KR20060107736A - 응고 인자 ⅶ을 활성화시키기 위한 프로테아제 - Google Patents

응고 인자 ⅶ을 활성화시키기 위한 프로테아제 Download PDF

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KR20060107736A
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위르겐 뢰미쉬
한스-아르놀트 슈퇴르
안네테 포이쓰너
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쳇엘베 베링 게엠베하
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Abstract

본원에는,
a) 아프로티닌의 존재하에서 억제되고,
b) 칼슘 이온 및/또는 헤파린이나 헤파린 관련 물질에 의해 활성이 증가되며,
c) SDS-PAGE에서, 환원되지 않은 상태에서 연속적으로 염색할 경우, 50 내지 75kDa의 분자량 범위에서 하나 이상의 밴드를 가지며, 환원된 상태에서는 40 내지 55kDa의 분자량 범위에서 하나의 밴드를 가지고 10 내지 35kDa의 분자량 범위에서 하나 이상의 밴드를 갖는, 혈액 응고 인자 VII을 활성화시키기 위한 프로테아제가 기술되어 있다.
본 프로테아제의 프로효소도 또한 특성화된다. 또한, 이 프로테아제를 수득하는 방법 및 출혈 예방이나 지혈에 있어서의 이의 용도도 기술되어 있다. 혈액 응고 인자 VII을 활성화시키는 프로테아제의 억제 또는 제거에 따른 단백질 분해에 의해 형성되는 불활성 인자 VIII 단편을 함유하지 않는 안정화 인자 V 및 안정화 인자 VIII 제제가 또한 기술되어 있다.
더욱이, 혈액 응고 인자 VII을 활성화시키는 프로테아제를 정성적 및 정량적으로 검출하기 위한 시험 시스템이 기술되어 있으며, 여기서 프로테아제는 혈액 응고 인자 VIII/VIIIa 또는 V/Va를 불활성화시키는 작용(a), 총괄적인 응고 시험에서 혈액 응고 시간을 감소시키는 작용(b) 또는 플라스미노겐 활성화인자를 활성화시키 는 작용(c)에 의해 측정된다.
마지막으로, 예를 들면, FVIII 억제제의 존재하에서 출혈의 예방 및 치료, 상처 치유 및 피브린 함유 혈전에 의해 유발되는 질환 치료에 적합한 약제학적 제제가 기술되어 있다. 제제는 혈액 응고 인자 VII 또는 이의 프로효소를 활성화시키는 프로테아제를 함유한다. 특정한 안정화제를 부가할 경우, 미소한 정도의 작용 손실을 동반하면서 이들을 저온 살균시킬 수 있다.
프로테아제, 프로효소, 혈액 응고 인자 VII, 아프로티닌, 플라스미노겐 활성화인자

Description

응고 인자 Ⅶ을 활성화시키기 위한 프로테아제{Protease for activating clotting factor VII}
도 1은 프로테아제 농도의 증가에 따른 FVIII의 활성 감소를 나타낸 그래프이다.
도 2는 항온처리 시간의 증가에 따른 활성 FVIII의 잔류 농도의 현저한 감소를 나타낸 그래프이다.
도 3은 칼슘 농도의 증가에 따른 FVIII의 활성 감소를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 혈액 응고 인자 VII을 활성화시키기 위한 프로테아제, 이를 분리, 검출 및 불활성화시키기 위한 방법, 및 본 프로테아제를 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다.
혈액 응고 시스템은 혈장에 존재하는 응고 인자를 활성화시키기 위한 두 가지의 상이한 연쇄 증폭 반응-유사 경로를 포함한다. 고유 경로 또는 외인성 경로가 개시 메카니즘에 따라 응고를 개시하는데 우선적으로 사용된다.
조직이 손상되는 경우에, 감염된 세포에 의해 외인성 응고 경로의 스타터로서 트롬보플라스틴(조직 인자, 인지질을 함유하는 TF)이 노출된다. 막에 위치한 트롬보플라스틴은 응고 인자 VII(FVII) 및 순환하는 활성화 FVII(FVIIa)을 모두 결합시킬 수 있다. 칼슘 이온 및 지질의 존재하에서, 이들 TF-FVIIa 복합체는 FX의 결합을 유도하고, 이는 제한된 단백질 분해에 의해 활성화된 형태(FXa)로 전환된다. FXa는 또한, 프로트롬빈을 활성화시킴으로써 트롬빈을 형성시키고, 피브린의 형성을 유도하여 궁극적으로는 상처를 봉합시킨다.
트롬보플라스틴-결합된 FVII의 추가의 활성화가 초기에는 자가촉매적으로 일어나지만, 특히 응고 연쇄 증폭 반응이 개시된 후에는, FXa 및 트롬빈에 의해 지지되어, 특히 반응 연쇄 증폭 반응의 현저한 강화를 유도한다.
FVIIa 또는 FVIIa 함유 농축물의 투여는 특정 임상적 상태에서 지시된다. 소위 FVIII-우회 활성(FVIII bypassing activity; FEIBA)을 갖는 FVIIa는 예를 들면, A형 혈우병을 앓고 있는 환자에 사용되며, FVIII 투여시 FVIII에 대한 항체를 생성한다. 현재 이용가능한 발견에 따르면, FVIIa는 이와 관련하여 이에 대하여 내성을 가지는 반면에, 혈전증에 대한 어떠한 소인도 야기하지 않으면서 응고가 제한적이지만 적절한 정도로 일어나도록 하는데 적합하다. 재조합 FVIIa는 이미 치료학적으로 및 예방학적으로 사용되고 있다. 혈장으로부터 분리된 FVII도 활성화된 다음, 사용될 수 있다. 프로테아제(예: 트롬빈)가 이러한 활성화에 사용될 수 있지만, 이들 프로테아제 자체가 응고물을 강력하게 활성화시키기 때문에, 혈전증의 위험을 야기시킬 수 있다. 이러한 이유로 인해, 후속적으로 트롬빈을 제거 또 는 불활성화시킬 필요가 있으며, 이 경우 수율 손실이 야기된다. 이와 관련된 혈전증의 위험으로 인해, FXa 또는 FIIa(트롬빈)의 사용이 종종 금기시되며, 단지 위급한 상황, 예를 들면, 혈액의 상당한 손실 및 지혈이 안되는 출혈과 관련된 위급 상황에서만 지시된다.
FVIIa는 건강한 피검자의 혈장에서는 매우 낮은 농도로 발견된다. 혈중에 순환되는 FVIIa의 형성 및 기원에 대해서는 지금까지 단지 매우 조금 공지되어 있다. 세포 파괴와 관련하여 발현되거나 방출되는 미량의 트롬보플라스틴이 이와 관련하여 역할을 하리라 여겨진다. 인자 XIIa는, 예를 들면, 특정 조건하에서 FVII 활성화를 유도할 수 있는 것으로 공지되고 있지만, 이러한 반응의 생리학적 관계는 아직까지 밝혀지지 않고 있다.
놀랍게도, 본 발명에 이르러, 사람의 혈장 및 특정 프로트롬빈 복합체 농축물의 분별화하는 과정에서, 이미 공지된 모든 프로테아제와는 상이한 FVII 활성화 프로테아제가 발견되었다. 이 프로테아제에 대한 연구에서, 이러한 프로테아제가 펩티드 기질 S2288(HD-이소루실-L-프롤릴-L-아르기닌-pNA)(제조원: Chromogenix AB, Sweden)에 대해 특히 높은 아미도 분해 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이 프로테아제의 특징은 아미도 분해 활성이 아프로티닌에 의해 효율적으로 억제된다는 것이다. 다른 억제제(예: 안티트롬빈 III/헤파린 복합체)도 또한 억제에 적합하다. 한편, 이의 활성은 헤파린 및 헤파린 관련 물질(예: 헤파란 설페이트 또는 덱스트란 설페이트 및 칼슘 이온)에 의해 증가된다. 마지막으로, 이 프로테아제는 시간 및 이의 농도에 따라 좌우되는 방법으로 FVII을 FVIIa로 전환시킬 수 있는 것 으로 밝혀졌다. 이러한 반응도 아프로티닌에 의해 억제된다.
따라서, 본 발명의 목적의 일부는,
a) 아프로티닌의 존재하에서 억제되고,
b) 칼슘 이온 및/또는 헤파린이나 헤파린 관련 물질에 의해 활성이 증가되며,
c) SDS-PAGE에서, 환원되지 않은 상태에서 연속적으로 염색할 경우, 50 내지 75kDa의 분자량 범위에서 하나 이상의 밴드를 가지며, 환원된 상태에서는 40 내지 55kDa의 분자량 범위에서 하나의 밴드를 가지고 10 내지 35kDa의 분자량 범위에서 하나 이상의 밴드를 갖는, 혈액 응고 인자 VII을 활성화시키기 위한 프로테아제이다.
후술되는 명세서에서, 프로테아제의 활성화된 형태는 "프로테아제"로 언급하는 반면에, 활성화되지 않은 형태는 "프로효소"로서 언급한다.
이 프로테아제에 관한 추가의 연구에서, 프로테아제를 농축 또는 분리 후에, pH 7.5인 20mM 트리스, 0.15M NaCl을 함유하는 용액에서 프로테아제 활성이 급속하게 손실됨이 관찰되었다. 0.1% 농도의 알부민을 부가하더라도, 프로테아제의 활성이 실온에서 1시간 후에 50%까지 감소되는 것을 막을 수 없다. 다른 한편으로, 50mM Na 시트레이트를 사용하여 pH 6.5로 완충시킨 용액에서는 프로테아제가 매우 우수한 안정화를 나타내는 것으로 관찰된다. 특정한 안정화제를 프로테아제 용액에 부가하지 않더라도, 용액의 pH를 4 내지 7.2, 바람직하게는 pH 5.0 내지 7.0으로 조절할 경우에는 활성이 전혀 손실되지 않거나 단지 약간 손실되는 것으로 관찰된다. 그러나, 시트레이트 이외의 적절한 안정화제, 특히 글루타메이트, 아미노산(예: 아르기닌, 글리신 또는 리신), 칼슘 이온 및 당(예: 글루코즈, 아라비노스 또는 만노스)을 1 내지 200mmol/ℓ, 바람직하게는 5 내지 100mmol/ℓ의 양으로 용액에 부가하는 것이 유용하다. 효율적인 안정화는 또한 글리콜(예: 에틸렌 글리콜 또는 글리세롤)을 5 내지 80중량%, 바람직하게는 10 내지 60중량%의 양으로 부가함으로써 성취된다. 그후의 안정화 용액의 pH는 4 내지 9의 값이어야 한다.
신규한 프로테아제 및 또한, 프로효소는 재조합 DNA법에 의해 또는, 예를 들면, 적절한 유전자 이식 동물의 유즙에서 제조하여 수득할 수 있지만, 이들은 특히, 혈장 또는 프로트롬빈 복합체(PPSB) 농축물의 분별화에 의해 수득할 수 있다. 그후, 출발 물질을 음이온 교환 크로마토그래피한 다음, 용출물을 친화 크로마토그래피한다. 매트릭스 상에 부동화된 헤파린 또는 헤파린 관련 물질(예: 헤파란 설페이트 또는 덱스트란 설페이트)이 친화 크로마토그래피에 특히 적합하다. 이러한 크로마토그래피법을 사용하는 경우, 신규한 프로테아제 및/또는 프로효소를 선택적으로 결합한 다음, 공지된 방법을 사용하여 다시 한번 용출시킬 수 있다. 스페이서의 사용이 리간드를 매트릭스에 결합시키는데 바람직하다. 헤파린-리신 매트릭스는 특히, 신규한 프로테아제를 분리하는데 적합한 것으로 밝혀졌다.
SDS-PAGE에서 연속적으로 염색시킬 경우, 이러한 방법으로 분리된 프로테아제는 환원되지 않은 상태에서는 55 내지 75kDa의 분자량 범위에서 함께 근접하여 존재하는 1 내지 수 개의 밴드를 나타낸다. 환원된 후에는, 15 내지 35kDa의 분자량 범위의 분자량 범위에서 1 내지 수 개의 밴드가 관찰되고, 40 내지 55kDa의 분자량 범위에서 하나의 밴드가 관찰된다. 스캐닝 및 정량적인 평가 후에, 전체 단백질의 5 내지 10%를 구성하는 60 내지 65kDa 사이의 추가의 밴드는 활성화되지 않은 프로효소가 또한 존재함을 나타내는 것이다. 이러한 결과는 이 프로테아제에 대한 모노클로날 항체를 사용하는 적절한 연구에 의해 지지된다. 따라서, 프로테아제의 프로효소는 또한 본 발명에 따르는 방법에 의해 제조되고, 저온 살균되며, 이용될 수 있다고 결론지을 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 목적은 혈액 응고 인자 VII을 활성화시키기 위한 프로테아제의 프로효소이다. 프로효소의 비는 60 내지 65kDa 사이의 밴드에 의해 제시된다. 프로효소, 트롬빈, 칼리크레인 또는 FXIIa의 활성화 영역을 구성하는 아미노산 서열은 이들의 기질 특이성에 따르는, 프로효소의 적절한 생리학적 활성화인자의 아미노산 서열에 상응한다.
기술된 신규한 프로테아제의 몇가지 특성, 즉 당해 프로테아제가 혈장 또는 혈장으로부터 유도되는 프로트롬빈 복합체(PPSB) 농축물로부터 분리될 수 있다는 사실, 아프로티닌에 의한 이의 아미도 분해 활성의 억제 및 SDS-PAGE에서 환원 상태 및 환원되지 않은 상태에서의 기술된 이동 거동은 더 이상 상세히 정의되지 않은 PPSB 농축물로부터 훈펠트(Hunfeld) 등의 문헌(참조: Ann. Hematol. 1997; 74; A87, 113; Ann. Hematol. 1998; 76; A101, P294 and Etscheid et al. Ann. Hematol. 1999, 78: A42)에 의해 분리되는 프로테아제에 대한 암시이다. 이 경우에, 필수적으로 아프로티닌 매트릭스를 사용하여 제조한다. 특정 펩티드 기질의 아미도 분해성 절단에 따라, 활성은 트롬빈-유사 활성으로서 기술된다. 훈펠트 등은 프로트롬빈 시간, 퀵(Quick) 또는 혈소판 응집 등의 총괄적인 응고 매개변수에 대한 어떠한 영향도 발견하지 못하였다.
훈펠트 등이 기술한 프로테아제의 N-말단 서열은 이의 cDNA가 초이-미우라(Choi-Miura) 등(참조: J. Biochem. 119: 1157-1165 (1996))이 기술한 단백질과 일치한다. 이의 일차 구조에서, 상응하는 단백질은 간세포 성장 인자 활성화 효소(HGFA)로 칭하는 효소와 상동성을 나타낸다.
환원 상태하에서 SDS-PAGE로부터 분리되는 두 개의 밴드를 N-말단 서열화시키는 경우에, 다음과 같은 일치하였다:
밴드의 분자량 범위 아미노산 서열 저자
10-35kDa 30kDa 17kDa 40-55kDa 50kDa 50kDa IYGGFKSTAGK IYGGFKSTAG IYGGFKSTAGKH LLESLDP SLDP SLLESLDPWTPD 본 발명 훈펠트 등 초이 미우라 등 본 발명 훈펠트 등 초이 미우라 등
기질 특이성 및 억제되는 활성의 능력과 같은 다른 시험 결과에서도 일치되는 것으로 밝혀졌다. 그럼에도 불구하고, 현재 이들 단백질이 동일하다고 확신할 수 없다. 어쨌든, 이미 연구된 상기 언급한 단백질은 FVII을 활성화하거나, 다른 인자(하기 참조)를 활성화하는 특성을 갖는 것으로 보고되고 있지 않다.
이의 기술한 특성을 근거로, 신규한 프로테아제는 진단용 및 치료용으로 사용될 수 있다.
1. 신규한 프로테아제를 사용한 시험 시스템
신규한 프로테아제는 시험시약으로서 진단용으로 사용될 수 있다. 따라서, 인자 VII의 존재 여부는 응고 시험에서 신규한 프로테아제를 부가함으로써 정성적 및 정량적으로 측정할 수 있다.
반대로, FVII 활성화를 측정하기 위하여 개발된 시험 시스템이 또한 프로테아제를 검출하고 정량하는데 사용될 수 있다. 이를 위하여, 프로테아제를 함유하는 용액을 FVII 함유 용액과 혼합하여 적절한 시간 동안 항온처리한 후에, 생성된 FVIIa의 양을 정량한다. 이는, 예를 들면, 스타클롯(StaclotR) FVIIa-rTF 시험(제조원: Stago/Boehringer Mannheim)을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직한 방법이 사용되는 경우에, 이러한 시험은 공급된 FVII 농도에 의해 제한되지 않는다. 프로테아제의 양이 전체 단백질 중의 비율로서 공지될 경우, 이 비율은
- 순수한 프로테아제 제제에서는, 켈달(Kjeldahl) 법에 의해 또는 숙련가에게 친숙한 다른 단백질 검정법에 의해 측정하거나,
- 예를 들면, 특이적 항체에 대한 항원 시험 및 적절한 면역화학적 측정법(예: ELISA)을 사용하여, 프로테아제 제제의 특이적 활성을 상응하는 방법으로 측정할 수 있다.
놀랍게도, 본 발명에 이르러, 프로테아제를 추가로 특성화하는 것과 관련하여, 부가적인 측정법도 수행가능하도록 만드는 특성이 밝혀졌다. 상기 프로테아제와 함께 혈액 응고 인자 VIII/VIIIa 및 V/Va를 항온처리한 다음 정량하는 것과 관 련하여, 당해 응고 인자가 프로테아제 농도 및 항온처리 시간에 따라 좌우되는 방법으로 불활성화됨이 명료해졌다.
따라서, 본 발명의 다른 목적은 혈액 응고 인자 VII을 활성화시키는 프로테아제를 정성적 및 정량적으로 검출하기 위한 신규한 시험 시스템에 관한 것으로서, 이 시스템에서는, 프로테아제가 혈액 응고 인자 VIII/VIIIa 또는 V/Va를 불활성화시키는 이의 작용에 의해 측정될 수 있다. 이러한 시험 시스템은 인자 VIII/VIIIa 또는 인자 V/Va와 함께 항온처리되는 프로테아제를 함유하는 용액을 기본으로 하며, 인자 VIII/VIIIa의 잔류량 또는 인자 V/Va의 잔류량은 통상적인 활성 시험에 의해 측정하고, 이어서 프로테아제의 양은 표준 곡선과 비교하여 이로부터 정량적으로 측정한다. 이러한 시험을 수행하는데 있어서, 프로테아제 활성의 항온처리는 아프로티닌을 제한량으로 부가함으로써 소정의 시간 후에 억제되는데, 이는 이러한 농도에서 후속되는 시험 시스템의 측정에 영향을 미치지 않는다는 잇점을 갖는다. 그 후에, 잔여 응고 인자의 활성은 숙련가에게 익숙한 시험으로 측정한다. 이를 위하여, 필수적으로 인자 IXa 및 X을 함유하며, 생성된 FXa의 양이 트롬빈 억제제의 존재하에 발색원성 기질의 전환(p2의 마지막 세 번째 단락 참조)에 의해 정량되는, 소위 코아마틱(CoamaticR) 인자 VIII 시험(제조원; Chromogenix AB)을 사용하는 것이 유리하다. 이러한 양은 또한 FVIII 또는 FVIIIa의 양에 비례한다. 잔류하는 FVIII 활성을 측정함으로써 존재하는 프로테아제의 농도를 예상할 수 있다.
단백질 분해 효과로 인한 FVIII/FVIIIa 또는 FV/FVa의 분해는 SDS-PAGE에 의해 명확히 설명될 수 있다. 프로테아제가 예를 들면, FVIII 농축물과 함께 항온처 리되는 시간에 따라, FVIII에 대해 통상적인 밴드는 없어지는 반면에, 다른 새로운 밴드가 나타나거나, 약했던 밴드의 세기가 증가된다. 따라서, 프로테아제의 활성은 또한 감소되거나 증가되는 밴드를 정량함으로써 상관관계를 가질 수 있기 때문에, 예를 들면, 프로테아제 표준을 사용하여 정량적으로 측정할 수 있다. SDS-PAGE 전기영동도에 대한 밴드 세기의 변화 또는 이어지는 다른 전기영동법은, 예를 들면, 숙련가들에게 익숙한 스캐너 및 적절한 프로그램을 사용하여 정량할 수 있다. 이외에, 응고 인자에 대한 항체가 웨스턴 블롯팅(Western blotting)에 사용될 수 있고, 기술된 방법으로 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 감소된 밴드나, 특히 나타나는 밴드를 특이적으로 검출하는 항체가 특히 적합하다. 이와 관련하여, 이들 항체는 또한 다른 면역화학적 시험(예: ELISA)을 수행하는데 사용될 수 있다.
FVIII/FVIIIa의 경우에서 기술되었던 단백질 분해 불활성화는 또한 프로테아제가 인자 V/Va와 함께 항온처리되는 경우에도 관찰되며, 이는 FVIII과의 어느 정도의 구조적 상동성을 나타낸다. 분해는 적절한 활성 시험 시스템 및 SDS-PAGE/웨스턴 블롯팅으로 모니터할 수 있다.
본 발명에 이르러, FV 및 FVIII의 불활성화에도 불구하고, 혈액, 혈소판이 풍부한 혈장 또는 혈장에 프로테아제를 부가하면 응고 시간이 단축되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 다양한 소위 "총괄적인 응고 시험"에서 압도적인 응고 촉진성 효과를 나타낸다. 이들 시험 시스템은, 예를 들면, 활성화되지 않은 부분 트롬보플라스틴 시간(non-activated partial thromboplastin time; NAPTT), 프로트롬빈 시간(PT) 및 재석회화 시간으로서 이해된다. 예를 들면, 소위 응혈계(coagulometer) 에서 트롬보엘라스토그래피(thromboelastography)에 의해 또는 그 밖의 발색원성 시험에서 측정되는 바와 같은 이들 시간의 단축은 응고 촉진 물질의 농도와 상호 관련이 있으므로, 샘플에서 물질의 농도는 역으로 응고 시간의 보정 곡선을 사용하여 유추할 수 있다. "FVII 활성화인자"의 농도는 선택된 총괄적인 응고 시험을 사용하여 상응하게 측정할 수 있다.
"FVII 활성화인자"도 마찬가지로, 플라스미노겐 활성화인자의 활성제(PAA)로서 작용할 수 있는, 단일쇄 유로키나제(scuPA, 단일쇄 유로키나제 플라스미노겐 활성화인자) 및 단일쇄 tPA(sctPA, 단일쇄 조직 플라스미노겐 활성화인자)를 효과적으로 활성시킬 수 있다는 사실을 발견한 것은 또한 놀라운 것이다. 활성화된 PA의 활성은, 예를 들면, 발색원성 기질을 사용하여 측정할 수 있다. 따라서, 이러한 특성은 "FVII 활성화인자"를 검출하고 정량하는데 또한 사용될 수 있다. 플라스미노겐 활성화인자의 활성화는 또한 플라스미노겐의 존재하에서 플라스민 자체의 형성에 의한 결합 반응 또는 플라스민에 의해 생성되는 피브린 혈병의 용해에 의한 결합 반응으로 측정할 수 있다.
따라서, 요약하면, 프로테아제를 FVIII 또는 FVIIIa를 함유하는 용액과 항온처리한 다음, 적절한 활성 시험에 의해 FVIII/VIIIa의 잔류량을 측정함으로써 프로테아제를 검출하고 정량할 수 있는 것으로 언급할 수 있다. 동일한 방법으로, FV 또는 FVa를 프로테아제와 함께 항온처리한 다음, 이어서 FV/FVa의 잔류량을 정량할 수 있다. 공지되지 않은 프로테아제 농도는 시험에 포함된 프로테아제의 증가량의 표준 곡선과 비교하여 정량적으로 측정할 수 있다. 다양한 총괄적인 응고 시험이 마찬가지로 정량에 적합하고, 이때 프로테아제 농도는 응고 시간의 단축을 기본으로 하는 보정 곡선으로부터 판독한다. 프로테아제의 PAA 활성이 또한 측정에 사용될 수 있다.
이들 시험의 또다른 특징은 FV 및 FVIII 불활성화 및 PAA 활성이 특히, 적당히 높은 농도, 바람직하게는 > 0.001mM, 특히 바람직하게는 > 0.005mM인 칼슘의 존재하에, 예를 들면, CaCl2의 형태에서 잘 나타난다는 것이다. 상기한 바와 같이, 헤파린 및 헤파린-유사 물질과 칼슘이 프로테아제 활성을 증가시키는 직접 발색원성 검정과는 대조적으로, FV/FVIII의 불활성화는 헤파린에 의해 촉진되지 않거나, 단지 미소한 정도로 촉진된다. 대조적으로, PAA 활성은 두 제제의 존재하에, 즉 칼슘 및/또는 헤파린이나 헤파린-유사 물질에 의해 촉진된다.
프로테아제-매개된 반응은 프로테아제를 헤파린 또는 헤파린-유사 물질(바람직하게는, 헤파린)의 존재하에 억제제, 특히 안티트롬빈 III, C1-에스테라제 억제제, α2-항플라스민, 인터-α-트립신 억제제 또는 공지된 합성 저분자량 프로테아제 억제제(예: 구아니디노카프로산-파라-에톡시카보닐페닐에스테르; 상표명 FOYR로 시판되고 있음)와 항온처리함으로써 매우 효율적으로 감소시키거나 방지할 수 있다. 따라서, 이들 물질은, 예를 들면, 항온처리 시간을 정확히 한정하거나, 시험의 특이성을 다시 증가시키기 위하여 반응을 정지하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 킬레이트화제와의 혼합물에서 유리 칼슘 이온의 감소가 이를 위해 또한 사용될 수 있다.
2. 인자 V 및 인자 VIII 의 안정화 제제
오늘날, 수율 손실 및 간섭성 단백질 단편일 수 있는 물질의 형성을 방지하기 위하여, 프로테아제를 억제하거나 이의 활성을 감소시키는 응고 인자 V 및 VIII에 대한 신규한 프로테아제의 단백질 분해 작용에 관하여 앞서 기술한 관찰사항에 이은 추가의 연구가 계속되고 있다. 이는 모두 FV 및 FVIII이 대개 칼슘 이온의 존재하에서 혈장으로부터 수득되는 저온 침전물로부터 제조되므로 보다 관련이 있는데, 이는 후자가 단백질 형태를 유지하는데 필요하기 때문이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 혈액 응고 인자 VII을 활성화시키는 프로테아제가 억제됨에 따른 단백질 분해로 인하여 형성되는 인자 V 또는 인자 VIII 단편이 함유되어 있지 않은 FV 또는 FVIII의 안정화 제제에 있다. 보다 상세한 연구에서는 프로테아제에 의한 인자 V 및 인자 VIII의 불활성화가 0.5mM 이상의 칼슘 이온 농도의 존재하에서 특히 효율적으로 일어난다고 제시하고 있으므로, 혈액 응고 인자 VII을 활성화시키는 프로테아제를 억제시키기 위해 인자 V 또는 인자 VIII 제제에서의 칼슘 이온의 농도를 1.0mM 미만, 바람직하게는 0.5mM 미만으로 조절할 경우 인자 V 또는 VIII 제제를 효과적으로 안정화시킬 수 있다. 프로테아제의 인자 V 및 인자 VIII 불활성화 특성은 이들 농도에서 현저히 감소되지만, 칼슘 이온의 양은 여전히 FV 및 FVIII 분자의 형태를 안정화시키는데 충분하다. 상기 언급된 칼슘 이온의 양은 단지 최종 생성물에서 뿐만 아니라, 저온 침전물 자체와 후속의 정제 단계에서도 초과되어서는 안된다.
앞서 기술한 헤파린 및 헤파린-유사 물질에 대한 프로테아제 또는 프로효소의 친화력에 따라, FVIII- 또는 FV 함유 용액을 부동화된 헤파린 또는 다른 적합한 면역- 또는 친화성 흡착제와 함께 항온처리함으로써 FVIII- 또는 FV 함유 용액으로부터 프로테아제/프로효소를 제거할 수 있다. 면역 흡착제의 제조시 유용한 각각의 항체 단편인, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체는 항원으로서 프로테아제 또는 프로효소의 전부 또는 일부를 사용하여 당해 분야에 공지된 기술에 의해 용이하게 제조된다.
그러나, 경우에 따라, FV 또는 FVIII의 단백질 분해를 방지하기 위하여, 칼슘 이온의 양을 감소시키는 이외에, 천연 또는 합성 프로테아제 억제제 또한 사용될 수 있다. 단백질(예: 아프로티닌, α2-항 플라스민, C1-에스테라제 억제제 또는 인터-트립신 억제제)이 억제제로서 사용될 수 있다. 숙련가들에게 합성 세린 프로테아제 억제제로서 공지된 저분자량 물질이 또한 이와 관련하여 사용될 수 있다. 이의 억제 잠재력이 헤파린 또는 헤파리노이드에 의해 증가되는 안티트롬빈 III과 같은 억제제가 또한 부가될 수 있다. 따라서, 놀랍게도, 헤파린 자체가 작은 발색원성 물질에 대한 프로테아제의 아미도 분해 활성을 증가시킬 수는 있지만, FV/FVIII의 불활성화는 지지하지 못하는 것으로 밝혀졌다.
3. 신규한 프로테아제를 포함하는 약제
신규한 프로테아제 및/또는 이의 프로효소가 또한 치료학적으로 사용될 수 있다.
이들은 단독으로 또는 헤파린이나 헤파린 관련 물질(예: 헤파란 설페이트) 및/또는 칼슘 이온과 같은, 프로테아제의 활성을 증가시키는 물질과 함께 혈액 응고제로서 사용될 수 있으며, 또한 인자 VII을 불활성 형태로 이 제제에 추가로 가할 수 있다. 이의 FVIII-우회 활성(FEIBA)을 사용하는 이러한 제제는 예를 들면, FVIII 및/또는 FIX 및/또는 FXI 및/또는 접촉상 단백질(예: FXII)에 대하여, 예를 들면, 항체의 존재를 고려할 때 불내성이 존재하는 경우 또는 다른 유형의 결핍 상태가 나타나는 경우에 사용될 수 있다. 이와 관련하여, FVII은 시험관 내에서, 혈장에서, 풍부한 분획에서 또는 정제된 FVII에서 작용함으로써 활성화될 수 있다. 일반적인 출혈을 예방하거나 출혈에 대한 내성을 갖도록 하기 위해 생체 밖에서 신규한 혈액 응고제를 또한 가할 수 있다.
다른 한편으로, 관찰된 바와 같은 아프로티닌 또는 상기한 억제제에 의한 신규한 프로테아제의 억제는 프로테아제 억제제를 포함하고 혈액을 응고시키는 능력을 감소시키는 제제를 개발하는데 사용될 수 있다. 이외에, 신규한 프로테아제는 이들의 프로테아제 억제 효과로 인하여 혈액 응고를 손상시키는 생리학적 또는 비생리학적 인자(예: 합성 펩티드)를 확인하는데 또한 사용될 수 있다. 특히 효율적으로 형질전환된 발색원성 기질의 펩티드 서열(예: S 2288의 펩티드 서열)(상세한 것은 상기 참조)은 이를 위한 구조적 기초로서 사용될 수 있다. 이들 제제가 단백질 분해 활성을 갖지 않는다면, 응고 제제를 제조하는 도중에 이에 적절한 억제제를 부가할 필요가 있다.
놀랍게도, 본 발명에 이르러, 프로테아제를 추가로 특성화하는 것과 관련하 여, 소위 "인자 VII 활성화인자" 프로테아제를 위한 부가 사용의 가능성을 여는 특성이 발견되었다. 프로뉴로키나제(예: 단일쇄 유로키나제, scuPA, 단일쇄 유로키나제 플라스미노겐 활성화인자) 또는 sctPA(단일쇄 조직 플라스미노겐 활성화인자)와 같은 단일쇄 플라스미노겐 활성화인자를 항온처리하는 경우에, "인자 VII 활성화인자"는 이들 플라스미노겐 활성화인자(PA)의 활성화를 유도한다. 이와 관련하여, 단일쇄 PA가 제한된 정도로 단백질 분해됨으로써, 플라스미노겐을 활성화시키는데 특히 적합한 이중쇄 프로테아제가 형성된다. 생성된 플라스민은 혈전을 용해시키는데 기여하는 생리학적 시스템인 피브린 용해의 작동 물질이다. PA(예: 프로유로키나제) 또는 tPA는 필요한 경우에 방출되고, 공지된 바와 같이, 플라스민 또는 칼리크레인(scuPA)에 의해 활성화되는 내인성 단백질이다. scuPA가 건강한 상태로 활성화되는 메카니즘은 아직까지 완전히 밝혀지지 않았다.
플라스미노겐 활성화인자는 혈전색전증 또는 합병증(예: 다리 정맥 혈전증, 심근경색 또는 뇌졸증)과 관련된 약제학적 제제에서 분리되거나 재조합으로 제조된 단백질로서 치료학적으로 사용된다.
본 발명에서 밝혀진 "인자 VII 활성화인자"의 특성에 따라, 후자는 플라스미노겐 활성화인자(예: 프로유로키나제) 또는 sctPA의 생체내 또는 생체외 활성화에 사용될 수 있다. 이러한 활성은 혈전색전증의 예방 또는 치료를 위하여 프로테아제를 특히, 단일쇄 또는 이중쇄 플라스미노겐 활성화인자 또는 항응고제와 함께 사용함으로써 또한 사용될 수 있다. 이러한 가능한 사용은 프로테아제가 응고 촉진성 방법에서 또한 작용할 수 있다는 사실과 상충되지 않는다. 이들 두가지 반응 중에서 어느 것이 우세한지에 관한 의문은 아마도 생리학적 기질의 유용성에 의해 해결될 것이다. 현상태의 지식에 따르면, 인자 VII은 혈장에서 적절히 활성화되고 FVIIa의 특정 농도를 계속해서 유지함으로써, 갑작스런 맥관 손상을 즉각적으로 저지할 수 있다. 다른 한편으로, 1㎖의 혈장에는 단지 나노그램 양의 조직 플라스미노겐 활성화인자 및 유로키나제 플라스미노겐 활성화인자가 존재한다. 이는 단지 피브린 침착 또는 혈전이 유발되는 경우에만, 플라스미노겐 활성화인자의 분비 또는 합성에 의해 농도가 증가된 다음, 이들이 특히 혈전에 결합된 경우에 국부적으로 활성화된 후, 플라스미노겐을 활성화시킴으로써 이들의 혈전 용해 활성을 나타내는 것이다. 단일쇄 PA가 특히, 국부적으로 제한된 방법으로 존재하는 경우에, 이들의 활성화가 FVII 활성화보다 우세함으로써, 생리학적 상태를 조절할 수 있게 된다. 따라서, 이러한 프로테아제는 또한 지혈을 조절함으로써, 선천성 및 후천성 결핍 상태의 경우에 프로테아제 및/또는 프로효소를 대신할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 목적은 피브린 함유 혈전을 용해시키기에 충분한, 혈액 응고 인자 VII-활성화 프로테아제 및/또는 이의 프로효소 형태를 다량 포함하는 약제학적 제제이다. 이 제제는 단일쇄 플라스미노겐 활성화인자(PA) 및/또는 항응고제를 추가로 포함할 수 있다. 프로효소가 존재하는 경우에는 상기의 약제학적 제제 내에 또는 이와 함께 적절한 활성화인자를 포함하는 것이 유용하다.
"FVII 활성화인자"의 플라스미노겐 활성화인자-보강 효과는 특히, 칼슘 및/또는 헤파린과 헤파린-유사 물질(예: 덱스트란 설페이트)에 의해 촉진되는 것으로 밝혀졌기 때문에, 가용성 칼슘 염 및/또는 헤파린이나 헤파린-유사 물질을 추가로 포함하는 약제학적 제제가 본 발명에 따라 피브린 함유 혈전을 용해시키는데 특히 유용하게 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 프로테아제/프로효소는 프로테아제에 대한 특별한 친화성을 나타냄으로써, 혈장 반감기를 연장시키기 위한 담체 물질로서 또는 표면에 대한 매개체로서의 이의 활성을 증가시키는 물질의 존재 또는 부재하에서, 그 자체로 또는 단일쇄나 이중쇄 플라스미노겐 활성화인자와의 혼합물로 사용될 수 있다.
혈액 응고 인자 VII-활성화 프로테아제를 포함하는 약제학적 제제는 이의 특이적인 피브린 용해 효과로 인하여, 피브린 함유 혈전에 의해 유발되는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 피브린 용해 과정은 또한 상처 치유 과정에도 포함된다. 이와 관련하여, 프로테아제 및/또는 프로효소는 상해 및 상처의 경우에, 정맥내 또는 국부적으로, 피하, 경피내 또는 근육내나, 그 밖의 국소적으로 투여하거나, 적절한 담체 기질에 결합될 수 있다. 체액(예: 혈액 또는 혈장)으로부터 분리되는 프로테아제/프로효소 및 재조합 또는 유전자이식에 의해 제조되는 프로테아제/프로효소가 둘다 이와 관련하여 사용될 수 있다. 프로테아제/프로효소는 또한 소위 피브린 접착제의 성분으로서 사용하기에 적합하며, 이는 프로테아제/프로효소를 억제하는 특정 물질(예: 아프로티닌)을 함유해서는 안된다. 이 경우에, 프로테아제의 응고 단축 특성을 사용할 수 있다.
상기의 프로테아제/프로효소는 (범발성) 출혈 발생시 각각의 혈전 관련 합병증에서 선천성 또는 후천성 지혈 결핍증에 대해 사용될 수 있다. 출혈을 치료하는데 사용될 경우에는 임의로 추가의 응고 인자의 부가하에서 FVIII과 프로테아제/프 로효소의 혼합물을 사용하는 것이 유용하다.
4. FVII 활성화 프로테아제의 저온 살균법
사람 혈장으로부터 분리된 단백질로서의 신규한 프로테아제 및/또는 이의 프로효소를 바이러스를 불활성화시키는 방법으로 미리 처리한 경우, 이는 단지 약제학적 제제로서 사용될 수 있다. 저온 살균법은 특히, 바이러스를 불활성화시키는 가장 중요한 방법으로서 인식되고 있다. 그러나, 약 60℃에서 10시간 이하로 가열할 경우에는 단백질이 적절한 안정성을 갖도록 처리할 필요가 있다. 최적의 안정화제는 각각의 단백질에 대해 별도로 결정되어야 하고, 이들의 농도는 최적화되어야 한다.
신규한 프로테아제 및/또는 이의 프로효소의 경우, 저온 살균을 수행하지 않고서, 용액에서 단백질을 안정화시키는 조건이 상기에서 이미 언급되었다. 이와 관련하여, 다소 산성인 pH 범위가 특히 유용한 것으로 입증되었다. 그러나, 이들 조건하에서 저온 살균을 수행하는 경우에, 신규한 프로테아제 및/또는 이의 프로효소의 활성은 대개 이의 본래 활성의 50% 이상 손실된다.
본 발명에 이르러, 제제가
a) 3.5 내지 8.0의 pH 범위, 바람직하게는 4.0 내지 6.8의 pH 범위에서,
b) 하나 이상의 아미노산을 0.01mol/ℓ 이상, 바람직하게는 0.05mol/ℓ 이상의 양으로 부가하고/하거나,
c) 당 또는 상이한 당 혼합물을 0.05g/㎖ 이상, 바람직하게는 0.2g/㎖ 이상 의 총량으로 부가하고/하거나,
d) 칼슘 이온을 착화시킬 수 있는 하나 이상의 물질(예: 시트레이트, 옥살레이트, 에틸렌디아민 테트라아세트산 등)을 부가함으로서 제조되는 경우에, 신규한 프로테아제 및/또는 이의 프로효소를 포함하는 약제학적 제제의 저온 살균이 최적의 안정화 결과를 보장하는 것으로 밝혀졌다.
부가제(예: 알부민, 헤마셀(HaemaccelR), 헤파린 및 헤파리노이드, 글리세롤, 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜)가 또한 별도로 또는 함께 혼합되어 사용될 수 있다. 저온 살균이 완료된 후에, 숙련가들에게 친숙한 방법을 사용하여 안정화제로서 부가된 당, 아미노산 및 다른 부가제를 감소시키거나, 제제로부터 완전히 제거할 수 있다. 저온 살균법의 결과는 실시예 12 및 13에 제시되어 있다.
실시예 1
스타클롯R FVIIa-rTF 시험 시스템(제조원; Stago/Boehringer Mannheim)을 사용하여 제조된 프로테아제에 의한 FVII의 활성화를 확인한다. 이러한 검출 시스템은 외인성 응고 경로를 개시하기 위하여 예비형성되어 활성화된 FVII(FVIIa)을 사용할 수 있는 (재조합) 가용성 조직 인자(rTF)의 특별한 특성을 근거로 한다. 완전한 조직 인자가 사용되는 경우와는 대조적으로, 이는 FVIIa의 실제 함량을 정확히 측정할 수 있다.
분리된 FVII(제조원; Enzyme Research Labs)은 활성화 실험에 사용된다. 이 러한 FVII 자체는 사람 혈장으로부터 분리되므로, 미량의 FVIIa를 함유한다. 농도는 완충액을 사용하여 희석시킴으로써 0.05IU FVII/㎖로 조절한다. FVII을 시험 물질과 함께 실온에서 10분 동안 항온처리한 다음, 실제 FVIIa 함량을 시험한다. FVIIa 함량은 평행하게 구성된 표준 곡선을 사용하여 정량한다.
본 명세서에 기술되지 않은 예비 실험에서는, 사용된 농도에서 아프로티닌은 제조된 프로테아제의 활성을 완전히 억제하지만, FVIIa에 대해서는 직접적인 효과를 나타내지 않으며, FVIIa-rTF 시험 시스템에 대해서도 유의적인 효과가 없는 것으로 확인되었다.
하기에 제시되는 결과는 각 경우에 3회 측정치에 대한 것이다.
따라서, 다음의 실험적 검정은 다음과 같이 준비한다:
1. FVII :
결과: 10mIU의 FVIIa/㎖
활성화되지 않은 FVII을 대조 검정용으로서 사용한다. 이는 이미 10mIU FVIIa/㎖의 양이 되도록 미량의 FVIIa(상기 참조)를 함유한다.
2. FVII + 아프로티닌 :
이 검정에서는, 사용된 아프로티닌에 의해 FVIIa 자체가 억제되지 않으며, 이들이 시험에 영향을 미치지 않음을 입증하기 위하여, FVII을 아프로티닌의 존재하에 항온처리하여 FVIIa-rTF 검정에 사용한다. 이를 확인한다(검정 1과 비교).
3. 프로테아제 + FVII (항온처리)에 이어서, 아프로티닌의 부가:
결과: 18mIU의 FVIIa/㎖
이 경우에, 프로테아제가 FVIIa를 활성화시킬 수 있도록 시간을 제공한다. 10분 동안 항온처리한 후에, 아프로티닌 만을 가하여 프로테아제를 억제한다. 생성된 FVIIa는 FVIIa-rTF 검정에서 정량한다. FVIIa 기본값(검정 1)을 뺌으로써, 선택된 조건하에서 프로테아제의 작용에 의해 8mIU FVIIa/㎖가 형성된다.
4. 프로테아제 + 아프로티닌에 이은 FVII 의 부가:
결과: 11mIU의 FVIIa/㎖
이 검정에서는, 프로테아제를 FVII과 접촉시키기 전에, 아프로티닌으로 억제시킨다. 이어서, FVII과 함께 항온처리한 다음 FVIIa를 정량하더라도 FVIIa 함량에 있어서의 상당한 증가를 유도하지 못한다(검정에서 편차 범위로 인하여, 검정 1의 10mIU/㎖와 비교하여 11mIU/㎖는 유의적인 것으로 간주되지 않음).
5. 프로테아제:
결과: 0mIU의 FVIIa/㎖
이 검정은 선택된 농도에서, 프로테아제 자체가 FVIIa-rTF 시험 시스템에 어떠한 영향도 미치지 않음을 나타내는 것이다.
요약하면, 상기로부터 다음의 사실을 알 수 있다:
- 기술된 프로테아제는 FVII을 활성화시킨다;
- 프로테아제에 의한 FVII의 활성화는 rTF의 존재와는 무관하게 "직접적으 로" 일어난다;
- FVII의 활성화는 아프로티닌에 의해 억제될 수 있으며, 선택된 농도에서, 아프로티닌 자체는 시험 시스템에 유의적인 영향을 미치지 않는다.
실시예 2
본 실시예는 프로테아제의 농도 및 프로테아제를 FVII과 항온처리하는 시간에 따라 좌우되는 반응에서 FVII이 어떻게 활성화되는지를 기술하고 있다.
시험 시스템 및 시약은 실시예 1에 기술된 조건과 상응하도록 선택한다. 첫번째 일련의 실험에서, 초기 도입된 FVII은 프로테아제 함유 용액의 상이한 희석액(1:5, 1:10 및 1:20)과 함께 미리 항온처리(실온에서 5분)시킨 다음, (프로테아제를 억제시키기 위하여) 아프로티닌으로 처리하고, 이어서 FVIIa-rTF 검정에서 이의 FVIIa의 함량을 시험한다.
다시 한번, 프로테아제를 FVII과 접촉시키기 전에 아프로티닌에 의해 억제시키는 평행 검정을 대조용 검정으로서 수행한다.
결과는 활성화 인자로서 제공되며, 즉 상기 언급한 대조용 검정에서 측정된 값의 x배에 상응하는 것이다.:
검정 대조용
프로테아제 + FVII 프로테아제 + 아프로티닌
항온처리 항온처리
+ 아프로티닌 + FVII
프로테아제 용액의 희석액 활성화 인자
1:5 2.6 1.0
1:10 2.0 1.0
1:20 1.6 1.0
대조용 검정의 활성화 인자 1:0은 추가로 포함되고, 동일한 항온처리 조건하에서 사용된 FVII을 함유하는 시험 완충액 만으로 처리하여 시험한 대조군에 상응한다. 즉, 대조용 검정에서는 유의적인 활성화가 일어나지 않는다.
이로부터, FVII은 프로테아제의 농도에 따라 좌우되는 방법으로 프로테아제에 의해 활성화됨을 알 수 있다.
유사하게, 공반응물의 농도가 일정하게 유지되는 경우에, FVII은 항온처리 길이에 따라 좌우되는 방법으로 프로테아제에 의해 활성화됨이 입증된다.
0.2IU FVII/㎖를 함유하는 용액 및 1:10 희석된 프로테아제 용액을 동일한 용적으로 함께 항온처리하는 경우에, 해당 시간 동안 항온처리하고 이어서 (활성화를 정지시키기 위하여) 아프로티닌을 부가함으로써 하기의 FVIIa 함량이 수득된다:
항온처리 시간 활성화 인자
0분 1.0
2.5분 1.3
5.0분 2.0
10.0분 2.8
40.0분 >3.8
이로부터, FVII은 시간 의존적 방법으로 프로테아제에 의해 활성화됨을 알 수 있다.
실시예 3
본 실시예를 사용하여, 프로테아제에 의한 FVII의 활성화가 칼슘 이온 및 헤파린의 존재하에서 증가됨을 입증하고자 한다.
25㎕의 프로테아제 함유 용액을 50㎕의
- 완충액(대조용)
- 15mM CaCl2
- 50USP 단위의 헤파린/㎖
- 파트롬틴(지질 혼합물, 제조업자의 지시에 따라 용해시킨 분취량)과 실온에서 5분 동안 혼합한 다음, 150㎕의 트리스/NaCl 완충액(pH 8.2) 및 25㎕의 발색원성 기질 S2288(3mM)로 처리하여, 405㎚에서 시간 경과에 따른 흡광도의 변화를 측정한다(37℃). 대조용 완충액에 대한 활성화 인자(x배)는 하기의 표에 제시되어 있다.
검정 활성화 인자(대조용 완충액의 x 배)
대조용 완충액 1.0
+ CaCl2 3.6
+ 헤파린 2.6
+ 지질 0.9
+ CaCl2 + 헤파린 4.3
+ CaCl2 + 지질 3.3
+ 헤파린 + 지질 2.7
+ CaCl2 + 헤파린 + 지질 3.7
본 실시예에 사용된 조건하에서, 프로테아제 활성이 칼슘 이온 및/또는 헤파린의 존재하에서 현저하게 증가됨을 관찰할 수 있다.
실시예 4
각각의 경우에, 10, 1 또는 0.1㎍의 프로테아제/㎖를 함유하는 25㎕의 용액을 25㎕의 FVIII(2 IU/㎖)과 혼합한 다음, 25㎕의 CaCl2(25 mM) 및 25㎕의 파트롬틴R(제조원; Dade Behring GmbH)을 가한다. 37℃에서 0, 3, 10 및 20분 동안 항온처리한 후에, 400㎕의 아프로티닌(500 KIU/㎎)을 가하여 반응을 정지시킨다. 초기에 아프로티닌을 도입한 샘플을 대조용으로서 사용한다.
각각의 샘플을 트리스-완충액/BSA로 희석시킨다. 각각의 경우에, 50㎕의 이 용액을 50㎕의 인자 시약[필수적으로, FIXa, FX 및 코아마틱R FVIII 시험(제조원; Chromogenix AB)에 따라 개질된 트롬빈 억제제로 구성됨]과 혼합하여 37℃에서 10분 동안 항온처리한다. 50㎕의 기질(예: S 2765, N-a-Cbo-D-Arg-Gly-Arg-pNA)을 가한 후에, 50㎕의 아세트산(50%)을 가하여 소정의 시간 동안 항온처리한 후에 반응을 정지시키고, OD405㎚를 측정한다. FVIII에 대한 표준 곡선을 사용하여 샘플의 농도를 측정한다.
결과:
첫번째 검정에서는, 프로테아제를 FVIII(2IU/㎖)과 항온처리시키는 시간을 일정하게(10분) 유지하지만, 프로테아제의 농도는 변화시킨다(0.1, 1 및 10㎍/㎖). 반응을 정지시키고, 활성 FVIII의 잔류 농도를 측정한다. 프로테아제 농도가 증가함에 따라, 상응하게 더 많은 FVIII이 불활성화된다(도 1).
샘플의 프로테아제 함량은 적절한 표준 곡선을 사용하여 정량할 수 있다.
두번째 검정에서는, 프로테아제의 농도를 일정(10㎍/㎖)하게 유지하지만, FVIII(2IU/㎖)과 항온처리하는 시간은 변화시킨다. 항온처리 길이가 증가됨에 따라, 활성 FVIII의 잔류 농도는 현저하게 감소됨을 보인다(도 2).
실시예 5
인자 V의 활성에 대한 "FVII 활성화인자"의 영향을 조사한다:
25㎕의 프로테아제 함유 용액(0 내지 100㎍/㎖)을 50㎕의 FV(5IU/㎖) 및 25㎕의 25mM CaCl2와 항온처리(0 내지 20분)한 후에, 100KIU의 아프로티닌/㎖를 함유하는 400㎕의 완충액을 가한다.
각각의 경우에, 100㎕의 각각의 항온처리 검정액을 100㎕의 FV-결핍 혈장과 37℃에서 1분 동안 항온처리한 후에, 200㎕의 트롬보렐 SR을 혼합하고, 슈니트거 및 그로스 응혈계(Schnitger and Gross coagulometer)에서 응고 시간을 측정한다. FV의 잔류 활성을 측정한다.
결과:
프로테아제 농도 (㎍/㎖) 잔류 FV 활성 프로테아제가 FV와 항온처리되는 시간(분)
0 10 20
10 93 91 100
30 100 93 28
100 100 29 13
본 실시예는 FV가 시간이 경과함에 따라 프로테아제에 의해 불활성화됨을 입증한다.
실시예 6
소위 총괄적인 시험에서 응고 시간에 대한 "FVII 활성화인자"의 영향을 슈니트거 및 그로스 응혈계를 사용하여 조사한다. 제시된 모든 차이값은 이러한 양에 의해 단축되는 응고 시간에 상응한다.
NAPTT (활성화되지 않은 부분 트롬보플라스틴 시간)
프로테아제 함유 용액을 완충액을 사용하여 100, 30, 10 및 3㎍/㎖로 희석시킨다. 100㎕의 이들 용액 각각을 100㎕의 시트레이트 혈장(표준 사람의 혈장 푸울 또는 개개 공여체) 및 100㎕의 파트롬틴R과 함께 37℃에서 2분 동안 항온처리한 후에, 100㎕의 25mM CaCl2를 가하고, 응고 시간을 측정한다. 프로테아제 대신에 완충액을 사용하여 수득한 이들 측정치 및 상응하는 응고 시간 사이의 차를 측정한다.
샘플 번호 응고 시간차(완충액 - 샘플)(초) 프로테아제 농도(㎍/㎖)
0 3 10 30 100
표준 사람 혈장 (213초) 0 13 20 42 43
1 2 3 4 5 0 0 0 0 0 20 27 13 18 25 33 31 14 37 49 42 45 23 51 54 41 47 29 50 46
FVII-활성화인자의 부가로 NAPTT의 농도 의존성 단축이 유도된다.
혈장 재석회화 시간
프로테아제-함유 용액을 완충액을 사용하여 100, 30, 10 및 3㎍/㎖로 희석시킨다. 100㎕의 이들 용액 각각을 100㎕의 시트레이트 혈장(표준 사람의 혈장 푸울 또는 개개 공여체)과 함께 37℃에서 1분 동안 항온처리한 후에, 100㎕의 25mM CaCl2를 가하여 응고 시간을 측정한다. 프로테아제 대신에 완충액을 사용하여 수득한 이들 측정치 및 상응하는 응고 시간 사이의 차를 측정한다.
샘플 번호 응고 시간차(완충액 - 샘플)(초) 프로테아제 농도(㎍/㎖)
0 3 10 30 100
표준 사람 혈장 (283초) 0 17.2 15.1 30.5 50.4
1 2 3 4 5 0 0 0 0 0 29.8 25.2 28.0 27.3 44.3 51.7 51.7 - 42.7 69.1 60.3 69.5 39.0 55.6 101.2 90.1 101.3 74.6 91.8 134.2
PT ( 프로트롬빈 시간)
프로테아제 함유 용액을 완충액을 사용하여 100, 30, 10 및 3㎍/㎖로 희석시킨다. 100㎕의 이들 용액 각각을 100㎕의 시트레이트 혈장(표준 사람의 혈장 푸울 또는 개개 공여체)과 함께 37℃에서 1분 동안 항온처리한 후에, 200㎕의 트롬보렐 SR(제조원; Dade Behring GmbH)를 가하여 응고 시간을 측정한다.
프로테아제 대신에 완충액을 사용하여 수득한 이들 측정치 및 상응하는 응고 시간 사이의 차를 측정한다.
샘플 번호 응고 시간차(완충액 - 샘플)(초) 프로테아제 농도(㎍/㎖)
0 3 10 30 100
표준 사람 혈장 (13.6초) 0 1.0 1.7 1.5 2.4
1 2 3 4 5 0 0 0 0 0 0.7 0.3 0.4 0.1 0.3 1.3 0.4 0.7 0.7 0.5 2.4 1.7 1.5 1.8 1.2 2.7 3.1 1.8 3.1 2.8
상기의 총괄적인 시험에서 응고 시간은 프로테아제의 농도에 따라 좌우되는 방법으로 단축된다. 상응하는 방법으로, 공지된 양의 "FVII 활성화인자"와 함께 사용되는 혈장을 "보정(calibrating)"한 후에, 표준 곡선으로부터 판독함으로써 샘플의 프로테아제 농도를 측정할 수 있다.
실시예 7
"FVII-활성화인자"의 플라스미노겐 활성화인자-활성화 특성을 단일쇄 유로키나제(scuPA) 및 단일쇄 tPA(sctPA)를 사용하여 조사한다.
검정:
0.1㎖의 PA 용액(20㎍의 scuPA/㎖ 또는 100㎍의 sctPA/㎖)
+ 0.1㎖의 시험 완충액, 100U 헤파린/시험 완충액 ㎖ 또는 시험 완충액 중의 20mM의 CaCl2
+ 0.5㎖의 시험 완충액
+ 0.1㎖의 프로테아제/샘플(증가되는 농도: 2 내지 10㎍의 scuPA/㎖ 또는 50 내지 200㎍의 sctPA/㎖)
37℃에서 항온처리
+ 0.1㎖의 100KIU 아프로티닌/시험 완충액 ㎖
37℃에서 2분 동안 항온처리
+ 0.1㎖의 기질 S-2444(3 mM)
대조용으로서, 처음 항온처리 전에, 플라스미노겐 활성화인자(PA) 대신에 아프로티닌을 초기에 도입시키고, 각각의 경우에 대해 과정을 수행한다. 대신에, 아프로티닌 대신에 PA를 이후까지 첨가하지 않는다.
측정치(Δ)의 차 ΔOD405 ㎚는 광도계로 측정한다. 수득한 대조값을 샘플/프로테아제 값으로부터 빼고, 이러한 방법으로 PAA 활성에 의해 유발되는 PA 활성을 측정한다(mIU/분).
결과:
scuPA 활성화(20㎍의 scuPA /㎖, 2 내지 10㎍의 " FVII 활성화인자 "/㎖)
A. 촉진제: 없음
항온처리 시간(분) 생성된 PA 활성(ΔmIU/분) "FVII 활성화인자"(㎍/㎖)
2 5 10
2 5 10 25 79 186 60 179 449 117 165 517
B. 촉진제 : 헤파린
항온처리 시간(분) 생성된 PA 활성(ΔmIU/분) "FVII 활성화인자"(㎍/㎖)
2 5 10
2 5 10 190 330 417 332 455 462 425 458 460
C. 촉진제 : CaCl2
항온처리 시간(분) 생성된 PA 활성(ΔmIU/분) "FVII 활성화인자"(㎍/㎖)
2 5 10
2 5 10 255 338 416 370 424 445 401 438 448
표는 scuPA가 "FVII 활성화인자"의 농도 및 항온처리 시간에 따라 좌우되는 방법으로 활성화된다는 사실을 예시한다. 동시에, 헤파린 및 칼슘은 모두 프로테아제에 의해 유발되는 PA의 활성화에 대해 촉진 효과를 갖는다.
sctPA 활성화(100㎍의 sctPA /㎖, 50 내지 200㎍의 " FVII 활성화인자 "/㎖)
활성화된 tPA의 전환률은 단지 tPA 프로효소에 비하여 3 내지 4배의 인자 만큼 증가되고(반면에, uPA의 전환율은 1000 내지 1500배의 인자 만큼 증가된다), 고농도의 두 가지 공반응물(상기 참조)은 분석 가능한 측정 신호를 수득하도록 선택되어야 한다.
항온처리 시간(분) 생성된 PA 활성(Δ mIU/분) "FVII 활성화인자"(200 ㎍/㎖)
1 10.2
2 16.8
5 38.8
10 60.2
20 73.3
B. "FVII 활성화인자"의 농도에 대한 의존성(항온처리 시간: 20분, 37 ℃에서), 촉진제: 헤파린(100 IU/㎖)
"FVII 활성화인자"(㎍/㎖) PA 활성(Δ mIU/분)
50 33.6
100 51.0
200 71.9
C. 촉진제(항온처리 시간: 20분, 37 ℃에서)
촉진제 PA 활성(Δ mIU/분)
없음 5.9
CaCl2 25.3
헤파린 63.8
표는 sctPA가 프로테아제 농도 및 항온처리 시간에 따라 좌우되는 방법으로 또한 활성화됨을 나타내는 것이다. 헤파린 및 칼슘 이온은 모두 "FVII 활성화인 자"의 PA-활성화 능력에 대해 촉진 효과를 갖는다.
실시예 8
둘 중 하나는 필수적으로 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor; vWF)를 함유하지 않는 반면에, 다른 하나는 vWF를 함유하는 두 가지 FVIII-함유 용액을 칼슘의 존재하에서 앞서 언급한 프로테아제와 함께 항온처리한다. 소정의 시간이 경과한 후에, 잔류하는 FVIII 활성을 발색원성 시험에 의해, 프로테아제를 함유하지 않는 대조용 검정에 대하여 측정한다.
이를 위하여, 0.1IU의 FVIII/㎖를 함유하는 용액 25㎕를 동일한 용적의 프로테아제 용액(10㎕/㎖)으로 처리하고, 전체를 25㎕의 CaCl2(25 mM)와 혼합한다. 37 ℃에서 0, 5, 10 및 20분 동안 항온처리한 후에, 검정물을 각 경우에 200KIU 아프로티닌/㎖를 함유하는 용액 400㎕로 처리하여 프로테아제의 단백질 분해 활성을 정지시킨다. 예비 실험에서는 이러한 농도의 아프로티닌이 하기에 기술되는 FVIII 활성 시험에 대해 유의적인 간섭 효과를 나타내지 않음을 보여준다(검정 1 + 3). 검정 2에서, 프로테아제는 FVIII과 접촉시키기 전에 아프로티닌과 함께 항온처리한 다음, 상기 기술된 바와 같이 수행한다.
이어서, 각 경우에, 정지시킨 샘플(또는 더욱 희석시킨 후에) 50㎕를 필수적으로, FIXa, FX 및 트롬빈 억제제로 구성된 소위 인자 시약으로 처리하고, 37℃에서 10분 동안 항온처리한다. 이어서, 활성화된 FX에 의해 분해되는 발색원성 기질 50㎕를 가하고, 50㎕의 아세트산(50%)을 가하여 5분 동안 항온처리한 후에 반응을 정지시키고, ΔOD405 ㎚를 측정한다. FVIII 활성(mIU)은 FVIII 농축물로부터 제조하여 시험에 포함시킨 일련의 희석액을 사용하여 작성한 표준 곡선에 의해 확인한다.
FVIII 활성은 프로테아제가 부가되지 않은 대조군을 기준으로 한 %로 나타낸다.
결과:
검정 FVIII 활성(%)
항온처리 시간(분)
0 5 10 20
1. FVIII 97 27 11 <1
2. FVIII/아프로티닌 98 97 97 96
3. FVIII/vWF 98 16 14 1
CaCl2(이 경우에, 6.25mM)의 존재하에서, FVIII은 항온처리 시간에 좌우되는 방법으로 프로테아제에 의해 불활성화된다. vWF는 FVIII이 프로테아제에 의해 불활성화되는 것을 막지 못한다. FVIII과 접촉되기 전에 프로테아제를 아프로티닌으로 억제시킬 경우 FVIII이 불활성화되는 것이 방지된다.
실시예 9
본 실험은 실시예 1/검정 1에 기술된 바와 같이 수행하지만, 이 경우에 프로테아제 및 FVIII의 혼합물 중의 칼슘의 농도는 변한다. 이를 위하여, 칼슘의 모용액으로부터 CaCl2를 도 3에 제시된 최종 농도까지 부가한다.
결과:
검정에서 칼슘의 농도가 1mM 미만으로 감소되는 경우에는, 이러한 조건하에 서 FVIII의 약 50%가 남는다. 0.5mM 미만의 칼슘에서는, 잔류율(%)이 60% 이상이다(도 1).
실시예 10
소위 총괄적인 시험에서 응고 시간에 대한 "FVII 활성화인자"의 영향을 트롬보엘라스토그래피로 조사한다.
관련 혈액 혈병의 전단 탄성 또는 강도의 변화는 힐가드 TEG 미터(Hilgard TEG meter; 제조원: Hellige)를 사용하여 계속해서 기록한다. 소위 r 및 k 값은 각각 혈액 회수 개시로부터의 시간 및 응고 반응의 개시로부터의 시간이며, 시트레이트 혈장의 경우에, TEG 곡선이 1㎜ 만큼 확대될 때까지의 재석회화 시간 및 곡선이 20㎜로 확대될 때까지의 r 값의 최종점으로부터의 시간(혈병 형성 시간)이다.
이를 위하여, 5명의 공급자로부터 수득한 혈액 또는 혈장 150㎕의 분취량을 각 경우에 계량용 큐벳에서 37℃에서 2분 동안 항온처리한 후에, 50㎕의 샘플(프로테아제)을 여기에 혼합한다. 반응은 25mM CaCl2 100㎕를 가하여 개시한다. 검정에서 "FVII 활성화인자"의 최종 농도는 15㎍/㎖이다. r 시간의 단축은 샘플 대신에 완충액을 함유하는 검정물에 대해 측정한다.
결과:
혈액 번호 샘플 r 시간(분) k 시간(분) r+k 시간(분)
1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 프로테아제 완충액 프로테아제 완충액 프로테아제 완충액 프로테아제 완충액 프로테아제 완충액 5.2 7.8 5.2 6.8 4.0 6.5 4.5 4.8 4.2 7.0 3.4 5.6 5.1 7.1 5.2 6.3 4.8 6.0 3.8 5.8 8.6 13.4 10.3 13.9 9.2 12.8 9.3 10.8 8.0 12.8
혈액 번호 샘플 r 시간(분)
1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 프로테아제 완충액 프로테아제 완충액 프로테아제 완충액 프로테아제 완충액 프로테아제 완충액 9.0 11.3 9.2 12.5 9.5 9.6 8.2 12.1 9.7 14.1
본 실시예는 거의 모든 경우에, 프로테아제를 부가하면 응고 시간이 현저하게 단축됨을 명확히 보여준다. 본 실시예에서, "FVII 활성화인자"의 피브린 분해 특성이 배경으로 포함된다. 이에 대한 이유는 "정상적인 피검자"에서, 혈장 중의 플라스미노겐 활성화인자의 농도가 나노그램 영역에 속하고, 시험관내 응고 시험에 영향을 주지 않기 때문이다.
실시예 11
프로테아제의 FVIII-우회 활성은 다음의 실험적 검정에 의해 기술된다: 측정방법으로서 트롬보엘라스토그래피를 사용한다. r 시간을 평가한다(참조: 실시예 10). 전혈 샘플을 FVIII-활성 억제 특성이 공지되어 있는 모노클로날 항체와 항온 처리하여 천연 FVIII 억제제(FVIII에 대한 항체)의 존재를 모의실험한다. 이 샘플을 전혈 샘플 대조군(Mab 대신에 완충액 사용)과 비교한다. 프로테아제의 FEIB 활성은 프로테아제(최종 농도 17 ㎍/㎖)를 Mab에 의해 억제되는 전혈 샘플에 가하여 시험한다. 프로테아제를 추가의 샘플에 가하여 r 시간에 대한 프로테아제 자체의 효과를 측정한다.
결과:
r 시간
전혈 대조군 8.0
전혈 + mAb 11.0
전혈 + mAb + 프로테아제 8.0
전혈 + 프로테아제 3.5
항-FVIII mAb에 의해 유발되는 r 시간의 연장을 프로테아제의 존재에 의해 다시 한번 표준화함으로써, 프로테아제의 FEIB 활성을 나타낸다. 프로테아제는 자체적으로 이미 상기에서 기술한 바와 같이 응고 시간을 단축시킨다.
실시예 12
다음의 물질을 50㎍의 FVII 활성화 프로테아제/㎖를 함유하는 용액에 가하여 상응하는 최종 농도를 제공한다:
25mM Na 시트레이트
25mM HEPES
100mM 아르기닌
0.75g의 슈크로즈/㎖
용액을 몇가지 분획으로 나누고, 분취량을 각 경우에 5.0 내지 8.6의 상이한 pH 값으로 조절한 다음, 60℃에서 10시간 동안 가열한다.
가열된 프로테아제 용액의 활성은 발색원성 시험으로 측정하고, 발색원성 기질 S2288(H-D-Ile-Pro-Arg-pHA x 2HCl, 제조원; Chromogenix AB, Sweden)의 시간 경과에 따른 아미도 분해를 기록한다. 이러한 활성은 가열되지 않고 평행으로 측정되는 분취량의 %로서 나타낸다:
결과:
검정 활성(%)
출발 물질 100
pH 5.0 76
pH 5.5 65
pH 6.1 81
pH 6.5 50
pH 7.1 43
pH 7.5 46
pH 8.1 46
pH 8.6 32
일련의 실험으로부터 특히, 산성 pH 범위에서의 안정화가 프로테아제의 불활성화를 현저하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. pH 5.5에서의 약간의 "돌파점(breakthrough)"은 프로테아제의 등전점이 이 범위에 속한다는 사실에 의해 설명될 수 있다. Na 시트레이트는 바람직한 pH 범위에서 발생하는 >50%의 활성 손실을 방지한다.
실시예 13
pH 6.1에서의 검정(실시예 1)은 프로테아제의 최상의 안정화를 나타내는 것이다. 따라서, 상이한 부가제를 pH 6.0에서 시험하여, 실시예 1에 기술된 바와같이 평가한다:
50㎍/㎖ 농도의 프로테아제를 사용하여, 다음의 최종 농도로 고정한다:
50mM Na 시트레이트/50 mM NaCl, pH 6.0
0.75g 슈크로즈/㎖
100mM 글리신
100mM 아르기닌
결과:
검정 활성(%)
출발 물질 100
Na 시트레이트/NaCl 54
Na 시트레이트/NaCl/슈크로즈 85
Na 시트레이트/NaCl/슈크로즈/글리신 92
Na 시트레이트/NaCl/슈크로즈/아르기닌 97
슈크로즈 및 각 경우에, 하나의 아미노산을 부가함으로써 프로테아제의 현저한 안정화가 나타낸다.
본 발명에 따르는 프로테아제는 응고 인자 ⅤⅡ을 활성화시키기 때문에, 이를 함유하는 약제학적 제제는 출혈의 예방 및 치료, 상처의 치유 및 피브린 함유 혈전에 의해 유발되는 질환을 치료하는데 적합하다.

Claims (9)

  1. a) 아프로티닌의 존재에 의해 억제되고,
    b) 칼슘 이온, 헤파린, 헤파란 설페이트 및 덱스트란 설페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 물질의 존재에 의해 활성이 증가되며,
    c) SDS-PAGE에서, 환원되지 않은 상태에서 후속적으로 염색할 경우, 50 내지 75kDa의 분자량 범위에서 하나 이상의 밴드를 가지고, 환원된 상태에서는 40 내지 55kDa의 분자량 범위에서 하나의 밴드를 가지며, 10 내지 35kDa의 분자량 범위에서 하나 이상의 밴드를 가지고,
    d) 40 내지 55kDa의 분자량 범위에서 환원된 상태의 SDS-PAGE에서 수득되는 밴드가 LLESLDP의 아미노산 서열을 가지고, 10 내지 35kDa의 분자량 범위에서 수득되는 밴드는 IYGGFKSTAGK의 아미노산 서열을 가짐을 특징으로 하고,
    혈장 또는 프로트롬빈(PPSB) 농축물을 음이온 교환 크로마토그래피한 다음 헤파린 또는 헤파란 설페이트 또는 덱스트란 설페이트를 사용하여 친화력 크로마토그래피함으로써 프로테아제를 수득함을 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는, 혈액 응고 인자 VII을 활성화시키기 위한 프로테아제.
  2. SDS-PAGE에서, 환원된 상태에서 60 내지 65kDa의 분자량 범위에서 하나의 밴드를 가지며 아미노산 서열 LLESLDP 및 IYGGFKSTAGK를 함유하는 제1항에 따른 프로테아제의 프로효소.
  3. 제1항에 따른 프로테아제 또는 제2항에 따른 프로효소에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 함유하는, 제1항에 따른 프로테아제 또는 제2항에 따른 프로효소의 면역학적 검출용 시약.
  4. 제1항에 따른 프로테아제 또는 제2항에 따른 프로효소 또는 이들 모두를 함유하는 진단용/분석용 시약.
  5. 제1항에 따른 프로테아제 또는 제2항에 따른 프로효소 또는 이들 모두를 함유하는 인자 VII 검출용 시약.
  6. 피브린-함유 혈전을 용해시키는데 적합한, 혈액 응고 인자 VII을 활성화시키는 제1항에 따른 프로테아제 또는 제2항에 따른 프로효소 또는 이들 모두를 소정량 함유하는 약제학적 제제.
  7. 제6항에 있어서, 혈액 응고 인자 VII을 활성화시키는 제1항에 따른 프로테아제 또는 제2항에 따른 프로효소 또는 이들 모두 이외에, 단일쇄 또는 이중쇄 플라스미노겐 활성화인자(PA) 또는 항응고제 또는 이들 모두를 함유하는 약제학적 제제.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, i) 가용성 칼슘 염, 또는 ii) 헤파린 또는 헤파란 설페이트 또는 덱스트란 설페이트, 또는 i)과 ii) 모두를 추가로 함유하는 약제학적 제제.
  9. 피브린 접착제 또는 플리스(fleece) 또는, 신속한 상처 봉합에 적합한 기타 피브린 기본 방출 시스템의 부가제로서 상처 치유 및 지혈을 촉진시키거나, 혈액 응고 인자 VIII에 대한 항체의 존재하에서 프로테아제 또는 이의 프로효소의 선천성 또는 후천성 결핍 상태에서 대체 사용되거나, 또는 인자 VII를 시험관내 활성화시키기 위한, 혈장 또는 프로트롬빈 복합체(PPSB) 농축물로부터 제조되거나, 재조합 또는 유전자이식에 의해 발현되는 제1항에 따른 프로테아제 또는 제2항에 따른 프로효소를 포함하는 약제학적 제제.
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Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19903693A1 (de) * 1998-04-24 1999-10-28 Centeon Pharma Gmbh Protease zur Aktivierung des Gerinnungsfaktors VII
DE19937219A1 (de) 1999-08-06 2001-02-08 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Reindarstellung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease, ihres Proenzyms oder eines Gemisches beider Proteine mittels Ionenaustauscherchromatographie
EP1023902A1 (en) 1999-01-28 2000-08-02 Aventis Behring Gesellschaft mit beschränkter Haftung Pharmaceutical preparation for the treatment of inflammatory processes
DE10023923A1 (de) 1999-06-10 2000-12-14 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Faktor VII-aktivierenden Protease aus Proteinlösungen
DE19937218A1 (de) * 1999-08-06 2001-02-08 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Reindarstellung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease, ihres Proenzyms oder eines Gemisches beider Proteine mittels Affinitätschromatographie
DE10036641A1 (de) * 2000-07-26 2002-02-14 Aventis Behring Gmbh Monoklonale Antikörper für die den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Protease (FSAP)und ihre Verwendung
DE10238429A1 (de) 2002-03-19 2003-10-30 Aventis Behring Gmbh Intellect Marburg I Mutante der Faktor VII aktivierenden Protease (FSAP) als Risikofaktor für Atherosklerose
ES2257361T3 (es) * 2000-07-26 2006-08-01 Zlb Behring Gmbh Mutantes de la proteasa activadora del factor vii y procedimiento de deteccion con anticuerpos especificos.
US7153679B2 (en) 2000-07-26 2006-12-26 Aventis Behring Gmbh Marburg I mutant of factor VII activating protease (FSAP) as risk factor for arterial thrombosis
DE50114021D1 (de) * 2001-01-08 2008-07-24 Csl Behring Gmbh Stabilisierte Flüssigzubereitung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease oder ihres Proenzyms
ES2502481T3 (es) * 2001-01-31 2014-10-03 Asahi Kasei Pharma Corporation Composición para el análisis de proteínas glicosiladas
DE10148037A1 (de) * 2001-09-28 2003-04-17 Aventis Behring Gmbh Verwendung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease zur Prophylaxe und Therapie von vaso-proliferativen Erkrankungen
AU2002351756A1 (en) 2001-12-21 2003-07-15 Novo Nordisk Health Care Ag Liquid composition of factor vii polypeptides
DE10205520A1 (de) * 2002-02-08 2003-08-14 Aventis Behring Gmbh Inhibitorischer, monoklonaler Antikörper gegen die den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Protease
PL207018B1 (pl) 2002-06-21 2010-10-29 Novo Nordisk Helth Care Ag Kompozycja farmaceutyczna, sposób przygotowania stabilnego polipeptydu czynnika VII i zastosowanie polipeptydu czynnika VII
DE10309368A1 (de) * 2002-08-06 2004-02-26 Aventis Behring Gmbh Intellectual Property/Legal Pharmazeutische Zubereitung mit RNA als Cofaktor der Hämostase
JP3830501B2 (ja) * 2003-01-17 2006-10-04 株式会社ティーティーシー アフィニティートラップリアクター、及びそれを用いたアンジオスタチン様断片のヒト血漿からの一段階精製プロセス
US7897734B2 (en) 2003-03-26 2011-03-01 Novo Nordisk Healthcare Ag Method for the production of proteins
KR20060015574A (ko) 2003-05-23 2006-02-17 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 용액 중 단백질 안정화
EP1495766A1 (en) * 2003-07-10 2005-01-12 ZLB Behring GmbH Factor VII activating protease (FSAP) derived polypeptides for the treatment of angiogenesis-related disorders
ES2574581T3 (es) 2003-08-14 2016-06-20 Novo Nordisk Health Care Ag Composición farmacéutica líquida acuosa de polipéptidos de tipo Factor VII
DE10346751A1 (de) * 2003-10-06 2005-04-21 Transmit Technologietransfer Clot-Lysis-Assay
RU2373953C2 (ru) 2003-12-19 2009-11-27 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг Стабилизированная композиция, содержащая полипептид фактора vii
DE102005026163A1 (de) 2004-08-24 2006-03-02 Dade Behring Marburg Gmbh Gegen den Marburg I Polymorphismus der Faktor VII aktivierenden Protease (FSAP) gerichtete Antikörper, ihre Herstellung und Verwendung
DE502006005169D1 (de) 2005-12-22 2009-12-03 Siemens Healthcare Diagnostics Diagnostisches Verfahren zur Erkennung von Trägern der Marburg l-Variante der Faktor VII-aktivierenden Protease (FSAP) anhand differenzieller Modulation der FSAP-Aktivität
US20100172830A1 (en) * 2007-03-29 2010-07-08 Cellx Inc. Extraembryonic Tissue cells and method of use thereof
US8545459B2 (en) * 2009-02-25 2013-10-01 Teleflex Medical Incorporated Stabilized enzyme compositions
US9333280B2 (en) 2009-02-25 2016-05-10 Teleflex Medical Incorporated Stabilized enzyme compositions
EP2386652A1 (de) 2010-05-12 2011-11-16 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Homogenes Verfahren zur Bestimmung der Plasminogenaktivator-aktivierenden Aktivität der FSAP
ES2844189T3 (es) 2013-03-08 2021-07-21 Csl Behring Gmbh Tratamiento y prevención de lesiones remotas por isquemia-reperfusión
AU2014301041B2 (en) * 2013-06-28 2019-10-31 Csl Behring Gmbh Combination therapy using a Factor XII inhibitor and a C1-Inhibitor
US10143413B2 (en) * 2014-06-13 2018-12-04 Kurin, Inc. Catheter insertion device with blood analyzer
US10010282B2 (en) 2015-07-24 2018-07-03 Kurin, Inc. Blood sample optimization system and blood contaminant sequestration device and method
US10827964B2 (en) 2017-02-10 2020-11-10 Kurin, Inc. Blood contaminant sequestration device with one-way air valve and air-permeable blood barrier with closure mechanism

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4363319A (en) * 1980-06-30 1982-12-14 Applied Medical Devices, Inc. Ready-to-use bandage incorporating a coagulant composition and method of preparing same
FR2504921A1 (fr) * 1981-04-30 1982-11-05 Choay Sa Medicament nouveau constitue par un complexe aprotinine-plasmine et procede de preparation de ce nouveau complexe
US4447412A (en) * 1983-02-01 1984-05-08 Bilton Gerald L Enzyme-containing digestive aid compostions
US5175087A (en) * 1987-07-06 1992-12-29 Biopool International, Inc. Method of performing tissue plasminogen activator assay
US5703055A (en) * 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
EP0482088B1 (en) * 1989-07-20 1999-03-31 Analytical Control Systems, Inc. Improved stable coagulation controls
JPH07500095A (ja) * 1991-10-11 1995-01-05 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ 局所止血用止血組成物
AU3479495A (en) * 1994-09-30 1996-04-26 Ppl Therapeutics (Scotland) Ltd Alpha-1-antitrypsin and antithrombine-iii variants
US6359054B1 (en) * 1994-11-18 2002-03-19 Supratek Pharma Inc. Polynucleotide compositions for intramuscular administration
DE19903693A1 (de) * 1998-04-24 1999-10-28 Centeon Pharma Gmbh Protease zur Aktivierung des Gerinnungsfaktors VII
DE19937219A1 (de) * 1999-08-06 2001-02-08 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Reindarstellung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease, ihres Proenzyms oder eines Gemisches beider Proteine mittels Ionenaustauscherchromatographie
DE10023923A1 (de) * 1999-06-10 2000-12-14 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Faktor VII-aktivierenden Protease aus Proteinlösungen
DE19937218A1 (de) * 1999-08-06 2001-02-08 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Reindarstellung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease, ihres Proenzyms oder eines Gemisches beider Proteine mittels Affinitätschromatographie
ES2257361T3 (es) * 2000-07-26 2006-08-01 Zlb Behring Gmbh Mutantes de la proteasa activadora del factor vii y procedimiento de deteccion con anticuerpos especificos.
US7153679B2 (en) * 2000-07-26 2006-12-26 Aventis Behring Gmbh Marburg I mutant of factor VII activating protease (FSAP) as risk factor for arterial thrombosis
DE50114021D1 (de) * 2001-01-08 2008-07-24 Csl Behring Gmbh Stabilisierte Flüssigzubereitung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease oder ihres Proenzyms
DE10148037A1 (de) * 2001-09-28 2003-04-17 Aventis Behring Gmbh Verwendung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease zur Prophylaxe und Therapie von vaso-proliferativen Erkrankungen
DE10205520A1 (de) * 2002-02-08 2003-08-14 Aventis Behring Gmbh Inhibitorischer, monoklonaler Antikörper gegen die den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Protease

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US6528299B1 (en) 2003-03-04

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