ES2620421T3 - Peptidasas acopladas a polímero - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la detección o la determinación cuantitativa de un inhibidor de una peptidasa del sistema hemostático en una muestra, siendo la peptidasa del sistema hemostático un factor de coagulación, seleccionado del grupo que consiste en factor IIa (trombina), VIIa, IXa, Xa, XIa así como fragmentos y mutantes de las peptidasas mencionadas, que muestran al menos el 80 % de la capacidad de las peptidasas mencionadas de convertir enzimáticamente sus sustratos del sistema de coagulación, y la muestra se selecciona de sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, orina, sudor u otro fluido, que comprende la puesta en contacto del inhibidor en la muestra con la peptidasa acoplada a un polímero del sistema hemostático, y el polímero es un polialquilenglicol o un copolímero, que comprende unidades de alquilenglicol, y en el que la peptidasa del sistema hemostático, por el acoplamiento a polímero, pierde su capacidad de reacción en el sistema de coagulación, pero, al mismo tiempo puede neutralizar aún inhibidores del sistema de coagulación con una masa molecular de entre 100 y 2.500 Da y puede convertir enzimáticamente sustratos del sistema de coagulación con una masa molecular de entre 100 y 2.500 Da, y o bien (i) la medición de la actividad de la peptidasa acoplada a polímero tras su puesta en contacto con el inhibidor en la muestra, y la comparación de la actividad de la peptidasa acoplada tras la puesta en contacto con la muestra con uno o varios valores de referencia, para establecer una eventual inhibición de la actividad; o (ii) la medición del tiempo de coagulación de la muestra tras la puesta en contacto con la peptidasa acoplada, y la comparación del tiempo de coagulación con uno o varios valores de referencia, para establecer una eventual variación del tiempo de coagulación.
Description
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DESCRIPCION
Peptidasas acopladas a poKmero
Las peptidasas (tambien denominadas como proteinasas o proteasas) son enzimas, que catalizan la escision de enlaces peptidicos en peptidos o protemas. En la forma de las endopeptidasas prefieren como componente de reaccion enlaces peptfdicos dentro de la molecula objetivo, en los que participan en la mayona de los casos determinados aminoacidos. Otras peptidasas escinden desde el extremo N o C terminal de la protema aminoacidos individuales o varios aminoacidos. A este respecto, las distintas endopeptidasas, en funcion de su estructura terciaria, pueden con frecuencia reaccionar con distintos componentes de reaccion fisiologicos o no fisiologicos, que contienen distintos enlaces peptfdicos espedficos, de diferente tamano molecular.
Las peptidasas tienen funciones importantes en el organismo y participan en multiples procesos tales como, por ejemplo, en la digestion de protemas, la respuesta inmunitaria (sistema del complemento), la coagulacion sangumea y la fibrinolisis en sus desarrollos fisiologicos pero tambien patologicos.
En algunos casos, las endopeptidasas activadas forman para ello tambien aun complejos macromoleculares con cofactores, asf por ejemplo el factor de coagulacion activado Xa con factor Va en el complejo protrombinasa.
Para determinados procedimientos de diagnostico, pero tambien procedimientos terapeuticos, es sin embargo desventajoso este espectro de componentes de reaccion para un uso dirigido, espedfico de enzimas de este tipo.
El proceso de la coagulacion sangumea es un proceso de varias etapas muy complejo, en el que se activan precursores enzimaticos inactivos mediante acciones enzimaticas con la accion conjunta de cofactores para dar enzimas de coagulacion activas.
Para balancear el equilibrio entre la disposicion de coagulacion de la sangre y garantizar sus propiedades de flujo en la circulacion, existe ademas un sistema integrado de interacciones de accion inhibidora o de refuerzo con moleculas adicionales, que se controla por numerosos mecanismos de retroacoplamiento positivo y negativo.
Para el tratamiento de trastornos del sistema de coagulacion sangumea se desarrollaron y se desarrollan nuevas clases de farmacos que inhiben de manera completamente dirigida solamente una unica enzima de la cascada de coagulacion, tal como por ejemplo el factor Xa activado (clase de principio activo de las sustancias inhibidoras de factor Xa de accion directa por ejemplo Rivaroxaban®, Apixaban®, Betrixaban®, Otamixaban®, Edoxaban®, Eribaxaban, YM150, LY-517717, PRT054021 entre otros) o la trombina (clase de principios activos de las sustancias inhibidoras de trombina de accion directa, por ejemplo Dabigatran®, argatroban, bivalirudina, MCC-977, AZD0837, NU172, flovagatran, entre otros).
Para garantizar una terapia efectiva (prevencion de trombosis) y segura (prevencion de hemorragias) con farmacos de este tipo es importante tanto la disponibilidad de metodos de deteccion exactos correspondientes del principio activo en fluidos corporales como tambien la posibilidad de poder neutralizar o eliminar estos farmacos.
Para poder medir de manera dirigida farmacos que inhiben de manera espedfica enzimas del sistema hemostatico, o para poder neutralizarlas in vitro o in vivo, sena ventajoso poder modificar o limitar el espectro de posibilidades de reaccion de las enzimas respectivas.
De manera correspondiente, para el desarrollo de antfdotos contra sustancias inhibidoras de factor Xa y trombina, se han conocido modificaciones de la estructura molecular de trombina y factor Xa, a traves de las que estas peptidasas pierden su funcionalidad y capacidad de interaccion en el sistema de coagulacion, pero aun pueden interaccionar con los principios activos inhibidores espedficos. Las peptidasas modificadas de este modo se emplearan para la neutralizacion del principio activo. Se designa neutralizacion a este respecto una union de la molecula de principio activo a la peptidasa, que lleva a que la molecula de principio activo ya no pueda ejercer su funcion como inhibidor del sistema hemostatico. Esto se consigue mediante la eliminacion de aminoacidos especiales y/o mediante su cambio. Para ello se divulgan procedimientos costosos, entre otros, en el documento US 6 060 300 (Thrombin muteins as antidotes for thrombin inhibitors) y en el documento WO 2009/041962 (Antidotes for Factor Xa inhibitors and methods of using the same). El documento US 2009/0098119A1 describe ademas que la vida media, en sf corta, de los mutantes de factor Xa, puede prolongarse mediante una reaccion con polietilenglicol, pero no que mediante esta modificacion cambian otras propiedades de la molecula de factor Xa mutada.
Era objetivo de la presente invencion proporcionar procedimientos para la deteccion o determinacion cuantitativa de un inhibidor de una peptidasa del sistema hemostatico en una muestra.
Ademas, era objetivo de la presente invencion proporcionar procedimientos in vitro para la neutralizacion de la actividad inhibidora de un inhibidor de una peptidasa del sistema hemostatico.
Se divulga modificar de manera sencilla la especificidad de las peptidasas del sistema hemostatico, tales como por ejemplo las peptidasas del sistema de coagulacion, en particular para poder emplear las peptidasas modificadas de este modo para la deteccion o para la neutralizacion de farmacos que actuan como sustancias inhibidoras sobre las peptidasas del sistema de coagulacion. Se divulga la provision de peptidasas modificadas que pueden reaccionar con
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los inhibidores y sustratos que van a detectarse o neutralizarse, pero pierden esencialmente su capacidad de reaccion en el sistema de coagulacion.
Se comprobo sorprendentemente que las peptidasas del sistema hemostatico o del sistema de coagulacion, tales como factor Xa o trombina, tras el acoplamiento a uno o varios polfmeros, en particular polialquilenglicoles y copolfmeros, que comprenden unidades de alquilenglicol, pierden su capacidad de reaccion en el sistema de coagulacion, pero, al mismo tiempo, pueden reaccionar aun con inhibidores y sustratos de menor tamano molecular. Las peptidasas modificadas de este modo del sistema hemostatico se denominan en adelante, para simplificar, tambien "peptidasas acopladas a polfmero".
La peptidasa, que se acopla en este caso con uno o varios polfmeros, es una peptidasa del sistema hemostatico, en particular del sistema hemostatico de un mairnfero, tal como el ser humano. Esta puede obtenerse de diferente manera, e incluye tanto peptidasas recombinantes como peptidasas obtenidas a partir de organismos, en particular de sangre, asf como sus fragmentos o mutantes. Los mutantes de las peptidasas se diferencias de las peptidasas nativas correspondientes porque, uno o mas, preferentemente de 1 a l0 restos de aminoacido estan delecionados o insertados o cambiados por, en cada caso, un resto de aminoacido. Pueden proporcionarse mediante procedimientos conocidos, tales como, por ejemplo, procedimientos sinteticos o mutagenesis dirigida al sitio. Idealmente, los fragmentos y mutantes de las peptidasas mencionadas en este caso muestran al menos el 80 %, mas preferentemente el 90 % de la actividad biologica y en particular la misma actividad biologica que la peptidasa nativa correspondiente, pudiendo determinarse la actividad con procedimientos conocidos en la especialidad. Es decir, el fragmento o los mutantes correspondientes, cuando no estan acoplados a un polfmero, tiene preferentemente el mismo efecto fisiologico e interacciona con las mismas sustancias con el mismo efecto biologico que la peptidasa nativa correspondiente.
Preferentemente, en el caso de la peptidasa del sistema hemostatico se trata de un factor de coagulacion en su forma activada. Se divulga un factor de coagulacion seleccionado de factor IIa (trombina), Vila, IXa, Xa y XIa. Se prefieren especialmente trombina y factor Xa. Asf mismo, se prefiere el uso de una forma nativa de las proteinasas para el acoplamiento a uno o varios polfmeros.
Los polfmeros que van a acoplarse en este caso a peptidasas de este tipo son compuestos qmmicos de cadenas moleculares y/o moleculas ramificadas que se componen preferentemente de unidades iguales o similares. A estos pertenecen polfmeros sinteticos, tales como por ejemplo polialquilenglicoles o tambien biopolfmeros, tales como por ejemplo moleculas con unidades de hidrato de carbono o secuencias de aminoacidos repetitivas que puede derivatizarse, dado el caso, mediante sustitucion. Ejemplos son dextrano o hidroxietilalmidon. En la industria farmaceutica se acoplan algunos de estos polfmeros a principios activos, para, de esta manera prolongar su vida media en el organismo. Procedimientos de este tipo son, por ejemplo la PEGilacion, HESilacion y PASilacion.
El polfmero, que se acopla en este caso a una peptidasa del sistema hemostatico, tiene habitualmente una masa molecular media (promedio en peso) de al menos 1.000 Da, preferentemente al menos 2000 Da y en particular al menos 5.000 Da. Ademas, la masa molecular asciende habitualmente a como maximo 60.000, preferentemente como maximo 40.000 Da y en particular como maximo 20.000 Da.
El polfmero puede ser ramificado o lineal, se prefieren los polfmeros lineales.
Se divulga, para el polfmero de la peptidasa acoplada a polfmero tambien un polialquilenglicol o un copolfmero que comprende unidades de alquilenglicol. La parte de alquileno de las unidades de alquilenglicol del polialquilenglicol o del copolfmero comprende preferentemente de 1 a 6, de manera especialmente preferente 2 o 3 atomos de C. Los copolfmeros contienen preferentemente por lo menos el 50 % en moles, de manera especialmente preferente al menos el 70 % en moles y en particular al menos el 90 % en moles, con respecto a la cantidad total de las unidades de repeticion en el copolfmero, de unidades de repeticion de formula -Alk-O-, en el que "Alk" representa un grupo alquileno tal como se definio anteriormente.
De manera especialmente preferente, en el caso del polfmero se trata de un polietilenglicol (tambien denominado PEG) o un copolfmero que comprende unidades de etilenglicol. Los copolfmeros contienen preferentemente por lo menos el 50 % en moles, de manera especialmente preferente al menos el 70 % en moles y en particular al menos el 90 % en moles, con respecto a la cantidad total de las unidades de repeticion, de unidades de repeticion de formula -CH2-CH2-O-.
En una forma de realizacion de especialmente preferida, en el caso de la peptidasa, se trata del factor de coagulacion Xa y en el caso del polfmero, se trata de polietilenglicol con una masa molecular media (promedio en peso) de habitualmente al menos 1.000 Da, preferentemente al menos 2000 Da y en particular al menos 5.000 Da. Ademas, la masa molecular media asciende habitualmente como maximo a 60.000, preferentemente como maximo 40.000 Da y en particular como maximo 20.000 Da. En una forma de realizacion especialmente preferida adicional, en el caso de la peptidasa, se trata del factor de coagulacion trombina y en el caso del polfmero, se trata de polietilenglicol con una masa molecular (promedio en peso) de habitualmente al menos 1.000 Da, preferentemente al menos 2000 Da y en particular al menos 5.000 Da. Ademas, la masa molecular media asciende habitualmente como maximo a 60.000, preferentemente como maximo 40.000 Da y en particular como maximo 20.000 Da.
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El acoplamiento del poKmero a la peptidasa tiene lugar preferentemente mediante un enlace covalente que puede generarse con procedimientos qmmicos convencionales. Por regla general, el polfmero se activa con ello en un extremo terminal para poder reaccionar con un grupo funcional de la peptidasa. En el caso de un polialquilenglicol, pueden usarse a este respecto derivados reactivos conocidos, tales como, por ejemplo, succinimidilsuccinato, succinimidilpropionato, nitrofenilcarbonato, tresilato, epoxidos, aldehndos, isocianatos, maleimidas y similares (Veronese FM, Pasut G: PEGylation, successful approach to drug delivery. DDT 2005; 10:1451-1458). Una molecula de peptidasa puede acoplarse a una o varias moleculas de polfmero, por ejemplo de 1 a 10 moleculas de polfmero. La relacion molar de peptidasa/polfmero se controla mediante las cantidades empleadas en la reaccion de acoplamiento.
Se comprobo que mediante el acoplamiento de la peptidasa con el polfmero se modifica la especificidad, es decir, en particular la especificidad de sustrato de la peptidasa, de modo que la peptidasa pierde su capacidad de reaccion en el sistema hemostatico o la capacidad de reaccion esta significativamente limitada. En particular pierde su capacidad de reaccion con receptores fisiologicos macromoleculares, sustratos macromoleculares, cofactores macromoleculares e inhibidores macromoleculares. En el caso de los receptores fisiologicos macromoleculares, sustratos macromoleculares, cofactores macromoleculares e inhibidores macromoleculares se trata con frecuencia de protemas y polipeptidos. En este contexto, la perdida o la limitacion significativa de la capacidad de reaccion en el sistema hemostatico significa, por ejemplo, que la peptidasa ya no puede, o solo aun en un grado mmimo, cumplir su funcion fisiologica y/o convertir los sustratos macromoleculares mencionados. Esto puede mostrarse, por ejemplo para factores de coagulacion acoplados a polfmero porque estos, en un plasma comercialmente disponible con deficiencia en el factor de coagulacion correspondiente (por ejemplo abnormal plasma, American Diagnostica Inc.), o influyen en el tiempo de protrombina prolongado mediante esta deficiencia en el factor del plasma con deficiencia, mientras que la adicion de una peptidasa no modificada del sistema de coagulacion, lleva a un acortamiento hasta una normalizacion del tiempo de protrombina del plasma. Tambien con ayuda de ensayos de coagulacion conocidos en la especialidad puede comprobarse que las peptidasas acopladas a polfmero no provocan reduccion alguna del tiempo de coagulacion como signo de un efecto de coagulacion en muestras de plasma.
Por ejemplo, mediante el acoplamiento a polfmero puede suprimirse o limitarse significativamente la capacidad de reaccion de una peptidasa con sustancias macromoleculares del sistema hemostatico con una masa molecular de
30.000 Da y superior.
De esta manera, mediante el acoplamiento a polfmero, no se pierde solamente la capacidad de la peptidasa de reaccionar de manera activante con componentes de reaccion de la cascada de coagulacion, sino que, asf mismo, ya no pueden inhibirse por inhibidores fisiologicos, tales como por ejemplo antitrombina con una masa molecular de
58.000 Da (en particular para PEG-Xa, PEG-IIa) o inhibidor de la ruta de factor tisular con una masa molecular de
39.000 Da (en particular para factor Xa).
Por el contrario, mediante el acoplamiento con el polfmero, no se perjudica la capacidad de la peptidasa de reaccionar con sustratos de bajo peso molecular o inhibidores de bajo peso molecular de la peptidasa del sistema hemostatico. La reaccion con un inhibidor de la peptidasa lleva, en este contexto, a una inhibicion de la actividad de la peptidasa acoplada a polfmero. En funcion de la relacion de concentracion entre peptidasa e inhibidor, puede tratarse a este respecto de una inhibicion parcial o completa. A este respecto, el termino de la actividad de la peptidasa acoplada a polfmero designa, en particular su capacidad de convertir enzimaticamente sustratos. Dado que, tal como se describio anteriormente, la capacidad de reaccion de la peptidasa con sustratos macromoleculares ya no se da por el acoplamiento con el polfmero, se trata por regla general de la capacidad de convertir enzimaticamente sustratos de bajo peso molecular. Se divulga un sustrato que presenta una masa molecular de al menos 100 Da y como maximo
10.000 Da. Se divulga asf mismo que la masa molecular del sustrato asciende como maximo a 7.500 Da, en particular como maximo 5.000 Da o como maximo 2.500 Da.
Los inhibidores de peptidasas del sistema hemostatico que, en el contexto de la invencion muestran efecto tambien como inhibidores de las peptidasas acopladas a polfmero, son habitualmente inhibidores de interaccion directa o de union directa o sustancias inhibidoras de la coagulacion de union directa, en particular aquellos, que se emplean como farmacos para este fin.
Por regla general, en el caso de los inhibidores del sistema hemostatico, que reaccionan con las peptidasas acopladas a polfmero o se neutralizan por las mismas, se trata de inhibidores de bajo peso molecular. Se divulga un inhibidor que presenta una masa molecular de al menos 100 Da y como maximo 10.000 Da. Se divulga asf mismo que la masa molecular del inhibidor asciende como maximo a 7.500 Da, en particular como maximo 5.000 Da o como maximo 2.500 Da. Ejemplos de inhibidores de este tipo son principios activos, seleccionados del grupo de los principios activos de los farmacos para la inhibicion directa del factor de coagulacion Xa tales como rivaroxaban, apixaban, betrixaban, otamixaban, edoxaban, raxazaban, eribaxaban, YM150, LY-517717 o PRT054021 o para la inhibicion directa de trombina, tales como dabigatran, argatroban, flovagatran, AZD0837, MCC-977, NU172 o bivalirudina. Como principios activos para la inhibicion directa o inhibidores directos se designan a este respecto aquellas sustancias que ejercen su actividad inhibidora a traves de una interaccion directa con el factor de coagulacion, es decir, normalmente una union al factor de coagulacion correspondiente.
En una forma de realizacion especialmente preferida para la provision de una peptidasa acoplada a polfmero, tiene lugar un acoplamiento de la peptidasa a PEG se acuerdo con los procedimientos en sf conocidos. En este sentido
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pueden usarse derivados de PEG reactivos tales como ejemplo succinimidilsuccinato, succinimidilpropionato, nitrofenilcarbonato, tresilato, epoxidos, aldehndos, isocianatos, maleimidas y similares (Veronese FM, Pasut G: PEGylation, successful approach to drug delivery. DDT 2005; 10:1451-1458).
El numero de cadenas que van a acoplarse asf como su longitud puede configurarse aleatoriamente y adaptarse para la estructura de enzima respectiva, prefiriendose masas moleculares medias de las cadenas de PEG tal como estan indicadas en general anteriormente. Para eliminar por completo la capacidad de reaccion de peptidasas con constituyentes del sistema de coagulacion, se usan preferentemente para el acoplamiento moleculas de PEG de al menos 5 000 Da.
De esta manera puede acoplarse por ejemplo el factor Xa al PEG de tal manera que el PEG-Xa generado ya no pueda interaccionar con el complejo de protrombinasa (cofactor Va, fosfolfpido) y escindir la proenzima protrombina para dar la trombina activa, la enzima esencial para desencadenar la coagulacion al final de la cascada de coagulacion. PEG-Xa pierde a este respecto asf mismo su capacidad de reaccionar con los inhibidores macromoleculares fisiologicos de factor Xa tales como antitrombina o TFPI (tissue factor pathway inhibitor).
Por el contrario, tras el acoplamiento de PEG al factor Xa se mantiene sorprendentemente la capacidad de reaccion original de factor Xa con las sustancias inhibidoras de bajo peso molecular usadas, entre otros, como principios activos farmaceuticos, al igual que la capacidad de reaccion con sustratos peptfdicos de bajo peso molecular.
Una forma de realizacion de la invencion, en la que se emplean las peptidasas acopladas a polfmero descritas en el presente documento, es un procedimiento para la deteccion o determinacion cuantitativa de un inhibidor de una peptidasa del sistema hemostatico en una muestra, siendo la peptidasa del sistema hemostatico un factor de coagulacion, seleccionado del grupo que consiste en factor IIa (trombina), Vila, IXa, Xa, XIa asf como fragmentos y mutantes de las peptidasas mencionadas, que muestran al menos el 80% de la capacidad de las peptidasas mencionadas de convertir enzimaticamente sus sustratos del sistema de coagulacion y la muestra se selecciona de sangre, plasma, suero, lfquido cefalorraqmdeo, orina, sudor u otro fluido, que comprende la puesta en contacto del inhibidor en la muestra con la peptidasa acoplada a un polfmero del sistema hemostatico, y el polfmero es un polialquilenglicol o un copolfmero, que comprende unidades de alquilenglicol, y en el que la peptidasa del sistema hemostatico, por el acoplamiento a polfmero, pierde su capacidad de reaccion en el sistema de coagulacion, pero, al mismo tiempo puede neutralizar aun inhibidores del sistema de coagulacion con una masa molecular entre 100 y 2.500 Da y puede convertir enzimaticamente sustratos del sistema de coagulacion con una masa molecular entre 100 y
2.500 Da, y o bien
(i) la medicion de la actividad de la peptidasa acoplada a polfmero tras su puesta en contacto con el inhibidor en la muestra, y la comparacion de la actividad de la peptidasa acoplada tras la puesta en contacto con la muestra con uno o varios valores de referencia, para establecer una eventual inhibicion de la actividad; o
(ii) la medicion del tiempo de coagulacion de la muestra tras la puesta en contacto con la peptidasa acoplada, y la comparacion del tiempo de coagulacion con uno o varios valores de referencia, para establecer una eventual variacion del tiempo de coagulacion. Un cambio de este tipo se desencadena mediante una reaccion del inhibidor con la peptidasa acoplada, lo que lleva a una inhibicion de la actividad del inhibidor.
Este procedimiento es adecuado particular para la deteccion o determinacion cuantitativa de un inhibidor de bajo peso molecular. Se divulga a su vez un inhibidor que presenta una masa molecular de al menos 100 Da y como maximo
10.000 Da. Se divulga igualmente que la masa molecular del inhibidor asciende como maximo a 7.500 Da, en particular como maximo 5.000 Da o como maximo 2.500 Da. Ejemplos de inhibidores de este tipo son tal como se menciono anteriormente. Debera estar claro para el experto que habitualmente la peptidasa acoplada a polfmero empleada en el procedimiento debera adaptarse al inhibidor que va a detectarse o que va a determinarse cuantitativamente, es decir, debera seleccionarse una peptidasa que pueda en principio realizar una interaccion con el inhibidor. Para la deteccion o determinacion cuantitativa de un inhibidor de bajo peso molecular en el contexto de la invencion se empleara preferentemente una peptidasa acoplada a polfmero, sobre la que actua el inhibidor como inhibidor directo.
En particular, el procedimiento para la deteccion o determinacion cuantitativa puede comprender las siguientes etapas preliminares:
(a) proporcionar al menos una muestra, en la que estara presente un inhibidor; y
(b) poner en contacto al menos una muestra de (a) con una peptidasa acoplada a polfmero tal como se describe en el presente documento.
A este respecto, puede recurrirse a las muestras obtenidas en la etapa (a), de manera correspondiente al procedimiento (ii), para la deteccion o determinacion cuantitativa del inhibidor no solo como muestra de medicion en la etapa (b), sino tambien como muestras comparativas, por ejemplo para la medicion de un tiempo de coagulacion sin adicion de la peptidasa acoplada a PEG.
La puesta en contacto de la peptidasa acoplada con el inhibidor en el procedimiento de acuerdo con la invencion comprende preferentemente una incubacion de la muestra con la peptidasa acoplada, en particular en la etapa (b), durante la cual puede tener lugar una interaccion de un inhibidor opcionalmente presente en la muestra con la
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peptidasa acoplada.
Se divulga que en el caso de la muestra se trata de una muestra que comprende un Ifquido o que es un Ifquido. Con frecuencia se trata de una muestra biologica, por ejemplo un fluido corporal, tal como sangre, plasma, suero, lfquido cefalorraqmdeo, orina o sudor, preferentemente sangre o plasma. En el caso de la muestra puede tratarse por ejemplo de una muestra para un procedimiento de medicion o de diagnostico.
Segun la opcion (i) del procedimiento mencionado anteriormente, puede generarse por ejemplo un valor de referencia para la comparacion, midiendose la actividad de la peptidasa acoplada a polfmero sin contacto previo con un inhibidor. Una reduccion de la actividad de la peptidasa acoplada, despues de que esta ha reaccionado con un inhibidor en la muestra, en comparacion con un valor de referencia de este tipo, permite por ejemplo la conclusion de que el inhibidor estaba presente en la muestra. Segun la opcion (i) pueden generarse tambien varios valores de referencia para la comparacion, midiendose la actividad de la peptidasa acoplada tras el contacto con diferentes concentraciones conocidas de un inhibidor. Asf, por ejemplo la comparacion con los valores de referencia, permite una determinacion cuantitativa del inhibidor.
La medicion de la actividad de la peptidasa acoplada a polfmero, tanto antes de la puesta en contacto con la muestra para generar uno o varios valores de referencia como despues de la puesta en contacto con la muestra para generar el valor de referencia, da informacion sobre la presencia o la concentracion del inhibidor en la muestra, puede tener lugar de acuerdo con procedimientos convencionales. A este respecto, se determina en particular la capacidad de la peptidasa acoplada a polfmero de convertir enzimaticamente sustratos. Dado que, tal como se describio anteriormente, la capacidad de reaccion de la peptidasa con sustratos macromoleculares ya no se da por el acoplamiento con el polfmero, se trata por regla general de la capacidad de convertir enzimaticamente sustratos de bajo peso molecular. A este respecto se divulga un sustrato que presenta una masa molecular de al menos 100 Da y como maximo 10.000 Da. Se divulga asf mismo que la masa molecular del sustrato asciende como maximo a 7.500 Da, en particular como maximo 5.000 Da o como maximo 2.500 Da. Por ejemplo pueden emplearse sustratos conocidos, de los que la peptidasa puede escindir un grupo de senalizacion, tal como por ejemplo un sustrato cromogenico. Como ejemplos de sustratos cromogenicos comercialmente disponibles adecuados para peptidasas puede mencionarse para el factor Xa N-a-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA (por ejemplo S-2765™, Chromogenix Instrumentation Laboratory, Milan, Italia), y para trombina puede mencionarse H-D-Phe-Pip- Arg-pNA (S-2238™, Chromogenix Instrumentation Laboratory, Milan, Italia), como alternativa pueden usarse por ejemplo tambien sustratos fluorigenicos, luminogenicos o electroqmmicos junto con la tecnica de deteccion correspondiente.
Segun la opcion (ii), el inhibidor puede determinarse en la muestra a traves de la medicion del tiempo de coagulacion. Para ello se encuentran disponibles diferentes posibilidades. Para una deteccion es suficiente por regla general comprobar que el tiempo de coagulacion de una muestra, que se puso en contacto con la peptidasa acoplada a polfmero, se ha reducido con respecto al tiempo de coagulacion de una muestra correspondiente sin contacto con la peptidasa acoplada (valor de referencia) mediante una neutralizacion completa o proporcional del inhibidor.
Para una determinacion cuantitativa puede recurrirse a una comparacion correspondiente de dos muestras o grupos de muestras, de los que en uno se neutralizo el inhibidor mediante adicion de la peptidasa acoplada. El cambio observado del tiempo de coagulacion en las muestras neutralizadas con respecto a las no neutralizadas puede relacionarse a continuacion, por ejemplo, con ayuda de una curva de calibracion con los cambios que se provocan mediante concentraciones conocidas de inhibidores. En una forma de realizacion espedfica de la opcion (ii), mediante la adicion de una cantidad definida de la peptidasa acoplada, puede neutralizarse proporcionalmente el inhibidor contenido en la muestra. Si se anade a esta muestra ahora un activador de coagulacion, tal como por ejemplo tromboplastina, tromboplastina parcial, veneno de serpiente que activa la coagulacion o una proteasa que activa la coagulacion aislada a partir del mismo o un factor de coagulacion activado que, en la cascada de activacion, se encuentra antes de la enzima inhibida, se prolonga el tiempo de coagulacion mediante la concentracion residual del inhibidor en comparacion con una muestra correspondiente sin inhibidor. Si se comparan estos valores con el tiempo de coagulacion que se midio en el mismo material de muestra sin adicion de la peptidasa acoplada asf como con la adicion de concentraciones conocidas de un calibrador adecuado, puede determinarse con el uso de una calibracion adecuada la concentracion del inhibidor excluyendo la influencia de la composicion de la muestra.
Si el material de muestra, debido a su composicion, no puede coagular, puede anadirse, para la medicion de la coagulacion de la opcion (ii) por ejemplo plasma normal como fuente para otros factores de coagulacion o en particular fibrinogeno, mediante lo cual se mejora aun la especificidad del procedimiento.
En el caso del procedimiento de la primera forma de realizacion puede tratarse por ejemplo de un procedimiento de diagnostico in vitro, en particular para la deteccion o para la medicion cuantitativa de un inhibidor de una peptidasa del sistema hemostatico en una muestra biologica, tal como sangre, plasma, suero, lfquido cefalorraqmdeo, orina o sudor. El procedimiento puede emplearse por ejemplo tambien en procedimientos de seleccion en la busqueda de principios activos.
La muestra puede, por ejemplo en el contexto de un procedimiento de diagnostico in vitro, proceder en particular de un mairnfero, tal como por ejemplo un ser humano.
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En una forma de realizacion de especialmente preferida para la deteccion o determinacion cuantitativa de un inhibidor de una peptidasa del sistema hemostatico se permite una deteccion espedfica de farmacos que inhiben la coagulacion, cuyo principio activo es un inhibidor directo del factor Xa, en fluidos corporales tales como sangre, plasma, suero, lfquido cefalorraqmdeo, orina, sudor u otros fluidos. Debido a la especificidad del factor Xa acoplado a polfmero, en particular de factor Xa acoplado a PEG (en adelante tambien "polfmero-Xa" o "PEG- Xa") para inhibidores directos de factor Xa, este procedimiento de acuerdo con la invencion permite una declaracion exacta con respecto a la concentracion de principio activo, sin que el resultado se falsee por la influencia del estado funcional actual del sistema de coagulacion. Asf mismos sin influencia son inhibidores indirectos de factor Xa, que actuan por ejemplo a traves de antitrombina, tales como heparinas no fraccionadas o de bajo peso molecular, Orgaran o pentasacaridos tales como Fondaparinux. Este aspecto es en este sentido una ventaja, dado que con frecuencia los pacientes se cambian de las heparinas a anticoagulantes directos parenterales u orales y, por lo tanto, en un tiempo de transicion, ambas clases de principio activo estan presentes en la sangre. Estas se consideran conjuntamente por lo tanto en los metodos de determinacion hasta el momento en mayor o menor medida.
Para llevar a cabo el procedimiento de acuerdo con la invencion preferido, se mezcla una muestra, por ejemplo plasma, que contiene un inhibidor de factor Xa de accion directa, con una cantidad definida de Xa acoplado a polfmero, en particular PEG-Xa, y se incuba a lo largo de un periodo de tiempo adecuado. El polfmero-Xa o PEG-Xa se une al inhibidor y se inactiva proporcionalmente a este respecto. Entonces se anade un sustrato, del que el polfmero-Xa no activado o PEG-Xa puede escindir un grupo de senalizacion, tal como por ejemplo un sustrato cromogenico.
La actividad residual de polfmero-Xa o PEG-Xa que se correlaciona inversamente con la concentracion del inhibidor escinde el sustrato cromogenico. La formacion de color resultante de esto se mide con un procedimiento adecuado. Mediante el uso de una calibracion correspondiente puede medirse la concentracion del inhibidor en la muestra exactamente y sin influencia de la composicion de la muestra, en particular tambien en presencia de sustancias inhibidoras de accion indirecta, tales como heparinas. Ademas de sustratos cromogenicos en particular de bajo peso molecular pueden usarse por ejemplo tambien sustratos fluorigenicos, luminogenicos o electroqmmicos de bajo peso molecular junto con la tecnica de deteccion correspondiente.
El fundamento del procedimiento para la modificacion de la especificidad de peptidasas del sistema hemostatico mediante acoplamiento a polfmeros tales como polietilenglicol, puede mostrarse tambien en el ejemplo de la trombina (a continuacion tambien polfmero-trombina o PEG-trombina). En su forma acoplada a polfmero, en particular mediante acoplamiento con PEG, la trombina pierde su capacidad de interaccionar con constituyentes del sistema de coagulacion y con ello su funcion en el sistema de coagulacion. Ya no puede escindir el fibrinogeno para dar fibrina y por lo tanto desencadenar la coagulacion en una muestra de plasma o sangre. polfmero-trombina, en particular PEG-trombina, no puede reaccionar ni con otros constituyentes del sistema de coagulacion plasmatico y celular ni con inhibidores fisiologicos tales como antitrombina, cofactor de heparina II o a2-macroglobulina.
Por el contrario, en el caso del polfmero-trombina, en particular PEG-trombina, esta conservada la capacidad de reaccion con inhibidores de trombina de bajo peso molecular de accion directa con un peso molecular preferido de al menos 100 Da y como maximo 7.500 Da, al igual que la capacidad de reaccion con sustratos peptfdicos de bajo peso molecular con pesos moleculares correspondientes.
Por consiguiente, puede llevarse a cabo de manera correspondiente al procedimiento de acuerdo con la invencion para la medicion de sustancias inhibidoras de factor Xa por ejemplo tambien un procedimiento para la medicion de sustancias inhibidoras de trombina de bajo peso molecular de accion directa. polfmero-trombina, en particular PEG-trombina, se une en este sentido al inhibidor contenido en la muestra y se activa proporcionalmente de este modo. Su actividad residual, que esta inversamente relacionada con la concentracion del inhibidor en la muestra, se mide con sustratos de bajo peso molecular adecuados, por ejemplo mediante la determinacion de la intensidad de color tras la reaccion con un sustrato cromogenico. Mediante el uso de una calibracion correspondiente puede determinarse la concentracion del inhibidor.
Debido a las propiedades de las peptidasas acopladas a polfmero, en particular acopladas a PEG pueden establecerse tambien procedimientos preferidos para la medicion de la concentracion de sustancias inhibidoras de accion directa de factor Xa y trombina, que como se describio anteriormente, se basan en una medicion del tiempo de coagulacion. Para ello se neutraliza proporcionalmente, mediante la adicion de una cantidad definida de la PEG-peptidasa de la sustancia inhibidora contenida en la muestra. Si en esta muestra, ahora mediante la adicion de activadores de coagulacion adecuados, tal como por ejemplo tromboplastina, tromboplastina parcial, se anade veneno de serpiente de activacion de la coagulacion o una proteasa de activacion de la coagulacion aislada a partir de la misma o mediante adicion de un factor de coagulacion activado que en la cascada de activacion se encuentra delante de la peptidasa inhibida, se prolonga el tiempo de coagulacion mediante la concentracion residual del principio activo. Si se comparan estos valores con el tiempo de coagulacion que se midio en el mismo material de muestra sin adicion de la PEG-enzima asf como con la adicion de concentraciones conocidas de un calibrador adecuado, puede determinarse la concentracion de la sustancia inhibidora de la coagulacion excluyendo la influencia de la composicion de la muestra. Si el material de muestra, debido a su composicion, no puede coagular, puede anadirse plasma normal como fuente para otros factores de coagulacion y en particular fibrinogeno, mediante lo cual se mejora aun la especificidad del procedimiento.
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Procedimientos segun estos principios son, en principio, posibles ademas de factor Xa y trombina tambien para otras peptidasas del sistema hemostatico o sus inhibidores, tales como por ejemplo para los factores IXa, Xla y Vila.
Ademas se divulgan tambien dispositivos, farmacos y procedimientos para la neutralizacion de inhibidores de peptidasas del sistema hemostatico, debiendo entenderse el termino de la neutralizacion de modo que el inhibidor se une mediante una reaccion con la peptidasa acoplada de acuerdo con la invencion y asf ya no puede mostrarse una actividad inhibidora adicional en una muestra o en un organismo.
Por la presente invencion esta comprendido un procedimiento in vitro para la neutralizacion de la actividad inhibidora de un inhibidor de una peptidasa del sistema hemostatico con una masa molecular entre 100 y 2.500 Da, seleccionandose la peptidasa del grupo que consiste en factor lla (trombina), Vila, IXa, Xa, Xla asf como fragmentos y mutantes de las peptidasas mencionadas, que muestran al menos el 80% de la capacidad de las peptidasas mencionadas, de convertir enzimaticamente sus sustratos del sistema de coagulacion, que comprende la puesta en contacto de una muestra seleccionada de sangre, plasma, suero, lfquido cefalorraqrndeo, orina, sudor u otro fluido, en la que esta contenido el inhibidor, con una peptidasa acoplada a polfmero del sistema hemostatico, y en el caso del polfmero se trata de polialquilenglicol o un copolfmero, que comprende unidades de alquilenglicol, y en el que la peptidasa, por el acoplamiento a polfmero, pierde su capacidad de reaccion en el sistema de coagulacion, pero, al mismo tiempo puede neutralizar aun inhibidores del sistema de coagulacion con una masa molecular entre 100 y 2.500 Da y puede convertir enzimaticamente sustratos del sistema de coagulacion con una masa molecular entre 100 y
2.500 Da, y la union del inhibidor mediante reaccion con la peptidasa acoplada a polfmero.
Como prueba se divulga una muestra, que comprende un lfquido o que es un lfquido. Con frecuencia se trata de una muestra biologica, por ejemplo un fluido corporal, tal como sangre, plasma, suero, lfquido cefalorraqrndeo, orina o sudor, preferentemente sangre o plasma. En una forma de realizacion preferida, este procedimiento se emplea en el contexto de un diagnostico in vitro, en el que se extrae una muestra de un mairnfero, en particular un ser humano pero no se devuelve.
En una forma de realizacion se extrae la muestra de la sangre de un paciente que se trata o se trato con un farmaco que contiene un inhibidor de una peptidasa del sistema hemostatico como principio activo. Tras la puesta en contacto de la muestra con la peptidasa acoplada se une el inhibidor administrado con el farmaco mediante la peptidasa y por lo tanto se neutraliza. En el contexto del procedimiento pueden llevarse a cabo por lo tanto adicionalmente tras la neutralizacion del inhibidor, pruebas para el diagnostico de trastornos en el sistema hemostatico o para la actividad de sustancias que intervienen en el sistema hemostatico de manera ventajosa en la muestra.
En el caso de pacientes que se tratan con inhibidores que inhiben la coagulacion de accion directa, la presencia de estos inhibidores en la sangre o el plasma provoca que determinados metodos de laboratorio in vitro para el diagnostico del estado funcional del sistema hemostatico o para la determinacion de la actividad de sustancias que intervienen en el sistema hemostatico, estan considerablemente alterado y por lo tanto ya no son significativos. Esto se refiere en particular a metodos que se basan en la medicion del tiempo de coagulacion desde el momento de la adicion de activadores especiales hasta el comienzo del acontecimiento de coagulacion (por ejemplo aPTT, PT, TT, determinacion del fibrinogeno). Bajo la influencia de los principios activos farmaceuticos se retarda claramente de manera artificial el tiempo de coagulacion en estas pruebas pero ya mediante estos principios activos y ya no permite ninguna deduccion diagnostica con respecto al estado del sistema hemostatico. En particular ya no puede diagnosticarse ninguna carencia de factores de coagulacion, lo que es desventajoso en distintas situaciones clmicas. Mediante la neutralizacion de los inhibidores, estas pruebas pueden llevarse a cabo sin influencia mediante el inhibidor y mantienen su fuerza informativa diagnostica completa.
Tambien para esta forma de realizacion se divulgan inhibidores que presentan una masa molecular de al menos 100 Da y como maximo 10.000 Da. Se divulga asf mismo que la masa molecular del inhibidor asciende como maximo a
7.500 Da, en particular como maximo 5.000 Da o como maximo 2.500 Da. Ejemplos de inhibidores de este tipo son tal como se menciono anteriormente. Para la neutralizacion del inhibidor en el contexto de la invencion se empleara de manera ventajosa una peptidasa acoplada a polfmero, sobre la que actua el inhibidor como inhibidor directo.
Se divulga tambien un dispositivo que contiene una peptidasa acoplada a polfmero de acuerdo con la invencion del sistema hemostatico, para eliminar un inhibidor de una peptidasa del sistema de coagulacion sangumea de una muestra o de la circulacion sangumea de un paciente. A este respecto, la peptidasa acoplada a polfmero puede estar inmovilizada por ejemplo sobre un material de soporte. En este contexto se hace referencia a modo de ejemplo al documento WO 98/46648, que divulga procedimientos y sistemas de interaccion, con cuya ayuda pueden inmovilizarse sobre un material de soporte las peptidasas acopladas a polfmero, en particular polialquilenglicol o peptidasas acopladas a PEG. La inmovilizacion de la peptidasa acoplada a polfmero puede tener lugar por ejemplo sobre estructuras particuladas, capilares, estructuras de red o paredes de recipientes. La peptidasa acoplada inmovilizada puede encontrarse en particular en un recipiente, tal como un cartucho, que presenta una entrada y una salida para fluidos y que puede atravesarse por un fluido.
Son especialmente adecuadas aquellas formas del dispositivo que pueden conectarse de manera extracorporea en la circulacion sangumea de un paciente. Para ello puede conducirse por ejemplo sangre por medio de un sistema de tubo flexible con o sin bomba del organismo de manera extracorporea mediante un cartucho que esta cargado con un
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material adecuado tal como por ejemplo capilares, partmulas o similares, en cuya superficie esta inmovilizada la peptidasa acoplada a poUmero. Si la sangre o tambien el plasma, cuando se efectuo previamente una separacion celular, circula pasando por la peptidasa acoplada a polfmero fijada en la superficie, esta se une espedficamente al inhibidor contenido, que se retira de esta manera de la circulacion, lo que lleva a una disminucion de la concentracion sangumea hasta intervalos no toxicos.
Se divulga tambien una peptidasa acoplada a polfmero del sistema hemostatico para su uso en el restablecimiento de la capacidad de coagulacion de la sangre, para aumentar la tendencia a la coagulacion de la sangre y/o para acelerar la coagulacion sangumea.
Un uso de este tipo puede estar indicado en particular en pacientes que se sometieron o se someten a un tratamiento con una sustancia inhibidora de bajo peso molecular. A este respecto se prefiere a su vez un inhibidor que presenta una masa molecular de al menos l0o Da y como maximo 10.000 Da. Preferentemente la masa molecular del inhibidor asciende como maximo a 7.500 Da, en particular como maximo 5.000 Da o como maximo 2.500 Da. Ejemplos de inhibidores de este tipo son principios activos, seleccionados del grupo de los principios activos de los farmacos para la inhibicion directa de factor de coagulacion Xa tal como por ejemplo rivaroxaban, apixaban, betrixaban, otamixaban, edoxaban, eribaxaban, YM150, LY- 517717 o PRT054021 o para la inhibicion directa de trombina, tal como por ejemplo dabigatran, argatroban, flovagatran, AZD0837, MCC-977, NU172 o bivalirudina.
Las peptidasas acopladas a polfmero para la neutralizacion de inhibidores, en particular sustancias inhibidoras de la coagulacion de bajo peso molecular de accion directa pueden emplearse por ejemplo en pacientes, por ejemplo cuando la concentracion sangumea de estos principios activos se encuentra en intervalos que pueden llevar a hemorragias peligrosas, por ejemplo para permitir con ello una operacion. Para ello puede administrarse la correspondiente peptidasa acoplada a polfmero directamente en la circulacion sangumea del paciente. Esta reaccionara en la sangre de manera espedfica con la sustancia inhibidora de la coagulacion y antagonizara con ello su efecto inhibidor de la coagulacion, sin ejercer en sf un efecto propio. A diferencia de los mutantes de factores de coagulacion, en este caso no hay que temer ninguna inmunizacion, dado que puede tratarse preferentemente de la forma natural de la protema. El ejemplo de la hemofilia de cuerpos inhibidores muestra que incluso cambios irnnimos de la estructura mediante mutaciones puntuales puede inducir ya una formacion de anticuerpos clmicamente significativa. La peptidasa acoplada a polfmero puede ponerse en contacto tambien en forma inmovilizada con la sangre de un paciente, en este sentido se remite al dispositivo divulgado anteriormente.
Se divulga tambien un kit de prueba que comprende como un primer reactivo una peptidasa acoplada a polfmero del sistema hemostatico y como un segundo reactivo un sustrato de la peptidasa, que puede emplearse en el procedimiento de diagnostico descrito anteriormente.
En particular pueden emplearse en el kit sustratos conocidos, de los que la peptidasa acoplada a polfmero puede escindir un grupo de senalizacion, tal como por ejemplo un sustrato cromogenico. Como alternativa pueden usarse por ejemplo tambien sustratos fluorigenicos, luminogenicos o electroqmmicos. Debena ser comprensible que, para estos fines, debido a la modificacion de la peptidasa, sean adecuados en particular sustratos de bajo peso molecular, preferentemente aquellos que presentan una masa molecular de al menos 100 Da y como maximo 10.000 Da. De manera especialmente preferente, la masa molecular asciende como maximo a 7.500 Da, en particular como maximo
5.000 Da o como maximo 2.500 Da.
Los siguientes ejemplos explicaran en detalle la invencion sin limitarla a los mismos.
Produccion de un conjugado de PEG-factor Xa
150 |jg de factor Xa bovino (EC 3.4.21.6, American Diagnostica Inc.) disueltos en 300 jl de tampon fosfato 0,05 M, pH
8.0 se anadieron a 20 mg de metoxi-polietilenglicol (PEG)-20.000 succinimidilproprionato. La preparacion se sacudio durante 1 h en el frigonfico (+2°C -+8°C). Tras 1 h se anadieron a la preparacion otros 10 mg de metoxi- PEG-20,000 succinimidilproprionato y se sacudio la mezcla durante una hora mas a +2°C -+8°C.
El conjugado de PEG 20 kD-factor Xa se aislo mediante cromatograffa de exclusion molecular en una columna Hi Load Superdex 200 pg 16/60 con Tris/HCl 0,02 M, NaCl 0,1 M, pH 7,4 a una velocidad de flujo de 1 ml/min. El conjugado PEG-factor Xa se eluye en primer lugar como pico simetrico con un volumen de elucion de 40 ml (deteccion de la absorcion UV a 220 nm y 280 nm). El exceso de polfmero y los productos de reaccion se eluyen posteriormente y se separaron de esta manera de la protema conjugada.
Las fracciones que contienen protema con actividad de factor Xa (determinada a traves de la escision de un sustrato cromogenico para factor Xa) se reunieron en tubos de recogida de fracciones, en los que se dispuso previamente PEG 8000 como estabilizador. Las fracciones con el contenido mas alto en factor Xa se reunieron y se almacenaron en almuotas a -80°C.
Ejemplo 2
Propiedades enzimaticas de PEG 20 kD-factor Xa
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a) Escision de sustrato cromogenico por PEG 20kD-factor Xa
La escision del sustrato cromogenico N- a-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA (Haemochrom Diagnostica GmbH) se caracterizo a traves de la determinacion de la constante de Michaelis-Menthen Km del sustrato. Como Km para PEG 20 kD-factor Xa se determino 0,102 mM, la constante es por lo tanto identica a Km para el factor Xa no modificado, que ascendfa a 0,105 mM.
b) Inhibicion de la actividad amidolftica de PEG 20 kD-factor Xa mediante el inhibidor directo de bajo peso molecular Pefabloc Xa
Para determinar la inhibicion de la actividad amidolftica de PEG 20 kD-factor Xa por el inhibidor de bajo peso molecular Pefabloc Xa (Loxo GmbH), se empleo un ensayo cromogenico y la evaluacion segun Lineweaver-Burk. La constante de inhibidor Kj para Pefabloc Xa frente a PEG 20 kD-factor Xa ascendio a 0,7 ±0,13 pM. Esta es comparable con la constante de inhibidor determinada con respecto a la enzima no modificada Ki de 1,1 ± 0,07 pM.
c) Influencia de antitrombina y heparina/antitrombina sobre la actividad amidolftica de PEG 20 kD-factor Xa
25 yl de factor Xa (American Diagnostica Inc., 1 mg/ml) o PEG 20 kD-factor Xa (1 mg de protema/ml) se incubaron con 25 ml antitrombina III (50 unidades/ml, Sigma Chemical Co. A-7388) durante 2-20 min, la actividad amidolftica se determino tras la adicion de sustrato cromogenico. Mientras que la actividad de factor Xa en funcion del tiempo de incubacion se inhibio en un 99%, la antitrombina III no tema ninguna influencia inhibidora sobre la actividad de pEg 20 kD-factor Xa (Figura 1).
25 pl de factor Xa (American Diagnostica Inc., 1 pg/ml) o PEG 20 kD-factor Xa (1 pg de protema/ml) se incubaron con 25 pl de una mezcla de antitrombina III (10 unidades/ml, Sigma Chemical Co. A-7388) y heparina (2 unidades de anti-FXa/ml, Low molecular weight heparin, 2nd International Standard, NIBSC) durante 2-20 min, la actividad amidolftica se determino tras la adicion de sustrato cromogenico. Mientras que la actividad de factor Xa en funcion del tiempo de incubacion se inhibio en un 99%, el complejo antitrombina III / heparina no teman ninguna influencia inhibidora sobre la actividad de PEG 20 kD-factor Xa (Figura 2).
d) Actividad de PEG 20 kD-factor Xa en el sistema de coagulacion plasmatico
Se determino la actividad de coagulacion de factor Xa no modificado (American Diagnostica Inc.), se incubaron 50 pl de plasma con 50 pl de factor Xa (contenido en protema entre 0,015 pg/ml y 2 pg/ml) durante 1 min a 37°C, la reaccion de coagulacion se inicio mediante la adicion de solucion 50 pl de CaCl2 0,025 M, que se templo a 37°C. Los tiempos de coagulacion se determinaron en un coagulometro esferico KC4A Micro y se encontraban entre 178 s y 34 s.
Con el uso de PEG 20 kD-factor Xa en lugar del factor Xa no modificado en concentraciones comparables en el ensayo de coagulacion no pudo desencadenarse una coagulacion, todos los tiempos de coagulacion medidos se encontraban en >250 s.
Para detectar que PEG 20 kD-factor Xa no ejerce actividad alguna en el sistema de coagulacion, se llevaron a cabo ademas lo siguientes ensayos: A plasma con deficiencia en factores de coagulacion (abnormal plasma, American Diagnostica Inc.) se le anadio factor Xa o PEG 20 kD-factor Xa (50 pl de plasma + 50 pl de factor Xa 8 pg/ml en BSA al 1,5%). Mediante la compensacion de la deficiencia de factor Xa se redujo a 15,1 s el tiempo de protrombina con respecto a plasma normal (normal plasma, American Diagnostica Inc.) en el plasma deficiente en factores de, prologado de 12,2 s a 29,9 s. Tras la adicion de pequenas cantidades de PEG 20 kD-factor Xa no se redujo el tiempo de protrombina del plasma deficiente, el PEG 20 kD-factor Xa no mostro ninguna actividad en el sistema de coagulacion plasmatico (Figura 3).
Ejemplo 3
Determinacion cuantitativa del inhibidor directo de factor Xa sintetico de bajo peso molecular Pefabloc Xa en el plasma
Para la determinacion cuantitativa del inhibidor directo de factor Xa sintetico Pefabloc Xa (Loxo GmbH) en el plasma se incuban 25 pl de PEG 20 kD-factor Xa (1 pg/ml en Tris/HCl 0,02 M, NaCl 0,1 M, PEG 8.000 al 1,5%, pH 7,4 a TA), 25 pl de muestra de plasma (plasma de citrato) y 100 pl de tampon de reaccion (Tris 0,05 M/HCl, NaCl 0,3 M , pH 8,4 a TA) 1 min a 37°C en el aparato de medicion (TC4+, TeCO GmbH). Tras la adicion de 50 pl de sustrato cromogenico se registra el aumento de la densidad optica a 405 nm (escision del sustrato cromogenico y liberacion p-nitroanilina mediante la parte no incubada del PEG 20 kD-factor Xa).
La actividad del PEG 20 kD-factor Xa se determina a traves del aumento de la curva de reaccion (cambio de la densidad optica en mOD/min). La actividad disminuye proporcionalmente a la concentracion de inhibidor en el plasma. Se registra una curva de calibracion, determinandose la actividad de PEG 20 kD-factor Xa a concentraciones de inhibidor definidas (10 pM-100 pM) en el plasma recogido de citrato (Figura 4). Con ayuda de esta curva de calibracion puede determinarse la concentracion de inhibidor de una muestra de plasma desconocida a traves de su actividad.
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Ejemplo 4
Produccion de un conjugado de PEG-factor IIa
5 mg de factor IIa bovino (trombina, EC 3.4.21.5, Kordia.) se disuelven junto con 100 mg de metoxi-polietilenglicol (PEG)-5.000 p-nitrofenilcarbonato en 500 jl de tampon fosfato 0,05 M, pH 8,0. La preparacion se sacudio durante 2 h en el frigorftico (+2°C -+8°C). Tras 30 min y 60 min se anadieron a la preparacion 45 mg adicionales y tras 90 min 6 mg adicionales de metoxi- polietilenglicol (PEG)-5.000 p-nitrofenilcarbonato.
El conjugado de PEG 5kD-trombina se eluyo mediante cromatograffa de exclusion molecular en una columna Hi Load Superdex 200pg 16/60 con NaCl 0,1 M a una velocidad de flujo de 1 ml/min. El conjugado PEG-trombina se eluye en primer lugar como pico simetrico con un volumen de elucion de 55ml (deteccion de la absorcion UV a 220 nm y 280 nm). El exceso de poftmero y los productos de reaccion se eluyen posteriormente y se separaron de esta manera de la protema conjugada.
Las fracciones que contienen protema se reunieron en tubos de recogida de fracciones, en los que se dispuso previamente PEG 8000 como estabilizador. Las fracciones con el mayor contenido en trombina (medido a traves de la escision de un sustrato de trombina cromogenico) se reunieron y se almacenaron en aftcuotas a -20°C.
Ejemplo 5
Determinacion cuantitativa del inhibidor directo de factor IIa sintetico de bajo peso molecular. Argatroban en el plasma
Para la determinacion cuantitativa del inhibidor directo de factor IIa sintetico Argatroban (Mitsubishi Pharma) en el plasma se anaden 15 jl de muestra de plasma (plasma de citrato) a 50 jl de sustrato cromogenico (H-D-Chg- Ala-Arg-pNA, JenAffin GmbH, 3 mM en Tris/HCl 0,05m, NaCl 0,1 M, pH 8,0 a 37°C). La reaccion cromogenica se inicio mediante adicion de 100 jl) de PEG 5kD- trombina. En el aparato de medicion (TC4+, TECO GmbH) se registra el aumento de la densidad optica a 405 nm (escision del sustrato cromogenico y liberacion de p-nitroanilina mediante la parte no inhibida del PEG 5kD-trombina).
La actividad del PEG 5 kD-trombina se determina a traves del aumento de la curva de reaccion (cambio de la densidad optica en mOD/min). La actividad disminuye proporcionalmente a la concentracion de inhibidor en el plasma. Se registra una curva de calibracion, determinandose la actividad del PEG 5kD-trombina a concentraciones de inhibidor definidas (0,375 jg/ml - 3 jg/ml) en plasma recogido de citrato (Figura 5). Con ayuda de esta curva de calibracion puede determinarse la concentracion de inhibidor de una muestra de plasma desconocida a traves de su actividad.
Ejemplo 6
Influencia de heparina sobre la actividad amidolftica de PEG 5kD-trombina
La influencia de heparina (Sigma, H-3393) en plasma sobre la actividad amidolftica de PEG 5 kD-trombina se comparo con la influencia de heparina sobre la actividad amidolftica de trombina no modificada. Se empleo el ensayo cromogenico para la determinacion de inhibidores directos de trombina (Ejemplo 5): Se anadieron 15 jl de muestra de plasma (plasma de citrato) a 50 jl de sustrato cromogenico (H-D-Chg-Ala-Arg-pNA, JenAffin GmbH, 3 mM en Tris 0,05 M/HCl, NaCl 0,1 M, pH 8,0 a 37°C). La reaccion cromogenica se inicia mediante la adicion de 100 jl de PEG 5kD-trombina o trombina. En el aparato de medicion (TC4+, TECO GmbH) se registra el aumento de la densidad optica a 405 nm (escision del sustrato cromogenico y liberacion de p-nitroanilina).
Se mostro que concentraciones de heparina crecientes en la muestra de plasma (heparina junto con plasma-antitrombina) influyen de manera inhibidora en la actividad de trombina no modificada. El contenido en heparina de la muestra de plasma no tema ninguna influencia sobre la actividad amidolftica del PEG 5 kD-trombina (Figura 6).
Figura 1: Influencia de la incubacion de antitrombina III sobre la actividad de PEG 20 kD-factor Xa asf como factor Xa no modificado
Figura 2: Influencia de la incubacion de antitrombina III / heparina (bajo peso molecular) sobre la actividad de PEG 20 kD-factor Xa asf como factor Xa no modificado
Figura 3: Influencia de la adicion de PEG 20kD-factor Xa asf como factor Xa no modificado sobre el tiempo de protrombina de plasma deficiente en factores
Figura 4: Curva de calibracion para la determinacion cuantitativa del inhibidor directo de factor Xa Pefabloc Xa en plasma por medio de ensayo cromogenico de PEG-factor Xa
Figura 5: Curva de calibracion para la determinacion cuantitativa del inhibidor directo de trombina Argatroban en plasma por medio de ensayo cromogenico de PEG-trombina
Figura 6: Influencia de la concentracion de heparina en plasma sobre la actividad amidolftica de PEG 5 kD-trombina asf como trombina no modificada
Claims (6)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Procedimiento para la deteccion o la determinacion cuantitativa de un inhibidor de una peptidasa del sistema hemostatico en una muestra, siendo la peptidasa del sistema hemostatico un factor de coagulacion, seleccionado del grupo que consiste en factor IIa (trombina), Vila, IXa, Xa, XIa asf como fragmentos y mutantes de las peptidasas mencionadas, que muestran al menos el 80 % de la capacidad de las peptidasas mencionadas de convertir enzimaticamente sus sustratos del sistema de coagulacion, y la muestra se selecciona de sangre, plasma, suero, lfquido cefalorraqrndeo, orina, sudor u otro fluido, que comprendela puesta en contacto del inhibidor en la muestra con la peptidasa acoplada a un polfmero del sistema hemostatico, y el polfmero es un polialquilenglicol o un copolfmero, que comprende unidades de alquilenglicol, y en el que la peptidasa del sistema hemostatico, por el acoplamiento a polfmero, pierde su capacidad de reaccion en el sistema de coagulacion, pero, al mismo tiempo puede neutralizar aun inhibidores del sistema de coagulacion con una masa molecular de entre 100 y 2.500 Da y puede convertir enzimaticamente sustratos del sistema de coagulacion con una masa molecular de entre 100 y 2.500 Da, y o bien(i) la medicion de la actividad de la peptidasa acoplada a polfmero tras su puesta en contacto con el inhibidor en la muestra, y la comparacion de la actividad de la peptidasa acoplada tras la puesta en contacto con la muestra con uno o varios valores de referencia, para establecer una eventual inhibicion de la actividad; o(ii) la medicion del tiempo de coagulacion de la muestra tras la puesta en contacto con la peptidasa acoplada, y la comparacion del tiempo de coagulacion con uno o varios valores de referencia, para establecer una eventual variacion del tiempo de coagulacion.
- 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, tratandose en el caso del inhibidor de un inhibidor de accion directa.
- 3. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que en el caso del inhibidor se trata de un principio activo de las clases de los inhibidores directos de factor Xa o de los inhibidores directos de trombina.
- 4. Procedimiento in vitro para la neutralizacion de la actividad inhibidora de un inhibidor de una peptidasa del sistema hemostatico con una masa molecular de entre 100 y 2.500 Da, seleccionandose la peptidasa del grupo que consiste en factor IIa (trombina), Vila, IXa, Xa, XIa asf como fragmentos y mutantes de las peptidasas mencionadas, que muestran al menos el 80 % de la capacidad de las peptidasas mencionadas de convertir enzimaticamente sus sustratos del sistema de coagulacion, que comprendela puesta en contacto de una muestra seleccionada de sangre, plasma, suero, lfquido cefalorraqrndeo, orina, sudor u otro fluido, en la que esta contenido el inhibidor, con una peptidasa acoplada a polfmero del sistema hemostatico, y en el caso del polfmero se trata de polialquilenglicol o un copolfmero que comprende unidades de alquilenglicol, y en el que la peptidasa, por el acoplamiento a polfmero, pierde su capacidad de reaccion en el sistema de coagulacion, pero, al mismo tiempo puede neutralizar aun inhibidores del sistema de coagulacion con una masa molecular de entre 100 y 2.500 Da y puede convertir enzimaticamente sustratos del sistema de coagulacion con una masa molecular de entre 100 y 2.500 Da, y la union del inhibidor mediante reaccion con la peptidasa acoplada a polfmero.
- 5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que la muestra se obtiene a partir de la sangre de un paciente que se trata o se trato con un farmaco que contiene un inhibidor de una peptidasa del sistema hemostatico como principio activo y, en el que tras la puesta en contacto de la muestra con la peptidasa acoplada, se une el inhibidor administrado con el farmaco mediante la peptidasa y por lo tanto se neutraliza.
- 6. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 4 o 5, en el que adicionalmente tras la neutralizacion del inhibidor se llevan a cabo pruebas en la muestra para el diagnostico de trastornos en el sistema hemostatico o para detectar la actividad de sustancias que intervienen en el sistema hemostatico.
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