir fragmentos de ácido nucléico que não são de ocorrência natural como fragmentos e não seriam encontrados 10 no estado natural. O termo "isolado" também é aqui usado para se referir aos polipeptídeos e proteínas que são isolados de outras proteínas celulares, e visa englobar polípeptídeos tanto purificados quanto recombinante. Em outras modalidades, o termo "isolado" significa separado de 15 constituintes celulares aos quais a célula, tecido, polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo ou fragmentols) destes, está norrnalmente
W associado na natureza. Por exemplo, uma célula isolada é uma célula que é separada de tecido ou células de fenótipo 20 ou genótipo diferente. Como é evidente para aqueles habilitados na técnica, um polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo de ocorrência não natural, ou fragmento(s) destes, não exige o "isolamento" para distingui-lo de sua contraparte de ocorrência natural.
25 Como aqui usado, o termo "equivalente destes", quando se refere a uma proteína, polipeptídeo ou ácido nucléico de referência, significa aqueles que possuem homologia míniuia, embora ainda mantenham a funcionalidade desejada.
Contempla-se que qualquer proteína modificada aqui 30 mencionada também inclui equivalentes desta. Por exemplo, a homologia pode ser pelo menos 75% de homologia e, u alternativamente, pelo menos 80% ou, alternativamente, pelo menos 85% ou, alternativamente, pelo menos 90% ou, . alternativamente, pelo menos 95% ou, alternativamente, 98 5 por cento de homologia e exibir atívidade biológica substancialmente equivalente ao polipeptídeo ou proteína de referência.
Um polinucleotídeo ou uma região do polinucleotídeo (ou um polipeptídeo ou região do polipeptídeo) que possui 10 certa percentagem (por exemplo, 80%, 85%, 90% ou 95%) de "identidade de seqüência" para outra seqüência significa que, quando alinhadas, aquela percentagem de bases (ou de aminoácidos) é igual na comparação das duas seqüêncías.
Deve-se observar que, quando apenas a cadeia pesada de fXa 15 (ou uma serina-protease relacionada) é usada, a homologia global pode ser menor do que 75% como, por exemplo, 65% ou 50%; no entanto, a funcionalidade desejada permanece. Esse d alinhamento e o percentual de homologia ou identidade de seqüência podem ser determinados com o uso de programas de 20 cornputador conhecidos na técnica, por exernplo, aqueles descritos em "CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY" (F.M.
Ausubel e col., eds., 1987) Suplemento 30, seção 7.7.18, Tabela 7.7.1. De preferência, são usados os parâmetros padronizados para o alinhamento. Um programa de alinhamento 25 preferido é BLAST, com a utilização dos parâmetros padronizados. Em particular, programas preferidos são BLASTN e BLASTP, com o uso dos seguintes parârnetros padronizados: Código genético = padrão; filtro = nenhum; fita = ambas; valor de corte = 60; esperado = 10; Matriz = 30 BLOSUM62; Descrições = 50 seqüênciãs; classificar por =
HIGH SCORE; Bases de dados = não redundantes, GenBank +
F EMBL + ddbj + PDB + traduçães GenBank CDS + SwissProtein + SPupdate + PIR. Detalhes desses programas podem ser encontrados no seguinte endereço da Internet: 5 http://www.ncbi.nlm.nih gov/cgi-bin/BLAST.
Os termos "polinucleotídeo" e "oligonucleotídeo" são usados de forma intercambiável e referem-se a uma forma poIiméríca de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou análogos 10 destes. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem realizar qualquer função, conhecida ou desconhecida. A seguir serão apresentados exemplos não limitantes de polinucleotídeos: um gene ou fragmento gênico (por exemplo, uma sonda, um iníciador, tag EST ou SAGE), 15 éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, ribozimas, CDNA, polinucleotídeos recombinantes, poIinucleotídeos . ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer seqüência, RNA isolado cíe qualquer seqüência, sondas e 20 íniciadores de ácido nucléico. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, por exemplo, nucleotídeos metilados, e análogos de nucleotídeos. Se presentes, as modificações à estrutura do nucleotídeo podem ser efetuadas antes ou depois da montagem do 25 polinucleotídeo. A seqüência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ainda ser modificado após polimerização, por exemplo, por conjugação com um componente de marcação. O termo tambérn se refere às 30 moléculas de fita dupla ou de fita simples. A menos que especificado ou necessário de forma diferente, qualquer modalidade desta invenção que seja um polinucleotídeo engloba tanto a forma de fita dupla quanto cada uma das duas formas complementares de fita dupla conhecidas ou que 5 prevê-se que constituam a forma de fita dupla.
Um polinucleotídeo é composto por uma seqüência específica de quatro bases nucleotídicas: adenina (A); citosina (C); guanína (G); timina {T); e uracil (U) para timína quando o poIinucleotídeo é RNA. Dessa forma, o termo "seqüência de polinucleotídeos" é a representação alfabética de uma molêcula de polinucleotídeo. Essa representação alfabética pode ser inserida em bases de dados em um computador que possui uma unidade de processamento central e usada para aplicações de bioinformática como, por exernplo, genômica funcional e pesquisa de homologia.
O termo "homologia" ou "identidade" ou "similaridade" refere-se à similaridade de seqüência entre dois peptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucléico. A hornologia pode ser determinada por comparação de uma posição em cada seqüência que pode ser alinhada para fins de comparação.
Quando uma posição na seqüência comparada é ocupada pela rnesma base ou aminoácido, então as rnolêculas são homólogas naquela posição. Um grau de homologia entre seqiíências é uma função cío número de posições combinadas ou homólogas compartilhado pelas seqüências. Uma seqüência "não rel-acionada" ou "não hcmóloga" compartilha menos de 40°: de identídade ou, alternativamente, menos de 25% de identidade, corn uma das seqüências da presente invenção.
Uma região do polinucleotídeo ou do poIínucleotídeo
(ou uma regíão poIipeptídeo ou do polipeptídeo) que possui certa percentagem (por exemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%) de "identidade de seqüência" para outra seqüência significa que, quando alinhada, aquela 5 percentagem de bases (ou aminoácidos) é igual na comparação das duas seqüências. Esse alinhamento e o percentual de homologia ou identidade de seqüência podem ser determinados com o uso de programas de cornputador conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles descritos em Ausubel e col. eds. (2007) "Current Protocols in Molecular Biology". De preferência, são usados parâmetros padronizados para o alinhamento. Um programa de alinhamento é BLAST, com a utilização dos parâmetros padronizados. Em particular, os programas são BLASTN e BLASTP, com o uso dos seguintes parâmetros padronizados: Código genético = padrão; filtro = nenhum; fita = arnbas; valor de corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 seqüências; classificar por = HIGH SCORE; Bases de dados = não redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traduções GenBank CDS + SwissProtein + SPupdate + PIR. Detalhes desses programas podem ser encontrados no seguinte endereço da Internet: http://www.ncbi.nlm.nih gov/blast/Blast.cgi, acessado pela última vez ern 26 de novembro de 2007.
Polinucleotídeos biologicamente equivalentes são aqueles que possuem o percentual de homologia especificado e que codificam urn polipeptídeo que possui a mesma atividade biolõgica ou uma atividade biológica similar.
O termo "um homõlogo de urri ácido nucléico" refere-se a um ácido nucléico que possui uma seqüência de nucleotídeos que possui certo grau de homologia com a seqüência de nucleotídeos do ácido nucléico ou complemento desta. Um homólogo de um ácido nucléico de fita dupla visa incluír ácidos nucléicos que possuem uma seqüência de nucleotídeos que possui certo grau de homologia com ele ou com o 5 complemento deste. Em um aspecto, homólogos de ácidos nucléicos são capazes de hibridizar para o ácido nucléico ou complemento deste.
O termo "gene" refere-se a um polinucleotídeo que contém pelo menos um quadro de leitura aberta (ORF) que ê capaz de codificar urn polipeptídeo ou uma proteína em particular após ser transcrito e traduzido. Qualquer uma das seqüências de polinucleotídeos ou poIipeptídeos aquí descritas pode ser usada para identificar fragmentos maiores ou seqüências codificadoras de comprimento total do gene com o qual estão associadas. Métodos de isolamento de seqüências de fragmentos maiores são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
O termo "expressar" refere-se à produção de um produto gênico.
Como aqui usado, o termo "expressão" refere-se ao processo pelo qual polinucleotídeos são transcritos em mRNA e/ou ao processo pelo qual o mRNA transcrito é subseqüentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Caso o polinucleotídeo seja derivado de DNA genômico, a expressão poderá incluir o splicíng do mRNA em uma célula eucariõtica.
O termo "codificar", como aplicado aos polinucleotídeos, refere-se a um polinucleotídeo que supostamente "codifica" um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado por métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, ele pode ser transcrito e/ou traduzido para produzir o mRNA para o polipeptídeo e/ou urri fragmento deste. A fita anti-senso é o complemento desse ácido nucléico, e a seqüência codificadora pode ser 5 deduzida a partir dela.
Um "conjugado peptídico" refere-se à associação por ligação covalente ou não covalente de um ou mais polipeptídeos e outro composto químico ou biológico. Em um exemplo não limitante, a "conjugação" de um polipeptídeo com um composto químico resulta no aumento da estabilidade ou eficácía do polipeptídeo para sua finalidade desejada.
Em uma modalidade, um peptídeo é conjugado a um veículo, em que o veículo ê um lipossomo, uma micela ou um polímero farmaceuticamente aceitável.
"Lípossomos" são vesículas microscópicas que consistem em bicamadas lípídicas concêntricas. Estruturalmente, lipossomos variam em termos de tamanho e formato desde tubos longos a esferas, com diuiensões de poucas centenas de Angstroms a frações de um rnilímetro. Lipídeos formadores de vesícula são selecionados para se obter um grau de fluidez ou rigidez especificado do complexo final que fornece a composição lipídica da camada externa. Esses são neutros (colesterol) ou bipolares, e incluem fosfolipídeos, por exemplo, fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI) e esfingomielina (SM), e outros tipos de lipídeos bipolares que inclueui, sem limitação, dioleoilfosfatidiletanolamína (DOPE), com um comprimento da cadeia de hidrocarboneto na faixa de 14-22, e saturada, ou com uma ou mais ligações duplas C=C. Exemplos de lipídeos capazes de produzir um lipossomo estável, isoladamente ou em combinação com outros cornponentes lipídicos, são fosfolipídeos, por exemplo, fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), lecitina, fosfatidiletanolamina,
lisolecitina, lisofosfatídiletanol-amina, fosfatídilserina,
5 fosfatidílinositol, esfingomielina, cefalina, cardiolipina,
ácido fosfatídico, cerebrosídeos,
diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE),
dioleoilfosfatidilcolina (DOPC),
dipalmítoilfosfatidilcolina (DPPC),
palmítoiloleoilfosfatidilcolina (POPC),
palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE) e díoleoilfosfatidiletanolamina 4-(N-maleimido-
metil)ciclohexano-l-carboxilato (DOPE-mal). Lipídeos adicionais que não contêm fósforo que podem ser incorporados em lipossomos incluem estearilamina,
dodecilamina, hexadecilamina, mirístato de isopropila,
trietanolamina-lauril sulfato, alquil-aril sulfato, acetil palmitato, ricinoleato de glicerol, hexadecil estearato,
polírneros anfotéricos acrílicos, amidas de ácido graxo polietiloxiladas, e os lipídeos catiônicos mencionados acima (DDAB, DODAC, DMRIE, DMTAP, DOGS, DOTAP (DOTMA),
DOSPA, DPTAP, DSTAP, DC-Chol). Lipídeos carregados negativamente incluem ácido fosfatídico (PA),
dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG),
dioleoilfosfatidilglicerol e (DOPG), dicetilfosfato que são capazes de formar vesículas.
Típicamente, os lipossomos podem ser divididos em três categorias com base em seu tamanho global e na natureza da estrutura lamelar.
As três classificações, como desenvolvidas pelo "New York Academy
Sciences Meeting", "Liposomes and Their Use in Biology and
Medicine", dezembro de 1977, são vesículas multilamelares (MLVs), vesículas unilamelares pequenas (SUVs) e vesículas unilamelares grandes (LUVs). . Uma "micela" é um agregado de rnoléculas tensoativas 5 dispersas em um colõide líquido. Uma micela típica em solução aquosa forma um agregado com as regiões hidrofílicas da "cabeça" em contatQ com o solvente circundante, seqüestrando as regiões hidrofílícas da cauda no centro da micela. Esse tipo de micela é conhecido como 10 uma micela de fase normal (mícela óIeo-em-água). Micelas inversas possuem os grupos da cabeça no centro com as caudas se estendendo para Eora (micela água-em-óleo). As micelas podem ser usadas para anexar um polinucleotídeo, polipeptídeo, anticorpo ou composição aqui descritos para 15 facilitar a liberação eficiente à célula ou tecido-alvo.
A frase "polímero farmaceuticamente aceitãvel" refere- se ao grupo de compostos que pode ser conjugado a um ou rnais polipeptídeos aqui descritos. Contempla-se que a conjugação de urri poIímero ao polipeptídeo é capaz de 20 prolongar a meia-vida do polípeptídeo in vivo e in vitro.
Exemplos não limitantes incluem polietileno glicôis, polivinilpirrolidonas, alcoóis polivinílicos, derivados de celulose, poliacrilatos, polimetacrilatos, açúcares, polióis e misturas destes.
25 Um "veículo de liberação gênica" é definido como qualquer molécula que possa carregar polinucleotídeos inseridos em uma célula hospedeira. Exernplos de veículos de liberação gênica são lipossomos, polímeros de micelas biocompatíveis, incluindo polímeros naturais e polímeros 30 sintêticos; lipoproteínas; polipeptídeos; polissacarídeos;
lipopolissacarídeos; envelopes virais artificiais; . partículas de metal; e bactérias ou vírus como, por exemplo, baculovírus, adenovírus e retrovírus, . bacteriófago, cosmídeo, plasmídeo, vetores fúngicos e 5 outros veículos de recombinação tipicamente usados na técnica que foram descritos para expressão em diversos hospedeiros eucarióticos e procarióticos, e podem ser usados para terapia gênica, bem como para simples expressão de proteína.
10 Um poIinucleotídeo desta invenção pode ser Iiberado a uma célula ou tecido usando um veículo de Iiberação gênica.
"Liberação gênica", "transferência gênica", "transdução", e semelhantes, como aqui usados, são termos que se referem à introdução de um polinucleotídeo exógeno (algurnas vezes 15 denominado um "transgene") em uma célula hospedeira, independentemente do método usado para a íntrodução. Esses métodos incluem diversas técnicas bern conhecidas como, por exemplo, transferência gênica mediada por vetor (por exemplo, por infecção/transfecção viral, ou vários outros 20 complexos de liberação gênica è base de proteína ou lipídeo), além de técnicas que faci-litam a liberação de polinucleotídeos "desnudos" (naked) (por exemplo, eletroporação, liberação por pistola gênica (gene gun) e vârias outras técnicas usadas para a introdução de 25 polínucleotídeos)- O polinucleotídeo introduzido pode ser mantido estavelmente ou transitoriamente na célula hospedeira. A manutenção estável típicamente exige que o polinucleotídeo introduzido contenha uma origem de replicação compatível com a célula hospedeira ou se integre 30 etri um replicon da célula hospedeira como, por exemplo, um replicon extracromossômico (por exemplo, um pIasmídeo) ou um cromossomo nuclear ou mitocondrial. Diversos vetores são · conhecidos como sendo capazes de mediar a transferência de genes às células de mamíferos, como é conhecido na técnica 5 e aquí descrito.
Um "vetor viral" é definido como um vírus ou partícula viral produzido recombinantemente que compreende um polinucleotídeo a ser liberado em uma célula hospedeira, in vivo, ex vivo ou in vitro. Exemplos de vetores virais 10 incluem vetores retrovirais, vetores adenovirais, vetores de vírus adeno-associado, vetores de alfavírus e semelhantes. Vetores de alfavírus, por exemplo, vetores baseados no vírus de Semliki Forest e no vírus Sindbis, também foram desenvolvidos para uso em terapia gênica e 15 imunoterapia. veja Schlesinger e Dubensky (1999) Curr.
Opin. Biotechnol. 5: 434-439 e Ying, e col. (1999) Nat.
Med. 5(7): 823-827. Em aspectos nos quais a transferência gênica é mediada por urri vetor retroviral, uma construção de vetor refere-se ao polínucleotídeo que compreende o genoma 20 retroviral, ou parte deste, e utn gene terapêutico. Como aqui usado, "transferência gênica por mediação retroviral" ou "transdução retroviral" possui o mesmo significado e refere-se ao processo pelo qual um gene ou seqüências de ácidos nucléicos são transferidos estavelmente na célula 25 hospedeira em virtude da entrada do vírus na célula e a integração de seu genoma no genoma da célula hospedeira. O vírus pode entrar na célula hospedeira por meio de seu mecanismo normal de infecção ou ser modificado de tal forma que se ligue a um receptor de superfície diferente da 30 célula hospedeira ou ligante para entrar na célula. Como aqui usado, o termo "vetor retroviral" refere-se a uma partícula viral capaz de introduzir ácido nucléico exógeno em urna célula por rrieio de um mecanismo de entrada viral ou viral-like.
5 Retrovírus carregam sua inforrnação genética na Eorma de RNA; no entanto, depois que o vírus infecta uma célula, o RNA ê transcrito de forma reversa na forma de DNA que se integra no DNA genômico da célula infectada. A forma de DNA integrada é denominada um prõ-vírus.
Em aspectos nos quais a transferência gênica é medíada por um vetor viral de DNA, por exemplo, um adenovírus (Ad) ou vírus adeno-associado (AAV), uma construção de vetor refere-se ao polínucleotídeo que compreende o genoma viral, ou parte deste, e um transgene. Adenovírus (Ads) são um grupo de vírus relativamente bem caracterizado, homogêneo, que inclui mais de 50 sorotipos. veja, por exemplo, Pedido PCT International N° WO 95/27071. O Ads não precisa ser integrado no genorna da célula hospedeira. Vetores derivados de Ad recombinante, particularmente aqueles que reduzern o potencial para recombínação e geração de vírus do tipo selvagem, também foram construídos. veja Pedidos de PCT International N°" WO 95/00655 e WO 95/11984. AAV do tipo selvagem possui infectividade e especificidade altas na integração no genoma da célula hospedeira. veja Herrnonat e Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. sci. USA 81: 6.466-6.470 e Lebkowski e col. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 3.988-3.996.
Vetores que contêm tanto um promotor quanto um sítio de clonagem no qual um polinucleotídeo pode ser ligado operacionalmente são bem conhecidos na técnica. Esses vetores são capazes de transcrever RNA in vítro ou in vivo,
e estão disponíveis comercialmente por fontes como e Stratagene (La jolla, CA) e Promega Biotech (Madison, WI).
A fim de otimizar a expressão e/ou transcrição in vitro, pode ser necessário remover, adicionar ou alterar porções 5 5' e/ou 3' não traduzidas dos clones para elirninar códons de iniciação da tradução potenciais inadequados alternativos extras, ou outras seqüências que possam interferir ou reduzir a expressão, tanto no nível da transcrição quanto da tradução. Alternativamente, sítios de 10 ligação de ribossomo de consenso podem ser inseridos imediatamente 5' do códon de partída para intensificar a expressão.
veículos de liberação gênica também incluern complexos de DNA/lipossomo, micelas e complexos direcionados de 15 proteína viral-DNA. Lipossomos que também compreendem um anticorpo de direcionamento ou fragrnento deste podem ser usados nos métodos desta invenção. Para aumentar a liberação a uma célula, o ácido nucléíco ou as proteínas desta invenção podem ser conjugados aos anticorpos ou 20 fragmentos de ligação destes que se ligam aos antígenos da superfície celular, por exemplo, urri marcador da superfície celular encontrado em cêlulas-tronco ou cardiomiócitos.
Além da liberação de polinucleotídeos a uma cêlula ou população de células, a introdução direta das proteínas 25 aqui descrítas à célula ou população de células pode ser feita pela técnica não limitante de transfecção de proteína; alternatívamente, condições de cultivo que podern aumentar a expressão e/ou promover a atividade das proteínas desta invenção são outras técnicas não 30 limitantes.
a frase "suporte sólido" refere-se às superfícies não aquosas como, por exemplo, "placas de cultura", "chips . gênicos" ou "microarranjos". Esses chips gênicos ou microarranjos podem ser usados para fins diagnósticos e 5 terapêuticos por diversas técnicas conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Em uma técnica, oligonucleotídeos são dispostos em um chip gênico para determinação da seqüência de DNA pela abordagem de hibridização, por exemplo, aquela apresentada nas Patentes U.S. N°": 10 6.025.136 e 6.018.041. Os polinucleotídeos desta invenção podem ser modificados ern sondas, as quais, por sua vez, podem ser usadas para detecção de uma seqüência genética.
Essas técnicas foram descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. N°": 5.968.740 e 5.858.659. Urna sonda também pode ser 15 afixada à superfície de um eletrodo para a detecção eletroquímica de seqüências de ácidos nucléicos, como descrito por Kayem e col. patente U.S. N° 5.952.172 e por Kelley e col. (1999) Nucleic Acids Res. 27: 4.830-4.837.
vários "chips gênícos" ou "microarranjos" e 20 tecnologias similares são bem conhecidos na técnica.
Exemplos destes incluem, sem limitação, LabCard (ACLARA Bio sciences Inc.); GeneChip (Affymetríc, Inc); Lábchip (Caliper Technologies Corp); urn arranjo de baixa densidade com sensores eletroquímicos (Clinical Micro Sensors); LabCD 25 System (Gamera Bioscience Corp.); Omni Grid (Gene Machines); Q Array (Genetix Ltd.); sistemas automatizados de espectrometria de massa de alto rendimento, com tecnologia de expressão de fase líquida (Gene Trace Systems, Inc-); um sistema de reconhecimento por jato 30 térmico (Hewlett Packard Company); Hyseq HyChip (Hyseq,
Inc.); BeadArray (Illumina, Inc.); GEM (Incyte Microarray 0 Systems); um sistema de microarranjo de alto rendimento que pode dispensar de 12 a 64 spots sobre múltiplas lâminas de vidro (Intelligent Bio-lnstruments); Molecular Biology 5 Workstation e NanoChip (Nanogen, Inc.); um chip de vidro microfluídico (Orchid biosciences, Inc.); BioChip Arrayer com quatro pontas piezelétricas drop-on-demand PiezoTip (Packard Instruments, Inc.); Flexjet (Rosetta Inpharmatic, Inc.); espectrômetro de massa MALDI-TOF (Sequnome); 10 ChipMaker 2 e ChipMaker 3 (TeleChem International, Inc.); e GenoSensor (Vysis, Inc.), corno identificados e descritos em Heller (2002) Annu. Rev. Biomed. Eng. 4: 129-153. Exemplos de "chíps gênicos" ou de "microarranjos" também são descritos nas Publicações de Patente U.S. N°": 2007- 15 0111322, 2007-0099198, 2007-0084997, 2007-0059769 e 2007- 0059765 e Patentes U.S. N°": 7.138.506, 7.070.740 e
6.989.267.
Em um aspecto, são preparados "chips gênicos" ou "microarranjos" contendo sondas ou iniciadores homólogos a 20 um polinucleotídeo, polipeptídeo ou anticorpo aqui descrito. Uma autostra adequada é obtida do paciente, é feita a extração de DNA genôrnico, RNA, proteína ou qualquer combinação destes e amplificada, se necessário. A amostra é colocada em contato com o painel do chip gênico ou 25 microarranjo sob condições adequadas à hibridização do(s) gene(s) ou produto(s) gênico(s) de interesse para a sonda(s) ou iniciador(s) contido no chip gênico ou microarranjo. As sondas ou iniciadores podem ser marcados de forma detectável, identificando, dessa forma, O(S) 30 gene(s) de interesse. Alternativamente, pode ser usada uma reação química ou biológica para identificar as sondas ou « inicíadores que hibridizaram com o DNA ou RNA do(s) gene(s) de interesse. Os genótípos ou fenótipo do paciente são . então determinados com o auxílio dos aparelhos e rnétodos 5 mencionados anteriormente.
Outros exemplos não limitantes de um suporte de fase sólida incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrana, náilon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, gabros e magnetita. A 10 natureza do veículo pode ser soIúvel em algum grau ou insolúvel. O material de suporte pode ter praticamente qualquer configuração estrutural possível, desde que a molécula acoplada seja capaz de se ligar a um polinucleotídeo, polipeptídeo ou anticorpo. Dessa forma, a 15 configuração do suporte pode ser esférica, como em um glóbulo, ou cilíndrica, como na superfície interíor de um tubo de ensaio, ou a superfície externa de um bastão.
Alternativamente, a superfície pode ser plana corno, por exernplo, uma folha, fita de teste etc. ou, 20 alternativamente, glõbulos de poliestireno. Aqueles habilitados na técnica conhecerão muitos outros veículos adequados para ligação do anticorpo ou antígeno, ou serão capazes de verificar os mesmos pelo uso de experimentação de rotina.
25 "Células eucarióticas" compreendem todos os reinos de vida, exceto Monera. Elas podem ser facilmente distínguidas por meio de um núcleo Iigado à membrana. Animais, plantas, fungos e protistas são eucariotas ou organismos cujas células são organizadas em estruturas complexas por 30 membranas internas e citoesqueleto. A estrutura ligada à membrana mais característica é o núcleo. Um hospedeiro eucariótico inclui, por exemplo, levedura, planta superior, cêlulas de insetos e de mamíferos ou, alternativarnente, de células procarióticas, como descrito acima. Exemplos não 5 limitantes inclueui símios, bovinos, suínos, murídeos, ratos, aves, répteis e hurnanos.
"Células procarióticas", que norrnalmente não possuem urri núcleo ou nenhuma outra organela ligada à membrana, são divididas em dois domínios, bactérias e archaea.
Adicionalmente, em vez de terem DNA cromossômico, as informações genéticas dessas células estão em uma alça círcular denominada plasmídeo. As células bacterianas são muito pequenas, aproximadamente com o tamanho de uma mitocôndria animal (cerca de 1-2 µm de diâmetro e 10 µrri de comprimento). As células procarióticas apresentam três formatos principaim em forma de bastão, esféricas e em espiral. Em vez de passarem por processos de replicação elaborados como os eucariotas, a células bacterianas se dividem por fissão binária. Exemplos incluem, sem limitação, bactérias bacillus, bactéría E. coIi e bactéría Salmonella.
O termo "anticorpo humano", como aqui usado, visa incluir anticorpos que possuem regiões variãveís e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podern incluir resíduos de aminoácido não codificados por seqüências de imunoglobulina da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou sítio-específica in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anticorpo humano", como aqui usado, não visa incluir anticorpos nos quais as seqüências de CDR derivadas da Iinhagem germinativa de outra espécie mamífera, por exemplo,
camundongo, foram enxertadas em seqüências framework
5 humanas.
Dessa forma, como aqui usado, o termo "anticorpo humano" refere-se a um anticorpo no qual substancialmente todas as partes da proteína (por exemplo, CDR, framework,
domínios Cl, Ch (por exemplo, Ch1, Ch2, Ch3), dobradiça, (VL,
VH)) são substancialmente não imunogênicas em seres humanos, apenas com pequenas alterações ou varíações de seqüência.
Similarmente, anticorpos designados de primatas
(macaco, babuíno, chimpanzés etc.), de roedores
(camundongo, rato, coelho, porquinho-da-índia, hamster, e semelhantes) e outros mamíferos desígnam esses anticorpos específicos para a espécie, subgênero, gênero, subfamília,
família.
Àlém disso, anticorpos quiméricos incluem qualquer combinação dos citados acima.
Essas alterações ou variações opcionalmente e preferivelmente retêm ou reduzem a imunogenicidade em seres humanos ou em outras espécies em relação aos anticorpos não modificados.
Dessa foruia, um anticorpo é distinto de um anticorpo quimérico ou humanizado.
Ressalta-se que um anticorpo humano pode ser produzido por um anirnal não humano ou uma célula procariótica ou eucariótica que é capaz de expressar genes de imunogl-obulina humana funcionalmente rearranjados (por exemplo, cadeia pesada e/ou cadeia ievel.
Além disso,
quando um anticorpo humano é um anticorpo de cadeia única,
ele pode compreender um peptídeo vínculador que não é encontrado em anticorpos humanos nativos.
Por exemplo, um
Fv pode compreender um peptídeo vinculador, por exemplo,
dois a cerca de oito resíduos de glicina ou de outro arninoácido, que conecta a região variãvel da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve. Esses peptídeos . vinculadores são considerados como sendo de origem humana.
5 Como aqui usado, um anticorpo humano é "derivado de" seqüência de uma linhagem germinativa em particular se o anticorpo é obtido de um sistema usando seqüências de imunoglobulina humana, por exemplo, por imunização de um camundongo transgênico que carrega genes de imunoglobulina 10 humana ou por avaliação de uma bíblioteca de genes de imunoglobulina humana. Um anticorpo humano que é "derivado de" uma seqüência de imunoglobulina da linhagem germinativa humana pode ser identificado como tal por comparação da seqüência de aminoácidos do anticorpo humano com a 15 seqüência de aminoácidos de imunoglobulinas da linhagem germínativa humana. Um anticorpo hurnano selecionado tipicamente é pelo menos 90% idêntico em termos de seqüência de aminoácidos com uma seqüência de amínoácidos codificada por um gene de imunoglobulina da linhagem 20 germinativa humana e contém resíduos de aminoácido que identificam o anticorpo humano como sendo humano, quando cornparado com as seqüências de aminoãcidos de imunoglobulina da linhagem germinativa de outras espécies (por exemplo, seqüências da linhagern germinativa murídea).
25 Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 95% ou até pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% ídêntico em termos de seqüência de arninoácidos à seqüência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linhagem germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano 30 derivado de uma seqüência da linhagem germinativa hurnana em particular exibirá no máximo 10 diferenças de aminoácidos - em relação à seqüência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linhagem germinativa humana. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir no máximo 5, ou até 5 mesmo no máximo 4, 3, 2 ou 1 diferença de aminoácido em relação à seqüência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linhagem germinativa.
Um "anticorpo monoclonal humano" refere-se aos anticorpos que exibem uma úníca especificidade de Iigação 10 que possuem regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulina da linhagern germinativa humana. O termo também engloba anticorpos humanos recombinantes. Métodos para produção desses anticorpos são aqui descritos.
15 O termo "anticorpo humano recombinante", como aqui usado, inclui todos os anticorpos hurnanos que são preparados, expressos, criados ou ísolados por meios recornbinantes, por exernplo, anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou 20 transcromossômico para genes de imunoglobulina humana ou para um hibridoma preparado a partir deles, anticorpos isolados de uma cêlula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, a partir de um transfectoma, anticorpos isolados de uma biblioteca 25 combinatória de anticorpos humanos recombinantes, e anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva a junção (splicing) de seqüências gênicas de imunoglobulina humana com outras seqüências de DNA. Esses anticorpos humanos recombinantes 30 possuem regiões variãveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulina da linhagem germinativa » humana. Em certas modalidades, no entanto, esses anticorpos humanos recorribinantes podem ser submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando é usado urri animal transgênico para 5 seqüências de Ig humana, mutagênese somática in vivo) e, dessa forma, as seqüências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são seqüências que, embora derívadas e relacionadas com as seqüências de VH e VL da linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmente 10 dentro do repertório de anticorpos da Iinhagem germinativa humana ín vivo. Métodos para produção desses anticorpos são aqui descritos.
Como aqui usado, "isótipo" refere-se ã classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou Iggi) que é codificado por 15 genes da região constante de cadeia pesada.
Os termos "anticorpo policlonal" ou "composição de anticorpo policlonal", como aqui usados, referem-se a uma preparação de anticorpos que são derivados de diferentes Iinhagens de células B. Eles são uma mistura de moléculas 20 de imunoglobulina secretada contra um antígeno específico, cada um reconhecendo um epitopo diferente.
Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", como aquí usados, referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição 25 molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe especificidade e afinidade de ligação únicas para um epitopo em particular.
Como aqui usado, o termo "marcador" significa um cornposto ou composição detectável direta ou indiretamente 30 que é conjugado direta ou indiretamente à composição a ser detectada, por exemplo, polinucleotídeo ou proteína, por exemplo, um anticorpo, de modo a gerar uma composição "marcada". O terrno também inclui seqüências conjugadas ao polinucleotídeo que gerarão um sinal mediante expressão das 5 seqüências inseridas, por exemplo, a proteína fluorescente verde (GFP), e semelhantes. O marcador pode ser detectável por si prõprio (por exemplo, marcadores de radioísótopo ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de urri composto ou composição substrato que seja detectável. Os marcadores podern ser adequados para a detecção em pequena escala ou mais adequados para a triagem de alto rendimento.
Dessa forma, marcadores adequados incluem, sern limitação, radioisótopos, fluoróforos, compostos quimioluminescentes, corantes e proteínas, incluindo enzimas. O marcador pode ser simplesmente detectado ou pode ser quantificado. Uma resposta que ê simplesmente detectada geralmente compreende uma resposta cuja existência merarnente é confirmada, enquanto uma resposta que é quantifícada geralmente compreende uma resposta que possui um valor quantificâvel (por exemplo, que pode ser relatado nurnericamente), por exemplo, intensidade, polarização e/ou outra propriedade.
Em ensaios de luminescência ou fluorescência, a resposta detectável pode ser gerada diretamente com o uso de um luminóforo ou fluoróforo associado a um componente do ensaio realmente envolvido na ligação, ou indiretamente usando um luminóforo ou fluoróforo associado a outro componente (por exemplo, repórter ou indicador).
Exemplos de marcadores luminescentes que produzem sinais incluem, sem limitação, bioluminescência e químioluminescência. a resposta detectável por . Iuminescência geralmente compreende uma alteração, ou uma - ocorrência de um sinal de luminescência. Métodos e luminóforos adequados para rnarcar de forma luminescente 5 componentes do ensaio são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Haugland, Richard P. (1996) "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chernicals" (6" Edição). Exemplos de sondas luminescentes incluem, sem limitação, aequorina e luciferases.
10 Exemplos de marcadores fluorescentes adequados incluem, sem limitação, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil- cumarinas, pireno, verde Malacita, estilbeno, Amarelo Lucifer, Cascade Blue" e Vermelho Texas. Outros corantes 15 ópticos adequados são descritos em Haugland, Richard P.
(1996) "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals" (6" Edição).
Em outro aspecto, o marcador fluorescente é funcíonalizado para facilitar a adesão covalente a um 20 componente celular presente dentro ou na superfície da célula ou tecido, por exemplo, um marcador da superfície celular. Grupos funcionais adequados incluem, sern limitação, grupos isotiocianato, grupos arnino, grupos haloacetil, maleimidas, succinimidil ésteres e haletos de 25 sulfonila, todos podendo ser usados para anexar o ínarcador fluorescente a uma segunda molécula. A escolha do grupo funcional do marcador fluorescente dependerá do local de adesão a um vinculador, ao agente, ao marcador ou ao segundo agente de marcação.
30 II. Métodos da invenção
Um aspecto da presente invenção está relacionado a um ^ método de prevenção ou redução de sangramento erri um . indivíduo submetido à terapia anticoagulante pela administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um 5 derívado da proteína do fator Xa. Em uma modalidade, o derivado possui um sítio ativo modificado e/ou um domínio Gla modificado, possuindo, dessa forma, atividade pró- coagulante reduzida ou ausente. O derivado atua como um antídoto e substancialmente neutraliza a atividade 10 anticoagulante do inibidor. Em uma modalidade, o derivado é deficiente em Gla ou sem domínio Gla. O indivíduo pode ser um mamífero ou, mais particularmente, um ser humano.
Em outra modalidade, a invenção é dirigida a um método para ligar e inibir seletivamente um inibidor do fator Xa 15 administrado exogenamente em um indivíduo. O método compreende a adrninistração ao paciente de uma quantidade eficaz de um derivado de um derivado de fator Xa como descrito acima. O indivíduo pode ser uma célula ou um mamífero como, por exemplo, um ser humano.
20 Pacientes adequaãos para essa terapia foram submetidos a terapia anticoagulante prévia, por exemplo, receberam a administração de urn ou mais anticoagulantes, por exernplo, um inibidor do fator Xa. Exemplos de anticoagulantes que são inibidores do fator Xa incluem, sem limitação, 25 fondaparinux, idraparinux, idraparinux biotinilado, enoxaparina, fragmina, NAP-5, rNAPc2, inibidor da via do fator tecidual, DX-9065a, YM-60828, YM-150, apixaban, rivaroxaban, PD-348292, otamixaban, DU-176b, LY517717, GSK913893, heparina de baixo peso molecular e betrixaban, 30 ou qualquer combinação destes. A fonte de vários anticoagulantes é encontrada ao longo da descrição. <.
Em um aspecto, o derivado possui um sítio ativo . modificado e/ou um domínio GIa modifícado ou removido. Em um aspecto, o derivado de fator Xa não possui ou exibe 5 nenhuma atividade pró-coagulante. Nesse aspecto, o derivado compreende pelo menos os resíduos de aminoácido 40 a 448, 45 a 448, ou 46 a 448 do ID. DE SEQ. N°: 3 ou equivalentes destes. Ern outro aspecto, o derivado compreende pelo menos os resíduos de aminoácido 45 a 139 e 195 a 448 ou 46 a 139 10 e 195-448 do ID. DE SEQ. N°: 3 ou equivalentes destes.
Ein outro aspecto da invenção, o derivado de fXa retém a estrutura tridimensional do sítio ativo da proteína de fxa. Informações em relação à estrutura tridimensional do fxa des-Gla podem ser encontradas em Brandstetter, H. e 15 col. j. Bio. Chem., 1996, 271: 29.988-29.992.
Em outro aspecto da invenção, os derivados de fXa podem não possuir o domínio Gla, além de um dos dois domínios iZGF. Em outro aspecto da invenção, os derivados de fXa são completamente desprovidos da cadeia leve. Outras 20 modificações da cadeia pesada podem compreender o domínio catalítico de serina-proteases relacionadas que são capazes de se ligar aos inibidores. As serina-proteases relacionadas possuem domínios catalíticos que possuem similaridade estrutural suficiente com o domínio catalítico 25 de fXa e são, portanto, capazes de se ligar aos inibidores de fXa de pequena molécula. Exemplos de serina-proteases relacionadas incluem, sem limitação, proteases de mamíferos como, por exemplo, calicreína plasmâtica, trombina e tripsina ou a protease bacteriana subtilisina. Esses 30 derivados ainda incluem modificações nos resíduos de aminoâcidos equivalentes aos resíduos de serina (SER379) ou
N de ácido aspártico (ASP282) do sítio ativo aqui descritos.
P Em algumas modalidades, a proteína do fator Xa com atividade pró-coagulante reduzída compreende uma cadeia 5 leve modificada, em que a modificação é substituição, adição ou eliminação do domínio Gla para reduzír a ligação à membrana de fosfolipídeo de fxa. Em algumas modalídades, a seqüência de aminoácidos principal de fXa não é alterada, mas a cadeia lateral de certos aminoácidos foi alterada.
10 Exernplos do domínio Gla modificado que reduz a ligação à membrana de fosfolipídeo de fXa compreendem polípeptídeos ou proteínas que possuem a seqüência de aminoácidos primária do ID. DE SEQ. N°: 3 ou um equivalente deste, com pelo menos uma substituição, adição ou eliminação de 15 aminoácido, quando comparado com o domínio Gla de uma proteina do fator Xa humano do tipo selvagem. Em algumas modalidades, pelo menos um aminoácido que é substituído ou eliminado é um ácido Y-carboxiglutâmico (Gla). Resíduos de Gla são mostrados no ID. DE SEQ. N°: 3 nas posições de 20 aminoácido 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 32 e 39. Em algumas modalidades, a seqüência de aminoácidos prirnária do antídoto ê idêntica ao ID. DE SEQ. N°: 3 ou equivalente deste, mas é uma proteína do fator Xa não carboxilada, subcarboxilada ou descarboxilada. Em algumas modalidades, o 25 antídoto é um fxa anidro des-Gla ou des-Gla :EX-S379A. Em algumas modalidades, a proteína do fator Xa com ligação reduzida à membrana de fosfolipídeo ainda compreende rnodificação ou eliminação dos domínios EGFI e/ou EGF2 (mostrados na Figura 3 como aminoácidos 46 a 84 e 85 a 128, 30 respectivamente) ou uma parte, ou seja, fragmento dos domínios EGFI e/ou EGF2. Em algumas niodalídades, toda a . cadeia leve ou substancialmente toda a cadeia leve é modificada ou removida. Por exernplo, a proteína de fxa modificada com ligação reduzida à merríbrana de fosfolipídeo 5 pode conter apenas a cadeia pesada, ou o fXa modificado pode conter a cadeia pesada e um fragrnento da cadeia leve que contém Cys132, o resíduo de aminoácido que forma a ligação dissulfeto simples com Cys302 da cadeia pesada no ID. DE SEQ. N°: 3. Em algumas modalidades, o derivado 10 compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°:
12. Em algumas modalidades, o derivado é o poIipeptídeo de duas cadeias que compreende o ID. DE SEQ. N°: 13. Em outras modalidades, o derivado é o polipeptídeo do ID. DE SEQ. N°:
15.
15 Em algumas modalidades, o derivado da proteína do fator Xa compreende uma cadeia pesada modificada que contérn o domínio catalítico da referida proteína do fator Xa. Em algumas modalidades, pelo menos uma substituição de aminoácido estã presente em uma ou mais posições de 20 aminoácido de fXa selecionado do grupo que consiste em Glu216, Glu218, Arg332, Arg347, Lys351 e Ser379 nos IDS. DE SEQ. N°": 3 e 7 (Glu37, Glu39, Arg150, Arg165, Lys169 e Ser195 na numeração de quimotripsina, respectivamente). Em algumas modalidades, o antídoto é uma proteína do fator Xa 25 com o resíduo de serina do sítio ativo (Ser379 nos IDS. DE SEQ. N°": 3 e 7, Ser195 na numeração de quimotripsina) modificado para desidro-alanina ou alanina. Essas modificações podern ser feitas na proteína de fXa do tipo selvagem ou em qualquer uma das proteínas de fXa 30 modificadas ou fragmentos descritos acima. Por exemplo, o fxa anidro des-Gla com os resíduos de serina do sítio ativo substituídos por desidro-alanina deserito no Exemplo 1 não demonstrou atividade de antídoto.
Em outras modalidades, o derivado possui interação 5 reduzida com ATIII, co-fatores fV/fva e fvIII/fvIIIa, quando comparado com fator Xa do típo selvagem ou de ocorrência natural. Em algumas modalidades, pelo menos uma substituição de aminoácido está presente na posição de aminoácido Arg306, GIu310, Arg347, Lys351, Lys414 ou Arg424 nos IDS. DE SEQ. N°": 3 e 7 (Arg125, GIu129, Arg165, Lys169, Lys230 ou Arg240 na numeração de quimotripsina, respectivamente). Essas rnodificações podem ser feítas na proteína de fXa do típo selvagem ou em qualquer uma das proteínas de fxa modificadas ou fragmentos descritos acima.
Em outras modalidades, o antídoto é uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidos de um domínio catalítico de serina-protease que pode mimetizar a capacidade de ligação ao inibidor da cadeia pesada de fXa.
Essas proteínas podem incluir proteases de mamíferos como, por exemplo, calicreína plasmática, trombina, tripsina (óu seu homólogo bacteriano subtilisina) que foraui modificadas recombinantemente para perderem atividade de serina- protease capazes de clivar súbstratos de proteína, mas ainda possuem as características estruturais da fenda do sítio atívo.
Também são fornecidas por esta invenção composições farmacêuticas que contêm um ou mais dos derivados de fator Xa modificados e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições são administradas a um indívíduo que necessita em urna quantidade que fornecerá o benefício desejado, uma redução ou interrupção do sangramento. As cornposições podem ser co-administradas com qualquer agente ou terapia adequada que complemente ou aumente a atividade do derivado de fator Xa. Um exemplo disso é um segundo agente capaz de 5 prolongar a rneia-vida plasmática do antídoto. Exemplos de segundos agentes adequados incluem, sem limitação, um anticorpo anti-fXa que reconhece o exosítio de cadeia pesada de fxa ou um derivado de fXa ligado à alfa-2- macroglobulina. A formação do complexo entre o derivado de fXa e um segundo agente (anticorpo de exosítio ou alfa-2- rnacroglobu1ina) bloquearia interações macromoleculares, mas reteria a habilidade de ligações ao inibidor dependentes do sítio ativo. Exemplos de anticorpos anti-fXa adequados à co-administração incluem, sem lirnitação, aqueles descritos eui Yang Y.H., e col., j. Inununol. 2006, 1; 177(11): 8.219- 25, Wilkens, M. e Krishnaswamy, S., lj. Bio. Chem., 2002, 277 (11), 9.366-9.374 e Church W.R., e col., Blood, 1988, 72(6), 1.911-1.921.
Em algumas modalidades, uma proteína do fator Xa é modificada por meios químicos, enzimáticos ou recombinantes. Por exemplo, a Ser379 do sítio ativo pode ser rnodificada quimicamente em desidroalanina, e o domínio Gla pode ser rernovido enzirnaticamente por digestão por quimotripsina, como descrito no Exemplo 1. Um fXa modificado aqui descrito tarríbém pode ser produzido por meio recombinante por rnodificação de seqüência do CDNA que codifica fX do tipo selvagem (ID. DE SEQ. N°: 2), descrito com mais detalhes no Exemplo 7, para expressão direta do antídoto recombinante (Antídoto-r) ou, alternativamente, uma proteína de fX com a modificação desejada pode ser produzida por meio recombinante seguida por ativação no fxa modificado por um ativador, por exemplo, veneno de cobra, por exemplo, veneno de víbora de Russel, e complexos de fVlla/fator tecidual ou flXa/fVIIla.
5 Os indivíduos que se beneficiarão da administração das composições aqui descritas e dos métodos que as acompanham incluem aqueles que apresentam, ou estão predispostos, a um quadro clínico de sangramento importante ou um quadro de sangramento não importante clinicamente significativo.
Exemplos de quadros clínicos de sangramento ímportante são selecionados do grupo que consiste em hemorragia, sangramento em órgãos vitais, sangramento que necessite de reoperação ou de um novo procedimento terapêutico, e um índice de sangramento > 2,0 com um sangramento observável associado (Turpie AGG, e col., NEJM, 2001, 344: 619-625).
Adicionalmente, o índivíduo pode estar apresentando ou estar predisposto a um quadro de sangramento não importante selecionado do grupo que consiste em epistaxe persistente ou recorrente e em quantidade substancial ou que não será interrompida ser intervenção, sangramento retal ou do trato urinário que não aurnenta até um nível que necessite de um procedirnento terapêutico, hematomas substanciais no local de injeções ou em outros locais que sejam espontâneos ou ocorram com trauma trivial, perda sangüínea substancíal mais do que normalmente associada a um procedimento cirúrgico que não exija frenagem, e sangramento que exija transfusão não planejada.
Em algumas modalidades, o antídoto é administrado após a administração de uma overdose de um inibidor de fxa ou antes de uma cirurgia que possa expor indivíduos ao ri-sco de hemorragia. - Em qualquer um dos métodos aqui descritos, deve-se . entender, mesrno que nem sempre explicitamente estabelecido, que uma quantidade efícaz do derivado é admínistrada ao 5 indivíduo. A quantidade pode ser determinada empirícamente pelo rnédico responsável pelo tratamento e irá variar com a idade, o sexo, o peso e a saúde do indivíduo. Fatores adicionais a serein considerados pelo médico responsável pelo tratamento incluem, sem limitação, a identidade e/ou 10 quantidade do inibidor do fator Xa que pode ter sido administrada, o mêtodo ou rnodo pelo qual o antídoto serã administrado ao indivíduo, a formulação do antídoto e o resultado terapêutico final para o paciente. Tendo em mente essas variáveis, aqueles habilitados na técnica 15 administrarão uma quantidade terapeuticamente eficaz ao indivíduo a ser tratado. Contempla-se que uma quantidade terapeuticamente eficaz dos antídotos aqui descritos suficiente para se contrapor, ou substancialmente neutralizar, um anticoagulante ern um indivíduo pode conter 20 desde cerca de 0,01 miligrama de antídoto por quilograma do peso corporal de um indivíduo até 1 grama de antídoto por quilograma do peso corporal de um indivíduo de antídoto. É ainda contemplado que o antídoto pode ser fornecido ao indivíduo em uma concentração que varia de cerca de 10 25 nanomolar a cerca de 100 micromolar, ou cerca de 10 nanomolar a cerca de 5 micromolar, ou cerca de 100 nanomolar a cerca de 2,5 micromolar.
As composíções podem ser administradas em quantidades que sejam eficazes para que o antídoto reconheça e se ligue 30 seletivamente, direta ou indiretamente, ao iníbidor do fator Xa no indivíduo. Elas também podem ser administradas em quantidades para inibir substancialmente ou neutralizar substancialmente inibidores do fator Xa administrados exogenamente em um índivíduo.
5 Ainda em outro aspecto, a invenção está relacionada a uma composição farmacêutica para a reversão ou neutralização da atividade anticoagulante de um inibidor do fator Xa administrado a um indivíduo, que compreende a administração de uma quantidade eficaz de urri antídoto para o inibidor do Eator Xa e um veículo farmaceuticamente aceitável, desde que o antídoto não seja fator VIla derivado do plasma, fator VIla recombinante, plasma fresco congelado, concentrados de complexo de protrombina e sangue total.
Em algumas modalidades, o antídoto é qualquer um dos antídotos descritos acima. Em algumas modalidades, o antídoto ê conjugado a uma porção capaz de prolongar a meia-vida circulante do antidoto. Em algumas modalidades, a porção é selecionada do grupo que consiste em polietileno glicol, um grupo acil, um lípossomo, uma proteína transportadora, uma membrana de fosfolipídeo artificial e uma nanopartícula. Por exemplo, um resíduo de lisina ou ci"teína que não ê do sítio ativo de urn derivado de fxa aqui descrito pode ser modificado quimicamente para se anexar a uma molécula de polietileno glicol. Outros métodos fornecidos em Werle, M. & Bemkop-Schniirch, A. "Strategies to Improve Plasma Half Life Time of Peptide and Protein Drugs", Amino Acids 2006, 30(4): 351-367 podem ser usados para prolongar a meia-vida plasmática dos antídotos desta invenção.
Em outras inodalidades da invenção, a meia-vida do u derivado de fXa é aumentada por acopl-amento do antídoto aos domínios do transportador de Fc. Em uma modalidade, o antídoto é acoplado a um fragmento Fc, por exemplo, uma 5 porção do peptídeo de imunoglobulina ou um fragmento de :rggi. Em uma modalidade, é contemplada uma proteína quimérica que compreende o derivado de fXa e a porção do peptídeo de imunoglobulina. Ainda em outra modalidade, o derivado de fXa e o peptídeo de imunoglobulina são 10 acoplados por uma reação química, por exemplo, uma ligação dissulfeto, com as regiões constantes da cadeia pesada e cadeia leve kappa de IgG humana.
Em algumas modalidades, a composição farmacêutica ainda cornpreende um agente capaz de prolongar a meia-vida 15 plasmática do antídoto. Em outro aspecto, a composição farmacêutica foi co-formulada com um agente capaz de prolongar a meia-vida pIasmática do antídoto. Em algumas modalidades, o agente co-administrado ou co-formulado é um anticorpo antí-fxa que reconhece o exosítio de fXa ou um 20 derivado de fxa ligado à alfa-2-macroglobulina.
III. Antídotos Derivados do Fator Xa Um aspecto da presente invenção consiste no uso de derivados de fXa, por exemplo, fXa deficiente em domínio 25 Gla ou fXa des-Gla, como antídotos seguros e eficazes para substancialmente neutralizar a atividade de um inibidor do fator da coagulação fXa para evitar ou interromper sangramento. Contempla-se que os antídotos da presente invenção serão úteis na reversão do efeito anticoagulante 30 de um inibidor de fXa, especialmente de urn inibidor de pequena molécula dirigido ao sítio ativo. . Contempla-se que um antídoto para urn inibidor de fXa . possui atividade pró-coagulante reduzida ou ausente, mas é capaz de se ligar a um inibídor de fXa. Contempla-se que 5 essa atividade limitada permite a dosagem do antídoto em um nível maior do que o fXa do tipo selvagem circulante.
Certos derivados de fxa como, por exemplo, fxa des-Gla e fxa deficiente em Gla, são antídotos adequados desta invenção. Além de terem atividade pró-coagulante reduzida 10 ou dirninuída, os antídotos da presente invenção também devem ser substancialmente não imunogênicos para o indivíduo. Um antídoto pode conter uma combinação de duas ou mais das mutações e/ou modificações acima. Além dísso, qualquer um dos derivados de fXa acima pode ser 15 administrado isoladarnente ou em combinação com outro.
O Fator Xa é uma serina-protease na via da coagulação sangüínea responsável pela conversão de protrombina em trombina. Ele é produzido a partir do fator X inativo mediante ativação pela Xase intrínseca (complexo formado 20 por fator IXa com seu co-fator, fator vIlla) ou pela Xase extrínseca (complexo formado por fator VIla com seu co- fator, fator tecidual). O fX ativado (fXa) podem passar por uma clívagem autocatalítica adicional no terminal C de sua cadeia pesada, convertendo fXaa na subforma fXaP (jesty, j 25 e col. lj. Biol. Chem. 1975, 250(12): 4.497-4.504). fXaa e fXafj são rnateriais adequados para a presente invenção. O próprio fXa converte protrombina em uma taxa baixa que não é suficiente para apoiar a coagulação. Apenas quando forma um compl-exo de protrombinase com co-fatores Ca2", 30 fosfolipídeo e fator va, fxa pode ativar protrombina em uma taxa suficientemente rápida para apoiar a coagulação b (Skogen, W.F., e col., j. Biol. Chem. 1984, 259(4): 2.306- 10). O complexo exige a ligação entre o fosfolipídeo carregado negativamente e os resíduos de ácido y- 5 carboxiglutâmico no domínio Gla de fxa via ponte de Ca'", portanto, erribora o dornínio Gla não contenha o sítio ativo de fXa, ele permite que fXa forme o complexo de protrombinase por meio dos resíduos de ácido y- carboxiglutâmico. Isso é demonstrado por remoção seletiva lO do domínio Gla de fxa por digestão por quimotripsina Neja a Figura 7 e o Exemplo 1). Foram feitos ensaios de coagulação em fxa durante um período de duração da clivagem do domínio Gla por digestão por quimotripsina. Foi relatado (Skogen e cols. j. Biol. Chem. 1984, 259(4): 2.306-10) que 15 um complexo de protrornbinase reconstituído composto por fXa sem domínio Gla, fVa, fosfolípídeos e íons de cálcio produz trombina em uma taxa significativamente reduzida (0,5% de produto gerado, comparada corn complexo de controle contendo fxa nativo). Como mostrado na Figura 7, a atividade de fXa 20 na formação de coágulo era parcialmente reduzida após o fXa ser digerido por quimotripsina por 15 minutos, e a atividade era perdida completamente após 30 minutos de digestão. Verificou-se, portanto, que fXa subcarboxilado ou descarboxilado, que não possui os resíduos de ácido gama- 25 carboxiglutâmico apropriados necessãrios para a ligação à membrana dependente de íon cál-cio, ê incapaz de montagem de complexo da coagulação dependente da membrana e não apóia a coagulação sangüínea (Mann, K.G. e col., Blood, 1990, 76: 1-16).
30 Também foi estabelecido que fXa deficiente em dornínio
H gla é capaz de se ligar aos inibidores de IXa dirigidos ao sítio ativo (Brandstetter, H e col., j. Bio. Chem., 1996, 271: 29.988-29.992). Houve relatos de cristalografia de inibidor de fXa de pequena molécula ligado ao IXa des-Gla 5 humano, que forneceram descrição estrutural da fenda do sítio ativo (Brandstetter, j. Bio. Chem., 1996, 271:
29.988-29.992 e Roehrig, j. Med. Chem. 2005, 48(19): 5.900- 8). A Figura 8 mostra que urn EXa anidro des-Gla exibiu afinidade de ligação de 0,319 nM com um inibidor de fxa 10 betrixaban, comparável com aquela de um fXa nativo.
Foi agora descoberto que des-Gla IXa, e outros derivados de fXa que possuem atívidade pró-coagulante reduzida, mas são capazes de ligação ao inibidor de fXa, podem ser usados como um antídoto para um inibidor de fXa.
15 Como mostrado na Figura 9, o fXa anidro des-Gla exibiu reversão completa da atividade anticoagulante de betrixaban em uma concentração de 680 riM. Como detalhado no Exemplo 2, a geração de trombina foi iniciada pela adição de reagente contendo TF (Innovin) e, dessa forma, indicativo da função 20 de fatores da coagulação na via da coagulação extrínseca.
Também foi demonstrado nos Exemplos 9-13 que o antídoto recombinante é útil para reverter urna ampla variedade de anticoagulantes.
Ensaios de prolongação da coagulação com o reagente de 25 tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) (Actina FS), que determina a função do fator da coagulação na via da coagulação intrínseca, tarnbém indicarn que o fxa anidro des- Gla possui atividade de antídoto. A Figura 10 mostra o efeito de dose-resposta do antídoto de fxa anidro des-Gía 30 contra 250 nM de betrixaban, com reversão completa a 600
74 /155 riM. A Figura 11 mostra que fXa anidro des-Gla também foí capaz de reverter a atividade antícoagulante de outro iníbidor de fXa, enoxaparina. A Figura 12 mostra que fXa anidro des-Gla não exibiu atividade de antídoto 5 significativa contra um inibidor direto de trombina, argatroban. Dessa forma, o fXa anidro des-Gla é um antídoto seletivo para inibidores de fXa e é capaz de restaurar a atividade de fxa pró-coagulante íniciada pela via extrínseca ou pela via intrínseca.
1-0 Alérn disso, a atividade de antídoto de fxa anidro des- Gla foi demonstrada pelos ensaios de prolongação com apTT medida com um cronômetro de coagulação tradicional. Como mostrado na Figura 13, o próprio fxa anidro des-Gla não tem nenhum efeito sobre apTT de plasma de controle nas maiores concentrações testadas (2.576 ríM). Quatrocentos nM de betrixaban prolongaram aPTT em mais de duas vezes. Esse efeito anticoagulante de betrixaban é revertido por fxa anidro des-Gla de forrna dose-dependente, com o retorno da aPTT ao nível quase normal do plasma de controle em concentrações de antídoto acima de 1.610 nM.
Contempla-se que truncamentos adicionais na cadeia leve de fXa, por exemplo, eliminação adicional do dominio EGFI, domínios EGFI mais EGF2, ou fragmentos destes, e a inativação de fXa apenas com a cadeia pesada, possam ser antídotos úteis desta invenção.
fXa deficiente em domínio Gla não apóia a coagulação norrnal sob concentração fisiologicamente relevante. No entanto, a proteína possuí a habilidade para clívar muitos substratos e causar coagulação em concentrações rnaiores.
Por exemplo, Skogen e cols. (Skogen, W.F., e col., LT. Biol.
Chem. 1984, 259(4): 2.306-10) mostraram que fXa des-Gla . bovína possui cerca de 0,5-1,0% de atividade de complexo de protrombinase em relação ao fXa do tipo selvagem. Dessa forma, modificaçães que reduzam ainda mais ou eliminem 5 completamente a atividade pró-coagulante de um derivado de fxa são contempladas pelos métodos da invenção. Essas modificações podem ser, por exernplo, em um domínio catalítico de fxa.
São conternpladas várias formas de modificação do lO domínio catalítico na cadeía pesada de fXa para reduzír sua atividade prõ-coagulante. O resíduo S379 do sítio ativo de fXa (como mostrado no ID. DE SEQ N°: 7), por exemplo, pode ser substituído seletivarnente por desidro-alanina Weja o Exemplo 1) ou alanina (veja o Exemplo 6) para reduzir ou 15 eliminar a atividade pró-coagulante. Sabe-se tarribém que a formação de complexo entre fXa e um reagente que visa o exosítio de fxa pode bloquear a habilidade de lígação macromolecular de fXa, reduzindo, dessa forma, sua atividade pró-coagulante, mantendo a habilidade de ligação 20 à pequena rnolécula no sítio ativo. Esse reagente que visa o exosítio inclui, sem limitação, anticorpos monoclonais que visam uma região rerriovida do sítio ativo (Wilkens, M. e Krishnaswamy, S, j. Bio. Chem., 2002, 277 (11), 9.366-
9.374), ou a-2-rnacrog1obulina. Sabe-se que o complexo de a- 25 2-macroglobulina-serina-protease, por exemplo, corri tripsina, trombina ou fXa, é capaz de se ligar aos substratos de pequena rnolécula (Kurolwa, K. e col., Clin.
Chem. 1989, 35(11), 2.169-2.172).
Sabe-se taníbém que um fXa inativo com modificações 30 unicamente na cadeia pesada, mantendo sua cadeia leve inalterada, poderia atuar como urn inibidor de protrombinase . (Hollenbach, S. e col., Thromb. Haemost., 1994, 71(3), 357- 62), pois ele interfere com a atividade pró-coagulante do fXa normal, como mostrado na Figura 6. Portanto, em uma 5 modalidade, o âerivado de fXa possui modificações tanto na cadeia leve quanto na cadeia pesada. Foi descoberto que essas modificações reduzem ou eliminam tanto a atividade pró-coagulantes quanto a atividade anticoagulante, retendo a habilidade de ligação aos inibidores do derivado de fXa.
10 podem ser usados vários métodos para produzir derívados de fXa deficientes em domínio Gla ou outros derivados de fXa aqui descritos. Por exemplo, o domínio Gla pode ser completamente removido por meio da clivagem quimotríptica, produzindo fXa sem domínio GIa.
15 Alternativamente, um fx sem domínio Gla pode ser produzido por clivagem quimotríptica de fX nativo. O fx sem domínio Gla pode então ser convertido em fxa sem domínio GIa por um ativador de fX. fX pode ser isolado do plasma da mesma espécie ou de uma espécie diferente em relação ao indivíduo 20 a ser tratado. Foi demonstrado que fX bovino, por exemplo, era funcional em ensaios no plasma humano. Exemplos de um ativador de fX incluem, sem limitação, urn veneno de cobra, por exemplo, veneno de víbora de Russel, e complexos de fVlla/fator tecidual ou flXa/fVIIla. Esse meio é conhecido 25 por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, Rudolph A.E. e cols. relataram um fxa recombinante produzido a partir de um fator X recombinante (fX) com uma única substituição de Arg347 por Glutamina (fXR347N) (Biochem.
2000, 39 (11): 2.861-2.867). Em uma modalidade, os 30 derivados de fxa produzidos a partir de fontes não humanas são não imunogênicos ou substancialmente não imunogênicos. 0 O Exemplo 7 também fornece um mêtodo de produção de um antídoto recombinante que possui a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 12.
5 Os derivados de fXa também podem ser purificados de plasma humano, ou podem ser produzidos pelo método de DNA recombinante em que um gene adequado para o derivado de fXa é expresso em urna organismo hospedeíro adequado. A expressão e a purificação de fXa recombinante foram 10 relatadas por vários grupos; veja, por exemplo, Larson, P.J., e col., Biochem., 1998, 37: 5.029-5.038, e Camire, R.M., e col., Biochem., 2000, 39, 14.322-14.329 para a produção de fx recombinante; Wolf, D.L. e col., LT. Bio.
Chem., 1991, 266(21): 13.726-13.730 para a produção de fxa 15 recombinante. fxa modificado pode ser preparado de acordo corn esses procedirnentos com o uso de um CDNA genericamente modificado que possui uma seqüência de n'ucleotídeos que codifica o rnutante de fxa desejado. o Exemplo 6 dá mais detalhes para a expressão direta de um mutante de fXa sem 20 domínio Gla-S379 com atividade funci.onal como um antídoto.
Contempla-se que fXa com sítio ativo mutado ou modificado com domínio Gla deficiente, por exemplo, fXa subcarboxilado, pode ser útil como antídoto para o inibidor de fXa. fXa subcarboxilado pode ser preparado por meio 25 recombinante por retenção de derivados de vitamina K durante a expressão de proteína (derivados de vitamina k são necessários para a modificação pós-tradução para formar os resíduos de Gla) ou por adição de antagonistas da vitamina K como, por exemplo, warfarina, durante a cultura 30 de tecido. fXa descarboxilado pode ser preparado por aquecimento (Bajaj p., j. Biol. Chem., 1982, 257(7): 3.726-
3.731) ou por digestão proteolitica por quimotripsina (Morita t., e col., j. Biol. Chem., 1986, 261(9): 4.015-
4.023). O antídoto também pode ser gerado em sistemas 5 procarióticos, seguido por um re-enovelamento ou constituição in vitro da ligação ao sítio do inibidor de fXa.
Os resíduos de Gla também podem ser rnodiEicados quimicamente para remover q grupo carboxil responsável pela ligação à membrana dependente de íon cálcio. Por exemplo, os grupos carboxil nos resíduos de GIa podern ser removidos seletivamente sob condições de descarboxilação ou podem ser cobertos, por exemplo, por esterificação ou aminação. É desejável que essa esteríficação ou aminação seja resistente à hidrólise in vivo de tal forma que o fXa modificado não seja rapidamente convertido em fXa ativo, o que pode causar trombose.
Outros mutantes ou derivados de fXa também podem ser antídotos úteis desta invenção. Em uma modalidade, esta invenção engloba uso de mutantes descritos em Peter j.
Larson e coI., Biochem., 1998, 37: 5.029-5.038 como antídotos para o inibidor de fXa.
Em outra uiodalidade, esta invenção engloba uso de mutantes de fXa cataliticamente inativos para a preparação de antídotos para o inibidor de fXa. Por exemplo, os mutantes descritos em Sinha, U., e CoI., Protein Expression and Purif., 1-992, 3: 518-524 rXai, mutantes com modificações químicas, por exemplo, desidro-alanina (fXa anidro), como descrito em Nogami, e col., j. Biol. Chezn.
1999, 274(43): 31.000-7. fXa com serina do sítio ativo
(Ser379 na numeração de fX, como mostrado no ID. DE SEQ.
N°: 7, e Ser195 na numeração de quimotripsina) substituída " com alanina (fXa-S379A na numeração de fX, ou fXa-Sl95A na numeração de quimotripsina), em que a atividade pró- 5 coagulante foi eliminada, também podem ser usados como antídotos para o inibidor de fXa. A invenção também prevê derivados de fXa com o resíduo de serina do sítio ativo acilado irreversivelmente que ainda é capaz de se ligar aos inibidores de pequena molécula. fXa com a serina do sítio 10 ativo acilada de forma reversível foi relatado por Wolf, e col., Blood, 1995, 86(11): 4.153-7. Essa acilação reversível, no entanto, é capaz de produção tempo- dependente de fXa ativo e pode Ievar a um excesso de fXa ativo após um período de ternpo. A taxa de desacilação pode 15 ser reduzida por estratégias sirnilares àquelas descritas em Lin P.H. e col., Thrombosis Res., 1997, 88(4), 365-372. Por exemplo, moléculas de fXa com Ser379 (Ser195 na numeração de quimotripsína) aciladas por grupos 4-metoxibenzíl e 3- bromo-4-metoxibenzil recuperam menos de 50% de sua 20 atividade original quando incubadas ern um tarnpão que possui ph 7,5 a 37°C por 4 horas.
Uma modalidade é dirigida ao uso de derivados de fXa com mutações nos resíduos de fXa sabidainente importantes para a interação de fXa com co-fator fV/fVa. Esses resíduos 25 incluem, sem limitação, Arg306, Glu310, Arg34,7, Lys351 ou Lys414 (IDS. DE SEQ. N°": 3 e 7, esses aminoácidos correspondem à Arg125, Glu129, Arg165, Lys169, Lys230 na nurneração de quimotripsina). Exemplos desses mutantes são relatados em Rudolph, A.E. e col., LT. Bio. Chem., 2001, 30 276: 5.123-5.128. Além disso, mutações nos resíduos de fXa sabidamente importantes para a interação fvIII/fvIIIa, por exemplo, Arg424 nos IDS. DE SEQ. n°": 3 e 7 (Arg240 na numeração de quimotripsina), também podem ser usadas como antídotos para o inibidor de fxa. Exemplos desses mutantes 5 são descritos em Nogami, K. e col., j. Biol. Chem., 2004, 279(32): 33.104-33.113.
Outra modificação de resíduos do sítio ativo de fXa ou resíduos sabidamente importantes para interações de serina- protease também pode levar a antídotos úteis desta invenção; por exemplo, a substituição de Glu216, Glu218 e Arg332 nos IDS. DE SEQ. N°": 3 e 7 (Glu37, Glu39 e Arg150 na numeração de quimotripsina, respectivamente) com outros resíduos de aminoácido.
Em uma modalidade, a atividade pró-coagulante residual de um antídoto, avaliada pelo ensaio de clivagem amidolítica de substrato, é de < 1%, preferivelmente < 0,1%, mais preferivelmente < 0,05% da do fxa humano derívado do plasma nativo. Por exemplo, não há atividade pró-coagulante mensurável para fxa recombinante-S379A quando a Ser379 do sítio ativo (S195 na numeração de qjuimotripsina) é substituída por um resíduo de alanina, medida por ensaios de coagulação.
A invenção ainda estã relacionada às seqüências de ãcidos nucléicos, em particular seqüências de DNA, que codificarn os derivados de fXa descritos acima. Essas podem ser facilmente determinadas por retro-tradução da seqüência de polipeptídeos na seqüência de DNA correspondente de acordo com o código genético. Os códons usados preferivelmente são aqueles que levam à boa expressão no organismo hospedeiro necessário. As seqüências de ácidos nucléicos podem ser preparadas por mutagênese sítio- específica, partindo da seqüência do gene de fXa natural, ou então por síntese completa de DNA.
Po1ipeptideo8 da invenção 5 Em certos aspectos, a invenção está relacionada a um polipeptídeo isolado que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 12, 13 ou 15. Também estão englobados por esta invenção os polipeptídeos que posmíem pelo menos 80% de homología para o ID. de SEQ. N°: 12, 13 ou 15.
Os poIipeptídeos que compreendem as seqüências de aminoácidos da invenção podem ser preparados por expressão de polinucleotídeos que codificam as seqüências de polipeptídeos desta invenção em urna célula hospedeira apropriada. Isso pode ser cibtido por métodos de tecnologia de DNA recombinante conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Conseqüentemente, esta invenção tambêm fornece métodos para a produção recombinantemente dos polipeptídeos desta invenção em células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas. As proteínas e os poIípeptídeos desta invenção tambêm podem ser obtidos por síntese química com o uso de um sintetizador automatizado de peptídeos disponível comercialmente como, por exemplo, aqueles fabricados por Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc., Modelo 430A ou 431A, Foster City, CA, EUA. A proteína ou o polipeptídeo sintetizado pode ser precipitado e adicionalmente purificado, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Conseqüentemente, esta invenção também fornece um processo para sintetizar quimicamente as proteínas desta invenção por fornecimento da seqüência da proteína e reagentes, por exemplo, aminoácidos e enzímas, e a Iigação em conjunto dos aminoácidos na orientação e seqüência linear adequadas.
Aqueles habilitados na técnica sabem que podem ser 5 feitas modificações a qualquer peptídeo para que ele adquira propriedades alteradas. Os polipeptídeos da invenção podem ser modificados para incluir aminoácidos não naturais. Dessa forma, os peptídeos podem compreender D- aminoácidos, uma combinação de d- e L-aminoácidos, e vários aminoácidos de "designer" (por exemplo, f-metil aminoácidos, C-a-metil aminoácidos, e N-a-metíl aminoácidos etc.) para transmitir propriedades especiais aos peptídeos.
Adicionalmente, dístribuindo-se aminoácidos específicos em etapas de acoplamento específicas, peptídeos com a-hélíces, !3 turns, lâminas ÊL a turns e peptídeos cíclicos podem ser gerados. Geralmente, acredita-se que a estrutura secundária a-helicoidal ou a estrutura secundária aleatória seja preferida.
Em uma modalidade adicional, serão escolhídas subunidades de polipeptídeos que conferem propriedades químicas e estruturais úteis. Por exemplo, peptídeos que compreendem D-amínoácidos podem ser resistentes às proteases específicas para L-arnínoácidos in vivo. Os compostos modificados com D-aminoácidos podem ser sintetizados com os aminoácidos alinhados em ordem reversa para produzir os peptídeos da invenção como peptídeos retro-inversos. Além disso, a presente invenção prevê as preparações de peptídeos que possuem melhores propriedades estruturais definidas, e o uso de peptidomiméticos e ligações de peptidomiméticos, por exemplo, ligações éster,
para preparar peptídeos com novas propriedades. Em outra modalidade, pode ser gerado um peptídeo que incorpora uma ligação peptídica reduzida, ou seja, R1-CH2NH-R2, erri que R1 e R, são resíduos ou seqüências de aminoácidos. Uma ligação 5 peptídica reduzida pode ser introduzida corrio uma subunidade dipeptídica. Urna molécula desse tipo seria resistente à hidrólise da ligação peptídica, por exemplo, atividade de protease. Essas moléculas forneceriam Iigantes com função e atividade únicas, por exemplo, meias-vidas in vivo prolongadas em função da resistência à degradação metabólica, ou atividade de protease. Além disso, é sabido que em certos sistemas peptídeos restritos exibem atividade funcional aumentada (Hruby (1982) Life Sciences 31: 189-199 e Hruby e COI. (1990) Biochem. j. 268: 249-262); a presente invenção fornece um método para a produção de um peptídeo restrito que incorpora seqüências aleatórias em todas as outras posições.
Os seguintes aminoácidos não clássicos podem ser incorporados nos peptídeos da invenção a fim de introduzir rnotivos conformacionais particularem 1,2,3,4- tetrahidroisoquínolina-3-carboxilato (Kazmierski e col.
(1991) ij. Am. Chem. Soc. 113: 2.275-2.283); (2S,3S)-meti1- fenilalanina, (2S,3R)-wetil-fenilalanina, (2R,3S)-metil- feni1alanina e (2R,3R)-metil-fenilalanina (Kazrnierski e Hruby (1991) Tetrahedron Lett. 32(41): 5.769-5.772); ãcido 2-aminotetrahidronaftaleno-2-carboxílico (Landis (1989) Ph.D. Thesis, University of Arizona); hidróxi-1,2,3,4- tetrahidroisoquino1ina-3-carboxilato (Miyake e col. (1989) j. Takeda Res. Labs. 43: 53-76); ácido histidina isoquinolina carboxílico (Zechel e col. (1991) Int. j. Pep.
Protein Res. 38(2): 131-138); e HIC (histidina uréia . cíclica), (Dharanipragada e col. (1993) T:nt. j. Pep.
Protein Res. 42(1): 68-77) e (Dharanipragada e COI. (1992) Acta. Crystallogr. C. 48: 1.239-1.241).
5 Os seguintes análogos de amínoãcidos e peptídomiméticos podem ser incorporados em urn peptídeo para induzir ou favorecer estruturas secundárias específicas: ll-Acp (ácido LL-3-amino-2-propenidona-6-carboxílico), um análogo dipeptídico indutor de f3 turn (Kemp e col. (1985) 10 j. Org. Chem. 50: 5.834-5.838); análogos índutores de lâminas f3 (Kemp e col. (1988) Tetrahedron Lett. 29: 5.081-
5.082); anãlogos indutores de f3 turn (Kemp e col. (1988) Tetrahedron Lett. 29: 5.057-5.060); análogos indutores de hélice a (Kemp e col. (1988) Tetrahedron Lett. 29: 4.935- 15 4.938); análogos indutores de a turn (Kemp e col. (1989) çj.
Org. Chem. 54: 109:115); análogos fornecidos pelas seguintes referências: Nagai e Sato (1-985) Tetrahedron Lett. 26: 647-650; e DiMaio e COI. (1989) j. Chem. Soc.
Perkin Trans. p. 1687; um análogo de turn Gly-Ala (Kahn e 20 col. (1989) Tetrahedron Lett. 30: 2.317); isóstero de ligação amida (Clones e col. (1988) Tetrahedron Lett. 29:
3.853-3.856); tetrazol (Zabrocki e col. (1988) lt. Am. Chem.
Soc. 110: 5.875-5.880); DTC (Samanen e col. (1990) Int. j.
Protein Pep. Res. 35: 501-509); e análogos ensinados em 25 Olson e col. (1990) j. Am. Chem. Sci. 112: 323-333 e Garvey e col. (1990) j. Org. Chem. 56: 436. Miméticos conformacionalmente restritos de beta turns e beta bulges, e peptídeos que os contêm, são descritos na Patente U.S. N° S.440.013, emitida em 8 de agosto de 1995 para Kahn.
30 Aqueles habilitados na técnica sabem que poderrt ser feitas modificações em qualquer peptídeo por substituição de um ou rnais aminoácidos com um ou mais arninoácidos funcionalmente equivalentes que não alteram a função biológica do peptideo. Em um aspecto, o aminoácido que é 5 substituído por um arnínoácido que possui propriedades intrínsecas similares, incluindo, sem limítação, hidrofobicidade, tamanho ou carga. Os métodos usados para determinar o arnínoácido apropriado a ser substituído e para qual aminoácido são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Exemplos não limitantes incluem modelos empíricos de substituição, como descrito por Dahoff e col. (1978) Em: "Atlas of Protein Sequence and Structure vol. 5" Supl. 2 (ed. M.O. Dayhoff), pp. 345-352. "National Biomedical Research Foundation", Washington DC; matrizes de PAM, incluindo matrizes de Dayhoff (Dahoff e col. (1978), supra, ou matrizes de JTT, como descrito por jones e col. (1992) Comput. Appl. Biosci. 8: 275-282 e Gonnet e col. (1992) Science 256: 1.443-1.145; o modelo empírico descrito por Adach e Hasegawa (1996) j. Mol. Evol. 42: 459-468; as matrizes de substituição em bloco (BLOSUM), como descrito por Henikoff e Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10.915-10.919; modelos de Poisson, corno descrito por Nei (1987) "Molecular Evolutionary Genetics". Columbia University Press, Nova York; e o Método de Probabilidade Mãxima (ML), como descrito por Muller e col. (2002) Mol.
Biol. Evol. 19: 8-13.
conjugados de polipeptídeos Os polipeptídeos e complexos de polipeptídeos da invenção podern ser usados em diversas formulações, que podem variar, dependendo do uso desejado. Por exemplo, uma ou mais podem ser Iigadas covalentemente ou não covalentemente (em complexo) a várias outras moléculas, cuja natureza pode variar, dependendo da finalidade particular. Por exemplo, um peptídeo da invenção pode 5 formar um complexo covalentemente ou não covalentemente com um veículo macromolecular, incluindo, sem limitação, polímeros naturais e sintéticos, proteínas, polissacarídeos, polipeptídeos (aminoácidos), álcool polivinílico, polivinil pirrolidona e lipídeos. Um peptídeo pode ser conjugado a um ácido graxo, para introdução em um lípossomo; veja a Patente U.S. N° 5.837.249. Um peptídeo da invenção pode formar um complexo covalentemente ou não covalentemente com um suporte sólido, vários dos quais são conhecidos na técnica e aqui descritos. Um epitopo peptídico antigênico da invenção pode estar associado a uma matriz de apresentação de antígeno como, por exemplo, urrí complexo de MHC, com ou sem moléculas co-estimuladoras.
Exemplos de veículos de proteína incluem, sem limitação, superantígenos, albumina sérica, toxóide tetânico, ovalbumina, tireoglobulina, mioglobulina e imunoglobulina.
PoIímeros de veículo de peptídeo-proteína podem ser formados com o uso de agentes de entrecruzamento convencionais como, por exemplo, carbodiimidas. Exemplos de carbodiimidas são 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil) carbodiimida (CMC), l-etil-3-(3-dírnetilaminopropi1) carbodiimida (EDC) e 1-etil-3-(4-azônia-44-dimetilpentil) carbodiimida.
Exemplos de outros agentes de entrecruzamento adequados são brometo de cianogênio, glutaraldeído e anídrido succínico. Em geral, qualquer um entre diversos agentes homo-bifuncionais, incluindo um aldeído homo- bifuncional, um epóxido homo-bifuncional, um imido-éster homo-bifuncional, um N-hidroxisuccinimida éster homo- 5 bifuncional, uma maleimida homo-bifuncional, um haleto de al-quila homo-bifuncional, um dissulfeto de piridil homo- bifuncional, um haleto de arila homo-bífuncional, uma hidrazida homo-bifuncional, um derivado de diazônio horno- bifuncional e um composto fotorreativo homo-bifuncional, pode ser usado. Também estão incluídos compostos hetero- bifuncionais, por exemplo, compostos que possuem um grupo amina-reativo e um grupo sulfidrila-reativo, compostos com um grupo amina-reativo e um grupo fotorreativo e compostos com um grupo carbonil-reativo e um grupo sulfidrila- reativo.
Exemplos específicos desses agentes de entrecruzamento homo-bifuncionais incluem os ésteres bifuncionais de N- hidroxisuccinimida ditiobis(succinimidilpropionato), suberato de dissuccinimidil e tartarato de dissuccinimidil; os imido-ésteres bifuncionai« adipimidato de dimetila, pimelimidato de dimetila e suberimidato de dimetila; os vinculadores cruzados bifuncionais suífidrila-reativos 1,4- di-[3'-(2'-píridílditio) propionamidojbutano, bismaleimidohexano e bis-N-maleimido-1,8-octano; os haletos de arila bifuncionais 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno e 4,4'-diflúor-3,3'-dinitrofenilsulfona; agentes fotorreativos bifuncionais como, por exemplo, bis-[b-(4- azidosalicilamido)etil]dissulfeto; os aldeídos bifuncionais formaldeído, malondialdeído, succinaldeído, glutaraldeído e adipaldeído; um epóxido bifuncional como, por exemplo, 1,4-
butanodiol diglicidil éter; as hidrazidas bífuncionais diidrazida de ácido adípico, carboidrazida e diidrazída de ácido succínico; os diazônios bifuncionais o-tolidina, benzidina diazotizada e bis-diazotizada; os haletos de 5 alquila bifuncíonais N1W-etileno-bis(iodoacetamida), NIN'- hexametileno-bis(iodoacetamida), NlN'-undecametileno- bis(iodoacetamida), bem como haletos de benzila e halo- mostardas, como ácido Ia'-diiodo-p-xileno sulfônico e tri(2-cloroetil)amina, respectivamente.
Exemplos de agentes de entrecruzamento hetero- bifuncionais comuns que podem ser usados para efetuar a conjugação de proteínas aos peptídeos incluem, sem limitação, SMCC (succinimidil-4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato), MBS (m- maleimidobenzoil-N-hidroxissuccínimida éster), SIAB (N- succinimídil(4-iodoacetil)aminobenzoato), SMPB (succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato), GMBS (N-(y- rna1eímiãobutiriloxi)succinimida éster), MPBH (hidrazida de ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico), M2C2H (4-(N- maleimidometil) ciclohexano-l-carboxil-hidrazida), SMPT (succinimidiloxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)tolueno) e SPDP (N-succinimidil 3-(2-piridi1ditio)propionato).
O entrecruzamento pode ser obtido por acoplamento de um grupo carbonil a um grupo amina ou a um grupo hidrazida por aminação redutiva.
Os peptídeos da invenção também podem ser formulados como adesão não covalente de monômeros por meio de interações iônicas, adsorptivas ou bioespecíficas.
Complexos de peptídeos com moléculas altamente carregadas positivamente ou negativamente podem ser feitos por meio da formação de urna ponte de sal sob ambientes de potência iônica baixa, por exemplo, em água deionizada.
Grandes complexos podem ser criados com o uso de polírneros carregados corno, por exemplo, poli-(ácido L-glutâmico) ou
5 poli-(L-lisina), que contêm numerosas cargas negativas e positivas, respectivamente.
A adsorção de peptídeos pode ser feita às superfícies como, por exemplo, glóbulos de micropartículas de látex ou a outros polímeros hidrofóbicos, que forrnam complexos de peptídeo-
lo superantígeno associados não covalenternente eficazmente que mimetizam proteína entrecruzada ou polimerizada quimicamente.
Finalmente, os peptídeos podem ser Iigados não cQvalentemente por meio do uso de interações bioespecíficas entre outras moléculas.
Por exemplo, a utilização da forte afinidade de biotina por proteínas como, por exemplo, avidina ou estreptavidina ou seus derivados, poderia ser usada para formar complexos de peptídeos.
Essas proteínas de ligação de biotina contêm quatro sítios de ligação que podem interagir com biotina em solução ou serem ligadas covalentemente a outra molécula
(veja wilchek (1988) Anal.
Biochem. 171: 1- 32). Os peptídeos podem ser modificados para que possuam grupos bíotina com o uso de reagentes de biotinílação cornuns corno,
por exemplo, o éster de N-hidroxissuccinimidil de D-biotina
(NHS-biotina) que reage com grupos amina disponíveis na proteína.
Os peptídeos biotinilados podem então ser incubados com avidina ou estreptavidína para criar complexos grandes.
A massa molecular desses polímeros pode ser regulada por meio do controle cuidadoso da proporção molar de peptídeo biotinilado para avidina ou estreptavidina.
Também são fornecidos por este pedido peptídeos e - polipeptídeos aqui descritos conjugados a um marcador, por exemplo, um marcador fluorescente ou bioluminescente, para 5 uso nos métodos diagnõsticos. Por exemplo, peptídeos e polipeptídeos marcados de forma detectável podem ser ligados a uma coluna e usados para a detecção e puríficação de anticorpos. Marcadores fluorescentes adequados incluem, sem limitação, fluoresceína, roãamina, tetrametilrodamina, 10 eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde Malacita, estilbeno, Amarelo Lucifer, Cascade BlueTM e Vermelho Texas. Outros corantes ópticos adequados são descrítos em Haugland, Richard P. (1996) "Molecular Probes Handbook".
15 Os polipeptídeos desta invenção também podem ser combinados com vários veículos de fase Iíquida como, por exemplo, soluções estéreis ou aquosas, veículos farmaceuticarrtente aceitáveis, suspensões e emulsões.
Exemplos de solventes não aquosos incluem propil etileno 20 glicol, polietileno glicol e óleos vegetais. Quando usados para a preparação de antícorpos, os veículos também podem incluir um adjuvante que seja útil para aurnentar de forrna inespecífica urna resposta imunológica específica. Aqueles habilitados na técnica poderão facilrnente determinar se um 25 adjuvante é necessário e selecionar um. No entanto, apenas para fins ilustrativos, adjuvantes adequados incluem, sem limitação, adjuvante completo de Freund, adjuvante incornpleto de Freund e sais minerais.
Cêlulas hospedeiras 30 Também são fornecidas células hospedeiras que compreendem um ou rnaís dos polipeptídeos desta invenção. Em um aspecto, os polipeptídeos são expressos e presentes na superfície celular (de forma extracelular). Células adequadas que contêm os polipeptídeos da invenção incluem 5 células procarióticas e eucarióticas, que incluem, sem limitação, células bacteri-anas, células de levedura, células de inseto, células animais, células de mamíferos, células murídeas, células de rato, células de carneiro, células de sírnios e células humanas. Exemplos de células bacterianas incluem Fscherichia coli, Salmonella enterica e Streptococcus gordonii. As células podem ser adquiridas de um vendedor comercial como, por exemplo, a "American Type Culture Collection" (ATCC, Rockville Mariland, EUA), ou cultivadas a partir de um isolado usando rnétodos conhecidos na técnica. Exemplos de cêlulas eucariõticas adequadas incluem, sem limitação, células 293T HEK, bem como a linhagem de cêlulas de hauister CHO, BHK-21; as linhagens de célula murídeas designadas NIH3T3, NSO, C 127, as linhagens de células de símios COS, Vero; e as Iinhagens de células humanas HeLa, PER.C6 (disponível comercíalmente por Crucell) U-937 e Hep G2.
Um exemplo não limitante de células de inseto inclui Spodoptera frugiperda. Exemplos de Ieveduras úteis para expressão incluem, sem limitação, Saccharomyces, Schizosaccharoinyces, Hansenula, Candida, Torulopsis, Yarrowia ou Pichia. veja, por exemplo, as patentes U.S.
N°": 4.812.405, 4.818.700, 4.929.555, 5.736.383, 5.955.349,
5.888.768 e 6.258.559.
Além da especificidade de espécie, as células podem ser de qualquer tipo de tecido em particular como, por exemplo, neuronais ou, alternativamente, uma célula-tronco somática ou embrionária como, por exemplo, urna célula- tronco que pode ou não se diferenciar em uma célula neuronal, por exemplo, uma célula-tronco embrionária, uma 5 célula-tronco adiposa, uma célula-tronco neuronal e uma célula-tronco hematopoiética. a célula-tronco pode ser de origem humana ou animal, por exemplo, de mamífero.
Polinucleotídeos ísolados e composições Esta invenção também fornece os polinucleotídeos complementares às seqüências identificadas acima ou seus complementos. A complementaridade pode ser determinada com o uso de hibridização tradicional sob condições de estringência moderada ou alta. Como aqui usado, o termo "polinucleotídeo" significa DNA e RNA, alérn de nucl-eotídeos modificados. Por exemplo, esta invenção também fornece a fita de polinucleotídeo anti-senso, por exemplo, rna anti- senso, a essas seqüências ou seus complementos.
Também são fornecidos polinucleotídeos que codificam polipeptídeos substancialmente homólogos e biologicamente equivalentes aos polipeptídeos da invenção e complexos de polipeptídeos. Substancialmente hcmólogos e biologicamente equivalentes significa aqueles que possuem graus variáveís de hornologia como, por exemplo, pelo menos 65% ou, alternativamente, pelo menos 70% ou, alternativamente, pelo menos 75% ou, alternativamente, pelo menos 80% ou, alternativamente, pelo menos 85% ou, alternativamente, pelo menos 90% ou, alternativamente, pelo menos 95°: ou, alternativamente, pelo menos 97% homólogos, como definido acima, e que codifícarn os poIipeptídeos que possuem a atividade biológica para se ligar aos inibidores do fator
Xa e não se agregam ao complexo de protrombinase, como aqui descrito. No entanto, deve-se entender que nem sempre será definido explicitamente que modalidades aos polipeptídeos e polinucleotídeos substancialmente homólogos estão 5 englobadas em cada aspecto desta invenção, por exemplo, poIipeptídeos, polinucleotídeos e anticorpos.
Os polinucleotídeos desta invenção podem ser replicados com c) uso de técnicas reconibinantes convencionais. Alternativamente, os polinucleotídeos podem 1-0 ser replicados usando a tecnologia de PCR. A PCR é o tema individual das Patentes U.S. N°": 4.683.195, 4.800.159,
4.754.065 e 4.683.202, e é descrita em "PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Mullis e col. eds, Birkhauser Press, Boston (1994)) e referências nele citadas. Além disso, aqueles habilitados na técnica poderão usar as seqüências aqui fornecidas e um sintetizador de DNA comercial para replicar o DNA. Conseqüentemente, esta invenção também fornece um processo para a obtenção dos poIinucleotídeos desta invenção por fornecimento da seqüência linear do polinucleotídeo, moléculas de iniciador apropriadas, substâncias químicas, tais como enzimas e instruções para sua replicação, e replicar ou ligar quimicamente os nucleotídeos na orientação adequada para obter os polinucleotídeos. Em uma modalidade separada, esses polinucleotídeos são ainda isolados. Alérn disso, aqueles habilitados na técnica poderão lígar operacionalmente os polinucleotídeos às seqüências reguladoras para sua expressão em uma célula hospedeira. Os polinucleotídeos e as seqüências reguladoras são inseridos na célula hospedeira (procariótica ou eucariótica) para replicação e amplificação. O DNA assim amplificado pode ser isolado da . célula por métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Um processo para a obtenção dos polinucleotídeos por esse método será aqui fornecido 5 posteriormente, bem como os polinucleotídeos assim obtidos.
o rna pode ser obtido inserindo-se primeiro um polinucleotídeo de DNA em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica adequada. O DNA pode ser inserido por qualquer método apropriado, por exemplo, pelo 10 uso de um veículo de liberação gênica apropriado (por exemplo, lipossomo, plasmídeo ou vetor) ou por eletroporação. Quando a célula se replica e o DNA é transcrito em RNA, o RNA pode então ser isolado com o uso de métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na 15 técnica, por exemplo, como apresentado em Sambrook e Russell (2001) supra. Por exernpl-o, o mRNA pode ser isolado com o uso de várías enzimas Iíticas ou soluções químicas de acordo com os procedimentos apresentados em Sambrook e Russell (2001) supra, ou extraído por resinas de Iigação de 20 ácido nucléico seguindo as instruções fornecidas pelos fabricantes.
Em um aspecto, o RNA é RNA interferente curto, também conhecido como s1RNA. Métodos para preparar e avaliar RNA interferente e selecionar quanto à habilidade para bloquear 25 a expressão de polinucleotídeo são conhecidos na técnica e exemplos não limitantes dos quais serão mostrados abaixo.
Esses RNAS interferentes são fornecidos por esta invenção.
Podern ser projetadas seqüências de S1RNA por obtenção da seqüência de mRNA-alvo e determinação de uma seqüência 30 de S1RNA complementar apropriada. Os s1RNAS da invenção são projetados para interagir com uma seqüência-alvo, o que significa que eles complementam uma seqüência-alvo suficientemente para hibridizar para aquela seqüência. Um S1RNA pode ser 100% idêntico à seqüência-alvo. No entanto, 5 a homologia da seqüência de S1RNA para a seqüência-alvo pode ser menor do que 100%, desde que o s1RNA possa hibridizar para a seqüência-alvo. Dessa forma, por exemplo, a molécula de S1RNA pode ser pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à seqüência- IO alvo ou ao complernento da seqüência-alvo. Portanto, moléculas de s1RNA corri inserções, eliminações ou mutações pontuais únicas em relação a um alvo também podem ser usadas. A geração de várias seqüências de S1RNA diferentes por mRNA-alvo ê recomendada para permítir a avaliação quanto à seqüência-alvo ótima. Uma pesquisa de homología, por exemplo, uma pesquisa BLAST, deve ser realizada para assegurar que a seqüência de S1RNA não contém homologia para qualquer gene de inamífero conhecido.
Em geral, é preferível que a seqüência-alvo esteja localizada pelo menos 100-200 nucleotídeos do códon de iniciação AUG e pelo menos 50-100 nucleotídeos afastada do códon de terminação do mRNA-alvo (Duxbury (2004) LT.
Surgical Res. 117: 339-344)- Os pesquisadores determinaram que certas características são comuns em nioléculas de S1RNA que silenciam eficazmente seu gene-alvo (Duxbury (2004) j.
Surgical Res. 117: 339-344; Ui-Tei e col. (2004) Nucl.
Acids Res. 32: 936-48). Como uma diretriz geral, s1RNAS que incluem uma ou mais das seguintes condições são particularmente úteis no silenciamento gênico em células de mamíferos: proporção GC entre 45-55%, sem execuções ãe mais de 9 resíduos G/C, G/C na extremidade 5' da fita senso; A/U na extremidade 5' da fita anti-senso; e pelo menos 5 resíduos A/U nas primeiras 7 bases do terrninal 5' da fita 5 anti-senso.
s1RNA possuem, em geral, de cerca de 10 a cerca de 30 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, o S1RNA pode ter um comprimento de 10-30 nucleotídeos, de 12-28 nucl-eotídeos, de 15-25 nucleotídeos, de 19-23 nucleotídeos ou de 21-23 nucleotídeos. Quando um S1RNA contém duas fitas de comprimentos diferentes, a mais longa fitas designa o comprimento do S1RNA. Nesse caso, os nucleotídeos não pareados da fita mais longa formariam uma protuberância (overhang).
O termo s1RNA inclui RNAs hairpin curtos (shRNAs).
shRNAs cornpreendem uma única fita de RNA que forma uma estrutura em stem-loop, em que o stem consiste nas fitas senso e anti-senso cornplementares que compreendem um S1RNA de fita dupla, e a loop é um vinculador de tamanho variável. A estrutura stem de shRNAs geralmente possui comprimento de cerca de 10 a cerca de 30 nucleotídeos. Por exemplo, a stem pode ter comprimento de 10-30 nucleotídeos, de 12-28 nucleotídeos, de 15-25 nucleotídeos, de 19-23 nucleotídeos ou de 21-23 nucleotídeos.
Ferramentas que auxiliam no design de S1RNA são facil-mente disponíveis ao público. Por exemplo, uma ferramenta computacional de design de s1RNA está disponível na Internet em www.dharmacon.com, acessado pela última vez em 26 de novembro de 2007.
Síntese de cIsRNA e 8iRNA
CÍSRNA e S1RNA podem ser sintetizados química ou enzimaticamente in vitro, como descrito em Micura (2002) Agnes Chem. lnt. Ed. Emgl. 41: 2.265-2.269; Betz (2003) Promega Notes 85: 15-18; e Paddison e Hannon (2002) Cancer 5 Cell. 2: 17-23.
A síntese química pode ser realizada através de métodos manuais ou automatizados, ambos bem conhecidos na técnica, como descrito em Micura (2002), supra. O S1RNA também pode ser expresso endogenamente dentro das células na forma de shRNAs, como descrito em Yu e col. (2002) Proc.
Natl. Acad. sci. USA 99: 6.047-6.052; e McManus e coI.
(2002) RNA 8: 842-850. A expressão endógena Eoi obtida usando sistemas de expressão baseados em plasmídeo usando pequenos prornotores de RNA nuclear, por exemplo, RNA polirnerase III U6 ou Hl, ou RNA poIimerase II Ul, como descrito em Brummelkamp e col. (2002) Science 296: 550-553 (2002); e Novarino e coI. (2004) tT. Neurosci. 24: 5.322-
5.330.
A síntese enzimática de dsRNA e S1RNA in vitro pode ser realizada usando um processo mediado por RNA polimerase para produzir fitas senso e anti-senso individuais que são aneladas in vitro antes da liberação nas células de escolha, corno descrito em Fire e col. (1998) Nature 391: 806-811; Donze e Picard (2002) Nucl. Acids Res. 30(10): e46; Yu e col. (2002); e Shim e col. (2002) LT. Biol. Chem.
277: 30.413-30.416. Vários manufacturers (Promega, Ambíon, New England Biolabs e Stragene) produzem kits de transcrição úteis na realização da síntese in vitro.
A síntese de s1RNA in vitro pode ser obtida, por exemplo, com o uso de um par de oligonucleotídeos duplex,
curtos, que contêm promotores de RNA polimerase T7 acima - das seqüências de RNA senso e anti-senso como o modelo de DNA. Cada olígonucleotídeo do duplex é um rnodelo separado para a síntese de urna fita do S1RNA. As fitas de RNA curtas 5 separadas que são sintetizadas são então aneladas para formar S1RNA, como descrito em "Protocols and Applicatíons, Chapter 2: RNA interference", Promega Corporation, (2005).
A síntese de CIsRNA in vitro pode ser obtida, por exemp1Q, pela utilização de um promotor de RNA polimerase 10 T7 nas extremidades 5' de ambas as fitas da seqüência de DNA-alvo. Isso é obtido pela utilização de modelos de DNA separados, cada um contendo a seqüência-alvo em uma orientação diferente ern relação ao promotor T7, transcritas em duas reações separadas. Os transcritos resultantes são 15 misturados e anelados pós-transcrição. Os modelos de DNA usados nessa reação podem ser criados por PCR ou pela utilização de dois modelos de pIasmídeo linearizados, cada um contendo o promotor de polimerase T7 em uma extremidade diferente da seqüência-alvo ("Protocols and Applications, 20 Chapter 2: RNA interference", Promega Corporation, (2005)).
A fim de expressar as proteínas aqui descritas, a liberação de seqüências de ácidos nucléicos que codificam o gene de interesse pode ser feita por várias técnicas.
Exemplos dessas técnicas incluem tecnologias virais (por 25 exemplo, vetores retrovirais, vetores de adenovírus, vetores de vírus adeno-associado, vetores de alfavírus e semelhantes) e tecnologias não virais (por exemplo, complexos de DNA/lipossomo, micelas e complexos direcionados de proteína viral-DNA), como aqui descrito).
30 Uma vez dentro da célula de interesse, a expressão do transgene pode ocorrer sob o controle de promotores ubíquos . (por exemplo, EF-1a) ou promotores tecido-específicos (por exemplo, promotor de quinase de calmodulina de câlcio 2 (CaMKI), promotor de NSE e prorrtotor de Thy-l humano).
5 Alternativamente, os níveis de expressão podem ser controlados pelo uso de um sistema de promotor indutível (por exemplo, promotor Tet on/off), como descrito em Wiznerowicz e col. (2005) Stem Cells 77: 8.957-8.961.
Exemplos não limitantes de promotores incluem, sem 10 limitação, cj promotor de cítomegalovírus (CMV) (Kaplitt e col. (1994) Nat. Genet. 8: 148-154), o promotor de p3- globina CMV/humana (Mandel e col. (1998) j. Neurosci. 18:
4.271-4.284), o promotor de NCXl, promotor de aMHC, o promotor de MLC2v, o promotor de GFAP (Xu e col. (2001) 15 Gene Ther., 8: 1.323-1.332), o promotor de enolase neurônio-específica de 1,8 kb (NSE) (Klein e col. (1998) Exp. Neurol. 150: 183-194), o promotor de beta-actina de galinha (CBA) (Miyazaki (1989) Gene 79: 269-277) e o promotor de É3-glucuronidase (GUSB) (Shipley e col. (1991) 20 Genetics 10: 1.009-1.018), o promotor de albumina sérica humana, o promotor de alfa-l-antitripsina. Para aumentar a expressão, outros elementos reguladores podem adicionalmente ser ligados operacionalmente ao transgene como, por exemplo, o Elemento PÓs-Regulador DO Vírus da 25 Hepatite Woodchuck (WPRE) (Donello e col. (1998) lj. Virol.
72: 5.085-5.092) ou o sítio de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino (BGH).
Também é aqui fornecido uma sonda ou iniciador de polinucleotídeo que compreende pelo menos 10, ou, 30 alternativamente, pelo menos 17 ou, alternativamente, pelo menos 20, ou, alternativamente, pelo menos 50, ou, alternativamente, pelo menos 75 polinucleotídeos, ou, alternativarnente, pelo menos 100 polinucleotídeos que codificam IDS. DE SEQ. N°": 12 a 15 ou seus complementos.
5 Sondas e iniciadores adequados são descritos supra. Sabe-se na técnica que uma sonda "perfeitamente combinada" não é necessária para uma hibridização específica. pequenas alterações na seqüência da sonda obtidas por substituíção, eliminação ou inserção de um pequeno número de bases não afetam a especificidade da hibridização. Em geral-, até 20% de não combinação de pareamento de bases (quando otimamente alinhadas) podem ser tolerados. Uma sonda útil para detecção do mRNA mencionado anteriorrnente é pelo menos cerca de 80% idêntica à região homóloga de tamanho comparável contida nas seqüências previamente identífícadas (identificadas acíma), que correspondem aos polinucleotídeos desta invenção caracterízados previamente.
Alternativamente, a sonda é 85% idêntica à seqüência gênica correspondente após alinhamento da região homóloga; e, além disso, ela exíbe 90% de identidade, ou ainda mais, é pelo menos 95% idêntica.
Essas sondas podem ser usadas em radioensaios (por exemplo, análise Southern e Northern blot) para detectar ou monitorar a expressão dos polinucleotídeos ou polipeptídeos desta invenção. As sondas também podem ser anexadas a um suporte sólido ou um arranjo como, por exemplo, um chip, para uso em ensaios de triagem de alto rendimento para a detecção da expressão do gene que corresponde a um ou mai-s polinucleotídeos desta invenção.
Os polinucleotideos e fragmentos dos poIinucleotídeos da presente invenção tambêm podem servir como iniciadores para a detecção de genes ou transcritos gênicos que são expressos em células neuronais, por exemplo, para confirmar a transdução dos polinucleotídeos em células hospedeiras.
5 Nesse contexto, amplificação significa qualquer método que emprega uma polimerase iniciador-dependente capaz de replicar uma seqüência-alvo com fidelidade razoável. A amplifícação pode ser realizada por DNA-poIimerases naturais ou recombinantes corno, por exemplo, DNA polimerase T7, fragrnento de Klenow de DNA polimerase de E. coli, e transcríptase reversa. O comprirrtento do iniciador é o mesmo que aquele identificado para as sondas, acirna.
A invenção ainda fornece os polinucleotídeos isolados desta invenção ligados operacionalmente a urri prornotor de transcrição de RNA, além de outras seqüências reguladoras para replicação e/ou expressão transitória ou estável do DNA ou RNA. Como aqui usado, o termo "ligado operacionalmente" significa posicionado de tal forma que o promotor irá dirigir a transcrição de RNA para fora da molécula de DNA. Exemplos desses promotores são SP6, T4 e T7. Em certas modalidades, são usados promotores célula- específicos para a expressão célula-específica do polinucleotídeo inserido. Vetores que contêm um promotor ou um promotor/intensificador, com códons de terminação e seqüências de marcador selecionável, além de um sítio de clonagem no qual um pedaço de DNA inserido possa ser ligado operacionalmente àquele promotor, são bem conhecidos na técnica e disponíveis comercialmente. para metodologia geral e estratégias de clonagem, veja "Gene Expression Technology" (Goeddel ed., Academic Press, Inc. (1991)) e referências nele citadas e "Vectors: Essential Data Series" (Gacesa e Rãmji, eds., john Wiley & Sons, N.Y. (1994)), que contém mapas, propriedades funcíonais, fornecedores comerciais e uma referência aos números de acesso no 5 GenEMBL para vários vetores adequados. De preferência, esses vetores são capazes de transcrever RNA in vitro ou in vivo.
Vetores de expressão que contêm esses áeidos nucléicos são úteis para se obter sistemas de hospedeíro de vetor para a produção de proteínas e polipeptídeos. Contempla-se que esses vetores de expressão devem ser replicáveís nos organismos hospedeiros, tanto como epissomos quanto como uma parte integral do DNA cromossômico- Vetores de expressão adequados incluem plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovírus, vírus adeno-associados, retrovírus, cosmídeos etc. Vetores adenovirais são particularmente úteis par a introdução de genes em tecidos in vivo, por causa de seus níveis elevados de expressão e transformação eficíente de células tanto in vitro quanto in vivo. Quando um ácido nuclêico é inserido em uma célula hospedeira adequada, por exemplo, uma célula procariótica ou uma célula eucariótica, e a célula hospedeira se replica, a proteína pode ser produzida recombinantemente. Células hospedeiras adequadas dependerão do vetor, e podem incluir células de mamíferos, células animais, células humanas, células de símios, células de inseto, células de levedura e células bacterianas, corrto descrito acima, e construídas com o uso de métodos bem conhecidos. veja Sambrook e Russell {2001), supra. Além do uso de vetor viral para inserção de ácido nucléico exógeno em células, o ácido nucléico pode ser inserido na célula hospedeíra por métodos bem ¥ conhecidos na técnica como, por exemplo, transformação para
V células bacterianas; transfecção com o uso de precipitação de fosfato de cálcio para células de mamíferos; DEAE- 5 dextrana; eletroporação; ou microinjeção. veja Sambrook e Russell (2001), supra para essa metodologia.
A presente invenção também fornece veículos de liberação adequados à liberação de um polinucleotídeo da invenção ern células (seja in vivo, ex vivo ou in vitro). Urn 10 polinucleotídeo da invenção pode estar contido dentro de urn veículo de liberação gênica, um vetor de clonagem ou um vetor de expressão. Esses vetores (especialmente vetores de expressão) podem, por sua vez, ser manipulados para assumir qualquer uma dentre várias formas que possam, por exemplo, 15 facilitar a liberação e/ou entrada em uma célula.
As células hospedeiras isoladas contendo os polinucleotídeos desta invenção são úteis para a replicação recombinante dos polinucleotídeos e para a produção recombinante de peptídeos e para triagem com alto 20 rendimento.
Os polinucleotídeos desta invenção podem ser conjugados a um marcador detectável ou cornbinados com um veículo corno, por exemplo, um suporte sólído ou veículo farmaceuticamente aceitável. Suportes sólidos adequados são 25 descritos acima, bem como o foram marcadores adequados.
Métodos para a adesão de um marcador a um polinucleotídeo são conhecidos por aqueles habilitados na técnica. veja Sambrook e Russell (2001), supra.
Composições de antieorpos terapêuticos 30 Esta invenção também fornece um anticorpo capaz de formar especificamente um cornplexo com uma proteína ou . polipeptídeo desta invenção, que são úteis nos rnétodos . terapêuticos desta invenção- O terrno "anticorpo" inclui anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais, fragmentos 5 de anticorpo, bem como derivados destes (descritos acima).
Os anticorpos incluem, sem limitação, anticorpos de camundongo, de rato e de coelho, ou humanos. Os anticorpos podem ser produzidos em cultura de células, em fago ou em vários animais, incluindo, sem limitação, vacas, coelhos, 10 cabras, camundongos, ratos, harnsters, porquinhos-da-índia, carneiros, cães, gatos, macacos, chimpanzés, símios etc. Os anticorpos também são úteis para ídentificar e purificar polipeptídeos terapêuticos.
Esta invenção tambérn fornece um complexo anticorpo- 15 peptídeo que compreende anticorpos descritos acima e um polipeptídeQ que se liga especificarnente ao anticorpo. Em um aspecto, o poIipeptideo é o polipeptídeo contra o qual o anticorpo foi desenvolvido. Em um aspecto, o cQmplexo anticorpo-peptídeo é um complexo isolado. Em um aspecto 20 adicional, o anticorpo do complexo é, sem limitação, um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo humanizado ou um derivado de anticorpo aqui descrito. Um ou ambos do anticorpo ou do peptídeo do complexo anticorpo- peptídeo podem estar marcados de forma detectável. Em um 25 aspecto, q complexo anticorpo-peptídeo da invenção pode ser usado como urn controle ou amostra de referência em ensaios diagnõsticos ou de triagem.
Os anticorpos policlonais da invenção podem ser gerados com o uso de metodologias convencionais corihecidas 30 na técnica e que são bem descritas na literatura. Existern várias metodologias para a produção de anticorpos policlonais. Por exemplo, anticorpos policlonais são · tipicamente produzidos por imunização de um mamífero adequado como, por exemplo, sem limitação, galinhas, 5 cabras, porquinhos-da-índia, hamsters, cavalos, camundongos, ratos e coelhos. Urn antígeno é injetado no mamífero, o que induz os Iinfócitos B a produzirem imunoglobulinas IgG específicas para o antígeno. Essa Igg é purificada do soro dos mamíferos. Variações dessa 10 metodologia incluem a modificação de adjuvantes, vias e locais de administração, volumes de injeção por local e o número de locais por animal para a produção õtima e tratamento humanitário do animal. Por exemplo, adjuvantes tipicamente são usados para aumentar ou intensificar uma 15 resposta imunológica aos antígenos. A maioria dos adjuvantes permite um depósito de antiben no local de injeção, o que permite uma liberação lenta de antígeno nos linfonodos de drenagem. Outros adjuvantes incluern tensoativos que promovem a concentração de moléculas de 20 proteína do antígeno sobre uma grande área de superfície e moléculas imunoestimuíadoras. Exemplos não limitantes de adjuvantes para a geração de anticorpo policlonal incluem adjuvantes de Freund, sistema adjuvante Ribi e Titermax. Os anticorpos policlonais podem ser gerados com o uso de 25 métodos descritos nas Patentes U.S. N°": 7.279.559,
7.119.179, 7.060.800, 6.709.659, 6.656.746, 6.322.788,
5.686.073 e 5.670.153.
Os anticorpos monoclonais da invenção podern ser gerados com o uso de metodologias convencionais de 30 hibridoma conhecidas na técnica e bem descritas na literatura.
Por exemplo, um hibridoma é produzido por fusão de uma linhagem de célula imortal adequada (por exemplo,
. uma linhagem de células de mieloma como, sem limitação, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NSI, NS2, AE-I, L.5,>243,
5 P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SSI, Sp2 SA5, U397, MLA
144, ACT IV, MOLT4, DA-I, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI,
NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, CHO, PerC.6,
YB2/O) ou semelhantes, ou heteromielomas, produtos de fusão destas, ou qualquer célula ou célula de fusão derivada
10 destas, ou qualquer outra linhagem de células adequadas,
como conhecido na técnica (veja, por exemplo, www.atcc.org,
www.lifetech.com., acessado pela última vez em 26 de novernbro de 2007, e semelhantes), com células produtoras de anticorpo, corrto, sem limitação, células esplênicas isoladas
15 ou clonadas, do sangue periférico, de linfonodos, da amígdala ou outras célula ímunes ou B que contêrn, ou quaisquer outras células que expressam seqüências constantes ou variáveis ou framework ou de CDR da cadeia pesada ou Ieve, como ácido nucléico endõgeno ou heterólogo,
20 corno células recombinantes ou endôgenas, virais,
bacterianas, de algas, procarióticas, de anfíbios, de inseto, de repteís, de peixe, de mamíferos, de roedores, de eqüinos, de ovinos, de cabra, de carneiro, de primatas,
eucarióticas, DNA genômico, CDNA, rDNA, DNA ou RNA
25 mitocondrial, DNA ou RNA de cloroplasto, hnRNA, mRNA, tRNA,
de fita simples, dupla ou tripla, hibridizadas, e semelhantes, ou qualquer combinação destas.
As células produtoras de anticorpo também podem ser obtidas do sangue periférico ou, preferivelmente, do baço ou linfonodos, de
30 seres humanos ou de outros animais adequados que foram imunizados com o antígeno de interesse. Qualquer outra célula hospedeira adequada também pode ser usada para a 0 expressão de ácido nucléico heterólogo ou endógeno que codifica um anticorpo, fragmento especificado ou variante 5 deste, da presente invenção. As células fundidas (hibridomas) ou células recombinantes podem ser isoladas com o uso de condições de cultura seletivas ou de outros métodos conhecidos adequados, e clonadas por diluição limitante ou separação de células, ou por outros métodos 10 conhecidos.
Em uma modalidade, os anticorpos aqui descritos podem ser gerados usando um sistema de Múltiplo Peptídeo Antigênico (MAP). O sistema MAP utiliza um núcleo de peptidil de três ou sete resíduos de lisina ramificados 15 radialmente, sobre o qual os peptídeos antigênicos de interesse podem ser construídos usando química de fase sólida padronizada. O núcleo de lisina gera o MAP que abriga cerca de 4 a 8 cópias do epitopo peptídico, dependendo do núcleo interno que geralmente é responsável 20 por menos de 10% do peso molecular total. O sistema MAP não necessita de uma proteína transportadora para a conjugação.
Foi demonstrado que a proporção molar elevada e a compactação densa de múltiplas cópias do epitopo antigênico em um MAP produzem uma forte resposta imunogênica. Esse 25 método é descrito na Patente U.S. N° 5.229.490 e é aqui incorporado por referêncía em sua totalidade.
Outros mêtodos adequados de produção ou isolamento de anticorpos da especificidade necessária podem ser usados, incluindo, sem limitação, métodos que selecionam anticorpo 30 recombinante de urna biblioteca de peptídeos ou proteínas
(por exemplo, sem limitação, uma biblioteca de apresentação em bacteriófago, ribossomo, oligonucleotídeo, RNA, CDNA, ou . serrlelhantes; por exemplo, como disponível por vários vendedores comerciais como, por exemplo, Cambridge Antibody 5 Technologies (Cambridgeshire, UK), MorphoSys (Martinsreid/Planegg, Del.), Biovation (Aberdeen, Escõcia, UK) Biolnvent (Lund, Suécia), com o uso de métodos conhecidos na técnica. veja as Patentes U.S. N°":
4.704.692, 5.723.323, 5.763.192, 5.814.476, 5.817.483, 10 5.824.514, 5.976.862. Métodos alternatívos se baseiam na imunização de animais transgênicos (por exemplo, camundongos SCID, Nguyen e col. (1977) Microbiol. Tmmunol.
41: 901-907 (1997); Sandhu e col.(1996) Crit. Rev.
Biotechnol. 16: 95-118; Eren e col. (1998) lmmunol. 93: 15 154-161 que são capazes de produzír um repertório de antícorpos humanos, como conhecido na técnica e/ou como aqui descrito. Tais técnicas, incluem, sem Iimitação, apresentação em ribossomo (Hanes e col. (1997) Proc. Natl.
Acaci. Sci. USA, 94: 4.937-4.942; Hanes e col.(1998) Proc.
20 Natl. Acad. Sci. USA, 95: 14.130-14.135); tecnologias de produção de anticorpo de célula única (por exemplo, método de anticorpo por linfócitos selecionados ("SLAM") (Patente U-S. N° 5.627.052, Wen e col. (1987) ji Tmmunol. 17: 887- 892; Babcook e col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93: 25 7.843-7.848); microgotícula de gel e citometria de fluxo (Powell e col. (1990) Biotechnol. 8: 333-337; One Ce11 Systems, (Cambridge, Mass).; Gray e coI. (1995) J. ljnm.
Meth. 182: 155-163; e Kenny e col. (1995) Bio. Technol. 13: 787-790); seleção de célula B (Steenbakkers e col. (1994) 30 Molec. Biol. Reports 19: 125-134.
Os derivados de anticorpo da presente invenção também podem ser preparados por liberação de um polinucleotídeo que codífica um anticorpo desta invenção a um hospedeiro adequado, por exemplo, animais transgênicos ou mamíferos, 5 por exemplo, cabras, vacas, cavalos, carneiros, e semelhantes, que produzem esses anticorpos em seu leite.
Esses métodos são conhecicíos na técnica e são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N°": 5.827.690, 5.849.992,
4.873.316, 5.849.992, 5.994.616, 5.565.362 e 5.304.489.
O termo "derivado de anticorpo" inclui a rnodificação pós-tradução à seqüência linear de polipeptideos do anticorpo ou fragmento. Por exemplo, a Patente U.S. N°
6.602.684 Bl descreve urn método para a geração de glicol- formas modificadas de anticorpos, incluindo moléculas inteiras de anticorpos, fragmentos de anticorpo, ou proteínas de fusão que incluem uma região equivalente à região Fc de uma imunoglobulina, que possuí toxicidade celular mediada por Fc aumentada, e glicoproteínas assim geradas.
Os derivados de anticorpo também podem ser preparados por liberação de um polinucleotídeo desta invenção para fornecer plantas transgênicas e células de pIanta cultivadas (por exemplo, serri limitação, de tabaco, rnilho e lemnácea) que produzem esses anticorpos, porções especificadas ou variantes nas partes da planta ou em células cultivadas a partir delas. Por exemplo, Cramer e col. (1999) Curr. top. Microbol. Immunol. 240:95-118 e referências nele citadas descrevem a produção de folhas de tabaco transgênicas que expressam grandes quantidades de proteínas recombinantes, por exemplo, com o uso de um promotor indutível. O milho transgênico foi usado para expressar proteínas de mamíferos erri níveis de produção W comercial, com atividades biolõgicas equivalentes àquelas produzidas em outros sistemas recombinantes ou purificadas 5 de fontes naturais. Veja, por exemplo, Hood e COI. (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 464: 127-147 e referências nele citadas. Derivados de anticorpo também forarn produzidos ern grandes quantidades a partir de sernentes de plantas transgênicas, incluindo fragmentos de anticorpo, por 10 exemplo, anticorpos de cadeia única (SCFVS), incluindo sementes de tabaco e tubérculos de batata. veja, por exemplo, Conrad e col.(1998) Pla-nt Mol. Biol. 38: 101-109 e referência nele citadas. Dessa forma, os anticorpos da presente invenção também podern ser produzidos com o uso de 15 plantas transgênicas, de acordo com métodos conhecidos.
Derivados de anticorpo também podem ser produzidos, por exemplo, por adição de seqüências exógenas para modificar a imunogenicidade ou reduzir, intensíficar ou modificar a ligação, afinidade, taxa on, taxa off, avidez, 20 especificidade, meía-vida, ou qualquer outra característica. Geralmente, parte ou todas as seqüências de CDR não humanas ou hurnanas são mantidas, enquanto as seqüências não humanas das regiões variáveís e constantes são substituídas com aminoácidos humanos ou outros 25 aminoácidos.
Em geral, os resíduos da CDR estão diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação de antígeno. A humanização ou criação genética de anticorpos da presente invenção pode ser realizada com o uso de método 30 conhecidos como, por exemplo, sem limitação, aqueles descritos nas Patentes U.S. N°": 5.723.323, 5.976.862, - 5.824.514, 5.817.483, 5.814.476, 5.763.192, 5.723.323, . 5.766.886, 5.714.352, 6.204.023, 6.180.370, 5.693.762,
5.530.101, 5.585.089, 5.225.539 e 4.816.567.
5 As metodologias para produzir anticorpos parcial a totalmente humanos são conhecidas na técnica, e qualquer uma dessas metodologias pode ser usada. De acordo com uma modalidade, seqüências de anticorpos totalmente humanos são feitas em um camundongo transgênico que foi criado 10 geneticamente para expressar genes de anticorpos hurnanos de cadeia pesada e leve. Foram feitas vãrias cepas desses camundongos transgênicos que podem produzir classes diferentes de anticorpos. células b de camundongos transgênicos que produzem um anticorpo desejado podem ser 15 fundidas para a produção de linhagens de células de hibrídoma para produção contínua do antícorpo desejado (veja, por exemplo, Russel e col. (2000) Tnfection and Tmmunity Abril de 2000: 1.820-1.826; gallo e col. (2000) European j'. of Immun. 30: 534-540; Green (1999) LT. of 20 Tmmun. Methods 231: 11-23; Yang e col. (1999A) lt. of Leukocyte Biology 66: 401-410; Yang (1999B) Cancer Research 59(6): 1.236-1.243; jakobovits. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 31: 33-42; Green e jakobovits (1998) j.
Exp. Med. 188(3): 483-495; jakobovits (1998) Exp. Opin.
25 Invest. Drugs 7(4): 607 614; Tsuda e col. (1997) Genomics 42: 413-421; Sherman-Gold (1997) Genetic Engineering News 1-7(14); Mendez e col. (1997) Nature Genetics 15: 146-156; jakobovits (1996) "Weir's Handbook O:E Experimental Immunology, The Integrated Imrriune System Vol. IV", 30 194.1194.7; jakobovits (1995) Current Opinion in
Biotechnology 6: 561-566; Mendez e COI. (1995) Genomics 26: 294-307; jakobovits (1994) Current Biology 4(8): 761-763; Arbones e col. (1994) lmmunity 1(4): 247-260; jakobovits (1993) Nature 362(6417): 255-258; jakobovits e COI. (1993) 5 proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(6): 2.551-2.555; e Patente U.S. N° 6.075.181).
Os anticorpos desta invenção também podem ser modificados para criar anticorpos quiméricos. Anticorpos quimêricos são aqueles nos quais os vários domínios das cadeias pesadas e leves de anticorpos são codificados pelo DNA de mais de uma espécie. veja, por exemplo, Patente U.S.
N° 4.816.567.
Alternativamente, os anticorpos desta invenção também podem ser modificados para criar anticorpos cobertos (veneered). Anticorpos cobertos são aqueles nos quais os resíduos de arninoácido exteriores do anticorpo de uma espécie são criteriosamente substituídos ou "cobertos" com aqueles de uma segunda espécíe de tal modo que anticorpos da primeira espécie não serão imunogênicos na segunda espécie, reduzíndo, dessa forma, a imunogenicidade do anticorpo. Na medida em que a antigenicidade de uma proteína é prirnariamente dependente da natureza de sua superfície, a imunogenicidade de um anticorpo poderia ser reduzida por substituição dos resíduos expostos que diferem daqueles normal-mente encontrados ern anticorpos de outra espécie de rnamífero. Essa substituição críteríosa de resíduos exteriores deve ter pouco ou nenhum efeito sobre os domínios interiores, ou sobre os contatos interdomínios.
Dessa forma, as propriedades de ligação de ligante não devem ser afetadas em conseqüência de alterações que são limitadas aos resíduos framework da região variável. O processo é denominado como "cobertura", na medida em que apenas a superfície externa ou "pele" do anticorpo é alterada, e os resíduos de suporte permanecem inalterados.
5 O procedimento para a "cobertura" se utiliza dos dados de seqüências disponíveis para os domínios variáveis de anticorpo humano compilados por Kabat e col. (1987) "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4" Edição, Bethesda, Md., "National Institutes of Health", atualizações dessa base de dados, e outras bases de dados acessíveis nos EUA e ein outros países (tanto de ácidos nucléicos quanto de proteínas). Exemplos não limitantes dos métodos usados para a geração de anticorpos cobertos incluem EP 519596; Patente U.S. N" 6.797.492; e descritos em Padlan e col. (1991) Mol. Iínmunol. 28(4-5): 489-498.
O termo "derivado de anticorpo" também inclui "diabodies", que são pequenos fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação de antígeno, ern que os fragmentos compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (veja, por exemplo, rzp 404.097; WO 93/11161; e Hollinger e CoI., (1993) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90: 6.444-6.448). Utilizando-se urn vinculador que seja muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os dornínios complernentares de outra cadeia e criar dois sítios de Iigação de antígeno (veja também Patente U.S. N°
6.632.926 a Chen e cOI. que revela variantes de anticorpos que possuem um ou mais aminoácidos inseridos em uma região hipervariável do anticorpo parente e uma afinidade de ligação para um antígeno-alvo que é pelo menos cerca de duas vezes mais forte do que a afínidade de Iigação do anticorpo parente pelo antígeno).
O termo "derivado de anticorpo" ainda inclui 5 "anticorpos lineares". O procedirnento para a produção de anticorpos lineares é conhecido na técnica e descrito em Zapata e col. (1995) Protein Eng. 8(10): 1.057-1.062.
Resumidamente, esses anticorpos compreendem um par de segmentos Fd em tandem Nh -Ch 1-VH -Ch1) que formam urn par de regiões de ligação de antígeno. Anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.
Os anticorpos desta invenção podern ser recuperados e purificados de culturas de células recombinantes por métodos conhecidos que íncluem, sem limitação, purificação com proteína a, precipitação com sulfato de amônio ou etanol, extração ácida, cromatografia por troca aniônica ou catiônica, cromatografia com fosfocelulose, cromatografia por interação hidrofóbica, cromatografia por afinídade, cromatografia com hidroxílapatita e cromatografia com lectina. A cromatografia líquida de alto desempenho ("HPLC") também pode ser usada para purificação.
Os anticorpos da presente invenção incluem produtos naturalrnente purificados, produtos de procedimentos químicos sintêticos e produtos produzidos por técnicas recombinantes por um hospedeiro eucariótico, incluindo, por exemplo, células de levedura, de planta superior, de insetos e de marníferos ou, alternativamente, de uma célula procariótica, como descrito acima.
Caso um anticorpo monoclonal que está sendo testado se ligue à proteína ou ao polipeptídeo, então o anticorpo que está sendo testado e os anticorpos fornecidos pelos hibridomas desta invenção serão equivalentes. Também é possível determinar sem experimentação desnecessária se urn anticorpo possui a mesma especificidade que o anticorpo 5 monoclonal desta invenção determinando-se se o anticorpo que está sendo testado evita que um anticorpo monoclonal desta invenção se ligue à proteína ou ao polipeptídeo com o qual o anticorpo monoclQna1 é normalmente reativo. Se o anticorpo que está sendo testado compete com o anticorpo monocl-onal da invenção, corno mostrado por uma diminuição da ligação pelo anticorpo monoclonal desta invenção, então é provável que os dois anticorpos se liguem ao mesmo epitopo ou a um epitopo intimamente relacionado. Alternativamente, pode-se pré-incubar o anticorpo monoclonal desta invenção corn uma proteína com a qual ele normalmente ê reativo, e determinar se o anticorpo monoclonal que está sendo testado é inibido em sua habilidade para se ligar ao antígeno. Se o anticorpo monoclonal que está sendo testado é inibido, então, muito provavelmente, ele possui a mesma especificidade de epitopo, ou uma especificidade de epitopo intimamente relacionada que o anticorpo monoclonal desta invenção.
O termo "anticorpo" tambérn visa incluir anticorpos de todos os ísótipos. Isôtipos específicos de um anticorpo monoclonal podem ser preparados diretamente por seleção a partir da fusão inicial, ou preparados secundariamente a partir de um hibridoma parental que secreta um anticorpo monoclonal de isótipo diferente por utilização da técnica de seleção sib para isolar variantes de mudança de classe com o uso do procedirriento descrito em Steplewski, e col.
(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8.653 ou Spira, e col. (1984) lj. Immunol. Methods 74: 307.
O isolamento de outros hibridomas que secretam anticorpos monoclonais com a especificidade dos anticorpos 5 monoclonais da invenção tamibém pode ser obtido por aqueles habilitados na técnica por produção de anticorpos anti- idiotípicos (Herlyn, e col. (1986) Science 232: 100). Um anticorpo anti-idiotípico é um anticorpo que reconhece determinantes únícos presentes no anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma de interesse.
A identidade idíotípica entre anticorpos monoclonais de dois hibridomas demonstra que os dois anticorpos monoclonaís são iguais com relação ao seu reconhecimento do mesmo determinante epitópico. Dessa forma, com o uso de anticorpos para os determinantes epitópicos em um anticorpo monoclonal, é possível identificar outros hibridomas que expressam anticorpos monoclonais da mesma especificidade epitópica.
É possível usar a tecnologia antí-ídiótipo para produzir anticorpos monoclonais que mimetizam um epitopo.
Por exemplo, um anticorpo monoclonal anti-idiotípico feito para um primeiro anticorpo monoclonal será um domínio de Iigação na região hiper"variável que é a imagern especular do epitopo ligado pelo primeiro anticorpo monoclonal. Dessa forma, nesse caso, o anticorpo monoclonal anti-idiotípico poderia ser usado para imunização para a produção desses anticorpos.
Em alguns aspectos desta invenção, será útil marcar de forma detectável ou terapeuticamente o anticorpo.
Marcadores adequados são descritos supra. Métodos para a conjugação de anticorpos a esses agentes são conhecidos na técnica. Apenas para fins ilustrativos, os anticorpos podem ser marcados com uma porção detectável, por exemplo, um ãtomo radioativo, um cromóforo, um fluoróforo, ou 5 semelhantes. Esses anticorpos marcados podem ser usados para técnicas diagnósticas, in vivo, ou em uma amostra de teste isolada.
O acoplarnento de anticorpos a haptenos de baixo peso molecular pode aumentar a sensibilidade do anticorpo em um ensaio. Os haptenos podem então ser detectados especificamente por ineio de uma segunda reação. Por exemplo, é comum usar haptenos como, por exemplo, biotina, que reage corn avidina, ou dinitrofenol, piridoxal e fluoresceína, que podem reagir com anticorpos anti-hapteno específicos. veja Harlow e Lane (1988) supra.
Os anticorpos podem ser marcados com uma porção detectável como, por exemplo, um átomo radioativo, um crornóforo, um fluoróforo, ou sernelhantes. Esses anticorpos marcados podem ser usados para técnicas diagnósticas, in vivo, ou em uma amostra de teste isolada. Os anticorpos tarnbém podem ser conjugados, por exemplo, a um agente farmacêutico, por exemplo, um fármaco quimioterápico ou uma toxina. Eles podern ser ligados a uma citocina, a um ligante, a outro anticorpo. Agentes adequados para o acoplamento aos anticorpos para se obter um efeito antitumoral incluem citocinas, por exemplo, interleucina 2 (IL-2) e fator de necrose tumoral (TNF); fotossensibilizantes, para uso em terapia fotodinâmica, incluindo ftalocianina tetrassulfonato de alumínio (III), hematoporfirina, e ftalocianina; radionuclídeos, por exemplo, iodo-131 (1'1I), ítrio-90 C°yÁ bísmuto-212 ('12Bi), bisrnuto-213 (2"3Bi), tecnésio-99m (""Tc), rênio-186 (186Re) e rênio-188 ('88Re); antibióticos, por exemplo, doxorrubicina, adriamicina, daunorrubicina, metotrexato, 5 daunomicina, neocarzinostatina e carboplatina; toxinas bacterianas, de plantas e outras toxínas, por exemplo, toxina diftérica, exotoxina de pseudomonas A, enterotoxina estafilocócica A, toxina abrina-A, ricina A (ricina A desglicosilada e ricina A nativa), toxina TGF-alfa, citotoxina de cobra da China (naja naja atra), e gelonina (uma toxina de planta); proteínas de ínativação de ribossomo de plantas, bactérias e fungos, por exemplo, restrictocina (uma proteína de inativação ribossorno de produzida por Aspergillus restrictus), saoorina (uma proteína de inativação ribossomo de Saponaria officinalis), e RNase; inibidores de tirosina quínase; ly207702 (um nucleosídeo de purina difluorado); lipossomos contendo agentes anti-císticos (por exempl-o, oligonucleotídeos anti- senso, plasmídeos que codificam toxinas, metotrexato etc.); e outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo, por exemplo, F(ab).
Os anticorpos da invenção também podem ser ligados a muitos veículos díferentes. Dessa forma, esta invenção tambêm fornece composições que contêm os anticorpos e outra súbstância, ativa ou inerte. Exemplos de veículos bem conhecidos incluem vidro, poliestireno, polípropileno, polietileno, dextrana, náilon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do veículo pode ser solúvel ou insolúvel para os objetivos da invenção. Aqueles habilitados na técnica conhecerão outros veículos adequados para a ligação de anticorpos monoclonais, ou serão capazes de verificar esses veículos, com cj uso de experimentação de rotina.
IV. Terapias 5 A presente invenção está relacionada a um mêtodo terapêutico de prevenção ou redução de sangramento em um indivíduo submetido à terapia anticoagulante. Contempla-se que os antídotos ou derivados da presente ínvenção podem ser fármacos de curta duração para serem usados em situações eletivas ou de emergência que podem neutralizar com segurança e especificamente as propríedades anticoagulantes de um inibidor de fXa convencional, sem causar efeitos colateraís hemodinâmicos deletérios ou exacerbação da resposta vascular proliferativa às lesões.
Em uma modalidade, a quantidade terapeuticamente eficaz de um antícíoto exibe um índice terapêutico elevado.
O índice terapêutico é a proporção de dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos, que pode ser expresso como a proporção entre LD,,, e ED5o. A LD50 é a dose letal para 50% da população, e a ED50 é a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população. A LD50 e a ed50 são determinadas por procedimentos farmacêuticos padronízados em culturas de células animais ou em animais experimentais. Os antídotos ou derivados desta invenção podem ser administrados uma vez ou várias vezes quando necessário para neutralizar o efeito de um inibidor de fXa presente no plasma de um indivíduo.
De preferência, os antídotos desta invenção são suficientes quando administrados ern uma dose única.
Contempla-se que uma dosagem típica dos antídotos da invenção dependerá do quadro clínico real e da concentração de inibidor no plasma. Em um ensaio in vitro, por exernplo, de geração de trombina, em ensaios clínicos de coagulação como, por exemplo, apTT, PT e ACT, espera-se que uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antídoto produza 5 uma correção da atividade de coagulação ex vivo de 10% ou mais. Ensaios in vitro indicam que uma proporção de antídoto/inibidor > 1,0 deve exibir efeito de reversão.
Espera-se que a concentração plasrnática mãxima para o antídoto esteja na faixa micromolar, provavelmente entre 10 micromolar ou menos.
Em um quadro clíníco, um dos critérios na determinação da eficácia de um antídoto é que ele produz qualquer alteração das medidas reais de sangramento. Em experimentos clínicos, as categorias de sangramentos importantes incluem hemorragía fatal, sangramentos em órgãos vitais (intracraniana, intra-ocular, retro-peritoneal, espinhal, pericárdica), qualquer sangramento que exija reoperação ou um novo procedimento terapêutico (por exemplo, aspiração de um joelho operado, inserção de tubo de toracotomia para hemotõrax, eletrocoagulação endoscópica etc.) ou um índice de sangramento > 2,0, caso esteja associado a um sangramento observãvel. O índice de sangramento é definido corno o número de unidades de células vermelhas embaladas ou de sangue total transfundido mais os valores de hemoglobina antes do episódio de sangramento rnenos os valores de hemoglobina após o sangramento ter se estabilizado (em gramas por decilitro).
Outro critério para eficácia do antídoto em ambientes clínicos é que ele reduza sangramento não importante clinicamente signifícativo. Essa categoría de hemorragias ínclui sangramento que não é importante, mas é mais do que m o usual e exige atenção clínica, incluindo epistaxe . persistente ou recorrente e em quantidade substancial ou que não pare sern intervenção; sangramento retal ou do trato 5 urinário que não aumenta atê um nível que exija um procedimento terapêutico (por exemplo, nova inserção de um cateter de Foley ou inspeção cistoscópica), hematomas substanciais em um local de injeções ou em algum outro lugar que sejarn espontâneos ou que ocorram com trauma 10 trivial; perda sangüínea substancial; sangramento que exija transfusão não planejada. Como aqui usado, o termo "perda sangüínea substancial" refere-se à quantidade de perda sangüínea que é maior do que aquela quantidade norrnalmente associada ao procedimento cirúrgico. A perda sangüínea 15 substancial leva ao edema que é tratado de forma conservadora, poís não chega a necessitar de drenagem.
Em uma rnodalidade, os derivados desta irivençãQ possuem meia-vida plasmática circulante suficiente para substancialmente neutralizar o inibidor de fXa presente no 20 plasrna. O fXa ativado praticamente não pQssui meia-vida circulante ern seres humanos, na medida em que é ínibído eficazmente por ATIII, TFPI e outros inibidores plasmáticos (Fuchs, H.E. e Pizzo, S.V., j. Clin. Tnvest., 1983, 72:
2.041-2.049). Foi demonstrado que o fXa inativo possui uma 25 meia-vida circulante de 2-3 horas em seres humanos. Em um modelo em babuíno, a meia-vida de um fXa bloqueado no sítio ativo por DEGR ([5-(dimeti1amino)1-naftalenossulfonil]- g1utamilglicilargini1 clorometil cetona) foi de aproximadamente 10 horas ou 2 horas, como determinado por 30 ensaios isotópicos ou ensaios irnunoabsorventes ligados à enzima, respectivamente (Taylor, F.B. e col., Blood, 1991, 78(2): 364-368).
Pode ser desejável prolongar a meia-vida de um antídoto derivado de fXa até 2.448 horas. Contempla-se que 5 a conjugação ou adição de uma ou mais das seguintes porções aumentará a meia-vida pIasmática de um antídoto: a) polietileno glicol; b) um grupo acil; C) lipossomos e agentes de encapsulação; d) proteínas transportadoras; e) membrana de fosfolipídeo artificial; f) imunoglobulina; e g) nanopartícula.
O local de conjugação pode não ser limitado a urna cadeia ou um resíduo em especial, desde que a conjugação não mascare O{S) sítio(s) de ligação ao iníbidor do antídoto. Os antídotos aqui descritos podem ser administrados em combinação com qualquer um ou rnais de um dos compostos descritos acíma.
Em geral, os anticorpos administrados possuem uma meia-vida mais longa do que as proteínas da coagulação sangüínea circulantes. É possível usar um complexo que consiste em fxa deficiente em domínio Gla e um anticorpo ligado ao exositio de fxa como um antídoto com meia-vida circulante prolongada. A formação de um complexo entre fXa e o anticorpo direcionado ao exosítio pode reduzir a interação de um fXa deficiente ern domínio Gla com substratos e inibidores rnacromolecul.ares, por exemplo, protrombina e antitrombina III, deixando a fenda do sítio ativo inalterada de modo que o complexo possa atuar como um antídoto para se ligar ao inibidor de pequena molécula dirigido ao sítio ativo. A formação de um complexo a-2- macroglobulina-fxa também pode ser útil corno um antídoto para inibidores de fXa de pequena molécula.
5 A eficácia dos antídotos na reversão da atividade anticoagulante de inibidores de fxa, bem corno de sua atividade prõ-coagulante, pode ser determinada por ensaios in vitro e modelos animais por aqueles habilitados na técníca. Exemplos de ensaios in vitro são a geração de trombina, ensaios clínicos de coagulação como, por exemplo, apTT, PT e ACT. Contempla-se que o antídoto desta invenção seja capaz de produzir 10% ou mais de correção da atividade de coagulação ex vivo. Vários modelos animais in vivo de tempo de sangramento e/ou perda sangüínea, por exemplo, em roedores, por exemplo, camundongos, cães e primatas, por exemplo, macacos, podem ser usados para medir a eficácia.
V. Composições farmacêuticas A presente invenção ainda fornece composições que compreendem um derivado de fXa e um veículo farmaceuticamente aceitável.
O termo "veículos farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a quaisquer diluentes, excipientes ou veículos que podem ser usados nas composições da invenção. Veículos farmaceuticamente aceitãveis incluem permutadores de íons, alumina, estearato de alumínio, lecitína, proteínas do soro, por exemplo, albumina sérica humana, substâncias de tarnponamento, por exemplo, fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas parciais de glicerídeos de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, por exemplo, sulfato de protamina,
hidrogênio fosfato dissódico, hidrogênio fosfato de . potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coIoidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, substâncias a base de celulose, poIietileno glícol, 5 carboximetilcelulose sõdica, poliacrilatos, caras, polímeros em bloco de polietileno-polioxipropileno, polietileno glicol e lanolina. Veículos farmacêuticos adequados sãcj descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Company, um texto de referência 10 padrão nesse campo. Eles são selecionados preferivelmente com relação à forma de administração desejada, ou seja, comprimidos orais, cápsulas, elíxires, xaropes e semelhantes, e consistentes com práticas farmacêuticas convencionais.
15 As composições farmacêuticas da invenção podem ser fabricadas por métodos bem conhecidos na técnica como, por exemplo, processos convencionais de granulação, mistura, dissolução, encapsulação, liofilização ou emulsificação, entre outros. As composições podem ser produzidas em várias 20 formas, íncluindo grânulos, precipitados ou particulados, pós, incluindo pós liofilizados, secos por rotação ou secos por vaporização, põs amorfos, injeções, emulsões, elixires, suspensões ou soluções. As formulações podem opcíonalmente conter estabilizantes, modificadores do pH, tensoativos, 25 modificadores da biodisponibilidade e combinações destes.
Formulações farmacêuticas podem ser preparadas como suspensões ou soluções líquidas com o uso de um líquido estéril, por exemplo, óleo, água, álcool, e combinações destes. Tensoativos farmaceuticaínente aceitáveis, agentes 30 de suspensão ou agentes emulsificantes podem ser adicionados para administração oral ou parenteral. b Suspensões podem incluir óleos, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de gergelim, óleo de semente de algodão, óleo de milho e azeite de oliva. A preparação de suspensão 5 também pode conter ésteres de ácidos graxos, por exemplo, etil oleato, miristato de isopropila, glicerídeos de ácido graxo e glicerídeos acetilados de ácido graxo. As formulações de suspensão podem incluir alcoóis, por exemplo, etanol, álcool isopropílico, álcool hexadecílico, 10 glicerol e propileno glicol. Éteres, por exemplo, poli(etilenoglicol), hidrocarbonetos de petróleo, por exemplo, óleo mineral e vaselína e água, tarríbém podeni ser usados em formulações de suspensão.
As composições desta invenção são formuladas para 15 administração farmacêutica a um marnífero, preferívelmente um ser humano. Essas composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas de diversas formas, preferivelmente parenteralmente.
Contempla-se que, a fim de reverter rapidamente a 20 atividade anticoagulante de um inibidor de fxa presente no pIasma de um paciente em uma situação de emergência, o antídoto desta invenção pode ser administrado à circulação sistêmica por meio de administração parental. O termo "parenteral", como aqui usado, inclui injeção subcutânea, 25 intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra- sinovial, intra-esternal, intratecal, intra-hepática, intralesional e intracraniana ou técnicas de infusão. No entanto, nos casos em que o inibidor de fXa que está sendo neutralizado possui uma rneia-vida plasmática longa, uma 30 infusão contínua ou uma formulação de liberação sustentada pode ser necessária para se lígar ao inibidor de EXa e Iiberar o fXa ativo, antes da depuração do inibidor de EXa do corpo.
As formas injetáveis estéreis das corriposições desta 5 invenção podem ser urna suspensão aquosa ou oleaginosa.
Essas suspensões podem ser formuladas de acordo com metodologias conhecidas na técnica com o uso de agentes de dispersão ou umidificação e agentes de suspensão adequados.
A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estêril em um diluente ou solvente atóxico parenteralmente aceitável, por exemplo, como urna soIução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados, estão água, soIução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para essa finalidade, qualquer mistura de óleos fixos pode ser empregada, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Ácidos graxos, por exemplo, ácido oléico e seus derivados glicerídicos, são úteis na preparação de injetáveis, bem como óIeos naturais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, azeite de oliva ou Õleo de rícino, especialmente em suas versões polioxietiladas. Essas soluções ou suspensões oleosas também podem conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, por exemplo, carboximetil celulose, ou agentes dispersantes similares que são comumente usados na formulação de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis, incluindo ernulsões e suspensões. Outros tensoativos comumente usados, por exemplo, Tweens, Spans e outros agentes emulsificantes ou intensificadores de biodisponibilidade que são comumente usados na fabricação . de formas de dosagem sólidas ou líquidas ou outras formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis também podem ser . usados para fins de formulação. Os compostos podem ser 5 formulados para administração parenteral por injeção como, por exernplo, injeção em bolo ou infusão contínua. Uma forma de dosagem unitãria para injeção pode estar em ampolas ou em recipientes multidoses.
Além das formas de dosagem descritas acima, 10 excipientes e veículos farmaceuticamente aceitáveis e formas de dosagem são geralmente conhecidos por aqueles habilitados na têcnica e estão incluídos na invenção. Deve- se entender que uma dosagem e um regime de tratamento específicos para qualquer pacíente em particular dependerão 15 de diversos fatores, incluindo a atividade do antídoto específico empregado, a idade, o peso corporal, a saúde geral, o sexo e a dieta, a função renal e hepática do paciente, e o tempo de administração, a taxa de excreção, combinação de fármacos, avaliação do médico ou veterinário 20 responsável pelo tratarnento e gravidade da doença em particular que está sendo tratada.
vi. Kits A invenção ainda fornece kits ou embalagens. Em algumas modalidades, o kit da presente invenção cornpreende: 25 (a) um primeiro recipiente que contém um inibidor de fXa para admínistração regular para o tratamento de trombose, e (b) um segundo recipíente que contém um antídoto desta invenção para ser usado em casos quando há uma overdose do inibidor de fXa em (a) ou quando a hemostasia normal 30 precisar ser restaurada pa-ra interromper ou evitar sangramento. Em outras modalidades, o kit ainda compreende urna bula que explica quando esses dois agentes em (a) e (b) devem ser usados.
Os primeiros e segundos recipíentes podem estar erri uma 5 garrafa, jarro, frasco, seringa, tubo, bolsa ou qualquer outro recipiente usado na fabricação, armazenamento ou dístribuição de um produto farmacêutico. A bula pode ser um rótulo, etiqueta, ou semelhantes, que cita as informações relacionadas à composição farmacêutica do kit. As informações ci-tadas nQrmalmente serão determinadas pela agência reguladora que atua na área na qual a composição farmacêutica deverá ser vendida, por exemplo, o FDA ("United States Food and Drug Administration" - agência governamental americana que regula e fiscaliza a fabricação de comestíveis, drogas e cosméticos). De preferência, a bula cita especificamente as indicações para as quais a composição farmacêutica foi aprovada. A bula pode ser feita de qualquer material sobre o qual uma pessoa possa ler as informações nele contidas. De preferência, a bula é um material que pode ser impresso, por exemplo, papel, papelão com fundo adesivo, folha metálica ou plástica, e semelhantes, sobre o qual as informações desejadas forarn impressas ou aplicadas.
EXEMPLOS A invenção será mais bem compreendida por referência aos exemplos a seguir, os quais são meramente exemplares da invenção. A presente invenção não tem seu escopo limitado pelas modalidades exemplificadas, que são apenas ilustrações de aspectos únicos da invenção. Quaisquer mêtodos que sejam funcionalmente equivalentes estão incluídos no escopo da invenção. Vârias modificações da invenção, além daquelas aqui descritas, ficarão evidentes para aqueles habilitados na têcnica a partir da descrição apresentada anteriormente e das figuras que a acompanham.
5 Essas rnodifícações estão incluídas no escopo das reivindicações em anexo.
A menos que estabelecido de forma diferente, todas as temperaturas estão em graus Celsius. Além disso, nesses exemplos e em outras seções, as abreviações possuem os seguintes significados: as = aminoácido ab = anticorpo ACT = tempo de coagulação ativado aPTT = tempo de tromboplastina parcial ativada célula CHO = célula de ovário de hamster chinês células CHO dhfr(-) = células CHO desprovidas do gene dhf r h hora INR = proporção internacional normalizada IV = intravenosa kg = quilograma M = molar mg = miligrama mg/kg = miligrama/quilograrna mg/ml = mi1ígrama/milí1itro min = minuto ml = mililitm rríM = milímolar nm = nanômêtro nM — nânoínolar
PO — — oral
PRP plasma rico em plaquetas
PT tempo de protrombina
unidade relativa de
5 fluorescência seg - segundo
TF = fator tecidual
U/ml = unidades/mililitro µ1 ou ul = microlitro µM = micromolar µg = micrograma
Exemplo 1. Preparação de fxa anidro des-Gla por digestão por quimotripsina fxa anidro des-Gla foi preparado de acordo com o procedimento de Morita, T. e col., j.
Bío.
Chem., 1986,
261(9): 4.015-4.023 por incubação de fXa anidro, em que desidroalanina substitui a serina do sítio ativo, com quimotripsina em 0,05 M de Tris-HCl, 0,1 M de NaCl, em pH
7,5, e 22°C por 60 minutos.
Em um quadro de experimento típico, 0,5 miligrama/mililitro (mg/ml) de fXa anidro foi incubado com 5 unidades/mililitro (U/ml) de glõbulos de a-
quimotripsina-agarose com agitação suave.
Ao final da reação, os glóbulos de a-quimotripsina-agarose foram removidos por centrifugação ou filtração.
Essa foi seguida por incubação com uma quantídade em excesso de inibidores fluoreto de 4-amidino-fenil-metano sulfonila (APMSF),
tosil-L-lisína clorometil cetona (TLCK) e tosil-L fenilalanina clorometil cetona (TPCK) para extinguir a atividade residual de fxa ou qualquer atividade de quirnotripsina possivelmente liberada pelos glóbulos.
O fragmento do domínio GIa e inibidores foram removidos do produto final, fXa anidro des-Gla, por um dispositivo de fíltração Amícon Ultra Centrifugal (membrana YMIO) ou por diálise convencional. A concentração ou troca de tampão, se 5 necessário, tambêrri foi feita ao mesmo tempo. O fxa anidro contendo o domínio GIa foi preparado de acordo com o procedimento relatado por Nogami, e col., j. Bíol. Chem.
1999, 274(43): 31.000-7. Os glóbulos de a-quimotripsina- agarose forarn adquiridos de Sigma e a atividade específica (U/m1) foi baseada nos dados do Eabricante para o número de lote específico usado.
A digestão por quimotripsina de fxa ativo pode ser realizada de acordo com o procedimento acima, sem a utilização de APMSF. a atividade de coagulação de fxa ativo foi determinada antes da digestão por quirnotripsina, e após 15, 30 e 60 minutos de digestão por quimotripsina de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 3 abaixo. A Figura 7 mostra a perda completa da atividade de coagulação após 30 rninutos de digestão por quimotripsina. O ternpo de incubação foi estendido até 60 minutos para assegurar a remoção completa do domínio Gla.
Exemplo 2. Ensaio de geração de trombina em plasma pobre em plaquetas (PPP) ou em plasma rico em pIaquetas (PRP) Nesse exemplo, amostras de plasma humano pobre em plaquetas ou ríco em plaquetas foram preparadas a partir de sangue ãe doadores saudáveis retirados ern 0,32% de cítrato.
PRP e PPP foram preparados por centrifugação do sangue anticoagulado a aproximadamente 100 X de gravidade ou 1000 X de gravidade por 20 minutos, respectivamente, em temperatura ambiente. 75-100 microlitros (µ1) de plasma foram rnisturados com CaCl2 e Z-Gly-G1y-Arg- aminometilcumarina (Z-GGR-AMC, um substrato fluorogênico de trombina). Fator tecidual (Innovin, Dade Behring) foi adicionado para iniciar a geração de trombina. Para um 5 experimento típico, a rnistura de reação continha 15 milimolar (mM) de Ca", 100 micromolar (µM) de Z-GGR-AMC, e 0,1 nanomolar (nM) de fator tecidual (TF) (Innovin). A formação de trombina foi monitorada continuamente a 37°C por uma leitora de placas fluorométrica (Molecular Devices) que mede as unidades relativas de fluorescência (RFU).
Inibidor e antídoto, quando presente, foram pré-incubados com plasma por 20 minutos em temperatura arnbientes antes do início da geração de trombina.
Os resultados de vários experimentos com o uso desse ensaio podem ser encontrados nas Figuras 4, 6 e 9.
Exemplo 3. Ensaio8 de prolongamento da coagulação Forarn usados dois formatos de ensaio de coagulação para testar os efeitos de inibidores do fator Xa e do antídoto sobre a prolongação da coagulação. No primeiro formato, uma placa de 96 poços foí usada para medir múltiplas amostras ao mesmo ternpo. No segundo formato de ensaio, aPTT foi medida com um instrumento de coagulação convencional (cronômetro de coagulação automático MLA Electra 800).
No método do formato de placa de 96 poços, plasma humano pobre em plaquetas ou rico em plaquetas foi preparado de forma similar aos procedimentos no Exemplo 2.
75-100 µ1 de pIasma foram re-calcifícados com CaC12, incubados a 37°C por 3 minutos e a formação de coâgulo foi iniciada por adíção de fator tecidual (Innovin, Dade
Behring) ou de um reagente de aPTT (Actin FS, Dade Behring). A mudança da ODq05 foi monitorada continuarnente por uma leitora de placas (Molecul-ar Devices). O ternpo de coagulação foi definido como o tempo (em segundos) quando a 5 metade do valor máximo da alteração da absorbância (OD405 nm) era alcançada. Inibidor do fator Xa e antídoto, quando presente, foram pré-incubados com plasma em temperatura ambiente por 20 minutos, antes do início da reação.
Quando um fxa ativo foi testado quanto à sua atividade de coagulação, como mostrado na Figura 7, 75-100 µ1 de plasma deficiente em fX (George King Bio-Medical, Inc.) foram re-calcificados com CaCl2, incubados a 37°C por 3 minutos e os produtos de fXa após digestão por quimotripsina forarn adicionados ao plasma para iniciar a formação de coágulo. A alteração da OD4o5 mi monitorada continuamente por uma leitora de placas, como descrito anteriormente.
Na Figura 13, o efeito de 400 nM de betrixaban sobre a prolongação de aPTT de plasma hurnano normal e sobre a reversão do efeito do inibidor betrixaban por antídoto fxa anidro des-Gla foi medido com um cronômetro de coagulação automátíco MLA Electra 800. Cem µ1 de pool de plasma humano foram rnisturados com 400 riM de betrixaban e concentrações diferentes de antídoto. O reagente de aPTT (Actin FS, Dade Behring) e CaC12 foram adicionados de acordo com as instruções do fabricante para a medida dos tempos de coagulação.
Os resultados de experimentos adicíonaís com a utilização desse ensaio podem ser encontrados nas Figuras 10 e 11.
Exemplo 4. Reversão da inibição de fXa por betrixaban por - fXa anidro des-Gla . Para medir a inibição da atividade de fXa por betrixaban e a reversão de seu efeito inibidor, fxa ativo 5 purificado, diferentes concentrações de betrixaban e de antídoto fXa anidro des-Gla foram adicionadas a 20 mM de Tris, 150 mM de Nacl, 5 mM Ca2" e albumina sérica bovina 0,1% (BSA). Após incubação em temperatura ambiente por 20 minutos, 100 µM de Spectrozyme-fXa (um substrato 10 cromogênico de fator Xa, Chromogenix) foram adicionados à mistura e a taxa de clivagem de substrato foi monitorada continuamente por 5 mínutos a 405 nanômetros (nm) por uma leitora de placas. Na Figura 5, a atividade cromogênica foi normalizada para fXa ativo na ausência de qualquer 15 inibidor. A velocidade inicial de formação de produto em função da concentração de inibidor e de antídoto foi analisada por regressão não linear para estimar a afinidade de betrixaban pelo antídoto (Figura 8).
O efeito do antídoto fxa anidro des-Gl-a sobre a 20 atividade de trombina em direção a um substrato cromogênico S2288 (200 µM) foi medido similarmente como anteriormente, com ou sem Argatroban, um inibídor Ila de pequena molécula específico. Como esperado, o antídoto (538 nM) não afeta a atividade amidolítica de Ila (5 nM) ou sua iníbição por 50 25 riM de Argatroban.
Exemplo 5. Preparação de fXa com resíduos de8carboxi1ados de ácido Y-carboxiglutâmico Um derivado de fXa com resíduos descarboxilados de ácido Y-carboxiglutâmico pode ser preparado por tratamento 30 de proteína de fXa, por exemplo, com base no procedimento relatado por Bajaj, e col. j'. Biol. Chem., 1982, 257(7): +
3.726-3.731. Dois a cinco mg de fXa purificado ou . recombinante em 2 ml de 0,1 molar de bicarbonato de arnônio em pH 8,0 são líofilizados. O pó resultante é lacrado sob 5 um vácuo de menos de 20 µm e aquecido a 1IO°C por vários períodos de tempo para obter fXa descarboxilado.
Exemplo 6. Preparação de EXa recombinante des-Gla-S379A Os derivados de fXa podem ser produzidos pelo método de DNA recombinante com um dos seguintes procedimentos com 10 base no cDNA de fX (ID. DE SEQ. N°: 2) para a expressão de fx (IDS. DE SEQ. N°": i, 3) ou derívados de fXa (IDS. DE SEQ. N°": 4, 5, 9 e 11) em um organismo hospedeiro adequado de acordo com os procedimentos gerais de mutagênese e biologia molecular.
15 fX recombinante e derivados de fX podem ser expressos, por exemplo, em células embrionárias de rim humano HEK293 com base nos procedimentos descritos em Larson, P.J., e col., Bíochem., 1998, 37: 5.029-5.038 e Camire, R.M., e col., Biochem., 2000, 39, 14.322-14.329. fx recombinante 20 pode ser ativado em rfXa pelo ativador de fator x, veneno de víbora de Russell (RVV). rfXa pode ainda ser processado em fxa anidro des-Gla com base nos procedimentos descritos no Exemplo 1.
fx-S379A recombinante (S195A na numeração de 25 quimotripsina) COUl o resíduo de serina do sítio ativo sendo substituído por alanina e, preferivelmente, o mutante de fXa ativado, rfXa-S379A, podeui ser expressos, por exemplo, em células de ovário de hamster chinês (CHO) com base nos procedimentos descritos por Sinha e col., Protein 30 Expression and Pur 1992, 3: 518-524; Wolf, D.L. e col., j.
Biol. Chem., 1991, 266(21): 13.726-13.730.
K fXa-S379A des-Gla pode ser preparado por digestão por quimotripsina de fXa-S379A de acordo com procedimentos descritos no Exemplo 1.
5 Mais preferivelmente, fXa-S379A des-Gla pode ser expresso diretamente de acordo corn procedimentos prévios com eliminação do fragmento do domínio Gla por procedimentos de rnutagênese. Por exemplo, a expressão recornbinante de proteína pode ser usada para expressam 10 des-Gla(1-39)-fxaS379A, após remoção do fragmento do domínio Gla 1-39 do ID. DE SEQ. N°: 3; des-Gla(1-44)-fXa- S379A, equivalente ao ID. DE SEQ. N": 10 com desidro- alanina sendo substituída por alanina; e des-Gla(1-45)-fXa- S379A com todo o dornínio Gla sendo removido (ID. DE SEQ.
15 N°: 11).
Truncamentos adicionais nos domínios EGFI ou domínios EGFI rnais EGF2 (Fígura 2) também podem ser feitos para expressar derivados de des(1-84)-fXa-S379A ou des(1-128)- fxa-S379A.
20 Exemplo 7. Expressão de mutante de fXa recombinante em cê1u1as CHO Esse exemplo descreve a expressão recombinante da construção de proteína e a linhagem de células para a expressão direta de uma variante de fXa sem domínio Gla- 25 S379A (S195A na numeração de quírnotripsina). O antídoto recombinante não necessita da ativação ou de etapas de rnodificação química necessárias para produzir o Antídoto-pd e possui afinidade comparável à proteína derivada do plasma nos ensaios in vitro aqui discutidos.
30 Nesse exemplo, um mutante de fxa (ID. DE SEQ. N°: 13,
Tabela 12a) foi expresso diretamente em células CHO (veja a Figura 14 para o vetor de expressão) e a proteína funcional foi purificada do meio condicionado, como descrito abaixo.
A atividade funcional do antídoto recombinante (Antídoto-r) 5 foi testada in vitro e ern um rnodelo anirrial (Exemplo 8).
PCR foi usada para mutar a seqüência de CDNA de fx (ID. DE SEQ. N°: 2) ern três regiões. A primeira rnutação foi a eliminação dos aa 6-39 no domínio Gla de FX (ID. DE SEQ.
N°: 3, Figura 3). A segunda rnutação foi a substituição da seqüência peptídica de ativação aa 143-194 com -RKR-. Isso produziu um vinculador -RKRRKR- que conecta a cadeia Ieve e a cadeia pesada. Após secreção, esse vinculador é removido em CHO resultando em urna molécula de fxa de duas cadeias. A terceira mutação é a mutação do resíduo do sítío ativo S379 em um resíduo Ala.
O polipeptídeo produzido pelo cDNA (ID. DE SEQ. N°: 16) descrito anteriormente está descrito na Tabela 12 (ID.
DE SEQ. N": 12). O alinhamento do CDNA com o poIipeptídeo é mostrado na Tabela 20. A molécula de fXa de duas cadeias produzida após secreção é um fragmento da cadeia leve descrito na Tabela 12b (ID. DE SEQ. N": 14) e um fragmento da cadeía pesada descrito na Tabela 12C (ID. DE SEQ. N°: 15).
Os primeiros 1-5 aa na seqüência de fX foram reservados e usados para conectar o polipeptídeo do mutante de fXa ao pré-prõ-peptídeo de fX (ID. DE SEQ. N°: 1, Figura 1), assegurando o processamento adequado do pré-pró- peptídeo no mutante de fXa.
A seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo de mutante de fXa descrito acima foi seqüenciada e inserida no vetor de expressão mostrado na Figura 14. O polínucleotídeo do vetor de expressão é mostrado no ID. DE SEQ. N°: 18. O DNA de plasmídeo fcji Iinearizado e transfectado em células CHO dhfr(-). As células foram selecionadas usando meio 5 deficiente em tetrahidrofolato (HT) mais metotrexato (MTX).
Os clones estáveis foram avaliados quanto à expressão de proteína elevada usando um kit de ELISA de fX (Enzyme Research Laboratories, Número de Catálogo FX-EIA). A proteína mutante de fXa foi expressa em meio sem soro e rrteio condicionado foi coletado e processado para purificação.
A proteína-alvo no meio pode ser isolada por cromatografia por troca íônica e subseqüentemente purificada por cromatografia por afinidade em etapa ünica (por exemplo, um anticorpo anti-fXa acoplado a uma matriz) ou por uma combinação de vãrias etapas de cromatografia como, por exemplo, matrízes hidrofóbicas. As purificações por afinidade podem incluir material cromatográfíco que se liga seletivamente à fenda do sítio ativo de fXa, por exemplo, benzamidina-sefarose ou inibidor de tripsina de soja-agarose (STI-Agarose).
A Figura 15 mostra os Western blots do mutante de fxa purificado por afinidade (STI-Agarose, Catálogo Sigma N° T0637) usando anticorpos monoclonais (Enzyrne Research Laboratories, FX-EIA) que reconhecem a cadeia pedada e leve de fX, respectivamente. Mediante redução da ligação díssulfeto que conecta a cadeia leve e pesada, o Antídoto-r mostra a bancía esperada da cadeia pesada similar ao derivado de fXa do plasma no Western blot. A eliminação de 6-39 como no domínio Gla do mutante de fXa resulta ern uma banda de peso molecular menor para a cadeia leve do Antídoto-r, comparado com o derivado de fXa do plasma. As marcas de peso molecular tambêm podem ser observadas no blot.
5 Exemplo 8. Modelo in vivo em camundongo Foi testado o perfil farmacocinético e farmacodinâmico (PK-PD) de betrixaban em machos de camundongos C57B1/6, com ou sem admínistração de antídoto. A administração oral única de betrixaban foi dosada em 0, 15, 25 e 75 mg/kg para grupos de controle. Quinze mg/kg foram usados para o grupo tratado com antídoto. Uma única injeção intravenosa (IV) de antídoto (300 µg/200 µ1) ou veículo (solução salina norrnal, 200 µ1) foi administrada 5 minutos antes do ponto do tempo de 1,5 hora.
A 1,5, 2,0, e 4,0 horas após a administração oral de betrixaban, os camundongos foram anestesiados com um coquetel de quetamina (SC) e dessangrados por meio de punção cardíaca. Foram obtidas amostras de sangue (0,5 rril) em 50 µ1 de citrato triss6dico. A INR do sangue total foi medida usando cartuchos Hemochron jr. (International Technidyne Corporation) de acordo com as ínstruções do fabricante. PIasma de camundongo pobre ern plaquetas foi preparado por centrifugação para determinações da concentração plasmática de betrixaban e antídoto (ELISA).
Para o experimento do antídoto recombinante (Antídoto- r), os camundongos receberam administração oral de betrixaban a 0, 15, 25 e 75 mg/kg para os grupos de controle. Quinze mg/kg foram usados para o grupo tratado com antídoto (300 µg/200 µ1). Forarn coletadas amostras 1,5 hora após a administração oral de betrixaban (5 minutos após a injeção do antídoto).
Como mostrado nas Figuras 16 e 17 e nas Tabelas 13 e 14, uma única injeção (300 µg, IV) de antídoto derivado do plasma (Antídoto-pd) ou mutante de fXa recombinante 5 (Antídoto-r) aos camundongos apõs a administração de betrixaban (15 mg/kg, PO) capturou eficazmente o inibidor in vivo. A correlação PK-PD de INR do sangue total com concentração plasmática de antídoto (Tabelas 13-14) indicou >50% de redução de betrixaban funcional com base em medidas da inr, e justificou a neutralização eficaz dos inibidores de fXa pelo antídoto por meio de injeções múltiplas ou outros regimes. Contempla-se que esses resultados demonstram que os derivados de fXa desta invenção possuem potencial para atuar como antídotos universais para reverter o efeito anticoagulante de inibidores de fXa em pacientes com sangramento ou com outras emergências médicas.
A Figura 22 mostra um experimento em camundongo com urna única injeção iv (1 injeçãd ou duas injeções (2 injeçõesl do Antídoto-r (n = 5 por grupo, 312 µg/200 µ1 de Antídoto-r) após administração oral de betrixaban (15 mg/kg). Para o grupo de injeção única, foram coIetadas amostras de sangue de camundongo ern 1 hora após administração oral de betrixaban. veículo (controle 1) ou Antídoto-r (1 injeção) foi administrado 5 minutos antes do ponto do tempo de 1 hora. Para o grupo de injeção dupla, foi ínjetado veículo ou Antídoto-r em 55 minutos e repetido em 115 minutos após administração oral de betrixaban. Amostras de sangue de camundongo foram coletadas em 2 horas para camundongos tratados com veículo (controle 2) e com
Antídoto-r (2 injeções). a INR medida como uma função da . proporção de antídoto/betrixaban no plasma de camundongo após injeções únicas ou duplas do antídoto é mostrada na Figura 22 B.
5 Exemplo 9. Reversão in vitro de rivaroxaban e apixaban por antídoto Como esperado, os antídotos contemplados por esta invenção também foram capazes de se ligar e neutralizar outros inibidores de fXa dirigidos ao sítio ativo. As 10 Tabelas 15 e 16 mostrarn a correção in vitro da inibição por betrixaban, rivaroxaban e apixaban por Antídoto-pd e Antídoto-r. fXa purificado (3,0 nM), inibidor (7,5 nM) e diferentes concentrações de antídoto foram incubados por 10 minutos a 22°C em um tampão com 20 rnM de Tris, 150 mM de 15 NaCl, BSA 0,1%, pH 7,4. A atividade de fXa foi testada de forma similar ao Exemplo 4.
Como mostrado na Tabela 15, 204 nM de Antídoto-pd produzem pelo menos 60% de correção dos efeitos inibídores dos inibidores testados, enquanto, na Tabela 16, foram 20 obtidos >95% de correção da inibição pelo Antídoto-r (186 nM) para betrixaban e rivaroxaban, e >70% de reversão de apixaban.
Exemplo 10. Rever8ão in vítro de betrixaban por antídoto-r Na Tabela 17, o efeito de proteína do antídoto 25 recombinante sobre a reversão da anticoagulação por betrixaban foi testado em urn ensaio de coagulação de plasma humano. O efeito de 300 riM e 400 nl'4 de betrixaban sobre a prolongação por aPTT do plasma e a reversão de efeito inibidor foi rnedido por um cronômetro de coagulação 30 automãtico MLA Electra 800. Cem µ1 de pool de plasma humano anticoagulado corn citrato foram misturados com 300 nM ou . 400 ríM de betrixaban e diferentes concentrações de antídoto. O reagente de aPTT (Actin FS, Dade Behring) e CaCl2 foram adicionados de acordo com as instruções do 5 fabricante.
Exemplo 11. Reversão in vitro de heparina de baixo peso molecular ("LMWH") por Antídoto-r Na Figura 18, o efeito de Antídoto-r para reverter c) efeito inibidor de LMWH enoxaparina (Sanofi-Aventis) foi 10 testado por alterações da turvação ern plasma hurnano.
Enoxaparina (0-1,25 U/ml) foi incubada a 22°C por 20 min, com ou sem 508 nM de Antídoto-r. As alterações da turvação foram medidas de acordo corn os procedimentos descritos no Exemplo 3. Quinhentos e oito nM de Antídoto-r corrigiram 15 substancialmente (> 75%) o efeito inibidor de 0,3125-1,25 U/ml de Enoxaparina.
Na Figura 19, o efeito de Antídoto-r sobre a reversão de anticoagulação por uma heparina de baixo peso molecular (LMWH enoxaparina, Sanofi-Aventis) foi testado em um ensaio 20 de coagulação de plasma humano. O efeito de 1 Unidade de anti-xa/ml de LMWH sobre a prolongação por apTT do plasma e sobre a reversão do efeito inibídor foi medido por um cronômetro de coagulação automãtico MLA Electra 800. Cem µ1 de pool de plasma humano anticoagulado com citrato foram 25 misturados com enoxaparina e diferentes concentrações de antídoto. Antes da medida do tempo de coagulação, reagente de âPTT (Actin FS, Dade Behríng) e CaCl2 Eoram adicionados de acordo com as instruções do fábricante. A adição de 1,14 µm de antídoto recombinante produziu uma correção de 52% da 30 anticoagulação produzida por 1 Unidade/ml de enoxaparina.
143 /155 Exemplo 12. Reversão in vitro de rivaroxaban por Ántídoto-r Na Figura 20, foi testado o efeito de proteína do antídoto recombinante sobre a reversão da anticoagulação por um inibidor do fator Xa de pequena molécula 5 (rivaroxaban, Bay 59-7939) em um ensaio da coagulação de pIasma humano. Como relatado por Perzborn e col., lj.
Thromb. Haemost. 3: 514-521, 2005, as medidas do tempo de protrombina são um rnétodo preciso para avaliar o efeito anticoagulante de rivaroxaban. O efeito de 1 µM de rivaroxaban sobre a prolongação do tempo de protrombina (PT) de pool de plasma humano e sobre a reversão do efeito inibidor foi medido por um cronômetro de coagulação automático MLA Electra 800. Cem µ1 de pooI de plasma humano anticoagulado com citrato foram misturados com rivaroxaban e diferentes concentrações de antídoto. Antes da medida do tempo de coagulação, o reagente Troníboplastina C Plus de cérebro de coelho (Dade Behring) foi adicionado às amostras de plasma de acordo com as instruções do fabricante. A adição de 1,9 µM de antídoto recombinante produziu uma correção de 100% da anticoagulação produzida por 1 µM de rivaroxaban.
Exemplo 13. Reversão ín vitro de Apixaban por Antídoto-r Na Tabela 18, o efeito da proteína do antídoto recombinante sobre a reversão de anticoagulação por apíxaban foi testado em um ensaio de coagulação de plasrna humano. Como relatado por Pinto e col., j. Meci. Chem.
55(22): 5.339-5.356, 2007, as medidas do tempo de protromibina (PT) são um método preciso para avaliar os efeitos anticoagulantes ex vivo de apixaban. O efeito de 1 µM e 1,5 µM de apixaban sobre a prolongação do tempo de protrombina (PT) de pooI de plasma humano e sobre a m reversão do efeito inibidor foi medido por urn cronômetro de coagulação automático MLA Electra 800. Cem µ1 de pool de plasma humano anticoagulado corn citrato foram misturados 5 com apixaban e diferentes concentrações de antídoto. Antes da medida do tempo de coagulação, reagente Tromboplastina C Plus de cérebro de coelho (Dade Behring) foi adicionado às amostras de plasma de acordo com as instruções do fabricante. A adição de 1,9 µm de antídoto recornbinante lO produziu uma correção de 97% da anticoagulação produzida por 1,5 µM de apixaban.
Exemplo 14. Inibição ín vitro de Argatroban por fXa anidro des-Gla para rriedir a inibição da atividade de trornbina por 15 argatroban e a reversão de seu efeito inibidor, trombina humana purificada (5 nM), argatroban (50 nM) e diferentes concentrações de antídoto fxa des-Gla anidro foram adicionados a um tampão contendo 20 mM de Tris, 0,15 M de NaCl, 5 rríM de cloreto de cálcio, albumina sérica bovina 20 0,1%, pH 7,4. Apõs incubação em temperatura ambiente por 20 min, um substrato arnidolítico S2288 (200 uM) foí adicionado à mistura e a taxa de cIivagem de substrato de p- nitroanilida foi- monitorada por absorbância a 405 nm. Os resultados são apresentados na Figura 12.
25 Deve-se entender que, embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as modalidades acima, a descrição e os exemplos apresentados anteriormente visam ilustrar, e não limitar, o escopo da invenção. Outros aspectos, vantagens e modificações dentro do escopo da invenção 30 ficarão evidentes para aqueles habilitados na técnica à qual a invenção pertence.
Tabela 13 - Correíação PK-PD em camundongos tratados com Àntídoto-pd a 1,5 hora apõs administração oral de 15 mg/kg de Betrixaban (5 minutos após injeção do antídoto) Animal tratado com 1 2 i 3 I 4 I 5 i 6 I 7 jMêdia Antídoto-pd Betrixaban 673 793 I 1170 I 415 I 217 I 664 i 879 I 687 (ng/ml) INR 4,2 4,5 I 5,2 I 3,3 I 2,3 | 4,1 I 4,7 I 4,0 esperada INR medida 2,3 2,3 I 3,3 I 0,8 I 0,8 I 1,5 I 2,0 I lL9 % de 63,9 66,6 I 52,3 I 100 I 100 I 83,1 i 74,4 I 77,2 correção Tabela 14 - Correlação PK-PD em camundongos tratados com Antídoto-r a 1,5 hora apõs administração oral de 15 mg/kg de Betrixaban (5 min apõs injeção do antídoto) Animal tratado com Antídoto-r 1 I 2 I 3 I 4 I Mêdia jBetrixaban I 262 I 335 I 494 I 381 I (ng/ml) 434 INR esperada 3,2 2,5 2,8 3,5 3,0 |INR rnedida I 2,0 I 0,9 I 1,2 i 0,9 ) _1L_3 % de correção 50,0 94,1 80,0 93,6 77,3 Tabela 15 - % de correção da inibição por inibidores de fXa Antídoto-pd Betrixaban Rivaroxaban Apixaban (nM) 0 0 0 0 10 , 2 13 , 1 10 , 6 6,5 20 , 4 34 , 8 37 , 4 11, 4
40,7 47,1 46,8 15,0
61,1 68,4 55,7 40,3
101,8 67,5 69,4 52,3
162,9 80,5 74,0 56,0
203,7 82,6 72,6 60,2
Tabela 16 - % de correção da inibição por inibidores de fXa
Antídoto-r Betrixaban i Rivaroxaban I Apixaban (nM)
0 I 0 I 0 I 0 9,3 21, 5 23 , 2 13 , 3
18 , 6 52 , 7 54 , 2 33 , 5
37,2 75, 5 72, 6 49, 9
55, 8 86 , 5 79,9 59,2
93 , 1 94 , 9 89,1 64,4
148,9 99,3 96,7 74,8
186,1 99,5 94,8 72,6
Tabela 17 - Reversão por Antídoto-r da atividade anticoagulante de betrixaban
N° de % de correção aPTT veze8 de da (seg) aumento anticoagulação Plasma humano de 35 ,2 1, 00 controle
300 nM de Betrixaban 61, 8 1, 76
300 riM de Betrixaban + 38, 3 1, 09 88 570 nM de Antídoto-r
300 npl de Betrixaban + 38, 2 1, 09 88 760 ríM de Antídoto-r
300 nM de Betrixaban + 38,1 1, 08 90
1140 riM de Antídoto-r
400 nM de Betrixaban I 66,3 I 1,88
400 riM de Betrixaban + 47,1 I 1,34 I 61 380 nM de Antídoto-r
400 nM de Betrixaban + 39,9 I 1,13 I 85 570 nM de Antídoto-r
400 nM de Betrixaban + 39,9 ! 1,13 I 85 760 nM de Antídoto-r
400 nM de Betrixaban + 37,8 ! 1,07 I 92 1140 ríM de Antídoto-r
400 riM de Betrixaban + 39,4 I 1,12 I 86 1520 nM de Antídoto-r
1140 nM de Antídoto-r 38,9 1,11
1520 nM de Antídoto-r 38,8 ]-,10
Tabela 18 - Reversão por Antídoto-r da atividade anticoagulante de Apixaban
I N° de vezes de PT (seg) aumento Plasma humano de controle 14,1
1 µm de apixaban 16,4 I 1,16
1 µjvI de apixaban + 380 nM de 15,3 I 1,09 Antídoto-r
1 jÁM de apixaban + 760 nM de 14 , 9 1, 06 Antídoto-r
1 µM de apixaban + 1,14 µnI de 14 , 2 1, 01 Antídoto-r
1 µM de apixaban + 1,52 µM de 14 , 2 1, 01 Antídoto-r
1,5 piM de apixaban 18 , 4 1,31
1,5 µM de apixaban + 1,52 µM de 14 , 6 1, 04
Antídoto-r 1,5 µM de apixaban + 1,90 µm de 14 , 3 1, 01 Antídoto-r 1,52 µM de Antídoto-r 14 1,90 µM de Antídoto-r I 14,2 I TABELA 1- ID. DE SEQ. N° 1 - SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO DE l" 0" " 1 MGRPLHLVLL SASLAGLLLIJ GESLFIRREQ ANNI LARVTR ANSFL EEPIKK GHLERECMEE 61 TCSYEEAREV FEDSDKTNEF hNKYKDGDQC ETS PCQNQGK CKDGLGEYTC TCLEGFEGKN 121 CELFTRKLCS LDNGDCDQFC HEEQNSVVCS CARGYTLADN GKACIPTGPY PCGKQTLERR 181 KRSVAQATSS SGEAPDSIIM KPYDAADLDP TENPFDLLDF NQTQPERGDN NLTRIVGGQE 241 CKDGECPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY TLTAAHCLYQ AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE 5 301 AVAE'/EVVIK HNRFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRMNVAP ACLPERDWAE STLMTQKTGI 361 VSGFGRTHEK GRQSTRLKMIJ EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ NMFCAGYDTK QEDACQGDSG 421 GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK WIDRSMKTRG LPKAKSHAPE 481 VITSSPLK TABELA 2 - ID. DE SEQ. N° 2 - UMA SEQUÊNCIA DE
POLINUCLEOTÍDEO CODIFICADORA DE FATOR X 1 gactttgctm cagcagcctg tcccagtgag gacagggaca cagtactcgg ccacaccatg 61 gggcgcccae tgcacctcgt ccEgctcagt gccrccctgg ctggcctcct gctgctcggg 121 ggzaagtctgt tcatccgcag ggagcaggcc aacaacatce tggcgagggt cacgagggcc 181 aattcctttc ttgaagagat gaagaaaqga cacctcgaaa gagagtgcat ggaagagacc 241 tgctcatacg aagaggcccg cgaggtctct gacjgacagcg acaagacgaa tgaattc.tgg 301 aataaataca aagatggcga ccagtgtgag accagtcctt gccagaacca gggcaaatgt 361 aaagacggcc tcggggaata cacctgcacc cgtttagaag gatEcgaagq caaaaactgt 421 gaattattca cacggaagct ctgcagcccg gacaacgggg acEgtgacca gm:ctgccac 481 gaggaacaga actctgtggt gtgctcctgc gcecgcgggt acaecctggc tgacaacggc 541 aaggcctgca. ttcccacagg gccctacccc tgtgggaaac agaccctgga acgcaggaag 601 aggtcagtgg cccaggccac cagcagcagc ggggaggccc etgaeagcat cacatggaag 661 ccatatgacg cagccgacct ggaccccacc gagaacccct tcgacctgct tgacrtcaac 721 cagacgcagc ctgagagagg cgacaacaac ctcaccagga tcgtgggagg ccaggaatgc 781 aaggacgggg agtgtccctg gcaggccctg ctcatcaatg aggaaaacga gggtttctgt 841 ggtggaacca ttcEgagcga gttctacatc etaacggcag cccactgtct ctaccaagcc 901 aagagaccca aggtgagggt aggggaccgg aacacggagc aggaggaggg cggtgaggcg 961 gtgcacgagg tggaggtggt catcaagcac aaccggttca caaaggagac ctatgacttc 1021 gacatcgccg tgctccggct caagacçcçc atcacettcc gcatgaacgt ggcgcctgcc 1081 tgcctccccg agcgtgactg ggccgagtcc acgctgatga cgcagaagac ggggategEg 1141 agcggcttcg ggcgcaccca cgagaagggc cggcagtcca ccaggctcaa gatgctggag 1201 gtgccctacg tggaccgcaa cagctgcaag ctgtccagca gcttcatcat cacccagaac 1261 acgttctgtg ccggcmcga caccaagcag gaggatgcct gccaggggga cagcgggggc 1321 ccgcacgtca cccgcttcaa ggacacctac ttcgtgacag gcatcgtcag ctggggagag 1381 ggctgtgccc gtaaggggaa gtacgggatc tacaccaagg tcaccgcctt cctcaagtgg 1441 atcgacaggt ccatgaaaac caggggcttg cccaaggcca agagccatgc cccggaggtc 1501 aEaacgtcct ctccattaaa gtgagatccc actcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa TABELA 3- ID. DE SEQ. N° 3- SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO DE
1 ANSFLEEMKK GHLERECMEE TCSYEEAREV FEDSDKTNEF WNKYKDGDQC ETSPCQNQGK 61 CKDGLGEYTC TCLEGFEGKN CELFTRKLCS LDNGDCDQFC HEEQNSVVCS CARGYTLADN 121 GKACIPTGPY PCGKQTLERR KRSVAQATSS SGEAPDSITW KPYDAADLDP TENPFDLLDF 181 NQTQPERGDN NLTRIVGGQE CKDGECPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ 241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEÁTVIK HNRFTKETYI) FDIAVLRLKT PITFAP 301 ACLPERDWAE STLFYTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPXVDRNSC KLSSSFIITQ 361 NMFC'AGYDTK QEDACQGDSG GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK 5 421 WIDRSNKTRG LPKAKSHAPE VITSSPLK TABELA 4- ID. DE SEQ. N° 4- SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO DE FATOR Xa SEM DOMÍNIO GLA DESPROVIDO DE 1 A 44 RESÍDUOS DE
AMINOÁCIDO Cadeial.eve DQC Erspc'QN%K 61 CKDGLGEYTC TCLE)GFEGKN CSLFTRKLCS LDNGK HEEQNSVVCS CARGYTLADN I2l GKACIPTGPY PCGKQTLER Cadâa Pesada a.i _ I,v,ggQ,E^wEcm?À _ L,L,I,N,E,HA,G,F I.L,S,E,FY _ I.L,T,C,L,Y,Q, 241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AWJEVEVVIK KNRFTKETYD FDIAVLRLXT PIT'FRFWVAP
0.1 _ ACLPERDWAE STLJ4TQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRL~ EVPYVDRNSC KLSSSFI ITQ 361 NKFCAGYDTK QBDACQGDSG GFHVTRFKMF YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYT'KVTAFLK 421 WIDRSMKTRG LPKAKSHAPE VITSSPLK TABELA 5- ID. DE SEQ. N° 5- SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO DE FATOR Xa SEM DOMÍNIO GLA DESPROVIDO DE 1 A 45 RESÍDUOS DE
AMINOÁCIDO CadeiaLeve 1 DGDQC ETSPCQNQGK 61 CKDGLGEYTC TCLEGFEGKN CELFTRKLCS LnNgDcDQFc HEEQNSVVCS CARGYTLADN 121 GKACIPTGPY PCGKQTLER m Cadeia Pesada 181 IVGGQE CKDGECPWQA LLINEKNEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ 241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEVVIK HNRFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRMNVAP 3 01 ACLPERDWAE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ 3 61 NMFCAGYDTK QEDACQGDSG GPKVTRFKDT YFVTGTVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK 421 WIDRSKTKTRG LPKAKSHAPE VITSSPLK TABELA 6- ID. DE SEQ. N° 6- SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO DE FATOR Xa HUMANO ATIVADO ANTES DA PÓS-TRADUÇÃO DE ÁCIDO GLUTÂMICO PARA ÁCIDO Y-CARBOXIGLUTÂMICO
I Cadeia Leve 1 ANSFLEEMKK GHLERECMEE TCSYEEAREV FEDSDKTNEF WNKYKWDQC ETSPCQNQGK 61 CKDGLGEYTC TCLEGFEGKN CELFTRKLCS LDNGDCDQFC HEEQNSVVCS CARGYTLADN . 121 GKACIPTGPY PCGKQTLER Cadeia Pesada 181 IVGGQE CKDGECF'WQA LLIgy CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ 241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVKEVEVVIK IDJRFTKETYD FDIAVLRLKT pITFRmvAp 301 ACLPERDWAE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ 361 NMFCAGYDTK QEDACQGDSG GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK 5 I 421 WIDRSMKTRG LPKAKSHAPE VITSSPLK TABELA 7 - ID. DE SEQ. N° 7- SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO DE FATOR Xa HUMANO ATIVADO COM A PÓS - TRADUÇÃO DE ÁCIDO GLUTÂMICO PARA ÁCIDO Y- CARBOXIGLUTÂMICO (Y REPRESENTA RESÍDUO DE ÁCIDO Y-CARBOXIGLUTÂMICO) 10 Cadeia Leve
ANSFLEEMKK GHLERECMEE TCSYEEAREV FEDSDKTNEF WNKYKDGIJQC ETSPCQNQGK J 61 CKDGLGEYTC TCLEGFEGKN CELFTRKLCS LJJNGDCDQFC I1EEQNSV\7CS CARGYTLADN _J 121 GKAC.IE'TGPY PCGKQTLER Cadeia Pesada 181 IVGGQE cKu3EcFwQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ I 241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEVVIK HNRFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRPWVAP I 301 ACLPERD'4AE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKFK EVPYVDRNSC KLS"SFIITQ I 361 NMFCAGYDTK OEDACQGDSG GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK I 421 'NIDR.'IFIKTRG LPKAKSHAPE VITSSPLK 15 TABELA 8- ID. DE SEQ. N° 8- SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO DE CADEIA LEVE DE FATOR Xa HUMA-NO ATIVADO COM A PÓS-TRADUÇÃO DE ÁCIDO GLUTÂMICO PARA ÁCIDO Y-CARBOXIGLUTÂMICO CadeiaLeve 1 ANSFLYYMKK GHLYRYC6¶Y TCSYYYARYV FYDSDKTNYF 'NNKYKDGDQC ETSPCQNQGK 20 I 61 CKDGLGEYTC TCLEGF'EGKN CELFTRKLCS LDNGDCDQFC KEEQNSVVCS CARGYTLA-DN 121 GKACIPTGPY PCGKQTLER TABELA 9- ID. DE SEQ. N" 9 - SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO DE CADEIA PESADA DE FATOR Xa HUMANO ATIVADO 181 IVGGQE CKDGWPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTA-AHCLYQ 241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEVVIK HNRFTKETYD FDIAVKRLKT PITFR6WVAP 25 301 ACLPERDPJAE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFTTTQ 361 NMFCAGYDTK QEDACQGDSG GPHVTRF= YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK 421 WIDRSMKTRG LPKAKSHAPE VITSSPLK TABELA 10- ID. DE SEQ. N° 10 - SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO DE FATOR Xa ANIDRO DES-GLA (Ã REPRESENTA DESIDROALANTNA) 30
Cadeia Leve 1 kdgdqc etspcqnqgk 61 ckdglgeytc tclegfegkn cflftrklcs ldngdcdqfc HEEQNsvvcg cargytladn 121 gkacip Cadeia Pesada 181 ivggqe ckdgecpwqa llineenegf cggtilsefy iltaahclyq 5 241 akrfkvrvgd rnteqeegge avhevevvik hnrftketyd fdiavlrlkt pi tfridnap 3 Ol aclperdwae stlmtqktgi vsgfgrthek grqstrlkml evpyvdrnsc klsssfiitq 3 61 nmfcagydtk qedacqgdÂg gpkvtrfkdt yfv¶x3ivswg egcarkgkyg iytkvtaflk 421 widrsmktrg lpkakshape vits,"plk tabela 11- id. DE SEQ. n° 11 - SEQUÊNCIA de POLIPEPTÍDEO de FATOR Xa-S379A DES-GLA CadeiaLeve 1 dgdqç Letspcqnqgk 61 ckdglgeytc tclegfegkn celftrklcs ldngdcdqfc heeqnsvvcs "l |cargytladn 12""" jCadeiaPesada 181 ivggqe ckdgecpwqa llineenegf cggttlsefy I iltaãhclyq I 241 akrfkvrvgd rnteqeegge avhvvik finrftketyjj fdiavijrlkt I pitf 301 aclperimae stimtqktgi vsgfgrthek grqstrlkml evpyvdrnsc I klsssfiitq 361 nmfcagyufk qedacqgdàg gphvtrfkdt yfv¶civswg egcarkgkyg I iytkvtaflk 421 widrsmktrg lpkakshape vitssplk TABELA 12- ID. DE SEQ. N" 12 - SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO DE FATOR Xa HUMANO TRIPLO MUTANTE ANTES DA REMOÇÃO DO LIGANTE -RKRRKR- Cadeia Leve 1 ÂNSFL F WNKYKDGDQC ETSPCQNQGK 61 CKDGLGEYTC TCLEGFEGKN CELFTRKLCS LDNGDCDQFC HEEQNSVVCS CARGYTLADN 121 G»-CIPTGPY PCGKQTLER ulnker
RKRRKR Cadeia Pesada 181 IVGGQE CKDGBCPWQA LLIGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ 241 AKRFKVRVGD RNTEQÉÉGGR AVHEVEVVIK HNRFTKETYD FDTAVLRLKT PITFRbMVAP 3 0 i ACLPERDWAE STLMTQKTGT VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ 361 NMFcAgYUrK QEDACQGDÀG GPHVTRFKDT YFVTGTVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK 421 WIDRSMKTRG LPKAKSHAPE VITSSPLK TABELA 12a- ID. DE SEQ. N" 13 - SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO
DE FATOR Xa HUMANO TRIPLO MUTANTE APÓS A REMOÇÃO DO LIGANTE -RKRRKR- Cadeia Leve 1 ANSFIJ F WNKYKDGDQC ETSPCQNQGK 61 CKDC-LGEYTC TCLEGFEGKN CELFTRKLCS LDNGDCDQFC HEEQNSVVCS CARGYTLADN 121 GKACIPTGPY PCGKQTLER 5 Cadeia Pesada 181 v,g,gq,e _ c.K!xíEçp,w,QiÁ _ l!j.i,npen,e,g,f _ c,gg,t.i.l,spf,y _ i,ltaah,c.ly,q. 2 4 1" AKRFKVRVGD rnteqeegge avhevevvik knrftketyd fdiavlrlkt pitfap 3Q1 ACLPERDWAE Stµµt,q,k,t,g.i _ v,s,g,F,g.R,m,E,K _ g,r,q,s,t,r,l,k,k,w _ evp,y,v,dµn,s.c _ k,l,s,s,s.f,i.i,t,q. 361 NMFCAGYDTK QEDACQGDÁG gphvtrfkdt yfvtgivspg egcarkgkyg iytkvtàflk 4 21 wrDRsbIKTRg U'kakshape vITss]éu' TABELA 12b- ID. DE SEQ. N° 14 - SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO DE FRAGMENTO DA CADEIA LEVE DO FATOR xa HUMANO TRIPLO
MUTANTE APÕS A SECREÇÃO 1 ANSFL F 'NNKYKDGDQC ETSPCQNQGK 61 CKDGLGEYTC TCLEGFEGKN CELFTRKLCS LDNGDCDQFC HEEQNSWCS CARGYTLADN 121 GKACIE'TGPY PCGKQTLER TABELA 12C- ID. DE SEQ. N° 15 - SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO DE FRAGMENTO DA CADEIA PESADA DO FATOR Xa HUMANO TRIPLO
MUTANTE APÓS A SECREÇÃO Cadaa Leve 181 IVGGQE CKDGECPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ 241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEVVIK HNRFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRMNVAP 301 ACLPERDWAE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTR EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ 361 NMFCAGYDTK QEDACQGDÀG GPHVTRFKDT gwspíg EGCARKGKYG IYTKVTAFLK 421 CYIDRSPÍKTRG LPKAKSHAPE VITSSPLK
TABELA 19- ID. DE SEQ. N° 16 - SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO DE CODIFICADORA DE r-ANTÍDOTO (UM FATOR X TRIPLO MUTANTE) 2 §2SS8S§S§' i 2Èíúi9Ê7E! 8 mC sumuàs '5 8 )ÊÊá9Ê8à9á L#ã#áÈ9 ?Õ8$88?88Ê U UUE·<UU dPD ãgáàÊ8g¢Èg 8?S8¥e?28z 62u6t'888á8 <UKCOEmE·µ ÁÁO ièii?tàià? µ CJU UF' UUUCJ z9áÉáÉâÊ'2Ê ?88É2áá?88 UE}EmUL)ET¢ej µH'? z88E¥""á96z Z8R28§?68R 69888?8ZG% UUKOÕPUO4eE )!)!ji])|j B2¶ãs9sé¥9 !i!líiN! UU" µQC)µDµZ ti Sg' uDadUU (3tDk6s8$8? b 8- Z28F88 2«6ét?iq&"6E 2MS288Ú88 E~'C <mo4ovo 78Zzã&?5g8< ' M919 28286? 2ÊÉí6Ê27Èiã U < U .O u r'ç DO·C u U UL'DE<KOc)r3UE· (J DUU UOE4 UOU© V O<U<F1è·Cj <·E<U
U jg § i< a—l ~ íííii!!lití r4 m ~ ~ r-l ~ ~ ¶—í ·m ~ ~
CJ ~ c> cj o õ cj = o çq rn my u3 LD r· = õ o <> CXJ t» C> a çq r-t a m
TABELA 20- ID. DE SEQ. N° 18 - SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEO DO VETOR DE EXPRESSÃO DO r-ANTÍDOTO CJ < O C) nç Cj U E- LJ O E- U <µ :SH 2Z EU §E§S ÈÈÊ ãé E 3§Èq§g£ )!Êiã ií!âá " E 8 UL)kçEm eç U 8"b8 6 CJ C)
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Claims (62)
1. Uso de urn derivado da proteína do fator Xa que se liga ao inibidor do fator Xa e não se agrega em um complexo de protrombinase caracterizado pelo fato de que é no 5 preparo de um medicamento para a prevenção ou redução de sangramento em um indivíduo subrnetido à terapia anticoagulante com um inibidor do fator Xa.
2. Uso de um derivado da proteína Xa que se Iiga ao inibidor do fator Xa e não se agrega em um complexo cíe protrombinase car,a,c.t.e.r.i.z.a,d,o, pelo fato de que é no preparo de um rnedicamento para ligar e inibir seletivamente um inibidor do fator Xa administrado exogenamente em um indivíduo.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o derivado da proteína do fator Xa se liga ao inibidor do fator Xa direta ou indiretamente.
4. Uso, de acordo corn a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o derivado possui atividade pró-coagulante reduzida ou ausente.
5. Uso, de acordo corn qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizqdo, pelo fato de que q derivado é um derivado da proteína do fator Xa deficiente ern Gla ou uma proteína des-Gla do fator Xa.
6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o derivado possui urrí sítio ativo modificado.
7. Uso, de acordo corn qualquer urna das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caract.e,r.i.z.a.do, pelo Eato de que o derivado compreende pelo menos os resíduos de aminoácido de
2 /11 46 a 448 do ID. DE SEQ. N" 3 ou um equívalente destes.
8. Uso, de acordo ccjín qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 , ,c.a,r,a,c.t.e,r.i.z.a,d,o, pelo fato de que c) derivado compreende pelo rnenos os resíduos de aminoácido de 5 46 a 139 e de 195 a 448 do ID. DE SEQ. N° 3 ou um equival-ente destes.
9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterízado pelo fato de que o derivado é desprovido de uma cadeia leve de fxa e contém um domínio catalítico de serina-protease presente na cadeia pesada.
10. Uso, de acordo com qualquer urna das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o derivado é um poIipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° 5.
11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 ou 10 , ,c.a,r,a,c.t.e.r.i.z.ado pelo fato de que o derivado inclui um domínio catalítico opcionalmente modificado química ou recombinantemente para perder a atividade proteolítica, mas manter características estruturais necessárias à ligação, o referido domínio derivado de: a. Proteases de mamíferos selecionadas do grupo que consiste em calicreína, trornbina e tripsina pIasmáticas; ou b. Protease bacteriana subtilísina.
12. Uso, de acordo corn qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, caracteriza,do, pelo fato de que o derivado compreende uma seqüêncía de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° 7 com uma cadeia leve modificada ou um equivalente desta.
3 /11
13. Usq, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que o derivado compreende uma cadeia leve modificada para reduzir a Iigação da membrana de 5 fosfolipídeo.
14. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve modificada compreende pelo menos uma substituição, adição ou eliminação de aminoácido IO no domínio Gla, quando comparada com o domínio Gla de uma proteína do fator Xa humano do tipo selvagem.
15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicaçães 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o derivado é selecionado do grupo que consiste em uma proteína não carboxilada, subcarboxilada e descarboxilada do fator Xa.
16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o derivado compreende a cadeia pesada do ID. de SEQ. N° 7 que é modificada, ou um equivalente desta.
17. Uso, de acordo com qualquer urna das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, caracte.r,i.z.a,d,o, pelo fato de que o derivado é modificado por pelo rrlpnos uma substituição de aminoácido de um arninoácido selecionado do grupo que consiste em G1u216, Glu218, Arg332, Arg347, Lys351 e Ser379.
18. Usc), de acordo com qualquer uma das reivindícações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1-0, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que Ser379 é modificada. para
4 /11 desidro-alanina ou alanina.
19. Uso, de acordo com qualquer urna das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 , ,c.a,r,a,c.t.e,r.i.z.a,d,o, pelo fato de que o derivado é des-Gla 5 anidro-fXa que possui uma seqüência de arninoácidos do ID.
DE SEQ. N° 10 ou um equivalente desta.
20. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o derivado é des- IO Gla fXa-S379A que possui uma seqüência de arninoácidos do ID. DE SEQ. N° 11 ou urn equivalente desta.
21. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, ,c.a,r,a,c.t.e.r,izado pelo fato de que o derivado possui interação reduzida com ATIII, co-fatores fV/fVa e/ou fvIII/fVIIIa, e compreende uma seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° 7 ou um equivalente desta.
22. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que o derivado compreende a seqüência de aminoácídos do ID. DE SEQ. n° 12 ou 13 ou 15 ou um polipeptídeo q'ue possui pelo menos 80% de homologia para o ID- DE SEQ. N" 12 ou 13 ou 15.
23. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22, carac,t.e.r.i.z.a,d,o, pelo fato de que o derivado possui pelo rnenos uma substituição de aminoácido na posição de aminoácido Arg306, Glu310, Arg347, Lys351, Lys414 ou Arg424.
24. Uso, de acordo corn qualquer uma das reivindicações
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, £a,r,a,c.t.eriz! pelo fato de que o derívado possui uma modificação no domínio EGF, a referida modificação sendo selecionada do grupo que consiste na 5 eliminação do dornínio EGFI, eliminação do domínio EGF2 e eliminação tanto do dcmínio EGFI quanto do domínio EGF2.
25. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que o derivado é conjugado a uma porção capaz de prolongar a meia-vida circulante do derivado.
26. Uso, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a porção é selecionada do grupo que consiste ern polietileno glicol, um grupo acil, um 1" lipossomo, um agente de encapsulação, uma proteína transportadora, uma rrlembrana de fosfolipídeo artificial, uma nanopartícula, fragmento de peptídeo Fc, uma proteína quimérica que compreende um domínio do transportador de Fc e derivado de fxa e combinações destes.
27. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 1-7, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou 26, caraeterizado pelo fato de que o método ainda cornpreende a adrnínístração de uma quantidade eficaz de um agente que prolonga a rneia-vida circulante do derivado.
28. Uso, de acordo com a reivindicação 27, carac,t.e,r.i.zado pelo fato de que o agente é um anticorpo anti-fXa que reconhece e se liga especificamente ao exosítio de fxa ou a uin derivado de fXa Iigado à a1£a-2- macroglobulina.
29. Usc), de acordo corn qualquer urna das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o inibidor do fator Xa é selecionado do 5 grupo que consiste em fondaparinux, idraparinux, idraparinux biotinilado, enoxaparina, fragrnina, NAP·-5, rNAPc2, inibidor da via do fator tecidual, DX-9065a, YM- 60828, YM-150, apixaban, rivaroxaban, PD-348292, otamixaban, DU-176b, LY517717, GSK913893, razaxaban, heparina de baixo peso molecular, betrixaban ou um sal farmaceuticamente aceitável destes, e combinações destes.
30. Uso, de acordo com a reivindicação 29, caracter.i.z.a,do, pel-o fato de que o inibidor do fator Xa é selecionado de betrixaban, rivaroxaban, apixaban, heparina de baixo peso molecular, e combinações destes.
31. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30, caracterizado pelo fato de que o indivíduo apresenta um quadro clínico de sangrarnento importante selecionado do grupo que consiste em hemorragia, sangramento ern órgãos vitais, sangramento que necessite de reoperação ou de um novo procedimento terapêutico e um índice de sangrarnento igual ou maior do que 2,0 com um sangraniento visível a.ssociado.
32. Uso, de acordo com qualquer urna das reivíndicações 1, 2., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 1-5, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que o indivíduo apresenta um quadro de sangramento selecionado do grupo que consiste em
7 /11 epistaxe persistente ou recorrente, sangramento retal ou do trato urinário sem a necessidade de um procedimento terapêutico, hematomas substanciais no local de injeções, hernatornas espontâneos ern fora do local de injeções, 5 hematomas que ocorrern com traurna trivial, perda sangüínea substancial e sangrarnento que exija transfusão não planejada.
33. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, jo, 20, 21, 22, 2.3, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o derivado é administrado antes de urna cirurgia.
34. Composição farmacêutica, ça,r.a,c.t.e.r,izada por compreender uma proteína de derivado de fator Xa que se 1" Iiga a urn inibidor do fator Xa e não se agrega em um complexo de protrombinase e um veículo farrnaceuticamente aceitável.
35. Polipeptídeo isolado, caracterizado por compreender a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° 12 ou um polipeptídeo que possui pelo menos 80% de homologia para o ID. DE SEQ. N° 12.
36. Polipeptídeo isolado, caracterizado por compreender a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° 12 .
37. Polipeptídeo de duas cadeias isolado, caracterizado por cornpreender a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° 13 ou um polipeptídeo que possui pelo menos 80% de hoinologia para c) ID. DE SEQ. N° 13.
38. Polipeptídeo isolado, caracterizado por compreender a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N" 15 ou um poIipeptídeo que possui pelo menos 80% de hornologia para o ID. DE SEQ. N° 15.
39. conjugado peptídico, caracterizado por cornpreender um veículo ligado covalente ou não covalentemente a um 5 polipeptídeo de qualquer urna das reivindicações 35, 36, 37 ou 38.
40. Conjugado peptídico, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o veículo é um lipossorno, uma micela, um polírnero farrnaceutic'amente aceitável, ou urn veículo farmaceuticarnente aceitável.
41. Cornposição farmacêutica, caracterizada por com'preender um veículo e um polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 35, 36, 37 ou 38.
42. Polinucleotídeo, caracterizado por codificar urn polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 35, 36, 37 ou 38.
43 . Anticorpo, ,c.a,r.a,c.t.e,r.i.z.ad,o, por se ligar a um polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 35, 36, 37 ou 3 8 .
44. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico ou urn anticorpo humanízado.
45. Fragmento biologícamente ativo ,c.a,r,a,c.t.e.r,i.z.a,do, pelo £ato de ser do A.nticorpo, de acordo com a reivindicação 43.
46. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é marcado de forma detectável.
47 . Composição ,c.a,r.a,c.t,e.r,i.z.a,d,a por compreender o Anticorpo da reivindicação 43 e urn veículo.
9 /11 48 . Composição ,c.a,r,a,c.t.e,r,i.z.a,da por compreender o anticorpo fragmento da reivindicação 45.
49. Complexo anticorpo-peptídeo, cçracterizado por compreender o Anticorpo da reivindicação 46 e um 5 polipeptídeo que se liga especificamente ao anticorpo.
50. Cornplexo, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é o polipeptídeo contra o qual o anticorpo é desenvolvido.
51. Complexo, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico ou urri anticorpo humanizado.
52. Método para a preparação de um polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 35, 36, 37 ou 38, caracterizado por compreender a expressão de um poIinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 35, 36, 37 ou 38 em urna célula hospedeira procariótica ou eucariõtica.
53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende a seqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N° 12 e o polinucleotídeo compreende a seqüência de nucleotídeos do ID. DE SEQ. N° 16.
54. Método, de acordo com a reivindicação 52, earaeterizado pelo fato de que a cél-ula hospedeira é urna célula de ovário de hamster chinês.
55. Método, de acordo com qualquer uma das reívindicações 52, 53 ou 54, caracterizado ainda por cornpreender o isolamento do polipeptídeo.
56. Célula hospedeira procariótica ou eucariótica isolada, ,c.a,r.a,c.t.e.r.i.z.ada por compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de qualquer uma das reivindicações 35, 36, 37 ou 38.
57. Composição earacterizada por compreender um 5 veículo e uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica da reivindicação 56.
58. Uso de urna composição da reivindicação 41 caracterizado pelo fato de ser no preparo de um rnedicamento para a prevenção ou redução de sangramento em urn indivíduo submetido à terapia anticoagulante com um inibidor do fator xá.
59. Método de se Iigar e inibir , seletivarnente um inibidor do fator Xa adminis'crado exogenarnente em urn indivíduo submetido à terapia anticoagulante com um inibidor do fator Xa, caracterizado por compreender a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de urna coInposição da reivindicaçã.o 41.
60. Método, de acordo com a reivindicação 58 ou 59, caracterizado pelo fato de que o inibidor do fator Xa é selecionado do grupo que consiste em fondaparinux, idraparinux, idraparinux biotinilado, enoxaparina, fragrnina, NAP-5, rNAPc2, inibidor da via do fator tecidual, DX-9065a, YM-60828, YM-150, apixaban, rivaroxaban, PD- 348292, otamixaban, DU-176b, LY517717, GSK913893, razaxaban, heparina de baixo peso rnolecular, betrixaban ou um sal farmaceuticamente aceitável destes, e combinações destes.
61. Método, de acordo com a reivindicação 60, car,a,c.t.e.r.i.z.a,d,o, pelo fato de que o inibidor do f ator Xa é selecionado de betrixaban, rivaroxaban, apixaban , heparina de baixo peso molecular, e combinações destes.
62. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o derivado é adrninistrado antes de uma cirurgia.
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US7696352B2 (en) * | 2004-06-18 | 2010-04-13 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Factor Xa inhibitors |
EA015942B1 (ru) | 2006-05-05 | 2011-12-30 | Милленниум Фамэсьютикэлс, Инк. | Замещенные имидазолы, композиция на их основе, способ профилактики или лечения нежелательного тромбообразования с их помощью и способ ингибирования коагуляции образцов крови |
EP3824902A1 (en) | 2007-09-28 | 2021-05-26 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
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KR101977846B1 (ko) | 2008-12-19 | 2019-05-14 | 박스알타 인코퍼레이티드 | Tfpi 억제제 및 사용 방법 |
EP2414517B1 (en) * | 2009-03-30 | 2016-09-21 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
JP6163304B2 (ja) * | 2009-07-15 | 2017-07-12 | ポートラ ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 第Xa因子インヒビターの解毒剤の単位用量処方物およびその使用方法 |
GB0916576D0 (en) * | 2009-09-22 | 2009-10-28 | Malmsten Nils M | Polypeptides and uses thereof |
ES2620421T3 (es) * | 2009-10-30 | 2017-06-28 | Senova Gesellschaft für Biowissenschaft und Technik mbH | Peptidasas acopladas a polímero |
US8742120B2 (en) * | 2009-12-17 | 2014-06-03 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Methods of preparing factor xa inhibitors and salts thereof |
US8530501B2 (en) * | 2009-12-17 | 2013-09-10 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Salts and crystalline forms of a factor Xa inhibitor |
AR079944A1 (es) * | 2010-01-20 | 2012-02-29 | Boehringer Ingelheim Int | Anticuerpo neutralizante de la actividad de un anticoagulante |
JP5730983B2 (ja) | 2010-03-19 | 2015-06-10 | バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドBaxter International Incorp0Rated | Tfpi阻害剤および使用方法 |
AR082804A1 (es) | 2010-09-01 | 2013-01-09 | Portola Pharm Inc | Formas cristalinas de un inhibidor del factor xa |
AR082803A1 (es) * | 2010-09-01 | 2013-01-09 | Portola Pharm Inc | Metodos y formulaciones para el tratamiento de la trombosis con betrixaban y un inhibidor de la glicoproteina p |
CA2824885A1 (en) | 2011-01-19 | 2012-07-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Binding proteins to inhibitors of coagulation factors |
FR2972114B1 (fr) * | 2011-03-01 | 2013-03-15 | Univ Grenoble 1 | Un nouveau leurre moleculaire procoagulant pour le traitement des hemophiles a ou b avec ou sans inhibiteur |
AP2013007046A0 (en) | 2011-03-30 | 2013-08-31 | Boehringer Ingelheim Int | Anticoagulant antidotes |
CA2850603C (en) * | 2011-09-30 | 2021-11-16 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for modulating hemostasis |
PE20141295A1 (es) * | 2011-11-29 | 2014-10-01 | Perosphere Inc | Agentes de reversion anticoagulante |
CN104254603A (zh) | 2012-02-14 | 2014-12-31 | 博尔托拉制药公司 | 用于制备xa因子抑制剂的重组解毒剂的方法 |
WO2013123248A1 (en) | 2012-02-16 | 2013-08-22 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | MODULATION OF FACTOR Xa INHIBITOR MEDIATED BLOOD LOSS BY PARTIAL AND TRANSIENT ADMINISTRATION OF ANTIDOTE |
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CN104379594B (zh) * | 2012-06-14 | 2017-06-23 | 博尔托拉制药公司 | 用于纯化重组因子Xa衍生物的方法 |
MX365612B (es) | 2012-07-25 | 2019-06-07 | Catalyst Biosciences Inc | Polipeptidos de factor x modificados y usos de los mismos. |
US9200268B2 (en) | 2012-12-27 | 2015-12-01 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for purification of serine proteases |
FR3000895B1 (fr) * | 2013-01-11 | 2017-02-24 | Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Sa | Utilisation d'antidotes d'inhibiteurs de la coagulation indiques dans la prevention ou le traitement de pathologies thromboemboliques |
SG10201705189XA (en) * | 2013-01-24 | 2017-07-28 | Portola Pharm Inc | INHIBITION OF TISSUE FACTOR PATHWAY INHIBITOR WITH FACTOR Xa DERIVATIVES |
AU2014210830A1 (en) | 2013-01-31 | 2015-07-16 | Pfizer Inc. | Compositions and methods for counteracting Factor Xa inhibition |
FR3007410B1 (fr) * | 2013-06-21 | 2016-05-27 | Lab Francais Du Fractionnement | Facteur x depourvu de domaine gla |
WO2015044836A1 (en) * | 2013-09-24 | 2015-04-02 | Pfizer Inc. | Compositions comprising heterogeneous populations of recombinant human clotting factor xa proteins |
WO2015066606A2 (en) * | 2013-11-01 | 2015-05-07 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for increasing the half-life of factor xa |
BR112016027649A2 (pt) | 2014-05-26 | 2017-08-15 | Academisch Ziekenhuis Leiden | Proteínas prohemostáticas para o tratamento de hemorragia |
WO2016019145A1 (en) * | 2014-07-31 | 2016-02-04 | Haemonetics Corporation | Detection and classification of an anticoagulant using a clotting assay |
US10676731B2 (en) | 2014-08-19 | 2020-06-09 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for modulating factor IX function |
KR102482517B1 (ko) | 2014-08-20 | 2022-12-28 | 포톨라 파마슈티컬스, 인코포레이티드 | 인자 xa 해독제용 동결건조된 제형 |
CN105030703B (zh) * | 2015-06-23 | 2018-03-23 | 上海旭东海普药业有限公司 | 一种防治疗栓塞性疾病的利伐沙班片及其制备方法 |
US9849125B1 (en) | 2015-11-03 | 2017-12-26 | Banner Lifie Sciences LLC | Anti-overingestion dosage forms |
US20190046450A1 (en) * | 2016-02-24 | 2019-02-14 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Lyophilized formulations for factor xa antidote |
US10859562B2 (en) | 2016-02-29 | 2020-12-08 | Iridia, Inc. | Methods, compositions, and devices for information storage |
US10438662B2 (en) | 2016-02-29 | 2019-10-08 | Iridia, Inc. | Methods, compositions, and devices for information storage |
US10640822B2 (en) | 2016-02-29 | 2020-05-05 | Iridia, Inc. | Systems and methods for writing, reading, and controlling data stored in a polymer |
MX2018010388A (es) * | 2016-02-29 | 2019-03-06 | Iridia Inc | Metodos, composiciones y dispositivos para el almacenamiento de informacion. |
TW201802121A (zh) | 2016-05-25 | 2018-01-16 | 諾華公司 | 抗因子XI/XIa抗體之逆轉結合劑及其用途 |
IL263591B2 (en) * | 2016-06-17 | 2023-03-01 | Portola Pharm Inc | Preparation of xa factor history |
WO2018115235A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antidotes to anti-coagulant drugs allowing diagnosis and treatment |
EP3559047A1 (en) | 2016-12-23 | 2019-10-30 | Novartis AG | Factor xi antibodies and methods of use |
US10335375B2 (en) | 2017-05-30 | 2019-07-02 | Patheon Softgels, Inc. | Anti-overingestion abuse deterrent compositions |
CN111246821A (zh) * | 2017-08-21 | 2020-06-05 | 美国绿阳生物技术及医药公司 | 光吸收组合物和使用方法 |
US11787874B2 (en) | 2017-11-15 | 2023-10-17 | Novo Nordisk A/S | Factor X binders enhancing FX activation |
EP3810187A4 (en) * | 2018-06-19 | 2022-08-31 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | ANTIDOTES FOR FACTOR XA INHIBITORS |
US20210299059A1 (en) * | 2018-08-14 | 2021-09-30 | Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. | Injectable pharmaceutical composition and preparation method therefor |
US11655465B1 (en) | 2019-05-02 | 2023-05-23 | Iridia, Inc. | Enzymes and systems for synthesizing DNA |
JP2022543302A (ja) * | 2019-08-08 | 2022-10-11 | アレクシオン ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 第xa因子及び誘導体を調製するための組成物及び方法 |
US11837302B1 (en) | 2020-08-07 | 2023-12-05 | Iridia, Inc. | Systems and methods for writing and reading data stored in a polymer using nano-channels |
CN113484386B (zh) * | 2021-05-21 | 2024-02-13 | 郑州轻工业大学 | 一种金属聚酞菁纳米材料的制备方法及其应用,适配体传感器及其制备方法 |
CN114681597A (zh) * | 2022-03-11 | 2022-07-01 | 兆科药业(合肥)有限公司 | 蝰蛇蛇毒血凝酶在制备用于逆转凝血因子Xa抑制剂的抗凝作用的药物中的应用 |
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Family Cites Families (96)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CH596313A5 (pt) * | 1975-05-30 | 1978-03-15 | Battelle Memorial Institute | |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4754065A (en) | 1984-12-18 | 1988-06-28 | Cetus Corporation | Precursor to nucleic acid probe |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
CH0229046H1 (de) | 1985-03-30 | 1998-07-15 | Stuart Alan Kauffman | Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptinique. des or proteins by means of a dna recombinant tech |
US5837249A (en) | 1985-04-19 | 1998-11-17 | The Wistar Institute | Method for generating an immunogenic T cell response protective against a virus |
US4818700A (en) | 1985-10-25 | 1989-04-04 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof |
US5618920A (en) | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
US4812405A (en) | 1986-02-18 | 1989-03-14 | Phillips Petroleum Company | Double auxotrophic mutants of Pichia pastoris and methods for preparation |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
US4704692A (en) | 1986-09-02 | 1987-11-03 | Ladner Robert C | Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides |
US5763192A (en) | 1986-11-20 | 1998-06-09 | Ixsys, Incorporated | Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique |
EP0832981A1 (en) | 1987-02-17 | 1998-04-01 | Pharming B.V. | DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion |
US5202231A (en) | 1987-04-01 | 1993-04-13 | Drmanac Radoje T | Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes |
US6270961B1 (en) | 1987-04-01 | 2001-08-07 | Hyseq, Inc. | Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification |
US5229490A (en) | 1987-05-06 | 1993-07-20 | The Rockefeller University | Multiple antigen peptide system |
US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
US4929555A (en) | 1987-10-19 | 1990-05-29 | Phillips Petroleum Company | Pichia transformation |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
US5120537A (en) * | 1989-06-14 | 1992-06-09 | Oklahoma Medical Research Foundation | Factor xa based anticoagulant compositions |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
US6075181A (en) | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
US5686073A (en) | 1990-05-23 | 1997-11-11 | The University Of Iowa Research Foundation | Polyclonal and monoclonal antibodies against a 43 KDA dystrophin associated protein |
EP0542810A1 (en) | 1990-08-02 | 1993-05-26 | B.R. Centre Limited | Methods for the production of proteins with a desired function |
US5583107A (en) * | 1990-09-04 | 1996-12-10 | Cor Therapeutics, Inc. | Agents affecting thrombosis and hemostasis |
US5597799A (en) | 1990-09-04 | 1997-01-28 | Cor Therapeutics, Inc. | Recombinant agents affecting thrombosis |
US5278144A (en) * | 1990-09-04 | 1994-01-11 | Cor Therapeutics, Inc. | Antithrombosis agents |
AU1570292A (en) | 1991-02-07 | 1992-09-07 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois, The | Conformationally restricted mimetics of beta turns and beta bulges and peptides containing the same |
DE69233482T2 (de) | 1991-05-17 | 2006-01-12 | Merck & Co., Inc. | Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen |
US6797492B2 (en) | 1991-05-17 | 2004-09-28 | Merck & Co., Inc. | Method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains |
AU679429B2 (en) | 1991-09-13 | 1997-07-03 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Immunoreactive hepatitis C virus polypeptide compositions |
WO1993009804A1 (en) | 1991-11-18 | 1993-05-27 | The Scripps Research Institute | Serine protease derived-polypeptides and anti-peptide antibodies, systems and therapeutic methods for inhibiting coagulation |
ATE297465T1 (de) | 1991-11-25 | 2005-06-15 | Enzon Inc | Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen |
ES2202310T3 (es) | 1991-12-13 | 2004-04-01 | Xoma Corporation | Metodos y materiales para la preparacion de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapeuticos. |
DE4203965A1 (de) | 1992-02-11 | 1993-08-12 | Max Planck Gesellschaft | Antidot fuer hirudin und synthetische thrombininhibitoren |
WO1993018782A1 (en) | 1992-03-20 | 1993-09-30 | Cor Therapeutics, Inc. | Glycosylation-mediated inhibition of factor x |
JP3532566B2 (ja) | 1993-06-24 | 2004-05-31 | エル. グラハム,フランク | 遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター |
US5858659A (en) | 1995-11-29 | 1999-01-12 | Affymetrix, Inc. | Polymorphism detection |
ATE437232T1 (de) | 1993-10-25 | 2009-08-15 | Canji Inc | Rekombinanter adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung |
US5455338A (en) | 1993-11-05 | 1995-10-03 | Zymogenetics, Inc. | DNA encoding novel human kunitz-type inhibitors and methods relating thereto |
US5952172A (en) | 1993-12-10 | 1999-09-14 | California Institute Of Technology | Nucleic acid mediated electron transfer |
US5827690A (en) | 1993-12-20 | 1998-10-27 | Genzyme Transgenics Corporatiion | Transgenic production of antibodies in milk |
US7252989B1 (en) | 1994-04-04 | 2007-08-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Adenovirus supervector system |
DE4430205A1 (de) * | 1994-08-26 | 1996-02-29 | Behringwerke Ag | Zusammensetzungen, die als Gegenmittel für Blut-Antikoagulanzien geeignet sind und deren Verwendung |
US5589571A (en) | 1994-10-28 | 1996-12-31 | Cor Therapeutics, Inc. | Process for production of inhibited forms of activated blood factors |
AT404357B (de) | 1995-06-13 | 1998-11-25 | Immuno Ag | Prothrombin-derivate |
US5968740A (en) | 1995-07-24 | 1999-10-19 | Affymetrix, Inc. | Method of Identifying a Base in a Nucleic Acid |
US5955349A (en) | 1996-08-26 | 1999-09-21 | Zymogenetics, Inc. | Compositions and methods for producing heterologous polypeptides in Pichia methanolica |
DE19605126A1 (de) | 1996-02-12 | 1997-08-14 | Basf Ag | Thrombinmuteine als Antidot für Thrombininhibitoren |
US5714352A (en) | 1996-03-20 | 1998-02-03 | Xenotech Incorporated | Directed switch-mediated DNA recombination |
US6200955B1 (en) | 1996-06-11 | 2001-03-13 | Commonwealth Biotechnologies, Inc. | Heparin binding peptides |
US5736383A (en) | 1996-08-26 | 1998-04-07 | Zymogenetics, Inc. | Preparation of Pichia methanolica auxotrophic mutants |
US6709659B1 (en) | 1996-08-02 | 2004-03-23 | Zymogenetics, Inc. | Antibodies that bind testis-specific insulin homolog polypeptides |
SE9604744D0 (sv) | 1996-12-20 | 1996-12-20 | Pharmacia & Upjohn Ab | A modified coagulation agent |
AT405516B (de) | 1997-02-27 | 1999-09-27 | Immuno Ag | Faktor x-analoge mit modifizierter proteasespaltstelle |
AT405517B (de) * | 1997-02-27 | 1999-09-27 | Immuno Ag | Faktor x-deletionsmutanten und analoge davon |
AU6673898A (en) * | 1997-03-07 | 1998-09-22 | Washington University | Factor x variant |
JPH1149800A (ja) | 1997-06-05 | 1999-02-23 | Fujimori Kogyo Kk | アンヒドロトロンビンの合成方法 |
PT1071700E (pt) | 1998-04-20 | 2010-04-23 | Glycart Biotechnology Ag | Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos |
US6322788B1 (en) | 1998-08-20 | 2001-11-27 | Stanley Arthur Kim | Anti-bacterial antibodies and methods of use |
ES2301254T3 (es) | 1998-11-18 | 2008-06-16 | Genentech, Inc. | Variantes de anticuerpos con una afinidad de union mayor en comparacion con los anticuerpos parentales. |
WO2000054787A1 (en) | 1999-03-16 | 2000-09-21 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Enhanced gamma-carboxylation of recombinant vitamin k-dependent clotting factors |
US6624141B1 (en) | 1999-03-17 | 2003-09-23 | The Regents Of The University Of Michigan | Protamine fragment compositions and methods of use |
US6258559B1 (en) | 1999-03-22 | 2001-07-10 | Zymogenetics, Inc. | Method for producing proteins in transformed Pichia |
US6939545B2 (en) | 1999-04-28 | 2005-09-06 | Genetics Institute, Llc | Composition and method for treating inflammatory disorders |
US6858599B2 (en) | 1999-06-30 | 2005-02-22 | Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. | Tricyclic compound having spiro union |
AT411997B (de) * | 1999-09-14 | 2004-08-26 | Baxter Ag | Faktor ix/faktor ixa aktivierende antikörper und antikörper-derivate |
EP1095933A1 (en) | 1999-10-30 | 2001-05-02 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Novel N-guanidinoalkylamides, their preparation, their use, and pharmaceutical preparations comprising them |
WO2001064642A2 (en) | 2000-02-29 | 2001-09-07 | Cor Therapeutics, Inc. | Benzamides and related inhibitors of factor xa |
US6852761B2 (en) | 2000-03-13 | 2005-02-08 | Pharmacia Corporation | Polycyclic aryl and heteroaryl substituted benzenes useful for selective inhibition of the coagulation cascade |
EP2298789B1 (en) | 2000-09-08 | 2012-03-14 | Schering Corporation | Mammalian genes; related reagents and methods |
US7070740B1 (en) | 2000-09-28 | 2006-07-04 | Beckman Coulter, Inc. | Method and apparatus for processing biomolecule arrays |
US20030064414A1 (en) | 2001-03-30 | 2003-04-03 | Benecky Michael J. | Rapid assessment of coagulation activity in whole blood |
US7138506B2 (en) | 2001-05-09 | 2006-11-21 | Genetic Id, Na, Inc. | Universal microarray system |
US6989267B2 (en) | 2001-07-02 | 2006-01-24 | Agilent Technologies, Inc. | Methods of making microarrays with substrate surfaces having covalently bound polyelectrolyte films |
DE10155075A1 (de) * | 2001-11-09 | 2003-05-22 | Merck Patent Gmbh | Cyclische Sulfonamide |
US6861236B2 (en) | 2002-05-24 | 2005-03-01 | Applied Nanosystems B.V. | Export and modification of (poly)peptides in the lantibiotic way |
CN1480466A (zh) * | 2002-09-03 | 2004-03-10 | �й������ž�����ҽѧ��ѧԺ����ҽ | 一类溶栓抗凝双功能融合蛋白及应用 |
US20040198660A1 (en) | 2002-11-06 | 2004-10-07 | Petersen Lars Christian | Tissue factor antagonist and protein C polypeptide compositions |
US7247654B2 (en) | 2003-06-04 | 2007-07-24 | Bristol-Myers Squibb Company | 3,4-disubstituted benzamidines and benzylamines, and analogues thereof, useful as serine protease inhibitors |
WO2005088310A2 (en) | 2004-03-05 | 2005-09-22 | The Scripps Research Institute | High throughput glycan microarrays |
JP4441336B2 (ja) | 2004-06-11 | 2010-03-31 | 日本碍子株式会社 | マイクロアレイの製造方法 |
US9223929B2 (en) | 2005-03-14 | 2015-12-29 | The California Institute Of Technology | Method and apparatus for detection, identification and quantification of single-and multi-analytes in affinity-based sensor arrays |
US7119179B1 (en) | 2005-03-21 | 2006-10-10 | Los Alamos National Security, Llc | Preparation of high nitrogen compound and materials therefrom |
WO2006102687A1 (en) | 2005-03-22 | 2006-09-28 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | A liposome-based microarray and methods of use thereof |
JP5227178B2 (ja) | 2005-11-08 | 2013-07-03 | ミレニアム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | N−(5−クロロ−2−ピリジニル)−2−[[4−[(ジメチルアミノ)イミノメチル]ベンゾイル]アミノ]−5−メトキシ−ベンズアミド、第Xa因子阻害剤の薬学的な塩および多形体 |
US20070111322A1 (en) | 2005-11-15 | 2007-05-17 | Lin-Cheng Yang | Novel method of using inject printing for creating microarrays |
MX2008006313A (es) | 2005-11-15 | 2008-11-06 | Philadelphia Children Hospital | Metodos y composiciones para modular la hemostasia. |
EP1820508A1 (en) | 2006-02-21 | 2007-08-22 | CSL Behring GmbH | Coagulation factor X polypeptides with modified activation properties |
EP3824902A1 (en) * | 2007-09-28 | 2021-05-26 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
CN102316893B (zh) | 2008-11-14 | 2015-02-18 | 博尔托拉制药公司 | 因子Xa抑制剂的解毒剂及其与血液凝固剂组合使用的方法 |
CN104262479A (zh) | 2008-12-19 | 2015-01-07 | 国家健康与医学研究院 | 丝氨酸蛋白酶衍生物及其在凝血功能障碍的预防或治疗中的用途 |
EP2414517B1 (en) * | 2009-03-30 | 2016-09-21 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
JP6163304B2 (ja) * | 2009-07-15 | 2017-07-12 | ポートラ ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 第Xa因子インヒビターの解毒剤の単位用量処方物およびその使用方法 |
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