ES2262264T3 - Proteasa para activar el factor de coagulacion vii. - Google Patents
Proteasa para activar el factor de coagulacion vii.Info
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Abstract
Un sistema de ensayo para la detección cualitativa y cuantitativa de la proteasa activadora de FVII, que: a) es inhibida por la presencia de aprotinina, b) aumenta su actividad mediante iones de calcio y/o heparina o sustancias relacionadas con la heparina, y c) en electroforesis de geles de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), tras la tinción posterior en el estado no reducido, tiene una o más bandas en el intervalo de pesos moleculares desde 50 hasta 75 kDa y en el estado reducido tiene una banda de 40 a 55 kDa y una o más bandas en el intervalo de pesos moleculares desde 10 hasta 35 kDa y en la que d) la banda obtenida en SDS-PAGE en el estado reducido, en el intervalo de pesos moleculares desde 60 hasta 65 kDa y desde 40 hasta 55 kDa, tiene una secuencia de aminoácidos de LLESLDP, y la banda obtenida en el intervalo de pesos moleculares desde 10 hasta 35 kDa tiene una secuencia de aminoácidos de IYGGFKSTAGK, o su proenzima, en el que la proteasa es medida por medio de: a) su actividad desactivando los factores de la coagulación de la sangre VIII/VIIIa o V/Va, o b) su actividad reduciendo los tiempos de coagulación de la sangre en ensayos globales de coagulación, o c) su actividad activando activadores del plasminógeno, o d) su actividad activando FVII y en el que la concentración desconocida de proteasa activadora de FVII se determina por comparación con una curva patrón de cantidades crecientes de proteasa activadora de FVII.
Description
Proteasa para activar el factor de coagulación
VII.
La invención se refiere a una proteasa para
activar el factor de la coagulación de la sangre VII, a un
procedimiento para aislarla, detectarla y desactivarla, y a
preparaciones medicinales que comprenden esta proteasa.
El sistema de coagulación de la sangre comprende
dos vías en cascada diferentes para activar los factores de la
coagulación que están presentes en el plasma. La vía intrínseca o la
extrínseca se usan preferentemente para iniciar la coagulación,
dependiendo del mecanismo de desencadenamiento.
Cuando un tejido es dañado, la tromboplastina
(factor tisular, TF con fosfolípidos) es expuesto por las células
afectadas como el iniciador de la vía de coagulación extrínseca. La
tromboplastina situada en la membrana puede unirse tanto al factor
de la coagulación VII (FVII) como al factor FVII activado circulante
(FVIIa). En presencia de iones de calcio y lípidos, este complejo
de TF-FVIIa conduce a la unión de FX, que se
convierte en su forma activada (FXa) mediante proteinólisis
limitada. FXa conduce posteriormente, mediante la activación de
protrombina para formar trombina, a la formación de fibrina y de ese
modo, por último, al cierre de la herida.
Aunque la activación adicional del FVII unido a
tromboplastina tiene lugar inicialmente de forma autocatalítica, en
particular, es mantenida, después de que la cascada de coagulación
se ha iniciado, por FXa y trombina, en particular, conduciendo a un
refuerzo notable de la reacción en cascada.
La administración de FVIIa o concentrados que
contienen FVIIa está indicada en ciertas situaciones clínicas. La
denominada actividad de bypass del inhibidor de FVIII (FEIBA)
de FVIIa se usa en pacientes que están padeciendo, por ejemplo,
hemofilia A y han desarrollado anticuerpos frente a FVIII como
consecuencia de la administración de FVIII. Conforme a hallazgos
disponibles actualmente, el FVIIa es bien tolerado en este contexto
y, mientras que no conduce a ninguna tendencia a la trombosis, es
adecuado para asegurar que la coagulación tenga lugar hasta un
grado limitado pero adecuado. Ya se está usando FVIIa recombinante
terapéutica y profilácticamente. El FVII que se ha aislado del
plasma sanguíneo puede activarse también y luego usarse. Las
proteasas tales como la trombina pueden usarse para esta
activación; sin embargo, estas proteasas, como tales, pueden activar
fuertemente la coagulación y conducir al riesgo de una trombosis.
Por esta razón, es necesaria la retirada o desactivación posterior
de la trombina, y conduce a pérdidas de rendimiento. Como resultado
del riesgo de trombosis que está asociado con ello, el uso de FXa o
FIIa (trombina) está contraindicado frecuentemente, y solamente
está indicado para emergencias, por ejemplo, en relación con una
extremada pérdida de sangre y hemorragias no restañables.
El FVIIa se encuentra en concentraciones muy
bajas en el plasma de sujetos sanos. Hasta ahora se conoce sólo muy
poco sobre la formación y el origen de FVIIa que está circulando en
la sangre. Pequeñas cantidades de tromboplastina que se ha
expresado o liberado en relación con la destrucción celular pueden
jugar un papel en este contexto. Aunque se conoce que el factor
XIIa, por ejemplo, puede conducir a la activación de FVII bajo
ciertas condiciones, todavía no se ha aclarado la relevancia
fisiológica de esta reacción.
Sorprendentemente, se ha encontrado actualmente,
en relación con el fraccionamiento de plasma humano y ciertos
concentrados de complejos de protrombina, una proteasa activadora de
FVII que se diferencia de todas las proteasas conocidas
previamente. Investigaciones acerca de esta proteasa han mostrado
que manifiesta una actividad amidolítica particularmente alta
frente al sustrato peptídico S-2288
(H-D-isoleucil-L-prolil-L-arginina-p-nitroanilina
(pNA)) de Chromogenix AB, Suecia. Una característica particular de
esta proteasa es que la actividad amidolítica es inhibida
eficazmente por la aprotinina. También son adecuados para la
inhibición otros inhibidores, tales como el complejo
heparina/antitrombina III. Por otra parte, su actividad aumenta
mediante la heparina y sustancias relacionadas con la heparina
tales como sulfato de heparano o sulfato de dextrano e iones de
calcio. Finalmente, se ha encontrado que esta proteasa es capaz, de
una manera que depende del tiempo y su concentración, de convertir
FVII en FVIIa. Esta reacción, también, es inhibida por la
aprotinina.
Parte de la materia objeto de la invención es,
por lo tanto, una proteasa para activar el factor de la coagulación
de la sangre VII, que:
- a)
- es inhibida por la presencia de aprotinina,
- b)
- aumenta su actividad mediante iones de calcio y/o heparina o sustancias relacionadas con la heparina, y
- c)
- en electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), tras la tinción posterior en el estado no reducido, tiene una o más bandas en el intervalo de pesos moleculares desde 50 hasta 75 kDa y en el estado reducido tiene una banda de 40 a 55 kDa y una o más bandas en el intervalo de pesos moleculares desde 10 hasta 35 kDa.
En el texto siguiente, la forma activada de la
proteasa se denomina "proteasa", mientras que la forma no
activada se denomina "proenzima".
\newpage
Investigaciones adicionales con esta proteasa
han mostrado que, después de enriquecimiento o aislamiento,
experimenta una rápida pérdida de actividad, que se observó en una
disolución que contenía trometamol 20 mM, NaCl 0,15 M a un pH de
7,5. La adición de albúmina a una concentración de 0,1% no fue capaz
de impedir que la actividad de la proteasa disminuyera en 50%
después de una hora a temperatura ambiente. Por otra parte, se
observó una muy buena estabilización de la proteasa en una
disolución tamponada a un pH de 6,5 con citrato de Na 50 mM. Si no
se añaden estabilizantes particulares a la disolución de proteasa,
no se observan, o sólo se observan ligeras, pérdidas de actividad
si la disolución se ajusta a un pH de entre 4 y 7,2, preferiblemente
a un pH de entre 5,0 y 7,0. Sin embargo, es conveniente añadir
estabilizantes a la disolución, siendo estabilizantes adecuados en
particular, aparte de citrato, glutamato, aminoácidos, tales como
arginina, glicina o lisina, iones de calcio y azúcares tales como
glucosa, arabinosa o manosa, en cantidades de 1-200
mmoles/l, preferiblemente en cantidades de 5-100
mmoles/l. También se logró una estabilización eficaz añadiendo
glicoles tales como etilenglicol o glicerol, usándose cantidades de
5-80% en peso, preferiblemente de
10-60% en peso. El pH de la disolución
\hbox{estabilizada debe estar entonces entre los valores de pH
de 4-9.}
La nueva proteasa, y también la proenzima,
pueden obtenerse mediante fraccionamiento de plasma sanguíneo o de
concentrados de complejos de protrombina (PPSB). El material de
partida es luego, en primer lugar, sometido a cromatografía de
intercambio aniónico, seguido por cromatografía de afinidad del
producto eluido. Es particularmente adecuada para la cromatografía
de afinidad una heparina que esté inmovilizada en una matriz, o una
sustancia relacionada con heparina, tal como sulfato de heparano o
sulfato de dextrano. Cuando se usa tal método cromatográfico, la
nueva proteasa y/o la proenzima puede unirse selectivamente y luego
ser eluida una vez más usando métodos conocidos. El uso de un
espaciador es aconsejable para acoplar el ligando a la matriz. Se ha
encontrado que una matriz de heparina-lisina es
particularmente adecuada para aislar la nueva proteasa.
En SDS-PAGE con tinción
posterior, la proteasa que se ha aislado mediante este método
manifiesta, en el estado no reducido, de una a varias bandas que se
encuentran próximas unas a otras en el intervalo de pesos
moleculares de 55-75 kDa. Después de la reducción,
se observaron de una a varias bandas en el intervalo de pesos
moleculares de 15-35 kDa y se observó una banda a
40-55 kDa. Una banda más, entre 60 y 65 kDa, que,
después de una exploración y determinación cuantitativa, constituyó
5-10% de la proteína total, mostró que una proenzima
no activada estaba también presente. Este resultado fue apoyado por
investigaciones apropiadas usando anticuerpos monoclonales frente a
esta proteasa. Se concluyó por lo tanto que la proenzima de esta
proteasa puede también prepararse, pasteurizarse y usarse mediante
el método conforme a la invención. Parte de la materia objeto de la
invención es, por lo tanto, la proenzima de la proteasa para activar
el factor de la coagulación de la sangre VII. La proporción de la
proenzima está indicada por la banda entre 60 y 65 kDa.
Correspondientes a la secuencia de aminoácidos que constituye la
región de activación de la proenzima, la trombina, calicreína, o
FXIIa son, de acuerdo con sus especificidades de sustrato, ejemplos
de activadores fisiológicos adecuados de la proenzima.
Algunas de las propiedades de la nueva proteasa
que se han descrito, es decir, el hecho de que puede aislarse a
partir de plasma o a partir de concentrados de complejos de
protrombina (PPSB) que son derivados de plasma, la inhibición de su
actividad amidolítica mediante aprotinina, y el comportamiento de
migración descrito en SDS-PAGE, tanto en el estado
reducido como en el no reducido, recuerdan una proteasa que fue
aislada por Hunfeld et al. (Ann. Hematol. 1997; 74; A87, 113;
Ann. Hematol. 1998; 76; A101, P294, y Etscheid et al. Ann.
Hematol. 1999, 78: A42) a partir de un concentrado de PPSB que no
se definió con ningún detalle más. En ese caso, la preparación se
logró esencialmente usando una matriz de aprotinina. Como resultado
de la escisión amidolítica de ciertos sustratos peptídicos, se
describió la actividad como una actividad semejante a la de
trombina. Hunfeld et al. no encontraron ninguna influencia
sobre los parámetros globales de coagulación tales como tiempo de
protrombina, Quick or agregación plaquetaria.
La secuenciación aminoterminal de la proteasa
descrita por Hunfeld et al. muestra concordancias con una
proteína cuyo ADN complementario fue descrito por
Choi-Miura et al. (J. Biochem. 119:
1157-1165 (1996)). En su estructura primaria, la
proteína correspondiente manifiesta homología con una enzima
denominada enzima activadora del factor de crecimiento de
hepatocitos (HGFA).
Cuando dos bandas que se aislaron a partir de
SDS-PAGE bajo condiciones reductoras se sometieron a
secuenciación aminoterminal, se establecieron las siguientes
concordancias:
| Intervalo de pesos moleculares | Secuencia de aminoácidos | Autor |
| de la banda | ||
| 10-35 kDa | YGGFKSTAGK | Presente invención |
| 30 kDa | IYGGFKSTAG | Hunfeld et al. |
| 17 kDa | IYGGFKSTAGKH | Choi-Miura et al. |
| 40-55 kDa | LLESLDP | Presente invención |
| 50 kDa | SLDP | Hunfeld et al. |
| 50 kDa | SLLESLDPWTPD | Choi-Miura et al. |
También se han encontrado concordancias en otros
resultados de ensayos tales como especificidad de sustrato y la
capacidad de que la actividad sea inhibida. A pesar de esto, todavía
no es posible actualmente asumir con confianza que estas proteínas
sean idénticas. De todos modos, no se ha informado que las proteínas
investigadas previamente, mencionadas anteriormente, posean la
propiedad de activar FVII o activar otros factores (véase más
adelante).
Sobre la base de sus propiedades descritas, la
nueva proteasa puede usarse diagnóstica y terapéuticamente.
La nueva proteasa puede usarse como medio
diagnóstico en reactivos de ensayo. De este modo, la presencia de
factor VII puede determinarse cualitativa y cuantitativamente en un
ensayo de coagulación añadiendo la nueva proteasa.
A la inversa, el sistema de ensayo desarrollado
para medir la activación de FVII puede usarse también para detectar
y cuantificar la proteasa. Para esto, se mezcla una disolución que
contiene la proteasa con una disolución que contiene FVII y,
después de un tiempo de incubación apropiado, se determina la
cantidad resultante de FVIIa. Esto puede llevarse a cabo, por
ejemplo, usando el ensayo Staclot® FVIIa-rTF
(Stago/Boehringer Mannheim). Cuando se usa un procedimiento
preferido, este ensayo no está limitado por la concentración de FVII
suministrada. Si se conoce la cantidad de proteasa en forma de la
proporción de proteína total, proporción que puede determinarse
- en una preparación de proteasa pura, por
medio del método Kjeldahl o por medio de otro análisis de proteínas
con el que la persona experta está familiarizada, o
- usando un ensayo de antígenos, por ejemplo
basado en anticuerpos específicos y un método de determinación
inmunoquímica apropiado, tal como ELISA, la actividad especifica de
la preparación de proteasa puede medirse lego de una manera
correspondiente.
Sorprendentemente, se ha encontrado actualmente
una propiedad, en relación con una caracterización más a fondo de
la proteasa, que hace posible llevar a cabo un método de
determinación adicional. En relación con la incubación de los
factores de la coagulación de la sangre VIII/VIIIa y V/Va con dicha
proteasa, y la subsiguiente cuantificación, se hizo claro que
dichos factores de coagulación se desactivan de una manera que
depende de la concentración de proteasa y de la duración de la
incubación.
Otra parte de la materia objeto de la invención
es por lo tanto un nuevo sistema de ensayo para detectar cualitativa
y cuantitativamente la proteasa que activa el factor de la
coagulación de la sangre VII, sistema en el que la proteasa puede
determinarse mediante su acción desactivadora de los factores de la
coagulación de la sangre VIII/VIIIa o V/Va. Este sistema de ensayo
está basado en una disolución que contiene la proteasa incubándose
con factor VIII/VIIIa o factor V/Va, y la cantidad restante de
factor VIII/VIIIa o la cantidad restante de factor V/Va midiéndose
por medio de un ensayo de actividad convencional, y la cantidad de
proteasa determinándose luego cuantitativamente a partir de éste por
comparación con una curva patrón. Al llevar a cabo este ensayo, se
inhibe la incubación de la actividad de la proteasa, después de
periodos predeterminados de tiempo, mediante la adición limitada de
aprotinina, que tiene la ventaja de que no tiene efecto, a estas
concentraciones, sobre las mediciones posteriores del sistema de
ensayo. Después de eso, las actividades restantes de los factores
de coagulación se miden por medio de un ensayo que es conocido por
la persona experta. Para esto, un sistema de ensayo ha demostrado,
en particular, su valía, en el que se hace uso del denominado ensayo
de factor VIII Coamatic® (Chromogenix AB), que contiene
esencialmente factores IXa y X, cuantificándose la cantidad restante
de FXa, en presencia de un inhibidor de trombina, por medio de la
conversión de un sustrato cromógeno (véase último tercio de la
página 2). Esta cantidad es proporcional a la cantidad de FVIII o
FVIIIa. La determinación de la actividad residual de FVIII hace
entonces posible deducir la concentración de proteasa que está
presente.
La degradación de FVIII/FVIIIa o FV/FVa debido
al efecto proteinolítico puede demostrarse claramente mediante
SDS-PAGE. Dependiendo del tiempo durante el que la
proteasa es incubada, por ejemplo, con un concentrado de FVIII, las
bandas que son típicas para FVIII desaparecen mientras que surgen
otras nuevas bandas, o aumenta la intensidad de bandas débiles. Por
consiguiente, la actividad de la proteasa puede correlacionarse
también cuantificando las bandas decrecientes o crecientes, y por lo
tanto, medirse cuantitativamente, por ejemplo, usando un patrón de
proteasa. Los cambios de las intensidades de las bandas en el
electroforetograma de la SDS-PAGE o siguiendo otros
métodos electroforéticos pueden cuantificarse, por ejemplo, usando
un dispositivo explorador, con el que una persona experta está
familiarizado, y el programa apropiado. Además de esto, pueden
usarse anticuerpos frente a dichos factores de coagulación para
inmunotransferencia (Western blotting), y emplearse para la
determinación de la manera descrita. Los anticuerpos que detectan
específicamente las bandas decrecientes o, en particular, las bandas
que surgen, son particularmente adecuados. En este contexto, estos
anticuerpos pueden usarse también para crear otros ensayos
inmunoquímicos tales como un ELISA.
La desactivación proteinolítica que se ha
descrito en el caso de FVIII/FVIIIa se observa también cuando la
proteasa es incubada con factor V/Va, que manifiesta un cierto grado
de homología estructural con FVIII. La degradación puede seguirse en
sistemas de ensayo de actividad adecuados, y en
SDS-PAGE/inmunotransferencia (Western blotting).
\newpage
A pesar de las desactivaciones de FV y FVIII, se
ha encontrado actualmente que añadiendo la proteasa a la sangre, a
plasma rico en trombocitos, o a plasma, se acortan los tiempos de
coagulación, que es el efecto procoagulante que predomina en
diversos denominados "ensayos globales de coagulación". Se
entiende que estos sistemas de ensayo son, por ejemplo, el tiempo de
tromboplastina parcial no activada (NAPTT), el tiempo de protrombina
(PT), y el tiempo de recalcificación. Ya que el acortamiento de
estos tiempos, como se mide, por ejemplo, en los denominados
coagulómetros, por medio de tromboelastografía o además en ensayos
cromogénicos, correlaciona con la concentración de una sustancia
que favorece la coagulación, la concentración de la sustancia en una
muestra puede deducirse a la inversa usando una curva de calibración
del tiempo de coagulación. La concentración del "activador de
FVII" puede determinarse igualmente usando ensayos globales de
coagulación seleccionados.
También fue sorprendente encontrar que el
"activador de FVII" es también capaz de producir una activación
eficaz de urocinasa monocatenaria (scuPA, activador del plasminógeno
de urocinasa monocatenario) y tPA monocatenario (sctPA, activador
del plasminógeno tisular monocatenario), esto es, puede actuar como
activador del activador del plasminógeno (PAA). La actividad de los
PA activados puede medirse, por ejemplo, usando sustratos
cromógenos. Por consiguiente, esta propiedad puede por lo tanto
usarse también para detectar y cuantificar el "activador de
FVII". La activación de los activadores del plasminógeno puede
determinarse también en una reacción acoplada en presencia de
plasminógeno, o por formación de la propia plasmina o por la
disolución de un coágulo de fibrina que es producido por
plasmina.
En resumen, por lo tanto, puede afirmarse que la
proteasa puede tanto detectarse como cuantificarse incubándola con
una disolución que contenga FVIII o FVIIIa, y determinando luego la
cantidad restante de FVIII/VIIIa por medio de un ensayo de actividad
adecuado. De la misma manera, FV o FVa pueden incubarse con la
proteasa y puede cuantificarse posteriormente la cantidad restante
de FV/FVa. La concentración de proteasa desconocida puede
determinarse cuantitativamente por comparación con una curva patrón
de cantidades crecientes de proteasa que es incluida en el ensayo.
Diversos ensayos globales de coagulación son asimismo adecuados para
la cuantificación, leyéndose la concentración de proteasa en una
curva de calibración sobre la base del acortamiento del tiempo de
coagulación. La actividad de PAA de la proteasa puede usarse también
con fines de determinación.
Otra característica de estos ensayos es que la
desactivación de FV y FVIII y la actividad de PAA se manifiestan
particularmente bien en presencia de concentraciones adecuadamente
altas de calcio, preferiblemente >0,001 mM, preferiblemente de
manera particular >0,005 mM, por ejemplo, en forma de CaCl_{2}.
Por contraste con el análisis cromogénico directo, en el que, como
se ha descrito anteriormente, tanto la heparina como las sustancias
semejantes a la heparina y también el calcio aumentan la actividad
de la proteasa, la desactivación de FV/FVIII no es favorecida, o
sólo favorecida de manera insignificante, por la heparina. Por
contraste, la actividad de PAA es estimulada en presencia de ambos
agentes, esto es, por calcio y/o heparina o sustancias semejantes a
la heparina.
Las reacciones en las que la proteasa actúa como
mediador pueden reducirse muy eficazmente o impedirse incubando la
proteasa con inhibidores, particularmente antitrombina III en
presencia de heparina o sustancias semejantes a la heparina
(preferiblemente en presencia de heparina), inhibidor de
C1-esterasa, \alpha2-antiplasmina,
inhibidor de
inter-\alpha-tripsina, o
inhibidores de proteasa de bajo peso molecular sintéticos conocidos
tales como el éster
para-etoxi-carbonilfenílico del
ácido guanidinocaproico, que está disponible con la marca registrada
FOY®. Estas sustancias pueden usarse por lo tanto para detener la
reacción, para, por ejemplo, definir tiempos de incubación con
precisión, o para aumentar todavía más la especificidad del ensayo.
Reducir los iones de calcio libres en la mezcla con un agente
quelante, por ejemplo, puede usarse también con este fin.
Una tarea adicional resulta ahora, a partir de
las observaciones descritas anteriormente relacionadas con las
acciones proteinolíticas de la nueva proteasa sobre los factores de
la coagulación V y VIII, de inhibir la proteasa o reducir su
actividad para evitar pérdidas de rendimiento y la formación de lo
que pueda ser posiblemente fragmentos proteínicos que interfieren.
Esto es lo más relevante, ya que FV y FVIII se preparan usualmente
a partir de crioprecipitados que se han obtenido a partir de plasma
y en presencia de iones de calcio porque los últimos son necesarios
para mantener las conformaciones proteínicas.
Otra parte de la materia objeto de la invención
es por lo tanto una preparación estabilizada de FV o FVIII que no
tenga fragmentos de factor V o factor VIII formados debido a la
degradación proteinolítica, como resultado del hecho de que es
inhibida la proteasa activadora del factor de la coagulación de la
sangre VII. Ya que investigaciones más detalladas han mostrado que
la desactivación del factor V y del factor VIII por dicha proteasa
tiene lugar eficazmente de manera particular en presencia de
concentraciones de iones de calcio superiores a 0,5 mM, la
preparación del factor V o VIII puede estabilizarse eficazmente si,
para la inhibición de la proteasa activadora del factor de la
coagulación de la sangre VII, las concentraciones de iones de calcio
en la preparación del factor V o del factor VIII se ajustan a un
valor inferior a 1,0 mM, preferiblemente inferior a 0,5 mM. Mientras
que las propiedades de desactivación del factor V y factor VIII de
la proteasa se reducen notablemente a estas concentraciones, la
cantidad de iones de calcio es todavía suficiente para estabilizar
las conformaciones de las moléculas de FV y FVIII. Las cantidades
mencionadas anteriormente de iones de calcio no deben sobrepasarse,
no sólo en el producto final, sino también en el propio
crioprecipitado y en las siguientes etapas de
purificación.
purificación.
De acuerdo con la afinidad descrita
anteriormente de la proteasa o la proenzima con la heparina y
sustancias semejantes a la heparina, la proteasa/la proenzima puede
retirarse de la disolución que contiene FVIII o FV por incubación
con heparina inmovilizada u otros inmunoadsorbentes o adsorbentes de
afinidad adecuados. Los anticuerpos policlonales o monoclonales, los
respectivos fragmentos de anticuerpos que son útiles en la
preparación de los inmunoadsorbentes son fácilmente disponibles
mediante técnicas conocidas en la técnica para usar toda o parte de
la proteasa o proenzima como antígeno.
Sin embargo, también pueden emplearse
inhibidores de proteasa naturales o sintéticos, cuando sea
apropiado, además de reducir la cantidad de iones de calcio, para
impedir la degradación proteinolítica del FV o el FVIII. Pueden
emplearse como inhibidores proteínas tales como aprotinina,
\alpha2-antiplasmina, inhibidor de
C1-esterasa o inhibidor de
inter-\alpha-tripsina. También
pueden usarse en este contexto sustancias de bajo peso molecular
conocidas por la persona experta como inhibidores de
serina-proteasa sintéticos. Pueden añadirse asimismo
inhibidores, tales como antitrombina III, cuyo potencial inhibidor
aumenta con heparina o heparinoides. De este modo, se ha encontrado
sorprendentemente, que mientras la heparina es por sí misma capaz de
aumentar la actividad amidolítica de la proteasa frente a sustancias
cromógenas pequeñas, no apoya la desactivación de FV/FVIII.
La nueva proteasa y/o su proenzima pueden usarse
también terapéuticamente.
Pueden emplearse como agentes coagulantes de la
sangre, o por sí mismos o junto con sustancias que aumentan la
actividad de la proteasa, tales como heparina, o sustancias
relacionadas con la heparina, tal como sulfato de heparano, y/o
iones de calcio, siendo posible también añadir adicionalmente factor
VII, en su forma inactiva, a este agente. El uso de tal agente, en
el que se explota su actividad de bypass del inhibidor de
FVIII (FEIBA), por ejemplo, puede estar indicado cuando existan
intolerancias frente a FVIII y/o FIX y/o FXI y/o las proteínas de
la fase de contacto, tales como FXII, por ejemplo por causa de la
presencia de anticuerpos, o cuando existan otros tipos de
situaciones de carencia. En relación con esto, el FVII puede
activarse o in vitro, en el plasma, en fracciones
enriquecidas o actuando sobre FVII purificado. También es posible
usar el nuevo agente de coagulación de la sangre ex vivo,
para profilaxis general de hemorragias o para hemorragias no
restañables.
Por otra parte, la inhibición observada de la
nueva proteasa mediante aprotinina o los inhibidores mencionados
anteriormente, puede usarse para desarrollar un agente que comprende
un inhibidor de proteasa y que reduce la capacidad de la sangre para
coagular. Además de esto, la nueva proteasa puede usarse también
para identificar factores fisiológicos o no fisiológicos, tales como
péptidos sintéticos, que perjudican la coagulación de la sangre
debido a su efecto inhibidor de proteasa. Las secuencias peptídicas
de los sustratos cromógenos que se transforman eficazmente de manera
particular, tales como los de S-2288 (véase
anteriormente para detalles), pueden usarse como base estructural
para esto. La adición de inhibidores adecuados a preparaciones
coagulantes, o durante su preparación, puede ser necesaria si estas
preparaciones no han de tener actividades proteinolíticas.
Sorprendentemente, se ha encontrado actualmente
una propiedad, en relación con la caracterización más a fondo de la
proteasa, que abre la posibilidad de un uso adicional para la
denominada proteasa "activadora del factor VII". Cuando se
incuban activadores del plasminógeno monocatenarios tales como
prourocinasa (urocinasa monocatenaria, scuPA, activador del
plasminógeno de urocinasa monocatenario) o sctPA (activador del
plasminógeno tisular monocatenario), el "activador del factor
VII" produce la activación de estos activadores del plasminógeno
(PA). Con respecto a esto, hay una proteinólisis limitada de los PA
monocatenarios, que da como resultado la formación de proteasas
bicatenarias, que son particularmente adecuadas para activar el
plasminógeno. La plasmina resultante es la efectora de la
fibrinólisis, que es el sistema fisiológico que es responsable de
disolver los trombos. Los PA, tales como prourocinasa o tPA, son
proteínas endógenas que se liberan cuando se necesita y que, como es
conocido, se activan mediante plasmina o mediante calicreína
(scuPA). El mecanismo mediante el cual se activa scuPA en el estado
sano no se ha aclarado todavía completamente.
Los activadores del plasminógeno se emplean
terapéuticamente, como proteínas aisladas o preparadas mediante
ingeniería genética, en preparaciones farmacéuticas en relación con
enfermedades o complicaciones tromboembólicas, tales como en
flebotrombosis, infarto de miocardio o ictus.
De acuerdo con las propiedades del "activador
del factor VII" que se han encontrado actualmente, el último
puede usarse para la activación in vivo o ex vivo de
los activadores del plasminógeno tales como prourocinasa o sctPA.
Esta actividad puede aplicarse también usando dicha proteasa para la
profilaxis o tratamiento de enfermedades tromboembólicas,
específicamente en combinación con activadores del plasminógeno
monocatenarios o bicatenarios, o también anticoagulantes. Este
posible uso no es contradictorio con el hecho de que la proteasa es
también capaz de actuar de un modo procoagulante. La cuestión de
cual de las dos reacciones predomina se resuelve probablemente por
la disponibilidad de los sustratos fisiológicos. Conforme al estado
actual de conocimiento, el factor VII es activado moderadamente en
el plasma y mantiene continuamente una cierta concentración de FVIIa
para ser capaz de contrarrestar inmediatamente cualquier daño
vascular súbito. Por otra parte, en un mililitro de plasma
sanguíneo sólo están presentes nanogramos de activador del
plasminógeno tisular y activador del plasminógeno de urocinasa.
Solamente cuando se produce la precipitación de fibrina o trombos
hay un aumento de la concentración, por secreción o síntesis, de
activadores del plasminógeno, que muestran luego su actividad
trombolítica activando el plasminógeno después de haber sido
activados localmente, en particular, cuando se unen al trombo.
Cuando están presentes PA monocatenarios, particularmente de una
manera restringida localmente, su activación puede tener más peso
que la activación de FVII, haciendo posible de ese modo ajustarse a
la situación fisiológica. Por consiguiente, esta proteasa puede
regular también la hemostasia, indicándose de ese modo una
reposición con la proteasa en caso de carencias congénitas y
adquiridas.
Otra parte de la materia objeto de la invención
es, por lo tanto, una preparación farmacéutica que comprende una
cantidad de proteasa activadora del factor de la coagulación de la
sangre VII y/o su forma de proenzima, que es suficiente para
disolver trombos que contienen fibrina. Esta preparación puede
comprender adicionalmente activadores del plasminógeno
monocatenarios (PA) y/o anticoagulantes. Cuando la proenzima está
presente, es ventajoso que comprenda un agente activador adecuado
dentro o junto con la preparación farmacéutica anterior.
Ya que se ha encontrado que el efecto de
refuerzo de activadores del plasminógeno del "activador de
FVII" está favorecido particularmente por calcio y/o heparina y
sustancias semejantes a la heparina, tales como sulfato de dextrano,
pueden emplearse ventajosamente de manera particular preparaciones
farmacéuticas que comprendan adicionalmente sales solubles de calcio
y/o heparina o sustancias semejantes a la heparina para disolver, de
acuerdo con la invención, trombos que contengan fibrina. En este
contexto, la proteasa/proenzima puede emplearse por sí misma o en
combinación con activadores del plasminógenos monocatenarios o
bicatenarios, con o sin sustancias que manifiesten afinidades
particulares por la proteasa, y aumentando de ese modo su actividad
como sustancias que actúan como vehículos para prolongar la semivida
en el plasma o como mediadores para superficies.
Las preparaciones farmacéuticas que comprenden
la proteasa activadora del factor de la coagulación de la sangre
VII pueden, debido a su efecto fibrinolítico especial, emplearse
para tratar enfermedades que están provocadas por trombos que
contienen fibrina. Los procesos fibrinolíticos están implicados
también en procesos de cicatrización de heridas. En relación con
esto, dichas proteasa y/o proenzima pueden administrarse por vía
intravenosa o local, subcutánea, intradérmica o intramuscular, o
además tópica en caso de lesiones y heridas, o unidas a un matriz
que actúa como vehículo adecuada. Tanto la proteasa como la
proenzima que se han aislado a partir de fluidos corporales tales
como sangre o plasma, y la proteasa/proenzima que se han preparado
mediante ingeniería genética o de modo transgénico, pueden emplearse
en este contexto. La proteasa/proenzima es también adecuada para
usar como componente de un denominado adhesivo de fibrina, que no
debe contener ninguna sustancia, tal como aprotinina, que inhiba la
proteasa/proenzima. En este caso, pueden usarse las propiedades de
acortamiento de la coagulación de la proteasa.
La proteasa/proenzima anterior puede usarse para
carencias hemostáticas hereditarias o adquiridas, en sucesos
hemorrágicos (difusos) en las respectivas complicaciones asociadas
con la trombosis. Si se usa para tratar hemorragias, la combinación
de proteasa/proenzima junto con F VIII, opcionalmente con adición de
más factores de coagulación, es ventajosa.
Como proteína que se ha aislado a partir de
plasma humano, la nueva proteasa y/o su proenzima puede emplearse
solamente como una preparación farmacéutica si se ha sometido
previamente a un procedimiento para desactivar virus. El
procedimiento de pasteurización es reconocido en particular como el
procedimiento más importante para desactivar virus. Sin embargo, el
calentamiento a aproximadamente 60ºC durante hasta 10 horas requiere
que la proteína que ha de tratarse sea de una estabilidad adecuada.
Los estabilizantes óptimos han de determinarse por separado para
cada proteína, y sus concentraciones han de optimizarse.
En el caso de la nueva proteasa y/o su
proenzima, las condiciones que estabilizan la proteína en
disolución, sin llevarse a cabo ninguna pasteurización, ya se han
mencionado anteriormente. Con respecto a esto, se ha demostrado que
un intervalo de pH ligeramente ácido es ventajoso. Sin embargo,
cuando se lleva a cabo una pasteurización en estas condiciones, como
regla, la nueva proteasa y/o su proenzima pierden más de 50% de su
actividad original.
Se ha encontrado actualmente que una
pasteurización de una preparación farmacéutica que comprende la
nueva proteasa y/o su proenzima, asegura unos resultados óptimos de
estabilización si la preparación se prepara:
- a)
- en un intervalo de pH desde 3,5 hasta 8,0, preferiblemente en un intervalo de pH desde 4,0 hasta 6,8;
- b)
- en presencia de uno o más aminoácidos añadidos en una cantidad de más de 0,01 moles/l, preferiblemente más de 0,05 moles/l; y/o
- c)
- en presencia de un azúcar o de una combinación de diferentes azúcares añadidos que tienen una concentración total de más de 0,05 g/ml, preferiblemente más de 0,2 g/ml; y/o
- d)
- en presencia de una o más sustancias añadidas que son capaces de formar complejos con iones de calcio, tales como citrato, oxalato, ácido etilendiaminotetraacético, etc.
También pueden usarse aditivos tales como
albúmina, Haemaccel®, heparina y heparinoides, glicerol, glicol y
polietilenglicol, por separado o mezclados unos con otros. Después
de haberse completado la pasteurización, los azúcares, aminoácidos y
otros aditivos que se hayan añadido como estabilizantes pueden
reducirse, o retirarse completamente de la preparación, usando
métodos que son familiares para la persona experta. Los resultados
de los procedimientos de pasteurización se presentan en los ejemplos
12 y 13.
El sistema de ensayo Staclot®
FVIIa-rTF (Stago/Boehringer Mannheim) se usó para
demostrar la activación de FVII mediante la proteasa preparada. Este
sistema de detección se basa en la propiedad particular del factor
tisular soluble (rTF) (recombinante), que es solamente capaz de usar
el FVII activado preformado (FVIIa) para iniciar la vía de
coagulación extrínseca. Por contraste con la situación cuando se usa
el factor tisular completo, esto hace posible determinar el
contenido real de FVIIa con precisión.
Se usó FVII aislado (Enzyme Research Labs) para
los experimentos de activación. Este mismo FVII contiene pequeñas
cantidades de FVIIa, ya que es aislado de plasma humano. La
concentración se ajustó a 0,05 UI de FVII/ml diluyendo con tampón.
El FVII se incubó a temperatura ambiente durante 10 min con las
sustancias de ensayo, y luego se ensayó para determinar el contenido
verdadero de FVIIa. Los contenidos de FVIIa se cuantificaron usando
una curva de referencia que se construyó en paralelo.
Se descubrió en experimentos preliminares, que
no se describen en la presente invención, que mientras, en la
concentración empleada, la aprotinina inhibió completamente la
actividad de la proteasa preparada, no tuvo efecto directo en el
FVIIa ni ningún efecto significativo en el sistema de ensayo
FVIIa-rTF.
Los resultados que se presentan a continuación
se refieren en cada caso a determinaciones por triplicado.
Se establecieron por lo tanto los siguientes
análisis experimentales:
Se usó FVII no activado como el análisis
testigo. Este ya contenía pequeñas cantidades de FVIIa (véase
anteriormente) en el orden de magnitud de 10 mUI de FVIIa/ml.
En este análisis, se incubó FVII en presencia de
aprotinina, y se usó en el análisis de FVIIa-rTF
para demostrar que el propio FVIIa no fue inhibido, y el ensayo
tampoco fue afectado por la aprotinina empleada. Esto fue confirmado
(en comparación con el análisis 1).
En este caso, se dio tiempo a la proteasa para
activar el FVIIa. Se añadió solamente aprotinina, para inhibir la
proteasa, después de que la incubación de 10 minutos hubo tenido
lugar. El FVIIa resultante fue cuantificado en el análisis de
FVIIa-rTF. Restando el valor de base de FVIIa
(análisis 1), se habían formado por lo tanto 8 mUI de FVIIa/ml por
la acción de la proteasa bajo las condiciones elegidas.
En este análisis, la proteasa fue inhibida con
aprotinina antes del contacto con FVII. Ni la incubación posterior
con FVII, ni la siguiente cuantificación de FVIIa condujo a ningún
aumento significativo del contenido de FVIIa (porque del intervalo
de variación en el análisis, 11 frente a 10 mUI/ml en el análisis 1,
no ha de considerarse como significativo).
Este análisis demostró que, a la concentración
seleccionada, la proteasa no tuvo por sí misma ningún efecto en el
sistema de ensayo FVIIa-rTF.
En resumen, de lo anterior resulta que:
- -
- la proteasa descrita activa FVII;
- -
- la activación de FVII por la proteasa tiene lugar "directamente", esto es, independientemente de la presencia de rTF;
\newpage
- -
- la activación de FVII puede ser inhibida por aprotinina; a la concentración seleccionada, la propia aprotinina no tiene ninguna influencia significativa sobre el sistema de ensayo.
Este ejemplo describe cómo es activado FVII en
una reacción que depende de la concentración de la proteasa y del
tiempo durante el cual la proteasa es incubada con FVII.
Se seleccionaron sistemas de ensayo y reactivos
para corresponder con las condiciones descritas en el ejemplo 1. En
una primera serie de experimentos, el FVII introducido inicialmente
fue preincubado con diferentes diluciones (1:5, 1:10 y 1:20) de las
disoluciones que contenían la proteasa (5 min a temperatura
ambiente), luego fue tratado con aprotinina (para inhibir la
proteasa), y posteriormente ensayado para determinar el contenido de
FVIIa en el análisis FVIIa-rTF.
Una vez más, los análisis paralelos, en los que
la proteasa había sido inhibida por aprotinina antes del contacto
con FVII, sirvieron como análisis testigo.
Los resultados se presentan como factores de
activación, es decir, corresponden a x veces el valor que fue medido
en el análisis testigo mencionado anteriormente:
| \hskip0,5cm Análisis | Testigo |
| Proteasa + FVII | Proteasa + aprotinina |
| Incubación | Incubación |
| + aprotinina | + FVII |
\vskip1.000000\baselineskip
| Dilución de la | Factor de activación | ||
| disolución de proteasa | |||
| 1:5 | 2,6 | 1,0 | |
| 1:10 | 2,0 | 1,0 | |
| 1:20 | 1,6 | 1,0 |
El factor de activación 1:0 de los análisis
testigo corresponde al testigo, que se incluyó adicionalmente y en
el que sólo el tampón de ensayo, que contenía el FVII empleado, se
trató en idénticas condiciones de incubación, y se ensayó. Esto es,
no tuvo lugar una activación significativa en los análisis
testigo.
De esto resulta que el FVII es activado por la
proteasa de una manera que depende de la concentración de la
proteasa.
Se demostró de manera similar que, cuando las
concentraciones de los agentes correaccionantes se mantienen
constantes, el FVII es activado por la proteasa de una manera que
depende de la duración de la incubación.
Cuando se incubaron conjuntamente volúmenes
iguales de una disolución que contenía 0,2 UI de FVII/ml y una
disolución de proteasa diluida 1:10, se obtuvieron los siguientes
contenidos de FVIIa después de incubar durante los tiempos
adecuados, y añadir posteriormente aprotinina (para detener la
activación):
| Duración de la incubación | Factor de activación | |
| 0 min | 1,0 | |
| 2,5 min | 1,3 | |
| 5,0 min | 2,0 | |
| 10,0 min | 2,8 | |
| 40,0 min | >3,8 |
De esto resulta que el FVII es activado por la
proteasa de una manera que depende del tiempo.
Usando este ejemplo, se demostrará que la
activación de FVII por la proteasa aumenta en presencia de iones de
calcio y heparina.
Se mezclaron 25 \mul de la disolución que
contenía proteasa con 50 \mul de:
- -
- tampón (testigo)
- -
- CaCl_{2} 15 mM
- -
- 50 unidades USP (farmacopea de EE.UU.) de heparina/ml
- -
- Pathromtin (mezcla de lípidos, cantidad disuelta de acuerdo con las instrucciones del fabricante)
a temperatura ambiente durante 5
min, y luego se trataron con 150 \mul de una disolución tampón de
trometamol/NaCl (pH, 8,2) y 25 \mul del sustrato cromógeno
S-2288 (3 mM); se midió luego el cambio dependiente
del tiempo en la extinción a 405 nm (a 37ºC). Los factores de
activación, relacionados con el testigo tampón (x veces), se
presentan en la tabla
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
| Análisis | Factor de activación |
| (x veces el testigo tampón) | |
| Testigo tampón | 1,0 |
| + CaCl_{2} | 3,6 |
| + heparina | 2,6 |
| + lípido | 0,9 |
| + CaCl_{2} + heparina | 4,3 |
| + CaCl_{2} + lípido | 3,3 |
| + heparina + lípido | 2,7 |
| + CaCl_{2} + heparina + lípido | 3,7 |
Bajo las condiciones usadas en este ejemplo,
pueden observarse aumentos notables de la actividad de la proteasa
en presencia de iones de calcio y/o heparina.
En cada caso, se mezclaron 25 \mul de una
disolución que contenía 10, 1 ó 0,1 \mug de proteasa/ml con 25
\mul de FVIII (2 UI/ml), después de lo cual se añadieron 25 \mul
de CaCl_{2} (25 mM) y 25 \mul de Pathromtin® (Dade Behring
GmbH). Después de incubar a 37ºC durante 0, 3, 10 y 20 min, la
reacción de detuvo añadiendo 400 \mul de aprotinina (500 kUI/mg).
Una muestra en la que inicialmente se introdujo aprotinina sirvió
como testigo.
Cada muestra se diluyó en tampón de
trometamol/seroalbúmina bovina (BSA). En cada caso, se mezclaron 50
\mul de esta disolución con 50 \mul del reactivo de factores
(compuesto esencialmente de FIXa, FX y un inhibidor de trombina,
modificado apropiadamente de acuerdo con el ensayo de FVIII
Coamatic®, Chromogenix AB), y se incubaron a 37ºC durante 10 min.
Después de que se hubieran añadido 50 \mul de sustrato (por
ejemplo, S-2765,
Na-Cbo-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilina),
la reacción se detuvo después de un periodo predeterminado de
incubación, añadiendo 50 \mul de ácido acético (50%), y se midió
entonces la DO a 405 nm. Se usó una curva patrón para FVIII para
determinar la concentración en la muestra.
En un primer análisis, se mantuvo constante (10
min) el tiempo durante el que se incubó la proteasa con FVIII (2
UI/ml), pero se varió la concentración de la proteasa (0,1, 1 y 10
\mug/ml). La reacción se detuvo y se determinó la concentración
residual de FVIII activo. Conforme aumentaba la concentración de
proteasa, más FVIII era desactivado equivalentemente (figura 1).
El contenido de proteasa de una muestra puede
cuantificarse usando una curva patrón apropiada.
En un segundo análisis, la concentración de la
proteasa se mantuvo constante (10 \mug/ml), pero se varió el
tiempo de incubación con FVIII (2 UI/ml). Se vio una reducción
notable en la concentración residual de FVIII activo conforme
aumentaba el tiempo de incubación (figura 2).
Se investigó la influencia del "activador de
FVII" sobre la actividad del factor V:
Se incubaron 25 \mul de disolución que
contenía proteasa (0-100 \mug/ml) con 50 \mul de
FV (5 UI/ml) y 25 \mul de CaCl_{2} 25 mM (0-20
min) y, después de eso, se añadieron 400 \mul de tampón que
contenía 100 kUI de aprotinina/ml.
En cada caso, se incubaron luego 100 \mul de
cada análisis de incubación con 100 \mul de plasma con carencia de
FV, a 37ºC durante 1 min, después de lo cual se mezclaron dentro 200
\mul de Thromborel S®, y se determinaron los tiempos de
coagulación en un coagulómetro Schnitger and Gross. Se determinaron
las actividades residuales de FV.
\vskip1.000000\baselineskip
| Concentración de proteasa | Actividad residual de FV | |||
| (\mug/ml) | Tiempo durante el cual la proteasa se | |||
| incubó con FV (min) | ||||
| 0 | 10 | 20 | ||
| 10 | 93 | 91 | 100 | |
| 30 | 100 | 93 | 28 | |
| 100 | 100 | 29 | 13 |
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demuestra que FV fue desactivado
por la proteasa con el tiempo.
Se investigó la influencia del "activador de
FVII" sobre los tiempos de coagulación en los denominados ensayos
globales, usando coagulómetros Schnitger and Gross. Todos los
valores de diferencias listados corresponden a los tiempos de
coagulación que fueron acortados con esta cantidad.
La disolución que contenía proteasa se diluyó
con tampón hasta 100, 30, 10 y 3 \mug/ml. 100 \mul de cada una
de estas disoluciones se incubó, a 37ºC durante 2 min, con 100
\mul de plasma con citrato (mezcla de plasmas humanos estándar o
de donantes individuales) y 100 \mul de Pathromtin®, después de lo
cual se añadieron 100 \mul de CaCl_{2} 25 mM; se determinaron
luego los tiempos de coagulación. Se determinaron las diferencias
entre estos valores medidos y los tiempos de coagulación
correspondientes obtenidos con disolución de tampón en vez de
la
proteasa.
proteasa.
\vskip1.000000\baselineskip
| Muestra Nº | Diferencias de tiempo de coagulación | |||||
| (tampón menos muestra) (s) | ||||||
| Concentración de proteasa (\mug/ml) | ||||||
| 0 | 3 | 10 | 30 | 100 | ||
| Plasma humano | ||||||
| estándar (213 s) | 0 | 13 | 20 | 42 | 43 | |
| 1 | 0 | 20 | 33 | 42 | 41 | |
| 2 | 0 | 27 | 31 | 45 | 47 | |
| 3 | 0 | 13 | 14 | 23 | 29 | |
| 4 | 0 | 18 | 37 | 51 | 50 | |
| 5 | 0 | 25 | 49 | 54 | 46 |
\vskip1.000000\baselineskip
La adición de activador de FVII dio como
resultado un acortamiento de NAPTT dependiente de la
concentración.
La disolución que contenía proteasa se diluyó
con tampón hasta 100, 30, 10 y 3 \mug/ml. 100 \mul de cada una
de estas disoluciones se incubó con 100 \mul de plasma con citrato
(mezcla de plasmas humanos estándar o de donantes individuales), a
37ºC durante 1 min, después de lo cual se añadieron 100 \mul de
CaCl_{2} 25 mM; se determinaron luego los tiempos de coagulación.
Se determinaron las diferencias entre estos valores medidos y los
tiempos de coagulación correspondientes obtenidos con disolución de
tampón en vez de la proteasa.
\newpage
| Muestra Nº | Diferencias de tiempo de coagulación | |||||
| (tampón menos muestra) (s) | ||||||
| Concentración de proteasa (\mug/ml) | ||||||
| 0 | 3 | 10 | 30 | 100 | ||
| Plasma humano | ||||||
| estándar (283 s) | 0 | 17,2 | 15,1 | 30,5 | 50,4 | |
| 1 | 0 | 29,8 | 51,7 | 60,3 | 90,1 | |
| 2 | 0 | 25,2 | 51,7 | 69,5 | 101,3 | |
| 3 | 0 | 28,0 | - | 39,0 | 74,6 | |
| 4 | 0 | 27,3 | 42,7 | 55,6 | 91,8 | |
| 5 | 0 | 44,3 | 69,1 | 101,2 | 134,2 |
\vskip1.000000\baselineskip
La disolución que contenía proteasa se diluyó
con tampón hasta 100, 30, 10 y 3 \mug/ml. 100 \mul de cada una
de estas disoluciones se incubó con 100 \mul de plasma con citrato
(mezcla de plasmas humanos estándar o de donantes individuales), a
37ºC durante 1 min, después de lo cual se añadieron 200 \mul de
Thromborel S® (Dade Behring GmbH); y se determinaron luego los
tiempos de coagulación.
Se determinaron las diferencias entre estos
valores medidos y los tiempos de coagulación correspondientes
obtenidos con disolución de tampón en vez de la proteasa.
\vskip1.000000\baselineskip
| Muestra Nº | Diferencias de tiempo de coagulación | |||||
| (tampón menos muestra) (s) | ||||||
| Concentración de proteasa (\mug/ml) | ||||||
| 0 | 3 | 10 | 30 | 100 | ||
| Plasma humano | ||||||
| estándar (13,6 s) | 0 | 1,0 | 1,7 | 1,5 | 2,4 | |
| 1 | 0 | 0,7 | 1,3 | 2,4 | 2,7 | |
| 2 | 0 | 0,3 | 0,4 | 1,7 | 3,1 | |
| 3 | 0 | 0,4 | 0,7 | 1,5 | 1,8 | |
| 4 | 0 | 0,1 | 0,7 | 1,8 | 3,1 | |
| 5 | 0 | 0,3 | 0,5 | 1,2 | 2,8 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los tiempos de coagulación en los ensayos
globales anteriores se acortaron de una manera dependiente de la
concentración de proteasa. De una manera correspondiente, fue
posible, después de "calibrar" un plasma que se usó con una
cantidad conocida del "activador de FVII", determinar la
concentración de proteasa en una muestra por lectura a partir de una
curva patrón.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Las propiedades de activación del activador del
plasminógeno del "activador de FVII" se investigaron usando
urocinasa monocatenaria (scuPA) y tPA monocatenario (sctPA).
- 0,1 ml de
- disolución de PA (20 \mug de scuPA/ml o 100 \mug de sctPA/ml)
- +0,1 ml de
- tampón de ensayo o
- \quad
- 100 U de heparina/ml en el tampón de ensayo o CaCl_{2} 20 mM en el tampón de ensayo
- +0,5 ml de
- tampón de ensayo
\newpage
- +0,1 ml de
- proteasa/muestra (concentraciones crecientes:
- \quad
- 2-10 \mug de scuPA/ml o
- \quad
- 50-200 \mug de sctPA/ml)
- Incubación
- 37ºC
- +0,1 ml de
- 100 kUI de aprotinina/ml en tampón de ensayo
- Incubación
- a 37ºC durante 2 min
- +0,1 ml de
- sustrato S-2444 (3 mM)
\vskip1.000000\baselineskip
Como testigo, se introdujo aprotinina
inicialmente, en vez del activador del plasminógeno (PA), antes de
la primera incubación, y se llevó a cabo en cada caso. En cambio, no
se añadió PA hasta más tarde, en lugar de aprotinina.
La diferencia de las mediciones (\Delta)
\DeltaDO_{405} nm se determinó mediante fotometría. Los valores
testigo que se obtuvieron se restaron a los valores de
muestra/proteasa, y de este modo se determinó la actividad de PA que
fue causada por la actividad de PAA (en mUI/min).
| Tiempo de | Actividad de PA resultante (\DeltamUI/min) | |||
| Incubación (min) | "Activador de FVII" (\mug/ml) | |||
| 2 | 5 | 10 | ||
| 2 | 25 | 60 | 117 | |
| 5 | 79 | 179 | 165 | |
| 10 | 186 | 449 | 517 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Tiempo de | Actividad de PA resultante (\DeltamUI/min) | |||
| Incubación (min) | "Activador de FVII" (\mug/ml) | |||
| 2 | 5 | 10 | ||
| 2 | 190 | 332 | 425 | |
| 5 | 330 | 455 | 458 | |
| 10 | 417 | 462 | 460 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Tiempo de | Actividad de PA resultante (\DeltamUI/min) | |||
| Incubación (min) | "Activador de FVII" (\mug/ml) | |||
| 2 | 5 | 10 | ||
| 2 | 255 | 370 | 401 | |
| 5 | 338 | 424 | 438 | |
| 10 | 416 | 445 | 448 |
Las tablas ilustran el hecho de que scuPA se
activó de una manera dependiente de la concentración del
"activador de FVII" y de la duración de la incubación. Al
mismo tiempo, tanto la heparina como el calcio tuvieron un efecto
estimulador sobre la activación del PA que se produjo mediante la
proteasa.
Ya que la velocidad de recambio del tPA activado
solamente aumenta en un factor de 3-4 cuando se
compara con la proenzima de tPA (mientras que la de uPA aumenta en
una factor de 1000-1500), tuvieron que seleccionarse
mayores concentraciones de los dos agentes correaccionantes (véase
anteriormente), para obtener una señal de medida analizable.
\vskip1.000000\baselineskip
| Tiempo de | Actividad de PA resultante (\DeltamUI/min) | |
| Incubación (min) | "Activador de FVII" (200 \mug/ml) | |
| 1 | 10,2 | |
| 2 | 16,8 | |
| 5 | 38,8 | |
| 10 | 60,2 | |
| 20 | 73,3 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| "Activador de FVII" | Actividad de PA (\DeltamUI/min) | |
| (\mug/ml) | ||
| 50 | 33,6 | |
| 100 | 51,0 | |
| 200 | 71,9 |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
| Estimulante | Actividad de PA (\DeltamUI/min) | |
| Ninguno | 5,9 | |
| CaCl_{2} | 25,3 | |
| Heparina | 63,8 |
\vskip1.000000\baselineskip
Las tablas demuestran que sctPA también fue
activado de una manera dependiente de la concentración de la
proteasa y del tiempo de incubación. Tanto la heparina como los
iones de calcio tuvieron un efecto estimulador sobre la capacidad de
activación de PA del "activador de FVII".
Se incubaron dos disoluciones que contenían
FVIII, una de las cuales no tenía esencialmente factor de Von
Willebrand mientras que la otra contenía factor de Von Willebrand,
con la proteasa mencionada anteriormente, en presencia de calcio.
Después de tiempos predeterminados, se determinaron las actividades
residuales de FVIII por medio de un ensayo cromogénico, y se
relacionaron con los análisis testigo sin proteasa.
Para esto, se trataron 25 \mul de una
disolución que contenia 0,1 UI de FVIII/ml con el mismo volumen de
la disolución de proteasa (10 \mug/ml), y el total se mezcló con
25 \mul de CaCl_{2} (25 mM). Después de periodos de incubación
de 0, 5, 10 y 20 min a 37ºC, los análisis se trataron en cada caso
con 400 \mul de una disolución que contenía 200 kUI de
aprotinina/ml, para detener la actividad proteinolítica de la
proteasa. Experimentos preliminares mostraron que esta concentración
de aprotinina no tuvo un efecto de interferencia significativo sobre
el ensayo de actividad de FVIII descrito más adelante (análisis 1 +
3). En el análisis 2, la proteasa se incubó con aprotinina antes del
contacto con FVIII, después de lo cual el procedimiento fue como se
ha descrito anteriormente.
En cada caso, 50 \mul de la muestra que fue
detenida (o después de una dilución adicional) se trataron luego
con el denominado reactivo de factores, compuesto esencialmente de
FIXa, FX y un inhibidor de trombina, y se incubaron a 37ºC durante
10 min. Después de la adición de 50 \mul de un sustrato cromógeno
que se escinde mediante FX activado, la reacción se detuvo después
de 5 minutos de incubación añadiendo 50 \mul de ácido acético
(50%); y luego se midió la \DeltaDO405 nm. Se determinó la
actividad de FVIII (mUI) con la ayuda de una curva patrón que se
construyó usando una serie de diluciones que se preparó a partir del
concentrado de FVIII y que se incluyó en el
ensayo.
ensayo.
Las actividades de FVIII se presentan en tantos
por ciento de los testigos a los que no se añadió la proteasa.
\vskip1.000000\baselineskip
| Actividad de FVIII (%) | ||||
| Análisis | Periodo de incubación (min) | |||
| 0 | 5 | 10 | 20 | |
| 1. FVIII | 97 | 27 | 11 | <1 |
| 2. FVIII/aprotinina | 98 | 97 | 97 | 96 |
| 3. FVIII/factor de Von Willebrand | 98 | 16 | 14 | 1 |
\vskip1.000000\baselineskip
En presencia de CaCl_{2} (en este caso 6,25
mM), el FVIII fue desactivado por la proteasa de una manera
dependiente de la duración de la incubación. El factor de Von
Willebrand no protegió al FVIII de la desactivación por la
proteasa. La inhibición de la proteasa con aprotinina antes del
contacto con FVIII impidió que este último se
desactivase.
desactivase.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Esta serie experimental se llevó a cabo como se
describe en el ejemplo 1/análisis 1, pero en este caso se variaron
las concentraciones de calcio en las mezclas de proteasa y FVIII.
Para esto, se añadió CaCl_{2}, de la disolución madre de calcio,
hasta las concentraciones finales mostradas en la figura 3.
Si la concentración de calcio en el análisis
disminuye por debajo de 1 mM, aproximadamente 50% del FVIII está
disponible luego en estas condiciones. Por debajo de 0,5 mM de
calcio, el tanto por ciento disponible es superior a 60% (figura
1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se investigó la influencia del "activador de
FVII" sobre los tiempos de coagulación en los denominados ensayos
globales por medio de tromboelastografía.
El cambio en la elasticidad de cizallamiento o
la resistencia del coágulo de sangre apropiado se registró
continuamente usando un tromboelastógrafo Hilgard (de Hellige). Los
denominados valores r y k son, respectivamente, los tiempos desde
el comienzo de la retirada de la sangre y desde el inicio de la
reacción de coagulación, y, en el caso de plasma sanguíneo con
citrato, el tiempo de recalcificación hasta que la curva de TEG se
ha ensanchado en 1 mm y el tiempo desde el punto final del valor r
hasta que la curva se ha ensanchado hasta 20 mm (tiempo de formación
del coágulo).
Para esto, se incubaron en cada caso partes
iguales de 150 \mul de sangre o plasma de 5 donantes en las
cubetas de medición, a 37ºC durante 2 min, después de lo cual se
mezclaron en ellas 50 \mul de muestra (proteasa). La reacción se
inició añadiendo 100 \mul de CaCl_{2} 25 mM. La concentración
final del "activador de FVII" en el análisis fue de 15
\mug/ml. El acortamiento del tiempo r se midió en relación con el
análisis que contenía tampón en vez de la
muestra.
muestra.
\newpage
| Sangre Nº | Muestra | tiempo r | tiempo k | tiempo r+k |
| (min) | (min) | (min) | ||
| 1 | Proteasa | 5,2 | 3,4 | 8,6 |
| 1 | Tampón | 7,8 | 5,6 | 13,4 |
| 2 | Proteasa | 5,2 | 5,1 | 10,3 |
| 2 | Tampón | 6,8 | 7,1 | 13,9 |
| 3 | Proteasa | 4,0 | 5,2 | 9,2 |
| 3 | Tampón | 6,5 | 6,3 | 12,8 |
| 4 | Proteasa | 4,5 | 4,8 | 9,3 |
| 4 | Tampón | 4,8 | 6,0 | 10,8 |
| 5 | Proteasa | 4,2 | 3,8 | 8,0 |
| 5 | Tampón | 7,0 | 5,8 | 12,8 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Plasma Nº | Muestra | tiempo r (min) |
| 1 | Proteasa | 9,0 |
| 1 | Tampón | 11,3 |
| 2 | Proteasa | 9,2 |
| 2 | Tampón | 12,5 |
| 3 | Proteasa | 9,5 |
| 3 | Tampón | 9,6 |
| 4 | Proteasa | 8,2 |
| 4 | Tampón | 12,1 |
| 5 | Proteasa | 9,7 |
| 5 | Tampón | 14,1 |
Este ejemplo subraya que, en casi todos los
casos, la adición de la proteasa dio como resultado un acortamiento
notable del tiempo de coagulación. En este caso presente, las
propiedades fibrinolíticas del "activador de FVII" regresaron
al fondo. Una razón para esto es que en "sujetos normales", las
concentraciones de activador del plasminógeno en el plasma están
situadas en la región de los nanogramos y no tienen ningún efecto en
el ensayo de coagulación in vitro.
La actividad de bypass del inhibidor de FVIII de
la proteasa se demostró con el siguiente análisis experimental: se
usó la tromboelastografía como técnica de medición. Se determinó el
tiempo r (véase el ejemplo 10). Se incubó una muestra de sangre con
un anticuerpo monoclonal, cuyas propiedades de inhibición de
actividad de FVIII son conocidas, para estimular la presencia de un
inhibidor de FVIII natural (anticuerpo frente a FVIII). Esta
muestra se comparó con la muestra de sangre testigo (tampón en vez
de Mab (anticuerpo monoclonal)). La actividad de bypass del
inhibidor de FVIII de la proteasa se ensayó añadiendo la proteasa
(concentración final, 17 \mug/ml) a la muestra de sangre que
había sido inhibida por el Mab. Se añadió proteasa a una muestra
adicional, y se determinó el efecto de la proteasa, por sí misma,
sobre el tiempo r.
| Tiempo r | |
| Sangre testigo | 8,0 |
| Sangre + mAb | 11,0 |
| Sangre + mAb + proteasa | 8,0 |
| Sangre + proteasa | 3,5 |
La prolongación del tiempo r, provocada por el
mAb anti-FVIII, se normalizó de nuevo por la
presencia de la proteasa, ilustrando por lo tanto la actividad de
bypass del inhibidor de FVIII de la proteasa. La proteasa acortó por
sí misma el tiempo de coagulación, como ya se ha demostrado
anteriormente.
Se añadieron las siguientes sustancias a una
disolución, que contenía 50 \mug de la proteasa activadora de
FVII/ml, para proporcionar las concentraciones finales
correspondientes:
- Citrato de Na 25 mM
- HEPES 25 mM
- Arginina 100 mM
- 0,75 g de sacarosa/ml
La disolución se dividió en partes, y las
cantidades iguales se ajustaron en cada caso a diferentes valores
de pH, desde 5,0 hasta 8,6, y luego se calentaron a 60ºC durante 10
horas.
Se determinaron las actividades de las
disoluciones calentadas de proteasa en un ensayo cromogénico,
registrándose la amidólisis dependiente del tiempo del sustrato
cromógeno S-2288
(H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilina.2HCl,
Chromogenix AB, Suecia). Esta actividad se expresó como tanto por
ciento de las cantidades iguales que no se calentaron y que se
midieron en paralelo:
\vskip1.000000\baselineskip
| Análisis | Actividad (%) |
| Material de partida | 100 |
| pH 5,0 | 76 |
| pH 5,5 | 65 |
| pH 6,1 | 81 |
| pH 6,5 | 50 |
| pH 7,1 | 43 |
| pH 7,5 | 46 |
| pH 8,1 | 46 |
| pH 8,6 | 32 |
\vskip1.000000\baselineskip
Esta serie de experimentos subraya que la
estabilización, particularmente en el intervalo de pH ácido, ha
reducido notablemente la desactivación de la proteasa. La ligera
"recaída" a pH 5,5 puede explicarse por el hecho de que el
punto isoeléctrico de la proteasa está en este intervalo. El citrato
de Na impide una pérdida de actividad de >50% que se produce en
el intervalo preferido de pH.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
El análisis a pH 6,1 (ejemplo 1) mostró la mejor
estabilización de la proteasa. Por consiguiente, se ensayaron
diferentes aditivos a pH 6,0 y se evaluaron como se describe en el
ejemplo 1:
Se ajustaron las siguientes concentraciones
finales, siendo la concentración de la proteasa de 50 \mug/ml:
- Citrato de Na 50 mM/NaCl 50 mM, pH 6,0
- 0,75 g de sacarosa/ml
- glicina 100 mM
- arginina 100 mM
\newpage
| Análisis | Actividad (%) |
| Material de partida | 100 |
| Citrato de Na/NaCl | 54 |
| Citrato de Na/NaCl/sacarosa | 85 |
| Citrato de Na/NaCl/sacarosa/glicina | 92 |
| Citrato de Na/NaCl/sacarosa/arginina | 97 |
Se demostró una notable estabilización de la
proteasa añadiendo sacarosa, y en cada caso un aminoácido.
Claims (20)
1. Un sistema de ensayo para la detección
cualitativa y cuantitativa de la proteasa activadora de FVII,
que:
- a)
- es inhibida por la presencia de aprotinina,
- b)
- aumenta su actividad mediante iones de calcio y/o heparina o sustancias relacionadas con la heparina, y
- c)
- en electroforesis de geles de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), tras la tinción posterior en el estado no reducido, tiene una o más bandas en el intervalo de pesos moleculares desde 50 hasta 75 kDa y en el estado reducido tiene una banda de 40 a 55 kDa y una o más bandas en el intervalo de pesos moleculares desde 10 hasta 35 kDa y en la que
- d)
- la banda obtenida en SDS-PAGE en el estado reducido, en el intervalo de pesos moleculares desde 60 hasta 65 kDa y desde 40 hasta 55 kDa, tiene una secuencia de aminoácidos de LLESLDP, y la banda obtenida en el intervalo de pesos moleculares desde 10 hasta 35 kDa tiene una secuencia de aminoácidos de IYGGFKSTAGK,
o su proenzima, en el que la proteasa es medida
por medio de:
- a)
- su actividad desactivando los factores de la coagulación de la sangre VIII/VIIIa o V/Va, o
- b)
- su actividad reduciendo los tiempos de coagulación de la sangre en ensayos globales de coagulación, o
- c)
- su actividad activando activadores del plasminógeno, o
- d)
- su actividad activando FVII
y en el que la concentración
desconocida de proteasa activadora de FVII se determina por
comparación con una curva patrón de cantidades crecientes de
proteasa activadora de
FVII.
2. El sistema de ensayo conforme a la
reivindicación 1, en el que la actividad reduciendo los tiempos de
coagulación de la sangre de la proteasa activadora de FVII se
determina por medio de:
- a)
- el tiempo de tromboplastina parcial no activada (NAPTT), o del
- b)
- tiempo de protrombina (PT), o del
- c)
- tiempo de recalcificación, o del
- d)
- tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), y
en el que la concentración
desconocida de proteasa activadora de FVII se determina por
comparación con una curva patrón de cantidades crecientes de
proteasa activadora de
FVII.
3. El sistema de ensayo conforme a la
reivindicación 1, en el que la actividad de la proteasa activadora
de FVII activando y/o potenciando los activadores del plasminógeno
se mide mediante la activación del:
- a)
- activador del plasminógeno (PA) de urocinasa monocatenario (scuPA, activador del plasminógeno de urocinasa monocatenario) o del
- b)
- tPA monocatenario (sctPA, activador del plasminógeno tisular monocatenario)
y en el que la concentración
desconocida de proteasa activadora de FVII se determina por
comparación con una curva patrón de cantidades crecientes de
proteasa activadora de
FVII.
4. El sistema de ensayo conforme a las
reivindicaciones 1 a 3, que contiene iones de calcio en una cantidad
superior a 0,001 mM, preferiblemente en una cantidad superior a
0,005 mM.
5. Un sistema de ensayo en el que la proteasa
activadora de FVII como está caracterizada en la
reivindicación 1, y/o una mezcla de su proenzima y activadores de la
proenzima apropiados, se usan para ensayar el tiempo de protrombina
sustituyendo al factor tisular/tromboplastina.
6. Un sistema de ensayo en el que la proteasa
activadora de FVII como está caracterizada en la
reivindicación 1, y/o una mezcla de su proenzima y activadores de la
proenzima apropiados, se usan para ensayar la funcionalidad de
activadores del plasminógeno y para la cuantificación de las formas
monocatenarias de activadores del plasminógeno.
7. El sistema de ensayo conforme a las
reivindicaciones 1, 3, 4 y 6, en el que la actividad potenciando los
activadores del plasminógeno:
a) se mide usando un ensayo cromogénico, o
b) en una reacción acoplada en presencia de
plasminógeno, se determina la propia formación de plasmina o la
disolución de un coágulo de fibrina producido por plasmina,
y en el que si se mide la proteasa
activadora de FVII como está caracterizada en la
reivindicación 1, la concentración desconocida de proteasa
activadora de FVII se determina por comparación con una curva patrón
de cantidades crecientes de proteasa activadora de
FVII.
8. Un sistema de ensayo en el que la presencia
de FVII puede determinarse cualitativa y cuantitativamente añadiendo
proteasa activadora de FVII como está caracterizada en la
reivindicación 1.
9. La proteasa activadora de FVII como está
caracterizada en la reivindicación 1 o su proenzima para uso
en un tratamiento.
10. Una preparación farmacéutica, que contiene
una cantidad de la proteasa activadora de FVII como está
caracterizada en la reivindicación 1 y/o su proenzima,
adecuada para la disolución de trombos que contienen fibrina.
11. La preparación farmacéutica conforme a la
reivindicación 10, que, aparte de la proteasa activadora de FVII
como está caracterizada en la reivindicación 1 y/o su
proenzima, contiene activadores del plasminógeno (PA) monocatenarios
o bicatenarios y/o anticoagulantes.
12. La preparación farmacéutica conforme a las
reivindicaciones 9 y 10, que contiene adicionalmente sales de calcio
solubles y/o heparina o sulfato de heparano o sulfato de
dextrano.
13. Un procedimiento para obtener la proteasa
activadora de FVII como está caracterizada en la
reivindicación 1, o su proenzima, que comprende su obtención a
partir de plasma sanguíneo o de concentrados de protrombina (PPSB),
después de una cromatografía de intercambio aniónico previa, por
medio de cromatografía de afinidad que usa heparina o sulfato de
heparano o sulfato de dextrano.
14. Un procedimiento para retirar la proteasa
activadora de FVII como está caracterizada en la
reivindicación 1, o su proenzima, que comprende retirarla del plasma
sanguíneo u otras disoluciones que contienen FVIII o FV, después de
una cromatografía de intercambio aniónico previa, por medio de
cromatografía de afinidad que usa heparina o sulfato de heparano o
sulfato de dextrano.
15. Un procedimiento para la pasteurización de
una preparación farmacéutica que comprende la proteasa activadora de
FVII como está caracterizada en la reivindicación 1 y/o su
proenzima, procedimiento que comprende preparar la preparación:
- a)
- en un intervalo de pH desde 3,5 hasta 8,0
- b)
- con adición de uno o más aminoácidos en una cantidad de >0,01 moles/l, y/o
- c)
- con adición de un azúcar o una combinación de varios azúcares en una cantidad total de >0,05 g/ml, y/o
- d)
- con adición de una o más sustancias de son capaces de formar complejos con iones de calcio en condiciones de pasteurización.
16. Un reactivo que contiene la proteasa
activadora de FVII como está caracterizada en la
reivindicación 1, junto con compuestos mejoradores de la actividad
de la proteasa activadora de FVII, o su proenzima junto con
activadores de la proenzima.
17. Un reactivo conforme a la reivindicación
16, que contiene la proteasa activadora de FVII o su proenzima,
junto con iones de calcio, heparina, sulfato de heparano o sulfato
de dextrano.
18. El uso de un reactivo conforme a la
reivindicación 17 para la detección de factor VII.
19. El uso de la proteasa activadora de FVII
como está caracterizada en la reivindicación 1 o su
proenzima, opcionalmente junto con activadores de la proenzima,
preparadas a partir de plasma sanguíneo o concentrados de complejos
de protrombina (PPSB) para la preparación de:
- -
- un medicamento para el fomento de la cicatrización de heridas y hemostasia,
- -
- un aditivo de un adhesivo o fieltro de fibrina, u otro sistema de liberación adecuado para un rápido cierre de heridas, basado en la fibrina.
- -
- un medicamento para reposición en carencias congénitas o adquiridas de esta proteasa o su proenzima, en presencia de anticuerpos frente al factor de la coagulación de la sangre VIII, o
- -
- un reactivo para la activación in vitro del factor VII.
20. El uso de la proteasa activadora de FVII
como está caracterizada en la reivindicación 1, para métodos
de diagnóstico in vitro para:
a) determinar cualitativa o cuantitativamente
la proteasa activadora de FVII, y/o
b) determinar cualitativa o cuantitativamente
el factor VII, y/o
c) ensayar la funcionalidad de activadores del
plasminógeno y para la cuantificación de las formas monocatenarias
de activadores del plasminógeno, y/o
d) ensayar el tiempo de protrombina
sustituyendo al factor tisular/tromboplastina.
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