ES2257361T3

ES2257361T3 - Mutantes de la proteasa activadora del factor vii y procedimiento de deteccion con anticuerpos especificos.

Info

Publication number: ES2257361T3
Application number: ES01115691T
Authority: ES
Inventors: Juergen Roemisch; Hans-Arnold Stoehr; Annette Feussner; Wiegand Lang; Thomas Weimer; Margret Becker; Claudia Nerlich; Gudrun Muth-Naumann
Original assignee: ZLB Behring GmbH
Current assignee: CSL Behring GmbH
Priority date: 2000-07-26
Filing date: 2001-07-05
Publication date: 2006-08-01
Anticipated expiration: 2021-07-05
Also published as: US20020142316A1; JP5080707B2; KR20020010512A; US7863009B2; DK1650305T3; US6831167B2; EP1182258A1; CA2353314C; US20090162871A1; ATE439445T1; EP1650305A1; JP2002291486A; EP1650305B1; DE50108974D1; EP1182258B1; ES2330544T3; US7442514B2; ATE318315T1; CA2353314A1; AU784441B2

Abstract

Mutante de la secuencia de ADN que codifica la proteasa activadora del Factor VII de la coagulación sanguínea y de los activadores del plasminógeno de cadena única (FSAP), caracterizado porque el mutante exhibe, en la posición de nucleótido 1601, un intercambio de bases G/A con respecto a la secuencia de nucleótidos según la SEQ ID Nº 1.

Description

Mutantes de la proteasa activadora del factor VII y procedimiento de detección con anticuerpos específicos.

La invención se refiere a mutantes de la proteasa activadora del factor VII de coagulación sanguínea (FSAP), y a un procedimiento para la detección de estos mutantes a nivel tanto proteico como de ARN/ADN, o en una muestra de tejidos.

Por la solicitud de Patente Alemana DE 199 03 693 se conoce ya una proteasa aislada del plasma sanguíneo, capaz de activar el factor VII de la coagulación. Sobre la base de este primer hallazgo, se la designó como proteasa activadora del Factor VII (FSAP, en sus siglas en inglés). Investigaciones detalladas han demostrado que la FSAP es también una potente activadora de los activadores del plasminógeno de cadena única, tales como pro-uroquinasa o el activador del plasminógeno tisular de cadena única (sct-PA, en sus siglas en inglés). Sobre la base de estas propiedades, se han descrito posibilidades de aplicación de la FSAP, por ejemplo, su uso como agente estimulante de la coagulación basado sobre la aceleración de la coagulación potenciada por la activación del Factor VII. Sola o en combinación con activadores del plasminógeno, la FSAP también puede encontrar aplicación en la fibrinolisis, por ejemplo, en las complicaciones trombóticas.

Tal como describen las solicitudes de Patente Alemana DE 199 03 693 y DE 199 26 531, se han desarrollado ensayos para la detección de la proteasa que permiten cuantificar tanto el contenido en antígeno FSAP como su actividad, por ejemplo, en plasma. En este caso, la determinación del antígeno se lleva a cabo, preferentemente, por medio de un ensayo ELISA. Como se describe en la solicitud de Patente Alemana DE 199 26 531, la actividad de FSAP se puede determinar mediante la cuantificación de la activación de pro-uroquinasa en uroquinasa, y su reacción con un sustrato cromógeno, con la consiguiente medición diferencial de la extinción. Un hallazgo sorprendente en la realización de este ensayo fue la activación de la pro-enzima FSAP aislada, por ejemplo, de plasma bajo las condiciones de incubación seleccionadas, permitiendo de esta forma la activación de la pro-uroquinasa. Investigaciones más recientes han demostrado que la FSAP se convierte, por auto-activación, en la forma activada y, de esta manera, puede activar, por ejemplo, la pro-uroquinasa o el FVII. Esto se confirma, adicionalmente, por medio de las condiciones de incubación anteriormente mencionadas, a saber, valor de pH neutro a alcalino, iones de calcio y heparina. Además, los resultados más recientes indican que las propias pro-uroquinasa/uroquinasa (o tPA de una y dos cadenas) provocan o apoyan una activación de FSAP de cadena única.

Utilizando los dos sistemas experimentales anteriormente mencionados, es decir, el ensayo ELISA y el de activación de pro-uroquinasa, se han investigado más de 180 plasmas de donantes de sangre sanos. Se demostró, de este modo, que entre 5 y 10% de todas las muestras exhibe una potencia claramente disminuida de la activación de pro-uroquinasa determinada por la FSAP con respecto a un conjunto de plasma (de más de 100 donantes sanos) o frente al promedio del colectivo experimental total.

Por el contrario, en la mayoría de estos donantes (con actividad reducida) se midieron valores medios de antígeno de FSAP. Se supone, por consiguiente, que las muestras de sangre analizadas podrían contener una o múltiples modificaciones de la FSAP, que tendrían como consecuencia actividades limitadas o ausentes. Tal como se había sospechado ya en la solicitud de Patente Alemana DE 199 26 531, esto podría basarse en polimorfismos existentes en la población, es decir, en una o múltiples mutaciones de las estructuras de la FSAP, que se muestran en una modificación de la secuencia de aminoácidos de la FSAP. Las actividades reducidas, por lo general, en un 50 hasta 70% con respecto al valor medio de todos los donantes analizados, señalan hacia una mutación heterocigótica. Esto se podría traducir, desde el punto de vista fenotípico, en la presencia probablemente paritaria en plasma de ambas FSAP, es decir, la FSAP de tipo salvaje y la variante mutante. Suponiendo que la variante mutada tuviera la propiedad de activar la pro-uroquinasa (casi) totalmente anulada, se podría medir, en promedio, una actividad aproximadamente reducida a la mitad. Adicionalmente, sin embargo, también se han descrito ya expresiones pseudo-homocigóticas de mutaciones heterocigóticas de otras proteínas, en las que la proteína mutada era apenas detectable, pero que, como tal, tenía anulada sólo una parte de la correspondiente propiedad biológica detectada.

Para excluir que la responsabilidad de la anulación de la actividad de la FSAP observada sea del déficit o de la disminución de potenciales co-factores desconocidos, se purificaron muestras de FSAP de tres donantes que habían mostrado en donaciones repetidas una actividad significativamente reducida. Las proteínas altamente purificadas exhibieron, con respecto a la FSAP purificada del conjunto del plasma, también una actividad manifiestamente reducida. Esto hace disminuir la posibilidad de una influencia de co-factores, e incrementa la de una modificación de la proteína en el sentido anteriormente citado. Resultó sorprendente el hallazgo de que la potencia para activar el Factor VII no parece encontrarse limitada. Por esta razón, estos mutantes son especialmente adecuados para la aplicación anteriormente mencionada como agente estimulante de la coagulación, como se describe en la solicitud de Patente Alemana DE 199 03 693, dado que su potencial fibrinolítico se encuentra aparentemente limitado. Sobre la base de los conocimientos de modificaciones de la secuencia de nucleótidos, que se describen a continuación, estos mutantes se pueden preparar de forma recombinante o transgénica. No obstante, también se les puede aislar como la correspondiente proteína FSAP (FSAP de una o dos cadenas) a partir de fuentes naturales tales como el plasma sanguíneo. En las solicitudes de Patente Alemana DE 199 03 7693, 199 37 219, y 199 37 218, se han descrito ya procedimientos que permiten la preparación de FSAP, preferentemente con ayuda de inmunoabsorción, tal como se explica detalladamente en la solicitud de Patente Alemana DE 100 36 641. Hasta donde se conoce, sin embargo, los anticuerpos monoclonales utilizados hasta la fecha no diferencian entre el tipo salvaje y los mutantes de FSAP. En consecuencia, para la preparación de mutantes sólo se pueden utilizar anticuerpos monoclonales capaces de reaccionar específicamente con los mutantes. En este caso, los anticuerpos se pueden obtener mediante inmunización con los mutantes. Además, para la inmunización y generación de los correspondientes anticuerpos según métodos conocidos, se pueden utilizar péptidos con regiones de proteína correspondientes a los aminoácidos 389 hasta 397 (...SFRVQKIFK...) y/o 534 hasta 539 (...EKRPGV...) de la SEQ. ID Nº 4 del protocolo de secuencia. Adicionalmente, estos anticuerpos encuentran también aplicación en la detección específica de estos mutantes, por ejemplo, como reactivos en procedimientos de detección tales como ELISA, Inmunotransferencia de Western, en inmunohistología o en la Clasificación Celular Asistida por Fluorescencia (= FACS, en sus siglas en inglés).

Por el contrario, anticuerpos específicamente dirigidos para el tipo salvaje de FSAP o contra la correspondiente secuencia de aminoácidos del tipo salvaje, por ejemplo, contra las secuencias de aminoácidos 389 hasta 397 (...SFRVEKIFK...) y/o contra la secuencia de aminoácidos 534 hasta 539 (...GKRPGV...), se pueden utilizar en forma humanizada como agentes farmacéuticos para la inhibición profiláctica o terapéutica de la actividad de FSAP, por ejemplo, para contrarrestar episodios de hiperfibrinolisis causadas por hemorragias. Adicionalmente, estos anticuerpos se pueden uti-
lizar también para la purificación, detección y diferenciación de FSAP de tipo salvaje del modo anteriormente descrito.

La secuencia genómica de la FSAP se ha identificado en el Banco de Genes bajo el Nº de Acceso AC 006097, por comparación con la secuencia conocida de ADNc (Choi-Miura, Nº de Acceso S 83182), habiéndose derivado, de esta forma, secuencias de intrón y exón. En total, se han diseñado 12 pares de cebadores para poder amplificar las secuencias codificadoras en reacciones de PCR específicas, junto con una pequeña parte de las respectivas secuencias de intrón flanqueantes.

En primer lugar, se aisló el ADN genómico de sangre de 2 voluntarios con actividad de pro-uroquinasa reducida y de 4 voluntarios con actividad de pro-uroquinasa normal, se amplificó con todos los pares de cebadores y, por último, utilizando el cebador de PCR, se determinó la secuencia de ADN. El resultado se representa en la Tabla 1. En total, 4 posiciones de nucleótidos en la región codificadora fueron polimorfas, es decir, en estas posiciones se detectan simultáneamente dos bases. Por consiguiente, se ha partido del hecho de que, en estos casos, hay presencia de heterocigosidad, con un alelo de tipo salvaje y un alelo mutante. Dos de ellos (en las posiciones 183 y 957) son intercambios de terceras bases, que no conducen a un intercambio de aminoácidos. Los otros dos, que se encontraron en el ADN de los voluntarios con actividad reducida de pro-uroquinasa, conducen a intercambios de aminoácidos como se muestra en la Tabla 1.

TABLA 1

Secuencia de ADN en posiciones de nucleótidos*

Voluntario nº	Actividad de	183	957	1177	1601
	Pro-UK-427.857
S83182	T	G	G	G
9689	normal	T/C	G	G	G
9690	normal	T/C	G	G	G
9704	normal	T	G/A	G	G
9706	normal	T	G/A	G	G
9714	reducida	T	G	G/C	G/A
9715	reducida	T	G	G/C	G/A
* en donde 1 es la A del codón de iniciación
Aminoácido en Posición*

Voluntario nº	Actividad de	NT*: 183	NT: 957	NT: 1177	NT: 1601
	Pro-UK-427.857	AS*: 61	AS: 319	AS: 393	AS: 534
S83182	His	Lys	Glu	Gly
9689	normal	His	Lys	Glu	Gly
9690	normal	His	Lys	Glu	Gly
9704	normal	His	Lys	Glu	Gly

TABLA 1 (continuación)

Aminoácido en Posición*

Voluntario nº	Actividad de	NT*: 183	NT: 957	NT: 1177	NT: 1601
	Pro-UK-427.857	AS*: 61	AS: 319	AS: 393	AS: 534
S83182	His	Lys	Glu	Gly
9706	normal	His	Lys	Glu	Gly
9714	reducida	His	Lys	Glu/Gln	Gly/Glu
9715	reducida	His	Lys	Glu/Gln	Gly/Glu
*NT = posición de nucleótido; AS = posición de aminoácido

Con el fin de investigar la correlación de ambas mutaciones con la actividad reducida de pro-uroquinasa, se secuenciaron los ADN de otras personas en estas posiciones. El resultado se representa en la Tabla 2. Los 6 voluntarios con actividad reducida de pro-uroquinasa fueron heterocigotos en la posición de nucleótido 1601 (intercambio de Gly-Glu), cuatro exhibieron, adicionalmente, heterocigosidad en la posición 1177 (intercambio de Glu-Gln). Ninguno de los, en total, 11 voluntarios con actividad de pro-uroquinasa normal o menor que el nivel normal, mostró las heterocigosidades anteriormente mencionadas. Este resultado permite concluir que, al menos, el intercambio en la posición de aminoácido 534 se encuentra originalmente relacionado con la actividad reducida de pro-uroquinasa. Hasta el momento, se desconoce si un intercambio de aminoácidos sólo en la posición 393 podría tener, como consecuencia, una reducción de la actividad de pro-uroquinasa.

TABLA 2

Secuencia de ADN en posición de nucleótido

Voluntario nº	Actividad de	1177	1601
	Pro-UK-427.857
9714	Reducida	C/G	A/G
9715	Reducida	C/G	A/G
9802	Reducida	C/G	A/G
10032	Reducida	G	A/G
10039	Reducida	C/G	A/G
10047	Reducida	G	A/G
9698	Nivel normal inferior	G	G
9702	Nivel normal inferior	G	G
9711	Nivel normal inferior	G	G
9712	Nivel normal inferior	G	G
10038	Nivel normal inferior	G	G
9689	Normal	G	G
9690	Normal	G	G
9704	Normal	G	G
9706	Normal	G	G
9803	Normal	G	G
10043	Normal	G	G

Por lo tanto, es objeto de la invención un mutante de la secuencia de ADN que codifica la proteasa activadora (FSAP) del factor VII de coagulación y los activadores del plasminógeno de cadena única, que posee en la posición de nucleótido 1177 un intercambio de bases G/C y/o en la posición de nucleótido 1601 un intercambio de bases G/A.

La secuencia de nucleótidos SEQ. ID Nº 1 del protocolo de secuencias adjunto indica la secuencia del tipo salvaje. La secuencia de ADN de los mutantes, con los dos intercambios en las posiciones de nucleótido 1177 y 1601 se describe mediante la SEQ. ID Nº 2 del protocolo de secuencias. La correspondiente secuencia de aminoácidos del tipo salvaje se puede deducir de la SEQ. ID Nº 3 del protocolo de secuencias. La SEQ. ID Nº 4 muestra la secuencia de aminoácidos de los mutantes con los dos intercambios de aminoácidos (Glu-Gln 393 y Gly-Glu 534).

Con el descubrimiento de las secuencias de ADN y de aminoácidos mencionadas en el protocolo de secuencias, se dan los requisitos previos para el desarrollo de procedimientos diagnósticos para la detección de pacientes con expresión heterocigótica u homocigótica de la FSAP, genéticamente condicionada. Las mutaciones se pueden detectar en el ADN genómico o en el ARNm derivado del mismo.

Se describen anticuerpos monoclonales contra la proteasa activadora del Factor VII de la coagulación, y sus mutantes, así como su uso para la detección y determinación de la actividad de FSAP y sus mutantes.

Los sistemas experimentales que permiten la cuantificación tanto del contenido en antígeno de FSAP como la determinación de su actividad, tales como inmunotransferencias de Western o un inmunoensayo enzimático (ELISA), son en sí conocidos ya de las solicitudes de Patente Alemana DE 199 03 693 y 199 26 531.

Estos sistemas experimentales se basan en que anticuerpos monoclonales específicos fijan y/o detectan la FSAP. Aun cuando mediante la inmunización, por ejemplo, de ratones, se identifican a menudo muchos clones positivos con respecto a la expresión de un anticuerpo monoclonal específico, no sólo son escasos, sino pocos de ellos los que resultan adecuados para las cuestiones anteriormente planteadas. Por lo tanto, se presenta la misión de encontrar anticuerpos monoclonales específicos contra la proteasa activadora del Factor VII de coagulación que se puedan utilizar de manera eficaz tanto para su preparación en estado puro, como también para la detección cualitativa y cuantitativa y para la determinación de su actividad.

Se ha encontrado ahora que los anticuerpos monoclonales contra la proteasa activadora del Factor VII de coagulación, formados por la línea celular de hibridoma DSM ACC2453 y la línea celular de hibridoma DSM ACC2454, satisfacen en gran medida estos requisitos. Estos anticuerpos han sido depositados, de acuerdo con el Acuerdo de Budapest, en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, en Braunschweig.

Hasta hace poco tiempo, la FSAP se purificaba predominantemente en su forma activada. Métodos de preparación convencionales, tales como las técnicas de cromatografía de columna, favorecen la rápida activación y consiguiente inactivación de la proteasa. En la actualidad, la preparación en estado puro de la proteasa activadora del Factor VII de coagulación y, sobre todo, de su proenzima, con un elevado rendimiento resulta posible por medio del acoplamiento de uno de los anticuerpos anteriormente mencionados a un soporte, equilibrar éste con un líquido que contenga la proteasa o su proenzima, lavarlo a continuación, y obtener la proteasa o su proenzima por
elución.

Adicionalmente, los anticuerpos mencionados son también adecuados para la detección de la proteasa activadora del Factor VII de coagulación, o su proenzima, mediante un inmunoensayo en el que

a): se incuba y se lava una muestra, que debe contener la proteasa o su proenzima, con un primer anticuerpo fijado a un soporte sólido, a continuación, se agrega un segundo anticuerpo marcado y nuevamente se lava, y se mide la señal generada por el segundo anticuerpo u otros anticuerpos monoclonales o policlonales; o

b): se fija en un soporte la proteasa o su proenzima contenida en la muestra a analizar, por ejemplo, mediante anticuerpos monoclonales contra la proteasa o su proenzima, y se le detecta con un anticuerpo marcado, solo o mezclado con un anticuerpo no marcado, y subsiguiente detección del anticuerpo monoclonal; o

c): se fija un anticuerpo sobre un soporte, mezclado con una muestra en la que se debe analizar la proteasa o su proenzima, en presencia de una proteasa o su proenzima marcada, y se mide la señal generada por la marca.

Otra posibilidad para la detección de la proteasa activadora del Factor VII de coagulación, o su proenzima, consiste en llevar a cabo la detección con la bio-metodología de Western mediante una reacción inmunológica con un anticuerpo marcado solo, o mezclado con un anticuerpo no marcado, y subsiguiente detección del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, por medio de proteína A o G marcada, o un anticuerpo monoclonal o policlonal, dirigido contra el anticuerpo monoclonal.

Por último, también es posible determinar la actividad de la proteasa activadora del Factor VII de coagulación, o su proenzima, en soluciones de proteínas, incubando la solución de proteínas que contiene la proteasa y/o su proenzima sobre un soporte sólido, al que se ha acoplado previamente un anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteasa y, tras el lavado del soporte sólido, se incuba la proteasa y su proenzima con reactivos que permiten la determinación de su actividad. La actividad de la proteasa o su proenzima se puede medir, entonces, por medio de una determinación fotométrica de la extinción que aparece por su acción sobre sustratos cromógenos.

Otras posibilidades para la determinación de la actividad de la proteasa o su proenzima consisten en medir

-: su efecto inactivador de los Factores VIII/VIIIa o V/Va de coagulación, o

-: su efecto reductor de los tiempos de coagulación en ensayos de coagulación globales, o

-: su efecto activador sobre los activadores del plasminógeno, o

-: su efecto activador del Factor VII de coagulación.

Para la aplicación en los procedimientos anteriormente mencionados son apropiados tanto los anticuerpos monoclonales completos, como sus fragmentos tales como F(ab')_{2} o Fab. Los anticuerpos o sus fragmentos se utilizan, tras su marca con una sustancia activa de tipo radioactivo, fluorescente o enzimático, como coadyuvantes de detección en un inmunoensayo o en un procedimiento de detección por inmunotransferencia de Western. Se pueden utilizar, igualmente os anticuerpos monoclonales o sus fragmentos no marcados, si bien, en este caso, la detección o inmovilización se lleva a cabo a través de un anticuerpo marcado, dirigido contra anticuerpos de ratón, o su fragmento marcado (procedimiento "sándwich"). Los anticuerpos monoclonales o sus fragmentos se pueden utilizar solos o en forma de mezcla. Esto es especialmente recomendable en inmunotransferencias de Western, ya que las electroforesis sobre gel SDS se llevan a cabo, con frecuencia, bajo condiciones reductoras de las muestras. Dado que las dos cadenas polipeptídicas de la FSAP están unidas entre sí únicamente mediante un puente disulfuro, en la reducción la molécula se degrada en dos cadenas, a saber la cadena pesada y la ligera, en donde los anticuerpos monoclonales DSM ACC2454 reconocen la primera, y los anticuerpos monoclonales DSM ACC 2453 reconocen esta última. Por consiguiente, para la detección de ambas cadenas son necesarios los dos anticuerpos monoclonales o sus fragmentos.

Los anticuerpos monoclonales se han preparado y caracterizado de la forma siguiente:

Inmunización

Tres ratones hembras Balb/c (de aproximadamente 6 semanas de edad) se inmunizaron con activador de FVII. La primera inyección estuvo compuesta por 0,2 ml del antígeno (10 \mug), mezclados con 0,2 ml de adyuvante de Freund complejo. En las tres inyecciones de refuerzo subsiguientes (a intervalos de 2 semanas entre sí), se administró el antígeno (20 \etag en 0,2 ml) sin adyuvante (todas las inyecciones fueron i.p.). La dilución del inmunógeno se llevó a cabo en PBS. Después de la última inyección, se determinó el título en suero por medio de ELISA indirecto, recubriendo una
placa de microtitulación con activador de FVII. Para la fusión, se seleccionó el ratón con el título en suero más alto.

Fusión

Alrededor de tres semanas después de la última aplicación, se administró el antígeno durante tres días consecutivos (10 \mug en 0,1 ml, i.v.). Al día siguiente (día 4), y tras una extracción de sangre, el ratón fue sacrificado, se extrajo el bazo y se aislaron las células esplénicas. A continuación, se fusionaron las células esplénicas con la línea celular de mieloma de ratón SP2/0-Ag 14. Se utilizó como reactivo de fusión polietilenglicol 4000 (Merck). La fusión se llevó a cabo por medio de una modificación del método original de Köhler/Milstein. Las células se distribuyeron sobre placas de cultivo de 24 pocillos. Como medio se utilizó Medio de Eagle Modificado por Dulbecco con suero bovino fetal al 10% y HAT para la selección. Después de alrededor de dos semanas, se transfirieron y se codificaron los clones celulares crecidos en las oquedades de una placa de 48 pocillos.

Rastreo del Hibridoma

A 1.728 clones crecidos se retiró el sobrenadante de cultivo y se analizó la presencia de IgG de ratón por ELISA. Con ayuda de activador de FVII inmovilizado, se analizó la especificidad de los sobrenadantes positivos para IgG de ratón (ELISA). De las líneas celulares estudiadas, se identificaron y conservaron por congelación 108 líneas celulares específicas para el activador de FVII.

Se seleccionaron las dos líneas celulares de hibridoma, con las designaciones DSM ACC2453 y DSM ACC2454, para investigaciones adicionales. La especificidad de los anticuerpos formados por estas líneas celulares se confirmó con ayuda del BIACORE y se estudió la cinética de fijación. Los dos anticuerpos monoclonales son del tipo de IgG1.

Con ayuda de los anticuerpos descritos contra el tipo salvaje de FSAP y contra sus mutantes, es posible llevar a cabo procedimientos diagnósticos para la detección de mutantes.

De esta forma, se puede

a): incubar una muestra, que podría contener el mutante, con un primer anticuerpo fijado a un soporte sólido y, seguidamente, lavarlo, agregando, entonces, un segundo anticuerpo marcado, o un anticuerpo marcado, dirigido contra el tipo salvaje, y volver a lavar y medir la señal generada por el segundo anticuerpo, o

b): incubar una muestra, que podría contener el mutante, con un primer anticuerpo contra el tipo salvaje, fijado a un soporte sólido y, a continuación, lavarlo, agregando, entonces, un segundo anticuerpo marcado y volver a lavar, y medir la señal generada por el segundo anticuerpo, o

c): fijar sobre un soporte sólido la muestra a investigar en busca de la presencia del mutante, que se detecta con un anticuerpo marcado solo o mezclado con un anticuerpo no marcado, y consiguiente detección del anticuerpo marcado, o

d): mezclar un anticuerpo fijado a un soporte sólido con la muestra a investigar en busca de la presencia del mutante, en presencia de un anticuerpo marcado, y medir la señal generada por la marca.

Se prefiere un procedimiento diagnóstico en el que se mide la actividad de la FSAP, en el cual la muestra que contiene la proteasa se incuba en un soporte sólido, al que se ha acoplado previamente un anticuerpo dirigido contra la proteasa y, después de lavar el soporte sólido, incubar la proteasa fijada con reactivos que permiten determinar su actividad.

En este caso, la actividad de la proteasa se puede medir por medio de la determinación fotométrica de la extinción que se produce como consecuencia de la acción sobre sustratos cromógenos.

Igualmente, es posible determinar la actividad de la proteasa midiendo

-: su efecto inactivador de los Factores VIII/VIIIa y V/Va de coagulación, o

-: su efecto reductor de los tiempos de coagulación en la prueba de coagulación global, o

-: su efecto activador de los activadores del plasminógeno, o

-: su efecto activador sobre el Factor VII de coagulación.

Por último, están también disponibles procedimientos en los que se mide el efecto activador de los activadores del plasminógeno, a través de la activación de

-: la uroquinasa de cadena única (scuPA, siglas en inglés de activador del plasminógeno de la uroquinasa cadena única), o del

-: tPA de cadena única (sctPA, siglas en inglés de activador del plasminógeno tisular de cadena única).

Para la detección de las mutaciones responsables de la disminución de la actividad de la pro-uroquinasa a niveles de ADN y ARN, se pueden utilizar procedimientos como los que se emplean también para la detección de polimorfismos de nucleótidos sencillos, por ejemplo

-: la amplificación del ADNc del ARN o la amplificación del ADN genómico y su consiguiente secuenciación:

-: la detección de mutaciones a nivel de ADNc o de ADN genómico, o su amplificación mediante

-: la hibridación con sondas específicas para la secuencia, que pueden portar también marcas adecuadas para la detección tales como enzimas, fosfatasa alcalina, HRP y sus sustratos, pigmentos fluorescentes, así como pares de reportero-extintor (tales como, por ejemplo, sondas Scorpions, Molecular Beacons, TaqMan), átomos radiactivos, cromóforos, marcas de quimio- y electro-quimioluminiscencia), o

-: mediante procedimientos tales como la acilación de 2'-amina selectiva, la oxidación electroquímica de ácidos nucleicos, por conjugados de oligonucleótidos "minor groove binder", o por medio de HPLC.

Sobre la base de los resultados de las investigaciones, obtenidos por los ensayos de antígeno y actividad anteriormente mencionados, fue posible investigar tres grupos de donantes sanos en cuanto a mutaciones potenciales a nivel genómico. Para esto, se extrajo sangre de los donantes y se separaron por centrifugación las células sanguíneas del plasma. A continuación, se utilizaron los plasmas para la cuantificación del nivel de antígeno y actividad de FSAP y, en consecuencia, estos últimos se dividieron en tres grupos, a saber: "elevado/medio", "medio/reducido" y "significativamente reducido". Las células sanguíneas obtenidas se utilizaron, entonces, para la extracción de ADN/ARN y calcular a partir de los mismos los hallazgos que se muestran en la página 5 y en la Tabla 1.

Sobre la base de los presentes resultados es posible, entonces, una rápida detección de una o ambas mutaciones descritas, independientemente del genotipo heterocigótico u homocigótico, a nivel de la correspondiente secuencia de FSAP. En tanto que los ensayos de antígeno y actividad anteriormente mencionados reflejan por completo el genotipo, cuando el donante está sano, esto puede ser difícil o imposible ante influencias sobre el nivel en plasma de FSAP. De esta forma, parámetros tales como oscilaciones hormonales, estilo de vida, etc., pero en especial, los estados patológicos pueden influir de manera más o menos intensa sobre los niveles de antígeno y/o actividad. Tal como se describe en la solicitud de Patente Alemana DE 199 26 531, en caso de un infarto de miocardio, ante un contenido en antígeno escasamente elevado, la actividad mensurable de FSAP puede estar claramente incrementada con respecto al valor normal, por lo que una actividad reducida de FSAP en donantes sanos puede aparecer como "media".

Por ejemplo, debido a las limitaciones anteriormente citadas, resultan difícilmente posibles las investigaciones para determinar si pacientes con una mutación de FSAP tienen mayor riesgo de sufrir complicaciones trombóticas tales como infartos de miocardio. Por el contrario, por ejemplo, una insuficiencia hepática puede dar lugar a niveles plasmáticos reducidos, lo que, a su vez, puede conducir también a una falsa interpretación de la predisposición genética "real". Al contrario, el ensayo de la mutación de FSAP a nivel de ADN/ARN es independiente de sucesos temporales. La combinación de todos los ensayos mencionados permite establecer un cuadro completo del donante/paciente, es decir, la evaluación de una mutación potencial y del estado agudo con respecto a una influencia sobre la relación de antígeno-actividad. De aquí pueden desprenderse medidas profilácticas y terapéuticas.

Como se ha descrito anteriormente, hasta ahora se han encontrado exclusivamente donantes de sangre heterocigotos, cuyo plasma sanguíneo contiene alrededor de 50% de FSAP normal y alrededor de 50% de mutante de FSAP. De aquí se deduce un nivel de actividad reducido en aproximadamente un 50% de los plasmas en los que están presentes los dos tipos de moléculas de FSAP. Las combinaciones de plasma, obtenidas de la sangre de 100 y más donantes, contienen, en consecuencia, también de 5 hasta 10% del mutante de FSAP, dependiendo de la población. De esta forma, en las transfusiones de sangre existe la correspondiente probabilidad de recibir plasma sanguíneo de un donante que contenga el mutante de FSAP. Si se administra sangre que contengan este mutante a un receptor que no lo forme, éste puede ser reconocido como ajeno y determinar la formación de los correspondientes anticuerpos. En una posterior aplicación del mutante de FSAP, se pueden producir reacciones inmunológicas en el receptor, con los efectos secundarios conocidos por los especialistas.

A la inversa, el receptor de sangre homocigoto, que forma únicamente el mutante de FSAP, pero no FSAP normal, ésta es reconocida como "ajena" y forma los correspondientes anticuerpos contra ella.

La FSAP influye sobre la homeostasia y los procesos celulares relacionados con la misma. Por su implicación en la coagulación sanguínea y/o la fibrinolisis, influye, igualmente, sobre la reacción de cicatrización de heridas. Adicionalmente, debido a la propiedad de la FSAP de exhibir una elevada afinidad por los glicosaminoglicanos, ésta se puede fijar a células y otras matrices, por lo que posiblemente interviene de forma fisiológica o fisiopatológica en la migración celular y en procesos proteolíticos celulares.

Por consiguiente, los anticuerpos contra la FSAP pueden influir sobre todas las actividades mediadas por la FSAP. En el caso que aparezcan auto-anticuerpos contra la FSAP, además de una afectación de las funciones fisiológicas, los complejos inmunológicos (FSAP + anticuerpos) pueden dar lugar a efectos secundarios de conocidas enfermedades autoinmunológicas. Esto puede originar vasculitis, por ejemplo cuando se localizan en el endotelio. La neutralización de la actividad de FSAP como agente profibrinolítico podría contribuir, por lo tanto, a una situación favorecedora de trombosis.

Existe, por consiguiente, la necesidad de un procedimiento diagnóstico para la detección de los anticuerpos anteriormente descritos.

Resulta posible un procedimiento diagnóstico para la detección de anticuerpos contra la proteasa activadora del Factor VII (= FSAP) y/o contra un mutante de la FSAP, formado por el intercambio de uno o múltiples aminoácidos, en el cual se hace actuar una muestra que pudiera contener anticuerpos, sobre la FSAP y/o mutante de la FSAP fijada a un soporte sólido, a continuación, se lava, se incuban los anticuerpos fijados a la(s) proteasa(s) con una anti-inmunoglobulina humana marcada o una proteína A marcada, y se determina la señal que envía la sustancia marcada fijada.

Este procedimiento diagnóstico se lleva a cabo, de forma conveniente, con la técnica de ELISA. En este caso, la FSAP y/o el mutante de FSAP se fija a una matriz, por ejemplo, a una placa de microtitulación. Para una presentación óptima de la FSAP y/o del mutante de FSAP, se puede efectuar previamente un recubrimiento de las placas con anticuerpos monoclonales o policlonales, o con sus fragmentos F(ab')_{2} o F(ab'), para cargarlas posteriormente con FSAP y/o el mutante de FSAP. Dado que la FSAP y el mutante se fijan muy bien al sulfato de dextrano, heparina y sustancias similares, también es posible hacer el recubrimiento previo con estos agentes para la fijación de FSAP. Después de lavar el soporte o la placa de microtitulación, éste se bloquea, eventualmente, además con agentes de utilidad reconocida para ello tales como detergente o albúmina, se lava y, seguidamente, se incuba con la solución a analizar. Las soluciones que contienen anticuerpos contra FSAP pueden ser suero sanguíneo, plasma y otros fluidos corpora-
les tales como líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, lágrimas o plasma seminal, así como lisados celulares.

Tras la incubación y lavado del soporte, se utiliza, entonces, un agente de detección apropiado. Las sustancias de prueba necesarias para la detección de las distintas clases de anticuerpos tales como IgG, IgM, IgA, IgE y las correspondientes subclases, están disponibles en el comercio como reactivos marcados. La detección y cuantificación del título de anticuerpo puede llevarse a cabo en forma de determinación fotométrica, en la que se mide la extinción que se produce por la separación de un sustrato cromógeno por una enzima acoplada al anticuerpo anti-humano. Sin embargo, también es posible medir la fluorescencia de un grupo fluorescente unido al anticuerpo que se usa para la detección. Por último, también es posible llevar a cabo la detección mediante una medición radiométrica cuando la sustancia usada para la detección está marcada con un grupo radiactivo.

A través del cálculo de anticuerpos contra la FSAP y/o, en especial, contra el mutante de FSAP, es posible establecer el riesgo que comporta una transfusión de sangre antes de su realización, y se pueden adoptar las medidas de prevención contra complicaciones peligrosas.

Los anticuerpos contra FSAP permiten un procedimiento diagnóstico para la detección inmuno-histoquímica de la proteasa activadora del Factor VII de coagulación, de su proenzima o sus mutantes o fragmentos, en el cual se hace actuar sobre una muestra de tejido un anticuerpo monoclonal o policlonal marcado, dirigido contra la proteasa, o uno de sus fragmentos, se retira por lavado el anticuerpo no fijado o sus fragmentos, y se determina la señal generada por el anticuerpo fijado o uno de sus fragmentos.

Igualmente, el procedimiento se puede llevar a cabo haciendo actuar sobre la muestra de tejido un anticuerpo monoclonal o policlonal no marcado, dirigido contra la proteasa, su proenzima o sus mutantes o fragmentos, se retira por lavado el anticuerpo no fijado o sus fragmentos, a continuación, se hace actuar un anti-anticuerpo marcado sobre el tejido y, tras retirar por lavado el anti-anticuerpo marcado no fijado, se determina la señal generada por el anti-anticuerpo fijado o sus fragmentos.

Adicionalmente, se ha encontrado que los anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra la FSAP, cuando están marcados con grupos cromóforos o luminiscentes, son especialmente adecuados para la detección de FSAP en cortes de tejido de origen humano. Para esta detección resultan adecuados anticuerpos policlonales contra FSAP obtenidos por inmunización de conejos, ovejas, cabras u otros mamíferos, así como anticuerpos monoclonales. Especialmente apropiados para la detección histológica y específica de FSAP, que puede estar presente tanto en forma activada como en forma de proenzima o fragmento, son los anticuerpos monoclonales de las líneas celulares de hibridoma DSM ACC2453 y DSM ACC2454. De esta forma se pueden detectar también complejos de FSAP activada con inhibidores tales como antiplasmina. Para esto resultan adecuados todos los procedimientos de detección histológico habituales tales como microscopia óptica, de fluorescencia y electrónica.

Para la detección de FSAP en los procedimientos anteriormente mencionados resultan adecuados tanto los anticuerpos policlonales o monoclonales completos, como sus fragmentos tales como F(ab')_{2} o Fab, con la condición de que estén marcados con un grupo detectable. En este caso, se pueden utilizar los anticuerpos anteriormente mencionados, o sus fragmentos, solos o en forma de mezcla. Esto es especialmente recomendable en el caso que uno de los epítopos reconocidos esté oculto. Por ejemplo, un dominio proteico por asociación celular puede no ser accesible para un anticuerpo, pero puede ser fijado por otro anticuerpo con especificidad para otra región de la FSAP. En la detección de FSAP en cortes de tejido de origen humano se pueden utilizar también anticuerpos dirigidos contra la FSAP humana, su tipo salvaje y/o contra sus mutantes, y que se describen con mayor detalle en la solicitud de Patente Alemana DE 100 52 319.

Los conocimientos adquiridos hasta la fecha acerca de la detección inmuno-histoquímica de FSAP se pueden resumir de la forma siguiente:

-: La FSAP se detecta en prácticamente todos los tejidos humanos analizados hasta ahora;

-: las células con actividad endocrina tales como las células intersticiales de Leydig o las células con actividad endocrina de los islotes de Langerhans en el páncreas, se pueden teñir de forma intra-citoplásmica muy intensamente con anticuerpos portadores de grupos cromóforos;

-: epitelios y endotelios exhiben, según su localización, una reacción inmunológica intra-citoplásmica más o menos intensa con los anticuerpos contra FSAP;

-: las células ganglionares y dendritas de la corteza cerebral exhiben una elevada concentración de FSAP, lo que se pone de manifiesto a través de una intensa reacción de coloración inmuno-histológica con anticuerpos cromóforos;

-: las células plasmáticas muestran una intensa coloración intra-citoplásmica con anticuerpos cromóforos;

-: las células del estroma mesenquimal de tejidos complejos exhiben una reacción de coloración nula o muy débil para FSAP.

Por consiguiente, la FSAP es una proteína que se debe considerar como componente celular normal. Hasta ahora, la FSAP se ha hallado de forma localizada tanto intra como extracelularmente, en donde el primero de los compartimentos se tiñe de forma claramente más intensa. Mediante la detección de FSAP con los citados anticuerpos o sus fragmentos, se pueden reconocer los siguientes procesos patológicos:

-: Tumores con actividad endocrina y tumores neuro-endocrinos;

-: endotelios y endotelios angiogénicos del endotelio capilar; así como

-: tumores angiogénicamente activos tales como gliomas y glioblastomas, así como, por ejemplo, tumores vasculares tales como hemangioendotelioma o hemangiopericitoma y angiosarcoma;

-: reacciones de cicatrización, tejido de granulación y colagenosis;

-: zonas arterioscleróticas, (micro)trombosadas y necróticas;

-: enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, así como encefalitis espongiforme desencadenada, por ejemplo, por proteínas priónicas;

-: gammopatías y mielomas.

Para la detección de la FSAP se utilizan, preferentemente, anticuerpos monoclonales de las líneas celulares de hibridoma DSM ACC2453 o DSM ACC2454.

Este procedimiento diagnóstico se explica de forma más detallada por medio del siguiente ejemplo:

Para investigar la reactividad inmuno-histoquímica de los anticuerpos monoclonales de las líneas celulares de hibridoma DSM ACC 2453 y DSM ACC2454, específicos para FSAP, se prepararon secciones en parafina de 10 mm de grosor a partir de tejidos humanos adultos y tumores urológicos malignos, con subsiguiente eliminación de la parafina, que se trataron en tampón citrato 3 veces durante 5 min en un microondas. A continuación, se hizo actuar sobre estas secciones, durante 30 min, un anticuerpo no marcado de las líneas celulares de hibridoma anteriormente citadas. Después de lavar la sección de tejido, se hizo actuar sobre el tejido un anticuerpo de detección anti-ratón marcado, también durante 30 min y, entonces, se hizo visible el anticuerpo de FSAP fijado mediante la formación del complejo APAAP (complejo fosfatasa alcalina-anti-fosfatasa alcalina, en sus siglas en inglés) y por tinción con cromógeno y contratinción con solución de "hemalaun".

Como control negativo se llevó a cabo en cada tejido, por separado, una incubación con el anticuerpo de detección - sin incubación previa con el anticuerpo de FSAP - para visualizar potenciales reacciones inespecíficas del detector. Adicionalmente, como control positivo, se utilizó un anticuerpo contra \alpha-queratina.

Los resultados del análisis inmuno-histoquímico del tejido humano normal se recopilan en la Tabla 1:

Anticuerpo contra FSAP, Clon DSMZ ACC2454 y DSMZ ACC2453 Tejido humano normal

	DSMZ	DSMZ		2454	2453
	ACC2454	ACC2453
Esófago			Apéndice
\hskip0.5cm Epitelio escamoso	2+	2+	\hskip0.5cm Epitelios	1+	1+
\hskip0.5cm Fragmentos terminales glandulares	0	0	\hskip0.5cm Musculatura	1+	1+
\hskip0.5cm Conductos intercalados	2+	2+	\hskip0.5cm Folículo linfático	1+	1+
\hskip0.5cm Musculatura	1+	1+	\hskip0.5cm Células plasmáticas	2+	2+
\hskip0.5cm Estroma	1+	1+-2+	\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	1+
\hskip0.5cm Endotelio vascular	2+	2+	Páncreas
Cardias (Estómago)			\hskip0.5cm Epitelios	1+	2+
\hskip0.5cm Epitelio foveolar	0	0	\hskip0.5cm Islotes Langerhans	3+	1+
\hskip0.5cm Glándulas del cardias	1+	2+	\hskip0.5cm Epitelio de transición	2+	2+
\hskip0.5cm Fragmentos terminales glandulares	0	0	\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	1+
\hskip0.5cm mucilaginosos
\hskip0.5cm Glándulas exocrinas	3+	3+	Glándulas salivares
\hskip0.5cm Musculatura	1+	1+	\hskip0.5cm Extremos mucosos	0	0
\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	1+	\hskip0.5cm Extremos serosos	1+	1+-2+
Estómago			\hskip0.5cm Conductos intercalados	1+	1+
\hskip0.5cm Epitelio foveolar	0	0-1+	\hskip0.5cm Fragmentos estriados	1+	1+

(Continuación)

	DSMZ	DSMZ		2454	2453
	ACC2454	ACC2453
\hskip0.5cm Cuerpo glandular del estómago	2+	2+	\hskip0.5cm Endotelio vascular	0-1+	0-1+
\hskip0.5cm Musculatura	0	1+	Hígado
\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	1+	\hskip0.5cm Hepatocitos	2+	2+
Duodeno			\hskip0.5cm Conductos biliares	0	0
\hskip0.5cm Epitelios	0-1+	1+	\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	(1+)
\hskip0.5cm Glándulas de Brunner	0	0	Vesícula biliar
\hskip0.5cm Musculatura	0	0-1+	\hskip0.5cm Epitelio	1+	1+
\hskip0.5cm Folículo linfático	1+	2+	\hskip0.5cm Musculatura	2+	1+
\hskip0.5cm Células ganglionares	2+	3+	\hskip0.5cm Endotelio vascular	2+	1+
\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	1+	Conducto cístico
Intestino delgado			\hskip0.5cm Epitelio	3+	3+
\hskip0.5cm Epitelios	2+	3+	\hskip0.5cm Musculatura	2+	1+
\hskip0.5cm Musculatura	1+	1+	\hskip0.5cm Células ganglionares	3+	3+
\hskip0.5cm Estroma	1+	2+	\hskip0.5cm Endotelio vascular	2+	2+
\hskip0.5cm Células ganglionares	3+	3+	Testículo
	2454	2453		2454	2453
\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	1+	\hskip0.5cm Células intersticiales de	3+	1+
			\hskip0.5cm Leydig
Colon / Recto			\hskip0.5cm Células de Sertoli	1+-2+	1+
\hskip0.5cm Epitelios	1+	1+	\hskip0.5cm Células germinales	1+-2+	1+
\hskip0.5cm Folículo linfático	1+	1+	\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	1+
\hskip0.5cm Células plasmáticas	1+	1+	Red testicular
\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	0	\hskip0.5cm Epitelio	2+	2+
Epidídimo			Placenta
\hskip0.5cm Conducto epididímico	2+	2+	\hskip0.5cm Epitelio coriónico	3+	2+
\hskip0.5cm Vasos eferentes	2+	2+	\hskip0.5cm Epitelio amniótico	2+	2+
\hskip0.5cm Estroma	1+	1+	\hskip0.5cm Células deciduales	2+-3+	2+
\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	1+	\hskip0.5cm Células estromáticas	0	+/-
\hskip0.5cm Vesícula seminal			\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	1+
\hskip0.5cm Epitelio	2+	3+	Membrana fetal
\hskip0.5cm Musculatura	1+	1+	\hskip0.5cm Epitelio amniótico	3+	2+
\hskip0.5cm Endotelio vascular	2+	2+	\hskip0.5cm Células deciduales	3+	1+

(Continuación)

	DSMZ	DSMZ		2454	2453
	ACC2454	ACC2453
Vasos deferentes			\hskip0.5cm Fibroblastos	3+	1+-2+
\hskip0.5cm Epitelio	2+	3+	Cuello uterino
\hskip0.5cm Capa muscular longitudinal	0	+/-	\hskip0.5cm Epitelio glandular	0	0
\hskip0.5cm Capa muscular anular	2+	3+	\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	0-1
\hskip0.5cm Endotelio vascular	2+	3+	\hskip0.5cm Estroma	1+	0-1
Próstata			Trompa de Falopio
\hskip0.5cm Epitelio glandular	2+	2+	\hskip0.5cm Epitelio	2+	3+
\hskip0.5cm Musculatura	1+	1+	\hskip0.5cm Musculatura	0	1+
\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+-2+	1+-2+	\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	2+
Riñones			Mama
\hskip0.5cm Túbulos	2+	1+	\hskip0.5cm Epitelios de los lóbulos	2+	2+
			\hskip0.5cm glandulares mamarios
\hskip0.5cm Glomérulos	0	0	\hskip0.5cm Epitelio de transición	2+	2+
			\hskip0.5cm Conductos secretores
\hskip0.5cm Epitelio medular	1+	1+	\hskip0.5cm Fibroblastos	0	1+
\hskip0.5cm Endotelio vascular	0-1+	0-1+	\hskip0.5cm Células plasmáticas	2+	2+
Vejiga urinaria			\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	0
\hskip0.5cm Urotelio	2+	1+-2+	\hskip0.5cm Tiroides
\hskip0.5cm Musculatura	2+	1+	\hskip0.5cm Epitelio folicular	2+	1+-2+
\hskip0.5cm Células plasmáticas	2+	2+	\hskip0.5cm Estroma	1+	1+
\hskip0.5cm Fibroblastos	1+-2+	1+-2+	\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	0
\hskip0.5cm Nervio periférico		0	Timo
\hskip0.5cm Suprarrenales			\hskip0.5cm Corpúsculos de Hassal	2+-3+	2+
\hskip0.5cm Zona glomerular	2+	1+	\hskip0.5cm Folículo	1+	2+
\hskip0.5cm Zona fasciculada	1+-2+	(1+)	\hskip0.5cm Zona capsular	(1+)	(1+)
\hskip0.5cm Zona reticulada	3+	(1+)	\hskip0.5cm Macrófagos en estrella	1+	1+
\hskip0.5cm Médula	0	0	Bazo	+	+
\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	(1+)	Amígdalas	+/-	+/-
\hskip0.5cm Endometrio			Ganglios linfáticos	+/-	+/-
\hskip0.5cm Epitelio glandular	3+	2+	Seno maxilar
\hskip0.5cm Células estromáticas	0	1+	\hskip0.5cm Epitelio respiratorio	2+	3+
\hskip0.5cm Miometrio	1+	1+	\hskip0.5cm Células plasmáticas	3+	3+
\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	2+	\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	1+

(Continuación)

	DSMZ	DSMZ		2454	2453
	ACC2454	ACC2453
Pulmón			\hskip0.5cm Tejido graso	2+	2+
\hskip0.5cm Epitelio bronquial	2+	1+	\hskip0.5cm Endotelio vascular	2+	2+
\hskip0.5cm Epitelio alveolar	1+-2+	1+	Piel
\hskip0.5cm Glándulas bronquiales	1+	1+	\hskip0.5cm Epidermis	2+	1+-2+
\hskip0.5cm Cartílago	3+	1+	\hskip0.5cm Dermis	(1+)	0
\hskip0.5cm Musculatura	1+	1+	\hskip0.5cm Tejido subcutáneo	(1+)	0
\hskip0.5cm Macrófagos alveolares	2+	2+	\hskip0.5cm Glándulas sudoríparas	1+	0
\hskip0.5cm Fibras elásticas	2+-3+	2+-3+	\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	0
\hskip0.5cm Endotelio vascular	1+	1+	Endocardio	0	0
Musculatura esquelética	2+	1+	\hskip0.5cm Fibroblastos	2+-3+	2+-3+
0 = negativo; 1+ = débilmente positivo; 2+ = moderadamente muy positivo; 3+ = fuertemente positivo

En células endocrinas tales como los islotes de Langerhans del páncreas, las células intersticiales de Leydig del intersticio testicular, en las células deciduales de la placenta y en los cuerpos glandulares exocrinos del cardias estomacal, así como en el epitelio cilíndrico superior del conducto cístico se observa una intensa reacción, en parte finamente granular. Se han observado reacciones fuertemente positivas en las células plasmáticas y de transición situadas en uniones de tejidos, así como en las neuronas de la corteza cerebral. También las células deciduales, el epitelio amniótico y los fibroblastos de la membrana fetal exhibieron una capacidad de tinción inmuno-histológica muy intensa, al igual que el epitelio de revestimiento de las vesículas seminales y los enterocitos del intestino delgado.

Investigaciones de material tumoral fijado con formalina, incluido en parafina, procedente de tumores urológicos, han demostrado una reacción intra-citoplasmática débil hasta moderadamente intensa de los adenocarcinomas prostáticos diversamente diferenciados. Las células tumorales de tumores testiculares seminomatosos han mostrado únicamente una débil reacción intra-citoplasmática, en tanto que los tumores no seminomatosos (carcinoma embrionario y coriocarcinoma) exhibieron una capacidad de tinción claramente reforzada de las células tumorales, que indicaron concentraciones incrementadas de FSAP.

Este procedimiento diagnóstico permite, por tanto, una detección inmuno-histoquímica de procesos patológicos en los más diversos órganos.

<110> Aventis Behring GmbH

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<120> Mutantes de la proteasa activadora del Factor VII, procedimiento para su detección y uso

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> 2000/A008-A7

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<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 4

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1683

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,5cm

SEQ ID No. 1

1

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<210> 2

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<211> 1683

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1,5cm

SEQ ID No. 2

3

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<210> 3

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<211> 560

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<212> PTR

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip3cm

SEQ ID No. 3

5

6

7

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<210> 4

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<211> 560

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<212> PTR

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip2,7cm

SEQ ID No. 4

8

9

10

Claims

1. Mutante de la secuencia de ADN que codifica la proteasa activadora del Factor VII de la coagulación sanguínea y de los activadores del plasminógeno de cadena única (FSAP), caracterizado porque el mutante exhibe, en la posición de nucleótido 1601, un intercambio de bases G/A con respecto a la secuencia de nucleótidos según la SEQ ID Nº 1.

2. Mutante según la reivindicación 1, caracterizado porque, adicionalmente, exhibe en la posición de nucleótido 1177 un intercambio de bases G/C.

3. Mutante de la FSAP, caracterizado porque el mutante exhibe, en la posición del aminoácido 534, un intercambio Gly/Glu con respecto a la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID Nº 3.

4. Mutante según la reivindicación 4, caracterizado porque el mutante, adicionalmente, exhibe en la posición del aminoácido 393 un intercambio Glu/Gln.

5. Proteínas o péptidos del mutante según las reivindicaciones 3 a 4, caracterizados porque contienen los aminoácidos 534 hasta 539 de la SEQ ID Nº 4.

6. Procedimiento diagnóstico in vitro para el reconocimiento de personas con expresión hetero-u homocigótica, genéticamente determinada, del mutante de la FSAP según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se detecta el mutante del ADN genómico o del ARNm derivado del mismo.

7. Procedimiento diagnóstico in vitro para el reconocimiento de personas con expresión hetero-u homocigótica, genéticamente determinada, del mutante de la FSAP según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se detecta el mutante del ADN genómico, en donde el ADN genómico se ha aislado de sangre.

8. Procedimiento diagnóstico in vitro para el reconocimiento de personas con expresión hetero-u homocigótica, genéticamente determinada, del mutante de la FSAP según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se mide la actividad del mutante de FSAP incubando la muestra que contiene la proteasa en un soporte sólido, al que se ha acoplado previamente un anticuerpo, su Fab o su fragmento F(ab')_{2}, dirigido contra la proteasa y, después de lavar el soporte sólido, se incuba la proteasa fijada al mismo con reactivos que permiten determinar su actividad.

9. Procedimiento diagnóstico según la reivindicación 8, caracterizado porque el anticuerpo dirigido contra la proteasa activadora del Factor VII de la coagulación sanguínea (FSAP) se caracteriza porque ha sido formado por una de las líneas celulares de hibridoma DSM ACC2453 ó 2454.

10. Uso del mutante según las reivindicaciones 1 a 4, para la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o el tratamiento de hemorragias en el déficit congénito o adquirido de FVIII, Factor de von Willebrand, FV, FIX, FX, FXI, FXII y/o anticuerpos dirigidos contra estas proteínas.

11. Procedimiento para la preparación de anticuerpos monoclonales contra el mutante de la FSAP según una de las reivindicaciones 3 y 4, caracterizado porque en el marco de un procedimiento de inmunización en sí conocido, se utilizan péptidos según la reivindicación 5.

12. Sonda de hibridación específica para secuencias que se utiliza en un procedimiento en sí conocido para la detección de un "polimorfismo de nucleótido único" en un mutante de FSAP, según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque el "polimorfismo de nucleótido único" es un intercambio de bases G/A en la posición del nucleótido 1601 como el contenido en la SEQ ID Nº 2.